CN1292796A - Meth1和meth2多核苷酸及多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与血小板反应蛋白相关的新抗血管生成蛋白质。更具体地说,提供了编码人METH1和METH2的分离核酸分子。还提供了METH1和METH2多肽以及用于其生产的载体、宿主细胞和重组方法。此外还提供了用于癌症预后的诊断方法及用于处理需要增加量METH1或METH2之个体的治疗方法。

Description

METH1和METH2多核苷酸及多肽

                      发明背景

联邦资助的研究和开发项目

在本发明开发期间的部分工作利用了美国政府基金。美国政府对该发明拥有一定的权利。

发明领域

本发明涉及与血小板反应蛋白相关的新抗血管生成蛋白质。更具体地说，提供了编码人METH1和METH2(ME代表金属蛋白酶，TH代表血小板反应蛋白)的分离核酸分子。还提供了METH1和METH2多肽以及用于其生产的载体、宿主细胞和重组方法。此外还提供了用于癌症预后的诊断方法及用于处理需要增加量METH1或METH2之个体的治疗方法。

相关领域

从原有脉管系统形成新血管的血管生成在正常成体中是一个严密调控的过程。在生理环境中，通过其作用而刺激或抑制血管生长之生长调节蛋白的相互作用严格控制新毛细管的生长。通常来说，这些影响力之间的平衡倾向于抑制，因而血管生长被抑制。然而在某些病理状况下，局部的抑制控制不能阻止血管生成诱导物增高的活性。血管生成是癌症转移(Folkman，Nature Med.1：27-31(1995))及异常伤口愈合、炎症、类风湿性关节炎、牛皮藓和糖尿病性视网膜病中关键的一步，在病理学上是必需的(Folkman等人，科学235：442(1987))，由此希望能通过对血管生长进行药理学和/或遗传抑制以调控这些病态个体(Iruela-Arispe等人，Thromb.Haem.78：672-677(1997))。

血小板反应蛋白(TSP-1)是释放自被激活血小板并由生长细胞分泌的450KDa抗血管生成性粘附糖蛋白(由Adams综述于Int.J.Biochem.Cell.Biol.29：861-865(1997))。TSP-1是一同源三聚体，每一亚基由1152个氨基酸长的多肽组成，具有N-连接的糖基化和天冬酰胺残基β-羟基化的翻译后加工。

TSP-1蛋白质和mRNA水平由多种因素调节。IL-1α和TNFα对TSP-1蛋白质水平进行负调控。TSP-1 mRNA和蛋白质水平被包括PDGF、TGF-β和bFGF在内的多肽生长因子正调节(Bornstein，FasebJ.6：3290-3299(1992))，并且还通过p53肿瘤抑制基因产物的表达水平进行调节(Dameron等人，科学265：1582-1584(1994))。血小板反应蛋白家族中至少已有4种其它成员被鉴定：TSP-2、TSP-3、TSP-4和TSP-5(也称COMP)。在本领域中需要鉴定血管生成调节中涉及的其它分子。

发明概述

本发明提供了含编码METH1多肽之多核苷酸的分离核酸分子，该多肽具有如SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列或由保藏于细菌宿主中的cDNA克隆编码的氨基酸序列，所说的细菌宿主保藏于1998年1月15日，ATCC 保藏号为209581。

本发明提供了含编码METH2多肽之多核苷酸的分离核酸分子，该多肽 具有如SEQ ID NO：4中所述的氨基酸序列或由保藏于细菌宿主中的cDNA 克隆编码的氨基酸序列，所说的细菌宿主保藏于1998年1月15日，ATCC 保藏号为209582。

本发明还涉及含本发明分离核酸分子的重组载体及包括该重组载体 的宿主细胞，还有通过重组技术制备所说载体和宿主细胞的方法及将它 们用于METH1或METH2多肽或肽生产的方法。

本发明进一步提供了具由本文所述多核苷酸编码之氨基酸序列的分离METH1或METH2多肽。

本发明进一步提供了在癌症诊断或预后中有用的诊断方法。

本发明的另一方面涉及治疗体内需更高水平的METH1或METH2活性之个体的方法，包括对这样的个体施用含治疗有效剂量之本发明分离的METH1或METH2多肽或其激动剂的组合物。

附图简述

图1显示METH1的核苷酸(SEQ ID NO：1)和推测的氨基酸(SEQ ID NO：2)序列。该蛋白质具有约28个氨基酸长的预计前导序列(下划线所标)。

图2显示METH2的核苷酸(SEQ ID NO：3)和推测的氨基酸(SEQ ID NO：4)序列。该蛋白质具有约23个氨基酸长的预计前导序列(下划线所标)。

图3显示METH1(SEQ ID NO：2)和METH2(SEQ ID NO：4)与它们最近的同系物-牛金属蛋白酶(pNPI)(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列比较。方框内为相同的氨基酸。通过序列和结构同源性预测的功能性结构域被标出，包括信号肽(单线)、哺乳动物枯草杆菌蛋白酶的潜在切割位点(双下划线)、金属蛋白酶结构域的锌结合位点(点线)和推定的去整联蛋白(disintegrin)环(箭头所示)。

图4显示METH1、METH2和pNPI的一级结构，包括前结构域(prodomain)、催化性的金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的去整联蛋白结构域、类TSP结构域、间隔区及不同数量的类TSP结构域，METH1有三个，METH2有两个，而pNPI是四个。

图5显示METH1(SEQ ID NO：2)和METH2(SEQ ID NO：4)与TSP1(SEQ IDNO：6，7，8)和TSP2(SEQ ID NO：9，10，11)的类TSP结构域比较，半胱氨酸编号为1-6，色氨酸用星号标出。

图6显示来源于METH1和METH2类TSP结构域的肽及重组蛋白质阻断VEGF诱导的血管生成。在存在或缺乏肽或重组蛋白质的情况下，用含铺于基质凝胶上的VEGF的尼龙网对12-14天胎儿的CAM诱导血管生成。毛细管密度评估如实施例4所述。阳性和阴性对照分别只含VEGF和载体。(A)重组蛋白质存在时VEGF诱导的血管生成反应量。TSP1、纯化血小板TSP1、GST、纯化的GST、GST-TSP1、GST-METH1和GST-METH2如实施例4所述。(B)存在或缺乏肽：P-TSP1、P-METH1和P-METH2(分别来源于TSP、METH1和METH2的I类重复区的肽)时VEGF诱导的血管生成反应量；SC1和SC2是用作对照的混杂肽。(C)存在GST-METH1时VEGF诱导的血管生成的剂量性应答。(D)存在GST-METH2时VEGF诱导的血管生成的剂量性应答。血管生成指标以来自VEGF基质胶的血管反应为100％并减去背景水平(只有基质胶)表示。试验至少重复两次。每一处理进行三份试样。所示值代表平均值，杠显示标准偏差。*P＜0.001.

图7显示METH1和METH2重组蛋白质对bFGF刺激的细胞增殖的作用。细胞在含bFGF和待测重组蛋白质(除图中所示外均为3ug/ml)的培养基中培养于24孔板上。对照只包括载体或GST重组蛋白质。(A)HDEC，人内皮细胞；(B)HMEC，人乳腺上皮细胞；(C)HDF，人皮肤成纤维细胞；(D)SMC，平滑肌细胞；(E)GST-METH1和GST-METH2对HDEC增殖的剂量性应答。试验至少重复两次。每一处理进行三份试样。所示值代表平均值，杠显示标准偏差。*P＜0.01.

图8显示pHE4-5表达载体(SEQ ID NO：12)和亚克隆的METH1或METH2cDNA编码序列的图解。卡那霉素抗性基因、METH1或METH2编码序列、oriC序列及lacIq编码序列的位置被标出。

图9显示pHE启动子调节元件的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。两个lac操纵基因序列、SD序列(S/D)和末端HindIII和NdeI限制位点(斜线表示)被标出。

图10显示METH1氨基酸序列的分析。显示了α、β转角和卷曲区、亲水性和疏水性、两亲区、柔性区、抗原性指数和表面概率，均由默认设置值得到的。在“抗原性指数或Jameson-Wolf”图中，阳性峰表示METH1或METH2蛋白高抗原区的位置，即可获得本发明带表位的肽的区域。这些图表确定的结构域在本发明范围内。图10中概述的数据列表表示于表1中。

图11显示METH2氨基酸序列的分析。显示了α、β、转角和卷曲区、亲水性和疏水性、两亲区、柔性区、抗原性指数和表面概率，均由默认设置值得到。在“抗原性指数或Jameson-Wolf”图中，阳性峰表示METH1或METH2蛋白高抗原区的位置，即可获得本发明带表位的肽的区域。这些图表确定的结构域在本发明范围内。图1中概述的数据列表表示于表2中。

                             表1

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...    Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..   Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Met	1	A	A	.	.	.	.	.	0.41	*	.	.	-0.30	0.60
Gly	2	.	A	.	.	.	.	C	0.91	*	.	.	0.50	0.81
															Asn	3	A	A	.	.	.	.	.	0.71	*	.	.	0.75	1.24
Ala	4	A	A	.	.	.	.	.	0.89	*	.	.	1.09	1.26
															Glu	5	A	A	.	.	.	.	.	0.93	*	.	F	1.58	1.97
Arg	6	.	A	B	.	.	.	.	1.23	*	.	F	1.92	1.21
															Ala	7	.	.	B	.	.	T	.	1.69	*	.	F	2.66	1.61
Pro	8	.	.	.	.	T	T	.	1.39	*	.	F	3.40	1.82
															Gly	9	.	.	.	.	T	T	.	1.28	*	.	F	3.06	1.25
Ser	10	.	.	.	.	T	T	.	0.93	*	.	F	2.42	1.07
															Arg	11	.	.	.	.	T	T	.	0.61	*	.	F	1.93	0.68
Ser	12	.	.	.	.	T	T	.	0.34	*	.	F	1.74	1.07
															Phe	13	.	.	B	.	.	T	.	0.34	*	.	F	0.25	0.59
Gly	14	.	.	B	.	.	T	.	0.38	*	.	F	0.25	0.47
															Pro	15	.	.	B	B	.	.	.	-0.13	*	.	F	-0.45	0.50
Val	16	.	.	B	B	.	.	.	-1.06	*	.	F	-0.45	0.48
															Pro	17	.	.	B	B	.	.	.	-1.57	.	.	F	-0.45	0.40
Thr	18	.	A	B	.	.	.	.	-1.68	.	.	F	-0.45	0.21
															Leu	19	.	A	B	.	.	.	.	-1.92	.	.	.	-0.60	0.24
Leu	20	A	A	.	.	.	.	.	-2.30	.	.	.	-0.60	0.15
															Leu	21	A	A	.	.	.	.	.	-2.03	.	.	.	-0.60	0.11

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-..     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen.. Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Leu	22	A	A	.	.	.	.	.	-2.63	.	.	.	-0.60	0.13
Ala	23	A	A	.	.	.	.	.	-3.13	.	.	.	-0.60	0.13
															Ala	24	A	A	.	.	.	.	.	-2.91	.	.	.	-0.60	0.13
Ala	25	A	A	.	.	.	.	.	-2.96	.	.	.	-0.60	0.16
															Leu	26	A	A	.	B	.	.	.	-2 44	.	.	.	-0.60	0.12
Leu	27	A	A	.	B	.	.	.	-1.63	.	.	.	-0.60	0.16
															Ala	28	A	A	.	B	.	.	.	-1.63	.	.	.	-0.30	0.26
Val	29	A	A	.	B	.	.	.	-1.86	.	.	.	-0.30	0.32
															Ser	30	A	A	.	.	.	.	.	-1.61	*	*	.	-0.30	0.32
Asp	31	A	A	.	.	.	.	.	-0.69	*	*	F	-0.15	0.31
															Ala	32	A	A	.	.	.	.	.	-0.09		*	F	0.75	0.83
Leu	33	.	A	.	.	.	.	C	0.20	*	.	F	1.55	0.96
															Gly	34	.	A	.	.	.	.	C	1.06	*	*	F	1.85	0.77
Arg	35	.	.	.	.	.	T	C	1.36	*	*	F	2.70	1.32
															Pro	36	.	.	.	.	.	T	C	1.36	*	*	F	3 00	2.76
Ser	37	.	.	.	.	.	T	C	1.94	*	.	F	2.70	4.66
															Glu	38	A	.	.	.	.	T	.	2.76	*	.	F	2.20	4.12
Glu	39	A	A	.	.	.	.	.	2.29	*	*	F	1.50	4.61
															Asp	40	A	A	.	.	.	.	.	1.32	*	*	F	1.20	2.84
Glu	41	A	A	.	.	.	.	.	0.68	.	.	F	0.90	1.22
															Glu	42	A	A	.	.	.	.	.	0.77	.	.	F	0.75	0.52
Leu	43	A	A	.	.	.	.	.	0.77	.	.	.	0.60	0.48

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...  Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Val	44	A	A	.	.	.	.	.	-0.04	.	.	.	0.60	0.48
Val	45	A	A	.	.	.	.	.	-0.04	*	.	.	-0.30	0.23
															Pro	46	A	A	.	.	.	.	.	0.07	*	.	.	-0.30	0.48
Glu	47	A	.	.	.	.	.	.	-0.52	*	.	F	1.10	1.27
															Leu	48	A	.	.	.	.	.	.	0.08	*	.	F	1.41	1.73
Glu	49	A	.	.	.	.	.	.	0.59	*	.	F	1.72	1.73
															Arg	50	A	.	.	.	.	.	.	1.41	*	.	F	1.88	0.99
Ala	51	A	.	.	.	.	T	.	1.28	*	.	F	2.24	1.64
															Pro	52	.	.	.	.	T	T	.	0.97	*	.	F	3.10	0.93
Gly	53	.	.	.	.	T	T	.	1.47	*	*	F	2.49	0.69
															His	54	.	.	.	.	.	T	C	1.58	*	*	F	1.38	0.98
Gly	55	.	.	.	.	.	.	C	0.66	*	*	F	1.62	1.25
															Thr	56	.	.	.	.	.	.	C	1.36	.	*	F	0.71	1.04
Thr	57	.	A	B	.	.	.	.	0.76	.	*	F	0.60	1.49
															Arg	58	.	A	B	.	.	.	.	1.07	.	*	F	0.60	1.25
Leu	59	.	A	B	.	.	.	.	0.51	.	*	.	0.45	1.17
															Arg	60	.	A	B	.	.	.	.	0.16	.	*	.	0.30	0.82
Leu	61	.	A	B	.	.	.	.	0.47	.	*	.	-0.30	0.36
															His	62	.	A	B	.	.	.	.	0.78	.	*	.	-0.30	0.74
Ala	63	A	A	.	.	.	.	.	0.67	.	*	.	0.30	0.65
															Phe	64	A	A	.	.	.	.	.	0.67	.	*	.	-0.15	1.37
Asp	65	A	A	.	.	.	.	.	0.56	.	*	F	-0.15	0.83

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Gln	66	A	A	.	.	.	.	.	0.56	.	*	F	0.60	1.37
Gln	67	A	A	.	.	.	.	.	0.59	.	*	F	0.60	1.30
															Leu	68	A	A	.	.	.	.	.	0.37	*	*	F	0.90	1.35
Asp	69	A	A	.	.	.	.	.	1.18	*	*	.	0.30	0.64
															Leu	70	.	A	B	.	.	.	.	0.97	.	*	.	0.94	0.73
Glu	71	.	A	B	.	.	.	.	0.97	.	*	.	1.43	1.37
															Leu	72	.	A	B	.	.	.	.	0.67	.	*	.	1.77	1.37
Arg	73	.	.	.	.	.	T	C	1.18	*	*	F	2.86	2.22
															Pro	74	.	.	.	.	T	T	.	0.48	*	*	F	3.40	1.72
Asp	75	.	.	.	.	T	T	.	0.48	.	*	F	2.76	1.80
															Ser	76	.	.	.	.	.	T	C	-0.11	.	*	F	2.07	0.76
Ser	77	.	.	B	.	.	.	.	0.49	*	*	F	0.73	0.50
															Phe	78	.	.	B	.	.	.	.	0.03	*	*	.	0.24	0.46
Leu	79	.	.	B	.	.	.	.	-0.46	.	.	.	-0.40	0.34
															Ala	80	.	.	B	.	.	T	.	-0.77	.	.	.	-0.20	0.22
Pro	81	.	.	B	.	.	T	.	-1.28	.	.	.	-0.20	0.37
															Gly	82	.	.	.	.	T	T	.	-0.98	.	.	.	0.20	0.37
Phe	83	.	.	B	.	.	T	.	-0.28	.	.	.	-0.20	0.63
															Thr	84	.	.	B	B	.	.	.	-0.32	.	.	.	-0.60	0 65
Leu	85	.	.	B	B	.	.	.	-0.08	*	*	.	-0.60	0.49
															Gln	86	.	.	B	B	.	.	.	0.24	*	.	.	-0.29	0.56
Asn	87	.	.	B	.	.	T	.	0.63	*	.	F	0.87	0.76

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...    Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Val	88	.	.	B	.	.	T	.	1.03	*	*	F	1.93	1.84
Gly	89	.	.	.	.	.	T	C	1.00	*	.	F	2.74	1.42
															Arg	90	.	.	.	.	T	T	.	1.51	*	.	F	3.10	0.87
Lys	91	.	.	.	.	.	T	C	1.51	*	.	F	2.74	1.58
															Ser	92	.	.	.	.	.	T	C	1.20	*	.	F	2.43	2.76
Gly	93	.	.	.	.	.	T	C	1.84	.	.	F	2.38	2.04
															Ser	94	.	.	.	.	.	T	C	1.38	.	.	F	2.33	1.57
Glu	95	.	.	.	.	.	.	C	1.06	.	.	F	1.63	0.97
															Thr	96	.	.	.	.	.	.	C	1.01	.	.	F	2.04	1.51
Pro	97	.	.	.	.	.	.	C	1.00	.	.	F	2.60	1.96
															Leu	98	.	.	.	.	.	.	C	1.34	.	.	F	2.04	1.63
Pro	99	A	.	.	.	.	.	.	0.83	.	.	F	1.58	1.89
															Glu	100	A	A	.	.	.	.	.	0.24	.	.	F	1.12	1.01
Thr	101	A	A	.	.	.	.	.	0.52	.	.	F	0.86	1.23
															Asp	102	A	A	.	.	.	.	.	0.07	.	.	F	0.60	1.08
Leu	103	A	A	.	.	.	.	.	0.18	.	.	.	0.30	0.34
															Ala	104	A	A	.	.	.	.	.	0.14	.	.	.	-0.60	0.20
His	105	.	A	B	.	.	.	.	-0.16	*	.	.	-0.60	0.19
															Cys	106	.	A	B	.	.	.	.	-0.19	*	.	.	-0.60	0.31
Phe	107	.	A	B	.	.	.	.	-0.50	*	.	.	-0.60	0.30
															Tyr	108	.	.	B	.	.	T	.	-0.54	.	.	.	-0.20	0.32
Ser	109	.	.	.	.	T	T	.	0.04	.	*	F	0.35	0.44

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Gly	110	.	.	.	.	T	T	.	-0.27	.	*	F	0.35	0.82
Thr	111	.	.	.	.	T	T	.	0.40	.	*	F	0.59	0.52
															Val	112	.	.	B	B	.	.	.	0.89	.	*	F	0.93	0.65
Asn	113	.	.	.	B	T	.	.	0.83	.	*	F	1.72	1.01
															Gly	114	.	.	.	B	.	.	C	0.83	.	*	F	1.61	0.94
Asp	115	.	.	.	.	.	T	C	0.59	.	*	F	2.40	1.69
															Pro	116	.	.	.	.	.	T	C	0.31	.	*	F	2.16	1.06
Ser	117	.	.	.	.	.	T	C	0.58	.	*	F	1.92	1.08
															Ser	118	A	.	.	.	.	T	.	-0.23	.	.	F	1.33	0.66
Ala	119	A	A	.	.	.	.	.	-0.19	.	.	.	-0.06	0.35
															Ala	120	A	A	.	.	.	.	.	-1.00	.	.	.	-0.30	0.35
Ala	121	A	A	.	.	.	.	.	-1.46	.	.	.	-0.60	0.22
															Leu	122	A	A	.	.	.	.	.	-1.16	.	.	.	-0.60	0.11
Ser	123	A	A	.	.	.	.	.	-1.20	.	.	.	-0.30	0.20
															Leu	124	A	A	.	.	.	.	.	-1.47	*	*	.	-0.30	0.19
Cys	125	.	A	B	.	.	.	.	-0.77	*	*	.	-0.30	0.17
															Glu	126	.	A	B	.	.	.	.	-0.52	*	*	.	0.30	0.25
Gly	127	A	.	.	.	.	.	.	-0.30	*	*	F	0.65	0.30
															Val	128	A	.	.	.	.	.		-0.70	*	*	F	0.65	0.57
Arg	129	.	.	B	.	.	.	.	-0.13	*	*	F	0.65	0.29
															Gly	130	.	.	B	B	.	.	.	-0.28	*	*	.	-0.60	0.45
Ala	131	.	.	B	B	.	.	.	-1.09	*	*	.	-0.60	0 50

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...      Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Phe	132	.	.	B	B	.	.	.	-1.09	*	*	.	-0.60	0.21
Tyr	133	.	.	B	B	.	.	.	-0.23	*	*	.	-0.60	0.21
															Leu	134	.	A	B	B	.	.	.	-0.93	*	*	.	-0.60	0.36
Leu	135	.	A	B	B	.	.	.	-0.83	.	*	.	-0.60	0.42
															Gly	136	A	A	.	B	.	.	.	-0.94	.	.	.	-0.60	0.42
Glu	137	A	A	.	.	.	.	.	-1.13	.	.	.	-0.60	0.44
															Ala	138	A	A	.	B	.	.	.	-0.89	.	.	.	-0.60	0.38
Tyr	139	.	.	B	B	.	.	.	-0.29	.	.	.	-0.60	0.66
															Phe	140	.	.	B	B	.	.	.	-0.29	.	.	.	-0.60	0.59
Ile	141	.	.	B	B	.	.	.	-0.16	.	.	.	-0.60	0.48
															Gln	142	.	.	B	B	.	.	.	-0.74	.	.	.	-0.60	0.48
Pro	143	.	.	B	B	.	.	.	-0.74	.	.	.	-0.60	0.55
															Leu	144	.	A	.	.	.	.	C	-0.80	*	.	.	-0.40	0.80
Pro	145	.	A	.	.	.	.	C	-0.10	*	.	.	-0.10	0.62
															Ala	146	A	A	.	.	.	.	.	0.90	*	.	.	0.30	0.69
Ala	147	A	A	.	.	.	.	.	0.09	*	.	.	0.75	1.64
															Ser	148	A	A	.	.	.	.	.	-0.29	*	.	F	0.75	0.88
Glu	149	A	A	.	.	.	.	.	0.21	*	.	F	0.45	0.88
															Arg	150	A	A	.	.	.	.	.	-0.17	*	.	F	0.60	1.25
Leu	151	A	A	.	.	.	.	.	-0.17	*	.	.	0.30	0.94
															Ala	152	A	A	.	.	.	.	.	0.21	*	.	.	0.30	0.55
Thr	153	A	A	.	.	.	.	.	0.17	*	.	.	0.04	0.43

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..    Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..     Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..     Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Ala	154	A	A	.	.	.	.	.	0.17	.	.	.	0.08	0 52
Ala	155	.	.	.	.		T	C	0.10	.	*	F	2.07	0.89
															Pro	156	.	.	.	.	.	T	C	0.70	.	.	F	2.86	1.24
Gly	157	.	.	.	.	T	T	.	1.08	.	.	F	3.40	1.90
															Glu	158	.	.	.	.	.	T	C	0.80	.	.	F	2.86	2.90
Lys	159	.	.	.	.	.	.	C	1.18	.	.	F	2.32	1.90
															Pro	160	.	.	.	.	.	.	C	0.96	.	*	F	1.98	2.97
Pro	161	.	.	.	.	.	.	C	1.17	.	*	F	1.64	1.41
															Ala	162	A	A	.	.	.	.	.	0.81	.	*	F	0.60	1.22
Pro	163	A	A	.	.	.	.	.	0.78	.	*	.	-0.60	0.68
															Leu	164	A	A	.	.	.	.	.	-0.08	.	*	.	-0.60	0.60
Gln	165	A	A	.	.	.	.	.	-0.68	*	*	.	-0.60	0.49
															Phe	166	.	A	B	.	.	.	.	-0.36	*	*	.	-0.60	0.26
His	167	.	A	B	.	.	.	.	0.34	*	*	.	-0.26	0.62
															Leu	168	.	A	B	.	.	.	.	0.56	*	*	.	0.38	0.70
Leu	169	.	A	B	.	.	.	.	1.48	*	*	.	0.87	1.31
															Arg	170	.	.	.	.	T	T	.	1.48	*	*	F	3.06	1.88
Arg	171	.	.	.	.	T	T	.	1.83	*	.	F	3.40	3.96
															Asn	172	.	.	.	.	T	T	.	1.87	*	.	F	3.06	4.75
Arg	173	.	.	.		T	T	.	1.82	*	.	F	2.72	4.05
															Gln	174	.	.	.	.	T	.	.	2.29	.	.	F	2.43	1.53
Gly	175	.	.	.	.	T	.	.	1.83	.	.	F	2.19	0.94

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..    Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..  Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Asp	176	.	.	.	.	T	T	.	1.41	.	.	F	2.30	0.48
Val	177	.	.	B	.	.	T		0.74	.	.	F	1.85	0.40
															Gly	178	.	.	.	.	T	T	.	0.29	.	.	F	2.50	0 22
Gly	179	.	.	B	.	.	T	.	-0.57	.	*	F	1.85	0.13
															Thr	180	.	.	B	B	.	.	.	-1.08	.	.	F	0.30	0.13
Cys	181	.	.	B	B	.	.	.	-1.08	.	.	.	-0.10	0.10
															Gly	182	.	.	B	B	.	.	.	-0.22	.	.	.	-0.05	0.16
Val	183	.	.	B	B	.	.	.	0.12	.	.	.	0.30	0.19
															Val	184	.	.	B	B	.	.	.	0.26	*	*	.	0.90	0.60
Asp	185	.	.	B	.	.	T	.	0.68	*	*	F	1.75	0.94
															Asp	186	.	.	B	.	.	T	.	1.13	*	*	F	2.20	2.49
Glu	187	.	.	B	.	.	T	.	1.17	*	*	F	2.50	5.18
															Pro	188	.	.	.	.	.	T	C	1.68	*	*	F	3.00	4.48
Arg	189	.	.	.	.	.	T	C	2 58	*	*	F	2.70	2.66
															Pro	190	.	.	.	.	.	T	C	1.99	*	*	F	2.40	3.07
Thr	191	.	.	.	.	.	T	C	1.99	*	*	F	2.10	2.00
															Gly	192	.	.	.	.	.	T	C	1.68	*	*	F	1.80	1.77
Lys	193	A	A	.	.	.	.	.	1.89	*	*	F	0.90	1.65
															Ala	194	A	A	.	.	.	.	.	1.78	*	*	F	0.90	1.98
Glu	195	A	A	.	.	.	.	.	1.99	.	*	F	0.90	3.35
															Thr	196	A	A	.	.	.	.	.	2.30	.	*	F	0.90	2.90
Glu	197	A	A	.	.	.	.	.	2.64	.	*	F	0.90	4.79

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni... Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...    Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Asp	198	A	A	.	.	.	.	.	2.26	.	*	F	0.90	4.79
Glu	199	A	A	.	.	.	.	.	2.53	.	.	F	0.90	3.29
															Asp	200	A	.	.	.	.	T	.	2.53	.	.	F	1.30	2.74
Glu	201	A	.	.	.	.	T	.	2.50	.	.	F	1.30	2.84
															Gly	202	A	.	.	.	.	T	.	2.50	.	.	F	1.30	1.62
Thr	203	A	.	.	.	.	T	.	2.50	.	.	F	1.30	1.68
															Glu	204	A	A	.	.	.	.	.	2.50	*	.	F	0.90	1.62
Gly	205	A	A	.	.	.	.	.	2.16	*	.	F	1.20	2.84
															Glu	206	A	A	.	.	.	.	.	1.94	*	.	F	1.50	1.95
Asp	207	.	A	.	.	T	.	.	2.29	*	.	F	2.20	1.74
															Glu	208	.	A	.	.	.	.	C	2.31	*	.	F	2.30	3.04
Gly	209	.	.	.	.	.	T	C	2.01	*	.	F	3.00	1.85
															Pro	210	.	.	.	.	T	T	.	2.14	.	.	F	2.60	1.48
Gln	211	.	.	.	.	T	T	.	2.14	.	.	F	2.30	1.32
															Trp	212	.	.	.	.	.	T	C	2.14	.	.	F	1.44	2.32
Ser	213	.	.	.	.	.	.	C	1.93	.	.	F	1.78	2.50
															Pro	214	.	.	.	.	T	T	.	1.69	.	.	F	2.12	2.23
Gln	215	.	.	.	.	.	T	C	1.09	.	.	F	1.56	2.15
															Asp	216	.	.	.	.	.	T	C	1.09	.	*	F	2.40	1.32
Pro	217	.	.	.	.	.	T	C	1.03	.	.	F	2.16	1.48
															Ala	218	.	.	.	.	T	.	.	0.48	.	.	F	1.77	0.85
Leu	219	.	.	B	.	.	.	.	0.34	*	.	F	0.53	0.38

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...    Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Gln	220	.	.	B	.	.	.	.	0.34	*	.	F	-0.01	0.24
Gly	221	.	.	B	.	.	T	.	0.13	*	*	F	-0.05	0.41
															Val	222	.	.	B	.	.	T	.	0.03	*	.	F	-0.05	0.77
Gly	223	.	.	B	.	.	T	.	0.28	*	.	F	0.25	0.64
															Gln	224	.	.	B	.	.	T	.	0.78	*	*	F	0.25	0.64
Pro	225	.	.	B	.	.	.	.	0.43	.	.	F	0.20	1.25
															Thr	226	.	.	.	.	T	.	.	0.48	.	*	F	0.60	1.25
Gly	227	.	.	.	.	.	T	C	0.44	*	*	F	0.45	0.97
															Thr	228	.	.	B	.	.	T	.	0.90	*	*	F	0.25	0.44
Gly	229	.	.	B	.	.	T	.	0.94	.	*	F	0.85	0.60
															Ser	230	.	.	B	.	.	T	.	1.20	.	*	F	1.30	1.20
Ile	231	.	A	B	.	.	.	.	1.62	.	*	F	0.90	1.67
															Arg	232	.	A	B	.	.	.	.	1.27	.	*	F	0.90	3.30
Lys	233	.	A	B	.	.	.	.	0.72	.	.	F	0.90	2.13
															Lys	234	.	A	B	B	.	.	.	0.77	.	.	F	0.90	2.26
Arg	235	.	A	B	B	.	.	.	0.77	.	.	F	0.90	1.55
															Phe	236	.	.	B	B	.	.	.	1.62	.	*	.	0.75	1.04
Val	237	.	.	B	B	.	.	.	1.62	.	*	.	0.30	0.71
															Ser	238	.	.	B	.	.	T	.	1.33	*	*	.	0.70	0.71
Ser	239	.	.	.	.	.	T	C	0.43	*	.	.	0.15	1.28
															His	240	.	.	.	.	.	T	C	0.32	*	*	.	0.45	1.28
Arg	241	.	.	.	.	.	T	C	0.71	*	.	.	1.05	1.65

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen.. Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...    Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Tyr	242	A	.	.	B	.	.	.	0.97	*	.	.	0.45	1.78
Val	243	A	.	.	B	.	.	.	0.46	*	.	.	0.45	1.29
															Glu	244	.	.	B	B	.	.	.	-0.10	*	.	.	-0.30	0.54
Thr	245	.	.	B	B	.	.	.	-0.66	*	.	.	-0.60	0.26
															Met	246	A	.	B	B	.	.	.	-0.77	*	.	.	-0.60	0.35
Leu	247	A	.	.	B	.	.	.	-0.52	.	.	.	0.30	0.34
															Val	248	A	.	.	B	.	.	.	0.03	.	.	.	-0.30	0.41
Ala	249	A	.	.	B	.	.	.	-0.57	.	.	.	-0.30	0.55
															Asp	250	A	.	.	.	.	T	.	-0.84	.	.	F	0.25	0.66
Gln	251	A	.	.	.	.	T	.	-0.24	.	.	F	0.25	0.90
															Ser	252	A	.	.	.	.	T	.	-0.13	.	.	F	1.30	1.54
Met	253	A	.	.	.	.	T	.	0.69	.	*	.	0.70	0.80
															Ala	254	A	.	.	.	.	.	.	0.93	.	*	.	-0.10	0.63
Glu	255	A	.	.	.	.	.	.	0.63	.	*	.	-0.10	0.46
															Phe	256	A	.	.	.	.	.	.	0.29	.	*	.	-0.10	0.63
His	257	A	.	.	.	.	T	.	-0.22	*	.	.	0.10	0.61
															Gly	258	A	.	.	.	.	T	.	0.42	*	.	F	0.25	0.29
Ser	259	A	.	.	.	.	T	.	0.98	*	*	F	0.25	0.68
															Gly	260	A	.	.	.	.	T	.	0.73	*	*	F	0.85	0.68
Leu	261	A	A	.	.	.	.	.	0.62	.	.	F	0.00	1.07
															Lys	262	A	A	.	.	.	.	.	-0.16	.	.	.	-0.60	0.66
His	263	.	A	B	.	.	.	.	-0.12	*	.	.	-0.60	0.55

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..   Alpha	Eisen..     Beta	Karpl...    Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Tyr	264	.	A	B	.	.	.	.	-0.63	*	.	.	-0.60	0.96
Leu	265	.	A	B	.	.	.	.	-0.99	*	.	.	-0.60	0.40
															Leu	266	.	A	B	.	.	.	.	-0.48	*	.	.	-0.60	0.25
Thr	267	.	A	B	.	.	.	.	-1.38	*	.	.	-0.60	0.22
															Leu	268	.	A	B	.	.	.	.	-1.93	*	.	.	-0.60	0.19
Phe	269	A	A	.	.	.	.	.	-2.28	*	*	.	-0.60	0.24
															Ser	270	A	A	.	.	.	.	.	-1.36	*	*	.	-0.60	0.17
Val	271	A	A	.	.	.	.	.	-1.36	*	*	.	-0.60	0.39
															Ala	272	A	A	.	.	.	.	.	-1.29	*	*	.	-0.60	0.38
Ala	273	A	A	.	.	.	.	.	-0.43	*	*	.	-0.60	0.44
															Arg	274	A	A	.	.	.	.	.	0.23	*	*	.	-0.15	1.18
Leu	275	A	A	.	.	.	.	.	0.32	*	*	.	0.45	1.59
															Tyr	276	.	.	.	.	T	.	.	0.88	*	*	.	1.39	2.44
Lys	277	.	.	B	.	.	.	.	0.58	*	*	F	1.48	1.67
															His	278	.	.	B	.	.	T	.	1.28	.	*	F	1.12	1.42
Pro	279	.	.	B	.	.	T	.	1.17	.	*	F	2.36	1.77
															Ser	280	.	.	.	.	T	T	.	1.68	.	*	F	3.40	1.43
Ile	281	.	.	B	.	.	T	.	1.07	.	*	F	2.36	1.41
															Arg	282	.	.	B	B	.	.	.	0.72	.	*	F	1.47	0.67
Asn	283	.	.	B	B	.	.	.	-0.06	*	*	F	1.13	0.67
															Ser	284	.	.	B	B	.	.	.	-0.70	*	*	F	0.19	0.79
Val	285	.	.	B	B	.	.	.	-1.26	*	*	.	-0.30	0.30

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..    Beta	Chou-...   Beta	Garni... Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen.. Alpha	Eisen..  Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Ser	286	.	.	B	B	.	.	.	-1.22	.	*	.	-0.60	0.14
Leu	287	.	.	B	B	.	.	.	-1.29	.	*	.	-0.60	0.08
															Val	288	.	.	B	B	.	.	.	-2.18	*	.	.	-0.60	0.21
Val	289	.	.	B	B	.	.	.	-2.69	.	*	.	-0.60	0.11
															Val	290	.	.	B	B	.	.	.	-2.69	.	.	.	-0.60	0.11
Lys	291	.	.	B	B	.	.	.	-3.28	.	.	.	-0.60	0.11
															Ile	292	.	.	B	B	.	.	.	-2.50	.	.	.	-0.60	0.10
Leu	293	.	.	B	B	.	.	.	-1.64	.	*	.	-0.60	0.19
															Val	294	.	.	B	B	.	.	.	-0.79	.	.	.	-0.30	0.16
Ile	295	.	.	B	B	.	.	.	0.07	.	*	.	0.00	0.39
															His	296	A	.	.	B	.	.	.	0.07	.	*	.	0.90	0.81
Asp	297	A	.	.	B	.	.	.	0.61	.	.	F	1.80	2.19
															Glu	298	A	.	.	.	.	.	.	1.21	*	.	F	2.30	3.09
Gln	299	.	.	.	.	T	.	.	2.07	*	.	F	3.00	3.51
															Lys	300	.	.	.	.	.	.	C	2.10	.	.	F	2.50	3.64
Gly	301	.	.	.	.	.	T	C	1.82	.	.	F	2.40	1.56
															Pro	302	.	.	.	.	.	T	C	1.52	.	.	F	2.10	1.30
Glu	303	.	.	B	.	.	T	.	1.52	*	.	F	1.45	0.87
															Val	304	A	.	.	.	.	T	.	0.93	*	.	F	1.00	1.42
Thr	305	A	.	.	.	.	T	.	0.30	.	*	F	0.85	0.93
															Ser	306	A	.	.	.	.	T	.	-0.17	.	*	F	0.85	0.54
Asn	307	A	.	.	.	.	T	.	-0.27	.	*	F	-0.05	0.60

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..  Beta	Karpl...      Flexi..	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Ala	308	A	.	.	.	.	T	.	-1.08	*	*	.	-0.20	0.60
Ala	309	A	.	.	.	.	.	.	-0.11	*	*	.	-0.40	0.37
															Leu	310	A	.	.	.	.	.	.	0.20	*	*	.	-0.10	0.45
Thr	311	.	.	B	.	.	.	.	-0.20	*	*	.	-0.10	0.72
															Leu	312	.	.	B	.	.	.	.	-0.87	*	*	.	-0.40	0.61
Arg	313	.	.	B	.	.	.	.	-0.28	*	*	.	-0.40	0.40
															Asn	314	.	.	.	.	T	.	.	0.02	*	*	.	0.30	0.44
Phe	315	.	.	.	.	T	T	.	0.83	*	*	.	0.20	0.57
															Cys	316	.	.	.	.	T	T	.	1.19	*	*	.	0.20	0.50
Asn	317	.	.	.	.	T	T	.	2.00	*	*	.	0.20	0.62
															Trp	318	.	.	.	.	T	T	.	1.86	*	.	.	0.35	1.25
Gln	319	.	.	.	.	T	.	.	1.86	.	.	.	0.45	3.16
															Lys	320	.	.	.	.	T	.	.	2.34	*	.	F	0.60	3.16
Gln	321	.	.	.	.	T	.	.	2.80	.	.	F	0.94	4.65
															His	322	.	.	.	.	.	.	C	2.50	*	.	F	1.68	4.15
Asn	323	.	.	.	.	.	.	C	2.79	*	.	F	2.02	2.78
															Pro	324	.	.	.	.	.	T	C	2.90	.	.	F	2.56	2.68
Pro	325	.	.	.	.	T	T	.	2.86	*	.	F	3.40	3.86
															Ser	326	.	.	.	.	.	T	C	2.27	.	.	F	2.86	4.01
Aso	327	.	.	.	.	.	T	C	2.30	.	.	F	2.52	2.62
															Arg	328	A	A	.	.	.	.	.	2.27	.	.	F	1.58	2.94
Asp	329	A	A	.	.	.	.	.	2.23	*	.	F	1.24	2.98

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..   Alpha	Eisen..     Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Ala	330	A	A	.	.	.	.	.	2.44	*	.	.	0.90	2.80
Glu	331	A	A	.	.	.	.	.	2.43	*	.	.	0.75	2.38
															His	332	A	.	.	.	.	T	.	1.84	*	.	.	1.15	2.06
Tyr	333	A	.	.	.	.	T	.	0.84	*	.	.	0.85	2.06
															Asp	334	A	.	.	.	.	T	.	0.03	.	.	.	0.70	0.83
Thr	335	A	.	.	.	.	T	.	-0.08	.	.	.	-0.20	0.51
															Ala	336	A	A	.	.	.	.	.	-0.39	*	.	.	-0.60	0.28
Ile	337	A	A	.	.	.	.	.	-0.24	*	.	.	-0.60	0.24
															Leu	338	.	A	B	.	.	.	.	0.00	.	.	.	-0.60	0.33
Phe	339	.	A	B	.	.	.	.	0.00	.	*	.	-0.60	0.56
															Thr	340	.	A	B	.	.	.	.	-0.50	.	.	F	0.00	1.34
Arg	341	.	A	B	.	.	.	.	-0.58	.	*	F	0.25	1.34
															Gln	342	.	A	.	.	T	.	.	-0.03	.	*	F	1.35	0.83
Asp	343	.	A	.	.	T	.	.	0.48	.	*	F	1.60	0.57
															Leu	344	.	A	.	.	T	.	.	1.18	*	.	F	2.15	0.39
Cys	345	.	.	.	.	T	T	.	1.18	.	*	F	2.50	0.39
															Gly	346	.	.	.	.	T	T	.	0.40	.	*	F	2.25	0.34
Ser	347	.	.	.	.	T	T	.	0.40	.	.	F	1.10	0.22
															Gln	348	.	.	B	.	.	T	.	0.09	.	.	F	1.35	0.68
Thr	349	.	.	B	.	.	.	.	0.09	.	.	F	0.90	0.99
															Cys	350	.	.	B	.	.	.	.	0.41	.	.	F	0.05	0.61
Asp	351	.	.	B	.	.	T	.	0.16	*	.	F	0.25	0.35

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...       Alpha	Garni..    Beta	Chou-...      Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Thr	352	.	.	B	.	.	T	.	-0.13	.	.	F	0.25	0.24
Leu	353	.	.	B	.	.	T	.	-0.13	.	.	.	0.10	0.45
															Gly	354	.	.	B	.	.	T	.	-0.68	.	.	.	0.70	0.45
Met	355	.	.	B	.	.	.	.	-0.36	.	.	.	-0.10	0.23
															Ala	356	.	.	B	.	.	.	.	-0.67	.	.	.	-0.10	0.28
Asp	357	.	.	B	.	.	T	.	-1.21	.	.	.	0.10	0.41
															Val	358	.	.	B	.	.	T	.	-1.07	.	.	.	0.10	0.30
Gly	359	.	.	B	.	.	T	.	-0.72	.	.	.	0.10	0.16
															Thr	360	.	.	B	.	.	T		-0.33	.	.	.	0.70	0.16
Val	361	.	.	B	.	.	.	.	-0.04	.	*	.	0.24	0.34
															Cys	362	.	.	B	.	.	.	.	0.07	*	.	.	1.18	0.46
Asp	363	.	.	B	.	.	T	.	0.62	*	.	F	1.87	0.62
															Pro	364	.	.	.	.	T	T	.	0.30	*	.	F	3.06	1.12
Ser	365	.	.	.	.	T	T	.	0.31	*	.	F	3.40	1.12
															Arg	366	.	.	.	.	T	T	.	0.31	*	.	F	2.91	0.90
Ser	367	.	.	.	B	T	.	.	0.09	*	.	F	1.87	0.43
															Cys	368	.	.	B	B	.	.	.	0.09	*	.	.	0.38	0.22
Ser	369	.	.	B	B	.	.	.	0.30	*	.	.	0.64	0.20
															Val	370	.	.	B	B	.	.	.	0.60	*	.	.	0.30	0.25
Ile	371	.	.	B	B	.	.	.	0.14	*	.	.	0.60	0.77
															Glu	372	.	.	B	B	.	.	.	-0.37	.	.	.	0.60	0.57
Asp	373	A	.	.	.	.	T	.	0.30	.	.	F	1.15	0.63

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...   Alpha	Garni.   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Asp	374	A	.	.	.	.	T	.	0.01	*	.	.	1.30	1.56
Gly	375	A	.	.	.	.	T	.	0.28	.	.	.	1.00	0.91
															Leu	376	A	.	.	.	.	T	.	0.47	*	.	.	0.70	0.55
Gln	377	A	A	.	.	.	.	.	0.16	.	.	.	-0.30	0.29
															Ala	378	A	A	.	.	.	.	.	-0.16	*	.	.	-0.60	0.42
Ala	379	A	A	.	.	.	.	.	-0.74	*	.	.	-0.60	0.73
															Phe	380	A	A	.	.	.	.	.	-0.43	*	.	.	-0.60	0.43
Thr	381	A	A	.	.	.	.	.	0.38	*	*	.	-0.60	0.57
															Thr	382	A	A	.	.	.	.	.	-0.43	*	.	.	-0.30	0.98
Ala	383	A	A	.	.	.	.	.	-0.19	*	.	.	-0.60	0.94
															His	384	A	A	.	.	.	.	.	0.37	*	.	.	-0.30	0.64
Glu	385	A	A	.	.	.	.	.	0.21	*	.	.	-0.30	0.61
															Leu	386	A	A	.	.	.	.	.	-0.18	*	.	.	-0.30	0.45
Gly	387	A	.	.	B	.	.	.	0.13	*	.	.	-0.60	0.28
															His	388	A	.	.	B	.	.	.	0.12	*	.	.	-0.60	0.26
Val	389	A	.	.	B	.	.	.	-0.06	*	.	.	-0.60	0.32
															Phe	390	A	.	.	B	.	.	.	-0.09	*	.	.	-0.60	0.49
Asn	391	.	.	B	B	.	.	.	0.72	*	.	.	-0.60	0.49
															Met	392	.	.	B	.	.	T	.	1.07	*	.	.	0.25	1.11
Pro	393	A	.	.	.	.	T	.	0.51	*	.	.	0.85	2.14
															His	394	.	.	.	.	T	T	.	1.41	*	.	F	1.70	1.34
Asp	395	A	.	.	.	.	T	.	2.11	*	.	F	1.30	2.72

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..  Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Asp	396	A	A	.	.	.	.	.	1.44	*	.	F	0.90	3.04
Ala	397	A	A	.	.	.	.	.	1.46	*	.	F	0.90	1.20
															Lys	398	A	A	.	.	.	.	.	1.37	*	*	F	0.75	0.73
Gln	399	A	A	.	.	.	.	.	0.59	.	*	.	0.60	0.58
															Cys	400	.	A	B	.	.	.	.	0.59	.	*	.	-0.30	0.48
Ala	401	.	A	B	.	.	.	.	0.24	.	*	.	0.30	0.38
															Ser	402	.	.	B	.	.	T	.	-0.02	.	*	.	0.10	0.22
Leu	403	.	.	B	.	.	T	.	-0.07	.	.	.	0.04	0.30
															Asn	404	.	.	.	.	T	T	.	-0.07	.	.	.	0.68	0.48
Gly	405	.	.	.	.	T	T	.	0.60	.	.	F	1.37	0.62
															Val	406	.	.	.	.	.	.	C	0.89	.	.	F	1.96	1.26
Asn	407	.	.	.	.	.	T	C	1.16	.	.	F	2.40	1.05
															Gln	408	A	.	.	.	.	T	.	1.37	*	.	F	1.96	1.44
Asp	409	A	.	.	.	.	T	.	0.77	*	.	F	1.72	1.92
															Ser	410	A	.	.	.	.	T	.	0.52	.	.	.	1.33	1.18
His	411	A	A	.	.	.	.	.	1.08	.	*	.	-0.06	0.69
															Met	412	A	A	.	.	.	.	.	0.48	.	.	.	0.30	0.55
Met	413	A	A	.	.	.	.	.	-0.33	.	.	.	-0.60	0.41
															Ala	414	A	A	.	.	.	.	.	-0.63	.	.	.	-0.60	0.25
Ser	415	A	A	.	.	.	.	.	-0.33	*	.	.	-0.60	0.34
															Met	416	A	A	.	.	.	.	.	-1.11	*	*	.	-0.60	0.55
Leu	417	A	.	.	.	.	T	.	-0.51	*	.	.	-0.20	0.45

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni...       Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...    Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Ser	418	A	.	.	.	.	T	.	0.06	*	.	.	0.38	0.56
Asn	419	A	.	.	.	.	T	.	0.34	.	.	.	0.66	0.76
															Leu	420	.	.	.	.	.	T	C	0.64	.	.	.	1.29	1.24
Asp	421	.	.	.	.	T	T	.	1.03	.	.	.	2.37	1.60
															His	422	.	.	.	.	T	T	.	1.56	.	.	F	2.80	1.54
Ser	423	.	.	.	.	.	T	C	1.56	.	.	F	1.72	1.97
															Gln	424	.	.	.	.	.	T	C	1.34	.	.	F	1.44	1.58
Pro	425	.	.	.	.	T	.	.	1.49	.	.	F	0.86	1.79
															Trp	426	.	.	.	.	T	.	.	1.19	.	.	F	0.43	0.72
Ser	427	.	.	.	.	.	T	C	0.63	.	.	F	0.15	0.55
															Pro	428	.	.	.	.	T	T	.	0.69	.	.	F	0.35	0.36
Cys	429	.	.	.	.	T	T	.	0.09	.	.	.	0.20	0.54
															Ser	430	.	.	B	.	.	T	.	-0.59	.	.	.	-0.20	0.40
Ala	431	.	.	B	B	.	.	.	-0.61	.	.	.	-0.60	0.18
															Tyr	432	.	.	B	B	.	.	.	-0.61	.	.	.	-0.60	0.49
Met	433	.	.	B	B	.	.	.	-1.10	.	.	.	-0.60	0.49
															Ile	434	.	.	B	B	.	.	.	-1.24	*	.	.	-0.60	0.42
Thr	435	.	.	B	B	.	.	.	-0.94	*	.	.	-0.60	0.22
															Ser	436	.	.	B	B	.	.	.	-0.36	*	.	.	-0.60	0.37
Phe	437	.	.	B	B	.	.	.	-0.46	*	.	.	-0.60	0.85
															Leu	438	.	.	B	.	.	T	.	0.11	*	.	F	0.56	0.58
Asp	439	.	.	.	.	T	T	.	0.66	*	.	F	1.27	0.59

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...       Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Asn	440	.	.	.	.	.	T	C	0.97	.	.	F	1.38	0.68
Gly	441	.	.	.	.	T	T	.	0.60	.	.	F	2.94	1.42
															His	442	.	.	.	.	T	T	.	0.49	.	.	F	3.10	0.46
Gly	443	A	.	.	.	.	T	.	0.70	.	.	F	1.49	0.23
															Glu	444	A	.	.	.	.	T	.	0.70	.	.	.	1.03	0.23
Cys	445	.	.	B	.	.	T	.	0.74	.	*	.	1.32	0.29
															Leu	446	.	A	B	.	.	.	.	0.88	.	.	.	1.25	0.58
Met	447	.	A	B	.	.	.	.	0.91	*	.	.	1.28	0.52
															Asp	448	.	A	.	.	T	.	.	1.26	*	.	F	2.02	1.67
Lys	449	.	A	.	.	.	.	C	1.04	*	.	F	2.16	3.26
															Pro	450	.	.	.	.	T	T	.	0.82	*	*	F	3.40	5.10
Gln	451	.	.	.	.	T	T	.	1.63	*	*	F	3.06	2.14
															Asn	452	.	.	B	.	.	T	.	1.42	*	*	F	2.02	1.85
Pro	453	.	.	B	.	.	T	.	1.21	*	*	F	0.63	0.99
															Ile	454	.	.	B	.	.	.	.	0.82	*	*	F	0.09	0.88
Gln	455	.	.	B	.	.	.	.	1.03	*	*	F	-0.25	0.54
															Leu	456	.	.	B	.	.	T	.	0.22	*	*	F	0.25	0.59
Pro	457	.	.	B	.	.	T	.	0.01	*	*	F	0.25	0.69
															Gly	458	.	.	B	.	.	T	.	-0.12	.	*	F	0.25	0.62
Asp	459	.	.	B	.	.	T	.	0.46	.	*	F	0.25	0.74
															Leu	460	.	.	.	.	.	T	C	0.16	.	*	F	1.05	0.69
Pro	461	.	.	B	.	.	T	.	0.72	.	*	F	0.85	0.93

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen..   Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Gly	462	.	.	B	.	.	T	.	0.93	.	.	F	0.25	0.88
Thr	463	.	.	B	.	.	T	.	0.69	.	*	F	0.74	1.78
															Ser	464	.	.	B	.	.	.	.	0.69	*	.	F	1.48	1.16
Tyr	465	.	.	.	.	T	.	.	1.61	*	.	F	2.22	1.88
															Asp	466	.	.	.	.	T	T	.	1.82	.	.	.	2.61	2.56
Ala	467	.	.	.	.	T	T	.	1.50	*	.	F	3.40	3.31
															Asn	468	.	.	.	.	T	T	.	1.81	.	*	F	2.76	1.13
Arg	469	.	.	B	.	.	T	.	1.41	.	*	F	2.32	1.17
															Gln	470	.	.	B	B	.	.	.	1.34	*	*	.	0.53	1.01
Cys	471	.	.	B	B	.	.	.	0.64	*	*	.	0.04	0.90
															Gln	472	.	.	B	B	.	.	.	0.89	.	.	.	-0.60	0.40
Phe	473	.	.	B	B	.	.	.	0.89	.	.	.	-0.26	0.23
															Thr	474	.	.	B	B	.	.	.	0.78	.	.	.	0.08	0.74
Phe	475	.	.	.	B	T	.	.	0.48	.	.	.	1.72	0.71
															Gly	476	.	.	.	.	T	T	.	1.19	.	*	F	2.76	1.10
Glu	477	.	.	.	.	T	T	.	1.16	.	*	F	3.40	1.52
															Asp	478	.	.	.	.	T	T	.	1.19	*	.	F	3.06	2.39
Ser	479	.	.	.	.	T	T	.	1.29	*	.	F	2.72	1.30
															Lys	480	.	.	.	.	T	.	.	1.99	*	.	F	2.43	1.16
His	481	.	.	.	.	T	.	.	1.74	*	.	F	2.34	1.16
															Cys	482	.	.	.	.	.	T	C	1.16	*	.	F	2.10	0.87
Pro	483	A	.	.	.	.	T	.	0.86	.	.	F	2.15	0.44

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..    Beta	Karpl... Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Asp	484	.	.	.	.	T	T	.	0.84	*	.	F	2.50	0.43
Ala	485	A	.	.	.	.	T	.	0.13	*	.	F	2.00	1.17
															Ala	486	A	.	.	.	.	.	.	-0.13	.	.	F	1.40	0 41
Ser	487	.	.	B	.	T	T	.	0.22	.	.	F	1.75	0.33
															Thr	488	.	.	B	.	.	T	.	-0.38	*	.	F	0.50	0.46
Cys	489	.	.	B	.	.	T	.	-0.67	*	.	F	-0.05	0.38
															Ser	490	.	.	B	.	.	T	.	-0.74	.	.	F	-0.05	0.30
Thr	491	.	.	B	B	.	.	.	-0.47	.	.	.	-0.60	0.11
															Leu	492	.	.	B	B	.	.	.	-0.51	.	.	.	-0.60	0.30
Trp	493	.	.	B	B	.	.	.	-0.51	.	.	.	-0.60	0.22
															Cys	494	.	.	B	B	.	.	.	-0.14	.	.	.	-0.60	0.22
Thr	495	.	.	B	B	T	.	.	-0.19	.	.	F	-0.05	0.36
															Gly	496	.	.	.	B	T	.	.	-0.22	.	.	F	-0.05	0.34
Thr	497	.	.	.	.	T	T	.	-0.27	.	.	F	0.65	0.62
															Ser	498	.	.	.	.	T	T	.	-0.79	.	.	F	0.65	0.32
Gly	499	.	.	.	.	T	T	.	-0.98	.	.	F	0.35	0.27
															Gly	500	.	.	.	.	T	T	.	-1.33	.	.	F	0.35	0.14
Val	501	.	.	B	B	.	.	.	-0.99	.	.	.	-0.60	0.05
															Leu	502	.	.	B	B	.	.	.	-0.99	.	.	.	-0.60	0.10
Val	503	.	.	B	B	.	.	.	-0.64	.	.	.	-0.60	0.14
															Cys	504	.	.	B	.	.	T	.	-0.33	.	.	.	-0.20	0.38
Gln	505	.	.	B	.	.	T	.	-0.69	.	.	.	0.10	0.62

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..    Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..   Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Thr	506	.	.	B	.	.	T	.	-0.04	.	.	F	0.25	0.72
Lys	507	.	.	B	.	.	T	.	0.48	.	.	F	0.40	2 09
															His	508	.	.	.	.	.	.	C	0.74	.	.	.	-0.05	1.27
Phe	509	.	.	B	.	.	.	.	1.41	.	.	.	-0.40	0.89
															Pro	510	.	.	.	.	T	.	.	1.07	.	.	.	0.30	0.74
Trp	511	.	.	.	.	T	T	.	1.07	.	.	.	0.20	0.54
															Ala	512	.	.	.	.	T	T	.	0.72	.	.	.	0.51	0.90
Asp	513	.	.	.	.	T	T	.	0.09	.	.	F	1.27	0.78
															Gly	514	.	.	.	.	T	T	.	0.44	.	.	F	1.58	0.40
Thr	515	.	.	.	.	T	T	.	0.66	.	.	F	2.49	0.39
															Ser	516	.	.	.	.	T	T	.	0.60	.	*	F	3.10	0.40
Cys	517	.	.	.	.	T	T	.	1.23	.	*	F	2.49	0.40
															Gly	518	.	.	.	.	T	T	.	0.94	.	*	F	2.48	0.56
Glu	519	.	.	.	.	T	.	.	0.62	.	*	F	1.67	0.44
															Gly	520	.	.	.	.	T	.	.	0.04	.	*	F	1.36	0.44
Lys	521	.	.	.	.	T	.	.	0.34	.	*	F	0.45	0.31
															Trp	522	.	.	.	.	T	.	.	0.67	.	*	.	0.90	0.29
Cys	523	.	.	B	.	.	T	.	1.06	.	*	.	-0.20	0.29
															Ile	524	.	.	B	.	.	T	.	0.39	.	*	.	0.70	0.29
Asn	525	.	.	.	.	T	T	.	-0.12	.	*	.	0.20	0.15
															Gly	526	.	.	.	.	T	T	.	-0.17	*	*	F	0.65	0.20
Lys	527	.	.	.	.	T	.	.	0.17	*	*	F	0.45	0.47

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..     Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen.. Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Cys	528	.	.	.	.	T	T	.	0.52	.	*	.	1.40	0.58
Val	529	.	.	B	.	.	T	.	1.41	*	*	.	1.04	0.85
															Asn	530	.	.	B	.	.	T	.	1.52	*	.	F	1.83	0.71
Lys	531	.	.	B	.	.	T	.	1.91	*	.	F	2.32	2.58
															Thr	532	.	.	B	.	.	T	.	1.83	*	.	F	2.66	6.96
Asp	533	.	.	.	.	T	T	.	1.80	*	.	F	3.40	5.89
															Arg	534	.	.	.	.	T	T	.	2.66	*	.	F	3.06	2.55
Lys	535	.	.	B	.	.	T	.	2.34	*	.	F	2.32	2.95
															His	536	.	.	B	.	.	.	.	2.09	*	.	F	1.78	2.55
Phe	537	.	.	B	.	.	.	.	1.70	*	.	F	1.44	2.01
															Asp	538	.	.	B	.	.	.	.	1.67	*	.	F	0.65	0.87
Thr	539	.	.	B	.	.	.	.	1.21	*	.	F	-0.25	0.87
															Pro	540	.	.	.	.	.	.	C	0.87	*	*	F	-0.05	1.00
Phe	541	.	.	.	.	T	.	.	0.61	.	*	F	0.45	0.80
															His	542	.	.	.	.	T	T	.	0.97	.	*	.	0.20	0.58
Gly	543	.	.	.	.	T	T	.	0.37	.	*	.	0.20	0.37
															Ser	544	.	.	.	.	T	T	.	0.39	.	*	.	0.20	0.43
Trp	545	.	.	.	.	T	T	.	0.26	.	*	.	0.20	0.33
															Gly	546	.	.	.	.	.	.	C	0.74	.	*	.	-0.20	0.33
Met	547	.	.	.	.	T	.	.	0.49	.	.	.	0.00	0.38
															Trp	548	.	.	.	.	T	.	.	0.49	.	.	.	0.00	0.38
Gly	549	.	.	.	.	.	T	C	0.79	.	.	.	0.00	0.38

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..    Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..   Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Pro	550	.	.	.	.	T	T	.	0.41	.	.	F	0.35	0.64
Trp	551	.	.	.	.	T	T	.	0.46	*	.	F	0.66	0.33
															Gly	552	.	.	.	.	T	T	.	1.17	*	.	F	1.27	0.44
Asp	553	.	.	.	.	T	.	.	1.14	*	.	F	1.98	0.56
															Cys	554	.	.	.	.	T	T	.	0.82	*	.	F	2.49	0.77
Ser	555	.	.	.	.	T	T	.	0.69	*	.	F	3.10	0.42
															Arg	556	.	.	.	.	T	T	.	0.63	*	.	F	2.79	0.25
Thr	557	.	.	.	.	T	T	.	0.63	*	.	F	2.18	0.46
															Cys	558	.	.	.	.	T	T	.	-0.22	*	.	F	1.87	0.34
Gly	559	.	.	.	.	T	T	.	0.44	*	.	F	1.56	0.13
															Gly	560	.	.	.	.	T	T	.	0.50	*	.	F	0.65	0.15
Gly	561	.	.	.	.	T	T	.	0.08	*	*	F	0.35	0.45
															Val	562	.	.	B	B	.	.	.	-0.21	*	*	.	-0.60	0.65
Gln	563	.	.	B	B	.	.	.	0.57	*	*	.	-0.60	0.65
															Tyr	564	.	.	B	B	.	.	.	0.91	*	*	.	-0.15	1.29
Thr	565	.	.	B	B	.	.	.	0.59	*	*	.	0.79	3.01
															Met	566	.	.	B	B	.	.	.	0.93	*	*	.	0.98	0.93
Arg	567	.	.	B	B	.	.	.	1.79	*	*	.	1.62	0.99
															Glu	568	.	.	.	.	T	.	.	1.58	*	*	F	2.86	1.11
Cys	569	.	.	.	.	T	T	.	0.97	*	.	F	3.40	1.73
															Asp	570	.	.	.	.	T	T	.	1.07	*	.	F	2.91	0.66

