CN1703422A - Meth1和meth2多核苷酸及多肽 - Google Patents

Meth1和meth2多核苷酸及多肽 Download PDF

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CN1703422A
CN1703422A CN 00810803 CN00810803A CN1703422A CN 1703422 A CN1703422 A CN 1703422A CN 00810803 CN00810803 CN 00810803 CN 00810803 A CN00810803 A CN 00810803A CN 1703422 A CN1703422 A CN 1703422A
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amino acid
seq
garni
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chou
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L·伊鲁拉－阿里斯皮
G·A·哈斯廷斯
S·M·鲁本
Z·L·卓纳克
S·H·图里
J·A·佛沃尔德
J·A·特里特
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SMITHLIN BEECHAM
Human Genome Sciences Inc
Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
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SMITHLIN BEECHAM
Human Genome Sciences Inc
Beth Israel Hospital Association
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Abstract

本发明涉及与血小板反应蛋白相关的新抗血管生成蛋白质。更具体地说，提供了编码人METH 1和METH 2的分离的核酸分子。还提供了METH 1和METH 2多肽以及用于其生产的载体、宿主细胞和重组方法。此外还提供了用于癌症预后的诊断方法及用于治疗需要增加量METH 1和METH 2之个体的治疗方法。还提供了利用METH 1或METH 2抑制血管生成的方法。

Description

METH1和METH2多核苷酸及多肽
发明背景
联邦资助的研究和开发项目
在本发明开发期间的部分工作利用了美国政府基金。美国政府对该发明拥有一定的权利。
发明领域
本发明涉及与血小板反应蛋白相关的新抗血管生成蛋白质。更具体地说，提供了编码人METH1和METH2(ME代表金属蛋白酶，TH代表血小板反应蛋白)的分离核酸分子。还提供了METH1和METH2多肽以及用于其生产的载体、宿主细胞和重组方法。此外还提供了用于癌症预后的诊断方法及用于处理需要增加量METH1或METH2之个体的治疗方法。
相关领域
从原有脉管系统形成新血管的血管生成在正常成体中是一个严密调控的过程。在生理环境中，通过其作用而刺激或抑制血管生长之生长调节蛋白的相互作用严格控制新毛细管的生长。通常来说，这些影响力之间的平衡倾向于抑制，因而血管生长被抑制。然而在某些病理状况下，局部的抑制控制不能阻止血管生成诱导物增高的活性。血管生成是癌症转移(Folkman，Nature Med.1：27-31(1995))及异常伤口愈合、炎症、类风湿性关节炎、牛皮癣和糖尿病性视网膜病中关键的一步，在病理学上是必需的(Folkman等人，科学235：442(1987))，由此希望能通过对血管生长进行药理学和/或遗传抑制以调控这些病态个体(Iruela-Arispe等人，Thromb.Haem.78：672-677(1997))。
血小板反应蛋白(TSP-1)是释放自被激活血小板并由生长细胞分泌的450KDa抗血管生成性粘附糖蛋白(由Adams综述于Int.J.Biochem.Cell.Biol.29：861-865(1997))。TSP-1是一同型三聚体，每一亚基由1152个氨基酸长的多肽组成，具有N-连接的糖基化和天冬酰胺残基β-羟基化的翻译后加工。
TSP-1蛋白质和mRNA水平由多种因素调节。IL-1α和TNFα对TSP-1蛋白质水平进行下调。TSP-1 mRNA和蛋白质水平被包括PDGF、TGF-β和bFGF在内的多肽生长因子上调(Bornstein，Faseb J.6：3290-3299(1992))，并且还通过p53肿瘤抑制基因产物的表达水平进行调节(Dameron等人，科学265：1582-1584(1994))。血小板反应蛋白家族中至少已有4种其它成员被鉴定：TSP-2、TSP-3、TSP-4和TSP-5(也称COMP)。在本领域中需要鉴定血管生成调节中涉及的其它分子。
发明概述
本发明提供了含编码METH1多肽之多核苷酸的分离核酸分子，该多肽具有如SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列或由保藏于细菌宿主中的cDNA克隆编码的氨基酸序列，所说的细菌宿主保藏于1998年1月15日，ATCC保藏号为209581。
本发明提供了含编码METH2多肽之多核苷酸的分离核酸分子，该多肽具有如SEQ ID NO：4中所述的氨基酸序列或由保藏于细菌宿主中的cDNA克隆编码的氨基酸序列，所说的细菌宿主保藏于1998年1月15日，ATCC保藏号为209582或者保藏于2000年3月14日，ATCC保藏号为PTA 1478。
本发明还涉及含本发明分离核酸分子的重组载体及包括该重组载体的宿主细胞，还有通过重组技术制备所说载体和宿主细胞的方法，及将它们用于METH1或METH2多肽或肽生产的方法。
本发明进一步提供了具由本文所述多核苷酸编码之氨基酸序列的分离METH1或METH2多肽。
本发明进一步提供了在癌症诊断或预后中有用的诊断方法。
本发明的另一方面涉及治疗体内需更高水平的METH1或METH2活性之个体的方法，包括对这样的个体施用含治疗有效剂量之本发明分离的METH1或METH2多肽或其激动剂的组合物。
附图简述
图1A-C显示METH1的核苷酸(SEQ ID NO：1)和推测的氨基酸(SEQID NO：2)序列。该蛋白质具有约28个氨基酸长的预计前导序列(下划线所标)。
图2A-B显示METH2的核苷酸(SEQ ID NO：3)和推测的氨基酸(SEQID NO：4)序列。该蛋白质具有约23个氨基酸长的预计前导序列(下划线所标)。
图3A-C显示METH1(SEQ ID NO：2)和METH2(SEQ ID NO：4)与它们最近的同系物-牛金属蛋白酶(pNPI)(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列比较。方框内为相同的氨基酸。通过序列和结构同源性预测的功能性结构域被标出，包括信号肽(单线)、哺乳动物枯草杆菌蛋白酶的潜在切割位点(双下划线)、金属蛋白酶结构域的锌结合位点(点线，在METH1中为氨基酸383-395，在METH2中为氨基酸363-375)和推定的去整联蛋白(disintegrin)环(箭头所示)。
图4显示METH1、METH2和pNPI的一级结构，包括前结构域(prodomain)、催化性的金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的去整联蛋白结构域、类TSP结构域、间隔区及不同数量的类TSP结构域，METH1有三个，METH2有两个，而pNPI是四个。
图5显示METH1(SEQ ID NO：2)和METH2(SEQ ID NO：4)与TSP1(SEQ ID NO：6，7，8)和TSP2(SEQ ID NO：9，10，11)的TSP样结构域比较，半胱氨酸编号为1-6，色氨酸用星号标出。
图6A-6D显示来源于METH1和METH2的TSP样结构域的肽及重组蛋白质阻断VEGF诱导的血管生成。在存在或缺乏肽或重组蛋白质的情况下，用含铺于基质凝胶上的VEGF的尼龙网对12-14天胚胎的CAM诱导血管生成。毛细管密度评估如实施例4所述。阳性和阴性对照分别只含VEGF和载体。(A)重组蛋白质存在时VEGF诱导的血管生成反应量。TSP1、纯化的血小板TSP1、GST、纯化的GST、GST-TSP1、GST-METH1和GST-METH2如实施例4所述。(B)存在或缺乏肽：P-TSP1、P-METH1和P-METH2(分别来源于TSP、METH1和METH2的I类重复区的肽)时VEGF诱导的血管生成反应量；SC1和SC2是用作对照的混杂肽。(C)存在GST-METH1时VEGF诱导的血管生成的剂量性应答。(D)存在GST-METH2时VEGF诱导的血管生成的剂量性应答。血管生成指标以来自VEGF基质胶的血管反应为100％并减去背景水平(只有基质胶)表示。试验至少重复两次。每一处理进行三份试样。所示值代表平均值，杠显示标准偏差。*P＜0.001。
