CN1300321C

CN1300321C - 对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒及获得方法

Info

Publication number: CN1300321C
Application number: CNB200410041045XA
Authority: CN
Inventors: 吴缅; 那沙·阿丁·霍蒂; 朱的娥; 宋质银; 王宜
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2004-06-17
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2007-02-14
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: CN1710080A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及生物基因工程技术。所述的Survivin突变体重组腺病毒，将Survivin基因序列的第158位碱基a突变为c，蛋白质序列第53位氨基酸D相应地突变为A。其获得方法包括引入突变、构建质粒和包装病毒。引入突变的步骤是首先根据已知野生型Survivin序列设计引物1和引物2，再根据突变原理设计含突变的引物3和引物4；用引物1和引物2从HeLa库中钓出Survivin基因，再分别扩增Survivin左右两部分片段，回收后等量加入，变性退火再循环，形成全长双链Survivin后进行第三轮PCR循环，扩增出含突变的Survivin(Surv-D53A)，此后再通过生物基因工程中常用方法构建质粒和包装病毒。从多项实验结果看出，本发明的重组腺病毒强烈诱导肝癌细胞、子宫颈癌细胞、肺癌细胞等癌细胞凋亡。

Description

对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒及获得方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及到生物基因工程技术。

背景技术

利用外源基因或核酸导入生物体内达到防治疾病的基因治疗是近几十年发展起来的新技术。在基因转导和表达的过程中，载体技术是关键，特别是其中的载体构建。载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。其中，腺病毒载体(Ad)具有转高染效率、能感染非增殖细胞、能产生更高病毒滴度(＞10¹¹)等独特优点，并具有携带大片段外源DNA的潜力及直接在体内途径(in vivo)基因转移上有较大优势，因此被广泛应用于基因治疗的基础研究和临床应用方面。以腺病毒为载体构建外源基因表达盒的机理是先利用基因工程技术克隆目的基因，同源重组到腺病毒骨架质粒以后，再包装成复制缺陷型腺病毒，形成高转染率、高表达的基因重组药物。

现有的用腺病毒作为载体，通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗效果的基因重组药物，要么特异性不高，要么对肿瘤治疗能力不强。例如中国专利申请02115228.4中公开的p53腺病毒载体引入外源野生型p53后，在一定程度上弥补了癌细胞中缺失或突变了的p53蛋白质的作用，但因p53在细胞周期中主要在上游的转录调控中起作用，因此p53的过表达能引起细胞周期停滞，其诱导凋亡能力并不强。而且该项发明中腺病毒载体不包含绿色荧光蛋白，不方便检测病毒滴度，操作不直观。因此，构建一种高转染率，高表达，低风险性，易生产，易检测，强治疗效果的基因重组药物对肿瘤治疗的基础研究和临床应用极为必要。

发明内容

本发明的目的在于，提出一种利用基因工程技术克隆并突变Survivin基因，再利用同源重组原理构建到复制缺陷型的腺病毒载体上，形成对肿瘤细胞有促凋亡能力的Survivin突变体重组腺病毒。

本发明的目的通过以下方式来实现。

本发明的对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒，包含突变的Survivin基因，其特征在于，所述的Survivin基因序列的第158位碱基a突变为c，蛋白质序列第53位氨基酸D相应地突变为A。

即所述的Survivin基因序列为：

atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctct

acattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgag

gctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagc₁₅₈cttggcccagtgtttcttctg

cttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagca

ttcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtga

atttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataa

gaagaaagaatttgaggaaactgcgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgc

catggattga

蛋白质序列表达式为：

MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPA₅₃LAQCFFCFKE

LEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEET

AKKVRRAIEQLAAMD

本发明的对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒的获得方法，包括引入突变、构建质粒和包装病毒，其特征在于，引入突变的步骤为：

(1)首先根据已知野生型Survivin序列设计引物1和引物2，再根据突变原理设计含突变的引物3和引物4：

引物1 5’＞CGGAATTCCATGGGTGCCCCGACGTTGC＜3’

引物2 5’＞CGCTCGAGTCAATCCATGGCAGCCAGCTG＜3’

引物3 5’＞GAGAACGAGCCAG CCTTGGCCCAGTGTTTC＜3’

引物4 5’＞GGGCCAAG GCTGGCTCGTTCTCAGTG＜3’

或者设计引物1.1来代替引物1：5’＞AGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTGC＜3’，其中引物1和引物1.1是Survivin上游引物，分别含EcoR I和Kpn I内切酶位点；引物2是Survivin下游引物，含Xho I内切酶位点；引物3和引物4为引入突变点引物；