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Asn	571	.	.	.	.	.	T	C	1.71	*	.	F	2.37	0.59
Pro	572	.	.	.	.	.	T	C	1.60	*	.	F	2.52	2.18
															Val	573	.	.	.	.	.	.	C	1.26	*	.	F	2.32	2.10
Pro	574	.	.	.	.	T	T	.	1.58	*	.	F	2.42	1.29
															Lys	575	.	.	.	.	T	T	.	1.62	*	.	F	2.61	0.83
Asn	576	.	.	.	.	T	T	.	1.38	*	.	F	3.40	2.23
															Gly	577	.	.	.	.	T	T	.	0.92	*	.	F	3.06	2.26
Gly	578	.	.	.	.	T	T	.	1.78	*	.	F	2.27	0.61
															Lys	579	.	.	B	.	.	T	.	1.64	.	.	F	1.53	0.65
Tyr	580	.	.	B	.	.	T	.	1.64	.	.	F	1.19	0.65
															Cys	581	.	.	B	.	.	T	.	1.76	.	.	F	1.30	1.32
Glu	582	.	.	B	.	.	.	.	1.24	.	*	F	1.10	1.29
															Gly	583	.	.	B	B	.	.	.	1.70	.	*	F	0.75	0.61
Lys	584	.	.	B	B	.	.	.	1.41	.	*	F	0.90	2.24
															Arg	585	.	.	B	B	.	.	.	1.77	.	*	F	1.15	2.02
Tyr	586	.	.	B	B	.	.	.	2.13	.	*	.	1.25	4.01
															Arg	587	.	.	B	B	.	.	.	1.47	*	*	.	1.50	2.68
Tyr	588	.	.	B	.	.	T	.	1.81	*	*	.	2.00	0.73
															Arg	589	.	.	.	.	T	T	.	0.96	*	*	.	2.50	1.59
Ser	590	.	.	.	.	T	T	.	0.84	*	*	.	2.10	0.67
															Cys	591	.	.	.	.	T	T	.	1.70	.	*	.	1.85	0.74
Asn	592	.	A	.	.	T	.	.	0.92	.	*	.	1.50	0.63

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen.. Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...    Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Leu	593	.	A	B	.	.	.	.	0.96	.	.	.	0.89	0.25
Glu	594	.	A	B	.	.	.	.	0.84	.	.	F	1.13	0.73
															Asp	595	.	A	.	.	T	.	.	1.17	.	.	F	2.17	0.76
Cys	596	.	.	B	.	.	T	.	1.81	.	.	F	2.66	1.48
															Pro	597	.	.	.	.	T	T	.	1.47	*	*	F	3.40	1.37
Asp	598	.	.	.	.	T	T	.	2.32	*	*	F	2.91	0.81
															Asn	599	.	.	.	.	T	T	.	2.01	*	.	F	3.02	3.03
Asn	600	.	.	.	.	T	T	.	1.31	*	.	F	2.98	2.83
															Gly	601	.	.	.	.	T	T	.	2.09	*	.	F	2.94	1.47
Lys	602	.	.	.	.	.	T	C	2.30	*	*	F	2.70	1.79
															Thr	603	.	.	.	.	.	T	C	2.30	*	.	F	3.00	1.92
Phe	604	A	A	.	.	.	.	.	2.30	*	.	F	2.10	3.37
															Arg	605	A	A	.	.	.	.	.	1.63	*	.	F	1.80	2.91
Glu	606	A	A	.	.	.	.	.	1.98	*	.	F	1.50	1.08
															Glu	607	A	A	.	.	.	.	.	1.34	*	.	F	1.20	2.17
Gln	608	A	A	.	.	.	.	.	1.62	*	.	F	0.90	1.12
															Cys	609	A	A	.	.	.	.	.	2.32	*	*	.	0.60	0.88
Glu	610	A	A	.	.	.	.	.	2.21	.	*	.	0.60	0.81
															Ala	611	A	A	.	.	.	.	.	1.51	.	*	.	0.60	0.81
His	612	A	A	.	.	.	.	.	1.21	*	.	.	0.45	1.32
															Asn	613	A	A	.	.	.	.	.	1.26	*	*	.	0.45	1.02
Glu	614	A	A	.	.	.	.	.	1.33	*	.	.	0.45	2.02

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-... Alpha	Garni..     Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...      Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Phe	615	A	A	.	.	.	.	.	1.03	*	*	F	0.60	1.50
Ser	616	A	A	.	.	.	.	.	0.92	.	.	F	0.90	1.25
															Lys	617	A	A	.	.	.	.	.	0.61	.	.	F	0.45	0.62
Ala	618	.	A	.	.	T	.	.	0.31	.	.	F	0.25	0.71
															Ser	619	.	A	.	.	T	.	.	-0.03	.	.	F	0.85	0.71
Phe	620	.	.	.	.	T	.	.	0.46	.	.	F	1.26	0.35
															Gly	621	.	.	.	.	T	T	.	0.17	.	.	F	1.07	0.54
Ser	622	.	.	.	.	.	T	C	-0.73	.	*	F	1.08	0.41
															Gly	623	.	.	.	.	.	T	C	-0.14	.	.	F	0.99	0.35
Pro	624	.	.	.	.	.	T	C	-0.13	.	.	F	2.10	0.61
															Ala	625	.	A	.	.	.	.	C	-0.32	.	.	F	0.89	0.48
Val	626	.	A	B	.	.	.	.	-0.19	*	.	.	0.03	0.34
															Glu	627	.	A	B	.	.	.	.	0.16	*	.	.	-0.18	0.34
Trp	628	.	A	B	.	.	.	.	0.26	*	.	.	-0.09	0.67
															Ile	629	.	.	B	.	.	.	.	-0.12	*	.	.	-0.25	1.42
Pro	630	.	.	B	.	.	T	.	0.12	*	.	.	0.10	0.83
															Lys	631	.	.	.	.	T	T	.	0.12	*	.	.	0.20	0.78
Tyr	632	.	.	.	.	T	T	.	-0.18	*	.	.	0.20	0.82
															Ala	633	.	.	.	.	T	T	.	-0.10	*	.	.	0.84	0.71
Gly	634	.	.	.	.	T	.	.	0.83	*	.	.	0.98	0.55
															Val	635	.	.	B	.	.	.	.	1.04	.	*	.	0.92	0.70
Ser	636	.	.	B	.	.	T	.	1.11	.	*	F	2.66	1.17

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..   Beta	Chou-...  Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..   Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Pro	637	.	.	.	.	T	T	.	0.69	.	*	F	3.40	2.31
Lys	638	.	.	.	.	T	T	.	1.32	.	*	F	3.06	1.67
															Asp	639	.	.	.	.	T	T	.	0.86	.	*	F	2.72	2.49
Arg	640	A	A	.	.	.	.	.	0.82	.	*	F	1.58	1.33
															Cys	641	A	A	.	.	.	.	.	0.46	*	*	F	1.09	0.46
Lys	642	.	A	B	.	.	.	.	0.67	*	*	.	0.30	0.15
															Leu	643	.	A	B	.	.	.	.	0.03	.	*	.	0.30	0.13
Ile	644	.	A	B	.	.	.	.	0.08	.	*	.	-0.60	0.25
															Cys	645	.	A	B	.	.	.	.	-0.38	.	*	.	0.30	0.25
Gln	646	.	A	B	.	.	.	.	-0.60	*	*	.	-0.30	0.30
															Ala	647	.	A	B	.	.	.	.	-0.99	*	*	.	-0.30	0.30
Lys	648	.	A	B	.	.	.	.	-0.42	*	*	F	-0.15	0.55
															Gly	649	.	.	.	.	T	T	.	-0.23	*	.	F	0.65	0.50
Ile	650	.	.	.	.	T	T	.	-0.27	.	*	.	0.20	0.43
															Gly	651	.	.	B	.	.	T	.	-1.12	.	*	.	-0.20	0.18
Tyr	652	.	.	B	.	.	T	.	-1.34	.	.	.	-0.20	0.14
															Phe	653	.	.	B	B	.	.	.	-1.39	.	.	.	-0.60	0.16
Phe	654	.	.	B	B	.	.	.	-1.26	.	*	.	-0.60	0.29
															Val	655	.	.	B	B	.	.	.	-0.32	.	*	.	-0.60	0.28
Leu	656	.	.	B	B	.	.	.	-0.83	.	*	.	-0.60	0.65
															Gln	657	.	.	B	.	.	T	.	-1.44	.	.	.	-0.20	0.56
Pro	658	.	.	B	.	.	T	.	-0.74	*	.	F	-0.05	0.56

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-... Alpha	Garni..  Beya	Chou-...  Beya	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen.. Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Lys	659	.	.	.	.	T	T	.	-0.39	.	*	F	1.40	1.13
Val	660	.	.	B	.	.	T	.	0.16	.	.	F	0.85	0.65
															Val	661	.	.	B	.	.	T	.	0.76	.	*	F	0.85	0.60
Asp	662	.	.	B	.	.	T	.	0.09	.	.	F	1.06	0.47
															Gly	663	.	.	B	.	.	T	.	0.00	*	.	F	0.67	0.34
Thr	664	.	.	B	.	.	T	.	-0.26	*	.	F	1.48	0.61
															Pro	665	.	.	B	.	.	.	.	0.60	.	.	F	1.49	0.56
Cys	666	.	.	.	.	T	.	.	1.16	.	.	F	2.10	0.95
															Ser	667	.	.	.	.	.	T	C	0.84	.	.	F	1.89	0.88
Pro	668	.	.	.	.	T	T	.	0.89	.	.	F	1.88	0.82
															Asp	669	.	.	.	.	T	T	.	0.34	.	.	F	1.82	2.06
Ser	670	.	.	.	.	T	T	.	-0.11	.	.	F	1.61	1.14
															Thr	671	.	.	.	B	T	.	.	-0.30	.	*	F	0.85	0.39
Ser	672	.	.	B	B	.	.	.	0.00	.	*	F	-0.15	0.18
															Val	673	.	.	B	B	.	.	.	-0.13	.	*	.	-0.60	0.23
Cys	674	.	.	B	B	.	.	.	-0.13	.	*	.	-0.60	0.16
															Val	675	.	.	B	B	.	.	.	-0.50	.	*	.	-0.60	0.20
Gln	676	.	.	B	B	.	.	.	-1.04	.	*	F	-0.45	0.15
															Gly	677	.	.	B	B	.	.	.	-0.70	.	*	F	-0.45	0.20
Gln	678	.	.	B	B	.	.	.	-0.43	.	*	F	-0.15	0.54
															Cys	679	.	.	B	B	.	.	.	-0.11	.	.	.	0.30	0.32
Val	680	.	.	B	B	.	.	.	0.08	*	*	.	0.30	0.32

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-... Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Lys	681	.	.	B	.	.	T	.	0.08	*	.	.	0.10	0.10
Ala	682	.	.	B	.	.	T	.	0.53	*	.	.	0.70	0.30
															Gly	683	.	.	B	.	.	T	.	-0.36	*	.	.	1.00	0.80
Cys	684	.	.	B	.	.	T	.	-0.58	*	.	.	1.00	0.28
															Asp	685	A	.	.	B	.	.	.	0.28	*	.	.	0.30	0.20
Arg	686	A	.	.	B	.	.	.	-0.07	*	.	.	0.60	0.33
															Ile	687	A	.	.	B	.	.	.	0.57	*	.	.	0.60	0.82
Ile	688	A	.	.	B	.	.	.	0.96	*	.	F	0.75	0.99
															Asp	689	A	.	.	.	.	T	.	1.67	*	*	F	1.30	1.01
Ser	690	A	.	.	.	.	T	.	0.97	*	*	F	1.30	2.88
															Lys	691	A	.	.	.	.	T	.	0.86	*	.	F	1.61	3.55
Lys	692	.	.	.	.	T	T	.	1.79	*	*	F	2.32	3.55
															Lys	693	.	.	.	.	T	.	.	2.01	*	*	F	2.43	5.30
Phe	694	.	.	.	.	T	.	.	1.67	*	*	F	2.74	1.42
															Asp	695	.	.	.	.	T	T	.	1.11	*	.	F	3.10	0.70
Lys	696	.	.	B	.	.	T	.	0.40	*	.	F	2.39	0.26
															Cys	697	.	.	B	.	.	T	.	0.01	*	.	.	1.63	0.16
Gly	698	.	.	B	.	.	T	.	-0.38	*	.	.	1.32	0.10
															Val	699	.	.	B	.	.	.	.	0.32	*	.	.	0.21	0.05
Cys	700	.	.	.	.	T	.	.	-0.02	.	.	.	0.00	0.14
															Gly	701	.	.	.	.	T	T	.	-0.37	.	.	F	0.65	0.14
Gly	702	.	.	.	.	T	T	.	-0.01	.	.	F	0.65	0.26

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-... Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Asn	703	.	.	.	.	T	T	.	-0.33	.	.	F	0.65	0.69
Gly	704	.	.	.	.	T	T	.	0.57	.	.	F	0.65	0.37
															Ser	705	.	.	.	.	T	T	.	1.28	.	.	F	1.25	0.76
Thr	706	.	.	B	.	.	T	.	0.73	.	.	F	1.41	0 94
															Cys	707	.	.	B	.	.	T	.	0.78	.	*	F	1.37	0.67
Lys	708	.	.	B	.	.	T	.	0.43	.	*	F	1.63	0.67
															Lys	709	.	.	B	.	.	.	.	0.48	*	*	F	1.69	0.46
Ile	710	.	.	B	.	.	T	.	-0.08	*	*	F	2.60	1.14
															Ser	711	.	.	B	.	.	T	.	-0.08	*	*	F	1.89	0.42
Gly	712	.	.	B	.	.	T	.	0.29	*	*	F	1.03	0.31
															Ser	713	.	.	B	.	.	T	.	-0.34	*	*	F	0.77	0 58
Val	714	.	.	B	B	.	.	.	-0.34	.	*	F	0.11	0.44
															Thr	715	.	.	B	B	.	.	.	0.33	.	.	F	0.73	0.89
Ser	716	.	.	B	B	.	.	.	0.29	.	.	F	1.16	1.03
															Ala	717	.	.	B	.	.	.	.	0.39	.	.	F	1.64	1.37
Lys	718	.	.	.	.	.	T	C	0.66	.	.	F	2.32	1.49
															Pro	719	.	.	.	.	T	T	.	1.51	*	.	F	2.80	1.51
Gly	720	.	.	.	.	T	T	.	0.93	*	.	F	2.52	2.50
															Tyr	721	.	.	B	.	.	T	.	0.34	*	.	.	1.54	0.88
His	722	.	.	B	B	.	.	.	0.62	*	.	.	-0.04	0.40
															Asp	723	.	.	B	B	.	.	.	-0.31	*	.	.	-0.32	0.58
Ile	724	.	.	B	B	.	.	.	-0.31	*	.	.	-0.60	0.26

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...  Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Ile	725	.	.	B	B	.	.	.	-0.28	*	.	.	-0.60	0.29
Thr	726	.	.	B	B	.	.	.	-0.38	*	.	.	-0.60	0.25
															Ile	727	.	.	B	.	.	T	.	-0.93	*	.	.	-0.20	0.36
Pro	728	.	.	B	.	.	T	.	-1.24	*	.	F	-0.05	0.52
															Thr	729	.	.	.	.	.	T	C	-0.36	*	.	F	0.15	0.52
Gly	730	.	.	.	.	.	T	C	-0.36	.	*	F	0.30	1.19
															Ala	731	.	.	.	B	.	.	C	-0.04	.	*	F	-0.25	0.54
Thr	732	.	.	.	B	.	.	C	-0.01	.	*	F	0.65	0.65
															Asn	733	.	.	B	B	.	.	.	0.24	.	*	F	-0.15	0.48
Ile	734	.	.	B	B	.	.	.	0.56	.	*	F	0.45	0.96
															Glu	735	.	.	B	B	.	.	.	1.01	.	*	F	0.60	1.15
Val	736	.	.	B	B	.	.	.	1.60	.	*	F	0.90	1.40
															Lys	737	.	.	B	B	.	.	.	1.91	.	*	F	1.24	3.21
Gln	738	.	.	B	.	.	.	.	2.02	.	*	F	1.78	3.21
															Arg	739	.	.	B	.	.	.	.	2.57	*	*	F	2.12	8.48
Asn	740	.	.	B	.	.	T	.	2.27	*	*	F	2.66	4.20
															Gln	741	.	.	.	.	T	T	.	3.23	*	*	F	3.40	3.25
Arg	742	.	.	.	.	T	T	.	3.19	*	.	F	3.06	3.25
															Gly	743	.	.	.	.	T	T	.	3.19	*	.	F	3.00	3.25
Ser	744	.	.	.	.	T	.	.	2.73	*	.	F	2.74	3.02
															Arg	745	.	.	.	.	.	.	C	2.43	*	*	F	2.48	1.52
Asn	746	.	.	.	.	T	T	.	1.73	*	.	F	2.82	2.06

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Asn	747	.	.	.	.	T	T	.	0.81	*	.	F	2.80	1.33
Gly	748	.	.	.	.	.	T	C	0.57	.	*	F	1.57	0.56
															Ser	749	.	.	B	.	.	T	.	-0.02	.	*	F	0.79	0.35
Phe	750	.	A	B	.	.	.	.	-0.09	.	*	.	-0.04	0.15
															Leu	751	.	A	B	.	.	.	.	-0.68	.	.	.	-0.32	0.31
Ala	752	.	A	B	.	.	.	.	-1.27	*	.	.	-0.60	0.23
															Ile	753	.	A	B	.	.	.	.	-0.92	.	.	.	-0.60	0.27
Lys	754	A	A	.	.	.	.	.	-0.97	.	.	.	0.30	0.55
															Ala	755	A	A	.	.	.	.	.	-0.58	.	.	.	0.30	0.54
Ala	756	A	A	.	.	.	.	.	-0.01	.	.	F	0.60	1.12
															Asp	757	A	.	.	.	.	T	.	-0.31	.	.	F	0.85	0.87
Gly	758	.	.	B	.	.	T	.	-0.23	.	*	F	0.25	0.61
															Thr	759	.	.	B	.	.	T	.	-0.28	.	.	F	-0.05	0.50
Tyr	760	.	.	B	.	.	T	.	-0.03	.	*	.	-0.20	0.48
															Ile	761	.	.	B	.	.	.	.	0.56	.	*	.	-0.40	0.48
Leu	762	.	.	B	.	.	.	.	0.31	.	*	.	-0.40	0.55
															Asn	763	.	.	B	.	.	T	.	0.34	.	*	F	-0.50	0.55
Gly	764	.	.	.	.	T	T	.	-0.16	.	*	F	0.50	1.14
															Asp	765	.	.	.	.	T	T	.	-0.21	.	*	F	0.50	1.14
Tyr	766	.	.	.	.	.	T	C	0.37	.	*	F	0.45	0.95
															Thr	767	.	.	B	B	.	.	.	0.37	.	*	.	-0.15	1.38
Leu	768	.	.	B	B	.	.	.	0.37	*	*	.	-0.60	0.68

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...    Turn	Chou-...    Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Ser	769	.	.	B	B	.	.	.	0.71	*	.	F	-0.45	0.75
Thr	770	.	.	B	B	.	.	.	0.71	*	*	F	-0.15	0.90
															Leu	771	A	.	.	B	.	.	.	0.07	*	.	F	0.60	1.83
Glu	772	A	.	.	B	.	.	.	-0.22	*	.	F	0.45	0.96
															Gln	773	A	.	.	B	.	.	.	0.34	*	*	F	0.45	0.66
Asp	774	A	.	.	B	.	.	.	0.69	.	*	F	0.00	1.25
															Ile	775	A	.	.	B	.	.	.	0.66	.	*	.	0.75	1.44
Met	776	A	.	.	B	.	.	.	0.61	.	*	.	0.30	0.82
															Tyr	777	.	.	B	B	.	.	.	-0.24	.	*	.	-0.30	0.37
Lys	778	.	.	B	B	.	.	.	-1.06	.	*	.	-0.60	0.39
															Gly	779	.	.	B	B	.	.	.	-0.94	.	*	.	-0.60	0.32
Val	780	.	.	B	B	.	.	.	-0.30	.	*	.	-0.30	0.40
															Val	781	.	.	B	B	.	.	.	0.00	.	*	.	-0.30	0.32
Leu	782	.	.	B	B	.	.	.	-0.10	.	*	.	-0.60	0.43
															Arg	783	.	.	B	B	.	.	.	-0.44	.	*	.	-0.60	0.57
Tyr	784	.	.	B	.	.	T	.	-0.40	.	*	.	0.25	1.03
															Ser	785	.	.	.	.	T	T	.	-0.13	.	*	F	0.80	1.68
Gly	786	.	.	.	.	.	T	C	0.13	.	*	F	1.05	0.86
															Ser	787	.	.	.	.	.	T	C	0.13	.	*	F	0.45	0.56
Ser	788	.	A	.	.	.	.	C	0.02	*	*	F	0.05	0.34
															Ala	789	A	A	.	.	.	.	.	0.38	.	*	F	0.45	0.60
Ala	790	A	A	.	.	.	.	.	-0.21	*	*	.	0.60	0.88

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...      Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..  Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Leu	791	A	A	.	.	.	.	.	0.24	*	*	.	0.30	0.46
Glu	792	A	A	.	.	.	.	.	0.24	*	*	.	0.60	0.89
															Arg	793	.	A	B	B	.	.	.	-0.16	*	*	F	0.90	1.18
Ile	794	A	A	.	B	.	.	.	0.13	*	*	F	0.60	1.24
															Arg	795	A	A	.	B	.	.	.	0.51	*	*	F	0.75	0.96
Ser	796	.	A	.	.	T	.	.	0.51	.	*	F	1.13	0.76
															Phe	797	.	.	.	.	.	.	C	0.56	.	*	F	0.81	0.89
Ser	798	.	.	.	.	.	T	C	0.44	.	*	F	1.89	0.91
															Pro	799	.	.	.	.	.	T	C	1.12	*	*	F	2.32	1.17
Leu	800	.	.	.	.	T	T	.	0.20	*	*	F	2.80	2.10
															Lys	801	.	.	.	.	.	T	C	0.19	*	*	F	2.32	1.29
Glu	802	.	.	.	.	.	.	C	0.00	.	*	F	1.84	1.20
															Pro	803	A	.	.	B	.	.	.	0.30	.	*	F	1.16	1.02
Leu	804	A	.	.	B	.	.	.	-0.34	.	*	F	0.73	0.89
															Thr	805	.	.	B	B	.	.	.	-0.34	.	*	.	-0.30	0.38
Ile	806	.	.	B	B	.	.	.	-0.70	.	*	.	-0.60	0.20
															Gln	807	.	.	B	B	.	.	.	-1.56	.	*	.	-0.60	0.35
Val	808	.	.	B	B	.	.	.	-1.69	.	*	.	-0.60	0.18
															Leu	809	.	.	B	B	.	.	.	-0.88	.	*	.	-0.60	0.26
Thr	810	.	.	B	B	.	.	.	-1.16	.	.	.	-0.60	0.24
															Val	811	.	.	B	B	.	.	.	-1.08	.	*	.	-0.60	0.33
Gly	812	.	.	B	B	.	.	.	-0.97	*	*	.	-0.60	0.33

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni... Turn	Chou-...  Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Asn	813	A	.	.	.	.	.	.	-0.32	*	*	.	0.12	0.44
Ala	814	A	.	.	.	.	.	.	0.53	*	*	.	0.34	0.92
															Leu	815	A	.	.	.	.	.	.	-0.04	*	*	F	1.76	1.86
Arg	816	.	.	B	.	.	.	.	0.86	*	*	F	1.53	0.81
															Pro	817	.	.	B	.	.	.	.	0.96	*	*	F	2.20	1.61
Lys	818	.	.	B	B	.	.	.	0.64	*	*	F	1.48	3.05
															Ile	819	.	.	B	B	.	.	.	0.99	.	*	F	1.56	2.25
Lys	820	.	.	B	B	.	.	.	1.10	*	*	F	0.44	2.28
															Tyr	821	.	.	B	B	.	.	.	0.13	*	*	.	-0.38	0.99
Thr	822	.	.	B	B	.	.	.	0.39	.	*	.	-0.45	1.04
															Tyr	823	A	.	.	B	.	.	.	0.39	.	*	.	-0.45	1.04
Phe	824	A	.	.	B	.	.	.	1.32	.	*	.	-0.45	1.33
															Val	825	A	.	.	B	.	.	.	1.32	.	.	.	0.45	1.85
Lys	826	A	.	.	B	.	.	.	1.57	.	.	F	0.90	2.36
															Lys	827	A	A	.	.	.	.	.	1.58	*	.	F	0.90	4.71
Lys	828	A	A	.	.	.	.	.	1.12	*	.	F	0.90	8.51
															Lys	829	A	A	.	.	.	.	.	1.82	*	.	F	0.90	3.68
Glu	830	A	A	.	.	.	.	.	2.09	*	.	F	0.90	2.96
															Ser	831	A	A	.	.	.	.	.	1.16	*	.	F	0.90	1.50
Phe	832	A	A	.	.	.	.	.	0.90	.	.	.	0.30	0.52
															Asn	833	.	A	B	.	.	.	.	0.54	*	.	.	-0.30	0.47
Ala	834	.	.	B	.	.	.	.	-0.20	*	*	.	-0.40	0.50

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...      Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...      Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Ile	835	.	.	.	.	.	.	C	-0.50	*	.	.	-0.20	0.50
Pro	836	.	.	.	.	.	T	C	-0.79	.	.	.	0.00	0.42
															Thr	837	.	.	.	.	T	T	.	-0.38	*	*	.	0.20	0.42
Phe	838	A	.	.	.	.	T	.	-1.23	*	.	.	-0.20	0.63
															Ser	839	.	.	.	.	.	T	C	-1.53	*	.	.	0.00	0.30
Ala	840	.	A	B	B	.	.	.	-0.64	.	.	.	-0.60	0.15
															Trp	841	.	A	B	B	.	.	.	-0.43	*	.	.	-0.60	0.29
Val	842	A	A	.	B	.	.	.	-0.41	.	.	.	-0.30	0.38
															Ile	843	A	A	.	B	.	.	.	-0.06	*	.	.	-0.60	0.40
Glu	844	A	A	.	B	.	.	.	0.24	*	.	.	-0.60	0.37
															Glu	845	A	A	.	.	.	.	.	0.17	*	.	.	0.30	0.87
Trp	846	A	A	.	.	.	.	.	0.16	*	.	.	0.61	0.66
															Gly	847	A	A	.	.	.	.	.	1.06	*	.	F	1.37	0.51
Glu	848	.	A	.	.	T	.	.	1.64	*	.	F	2.08	0.59
															Cys	849	.	A	.	.	T	.	.	0.98	*	.	F	2.09	0.76
Ser	850	.	.	.	.	T	T	.	0.98	.	.	F	3.10	0.41
															Lys	851	.	.	.	.	T	T	.	0.46	.	.	F	2.79	0.41
Ser	852	.	.	.	.	T	T	.	0.46	.	.	F	2.18	0.63
															Cys	853	.	.	.	.	T	T	.	0.17	*	*	.	2.02	0.47
Glu	854	A	A	.	.	.	.	.	0.83	*	.	.	0.61	0.24
															Leu	855	A	A	.	.	.	.	.	1.24	.	.	.	-0.30	0.32
Gly	856	.	A	.	.	.	.	.	1.31	.	*	.	0.85	1.16

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..    Beta	Chou-...     Beta	Garni...  Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Trp	857	A	A	.	.	.	.	.	0.80	*	*	.	0.75	1.31
Gln	858	A	A	.	.	.	.	.	0.61	*	*	.	-0.15	1.31
															Arg	859	A	A	.	.	.	.	.	0.61	*	*	.	-0.30	0.98
Arg	860	.	A	B	.	.	.	.	0.76	.	*	.	0.45	1.61
															Leu	861	.	A	B	.	.	.	.	1.21	*	.	.	0.60	0.50
Val	862	.	A	B	.	.	.	.	1.50	*	.	.	0.60	0.50
															Glu	863	.	A	B	.	.	.	.	0.61	.	.	.	0.94	0.43
Cys	864	.	A	B	.	.	.	.	0.50	.	.	.	0.98	0.36
															Arg	865	.	A	.	.	T	.	.	0.04	.	.	F	2.17	0.78
Asp	866	.	.	.	.	T	T	.	0.86	.	.	F	2.91	0.45
															Ile	867	.	.	.	.	T	T	.	1.50	.	.	F	3.40	1.45
Asn	868	.	.	.	.	T	T	.	0.91	.	.	F	3.06	1.14
															Gly	869	.	.	.	.	.	T	C	1.28	.	.	F	2.07	0.69
Gln	870	.	.	.	.	.	T	C	1.17	.	*	F	1.28	1.32
															Pro	871	.	.	.	.	.	T	C	0.50	.	*	F	1.54	1.42
Ala	872	.	.	.	.	.	T	C	0.80	.	*	F	1.05	0.77
															Ser	873	A	.	.	.	.	T	.	0.84	*	.	F	0.85	0.45
Glu	874	A	A	.	.	.	.	.	1.19	*	.	F	0.75	0.58
															Cys	875	A	A	.	.	.	.	.	0.33	*	.	.	0.60	1.00
Ala	876	A	A	.	.	.	.	.	0.59	*	.	.	0.60	0.55
															Lys	877	A	A	.	.	.	.	.	0.97	*	.	F	0.75	0.64
Glu	878	A	A	.	.	.	.	.	0.68	*	.	F	0.90	1.84

Res	Pos.	Garni..     Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..     Beta	Chou-...      Beta	Garni...    Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..    Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Val	879	A	A	.	.	.	.	.	0.38	*	.	F	0.90	1.84
Lys	880	A	A	.	.	.	.	.	0.73	*	.	F	0.90	1.23
															Pro	881	A	.	.	.	.	T	.	1.43	*	.	F	1.30	1.03
Ala	882	.	.	.	.	T	T	.	1.18	*	.	F	2.01	2.71
															Ser	883	.	.	.	.	T	T	.	0.51	.	*	F	2.32	2.10
Thr	884	.	.	.	.	T	T	.	0.78	.	*	F	2.18	0.73
															Arg	885	.	.	B	.	.	T	.	0.73	.	*	F	2.09	0.73
Pro	886	.	.	.	.	T	T	.	0.91	.	*	F	3.10	0.91
															Cys	887	.	.	.	.	T	T	.	1.29	.	*	.	2.64	0.85
Ala	888	.	.	.	.	T	T	.	0.92	.	*	.	2.43	0.67
															Asp	889	.	.	.	.	T	.	.	1.02	.	*	.	1.72	0.23
His	890	.	.	.	.	.	T	C	0.91	.	*	.	1.51	0.67
															Pro	891	.	.	.	.	T	T	.	0.83	.	.	.	1.65	1.16
Cys	892	.	.	.	.	T	T	.	1.50	.	*	.	1.00	0.73
															Pro	893	.	.	.	.	T	T	.	1.28	.	*	.	0.60	0.93
Gln	894	.	A	.	.	T	.	.	0.93	.	.	.	0.10	0.49
															Trp	895	.	A	B	.	.	.	.	0.97	.	.	.	-0.40	0.91
Gln	896	.	A	B	.	.	.	.	0.89	.	.	.	-0.05	1.02
															Leu	897	.	A	B	.	.	.	.	1.26	.	.	.	-0.60	0.62
Gly	898	.	.	.	.	T	.	.	1.17	.	.	.	0.00	0.79
															Glu	899	.	.	.	.	T	.	.	0.50	.	.	F	0.45	0.61
Trp	900	.	.	.	.	T	.	.	0.49	.	.	F	0.45	0.40

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni...     Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..    Beta	Karpl....     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Ser	901	.	.	.	.	T	T	.	0.53	.	.	F	0.65	0.54
Ser	902	.	.	.	.	T	T	.	1.03	.	.	F	1.25	0.62
															Cys	903	.	.	.	.	T	T	.	0.71	.	*	F	0.65	0.85
Ser	904	.	.	.	.	T	T	.	0.37	*	*	F	1.25	0.34
															Lys	905	.	.	.	.	T	.	.	0.70	*	*	F	1.05	0.25
Thr	906	.	.	.	.	T	.	.	0.66	*	*	F	1.69	0.94
															Cys	907	.	.	.	.	T	.	.	0.71	*	.	F	2.03	0.69
Gly	908	.	.	.	.	T	T	.	1.42	*	*	F	2.27	0.54
															Lys	909	.	.	.	.	T	T	.	1.77	*	*	F	2.61	0.75
Gly	910	.	.	.	.	T	T	.	1.83	*	*	F	3.40	2.81
															Tyr	911	.	.	.	.	T	T	.	1.84	.	.	F	3.06	5.57
Lys	912	.	A	B	.	.	.	.	1.70	*	.	F	1.92	3.73
															Lys	913	.	A	B	.	.	.	.	2.09	*	.	F	1.58	3.11
Arg	914	.	A	B	.	.	.	.	1.38	*	.	F	1.24	3.97
															Ser	915	.	A	B	.	.	.	.	0.91	*	.	F	0.90	1.06
Leu	916	.	A	B	.	.	.	.	0.86	*	.	F	0.75	0.44
															Lys	917	.	A	B	.	.	.	.	0.78	*	.	.	0.30	0.30
Cys	918	.	A	B	.	.	.	.	0.73	*	.	.	-0.30	0.30
															Leu	919	.	A	B	.	.	.	.	0.28	*	.	.	0.30	0.62
Ser	920	.	.	B	.	.	.	.	0.23	.	.	.	0.50	0.31
															His	921	.	.	B	.	.	T	.	0.19	*	.	F	0.85	0.56
Asp	922	.	.	.	.	T	T	.	-0.67	*	.	F	0.65	0.51

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni... Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..  Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Gly	923	.	.	.	.	T	T	.	-0.30	.	.	F	0.65	0.31
Gly	924	.	.	.	.	T	T	.	0.48	.	.	F	0.65	0.31
															Val	925	.	.	B	.	.	.	.	0.78	.	.	.	-0.10	0.25
Leu	926	.	.	B	.	.	.	.	0.51	.	.	.	-0.10	0.44
															Ser	927	.	.	B	.	.	.	.	-0.16	.	.	.	-0.10	0.59
His	928	.	.	B	.	.	T	.	0.19	.	.	.	0.10	0.43
															Glu	929	.	.	B	.	.	T	.	0.32	.	.	F	0.85	0.87
Ser	930	A	.	.	.	.	T	.	0.37	*	.	F	1.30	1.00
															Cys	931	A	.	.	.	.	T	.	1.22	*	.	F	0.85	0.61
Asp	932	A	.	.	.	.	T	.	1.57	*	.	F	1.15	0.70
															Pro	933	A	.	.	.	.	T	.	1.39	*	.	F	1.30	1.05
Leu	934	A	.	.	.	.	T	.	1.43	*	.	F	1.30	3.02
															Lys	935	A	.	.	.	.	T	.	1.70	*	.	F	1.30	3.62
Lys	936	A	A	.	.	.	.	.	1.67	*	.	F	0.90	3.18
															Pro	937	A	A	.	.	.	.	.	0.78	*	.	F	0.90	3.34
Lys	938	A	A	.	.	.	.	.	0.99	*	*	F	0.90	1.17
															His	939	A	A	.	.	.	.	.	1.10	*	*	.	0.60	0.98
Phe	940	.	A	B	.	.	.	.	0.39	*	*	.	-0.30	0.55
															Ile	941	.	A	B	.	.	.	.	0.03	*	*	.	-0.30	0.15
Asp	942	A	A	.	.	.	.	.	-0.36	*	*	.	-0.60	0.16
															Phe	943	A	A	.	.	.	.	.	-0.99	*	*	.	-0.60	0.18
Cys	944	A	A	.	.	.	.	.	-0.96	.	.	.	-0.60	0.26

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni...   Turn	Chou-...   Turn	Garni..     Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen..    Alpha	Eisen..   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Thr	945	A	A	.	.	.	.	.	-0.92	.	*	.	0.30	0.27
Met	946	A	A	.	.	.	.	.	-0.33	.	*	.	-0.60	0.16
															Ala	947	A	A	.	.	.	.	.	-0.72	.	.	.	-0.30	0.41
Glu	948	A	A	.	.	.	.	.	-0.41	.	.	.	0.30	0.36
															Cys	949	A	A	.	.	.	.	.	-0.13	.	.	.	0.30	0.47
Ser	950	A	A	.	.	.	.	.	-0.21	.	.	.	0.30	0.60

                                                                                                             表2

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..     Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen...   Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Emini     Surfa...
															Met	1	.	.	B	.	.	.	.	-0.37	.	.	.	-0.40	0.50
Phe	2	.	.	B	.	.	.	.	-0.57	.	.	.	-0.40	0.61
															Pro	3	.	.	B	.	.	.	.	-0.77	.	.	.	-0.40	0.48
Ala	4	.	.	.	.	.	.	C	-0.59	.	*	.	-0.20	0.49
															Pro	5	.	.	.	.	.	.	C	-0.09	.	*	.	-0.20	0.87
Ala	6	.	.	.	.	.	.	C	0.22	*	*	.	0.85	1.11
															Ala	7	.	.	.	.	.	T	C	0.11	*	*	.	0.45	1.15
Pro	8	A	.	.	.	.	T	.	0.11	*	.	.	-0.20	0.61
															Arg	9	.	.	.	.	T	T	.	0.00	*	.	.	0.20	0.94
Trp	10	.	.	B	.	.	T	.	-0.60	*	.	.	-0.20	0.81
															Leu	11	.	A	B	.	.	.	.	-0.82	*	.	.	-0.60	0.43
Pro	12	.	A	B	.	.	.	.	-1.04	*	.	.	-0.60	0.18
															Phe	13	.	A	B	.	.	.	.	-1.64	*	.	.	-0.60	0.14
Leu	14	A	A	.	.	.	.	.	-2.57	*	.	.	-0.60	0.14
															Leu	15	A	A	.	.	.	.	.	-3.09	.	.	.	-0.60	0.08
Leu	16	A	A	.	.	.	.	.	-3.09	.	.	.	-0.60	0.07
															Leu	17	A	A	.	.	.	.	.	-3.69	.	.	.	-0.60	0.07
Leu	18	A	A	.	.	.	.	.	-3.80	.	.	.	-0.60	0.07
															Leu	19	A	A	.	.	.	.	.	-3.20	.	.	.	-0.60	0.07
Leu	20	A	A	.	.	.	.	.	-3.20	.	.	.	-0.60	0.14

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...  Alpha	Garni.. Beta	Chou-...  Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...  Flexi...	James...    Antig...	Emini    Surfa...
															Leu	21	A	A	.	.	.	.	.	-2.98	*	.	.	-0.60	0.14
Leu	22	.	A	B	.	.	.	.	-2.06	*	.	.	-0.60	0.17
															Pro	23	.	A	B	.	.	.	.	-1.59	*	.	.	-0.60	0.39
Leu	24	A	A	.	.	.	.	.	-1.37	*	.	.	-0.60	0.47
															Ala	25	A	A	.	.	.	.	.	-0.77	*	.	.	-0.04	0.58
Arg	26	.	A	B	.	.	.	.	-0.54	*	.	.	0.82	0.58
															Gly	27	.	A	B	.	.	.	.	0.38	.	.	F	0.63	0.71
Ala	28	.	.	B	.	.	.	.	0.38	.	.	F	2.14	1.37
															Pro	29	.	.	.	.	.	.	C	0.60	.	.	F	2.60	1.08
Ala	30	.	.	B	.	.	.	.	0.60	.	.	F	1.84	1.11
															Arg	31	.	.	B	.	.	.	.	0.14	.	*	F	1.58	1.11
Pro	32	.	.	B	.	.	.	.	0.14	.	*	F	1.17	0.71
															Ala	33	.	.	B	.	.	T	.	0.73	.	*	F	1.11	0.69
Ala	34	A	.	.	.	.	T	.	0.36	.	*	F	0.85	0.61
															Gly	35	.	.	.	.	.	T	C	0.64	.	*	F	0.45	0.40
Gly	36	.	.	.	.	.	T	C	0.53	.	.	F	0.45	0.53
															Gln	37	A	.	.	.	.	.	.	-0.07	.	.	F	0.65	0.91
Ala	38	.	.	B	.	.	.	.	-0.33	.	.	F	0.65	0.76
															Ser	39	.	.	B	B	B	.	.	-0.60	.	.	F	-0.15	0.57
Glu	40	.	.	B	B	B	.	.	-0.47	.	.	F	-0.15	0.24
															Leu	41	.	.	B	B	B	.	.	-0.43	.	*	.	-0.30	0.37
Val	42	.	.	B	B	B	.	.	-0.32	.	*	.	-0.30	0.40

Res	Pos.	Garni..     Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...    Beta	Garni..    Turn	Chou-...    Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen...   Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...     Flexi...	James...     Antig...	Emini    Surfa...
															Val	43	.	.	B	B	B	.	.	-0.54	.	*	.	0.30	0.46
Pro	44	.	.	B	B	B	.	.	-0.46	.	*	F	-0.24	0.46
															Thr	45	.	.	B	B	B	.	.	-0.80	.	*	F	0.27	0.95
Arg	46	.	.	B	B	B	.	.	-0.29	.	*	F	0.63	1.26
															Leu	47	.	.	.	.	.	T	C	-0.02	*	*	F	2.04	1.10
Pro	48	.	.	.	.	.	T	C	0.49	*	*	F	2.10	0.77
															Gly	49	.	.	.	.	.	T	C	0.70	*	*	F	1.89	0.39
Ser	50	.	.	.	.	.	T	C	0.20	*	*	F	1.68	0.81
															Ala	51	A	A	.	.	.	.	.	-0.50	*	*	F	0.87	0.43
Gly	52	A	A	.	.	.	.	.	-0.50	.	.	F	0.66	0.44
															Glu	53	A	A	.	.	.	.	.	-0.32	.	*	.	-0.30	0.27
Leu	54	A	A	.	.	.	.	.	-0.79	.	*	.	-0.30	0.37
															Ala	55	A	A	.	.	.	.	.	-0.79	.	*	.	-0.60	0.31
Leu	56	A	A	.	.	.	.	.	-0.79	.	*	.	-0.60	0.24
															His	57	A	A	.	.	.	.	.	-1.14	.	*	.	-0.60	0.29
Leu	58	A	A	.	.	.	.	.	-1.49	*	*	.	-0.60	0.25
															Ser	59	A	A	.	.	.	.	.	-0.63	*	*	.	-0.60	0.30
Ala	60	A	A	.	.	.	.	.	-0.39	*	*	.	-0.30	0.44
															Phe	61	A	A	.	.	.	.	.	-0.28	*	*	.	-0.30	0.53
Gly	62	.	.	.	.	T	T	.	-1.10	*	.	.	0.50	0.34
															Lys	63	A	.	.	.	.	T	.	-1.10	.	*	F	-0.05	0.25
Gly	64	.	.	B	.	.	T	.	-0.69	.	*	.	-0.20	0.24

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni..   Turn	Chou-...    Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen...  Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...    Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Phe	65	.	.	B	.	.	T	.	-0.91	.	*	.	0.70	0.47
Val	66	.	.	B	B	.	.	.	-0.80	*	*	.	-0.30	0.19
															Leu	67	.	.	B	B	.	.	.	-0.67	*	*	.	-0.30	0.20
Arg	68	.	.	B	B	.	.	.	-0.71	.	*	.	0.00	0.35
															Leu	69	.	.	B	B	.	.	.	-0.37	*	*	.	1.20	0.80
Ala	70	.	.	.	.	.	T	C	0.03	.	*	.	2.55	1.61
															Pro	71	.	.	.	.	.	T	C	0.19	*	*	F	3.00	1.10
Asp	72	.	.	.	.	T	T	.	0.19	.	*	F	2.60	1.16
															Asp	73	A	.	.	.	.	T	.	-0.51	.	*	F	1.75	0.95
Ser	74	A	A	.	.	.	.	.	0.09	.	.	.	0.90	0.62
															Phe	75	A	A	.	.	.	.	.	0.68	.	.	.	0.60	0.57
Leu	76	A	A	.	.	.	.	.	0.19	.	*	.	0.30	0.59
															Ala	77	A	A	.	.	.	.	.	0.23	.	*	.	-0.60	0.38
Pro	78	A	A	.	.	.	.	.	0.66	.	*	.	-0.30	0.89
															Glu	79	A	A	.	.	.	.	.	-0.36	*	*	F	-0.15	0.75
Phe	80	A	A	.	.	.	.	.	0.46	*	.	F	0.90	1.29
															Lys	81	A	A	.	.	.	.	.	0.46	*	*	F	0.90	1.63
Ile	82	A	A	.	.	.	.	.	0.70	*	.	F	0.75	0.78
															Glu	83	A	A	.	.	.	.	.	0.57	*	*	F	0.45	0.89
Arg	84	A	A	.	.	.	.	.	0.27	*	*	F	0.75	0.44
															Leu	85	.	A	.	.	T	.	.	0.62	*	*	F	0.85	0.84
Gly	86	.	A	.	.	T	.	.	0.69	*	*	F	1.15	0.48

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...  Beta	Garni..    Turn	Chou-...  Turn	Garni...  Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen...  Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...    Flexi...	James...    Antig...	Emini  Surfa...
															Gly	87	.	.	.	.	.	T	C	0.99	*	*	F	1.35	0.48
Ser	88	.	.	.	.	.	T	C	0.68	*	*	F	1.05	0.59
															Gly	89	.	.	.	.	.	T	C	0.22	*	*	F	1.05	0.86
Arg	90	.	.	B	.	.	T	.	0.69	.	*	F	1.19	0.86
															Ala	91	.	.	.	.	.	T	C	1.03	.	*	F	1.73	0.63
Thr	92	.	.	B	.	.	T	.	1.49	.	*	F	2.32	1.11
															Gly	93	.	.	B	.	.	T	.	1.44	.	*	F	2.66	1.11
Gly	94	.	.	.	.	T	T	.	0.98	*	*	F	3.40	1.09
															G1u	95	.	.	B	.	.	.	.	0.98	*	.	F	2.31	0.62
Arg	96	.	.	B	.	.	.	.	1.22	*	.	F	2.12	1.23
															Gly	97	.	.	.	.	T	.	.	0.87	*	*	F	2.18	1.23
Leu	98	.	.	B	.	.	T	.	0.51	*	.	F	1.49	0.38
															Arg	99	.	.	B	.	.	T	.	0.16	*	.	.	0.70	0.17
Gly	100	.	.	B	.	.	T	.	-0.14	*	.	.	-0.20	0.15
															Cys	101	.	.	B	.	.	T	.	-0.60	*	.	.	-0.20	0.24
Phe	102	.	.	B	.	.	.	.	-0.57	.	*	.	-0.10	0.12
															Phe	103	.	.	B	.	.	T	.	-0.61	.	*	.	-0.20	0.18
Ser	104	.	.	B	.	.	T	.	-0.72	.	*	F	-0.05	0.24
															Gly	105	.	.	.	.	.	T	C	-0.72	.	*	F	0.15	0.45
Thr	106	.	.	.	.	.	T	C	-0.06	*	*	F	0.45	0.52
															Val	107	.	.	.	B	.	.	C	0.43	.	*	F	1.25	0.67
Asn	108	.	.	.	B	.	.	C	1.13	.	*	F	1.70	1.05

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...    Beta	Garni..   Turn	Chou-...    Turn	Garni..    Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen... Beta	Karpl...   Flexi...	James...    Antig...	Emini  Surfa...
															Gly	109	.	.	.	B	.	.	C	1.13	.	*	F	2.30	1.26
Glu	110	.	.	.	.	.	T	C	0.67	.	*	F	3.00	2.27
															Pro	111	A	.	.	.	.	T	.	0.39	.	*	F	2.50	1.16
Glu	112	A	.	.	.	.	T	.	0.66	.	*	F	2.20	1.19
															Ser	113	A	.	.	.	.	T	.	-0.20	.	.	F	1.75	0.69
Leu	114	A	A	.	B	.	.	.	-0.16	.	.	.	0.00	0.33
															Ala	115	A	A	.	B	.	.	.	-0.97	.	.	.	-0.30	0.26
Ala	116	A	A	.	B	.	.	.	-1.42	.	.	.	-0.60	0.16
															Val	117	A	A	.	B	.	.	.	-1.31	.	.	.	-0.60	0.10
Ser	118	.	A	B	B	.	.	.	-1.36	*	.	.	-0.30	0.20
															Leu	119	.	.	B	B	.	.	.	-1.36	*	.	.	-0.30	0.20
Cys	120	.	.	B	.	.	T	.	-1.07	*	.	.	0.10	0.22
															Arg	121	.	.	B	.	.	T	.	-0.82	*	.	.	0.10	0.22
Gly	122	.	.	.	.	T	T	.	-0.27	*	.	F	0.65	0.26
															Leu	123	.	.	.	.	T	T	.	-0.67	*	.	F	1.25	0.65
Ser	124	.	.	.	.	.	T	C	-0.67	*	.	F	0.45	0.29
															Gly	125	.	.	B	.	.	T	.	-0.81	.	*	F	-0.05	0.24
Ser	126	.	.	B	.	.	T	.	-0.92	.	*	F	-0.05	0.24
															Phe	127	.	.	B	.	.	T	.	-0.92	.	*	.	0.10	0.30
Leu	128	.	A	B	.	.	.	C	-0.11	.	*	.	-0.30	0.30
															Leu	129	.	A	.	.	.	.	.	0.19	.	*	F	0.65	0.39
Asp	130	A	A	.	.	.	.	.	-0.17	.	.	F	0.45	0.77

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..    Turn	Chou-...   Turn	Garni..     Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen...   Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...    Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Gly	131	A	A	.	.	.	.	.	-0.18	.	.	F	0.45	0.81
Glu	132	A	A	.	.	.	.	.	-0.37	.	*	F	0.90	1.42
															Glu	133	A	A	.	.	.	.	.	0.44	.	*	F	0.75	0.60
Phe	134	A	A	.	.	.	.	.	1.04	.	*	.	0.45	1.04
															Thr	135	.	A	B	.	.	.	.	1.04	.	*	.	0.30	0.93
Ile	136	.	.	B	.	.	.	.	1.04	.	*	F	0.05	0.93
															Gln	137	.	.	B	.	.	.	.	0.46	.	*	F	-0.10	1.06
Pro	138	.	.	.	.	.	.	C	0.11	.	*	F	0.25	0.75
															Gln	139	.	.	.	.	T	.	.	0.47	.	*	F	0.60	1.05
Gly	140	.	.	.	.	.	T	C	0.48	.	.	F	0.45	0.60
															Ala	141	.	.	.	.	T	T	.	0.56	.	.	F	1.25	0.52
Gly	142	.	.	.	.	.	T	C	-0.03	.	.	F	0.45	0.25
															Gly	143	.	.	.	.	.	T	C	0.18	.	.	F	0.65	0.25
Ser	144	.	.	.	.	.	.	C	-0.03	.	.	F	0.65	0.43
															Leu	145	.	.	B	.	.	.	.	0.28	*	.	F	0.65	0.68
Ala	146	.	.	B	.	.	.	.	0.98	*	.	F	0.85	0.93
															Gln	147	.	.	B	.	.	T	.	0.51	.	*	F	2.00	1.36
Pro	148	.	.	B	.	.	T	.	0.86	*	.	.	1.05	1.36
															His	149	.	.	B	.	.	T	.	1.27	*	.	.	1.45	2.34
Arg	150	.	.	B	.	.	T	.	1.79	*	.	.	1.55	2.64
															Leu	151	.	.	B	.	.	.	.	2.03	*	.	.	0.85	1.80
Gln	152	.	.	B	.	.	.	.	1.82	*	.	.	0.65	1.31

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-..    Alpha	Garni.. Beta	Chou-...    Beta	Garni..  Turn	Chou-...    Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen... Beta	Karpl...   Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Arg	153	.	.	.	.	T	.	.	1.44	*	.	.	1.05	1.03
Trp	154	.	.	.	.	T	.	.	1.13	*	.	F	0.84	1.26
															Gly	155	.	.	.	.	.	T	C	0.43	*	.	F	0.93	0.72
Pro	156	.	.	.	.	.	T	C	1.36	*	.	F	1.17	0.37
															Ala	157	.	.	.	.	T	T	.	1.14	*	.	F	1.61	0.69
Gly	158	.	.	.	.	.	T	C	0.22	*	.	F	2.40	1.08
															Ala	159	.	.	.	.	.	.	C	0.30	*	*	F	1.81	0.58
Arg	160	.	.	B	.	.	.	.	0.76	*	*	F	1.37	0.89
															Pro	161	.	.	B	.	.	.	.	0.62	*	*	F	1.58	1.75
Leu	162	.	.	.	.	.	.	C	1.00	*	*	F	1.84	1.72
															Pro	163	.	.	.	.	.	.	C	1.34	*	*	F	1.90	1.35
Arg	164	.	.	.	.	.	.	C	1.64	*	*	F	2.20	1.52
															Gly	165	.	.	.	.	.	T	C	1.53	*	*	F	2.40	1.93
Pro	166	.	.	.	.	.	T	C	0.89	*	.	F	3.00	2.17
															Glu	167	.	.	.	.	.	T	C	1.70	*	.	F	2.55	0.82
Trp	168	A	.	.	.	.	T	.	1.60	*	.	.	2.05	1.44
															Glu	169	A	.	.	.	.	.	.	1.14	*	.	.	1.85	1.34
Val	170	A	.	.	.	.	.	.	1.49		.	F	1.85	0.77
															Glu	171	A	.	.	.	.	.	.	1.36		*	F	2.00	1.26
Thr	172	A	.	.	.	.	.	.	1.36		*	F	2.15	0.72
															Gly	173	.	.	.	.	.	T	C	1.76		.	F	3.00	1.68
Glu	174	A	.	.	.	.	T	.	1.76		.	F	2.50	1.90

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..   Beta	Chou-...  Beta	Garni..   Turn	Chou-...  Turn	Garni..   Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...  Antig...	Emini  Surfa...
															Gly	175	A	.	.	.	.	T	.	2.61		.	F	2.20	2.28
Gln	176	A	.	.	.	.	T	.	2.72		.	F	1.90	4.00
															Arg	177	A	A	.	.	.	.	.	2.69		*	F	1.54	4.52
Gln	178	A	A	.	.	.	.	.	3.03		*	F	1.58	4.52
															Glu	179	.	A	.	.	T	.	.	3.00	*	*	F	2.32	4.36
Arg	180	.	A	.	.	T	.	.	3.34	*	.	F	2.66	3.03
															Gly	181	.	.	.	.	T	T	.	3.34	.	*	F	3.40	3.03
Asp	182	.	.	.	.	.	T	C	3.23	.	.	F	2.86	3.03
															His	183	.	.	.	.	.	T	C	2.93	.	*	F	2.52	2 58
Gln	184	.	.	.	.	.	T	C	2.93	.	*	F	2.18	3.50
															Glu	185	.	A	.	.	.	.	C	2.82	.	*	F	1.44	3.63
Asp	186	A	A	.	.	.	.	.	3.17	.	.	F	0.90	4.61
															Ser	187	A	A	.	.	.	.	.	2.87	.	.	F	0.90	4.61
Glu	188	A	A	.	.	.	.	.	2.90	.	.	F	0.90	3.57
															Glu	189	A	A	.	.	.	.	.	2.90	.	.	F	0.90	3.70
Glu	190	A	A	.	.	.	.	.	2.90	.	.	F	0.90	4.79
															Ser	191	A	A	.	.	.	.	.	2.90	.	.	F	0.90	4.79
Gln	192	A	A	.	.	.	.	.	2.61	.	.	F	0.90	4.79
															Glu	193	A	A	.	.	.	.	.	2.61	.	.	F	0.90	2.79
Glu	194	A	A	.	.	.	.	.	2.27	.	.	F	0.90	3.61
															Glu	195	A	A	.	.	.	.	.	1.68	.	.	F	0.90	2.06
Ala	196	A	A	.	.	.	.	.	1.68	.	.	F	1.16	1.20

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..   Turn	Chou-...    Turn	Garni..  Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...  Flexi...	James...    Antig...	Emini     Surfa...
															Glu	197	A	A	.	.	.	.	.	1.68	.	.	F	1.27	0.93
Gly	198	A	A	.	.	.	.	.	1.47	.	.	F	1.53	0.93
															Ala	199	.	A	.	.	T	.	.	1.26	.	.	F	2.34	1.42
Ser	200	.	.	.	.	.	.	C	1.04	.	.	F	2.60	1.27
															Glu	201	.	.	.	.	.	.	C	1.42	*	.	F	2.04	1.99
Pro	202	.	.	.	.	.	.	C	0.61	*	.	F	1.78	3.04
															Pro	203	.	.	.	.	.	.	C	0.61	.	.	F	1.52	1.87
Pro	204	.	.	.	.	.	T	C	0.61	.	.	F	1.46	1.07
															Pro	205	.	.	.	.	.	T	C	0.60	.	.	F	0.45	0.70
Leu	206	.	.	.	.	.	T	C	0.30	*	*	F	0.45	0.65
															Gly	207	.	.	B	.	.	T	.	0.62	.	*	F	0.51	0.57
Ala	208	.	.	B	.	.	.	.	0.52	.	*	F	1.17	0.72
															Thr	209	.	.	B	.	.	.	.	0.78	*	*	F	1.58	1.25
Ser	210	.	.	B	.	.	T	.	1.10	*	.	F	2.34	2.53
															Arg	211	.	.	B	.	.	T	.	1.21	*	.	F	2.60	4.91
Thr	212	.	.	B	.	.	T	.	0.70	*	.	F	2.34	2.95
															Lys	213	.	.	B	.	.	T	.	0.99	*	.	F	2.08	1.63
Arg	214	.	.	B	B	.	.	.	1.30	*	.	F	1.42	1.12
															Phe	215	.	.	B	B	.	.	.	1.01	*	*	.	1.01	1.34
Val	216	.	.	B	B	.	.	.	1.01	*	*	.	0.60	0.68
															Ser	217	A	.	.	B	.	.	.	0.62	*	*	.	0.60	0.68
Glu	218	A	A	.	.	.	.	.	-0.28	*	*	.	-0.30	0.68

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni..  Turn	Chou-...     Turn	Garni.. Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...     Antig...	Eminl  Surfa...
															Ala	219	A	A	.	B	.	.	.	-0.39	*	*	.	0.30	0.68
Arg	220	A	A	.	B	.	.	.	0.00	*	*	.	0.60	0.87
															Phe	221	A	A	.	B	.	.	.	0.04	*	.	.	0.60	0.73
Val	222	A	A	.	B	.	.	.	-0.47	*	*	.	-0.30	0.59
															Glu	223	A	A	.	B	.	.	.	-1.32	*	*	.	-0.30	0.25
Thr	224	A	A	.	B	.	.	.	-1.32	*	*	.	-0.60	0.21
															Leu	225	A	A	.	B	.	.	.	-1.43	*	*	.	-0.60	0.29
Leu	226	A	A	.	B	.	.	.	-1.32	.	.	.	0.30	0.28
															Val	227	A	A	.	B	.	.	.	-0.77	.	.	.	-0.60	0.20
Ala	228	A	A	.	B	.	.	.	-1.37	.	.	.	-0.30	0.32
															Asp	229	A	A	.	B	.	.	.	-1.64	.	.	.	-0.30	0.38
Ala	230	A	A	.	.	.	.	.	-1.42	.	.	.	-0.30	0.52
															Ser	231	A	A	.	.	.	.	.	-1.31	.	.	.	0.30	0.52
Met	232	A	A	.	.	.	.	.	-0.70	.	.	.	-0.30	0.27
															Ala	233	A	A	.	.	.	.	.	-0.46	.	.	.	-0.60	0.42
Ala	234	A	A	.	.	.	.	.	-1.04	.	.	.	-0.60	0.31
															Phe	235	A	A	.	.	.	.	.	-0.46	.	.	.	-0.60	0.32
Tyr	236	A	A	.	.	.	.	.	-0.97	.	.	.	-0.60	0.52
															Gly	237	A	A	.	.	.	.	.	-0.37	.	.	.	-0.60	0.43
Ala	238	A	A	.	.	.	.	.	0.22	.	.	.	-0.60	0.86
															Asp	239	A	A	.	.	.	.	.	0.78	*	*	.	-0.30	0.88
Leu	240	A	A	.	.	.	.	.	0.59	*	.	.	0.45	1.21

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...    Beta	Garni..  Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...    Antig...	Emini  Surfa...
															Gln	241	A	A	.	B	.	.	.	0.02	*	*	.	-0.30	0.84
Asn	242	A	A	.	B	.	.	.	0.06	*	.	.	-0.30	0.41
															His	243	.	A	B	B	.	.	.	-0.17	*	*	.	-0.60	0.72
Ile	244	.	A	B	B	.	.	.	-0.77	*	.	.	-0.60	0.35
															Leu	245	.	A	B	B	.	.	.	-0.26	*	.	.	-0.60	0.21
Thr	246	.	A	B	B	.	.	.	-1.11	*	.	.	-0.60	0.21
															Leu	247	.	A	B	B	.	.	.	-1.70	*	.	.	-0.60	0.22
Met	248	A	A	.	B	.	.	.	-2.26	*	*	.	-0.60	0.27
															Ser	249	A	A	.	B	.	.	.	-1.26	*	*	.	-0.60	0.19
Val	250	A	A	.	B	.	.	.	-1.33	*	*	.	-0.30	0.45
															Ala	251	A	A	.	B	.	.	.	-1.27	*	*	.	-0.30	0.32
Ala	252	A	A	.	B	.	.	.	-0.41	*	*	.	-0.60	0.37
															Arg	253	A	A	.	B	.	.	.	0.16	*	*	.	-0.15	1.01
Ile	254	A	A	.	B	.	.	.	0.24	*	*	.	0.45	1.36
															Tyr	255	A	.	.	.	.	.	.	0.80	*	*	.	0.99	2.08
Lys	256	.	.	B	.	.	.	.	0.50	*	*	.	1.33	1.42
															His	257	.	.	B	.	.	T	.	1.13	.	*	F	1.12	1.42
Pro	258	.	.	.	.	.	T	C	1.02	.	*	F	2.56	1.81
															Ser	259	.	.	.	.	T	T	.	1.61	.	*	F	3.40	1.46
Ile	260	.	.	.	.	T	T	.	0.97	.	*	F	2.76	1.44
															Lys	261	.	.	B	.	.	.	.	0.92	.	*	F	1.67	0.65
Asn	262	.	.	.	.	T	.	.	0.14	*	*	F	1.73	0.78