图7A-E显示METH1和METH2重组蛋白质对bFGF刺激的细胞增殖的作用。细胞在含bFGF和待测重组蛋白质(除图中所示外均为3ug/ml)的培养基中培养于24孔板上。对照只包括载体或GST重组蛋白质。(A)HDEC，人皮肤内皮细胞；(B)HMEC，人乳腺上皮细胞；(C)HDF，人皮肤成纤维细胞；(D)SMC，平滑肌细胞；(E)GST-METH1和GST-METH2对HDEC增殖的剂量性应答。试验至少重复两次。每一处理进行三份试样。所示值代表平均值，杠显示标准偏差。*P＜0.01.
图8显示pHE4-5表达载体(SEQ ID NO：12)和亚克隆的METH1或METH2 cDNA编码序列的图解。卡那霉素抗性标记基因、METH1或METH2编码序列、oriC序列及lacIq编码序列的位置被标出。
图9显示pHE启动子调节元件的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。两个lac操纵基因序列、SD序列(S/D)和末端HindIII和NdeI限制位点(斜线表示)被标出。
图10显示METH1氨基酸序列的分析。显示了α、β转角和卷曲区、亲水性和疏水性、两亲区、柔性区、抗原性指数和表面概率，均由默认设置值得到的。在“抗原性指数或Jameson-Wolf”图中，阳性峰表示METH1或METH2蛋白高抗原区的位置，即可获得本发明带表位的肽的区域。这些图表确定的结构域在本发明范围内。图10中概述的数据列表表示于表1中。
图11显示METH2氨基酸序列的分析。显示了α、β、转角和卷曲区、亲水性和疏水性、两亲区、柔性区、抗原性指数和表面概率，均由默认设置值得到。在“抗原性指数或Jameson-Wolf”图中，阳性峰表示METH1或METH2蛋白高抗原区的位置，即可获得本发明带表位的肽的区域。这些图表确定的结构域在本发明范围内。图1中概述的数据列表表示于表2中。
                                                                                表1
  Res   Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
Met  1   A     A     .     .   .   .   .     0.41 * .   .     -0.30   0.60
Gly  2   .     A     .     .   .   .   C     0.91 * .   .     0.50   0.81
Asn  3   A     A     .     .   .   .   .     0.71 * .   .     0.75   1.24
Ala  4   A     A     .     .   .   .   .     0.89 * .   .     1.09   1.26
Glu  5   A     A     .     .   .   .   .     0.93 * .   F     1.58   1.97
Arg  6   .     A     B     .   .   .   .     1.23 . .   F     1.92   1.21
Ala  7   .     .     B     .   .   T   .     1.69 . .   F     2.66   1.61
Pro  8   .     .     .     .   T   T   .     1.39 . .   F     3.40   1.82
Gly  9   .     .     .     .   T   T   .     1.28 . .   F     3.06   1.25
Ser  10   .     .     .     .   T   T   .     0.93 . .   F     2.42   1.07
Arg  11   .     .     .     .   T   T   .     0.61 . *   F     1.93   0.68
Ser  12   .     .     .     .   T   T   .     0.34 * .   F     1.74   1.07
Phe  13   .     .     B     .   .   T   .     0.34 * .   F     0.25   0.59
Gly  14   .     .     B     .   .   T   .     0.38 * .   F     0.25   0.47
Pro  15   .     .     B     B   .   .   .     -0.13 * .   F     -0.45   0.50
Val  16   .     .     B     B   .   .   .     -1.06 * .   F     -0.45   0.48
Pro  17   .     .     B     B   .   .   .     -1.57 . .   F     -0.45   0.40
Thr  18   .     A     B     .   .   .   .     -1.68 . .   F     -0.45   0.21
Leu  19   .     A     B     .   .   .   .     -1.92 . .   .     -0.60   0.24
Leu  20   A     A     .     .   .   .   .     -2.30 . .   .     -0.60   0.15
Res Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha Garni…Beta Chou-…Beta Garni…Turn Chou…Turn Garni…Coil Kyte-…Hydro… Eisen…Alph Eisen…Beta Karpl…Flexi… James…Antig… EminiSurfa…
Leu  21 A   A   .     .   .   . .     -2.03 . .   .     -0.60     0.11
Leu  22 A   A   .     .   .   . .     -2.63 . .   .     -0.60     0.13
Ala  23 A   A   .     .   .   . .     -3.13 . .   .     -0.60     0.13
Ala  24 A   A   .     .   .   . .     -2.91 . .   .     -0.60     0.13
Ala  25 A   A   .     .   .   . .     -2.96 . .   .     -0.60     0.16
Leu  26 A   A   .     B   .   . .     -2.44 . .   .     -0.60     0.12
Leu  27 A   A   .     B   .   . .     -1.63 . .   .     -0.60     0.16
Ala  28 A   A   .     B   .   . .     -1.63 . .   .     -0.30     0.26
Val  29 A   A   .     B   .   . .     -1.86 . .   .     -0.30     0.32
Ser  30 A   A   .     .   .   . .     -1.61 * *   .     -0.30     0.32
Asp  31 A   A   .     .   .   . .     -0.69 * *   F     -0.15     0.31
Ala  32 A   A   .     .   .   . .     -0.09 . *   F     0.75     0.83
Leu  33 .   A   .     .   .   . C     0.20 * .   F     1.55     0.96
Gly  34 .   A   .     .   .   . C     1.06 * *   F     1.85     0.77