(2)首先用引物1和引物2从HeLa库中钓出Survivin基因，再分别通过引物1和引物4、引物3和引物2两对引物扩增Survivin左右两部分片段，回收后等量加入PCR扩增体系，8-12个循环后，使具有重叠部分的左右两段变性退火，形成全长双链Survivin，再加入引物1和引物2进行第三轮PCR循环扩增出含突变的Survivin(Surv-D53A)，即第158位碱基a(腺嘌呤)突变为c(胞嘧啶)，由此蛋白质序列相应发生了改变，即第53位氨基酸D(天冬氨酸)突变为A(丙氨酸)，如图1；此后再通过生物基因工程中常用方法构建质粒和包装病毒，其步骤为：

(3)通过EcoR I/Xho I双酶切，把Surv-D53A构建到pcDNA3-flag载体上；

(4)将pcDNA3-flag-Surv-D53A经Kpn I和Xho I内切酶酶切，克隆到经相应内切酶消化过的pAd-Track-CMV载体上；或者以引物1.1替换引物1，经过相应的三轮PCR循环引入突变，扩增出含突变的全长Survivin，经Kpn I和Xho I酶切后连接到pAd-Track-CMV载体上；

(5)经内切酶pme I单酶切线性化后与经修饰改造过的腺病毒骨架质粒pAd-easyl共转到大肠杆菌BJ5183中，在大肠杆菌中同源重组，经筛选，得到重组质粒pHomo-GFP-CMV-Surv-D53A；

(6)该重组质粒由内切酶pac I线性化后转染293A细胞包装得到复制缺陷型腺病毒Ad-D53A。

本发明方法中所用试剂为：EcoR I、Kpn I和Xho I内切酶，CIAP碱性磷酸酶购自上海生工公司，细胞培养基来自Oxid公司，脂质体Liofectamine 2000购自clontech公司，etopside、TRAIL和doxorubicin等化疗药物购自R&D公司，Hoechst 33342及其它大部分试剂购自Sigma公司。

IAP家族在肿瘤细胞抗凋亡过程中起非常重要的作用，Survivin属于IAP家族成员，这个家族的各个成员在BIR(baculovirus IAP repeat)结构域中D最为保守，见图2。Survivin第53位天冬氨酸D形成的酸性表面对于维持其三级结构和生理功能极为重要，把它突变为丙氨酸后，Survivin的功能从抗凋亡转变为促凋亡，具体机制是由于它竞争性地抑制了野生型Survivin(WT)的功能，使Survivin(WT)不能结合到Smac(一种促凋亡蛋白)，从而解除了Survivin阻止凋亡的作用，突变体本身也不能结合到Smac；另一方面，Surv-D53A不能像野生型Survivin一样与Aurora B(一种参与细胞分裂的激酶)结合，使处于强分裂的癌细胞分裂失败，从而激发凋亡。同时，Survivin突变体重组腺病毒使肿瘤细胞对etopside、TRAIL和doxorubicin等化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡更加敏感。因此，用本发明方法获得的Survivin突变体重组腺病毒对肿瘤细胞有较好的促凋亡治疗效果。

为了设计对照，本发明同时还构建了腺病毒载体Ad-GFP。将上述得到的复制缺陷型腺病毒载体进行下列实验，以验证所述腺病毒Ad-D53A促凋亡性能。

(1)子宫颈癌细胞(HeLa)和肝癌细胞(QGY-7703)经Ad-D53A感染24到48小时后，出现典型的凋亡现象，而对照组Ad-GFP无变化，结果如附图3(A、B、C、D)。

(2)MTT实验分析。Ad-D53A，Ad-GFP腺病毒按一定滴度感染QGY-7703细胞，在特定时间加入MTT，孵育3小时，接着溶解在DMSO中，最后通过570nm波长，在ELX800 UniversalMicroplate Reader(BIO-TEK Instrument Inc.USA)仪器上读出读数，计算细胞存活率。随着时间的加长，被Ad-D53A感染的QGY-7703细胞凋亡百分比逐步上升，见图4；同时Surv-D53A使QGY-7703对etoposide和doxorubicin的治疗效果更加敏感，能明显加强TRAIL对子宫颈癌HeLa细胞的治疗作用，见图5.