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen...  Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...  Flexi...	James...     Antig...	Emini   Surfa...
															Ser	263	.	.	B	B	.	.	.	-0.24	*	*	F	0.19	0.92
Ile	264	.	.	B	B	.	.	.	-0.80	*	*	.	-0.30	0.45
															Asn	265	.	.	B	B	.	.	.	-0.77	*	*	.	-0.60	0.21
Leu	266	.	.	B	B	.	.	.	-0.77	.	*	.	-0.60	0.12
															Met	267	A	.	.	B	.	.	.	-1.62	*	.	.	-0.60	0.33
Val	268	.	.	B	B	.	.	.	-2.13	.	*	.	-0.60	0.15
															Val	269	.	.	B	B	.	.	.	-2.13	.	.	.	-0.60	0.15
Lys	270	A	.	.	B	.	.	.	-2.99	.	.	.	-0.60	0.11
															Val	271	.	.	B	B	.	.	.	-2.18	.	.	.	-0.60	0.11
Leu	272	.	.	B	B	.	.	.	-1.58	.	.	.	-0.30	0.25
															Ile	273	A	.	.	B	.	.	.	-0.72	.	.	.	0.30	0.21
Val	274	A	.	.	B	.	.	.	0.18	.	*	.	0.30	0.49
															Glu	275	A	.	.	B	.	.	.	-0.16	.	.	.	0.75	1.19
Asp	276	A	A	.	.	.	.	.	0.36	.	.	F	0.90	1.79
															Glu	277	A	A	.	.	.	.	.	0.96	*	.	F	0.90	2.39
Lys	278	.	A	.	.	T	.	.	1.84	*	*	F	1.30	2.13
															Trp	279	.	A	.	.	.	.	C	1.84	.	*	F	1.10	2.21
Gly	280	.	.	.	.	.	T	C	1.54	*	.	F	1.35	0.95
															Pro	281	.	.	.	.	.	T	C	1.54	*	*	F	1.36	0.64
Glu	282	.	.	B	.	.	T	.	1.54	*	*	F	1.62	1.01
															Val	283	.	.	B	.	.	T	.	1.16	*	*	F	2.23	1.64
Ser	284	.	.	.	.	.	T	C	1.10	.	*	F	2.74	1.05

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..  Beta	Chou-..     Beta	Garni..    Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...   Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Asp	285	.	.	.	.	T	T	.	0.63	.	.	F	3.10	0.60
Asn	286	.	.	.	.	T	T	.	0.53	.	*	F	2.49	0.67
															Gly	287	.	.	.	.	T	T	.	-0.28	*	*	F	2.18	0.72
Gly	288	.	.	.	.	T	.	.	0.69	*	*	F	1.07	0.35
															Leu	289	.	.	B	.	.	.	.	0.99	*	*	F	0.36	0.43
Thr	290	.	.	B	.	.	.	.	0.29	*	*	.	-0.10	0.70
															Leu	291	.	.	B	.	.	.	.	-0.38	*	*	.	-0.40	0.61
Arg	292	.	.	B	.	.	.	.	-0.03	*	*	.	-0.40	0.40
															Asn	293	.	.	B	.	.	.	.	0.02	*	*	.	-0.10	0.44
Phe	294	.	.	.	.	T	T	.	0.83	*	*	.	0.20	0.57
															Cys	295	.	.	.	.	T	T	.	1.26	*	*	.	0.20	0.50
Asn	296	.	.	.	.	T	T	.	2.18	*	*	.	0.20	0.61
															Trp	297	.	.	.	.	T	T	.	1.37	*	*	.	0.65	1.38
Gln	298	.	.	.	.	T	.	.	1.37	*	.	.	0.45	2.23
															Arg	299	.	.	.	.	T	.	.	2.07	*	.	.	1.05	2.23
Arg	300	.	.	.	.	T	.	.	2.52	*	*	F	1.20	3.67
															Phe	301	.	.	.	.	T	.	.	2.22	*	*	F	1.84	3.28
Asn	302	.	.	.	.	T	.	.	2.51	*	*	F	2.18	2.24
															Gln	303	.	.	.	.	.	T	C	2.62	*	.	F	2.52	1.91
Pro	304	.	.	.	.	.	T	C	2.48	*	.	F	2.86	4.33
															Ser	305	.	.	.	.	T	T	.	2.16	*	*	F	3.40	3.66
Asp	306	.	.	.	.	T	T	.	2.86	*	.	F	3.06	3.27

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..    Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen... Beta	Karpl... Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Arg	307	.	.	.	.	.	.	C	2.82	*	.	F	2.32	3.66
His	308	.	.	.	.	.	.	C	2.58	*	.	F	1.98	3.72
															Pro	309	.	.	.	.	.	.	C	2.79	*	.	F	1.64	3.49
Glu	310	.	.	.	.	T	.	.	2.78	*	.	F	1.50	2.97
															His	311	A	.	.	.	.	T	.	2.19	*	.	F	1.00	3.15
Tyr	312	A	.	.	.	.	T	.	1.19	*	.	F	1.00	2.06
															Asp	313	A	.	.	.	.	T	.	0.41	.	.	F	0.85	0.83
Thr	314	A	.	.	.	.	T	.	-0.19	.	.	.	-0.20	0.51
															Ala	315	A	.	.	B	.	.	.	-0.50	*	.	.	-0.60	0.27
Ile	316	.	.	B	B	.	.	.	-0.36	*	.	.	-0.60	0.23
															Leu	317	.	.	B	B	.	.	.	-0.11	.	.	.	-0.60	0.31
Leu	318	.	.	B	B	.	.	.	-0.11	.	*	.	-0.60	0.53
															Thr	319	.	.	B	B	.	.	.	-0.50	.	.	F	0.00	1.23
Arg	320	.	.	B	B	.	.	.	-0.58	.	*	F	-0.08	1.29
															Gln	321	.	.	.	B	T	.	.	-0.03	.	*	F	0.69	0.84
Asn	322	.	.	.	.	T	T	.	0.78	.	*	F	1.31	0.57
															Phe	323	.	.	.	.	T	T	.	1.59	.	.	.	1.98	0.51
Cys	324	.	.	.	.	T	T	.	1.56	.	*	.	2.20	0.51
															Gly	325	.	.	.	.	T	T	.	0.63	.	*	F	1.53	0.31
Gln	326	.	.	.	.	T	.	.	-0.03	.	.	F	1.11	0.30
															Glu	327	.	.	.	.	T	.	.	-0.03	.	.	F	0.89	0.30
Gly	328	.	.	.	.	T	.	.	0.36	.	.	F	1.27	0.50

Res	Pos.	Garni..     Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen...  Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...    Flexi...	James...  Antig...	Emini    Surfa...
															Leu	329	.	.	B	.	.	.	.	0.21	.	.	F	0.65	0.42
Cys	330	.	.	B	.	.	.	.	0.21	.	.	.	0.50	0.20
															Asp	331	.	.	B	.	.	T	.	-0.64	.	.	.	0.10	0.20
Thr	332	.	.	B	.	.	T	.	-1.23	*	.	.	-0.20	0.18
															Leu	333	.	.	B	.	.	T	.	-0.89	.	.	.	0.10	0.34
Gly	334	.	.	B	.	.	T	.	-0.97	.	.	.	0.70	0.34
															Val	335	.	.	B	.	.	.	.	-0.64	.	.	.	-0.40	0.16
Ala	336	.	.	B	.	.	.	.	-0.96	.	.	.	-0.10	0.20
															Asp	337	.	.	B	.	.	T	.	-1.53	.	.	.	0.10	0.29
Ile	338	.	.	B	.	.	T	.	-1.39	.	.	.	-0.20	0.27
															Gly	339	.	.	B	.	.	T	.	-1.04	*	.	.	0.10	0.14
Thr	340	.	.	B	.	.	T	.	-0.40	.	.	.	0.70	0.14
															Ile	341	.	.	B	.	.	.	.	0.19	.	.	.	0.24	0.32
Cys	342	.	.	B	.	.	.	.	0.23	.	.	.	1.18	0.52
															Asp	343	.	.	B	.	.	T	.	0.82	*	.	F	1.87	0.72
Pro	344	.	.	.	.	T	T	.	0.50	.	.	F	3.06	1.37
															Asn	345	.	.	.	.	T	T	.	0.51	.	.	F	3.40	1.37
Lys	346	.	.	.	.	T	T	.	0.54	*	.	F	3.06	1.10
															Ser	347	.	.	.	B	T	.	.	0.32	.	.	F	1.87	0.53
Cys	348	.	.	B	B	.	.	.	0.32	*	.	.	0.38	0.23
															Ser	349	.	.	B	B	.	.	.	0.53	*	.	.	0.64	0.20
Val	350	.	.	B	B	.	.	.	0.53	*	.	.	0.30	0.25

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni..    Turn	Chou-...   Turn	Garni.. Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...    Antig...	Emini     Surfa...
															Ile	351	.	.	B	B	.	.	.	0.14	*	.	.	0.60	0.80
Glu	352	A	.	.	B	.	.	.	-0.37	.	.	.	0.60	0.59
															Asp	353	A	A	.	.	.	.	.	0.30	.	.	F	0.75	0.66
Glu	354	A	A	.	.	.	.	.	0.01	*	.	F	0.90	1.62
															Gly	355	A	A	.	.	.	.	.	0.28	*	.	F	0.75	0.95
Leu	356	A	A	.	.	.	.	.	1.13	*	.	.	0.30	0.57
															Gln	357	A	A	.	.	.	.	.	0.82	*	.	.	-0.30	0.45
Ala	358	A	A	.	.	.	.	.	0.01	*	.	.	-0.60	0.66
															Ala	359	A	A	.	.	.	.	.	-0.58	*	.	.	-0.60	0.66
His	360	A	A	.	.	.	.	.	-0.27	*	.	.	-0.60	0.38
															Thr	361	A	A	.	.	.	.	.	0.54	*	.	.	-0.60	0.52
Leu	362	A	A	.	.	.	.	.	-0.27	*	.	.	-0.30	0.88
															Ala	363	A	A	.	.	.	.	.	-0.02	*	.	.	-0.30	0.54
His	364	A	A	.	.	.	.	.	0.53	*	.	.	-0.30	0.37
															Glu	365	A	A	.	.	.	.	.	-0.29	*	.	.	-0.30	0.61
Leu	366	A	A	.	B	.	.	.	-0.79	*	.	.	-0.30	0.45
															Gly	367	A	A	.	B	.	.	.	-0.28	*	.	.	-0.60	0.27
His	368	A	A	.	B	.	.	.	-0.29	*	.	.	-0.30	0.21
															Val	369	A	A	.	B	.	.	.	-0.47	*	.	.	-0.60	0.25
Leu	370	.	A	B	B	.	.	.	-0.50	*	.	.	-0.26	0.39
															Ser	371	.	A	B	B	.	.	.	0.31	*	.	.	0.08	0.39
Met	372	.	.	B	.	.	.	.	0.66	.	.	.	0.92	0.88

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni.. Turn	Chou-...    Turn	Garni..    Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...    Beta	Karpl... Flexi...	James...    Antig...	Emini  Surfa...
															Pro	373	.	.	.	.	T	.	.	0.39	*	.	.	2.41	1.78
His	374	.	.	.	.	T	T	.	1.29	*	.	F	3.40	1.78
															Asp	375	.	.	.	.	T	T	.	1.89	.	.	F	3.06	3.61
Asp	376	.	.	.	.	T	T	.	1.52	.	.	F	2.89	3.61
															Ser	377	.	.	.	.	T	T	.	1.81	*	*	F	2.72	1.42
Lys	378	.	.	B	.	.	T	.	2.13	*	*	F	2.15	1.23
															Pro	379	.	.	.	.	T	T	.	1.36	*	*	F	2.38	1.44
Cys	380	.	.	B	.	.	T	.	0.66	*	*	F	1.70	0.89
															Thr	381	.	.	B	.	.	T	.	0.31	*	*	F	1.53	0.38
Arg	382	.	.	B	B	.	.	.	0.40	*	*	F	0.36	0.25
															Leu	383	.	.	B	B	.	.	.	-0.24	*	*	.	0.04	0.71
Phe	384	.	.	B	B	.	.	.	-0.38	*	.	.	-0.43	0.49
															Gly	385	.	.	.	B	.	.	C	0.33	*	.	F	0.05	0.25
Pro	386	.	.	.	.	.	T	C	0.61	*	*	F	0.45	0.59
															Met	387	.	.	.	.	T	T	.	0.47	*	*	F	0.65	0.93
Gly	388	A	.	.	.	.	T	.	0.42	.	.	F	1.00	1.29
															Lys	389	A	.	.	.	.	T	.	0.52	.	.	.	0.10	0.62
His	390	A	A	.	.	.	.	.	0.28	.	.	.	-0.30	0.62
															His	391	A	A	.	.	.	.	.	0.28	.	*	.	-0.30	0.63
Val	392	.	A	B	.	.	.	.	0.07	.	.	.	-0.30	0.49
															Met	393	A	A	.	.	.	.	.	-0.29	.	*	.	-0.60	0.30
Ala	394	A	A	.	.	.	.	.	-1.19	.	*	.	-0.60	0.19

Res	Pos.	Garni..  Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..  Beta	Chou-...     Beta	Garni..    Turn	Chou-...    Turn	Garnl...   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...  Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Pro	395	A	A	.	.	.	.	.	-1.19	.	*	.	-0.60	0.19
Leu	396	A	A	.	.	.	.	.	-1.97	.	*	.	-0.60	0.26
															Phe	397	A	A	.	.	.	.	.	-1.11	*	*	.	-0.60	0.21
Val	398	A	A	.	.	.	.	.	-0.51	*	.	.	-0.60	0.22
															His	399	.	A	B	.	.	.	.	-0.23	*	*	.	-0.60	0.46
Leu	400	.	A	B	.	.	.	.	-0.83	*	*	.	-0.60	0.77
															Asn	401	.	A	.	.	T	.	.	-0.23	*	*	F	-0.05	0.85
Gln	402	.	A	.	.	T	.	.	0.18	.	*	F	-0.05	0.97
															Thr	403	.	A	.	.	T	.	.	0.73	.	*	F	0.10	1.24
Leu	404	.	A	.	.	.	.	C	0.56	.	*	F	-0.10	1.03
															Pro	405	.	.	.	.	T	.	.	0.70	.	.	.	0.00	0.92
Trp	406	.	.	.	.	T	.	.	0.40	.	.	.	0.00	0.34
															Ser	407	.	.	.	.	.	T	C	-0.19	.	.	.	0.00	0.55
Pro	408	.	.	.	.	T	T	.	-0.48	.	.	.	0.20	0.36
															Cys	409	.	.	.	.	T	T	.	0.09	.	.	.	0.20	0.34
Ser	410	.	.	B	.	.	T	.	-0.51	.	.	.	-0.20	0.40
															Ala	411	.	A	B	.	.	.	.	-0.53	.	.	.	-0.60	0.21
Met	412	.	A	B	.	.	.	.	-0.23	.	.	.	-0.60	0.57
															Tyr	413	.	A	B	.	.	.	.	-0.83	.	.	.	-0.60	0.74
Leu	414	.	A	B	.	.	.	.	-0.98	*	.	.	-0.60	0.60
															Thr	415	.	A	B	.	.	.	.	-0.68	*	.	.	-0.60	0.50
Glu	416	A	A	.	.	.	.	.	-0.43	*	.	.	-0.30	0.54

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni..     Turn	Chou-...    Turn	Garni..     Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen...   Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...   Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Leu	417	A	A	.	.	.	.	.	-0.18	*	.	F	0.76	0.64
Leu	418	A	.	.	.	.	T	.	0.03	*	.	F	1.47	0.44
															Asp	419	.	.	.	.	T	T	.	0.50	*	.	F	2.18	0.35
Gly	420	.	.	.	.	T	T	.	0.81	.	.	F	1.89	0.42
															Gly	421	.	.	.	.	T	T	.	0.14	.	.	F	3.10	0.84
His	422	.	.	.	.	T	T	.	0.14	.	.	F	2.79	0.27
															Gly	423	.	.	.	.	T	T	.	0.14	.	.	F	1.58	0.23
Asp	424	.	.	B	.	.	T	.	0.14	.	*	.	0.72	0.19
															Cys	425	.	.	B	.	.	T	.	-0.10	.	*	.	1.01	0.23
Leu	426	.	.	B	.	.	.	.	0.03	.	*	.	0.50	0.24
															Leu	427	.	.	B	.	.	.	.	-0.28	.	*	.	0.50	0.22
Asp	428	.	.	B	.	.	.	.	-0.52	*	*	.	-0.10	0.40
															Ala	429	.	.	B	.	.	T	.	-1.11	*	.	F	0.25	0.49
Pro	430	A	.	.	.	.	T	.	-1.26	.	.	F	0.25	0.60
															Gly	431	.	.	.	.	T	T	.	-0.66	.	.	F	0.65	0.30
Ala	432	.	.	B	.	.	T	.	-0.66	.	.	.	-0.20	0.46
															Ala	433	.	.	B	.	.	.	.	-0.87	.	.	.	-0.40	0.24
Leu	434	.	.	B	.	.	.	.	-0.59	.	.	.	-0.40	0.38
															Pro	435	.	.	B	.	.	.	.	-0.72	.	.	.	-0.40	0.54
Leu	436	.	.	B	.	.	T	.	-1.19	.	.	.	-0.20	0.53
															Pro	437	.	.	B	.	.	T	.	-0.81	.	.	F	0.00	0.53
Thr	438	.	.	.	.	T	T	.	-0.57	.	*	F	0.45	0.53

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...     Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...    Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Gly	439	.	.	.	.	.	T	C	0.36	.	*	F	0.30	0.64
Leu	440	.	.	.	.	.	T	C	-0.03	.	*	F	1.25	0.81
															Pro	441	.	.	B	.	.	T	.	0.19	.	*	F	0.50	0.55
Gly	442	.	.	B	.	.	T	.	-0.41	.	*	F	0.45	0.57
															Arg	443	.	.	B	.	.	T	.	-0.34	.	*	.	0.25	0.57
Met	444	.	A	B	.	.	.	.	0.00	.	*	.	-0.50	0.57
															Ala	445	.	A	B	.	.	.	.	0.00	*	*	.	-0.10	1.00
Leu	446	.	A	B	.	.	.	.	0.21	*	.	.	-0.60	0.42
															Tyr	447	.	A	B	.	.	.	.	0.56	*	*	.	-0.60	0.71
Gln	448	.	A	B	.	.	.	.	0.44	*	*	.	-0.45	1.22
															Leu	449	A	A	.	.	.	.	.	0.38	*	*	.	-0.15	2.57
Asp	450	A	A	.	.	.	.	.	1.08	*	*	F	-0.15	0.88
															Gln	451	.	A	B	.	.	.	.	1.89	*	*	F	0.75	0.99
Gln	452	.	A	B	.	.	.	.	1.24	*	*	F	0.90	2.09
															Cys	453	.	A	B	.	.	.	.	0.54	*	*	F	0.75	0.88
Arg	454	.	A	B	.	.	.	.	1.01	*	*	.	-0.30	0.44
															Gln	455	.	A	B	.	.	.	.	0.80	*	.	.	-0.30	0.25
Ile	456	.	A	B	.	.	.	.	0.80	*	*	.	-0.30	0.72
															Phe	457	.	A	.	.	T	.	.	0.10	*	*	.	0.70	0.62
Gly	458	.	.	.	.	.	T	C	0.88	*	*	.	0.00	0.31
															Pro	459	.	.	.	.	T	T	.	0.73	*	*	F	0.65	0.86
Asp	460	.	.	.	.	T	T	.	0.07	*	*	F	1.40	1.35

Res	Pos.	Garni..    Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-...  Beta	Garni..   Turn	Chou-...     Turn	Garni..    Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen...   Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...    Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Phe	461	.	.	.	.	T	T	.	0.74	*	*	.	1.35	0.73
Arg	462	.	.	.	.	T	.	.	1.44	*	*	.	1.40	0.73
															His	463	.	.	.	.	T	.	.	1.48	*	*	.	1.65	0.71
Cys	464	.	.	.	.	.	T	C	1.39	*	*	.	1.45	1.18
															Pro	465	.	.	.	.	T	T	.	0.80	*	.	F	2.50	0.80
Asn	466	.	.	.	.	T	T	.	1.50	*	*	F	1.65	0.60
															Thr	467	.	.	.	.	T	T	.	1.39	*	*	F	1.55	1.93
Ser	468	.	A	.	.	T	.	.	0.57	*	.	F	1.50	2.08
															Ala	469	.	A	.	.	T	.	.	0.57	.	.	F	1.10	0.96
Gln	470	.	A	B	.	.	.	.	0.19	.	.	F	0.45	0.36
															Asp	471	.	A	B	.	.	.	.	0.19	*	*	F	0.45	0.27
Val	472	.	A	B	.	.	.	.	-0.31	*	.	.	-0.30	0.46
															Cys	473	.	A	B	.	.	.	.	-0.30	*	.	.	-0.30	0.22
Ala	474	.	A	B	.	.	.	.	-0.38	*	*	.	-0.60	0.14
															Gln	475	.	A	B	.	.	.	.	-0.41	.	*	.	-0.60	0.10
Leu	476	.	A	B	.	.	.	.	-0.72	*	*	.	-0.60	0.25
															Trp	477	.	A	B	.	.	.	.	0.13	.	*	.	-0.60	0.36
Cys	478	.	A	B	.	.	.	.	0.46	.	.	.	-0.26	0.35
															His	479	.	.	.	.	T	T	.	0.46	.	.	.	0.88	0.42
Thr	480	.	.	.	.	T	T	.	0.46	.	*	.	1.52	0.40
															Asp	481	.	.	.	.	T	T	.	1.06	.	.	F	3.06	1.30
Gly	482	.	.	.	.	T	T	.	0.53	.	.	F	3.40	1.48

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...      Beta	Garni..  Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen...   Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...  Flexi...	James...  Antig...	Emini  Surfa...
															Ala	483	.	.	.	.	T	.	C	0.53	*	.	F	2.41	0.85
Glu	484	A	.	.	.	.	.	.	0.53	*	.	F	1.67	0.27
															Pro	485	A	.	.	.	.	.	.	0.53	.	.	F	0.73	0.37
Leu	486	A	.	.	.	.	.	.	0.58	*	.	.	0.24	0.53
															Cys	487	A	.	.	.	.	.	.	0.92	.	.	.	0.78	0.62
His	488	.	.	B	.	.	.	.	1.17	.	.	F	0.61	0.64
															Thr	489	.	.	.	.	T	T	.	0.87	.	.	F	1.49	0.77
Lys	490	.	.	.	.	T	T	.	0.27	.	.	F	2.52	1.92
															Asn	491	.	.	.	.	T	T	.	0.87	.	.	F	2.80	1.16
Gly	492	.	.	.	.	T	T	.	1.24	.	.	F	2.52	1.25
															Ser	493	.	.	.	.	.	.	C	0.69	.	.	F	1.09	0.66
Leu	494	.	.	.	.	.	.	C	1.00	.	.	.	0.36	0.41
															Pro	495	.	.	B	.	.	.	.	0.61	.	.	.	0.18	0.69
Trp	496	.	.	.	.	T	T	.	0.30	.	.	.	0.50	0.51
															Ala	497	.	.	B	.	.	T	.	0.43	.	.	.	0.05	0.90
Asp	498	.	.	.	.	T	T	.	0.07	.	.	F	1.15	0.90
															Gly	499	.	.	.	.	T	T	.	0.53	.	.	F	1.40	0.46
Thr	500	.	.	.	.	.	T	C	0.53	.	.	F	2.05	0.45
															Pro	501	.	.	.	.	T	T	.	0.48	.	.	F	2.50	0.42
Cys	502	.	.	.	.	T	T	.	1.03	.	*	F	1.65	0.42
															Gly	503	.	.	.	.	.	T	C	0.22	.	.	F	1.20	0.39
Pro	504	.	.	.	.	T	.	.	-0.10	.	.	F	0.65	0.21

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...  Beta	Garni..   Turn	Chou-...  Turn	Garni..    Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen...  Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...    Flexi...	James...    Antig...	Emini   Surfa...
															Gly	505	.	.	.	.	T	.	.	-0.09	.	.	.	0.25	0.21
His	506	.	.	B	.	.	.	.	0.12	.	.	.	-0.40	0.28
															Leu	507	.	.	B	.	.	.	.	0.44	.	.	.	0.50	0.32
Cys	508	.	.	B	.	.	T	.	0.49	.	*	.	0.91	0.32
															Ser	509	.	.	.	.	T	T	.	0.03	.	.	F	1.67	0.31
Glu	510	.	.	.	.	T	T	.	-0.43	.	.	F	1.28	0.20
															Gly	511	.	.	.	.	T	T	.	-0.61	*	.	F	1.49	0 31
Ser	512	.	.	.	.	T	.	.	0.20	*	.	F	2.10	0.36
															Cys	513	.	A	.	.	.	.	C	0.87	.	.	F	1.79	0.36
Leu	514	.	A	.	.	.	.	C	1.17	.	.	F	1.58	0.63
															Pro	515	A	A	.	.	.	.	.	0.31	.	.	F	1.17	0.81
Glu	516	A	A	.	.	.	.	.	0.66	*	.	F	1.11	1.13
															Glu	517	A	A	.	.	.	.	.	1.07	*	.	F	0.90	2.37
Glu	518	A	A	.	.	.	.	.	1.52	.	.	F	0.90	3.00
															Val	519	A	A	.	.	.	.	.	2.38	.	.	F	0.90	2.68
Glu	520	A	A	.	.	.	.	.	2.38	*	.	F	0.90	3.09
															Arg	521	A	.	.	.	.	T	.	1.52	*	.	F	1.30	2.76
Pro	522	A	.	.	.	.	T	.	0.67	*	.	F	1.30	2.76
															Lys	523	A	.	.	.	.	T	.	0.67	*	*	F	1.30	1.18
Pro	524	.	.	B	.	.	T	.	1.18	*	*	F	1.30	1.01
															Val	525	.	.	B	.	.	.	.	0.83	*	*	F	0.65	0.65
Val	526	.	.	B	.	.	.	.	0.43	.	*	F	0.65	0.32

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..  Beta	Chou-...   Beta	Garni.. Turn	Chou-...    Turn	Garni..  Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Asp	527	.	.	B	.	.	T	.	0.06	*	.	F	-0.05	0.22
Gly	528	.	.	B	.	.	T	.	-0.20	*	.	F	-0.05	0.30
															Gly	529	.	.	.	.	T	T	.	-0.28	.	.	F	0.65	0.62
Trp	530	.	.	.	.	.	T	C	0.23	.	.	.	0.00	0.39
															Ala	531	.	.	.	.	.	.	C	0.88	.	.	.	-0.20	0.39
Pro	532	.	.	.	.	T	.	.	0.59	.	.	.	0.00	0.61
															Trp	533	.	.	.	.	T	.	.	0.59	.	.	.	0.00	0.61
Gly	534	.	.	.	.	.	T	C	0.93	.	.	.	0.00	0.59
															Pro	535	.	.	.	.	T	T	.	0.56	.	.	F	0.35	0.66
Trp	536	.	.	.	.	T	T	.	0.84	*	.	F	0.66	0.34
															Gly	537	.	.	.	.	.	T	C	1.17	*	.	F	1.07	0.46
Glu	538	.	.	.	.	T	.	.	1.14	*	.	F	1.98	0.58
															Cys	539	.	.	.	.	T	T	.	0.82	*	.	F	2.49	0.80
Ser	540	.	.	.	.	T	T	.	0.69	*	.	F	3.10	0.43
															Arg	541	.	.	.	.	T	T	.	0.63	*	.	F	2.79	0.25
Thr	542	.	.	.	.	T	T	.	0.63	*	.	F	2.18	0.46
															Cys	543	.	.	.	.	T	T	.	-0.22	*	.	F	1.87	0.34
Gly	544	.	.	.	.	T	T	.	0.44	*	.	F	1.56	0.13
															Gly	545	.	.	.	.	T	T	.	0.04	*	*	F	0.65	0.15
Gly	546	.	.	.	.	T	T	.	-0.37	*	*	F	0.35	0.25
															Val	547	.	.	B	B	.	.	.	-0.09	*	*	.	-0.60	0.33
Gln	548	.	.	B	B	.	.	.	0.69	*	*	.	-0.60	0.46

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...    Beta	Garni..  Turn	Chou-...  Turn	Garni..   Coil	Kyte-... Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...    Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Phe	549	.	.	B	B	.	.	.	1.03	*	*	.	-0.30	0.91
Ser	550	.	.	B	B	.	.	.	0.71	*	*	.	0.79	2.13
															His	551	.	.	B	.	.	.	.	1.10	*	*	.	1.18	0.66
Arg	552	.	.	.	.	T	.	.	1.96	*	*	.	2.37	1.52
															Glu	553	.	.	.	.	T	.	.	1.74	*	*	F	2.86	1.89
Cys	554	.	.	.	.	T	T	.	2.44	*	.	F	3.40	2.15
															Lys	555	.	.	.	.	T	T	.	2.53	*	.	F	3.06	1.90
Asp	556	.	.	.	.	.	T	C	2.57	*	.	F	2.52	1.70
															Pro	557	.	.	.	.	.	T	C	2.46	*	.	F	2.52	5.49
Glu	558	.	.	.	.	.	.	C	2.11	.	.	F	2.32	4.41
															Pro	559	.	.	.	.	T	T	.	2.43	.	*	F	2.72	2.62
Gln	560	.	.	.	.	T	T	.	2.50	.	*	F	2.76	1.67
															Asn	561	.	.	.	.	T	T	.	2.26	*	*	F	3.40	1.89
Gly	562	.	.	.	.	T	T	.	1.80	*	*	F	2.76	1.92
															Gly	563	.	.	.	.	T	T	.	0.99	*	*	F	2.27	0.59
Arg	564	.	.	B	.	.	T	.	0.86	*	.	F	0.93	0.30
															Tyr	565	.	.	B	.	.	T	.	0.97	.	.	.	0.44	0.30
Cys	566	.	.	B	.	.	T	.	1.08	.	.	.	1.00	0.60
															Leu	567	.	.	B	.	.	.	.	0.83	.	*	.	1.40	0.60
Gly	568	.	.	B	.	.	.	.	1.22	.	*	F	1.55	0.39
															Arg	569	.	.	B	.	.	.	.	0.87	.	*	F	2.30	1.45
Arg	570	.	.	.	.	T	.	.	1.11	*	*	F	3.00	2.75

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..  Beta	Chou-...   Beta	Garni..   Turn	Chou-...  Turn	Garni..   Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James... Antig...	Emini  Surfa...
															Ala	571	.	.	.	.	T	.	.	1.48	*	*	F	2.70	4.82
Lys	572	.	.	.	.	T	.	.	1.62	*	*	F	2.40	3.30
															Tyr	573	.	.	.	.	T	T	.	1.93	*	.	F	1.85	0.90
Gln	574	.	.	.	.	T	T	.	1.51	.	.	F	1.10	1.22
															Ser	575	.	.	.	.	T	T	.	1.40	.	*	.	0.50	0.88
Cys	576	.	.	.	.	T	T	.	1.99	.	.	.	0.50	0.97
															His	577	.	A	B	.	.	.	.	1.28	.	.	.	0.60	0.97
Thr	578	.	A	.	.	T	.	.	1.31	.	.	F	0.85	0.39
															Glu	579	.	A	.	.	T	.	.	1.10	.	.	F	1.00	1.12
Glu	580	.	A	.	.	T	.	.	1.40	.	*	F	1.64	1.27
															Cys	581	.	A	B	.	.	.	.	1.72	.	*	F	1.58	1.47
Pro	582	.	.	.	.	.	T	C	1.80	.	*	F	2.37	0.84
															Pro	583	.	.	.	.	T	T	.	1.81	*	.	F	2.91	0.97
Asp	584	.	.	.	.	T	T	.	1.11	*	.	F	3.40	2.43
															Gly	585	.	.	.	.	T	T	.	1.22	*	.	F	3.06	1.36
Lys	586	.	A	.	.	T	.	.	1.89	*	.	F	2.32	1.72
															Ser	587	A	A	.	.	.	.	.	2.10	.	.	F	1.58	1.79
Phe	588	A	A	.	.	.	.	.	2.31	.	.	F	1.24	3.13
															Arg	589	A	A	.	.	.	.	.	1.64	.	.	F	0.90	2.71
Glu	590	A	A	.	.	.	.	.	1.99	.	.	F	0.60	1.08
															Gln	591	A	A	.	.	.	.	.	1.99	.	.	F	0.90	2.17
Gln	592	A	A	.	.	.	.	.	2.04	.	*	F	0.90	2.21

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni.. Beta	Chou-... Beta	Garni.. Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...    Flexi...	James...   Antig...	Emini  Surfa...
															Cys	593	A	A	.	.	.	.	.	2.74	.	*	F	1.15	2.00
Glu	594	.	A	.	.	T	.	.	2.04	.	.	F	1.50	1.86
															Lys	595	.	A	.	.	T	.	.	1.80	.	.	F	1.75	1.08
Tyr	596	.	.	.	.	T	.	.	1.80	.	.	.	2.05	3.17
															Asn	597	.	.	.	.	T	T	.	1.56	.	.	.	2.50	2.94
Ala	598	.	.	.	.	T	T	.	1.91	.	.	.	1.35	2.30
															Tyr	599	.	.	B	.	.	T	.	1.91	.	.	.	0.70	2.12
Asn	600	.	.	B	.	.	T	.	1.27	.	*	.	0.75	2.20
															Tyr	601	.	.	B	.	.	.	.	1.51	.	.	.	0.25	2.16
Thr	602	.	.	B	.	.	.	.	1.17	.	*	F	0.70	2.30
															Asp	603	.	.	B	.	.	T	.	1.76	.	*	F	1.75	1.42
Met	604	.	.	B	.	.	T	.	1.19	.	*	F	2.00	1.45
															Asp	605	.	.	.	.	T	T	.	0.38	*	.	F	2.50	0.83
Gly	606	.	.	B	.	.	T	.	0.62	*	*	F	1.85	0.41
															Asn	607	.	.	B	B	.	.	.	0.64	*	*	F	0.60	0.72
Leu	608	A	.	.	B	.	.	.	-0.21	*	*	.	-0.10	0.45
															Leu	609	.	.	B	B	.	.	.	0.18	*	*	.	-0.35	0.34
Gln	610	.	.	B	B	.	.	.	0.22	*	*	.	-0.60	0.33
															Trp	611	.	.	B	B	.	.	.	0.32	*	.	.	-0.60	0.79
Val	612	.	.	B	B	.	.	.	-0.27	*	.	.	-0.45	1.50
															Pro	613	.	.	B	.	.	T	.	0.20	*	.	.	-0.20	0.88

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..    Turn	Chou-...  Turn	Garni..  Coil	Kyte-...  Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Lys	614	.	.	B	.	.	T	.	0.16	*	*	.	-0.20	0.82
Tyr	615	.	.	B	.	.	T	.	-0.14	.	.	.	0.10	0.82
															Ala	616	.	.	.	.	T	T	.	-0.07	*	*	.	0.50	0.71
Gly	617	.	.	.	.	T	.	.	0.90	*	.	.	0.64	0.55
															Val	618	.	.	B	.	.	.	.	1.11	.	*	.	0.58	0.69
Ser	619	.	.	B	.	.	T	.	1.18	.	*	F	2.32	1.14
															Pro	620	.	.	B	.	.	T	.	0.76	.	*	F	2.66	2.26
Arg	621	.	.	.	.	T	T	.	1.39	.	*	F	3.40	1.63
															Asp	622	.	.	.	.	T	T	.	0.92	.	*	F	3.06	2.43
Arg	623	.	A	.	.	T	.	.	1.08	.	*	F	2.32	1.30
															Cys	624	.	A	B	.	.	.	.	0.71	*	*	F	1.43	0.57
Lys	625	.	A	B	.	.	.	.	1.03	*	*	.	0.64	0.18
															Leu	626	.	A	B	.	.	.	.	0.33	*	*	.	0.30	0.18
Phe	627	.	A	B	.	.	.	.	0.44	.	*	.	0.04	0.35
															Cys	628	.	A	B	.	.	.	.	-0.01	.	*	.	0.98	0.34
Arg	629	.	A	B	.	.	.	.	0.77	*	*	.	1.32	0.41
															Ala	630	A	.	.	.	.	T	.	0.42	*	*	.	2.36	0.92
Arg	631	.	.	.	.	T	T	.	1.23	.	*	F	3.40	2.31
															Gly	632	.	.	.	.	T	T	.	1.23	.	*	F	3.06	2.04
Arg	633	.	.	.	.	T	T	.	1.94	.	*	F	2.72	1.75
															Ser	634	A	A	.	.	.	.	.	0.98	*	*	F	1.58	1.79

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..  Turn	Chou-...    Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...   Flexi...	James... Antig...	Emini  Surfa...
															Glu	635	A	A	.	.	.	.	.	0.87	*	*	F	1.24	1.34
Phe	636	A	A	.	.	.	.	.	0.76	*	*	F	0.45	0.59
															Lys	637	A	A	.	.	.	.	.	0.51	*	*	.	0.30	0.77
Val	638	A	A	.	.	.	.	.	0.44	*	*	.	0.30	0.45
															Phe	639	A	A	.	.	.	.	.	-0.11	.	.	.	0.45	1.03
Glu	640	A	A	.	.	.	.	.	-1.00	*	.	.	0.30	0.38
															Ala	641	A	.	.	B	.	.	.	-0.30	*	.	.	-0.30	0.36
Lys	642	A	.	.	B	.	.	.	-0.69	.	.	.	0.30	0.70
															Val	643	A	.	.	B	.	.	.	-0.14	.	.	.	0.60	0.40
Ile	644	A	.	.	B	.	.	.	-0.26	.	*	F	0.45	0.57
															Asp	645	.	.	B	B	.	.	.	-0.92	.	.	F	0.45	0.23
Gly	646	.	.	B	B	.	.	.	-0.68	*	.	F	-0.45	0.17
															Thr	647	.	.	B	B	.	.	.	-0.93	*	.	F	-0.15	0.24
Leu	648	.	.	.	B	.	.	C	-0.08	.	.	F	0.05	0.22
															Cys	649	.	.	.	B	T	.	.	0.50	*	*	.	0.10	0.39
Gly	650	.	.	.	.	.	T	C	-0.31	.	.	F	0.45	0.39
															Pro	651	.	.	.	.	T	T	.	-0.56	.	.	F	0.65	0.39
Glu	652	A	.	.	.	.	T	.	-1.13	.	.	F	0.25	0.73
															Thr	653	A	.	.	.	.	T	.	-0.99	.	.	F	0.25	0.52
Leu	654	A	.	.	B	.	.	.	-1.18	*	*	.	-0.30	0.18
															Ala	655	.	.	B	B	.	.	.	-0.72	*	*	.	-0.60	0.08
Ile	656	.	.	B	B	.	.	.	-0.86	.	*	.	-0.60	0.10

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-... Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen...   Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...   Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Cys	657	.	.	B	B	.	.	.	-0.86	.	*	.	-0.60	0.13
Val	658	A	.	.	B	.	.	.	-1.21	.	*	.	-0.30	0.21
															Arg	659	.	.	B	B	.	.	.	-1.26	.	*	.	-0.30	0.16
Gly	660	.	.	.	B	T	T	.	-0.62	.	*	F	0.25	0.23
															Gln	661	.	.	B	B	.	.	.	-0.32	.	*	F	0.45	0.61
Cys	662	.	.	B	B	.	.	.	0.00	.	*	.	0.30	0.32
															Val	663	.	.	B	B	.	.	.	0.19	.	*	.	0.30	0.32
Lys	664	.	.	B	.	.	T	.	0.08	.	*	.	0.10	0.10
															Ala	665	.	.	B	.	.	T	.	0.39	*	.	.	0.70	0.30
Gly	666	.	.	B	.	.	T	.	-0.47	*	.	.	0.70	0.56
															Cys	667	.	.	B	.	.	T	.	-0.66	*	*	.	0.70	0.21
Asp	668	.	.	B	B	.	.	.	0.20	*	*	.	-0.30	0.15
															His	669	.	.	B	B	.	.	.	-0.14	*	.	.	0.30	0.26
Val	670	.	.	B	B	.	.	.	0.23	*	.	.	0.30	0.64
															Val	671	.	.	B	B	.	.	.	0.69	*	.	.	0.64	0.59
Asp	672	.	.	B	B	.	.	.	1.40	*	.	F	1.13	0.86
															Ser	673	.	.	B	.	.	T	.	0.59	*	.	F	2.32	2.31
Pro	674	A	.	.	.	.	T	.	0.62	*	.	F	2.66	2.56
															Arg	675	.	.	.	.	T	T	.	1.52	*	.	F	3.40	2.56
Lys	676	.	.	.	.	T	T	.	1.71	*	.	F	3.06	3.82
															Leu	677	.	.	.	.	T	.	.	1.37	*	.	F	2.52	1.33
Asp	678	.	.	.	.	T	T	.	0.81	*	.	F	2.23	0.67

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...     Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen...   Alphn	Eisen...   Beta	Karpl...   Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Lys	679	.	.	B	.	.	T	.	0.36	*	.	F	1.49	0.25
Cys	680	.	.	B	.	.	T	.	-0.10	*	.	.	0.70	0.16
															Gly	681	.	.	B	.	.	T	.	-0.49	*	.	.	0.70	0.10
Val	682	.	.	B	.	.	.	.	0.37	*	.	.	-0.10	0.05
															Cys	683	.	.	B	.	.	T	.	0.02	.	.	.	0.10	0.18
Gly	684	.	.	.	.	T	T	.	-0.02	.	.	F	1.59	0.18
															Gly	685	.	.	.	.	T	T	.	0.34	.	.	F	1.93	0.38
Lys	686	.	.	.	.	T	T	.	0.02	.	.	F	2.27	0.96
															Gly	687	.	.	.	.	T	.	.	0.99	.	.	F	2.41	0.52
Asn	688	.	.	.	.	T	T	.	1.70	.	.	F	3.40	1.03
															Ser	689	.	.	B	.	.	T	.	1.19	.	.	F	2.66	1.03
Cys	690	.	.	B	.	.	T	.	1.23	.	.	F	2.34	0.77
															Arg	691	.	.	B	.	.	T	.	0.84	.	.	F	2.17	0.64
Lys	692	.	.	B	.	.	.	.	0.89	*	.	F	1.80	0.47
															Val	693	.	.	B	.	.	T	.	0.08	*	.	F	1.98	1.18
Ser	694	.	.	B	.	.	T	.	0.07	*	.	F	1.70	0.50
															Gly	695	.	.	B	.	.	T	.	0.52	*	.	F	0.93	0.36
Ser	696	.	.	B	.	.	T	.	0.10	*	.	F	0.46	0.75
															Leu	697	.	.	B	.	.	.	.	0.06	.	*	F	0.39	0.81
Thr	698	.	.	B	.	.	.	.	0.67	.	.	F	0.37	1.31
															Pro	699	.	.	B	.	.	T	.	0.62	.	.	F	0.10	1.53
Thr	700	.	.	.	.	T	T	.	0.72	.	.	F	0.50	1.84

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...  Alpha	Garni..  Beta	Chou-...   Beta	Garni.. Turn	Chou-... Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Asn	701	.	.	B	.	.	T	.	1.02	.	.	F	0.10	2.00
Tyr	702	.	.	.	.	T	T	.	1.83	*	.	.	0.35	2.08
															Gly	703	.	.	.	.	T	T	.	1.26	*	.	.	0.65	2.41
Tyr	704	.	.	.	.	T	T	.	0.61	*	.	.	0.35	1.05
															Asn	705	.	.	B	.	.	T	.	0.61	*	.	.	-0.20	0.50
Asp	706	.	.	B	.	.	T	.	-0.28	*	.	.	0.10	0.72
															Ile	707	.	.	B	B	.	.	.	-0.24	*	.	.	-0.60	0.32
Val	708	.	.	B	B	.	.	.	-0.49	.	.	.	-0.30	0.31
															Thr	709	.	.	B	B	.	.	.	-0.59	*	.	.	-0.60	0.19
Ile	710	.	.	B	B	.	.	.	-1.18	.	.	.	-0.60	0.27
															Pro	711	.	.	B	.	.	T	.	-1.49	*	.	.	-0.20	0.36
Ala	712	.	.	B	.	.	T	.	-0.60	*	.	.	-0.20	0.36
															Gly	713	.	.	.	.	.	T	C	-0.63	.	*	.	0.00	0.83
Ala	714	.	.	.	.	.	T	C	-0.32	.	*	F	0.15	0.38
															Thr	715	.	.	B	B	.	.	.	-0.29	.	*	F	0.45	0.62
Asn	716	.	.	B	B	.	.	.	-0.03	.	*	F	-0.15	0.47
															Ile	717	.	.	B	B	.	.	.	0.56	.	*	F	0.45	0.92
Asp	718	.	.	B	B	.	.	.	1.01	.	*	F	0.60	1.11
															Val	719	.	.	B	B	.	.	.	1.30	.	*	F	0.90	1.35
Lys	720	.	.	B	B	.	.	.	1.58	.	*	F	0.90	2.58
															Gln	721	.	.	B	.	.	.	.	1.37	.	*	F	1.10	2.10
Arg	722	.	.	B	.	.	.	.	1.91	.	*	F	1.10	4.38

Res	Pos.	Garni..   Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..  Turn	Chou-...  Turn	Garni..  Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...   Beta	Karpl...   Flexi...	James... Antig...	Emini   Surfa...
															Ser	723	.	.	.	.	.	.	C	1.06	*	*	F	1.30	2.17
His	724	.	.	.	.	.	T	C	1.91	*	*	F	1.05	0.93
															Pro	725	.	.	.	.	.	T	C	1.87	.	*	F	1.33	0.82
Gly	726	.	.	.	.	T	T	.	1.87	*	*	F	1.21	0.99
															Val	727	.	.	B	.	.	T	.	1.41	*	*	F	1.84	1.21
Gln	728	.	.	B	.	.	.	.	1.71	.	*	F	1.77	0.77
															Asn	729	.	.	B	.	T	T	.	1.50	*	.	F	2.80	1.26
Asp	730	.	.	.	.	T	T	.	0.90	*	.	F	1.92	2.66
															Gly	731	.	.	.	.	T	T	.	0.66	.	.	F	1.64	1.27
Asn	732	.	.	B	.	.	T	.	0.70	.	*	F	0.81	0.80
															Tyr	733	.	A	B	.	.	.	.	0.74	.	.	.	-0.32	0.39
Leu	734	.	A	B	.	.	.	.	0.43	*	.	.	-0.60	0.79
															Ala	735	.	A	B	.	.	.	.	-0.16	*	.	.	-0.60	0.71
Leu	736	.	A	B	.	.	.	.	0.19	.	.	.	-0.40	0.46
															Lys	737	.	A	B	.	.	.	.	-0.16	.	.	F	0.85	0.93
Thr	738	.	.	B	.	.	T	.	0.09	.	.	F	1.45	0.91
															Ala	739	A	.	.	.	.	T	.	0.66	.	.	F	2.10	1.91
Asp	740	.	.	B	.	.	T	.	0.43	.	.	F	2.00	1.50
															Gly	741	.	.	B	.	.	T	.	0.43	.	*	F	1.05	0.86
Gln	742	.	.	B	.	.	.	.	0.39	.	*	F	0.35	0.70
															Tyr	743	.	.	B	.	.	.	.	0.36	.	*	.	0.30	0.67

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-..    Alpha	Garni..  Beta	Chou-...   Beta	Garni..  Turn	Chou-...    Turn	Garni..   Coil	Kyte-...     Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen... Beta	Karpl... Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Leu	744	.	.	B	.	.	.	.	0.94	.	*	.	-0.20	0.67
Leu	745	.	.	B	.	.	.	.	0.13	.	*	.	-0.40	0.63
															Asn	746	.	.	B	.	.	T	.	-0.11	.	*	F	-0.05	0.33
Gly	747	.	.	.	.	T	T	.	-1.00	.	*	F	0.35	0.40
															Asn	748	.	.	.	.	.	T	C	-1.06	.	*	.	0.00	0.34
Leu	749	.	.	.	.	.	T	C	-0.83	.	*	.	0.00	0.29
															Ala	750	A	A	B	.	.	.	.	-0.91	.	*	.	-0.60	0.29
Ile	751	.	A	B	.	.	.	.	-0.91	*	*	.	-0.60	0.13
															Ser	752	.	A	B	.	.	.	.	-0.57	*	*	.	-0.60	0.27
Ala	753	A	A	.	.	.	.	.	-0.57	*	.	.	-0.30	0.46
															Ile	754	A	A	.	.	.	.	.	-0.64	*	.	.	0.45	1.09
Glu	755	A	A	.	.	.	.	.	-0.87	*	.	F	0.45	0.57
															Gln	756	A	.	.	B	.	.	.	-0.83	.	*	F	0.45	0.47
Asp	757	A	.	.	B	.	.	.	-0.49	.	*	F	-0.15	0.49
															Ile	758	A	.	.	B	.	.	.	-0.24	.	*	.	0.60	0.57
Leu	759	A	.	.	B	.	.	.	0.33	.	*	.	0.30	0.33
															Val	760	A	.	.	B	.	.	.	-0.56	.	*	.	0.30	0.28
Lys	761	A	.	.	B	.	.	.	-1.37	.	*	F	-0.45	0.28
															Gly	762	.	.	B	B	.	.	.	-1.32	.	*	F	-0.45	0.28
Thr	763	.	.	B	B	.	.	.	-0.68	.	*	F	0.45	0.76
															Ile	764	.	.	B	B	.	.	.	-0.17	.	.	F	-0.15	0.59
Leu	765	.	.	B	B	.	.	.	0.34	.	*	.	-0.60	0.80

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..   Beta	Chou-...   Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..   Coil	Kyte-... Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...   Flexi...	James...   Antig...	Emini   Surfa...
															Lys	766	.	.	B	B	.	.	.	0.00	.	*	F	-0.45	0.55
Tyr	767	.	.	B	.	.	T	.	-0.54	*	*	F	0.40	1.05
															Ser	768	.	.	.	.	.	T	C	-0.82	*	*	F	0.45	0.89
Gly	769	.	.	.	.	.	T	C	-0.24	*	.	F	0.45	0.45
															Ser	770	.	.	.	.	.	T	C	-0.24	.	*	F	0.15	0.42
Ile	771	.	A	B	.	.	.	.	-0.29	*	*	.	-0.60	0.26
															Ala	772	.	A	B	.	.	.	.	0.07	*	.	.	-0.30	0.45
Thr	773	.	A	B	.	.	.	.	-0.44	*	*	.	0.30	0.66
															Leu	774	.	A	B	.	.	.	.	-0.10	*	.	.	-0.30	0.77
Glu	775	A	A	.	.	.	.	.	-0.10	*	.	.	0.45	1.32
															Arg	776	.	A	B	.	.	.	.	0.09	.	.	F	0.60	1.23
Leu	777	.	A	.	.	T	.	.	0.79	.	.	F	1.00	1.29
															Gln	778	.	A	.	.	T	.	.	0.89	.	.	F	1.30	1.46
Ser	779	.	A	.	.	T	.	.	0.89	.	.	F	1.00	1.15
															Phe	780	.	.	B	.	.	.	.	0.68	*	.	F	0.41	1.15
Arg	781	.	.	.	.	.	.	C	0.57	.	*	F	0.82	1.03
															Pro	782	.	.	.	.	.	.	C	1.17	*	.	F	1.63	1.33
Leu	783	.	.	.	.	.	T	C	0.36	*	.	F	2.04	2.37
															Pro	784	.	.	.	.	.	T	C	0.34	*	*	F	2.10	1.00
Glu	785	.	.	.	.	.	T	C	0.19	*	*	F	1.29	0.93
															Pro	786	.	.	B	.	.	T	.	0.08	*	*	F	0.88	0.84
Leu	787	.	.	B	B	.	.	.	-0.52	.	*	F	0.27	0.94

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-...    Beta	Garni..   Turn	Chou-...   Turn	Garni..  Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpi...  Flexi...	James... Antig...	Emini   Surfa...
															Thr	788	.	.	B	B	.	.	.	-0.52	.	*	.	-0.09	0.45
Val	789	.	.	B	B	.	.	.	-0.62	.	.	.	-0.60	0.24
															Gln	790	.	.	B	B	.	.	.	-1.48	.	.	.	-0.60	0.42
Leu	791	.	.	B	B	.	.	.	-1.48	.	.	.	-0.60	0.21
															Leu	792	.	.	B	B	.	.	.	-1.01	.	*	.	-0.60	0.45
Thr	793	.	.	B	B	.	.	.	-0.70	.	*	.	-0.60	0.26
															Val	794	.	.	B	.	.	T	.	-0.70	*	.	F	0.25	0.54
Pro	795	.	.	B	.	.	T	.	-1.40	*	.	F	0.25	0.48
															Gly	796	.	.	B	.	.	T	.	-0.80	*	.	F	-0.05	0.29
Glu	797	.	.	B	.	.	T	.	-0.20	.	*	F	0.25	0.60
															Val	798	.	.	B	.	.	.	.	0.16	.	*	F	0.05	0.60
Phe	799	.	.	B	.	.	.	.	0.16	.	*	F	1.00	1.22
															Pro	800	.	.	B	.	.	T	.	0.41	*	*	F	1.25	0.52
Pro	801	.	.	.	.	T	T	.	0.51	*	*	F	2.00	1.41
															Lys	802	.	.	.	.	T	T	.	0.20	*	*	F	1.60	2.55
Val	803	.	.	B	.	.	T	.	0.36	.	*	F	2.00	2.38
															Lys	804	.	.	B	B	.	.	.	0.36	.	*	F	0.80	1.33
Tyr	805	.	.	B	B	.	.	.	-0.29	.	*	.	0.00	0.58
															Thr	806	.	.	B	B	.	.	.	-0.29	.	*	.	-0.20	0.58
Phe	807	.	.	B	B	.	.	.	-0.33	.	*	.	-0.40	0.45
															Phe	808	.	.	B	B	.	.	.	0.52	*	*	.	-0.60	0.46
Val	809	.	.	B	.	.	T	.	-0.38	*	*	.	-0.20	0.53

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..  Beta	Chou-...   Beta	Garni..  Turn	Chou-...    Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...  Flexi...	James... Antig...	Emini  Surfa...
															Pro	810	.	.	B	.	.	T	.	-0.13	.	*	F	-0.05	0.45
Asn	811	.	.	.	.	T	T	.	-0.52	.	*	F	1.25	0.88
															Asp	812	.	.	.	.	T	T	.	-0.12	.	*	F	1.40	1.02
Val	813	A	.	.	.	.	.	.	-0.02	*	*	F	0.65	0.89
															Asp	814	A	.	.	.	.	.	.	0.83	*	*	F	0.50	0.54
Phe	815	A	.	.	.	.	.	.	0.74	.	*	F	0.80	0.57
															Ser	816	A	.	.	.	.	.	.	0.44	.	*	F	0.65	1.02
Met	817	A	.	.	.	.	.	.	0.49	.	*	F	1.40	0.82
															Gln	818	A	.	.	.	.	T	.	1.34	.	*	F	2.20	1.89
Ser	819	.	.	.	.	.	T	C	1.46	.	*	F	3.00	2.44
															Ser	820	.	.	.	.	.	T	C	1.57	.	*	F	2.70	4.84
Lys	821	A	.	.	.	.	T	.	1.56	.	*	F	2.20	2.82
															Glu	822	A	.	.	.	.	.	.	1.84	.	*	F	1.70	3.04
Arg	823	A	.	.	B	.	.	.	1.84	*	*	F	1.20	3.27
															Ala	824	A	.	.	B	.	.	.	1.26	*	*	F	0.90	2.63
Thr	825	.	.	B	B	.	.	.	0.67	*	*	F	0.60	1.06
															Thr	826	.	.	B	B	.	.	.	0.62	*	*	F	-0.15	0.38
Asn	827	.	.	B	B	.	.	.	0.41	*	*	.	-0.60	0.65
															Ile	828	.	.	B	B	.	.	.	-0.51	*	*	.	-0.60	0.70
Ile	829	.	.	B	B	.	.	.	-0.73	*	.	.	-0.60	0.40
															Gln	830	.	A	B	.	.	.	.	-0.46	*	.	.	-0.60	0.21
Pro	831	.	A	B	.	.	.	.	-0.73	*	.	.	-0.60	0.40

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...    Alpha	Garni..  Beta	Chou-...    Beta	Garni..   Turn	Chou-...     Turn	Garni..   Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Beta	Karpl...  Flexi...	James...  Antig...	Emini  Surfa...
															Leu	832	.	A	B	.	.	.	.	-0.73	*	*	.	-0.60	0.57
Leu	833	.	A	B	.	.	.	.	-0.13	.	.	.	-0.60	0.57
															His	834	.	A	B	.	.	.	.	-0.10	.	*	.	-0.60	0.39
Ala	835	.	A	B	B	.	.	.	-0.91	.	*	.	-0.60	0.35
															Gln	836	.	A	B	B	.	.	.	-1.04	.	.	.	-0.60	0.35
Trp	837	.	A	B	B	.	.	.	-0.23	.	.	.	-0.60	0.26
															Val	838	.	A	B	B	.	.	.	0.29	.	*	.	-0.60	0.42
Leu	839	.	.	B	.	.	T	.	0.02	*	.	.	-0.20	0.26
															Gly	840	.	.	.	.	T	T	.	0.61	*	.	.	0.45	0.33
Asp	841	.	.	.	.	T	T	.	-0.06	.	.	F	1.15	0.76
															Trp	842	.	.	.	.	T	T	.	-0.07	.	.	F	2.00	0.50
Ser	843	.	.	.	.	.	T	.	0.49	*	.	F	2.05	0.67
															Glu	844	.	.	.	.	T	T	.	0.99	.	.	F	2.50	0.54
Cys	845	.	.	.	.	T	T	.	0.67	.	.	F	1.65	0.74
															Ser	846	.	.	.	.	T	T	.	0.32	.	.	F	2.00	0.30
Ser	847	.	.	.	.	T	.	.	0.02	.	.	F	1.55	0.17
															Thr	848	.	.	.	.	T	.	.	-0.02	.	.	F	0.70	0.32
Cys	849	.	.	.	.	T	.	.	-0.31	.	.	F	0.45	0.24
															Gly	850	.	.	.	.	T	T	.	0.36	*	.	.	0.20	0.18
Ala	851	.	.	.	.	T	T	.	0.77	.	.	.	0.20	0.22
															Gly	852	.	.	.	.	T	T	.	1.18	.	.	.	0.50	0.81
Trp	853	.	.	.	.	T	T	.	1.18	*	.	.	1.25	1.60

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..   Beta	Chou-...    Beta	Garni..   Turn	Chou-...     Turn	Garni..  Coil	Kyte-...    Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen... Beta	Karpl...   Flexi...	James...    Antig...	Emini  Surfa...
															Gln	854	.	.	B	B	.	.	.	0.99	*	.	F	0.60	2.29
Arg	855	.	.	B	B	.	.	.	1.33	*	.	F	0.60	1.72
															Arg	856	.	.	B	B	.	.	.	1.26	.	*	F	0.90	2.83
Thr	857	.	.	B	B	.	.	.	1.71	.	.	F	1.05	0.87
															Val	858	.	.	B	B	.	.	.	2.00	.	.	.	1.20	0.87
Glu	859	.	.	B	B	.	.	.	1.79	.	.	.	1.50	0.75
															Cys	860	.	.	.	.	T	.	.	1.38	.	*	.	2.40	0.80
Arg	861	.	.	.	.	T	.	.	0.92	.	.	F	3.00	1.44
															Asp	862	.	.	.	.	.	T	C	1.23	.	*	F	2.55	0.82
Pro	863	.	.	.	.	T	T	.	1.50	.	*	F	2.60	2.66
															Ser	864	.	.	.	.	T	T	.	1.20	.	*	F	2.30	1.37
Gly	865	.	.	.	.	T	T	.	1.28	.	.	F	1.70	1.10
															Gln	866	A	.	.	.	.	.	.	0.86	.	*	F	0.05	0.72
Ala	867	.	.	B	.	.	.	.	0.19	.	*	F	0.05	0.78
															Ser	868	.	.	B	.	.	.	.	0.40	.	*	.	-0.10	0.42
Ala	869	A	.	.	.	.	.	.	0.74	.	*	.	-0.10	0.39
															Thr	870	A	.	.	.	.	T	.	0.50	*	.	.	0.70	0.77
Cys	871	A	.	.	.	.	T	.	-0.31	*	.	.	0.70	0.58
															Asn	872	A	.	.	.	.	T	.	0.32	*	.	.	0.10	0.48
Lys	873	A	.	.	.	.	T	.	0.41	.	.	F	0.85	0.66
															Ala	874	A	.	.	.	.	.	.	1.00	*	.	F	0.80	1.90
Leu	875	A	.	.	.	.	.	.	1.31	*	.	F	1.10	2.05

Res	Pos.	Garni.. Alpha	Chou-...   Alpha	Garni..    Beta	Chou-... Beta	Garni.. Turn	Chou-...   Turn	Garni..  Coil	Kyte-...   Hydro...	Eisen... Alpha	Eisen...  Bets	Karpl...  Flexi...	James...   Antig...	Emini  Surfa...
															Lys	876	A	.	.	.	.	T	.	1.39	.	.	F	1.30	1.71
Pro	877	A	.	.	.	.	T	.	1.43	.	.	F	1.30	1.71
															Glu	878	A	.	.	.	.	T	.	1.18	.	.	F	1.30	4.14
Asp	879	A	.	.	.	.	T	.	1.10	.	.	F	1.30	3.20
															Ala	880	A	.	.	.	.	.	.	1.91	.	.	F	1.10	1.11
Lys	881	A	.	.	.	.	T	.	1.57	.	.	F	1.30	1.11
															Pro	882	A	.	.	.	.	T	.	1.78	*	.	F	1.15	0.89
Cys	883	A	.	.	.	.	T	.	0.97	*	.	F	1.30	1.53
															Glu	884	A	.	.	.	.	T	.	0.30	.	.	F	1.15	0.63
Ser	885	A	A	.	.	.	.	.	0.68	*	.	F	-0.15	0.22
															Gln	886	.	A	B	.	.	.	.	-0.18	*	.	F	-0.15	0.63
Leu	887	.	A	B	.	.	.	.	-0.36	.	.	.	-0.30	0.30
															Cys	888	.	A	B	.	.	.	.	-0.08	.	.	.	-0.60	0.29
Pro	889	.	A	B	.	.	.	.	-0.47	.	.	.	-0.60	0.21
															Leu	890	.	.	B	.	.	.	.	-0.56	.	.	.	-0.40	0.33