Arg  35 .   .   .     .   .   T C     1.36 * *   F     2.70     1.32
Pro  36 .   .   .     .   .   T C     1.36 * *   F     3.00     2.76
Ser  37 .   .   .     .   .   T C     1.94 * .   F     2.70     4.66
Glu  38 A   .   .     .   .   T .     2.76 * .   F     2.20     4.12
Glu  39 A   A   .     .   .   . .     2.29 * *   F     1.50     4.61
Asp  40 A   A   .     .   .   . .     1.32 * *   F     1.20     2.84
Glu  41 A   A   .     .   .   . .     0.68 . .   F     0.90     1.22
Res Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha Garni…Beta Chou-…Beta Garni…Turn Chou-…Turn Garni…Coil Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha Eisen…Beta Karpl…Flexi… James…Antig… EminiSurfa…
 Glu  42 A   A   .     .   .   .   .     0.77 .   .   F     0.75   0.52
 Leu  43 A   A   .     .   .   .   .     0.77 .   .   .     0.60   0.48
 Val  44 A   A   .     .   .   .   .     -0.04 .   .   .     0.60   0.48
 Val  45 A   A   .     .   .   .   .     -0.04 *   .   .     -0.30   0.23
 Pro  46 A   A   .     .   .   .   .     0.07 *   .   .     -0.30   0.48
 Glu  47 A   .   .     .   .   .   .     -0.52 *   .   F     1.10   1.27
 Leu  48 A   .   .     .   .   .   .     0.08 *   .   F     1.41   1.73
 Glu  49 A   .   .     .   .   .   .     0.59 *   .   F     1.72   1.73
 Arg  50 A   .   .     .   .   .   .     1.41 *   .   F     1.88   0.99
 Ala  51 A   .   .     .   .   T   .     1.28 *   .   F     2.24   1.64
 Pro  52 .   .   .     .   T   T   .     0.97 *   .   F     3.10   0.93
 Gly  53 .   .   .     .   T   T   .     1.47 *   *   F     2.49   0.69
 His  54 .   .   .     .   .   T   C     1.58 *   *   F     1.38   0.98
 Gly  55 .   .   .     .   .   .   C     0.66 *   *   F     1.62   1.25
 Thr  56 .   .   .     .   .   .   C     1.36 .   *   F     0.71   1.04
 Thr  57 .   A   B     .   .   .   .     0.76 .   *   F     0.60   1.49
 Arg  58 .   A   B     .   .   .   .     1.07 .   *   F     0.60   1.25
 Leu  59 .   A   B     .   .   .   .     0.51 .   *   .     0.45   1.17
 Arg  60 .   A   B     .   .   .   .     0.16 .   *   .     0.30   0.82
 Leu  61 .   A   B     .   .   .   .     0.47 .   *   .     -0.30   0.36
 His  62 .   A   B     .   .   .   .     0.78 .   *   .     -0.30   0.74
Res   Pos. Garni…Alpha   Chou…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alph  Eisen…Beta   Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
Ala   63 A     A   .     .   .   .   .     0.67 .   *     .     0.30   0.65
Phe   64 A     A   .     .   .   .   .     0.67 .   *     .     -0.15   1.37
Asp   65 A     A   .     .   .   .   .     0.56 .   *     F     -0.15   0.83
Gln   66 A     A   .     .   .   .   .     0.56 .   *     F     0.60   1.37
Gln   67 A     A   .     .   .   .   .     0.59 .   *     F     0.60   1.30
Leu   68 A     A   .     .   .   .   .     0.37 *   *     F     0.90   1.35
Asp   69 A     A   .     .   .   .   .     1.18 *   *     .     0.30   0.64
Leu   70 .     A   B     .   .   .   .     0.97 .   *     .     0.94   0.73
Glu   71 .     A   B     .   .   .   .     0.97 .   *     .     1.43   1.37
Leu   72 .     A   B     .   .   .   .     0.67 .   *     .     1.77   1.37
Arg   73 .     .   .     .   .   T   C     1.18 *   *     F     2.86   2.22
Pro   74 .     .   .     .   T   T   .     0.48 *   *     F     3.40   1.72
Asp   75 .     .   .     .   T   T   .     0.48 .   *     F     2.76   1.80
Ser   76 .     .   .     .   .   T   C     -0.11 .   *     F     2.07   0.76
Ser   77 .     .   B     .   .   .   .     0.49 *   *     F     0.73   0.50
Phe   78 .     .   B     .   .   .   .     0.03 *   *     .     0.24   0.46
Leu   79 .     .   B     .   .   .   .     -0.46 .   .     .     -0.40   0.34
Ala   80 .     .   B     .   .   T   .     -0.77 .   .     .     -0.20   0.22
Pro   81 .     .   B     .   .   T   .     -1.28 .   .     .     -0.20   0.37