(3)琼脂糖克隆数形成实验。在细胞板上先铺一层0.7％的琼脂糖胶，QGY-7703细胞包埋在0.3％的上层琼脂糖培养基上，15天后，经结晶紫染色，显微镜下观察，拍照。，被Ad-D53A感染的肝癌细胞QGY-7703在琼脂糖上极少存活，只有很少克隆数形成，绝大多数癌细胞已凋亡，而对照组PBS，Ad-GFP形成很多细胞克隆群。

(4)裸鼠肿瘤模型实验。经皮下及腹腔注射肝癌细胞QGY-7703，建立肿瘤模型，再给予该基因药物；或者皮下及腹腔注射经重组基因药物感染过的肝癌细胞。无论哪种处理方式，与对照组Ad-GFP比较起来，Ad-D53A都能抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。

(5)免疫组化结果。肿瘤组织常规切片，脱蜡，复水后，用抗flag抗体，经免疫组化试剂盒检测表明，Ad-D53A处理过的肿瘤组织，有flag表达，呈阳性，Ad-D53A在肿瘤组织中高表达，细胞已发生凋亡；而对照组呈阴性。

(6)H&E染色结果。肿瘤组织常规切片，脱蜡，复水后，分别经伊红、苏木素染色，脱水封片后，在显微镜下观察到Ad-D53A处理过的肿瘤细胞大面积凋亡，而对照组未见损伤。

从多项实验结果可以看出，本发明的重组腺病毒强烈诱导肝癌细胞(QGY-7703)，子宫颈癌细胞(HeLa)及肺癌细胞(A549和H1299)等癌细胞凋亡。

附图说明

下面结合附图和实施例作进一步描述。

图1是Survivin基因的结构及突变点示意图。

图2是IAP家族中BIR结构域中较为保守的序列示意图。

图3是Ad-D53A在子宫颈癌细胞和肝癌细胞中诱导凋亡结果示意图。

图4是肝癌细胞(QGY-7703)感染后的MTT分析结果示意图。

图5是子宫颈癌细胞(HeLa)被C1-GFP、C1-GFP-Survivin(野生型)、C1-GFP-Surv(D53A突变型)及化疗药物TRAIL处理后的MTT分析结果示意图。

参见图1，其中1、3为二聚体形成界面，2为BIR结构域，4为与微管结合及核出位信号区，5为突变点(D突变为A)

参见图2，本图为IAP家族各成员BIR结构域序列的比较，其中氨基酸D用星号标出。该结果是用欧洲生物信息研究所ClustalW软件和巴斯德研究所Boxshade软件分析所得。

参见图3，其中A、B图中为HeLa细胞，A为Ad-GFP感染过，细胞未见凋亡，状态良好，呈多角状态，B图中细胞为Ad-Surv(D53A)感染过，与A中比较，可见细胞变圆，有明显的凋亡现象；C、D图为肝癌细胞QGY-7703，C中细胞感染过Ad-GFP，细胞形态保持完好，未见损伤，而D图中被Ad-Surv(D53A)感染后，部分细胞变圆，开始凋亡。

参见图4：肝癌细胞QGY-7703经Ad-GFP或Ad-Surv(D53A)感染后，随着时间的延长，细胞凋亡数逐渐增多。经过MTT实验分析，Ad-Surv(D53A)组在24小时达到约28％的死亡率，在48小时约为45％。

参见图5：子宫颈癌细胞(HeLa)先转染C1-GFP，C1-GFP-Survivin(野生型)，C1-GFP-Surv(D53A突变型)，12小时后加入化疗药物TRAIL，其工作浓度为10纳克每毫升，随着与该药孵育时间的加长，Surv(D53A)与TRAIL共同作用的细胞凋亡率，2小时已达到70％，而作为对照的野生型Survivin和C1-GFP细胞凋亡率不到50％。在4小时效果更加明显，联合用药使癌细胞凋亡达100％。

具体实施方式

1)引入突变

所用PCR循环条件为：

94℃ 热变性 8分钟

94℃ 热变性 1分钟

56℃ 退火 1分钟

72℃ 延伸 1分钟

从第二步到第四步进行30个循环

72℃ 延伸 10分钟

16℃ 保持

首先，通过PCR循环用引物1和引物2从HeLa库中钓出Survivin基因。

其次，分别以引物1和引物4，引物3和引物2扩增Survivin左右两段。以1％琼脂糖胶回收后作为模板等量加入PCR扩增体系，再次扩增10个循环，使具有重叠部分的两段变性后退火相连，形成全长含突变的Survivin。

最后，再加入引物1和引物2指数级扩增突变Survivin。

如果在引入突变的三轮循环中用引物1.1替代引物1，则用Kpn I酶切位点替代EcoR I位点，以方便直接将突变Survivin基因连接到pAd-Track-CMV载体上，而不经过pcDNA3-flag载体。