发明详述

通过用编码TSP-1抗血管生成结构域的cDNA筛选cDNA文库，本发明发明者已鉴定了两种新的蛋白质METH1和METH2(作为血管内皮生长拮抗物也分别称VEGA-1和VEGA-2)，它们包括TSP-1的抗血管生成结构域、金属蛋白酶结构域和类去整联蛋白结构域。本发明发明者已证实METH1和METH2均具抗血管生成活性。

因而，本发明提供了含编码具SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的METH1多肽之多核苷酸的分离核酸分子，它是通过对cDNA克隆测序进行测定的。本发明METH1蛋白与血小板反应蛋白-1和pNPI具序列同源性。SEQ IDNO：1中所示核苷酸序列是通过对cDNA克隆测序而获得，该克隆于1998年1月15日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manasssas，Virginia20110-2209，接收号为209581。ATCC保藏号209581中所含的cDNA克隆包括编码SEQ ID NO：2中1-950位氨基酸的METH1序列。

本发明还提供了含编码具SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的METH2多肽之多核苷酸的分离核酸分子，它是通过对cDNA克隆测序而部分测定的。本发明METH2蛋白与血小板反应蛋白-1和pNPI具序列同源性。SEQ IDNO：3中所示核苷酸序列是通过对cDNA克隆测序而部分获得的，该克隆于1998年1月15日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manasssas，Virginia20110-2209，接收号为209582。ATCC保藏号209582中所含的cDNA克隆包括编码SEQ ID NO：4中112-890位氨基酸的部分METH2序列。

核酸分子

此处通过DNA分子测序确定的一些核苷酸序列是用自动DNA测序仪测定的(如来自Applied Biosystem，Inc的Model 373)，本文所测定DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列是通过翻译以上所测DNA序列而推测的。因此，正如本领域已知用此自动方法所测任何DNA序列一样，本文所测的任何核苷酸序列可能含有某些错误。自动化测定的核苷酸序列一般与所测DNA分子的真实核苷酸序列至少约90％相同，更通常地至少约95％-99.9％相同。真实的序列可用其它方法更准确地测定，包括本领域众所周知的人工DNA测序方法。又如本领域中已知的，与真实的序列相比，所测核苷酸序列中单个插入或缺失将造成该核苷酸序列翻译中发生移码，以至由所测核苷酸序列编码的预计氨基酸序列自所说的插入或缺失位点开始将完全不同于所测DNA分子真正编码的氨基酸序列。

利用本文提供的信息，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中的核苷酸序列，可用标准克隆和筛选方法获得编码METH1或METH2多肽的本发明核酸分子，诸如那些用于以mRNA为原材料的克隆cDNA的方法。作为本发明的例证，SEQ ID NO：1中所述核酸分子发现于来自人心脏的cDNA文库，而SEQ ID NO：3中所述核酸分子发现于来自人肺的cDNA文库。所测的SEQID NO：1中METH1 cDNA核苷酸序列含编码约950个氨基酸残基长蛋白质的开放阅读框架，其中包括约28个氨基酸残基长的预计前导序列。本发明发明者已测定SEQ ID NO：3中METH2 cDNA核苷酸序列含编码约890个氨基酸残基长蛋白质的开放阅读框架，其中包括约23个氨基酸残基长的预计前导序列。

本发明还提供了成熟形式的本发明METH1和METH2蛋白质。按照信号假说，哺乳动物细胞所分泌的蛋白质具有信号或分泌前导序列，一旦正在生长的蛋白质链已开始穿越粗面内质网，这种序列即从成熟蛋白质上切割下来。大部分哺乳动物细胞和甚至昆虫细胞以相同的特异性切割分泌的蛋白质。然而，在某些情况下，分泌蛋白质的切割不完全相同，这将导致两个或多个成熟种类的蛋白质。此外，长期以来已知分泌蛋白质的切割特异性最终由完整蛋白质的一级结构所决定，也就是说，它是多肽氨基酸序列内所固有的。因此，本发明提供了编码成熟METH1多肽的核苷酸序列，该多肽具有由鉴定为ATCC保藏号209581的宿主所含cDNA克隆编码并如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明也提供了编码成熟METH2多肽的核苷酸序列，该多肽具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。成熟METH1蛋白质具有由鉴定为ATCC保藏号209581的宿主所含cDNA克隆编码的氨基酸序列表示通过被保藏宿主内载体所含克隆之人DNA序列编码的完整开放阅读框架在哺乳动物细胞(如下述的COS细胞)的表达中产生的成熟形式的METH1蛋白质。如下所示，具有由ATCC保藏号209581中cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟METH1可以相同或不同于SEQ ID NO：2所示(约第29-950位氨基酸)的预计“成熟”METH1蛋白质，这取决于以计算机分析为基础的预计切割位点的精确度；而成熟METH2可以相同或不同于SEQ ID NO：4所示(约第24-890位氨基酸)的预计“成熟”METH2蛋白质，这也取决于以计算机分析为基础的预计切割位点的精确度。

用于预计蛋白质是否具有分泌前导序列以及该前导序列切割位点的方法是可获得的。例如，可利用McGeoch(病毒研究3：271-286(1985))和yon Heinje(核酸研究14：4683-4690(1986))的方法。这些方法中每一个预计已知哺乳动物分泌蛋白质切割点的精确度范围为75-80％。VonHeinje，同上。然而，对于所给蛋白质，两种方法并非总能得到相同的预计切割点。

在本文中，用计算机软件(“PSORT”)(K.Nakai和M.Kanehisa，Genomics14：897-911(1992))分析本发明完整METH1和METH2多肽的预计氨基酸序列，这是一个基于氨基酸序列预计蛋白质之细胞定位的专门系统。作为此计算机预计定位的部分，也使用McGeoch和von Heinje的方法。用PSORT软件进行的分析预测切割位点在SEQ ID NO：2中是氨基酸28-29之间，而在SEQ ID NO：4中是氨基酸23-24之间。其后，应用简单形式的von Heinje(-1、-3)规则通过目测进一步分析该完整的氨基酸序列。von Heinje，同上。因而，预计METH1蛋白质的前导序列由SEQ IDNO：2中约1-28位氨基酸残基组成，而预计成熟METH1蛋白质由约29-950位氨基酸残基组成；预计METH2蛋白质的前导序列由SEQ ID NO：4中约1-23位氨基酸残基组成，而预计成熟METH2蛋白质由约24-890位氨基酸残基组成。另一种预计成熟METH1蛋白质由SEQ ID NO：2中约30-950位残基组成。

作为常规技术人员应当理解，由于测序的可能性错误以及在不同已知蛋白质中前导序列切割位点的可变性，由所保藏cDNA编码的预计METH1多肽包括约950个氨基酸，但也可以是910-990个氨基酸范围内任何数目；预计该蛋白质的前导序列约为28个氨基酸，但也可以是约18-38个氨基酸范围内任何数目。此外，预计METH2多肽包括约890个氨基酸，但也可以是850-约930个氨基酸范围内任何数目；预计该蛋白质的前导序列约为23个氨基酸，但也可以是约13-33个氨基酸范围内任何数目。

正如所表明的，本发明的核酸分子可以是诸如mRNA之类的RNA形式，或是DNA形式，包括例如通过克隆或合成产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链，已知为有义链，或可以是非编码链，也称反义链。

“分离的”核酸分子意指已脱离自其天然环境的核酸分子、DNA或RNA。例如，为本发明的目的，载体中所含的重组DNA分子也视为分离的。分离DNA分子的另外例子包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中的纯化(部分地或基本上)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子在体内或体外的RNA转录物。按照本发明，分离的核酸分子还包括合成产生的这些分子。

本发明的分离核酸分子包括含有如SEQ ID NO：1所示开放阅读框架(ORF)的DNA分子；含成熟METH1蛋白质编码序列的DNA分子；以及含有基本不同于上述分子，但由于遗传密码的简并性依然编码METH1蛋白质的序列的DNA分子。还包括含有如SEQ ID NO：3所示开放阅读框架(ORF)的DNA分子；含成熟METH2蛋白质编码序列的DNA分子；以及含有基本不同于上述分子，但由于遗传密码的简并性依然编码METH2蛋白质的序列的DNA分子。当然，遗传密码在本领域中是众所周知的。因此，对本领域技术熟练人员来说产生所说的简并变体是常规工作。

另一方面，本发明提供了编码METH1或METH2多肽的分离核酸分子，所述多肽具有分别由以下两质粒中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列：于1998年1月15日保藏的ATCC保藏号209581或于1998年1月15日保藏的ATCC保藏号209582。在另外的实施方案中，提供了编码成熟METH1或METH2多肽或缺少N-末端甲硫氨酸的全长METH1或METH2多肽的核酸分子。本发明还提供了具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列或上述保藏克隆中所含METH1或METH2 cDNA的核苷酸序列的分离核酸分子，或具有与上述序列之一互补的序列的核酸分子。这样的分离分子，尤其是DNA分子可用作探针，通过染色体原位杂交用于基因作图，以及通过例如RNA印迹分析用于检测在人组织中METH1或METH2基因的表达。

本发明还涉及本文所述分离核酸分子的片段。具有保藏cDNA的或者如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的分离核酸分子的片段指至少约15nt，更优选至少约20nt，还更优选至少约30nt，更优选至少约40nt长的片段，如本文所述它们可用作诊断探针和引物。当然，按照本发明，相应于保藏cDNA或者如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列大部分甚至全部的较长片段，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000nt长的片段也是有用的。例如，至少20nt长的片段意指该片段包括来自保藏cDNA或如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的20个或更长的连续碱基。

本发明优选的核酸片段包括编码METH1或METH2蛋白质带表位部分的核酸分子。确定METH1或METH2蛋白质带表位部分的方法如下所详述。

其它本发明优选的核酸片段包括编码以下部分的核酸分子：METH1的金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：2中的第235-459位氨基酸；METH1的去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：2中的第460-544位氨基酸；METH1的第一个类TSP结构域，SEQ ID NO：2中的第545-598位氨基酸；METH1的第二个类TSP结构域，SEQ ID NO：2中的第841-894位氨基酸；METH1的第三个类TSP结构域，SEQ ID NO：2中的第895-934位氨基酸；SEQ IDNO：2中的第536-613位氨基酸；SEQ ID NO：2中的第549-563位氨基酸；METH2的金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：4中的第214-439位氨基酸；METH2的去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：4中的第440-529位氨基酸；METH2的第一个类TSP结构域，SEQ ID NO：4中的第530-583位氨基酸；METH2的第二个类TSP结构域，SEQ ID NO：4中的第837-890位氨基酸；SEQ ID NO：4中的第280-606位氨基酸；SEQ ID NO：4中的第529-548位氨基酸。

此外，本发明的发明者已鉴定出下述cDNA克隆与SEQ ID NO：1中所示序列部分相关：HOUCQ17RA(SEQ ID NO：14)、HPLBM11R(SEQ ID NO：15)、HGBI07R(SEQ ID NO：16)、HNTMA49R(SEQ ID NO：17)、HNALE27R(SEQ IDNO：18)和HIBDB45R(SEQ ID NO：19)。

如下与SEQ ID NO：1的部分相关的公共EST也已鉴定：

              D67076(SEQ ID NO：20)，AB001735(SEQ IDNO：21)，X14787(SEQ ID NO：22)，U64857(SEQ ID NO：23)，X04665(SEQ IDNO：24)，M64866(SEQ ID NO：25)，L07803(SEQ ID NO：26)，U08006(SEQ IDNO：27)，M16974(SEQ ID NO：28)，L13855(SEQ ID NO：29)，AL021529(SEQID NO：30)，D86074(SEQ ID NO：31)，L05390(SEQ ID NO：32)，Z69361(SEQID NO：33)，X99599(SEQ ID NO：34)，AF018073(SEQ ID NO：35)，L23760(SEQ ID NO：36)，Z46970(SEQ ID NO：37)，AC004449(SEQ ID NO：38)，Z69589(SEQ ID NO：39)，Z22279(SEQ ID NO：40)，and X17524(SEQ IDNO：41).

本发明的发明者也已鉴定了如下与SEQ ID NO：3的部分相关的cDNA克隆：HCE4D69FP02(SEQ ID NO：42)，HIBDB45F(SEQ ID NO：43)，HKIXH64R(SEQ ID NO：44)，HIBDB45R(SEQID NO：19)，HCE3Z95R(SEQ ID NO：45)，HTLEQ90R(SEQ ID NO：46)，HMWEF45R(SEQ ID NO：47)，HTOFC34RA(SEQ ID NO：48)，HHFDI20R(SEQ ID NO：49)，HMSHY47R(SEQ ID NO：50)，HCESF90R(SEQ ID NO：51)，HMCAO46R(SEQ ID NO：52)，HTTAQ67R(SEQ ID NO：53)，HFKCF19F(SEQ ID NO：54)，HMCAS31R(SEQ ID NO：55)，HMWGP26R(SEQ IDNO：56)，HLHTP36R(SEQ ID NO：57)，HE8AN11R(SEQ ID NO：58)，HEONN73R(SEQ ID NO：59)，HBNBG53R(SEQ ID NO：60)，and HMSCH94R(SEQ ID NO：61).

如下与SEQ ID NO：3所示序列的部分相关的公共EST也已鉴定：D67076(SEQ ID NO：20)，AB001735(SEQ ID NO：21)，AB005287(SEQ ID NO：62)，X87619(SEQ IDNO：63)，X14787(SEQ ID NO：22)，X04665(SEQ ID NO：24)，M87276(SEQ IDNO：64)，M62458(SEQ ID NO：65)，AB002364(SEQ ID NO：66)，AB005297(SEQ ID NO：67)，X69161(SEQ ID NO：68)，X16619(SEQ ID NO：69)，I36448(SEQ ID NO：70)，L12260(SEQ ID NO：71)，I36352(SEQ ID NO：72)，X15898(SEQ ID NO：73)，I07789(SEQ ID NO：74)，I08144(SEQ ID NO：75)U31814(SEQ ID NO：76)，and AF001444(SEQ ID NO：77).

在特殊的实施方案中，本发明的多核苷酸小于300kb、200kb、100kb、50kb、15kb、10kb或7.5kb长。在另外的实施方案中，本发明的多核苷酸包括METH1或METH2编码序列的至少15个连续核苷酸，但不包括任何METH1或METH2内含子的全部或部分。在另一实施方案中，含METH1或METH2编码序列的核酸不包含基因组侧翼基因的编码序列(即基因组中METH1或METH2基因的5’或3’)。

另一方面，本发明提供了所含的多核苷酸在严谨的杂交条件下与上述本发明核酸分子内的多核苷酸一部分可杂交的分离核酸分子，所述本发明核酸分子例如是ATCC保藏号209581或ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆。“严谨的杂交条件”指在含以下组分的溶液中于42℃温育过夜：50％甲酰胺、5xSSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸和20ug/ml变性的剪切鲑精DNA，随后在0.1xSSC中约65℃洗涤滤膜。

与多核苷酸一部分可杂交的多核苷酸指与参照多核苷酸至少约15个核苷酸(nt)，更优选至少约20nt，还更优选至少约30nt，更优选至少约30、40、50、60或70nt可杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。如上述及下文详述，它们可用作诊断探针和引物。

例如，“至少20nt长”的多核苷酸部分指来自参照多核苷酸之核苷酸序列(如保藏的cDNA或如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列)的20个或更多个连续核苷酸。当然，只与polyA序列(分别诸如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3中所示METH1或METH2 cDNA的3’末端polyA)或一段T(或U)残基互补序列杂交的多核苷酸不包括在用于与本发明核酸一部分杂交的本发明多核苷酸内，因为这样的多核苷酸会与任何含poly(A)或其互补序列的核酸分子(如，几乎任何双链cDNA克隆)杂交。

在适度的高严谨条件下与METH1或METH2多核苷酸可杂交的核酸分子也是所预期的。主要通过控制甲酰胺浓度(较低百分率的甲酰胺导致较低的严谨度)、盐浓度或温度完成杂交严谨度和信号检测的改变。例如，适度的高严谨条件包括在含以下成分的溶液中37℃温育过夜：6XSSPE(20X SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH₂PO₄；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100ug/ml鲑精封闭DNA；随后在1X SSPE、0.1％SDS中50℃洗涤。此外，为了达到较低的严谨度，可在严谨杂交后在较高的盐浓度下(如5XSSC)进行洗涤。

应注意，以上条件的变化可通过包含和/或替代杂交实验中用于抑制背景的封闭剂而完成。典型的封闭剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA及可购得的配方。由于相容性的问题，具体封闭试剂的加入可能需要对上述严谨条件进行改良。

当然，只与polyA+序列(诸如序列表中所示cDNA的任何3’末端polyA+)或一段T(或U)残基互补序列杂交的多核苷酸不包括在“多核苷酸”的定义内，因为这样的多核苷酸会与任何含poly(A)或其互补序列的核酸分子(如，几乎任何双链cDNA克隆)杂交。

METH1或METH2多核苷酸可含任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，METH1或METH2多核苷酸的组成可以是单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混合的RNA、含DNA和RNA的杂合分子，它们可以是单链或更通常是双链，或单链和双链区混合物。此外，METH1或METH2多核苷酸可由含RNA或DNA或二者的三链区组成。METH1或METH2多核苷酸还可包含一个或多个修饰碱基或为了稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和如次黄嘌呤核苷之类的稀有碱基。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包含化学、酶促或代谢修饰的形式。

“SEQ ID NO：1”指METH1多核苷酸序列，而“SEQ ID NO：2”指METH1多肽序列。“SEQ ID NO：3”指METH2多核苷酸序列，而“SEQ ID NO：4”指METH2多肽序列。

正如所表明的，本发明编码METH1或METH2多肽的核酸分子可包括，但不局限于，自身编码成熟多肽氨基酸序列的分子；含有成熟多肽的编码序列和附加序列，诸如前导或分泌序列如前-、原-或前原-蛋白质序列的编码序列；成熟多肽的编码序列，有或无前述附加编码序列，另有附加的非编码序列，包括例如，但不局限于内含子和非编码的5’和3’序列，如在转录、mRNA加工包括剪接和多聚腺苷酸化信号中起作用(例如用于核糖体结合和mRNA稳定)的被转录而不翻译的序列；编码附加氨基酸的附加编码序列，如提供附加功能的序列。此外，编码多肽的序列可与标记序列融合，如所编码肽方便融合多肽纯化的序列。在本发明此方面的某些优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标记等等，其中许多标记均可购得。例如，如在Gentz等人，美国国家科学院报86：821-824(1989)中所述，六组氨酸可方便融合蛋白质的纯化。“HA”标记是可用于纯化的另一肽，其相应于流感血凝素蛋白质表位，如Wilson等人，细胞37：767-778(1984)中所述。如下所述，其它这样的融合蛋白质包括在N-或C-末端与Fc融合的METH1或METH2。

本发明进一步涉及编码METH1或METH2蛋白质部分、同系物或衍生物的本发明核酸分子变体。变体可天然，如天然等位基因变体。“等位基因变体”指占据生物染色体上一给定位置的数种可变形式基因之一。Lewin，B.编辑，基因II，John Wiley &Sons，纽约(1985)。非天然变体可用本领域已知诱变技术产生。

这类变体包括通过一个或多个核苷酸取代、缺失或添加而产生的变体。变体可能在编码区、非编码区或二者内有改变。编码区内的改变可产生保守或非保守氨基酸的取代、缺失或添加。其中尤其优选的是沉默的取代、缺失或添加，不会改变METH1或METH2蛋白质或其部分的特征和活性。在这点上尤其优选的是保守取代。

本发明的其它实施方案包括含有多核苷酸的分离核酸分子，该多核苷酸的核苷酸序列与以下核苷酸序列至少95％相同，更优选至少96％、97％、98％或99％相同：编码具SEQ ID NO：2中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：2中氨基酸序列但缺少N-端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：2中约第29-950位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209581中cDNA克隆编码之氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209581中cDNA克隆编码之氨基酸序列的成熟METH1多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸的核苷酸序列(METH1的金属蛋白酶结构域)；编码SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸的核苷酸序列(METH1的去整联蛋白结构域)；编码SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸的核苷酸序列(METH1的第一类TSP结构域)；编码SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸的核苷酸序列(METH1的第二类TSP结构域)；编码SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸的核苷酸序列(METH1的第三类TSP结构域)；编码SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：2中第549-563位氨基酸的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中氨基酸序列但缺少N-端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中约第24-890位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209582中cDNA克隆编码之氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209582中cDNA克隆编码之氨基酸序列的成熟METH2多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸的核苷酸序列(METH2的金属蛋白酶结构域)；编码SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸的核苷酸序列(METH2的去整联蛋白结构域)；编码SEQ ID NO：4中第530-583位氨基酸的核苷酸序列(METH2的第一类TSP结构域)；编码SEQ ID NO：4中第837-890位氨基酸的核苷酸序列(METH2的第二类TSP结构域)；编码SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4中第529-548位氨基酸的核苷酸序列；或与任何上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

具有与编码METH1或METH2多肽的参照核苷酸序列至少例如95％相同的核苷酸序列的多核苷酸指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列大致相同，只是该多核苷酸序列与编码METH1或METH2多肽的参照核苷酸序列相比每100个核苷酸可包括最多5个点突变。换而言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中最多5％的核苷酸可被缺失或用另外的核苷酸取代，或数目最多为参照序列总核苷酸数5％的核苷酸可插入参照序列中。参照序列的这些突变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置间的任何位置，它们或分别散布于参照序列的核苷酸中或以一个或多个连续组散布于参照序列中。

在实际情况中，例如，任何特殊核酸分子是否与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3中所示核苷酸序列或者各保藏cDNA克隆的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同可用已知的诸如Bestfit软件(WisconsinSequence Analysis Package，Version8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)之类计算机软件常规地确定。Bestfit利用了Smith和Waterman，应用数学进展(Ad vances in Applied Mathematics)2：482-489(1981)中的局部同源性运算法则来寻找两序列间的最佳同源区段。当用Bestfit或任何其它序列对比软件确定一特殊序列是否与本发明参照序列具如95％相同时，参数当然设置成对参照核苷酸序列全长计算相同性百分比，且高达参照序列总核苷酸数5％的同源缺口允许存在。

确定待查序列(本发明序列)和指示序列间最佳总体匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于原rutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，待查和指示序列均为DNA序列。可通过将U转变为T来比较RNA序列。所说综合序列对比的结果以相同性百分比表示。在DNA序列的FASTDB对比中，用于计算相同性百分比的优选参数为：矩阵(Matrix)＝Unitary，k-tuple＝4，错配罚分(Mismatch Penalty)＝1，连接罚分(JoiningPenalty)＝30，随机化分组长度(Randomization Group Length)＝0，截断分(Cutoff score)＝1，缺口罚分(Gap Penalty)＝5，缺口大小罚分(Gap Size Penalty)＝0.05，窗口大小(Window Size)＝500或指示核苷酸序列长度(选择较短者)。

若指示序列由于5’或3’缺失，不是由于内部缺失而比待查序列短，必对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软件不考虑指示序列的5’和3’截短。对于相对待查序列而言5’或3’端截短的指示序列，通过计算位于指示序列5’和3’的不相配/匹配的待查序列碱基数作为待查序列总碱基的百分比，矫正相同性百分比。核苷酸是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的相同性百分比值。此修正值即本发明中涉及的值。正如FASTDB序列对比所展示的，人工调整相同性百分比值时，只计算与待查序列不相配/匹配的、位于指示序列5’和3’碱基外的碱基。

例如，一90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列5’端，因此FASTDB序列对比显示5’端头10个碱基不相配/匹配。这10个未配对碱基代表了序列的10％(不匹配的5’和3’端碱基数/待查序列的总碱基数)，因此从FASTDB软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个碱基完全匹配，则最终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的5’和3’端无与待查序列不相配/匹配的碱基。这种情况下，对用FASTDB计算的相同性百分比不作人为的修正。再者，只对与待查序列不相配/匹配的指示序列的5’和3’碱基人为修正。为了本发明的目的，不进行其它的人工修正。

本申请涉及与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或所保藏cDNA的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸分子，不管它们是否编码具METH1或METH2活性的多肽。这是因为即使一特殊核酸分子不编码具METH1或METH2活性的多肽，本领域技术熟练人员仍应知如何利用此核酸分子，例如，作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具METH1或METH2活性的多肽的本发明核酸分子的应用特别地包括(1)在cDNA文库中分离METH1或METH2基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体丝进行原位杂交(如“FISH”)以得到METH1或METH2基因的准确染色体位置，如Verma等，人染色体：基础技术手册(HumanChromosomes：A Manual of Basic Techniques)，Pergamon Press，纽约(1988)中所述；及(3)用于检测在特异组织中METH1或METH2 mRNA表达的RNA印迹分析。

然而，优选的是与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或所保藏cDNA的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同，且确实编码具METH1或METH2蛋白活性的多肽的核酸分子。“具METH1活性的多肽”指在特殊生物实验中展现METH1活性的多肽。例如，可用尿囊绒膜试验(Iruela-Arispe等，血栓形成和淤血(Thrombosis andHaemostasis)78(1)：672-677(1997))或角膜囊试验(Tolsma等，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)122：497-511(1993))检测METH1蛋白质活性，这两种试验均可见于以下实施例4中。“具METH2活性的多肽”指在特殊生物实验中展现METH2活性的多肽。例如，可用尿囊绒膜试验(Iruela-Arispe等，血栓形成和止血78(1)：672-677(1997))或角膜囊试验(Tolsma等，细胞生物学杂志122：497-511(1993))检测METH2蛋白质的活性，这两种试验均可见于以下实施例4中。

简单的说，在尿囊绒膜试验中，将潜在抗血管生成的目的化合物与bFGF之类的血管生长因子一起加入I类胶原蛋白团块(Vitrogen)中。样品混合并放至尼龙网上，使其聚合。聚合完全后，将网放于12日龄鸡胚的尿囊绒膜上并在37℃放置24小时。然后用FITC-葡聚糖之类的荧光剂注射胚，并将网固定和安放好以便在荧光显微镜下观察。

在角膜囊试验中，将含目的化合物和bFGF之类的血管生长因子的亲水球植入大鼠或小鼠的角膜边缘1-2mm中。一段时间，如5天后，检查反应情况。通过检测角膜边缘毛细管的迁移来评估血管生成的程度。

当然，由于遗传密码的简并性，本领域技术熟练人员将立即认识到，含有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或所保藏cDNA的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的许多核酸分子可编码“具METH1或METH2蛋白活性的”多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变体均编码相同的多肽，即使不进行以上比较实验，这对于本领域技术熟练人员也是显而易见的。在本领域中还将进一步认识到的是，对于非简并变体的核酸分子，其中相当一部分也将编码具METH1或METH2蛋白质活性的多肽。这是因为本领域技术熟练人员完全清楚不太可能或不可能严重影响蛋白质功能的氨基酸取代(如用第二种脂肪族氨基酸置换第一种脂肪族氨基酸)。

例如，关于怎样制备表型沉默的氨基酸取代的指导可见于Bowie，J.U.等，“蛋白质序列的信息解译：对氨基酸取代的容忍(Deciphering theMessage in Protein Sequences：Tolerance to Amino AcidSubstitutions)”，科学247：1306-1310(1990)中，其中作者指出蛋白质对氨基酸取代具有惊人的容忍性。

载体和宿主细胞

本发明还涉及含本发明分离DNA分子的载体、遗传工程改造的含重组载体的宿主细胞及利用重组技术生产METH1或METH2多肽或其片段。

多核苷酸可连接到含选择标记的载体内以在宿主中增殖。通常，通过磷酸钙沉淀之类的沉淀法或与带电荷脂类形成复合物而导入质粒载体。若载体为病毒，可用适当的包装细胞系将其在体外包装并随后转导入宿主细胞。

DNA插入片段应与适当的启动子有效连接，诸如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早、晚期启动子、逆转录病毒LTR启动子，等等。本领域技术熟练人员应知道其他的合适启动子。表达构建体将进一步包括转录起始、终止位点和在转录区内用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达之成熟转录物的编码区将优选包括开始处的翻译起点和恰当定位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。

正如已表明的，表达载体将优选包括至少一个选择标记。所说的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性和用于大肠杆菌及其它细菌培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的典型例子包括，但不局限于，细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇S2和秋粘虫Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞；及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域所已知的。

载体中优选用于细菌中的包括pQE70、pQE60和pQE-9，可购自Qiagen；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可购自Stratagene；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可购自Pharmacia。优选的真核载体包括来自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；及来自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它的合适载体对本领域技术熟练人员来说将是显然的。

除了表达载体在本发明实践中的应用外，本发明进一步包括含与编码目的蛋白之核苷酸序列有效连接的操纵基因和启动子元件的新表达载体。这种载体的一个例子是下文详述的pHE4-5。

如图8和9中所概述的，pHE4-5载体(SEQ ID NO：12)的组成包括：1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌的复制起点，3)T5噬菌体启动子序列，4)两个lac操纵基因序列，5)SD序列，6)乳糖操纵子阻抑蛋白基因(lacIq)。复制起点(oriC)来自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子序列和操纵基因序列通过合成制备。核苷酸序列的合成产生在本领域是众所周知的。CLONTECH 95/96 Catalog，第215-216页，CLONTECH，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，CA94303。通过将核苷酸序列插入pHE4-5载体中NdeI和Asp718位点之间，编码METH1(SEQ ID NO：2)或METH2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列即与启动子和操纵基因有效连接。

如上所提及，pHE4-5载体含lacIq基因。LacIq是严密调控lac操纵基因的lacI基因的等位基因。Amann，E.等，基因69：301-315(1988)；Stark，M.，基因51：255-267(1987)。LacIq基因编码可与lac操纵基因序列结合并封闭下游(即3’)序列的转录的阻遏蛋白。然而，存在乳糖或某些乳糖类似物，如异丙基B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)时，lacIq基因产物与lac操纵基因解离。因此在含pHE4-5载体的未诱导宿主细胞中不产生大量METH1或METH2。可是，加入IPTG之类的物质诱导这些宿主细胞，可导致METH1或METH2编码序列的表达。

pHE4-5载体的启动子/操纵基因序列(SEQ ID NO：13)包括T5噬菌体启动子和两个lac操纵基因序列。一操纵基因位于转录起始位点的5’而另一个位于其3’。这些操纵基因与lacIq基因产物一起存在时，在缺少lac操纵子诱导剂如IPTG情况下，它们紧密抑制下游序列。通过加入lac操纵子诱导剂，如IPTG，可诱导位于lac操纵基因下游的有效连接序列的表达。lac诱导剂与lacIq蛋白质的结合导致其脱离lac操纵基因序列，以及有效连接序列的转录起始。基因表达的lac操纵子调节综述于Devlin，T.，生化与临床相互关系(TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITHCLINICAL CORRELATIONS)，第4版(1997)，第802-807页中。

pHE4系列载体包含pHE4-5载体中除METH1或METH2编码序列外的所有组分。pHE4载体的特征包括优化过的合成T5噬菌体启动子、lac操纵基因和SD序列。此外，这些序列还被最佳地间隔开，以便可严密调控插入基因的表达并在诱导时产生高水平的表达。

适用于本发明蛋白质产生的已知细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子及trp启动子等。合适的真核启动子包括CMV即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早、晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子如劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，和金属硫蛋白启动子如金属硫蛋白-1启动子。

pHE4-5载体还包含位于AUG起始密码子5’的SD序列。SD序列是通常位于AUG起始密码子上游(即5’)约10个核苷酸处的短序列。这些序列本质上是指导原核核糖体至AUG起始密码子处。

此外，本发明还涉及可用于本发明蛋白质生产的表达载体。本发明的这一方面通过pHE4-5载体(SEQ ID NO：12)举例说明。

可用磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法将构建体引入宿主细胞。这样的方法可见于许多标准实验室手册中，如Davis等，分子生物学基本方法(BasicMethods In Molecular Biology)(1986)。

多肽可以融合蛋白之类的修饰形式表达，不仅可包含分泌信号肽，还可包含附加的异源功能区。例如，可将另外的氨基酸区域，尤其是带电荷氨基酸加到多肽的N-末端以提高在宿主细胞内，纯化或随后的处理和保存中的稳定性和持续性。此外，可将肽部分加到多肽上以便于纯化。这样的区域可在多肽最终制备前去除。添加肽部分至多肽上以便分泌或排泄、提高稳定性和方便纯化等等是本领域所熟知和常规的技术。优选的融合蛋白包含来自免疫球蛋白的可用于溶解蛋白质的异源区。例如，EP-A-O 464533(加拿大对应文件2045869)公开了含免疫球蛋白分子恒定区不同部分及另一种人蛋白质或其部分的融合蛋白。在许多情况中，融合蛋白内的Fc部分非常利于在治疗和诊断中使用，因而导致例如改善药物动力学特性(EP-A0232 262)。另一方面，为了某些用途，可能期望在融合蛋白以上述有利形式表达、检测和纯化后能删除Fc部分。当Fc部分被证实妨碍治疗和诊断使用，例如当融合蛋白用作免疫抗原时即是如此。例如，在药物发明中，为了达到鉴定hIL-5拮抗物的高流通量筛选试验的目的，已将hIL5-受体之类的人蛋白质与Fc部分融合。参阅，D.Bennett等，J.Mol.Recognition8：52-58(1995)和K.Johanson等，生物化学杂志270(16)：9459-9471(1995)。

用众所周知的方法可从重组细胞培养物中回收和纯化METH1或METH2蛋白质，包括硫酸铵或酒精沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和外源凝集素层析。最优选高效液相层析(“HPLC”)用于纯化。本发明的多肽包括天然纯化产物、化学合成方法的产物，和用重组技术自真核或原核宿主生产的产物，包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明多肽可以是糖基化或非糖基化的，这取决于重组生产方法中所用宿主。此外，本发明多肽还可包括起始的修饰甲硫氨酸，在某些情况下是宿主介导加工的结果。

METH1和METH2多肽及片段

本发明进一步提供了具保藏cDNA编码之氨基酸序列或SEQ ID NO：2中氨基酸序列的分离METH1多肽，或含上述多肽一部分的肽或多肽。本发明进一步提供了具保藏cDNA编码之氨基酸序列或SEQ ID NO：4中氨基酸序列的分离METH2多肽，或含上述多肽一部分的肽或多肽。

METH1或METH2多肽可由通过肽键或被修饰肽键，即肽同配基(isosteres)相互连接的氨基酸组成，并可包含20种基因编码氨基酸之外的氨基酸。可通过诸如翻译后加工之类的天然加工或本领域众所周知的化学修饰技术修饰METH1或METH2多肽。在基础课本和更详尽的专论及许多研究文献中对这些修饰都有很好的描述。修饰可发生于METH1或METH2多肽中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。应当理解，在所给METH1或METH2多肽的数个位点处可存在相同或不同程度的同类修饰。此外，所给METH1或METH2多肽可包含多种类型的修饰。METH1或METH2多肽可以是分枝的，例如由于遍在蛋白化的结果，它们也可以是环状的，有或无分枝。环状、分枝和分枝环状的METH1或METH2多肽可在翻译后天然加工产生或可用合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价添加、血红素部分的共价添加、核苷酸或核苷酸衍生物的共价添加、脂类或脂类衍生物的共价添加、磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol)的共价添加、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、如精氨酰化之类的转移RNA介导的氨基酸加入蛋白质中和遍在蛋白化。(参阅，例如，蛋白质的结构和分子特性(PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，纽约(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson编辑，Academic Press，纽约，第1-12页(1983)；Seifter等，酶学方法182：626-646(1990)；Rattan等，Ann NY Acad Sci663：48-62(1992))。

在本领域中应当认识到，METH1或METH2多肽的一些氨基酸序列可变化而不显著影响蛋白质的结构和功能。如果这些序列中的差异也包括在内，应当记住在蛋白质中存在决定活性的关键区域。

本项发明者已表明，METH1和METH2可抑制体外和体内的血管形成。METH1和METH2均含金属蛋白酶结构域、去整联蛋白结构域和类TSP结构域。金属蛋白酶结构域可能具催化活性。去整联蛋白结构域可能通过与整联蛋白相互作用而在抑制血管形成中起作用，因为整联蛋白在增殖和转移信号的介导中是必需的。本项发明者已表明，来自METH1和METH2类TSP结构域的肽可抑制体外和体内的血管形成。

此外，本发明还包括显示实质性METH1多肽活性或含如下述蛋白质部分之类METH1蛋白区的METH1多肽变种；和显示实质性METH2多肽活性或含如下述蛋白质部分之类METH2蛋白区的METH2多肽变种。所说的突变体包括缺失、插入、倒置、重复和类型取代。如上所表明的，关于哪些氨基酸可能是表型沉默的指导可见如下文献：Bowie，J.U.等，“蛋白质序列的信息解译：对氨基酸取代的容忍”，科学247：1306-1310(1990)。

因此，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4多肽或由保藏cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代，该取代氨基酸残基可由或不由遗传密码编码，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基含取代基团，或(iii)其中成熟多肽与另一化合物如提高多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合，如IgGFc融合区域肽或者前导或者分泌序列或者用于成熟多肽纯化的序列或前蛋白序列。根据本文教导，这样的片段、衍生物和类似物在本领域技术熟练人员的范围内。

特别令人感兴趣的是用另一带电氨基酸和用中性或带相反电荷的氨基酸取代带电氨基酸。后者产生带更少正电荷的蛋白质，以改善METH1或METH2蛋白质的性质。十分期望的是防止聚集。蛋白质的聚集不仅导致活性的丧失，还可能在制备药用配方时产生问题，因为它们可能是免疫原性的。(Pinckard等，临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)2：331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845(1987)；Cleland等，治疗给药物载体系统评述(Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrieer Systems)10：307-377(1993))。

如上所指出，优选较小特性的改变，如不显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见表3)。

表3  保守氨基酸取代

芳香族氨基酸     疏水氨基酸     极性氨基酸   碱性氨基酸     酸性氨基酸   小氨基酸

苯丙氨酸 色氨酸 酪氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 缬氨酸 谷氨酰胺 天冬酰胺 精氨酸 赖氨酸 组氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 丙氨酸 丝氨酸 苏氨酸 甲硫氨酸 甘氨酸

当然，本领域技术熟练人员进行氨基酸取代的数目由许多因素决定，包括上述因素。一般说来，任何所给METH1或METH2多肽的氨基酸取代数目应不超过50、40、30、20、10、5或3个。

用本领域已知方法可鉴定本发明METH1和METH2蛋白质中功能所必需的氨基酸，如定位诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子的每一残基处引入单个丙氨酸突变。然后检测所产生突变分子诸如在体外或体内抑制血管生成之类的生物学活性。还可用如结晶、核磁共振或光亲和标记之类的结构分析确定对抑制血管生成关键的位点(Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224：899-904(1992)和de Vos等，科学255：306-312(1992))。

优选以分离形式提供本发明多肽。“分离多肽”指脱离其天然环境的多肽。因此，为了本发明的目的，重组宿主细胞中产生和/或包含的多肽被视作是分离的。“分离多肽”还指已自重组宿主细胞或天然来源部分或基本上纯化的多肽。例如，用Smith和Johnson，基因67：31-40(1988)中所述的一步方法可基本纯化重组产生的METH1或METH2多肽。

本发明多肽包括由含前导序列之保藏cDNA编码的METH1多肽；由不含前导序列之保藏cDNA编码的成熟METH1多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ ID NO：2中约第1-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第2-950位氨基酸的多肽；含SEQ IDNO：2中约第29-950位氨基酸的多肽；含SEQID NO：2中约第30-950位氨基酸的多肽；含METH1金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸的多肽；含METH1去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸的多肽；含METH1第一类TSP结构域，SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸的多肽；含METH1第二类TSP结构域，SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸的多肽；含METH1第三类TSP结构域，SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第549-563位氨基酸的多肽；由含前导序列之保藏cDNA编码的METH2多肽；由不含前导序列之保藏cDNA编码的成熟METH2多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ IDNO：4中约第1-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第2-890位氨基酸的多肽；含SEQID NO：4中约第24-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸的多肽；含METH2金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸的多肽；含METH2去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸的多肽；含METH2第一类TSP结构域，SEQ IDNO：4中第530-583位氨基酸的多肽；含METH2第二类TSP结构域，SEQ ID NO：4中第837-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸的多肽；含SEQID NO：4中第529-548位氨基酸的多肽；以及与上述多肽至少95％相同，更优选至少96％、97％、98％或99％相同，并且包含这些多肽的至少30个氨基酸、更优选至少50个氨基酸的部分的多肽。

具有与METH1或METH2多肽的参照氨基酸序列有至少例如95％相同的氨基酸序列的多肽指该多肽的氨基酸序列除了与METH1或METH2多肽的参照氨基酸序列相比每100个氨基酸可包括最多5个氨基酸改变之外，其余与参照序列相同。换而言之，为了获得具有与参照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参照序列中最多5％的氨基酸可被缺失或用另外的氨基酸取代，或数目最多为参照序列总氨基酸残基数5％的氨基酸可插入参照序列中。参照序列的这些改变可发生于参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置间的任何位置，它们或者各自散布于参照序列的残基中，或者以一个或多个连续组的形式存在于参照序列中。

事实上，例如，任何特殊多肽分子是否与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列或由保藏cDNA克隆所编码的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同可用已知的诸如Bestfit软件(WisconsinSequence Analysis Package，Version8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science DriVe，Madison，WI53711)之类计算机软件常规地确定。当用Bestfit或任何其它序列对比软件确定一特殊序列是否按本发明与参照序列例如95％相同时，参数当然设置成针对参照氨基酸序列全长计算相同性百分比，且允许有高达参照序列总氨基酸残基数5％的同源性缺口。

确定待查序列(query sequence)(本发明序列)和指示序列(subjectsequence)间最佳完全匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于Brutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，待查序列和指示序列均为核苷酸序列或均为氨基酸序列。所说综合序列对比的结果表示为相同性百分比。在氨基酸序列的FASTDB对比中用于计算相同性百分比的优选参数为：矩阵＝PAM 0，k-tuple＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化分组长度＝0，截断分＝1，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或指示氨基酸序列长度(取较短者)。

若指示序列由于N-或C-端缺失，不是由于内部缺失而比待查序列短， 必须对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软 件不考虑指示序列的N-和C-端截短。对于相对待查序列而言在N-和C- 端截短的指示序列，通过计算待查序列中位于指示序列N-和C-端的不相 配/匹配的残基数作为待查序列总残基的百分数，矫正相同性百分比。残 基是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通 过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的 相同性百分比值。此最终的相同性百分比值是用于本发明目的的。人工 调整相同性百分比值时，只计算与待查序列不相配/匹配的、在指示序列 N-和C-端外的残基。即，只考虑指示序列N-和C-最末端残基外的待查残 基位置。

例如，将90个氨基酸残基长的指示序列与100个残基长的待查序列 排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列N-端，FASTDB序列对比 不显示N-端头10个碱基的相配/匹配。这10个未配对残基代表了序列的 10％(不匹配的N-和C-端残基数/待查序列的总残基数)，因此从FASTDB 软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个残基完全匹配，则最 终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个残基长的指示序列与100 个残基长的待查序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的N-和 C-端无与待查序列不相配/匹配的残基。这种情况下，用FASTDB计算的 相同性百分比不用人为的修正。再者，正如在FASTDB序列对比中所展示 的，只有与待查序列不相配/匹配的位于指示序列N-和C-末端的残基位 置需人为修正。为了本发明的目的不进行其它的人工修正。

通过本领域技术熟练人员众所周知的方法可以将本发明多肽用作 SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤中的分子量标准。

另一方面，本发明提供含本发明多肽之带表位部分的肽或多肽。此多 肽的表位部分是本文所述多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表 位”定义为当整个蛋白质作为免疫原时会引起抗体应答的蛋白质部分。 另一方面，抗体可结合的蛋白质分子区定义为“抗原性表位”。蛋白质免 疫原性表位数通常少于抗原性表位数。参阅，例如，Geysen等，美国国 家科学院院报81：3998-4002(1983)。

至于带抗原性表位的肽或多肽(即，含抗体可结合的蛋白质分子区) 的选择，在本领域中众所周知，模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成 肽通常能引发与部分模拟蛋白质可反应的抗血清。参阅，例如，Sutcliffe， J.G.等，“与蛋白质中特定位点反应的抗体(Antibodies that react with predetermined sites on proteins)”，科学219：660-666(1983)。能引 起蛋白质反应性血清的肽经常用蛋白质的一级序列表示，它们可用一套 简单的化学规则鉴定，既不限制在完整蛋白质的免疫显性区(即，免疫 原性表位)，也不限制在氨基或羧基末端。

因此，本发明之带抗原性表位的肽和多肽可用于产生与本发明多肽可 特异结合的抗体，包括单克隆抗体。参阅，例如，Wilson等，细胞 37：767-778(1984)的第777页。

本发明之带抗原性表位的肽和多肽优选包含本发明多肽氨基酸序列 中至少7个，更优选至少9个及更优选至少约15-30个氨基酸的序列。

本发明之带表位的肽和多肽可用任何常规方法产生。Houghten，R.A.， “肽的大量快速固相合成通用方法：在单个氨基酸水平上的抗原-抗体相 互作用特异性”，美国国家科学院院报82：5131-5135(1985)。此“同时 多种肽合成(SMPS)”的方法进一步描述于Houghten等的美国专利号 4631211(1986)中。

本领域技术熟练人员应当理解，上述本发明的METH1或METH2多肽及 其带表位片段可与免疫球蛋白(IgG)的恒定结构域部分结合，产生嵌合 多肽。这些融合蛋白质可方便纯化并且体内半寿期延长。这点已在如由 人CD4多肽头两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的多 个结构域组成的嵌合蛋白质中得到证实(EPA394827；Traunecker等，自 然331：84-86(1988))。在结合和中和其他分子方面，由于IgG部分而 具二硫键连接之二聚体结构的融合蛋白比仅有单体METH1或METH2蛋白 质或蛋白质片段更有效(Fountoulakis等，生化杂志(J.Biochem.)270： 3958-3964(1995))。

METH1和METH2多核苷酸和多肽片段

在本发明中，“多核苷酸片段”指具保藏克隆中所含或者SEQ ID NO：1 或SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的短多核苷酸。该短核苷酸片段优 选至少约15nt，更优选至少约20nt，还更优选至少约30nt，更优选至少 约40nt的长度。例如，“长度至少为20nt”的片段表示包括来自保藏克 隆中所含cDNA序列或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列 的20个或更多个连续碱基。这些核苷酸片段可如本文所述用作诊断探针 和引物。当然，更大的片段是优选的(例如，50、150、500、600、2000 个核苷酸)。

此外，METH1或METH2多核苷酸片段的代表性例子包括，例如，具SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中核苷酸数约第1-50、51-100、101-150、151-200、 201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、 551-600、651-700、701-750、751-800、800-850、851-900、901-950、 951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、 1251-1300、1301-1350、1351-1400、1401-1450、1451-1500、1501-1550、 1551-1600、1601-1650、1651-1700、1701-1750、1751-1800、1801-1850、 1851-1900、1901-1950、1951-2000或2001-最后，或者保藏克隆中所含 cDNA之序列的片段。在此上下文中“大约”包括了在任一端或两端更多 或更少几个核苷酸(5、4、3、2或1)的特别列举范围。优选这些片段 编码具生物活性的多肽。更优选这些多核苷酸可如文所述用作探针或引 物。

在本发明中，“多肽片段”指具保藏克隆中所含cDNA编码的或者SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所含的短氨基酸序列。蛋白质片段可以是“独 立的”或包含于较大多肽内形成其中一部分或一个区域，最优选作为单 个连续区存在于其中。本发明多肽片段的典型例子包括，例如，来自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4编码区约第1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、 102-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、 241-260、261-280或281-最后位氨基酸的片段。此外，多肽片段可为约 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150 个氨基酸长。在此上下文中“大约”包括了特别列举范围，在其任一端 或两端值更多或更少几个氨基酸(5、4、3、2或1)的范围。

优选的多肽片段包括被分泌的METH1或METH2蛋白质及其成熟形式。 更优选的多肽片段包括从氨基或羧基末端或两端具连续缺失残基的被分 泌METH1或METH2蛋白质及其成熟形式。例如，可从分泌METH1或METH2 多肽或其成熟形式的氨基端缺失1-60个范围内的任何数目氨基酸。类似 地，可从分泌METH1或METH2蛋白质或其成熟形式的羧基端缺失1-30个 范围内的任何数目氨基酸。而且，优选上述氨基或羧基末端缺失的任何 组合。同样地，也优选编码这些METH1或METH2多肽片段的核苷酸片段。

尤其是，METH1多肽的N-端缺失体可用概括的公式m-950描述，其中 m是2-949的整数，其中m相应于SEQ ID NO：2中所定的氨基酸残基位 置。优选如SEQ ID NO：2所示之本发明METH1多肽的N-端缺失体包括含 如下氨基酸残基序列的多肽：

                  G-2 to S-950；N-3 to S-950；A-4 to S-950；E-5 to S-950； R-6 to S-950；A-7 to S-950；P-8 to S-950；G-9 to S-950；S-10 to S-950；R-11 to S-950；S-12 to S-950；F-13 to S-950；G-14 to S-950；P-15 to S-950；V-16 to S- 950；P-17 to S-950；T-18 to S-950；L-19 to S-950；L-20 to S-950；L-21 to S-950； L-22 to S-950；A-23 to S-950；A-24 to S-950；A-25 to S-950；L-26 to S-950；L- 27 to S-950；A-28 to S-950；V-29 to S-950；S-30 to S-950；D-31 to S-950；A-32 to S-950；L-33 to S-950；G-34 to S-950；R-35 to S-950；P-36 to S-950；S-37 to S-950；E-38 to S-950；E-39 to S-950；D-40 to S-950；E-41 to S-950；E-42 to S- 950；L-43 to S-950；V-44 to S-950；V-45 to S-950；P-46 to S-950；E-47 to S- 950；L-48 to S-950；E-49 to S-950；R-50 to S-950；A-51 to S-950；P-52 to S- 950；G-53 to S-950；H-54 to S-950；G-55 to S-950；T-56 to S-950；T-57 to S- 950；R-58 to S-950；L-59 to S-950；R-60 to S-950；L-61 to S-950；H-62 to S- 950；A-63 to S-950；F-64 to S-950；D-65 to S-950；Q-66 to S-950；Q-67 to S- 950；L-68 to S-950；D-69 to S-950；L-70 to S-950；E-71 to S-950；L-72 to S- 950；R-73 to S-950；P-74 to S-950；D-75 to S-950；S-76 to S-950；S-77 to S-950； F-78 to S-950；L-79 to S-950；A-80 to S-950；P-81 to S-950；G-82 to S-950；F- 83 to S-950；T-84 to S-950；L-85 to S-950；Q-86 to S-950；N-87 to S-950；V-88 to S-950；G-89 to S-950；R-90 to S-950；K-91 to S-950；S-92 to S-950；G-93 to S-950；S-94 to S-950；E-95 to S-950；T-96 to S-950；P-97 to S-950；L-98 to S- 950；P-99 to S-950；E-100 to S-950；T-101 to S-950；D-102 to S-950；L-103 to S-950；A-104 to S-950；H-105 to S-950；C-106 to S-950；F-107 to S-950；Y-108 to S-950；S-109 to S-950；G-110 to S-950；T-111 to S-950；V-112 to S-950；N- 113 to S-950；G-114 to S-950；D-115 to S-950；P-116 to S-950；S-117 to S-950； S-118 to S-950；A-119 to S-950；A-120 to S-950；A-121 to S-950；L-122 to S- 950；S-123 to S-950；L-124 to S-950；C-125 to S-950；E-126 to S-950；G-127 to S-950；V-128 to S-950；R-129 to S-950；G-130 to S-950；A-131 to S-950；F- 132 to S-950；Y-133 to S-950；L-134 to S-950；L-135 to S-950；G-136 to S-950； E-137 to S-950；A-138 to S-950；Y-139 to S-950；F-140 to S-950；I-141 to S- 950；Q-142 to S-950；P-143 to S-950；L-144 to S-950；P-145 to S-950；A-146 to S-950；A-147 to S-950；S-148 to S-950；E-149 to S-950；R-150 to S-950；L- 151 to S-950；A-152 to S-950；T-153 to S-950；A-154 to S-950；A-155 to S-950； P-156 to S-950；G-157 to S-950；E-158 to S-950；K-159 to S-950；P-160 to S- 950；P-161 to S-950；A-162 to S-950；P-163 to S-950；L-164 to S-950；Q-165 to S-950；F-166 to S-950；H-167 to S-950；L-168 to S-950；L-169 to S-950；R- 170 to S-950；R-171 to S-950；N-172 to S-950；R-173 to S-950；Q-174 to S-950； G-175 to S-950；D-176 to S-950；V-177 to S-950；G-178 to S-950；G-179 to S- 950；T-180 to S-950；C-181 to S-950；G-182 to S-950；V-183 to S-950；V-184 to S-950；D-185 to S-950；D-186 to S-950；E-187 to S-950；P-188 to S-950；R- 189 to S-950；P-190 to S-950；T-191 to S-950；G-192 to S-950；K-193 to S-950； A-194 to S-950；E-195 to S-950；T-196 to S-950；E-197 to S-950；D-198 to S- 950；E-199 to S-950；D-200 to S-950；E-201 to S-950；G-202 to S-950；T-203 to S-950；E-204 to S-950；G-205 to S-950；E-206 to S-950；D-207 to S-950；E- 208 to S-950；G-209 to S-950；P-210 to S-950；Q-211 to S-950；W-212 to S-950； S-213 to S-950；P-214 to S-950；Q-215 to S-950；D-216 to S-950；P-217 to S- 950；A-218 to S-950；L-219 to S-950；Q-220 to S-950；G-221 to S-950；V-222 to S-950；G-223 to S-950；Q-224 to S-950；P-225 to S-950；T-226 to S-950；G- 227 to S-950；T-228 to S-950；G-229 to S-950；S-230 to S-950；I-231 to S-950； R-232 to S-950；K-233 to S-950；K-234 to S-950；R-235 to S-950；F-236 to S- 950；V-237 to S-950；S-238 to S-950；S-239 to S-950；H-240 to S-950；R-241 to S-950；Y-242 to S-950；V-243 to S-950；E-244 to S-950；T-245 to S-950；M- 246 to S-950；L-247 to S-950；V-248 to S-950；A-249 to S-950；D-250 to S-950； Q-251 to S-950；S-252 to S-950；M-253 to S-950；A-254 to S-950；E-255 to S- 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950；E-627 to S-950；W-628 to S-950；I-629 to S-950；P-630 to S-950；K-631 to S-950；Y-632 to S-950；A-633 to S-950；G-634 to S-950；V-635 to S-950；S- 636 to S-950；P-637 to S-950；K-638 to S-950；D-639 to S-950；R-640 to S-950； C-641 to S-950；K-642 to S-950；L-643 to S-950；I-644 to S-950；C-645 to S- 950；Q-646 to S-950；A-647 to S-950；K-648 to S-950；G-649 to S-950；I-650 to S-950；G-651 to S-950；Y-652 to S-950；F-653 to S-950；F-654 to S-950；V- 655 to S-950；L-656 to S-950；Q-657 to S-950；P-658 to S-950；K-659 to S-950； V-660 to S-950；V-661 to S-950；D-662 to S-950；G-663 to S-950；T-664 to S- 950；P-665 to S-950；C-666 to S-950；S-667 to S-950；P-668 to S-950；D-669 to S-950；S-670 to S-950；T-671 to S-950；S-672 to S-950；V-673 to S-950；C-674 to S-950；V-675 to S-950；Q-676 to S-950；G-677 to S-950；Q-678 to S-950；C- 679 to S-950；V-680 to S-950；K-681 to S-950；A-682 to S-950；G-683 to S-950； C-684 to S-950；D-685 to S-950；R-686 to S-950；I-687 to S-950；I-688 to S- 950；D-689 to S-950；S-690 to S-950；K-691 to S-950；K-692 to S-950；K-693 to S-950；F-694 to S-950；D-695 to S-950；K-696 to S-950；C-697 to S-950；G- 698 to S-950；V-699 to S-950；C-700 to S-950；G-701 to S-950；G-702 to S-950； N-703 to S-950；G-704 to S-950；S-705 to S-950；T-706 to S-950；C-707 to S- 950；K-708 to S-950；K-709 to S-950；I-710 to S-950；S-711 to S-950；G-712 to S-950；S-713 to S-950；V-714 to S-950；T-715 to S-950；S-716 to S-950；A-717 to S-950；K-718 to S-950；P-719 to S-950；G-720 to S-950；Y-721 to S-950；H- 722 to S-950；D-723 to S-950；I-724 to S-950；I-725 to S-950；T-726 to S-950； I-727 to S-950；P-728 to S-950；T-729 to S-950；G-730 to S-950；A-731 to S- 950；T-732 to S-950；N-733 to S-950；I-734 to S-950；E-735 to S-950；V-736 to S-950；K-737 to S-950；Q-738 to S-950；R-739 to S-950；N-740 to S-950；Q-741 to S-950；R-742 to S-950；G-743 to S-950；S-744 to S-950；R-745 to S-950；N- 746 to S-950；N-747 to S-950；G-748 to S-950；S-749 to S-950；F-750 to S-950； L-751 to S-950；A-752 to S-950；I-753 to S-950；K-754 to S-950；A-755 to S- 950；A-756 to S-950；D-757 to S-950；G-758 to S-950；T-759 to S-950；Y-760 to S-950；I-761 to S-950；L-762 to S-950；N-763 to S-950；G-764 to S-950；D- 765 to S-950；Y-766 to S-950；T-767 to S-950；L-768 to S-950；S-769 to S-950； T-770 to S-950；L-771 to S-950；E-772 to S-950；Q-773 to S-950；D-774 to S- 950；I-775 to S-950；M-776 to S-950；Y-777 to S-950；K-778 to S-950；G-779 to S-950；V-780 to S-950；V-781 to S-950；L-782 to S-950；R-783 to S-950；Y- 784 to S-950；S-785 to S-950；G-786 to S-950；S-787 to S-950；S-788 to S-950； A-789 to S-950；A-790 to S-950；L-791 to S-950；E-792 to S-950；R-793 to S- 950；I-794 to S-950；R-795 to S-950；S-796 to S-950；F-797 to S-950；S-798 to S-950；P-799 to S-950；L-800 to S-950；K-801 to S-950；E-802 to S-950；P-803 to S-950；L-804 to S-950；T-805 to S-950；I-806 to S-950；Q-807 to S-950；V- 808 to S-950；L-809 to S-950；T-810 to S-950；V-811 to S-950；G-812 to S-950； N-813 to S-950；A-814 to S-950；L-815 to S-950；R-816 to S-950；P-817 to S- 950；K-818 to S-950；I-819 to S-950；K-820 to S-950；Y-821 to S-950；T-822 to S-950；Y-823 to S-950；F-824 to S-950；V-825 to S-950；K-826 to S-950；K-827 to S-950；K-828 to S-950；K-829 to S-950；E-830 to S-950；S-831 to S-950；F- 832 to S-950；N-833 to S-950；A-834 to S-950；I-835 to S-950；P-836 to S-950； T-837 to S-950；F-838 to S-950；S-839 to S-950；A-840 to S-950；W-841 to S- 950；V-842 to S-950；I-843 to S-950；E-844 to S-950；E-845 to S-950；W-846 to S-950；G-847 to S-950；E-848 to S-950；C-849 to S-950；S-850 to S-950；K- 851 to S-950；S-852 to S-950；C-853 to S-950；E-854 to S-950；L-855 to S-950； G-856 to S-950；W-857 to S-950；Q-858 to S-950；R-859 to S-950；R-860 to S- 950；L-861 to S-950；V-862 to S-950；E-863 to S-950；C-864 to S-950；R-865 to S-950；D-866 to S-950；I-867 to S-950；N-868 to S-950；G-869 to S-950；Q- 870 to S-950；P-871 to S-950；A-872 to S-950；S-873 to S-950；E-874 to S-950； C-875 to S-950；A-876 to S-950；K-877 to S-950；E-878 to S-950；V-879 to S- 950；K-880 to S-950；P-881 to S-950；A-882 to S-950；S-883 to S-950；T-884 to S-950；R-885 to S-950；P-886 to S-950；C-887 to S-950；A-888 to S-950；D- 889 to S-950；H-890 to S-950；P-891 to S-950；C-892 to S-950；P-893 to S-950； Q-894 to S-950；W-895 to S-950；Q-896 to S-950；L-897 to S-950；G-898 to S- 950；E-899 to S-950；W-900 to S-950；S-901 to S-950；S-902 to S-950；C-903 to S-950；S-904 to S-950；K-905 to S-950；T-906 to S-950；C-907 to S-950；G- 908 to S-950；K-909 to S-950；G-910 to S-950；Y-911 to S-950；K-912 to S-950； K-913 to S-950；R-914 to S-950；S-915 to S-950；L-916 to S-950；K-917 to S- 950；C-918 to S-950；L-919 to S-950；S-920 to S-950；H-921 to S-950；D-922

to S-950；G-923 to S-950；G-924 to S-950；V-925 to S-950；L-926 to S-950；S-

927 to S-950；H-928 to S-950；E-929 to S-950；S-930 to S-950；C-931 to S-950；

D-932 to S-950；P-933 to S-950；L-934 to S-950；K-935 to S-950；K-936 to S-

950；P-937 to S-950；K-938 to S-950；H-939 to S-950；F-940 to S-950；I-941 to

S-950；D-942 to S-950；F-943 to S-950；C-944 to S-950；T-945 to S-950；(SEQ

ID NO：2)

此外，METH1多肽的C-端缺失体可用概括的公式1-n描述，其中n是 2-950的整数，其中n相应于SEQ ID NO：2中所定的氨基酸残基位置。 优选如SEQ ID NO：2所示之本发明METH1多肽的C-端缺失体包括含如下 氨基酸残基序列的多肽：