Gly   82 .     .   .     .   T   T   .     -0.98 .   .     .     0.20   0.37
Phe   83 .     .   B     .   .   T   .     -0.28 .   .     .     -0.20   0.63
Res Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
Thr 84 . .   B     B   .   .   .     -0.32 .   . .     -0.60   0.65
Leu 85 . .   B     B   .   .   .     -0.08 *   * .     -0.60   0.49
Gln 86 . .   B     B   .   .   .     0.24 *   . .     -0.29   0.56
Asn 87 . .   B     .   .   T   .     0.63 *   . F     0.87   0.76
Val 88 . .   B     .   .   T   .     1.03 *   * F     1.93   1.84
Gly 89 . .   .     .   .   T   C     1.00 *   . F     2.74   1.42
Arg 90 . .   .     .   T   T   .     1.51 *   . F     3.10   0.87
Lys 91 . .   .     .   .   T   C     1.51 *   . F     2.74   1.58
Ser 92 . .   .     .   .   T   C     1.20 *   . F     2.43   2.76
Gly 93 . .   .     .   .   T   C     1.84 .   . F     2.38   2.04
Ser 94 . .   .     .   .   T   C     1.38 .   . F     2.33   1.57
Glu 95 . .   .     .   .   .   C     1.06 .   . F     1.63   0.97
Thr 96 . .   .     .   .   .   C     1.01 .   . F     2.04   1.51
Pro 97 . .   .     .   .   .   C     1.00 .   . F     2.60   1.96
Leu 98 . .   .     .   .   .   C     1.34 .   . F     2.04   1.63
Pro 99 A .   .     .   .   .   .     0.83 .   . F     1.58   1.89
Glu 100 A A   .     .   .   .   .     0.24 .   . F     1.12   1.01
Thr 101 A A   .     .   .   .   .     0.52 .   . F     0.86   1.23
Asp 102 A A   .     .   .   .   .     0.07 .   . F     0.60   1.08
Leu 103 A A   .     .   .   .   .     0.18 .   . .     0.30   0.34
Ala 104 A A   .     .   .   .   .     0.14 .   . .     -0.60   0.20
 Res  Pos. Garni…Alpha   Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…   EminiSurfa…
  His   105 .     A   B     .   .   .   .     -0.16 *   . .     -0.60     0.19
  Cys   106 .     A   B     .   .   .   .     -0.19 *   . .     -0.60     0.31
  Phe   107 .     A   B     .   .   .   .     -0.50 *   . .     -0.60     0.30
  Tyr   108 .     .   B     .   .   T   .     -0.54 .   . .     -0.20     0.32
  Ser   109 .     .   .     .   T   T   .     0.04 .   * F     0.35     0.44
  Gly   110 .     .   .     .   T   T   .     -0.27 .   * F     0.35     0.82
  Thr   111 .     .   .     .   T   T   .     0.40 .   * F     0.59     0.52
  Val   112 .     .   B     B   .   .   .     0.89 .   * F     0.93     0.65
  Asn   113 .     .   .     B   T   .   .     0.83 .   * F     1.72     1.01
  Gly   114 .     .   .     B   .   .   C     0.83 .   * F     1.61     0.94
  Asp   115 .     .   .     .   .   T   C     0.59 .   * F     2.40     1.69
  Pro   116 .     .   .     .   .   T   C     0.31 .   * F     2.16     1.06
  Ser   117 .     .   .     .   .   T   C     0.58 .   * F     1.92     1.08
  Ser   118 A     .   .     .   .   T   .     -0.23 .   . F     1.33     0.66
  Ala   119 A     A   .     .   .   .   .     -0.19 .   . .     -0.06     0.35
  Ala   120 A     A   .     .   .   .   .     -1.00 .   . .     -0.30     0.35
  Ala   121 A     A   .     .   .   .   .     -1.46 .   . .     -0.60     0.22
  Leu   122 A     A   .     .   .   .   .     -1.16 .   . .     -0.60     0.11
  Ser   123 A     A   .     .   .   .   .     -1.20 .   . .     -0.30     0.20
  Leu   124 A     A   .     .   .   .   .     -1.47 *   * .     -0.30     0.19
  Cys   125 .     A   B     .   .   .   .     -0.77 *   * .     -0.30     0.17
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig… EminiSurfa…
 Glu  126 . A   B     .   .   .   .     -0.52   *     * .     0.30   0.25
 Gly  127 A .   .     .   .   .   .     -0.30   *     * F     0.65   0.30
 Val  128 A .   .     .   .   .   .     -0.70   *     * F     0.65   0.57
 Arg  129 . .   B     .   .   .   .     -0.13   *     * F     0.65   0.29
 Gly  130 . .   B     B   .   .   .     -0.28   *     * .     -0.60   0.45
