CN1673371A - 一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原i、其编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)正常细胞壁中表达的新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I及其编码序列，本发明还提供了该细胞壁表面抗原蛋白及其核酸的制备方法及其应用。用该抗原免疫小鼠成功地制备了对应的单克隆抗体，并经筛选得到了特异性好、亲和力高的多株单克隆抗体，同时建立双抗体夹心ELISA法检测抗原，可应用于临床快速诊断马尔尼菲青霉病。

Description

一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I、其编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及分子免疫学、分子生物学、生物信息学和基因工程等领域，具体地，本发明涉及一种马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)细胞壁表面抗原I及其编码序列。本发明还提供了该细胞壁表面抗原I及其核酸序列的制备方法和应用。

背景技术

真菌基因组研究始于二十世纪九十年代，第一个完成全基因组测序的真菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在过去的几年里，FGI(Fungal Genome Initiative)委员会从150多万种真菌中，选取了15个在医药和工农业中具有重要价值的物种进行了基因组学的研究。2003年6月，FGI委员会新增了44个物种，其中包括了马尔尼菲青霉菌。

马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先于1956年在越南从一只中华竹鼠的肝脏分离出来的一种青霉，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此后并没有引起人们的注意。1973年Disalvo在美国南卡首次发现人自然感染的病例，患者是一位曾在东南亚旅行过的传教士。

1964年邓卓霖在广西一土生农民身上发现此菌，但当时全世界都还没有此病报导，故将其认定为荚膜组织胞浆菌。1984年邓卓霖在国内首例报导了一例马尔尼菲青霉病。

从1984年到1987年，广西医科大学病理科收集的19全身播散型病例中，有4例发现有导致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺发育不良，SLE(系统性红斑斓创)，TB(结核)等。1999年，邓卓霖首先发现了国内第一例合并AIDS的患者。近几年国内新发现的病例中，合并AIDS的患者越来越多。泰国至1998年已有1300例合并AIDS的患者。近年来发现70-80％的AIDS的患者后期感染上马尔尼菲青霉菌。

马尔尼菲青霉菌多呈条件致病菌，25℃呈丝状真菌，为非致病菌；37℃呈酵母形态，为致病菌。它是一种深部致病真菌。它侵犯人体的单核巨噬系统，破坏人的免疫系统，使人体的免疫力下降。由于它在局部的机械破坏作用，以及代谢产物，毒素等作用，产生炎症反应，导致浓肿，肉芽肿等改变。并容易破坏血管进入血液循环，导致败血症。进入人体的途径一般是呼吸道或皮肤。

马尔尼菲青霉菌是300余种青霉菌中唯一的双相致病菌(Borneman AR，etal.2000)。随着AIDS在全世界范围的蔓延，马尔尼菲青霉菌引起的急性系统性或播散性感染明显增加，已成为影响未来公众健康的潜在机会性致病菌(Ungpakorn R.2000)。马尔尼菲青霉病病情凶险，若不及时治疗，死亡率可高达91.3％(Sirisanthana R，et al.1998)。如果能早期诊断，早期抗真菌治疗对此病是有效的(Sirisanthana R，et al.1998)。但因其临床表现复杂且无特异性，误诊率极高。目前对马尔尼菲青霉感染诊断主要依靠分离培养及组织病理学检查。但分离培养耗时长，阳性率低，且易污染造成假阳性结果。组织活检病理学发现特征性酵母样细胞对诊断有重要价值，但极易与荚膜组织胞浆菌及隐球菌感染相混淆。国外学者采用免疫组化方法鉴定马尔尼菲青霉感染(Arrese E J，et al.1992)，敏感性较低，而且实验耗时长。Desakorn等(1999)制备荧光标记抗体并采用ELISA方法检测马尔尼菲青霉，敏感性高，但由于是多克隆抗体，易出现交叉反应。目前国内尚无一种检测马尔尼菲青霉抗原快速、敏感性高、特异性强的方法。

我们经研究发现了一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I，用该抗原免疫小鼠成功地制备了对应的单克隆抗体，并经筛选得到了特异性好、亲和力高的多株单克隆抗体，同时建立双抗体夹心ELISA法检测抗原，应用于临床快速诊断马尔尼菲青霉病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I、其编码序列及该细胞壁表面抗原的应用。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：