           M-1 to C-949；M-1 to E-948；M-1 to A-947；M-1 to M-946；M-1 to

T-945；M-1 to C-944；M-1 to F-943；M-1 to D-942；M-1 to I-941；M-1 to F-940；

M-1 to H-939；M-1 to K-938；M-1 to P-937；M-1 to K-936；M-1 to K-935；M-1

to L-934；M-1 to P-933；M-1 to D-932；M-1 to C-931；M-1 to S-930；M-1 to E-

929；M-1 to H-928；M-1 to S-927；M-1 to L-926；M-1 to V-925；M-1 to G-924；

M-1 to G-923；M-1 to D-922；M-1 to H-921；M-1 to S-920；M-1 to L-919；M-1

to C-918；M-1 to K-917；M-1 to L-916；M-1 to S-915；M-1 to R-914；M-1 to K-

913；M-1 to K-912；M-1 to Y-911；M-1 to G-910；M-1 to K-909；M-1 to G-908；

M-1 to C-907；M-1 to T-906；M-1 to K-905；M-1 to S-904；M-1 to C-903；M-1

to S-902；M-1to S-901；M-1 to W-900；M-1 to E-899；M-1 to G-898；M-1 to L-

897；M-1 to Q-896；M-1 to W-895；M-1 to Q-894；M-1 to P-893；M-1 to C-892；

M-1 to P-891；M-1 to H-890；M-1 to D-889；M-1 to A-888；M-1 to C-887；M-1

to P-886；M-1 to R-885；M-1 to T-884；M-1 to S-883；M-1 to A-882；M-1 to P-

881；M-1 to K-880；M-1 to V-879；M-1 to E-878；M-1 to K-877；M-1 to A-876；

M-1 to C-875；M-1 to E-874；M-1 to S-873；M-1 to A-872；M-1 to P-871；M-1

to Q-870；M-1 to G-869；M-1 to N-868；M-1 to I-867；M-1 to D-866；M-1 to R-

865；M-1 to C-864；M-1 to E-863；M-1 to V-862；M-1 to L-861；M-1 to R-860；

M-1 to R-859；M-1 to Q-858；M-1 to W-857；M-1 to G-856；M-1 to L-855；M-1

to E-854；M-1 to C-853；M-1 to S-852；M-1 to K-851；M-1 to S″-850；M-1 to C- 849；M-1 to E-848；M-1 to G-847；M-1 to W-846；M-1 to E-845；M-1 to E-844； M-1 to I-843；M-1 to V-842；M-1 to W-841；M-1 to A-840；M-1 to S-839；M-1 to F-838；M-1 to T-837；M-1 to P-836；M-1 to I-835；M-1 to A-834；M-1 to N- 833；M-1 to F-832；M-1 to S-831；M-1 to E-830；M-1 to K-829；M-1 to K-828； M-1 to K-827；M-1 to K-826；M-1 to V-825；M-1 to F-824；M-1 to Y-823；M-1 to T-822；M-1 to Y-821；M-1 to K-820；M-1 to I-819；M-1 to K-818；M-1 to P- 817；M-1 to R-816；M-1 to L-815；M-1 to A-814；M-1 to N-813；M-1 to G-812； M-1 to V-811；M-1 to T-810；M-1 to L-809；M-1 to V-808；M-1 to Q-807；M-1 to I-806；M-1 to T-805；M-1 to L-804；M-1 to P-803；M-1 to E-802；M-1 to K- 801；M-1 to L-800；M-1 to P-799；M-1 to S-798；M-1 to F-797；M-1 to S-796； M-1 to R-795；M-1 to I-794；M-1 to R-793；M-1 to E-792；M-1 to L-791；M-1 to A-790；M-1 to A-789；M-1 to S-788；M-1 to S-787；M-1 to G-786；M-1 to S- 785；M-1 to Y-784；M-1 to R-783；M-1 to L-782；M-1 to V-781；M-1 to V-780； 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333；M-1 to H-332；M-1 to E-331；M-1 to A-330；M-1 to D-329；M-1 to R-328； M-1 to D-327；M-1 to S-326；M-1 to P-325；M-1 to P-324；M-1 to N-323；M-1 to H-322；M-1 to Q-321；M-1 to K-320；M-1 to Q-319；M-1 to W-318；M-1 to N-317；M-1 to C-316；M-1 to F-315；M-1 to N-314；M-1 to R-313；M-1 to L- 312；M-1 to T-311；M-1 to L-310；M-1 to A-309；M-1 to A-308；M-1 to N-307； M-1 to S-306；M-1 to T-305；M-1 to V-304；M-1 to E-303；M-1 to P-302；M-1 to G-301；M-1 to K-300；M-1 to Q-299；M-1 to E-298；M-1 to D-297；M-1 to H-296；M-1 to I-295；M-1 to V-294；M-1 to L-293；M-1 to I-292；M-1 to K-291； M-1 to V-290；M-1 to V-289；M-1 to V-288；M-1 to L-287；M-1 to S-286；M-1 to V-285；M-1 to S-284；M-1 to N-283；M-1 to R-282；M-1 to I-281；M-1 to S- 280；M-1 to P-279；M-1 to H-278；M-1 to K-277；M-1 to Y-276；M-1 to L-275； M-1 to R-274；M-1 to A-273；M-1 to A-272；M-1 to V-271；M-1 to S-270；M-1 to F-269；M-1 to L-268；M-1 to T-267；M-1 to L-266；M-1 to L-265；M-1 to Y- 264；M-1 to H-263；M-1 to K-262；M-1 to L-261；M-1 to G-260；M-1 to S-259； M-1 to G-258；M-1 to H-257；M-1 to F-256；M-1 to E-255；M-1 to A-254；M-1 to M-253；M-1 to S-252；M-1 to Q-251；M-1 to D-250；M-1 to A-249；M-1 to V-248；M-1 to L-247；M-1 to M-246；M-1 to T-245；M-1 to E-244；M-1 to V- 243；M-1 to Y-242；M-1 to R-241；M-1 to H-240；M-1 to S-239；M-1 to S-238； M-1 to V-237；M-1 to F-236；M-1 to R-235；M-1 to K-234；M-1 to K-233；M-1 to R-232；M-1 to I-231；M-1 to S-230；M-1 to G-229；M-1 to T-228；M-1 to G- 227；M-1 to T-226；M-1 to P-225；M-1 to Q-224；M-1 to G-223；M-1 to V-222； M-1 to G-221；M-1 to Q-220；M-1 to L-219；M-1 to A-218；M-1 to P-217；M-1 to D-216；M-1 to Q-215；M-1 to P-214；M-1 to S-213；M-1 to W-212；M-1 to Q-211；M-1 to P-210；M-1 to G-209；M-1 to E-208；M-1 to D-207；M-1 to E- 206；M-1 to G-205；M-1 to E-204；M-1 to T-203；M-1 to G-202；M-1 to E-201； M-1 to D-200；M-1 to E-199；M-1 to D-198；M-1 to E-197；M-1 to T-196；M-1 to E-195；M-1 to A-194；M-1 to K-193；M-1 to G-192；M-1 to T-191；M-1 to P- 190；M-1 to R-189；M-1 to P-188；M-1 to E-187；M-1 to D-186；M-1 to D-185； M-1 to V-184；M-1 to V-183；M-1 to G-182；M-1 to C-181；M-1 to T-180；M-1 to G-179；M-1 to G-178；M-1 to V-177；M-1 to D-176；M-1 to G-175；M-1 to Q-174；M-1 to R-173；M-1 to N-172；M-1 to R-171；M-1 to R-170；M-1 to L- 169；M-1 to L-168；M-1 to H-167；M-1 to F-166；M-1 to Q-165；M-1 to L-164； M-1 to P-163；M-1 to A-162；M-1 to P-161；M-1 to P-160；M-1 to K-159；M-1 to E-158；M-1 to G-157；M-1 to P-156；M-1 to A-155；M-1 to A-154；M-1 to T- 153；M-1 to A-152；M-1 to L-151；M-1 to R-150；M-1 to E-149；M-1 to S-148； M-1 to A-147；M-1 to A-146；M-1 to P-145；M-1 to L-144；M-1 to P-143；M-1 to Q-142；M-1 to I-141；M-1 to F-140；M-1 to Y-139；M-1 to A-138；M-1 to E- 137；M-1 to G-136；M-1 to L-135；M-1 to L-134；M-1 to Y-133；M-1 to F-132； M-1 to A-131；M-1 to G-130；M-1 to R-129；M-1 to V-128；M-1 to G-127；M-1 to E-126；M-1 to C-125；M-1 to L-124；M-1 to S-123；M-1 to L-122；M-1 to A- 121；M-1 to A-120；M-1 to A-119；M-1 to S-118；M-1 to S-117；M-1 to P-116； M-1 to D-115；M-1 to G-114；M-1 to N-113；M-1 to V-112；M-1 to T-111；M-1 to G-110；M-1 to S-109；M-1 to Y-108；M-1 to F-107；M-1 to C-106；M-1 to H- 105；M-1 to A-104；M-1 to L-103；M-1 to D-102；M-1 to T-101；M-1 to E-100； M-1 to P-99；M-1 to L-98；M-1 to P-97；M-1 to T-96；M-1 to E-95；M-1 to S-94； M-1 to G-93；M-1 to S-92；M-1 to K-91；M-1 to R-90；M-1 to G-89；M-1 to V- 88；M-1 to N-87；M-1 to Q-86；M-1 to L-85；M-1 to T-84；M-1 to F-83；M-1 to G-82；M-1 to P-81；M-1 to A-80；M-1 to L-79；M-1 to F-78；M-1 to S-77；M-1 to S-76；M-1 to D-75；M-1 to P-74；M-1 to R-73；M-1 to L-72；M-1 to E-71；M- 1 to L-70；M-1 to D-69；M-1 to L-68；M-1 to Q-67；M-1 to Q-66；M-1 to D-65； M-1 to F-64；M-1 to A-63；M-1 to H-62；M-1 to L-61；M-1 to R-60；M-1 to L- 59；M-1 to R-58；M-1 to T-57；M-1 to T-56；M-1 to G-55；M-1 to H-54；M-1 to G-53；M-1 to P-52；M-1 to A-51；M-1 to R-50；M-1 to E-49；M-1 to L-48；M-1

to E-47；M-1 to P-46；M-1 to V-45；M-1 to V-44；M-1 to L-43；M-1 to E-42；M-

1 to E-41；M-1 to D-40；M-1 to E-39；M-1 to E-38；M-1 to S-37；M-1 to P-36；

M-1 to R-35；M-1 to G-34；M-1 to L-33；M-1 to A-32；M-1 to D-31；M-1 to S-

30；M-1 to V-29；M-1 to A-28；M-1 to L-27；M-1 to L-26；M-1 to A-25；M-1 to

A-24；M-1 to A-23；M-1 to L-22；M-1 to L-21；M-1 to L-20；M-1 to L-19；M-1

to T-18；M-1 to P-17；M-1 to V-16；M-1 to P-15；M-1 to G-14；M-1 to F-13；M-

1 to S-12；M-1 to R-11；M-1 to S-10；M-1 to G-9；M-1 to P-8；M-1 to A-7；

(SEQ ID NO：2)优选地，任何以上列举的N-或C-端缺失可组合而产生 N-和C-端缺失的METH1多肽。

另外，METH2多肽的N-端缺失体可用概括的公式m-890描述，其中m 是2-889的整数，其中m相应于SEQ ID NO：4中所定的氨基酸残基位置。 优选如SEQ ID NO：4所示之本发明METH2多肽的N-端缺失体包括含如下 氨基酸残基序列的多肽：

                      F-2 to L-890；P-3 to L-890；A-4 to L-890；P-5 to L-890；

A-6 to L-890；A-7 to L-890；P-8 to L-890；R-9 to L-890；W-10 to L-890；L-11

to L-890；P-12 to L-890；F-13 to L-890；L-14 to L-890；L-15 to L-890；L-16 to

L-890；L-17 to L-890；L-18 to L-890；L-19 to L-890；L-20 to L-890；L-21 to L-

890；L-22 to L-890；P-23 to L-890；L-24 to L-890；A-25 to L-890；R-26 to L-

890；G-27 to L-890；A-28 to L-890；P-29 to L-890；A-30 to L-890；R-31 to L-

890；P-32 to L-890；A-33 to L-890；A-34 to L-890；G-35 to L-890；G-36 to L-

890；Q-37 to L-890；A-38 to L-890；S-39 to L-890；E-40 to L-890；L-41 to L-

890；V-42 to L-890；V-43 to L-890；P-44 to L-890；T-45 to L-890；R-46 to L-

890；L-47 to L-890；P-48 to L-890；G-49 to L-890；S-50 to L-890；A-51 to L-

890；G-52 to L-890；E-53 to L-890；L-54 to L-890；A-55 to L-890；L-56 to L-

890；H-57 to L-890；L-58 to L-890；S-59 to L-890；A-60 to L-890；F-61 to L-

890；G-62 to L-890；K-63 to L-890；G-64 to L-890；F-65 to L-890；V-66 to L-

890；L-67 to L-890；R-68 to L-890；L-69 to L-890；A-70 to L-890；P-71 to L-

890；D-72 to L-890；D-73 to L-890；S-74 to L-890；F-75 to L-890；L-76 to L-

890；A-77 to L-890；P-78 to L-890；E-79 to L-890；F-80 to L-890；K-81 to L- 890；I-82 to L-890；E-83 to L-890；R-84 to L-890；L-85 to L-890；G-86 to L- 890；G-87 to L-890；S-88 to L-890；G-89 to L-890；R-90 to L-890；A-91 to L- 890；T-92 to L-890；G-93 to L-890；G-94 to L-890；E-95 to L-890；R-96 to L- 890；G-97 to L-890；L-98 to L-890；R-99 to L-890；G-100 to L-890；C-101 to L- 890；F-102 to L-890；F-103 to L-890；S-104 to L-890；G-105 to L-890；T-106 to L-890；V-107 to L-890；N-108 to L-890；G-109 to L-890；E-110 to L-890；P- 111 to L-890；E-112 to L-890；S-113 to L-890；L-114 to L-890；A-115 to L-890； A-116 to L-890；V-117 to L-890；S-118 to L-890；L-119 to L-890；C-120 to L- 890；R-121 to L-890；G-122 to L-890；L-123 to L-890；S-124 to L-890；G-125 to L-890；S-126 to L-890；F-127 to L-890；L-128 to L-890；L-129 to L-890；D- 130 to L-890；G-131 to L-890；E-132 to L-890；E-133 to L-890；F-134 to L-890； T-135 to L-890；I-136 to L-890；Q-137 to L-890；P-138 to L-890；Q-139 to L- 890；G-140 to L-890；A-141 to L-890；G-142 to L-890；G-143 to L-890；S-144 to L-890；L-145 to L-890；A-146 to L-890；Q-147 to L-890；P-148 to L-890；H- 149 to L-890；R-150 to L-890；L-151 to L-890；Q-152 to L-890；R-153 to L-890； W-154 to L-890；G-155 to L-890；P-156 to L-890；A-157 to L-890；G-158 to L- 890；A-159 to L-890；R-160 to L-890；P-161 to L-890；L-162 to L-890；P-163 to L-890；R-164 to L-890；G-165 to L-890；P-166 to L-890；E-167 to L-890；W- 168 to L-890；E-169 to L-890；V-170 to L-890；E-171 to L-890；T-172 to L-890； G-173 to L-890；E-174 to L-890；G-175 to L-890；Q-176 to L-890；R-177 to L- 890；Q-178 to L-890；E-179 to L-890；R-180 to L-890；G-181 to L-890；D-182 to L-890；H-183 to L-890；Q-184 to L-890；E-185 to L-890；D-186 to L-890；S- 187 to L-890；E-188 to L-890；E-189 to L-890；E-190 to L-890；S-191 to L-890； Q-192 to L-890；E-193 to L-890；E-194 to L-890；E-195 to L-890；A-196 to L- 890；E-197 to L-890；G-198 to L-890；A-199 to L-890；S-200 to L-890；E-201 to L-890；P-202 to L-890；P-203 to L-890；P-204 to L-890；P-205 to L-890；L- 206 to L-890；G-207 to L-890；A-208 to L-890；T-209 to L-890；S-210 to L-890； R-211 to L-890；T-212 to L-890；K-213 to L-890；R-214 to L-890；F-215 to L- 890；V-216 to L-890；S-217 to L-890；E-218 to L-890；A-219 to L-890；R-220 to L-890；F-221 to L-890；V-222 to L-890；E-223 to L-890；T-224 to L-890；L- 225 to L-890；L-226 to L-890；V-227 to L-890；A-228 to L-890；D-229 to L-890； A-230 to L-890；S-231 to L-890；M-232 to L-890；A-233 to L-890；A-234 to L- 890；F-235 to L-890；Y-236 to L-890；G-237 to L-890；A-238 to L-890；D-239 to L-890；L-240 to L-890；Q-241 to L-890；N-242 to L-890；H-243 to L-890；I- 244 to L-890；L-245 to L-890；T-246 to L-890；L-247 to L-890；M-248 to L-890； S-249 to L-890；V-250 to L-890；A-251 to L-890；A-252 to L-890；R-253 to L- 890；I-254 to L-890；Y-255 to L-890；K-256 to L-890；H-257 to L-890；P-258 to L-890；S-259 to L-890；I-260 to L-890；K-261 to L-890；N-262 to L-890；S- 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576 to L-890；H-577 to L-890；T-578 to L-890；E-579 to L-890；E-580 to L-890； C-581 to L-890；P-582 to L-890；P-583 to L-890；D-584 to L-890；G-585 to L- 890；K-586 to L-890；S-587 to L-890；F-588 to L-890；R-589 to L-890；E-590 to L-890；Q-591 to L-890；Q-592 to L-890；C-593 to L-890；E-594 to L-890；K- 595 to L-890；Y-596 to L-890；N-597 to L-890；A-598 to L-890；Y-599 to L- 890；N-600 to L-890；Y-601 to L-890；T-602 to L-890；D-603 to L-890；M-604 to L-890；D-605 to L-890；G-606 to L-890；N-607 to L-890；L-608 to L-890；L- 609 to L-890；Q-610 to L-890；W-611 to L-890；V-612 to L-890；P-613 to L- 890；K-614 to L-890；Y-615 to L-890；A-616 to L-890；G-617 to L-890；V-618 to L-890；S-619 to L-890；P-620 to L-890；R-621 to L-890；D-622 to L-890；R- 623 to L-890；C-624 to L-890；K-625 to L-890；L-626 to L-890；F-627 to L-890； C-628 to L-890；R-629 to L-890；A-630 to L-890；R-631 to L-890；G-632 to L- 890；R-633 to L-890；S-634 to L-890；E-635 to L-890；F-636 to L-890；K-637 to L-890；V-638 to L-890；F-639 to L-890；E-640 to L-890；A-641 to L-890；K- 642 to L-890；V-643 to L-890；I-644 to L-890；D-645 to L-890；G-646 to L-890； T-647 to L-890；L-648 to L-890；C-649 to L-890；G-650 to L-890；P-651 to L- 890；E-652 to L-890；T-653 to L-890；L-654 to L-890；A-655 to L-890；I-656 to L-890；C-657 to L-890；V-658 to L-890；R-659 to L-890；G-660 to L-890；Q-661 to L-890；C-662 to L-890；V-663 to L-890；K-664 to L-890；A-665 to L-890；G- 666 to L-890；C-667 to L-890；D-668 to L-890；H-669 to L-890；V-670 to L- 890；V-671 to L-890；D-672 to L-890；S-673 to L-890；P-674 to L-890；R-675 to L-890；K-676 to L-890；L-677 to L-890；D-678 to L-890；K-679 to L-890；C- 680 to L-890；G-681 to L-890；V-682 to L-890；C-683 to L-890；G-684 to L- 890；G-685 to L-890；K-686 to L-890；G-687 to L-890；N-688 to L-890；S-689 to L-890；C-690 to L-890；R-691 to L-890；K-692 to L-890；V-693 to L-890；S- 694 to L-890；G-695 to L-890；S-696 to L-890；L-697 to L-890；T-698 to L-890； P-699 to L-890；T-700 to L-890；N-701 to L-890；Y-702 to L-890；G-703 to L- 890；Y-704 to L-890；N-705 to L-890；D-706 to L-890；I-707 to L-890；V-708 to L-890；T-709 to L-890；I-710 to L-890；P-711 to L-890；A-712 to L-890；G- 713 to L-890；A-714 to L-890；T-715 to L-890；N-716 to L-890；I-717 to L-890； D-718 to L-890；V-719 to L-890；K-720 to L-890；Q-721 to L-890；R-722 to L- 890；S-723 to L-890；H-724 to L-890；P-725 to L-890；G-726 to L-890；V-727 to L-890；Q-728 to L-890；N-729 to L-890；D-730 to L-890；G-731 to L-890；N- 732 to L-890；Y-733 to L-890；L-734 to L-890；A-735 to L-890；L-736 to L-890； K-737 to L-890；T-738 to L-890；A-739 to L-890；D-740 to L-890；G-741 to L- 890；Q-742 to L-890；Y-743 to L-890；L-744 to L-890；L-745 to L-890；N-746 to L-890；G-747 to L-890；N-748 to L-890；L-749 to L-890；A-750 to L-890；I- 751 to L-890；S-752 to L-890；A-753 to L-890；I-754 to L-890；E-755 to L-890； Q-756 to L-890；D-757 to L-890；I-758 to L-890；L-759 to L-890；V-760 to L- 890；K-761 to L-890；G-762 to L-890；T-763 to L-890；I-764 to L-890；L-765 to L-890；K-766 to L-890；Y-767 to L-890；S-768 to L-890；G-769 to L-890；S- 770 to L-890；I-771 to L-890；A-772 to L-890；T-773 to L-890；L-774 to L-890； E-775 to L-890；R-776 to L-890；L-777 to L-890；Q-778 to L-890；S-779 to L- 890；F-780 to L-890；R-781 to L-890；P-782 to L-890；L-783 to L-890；P-784 to L-890；E-785 to L-890；P-786 to L-890；L-787 to L-890；T-788 to L-890；V-789 to L-890；Q-790 to L-890；L-791 to L-890；L-792 to L-890；T-793 to L-890；V-

794 to L-890；P-795 to L-890；G-796 to L-890；E-797 to L-890；V-798 to L-890；

F-799 to L-890；P-800 to L-890；P-801 to L-890；K-802 to L-890；V-803 to L-

890；K-804 to L-890；Y-805 to L-890；T-806 to L-890；F-807 to L-890；F-808

to L-890；V-809 to L-890；P-810 to L-890；N-811 to L-890；D-812 to L-890；V-

813 to L-890；D-814 to L-890；F-815 to L-890；S-816 to L-890；M-817 to L-890；

Q-818 to L-890；S-819 to L-890；S-820 to L-890；K-821 to L-890；E-822 to L-

890；R-823 to L-890；A-824 to L-890；T-825 to L-890；T-826 to L-890；N-827

to L-890；I-828 to L-890；I-829 to L-890；Q-830 to L-890；P-831 to L-890；L-

832 to L-890；L-833 to L-890；H-834 to L-890；A-835 to L-890；Q-836 to L-890；

W-837 to L-890；V-838 to L-890；L-839 to L-890；G-840 to L-890；D-841 to L-

890；W-842 to L-890；S-843 to L-890；E-844 to L-890；C-845 to L-890；S-846

to L-890；S-847 to L-890；T-848 to L-890；C-849 to L-890；G-850 to L-890；A-

851 to L-890；G-852 to L-890；W-853 to L-890；Q-854 to L-890；R-855 to L-

890；R-856 to L-890；T-857 to L-890；V-858 to L-890；E-859 to L-890；C-860

to L-890；R-861 to L-890；D-862 to L-890；P-863 to L-890；S-864 to L-890；G-

865 to L-890；Q-866 to L-890；A-867 to L-890；S-868 to L-890；A-869 to L-890；

T-870 to L-890；C-871 to L-890；N-872 to L-890；K-873 to L-890；A-874 to L-

890；L-875 to L-890；K-876 to L-890；P-877 to L-890；E-878 to L-890；D-879

to L-890；A-880 to L-890；K-881 to L-890；P-882 to L-890；C-883 to L-890；E-

884 to L-890；S-885 to L-890；(SEQ ID NO：4.)

此外，METH2多肽的C-端缺失体可用概括的公式1-n描述，其中n是 2-890的整数，其中n相应于SEQ ID NO：4中所定的氨基酸残基位置。 优选如SEQ ID NO：4所示之本发明METH2多肽的C-端缺失体包括含如下 氨基酸残基序列的多肽：

    M-1 to P-889；M-1 to C-888；M-1 to L-887；M-1 to Q-886；M-1 to

S-885；M-1 to E-884；M-1 to C-883；M-1 to P-882；M-1 to K-881；M-1 to A-

880；M-1 to D-879；M-1 to E-878；M-1 to P-877；M-1 to K-876；M-1 to L-875；

M-1 to A-874；M-1 to K-873；M-1 to N-872；M-1 to C-871；M-1 to T-870；M-1

to A-869；M-1 to S-868；M-1 to A-867；M-1 to Q-866；M-1 to G-865；M-1 to S- 864；M-1 to P-863；M-1 to D-862；M-1 to R-861；M-1 to C-860；M-1 to E-859； M-1 to V-858；M-1 to T-857；M-1 to R-856；M-1 to R-855；M-1 to Q-854；M-1 to W-853；M-1 to G-852；M-1 to A-851；M-1 to G-850；M-1 to C-849；M-1 to T-848；M-1 to S-847；M-1 to S-846；M-1 to C-845；M-1 to E-844；M-1 to S-843； M-1 to W-842；M-1 to D-841；M-1 to G-840；M-1 to L-839；M-1 to V-838；M-1 to W-837；M-1 to Q-836；M-1 to A-835；M-1 to H-834；M-1 to L-833；M-1 to L-832；M-1 to P-831；M-1 to Q-830；M-1 to I-829；M-1 to I-828；M-1 to N-827； M-1 to T-826；M-1 to T-825；M-1 to A-824；M-1 to R-823；M-1 to E-822；M-1 to K-821；M-1 to S-820；M-1 to S-819；M-1 to Q-818；M-1 to M-817；M-1 to S- 816；M-1 to F-815；M-1 to D-814；M-1 to V-813；M-1 to D-812；M-1 to N-811； M-1 to P-810；M-1 to V-809；M-1 to F-808；M-1 to F-807；M-1 to T-806；M-1 to Y-805；M-1 to K-804；M-1 to V-803；M-1 to K-802；M-1 to P-801；M-1 to P- 800；M-1 to F-799；M-1 to V-798；M-1 to E-797；M-1 to G-796；M-1 to P-795； M-1 to V-794；M-1 to T-793；M-1 to L-792；M-1 to L-791；M-1 to Q-790；M-1 to V-789；M-1 to T-788；M-1 to L-787；M-1 to P-786；M-1 to E-785；M-1 to P- 784；M-1 to L-783；M-1 to P-782；M-1 to R-781；M-1 to F-780；M-1 to S-779； M-1 to Q-778；M-1 to L-777；M-1 to R-776；M-1 to E-775；M-1 to L-774；M-1 to T-773；M-1 to A-772；M-1 to I-771；M-1 to S-770；M-1 to G-769；M-1 to S- 768；M-1 to Y-767；M-1 to K-766；M-1 to L-765；M-1 to I-764；M-1 to T-763； M-1 to G-762；M-1 to K-761；M-1 to V-760；M-1 to L-759；M-1 to I-758；M-1 to D-757；M-1 to Q-756；M-1 to E-755；M-1 to I-754；M-1 to A-753；M-1 to S- 752；M-1 to I-751；M-1 to A-750；M-1 to L-749；M-1 to N-748；M-1 to G-747； M-1 to N-746；M-1 to L-745；M-1 to L-744；M-1 to Y-743；M-1 to Q-742；M-1 to G-741；M-1 to D-740；M-1 to A-739；M-1 to T-738；M-1 to K-737；M-1 to L-736；M-1 to A-735；M-1 to L-734；M-1 to Y-733；M-1 to N-732；M-1 to G- 731；M-1 to D-730；M-1 to N-729；M-1 to Q-728；M-1 to V-727；M-1 to G-726； M-1 to P-725；M-1 to H-724；M-1 to S-723；M-1 to R-722；M-1 to Q-721；M-1 to K-720；M-1 to V-719；M-1 to D-718；M-1 to I-717；M-1 to N-716；M-1 to T- 715；M-1 to A-714；M-1 to G-713；M-1 to A-712；M-1 to P-711；M-1 to I-710； M-1 to T-709；M-1 to V-708；M-1 to I-707；M-1 to D-706；M-1 to N-705；M-1 to Y-704；M-1 to G-703；M-1 to Y-702；M-1 to N-701；M-1 to T-700；M-1 to P-699；M-1 to T-698；M-1 to L-697；M-1 to S-696；M-1 to G-695；M-1 to S-694； M-1 to V-693；M-1 to K-692；M-1 to R-691；M-1 to C-690；M-1 to S-689；M-1 to N-688；M-1 to G-687；M-1 to K-686；M-1 to G-685；M-1 to G-684；M-1 to C-683；M-1 to V-682；M-1 to G-681；M-1 to C-680；M-1 to K-679；M-1 to D- 678；M-1 to L-677；M-1 to K-676；M-1 to R-675；M-1 to P-674；M-1 to S-673； M-1 to D-672；M-1 to V-671；M-1 to V-670；M-1 to H-669；M-1 to D-668；M-1 to C-667；M-1 to G-666；M-1 to A-665；M-1 to K-664；M-1 to V-663；M-1 to C-662；M-1 to Q-661；M-1 to G-660；M-1 to R-659；M-1 to V-658；M-1 to C- 657；M-1 to I-656；M-1 to A-655；M-1 to L-654；M-1 to T-653；M-1 to E-652； M-1 to P-651；M-1 to G-650；M-1 to C-649；M-1 to L-648；M-1 to T-647；M-1 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E-275；M-1 to V-274；M-1 to I-273；M-1 to L-272；M-1 to V-271；M-1 to K- 270；M-1 to V-269；M-1 to V-268；M-1 to M-267；M-1 to L-266；M-1 to N-265； M-1 to I-264；M-1 to S-263；M-1 to N-262；M-1 to K-261；M-1 to I-260；M-1 to S-259；M-1 to P-258；M-1 to H-257；M-1 to K-256；M-1 to Y-255；M-1 to I- 254；M-1 to R-253；M-1 to A-252；M-1 to A-251；M-1 to V-250；M-1 to S-249； M-1 to M-248；M-1 to L-247；M-1 to T-246；M-1 to L-245；M-1 to I-244；M-1 to H-243；M-1 to N-242；M-1 to Q-241；M-1 to L-240；M-1 to D-239；M-1 to A-238；M-1 to G-237；M-1 to Y-236；M-1 to F-235；M-1 to A-234；M-1 to A- 233；M-1 to M-232；M-1 to S-231；M-1 to A-230；M-1 to D-229；M-1 to A-228； M-1 to V-227；M-1 to L-226；M-1 to L-225；M-1 to T-224；M-1 to E-223；M-1 to V-222；M-1 to F-221；M-1 to R-220；M-1 to A-219；M-1 to E-218；M-1 to S- 217；M-1 to V-216；M-1 to F-215；M-1 to R-214；M-1 to K-213；M-1 to T-212； M-1 to R-211；M-1 to S-210；M-1 to T-209；M-1 to A-208；M-1 to G-207；M-1 to L-206；M-1 to P-205；M-1 to P-204；M-1 to P-203；M-1 to P-202；M-1 to E- 201；M-1 to S-200；M-1 to A-199；M-1 to G-198；M-1 to E-197；M-1 to A-196； M-1 to E-195；M-1 to E-194；M-1 to E-193；M-1 to Q-192；M-1 to S-191；M-1 to E-190；M-1 to E-189；M-1 to E-188；M-1 to S-187；M-1 to D-186；M-1 to E- 185；M-1 to Q-184；M-1 to H-183；M-1 to D-182；M-1 to G-181；M-1 to R-180； M-1 to E-179；M-1 to Q-178；M-1 to R-177；M-1 to Q-176；M-1 to G-175；M-1 to E-174；M-1 to G-173；M-1 to T-172；M-1 to E-171；M-1 to V-170；M-1 to E- 169；M-1 to W-168；M-1 to E-167；M-1 to P-166；M-1 to G-165；M-1 to R-164； M-1 to P-163；M-1 to L-162；M-1 to P-161；M-1 to R-160；M-1 to A-159；M-1 to G-158；M-1 to A-157；M-1 to P-156；M-1 to G-155；M-1 to W-154；M-1 to R-153；M-1 to Q-152；M-1 to L-151；M-1 to R-150；M-1 to H-149；M-1 to P- 148；M-1 to Q-147；M-1 to A-146；M-1 to L-145；M-1 to S-144；M-1 to G-143； M-1 to G-142；M-1 to A-141；M-1 to G-140；M-1 to Q-139；M-1 to P-138；M-1 to Q-137；M-1 to I-136；M-1 to T-135；M-1 to F-134；M-1 to E-133；M-1 to E- 132；M-1 to G-131；M-1 to D-130；M-1 to L-129；M-1 to L-128；M-1 to F-127； M-1 to S-126；M-1 to G-125；M-1 to S-124；M-1 to L-123；M-1 to G-122；M-1 to R-121；M-1 to C-120；M-1 to L-119；M-1 to S-118；M-1 to V-117；M-1 to A- 116；M-1 to A-115；M-1 to L-114；M-1 to S-113；M-1 to E-112；M-1 to P-111； M-1 to E-110；M-1 to G-109；M-1 to N-108；M-1 to V-107；M-1 to T-106；M-1 to G-105；M-1 to S-104；M-1 to F-103；M-1 to F-102；M-1 to C-101；M-1 to G- 100；M-1 to R-99；M-1 to L-98；M-1 to G-97；M-1 to R-96；M-1 to E-95；M-1 to G-94；M-1 to G-93；M-1 to T-92；M-1 to A-91；M-1 to R-90；M-1 to G-89； M-1 to S-88；M-1 to G-87；M-1 to G-86；M-1 to L-85；M-1 to R-84；M-1 to E- 83；M-1 to I-82；M-1 to K-81；M-1 to F-80；M-1 to E-79；M-1 to P-78；M-1 to A-77；M-1 to L-76；M-1 to F-75；M-1 to S-74；M-1 to D-73；M-1 to D-72；M-1 to P-71；M-1 to A-70；M-1 to L-69；M-1 to R-68；M-1 to L-67；M-1 to V-66；M-

1 to F-65；M-1 to G-64；M-1 to K-63；M-1 to G-62；M-1 to F-61；M-1 to A-60；

M-1 to S-59；M-1 to L-58；M-1 to H-57；M-1 to L-56；M-1 to A-55；M-1 to L-

54；M-1 to E-53；M-1 to G-52；M-1 to A-51；M-1 to S-50；M-1 to G-49；M-1 to

P-48；M-1 to L-47；M-1 to R-46；M-1 to T-45；M-1 to P-44；M-1 to V-43；M-1

to V-42；M-1 to L-41；M-1 to E-40；M-1 to S-39；M-1 to A-38；M-1 to Q-37；M-

1 to G-36；M-1 to G-35；M-1 to A-34；M-1 to A-33；M-1 to P-32；M-1 to R-31；

M-1 to A-30；M-1 to P-29；M-1 to A-28；M-1 to G-27；M-1 to R-26；M-1 to A-

25；M-1 to L-24；M-1 to P-23；M-1 to L-22；M-1 to L-21；M-1 to L-20；M-1 to

L-19；M-1 to L-18；M-1 to L-17；M-1 to L-16；M-1 to L-15；M-1 to L-14；M-1

to F-13；M-1 to P-12；M-1 to L-11；M-1 to W-10；M-1 to R-9；M-1 to P-8；M-1

to A-7；(SEQ ID NO：4)优选地，任何以上列举的N-或C-端缺失可组合 而产生N-和C-端缺失的METH2多肽。

本发明还提供了在氨基和羧基端两端均具一个或多个氨基酸缺失的 多肽，它们通常可描述为具SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的m-n残基， 其中n和m是如上所述的整数。

也优选以结构或功能结构域为特征的METH1或METH2多肽和多核苷酸 片段。本发明的优选实施方案包括含以下区域的片段：α-螺旋和α-螺 旋形成区(“α-区”)、β-折叠和β-折叠形成区(“β-区”)、转角和转 角形成区(“转角区”)、卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)、亲水区、疏水 区、α两亲区、β两亲区、柔性区、表面形成区、底物结合区和高抗原 性指数区。如图中所列出的，这样的优选区包括Garnier-Robsonα-区、 β-区、转角区和卷曲区、Chou-Fasmanα-区、β-区和转角区、 Kyte-Doolittle亲水区和疏水区、Eisenbergα和β两亲区、 Karplus-Schulz柔性区、Emini表面形成区和Jameson-Wolf高抗原性指 数区。本发明特别包括落在保守结构域内的SEQ ID NO：2多肽片段。(参 阅图10&11和表1&2)。此外，本发明也包括编码这些结构域的多核苷酸 片段。

其他优选片段是生物活性的METH1或METH2片段。生物活性片段是那 些展示与METH1或METH2多肽活性相似但不必完全相同的活性的片段。 这些片段的生物活性包括提高的期望活性或降低的不理想活性。

如EST序列之类的许多多核苷酸序列可公开地从序列数据库获得。其 中一些与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3有关，并可能在本发明构思前已 可公开地获得。优选地，这种相关多核苷酸排除在本发明范围之外。将 每个相关序列一一列举是繁琐的。因此，优选从本发明中排除的是含通 式a-b所描述之核苷酸序列的一个或多个多核苷酸，其中a是SEQ ID NO：1 第1-936位的任何整数，b是第15-950位整数，其中a和b都相应于SEQ ID NO：1中所示的核苷酸残基位置，且b大于或等于+14。此外，优选从 本发明中排除的是含通式a-b所描述之核苷酸序列的一个或多个多核苷 酸，其中a是SEQ ID NO：3第1-876位的任何整数，b是第15-890位整 数，其中a和b都相应于SEQ ID NO：3中所示的核苷酸残基位置，且b 大于或等于+14。

表位和抗体

在本发明中，“表位”指在动物，尤其是人体内具抗原性或免疫原性 活性的METH1或METH2多肽片段。本发明的优选实施方案涉及含表位的 METH1或METH2多肽片段以及编码该片段的多核苷酸。抗体可结合的蛋白 质分子区称为“抗原性表位”。相对而言，“免疫原性表位”定义为可引 发抗体应答的蛋白质部分。(参阅，例如，Geysen等，美国国家科学院院 报81：3998-4002(1983))。

具表位功能的片段可用任何常规方法产生。(见，如，Houghten，R.A.， 美国国家科学院院报82：5131-5135(1985)，进一步描述于美国专利号 4631211中。)

在本发明中，抗原性表位优选包括至少7个，更优选至少9个，最优 选约15-30个氨基酸的序列。抗原性表位可用于产生与表位可特异结合 的抗体，包括单克隆抗体。(见，例如，Wilson等，细胞37：767-778(1984)； Sutcliffe，J.G.等，科学219：660-666(1983))。

同样地，免疫原性表位可按本领域众所周知的方法用于诱发抗体。 (参阅，例如，Sutcliffe等，见上文；Wilson等，见上文；Chow，M.等， 美国国家科学院院报82：910-914；和Bittle，F.J.等，普通病毒学杂志 (J.Gen.Virol.)66：2347-2354(1985)。)优选的免疫原性表位包括分泌的 蛋白质。免疫原性表位可与载体蛋白质，如清蛋白一起用于动物系统(如 兔或小鼠)，或者，如果它足够长(至少约25个氨基酸)，则可以无需载 体。然而，含少至8-10个氨基酸的免疫原性表位已显示足以产生能至少 结合变性多肽中线性表位的抗体(如在蛋白质印迹中)。

利用DNAstar分析，发现SEQ ID NO：2在以下氨基酸处有抗原性：

      2-14，32-44，47-60，66-78，87-103，109-118，146-162，168-180，183-219，

223-243，275-284，296-306，314-334，341-354，357-376，392-399，401-410，418-

429，438-454，456-471，474-488，510-522，524-538，550-561，565-626，630-643，

659-671，679-721，734-749，784-804，813-820，825-832，845-854，860-894，899-

917，919-924 and 928-939因此，这些区域可用作表位以产生抗METH1 cDNA所编码蛋白质的抗体。

利用DNAstar分析，发现SEQ ID NO：4在以下氨基酸处有抗原性：

      26-38，45-52，69-76，80-99，105-113，129-136，138-217，254-263，273-

289，294-313，321-331，339-356，371-383，417-427，438-443，459-471，479-505，

507-526，535-546，550-607，615-640，648-653，660-667，669-681，683-704，717-

732，737-743，775-787，797-804，811-825，840-867 and 870-884，

因此，这些区域可用作表位以产生抗METH 2 cDNA所编码蛋白质的抗 体。

此处所用术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)表示包括完整分 子及能特异结合蛋白质的抗体片段(如，例如Fab和F(ab’)2片段)。Fab 和F(ab’)2片段缺少完整抗体的Fc片段，与完整抗体相比能更迅速地从 循环中清除，且可能有更少的非特异性组织结合。(Wahl等， J.Nucl.Med.24：316-325(1983).)因此，优选这些片段，以及FAB或其 他免疫球蛋白表达文库的产物。此外，本发明的抗体包括嵌合、单链和 人源化抗体。

融合蛋白

任何METH1或METH2多肽可用于产生融合蛋白。例如，与第二种蛋白 质融合了时，METH1或METH2多肽可用作抗原标记。产生的抗METH1或 METH2多肽的抗体可通过与METH1或METH2结合而用于间接检测第二种蛋 白质。而且，因为分泌蛋白质基于运输信号而定向于细胞位置，故METH1 或METH2多肽一旦与其它蛋白质融合就可用作靶向分子。

可与METH1或METH2多肽融合的结合域例子不仅包括异源信号序列， 还包括其他异源功能区。融合不必一定是直接的，也可通过连接序列产 生。

此外，融合蛋白质还可通过基因工程改造以改善METH1或METH2多肽 的特性。例如，可将附加氨基酸区，尤其是带电氨基酸加入METH1或METH2 多肽的N-末端，从而提高其在从宿主细胞中纯化或随后的处理和储藏中 的稳定性和持久性。此外，可将肽部分加入METH1或METH2多肽中以方 便纯化。在METH1或METH2多肽最后制成前可将这样的区域去除。添加 肽部分以方便多肽处理是本领域所熟悉和常规的技术。

此外，METH1或METH2多肽，包括片段和特异性表位可与免疫球蛋白 (IgG)的恒定区部分结合产生嵌合多肽。这些融合蛋白方便了纯化且显示 体内半寿期增长。已报道的一个例子描述了由人CD4多肽的头两个结构 域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区多个结构域组成的嵌合蛋 白。(EP A394827；Traunecker等，自然331：84-89(1988)。)与单独的 单体分泌蛋白或蛋白质片段相比，具二硫键连接之二聚体结构(由于IgG) 的融合蛋白在结合和中和其他分子方面更有效。(Fountoulakis等，生化 杂志270：3958-3964(1995).)

类似的，EP-A-O 464 533(加拿大相应文本2045869)公开了含免疫 球蛋白分子恒定区多个部分及另一种人蛋白质或其片段的融合蛋白。在 许多情况下，融合蛋白中的Fc部分有益于治疗和诊断，并因此导致例如 改善的药物动力学特性。(EP-A 0232 262)或者，可能期望在融合蛋白 表达、检测和纯化后删除Fc部分。例如，若融合蛋白用作免疫反应抗原， Fc部分可能会妨碍治疗和诊断。例如，在药物的开发中，已将如hIL-5 之类的人蛋白质与Fc部分融合以达到进行高流通量试验鉴定hIL-5拮抗 物的目的。(参阅，D.Bennett等，分子识别杂志(J.Molecular Recognition)8：52-58(1995)；K.Johanson等，生物化学杂志 270：9459-9471(1995)。)

此外，METH1或METH2多肽可与标记序列融合，诸如方便METH1或METH2 纯化的肽。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE 载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatswirth，CA，91311)中提供的 标记，其它许多标记可购买得到。例如，如Gentz等，美国国家科学院 院报86：821-824(1989)中所述，六组氨酸可便于融合蛋白的纯化。另一 可用于纯化的肽标签，“HA”标签相应于来自流感血凝素蛋白的表位。 (Wilson等，细胞37：767(1984)。)

如此说来，可用METH1或METH2多核苷酸或多肽加工得到任何以上融 合体。

METH1或METH2的生物学活性

METH1或METH2多核苷酸和多肽可用于试验中以检测其一种或多种生 物学活性。如果在特殊试验中METH1或METH2多核苷酸和多肽确实呈现 了活性，那么在与此生物学活性相关的疾病中可能涉及METH1或METH2。 因此，METH1或METH2可用于治疗此相关疾病。

免疫活性

METH1或METH2多肽或多核苷酸可通过激活或抑制免疫细胞的增殖、 分化或转移(趋化性)而用于治疗免疫系统的缺乏或疾病。免疫细胞通 过从多能干细胞产生骨髓(血小板、血红细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细 胞)和淋巴(B和T淋巴细胞)细胞的称为血细胞生成的过程而发育。这 些免疫缺乏或疾病的病因可能是遗传的、体细胞的(如癌症或一些自身 免疫疾病)、获得性的(如通过化疗或毒素)或传染性的。此外，METH1 或METH2多核苷酸或多肽可用作特殊免疫系统疾病或疾病的标记或检测 物。

METH1或METH2多核苷酸或多肽可用于治疗或检测造血细胞的缺乏或 疾病。在治疗与某些(或许多)类型造血细胞的减少相关的疾病时，METH1 或METH2多肽或多核苷酸可用于增加包括多能干细胞在内的造血细胞的 分化和增殖。免疫缺陷综合症的例子包括，但不局限于：血液蛋白质疾 病(如丙球蛋白缺乏血症、异常γ球蛋白血症)、共济疾病毛细血管扩张 血症、常见的可变型免疫缺陷症、Digeorge综合症、HIV感染、HTLV-BLV 感染、白细胞附着缺陷综合症、淋巴球减少症、吞噬细胞杀菌功能紊乱、 严重联合免疫缺损(SCID)、Wiskott-Aldrich疾病、贫血、血小板减少 症或血红蛋白尿症。

此外，METH1或METH2多肽或多核苷酸还可用于调节止血(停止出血) 或溶栓活性(血凝块形成)。例如，通过提高止血或溶栓活性，METH1或 METH2多核苷酸或多肽可用于治疗血液凝结疾病(如纤维蛋白原缺乏血 症、因子缺乏症)、血小板疾病(如血小板减少症)或创伤、手术或其他 原因引起的伤口。或者，能降低止血或溶栓活性的METH1或METH2多核 苷酸或多肽可用于抑制凝血或溶解血块，这在治疗心脏病发作(梗塞)、 中风或瘢疤形成中是重要的。

METH1或METH2多核苷酸或多肽也可用于治疗或检测自身免疫疾病。 许多自身免疫疾病是由于自身免疫细胞不适当地将自身物质识别成外来 物而产生的。此不适当的识别引起免疫应答，导致宿主组织的破坏。因 此，服用能抑制免疫应答，尤其是T-细胞增殖、分化或趋化性的METH1 或METH2多肽或多核苷酸可能是预防自身免疫疾病的有效治疗方法。

用METH1或METH2可治疗或检测的自身免疫疾病例子包括，但不局限 于：艾迪生病、溶血性贫血、抗磷脂综合症、类风湿性关节炎、皮炎、 变应性脑脊髓炎、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合症、Graves病、多发性 硬化症、重症肌无力、神经炎、眼炎、大疤性类天疱疮、天疱疮、多内 分泌腺病、紫癜、赖特病、僵人综合症、自身免疫性甲状腺炎、系统性 红斑狼疮、自身免疫性肺炎、Guillain-Barre综合症、胰岛素依赖性糖 尿病和自身免疫性眼炎。

类似地，诸如哮喘(尤其是过敏性哮喘)之类的过敏性反应和状态或 其他呼吸问题也可用METH1或METH2多肽或多核苷酸治疗。此外，METH1 或METH2可用于治疗过敏性反应、对抗原分子的超敏性或血型不合。

METH1或METH2多核苷酸或多肽也可用于治疗和/或防止器官排斥或 移植物抗宿主病(GVHD)。宿主细胞通过免疫应答破坏移植组织产生 器官排斥。类似地，在GVHD中也涉及免疫应答，但在此情况下是外来移 植的免疫细胞破坏宿主组织。服用能抑制免疫应答，尤其是T-细胞增殖、 分化或趋化性的METH1或METH2多肽或多核苷酸可能是预防器官排斥或 GVHD的有效治疗方法。

类似地，METH1或METH2多肽或多核苷酸也可用于缓解炎症。例如， METH1或METH2多肽或多核苷酸可抑制参与炎症反应的细胞的增殖和分 化。这些分子可用于治疗慢性或急性炎症，包括与感染(如，脓毒性休 克、脓毒病或全身炎性反应综合症(SIRS)、局部缺血一重灌注损伤、内 毒素致死性、关节炎、补体介导的超急性排斥、肾炎、细胞因子或趋化 因子诱发的肺损伤、感染性肠炎、局限性回肠炎或细胞因子过量产生引 起的炎症(如，TNF或IL-1)。

过度增殖疾病

METH1或METH2多肽或多核苷酸可用于治疗或检测包括瘤形成在内的 过度增殖疾病。METH1或METH2多肽或多核苷酸可通过直接或间接的相互 作用抑制疾病的增殖。或者，METH1或METH2多肽或多核苷酸可使其他能 抑制过度增殖疾病的细胞增殖。

例如，可通过提高免疫应答，尤其是提高过度增殖疾病的抗原性或通 过T-细胞增殖、分化或转移来治疗过度增殖疾病。通过增强现有免疫应 答或激发新的免疫应答可增加该免疫应答。或者，减少免疫应答可能也 是治疗过度增殖疾病的方法，如化疗物质。

可用METH1或METH2多核苷酸或多肽治疗或检测的过度增殖疾病例子 包括，但不局限于以下部位的瘤形成：腹部、骨、乳腺、消化系统、肝、 胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲 状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和外周神经、淋巴系统、骨盆、皮肤、 软组织、脾、胸和泌尿生殖系统。

类似地，其他的过度增殖疾病也可用METH1或METH2多核苷酸或多肽 治疗或检测。这些过度增殖疾病例子包括，但不局限于：高丙球蛋白血 症、淋巴组织增生疾病、异常蛋白血症、紫癜、结节病、赛塞综合症、 瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、戈谢病、组织细胞增多病和位于上述器官 系统中除瘤形成外的任何其他过度增殖疾病。

传染病

METH1或METH2多肽或多核苷酸可用于治疗或检测传染因子。例如， 通过提高免疫应答，尤其是提高B和/或T-细胞的增殖和分化，可治疗 传染病。可通过增强现有免疫应答或激发新的免疫应答来增加免疫应答。 或者，METH1或METH2多肽或多核苷酸也可直接抑制传染因子，无需引起 免疫反应。

病毒是能引起可被METH1或METH2多核苷酸或多肽治疗或检测之疾病 或症状的传染因子例子。病毒的例子包括，但不局限于以下DNA和RNA 病毒科：虫媒病毒、腺病毒科、砂粒病毒科、动脉病毒、双RNA病毒、 Bunyaviridae、杯状病毒科、环状病毒科、冠形病毒科、黄病毒科、嗜 肝DNA病毒科(肝炎)、疱疹病毒科(如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、带 状疱疹)、Mononegavirus(如副粘病毒科、麻疹病毒科、弹状病毒科)、 正粘病毒科(如流感病毒)、乳多空病毒科、细小病毒科、微小RNA病毒 科、痘病毒科(如天花病毒或痘苗病毒)、呼肠孤病毒科(如轮状病毒)、 逆转录病毒科(HTLV-I、HTLV-II或慢病毒属)和披膜病毒科(如风疹病 毒)。在这些科内的病毒可引起多种疾病或症状，包括但不局限于：关节 炎、细支气管炎、脑炎、眼部感染(如结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合 症、肝炎(A、B、C、E、慢性活动性、丁型肝炎)、脑膜炎、机会性 感染(如AIDS)、肺炎、伯基特淋巴瘤、水痘、出血热、麻疹、流行性腮 腺炎、副流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传 播疾病、皮肤病(如卡波西病、疣)和病毒血症。METH1或METH2多肽或 多核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。

类似地，能引起可被METH1或METH2多核苷酸或多肽治疗或检测之疾 病或症状的细菌和真菌包括，但不局限于以下革兰氏阴性和革兰氏阳性 细菌及真菌：放线菌目(如棒杆菌、分枝杆菌、Norcardia)、曲霉、芽 孢杆菌科(如炭疽、梭菌)、拟杆菌科、芽酵母、博德特氏菌、疏螺旋体、 普鲁氏杆菌、念珠菌、弯曲杆菌、球孢子菌、隐球菌、Dermatocycoses、 肠杆菌科(克雷伯氏菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、耶尔森氏菌)、丹毒丝菌、 螺杆属菌、军团菌、钩端螺旋体病、利斯特氏菌、枝原体目、奈瑟氏球 菌科(如不动杆菌、淋病、Menigococcal)、巴斯德氏菌科感染(如放 线菌、嗜血菌(Heamophilus)、巴斯德氏菌)、假单胞菌、立克次氏体科、 衣原体科、梅毒和葡萄球菌。这些细菌或真菌家族能引起以下疾病或症 状，包括但不局限于：菌血症、心内膜炎、眼感染(如结膜炎、结核病、 眼色素层炎)、齿龈炎、机会感染(如AIDS相关感染)、甲沟炎、与修复 术相关的感染、赖特氏病、呼吸道感染(如百日咳或脓胸)、脓毒症、莱 姆病、猫抓病、痢疾、副伤寒热、食物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑膜 炎、衣原体、梅毒、白喉、麻风病、类结核、结核病、狼疮、肉毒中毒、 坏疽、破伤风、脓胞病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤病(如蜂 窝织炎、dermatocycoses)、毒血症、尿道感染、伤口感染。METH1或METH2 多肽或多核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。

此外，能引起可被METH1或METH2多核苷酸或多肽治疗或检测之疾病 或症状的寄生物包括，但不局限于以下家族：变形虫、巴贝虫、球虫、 隐孢子虫双核阿米巴(Dientamoebiasis)、姌疫(Dourine)、外寄生虫、 贾第鞭毛虫、蠕虫、利什曼虫、泰勒尔梨浆虫、弓形体、锥虫和毛滴虫 (Trichomonas)。这些寄生虫能引起多种疾病或症状，包括但不局限于： 疥疮、恙螨病、眼感染、肠疾病(如痢疾、贾第鞭毛虫病)、肝病、肺病、 机会感染(如AIDS相关疾病)、症疾、妊娠并发症和弓形体病。METH1 或METH2多肽或多核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。

优选的，利用METH1或METH2多肽或多核苷酸进行的治疗可通过施用 有效量METH1或METH2多肽于病人，或从患者体内取出细胞，给细胞提 供METH1或METH2多核苷酸，并将该改造后的细胞重新引入患者体内(离 体疗法)而进行。此外，METH1或METH2多肽或多核苷酸可用作疫苗中的 抗原以产生抗传染病的免疫应答。

再生

METH1或METH2多核苷酸或多肽可用于分化、增殖和吸引细胞，导致 组织再生。(见，科学276：59-87(1997)。)组织的再生可用于修复、置换 或保护由于先天缺陷、损伤(创伤、烧伤、割伤或溃疡)、年龄、疾病(如 骨质疏松症、骨性关节炎、牙周疾病、肝衰竭)、外科手术，包括整容手 术、纤维变性症、重灌注损伤或系统性细胞因子损伤而受损的组织。

可用本发明再生的组织包括器官(如胰、肝、肠、肾、皮肤、内皮)、 肌肉(平滑肌、骨胳肌或心肌)、血管(包括血管内皮)、神经、造血和 骨胳(骨、软骨、腱和韧带)组织。优选地，再生发生时无或减少瘢疤 形成。再生也可包括血管形成。

此外，METH1或METH2多核苷酸或多肽可促进难于愈合的组织的再生。 例如，促进腱/韧带再生会加快损伤后的恢复时间。也可预防性地使用本 发明的METH1或METH2多核苷酸或多肽以避免损伤。可治疗的特异疾病 包括腱炎、腕管综合症和其他腱或韧带损伤。非愈合性创伤的组织再生 的其他例子包括强制性溃疡(pressure ulcer)、与血管不足相关的溃疡、 外科手术创伤和外伤。

类似地，通过利用METH1或METH2多核苷酸或多肽增殖和分化神经细 胞也可再生神经和脑组织。用此方法可治疗的疾病包括中枢和外周神经 系统疾病、神经病或机械性和创伤性疾病(如脊髓紊乱、头部创伤、脑 血管疾病和中风)。特别是，与外周神经损伤相关的疾病、外周神经病(如 由于化疗或其他医学治疗所产生)、局部神经病和中枢神经系统疾病(如 早老性痴呆、帕金森症、亨亭顿氏舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化和 Shy-Drager综合症)均可用METH1或METH2多核苷酸或多肽治疗。

趋化性

METH1或METH2多核苷酸或多肽可能具趋化活性。趋化分子吸引或迁 移细胞(如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞、T-细胞、肥大细胞、 嗜酸性粒细胞、上皮细胞和/或内皮细胞)至身体的特殊位点，如发炎、 感染或过度增殖位点。然后迁移细胞去除和/或治愈特殊损伤或异常。

METH1或METH2多核苷酸或多肽可增加特殊细胞的趋化性。然后这些 趋化分子可通过增加定向于身体内特殊位置的细胞数而用于治疗炎症、 感染、过度增殖疾病或任何免疫系统疾病。例如，趋化分子可通过吸引 免疫细胞至受伤部位而用于治疗组织的创伤和其他损伤。作为趋化分子， METH1或METH2还能吸引可用于治疗创伤的成纤维细胞。

也考虑到METH1或METH2多核苷酸或多肽可抑制趋化活性。这些分子 也可用于治疗疾病。因此，METH1或METH2多核苷酸或多肽可用作趋化性 的抑制剂。

结合活性

METH1或METH2多肽可用于筛选可结合METH1或METH2的分子或者 METH1或METH2结合的分子。METH1或METH2与分子的结合可激活(激动 剂)、提高、抑制(拮抗物)或降低METH1或METH2或者所结合分子的活 性。所说分子的例子包括抗体、寡核苷酸、蛋白质(如受体)或小分子。

优选地，该分子与METH1或METH2的天然配基紧密相关，如配基片段、 天然底物、配基、结构或功能模拟物。(见，Coligan等，免疫学通用方 法(Current protocols in Immunology)1(2)：第5章(1991)。)类似的， 该分子可能与METH1或METH2所结合的天然受体或至少能被METH1或 METH2结合的受体片段(如活性位点)紧密相关。任何一种情况中分子均 可用已知技术合理设计。

优选地，这些分子的筛选包括产生表达METH1或METH2(作为分泌蛋 白或在细胞膜上)的适当细胞。优选的细胞包括哺乳动物、酵母、果蝇 或大肠杆菌的细胞。然后将表达METH1或METH2的细胞(或含表达多肽 的细胞膜)与可能含此分子的检测化合物接触，以观察METH1或METH2 或此分子的结合、活性的刺激或抑制。

试验可只检测候选化合物与METH1或METH2的结合，其中结合用标记 或包括与标记竞争物竞争的试验来检测。另外，试验可检测候选化合物 是否通过与METH1或METH2结合产生信号。

或者，可用无细胞制品、粘附于固相支持物的多肽/分子、化学药品 或天然产物混合物进行试验。试验也可简单地包括以下步骤：混合候选 化合物与含METH1或METH2的溶液，检测METH1或METH2/分子的活性或 结合，并与标准品比较METH1或METH2/分子的活性或结合。

优选地，ELISA试验可用单克隆抗体或多克隆抗体检测样品(如生物 样品)中METH1或METH2水平或活性。抗体可通过直接或间接地与METH1 或METH2结合或与METH1或METH2竞争底物而检测METH1或METH2的水 平或活性。

所有以上试验均可用作诊断或预后标记。用这些试验发现的分子可用 于通过活化或抑制METH1或METH2分子而治疗疾病或在患者中产生特殊 的效果(如血管生长)。此外，这些试验能发现可抑制或增强适当处理细 胞或组织中METH1或METH2产生的物质。

因此，本发明包括鉴定与METH1或METH2可结合的化合物的方法，该 方法包括以下步骤：(a)温育候选结合化合物与METH1或METH2；和(b) 测定结合是否发生。另外，本发明包括鉴定激动剂/拮抗物的方法，该方 法含以下步骤：(a)温育候选化合物与METH1或METH2；(b)检测生物学 活性，和(c)测定METH1或METH2的生物学活性是否已改变。

其它活性

除了以上所述的造血细胞系外，METH1或METH2多肽或多核苷酸还可 增加或减少胚胎干细胞的分化或增殖。

METH1或METH2多肽或多核苷酸还可用于调节哺乳动物的特性，如身 高、体重、发色、眼的颜色、皮肤、脂肪组织的百分比、色素沉着、大 小和形状(如整容手术)。类似地，METH1或METH2多肽或多核苷酸可用 于调节哺乳动物的代谢，影响分解代谢、合成代谢、加工、利用和能量 的储存。

METH1或METH2多肽或多核苷酸可用于通过影响生物节律、抑郁(包 括抑郁性疾病)、暴力倾向、耐痛力、生殖能力(优选通过活化素或类抑 制素活性)、激素或内分泌水平、食欲、性欲、记忆力、应激力或其他认 知性而改变哺乳动物的精神状态或身体状况。

METH1或METH2多肽或多核苷酸还可用做食品添加剂或防腐剂，如用 于增加或减少储存能力、脂肪含量、脂类、蛋白质、碳水化合物、维生 素、矿物质、辅助因子或其他营养成分。

以上已对本发明进行了综述，参照举例说明的以下实施例将更易理解 本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

癌症诊断和预后

现认为，与相应的标准哺乳动物(即未患癌症的同种哺乳动物)相比， 患癌哺乳动物体内的某些组织表达明显减少水平的METH1或METH2蛋白 质和编码METH1或METH2蛋白质的mRNA。进一步认为与来自未患癌症的 同种哺乳动物的血清相比，在来自患癌哺乳动物的某些体液(如血清、 血浆、尿和脊髓液)中可检测到减少水平的METH1或METH2蛋白质。因 此，本发明提供了一种肿瘤诊断中有用的诊断方法，包括检测哺乳动物 细胞或体液中编码METH1蛋白质的基因的表达水平，并比较此基因表达 水平与标准的METH1基因表达水平，基因表达水平降低到标准之下是某 些肿瘤的指示。本发明还提供了一种肿瘤诊断中有用的诊断方法，包括 检测哺乳动物细胞或体液中编码METH2蛋白质的基因的表达水平，并比 较此基因表达水平与标准的METH2基因表达水平，基因表达水平降低到 标准之下是某些肿瘤的指示。