 Ala  131 . .   B     B   .   .   .     -1.09   *     * .     -0.60   0.50
 Phe  132 . .   B     B   .   .   .     -1.09   *     * .     -0.60   0.21
 Tyr  133 . .   B     B   .   .   .     -0.23   *     * .     -0.60   0.21
 Leu  134 . A   B     B   .   .   .     -0.93   *     * .     -0.60   0.36
 Leu  135 . A   B     B   .   .   .     -0.83   .     * .     -0.60   0.42
 Gly  136 A A   .     B   .   .   .     -0.94   .     . .     -0.60   0.42
 Glu  137 A A   .     .   .   .   .     -1.13   .     . .     -0.60   0.44
 Ala  138 A A   .     B   .   .   .     -0.89   .     . .     -0.60   0.38
 Tyr  139 . .   B     B   .   .   .     -0.29   .     . .     -0.60   0.66
 Phe  140 . .   B     B   .   .   .     -0.29   .     . .     -0.60   0.59
 Ile  141 . .   B     B   .   .   .     -0.16   .     . .     -0.60   0.48
 Gln  142 . .   B     B   .   .   .     -0.74   .     . .     -0.60   0.48
 Pro  143 . .   B     B   .   .   .     -0.74   .     . .     -0.60   0.55
 Leu  144 . A   .     .   .   .   C     -0.80   *     . .     -0.40   0.80
 Pro  145 . A   .     .   .   .   C     -0.10   *     . .     -0.10   0.62
 Ala  146 A A   .     .   .   .   .     0.90   *     * .     0.30   0.69
 Res Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn   Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala 147 A A   .     .   .   .     .     0.09 *   . .     0.75   1.64
  Ser 48 A A   .     .   .   .     .     -0.29 *   . F     0.75   0.88
  Glu 149 A A   .     .   .   .     .     0.21 *   . F     0.45   0.88
  Arg 150 A A   .     .   .   .     .     -0.17 *   . F     0.60   1.25
Leu 151 A A . . . . . -0.17 * . . 0.30 0.94
  Ala 152 A A   .     .   .   .     .     0.21 *   * .     0.30   0.55
  Thr 153 A A   .     .   .   .     .     0.17 *   * .     0.04   0.43
  Ala 154 A A   .     .   .   .     .     0.17 .   . .     0.08   0.52
  Ala 155 . .   .     .   .   T     C     0.10 .   * F     2.07   0.89
  Pro 156 . .   .     .   .   T     C     0.70 .   . F     2.86   1.24
  Gly 157 . .   .     .   T   T     .     1.08 .   . F     3.40   1.90
  Glu 158 . .   .     .   .   T     C     0.80 .   . F     2.86   2.90
  Lys 159 . .   .     .   .   .     C     1.18 .   . F     2.32   1.90
  Pro 160 . .   .     .   .   .     C     0.96 .   * F     1.98   2.97
  Pro 161 . .   .     .   .   .     C     1.17 .   * F     1.64   1.41
  Ala 162 A A   .     .   .   .     .     0.81 .   * F     0.60   1.22
  Pro 163 A A   .     .   .   .     .     0.78 .   * .     -0.60   0.68
  Leu 164 A A   .     .   .   .     .     -0.08 .   * .     -0.60   0.60
  Gln 165 A A   .     .   .   .     .     -0.68 *   * .     -0.60   0.49
  Phe 166 . A   B     .   .   .     .     -0.36 *   * .     -0.60   0.26
  His 167 . A   B     .   .   .     .     0.34 *   * .     -0.26   0.62
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn   Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Leu   168   .   A   B     .   .   .     .     0.56 *   * .     0.38   0.70
  Leu   169   .   A   B     .   .   .     .     1.48 *   * .     0.87   1.31
  Arg   170   .   .   .     .   T   T     .     1.48 *   . F     3.06   1.88
  Arg   171   .   .   .     .   T   T     .     1.83 *   . F     3.40   3.96
  Asn   172   .   .   .     .   T   T     .     1.87 *   . F     3.06   4.75
  Arg   173   .   .   .     .   T   T     .     1.82 *   . F     2.72   4.05
  Gln   174   .   .   .     .   T   .     .     2.29 .   . F     2.43   1.53
  Gly   175   .   .   .     .   T   .     .     1.83 .   . F     2.19   0.94
  Asp   176   .   .   .     .   T   T     .     1.41 .   * F     2.30   0.48
  Val   177   .   .   B     .   .   T     .     0.74 *   . F     1.85   0.40
  Gly   178   .   .   .     .   T   T     .     0.29 *   . F     2.50   0.22
  Gly   179   .   .   B     .   .   T     .     -0.57 .   * F     1.85   0.13