在本发明的一个方面，提供了一种来自马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的分离的多核苷酸，其含有编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自：

a)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，

b)编码含有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及

d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。

较佳的，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。

或者较佳的，所述的多核苷酸含有

(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列，或

(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或

(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地

(iv)(i)中中性功能的有义突变。

更佳的，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。较佳的，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的再一方面，提供了一种载体，所述载体含上述分离出的多核苷酸。

在本发明的再一方面，提供了一种遗传工程宿主细胞，所述宿主细胞是用上述载体转化的宿主细胞。

本发明还提供了一种生产马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的方法，该方法包括如下步骤：

(I)将编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成抗原表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列有至少70％同源性；

(II)将步骤(I)中的表达载体转入宿主细胞，形成马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I重组细胞；

(III)在适合表达马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I多肽的条件下，培养步骤(II)中的重组细胞；

(IV)分离出马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽。

较佳的，上述生产马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的方法中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列。

本发明还提供了一种抗体，所述抗体是能与上述马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I特异性结合的抗体。

本发明还包括一种探针分子，该探针分子通常含有马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针分子可用于检测样品中是否存在编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的核酸分子。

本发明还提供了含所述的多肽或其连续片段的药物组合物及疫苗组合物。

本发明还提供了所述的多核苷酸、多肽、抗体及疫苗在制备诊断和治疗针对马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物及试剂盒中的应用。

本发明还提供了包含所述的多核苷酸、多肽或抗体或它们的连续片断的试剂盒及生物芯片。

本发明还提供了双抗体夹心ELISA法检测所述抗原，应用于临床快速诊断马尔尼菲青霉病。

本发明还包括检测马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

根据本发明公开的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I及其基因，可以制备相关疫苗，并可为进一步开发针对该病菌引起的疾病的药物提供重要的参考价值，同时，它们也可以作为这类疾病诊治的潜在药物靶点。

具体实施方式

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA，或人工化学合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。单链的DNA可以是编码链或非编码链。

在本发明中，“分离的”多核苷酸是指，该多核苷酸或片断已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该多核苷酸或片断已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明中，术语“马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的编码序列”是指编码具有马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1中31-693位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框31-693位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中31-693位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常位1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常位60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I”是指具有马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的活性片断和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的可溶性片段。通常，该片段具有马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸。

发明还提供马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞。

另一方面，本发明还包括对马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I具有特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。这里“特异性”是指抗体能结合于马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I或片段。较佳地，指那些能与马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的分子，也包括那些并不影响表面抗原I蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的表面抗原I结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利NO.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的抗体以及不影响其功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的片段或功能区，通过免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与″药学上可接受的载体″组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(″佐剂″)作用。另外，抗原或免疫原可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(如可包括抗原，药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。

常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服制剂、栓剂和透皮应用。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。

作为以蛋白质为基础的疫苗的一种替代方案是，可以采用DNA疫苗接种。

本发明的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列，这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，也可通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因的克隆

1.总RNA分离(Totle RNA isolation)

将马尔尼菲青霉菌，在37℃或25℃培养后，离心弃上清取菌体，加入TRIzolReagents抽提其总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。

2.mRNA的分离(mRNA isolation)

用带Oligo d(T)的纤维素柱分离总RNA中的mRNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，定量。

3.cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)

以mRNA为模板，反转录酶作用下合成双链cDNA。过柱筛选长度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，无菌水溶解，连接至pDONR^TM222(Invitrogen，Carlsbad，CA)载体，以CloneMiner^TM cDNA Library Construction Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行包装，电击转化，宿主菌使用DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)细菌。涂板并测定滴度。

4.测序及数据库建立(Seqenc ing and Database Constructing)

挑选0文库中有外源片段插入的克隆，扩增后抽提质粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作为3’端和5’端的通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行EST大规模测序。测序结果用FACTURA软件去除载体序列，传输到SUN Ultra 450Server上进行下一步的处理。所有的序列信息再用GCG软件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，将无同源性或同源性低于95％的序列视为新基因建立数据库。

5.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

在得到的新基因片段序列信息基础上，进行cDNA全长克隆，分两阶段进行：

(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)

以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库，将重叠序列＞50bp，同源性在98％以上的表达序列标签(Expressed Sequence Tag，简称“EST”)序列认为同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER软件进行拼接，部分EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜寻Genbank或SwissProt以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性，以帮助判别所得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法，通常可获取马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因的全长序列。

(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)