在已可按常规方法进行的肿瘤诊断中，本发明可用做预后指示剂，呈 现减少METH1或METH2基因表达的病人，其临床结果比以较低水平表达 此基因的病人更坏。

“检测编码METH1或METH2蛋白质的基因表达水平”指直接(如测定 或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平)或相对(如与第二种生物样品中的 METH1或METH2蛋白质的水平或mRNA水平相比较)地定性或定量检测或 估计在第一种生物样品中METH1或METH2蛋白质的水平或编码METH1或 METH2蛋白质的mRNA水平。

优选地，对第一种生物样品中的METH1或METH2蛋白质水平或mRNA 水平进行检测或估计并与标准METH1或METH2蛋白质水平或mRNA水平相 比较，作为标准的第二种生物样品获自未患癌症的个体。正如本领域中 应理解的，一旦标准的METH1或METH2蛋白质水平或mRNA水平已知，它 可重复使用作为比较的标准。

“生物样品”指获自含METH1或METH2蛋白质或mRNA之个体、细胞 系、组织培养物或其他来源的任何生物样品。生物样品包括含分泌型成 熟METH1或METH2蛋白质的哺乳动物体液(如血清、血浆、尿、滑液和 脊髓液)，以及肾上腺、甲状腺、胃、脑、心、胎盘、肺、肝、肌肉、肾、 胰、睾丸和卵巢组织(对于METH1)；及前列腺、小肠、结肠、脑和肺组 织(对于METH2)。

本发明可用于检测哺乳动物的癌症。本发明特别可用于哺乳动物以下 类型癌症的诊断中：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、 结肠癌和睾丸癌。优选的哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、牛、猪、马、 兔和人。尤其优选人。

用Chomczynski和Sacchi，生化分析(Anal.Biochem.)162： 156-159(1987)中所述的一步硫氰酸胍-酚-氯仿法可从生物样品中分离 细胞的总RNA。然后用任何恰当的方法检测编码METH1或METH2蛋白质的 mRNA水平。这些方法包括RNA印迹分析(Harada等，细胞 63：303-312(1990))、S1核酸酶作图(Fujita等，细胞 49：357-367(1987))、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录与聚合酶链式反应 联合(RT-PCR)(Makino等，技术(Technique)2：295-301(1990))和逆转 录与连接酶链式反应联合(RT-LCR)。

可用以抗体为基础的技术检验生物样品中的METH1或METH2蛋白质水 平。例如，可用传统的免疫组织学方法(Jalkanen，M.等，细胞生物学杂 志(J.Cell Biol.)101：976-985(1985)；Jalkanen等，细胞生物学杂志 105：3087-3096(1987))研究组织中METH1或METH2蛋白质的表达。

其他以抗体为基础、可用于检测METH1或METH2蛋白质基因表达的方 法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放免测定(RIA)。

合适的标记是本领域已知的，包括酶标记(如葡萄糖氧化酶)、放射 性同位素(如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In) 和锝(^99mTc))和荧光标记(如荧光素和若丹明)和生物素。

给药方式

现已认识到血管供应的增加在肿瘤发展和转移中起中心作用；因此， 可证实将血管生成抑制剂用做癌症病人的辅助治疗是有效的。一些目前 已知的血管生成抑制剂由于严重的副作用而不适合用于全身性治疗。本 发明的发明者已发现，METH1和METH2在体内和体外均为血管生成的强抑 制剂。与其他血管生成抑制剂相比，METH1和METH2的优点在于它们通常 与生理性血管生成的抑制相关；因此，它们无毒性和内皮特异性。此外， METH1和METH2具有限制性表达模式，可能在器官特异性方面有优势。

因此，本发明多肽可用于治疗癌症。本发明的METH1和METH2多肽还 可用于治疗患与血管生成相关之其他疾病的个体，包括异常伤口愈合、 炎症、类风湿性关节炎、牛皮藓、子宫内膜出血紊乱、糖尿病性视网膜 病、一些形式的黄斑变性、血管瘤和动脉-静脉畸形。

因而，本发明提供了抑制个体内血管生成的方法，包括将含有效剂量 的本发明分离METH1多肽的药物组合物施用于该个体，有效地提高其体 内的METH1活性水平。本发明还提供了抑制个体内血管生成的方法，包 括将含有效剂量的本发明分离METH2多肽的药物组合物施用于该个体， 有效地提高其体内的METH2活性水平。

可以此方式用于抑制血管生成的METH1多肽包括：由含前导序列之保 藏cDNA编码的METH1多肽；由不含前导序列之保藏cDNA编码的成熟 METH1多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ ID NO：2中约第1-950位氨基酸 的多肽；含SEQ ID NO：2中约第2-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2 中约第29-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基 酸的多肽；含METH1金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：2中第235-459位氨 基酸的多肽；含METH1去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：2中第460-544 位氨基酸的多肽；含METH1第一类TSP结构域，SEQ ID NO：2中第545-598 位氨基酸的多肽；含METH1第二类TSP结构域，SEQ ID NO：2中第841-894 位氨基酸的多肽；含METH1第三类TSP结构域，SEQ ID NO：2中第895-934 位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第549-563位氨基酸的多肽。

可以此方式用于抑制血管生成的METH2多肽包括：由含前导序列之保 藏cDNA编码的METH2多肽；由不合前导序列之保藏cDNA编码的成熟 METH2多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ ID NO：4中约第1-890位氨基酸 的多肽；含SEQ ID NO：4中约第2-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4 中约第24-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基 酸的多肽；含METH2金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：4中第214-439位氨 基酸的多肽；含METH2去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：4中第440-529 位氨基酸的多肽；含METH2第一类TSP结构域，SEQ ID NO：4中第530-583 位氨基酸的多肽；含METH2第二类TSP结构域，SEQ ID NO：4中第837-890 位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第529-548位氨基酸的多肽。

尽管如上所提及，治疗剂量应根据治疗情况而定，但通常建议的非胃 肠施用METH1或METH2多肽的每剂总药学有效量是约1ug/kg病人体重/ 天-10mg/kg病人体重/天。更优选剂量为至少0.01mg/kg/天，对于人来 说最优选约为0.01-1mg/kg/天。如果持续给药，一般METH1或METH2多 肽给药速率是约1ug/kg/小时-50ug/kg/小时，由注射1-4次/天或持续皮 下输注，如用微型泵进行。也可使用静脉袋溶液。

含本发明METH1或METH2的药物组合物可口服、直肠给药、非肠道给 药、脑池内给药、阴道内给药、腹膜内给药、局部给药(如用粉剂、药 膏、滴剂或经皮片剂)、经颊给药或作为口或鼻喷雾剂给药。“药学可接 受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任 何类型的辅助配方。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静 脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。

染色体试验

本发明的核酸分子还可用于染色体鉴别。该序列特异地定向到单个人 染色体上的特殊位置并与其杂交。按本发明绘图DNA至染色体上是将那 些序列与疾病相关基因联系起来的重要的第一步。

在此方面的某些优选实施方案中，此处公开的cDNA用于克隆METH1 或METH2蛋白质基因的基因组DNA。这可通过各种众所周知的技术和一般 可购得的文库来完成。然后用此方面众所周知的技术将基因组DNA进行 原位染色体作图。

另外，在某些例子中可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而 将序列作图于染色体上。利用基因3’非翻译区的计算器分析以迅速选择 跨度不超过基因组DNA中一个以上外显子的引物，因而使扩增过程复杂 化。然后将这些引物用于含单个人染色体之体细胞杂合体的PCR筛选。

cDNA克隆与中期染色体的荧光原位杂交(“FISH”)可一步提供其准 确的染色体定位。此技术可利用来自cDNA的短至50或60bp的探针。此 技术综述于Verma等，人染色体：基础技术手册(Human Chromosomes：A Manual Of Basic Techniques)，Pergamon Press，纽约。

一旦序列已做图于准确的染色体位置，就可将该序列在染色体上的物 理位置与遗传图谱数据相联系。例如，在V.McKusick，人类孟德尔遗传 (Mendelian Ingeritance In Man)(可在线获自Johns Hopkins University，Welch Medical Library)中即有所说的数据。然后已作图 于同一染色体区域之基因和疾病的联系通过连锁分析鉴定(物理图谱上 相邻基因的共遗传)。

下一步，必须测定在受影响和未受影响个体之间cDNA或基因组序列 的差异。若在某些或所有受影响个体中可观察到突变但在任何正常个体 中都观察不到，那么此突变很可能是该疾病的一个病因。

除了已总述的之外，参照举例说明的以下实施例将更易理解本发明， 但本发明并不局限于这些实施例。

                         实施例

实施例1：METH1和METH2的鉴定和克隆

为了寻找具类TSP结构域的新基因，在约90000个表达序列标签(EST) 组成的人cDNA大数据库中筛选与第二种TSP1I类重复区同源的序列。预 计数种EST编码具类TSP结构域的蛋白质。两个来自人心脏和肺文库的 cDNA克隆被进一步测序并选作功能分析。

按制造商说明书用cDNA末端的5’快速扩增(RACE)PCR技术获得METH1 的氨基末端(Marathon cDNA扩增试剂盒，Clontech)。通过5’RACE PCR 获得METH2的部分氨基端末端并随后证实和用基因组筛选完成。为进行 基因组筛选，最初用PCR鉴定BAC克隆(Genome Systems)。然后将含 150-200bp的阳性BAC克隆作为小片段亚克隆入pGEM载体并测序。

将推断的氨基酸序列与GenBank、EMBL和Swissprot数据库一起分析 和比较，显示这些基因属于一新的金属蛋白酶家族，在其NH₂-末端与 reprolysin家族具同源性，而COOH-末端有数个类TSP基元。这些cDNA 称为METH1和METH2；ME指金属蛋白酶，而TH指血小板反应蛋白。METH1 的小鼠同系物被鉴定和称为ADAMTS1(Kuno，K等，生物化学杂志 272：556-562(1997))。人和小鼠序列的直接比较显示有高水平的保守 (83.4％的氨基酸相同)。迄今为止未鉴定到METH2的同系物。

有趣的是，一最近鉴定称为pNPI的蛋白质(前胶原IN-蛋白酶； (Colidge，A.等，美国国家科学院院报94：2374-2379(1997))显示出与 METH1和METH2有显著的序列和结构类似性(图3)。作为在此描述的新 蛋白质，pNPI在羧基末端还包括金属蛋白酶(reprolysin亚家族)和TSP 结构域。尽管pNPI的序列是牛源的，序列对比还是显示了相同的结构特 性。METH1和METH2之间的氨基酸相似性为51.7％，而METH1或METH2和 pNPI之间的同源性分别少于33.9％和36.3％。

序列分析显示METH1和METH2的ORF分别编码950和890个氨基酸的 蛋白质。在所有的三种蛋白质中，NH₂末端均包括一推定的信号肽，其后 是位于氨基酸300左右的另一推断的跨膜结构域，这是由亲水性图推断 的。还不清楚这些蛋白质是否与膜结合。可是，根据初步的数据，更可 能是此第二跨膜结构域将组成疏水性口袋，而METH1、METH2和pNPI事 实上是分泌蛋白质。跨信号肽的NH2末端与锌蛋白酶超家族具同源性， 可再细分为前结构域、金属蛋白酶结构域和富半胱氨酸区域。

图3中位于前结构域和金属蛋白酶结构域间边界线处的METH1和 METH2内双下划线序列是诸如成对碱性氨基酸蛋白酶之类哺乳动物枯草 杆菌蛋白酶的可能切割位点(Barr，1991)。蛋白水解加工过程发生于SVMP 内，产生可溶性金属蛋白酶和去整联蛋白(Bjarnason，J.B.和Fox，J.W.， 酶学方法248：345-368(1995))，这还在一些ADAM内检测到(综述于 Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))。在这 点上，最初的实验显示蛋白水解加工至少发生于METH1内。此外，METH1 和METH2均存在由于某些功能重要氨基酸的保守而被认为具催化活性的Zn²⁺结合位点(图3中的点线)(Rawlings，N.D.和Barrett，A.J.，酶学方 法248：183-228(1995))，表明这些蛋白质可能是活性蛋白酶。金属蛋白 酶结构域之后是一含两个公认去整联蛋白环的富半胱氨酸区域 (Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))(图3 中用箭头标出)。在金属蛋白酶超家族中的蛇毒金属蛋白酶(SVMP)和ADAM (含一去整联蛋白和一金属蛋白酶结构域的哺乳动物蛋白质)内找到了 去整联蛋白结构域，它们可能具有抑制整联蛋白与SVMP内其配基结合的 功能。相反，作为膜锚定蛋白一部分的类ADAM去整联蛋白结构域可促进 而非破坏细胞与细胞间的相互作用(Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育 生物学180：389-401(1996))。类TSP结构域位于METH1和METH2蛋白质 的COOH半侧。METH1包括由未知功能的间隔区分隔的两个保守TSP结构 域、具较小同源性的亚结构域及只5个半胱氨酸，位于第二个抗血管生 成区域之后。METH2包括由间隔区分隔的两个TSP结构域。METH1和METH2 的类TSP结构域与TSP1和TSP2的序列对比如图5所示。在所有TSP重 复区中，同源性变化在19.2％-52％氨基酸相似性范围内。1-6号半胱氨酸 和星号标记的色氨酸高度保守。

人基因组DNA的DNA印迹表明基因组中存在METH1和METH2。METH1 和METH2探针显示不同大小的条带，表明它们转录自不同基因。

I类重复片段的共有序列包括有6个完全保守半胱氨酸的16个残基。 通常它开始于序列基元WSXWS(SEQ ID NO：82))，已表明它可与肝素结合 (Guo，N.等，生物化学杂志267：19349-19355(1992))。此区域与肝素的 亲和性推测是TSP-1抗血管生成活性的一部分(Guo，N.等，肽研究杂志 (J.Peptide Res.)49(1997))。在TSP家族蛋白质的5个成员中，只有 TSP-1和TSP-2可抑制血管生成并含I类重复片段(Tolsma，S.S.等，细 胞生物学杂志122：497-511(1993)；Kyriakides，T.R.等，细胞生物学杂 志140：419-430(1998))。这很可能是在500-900年前通过外显子改组而 将I类或备解素重复片段加入到了TSP-1和2的前体中(Adams，J.等， 血小板反应蛋白基因家族(The Thrombospondin Gene Family)，第一 版，Molecular Biology Intelligence Unit(Springer，Ed.)，R.G.Landes Company，德国(1995))。很可能此结构域的获得使TSP-1和TSP-2前体具 有如调节新血管形成之类的功能。最近，BAI-1(脑血管生成抑制剂-1)， 由于其被p53调控的能力而分离自脑文库的一种蛋白质，也已显示含 TSP-1的I类重复，为此分子提供了抗血管生成的潜能(Nishimori，H. 等，致癌基因(Oncogene)15：2145-2150(1997))。不过，似乎附加序列或 前后序列也是重要的，因为其他含I类重复片段的蛋白质未显示有清楚 或更确定的抗血管生成特性，如：备解素、F-spondin和补体家族的其他 成员。

由于METH1和METH2中TSP重复片段的存在及其抗血管生成特性，这 些蛋白质最初被认为是TSP超家族成员。不过，它们与其他TSP无另外 的同源性，事实上，它们与TSP-1和TSP-2的相似性局限于I类重复区。 而且，该蛋白质还与ADAM家族成员具很高的序列和结构同源性。这些特 性使Kuno和同事将ADAMTS称为MWTH1的小鼠同系物(Kuno，K.等，生物 化学杂志272：556-562(1997))。pNPI的最新鉴定及其与此处所述蛋白质 的显著序列同源性提示所有这3种蛋白质属于一称为metallospondins 的亚家族。在这点上，尚不清楚pNPI是否具抗血管生成特性或者METH1 和/或METH2是否参与α1(I)前胶原氨基末端前肽的切割。

实施例2：DNA和RNA印迹分析

如前所述(Chomczynski，P.和Sacchi，N.，生化分析 162：156-159(1987))，用异硫氰酸胍抽提法从细胞中纯化总RNA。用 Boehringer Mannheim(BMB，Indianapolis，IN)试剂盒按制造商说明书提 取Poly(A)+RNA。其他Poly(A)+RNA印迹购自Clontech(Palo Alto，CA)。 在含以下成分的溶液中进行预杂交：50％甲酰胺、6X SSPE、1X Denhardt’s 溶液、0.1％SDS和100ug/ml热变性鲑精DNA，42℃12-18小时。利用标记 cDNA探针的杂交反应在相同溶液中于42℃进行12-18小时。TSP1和 METH1探针相应于全长人cDNA。METH2探针相应于人cDNA的KpnI-EcoRI 片段。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的1.3Kb长PstI片段用于对上样 和转移效率进行标准化。膜曝光于Kodak BiomaxMS胶片(Kodak，New Haven，CT)上。

购自Promega(Madison，WI)、用于DNA杂交的人基因组DNA在65℃加 热10分钟并用EcoRI和PstI 37℃消化过夜。5ug消化DNA分离于1％琼 脂糖凝胶上，转移至nytran膜上并用紫外线交联。cDNA探针以及预杂 交和杂交条件与上述RNA印迹的相同。用高严谨性洗涤印迹膜(0.2XSSC、 0.2％SDS，50℃)。

在成人和胚胎组织中检查METH1和METH2的表达模式。对包括人组织  Poly(A)+RNA的RNA印迹分析在高严谨条件下进行。METH1和METH2的转 录物分别显示4.6和3.7Kb的单条带。在肾上腺、心脏、胎盘观察到丰 富的METH1 mRNA表达，骨胳肌、甲状腺和胃中表达水平稍低一些。在胚 胎组织分析中，肾显出METH1 mRNA表达量最高。不过，在所有被分析组 织中均有较弱的METH1 mRNA表达。METH2 mRNA的分布更窄，并较METH1 的弱。胚胎和成人均在肺中可见最高表达。有趣的是，METH1和METH2 的表达不重叠。结合起来说，结构相似性和它们的表达模式显示它们在 功能上有重复，但转录调节不同。为进行比较，还分析了同一印迹中TSP1 转录物的表达水平。在被分析的成人胎盘和所有胚胎组织中可见TSP1 mRNA的最高表达。与METH1和METH2相对照，我们在所有被检测的其他 组织中观察到恒定水平的TSP1转录物。

通过Poly(A)+RNA的RNA印迹分析还研究了细胞类型分布情况。在皮 肤成纤维细胞、血管平滑肌、子宫内膜基质细胞和两个癌细胞系Hela和 G631、腺癌和黑素瘤中可分别检测到低水平的METH1 mRNA。METH2 mRNA 只在SW480，一种结肠癌细胞系中检测到，在被分析的任何其他细胞系和 原株中均未见表达。

血管生成和抗血管生成因子组可能涉及调节特异器官中血管网形成， 很可能是真实的，但未经证实。至少总体水平上，明显不同且几乎不重 叠的METH1和METH2表达模式是令人迷惑的。TSP1和TSP2还共有相同的 结构、高水平的氨基酸相似性，而它们的表达模式却显著不同 (Iruela-Arispe，M.L.，Dev.Dyn.197：40-56(1993))。如前所提及，差异 很可能是基于它们启动子中的不同顺式作用元件和不同的调节机制。尽 管METH1和2的启动子尚未被鉴定，但很可能它们对每个基因的调节都 有独特的特征。不过，具已被证实的抗血管生成特性的一个基元抗血管 生成/I类重复区可能存在于具不同组织特异性的数种蛋白质中这一推测 颇引人注意。或者，同一家族之紧密相关成员间序列中的小差异可能具 有功能重复之外的重要性。以TSP1和TSP2为例，除了显著的功能相似 性和可能具有共同的抗血管生成特性外，TSP1和TSP2还具有自身独特 的、不太可能与其类似相关物共有的功能。这些基因的敲除结果明显证 实了这一点。TSP1无效动物首先出现肺疾病(Lawler，J.等，临床研究杂 志(J.Clin.Invest.)101：982-992(1998))，其次是血管畸形，但只在特 异病理状态下或有限器官中如此。相反，TSP2敲除小鼠呈现未预期的胶 原装配异常，伴随着对皮肤、腱和骨的不良影响(Kyriakides，T.R.等， 细胞生物学杂志140：419-430(1998))。此外，这些动物还呈现皮肤中毛 细管密度全面增加。不太能理解的是新描述的metallospondin家族成员 的类同处怎样在功能上体现出来。明显地，pNIP显示有切割I类前胶原 蛋白的活性，因而具有蛋白水解活性(Colidge，A.等，美国国家科学院 院报94：2374-2379(1997))。

第二个目的功能区与去整联蛋白结构域相应。此结构域已在显示可与 αIIbβ3结合并抑制其与血小板相互作用而阻止凝血的蛇毒金属蛋白酶 相关成员中有更完整的描述(Pfaff，M.等，Cell Adhes Commun.2：491-501(1994)；Usami，Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun. 201：331-339(1994))。去整联蛋白基元由13-15个结构域组成，其中经 常包括一RGD或在天冬氨酸处有带负电残基。RGD或其等价物与整联蛋白 结合并充当拮抗物或信号配基(Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物 学180：389-401(1996))。METH2，而非METH1，具有位于去整联蛋白氨基 端侧的RGD序列。另外，两种分子均在去整联蛋白基元内有相对高度但 非完全的半胱氨酸保守。这似乎在此区域的四级结构及其与整联蛋白的 相互作用能力上有重要作用。此外，其中一些结构域已显示出可作为功 能性粘附分子，尤其是那些具跨膜区域的分子(Wolsberg，T.G.和 White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))。这对于METH1和METH2 是不可能的，因为这两种蛋白质似乎是分泌型的。

实施例3：重组蛋白质的表达和纯化

用于截短融合蛋白表达的重组构建体如下：(1)pRSET-METH1-I类： 用以下引物通过聚合酶链式反应扩增METH1的第1605-1839位核苷酸(距 离起始密码子)：5’-GCATTTTGGATCCGCCTTTTCATG-3’(SEQ ID NO：78)和 5’-GTTGTGTGCTGCAGATTGTTCC-3’(SEQ ID NO：79)。将扩增片段亚克隆入 pRSET载体的BamHI和PstI位点；(2)pGEX-METH1-TSP，通过平头连接 将来自pRSET-METH1-TSP的BamHI-EcoRI片段连入pGEX-5X载体 (Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)的SmaI位点而产 生；(3)pGEX-1.0-METH2：将METH2 cDNA的第838-1818位核苷酸片段(从 起始密码子开始)连入pGEM-2TK的BamHI-EcoRI位点。用以下引物通过 PCR扩增METH2片段：5’-GAAAAATGGGGATCCGAGGTG-3’(SEQ ID NO：80)和 5’-GCAGGAGAATTCCGTCCATG-3’(SEQ ID NO：81)产生BamHI和EcoRI限制位 点；(4)pGEX-METH2-TSP：将分离自pGEX-1.0-METH2的0.5Kb XmaI-EcoRI 片段亚克隆入pGEM-2TK载体的XmaI和EcoRI位点。所有构建体均测序 证实其序列无误并有正确的开放阅读框架。

重组蛋白质命名为6H-METH1(质粒pRSET-METH1-TSP表达)、GST-METH1 (质粒pGEX-METH1-TSP表达)和GST-METH2(质粒pRSET-METH2-TSP表 达)。

将表达质粒转化入大肠杆菌菌株BL21：DE3(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)并按制造商推荐方法诱导融合蛋白。简单地说， 就是将被诱导菌体重悬于PBS中并在冰里超声处理1分钟。然后将悬浮 液在1％triton X-100中室温保温20分钟，4℃离心。再用Ni-NTA珠 (Qiagen，Chatsworth，CA)通过4℃保温20ml上清和1ml珠子(50％的浆液) 2小时而纯化组氨酸标记的融合蛋白。将悬浮液转入柱子并用10个柱床 体积含10mM咪唑的PBS洗涤，随后用含50mM咪唑的PBS洗涤，最后用 含100mM咪唑的PBS洗涤。用含500mM咪唑的PBS洗脱蛋白质。含重组 蛋白质的部分用无酚红DMEM透析。样品4℃离心30分钟，部分蛋白质不 溶而在离心中丢失。上清保存于-70℃并用作增殖试验、角膜囊试验和 尿囊绒膜(CAM)试验。

为了纯化GST融合蛋白质，离心清理提取物并上GST亲和柱 (Pharmacia)。先用含0.1mM还原型谷胱甘肽的PBS-1％triton X-100洗 涤柱子，然后用含0.5mM还原型谷胱甘肽的同一缓冲液洗涤。用含10mM 还原型谷胱甘肽的50mM Tris-HCl，pH7.5洗脱融合蛋白质。含此蛋白质 的部分用DMEM透析，-70℃保存并用作增殖、角膜囊和尿囊绒膜(CAM) 试验。

在12.5％或15％的聚丙烯酰胺凝胶上用考马斯兰染色分析重组蛋白质 的完整性和纯度。

含TSP头两个I类重复区的重组GST融合蛋白质在功能试验前也用 DMEM透析。如前所述从血小板中纯化完整TSP1(Roberts，D.D.等，组织 培养方法杂志(J.Tissue Cult.Methods)16：217-222(1994))。

在细菌中产生重组融合蛋白质，以检验METH1和METH2 TSP结构域可 充当血管生成调节剂的假说。构建体包括METH1或METH2的第一个TSP 结构域。此结构域是最保守的，与TSP1的第二个I类重复区具52％的氨 基酸相似性，(此结构域含推测的CD36结合位点)。所有重组蛋白质均在 非变性条件下分离以尽可能地保留其二级结构。6H-METH1和GST-METH1 含METH1第一个类TSP结构域，以及分别与之融合的组氨酸标记或GST。 由于纯化和结构优势，将METH1重组蛋白质制成带两个不同标记。由于 标记大小的不同造成其大小的差异，组氨酸是6KDa，GST是27KDa。 GST-METH2含METH2第一个TSP结构域，以及与之融合的GST。相应于TSP1 最后两个I类重复区并与GST融合的片段，以及纯化自血小板之完整TSP1 为阳性对照。另外，在所有实验中均用GST本身为阴性对照。

实施例4：METH1和METH2中的TSP结构域破坏体内血管生成

角膜囊试验

瑞士Webster雌性和雄性小鼠购自Charles River(Boston，MA)并在 8-10周大时用于团块的移植。如Kenyon和同事所述方法，基本不做改动 进行角膜囊试验(Kenyon，B.M.等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37： 1625-1632(1996))。简单地说，即将10ug重组bFGF加5mg sucralfate 的溶液与10ul海昌(200mg/ml于乙醇中；New Brunswick，NJ)和目的重组 蛋白质(2ug)混合。然后将悬浮液点到无菌尼龙网(孔径大小500um；Tetko Inc.，Briarcliff Manor，NY)上并干燥30分钟。拉出网的纤维形成500um³的团块，-20℃保存。在显微镜下选择同样大小的团块用于实验。

用三溴乙醇麻醉小鼠。在Nikon SMZ-U解剖显微镜下用手术刀切开角 膜。将单个团块植入囊中。团块植入5天后评估角膜的血管生成并拍照。

CAM试验

对胚胎发育12-14天的Leghorn鸡胚(SPAFAS，MA)进行尿囊绒膜试 验。混合Matrigel(750ug/ml)、VEGF(250ng/网)和待测蛋白质或肽，放 于尼龙网(孔径大小250um；Tetko Inc.)上并相继保温于37℃30分钟及 4℃2小时以诱导聚合。对各CAM还准备有阳性(matrigel和VEGF)和阴性 (只有VEGF)对照。将聚合的网置于CAM的第三个外区域上并保温24小时。 将400ul异硫氰酸荧光素葡聚糖(10mg/ml，SIGMA)注入小鸡血流中以使血 管显现。保温5-10分钟后，用3.7％的甲醛局部固定小鸡5分钟。然后将 网切片并固定在载片上。用计算机辅助图象软件(NIH Imagel.59)分析 荧光密度。

用于此实验的肽由Chiron(Raleigh，NC)合成。序列相应于氨基酸： P-TSP1，430-447；P-METH1，549-563；P-METH2，529-548。

血管生成或抗血管生成反应的评估很大程度上依赖于测定反应的试 验的灵敏度和特异性。为了评估这些片段在体内的抗血管生成活性，使 用两个流行且普遍接受的血管生成试验：角膜囊试验和尿囊绒膜试验。 角膜的可见性、易接近性和无血管性非常有利并便于观察新血管生成反 应及检验物质的局部应用。将已知量的血管生成因子以团块的形式植入 眼角膜内制成的囊中。为了检测血管生成抑制剂，将分子与同一团块中 的刺激物一起移植，与只有刺激物的反应比较。

在这些实验中，将bFGF用作血管形成刺激物。含重组蛋白质的团块 移植入小鼠角膜并将其抑制bFGF诱导的血管生成反应的能力与对照相 比。当含GST的bFGF团块被植入后，新的毛细管在5天内自角膜缘产生、 穿过角膜并进入团块。相反，添加GST-METH1或GST-METH2至bFGF团块 则完全阻止了血管生长。表4为所进行的41个试验的结果概述。纯化自 血小板的完整TSP1和GST-TSP1用做阳性对照。所有实验以同一浓度进 行，显示METH1和METH2在抑制血管生成中具有与TSP1相似的潜能。另 外，当使用浓度为标准浓度一半时，观察到弱的，但可见的反应，表明 为剂量依赖效应。

                    表4

 在角膜囊试验中METH1和METH2重组蛋白质的活性

bFGF团块	形成血管的角膜/总角膜
		载体	5/5
TSP1	0/5
		GST	11/11
GST-TSP1-T1	1/4
		GST-METH1-TSP	0/8
GST-METH2-TSP	0/8

在CAM试验中，通过检测含血管生成性生长因子之基质聚合体中生成 的血管数量分析血管生成反应。为了测定在CAM试验中重组METH1和 METH2蛋白质是否抑制VEGF诱导的新血管形成，将含VEGF和重组蛋白质 的matrigel聚合体移植入CAM。实验的定量分析，每次处理包括三种不 同聚合体的结果如图6A所示。含VEGF和5ug GST-METH1或GST-METH2 的matrigel聚合体引起血管生成超过80％的抑制。用来自TSP1I类重复 区的GST重组蛋白质也发现了相似的潜能。而且，METH1和METH2中TSP 结构域的抗血管生成作用是剂量依赖型的，当使用15ug/ml的蛋白质时， 血管生成完全被抑制(图6C和D)。单独的GST在相同浓度时对VEGF刺 激的血管生成无明显作用。

来自人TSP1第二或第三个I类重复区的合成肽可模拟完整TSP1的抗 血管生成作用(Tolsma，S.S.等，细胞生物学杂志122：497-511(1993))。 事实上，已显示19个残基长的多肽足以阻断大鼠角膜中的体内新血管形 成和抑制bFGF诱导的人工培养内皮细胞转移(Vogel，T.等，细胞生化杂 志(J.Cell.Biochem.)53：74-84(1993)；Tolsma，S.S.等，细胞生物学杂 志122：497-511(1993))。为了检验METH1和METH2 TSP结构域是否有 相同特性，合成来自同一区域的肽并用CAM试验评估其抗血管生成活性。 结果显示于图6B。来自METH1和METH2 TSP结构域的肽都与TSP1相似地 阻断VEGF诱导的血管生成。相反，混杂肽无明显作用。 实施例5：增殖实验

分离人内皮细胞(HDEC)并培养于Vitrogen^TM包被平皿上补充有15％ 胎牛血清、25ug/mlcAMP和1ug/ml皮质醇-21-乙酸的EBM(Clonetics，San Diego，CA)中，使用第3-6代细胞。通过在含0.2％BSA的无酚红EBM中将 汇合的单层细胞保温48小时使细胞静止。从新生包皮中酶解分离人皮肤 成纤维细胞。成纤维细胞和平滑肌细胞都维持于补充有10％胎牛血清的 DMEM中。人乳腺上皮细胞(HMEC)购自Clonetics并保持于推荐培养基 (乳腺上皮生长培养基，MEGM)中。

将第3-6代静止人内皮细胞在存在或缺乏重组蛋白质的情况下铺于含 补充有0.2％BSA、0.1％胎牛血清和1ng/ml bFGF之EBM的Vitrogen^TM包被 24孔板上，并在5％CO₂中37℃保温48小时。对于血管平滑肌(VSM)和 成纤维细胞增殖实验，细胞在相同条件下保温，但用DMEM取代EBM。人 乳腺上皮细胞温育于其生长培养基中。在收获前最后4小时加入[³H]-胸 苷(1uCi/ul)脉冲。洗涤细胞并固定于10％TCA中。如前所述用闪烁计数 测定[³H]-胸苷掺入量(Iruela-Arispe，M.L.和Sage，E.H.，细胞生化杂 志(J.Cell.Biochem.)52：414(1993))。

通过Macintosh上用的In-Stat软件(Graph Pad Software)进行统 计分析。假定为正态分布，用单向ANOVA分析数据，然后用T-test Dunnett 检测做组间的比较。或用student-Newman-Kleus检测做组间多重比较。

为了认识METH1和METH2抑制新血管形成的机制，检测纯化重组蛋白 质对内皮细胞增殖的直接作用。将缺血清的内皮细胞植入含bFGF和FCS 的生长培养基中。重组蛋白质(3ug/ml)在铺板时同时加入。与只加GST 时无明显作用相对照，观察到40％(GST-METH1)、45％(6H-GST)或36％ (GST-METH2)的抑制。来自TSP1 I类重复区的重组蛋白质具有相似的 抑制作用。(图7A)。而且，METH1或METH2介导的增殖抑制是剂量依赖 型的，如图7E所示。处理后1天即可观察到抑制，这种抑制作用无毒性 且可逆，因为重组蛋白质去除和随后只添加生长因子可导致内皮细胞增 殖的恢复。

用对多种非内皮细胞进行的附加增殖实验评估METH1和METH2的抗增 殖作用对内皮的细胞特异性。在成纤维细胞或平滑肌细胞培养物中未见 明显的增殖抑制。相反，可观察到对这两种细胞类型不显著但可再现的 刺激作用。此结果排除了在重组蛋白质制品中任何可能的非特异细胞生 长抑制剂的存在。不过，在乳腺上皮细胞中，METH1和METH2抑制细胞增 殖的程度与对内皮细胞的相同。有趣的是，TSP1也在体外和转基因模型 中抑制乳腺上皮细胞增殖。

METH1和METH2可充当去整联蛋白的可能性是与其抗血管生成特性相 符的。用抗体完全封闭αVβ3和β1整联蛋白已显示可在发育期间和肿 瘤中抑制新血管形成(Brooks，P.C.等，细胞85：683-693(1996)； BrooksP.C.等，细胞92：391-400(1998)；Senger，D.R.等，美国国家科学 院院报94：13612-13617(1997))。整联蛋白对增殖和迁移信号的介导都是 必需的(Schwartz，M.A.和Ingber，D.E.，细胞分子生物学 (Mol.Biol.Cell)5：389-393(1994))，因此干扰这些信号对血管生成过程 非常不利。用只含METH1和METH2 I类重复区的重组蛋白质进行血管生 成功能性试验。

关于METH1和METH2血管生成抑制活性的作用机制是未知的。到目前 为止我们有证据表明这些蛋白质是分泌型的且可与内皮细胞结合。进一 步的研究涉及受体鉴定和信号转导机制。从对TSP1的了解中得到的可能 假设是METH1和METH2都与CD36结合。最近发现此清除剂受体与TSP-1 发挥其抗血管生成作用的信号介导有关(Dawson，D.W.等，细胞生物学杂 志138：707-717(1997))。推测CSVTCG(SEQ ID NO：83)(Asch，A.S.等， 自然262：1436-1439(1993)；Catimel，B.等，生化杂志 284：231-236(1992))和GCQXR(SEQ ID NO：84)序列为CD36的主要结合基 元(Dawson，D.W.等，细胞生物学杂志138：707-717(1997))。METH1和 METH2在这些区域都几乎完全保守。互补且也可能发生的是METH1和 METH2与bFGF的结合。推测与肝素和bFGF的结合为TSP1抗血管生成活 性的一部分(Guo，N，等，肽研究杂志49(1997))。似乎此特性通过 WSXWS(SEQ ID NO：82)基元介导，该基元在METH1和METH2中也保守。未 来的努力将集中于由这些新蛋白质介导的抗血管生成特性所涉及的信号 和它们作为胞外环境蛋白酶的潜能。 实施例6：从保藏样品中分离METH1或METH2 cDNA克隆

两种方法可用于自保藏样品中分离METH1或METH2。第一种，用本领 域技术熟练人员已知的技术将保藏克隆转化入合适宿主(如XL-1 Blue(Stratagene))，如载体供应者提供或在相关出版物或专利中的技 术。将转化子以约150个转化子(菌落)/平板的密度接种于1.5％琼脂板 上(含恰当的选择物，如氨苄青霉素)。然后通过本领域技术熟练人员众 所周知的技术用单菌落制备DNA。(如Sambrook等，分子克隆：实验室手 册，第二版，(1989)，冷泉港实验室出版社。)

或者，合成两个来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3两末端(即，在克 隆的5’NT和3’NT之间的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3区域内)的17-20 个核苷酸长引物，并以保藏cDNA质粒为模板用于扩增METH1或METH2 cDNA。在常规条件下进行聚合酶链式反应，例如，在含0.5ug上述cDNA 模板的25ul反应混合物中进行。一种方便的反应混合物是1.5-5mMMgCl₂、0.01％(W/V)明胶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各20uM、引物各25pmol 和0.25个单位Taq聚合酶。用Perkin-Elmer Cetus自动热循环仪进行 35个PCR循环(94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延伸1分钟)。 用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物并将具预期分子量的DNA带切出并纯化。 通过DNA产物的亚克隆和测序证实PCR产物是所选序列。

可有多种方法用于鉴定可能不存在于保藏克隆中的METH1或METH2基 因5’或3’非编码部分。这些方法包括但不局限于，滤膜检测、利用特异 探针的克隆富集和与本领域众所周知的5’和3’“RACE”流程相似或相同 的方案。例如，有类似于5’RACE的方法可用于产生预期全长转录物丢失 的5’端。(Fromont-Racine等，核酸研究21(7)：1683-1684(1993)。)

简单地说，将特异RNA寡核苷酸与推测含全长基因RNA转录物的RNA 群的5’端连接。利用含特异于所连接的RNA寡核苷酸的引物和特异于 METH1或METH2目的基因之已知序列的引物的引物对，PCR扩增METH1或 METH2全长基因的5’部分。然后将此扩增产物测序并用于产生全长基因。

尽管可用poly-A+RNA，此上述方法以分离自预期来源的总RNA开始。 如果必需的话，可用磷酸酶处理RNA制品，以消除可能会干扰后来RNA 连接酶步骤的降解或受损RNA之5’磷酸基。随后应使磷酸酶失活并用烟 草酸焦磷酸酶处理RNA以去除信使RNA5’端的帽子结构。此反应在去帽RNA 的5’端留下一5’磷酸基，该RNA然后可用T4 RNA连接酶与RNA寡核苷酸 连接。

此被修饰RNA制品用做通过基因特异性寡核苷酸合成第一条链cDNA 的模板。第一链合成产物用做PCR扩增预期5’端的模板，所用的一引物 特异于连接的RNA寡核苷酸而另一引物特异于目的基因的已知序列。然 后将产生的产物测序并分析，以证实5’端序列属于METH1或METH2基因。 实施例7：METH1或METH2的细菌表达

用如实施例5中所列的相应于DNA序列5’和3’端的PCR寡核苷酸引 物，扩增编码本发明METH1或METH2多肽的METH1或METH2多核苷酸， 以合成插入片段。为了将扩增产物克隆入表达载体，用于扩增cDNA插入 片段的引物应优选在引物5’端包含限制位点，如BamHI和XbaI。例如， BamHI和XbaI相应于细菌表达载体pQE-9上的限制酶位点。 (Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)。此质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、细 菌复制起点(ori)、IPTG可调节的启动子/操纵基因(P/O)、核糖体结合 位点(RBS)、6-组氨酸标记(6-His)和限制酶克隆位点。用BamHI和XbaI 消化pQE-9载体，并将扩增片段连接入pQE-9载体，保持起始于细菌RBS 的阅读框架。然后连接混合物用于转化含多拷贝质粒pREP4的大肠杆菌 菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)，该质粒表达lacI阻遏蛋白并还赋予卡那 霉素抗性(Kar^r)。通过它们在LB平板上生长的能力鉴定转化子并选择氨 苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并用限制酶分析证实。

含预期构建体的克隆在补充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB 液体培养基中培养过夜(O/N)。以1∶100-1∶250的比率接种O/N培养 物于大培养基中。细胞生长至光密度600(O.D.⁶⁰⁰)为0.4-0.6之间。然后 加入终浓度1mM的IPTG(异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷)。IPTG诱导通 过使lacI阻遏蛋白失活、清理P/O而导致增加基因表达。

细胞再生长3-4小时，然后离心收获(6000Xg，20分钟)。细胞沉淀 通过4℃搅拌3-4小时而溶于6M盐酸胍离液剂中。离心去除细胞碎片， 含多肽的上清加入镍-氨三乙酸(“Ni-NTA”)亲和树脂柱(获自 QIAGEN，Inc.，见上文)。带6xHis标记的蛋白质与Ni-NTA树脂以高亲和 性结合，并可用简单的一步法纯化(详见：QIAexpressionist(1995) QIAGEN，Inc.，见上文)。

简单地说，将上清液上6M盐酸胍，pH8的柱子，此柱先用10倍体积 的6M盐酸胍，pH8洗涤，然后用10倍体积的6M盐酸胍，pH6洗涤，最 后多肽用6M盐酸胍，pH5洗脱。

然后将纯化的METH1或METH2蛋白质在磷酸缓冲盐溶液(PBS)或50mM 乙酸钠，pH6缓冲液加200mM NaCl中透析复性。或者，当固定于Ni-NTA 柱上时，METH1或METH2蛋白质可成功地再折叠。推荐条件如下：用在 500mM NaCl、20％甘油、20mM Tris/HCl pH7.4中的6M-1M尿素(其中含 蛋白酶抑制剂)线性梯度复性。复性进行时间应不少于1.5小时。复性 后加入250mM咪唑洗脱蛋白质。最后用PBS或50mM乙酸钠，pH6缓冲液 加200mM NaCl透析除去咪唑。纯化的METH1或METH2蛋白质在4℃保存 或冷冻于-80℃。

除了上述表达载体外，本发明还包括含与METH1或METH2多核苷酸有 效连接之噬菌体操纵基因和启动子元件的表达载体，称pHE4a。(ATCC接 收号209645，保藏于1998年2月25日。)此载体包含：1)作为选择标 记的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌复制起点，3)T5噬菌体启动 子序列，4)两个lac操纵基因序列，5)SD序列，和6)乳糖操纵子阻 遏蛋白基因(lacIq)。复制起点(oriC)来自 pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子序列和操纵基因序列通过合成制 备。

通过用NdeI和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718限制性酶切载体，凝胶 电泳酶切产物并分离较大的片段(填充片段应为约310bp)，将DNA插入 pHEa。按实施例5所述PCR流程产生DNA插入片段，所用引物具NdeI(5’ 引物)和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718(3’引物)的限制性切点。凝胶 纯化PCR插入片段并用一致的酶酶切。按标准方案连接插入片段和载体。

在以上流程中可方便地替换基因工程改造载体以在细菌系统中表达 蛋白质。

实施例8：从包涵体中纯化METH1或METH2多肽

当其以包涵体形式存在时，以下任选方法可用于纯化表达于大肠杆菌 中的METH1或METH2多肽。除非特别说明，所有以下步骤均在4-10℃进 行。

大肠杆菌发酵的生产阶段完成后，细胞培养物冷至4-10℃并在 15000rpm(Heraeus Sepatech)连续离心收获细胞。依据预期蛋白质产量/ 单位细胞团重量和所需的纯化蛋白质量，通过称重，将适当量的细胞团 悬浮于含100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4的缓冲液中。用高剪切混合仪分 散细胞成为均一悬浮液。

将溶液以4000-6000psi两次通过显微流化仪(microfluidizer) (Microfuidics，Corp.或APV Gaulin，Inc)而溶解细胞。将匀浆液与终浓 度0.5M的NaCl溶液混合，然后在7000xg离心15分钟。产生的沉淀再 用0.5M NaCl，100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4洗涤。

用1.5M盐酸胍(GuHCl)溶解洗涤过的包涵体2-4小时。7000xg离心 15分钟后，弃沉淀并将含多肽的上清4℃放置过夜以便进一步的GuHCl 提取。

高速离心(30000xg)去除不溶颗粒后，通过剧烈搅拌将GuHCl提取液 与20倍体积含50mM钠，pH4.5，150mM NaCl，2mM EDTA的缓冲液快速混 合从而使GuHCl溶解的蛋白质再折叠。重折叠的稀释蛋白质溶液无需混 合，在进一步纯化步骤前4℃放置12小时。

为了澄清再折叠的多肽溶液，使用一事先制备的切向过滤装置，其装 配有具适当表面积的0.16um滤膜器(如Filtron)，并用40mM NaAC，pH6.0 平衡过。将过滤样品上阳离子交换树脂(如Poros HS-50，Perseptive Biosystems)。用40mM乙酸钠，pH6.0洗柱，再用同一缓冲液中的250mM、 500mM、1000mM和1500mM NaCl逐步洗脱。连续监测流出物在280nm的吸 光值。收集组分并用SDS-PAGE进一步分析。

然后将含METH1或METH2多肽的部分集中并与4倍体积水混合。稀释 样品先后上预先制备好的一套强阴离子交换树脂(Poros HQ-50，Perseptive Biosystems)和弱阴离子交换树脂(Poros CM-20，Perseptive Biosystems)。用40mM乙酸钠，pH6.0平衡柱子。两 柱子均用40mM乙酸钠，pH6.0，200mM NaCl洗涤。然后用10个柱床体积 的0.2M NaCl，50mM乙酸钠，pH6.0至1.0M NaCl，50mM乙酸钠，pH6.5 的线性梯度液洗脱CM-20柱。在持续监测流出物A_280nm的条件下收集组分。 然后集中含该多肽的组分(例如通过16％SDS-PAGE确定)。

经以上重折叠和纯化步骤后，产生的METH1或METH2多肽纯度应高于 95％。当上样量为5ug纯化蛋白质时，在考马斯兰染色的16％SDS-PAGE凝 胶上应观察不到明显的杂带。也可检测纯化METH1或METH2蛋白质中是 否有内毒素/LPS污染，一般按LAL试验，LPS含量少于0.1ng/ml。 实施例9：在杆状病毒表达系统中METH1或METH2的克隆和表达

在此实施例中，质粒穿梭载体pA2用于将METH1或METH2多核苷酸插 入杆状病毒以表达METH1或METH2。此表达载体包含苜蓿银纹夜蛾核型多 角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，其后是方便的限制位点， 如BamHI、XbaI和Asp718。猿猴病毒40(“SV40”)的多聚腺苷酸化位点 用于有效的多聚腺苷酸化。为了方便重组病毒的选择，质粒包含来自大 肠杆菌、以同一方向在弱果蝇启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因，其后 是多角体蛋白基因的多聚腺苷酸化信号。插入基因两侧均为用于与野生 型病毒DNA进行细胞介导的同源重组的病毒序列，以产生表达克隆METH1 或METH2多核苷酸的活病毒。

正如本领域技术熟练人员应理解的，许多其他杆状病毒载体可替代上 述载体使用，如pAc373、pVL941和pAcIM1，只要该构建体能为转录、翻 译、分泌等等提供恰当的定位信号，包括所要求的信号肽和框架内AUG 即可。这样的载体参阅，如，Luckow等，病毒学(Virology)170： 31-39(1989)。

具体地说，用实施例5所述的PCR流程扩增保藏克隆中所含的METH1 或METH2 cDNA序列，其中包括AUG起始密码子和任何天然相关的前导序 列。如果用天然信号序列生产分泌蛋白质，则pA2载体不需第二个信号 肽。或者，可用标准方法将载体修饰成含杆状病毒前导序列(pA2 GP)， 参阅，Summers等，“杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册(A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures)”德克萨斯农业试验站简报号1555(1987)。

用可购买到的试剂盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从 1％的琼脂糖凝胶上分离扩增片段。然后用适当的限制酶消化片段并再次 于1％的琼脂糖凝胶上纯化。

通过本领域已知的常规方法，用相应的限制酶消化质粒，且任选地， 可用小牛肠磷酸酶使其去磷酸化。然后用可购买到的试剂盒 (“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶上分离 DNA。

用T4 DNA连接酶将片段和去磷酸化质粒连起来。连接混合物转化大 肠杆菌HB101或如XL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA) 之类的其它合适大肠杆菌宿主细胞并铺于培养皿上。通过消化来自单菌 落的DNA并凝胶电泳分析消化产物而鉴定含质粒的细菌。DNA测序证实所 克隆片段的序列。

用Felgner等，美国国家科学院院报84：7413-7417(1987)所述的脂转 染法将5ug含多核苷酸的质粒与1.0ug可购得的线性杆状病毒 DNA(“BaculoGold^a baculovirus DNA”，Pharmingen，San Diego，CA)共转 染。在含50ul无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.， Gaithersburg，ND)的微量滴定板上无菌孔中混合1ug BaculoGold^a病毒 DNA和5ug质粒。之后，加入10ul Lipofectin和90ul Grace’s培养基， 混合并室温保温15分钟。然后将转染混合物滴加到培养于35mm组织培 养皿中1ml无血清Grace’s培养基内的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711) 上。平板27℃保温5小时。随后从平板上除去转染溶液并加入补充有10％ 胎牛血清的1ml Grace’s昆虫培养基。在27℃继续培养4天。

4天后收集上清并进行空斑测定，如Summers和Smith(同上文)所 述。用有“Blue Gal”(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)的琼 脂糖凝胶可方便地鉴定和分离产生兰斑的表达gal克隆。(关于此类型 “空斑测定”的详细描述也可参阅Life Technologies Inc.，Gaithersburg提供的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南，第9-10 页。)恰当保温后，用微量加液吸头(如Eppendorf)挑出兰斑。将含重 组病毒的琼脂重悬于含200ul Grace’s培养基的微量离心管中，用含重组 杆状病毒的悬浮液感染培养于35mm平板上的Sf9细胞。4天后收获培养 板上清并4℃保存。

为了证实多肽的表达，将Sf9细胞培养于补充有10％热失活FBS的 Grace’s培养基中。用含多核苷酸的重组体杆状病毒以感染复数(“MOI”) 约2感染细胞。若需放射性标记蛋白质，6小时后去除培养基，换入无甲 硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培养基(购自Life Technologies Inc.，Rockville，MD)。42小时后，加入5uCi ³⁵S-甲硫氨酸和5uCi ³⁵S- 半胱氨酸(购自Amersham)。细胞再保温16小时后离心收获。用SDS-PAGE 及随后放射自显影(若放射性标记)分析上清中的蛋白质和胞内蛋白质。

纯化蛋白质氨基末端氨基酸序列的微量测序可用于确定所产生的 METH1或METH2蛋白质的氨基末端序列。 实施例10：哺乳动物细胞中METH1或METH2的表达

TMEH1或METH2多肽可表达于哺乳动物细胞中。典型的哺乳动物细胞 表达载体包含介导mRNA转录起始的启动子元件、蛋白质编码序列和转录 终止及转录物多聚腺苷酸化所需的信号。另外的元件包括增强子、Kozak 序列和两侧为RNA剪切供体和受体位点的间插序列。用SV40早晚期启动 子、来自如RSV、HTLVI、HIVI之类逆转录病毒的长末端重复(LTR)和 巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可完成高效表达。不过，还可用细胞元 件(如人肌动蛋白启动子)。

本发明应用中合适的表达载体包括，例如，pSVL和 pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2DHFR (ATCC 37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport2.0和pCMVSport3.0 之类的载体。可用的哺乳动物宿主细胞包括：人Hela、293、H9和Jurkat 细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1，Cos7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞， 小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

或者，METH1或METH2多肽可于含整合入染色体之METH1或METH2多 核苷酸的稳定细胞系中表达。与诸如DHFR、gpt、新霉素、潮霉素之类的 选择标记共转染可鉴定和分离转染细胞。

还可扩增转染的METH1或METH2基因以表达大量编码蛋白质。DHFR(二 氢叶酸还原酶)标记可用于获得带数百或甚至数千拷贝目的基因的细胞 系(见，如，Alt，F.W.等，生物化学杂志253：1357-1370(1978)；Hamlin，J.L. 和Ma，C.，生化和生物物理学报(Biochem.Et Biophys.Acta)1097：107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，生物 技术(Biotechnology)9：64-68(1991)。)另一有用的选择标记是谷氨酰胺 转移酶(GS)(Murphy等，生化杂志227：277-279(1991)；Bebbington 等，Bio/Technology10：169-175(1992))。利用这些标记，培养哺乳动物 细胞于选择性培养基上并选择具最高抗性的细胞。这些细胞系包含整合 入染色体的扩增基因。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NSO细胞经常用于蛋 白质的生产。

质粒pSV2-DHFR(ATCC接收号37146)、表达载体pC4(ATCC接收号 209649)和pC6(ATCC接收号209647)的衍生物包含劳氏肉瘤病毒的强 启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月)) 以及CMV-增强子片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。多克隆位 点，如限制酶BamHI、XbaI和Asp718的切点，可方便METH1或METH2的 克隆。载体还包含3’内含子、大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化和终 止信号及在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。

如果用天然信号序列生产分泌蛋白质，则载体无需第二个信号肽。或 者，如果不用天然信号序列，则载体可被修饰成含异源信号肽以便从细 胞中分泌蛋白质。(见，如，WO96/34891。)

然后用恰当的限制酶消化扩增片段并用购买到的试剂盒 (“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)于1％的琼脂糖凝胶上纯化。 用T4 DNA连接酶连接分离片段和去磷酸化载体。随后转化大肠杆菌HB101 或XL-1Blue细胞，并用如限制酶分析之类的方法鉴定质粒pC6或pC4中 含插入片段的细菌。

缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用脂转染法 (Felgner等，同上文)共转染5ug表达质粒pC6或pC4和0.5ug质粒 pSVneo。质粒pSV2-neo包含一显性选择标记，neo基因来自所编码酶具 抗包括抗G418在内的一组抗生素抗性的Tn5。细胞培养于含1mg/ml G418 的α-MEM中。2天后，用胰蛋白酶消化细胞并在含10、25或50ng/ml氨 甲喋呤和1mg/ml G418的α-MEM中于杂种瘤克隆平板(Greiner，Germany) 上培养。约10-14天后用胰蛋白酶水解单克隆并用不同浓度氨甲喋呤 (50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)培养于6孔培养皿或10ml瓶中。 然后将生长于最高浓度氨甲喋呤中的克隆转移至含甚至更高浓度氨甲喋 呤(1uM、2uM、5uM、10mM、20mM)的6孔板上。重复相同步骤直至获得在 100-200uM浓度下生长的克隆。用例如SDS-PAGE和蛋白质印迹或反相 HPLC之类的方法分析METH1或METH2的表达。 实施例11：N-末端和/或C-末端缺失突变体的构建

以下常规方法可用于克隆N-末端或C-末端缺失的METH1或METH2缺 失突变体。通常，约15-25个核苷酸长的两寡核苷酸引物来自SEQ ID NO：1 或SEQ ID NO：3多核苷酸的预期5’和3’位置。以预期METH1或METH2多 核苷酸片段为基础确定引物的5’和3’位置。如果需要，可在5’和3’引物 中分别加入起始和终止密码子以表达此多核苷酸片段编码的METH1或 METH2多肽片段。优选的METH1或METH2多核苷酸片段是编码公开于说明 书中“多核苷酸和多肽片段”部分的N-末端和C-末端缺失突变体的那些 多核苷酸片段。

含限制位点以方便METH1或METH2多核苷酸片段克隆入预期载体的附 加核苷酸也可加入5’和3’引物序列中。用恰当的PCR寡核苷酸引物和本 文所述或本领域已知条件从基因组DNA或保藏cDNA克隆中扩增METH1或 METH2多核苷酸片段。尽管由于特异片段和全长多肽间化学和物理特性的 差异使得可能需要一些常规改动，由本发明METH1或METH2多核苷酸片 段编码的METH1或METH2多肽片段还是可以与全长多肽相同的一般方式 进行表达和纯化。

作为例子但本发明不局限于此，编码METH1多肽片段D-40至S-950 或METH2多肽片段L-20至L-890的多核苷酸扩增和克隆如下：产生5’ 引物，其包含限制酶切点，其后是与分别编码开始于D-40或L-20之多 肽片段N-末端部分的多核苷酸序列读框一致的起始密码子。产生互补3’ 引物，其包含限制酶切点，其后是与分别编码结束于S-950或L-890之 METH1或METH2多肽片段C-末端部分的多核苷酸序列读框一致的终止密 码子。

用识别引物中这些位点的限制酶消化扩增的多核苷酸片段和表达载 体。然后将消化的多核苷酸连在一起。将METH1或METH2多核苷酸片段 插入限制性消化的表达载体中，优选是将METH1或METH2多肽片段编码 区放置在启动子下游。用标准方法如本文实施例所述将连接混合物转化 入感受态大肠杆菌细胞。从抗性菌落中分离质粒DNA并用限制性酶切分 析、PCR和DNA测序证实克隆DNA。 实施例12：METH1或METH2的蛋白质融合

METH1或METH2多肽优选与其他蛋白质融合。这些融合蛋白质可用于 各种用途。例如，METH1或METH2多肽与His标记、HA标记、蛋白A、IgG 结构域和麦芽糖结合蛋白质融合可方便纯化。(见实施例7；也可参阅EP A 394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988)。)同样地，与IgG-1、 IgG-3和白蛋白融合可延长它们在体内的半寿期。与METH1或METH2多肽 融合的核定位信号可使蛋白质定向于特异亚细胞位置，而共价杂二聚体 或同型二聚体可提高或降低融合蛋白质的活性。融合蛋白质还可产生具 一种以上功能的嵌合分子。最后，与非融合蛋白质相比，融合的蛋白质 可提高被融合的蛋白质的溶解度和稳定性。所有上述类型融合蛋白质均 可通过对以下概述多肽与IgG分子融合的流程或实施例7中所述的流程 稍作改动而制备。

简单地说，可用跨越下述序列5’和3’端的引物PCR扩增人IgG分子的 Fc部分。这些引物还应有方便的限制性酶切位点便于克隆入表达载体， 优选哺乳动物表达载体。

例如，若使用pC4(接收号209646)，可将人Fc部分连接到BamHI克 隆位点。注意3’BamHI位点应被破坏。然后，用BamHI酶切含人Fc部分 的载体，将载体线性化，并将按实施例5中所述PCR方案分离的METH1 或METH2多核苷酸连入此BamHI位点。注意多核苷酸的克隆无终止密码 子，否则不能产生融合蛋白质。

如果用天然信号序列生产分泌蛋白质，pC4无需第二个信号肽。或者， 如果不用天然信号序列，载体可修饰成含异源信号序列。(见，如， WO96/34891)

人IgG Fc区： GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAA AGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGG ACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO：85) 实施例13：抗体的生产

本发明的抗体可用多种方法制备。(见通用流程第二章)例如，将表 达METH1或METH2的细胞施用于动物以诱发含多克隆抗体的血清的产生。 在优选的方法中，METH1或METH2蛋白质制品被制备和纯化成基本上无天 然污染物。然后将这样的制品引入动物以产生更高比活性的多克隆抗血 清。

在最优选的方法中，本发明抗体是单克隆抗体(或其蛋白质结合片 段)。这样的单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。(Kohler等，自然256： 495(1975)；Kohler等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6：511(1976)； Kohler等，欧洲免疫学杂志6：292(1976)；Hammerling等，单克隆抗体 和T-细胞杂交瘤，Elsevier，N.Y.，第563-681页(1981)。)大体上，这样 的方法包括用METH1或METH2多肽，或更优选的用表达分泌METH1或 METH2多肽的细胞免疫动物(优选小鼠)。所说的细胞可培养于任何合适 的组织培养基中；不过，优选培养细胞于含10％胎牛血清(56℃灭活)， 并补充有约10g/l非必需氨基酸、约1000U/ml青霉素和约100ug/ml链 霉素的Earle modifide Eagle’s培养基中。

提取所说小鼠的脾细胞并与合适的骨髓瘤细胞系融合。按照本发明可 用任何合适的骨髓瘤细胞系；不过，优选可获自ATCC的亲代骨髓瘤细胞 系(SP20)。融合后，产生的杂交瘤细胞选择性地保持于HAT培养基中， 然后如Wands等(肠胃病学80：225-232(1981))所述用有限稀释法克 隆。检验这样选择获得的杂交瘤细胞以鉴别所分泌抗体能结合METH1或 METH2多肽的克隆。

或者，可用抗独特型抗体经两步产生能结合METH1或METH2多肽的其 它抗体。这样的方法利用了抗体本身即为抗原的事实，因此可能得到能 结合第二抗体的抗体。按照此方法，蛋白质特异性抗体被用于免疫动物， 优选小鼠。用所说动物的脾细胞产生杂交瘤细胞，筛选该杂交瘤细胞以 鉴定能产生其结合METH1或METH2蛋白质特异性抗体的能力可被METH1 或METH2阻断的抗体的克隆。这样的抗体包含抗METH1或METH2蛋白质 特异性抗体的抗独特型抗体，可用于免疫动物以诱发其它METH1或METH2 蛋白质特异性抗体的形成。

应当理解Fab和F(ab’)2和本发明的其它抗体片段可按本文公开方法 利用。这样的片段一般用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶 (产生F(ab’)2片段)之类的酶进行蛋白水解切割产生。或者，分泌型 METH1或METH2蛋白质结合片段可通过重组DNA技术的应用或合成化学法 产生。

为了抗体在人体内的利用，优选使用“人源化”嵌合单克隆抗体。这 样的抗体可用来自上述产单克隆抗体之杂交瘤细胞的基因构建体产生。 可用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。(见，综述，Morrison，科 学229：1202(1985)；Oi等，BioTechnique4：214(1986)；Cabilly等，美 国专利号4816567；Taniguchi等，EP171496；Morrison等，EP173494； Neuberger等，WO8601533；Robinson等，WO8702671；Boulianne等，自 然312：643(1984)；Neuberger等，自然314：268(1985)。)     实施例14：用于高流通量筛选试验的METH1或METH2蛋白质生产