  Thr   180   .   .   B     B   .   .     .     -1.08 .   * F     0.30   0.13
  Cys   181   .   .   B     B   .   .     .     -1.08 .   . .     -0.10   0.10
  Gly   182   .   .   B     B   .   .     .     -0.22 .   . .     -0.05   0.16
  Val   183   .   .   B     B   .   .     .     0.12 .   . .     0.30   0.19
  Val   184   .   .   B     B   .   .     .     0.26 *   * .     0.90   0.60
  Asp   185   .   .   B     .   .   T     .     0.68 *   * F     1.75   0.94
  Asp   186   .   .   B     .   .   T     .     1.13 *   * F     2.20   2.49
  Glu   187   .   .   B     .   .   T     .     1.17 *   * F     2.50   5.18
  Pro   188   .   .   .     .   .   T     C     1.68 *   * F     3.00   4.48
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn   Chou-…Turn   Garni…Coil   Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta   Karpl…Flexi… James…Antig…  EminiSurfa…
 Arg   189 . .   .     .   .     T     C     2.58   *   *     F 2.70   2.66
 Pro   190 . .   .     .   .     T     C     1.99   *   *     F 2.40   3.07
 Thr   191 . .   .     .   .     T     C     1.99   *   *     F 2.10   2.00
 Gly   192 . .   .     .   .     T     C     1.68   *   *     F 1.80   1.77
 Lys   193 A A   .     .   .     .     .     1.89   *   *     F 0.90   1.65
 Ala   194 A A   .     .   .     .     .     1.78   *   *     F 0.90   1.98
 Glu   195 A A   .     .   .     .     .     1.99   .   *     F 0.90   3.35
 Thr   196 A A   .     .   .     .     .     2.30   .   *     F 0.90   2.90
 Glu   197 A A   .     .   .     .     .     2.64   .   *     F 0.90   4.79
 Asp   198 A A   .     .   .     .     .     2.26   .   *     F 0.90   4.79
 Glu   199 A A   .     .   .     .     .     2.53   .   .     F 0.90   3.29
 Asp   200 A .   .     .   .     T     .     2.53   .   .     F 1.30   2.74
 Glu   201 A .   .     .   .     T     .     2.50   .   .     F 1.30   2.84
 Gly   202 A .   .     .   .     T     .     2.50   .   .     F 1.30   1.62
 Thr   203 A .   .     .   .     T     .     2.50   .   .     F 1.30   1.68
 Glu   204 A A   .     .   .     .     .     2.50   *   .     F 0.90   1.62
 Gly   205 A A   .     .   .     .     .     2.16   *   .     F 1.20   2.84
 Glu   206 A A   .     .   .     .     .     1.94   *   .     F 1.50   1.95
 Asp   207 . A   .     .   T     .     .     2.29   *   .     F 2.20   1.74
 Glu   208 . A   .     .   .     .     C     2.31   *   .     F 2.30   3.04
 Gly   209 . .   .     .   .     T     C     2.01   *   .     F 3.00   1.85
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
 Pro  210 . . .     .   T   T   .     2.14 .   .   F     2.60   1.48
 Gln  211 . . .     .   T   T   .     2.14 .   .   F     2.30   1.32
 Trp  212 . . .     .   .   T   C     2.14 .   .   F     1.44   2.32
 Ser  213 . . .     .   .   .   C     1.93 .   .   F     1.78   2.50
 Pro  214 . . .     .   T   T   .     1.69 .   .   F     2.12   2.23
 Gln  215 . . .     .   .   T   C     1.09 .   .   F     1.56   2.15
 Asp  216 . . .     .   .   T   C     1.09 .   *   F     2.40   1.32
 Pro  217 . . .     .   .   T   C     1.03 .   .   F     2.16   1.48
 Ala  218 . . .     .   T   .   .     0.48 .   .   F     1.77   0.85
 Leu  219 . . B     .   .   .   .     0.34 *   .   F     0.53   0.38
 Gln  220 . . B     .   .   .   .     0.34 *   .   F     -0.01   0.24
 Gly  221 . . B     .   .   T   .     0.13 *   *   F     -0.05   0.41
 Val  222 . . B     .   .   T   .     0.03 *   .   F     -0.05   0.77
 Gly  223 . . B     .   .   T   .     0.28 *   .   F     0.25   0.64
 Gln  224 . . B     .   .   T   .     0.78 *   *   F     0.25   0.64
 Pro  225 . . B     .   .   .   .     0.43 .   .   F     0.20   1.25
 Thr  226 . . .     .   T   .   .     0.48 .   *   F     0.60   1.25
 Gly  227 . . .     .   .   T   C     0.44 *   *   F     0.45   0.97