如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长，则在已有序列的5’或3’端设计引物，在马尔尼菲青霉菌cDNA文库中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF，如无，重复上述过程直至获得全长。

(3)RT-PCR

对于5’和3’端已知的序列，如果中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库或自身数据库获得，可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5’端设计引物，3’端引物采用Oligo-dT，在马尔尼菲青霉总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。最后拼接并获得全长。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的全长编码序列，即获得SEQ ID NO.1所示的序列。

根据得到的全长cDNA序列推导出细胞壁表面抗原I的氨基酸序列，共220个氨基酸，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。

实施例2

马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因的序列信息与同源性分析：

本发明新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因的全长cDNA为859bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于31-693位核苷酸。根据全长cDNA推导出马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的氨基酸序列，共220个氨基酸残基。详细序列见SEQ ID NO.2。

将马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现：在氨基酸水平上，它与马尔尼菲青霉甘露糖蛋白1(MP1，SwissProt Accession No.042721)的第1-187位氨基酸残基仅有32％的相同性和50％的相似性。由上可见，马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因与MP1基因在蛋白水平上同源性较低，是一种新的细胞壁抗原基因。

本发明的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I蛋白的N端与MP1蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

实施例3

马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的结构和功能研究：

将马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的氨基酸序列在PROSITE数据库(网址为：http：//expasy.hcuge.ch/sprot/scnpsitl.html)中检索基序(motif)，得到以下结果：

在氨基酸序列中，存在以下功能基序：

(i)蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site)：86-88

(ii)酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylationsite)：20-23，33-36，45-48，63-66，80-83，91-94，100-103，212-215

(iii)N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)：58-63，132-137，200-205

(IV)N糖基化位点(N-glycosylation site)：43-46

而蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点和N糖基化位点均与翻译后修饰(post-translational modifications)有关，并且这些位点在药物开发过程中起着关键作用，可作为治疗由马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物的作用靶点。

实施例4

马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因的生长发育表达谱

电子Northern表达谱。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)：589-594；Hwang DM，et al.，Circulation1997 Dec 16；96(12)：4146-4203)，将马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I cDNA序列在GCG软件包中的dbEST数据库中做BLAST检索，在得到的EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST，可视为该基因在不同生长发育过程中的转录表达本，由此得出表达该基因的生长发育谱，揭示它在马尔尼菲青霉菌不同发育阶段中都发挥着重要作用。

实施例5

马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的制备和提纯

在该实施例中，将全长的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I编码序列或片断构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

(1)原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pDEST^TM17载体而定)，以便构建表达载体。将马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pDEST^TM17载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体利用电击转化方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pDEST^TM17-细胞壁表面抗原I表达载体的工程菌BL21-pDEST^TM17-细胞壁表面抗原I。

(2)表达GST-细胞壁表面抗原I重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pDEST^TM17-细胞壁表面抗原I工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-细胞壁表面抗原I融合蛋白的工程菌。

(3)GST-细胞壁表面抗原I融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达GST-细胞壁表面抗原I融合表达蛋白的工程菌BL21-pDEST^TM17-细胞壁表面抗原I。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-细胞壁表面抗原I的谷胱苷肽Sepharose4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在24kDa处的蛋白质条带即为马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I蛋白。

实施例6

马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I在酵母中进行真核细胞表达

1.马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I酵母表达载体的构建及转化

根据马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。将马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pYES2-DEST52载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体利用电击转化方法转入酵母细胞DB3.1中，利用氨苄青霉素筛选鉴定得到含有pYES2-DEST52-细胞壁表面抗原I表达载体的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-细胞壁表面抗原I。

2.表达细胞壁表面抗原I重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的DB3.1-pYES2-DEST52-细胞壁表面抗原I工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的YPD培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养至OD₆₀₀达0.5。取1ml菌液离心，在菌体沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬菌体沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量的菌株即为表达马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I融合蛋白的工程菌。

收集转化的细胞进行Western鉴定。将菌体裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳后的胶于Pharmacia的Multiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的抗体溶液中封闭1小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I一抗的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。

挑取高表达马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的克隆。

3.马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的提取纯化

按上述方法诱导表达细胞壁表面抗原I的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-细胞壁表面抗原I。收集菌体沉淀，菌体沉淀加入PBS重悬菌体，超声破碎菌体，离心，清洗几次，进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在24kDa处的蛋白质条带即为马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I。

实施例7

抗马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I抗体的制备

将实施例5和实施例6中获得的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。然后制备饲养细胞，再进行细胞融合。