以下流程可产生含待测METH1或METH2多肽的上清。此上清可随后用 于实施例16-23所述之筛选试验中。

首先，在PBS(w/o钙或镁17-516F Biowhittaker)中以1∶20的比例 稀释多聚-D-赖氨酸(644587Boehringer-Mannheim)母液(1mg/ml于PBS 中)至50ug/ml的使用液。每孔(24孔板)中加200ul该溶液并室温放 20分钟。保证每孔中分配有溶液(注意：可用12通道移液器，每通道上 各有吸头)。吸去多聚-D-赖氨酸溶液并用1ml PBS(磷酸缓冲盐水)漂洗。 PBS应保持在孔中直到细胞铺板前，且平板可先被多赖氨酸包被长达两 周。

在5ml DMEM(Dulbecco’s Modifide Eagle Medium)(含4.5G/L葡萄 糖和L-谷氨酰胺(12-604F Biowhittaker))/10％热失活FBS(14-503F Biowhittaker)/1xPenstrep(17-602E Biowhittaker)中以2×10⁵细胞/孔 的密度将293T细胞(没有超过P+20的细胞)铺于板上。使细胞生长过 夜。

第二天，在无菌溶液瓶中混合：300ul Lipofectamine(18324-012 Gibco/BRL)和5ml Optimem I(31985070 Gibco/BRL)/96孔板。用小体积 多通道移液器，将用实施例10-12所述方法产生的含多核苷酸插入片段 的表达载体约2ug置于恰当标记的96孔圆底板中。用多通道移液器在每 孔中加入50ul Lipofectamine/Optimen I混合物。用移液器上下轻吹吸 以混合。室温放15-45分钟。约20分钟后，用多通道移液器在每孔中加 入150ul Optimem I。作为对照，无插入片段的载体DNA的平板应与各套 转染一起进行转染。

优选地，转染应通过标记协同法(tag-teaming)进行以下工作完成。 通过标记协同法，时间减半，细胞不用在PBS中放太长时间。首先，一 人从细胞的4个24孔板中吸出培养基，然后另一人用5-1ml PBS漂洗各 孔。第一人吸出漂洗PBS液，第二人用每隔一通道带吸头的12通道移液 器先在24孔板每行的奇数孔中加入200ul DNA/Lipofectamine/Optimen I复合物，然后加入偶数孔中。37℃保温6小时。

在细胞保温时，制备恰当的培养基，或是在含1xpenstrep的DMEM 中的1％BSA，或是HGS CHO-5培养基(116.6mg/L CaCl₂(无水)；不 0.00130mg/L CuSO₄-5H₂O；0.050mg/L Fe(NO₃)₃-9H₂O；0.417mg/LFeSO₄-7H₂O；311.80mg KCl；28.64mg/L MgCl₂；48.84mg/L MgSO₄；6995.50 mg/L NaCl；2400.0mg/L NaHCO₃；62.50mg/L NaH₂PO₄-H₂O；71.02mg/LNa₂HPO₄；4320mg/L ZnSO₄-7H₂O；0.002mg/L花生四烯酸；1.022mg/L胆固 醇；0.070mg/L DL-α-生育酚乙酰酯；0.0520mg/L亚油酸；0.010mg/L 亚麻酸；0.010mg/L肉豆蔻酸；0.010mg/L油酸；0.010mg/L Palmitric Acid；0.010mg/L棕榈酸；100mg/L Pluronic F-68；0.010mg/L硬 脂酸；2.20mg/L吐温80；455lmg/L D-葡萄糖；130.85mg/ml L-丙氨酸； 147.50mg/ml L-精氨酸-HCl；7.50mg/ml L-天冬酰胺-H₂O；6.65mg/ml L- 天冬氨酸；29.56mg/ml L-半胱氨酸-2HCl-H₂O；31.29mg/ml L-半胱氨酸 -2HCl；7.35mg/ml L-谷氨酸；365.0mg/ml L-谷氨酰胺；18.75mg/ml 甘氨酸；52.48mg/ml L-组氨酸-HCl-H₂O；106.97mg/ml L-异亮氨 酸；111.45mg/ml L-亮氨酸；163.75mg/ml L-赖氨酸-HCL；32.34mg/ml L- 甲硫氨酸；68.48mg/ml L-苯丙氨酸；40.0mg/ml L-脯氨酸；26.25mg/ml L-丝氨酸；101.05mg/ml L-苏氨酸；19.22mg/ml L-色氨酸；91.79mg/ml L-酪氨酸-2Na-2H₂O；99.65mg/ml L-缬氨酸；0.0035mg/L生物素；3.24 mg/L D-泛酸钙；11.78mg/L胆碱盐酸盐；4.65mg/L叶酸；15.60mg/L I- 肌醇；3.02mg/L烟酰胺；3.00mg/L盐酸吡哆醛；0.031mg/L盐酸吡哆 素；0.319mg/L核黄素；3.17mg/L盐酸硫胺素；0.365mg/L胸苷；0.680 mg/L维生素B₁₂；25mM HEPES缓冲液；2.39mg/L次黄嘌呤钠；0.105mg/L 硫辛酸；0.081mg/L二盐酸腐胺钠；55.0mg/L丙酮酸钠；0.0067mg/L亚 硒酸钠；20uM乙醇胺；0.122mg/L柠檬酸铁；41.70mg/L与亚油酸得合的 甲基-B-环糊精；33.33mg/L与油酸复合的甲基-B-环糊精；10mg/L与乙 酸视黄醛复合的甲基-B-环糊精。用2mm谷氨酰胺和1xpenstrep(BSA (81-068-3 Bayer)100gm溶于1L DMEM中成10％的BSA母液)调整重量摩 尔渗透压浓度为327mOsm.。过滤培养基并收集50ul以在15ml聚苯乙烯 圆锥管中进行内毒素检验。

在保温末期优选用标记协同法终止转染。一人吸去转染培养基，而另 一人往各孔中加入1.5ml恰当的培养液。37℃保温45或72小时，取决 于所用培养液：用1％BSA是45小时，用CHO-5是72小时。

第四天，用300ul多通道移液器将600ul等份试样加入一1ml深孔平 板上，剩下的上清加入2ml深孔平板上。然后将各孔上清用于实施例 16-23所述的检验中。

特别提出的是，在用上清进行的任何下述实验中得到活性时，此活性 或直接来自METH1或METH2多肽(如作为分泌蛋白质)或者是METH1或 METH2诱导其它蛋白质的表达，然后该蛋白质分泌到上清中所致。因此， 本发明进一步提供了鉴别上清中特征在于在特异检验中有活性的蛋白质 的方法。 实施例15：GAS报道基因构建体的构建

在细胞分化和增殖中涉及的一条信号转导途径称为Jaks-STAT途径。 在Jaks-STAT途径中活化蛋白质与位于许多基因启动子内的γ活化位点 “GAS”元件或干扰素敏感应答元件(“ISRE”)结合。蛋白质与这些元件 的结合改变了相关基因的表达。

GAS和ISRE元件由称为信号转导物和转录激活剂或“STAT”的一类转 录因子识别。STAT家族有6个成员。如Stat2(对IFN-α的应答广泛存 在)一样，Stat1和Stat3存在于许多细胞类型中。Stat4的存在更有限 制，尽管在用IL-2处理后的T辅助I类细胞中已有发现，但它在许多细 胞中是没有的。Stat5最初称为乳腺生长因子，但已发现在包括脊髓细胞 在内的其它细胞中其浓度更高。在组织培养细胞中它可被许多细胞因子 活化。

STAT被一套已知为Janus激酶(“Jaks”)家族的激酶通过酪氨酸磷酸 化活化，从细胞质转位至细胞核。Jaks代表了一个独特的可溶性酪氨酸 激酶家族，它包括Tyk2、Jak1、Jak2和Jak3。这些激酶呈现有显著的序 列类似性，且通常在静止细胞中无催化性活性。

Jaks可被概述如下表的多种受体激活。(改编自综述Schidler和 Darnell，生化年鉴(Ann.Rev.Biochem.)64：621-51(1995)。)能激活Jaks 的细胞因子受体家族分成两组：(a)1类包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、 IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、Epo、PRL、GH、G-CSF、GM-CSF、 LIF、CNTF和血小板生成素的受体；和(b)2类包括IFN-a、IFN-g和IL-10。 1类受体共有保守的半胱氨酸基元(一套4个半胱氨酸和1个色氨酸)和 WSXWS基元(编码Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser(SEQ ID NO：82)的近膜区)。

因此，通过配基与受体的结合，Jaks被活化，从而激活STAT，然后 STAT转位并与GAS元件结合。此完整过程包含在Jaks-STAT信号转导途 径中。

因此，GAS或ISRE元件的结合所反映的Jaks-STAT途径的激活可用 于指示细胞增殖和分化中涉及的蛋白质。例如，已知生长因子和细胞因 子可激活Jaks-STAT途径。(见下表)这样，通过利用与报道分子连接的 GAS元件，可鉴定Jaks-STAT途径的激活剂。

	JAK				STATS	GAS(元件)或ISRE
							配基	tyk2	Jak1	Jak2	Jak3
IFN家族
							IFN-a/B IFN-g I1-10	+ +	+ + ？	- + ？	- - -	1，2，3 1 1，3	ISRE GAS(IRF1＞Lys6＞IFP)
gp130家族
							IL-6(多效) I1-11(多效) OnM(多效) LIF(多效) CNTF(多效) G-CSF(多效) IL-12(多效)	+ ？ ？ ？ -/+ ？ +	+ + + + + + -	+ ？ + + + ？ +	？ ？ ？ ？ ？ ？ +	1，3 1，3 1，3 1，3 1，3 1，3 1，3	GAS(IRF1＞Lys6＞IFP)
g-C家族
							IL-2(淋巴细胞) IL-4(淋巴/骨髓) IL-7(淋巴细胞) IL-9(淋巴细胞) IL-13(淋巴细胞) IL-15	- - - - - ？	+ + + + + +	- - - - ？ ？	+ + + + ？ +	1，3，5 6 5 5 6 5	GAS GAS(IRF1＝IFP＞＞Ly6)(IgH) GAS GAS GAS GAS
gp140家族
							IL-3(骨髓) IL-5(骨髓) GM-CSF(骨髓)	- - -	- - -	+ + +	- - -	5 5 5	GAS(IRF1＞IFP＞＞Ly6) GAS GAS
生长激素家族
							GH PRL EPO	？ ？ ？	- +/- -	+ + +	- - -	5 1，3，5 5	GAS(B-CAS＞IRF1＝IFP＞＞Ly6)
受体酪氨酸激酶
							EGF PDGF CSF-1	？ ？ ？	+ + +	+ + +	- - -	1，3 1，3 1，3	GAS(IRF1) GAS(非IRF1)

为了构建用于实施例16-17所述生物学检验、含启动子元件的合成 GAS，应用以PCR为基础的方法产生GAS-SV40启动子序列。5’引物包含在 IRF1启动子中发现的4个串联拷贝GAS结合位点，先前已证实这些位点 在一些细胞因子诱导下可与STAT结合(Rothman等，免疫力 1：457-468(1994))，尽管如此，其他的GAS或ISRE元件可代替它们使用。 5’引物还包含与SV40早期启动子序列互补的18bp序列，侧翼有XhoI位 点。5’引物序列是： 5′：GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTT CCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG：3′(SEQ ID NO：86)

下游引物与SV40启动子互补且侧翼有HindIII位点： 5’：GCGGCAAGCTTTTTG CAAAGCCTAGGC：3’(SEQ ID NO：87)。

用获自Clontech的B-gal启动子质粒内的SV40启动子模板进行PCR 扩增。用XhoI/HindIII消化产生的PCR片段并亚克隆入 BLSK2-(Stratagene)。用正向和反向引物测序证实插入片段含以下序列： 5′： CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCC GAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCA TAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGT TCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCA GAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAG GAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA AAGCTT：3′(SEQ ID NO：88)

随后用与SV40启动子连接的GAS启动子元件经基因工程构建GAS： SEAP2报道构建体。在此，报道分子是分泌型碱性磷酸酶或“SEAP”。不 过，明显地，在此或任何其他实施例中可使用任何报道分子替代SEAP。 众所周知可替代SEAP使用的报道分子包括氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧 光素酶、碱性磷酸酶、B-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)或可用抗体 检测的任何蛋白质。

用HindIII和XhoI将已经序列确认的合成GAS-SV40启动子元件亚 克隆入获自Clontech的pSEAP启动子载体，以扩增的GAS：SV40启动子 元件有效置换SV40启动子，从而产生GAS-SEAP载体。然而，此载体不 含新霉素抗性基因，因此不优选用于哺乳动物表达系统。

因而，为了产生表达GAS-SEAP报道基因的哺乳动物稳定细胞系，用 SaII和NotI从GAS-SEAP载体中取出GAS-SEAP盒，并用多克隆位点内的 这些限制位点将其插入含新霉素抗性基因的骨架载体，如 pGFP-1(Clontech)，从而产生GAS-SEAP/Neo载体。一旦此载体被转染入 哺乳动物细胞，就可随后如实施例16-17所述用作GAS结合的报道分子。

通过使用以上方法并用不同的启动子序列替代GAS可制备其他的构建 体。例如，含NFK-B和EGR启动子序列的报道分子的构建如实施例18和 19所述。不过，用这些实施例中所述流程可取代许多其他启动子。如， 可单独或联合替代SRE、IL-2、NFAT或骨钙蛋白启动子(如 GAS/NF-KB/EGR、GAS/NF-KB、IL-2NFAT或NF-KB/GAS)。同样地，其他细 胞系可用于检测报道基因构建体活性，如HELA(上皮细胞)、HUVEC(内 皮细胞)、Reh(B-细胞)、Saos-2(成骨细胞)、HUVAC(主动脉)或心肌 细胞。 实施例16：T-细胞活性的高流通量筛选试验

利用以下流程，通过测定METH1或METH2上清是否增殖和/或分化T- 细胞而评估METH1或METH2的T-细胞活性。用实施例15产生的 GAS/SEAP/Neo构建体评估T细胞活性。这样，可提高SEAP活性的因子表 明其具有激活Jaks-STAT信号转导途径的能力。尽管Molt-3细胞(ATCC 接收号CRL-1552)和Molt-4细胞(ATCC接收号CRL-1582)也可使用， 用于本试验的T细胞是Jurkat T细胞(ATCC接收号TIB-152)。

Jurkat T细胞是成淋巴细胞CD4+Th1辅助细胞。为了产生稳定的细胞 系，用DMRIE-C(Life Technologies)将GAS-SEAP/Neo载体转染入约两百 万个Jurkat细胞中(转染步骤如下)。转染细胞接种密度约20000个细 胞/孔，选择抗1mg/ml genticin的转染子。扩展抗性菌落，并随后检测 其对逐步提高浓度的γ干扰素的应答。证实所选克隆的剂量应答。

特别是，以下方案将产生足够细胞以用于含200ul细胞的75个孔中。 因此，或者比例增大或成倍增加以产生足够细胞用于若干块96孔板。 Jurkat细胞维持于含1％Pen-Strep的RPMI+10％血清中。在T25摇瓶中合 并2.5ml OPTI-MEM(Life Technologies)和10ug质粒DNA。加入含50ul DMRIE-C的2.5ml OPTI-MEM并室温保温15-45分钟。

在保温期间，计算细胞浓度，离心所要求的细胞数(10⁷/次转染)， 并重悬于OPTI-MEM中至终浓度10⁷个细胞/ml。然后将OPTI-MEM中 1ml1×10⁷个细胞加入T25摇瓶中，37℃保温6小时。保温后，加10ml RPMI+15％血清。

Jurkat：GAS-SEAP稳定报道体系维持在RPMI+10％血清、1mg/ml Genticin和1％Pen-Strep中。用含METH1或METH2多肽或者如实施例14 所述方法产生的METH1或METH2诱导的多肽的上清处理这些细胞。

在用该上清处理的当天，这些细胞应漂洗并重悬于新鲜RPMI+10％血清 中至500000个细胞/ml的密度。所要求的确切细胞数将决定于被筛选的 上清量。对于1个96孔板，需要约一千万个细胞(对于10个平板，需 要一亿个细胞)。

为了分配细胞至96孔皿里，用12通道移液器转移细胞至三角贮器中。 用12通道移液器转移200ul细胞至每一孔中(因此为100000个细胞/孔)。

所有平板均已接种后，用12通道移液器直接将50ul上清从含上清的 96孔板转移至各孔中。此外，将不同量外源干扰素γ(0.1、1.0、10ng) 加入孔H9、H10和H11中用做检验的阳性对照。

将含有用上清处理过的Jurkat细胞的96孔皿放于培养箱中48小时 (注意：此时间可在48-72小时间变化)。然后用12通道移液器将各孔 的35ul样品转移至不透明96孔板。此不透明板应覆盖(用sellophene 覆盖层)并保存于-20℃直到按实施例20进行SEAP试验。将含剩余处理 细胞的平板放置于4℃，需要时用做对特异孔重复试验的材料来源。

用100个单位/ml干扰素γ做阳性对照，已知它可激活Jurkat T细胞。 在阳性对照孔中一般可观察到超过30倍的诱导。 实施例17：鉴定脊髓活性的高流通量筛选试验

利用以下流程通过测定METH1或METH2是否增殖和/或分化脊髓细胞 而评估METH1或METH2的脊髓活性。用实施例15产生的GAS/SEAP/Neo 构建体评估脊髓细胞活性。这样，可提高SEAP活性的因子表明其具有激 活Jaks-STAT信号转导途径的能力。尽管TF-1、HL60或KG1也可使用， 用于本试验的脊髓细胞是U937，一种前单核细胞系。

为了用实施例15产生的GAS/SEAP/Neo构建体瞬时转染U937细胞， 使用了DEAE-葡聚糖的方法(Kharbanda等，1994，细胞生长和分化 5：259-265)。首先，收获2×10e⁷U937细胞并用PBS漂洗。U937细胞通常 培养于含10％热灭活胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素和100mg/ml 链霉素的RPMI 1640培养液中。

然后，悬浮细胞于含0.5mg/ml DEAE-葡聚糖、8ug GAS-SEAP2质粒 DNA、140mM NaCl、5mM KCl、375uM Na₂HPO₄·7H₂O、1mM MgCl₂和675uM CaCl₂的1ml 20mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中。37℃保温45分钟。

用含10％FBS的RPMI 1640培养液漂洗细胞，然后重悬于10ml完全培 养液中并37℃保温36小时。

通过培养细胞于400ug/ml G418中得到GAS-SEAP/U937稳定细胞。除 每1-2个月于含400ug/ml G418的培养液培养数代之外，一般使用无G418 培养基进行常规培养。

收获1×10⁸个细胞(足以用于10个96孔板试验)用于检测并用PBS 漂洗。悬浮细胞于200ml上述生长培养液中，终浓度5×10⁵个细胞/ml。 加200ul细胞/孔于96孔板中(或1×10⁵个细胞/孔)。

加50ul用实施例14所述方法制备的上清。37℃保温48-72小时。用 100个单位/ml干扰素γ做阳性对照，已知它可激活U937细胞。在阳性 对照孔中一般可观察到超过30倍的诱导。按实施例20所述方法用SEAP 检验上清。

实施例18：鉴定神经  活性的高流通量筛选试验

当细胞分化和增殖时，一组基因通过许多不同的信号转导途径被激 活。这些基因之一，EGR1(早期生长应答基因1)在激活作用下在多种组 织和细胞类型中被诱导。EGR1的启动子负责这种诱导。通过连接于报道 分子的EGR1启动子，细胞的激活作用可用METH1或METH2评估。

尤其是，用以下方法评估PC12细胞系中的神经活性。已知PC12细 胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞)通过许多促有丝分裂素的激活作用增殖和/或 分化，如TPA(十四烷酰佛波醇乙酸酯)、NGF(神经生长因子)和EGF(表 皮生长因子)。在此处理过程中EGR1基因表达被激活。从而，通过用含 与SEAP报道基因连接之EGR启动子的构建体稳定转染PC12细胞，可评 估METH1或METH2对PC12细胞的激活作用。

EGR/SEAP报道基因构建体可用以下流程装配。EGR-1启动子序列(-633 至+1)(Sakamoto K等，癌基因6：867-871(1991))可用如下引物PCR 扩增自人基因组DNA：

5′GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3′(SEQ ID NO：89)

5′GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3′(SEQ ID NO：90)

用实施例15产生的GAS：SEAP/Neo载体，将EGR1扩增产物插入此载 体中。用限制性酶XhoI/HindIII线性化GAS：SEAP/Neo载体，去除 GAS/SV40填充片段。用相同的酶限制性酶切EGR1扩增产物。连接载体和 EGR1启动子。

为了制备细胞培养的96孔板，将2ml包被溶液(I类胶原(Upstate Biotech Inc Cat#08-115)在30％乙醇中的1∶30稀释液(过滤灭菌)) 加入每个10cm平板或96孔板，50ml/孔，空气干燥2小时。

PC12细胞在预先包被的10cm组织培养皿上于含10％马血清(JRH BIOSCIENCES，Cat.#12449-78P)、5％热灭活胎牛血清(FBS)并补充有100 单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养基(Bio Whittaker) 中常规培养。每3-4天按1∶4传代。从平板上刮下细胞并上下吹吸15 次以上将其重悬。

用实施例14所述Lipofectamine法将EGR/SEAP/Neo构建体转染入 PC12。培养细胞于300ug/ml G418中得到EGR-SEAP/PC12稳定细胞。用 无G418培养液进行常规培养，但每1-2个月，细胞应在300ug/ml G418 中再培养多代。

为检验神经活性，去除旧培养液，筛选约70-80％细胞汇合的10cm平 板。用PBS(磷酸缓冲盐水)洗细胞1次。在低血清培养液(含1％马血 清和0.5％FBS并补加抗生素的RPMI-1640)中饥饿培养细胞过夜。

第二天早上，弃培养液并用PBS洗细胞。从平板上刮下细胞，充分悬 浮细胞于2ml低血清培养液中。细胞计数并加入更低浓度血清的培养液 至最终细胞密度为5×10⁵个细胞/ml。

将200ul细胞悬液加入96孔板的各孔中(相当于1×10⁵个细胞/孔)。 加50ul实施例14产生的上清，37℃保温48-72小时。可用已知通过EGR 激活PC12细胞的生长因子作阳性对照，如50ng/ul神经生长因子(NGF)。 在阳性对照孔中一般可观察到超过50倍的SEAP诱导量。按实施例20所 述方法用SEAP检验上清。 实施例19：T-细胞活性的高流通量筛选试验

NF-KB(核因子KB)是可被多种物质，包括炎症细胞因子IL-1和TNF、 CD30和CD40、淋巴毒素α和淋巴毒素β，通过暴露于LPS或凝血酶，和 通过某些病毒基因产物的表达而被激活的转录因子。作为转录因子， NF-KB可调节免疫细胞激活、细胞程序死亡控制(NF-KB似乎可保护细胞 免于程序死亡)、B和T-细胞发育、抗病毒和抗微生物反应和多种应激反 应中涉及的基因表达。

在非刺激条件下，NF-KB与I-KB(抑制剂KB)保持于细胞质中。然而， 在受刺激时，I-KB被磷酸化并降解，引起NF-KB进入核，从而激活靶基 因的转录。可被NF-KB激活的靶基因包括IL-2、IL-6、GM-CSF、ICAM-1 和1类MHC。

由于其重要作用和与多种刺激反应的能力，利用NF-KB启动子元件的 报道基因构建体可用于筛选实施例14产生的上清。NF-KB的激活剂或抑 制剂可用于治疗疾病。例如，NF-KB的抑制剂可用于治疗与急性或慢性 NF-KB活化相关的疾病，如类风湿性关节炎。

为了构建含NF-KB启动子元件的载体，采用了以PCR为基础的方法。 上游引物包含4个NF-KB结合位点(GGGGACTTTCCC)(SEQ ID NO：91) 的串联拷贝，与SV40早期启动子序列5’端互补的18bp长序列，侧翼有 XhoI位点：

5′：GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCG

GGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG：3′(SEQ ID NO：92)

下游引物与SV40启动子的3’端互补且侧翼有HindIII位点：

5′：GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC：3′(SEQ ID NO：93)

用存在于获自Clontech之pB-gal：启动子质粒中的SV40启动子模板 进行PCR扩增。用XhoI和HindIII消化产生的PCR片段并亚克隆入 BLSK2-(Stratagene)。用T7和T3引物测序确认插入片段含以下序列： 5′：CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACT TTCCATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCG CCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGC CTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGA GGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT：3′(SEQ ID NO：88)

然后用XhoI和HindIII，将该NF-KB/SV40片段置换pSEAP2启动子质 粒(Clontech)中的SV40最小启动子元件。不过，此载体不包含新霉素抗 性基因，因此不优选用于哺乳动物表达系统。

为了产生稳定的哺乳动物细胞系，用限制酶SalI和NotI从上述 NF-KB/SEAP载体中去除NF-KB/SV40/SEAP盒，并插入含新霉素抗性的载 体中。特别是，在用限制酶SalI和NotI消化pGFP-1后，将 NF-KB/SV40/SEAP盒插入pGFP-1(Clontech)中置换GFP基因。

一旦产生了NF-KB/SV40/SEAP/Neo载体，即按实施例16所述方法建 立和维持稳定的Jurkat T-细胞。同样地，用这些稳定的Jurkat T-细胞 检验上清的方法也描述于实施例16中。作为阳性对照，将外源TNFα (0.1、1、10ng)加入孔H9、H10和H11中，通常可观察到5-10倍的激 活作用。 实施例20：SEAP活性检测

作为实施例16-19中所述试验的报道分子，按以下通用步骤用Tropix Phospho-light Kit(Cat.BP-400)检测SEAP活性。Tropix Phospho-light Kit提供了以下所用的稀释、检测和反应缓冲液。

预先准备好2.5x稀释缓冲液并分配15ul 2.5x稀释缓冲液至含35ul 上清的Optiplate中。用塑料密封材料密封平板并65℃保温30分钟。隔 开Optiplate以避免不均匀加热。

冷却样品至室温15分钟。倾空分配器并准备好检测缓冲液。加入50ml 检测缓冲液并室温保温5分钟。倾空分配器并准备好反应缓冲液(见下 表)。加入50ul反应缓冲液并室温保温20分钟。因为化学发光信号的强 度是时间依赖性的，在光度计上用大约10分钟读5个平板，所以每次应 处理5个平板，并于10分钟后处理下一组平板。

在光度计上读相对光单位。以H12为空白，打印结果。化学发光度的 增加表明了报道分子的活性。

反应缓冲液配方：

平板号                      Rxn缓冲液稀释剂(ml)

平板号               Rxn缓冲液稀释剂(ml)          CSPD(ml)

  10                 60                           3

  11                 65                           3.25

  12                 70                           3.5

  13                 75                           3.75

  14                 80                           4

  15                 85                           4.25

  16                 90                           4.5

  17                 95                           4.75

  18                 100                          5

  19                 105                          5.25

  20                 110                          5.5

  21                 115                          5.75

  22                 120                          6

  23                 125                          6.25

  24                 130                          6.5

  25                 135                          6.75

  26                 140                          7

  27                 145                          7.25

  28                 150                          7.5

  29                 155                          7.75

     平板号               Rxn缓冲液稀释剂(ml)    CSPD(ml)

       30                   160                    8

       31                   165                    8.25

       32                   170                    8.5

       33                   175                    8.75

       34                   180                    9

       35                   185                    9.25

       36                   190                    9.5

       37                   195                    9.75

       38                   200                    10

       39                   205                    10.25

       40                   210                    10.5

       41                   215                    10.75

       42                   220                    11

       43                   225                    11.25

       44                   230                    11.5

       45                   235                    11.75

       46                   240                    12

       47                   245                    12.25

       48                   250                    12.5

       49                   255                    12.75

       50                   260                    13 实施例21：鉴定小分子浓度和膜渗透性改变的高流通量筛选试验

已知配基与受体的结合可改变如钙、钾、钠之类小分子的细胞内水平 和胞内pH，也可改变膜电位。可在实验中检测这些改变以鉴别可结合特 异细胞的受体的上清。尽管以下方案只描述了用于检测钙的试验，但此 方案可方便地修改后用于检测钾、钠、pH、膜电位或荧光素探针可检测 的任何其他小分子的变化。

以下试验用荧光成像平板读数器(“FLIPR”)检测结合小分子的荧光 分子(Molecular Probes)的改变。显然，任何检测小分子的荧光分子 可用于替代此处所用钙荧光分子，fluo-3。

对于粘附细胞，以10000-20000个细胞/孔的密度接种细胞于底部清 晰的Co-star黑色96-孔板。平板在二氧化碳培养箱中保温20小时。在 Biotek washer中用200ul HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗粘附细胞两次， 最后一次留下100ul缓冲液。

在10％Dluronic acid DMSO中制备1mg/ml fluo-3母液。为了使细胞 带上fluo-3，在各孔中加入50ul 12ug/ml fluo-3。平板在二氧化碳培 养箱中37℃保温60分钟。在Biotek washer中用HBSS洗平板4次，最 后一次留下100ul缓冲液。

对于非粘附细胞，将细胞从培养液中离心下来。在50ml圆锥管中用 HBSS以2-5×10⁶个细胞/ml的密度重悬细胞。将在10％pluronic acid DMSO 中的1mg/ml fluo-3溶液4ul加入每ml细胞悬液中。然后将管放置于37 ℃水浴30-60分钟。用HBSS洗细胞两次，重悬为1×10⁶个细胞/ml，分到 微量滴定板上，100ul/孔。在1000rpm离心平板5分钟。在Denley CellWash中用200ul洗平板1次，然后吸出部分至终体积为100ul。

对于不基于细胞的试验，各孔包含有荧光分子，如fluo-3。将上清加 入各孔中，检测荧光改变。

为了检测细胞内钙的荧光，FLIPR的参数设置如下：(1)系统增益为 300-800mW；(2)曝光时间为0.4秒；(3)相机F数为F/2；(4)激发光 为488nm；(5)发射光为530nm；和(6)加入样品为50ul。在530nm处 发射光值增加显示有由METH1或METH2分子或者被METH1或METH2诱导 的分子引起的细胞外信号事件，导致细胞内Ca⁺⁺浓度的提高。 实施例22：鉴定酪氨酸激酶活性的高流通量筛选试验

蛋白质酪氨酸激酶(PTK)代表了一组不同的跨膜和胞质激酶。在受 体蛋白质酪氨酸激酶(RPTK)组内有有丝分裂和新陈代谢生长因子的受 体，包括PDGF、FGF、EGF、NGF、HGF和胰岛素受体亚家族。此外有一大 的RPTK家族，其相应配基是未知的。RPTK的配基主要包括分泌的小蛋白 质，但也包括膜结合蛋白和胞外基质蛋白。

RPTK被配基激活涉及配基介导的受体二聚化，导致受体亚单位的转磷 酸化作用和胞质酪氨酸激酶的活化。胞质酪氨酸激酶包括src家族的受 体相关酪氨酸激酶(如src、yes、lck、lyn、fyn)和非受体相关及胞质 蛋白质酪氨酸激酶，如Jak家族，其成员介导由受体细胞因子超家族(如 白介素、干扰素、GM-CSF和Leptin)激发的信号转导。

因为能刺激酪氨酸激酶活性的已知因子较多，鉴定METH1或METH2或 者METH1或METH2诱导的分子是否能激活酪氨酸激酶信号转导途径是令 人感兴趣的。因此设计如下方案以鉴定能激活酪氨酸激酶信号转导途径 的这些分子。

以约25000个细胞/孔的密度接种靶细胞(如初级角质细胞)于购自 Nalge Nunc(Naperville，IL)的96孔Loprodyne Silent Screen Plates。 用100％酒精洗平板两次消毒，30分钟/次，再用水洗并干燥过夜。一些 平板用购自Sigma Chemicals(St.Louis，MO)的细胞培养级I类胶原 (50mg/ml)、明胶(2％)或多溶素(50mg/ml)或者购自Becton Dickinson(Bedford，MA)的10％Matrigel，或小牛血清100ml包被2小时， 用PBS洗并存于4℃。这些平板上细胞生长的检测通过接种5000个细胞/ 孔于生长培养液中，48小时后按制造商Alamar Biosciences， Inc.(Sacramento，CA)所述用alamarBlue间接定量确定细胞数量进行。 来自Becton Dickinson(Bedford，MA)的编号#3071的Falcon平板盖用于 覆盖Loprodyne Silent Screen平板。Falcon Microtest III细胞培养 板也可用于一些增殖实验中。

为了制备提取物，将A431细胞接种于Loprodyne板的尼龙膜上 (20000/200ml/孔)并在完全培养基中培养过夜。在无血清的基本培养 液中保温24小时使细胞静止。用EGF(60ng/ml)或实施例14所产生的 上清50ul处理5-20分钟后，弃培养液，并在各孔中加入100ml获自 Boehringer Mannheim(Indiamapolis IN)的提取缓冲液(20mM HEPES pH7.5，0.15M NaCl，1％Triton X-100，0.1％SDS，2mM Na₃VO₄，2mM Na₄P₂O₇和蛋白酶抑制剂混合物(#1836170))，平板在旋转摇床上4℃振荡5分 钟。然后将平板放于真空转移除尘歧管中，用室内真空使提取液滤过各 孔底部的0.45mm膜。在真空除尘歧管底部收集提取液于96孔收集/检验 平板中，立即置于水上。为了得到澄清的提取液，在去垢剂溶解5分钟 后，取各孔中物质并于4℃16000g离心15分钟。

检测滤过提取液的酪氨酸激酶活性水平。尽管已知许多检测酪氨酸激 酶活性的方法，但在此只描述了一种。

通常，通过测定其使特异底物(生物素化肽)中酪氨酸残基磷酸化的 活性来评估上清的酪氨酸激酶活性。可用于此目的的生物素化肽包括 PSK1(相应于细胞分裂激酶cdc2-p34的第6-20位氨基酸)和PSK2(相 应于胃泌素的第1-17位氨基酸)。两肽均为多种酪氨酸激酶的底物并可 购自Boehringer Mannheim。

通过依次加入以下组分进行酪氨酸激酶反应。首先，加入10ul 5uM 生物素化肽，然后是10ul ATP/Mg²⁺(5mM ATP/50mM MgCl₂)、10ul 5x检测 缓冲液(40mM咪唑盐酸，pH7.3，40mM β-甘油磷酸盐，1mM EGTA，100mMMgCl₂，5m MnCl₂，0.5mg/mlBSA)、5ul钒酸钠(1mM)和5ul水。温和混合 这些组分并将反应混合物30℃预热2分钟。加入10ul对照酶或过滤上清 起始反应。

然后加入10ul 120mm EDTA终止酪氨酸激酶测定反应并置于冰上。

通过转移50ul反应混合物的等分试样至微量滴定板(MTP)孔中并37 ℃保温20分钟测定酪氨酸激酶活性。这使得包被链霉亲和素的96孔板 与生物素化肽相连。用300ul/孔的PBS洗MTP孔4次。然后在各孔中加 入偶联有辣根过氧化物酶的抗磷酸酪氨酸抗体(抗-P-Tyr-POD (0.5u/ml))75ul并37℃保温1小时。如上所述洗孔。

加入100ul过氧化物酶底物溶液(Boehringer Mannheim)并室温保 温至少5分钟(最多30分钟)。用ELISA读数器检测样品在405nm的吸 光值。用ELISA读数器定量测定结合过氧化物酶的活性水平，这反映了 酪氨酸激酶的活性水平。 实施例23：鉴定磷酸化作用活性的高流通量筛选试验

作为对实施例22中所述蛋白质酪氨酸激酶活性检测的潜在选择和/或 补充，也可使用检测主要胞内信号转导中间体活化(磷酸化)的试验。 例如，如下所述的特殊实验可检测Erk-1和Erk-2激酶的酪氨酸磷酸化 作用。不过，其它分子，如Raf、JNK、p38MAP、Map激酶激酶(MEK)、 MEK激酶、Src、肌肉特异性激酶(MuSK)、IRAK、Tec和Janus，以及任何 其他磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸分子的磷酸化作用，可通过 在以下实验中用这些分子替代Erk-1或Erk-2而检测。

具体地说，通过用0.1ml蛋白G(1ug/ml)室温(RT)包被96-孔ELISA 平板的孔2小时制备检测平板。平板用PBS洗并以3％BSA/PBS室温封闭1 小时。然后用买来的两种抗Erk-1和Erk-2单克隆抗体(100ng/孔)处理 蛋白G平板(室温1小时)(Santa Cruz Biotechnology)。(为检测其它 分子，此步可通过用可检测任何上述分子的单克隆抗体替代而方便地作 些改动。)用PBS洗3-5次，平板4℃保存待用。

接种A431细胞(20000/孔)于96孔Loprodyne滤板中并在生长培养 液里培养过夜。在基本培养液(DMEM)中饥饿细胞48小时，然后用EGF (6ng/孔)或实施例14所获上清50ul处理5-20分钟。再溶解细胞并直 接过滤提取物到检测板中。

室温保温提取液1小时后，再次洗孔。用购得的MAP激酶制剂(10ng/ 孔)取代A431提取液以做阳性对照。然后用买来的可特异识别Erk-1和 Erk-2激酶磷酸化表位的多克隆(兔)抗体(1ug/ml)处理平板(室温1 小时)。此抗体用标准方法生物素化。然后通过在Wallac DELFIA装置用 铕链霉亲和素和铕荧光增强剂(时间分辨荧光)连续保温来定量测定所 结合的多克隆抗体。超过背景的增强荧光信号表明METH1或METH2或者 METH1或METH2诱导的分子的磷酸化作用。 实施例24：测定METH1或METH2基因中变化的方法

分离来自呈目的表型(如疾病)之整个家族或个别病人的RNA。用本 领域已知方法从这些RNA样品中生产cDNA。(见Sambrook)然后用此cDNA 为PCR模板，应用SEQ ID NO：1中目的区周围的引物。建议的PCR条件 由35个循环组成，每个循环为95℃30秒；52-58℃60-120秒；和70℃ 60-120秒，所用缓冲溶液如Sidransky等，科学252：706(1991)描述。

然后用SequiTherm聚合酶(Epicentre Technologies)测定PCR产 物序列，所用引物在5’端被T4多核苷酸激酶标记。还确定METH1或METH2 之所选外显子的内含子-外显子边界，分析基因组PCR产物以确认结果。 然后将含METH1或METH2中预测突变的PCR产物克隆和测序，以证实直 接测序的结果。

如Holton，T.A.和Graham，M.W.，核酸研究19：1156(1991)所述将 METH1或METH2的PCR产物克隆入T结尾的载体并用T7聚合酶(United States Biochemical)测序。通过未患病个体中不存在的METH1或METH2 的突变而鉴别受影响个体。

测定METH1或METH2基因中改变的方法也可观察到基因组的重排。分 离的基因组克隆用地高辛脱氧尿苷5’-三磷酸(Boehringer Mannheim) 进行缺口翻译，并如Johnson，Cg等，细胞生物学方法35：73-99(1991) 所述完成FISH。为与METH1或METH2基因组位置特异杂交，用大大过量 的人cot-1 DNA进行与标记探针的杂交。

用4，6-二氨基-2-苯基吲哚和碘化丙锭负染染色体，同时产生C-和 R-带。用三波段过滤装置(Chroma Technology，Brattleboro，VT)与冷却 的电荷耦合器件像机(Photometrics，Tucson，AZ)和可变激发波长滤器 获得用于精确绘图的序列对比图象(Johnson Cv.等， Genet.Anal.Tech.Appl.8：75(1991))。用Isee Graphical软件系统 (Inovision Corporation，Durham，NC.)进行图像收集、分析和染色体 部分长度检测。METH1或METH2基因组区域(被探针杂交)的染色体改变 鉴定为插入、缺失和转位。这些METH1或METH2的改变用做相关疾病的 诊断标记。 实施例25：检测生物样品中METH1或METH2异常水平的方法

可在生物样品内检测METH1或METH2多肽，如果检测到METH1或METH2 水平的提高或降低，则此多肽可用做特异表型的标记。检测方法很多， 因此应当理解本领域技术熟练人员可修改以下试验以适合其特殊需要。

例如，抗体夹层ELISA可用于检测样品中的METH1或METH2，优选生 物样品。用抗METH1或METH2的特异抗体包被微量滴定板的孔，终浓度 0.2-10ug/ml。抗体是单克隆或多克隆抗体，可用实施例13所述方法产 生。封闭各孔以使METH1或METH2与孔的非特异结合降低。

然后将包被孔与含METH1或METH2的样品室温保温2小时以上。优选 地，应用样品的系列稀释液证实结果。用去离子水或蒸馏水洗平板3次 以去除未结合METH1或METH2。

下一步，加入浓度为25-400ng的50ul特异抗体-碱性磷酸酶偶联物 并室温保温2小时。用去离子水或蒸馏水再洗平板3次以去除未结合的 偶联物。

加入75ul 4-methylumbelliferyl phosphate(MUP)或对硝基苯基磷酸 (NPP)底物溶液于各孔中并室温保温1小时。用微量滴定板读数器测定 反应。用对照样品的系列稀释液作标准曲线，METH1或METH2多肽浓度绘 于X-轴(对数刻度)而荧光值或吸光值绘于Y-轴(线性刻度)。用标准 曲线得到样品中METH1或METH2的浓度。 实施例26：多肽配制

METH1或METH2组合物将以利于药用的方式配制和给药，需考虑到个 体病人的临床状况(尤其是单独使用METH1或METH2多肽治疗的副作用)、 运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于 本文的目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

作为一般的建议，METH1或METH2的非肠道用的总药学有效量范围是 每剂约1ug-10mg/kg病人体重/天，当然，如上所提及，这将因治疗的个 体差异而不同。更优选的剂量是至少0.01mg/kg/天，对于人来说最优选 的是给予该激素约0.01-1mg/kg/天。若持续给药，METH1或METH2的一 般给药速率是约1-50ug/kg/小时，这或是注射1-4次/天，或是用例如微 型泵持续皮下输注。也可使用静脉内袋溶液。观察到变化所需的治疗时 间和治疗后发生反应的间隔依预期效果而变化。

含METH1或METH2的药物组合物可口服、直肠给药、非肠道给药、脑 池内给药、阴道内给药、腹膜内给药、局部给药(如通过粉剂、药膏、 凝胶、滴剂或经皮片剂)、经颊给药或者口或鼻喷雾剂。。“药学可接受载 体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类 型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉 内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。

METH1或METH2还可通过缓释系统恰当地给药。合适的缓释组合物例 子包括成形颗粒形式的半透性聚合体基质，如薄膜或微胶囊。缓释基质 包括聚交酯(美国专利号3773919，EP58481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L- 谷氨酸酯的共聚物(Sidman，U.等，生物聚合体22：547-556(1983))、 聚(2-羟乙基异丁烯酸酯)(R.Langer等，J.Biomed.Mater.Res. 15：167-277(1981)和R.Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))、乙烯醋 酸乙烯酯(R.Langer等)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133988)。缓释组 合物还包括脂质体包裹的METH1或METH2多肽。用已知的方法制备含 METH1或METH2的脂质体：DE 3218121；Epstein等，美国国家科学院院 报82：3688-3692(1985)；Hwang等，美国国家科学院院报77：4030-4034 (1980)EP 52322；EP 36676；EP 88046；EP 143949：EP 142641；日本 专利申请83-118008；美国专利号4485045和4544545；和EP 102324。 通常脂质体是小的(约200-800埃)单层脂质形式，其中脂含量大于约 30摩尔百分比胆固醇，可调节选择比率以达到最好的分泌多肽疗效。

对于非肠道给药，在一个实施方案中，METH1或METH2的配制通常通 过将其以所需纯度在可注射形式(溶液、悬浮液或乳状液)剂量单位内 与药学可接受载体混合进行，所述载体即在应用剂量和浓度对接受者无 毒性且与配方的其他成分相容的载体。例如，配方优选不包括氧化剂和 已知对多肽有毒的其他化合物。

通常，通过将METH1或METH2均一和密切地与液态载体或精细分散的 固态载体或两者接触而制备制剂。然后，如果需要，可将产物成形为预 期的形状。优选载体是非肠道载体，更优选是与接受者血液等渗的溶液。 这样的载体例子包括水、盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。诸如固定 化油和油酸乙酯之类非水载体也可用于此，脂质体也可使用。

载体可恰当地包含少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。 这样的材料在应用剂量和浓度对接受者无毒性，包括缓冲液，如磷酸、 柠檬酸、琥珀酸和其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低 分子量(少于约10个残基)多肽，如多聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血 清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基 酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、双糖和其他碳水化 合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖(manose)或糊精；螯 合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；抗衡离子，如钠；和/或非离 子表面活性剂，如聚山梨醇酯、poloxamers或PEG。

METH1或METH2一般以约0.1-100mg/ml、优选1-10mg/ml的浓度， pH约3-8配制于这类载体中。应当理解前述一些赋形剂、载体或稳定剂 的使用将导致多肽盐的形成。

治疗用TMEH1或METH2可是无菌的。通过无菌滤膜(0.2um膜)过滤 可方便地完成消毒。治疗用多肽组合物通常置于具无菌入口的容器内， 例如，带有可被皮下注射针头刺穿之塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

METH1或METH2多肽通常以水溶液或用于重熔的冻干状态保存于单或 多剂容器内，例如密封的安锫瓶或小瓶中。作为冻干药品的例子，10ml 小瓶中填充了5ml无菌过滤的1％(w/v)METH1或METH2多肽水溶液，将 产生的混合物冻干。用注射专用抑菌水重溶冻干的METH1或METH2多肽 制备输注溶液。

本发明还提供了含一个或多个容器的药用包装或试剂盒，其中容器中 填充了一种或多种本发明药物组合物的成分。与这些容器一起附具的可 以有管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府管理部门出具的公告， 该公告反映管理部门已批准其生产、使用或销售，以对人给药。此外， METH1或METH2可与其他治疗化合物联合使用。 实施例27：治疗降低水平METH1或METH2的方法

本发明涉及体内需降低METH1或METH2活性水平的个体的治疗方法， 包括对这样的个体施用含治疗有效量METH1或METH2拮抗物的组合物。 优选用于本发明的拮抗物是METH1或METH2特异性抗体。

而且，应当理解，由于个体内标准或者正常METH1或METH2表达水平 降低引起的状况可通过给予METH1或METH2而得到治疗，优选以分泌的 多肽形式给药。此外，本发明还提供了需增加METH1或METH2多肽水平 的个体的治疗方法，包括对这样的个体施用含一定量METH1或METH2的 药物组合物以提高在所说个体中METH1或METH2的活性水平。

例如，具降低水平METH1或METH2多肽的病人可连续6天接受日剂量 0.1-100ug/kg的多肽。优选为分泌形式的多肽。基于给药和配方的精确 用药方案详情如实施例26所提供。 实施例28：治疗增高水平METH1或METH2的方法

本发明还涉及体内需增高METH1或METH2活性水平的个体的治疗方 法，包括对这样的个体施用含治疗有效量METH1或METH2或其激动剂的 组合物。

反义技术可用于抑制METH1或METH2的生产。由于种种病因，如癌症， 此技术是降低METH1或METH2多肽(优选分泌形式)水平的方法的一例 子。

例如，对诊断为METH1或METH2水平异常增高的病人静脉内注射反义 多核苷酸21天，0.5、1.0、1.5、2.0或3.0mg/kg/天。若对此治疗能忍 受，7天检测期后重复此治疗。反义多核苷酸的配方如实施例26所提供。 实施例29：利用基因疗法的治疗方法-离体

基因治疗的一种方法是将能表达METH1或METH2多肽的成纤维细胞移 植到病人体内。将产生的组织置于组织培养液内并分成小片。将组织小 块置于组织培养瓶的湿表面上，约10片/瓶。将小瓶翻转、拧紧并室温 放置过夜。室温24小时后，再将瓶翻过来，保持组织块固定在瓶底并加 入新鲜培养液(如Ham’s F12培养液，含10％FBS、青霉素和链霉素)。然 后将瓶37℃保温约一周。

此时，加入新鲜培养液并随后每隔几天换液。再培养两周后，单层成 纤维细胞出现。用胰蛋白酶消化此单层并放入更大的瓶中。

用EcoRI和HindIII消化侧翼为莫洛尼鼠肉瘤病毒长末端重复片段的 pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA7：219-25(1988))并随后用小牛肠磷 酸酶处理。将线性载体在琼脂糖凝胶上分离并用玻璃珠纯化。

如实施例5所示，用分别相应于5’和3’末端序列的PCR引物扩增编码 METH1或METH2的cDNA。优选5’引物含EcoRI位点而3’引物含HindIII 位点。在存在T4 DNA连接酶的条件下将等量莫洛尼鼠肉瘤病毒线性骨架 和扩增的EcoRI和HindIII片段连接到一起。在适于两片段连接的条件 下保持混合物。然后用连接混合物转化大肠杆菌HB101，再将细菌铺于含 卡那霉素的琼脂板上以确认载体包含正确插入的METH1或METH2。

在含10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)中将双嗜性pA317或GP+am12包装细胞培养于组织 培养物里直到汇合的密度。然后将含METH1或METH2基因的MSV载体加 入培养液中并使其转导包装细胞。这样包装细胞就可生产含METH1或 METH2基因的感染性病毒颗粒(此时包装细胞称为生产者细胞)。

将新鲜培养液加入转导的生产者细胞中，随后从汇合生产者细胞的 10cm板上收获培养基。含感染性病毒颗粒的已耗尽养分的培养基过滤通 过微孔滤器以去除分离的生产者细胞，然后用此培养液感染成纤维细胞。 从成纤维细胞的次汇合平板上去除培养液并迅速换入生产者细胞的培养 液。再去除此培养液并换入新鲜培养液。若病毒滴度高，则几乎所有成 纤维细胞将被感染，无需选择。若滴度很低，则必需利用有选择标记， 如neo或his的逆转录病毒载体。一旦成纤维细胞已有效感染，分析成 纤维以测定METH1或METH2蛋白是否产生。

然后将加工过的成纤维细胞或单独或在cytodex3微载体珠上已生长 至汇合后移植入宿主。 实施例30：利用基因疗法的治疗方法-在体内

本发明的另一方面是用体内基因疗法治疗疾病、疾病和其他状态。基 因疗法涉及将裸核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)METH1或METH2序列 引入动物以增加或减少METH1或METH2多肽的表达。METH1或METH2多核 苷酸可与启动子或靶组织表达METH1或METH2多肽需要的任何其他元件 有效连接。这种基因治疗和运送技术和方法是本领域已知的，见，例如， WO90/11092，WO98/11779；美国专利号5693622、5705151、5580859；Tabata H.等(1997)心血管研究(Cardiovasc.Res.)35(3)：470-479，Chao，J. 等(1997)药理学研究(Pharmacol.Res.)35(6)：517-522，Wolff J.A.(1997) 神经肌肉疾病(Neuromuscul.Disord.)7(5)：314-318，Schwartz，B.等 (1996)基因治疗(Gene Ther.)3(5)：405-411，Tsurumi Y.等(1996) 循环(Circulation)94(12)：3281-3290(在此收编作为参考)。

METH1或METH2多核苷酸构建体可用任何运送可注射物质至动物细胞 的方法运送，如注射入组织间隙(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝、小肠等 等)。METH1或METH2多核苷酸构建体可在药学可接受液态或含水载体内 运送。

术语“裸露的”多核苷酸、DNA或RNA指无其他可辅助、促进或方便 进入细胞的运送载体，包括病毒序列、病毒颗粒制剂、脂质体、脂转染 剂或沉淀剂等的序列。不过，METH1或METH2多核苷酸还可以(如Felgner P.L.等(1995)纽约科学年鉴(Ann.NY Acad.Sci.)772：126-139和 Abdallah B.等(1995)细胞生物学(Biol.Cell)85(1)：1-7里所教导) 以脂质体制剂形式运送，其中脂质体制剂可用本领域技术熟练人员众所 周知的方法制备。

用于基因疗法的METH1或METH2多核苷酸载体构建体优选不整合入宿 主基因组并不含可引起复制的序列的构建体。任何本领域技术熟练人员 已知的强启动子均可用于驱动DNA的表达。与其他的基因治疗技术不同 的是，将裸露核苷酸序列引入靶细胞的一个主要优势是细胞内多核苷酸 合成的瞬时特性。研究表明，非复制DNA序列可引入细胞而在长达6个 月的期间内产生预期多肽。

METH1或METH2多核苷酸构建体可运送到动物组织胞间隙，包括肌肉、 皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、 胰腺、肾、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、 腺体和结缔组织的胞间隙。组织的胞间隙包含细胞间液、器官组织网状 纤维中的粘多糖基质、血管或腔室壁中的弹性纤维、纤维性组织的胶原 纤维或者包盖肌肉细胞的结缔组织或骨腔隙中的同样基质。被循环血浆 和淋巴管的淋巴液占据的空间也可如此。由于以下原因优选向肌肉组织 胞间隙运送。它们可通过注射入含这些细胞的组织而被方便地运送。尽 管在非分化或较少完全分化的细胞，如血液干细胞或皮肤成纤维细胞中 也能达到运送和表达，但它们优选运送和表达于已分化的永久不分裂细 胞。体内肌肉细胞尤其有利用价值，因为它们能吸收和表达多核苷酸。

对于裸露的METH1或METH2多核苷酸注射，DNA或RNA的有效剂量范 围是约0.05g-50mg/kg体重。优选剂量为约0.005-20mg/kg，更优选约 0.05-5mg/kg。当然，正如本领域普通技术人员应理解的，此剂量依注射 的组织位点而变化。核苷酸序列的恰当和有效剂量可由本领域普通技术 人员很容易测定，并可能决定于待治疗的疾病和给药途经。优选的给药 途经是非肠道注射入组织的胞间隙。不过，其他的非肠道途经也可采用， 如，吸入喷雾剂，对于向肺或支气管组织、咽喉或鼻黏膜的运送更是如 此。此外，裸露的METH1或METH2多核苷酸构建体可在血管成形术中通 过该项手术中使用的导管运送到动脉处。

体内肌肉中被注射METH1或METH2多核苷酸的剂量反应测定如下。按 标准重组DNA方法制备用于生产编码METH1或METH2多肽之mRNA的恰当 METH1或METH2模板DNA。环状或线性的模板DNA以裸露DNA形式或与脂 质体复合使用。然后用多种剂量的模板DNA注射小鼠四头肌。

用0.3ml 2.5％Avertin腹膜内注射麻醉5-6周大的雌性和雄性Balb/C 小鼠。在前腿处切一1.5cm切口，四头肌直接可见。将于0.1ml载体内 的METH1或METH2模板DNA用1cc注射器通过27号针头从离肌肉远端插 入位点约0.5cm处注射入膝盖约0.2cm深，注射1分钟以上。缝合线留 在注射位点处以便将来定位，皮肤用不锈钢钳闭合。

适当保温后(如7天)，切开整个四头肌制备肌肉提取物。对各四头 肌的每第5个15um横切片进行组织化学染色，分析METH1或METH2蛋白 质的表达。有关METH1或METH2蛋白质的表达时间的试验也可用类似方 式进行，只是在不同时间收获不同小鼠的四头肌这一点上不同。注射后 肌肉内METH1或METH2 DNA的保持可在从被注射小鼠和对照小鼠中制备 总细胞DNA和HIRT上清后用DNA印迹分析进行测定。以上小鼠中的实验 结果可用于推断在人和其他动物中使用METH1或METH2裸露DNA的正确 剂量和其他治疗参数。

应当清楚除以上描述和实施例之外，本发明还可以其它方式实施。

根据上文教导，可以对本发明进行多种修饰和改变，因此，它们也在 附加的权利要求范围内。

此处引用的所有出版物的全部内容(包括专利、专利申请、期刊杂志、 实验室手册、书或其他文件)均收编作为参考。

                              序列表 <110>Iruela-Arispe，Luisa

 Hastings，Gregg A.