 Thr  228 . . B     .   .   T   .     0.90 *   *   F     0.25   0.44
 Gly  229 . . B     .   .   T   .     0.94 .   *   F     0.85   0.60
 Ser  230 . . B     .   .   T   .     1.20 .   *   F     1.30   1.20
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta   Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Ile   231 . A   B     .   .   .   .     1.62 .   *     F     0.90   1.67
  Arg   232 . A   B     .   .   .   .     1.27 .   *     F     0.90   3.30
  Lys   233 . A   B     .   .   .   .     0.72 .   .     F     0.90   2.13
  Lys   234 . A   B     B   .   .   .     0.77 .   .     F     0.90   2.26
  Arg   235 . A   B     B   .   .   .     0.77 .   .     F     0.90   1.55
  Phe   236 . .   B     B   .   .   .     1.62 .   *     .     0.75   1.04
  Val   237 . .   B     B   .   .   .     1.62 .   *     .     0.30   0.71
  Ser   238 . .   B     .   .   T   .     1.33 *   *     .     0.70   0.71
  Ser   239 . .   .     .   .   T   C     0.43 *   .     .     0.15   1.28
  His   240 . .   .     .   .   T   C     0.32 *   *     .     0.45   1.28
  Arg   241 . .   .     .   .   T   C     0.71 *   .     .     1.05   1.65
  Tyr   242 A .   .     B   .   .   .     0.97 *   .     .     0.45   1.78
  Val   243 A .   .     B   .   .   .     0.46 *   .     .     0.45   1.29
  Glu   244 . .   B     B   .   .   .     -0.10 *   .     .     -0.30   0.54
  Thr   245 . .   B     B   .   .   .     -0.66 *   .     .     -0.60   0.26
  Met   246 A .   B     B   .   .   .     -0.77 *   .     .     -0.60   0.35
  Leu   247 A .   .     B   .   .   .     -0.52 .   .     .     0.30   0.34
  Val   248 A .   .     B   .   .   .     0.03 .   .     .     -0.30   0.41
  Ala   249 A .   .     B   .   .   .     -0.57 .   .     .     -0.30   0.55
  Asp   250 A .   .     .   .   T   .     -0.84 .   .     F     0.25   0.66
  Gln   251 A .   .     .   .   T   .     -0.24 .   .     F     0.25   0.90
Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
Ser   252 A   .   .     .   .   T   .     -0.13 .   .   F     1.30   1.54
Met   253 A   .   .     .   .   T   .     0.69 .   *   .     0.70   0.80
Ala   254 A   .   .     .   .   .   .     0.93 .   *   .     -0.10   0.63
Glu   255 A   .   .     .   .   .   .     0.63 .   *   .     -0.10   0.46
Phe   256 A   .   .     .   .   .   .     0.29 .   *   .     -0.10   0.63
His   257 A   .   .     .   .   T   .     -0.22 *   .   .     0.10   0.61
Gly   258 A   .   .     .   .   T   .     0.42 *   .   F     0.25   0.29
Ser   259 A   .   .     .   .   T   .     0.98 *   *   F     0.25   0.68
Gly   260 A   .   .     .   .   T   .     0.73 *   *   F     0.85   0.68
Leu   261 A   A   .     .   .   .   .     0.62 .   .   F     0.00   1.07
Lys   262 A   A   .     .   .   .   .     -0.16 .   .   .     -0.60   0.66
His   263 .   A   B     .   .   .   .     -0.12 *   .   .     -0.60   0.55
Tyr   264 .   A   B     .   .   .   .     -0.63 *   .   .     -0.60   0.96
Leu   265 .   A   B     .   .   .   .     -0.99 *   .   .     -0.60   0.40
Leu   266 .   A   B     .   .   .   .     -0.48 *   .   .     -0.60   0.25
Thr   267 .   A   B     .   .   .   .     -1.38 *   .   .     -0.60   0.22
Leu   268 .   A   B     .   .   .   .     -1.93 *   .   .     -0.60   0.19
Phe   269 A   A   .     .   .   .   .     -2.28 *   *   .     -0.60   0.24
Ser   270 A   A   .     .   .   .   .     -1.36 *   *   .     -0.60   0.17
Val   271 A   A   .     .   .   .   .     -1.36 *   *   .     -0.60   0.39
Ala   272 A   A   .     .   .   .   .     -1.29 *   *   .     -0.60   0.38
 Res  Pos. Garni…Alpha   Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala   273 A     A   .     .   .   .   .   -0.43   *   * .     -0.60     0.44
  Arg   274 A     A   .     .   .   .   .   0.23   *   * .     -0.15     1.18
  Leu   275 A     A   .     .   .   .   .   0.32   *   * .     0.45     1.59