2)构建质粒和包装病毒

引物1和引物2分别含内切酶EcoR I、Xho I酶切位点，经酶切消化，连接到经相应酶切过的pcDNA3-flag真核表达载体上。

酶切体系(10μl)为：

BSA(小牛血清) 1μl

Buffer D(缓冲液) 1μl

EcoR I(内切酶) 0.2μl

Xho I(内切酶) 0.2μl

Surv(D53A) 7.6μl

37℃反应4个小时，再跑胶回收。

连接体系(10μl)为：

ligase Buffer(连接酶缓冲液) 1μl

ligase(连接酶) 0.5μl

载体pcDNA3-flag 2μl

片段Surv(D53A) 6.5μl

16℃反应过夜。再转化到大肠杆菌菌株DH5α。挑取单克隆，摇菌，用试剂盒(kit)抽质粒。再用内切酶EcoR I、Xho I酶切鉴定，证明质粒构建正确。免疫印记实验证实突变Survivin表达了。

把Survivin基因连接到pcDNA3-flag载体上，是为了使该基因与flag(一种只有十几个氨基酸的抗原表位)融合，方便于用flag抗体检测Survivin的表达。

用内切酶Kpn I和Xho I把Survivin从pcDNA3-flag上切下(与EcoR I和Xho I具有相同的酶切体系和反应条件)，连接到腺病毒体系中的转移载体pAd-Track-CMV上。该载体含两个CMV启动子，一个调控目的基因，另一个调控GFP(绿色荧光蛋白)各自独立调控表达。GFP的存在方便于病毒滴度的鉴定及感染效率的检测，非常直观。pAd-Track-CMV-Surv(D53A)经内切酶pme I线性化后，与腺病毒骨架质粒pAd-easyl共同电转到大肠杆菌菌株BJ5183，使Surv(D53A)重组到腺病毒中，经卡那霉素筛选得到阳性重组克隆pHomo-Surv(D53A)，该质粒经pac I线性化后，转染293A细胞，13天后得到含Surv(D53A)的复制缺陷型重组病毒载体。

pme I线性化条件(20μl体系)为：

H₂O(水) 9μl

Buffer4(缓冲液4) 1μl

BSA(小牛血清) 1μl

pme I(内切酶) 2μl

pAd-Track-CMV-Surv(D53A) 7μl

37℃反应过夜。

pac I线性化条件为：

H₂O(水) 10μl

Buffer1(缓冲液1) 1μl

BSA(小牛血清) 1μl

pac I(内切酶) 2μl

pHomo-Surv(D53A) 6μl

每管20μl，共4管，37℃反应过夜。

质粒pAd-Track-CMV-Surv(D53A)，pHomo-Surv(D53A)酶切后，再经CIAP碱性磷酸酶处理，使其不能自连接，再跑胶回收。

CIAP(碱性磷酸酶)反应体系分别为23/90μl：

CIAP Buffer(缓冲液) 2.3μl/9μl

CIAP碱性磷酸酶 0.7μl/1μl

酶切后质粒 20μl/80μl

37℃反应1小时。

电转及筛选：

40μl感受态BJ5183菌株中加入4μl线性化pAd-Track-CMV-Surv(D53A)和2μl腺病毒骨架质粒pAd-easyl

电压2.5千伏特

电阻200欧姆

电容25微法拉

电激4.94秒，快速加入LB培养基，37℃以50转速度摇1个小时，涂在卡那抗性LB板上。48小时后，挑取小点培养，酚/氯仿法抽取质粒，酶切，跑胶检测，确定阳性克隆。

293A细胞培养及转染步骤为：

在转染前18-24小时传293A细胞，使其在转染时密度达60-80％。

取8μl脂质体溶入200μl DMEM(不含血清和抗生素的细胞培养基)，室温放置2-5分钟；

取8μl线性化pHomo-Surv(D53A)溶入200μl DMEM中；

轻轻打匀两者，室温放置15-20分钟；

给细胞换上新鲜培养基，加入质粒脂质体混合物，轻轻混匀。

3)大量包装

用原代病毒Ad-Surv(D53)感染293A细胞，大量包装，3-4天后细胞悬浮，离心收集细胞(在4℃以1000转离心5分钟)，沉淀溶解在PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.2)中，放置在-80℃，20分钟后取出，于37℃融化，用震荡器破裂。重复冻融2次，离心(在4℃以9000转离心10分钟)，收集上清，分装，-80℃保存.。

4)效果检测

感染细胞：肝癌细胞(QGY-7703)，子宫颈癌细胞(HeLa)，肺癌细胞(A549和H1299)等细胞长到密度约90％时，以MOI(滴度)50加入Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP，轻轻混匀，6小时后换培养基，24或48小时后在荧光显微镜下观察细胞，与对照组Ad-GFP相比，能见到Ad-Surv(D53A)感染的癌细胞有明显的凋亡现象。