在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I做抗体活性的初步筛选，常用的方法有：免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。

实施例8

马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因用于制备生物芯片

用获取的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因的核苷酸序列涉及引物，扩增出全长的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因或该基因的部分片断，用作生物芯片点样的样品。

用英国的BioRobotics自动点膜仪将样品点在8×12cm尼龙膜上，每一标本点4个点，每点的DNA量约为10ng。阳性对照是重复4次点样的人β-actin基因，阴性对照是重复4次点样的λ噬菌体DNA。

含有马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因的芯片可用于感染马尔尼菲青霉菌疾病的诊断和药物筛选。

实施例9

免疫制剂

用常规基因工程方法将马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I基因克隆入融合表达载体，融合表达的受体菌选用大肠杆菌或结核杆菌(卡介苗)。在大肠杆菌中表达的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I须先将其分离、浓缩、提纯，加入福氏佐剂制备成细胞壁表面抗原I免疫原。在卡介苗中表达的细胞壁表面抗原I可直接作为免疫原，即疫苗。

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I、其编码序列及其应用

<130>NP-1244

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>859

<212>DNA

<213>马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)

<220>

<221>CDS

<222>(31)..(693)

<400>1

aaataatagt acacctatta actaattacc atg aag ttc tta ccc tct ctc gtc      54

                                 Met Lys Phe Leu Pro Ser Leu Val

                                 1               5

gtc ctc ggt ctt tct acc cag gct ctt gcg agc tct tac gtc gat tat      102

Val Leu Gly Leu Ser Thr Gln Ala Leu Ala Ser Ser Tyr Val Asp Tyr

    10                  15                  20

gtt act aag gac cag cat ggt ctt act gtt tat gag atg gtc ata aat      150

Val Thr Lys Asp Gln His Gly Leu Thr Val Tyr Glu Met Val Ile Asn

25                  30                  35                  40

atc att aac acc act acc tca gac ttc aat acc cgg att cag agt tac      198

Ile Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asp Phe Asn Thr Arg Ile Gln Ser Tyr

                45                  50                  55

cag ggt ggt gat ctc agc agc att ctc gaa ggc tgt aat caa gtt acc      246

Gln Gly Gly Asp Leu Ser Ser Ile Leu Glu Gly Cys Asn Gln Val Thr

            60                  65                  70

caa ata atg aag ctt ggg gct acg ata ctc gat cag caa aca acg aaa      294

Gln Ile Met Lys Leu Gly Ala Thr Ile Leu Asp Gln Gln Thr Thr Lys

        75                  80                  85

ccc ctt acc aat aat gag tgg ctt agc ctc ctc tca cat atg gag aaa      342

Pro Leu Thr Asn Asn Glu Trp Leu Ser Leu Leu Ser His Met Glu Lys

    90                  95                  100

aag ggt ggt tta gaa gat atg ttg aaa atg gct ata aat act ctt atc      390

Lys Gly Gly Leu Glu Asp Met Leu Lys Met Ala Ile Asn Thr Leu Ile

105                 110                 115                 120

ctg aag aag tca ctt att ctt gat tct ggt ttg ggt tct aag ctt ggg      438

Leu Lys Lys Ser Leu Ile Leu Asp Ser Gly Leu Gly Ser Lys Leu Gly

                125                 130                 135

tta gcg ctt tac agt cag cag atg gct tct ata gac ctc ggt gct aag      486

Leu Ala Leu Tyr Ser Gln Gln Met Ala Ser Ile Asp Leu Gly Ala Lys

            140                 145                 150

ttc ttt gag aag acc ccc cca gga aag gtc gaa gat ttc aga gaa cac      534

Phe Phe Glu Lys Thr Pro Pro Gly Lys Val Glu Asp Phe Arg Glu His

        155                 160                 165

tgg ttt aag aac atc atg tgg gtc atc ggg cga ggt gtt gat acc ttt      582

Trp Phe Lys Asn Ile Met Trp Val Ile Gly Arg Gly Val Asp Thr Phe

    170                 175                 180

gat aaa tct acc cat cac gcg aca ata cct acc tta ccc cct aga ggt      630

Asp Lys Ser Thr His His Ala Thr Ile Pro Thr Leu Pro Pro Arg Gly

185                 190                 195                 200

gct atg gcg act agt aat tcg cct gct atc cct act ttt act gat gct      678

Ala Met Ala Thr Ser Asn Ser Pro Ala Ile Pro Thr Phe Thr Asp Ala

                205                 210                 215

gct agt gct aac tag gttagcagtg cgactagccc tacccgctat tcctttctaa      733

Ala Ser Ala Asn

            220

ttcaaaggaa ttggttattc ttgatagtct gaatctgtct gatagagttg tttctgctag    793

gtgtcaagat aattcagtat attatttata aaagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    853

aaaaaa

859

<210>2

<211>220

<212>PRT

<213>马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)