 Ruben，Steven M. <120>Meth1和Meth2多核苷酸及多肽 <130>1488.107CN02 <140> <141> <150>US 60/072,298 <151>1998-01-23 <150>US 60/098,539 <151>1998-08-28 <160>93 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>3261 <212>DNA <213>人 <220> <221>CDS <222>(1)..(2853) <220> <221>不确定 <222>(3095) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(3248) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(3255) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(3261) <223>可能是任何核酸 <400>1 atg ggg aac gcg gag cgg gct ccg ggg tct cgg agc ttt ggg ccc gta      48 Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser Arg Ser Phe Gly Pro Val   1               5                  10                  15 ccc acg ctg ctg ctg ctc gcc gcg gcg cta ctg gcc gtg tcg gac gca    96 Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ala Val Ser Asp Ala

         20                   25                 30 ctc ggg cgc ccc tcc gag gag gac gag gag cta gtg gtg ccg gag ctg    144 Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu Leu Val Val Pro Glu Leu

     35                  40                  45 gag cgc gcc ccg gga cac ggg acc acg cgc ctc cgc ctg cac gcc ttt    192 Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg Leu Arg Leu His Ala Phe

 50                  55                  60 gac cag cag ctg gat ctg gag ctg cgg ccc gac agc agc ttt ttg gcg    240 Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro Asp Ser Ser Phe Leu Ala  65                  70                  75                  80 ccc ggc ttc acg ctc cag aac gtg ggg cgc aaa tcc ggg tcc gag acg    288 Pro Gly Phe Thr Leu Gln Asn Val Gly Arg Lys Ser Gly Ser Glu Thr

             85                  90                  95 ccg ctt ccg gaa acc gac ctg gcg cac tgc ttc tac tcc ggc acc gtg    336 Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys Phe Tyr Ser Gly Thr Val

        100                 105                 1l0 aat ggc gat ccc agc tcg gct gcc gcc ctc agc ctc tgc gag ggc gtg    384 Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Glu Gly Val

    115                 120                 125 cgc ggc gcc ttc tac ctg ctg ggg gag gcg tat ttc atc cag ccg ctg    432 Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala Tyr Phe Ile Gln Pro Leu

130                 135                 140 ccc gcc gcc agc gag cgc ctc gcc acc gcc gcc cca ggg gag aag ccg    480 Pro Ala Ala Ser Glu Arg Leu Ala Thr Ala Ala Pro Gly Glu Lys Pro 145                 150                 155                 160 ccg gca cca cta cag ttc cac ctc ctg cgg cgg aat cgg cag ggc gac    528 Pro Ala Pro Leu Gln Phe His Leu Leu Arg Arg Asn Arg Gln Gly Asp

            165                  170                175 gta ggc ggc acg tgc ggg gtc gtg gac gac gag ccc cgg ccg act ggg    576 Val Gly Gly Thr Cys Gly Val Val Asp Asp Glu Pro Arg Pro Thr Gly

        180                 185                 190 aaa gcg gag acc gaa gac gag gac gaa ggg act gag ggc gag gac gaa    624 Lys Ala Glu Thr Glu Asp Glu Asp Glu Gly Thr Glu Gly Glu Asp Glu

    195                 200                 205 ggg cct cag tgg tcg ccg cag gac ccg gca ctg caa ggc gta gga cag    672 Gly Pro Gln Trp Ser Pro Gln Asp Pro Ala Leu Gln Gly Val Gly Gln

210                 215                 220 ccc aca gga act gga agc ata aga aag aag cga ttt gtg tcc agt cac    720 Pro Thr Gly Thr Gly Ser Ile Arg Lys Lys Arg Phe Val Ser Ser His 225                 230                 235                 240 cgc tat gtg gaa acc atg ctt gtg gca gac cag tcg atg gca gaa ttc    768 Arg Tyr Val Glu Thr Met Leu Val Ala Asp Gln Ser Met Ala Glu Phe

            245                 250                 255 cac ggc agt ggt cta aag cat tac ctt ctc acg ttg ttt tcg gtg gca    816 His Gly Ser Gly Leu Lys His Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Ser Val Ala

        260                 265                 270 gcc aga ttg tac aaa cac ccc agc att cgt aat tca gtt agc ctg gtg    864 Ala Arg Leu Tyr Lys His Pro Ser Ile Arg Asn Ser Val Ser Leu Val

    275                 280                 285 gtg gtg aag atc ttg gtc atc cac gat gaa cag aag ggg ccg gaa gtg    912 Val Val Lys Ile Leu Val Ile His Asp Glu Gln Lys Gly Pro Glu Val

290                 295                 300 acc tcc aat gct gcc ctc act ctg cgg aac ttt tgc aac tgg cag aag    960 Thr Ser Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Lys 305                 310                 315                 320 cag cac aac cca ccc agt gac cgg gat gca gag cac tat gac aca gca    1008 Gln His Asn Pro Pro Ser Asp Arg Asp Ala Glu His Tyr Asp Thr Ala

            325                 330                 335 att ctt ttc acc aga cag gac ttg tgt ggg tcc cag aca tgt gat act    1056 Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Ser Gln Thr Cys Asp Thr

        340                 345                 350 ctt ggg atg gct gat gtt gga act gtg tgt gat ccg agc aga agc tgc    1104 Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp Pro Ser Arg Ser Cys

    355                 360                 365 tcc gtc ata gaa gat gat ggt tta caa gct gcc ttc acc aca gcc cat    1152 Ser Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ala Ala Phe Thr Thr Ala His

370                 375                 380 gaa tta ggc cac gtg ttt aac atg cca cat gat gat gca aag cag tgt    1200 Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp Asp Ala Lys Gln Cys 385                 390                 395                 400 gcc agc ctt aat ggt gtg aac cag gat tcc cac atg atg gcg tca atg    1248 Ala Ser Leu Asn Gly Val Asn Gln Asp Ser His Met Met Ala Ser Met

            405                 410                 415 ctt tcc aac ctg gac cac agc cag cct tgg tct cct tgc agt gcc tac    1296 Leu Ser Asn Leu Asp His Ser Gln Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Tyr

        420                 425                 430 atg att aca tca ttt ctg gat aat ggt cat ggg gaa tgt ttg atg gac    1344 Met Ile Thr Ser Phe Leu Asp Asn Gly His Gly Glu Cys Leu Met Asp

    435                 440                 445 aag cct cag aat ccc ata cag ctc cca ggc gat ctc cct ggc acc tcg    1392 Lys Pro Gln Asn Pro Ile Gln Leu Pro Gly Asp Leu Pro Gly Thr Ser

450                 455                 460 tac gat gcc aac cgg cag tgc cag ttt aca ttt ggg gag gac tcc aaa    1440 Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Cys Gln Phe Thr Phe Gly Glu Asp Ser Lys 465                 470                 475                 480 cac tgc cct gat gca gcc agc aca tgt agc acc ttg tgg tgt acc ggc    1488 His Cys Pro Asp Ala Ala Ser Thr Cys Ser Thr Leu Trp Cys Thr Gly

            485                 490                 495 acc tct ggt ggg gtg ctg gtg tgt caa acc aaa cac ttc ccg tgg gcg    1536 Thr Ser Gly Gly Val Leu Val Cys Gln Thr Lys His Phe Pro Trp Ala

        500                 505                 510 gat ggc acc agc tgt gga gaa ggg aaa tgg tgt atc aac ggc aag tgt    1584 Asp Gly Thr Ser Cys Gly Glu Gly Lys Trp Cys Ile Asn Gly Lys Cys

    515                 520                 525 gtg aac aaa acc gac aga aag cat ttt gat acg cct ttt cat gga agc    1632 Val Asn Lys Thr Asp Arg Lys His Phe Asp Thr Pro Phe His Gly Ser    530                  535                 540 tgg gga atg tgg ggg cct tgg gga gac tgt tcg aga acg tgc ggt gga    1680 Trp Gly Met Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly 545                 550                 555                 560 gga gtc cag tac acg atg agg gaa tgt gac aac cca gtc cca aag aat    1728 Gly Val Gln Tyr Thr Met Arg Glu Cys Asp Asn Pro Val Pro Lys Asn

            565                 570                 575 gga ggg aag tac tgt gaa ggc aaa cga gtg cgc tac aga tcc tgt aac    1776 Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Lys Arg Val Arg Tyr Arg Ser Cys Asn

        580                 585                  590 ctt gag gac tgt cca gac aat aat gga aaa acc ttt aga gag gaa caa    1824 Leu Glu Asp Cys Pro Asp Asn Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Glu Gln

    595                 600                 605 tgt gaa gca cac aac gag ttt tca aaa gct tcc ttt ggg agt ggg cct    1872 Cys Glu Ala His Asn Glu Phe Ser Lys Ala Ser Phe Gly Ser Gly Pro

610                 615                 620 gcg gtg gaa tgg att ccc aag tac gct ggc gtc tca cca aag gac agg    1920 Ala Val Glu Trp Ile Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Lys Asp Arg 625                 630                 635                 640 tgc aag ctc atc tgc caa gcc aaa ggc att ggc tac ttc ttc gtt ttg    1968 Cys Lys Leu Ile Cys Gln Ala Lys Gly Ile Gly Tyr Phe Phe Val Leu

            645                 650                 655 cag ccc aag gtt gta gat ggt act cca tgt agc cca gat tcc acc tct    2016 Gln Pro Lys Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Thr Ser

        660                 665                 670 gtc tgt gtg caa gga cag tgt gta aaa gct ggt tgt gat cgc atc ata    2064 Val Cys Val Gln Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile

    675                 680                 685 gac tcc aaa aag aag ttt gat aaa tgt ggt gtt tgc ggg gga aat gga    2112 Asp Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asn Gly

690                 695                 700 tct act tgt aaa aaa ata tca gga tca gtt act agt gca aaa cct gga    2160 Ser Thr Cys Lys Lys Ile Ser Gly Ser Val Thr Ser Ala Lys Pro Gly 705                 710                 715                 720 tat cat gat atc atc aca att cca act gga gcc acc aac atc gaa gtg    2208 Tyr His Asp Ile Ile Thr Ile Pro Thr Gly Ala Thr Asn Ile Glu Val

            725                 730                 735 aaa cag cgg aac cag agg gga tcc agg aac aat ggc agc ttt ctt gcc    2256 Lys Gln Arg Asn Gln Arg Gly Ser Arg Asn Asn Gly Ser Phe Leu Ala

        740                 745                 750 atc aaa gct gct gat ggc aca tat att ctt aat ggt gac tac act ttg    2304 Ile Lys Ala Ala Asp Gly Thr Tyr Ile Leu Asn Gly Asp Tyr Thr Leu

    755                 760                 765 tcc acc tta gag caa gac att atg tac aaa ggt gtt gtc ttg agg tac    2352 Ser Thr Leu Glu Gln Asp Ile Met Tyr Lys Gly Val Val Leu Arg Tyr

770                 775                 780 agc ggc tcc tct gcg gca ttg gaa aga att cgc agc ttt agc cct ctc    2400 Ser Gly Ser Ser Ala Ala Leu Glu Arg Ile Arg Ser Phe Ser Pro Leu 785                 790                 795                 800 aaa gag ccc ttg acc atc cag gtt ctt act gtg ggc aat gcc ctt cga    2448 Lys Glu Pro Leu Thr Ile Gln Val Leu Thr Val Gly Asn Ala Leu Arg

            805                 810                 815 cct aaa att aaa tac acc tac ttc gta aag aag aag aag gaa tct ttc    2496 Pro Lys Ile Lys Tyr Thr Tyr Phe Val Lys Lys Lys Lys Glu Ser Phe

        820                 825                 830 aat gct atc ccc act ttt tca gca tgg gtc att gaa gag tgg ggc gaa    2544 Asn Ala Ile Pro Thr Phe Ser Ala Trp Val Ile Glu Glu Trp Gly Glu

    835                 840                 845 tgt tct aag tca tgt gaa ttg ggt tgg cag aga aga ctg gta gaa tgc    2592 Cys Ser Lys Ser Cys Glu Leu Gly Trp Gln Arg Arg Leu Val Glu Cys

850                 855                 860     cga gac att aat gga cag cct gct tcc gag tgt gca aag gaa gtg aag    2640 Arg Asp Ile Asn Gly Gln Pro Ala Ser Glu Cys Ala Lys Glu Val Lys 865                 870                 875                 880 cca gcc agc acc aga cct tgt gca gac cat ccc tgc ccc cag tgg cag    2688 Pro Ala Ser Thr Arg Pro Cys Ala Asp His Pro Cys Pro Gln Trp Gln

            885                 890                 895 ctg ggg gag tgg tca tca tgt tct aag acc tgt ggg aag ggt tac aaa    2736 Leu Gly Glu Trp Ser Ser Cys Ser Lys Thr Cys Gly Lys Gly Tyr Lys

        900                 905                 910 aaa aga agc ttg aag tgt ctg tcc cat gat gga ggg gtg tta tct cat    2784 Lys Arg Ser Leu Lys Cys Leu Ser His Asp Gly Gly Val Leu Ser His

    915                 920                 925 gag agc tgt gat cct tta aag aaa cct aaa cat ttc ata gac ttt tgc    2832 Glu Ser Cys Asp Pro Leu Lys Lys Pro Lys His Phe Ile Asp Phe Cys

930                 935                 940 aca atg gca gaa tgc agt taa gtggtttaag tggtgttagc tttgaggcaa       2883 Thr Met Ala Glu Cys Ser 945                 950 ggcaaagtga ggaagggctg gtgcagggaa agcaagaagg ctggagggat ccagcgtatc  2943 ttgccagtaa ccagtgaggt gtatcagtaa ggtgggatta tgggggtaga tagaaaagga  3003 gttgaatcat cagagtaaac tgccagttgc aaatttgata ggatagttag tgaggattat  3063 taacctctga gcagtgatat agcataataa anccccgggc attattatta ttatttcttt  3123 tgttacatct attacaagtt tagaaaaaac aaagcaattg tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa  3183 aaaaaaaaaa aaagggcggc cgctctagag gatccctcga ggggcccaag cttacgcgtg  3243 catgntgtca tnagtctn                                                3261 <210>2 <211>950 <212>PRT <213>人 <400>2 Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser Arg Ser Phe Gly Pro Val   1               5                  10                  15 Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ala Val Ser Asp Ala

         20                  25                  30 Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu Leu Val Val Pro Glu Leu

     35                  40                  45 Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg Leu Arg Leu His Ala Phe

 50                  55                  60 Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro Asp Ser Ser Phe Leu Ala  65                  70                  75                  80 Pro Gly Phe Thr Leu Gln Asn Val Gly Arg Lys Ser Gly Ser Glu Thr

             85                  90                  95  Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys Phe Tyr Ser Gly Thr Val

        100                 105                 110 Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Glu Gly Val

    115                 120                 125 Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala Tyr Phe Ile Gln Pro Leu

130                 135                 140 Pro Ala Ala Ser Glu Arg Leu Ala Thr Ala Ala Pro Gly Glu Lys Pro 145                 150                 155                 160 Pro Ala Pro Leu Gln Phe His Leu Leu Arg Arg Asn Arg Gln Gly Asp

            165                 170                 175 Val Gly Gly Thr Cys Gly Val Val Asp Asp Glu Pro Arg Pro Thr Gly

        180                 185                 190 Lys Ala Glu Thr Glu Asp Glu Asp Glu Gly Thr Glu Gly Glu Asp Glu

    195                 200                 205 Gly Pro Gln Trp Ser Pro Gln Asp Pro Ala Leu Gln Gly Val Gly Gln

210                 215                 220 Pro Thr Gly Thr Gly Ser Ile Arg Lys Lys Arg Phe Val Ser Ser His 225                 230                 235                 240 Arg Tyr Val Glu Thr Met Leu Val Ala Asp Gln Ser Met Ala Glu Phe

            245                 250                 255 His Gly Ser Gly Leu Lys His Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Ser Val Ala

        260                 265                 270 Ala Arg Leu Tyr Lys His Pro Ser Ile Arg Asn Ser Val Ser Leu Val

    275                 280                 285 Val Val Lys Ile Leu Val Ile His Asp Glu Gln Lys Gly Pro Glu Val

290                 295                 300 Thr Ser Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Lys 305                 310                 315                 320 Gln His Asn Pro Pro Ser Asp Arg Asp Ala Glu His Tyr Asp Thr Ala

            325                 330                 335 Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Ser Gln Thr Cys Asp Thr

        340                 345                 350 Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp Pro Ser Arg Ser Cys

    355                 360                 365 Ser Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ala Ala Phe Thr Thr Ala His

370                 375                 380 Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp Asp Ala Lys Gln Cys 385                 390                 395                 400 Ala Ser Leu Asn Gly Val Asn Gln Asp Ser His Met Met Ala Ser Met

            405                 410                 415 Leu Ser Asn Leu Asp His Ser Gln Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Tyr

        420                 425                 430 Met Ile Thr Ser Phe Leu Asp Asn Gly His Gly Glu Cys Leu Met Asp

    435                 440                 445 Lys Pro Gln Asn Pro Ile Gln Leu Pro Gly Asp Leu Pro Gly Thr Ser

450                 455                 460 Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Cys Gln Phe Thr Phe Gly Glu Asp Ser Lys 465                 470                 475                 480 His Cys Pro Asp Ala Ala Ser Thr Cys Ser Thr Leu Trp Cys Thr Gly

            485                 490                 495 Thr Ser Gly Gly Val Leu Val Cys Gln Thr Lys His Phe Pro Trp Ala

        500                 505                 510 Asp Gly Thr Ser Cys Gly Glu Gly Lys Trp Cys Ile Asn Gly Lys Cys

    515                 520                 525 Val Asn Lys Thr Asp Arg Lys His Phe Asp Thr Pro Phe His Gly Ser

530                 535                 540 Trp Gly Met Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly 545                 550                 555                 560 Gly Val Gln Tyr Thr Met Arg Glu Cys Asp Asn Pro Val Pro Lys Asn

            565                 570                 575 Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Lys Arg Val Arg Tyr Arg Ser Cys Asn

        580                 585                 590 Leu Glu Asp Cys Pro Asp Asn Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Glu Gln

    595                 600                 605 Cys Glu Ala His Asn Glu Phe Ser Lys Ala Ser Phe Gly Ser Gly Pro

610                 615                 620 Ala Val Glu Trp Ile Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Lys Asp Arg 625                 630                 635                 640 Cys Lys Leu Ile Cys Gln Ala Lys Gly Ile Gly Tyr Phe Phe Val Leu

            645                 650                 655 Gln Pro Lys Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Thr Ser

        660                 665                 670 Val Cys Val Gln Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile

    675                 680                 685 Asp Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asn Gly

690                 695                 700 Ser Thr Cys Lys Lys Ile Ser Gly Ser Val Thr Ser Ala Lys Pro Gly 705                 710                 715                 720 Tyr His Asp Ile Ile Thr Ile Pro Thr Gly Ala Thr Asn Ile Glu Val

            725                 730                 735 Lys Gln Arg Asn Gln Arg Gly Ser Arg Asn Asn Gly Ser Phe Leu Ala

        740                 745                 750 Ile Lys Ala Ala Asp Gly Thr Tyr Ile Leu Asn Gly Asp Tyr Thr Leu

    755                 760                 765 Ser Thr Leu Glu Gln Asp Ile Met Tyr Lys Gly Val Val Leu Arg Tyr

770                 775                 780 Ser Gly Ser Ser Ala Ala Leu Glu Arg Ile Arg Ser Phe Ser Pro Leu 785                 790                 795                 800 Lys Glu Pro Leu Thr Ile Gln Val Leu Thr Val Gly Asn Ala Leu Arg

            805                 810                 815 Pro Lys Ile Lys Tyr Thr Tyr Phe Val Lys Lys Lys Lys Glu Ser Phe

        820                 825                 830 Asn Ala Ile Pro Thr Phe Ser Ala Trp Val Ile Glu Glu Trp Gly Glu

    835                 840                 845 Cys Ser Lys Ser Cys Glu Leu Gly Trp Gln Arg Arg Leu Val Glu Cys

850                 855                 860 Arg Asp Ile Asn Gly Gln Pro Ala Ser Glu Cys Ala Lys Glu Val Lys 865                 870                 875                 880 Pro Ala Ser Thr Arg Pro Cys Ala Asp His Pro Cys Pro Gln Trp Gln

            885                 890                 895 Leu Gly Glu Trp Ser Ser Cys Ser Lys Thr Cys Gly Lys Gly Tyr Lys

        900                 905                 910 Lys Arg Ser Leu Lys Cys Leu Ser His Asp Gly Gly Val Leu Ser His

    915                 920                 925 Glu Ser Cys Asp Pro Leu Lys Lys Pro Lys His Phe Ile Asp Phe Cys

930                 935                 940 Thr Met Ala Glu Cys Ser 945                 950 <210>3 <211>3008 <212>DNA <213>人 <220> <221>CDS <222>(1)..(2670) <220> <22l>不确定 <222>(2887) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(2957) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(2970) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(2981) <223>可能是任何核酸 <400>3 atg ttc ccc gcc ccc gcc gcc ccc cgg tgg ctt ccg ttc ctg ctg ctg    48 Met Phe Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Trp Leu Pro Phe Leu Leu Leu   1               5                  10                  15 ctg ctg ctg ctg ctg ctg ccg ctg gcc cgc ggc gcc ccg gcc cgg ccc    96 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Arg Gly Ala Pro Ala Ara Pro

         20                  25                  30 gca gcc ggg ggg cag gcc tcg gag ctg gtg gtg ccc acg cgg ttg ccc    144 Ala Ala Gly Gly Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Pro Thr Arg Leu Pro

     35                  40                  45 ggc agc gcg ggc gag ctc gcg ctc cac ctg tcc gcc ttc ggc aag ggc    192 Gly Ser Ala Gly Glu Leu Ala Leu His Leu Ser Ala Phe Gly Lys Gly

 50                  55                  60 ttc gtg ttg cgc ctg gcg ccc gac gac agc ttc ctg gcg ccc gag ttc    240 Phe Val Leu Arg Leu Ala Pro Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro Glu Phe  65                  70                  75                  80 aag atc gag cgc ctc ggg ggc tcc ggc cgg gcg acc ggg ggc gag cgg    288 Lys Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ala Thr Gly Gly Glu Arg

             85                  90                  95 ggg ctg cgc ggc tgt ttt ttt tcc ggc acc gtg aat ggg gag ccc gag    336 Gly Leu Arg Gly Cys Phe Phe Ser Gly Thr Val Asn Gly Glu Pro Glu

        100                 105                 110 tcg ctg gcg gcg gtc agc ctg tgc cgc ggg ctg agc ggc tcc ttc ctg    384 Ser Leu Ala Ala Val Ser Leu Cys Arg Gly Leu Ser Gly Ser Phe Leu

    115                 120                 125 ctg gac ggc gag gag ttc acc atc cag ccg cag ggc gcg ggg ggc tcc    432 Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Ile Gln Pro Gln Gly Ala Gly Gly Ser

130                 135                 140 ctg gct cag ccg cac cgc ctg cag cgc tgg ggt ccc gcc gga gcc cgc    480 Leu Ala Gln Pro His Arg Leu Gln Arg Trp Gly Pro Ala Gly Ala Arg 145                 150                 155                 160 ccc ctc ccg cga gga ccc gag tgg gag gtg gag acg gga gag ggt cag    528 Pro Leu Pro Arg Gly Pro Glu Trp Glu Val Glu Thr Gly Glu Gly Gln

            165                 170                 175 agg cag gag aga gga gac cac cag gag gac agc gag gag gag agc caa    576 Arg Gln Glu Arg Gly Asp His Gln Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ser Gln

        180                 185                 190 gaa gag gag gca gaa ggc gct agc gag ccg cca ccg ccc ctg ggg gcc    624 Glu Glu Glu Ala Glu Gly Ala Ser Glu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala

    195                 200                 205 acg agt agg acc aag cgg ttt gtg tct gag gcg cgc ttc gtg gag acg    672 Thr Ser Arg Thr Lys Arg Phe Val Ser Glu Ala Arg Phe Val Glu Thr

210                 215                 220 ctg ctg gtg gcc gat gcg tcc atg gct gcc ttc tac ggg gcc gac ctg    720 Leu Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Tyr Gly Ala Asp Leu 225                 230                 235                 240 cag aac cac atc ctg acg tta atg tct gtg gca gcc cga atc tac aag    768 Gln Asn His Ile Leu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Arg Ile Tyr Lys

            245                 250                 255 cac ccc agc atc aag aat tcc atc aac ctg atg gtg gta aaa gtg ctg    816 His Pro Ser Ile Lys Asn Ser Ile Asn Leu Met Val Val Lys Val Leu

        260                 265                 270 atc gta gaa gat gaa aaa tgg ggc cca gag gtg tcc gac aat ggg ggg    864 Ile Val Glu Asp Glu Lys Trp Gly Pro Glu Val Ser Asp Asn Gly Gly

    275                 280                 285 ctt acg ctg cgt aac ttc tgc aac tgg cag cgg cgt ttc aac cag ccc    912 Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Arg Arg Phe Asn Gln Pro

290                 295                 300 agc gac cgc cac cca gag cac tac gac acg gcc atc ctg ctc acc aga    960 Ser Asp Arg His Pro Glu His Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg 305                 310                 315                 320 cag aac ttc tgt ggg cag gag ggg ctg tgt gac acc ctg ggt gtg gca    1008 Gln Asn Phe Cys Gly Gln Glu Gly Leu Cys Asp Thr Leu Gly Val Ala

            325                 330                 335 gac atc ggg acc att tgt gac ccc aac aaa agc tgc tcc gtg atc gag    1056 Asp Ile Gly Thr Ile Cys Asp Pro Asn Lys Ser Cys Ser Val Ile Glu

        340                 345                 350 gat gag ggg ctc cag gcg gcc cac acc ctg gcc cat gaa cta ggg cac    1104 Asp Glu Gly Leu Gln Ala Ala His Thr Leu Ala His Glu Leu Gly His

    355                 360                 365 gtc ctc agc atg ccc cac gac gac tcc aag ccc tgc aca cgg ctc ttc    1152 Val Leu Ser Met Pro His Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Arg Leu Phe

370                 375                 380 ggg ccc atg ggc aag cac cac gtg atg gca ccg ctg ttc gtc cac ctg    1200 Gly Pro Met Gly Lys His His Val Met Ala Pro Leu Phe Val His Leu 385                 390                 395                 400 aac cag acg ctg ccc tgg tcc ccc tgc agc gcc atg tat ctc aca gag    1248 Asn Gln Thr Leu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Met Tyr Leu Thr Glu

            405                 410                 415 ctt ctg gac ggc ggg cac gga gac tgt ctc ctg gat gcc cct ggt gcg    1296 Leu Leu Asp Gly Gly His Gly Asp Cys Leu Leu Asp Ala Pro Gly Ala

        420                 425                 430 gcc ctg ccc ctc ccc aca ggc ctc ccg ggc cgc atg gcc ctg tac cag    1344 Ala Leu Pro Leu Pro Thr Gly Leu Pro Gly Arg Met Ala Leu Tyr Gln

    435                 440                 445 ctg gac cag cag tgc agg cag atc ttt ggg ccg gat ttc cgc cac tgc    1392 Leu Asp Gln Gln Cys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Asp Phe Arg His Cys

450                 455                 460 ccc aac acc tct gct cag gac gtc tgc gcc cag ctt tgg tgc cac act    1440 Pro Asn Thr Ser Ala Gln Asp Val Cys Ala Gln Leu Trp Cys His Thr 465                 470                 475                 480 gat ggg gct gag ccc ctg tgc cac acg aag aat ggc agc ctg ccc tgg    1488 Asp Gly Ala Glu Pro Leu Cys His Thr Lys Asn Gly Ser Leu Pro Trp

            485                 490                 495 gct gac ggc acg ccg tgc ggg cct ggg cac ctc tgc tca gaa ggc agc    1536 Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser

        500                 505                 510 tgt cta cct gag gag gaa gtg gag agg ccc aag ccc gtg gta gat gga    1584 Cys Leu Pro Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Val Val Asp Gly

    515                 520                 525 ggc tgg gca ccg tgg gga ccc tgg gga gaa tgt tct cgg acc tgt gga    1632 Gly Trp Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly

530                 535                 540 gga gga gta cag ttt tca cac cgt gag tgc aag gac ccc gag cct cag    1680 Gly Gly Val Gln Phe Ser His Arg Glu Cys Lys Asp Pro Glu Pro Gln 545                 550                 555                 560 aat gga gga aga tac tgc ctg ggt cgg aga gcc aag tac cag tca tgc    1728 Asn Gly Gly Arg Tyr Cys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Tyr Gln Ser Cys

            565                 570                 575 cac acg gag gaa tgc ccc cct gac ggg aaa agc ttc agg gag cag cag    1776 His Thr Glu Glu Cys Pro Pro Asp Gly Lys Ser Phe Arg Glu Gln Gln

        580                 585                 590 tgt gag aag tat aat gcc tac aat tac act gac atg gac ggg aat ctc    1824 Cys Glu Lys Tyr Asn Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Met Asp Gly Asn Leu

    595                 600                 605 ctg cag tgg gtc ccc aag tat gct ggg gtg tcc ccc cgg gac cgc tgc    1872 Leu Gln Trp Val Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Arg Asp Arg Cys

610                 615                 620 aag ttg ttc tgc cga gcc cgg ggg agg agc gag ttc aaa gtg ttc gag    1920 Lys Leu Phe Cys Arg Ala Arg Gly Arg Ser Glu Phe Lys Val Phe Glu 625                 630                 635                 640 gcc aag gtg att gat ggc acc ctg tgt ggg cca gaa aca ctg gcc atc    1968 Ala Lys Val Ile Asp Gly Thr Leu Cys Gly Pro Glu Thr Leu Ala Ile

            645                 650                 655 tgt gtc cgt ggc cag tgt gtc aag gcc ggc tgt gac cat gtg gtg gac    2016 Cys Val Arg Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp His Val Val Asp

        660                 665                 670 tcg cct cgg aag ctg gac aaa tgc ggg gtg tgt ggg ggc aaa ggc aac    2064 Ser Pro Arg Lys Leu Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Lys Gly Asn

    675                 680                 685 tcc tgc agg aag gtc tcc ggg tcc ctc acc ccc acc aat tat ggc tac    2112 Ser Cys Arg Lys Val Ser Gly Ser Leu Thr Pro Thr Asn Tyr Gly Tyr

690                 695                 700 aat gac att gtc acc atc cca gct ggt gcc act aat att gac gtg aag    2160 Asn Asp Ile Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Asn Ile Asp Val Lys 705                 710                 715                 720 cag cgg agc cac ccg ggt gtg cag aac gat ggg aac tac ctg gcg ctg    2208 Gln Arg Ser His Pro Gly Val Gln Asn Asp Gly Asn Tyr Leu Ala Leu

            725                 730                 735 aag acg gct gat ggg cag tac ctg ctc aac ggc aac ctg gcc atc tct    2256 Lys Thr Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ile Ser

        740                 745                 750 gcc ata gag cag gac atc ttg gtg aag ggg acc atc ctg aag tac agc    2304 Ala Ile Glu Gln Asp Ile Leu Val Lys Gly Thr Ile Leu Lys Tyr Ser

    755                 760                 765 ggc tcc atc gcc acc ctg gag cgc ctg cag agc ttc cgg ccc ttg cca    2352 Gly Ser Ile Ala Thr Leu Glu Arg Leu Gln Ser Phe Arg Pro Leu Pro

770                 775                 780 gag cct ctg aca gtg cag ctc ctg aca gtc cct ggc gag gtc ttc ccc    2400 Glu Pro Leu Thr Val Gln Leu Leu Thr Val Pro Gly Glu Val Phe Pro 785                 790                 795                 800 cca aaa gtc aaa tac acc ttc ttt gtt cct aat gac gtg gac ttt agc    2448 Pro Lys Val Lys Tyr Thr Phe Phe Val Pro Asn Asp Val Asp Phe Ser

            805                 810                 815 atg cag agc agc aaa gag aga gca acc acc aac atc atc cag ccg ctg    2496 Met Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Thr Thr Asn Ile Ile Gln Pro Leu

        820                 825                 830 ctc cac gca cag tgg gtg ctg ggg gac tgg tct gag tgc tct agc acc    2544 Leu His Ala Gln Trp Val Leu Gly Asp Trp Ser Glu Cys Ser Ser Thr

    835                 840                 845 tgc ggg gcc ggc tgg cag agg cga act gta gag tgc agg gac ccc tcc    2592 Cys Gly Ala Gly Trp Gln Arg Arg Thr Val Glu Cys Arg Asp Pro Ser

850                 855                 860 ggc cag gcc tct gcc acc tgc aac aag gct ctg aaa ccc gag gat gcc    2640 Gly Gln Ala Ser Ala Thr Cys Asn Lys Ala Leu Lys Pro Glu Asp Ala 865                 870                 875                 880 aag ccc tgc gaa agc cag ctg tgc ccc ctg tgattcaggg gggcaggggc      2690 Lys Pro Cys Glu Ser Gln Leu Cys Pro Leu

            885                 890 cagtcttgtg ctcctggaca tgcggtactg aggtgcagac aaggtctcca ctgtggtgac  2750 tgggtccctt ggccatatca aggcagcacg gcccacccag gcctcccatt gccgcaaccc  2810 ctccagtact gcacaaattc ctaaggggga agagaaaagg tatggggcgg caaaacctat  2870 catcaactgt ccawtgnaat ggaacttgct cgggttcaat taaaggcata agttaaagta  2930 aattcattat gatcaacaga cctcacntca tctgttgcan gatacaacta ntaaaaaaaa  2990 aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                                3008 <210>4 <211>890 <212>PRT <213>人 <400>4 Met Phe Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Trp Leu Pro Phe Leu Leu Leu   1               5                  10                  15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Arg Gly Ala Pro Ala Arg Pro

         20                  25                  30 Ala Ala Gly Gly Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Pro Thr Arg Leu Pro

     35                  40                  45 Gly Ser Ala Gly Glu Leu Ala Leu His Leu Ser Ala Phe Gly Lys Gly

 50                  55                  60   Phe Val Leu Arg Leu Ala Pro Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro Glu Phe  65                  70                  75                  80 Lys Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ala Thr Gly Gly Glu Arg

             85                  90                  95 Gly Leu Arg Gly Cys Phe Phe Ser Gly Thr Val Asn Gly Glu Pro Glu

        100                 105                 110 Ser Leu Ala Ala Val Ser Leu Cys Arg Gly Leu Ser Gly Ser Phe Leu

    115                 120                 125 Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Ile Gln Pro Gln Gly Ala Gly Gly Ser

130                 135                 140 Leu Ala Gln Pro His Arg Leu Gln Arg Trp Gly Pro Ala Gly Ala Arg 145                 150                 155                 160 Pro Leu Pro Arg Gly Pro Glu Trp Glu Val Glu Thr Gly Glu Gly Gln

            165                 170                 175 Arg Gln Glu Arg Gly Asp His Gln Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ser Gln

        180                 185                 190 Glu Glu Glu Ala Glu Gly Ala Ser Glu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala

    195                 200                 205 Thr Ser Arg Thr Lys Arg Phe Val Ser Glu Ala Arg Phe Val Glu Thr

210                 215                 220 Leu Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Tyr Gly Ala Asp Leu 225                 230                 235                 240 Gln Asn His Ile Leu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Arg Ile Tyr Lys

            245                 250                 255 His Pro Ser Ile Lys Asn Ser Ile Asn Leu Met Val Val Lys Val Leu

        260                 265                 270 Ile Val Glu Asp Glu Lys Trp Gly Pro Glu Val Ser Asp Asn Gly Gly

    275                 280                 285 Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Arg Arg Phe Asn Gln Pro

290                 295                 300 Ser Asp Arg His Pro Glu His Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg 305                 310                 315                 320 Gln Asn Phe Cys Gly Gln Glu Gly Leu Cys Asp Thr Leu Gly Val Ala

            325                 330                 335 Asp Ile Gly Thr Ile Cys Asp Pro Asn Lys Ser Cys Ser Val Ile Glu

        340                 345                 350 Asp Glu Gly Leu Gln Ala Ala His Thr Leu Ala His Glu Leu Gly His

    355                 360                 365 Val Leu Ser Met Pro His Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Arg Leu Phe

370                 375                 380 Gly Pro Met Gly Lys His His Val Met Ala Pro Leu Phe Val His Leu 385                 390                 395                 400 Asn Gln Thr Leu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Met Tyr Leu Thr Glu

            405                 410                 415 Leu Leu Asp Gly Gly His Gly Asp Cys Leu Leu Asp Ala Pro Gly Ala

        420                 425                 430 Ala Leu Pro Leu Pro Thr Gly Leu Pro Gly Arg Met Ala Leu Tyr Gln

    435                 440                 445 Leu Asp Gln Gln Cys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Asp Phe Arg His Cys

450                 455                 460 Pro Asn Thr Ser Ala Gln Asp Val Cys Ala Gln Leu Trp Cys His Thr 465                 470                 475                 480 Asp Gly Ala Glu Pro Leu Cys His Thr Lys Asn Gly Ser Leu Pro Trp

            485                 490                 495 Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser

        500                 505                 510 Cys Leu Pro Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Val Val Asp Gly

    515                 520                 525 Gly Trp Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly

530                 535                 540 Gly Gly Val Gln Phe Ser His Arg Glu Cys Lys Asp Pro Glu Pro Gln 545                 550                 555                 560 Asn Gly Gly Arg Tyr Cys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Tyr Gln Ser Cys

            565                 570                 575 His Thr Glu Glu Cys Pro Pro Asp Gly Lys Ser Phe Arg Glu Gln Gln

        580                 585                 590 Cys Glu Lys Tyr Asn Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Met Asp Gly Asn Leu

    595                 600                 605 Leu Gln Trp Val Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Arg Asp Arg Cys

610                 615                 620 Lys Leu Phe Cys Arg Ala Arg Gly Arg Ser Glu Phe Lys Val Phe Glu 625                 630                 635                 640 Ala Lys Val Ile Asp Gly Thr Leu Cys Gly Pro Glu Thr Leu Ala Ile

            645                 650                 655 Cys Val Arg Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp His Val Val Asp

        660                 665                 670 Ser Pro Arg Lys Leu Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Lys Gly Asn

    675                 680                 685 Ser Cys Arg Lys Val Ser Gly Ser Leu Thr Pro Thr Asn Tyr Gly Tyr

690                 695                 700 Asn Asp Ile Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Asn Ile Asp Val Lys 705                 710                 715                 720 Gln Arg Ser His Pro Gly Val Gln Asn Asp Gly Asn Tyr Leu Ala Leu

            725                 730                 735 Lys Thr Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ile Ser

        740                 745                 750 Ala Ile Glu Gln Asp Ile Leu Val Lys Gly Thr Ile Leu Lys Tyr Ser

    755                 760                 765 Gly Ser Ile Ala Thr Leu Glu Arg Leu Gln Ser Phe Arg Pro Leu Pro

770                 775                 780 Glu Pro Leu Thr Val Gln Leu Leu Thr Val Pro Gly Glu Val Phe Pro 785                 790                 795                 800 Pro Lys Val Lys Tyr Thr Phe Phe Val Pro Asn Asp Val Asp Phe Ser

            805                 810                 815 Met Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Thr Thr Asn Ile Ile Gln Pro Leu

        820                 825                 830 Leu His Ala Gln Trp Val Leu Gly Asp Trp Ser Glu Cys Ser Ser Thr

    835                 840                 845 Cys Gly Ala Gly Trp Gln Arg Arg Thr Val Glu Cys Arg Asp Pro Ser 850                     855                 860 Gly Gln Ala Ser Ala Thr Cys Asn Lys Ala Leu Lys Pro Glu Asp Ala 865                 870                 875                 880 Lys Pro Cys Glu Ser Gln Leu Cys Pro Leu

            885                 890 <210>5 <211>1203 <212>PRT <213>Bovine <400>5 Met Asp Pro Pro Ala Gly Ala Ala Gly Arg Leu Leu Cys Pro Ala Leu   1               5                  10                  15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Pro Ala Asp Ala Arg Leu Ala Ala

         20                  25                  30 Ala Ala Ala Asp Pro Pro Gly Gly Pro Gln Gly His Gly Ala Glu Arg

     35                  40                  45 Ile Leu Ala Val Pro Val Arg Thr Asp Ala Gln Gly Arg Leu Val Ser

 50                  55                  60 His Val Val Ser Ala Ala Thr Ala Pro Ala Gly Val Arg Thr Arg Arg  65                  70                  75                  80 Ala Ala Pro Ala Gln Ile Pro Gly Leu Ser Gly Gly Ser Glu Glu Asp

             85                  90                  95 Pro Gly Gly Arg Leu Phe Tyr Asn Val Thr Val Phe Gly Arg Asp Leu

        100                 105                 110 His Leu Arg Leu Arg Pro Asn Ala Arg Leu Val Ala Pro Gly Ala Thr

    115                 120                 125 Val Glu Trp Gln Gly Glu Ser Gly Ala Thr Arg Val Glu Pro Leu Leu

130                 135                 140 Gly Thr Cys Leu Tyr Val Gly Asp Val Ala Gly Leu Ala Glu Ser Ser 145                 150                 155                 160 Ser Val Ala Leu Ser Asn Cys Asp Gly Leu Ala Gly Leu Ile Arg Met

            165                 170                 175 Glu Glu Glu Glu Phe Phe Ile Glu Pro Leu Glu Lys Gly Leu Ala Ala

        180                 185                 190 Lys Glu Ala Glu Gln Gly Arg Val His Val Val Tyr His Arg Pro Thr

    195                 200                 205 Thr Ser Arg Pro Pro Pro Leu Gly Gln Ala Leu Asp Thr Gly Ile Ser

210                 215                 220 Ala Asp Ser Leu Asp Ser Leu Ser Arg Ala Leu Gly Val Leu Glu Glu 225                 230                 235                 240 Arg Val Asn Ser Ser Arg Arg Arg Met Arg Arg His Ala Ala Asp Asp

            245                 250                 255 Asp Tyr Asn Ile Glu Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Ser Val Val Gln

        260                 265                 270 Phe His Gly Thr Glu His Val Gln Lys Tyr Leu Leu Thr Leu Met Asn

    275                 280                 285 Ile Val Asn Glu Ile Tyr His Asp Glu Ser Leu Gly Ala His Ile Asn

290                 295                 300 Val Val Leu Val Arg Ile Ile Leu Leu Ser Tyr Gly Lys Ser Met Ser 305                 310                 315                 320 Leu Ile Glu Ile Gly Asn Pro Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val Cys Arg

            325                 330                 335 Trp Ala Tyr Leu Gln Gln Lys Pro Asp Thr Asp His Asp Glu Tyr His

        340                 345                 350 Asp His Ala Ile Phe Leu Thr Arg Gln Asp Phe Gly Pro Ser Gly Met

    355                 360                 365 Gln Gly Tyr Ala Pro Val Thr Gly Met Cys His Pro Val Arg Ser Cys

370                 375                 380 Thr Leu Asn His Glu Asp Gly Phe Ser Ser Ala Phe Val Val Ala His 385                 390                 395                 400 Glu Thr Gly His Val Leu Gly Met Glu His Asp Gly Gln Gly Asn Arg

            405                 410                 415 Cys Gly Asp Glu Val Arg Leu Gly Ser Ile Met Ala Pro Leu Val Gln

        420                 425                 430 Ala Ala Phe His Arg Phe His Trp Ser Arg Cys Ser Gln Gln Glu Leu

    435                 440                 445 Ser Arg Tyr Leu His Ser Tyr Asp Cys Leu Arg Asp Asp Pro Phe Thr

450                 455                 460 His Asp Trp Pro Ala Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu His Tyr Ser Met 465                 470                 475                 480 Asn Glu Gln Cys Arg Phe Asp Phe Gly Leu Gly Tyr Met Met Cys Thr

            485                 490                 495 Ala Phe Arg Thr Phe Asp Pro Cys Lys Gln Leu Trp Cys Ser His Pro

        500                 505                 510 Asp Asn Pro Tyr Phe Cys Lys Thr Lys Lys Gly Pro Pro Leu Asp Gly

    515                 520                 525 Thr Met Cys Ala Pro Gly Lys His Cys Phe Lys Gly His Cys Ile Trp

530                 535                 540 Leu Thr Pro Asp Ile Leu Lys Arg Asp Gly Asn Trp Gly Ala Trp Ser 545                 550                 555                 560 Pro Phe Gly Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly Thr Gly Val Lys Phe Arg

            565                 570                 575 Thr Arg Gln Cys Asp Asn Pro His Pro Ala Asn Gly Gly Arg Thr Cys

        580                 585                 590 Ser Gly Leu Ala Tyr Asp Phe Gln Leu Cys Asn Ser Gln Asp Cys Pro

    595                 600                 605 Asp Ala Leu Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Cys Arg Gln Trp Asp Leu

610                 615                 620 Tyr Phe Glu His Gly Asp Ala Gln His His Trp Leu Pro His Glu His 625                 630                 635                 640 Arg Asp Ala Lys Glu Arg Cys His Leu Tyr Cys Glu Ser Lys Glu Thr

            645                 650                 655 Gly Glu Val Val Ser Met Lys Arg Met Val His Asp Gly Thr Arg Cys

        660                 665                 670 Ser Tyr Lys Asp Ala Phe Ser Leu Cys Val Arg Gly Asp Cys Arg Lys

    675                 680                 685 Val Gly Cys Asp Gly Val Ile Gly Ser Ser Lys Gln Glu Asp Lys Cys

690                 695                 700 Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser His Cys Lys Val Val Lys Gly Thr 705                 710                 715                 720 Phe Ser Arg Ser Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Ile Lys Met Phe Glu Ile

            725                 730                 735 Pro Ala Gly Ala Arg His Leu Leu Ile Gln Glu Ala Asp Thr Thr Ser

        740                 745                 750 His His Leu Ala Val Lys Asn Leu Glu Thr Gly Lys Phe Ile Leu Asn

    755                 760                 765 Glu Glu Asn Asp Val Asp Pro Asn Ser Lys Thr Phe Ile Ala Met Gly

770                 775                 780 Val Glu Trp Glu Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Thr Leu Gln Thr 785                 790                 795                 800 Met Gly Pro Leu His Gly Thr Ile Thr Val Leu Val Ile Pro Glu Gly

            805                 810                 815 Asp Ala Arg Ile Ser Leu Thr Tyr Lys Tyr Met Ile His Glu Asp Ser

        820                 825                 830 Leu Asn Val Asp Asp Asn Asn Val Leu Glu Asp Asp Ser Val Gly Tyr

    835                 840                 845 Glu Trp Ala Leu Lys Lys Trp Ser Pro Cys Ser Lys Pro Cys Gly Gly

850                 855                 860  Gly Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Gly Cys Arg Arg Arg Leu Asp His Lys 865                 870                 875                 880 Met Val His Arg Gly Phe Cys Asp Ser Val Ser Lys Pro Lys Ala Ile

            885                 890                 895 Arg Arg Thr Cys Asn Pro Gln Glu Cys Ser Gln Pro Val Trp Val Thr

        900                 905                 910 Gly Glu Trp Glu Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Arg Thr Gly Met Gln

    915                 920                 925 Val Arg Ser Val Arg Cys Val Gln Pro Leu His Asn Asn Thr Thr Arg

930                 935                 940 Ser Val His Thr Lys His Cys Asn Asp Ala Arg Pro Glu Gly Arg Arg 945                 950                 955                 960 Ala Cys Asn Arg Glu Leu Cys Pro Gly Arg Trp Arg Ala Gly Ser Trp

            965                 970                 975 Ser Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Thr Gln Glu Arg Pro Val

        980                 985                 990 Leu Cys Arg Thr Ala Asp Asp Ser Phe Gly Val Cys Arg Glu Glu Arg

    995                 1000                1005 Pro Glu Thr Ala Arg Ile Cys Arg Leu Gly Pro Cys Pro Arg Asn Thr

1010                1015                1020 Ser Asp Pro Ser Lys Lys Ser Tyr Val Val Gln Trp Leu Ser Arg Pro 1025                1030                1035                1040 Asp Pro Asn Ser Pro Val Gln Glu Thr Ser Ser Lys Gly Arg Cys Gln

            1045                1050                1055 Gly Asp Lys Ser Val Phe Cys Arg Met Glu Val Leu Ser Arg Tyr Cys

        1060                1065                1070 Ser Ile Pro Gly Tyr Asn Lys Leu Cys Cys Lys Ser Cys Asn Pro His

    1075                1080                1085 Asp Asn Leu Thr Asp Val Asp Asp Arg Ala Glu Pro Pro Ser Gly Lys

1090                1095                1100 His Asn Asp Ile Glu Glu Leu Met Pro Thr Leu Ser Val Pro Thr Leu 1105                1110                1115                1120  Val Met Glu Val Gln Pro Pro Pro Gly Ile Pro Leu Glu Val Pro Leu

            1125                1130                1135 Asn Thr Ser Ser Thr Asn Ala Thr Glu Asp His Pro Glu Thr Asn Ala

        1140                1145                1150 Val Asp Val Pro Tyr Lys Ile Pro Gly Leu Glu Asp Glu Val Gln Pro

    1155                1160                1165 Pro Asn Leu Ile Pro Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Glu Lys Thr Arg Asn

1170                1175                1180 Gln Arg Ile Gln Glu Leu Ile Asp Glu Met Arg Lys Lys Glu Met Leu 1185               1190                1195                1200 Gly Lys Phe <210>6 <211>50 <212>PRT <213>人 <400>6 Asp Asp Gly Trp Ser Pro Trp Ser Glu Trp Thr Ser Cys Ser Thr Ser   1               5                  10                  15 Cys Gly Asn Gly Ile Gln Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Ser Leu Asn

         20                  25                  30 Asn Arg Cys Glu Gly Ser Ser Val Gln Thr Arg Thr Cys His Ile Gln

     35                  40                  45 Glu Cys

50 <210>7 <211>57 <212>PRT <213>人 <400>7 Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser Val Thr   1               5                  10                  15 Cys Gly Asp Gly Val Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys Asn Ser Pro Ser

         20                  25                  30 Pro Gln Met Asn Gly Lys Pro Cys Glu Gly Glu Ala Arg Glu Thr Lys

     35                  40                  45 Ala Cys Lys Lys Asp Ala Cys Pro Ile

 50                  55 <210>8 <211>57 <212>PRT <213>人 <400>8 Asn Gly Gly Trp Gly Pro Trp Ser Pro Trp Asp Ile Cys Ser Val Thr   1               5                  10                  15 Cys Gly Gly Gly Val Gln Lys Arg Ser Arg Leu Cys Asn Asn Pro Thr

         20                  25                  30 Pro Gln Phe Gly Gly Lys Asp Cys Val Gly Asp Val Thr Glu Asn Gln

     35                  40                  45 Ile Cys Asn Lys Gln Asp Cys Pro Ile

 50                  55 <210>9 <211>50 <212>PRT <213>人 <400>9 Glu Glu Gly Trp Ser Pro Trp Ala Glu Trp Thr Gln Cys Ser Val Thr   1               5                  10                  15 Cys Gly Ser Gly Thr Gln Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Val Thr Ser

         20                  25                  30 Asn Thr Cys Leu Gly Pro Ser Ile Gln Thr Arg Ala Cys Ser Leu Ser

     35                  40                  45 Lys Cys

 50 <210>10 <211>57 <212>PRT <213>人 <400>10 Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser Val Thr   1               5                  10                  15 Cys Gly Val Gly Asn Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys Asn Ser Pro Val

         20                  25                  30 Pro Gln Met Gly Gly Lys Asn Cys Lys Gly Ser Gly Arg Glu Thr Lys

     35                  40                  45 Ala Cys Gln Gly Ala Pro Cys Pro Ile

 50                  55 <210>11 <211>56 <212>PRT <213>人 <400>11 Asp Gly Arg Trp Ser Pro Trp Ser Pro Trp Ser Ala Cys Thr Val Thr   1               5                  10                  15 Cys Ala Gly Gly Ile Arg Glu Arg Thr Arg Val Cys Asn Ser Pro Glu

         20                  25                  30 Pro Gln Tyr Gly Gly Lys Ala Cys Val Gly Asp Val Gln Glu Arg Gln

     35                  40                  45 Met Cys Asn Lys Arg Ser Cys Pro

 50                  55 <210>12 <211>3974 <212>DNA <213>人 ggtacctaag tgagtagggc gtccgatcga cggacgcctt ttttttgaat tcgtaatcat 60 ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 120 ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 180 cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 240 tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 300 ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 360 taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc  420 agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc  480 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac  540 tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc  600 tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata  660 gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc  720 acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca  780 acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag  840 cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta  900 gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg  960 gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc  1020 agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt  1080 ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcgtcga  1140 caattcgcgc gcgaaggcga agcggcatgc atttacgttg acaccatcga atggtgcaaa  1200 acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg  1260 aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc  1320 cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg  1380 atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg  1440 ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg  1500 gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga  1560 agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg  1620 ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact  1680 aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc  1740 tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa  1800 atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg  1860 cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt  1920 gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg  1980 atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg  2040 ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt  2100 tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg  2160 gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc  2220 tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg  2280 ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga  2340 gcgcaacgca attaatgtaa gttagcgcga attgtcgacc aaagcggcca tcgtgcctcc  2400 ccactcctgc agttcggggg catggatgcg cggatagccg ctgctggttt cctggatgcc  2460 gacggatttg cactgccggt agaactccgc gaggtcgtcc agcctcaggc agcagctgaa  2520 ccaactcgcg aggggatcga gcccggggtg ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg  2580 ctggaggatc atccagccgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa  2640 ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc  2700 gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc  2760 gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc  2820 tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc  2880 cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag  2940 gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg  3000 aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga  3060 ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg  3120 caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc  3180 tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc  3240 cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg  3300 gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg  3360 gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag  3420 cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga  3480 gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 3540 tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact 3600 ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct 3660 gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt 3720 ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt 3780 cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgttccgct tcctttagca gcccttgcgc 3840 cctgagtgct tgcggcagcg tgaagcttaa aaaactgcaa aaaatagttt gacttgtgag 3900 cggataacaa ttaagatgta cccaattgtg agcggataac aatttcacac attaaagagg 3960 agaaattaca tatg                                                   3974 <210>13 <211>112 <212>DNA <213>人 <400>13 aagcttaaaa aactgcaaaa aatagtttga cttgtgagcg gataacaatt aagatgtacc 60 caattgtgag cggataacaa tttcacacat taaagaggag aaattacata tg         112 <210>14 <211>542 <212>DNA <213>小鼠 <220> <221>不确定 <222>(3) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(21) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(22) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(361) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(369) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(407) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(427) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(479) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(482) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(535) <223>可能是任何核酸 <400>14 gtncgaattt cggcacgaga nnttagacgc cttttcatgg aagctgggga atgtgggggc  60 cttggggaga ctgttcgaga acgtgcggtg gaggagtcca gtacacgatg agggaatgtg 120 acaacccagt cccaaagaat ggagggaagt actgtgaagg caaacgagtg cgctacagat 180 cctgtaacct tgaggactgt ccagacaata atggaaaaac ctttagagag gaacaatgtg 240 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aatgccgaga cattaatgga cagcctgctt ccgagtgtgc aaaggaagtg aagccagcca  60 gcaccagacc ttgtgcagac catccctgcc cccagtggca gctgggggag tggtcatcat  120 gttctaagac ctgtgggaag ggttacaaaa aaagaagctt gaagtgtctg tcccatgatg  180 gaggggtgtt atctcatgag agctgtgatc ctttaaagaa acctaaacat ttcatagact  240 tttgcacaat ggcagaatgc agttaagtgg tttaagtggt gttagctttg agggcaaggc  300 aaagtgagga agggct                                                  316 <210>17 <211>383 <212>DNA <213>Caenorhabditis elegans <220> <221>不确定 <222>(160) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(326) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(358) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定     <222>(366) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(377) <223>可能是任何核酸 <220> <221>不确定 <222>(379) <223>可能是任何核酸 <400>17 gtcgacccac gcgtccggat ggtactccat gtagcccaga ttccacctct gtctgtgtgc 60 aaggacagtg tgtaaaagct ggttgtgatc gcatcataga ctccaaaaag aagtttgata 120 aatgtggtgt ttgcggggga aatggatcta cttgtaaaan aatatcagga tcagttacta 180 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aagcggatag cttgtgatga agaattctca gattctgagg atgaaggaga aggaggtcga 1500 agaaatgtgg ctgatcataa gaaaggagca aagaaagcta gaattgaaga agataagaaa 1560 gaaacagagg acaaaaaaac agacgttaag gaagaagata aatccaagga caacagtggt 1620 gaaaaaacag ataccaaagg aaccaaatca gaacagctca gcaacccctg aatttgacag 1680 tctcaccaat ttcagaaaat cattaaaaag aaaatattga aaggaaaatg ttttcttttt 1740 gaagacttct ggcttcattt tatactactt tggcatggac tgtatttatt ttcaaatggg 1800 actttttcgt ttttgttttt ctgggcaagt tttattgtga gattttctaa ttatgaagca 1860 aaatttcttt tctccaccat gctttatgtg atagtattta aaattgatgt gagttattat 1920 gtcaaaaaaa ctgatctatt aaagaagtaa ttggcctttc tgagctgaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaag                                                             1985 <210>77 <211>476 <212>DNA <213>未知 <220> <223>未知生物描述：未知 <400>77 ccaccctcct ccccctcccc cggccacttc gctaacttgg tggctgttgt gatgcgtatt 60 cctgtagatc cgagcaccag ccggcgcttc agccccccct ccagcagcct gcagcccggc 120 aaaatgagcg acgtgagccc ggtggtggct gcgcaacagc agcagcaaca gcagcagcag 180 caacagcagc agcagcagca gcaacagcag cagcagcagc aggaggcggc ggcggcggct 240 gcggcggcag cggcggctgc ggcggcggca gctgcagtgc cccggttgcg gccgccccac 300 gacaaccgca ccatggtgga gatcatcgcc gaccacccgg ccgaactcgt ccgcaccgac 360 agccccaact tcctgtgctc ggtgctgccc tcgcactggc gctgcaacaa gaccctgccc 420 gtggccttca aggtaagagg ctaccccgcc ccccgccccc ggccgggagc ggcgga     476 <210>78 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> 人工序列描述：DNA引物 <400>78 gcattttgga tccgcctttt catg                                        24 <210>79 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：DNA引物 <400>79 gttgtgtgct gcagattgtt cc                                   22 <210>80 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：DNA引物 <400>80 gaaaaatggg gatccgaggt g                                    21 <210>81 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：DNA引物 <400>81 gcaggagaat tccgtccatg                                      20 <210>82 <211>5 <212>PRT <213>人 <220> <221>不确定 <222>(3) <223>可以是任何氨基酸 <400>82 Trp Ser Xaa Trp Ser   1               5 <210>83 <211>6 <212>PRT <213>人 <400>83 Cys Ser Val Thr Cys Gly   1               5 <210>84 <211>5 <212>PRT <213>人 <220> <221>不确定 <222>(4) <223>可以是任何氨基酸 <400>84 Gly Cys Gln Xaa Arg   1               5 <210>85 <211>733 <212>DNA <213>人 <400>85 gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60 aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420 caccccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480 atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540 ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gactctagag gat                                                    733 <210>86 <211>86 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：DNA引物 <400>86 gcgcctcgag atttccccga aatctagatt tccccgaaat gatttccccg aaatgatttc 60 cccgaaatat ctgccatctc aattag                                      86 <210>87 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：DNA引物 <400>87 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc                                     27 <210>88 <211>271 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：PCR片段 <400>88 ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg 60 aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 120 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 180 ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 240 ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct t                                271 <210>89 <211>32 <212>DNA <213>人 <400>89 gcgctcgagg  gatgacagcg atagaacccc gg                               32 <210>90 <211>31 <212>DNA <213>人 <400>90 gcgaagcttc  gcgactcccc ggatccgcct c                                31 <210>91 <211>12 <212>DNA <213>人 <400>91 ggggactttc cc                                                      12 <210>92 <211>73 <212>DNA <213>人 <400>92 gcggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatcctg  60 ccatctcaat tag                                                     73 <210>93 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> 人工序列描述：PCR片段 <400>93 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc                                      27

Claims (19)

1.含选自由下述组成之组的多核苷酸的分离核酸分子：

(a)编码含SEQ ID NO：2中第1-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(b)编码含SEQ ID NO：2中第2-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(c)编码含SEQ ID NO：2中第29-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(d)编码含SEQ ID NO：2中第30-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(e)含编码METH1多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有由 ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；

(f)含编码成熟METH1多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有 由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；

(g)编码含SEQ ID NO：4中第1-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(h)编码含SEQ ID NO：4中第2-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(i)编码含SEQ ID NO：4中第24-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(j)编码含SEQ ID NO：4中第112-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(k)含编码METH2多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有由 ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；

(l)含编码成熟METH2多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有 由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；

(m)通过改变(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、 (k)或(l)的多核苷酸而产生的多核苷酸变体，其中：

  (i)所说的改变包括核苷酸插入、缺失或取代，或它们的任何组 合，并且

  (ii)改变的数目不超过未改变多核苷酸中总核苷酸数的5％；

(n)编码SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸的多核苷酸；

(o)编码SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸的多核苷酸；

(p)编码SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸的多核苷酸；

(q)编码SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸的多核苷酸；

(r)编码SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸的多核苷酸；

(s)编码SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸的多核苷酸；

(t)编码SEQ ID NO：2中第549-563位氨基酸的多核苷酸；

(u)编码SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸的多核苷酸；

(v)编码SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸的多核苷酸；

(w)编码SEQ ID NO：4中第530-583位氨基酸的多核苷酸；

(x)编码SEQ ID NO：4中第837-890位氨基酸的多核苷酸；

(y)编码SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸的多核苷酸；

(z)编码SEQ ID NO：4中第529-548位氨基酸的多核苷酸；

(aa)  与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、 (k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、 (x)、(y)或(z)中任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.包含编码SEQ ID NO：2中METH1多肽或SEQ ID NO：4中METH2多 肽带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸的分离核酸分子。

3.含有选自由下述组成之组的多核苷酸的分离核酸分子：

(a)SEQ ID NO：1编码区的50个连续核苷酸，条件是所说的核苷酸 序列不是SEQ ID No：14-41任何之一或其任何亚片段；和

(b)与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。

4.含有选自由下述组成之组的多核苷酸的分离核酸分子：

  (a)SEQ ID NO：3编码区的50个连续核苷酸，条件是所说的核苷酸序 列不是SEQ ID No：19-22、24、42-77或其任何亚片段；和

  (b)与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。

5.制备重组载体的方法，包括将权利要求1的分离核酸分子插入载 体，与启动子有效连接。

6.由权利要求5的方法生产的重组载体。

7.制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求6的重组载体引入宿 主细胞。

8.用权利要求7的方法生产的重组宿主细胞。

9.生产METH1或METH2多肽的重组方法，包括在使所说多肽表达的 条件下培养权利要求8的重组宿主细胞和回收该多肽。

10.含有选自由下述组成之组的氨基酸序列的分离多肽：

(a)SEQ ID NO：2中第1-950位氨基酸；

(b)SEQ ID NO：2中第2-950位氨基酸；

(c)SEQ ID NO：2中第29-950位氨基酸；

(d)SEQ ID NO：2中第30-950位氨基酸；

(e)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的METH1多肽的氨基酸序列；

(f)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的成熟METH1多肽的氨基酸序列；

(g)SEQ ID NO：4中第1-890位氨基酸；

(h)SEQ ID NO：4中第2-890位氨基酸；

(i)SEQ ID NO：4中第24-890位氨基酸；

(j)SEQ ID NO：4中第112-890位氨基酸；

(k)具有由ATCC保藏号209582中所含METH2 cDNA克隆编码的氨基 酸序列的METH2多肽的氨基酸序列；

(l)具有由ATCC保藏号209582中所含METH2 cDNA克隆编码的氨基 酸序列的成熟METH2多肽的氨基酸序列；

(m)通过改变(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、 (k)或(l)的多肽而产生的多肽变体的氨基酸序列，其中：

  (i)所说的改变包括氨基酸插入、缺失或取代，或它们的任何组 合，并且

  (ii)改变的数目不超过未改变氨基酸序列中总氨基酸数的5％；

(m)SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸；

(n)SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸；

(o)SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸；

(p)SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸；

(q)SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸；

(r)SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸；

(s)SEQ ID NO：2中第549-563位氨基酸；

(t)SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸；

(u)SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸；

(v)SEQ ID NO：4中第530-583位氨基酸；

(w)SEQ ID NO：4中第837-890位氨基酸；

(x)SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸；

(y)SEQ ID NO：4中第529-548位氨基酸；

(z)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、 (l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x) 或(y)中任何多肽的带表位部分的氨基酸序列。

11.权利要求10的分离多肽，其产生于重组宿主细胞中。

12.权利要求11的分离多肽，其中所说重组宿主细胞是哺乳动物细 胞。

13.含编码METH1或METH2多肽之多核苷酸的分离核酸分子，其中除 有1-50个保守氨基酸取代外，所说多肽含有选自由下述组成之组的序列：

(a)SEQ ID NO：2中约第1-950位氨基酸；

(b)SEQ ID NO：2中约第2-950位氨基酸；

(c)SEQ ID NO：2中约第29-950位氨基酸；

(d)SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基酸；

(e)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的METH1多肽 的氨基酸序列；

(f)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的成熟METH1 多肽的氨基酸序列；

(g)SEQ ID NO：4中约第1-890位氨基酸；

(h)SEQ ID NO：4中约第2-890位氨基酸；

(i)SEQ ID NO：4中约第24-890位氨基酸；

(j)SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸；

(k)具有由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的METH2多肽 的氨基酸序列；

(l)具有由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的成熟METH2 多肽的氨基酸序列。

14.一种分离多肽，其中除有1-50个保守氨基酸取代外，所说多肽 具有选自由下述组成之组的序列：

(a)SEQ ID NO：2中约第1-950位氨基酸；

(b)SEQ ID NO：2中约第2-950位氨基酸；

(c)SEQ ID NO：2中约第29-950位氨基酸；

(d)SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基酸；

(e)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的METH1多肽的氨基酸序列；

(f)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的成熟METH1多肽的氨基酸序列；

(g)SEQ ID NO：4中约第1-890位氨基酸；

(h)SEQ ID NO：4中约第2-890位氨基酸；

(i)SEQ ID NO：4中约第24-890位氨基酸；

(j)SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸；

(k)具有由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的METH2多肽的氨基酸序列；

(l)具有由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的成熟METH2多肽的氨基酸序列；

(m)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k) 或(l)中任何多肽的带表位部分的氨基酸序列。

15.含有与选自由下述组成之组的多核苷酸至少95％相同的多核苷 酸的分离核酸分子：

(a)编码含SEQ ID NO：2中第1-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(b)编码含SEQ ID NO：2中第2-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(c)编码含SEQ ID NO：2中第29-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(d)编码含SEQ ID NO：2中第30-950位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(e)含编码METH1多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有由 ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；

(f)含编码成熟METH1多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有 由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；

(g)编码含SEQ ID NO：4中第1-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(h)编码含SEQ ID NO：4中第2-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(i)编码含SEQ ID NO：4中第24-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(j)编码含SEQ ID NO：4中第112-890位氨基酸之多肽的多核苷酸；

(k)含编码METH2多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有由 ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；

(l)含编码成熟METH2多肽之核苷酸序列的多核苷酸，该多肽具有 由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列；和

(m)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k) 或(l)中任何核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中

所说的相同性百分比是用FASTDB计算机软件计算的，参数如下： 矩阵＝Unitary，k-tuple＝4，错配罚分＝1，连接罚分＝30，随机化分组长度 ＝0，截断分＝1，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或指示核 苷酸序列长度，取其中较短者。

16.含有与具有选自由下述组成之组的氨基酸序列的多肽至少95％相 同的多肽的分离多肽：

(a)SEQ ID NO：2中约第1-950位氨基酸；

(b)SEQ ID NO：2中约第2-950位氨基酸；

(c)SEQ ID NO：2中约第29-950位氨基酸；

(d)SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基酸；

(e)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的METH1多肽的氨基酸序列；

(f)具有由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的成熟METH1多肽的氨基酸序列；

(g)SEQ ID NO：4中约第1-890位氨基酸；

(h)SEQ ID NO：4中约第2-890位氨基酸；

(i)SEQ ID NO：4中约第24-890位氨基酸；

(j)SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸；

(k)具有由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的METH2多肽的氨基酸序列；

(l)具有由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列 的成熟METH2多肽的氨基酸序列；

其中

所说的相同性百分比是用FASTDB计算机软件计算的，参数如下：矩 阵＝PAM O，k-tuple＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化分组长度＝0， 截断分＝1，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或指示氨基 酸序列长度，取其中较短者。

17.抑制个体中血管生成的方法，包括对该个体给予有效量的权利要 求10的多肽。

18.含SEQ ID NO：2中m-n氨基酸序列的多肽，其中m是1-950的整 数，而n是10-950的整数。

19.含SEQ ID NO：4中m-n氨基酸序列的多肽，其中m是1-890的整 数，而n是10-890的整数。

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