MTT分析：在96孔板中传肝癌细胞，使其密度达到80％，24小时后，感染Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP，一定时间细胞出现凋亡现象后，1毫克每毫升的工作浓度加入MTT，37℃孵育3小时，加入100微升DMSO(二甲基亚砜)，半小时后，在ELX800读数仪上读数，取平均数后计算细胞存活率。

动物模型：4周龄胸腺缺陷型裸鼠(Athymus BALB/c nude mice)皮下或腹腔种植肝癌细胞QGY-7703(每只约2×10⁶个细胞)，一个星期后，肿瘤组织开始长成，再相应地在皮下肿瘤或腹腔中注射复制缺陷型病毒Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP，10天后，经皮下种植并被Ad-Surv(D53A)处理过的肿瘤基本消失，而对照组的肿瘤长的更大；腹腔种植肿瘤细胞并注射Ad-Surv(D53A)的裸鼠经解剖开腔后发现，肿瘤细胞在腹腔内并无迁移和扩散，只在原始部位有一很小的肿瘤组织，而对照组Ad-GFP处理过的裸鼠，肿瘤细胞侵润到整个腹腔。

另一组实验是先培养肝癌细胞QGY-7703，使其密度达到90％，再用重组病毒Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP以MOI为25的滴度感染细胞，6小时后换新鲜培养基，24小时后收细胞，皮下或腹腔注射裸鼠(每只约2×10⁶个细胞)，14天后，与对照组Ad-GFP比较起来，Ad-Surv(D53A)能强烈诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的发展和迁移。

序列表

<160>2

<210>1

<211>429

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60

acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120

gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagcct tggcccagtg tttcttctgc 180

ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240

tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300

tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360

aagaaagaat ttgaggaaac tgcgaagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420

atggattga 429

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Ala Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala

115 120 125

Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

130 135 140

Claims

1.一种对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒，包括突变的Survivin基因，其特征在于，所述的Survivin基因序列的第158位碱基a突变为c，其基因序列表达式为

atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctct

acattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgag

gctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagc₁₅₈cttggcccagtgtttcttctg

cttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagca

ttcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtga

atttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataa

gaagaaagaatttgaggaaactgcgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgc

catggattga

蛋白质序列第53位氨基酸D相应地突变为A，蛋白质序列表达式为：

MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPA₅₃LAQCFFCFKE

LEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEET

AKKVRRAIEQLAAMD。

2.一种对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒的获得方法，包括引入突变、构建质粒和包装病毒，其特征在于，引入突变的步骤为：

(1)根据已知野生型Survivin序列设计引物1和引物2，再根据突变原理设计含突变的引物3和引物4：

引物1 5’>CGGAATTCCATGGGTGCCCCGACGTTGC<3’

引物2 5’>CGCTCGAGTCAATCCATGGCAGCCAGCTG<3’

引物3 5’>GAGAACGAGCCAG CCTTGGCCCAGTGTTTC<3’

引物4 5’>GGGCCAAG GCTGGCTCGTTCTCAGTG<3’

其中引物1是Survivin上游引物，含EcoR I内切酶位点；引物2是Survivin下游引物，含Xho I内切酶位点；引物3和引物4为引入突变点引物；

(2)用引物1和引物2从HeLa库中钓出Survivin基因，再分别通过引物1和引物4、引物3和引物2两对引物扩增Survivin左右两部分片段，回收后等量加入PCR扩增体系，8-12个循环后，使具有重叠部分的左右两段变性退火，形成全长双链Survivin，再加入引物1和引物2进行第三轮PCR循环扩增出含突变的Survivin：第158位碱基a突变为c，此蛋白质序列第53位氨基酸D相应突变为A；

此后再通过生物基因工程中常用方法构建质粒和包装病毒，其步骤为：

(3)通过EcoR I/Xho I双酶切，把Surv-D53A构建到pcDNA3-flag载体上；

(4)将pcDNA3-flag-Surv-D53A经Kpn I和Xho I内切酶酶切，克隆到经相应内切酶消化过的pAd-Track-CMV载体上；

3.如权利要求2的对肿瘤细胞有促凋亡功能的Survivin突变体重组腺病毒的获得方法，其特征在于，根据已知野生型Survivin序列设计引物1.1来代替引物1：5’>AGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTGC<3’，以引物1.1替换引物1，经过相应的三轮PCR循环引入突变，扩增出含突变的全长Survivin，经Kpn I和Xho I酶切后连接到pAd-Track-CMV载体上。