<400>2

Met Lys Phe Leu Pro Ser Leu Val Val Leu Gly Leu Ser Thr Gln Ala

1               5                   10                  15

Leu Ala Ser Ser Tyr Val Asp Tyr Val Thr Lys Asp Gln His Gly Leu

            20                  25                  30

Thr Val Tyr Glu Met Val Ile Asn Ile Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asp

        35                  40                  45

Phe Asn Thr Arg Ile Gln Ser Tyr Gln Gly Gly Asp Leu Ser Ser Ile

    50                  55                  60

Leu Glu Gly Cys Asn Gln Val Thr Gln Ile Met Lys Leu Gly Ala Thr

65                  70                  75                  80

Ile Leu Asp Gln Gln Thr Thr Lys Pro Leu Thr Asn Asn Glu Trp Leu

                85                  90                  95

Ser Leu Leu Ser His Met Glu Lys Lys Gly Gly Leu Glu Asp Met Leu

            100                 105                 110

Lys Met Ala Ile Asn Thr Leu Ile Leu Lys Lys Ser Leu Ile Leu Asp

        115                 120                 125

Ser Gly Leu Gly Ser Lys Leu Gly Leu Ala Leu Tyr Ser Gln Gln Met

    130                 135                 140

Ala Ser Ile Asp Leu Gly Ala Lys Phe Phe Glu Lys Thr Pro Pro Gly

145                 150                 155                 160

Lys Val Glu Asp Phe Arg Glu His Trp Phe Lys Asn Ile Met Trp Val

                165                 170                 175

Ile Gly Arg Gly Val Asp Thr Phe Asp Lys Ser Thr His His Ala Thr

            180                 185                 190

Ile Pro Thr Leu Pro Pro Arg Gly Ala Met Ala Thr Ser Asn Ser Pro

        195                 200                 205

Ala Ile Pro Thr Phe Thr Asp Ala Ala Ser Ala Asn

    210                 215                 220

Claims (18)

1.一种来自马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的分离的多核苷酸，其含有编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自：

a)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，

b)编码含有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及

d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。

3.如权利要求1所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有

(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列，或

(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或

(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地

(iv)(i)中中性功能的有义突变。

4.如权利要求3所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列。

5.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。

6.如权利要求5所述的一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。

7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的分离的多核苷酸。

8.一种遗传工程宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是用权利要求7所述载体转化的宿主细胞。

9.一种生产马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(I)将编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成抗原表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列有至少70％同源性；

(II)将步骤(I)中的表达载体转入宿主细胞，形成马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I重组细胞；

(III)在适合表达马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I多肽的条件下，培养步骤(II)中的重组细胞；

(IV)分离出马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽。

10.如权利要求9所述的一种产生马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的方法，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列。

11.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求5或6所述的多肽特异性结合的抗体。

12.一种探针分子，其特征在于，所述的探针分子含有权利要求1所述的多核苷酸中8-100个连续的核苷酸。

13.权利要求5或6的多肽在制备治疗针对马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物中的应用。

14.含有权利要求5或6的多肽的药物组合物。

15.含有权利要求5或6的多肽的疫苗组合物。

16.权利要求5或6的多肽作为诊断试剂和疫苗在防治马尔尼菲青霉菌引起的疾病中的应用。

17.一种用于诊断和治疗针对马尔尼菲青霉菌引起的疾病的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒包含权利要求1～4中任一种多核苷酸序列或其连续片段，或者

所述试剂盒包含权利要求5或6的多肽或其连续片段，或者

所述试剂盒包含权利要求11的抗体。

18.一种生物芯片，其特征在于：

所述生物芯片的载体上含有权利要求1～4中任一种多核苷酸序列或其连续片段，或者

所述生物芯片的载体上含有权利要求5或6的多肽或其连续片段，或者

所述生物芯片的载体上包含权利要求11的抗体。