  Tyr   276 .     .   .     .   T   .   .   0.88   *   * .     1.39     2.44
  Lys   277 .     .   B     .   .   .   .   0.58   *   * F     1.48     1.67
  His   278 .     .   B     .   .   T   .   1.28   .   * F     1.12     1.42
  Pro   279 .     .   B     .   .   T   .   1.17   .   * F     2.36     1.77
  Ser   280 .     .   .     .   T   T   .   1.68   .   * F     3.40     1.43
  Ile   281 .     .   B     .   .   T   .   1.07   .   * F     2.36     1.41
  Arg   282 .     .   B     B   .   .   .   0.72   .   * F     1.47     0.67
  Asn   283 .     .   B     B   .   .   .   -0.06   *   * F     1.13     0.67
  Ser   284 .     .   B     B   .   .   .   -0.70   *   * F     0.19     0.79
  Val   285 .     .   B     B   .   .   .   -1.26   *   * .     -0.30     0.30
  Ser   286 .     .   B     B   .   .   .   -1.22   .   * .     -0.60     0.14
  Leu   287 .     .   B     B   .   .   .   -1.29   .   * .     -0.60     0.08
  Val   288 .     .   B     B   .   .   .   -2.18   *   . .     -0.60     0.21
  Val   289 .     .   B     B   .   .   .   -2.69   .   * .     -0.60     0.11
  Val   290 .     .   B     B   .   .   .   -2.69   .   . .     -0.60     0.11
  Lys   291 .     .   B     B   .   .   .   -3.28   .   . .     -0.60     0.11
  Ile   292 .     .   B     B   .   .   .   -2.50   .   . .     -0.60     0.10
  Leu   293 .     .   B     B   .   .   .   -1.64   .   * .     -0.60     0.19
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Val   294 .   .   B     B   .   .   .     -0.79 .   .   .     -0.30   0.16
  Ile   295 .   .   B     B   .   .   .     0.07 .   *   .     0.00   0.39
  His   296 A   .   .     B   .   .   .     0.07 .   *   .     0.90   0.81
  Asp   297 A   .   .     B   .   .   .     0.61 .   .   F     1.80   2.19
  Glu   298 A   .   .     .   .   .   .     1.21 *   .   F     2.30   3.09
  Gln   299 .   .   .     .   T   .   .     2.07 *   .   F     3.00   3.51
  Lys   300 .   .   .     .   .   .   C     2.10 .   .   F     2.50   3.64
  Gly   301 .   .   .     .   .   T   C     1.82 .   .   F     2.40   1.56
  Pro   302 .   .   .     .   .   T   C     1.52 .   .   F     2.10   1.30
  Glu   303 .   .   B     .   .   T   .     1.52 *   .   F     1.45   0.87
  Val   304 A   .   .     .   .   T   .     0.93 *   .   F     1.00   1.42
  Thr   305 A   .   .     .   .   T   .     0.30 .   *   F     0.85   0.93
  Ser   306 A   .   .     .   .   T   .     -0.17 .   *   F     0.85   0.54
  Asn   307 A   .   .     .   .   T   .     -0.27 .   *   F     -0.05   0.60
  Ala   308 A   .   .     .   .   T   .     -1.08 *   *   .     -0.20   0.60
  Ala   309 A   .   .     .   .   .   .     -0.11 *   *   .     -0.40   0.37
  Leu   310 A   .   .     .   .   .   .     0.20 *   *   .     -0.10   0.45
  Thr   311 .   .   B     .   .   .   .     -0.20 *   *   .     -0.10   0.72
  Leu   312 .   .   B     .   .   .   .     -0.87 *   *   .     -0.40   0.61
  Arg   313 .   .   B     .   .   .   .     -0.28 *   *   .     -0.40   0.40
  Asn   314 .   .   .     .   T   .   .     0.02 *   *   .     0.30   0.44
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn   Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Phe   315 . .   .     .   T     T   .     0.83   *     * .     0.20   0.57
  Cys   316 . .   .     .   T     T   .     1.19   *     * .     0.20   0.50
  Asn   317 . .   .     .   T     T   .     2.00   *     * .     0.20   0.62
  Trp   318 . .   .     .   T     T   .     1.86   *     . .     0.35   1.25
  Gln   319 . .   .     .   T     .   .     1.86   .     . .     0.45   3.16
  Lys   320 . .   .     .   T     .   .     2.34   *     . F     0.60   3.16
  Gln   321 . .   .     .   T     .   .     2.80   .     . F     0.94   4.65
  His   322 . .   .     .   .     .   C     2.50   *     . F     1.68   4.15
  Asn   323 . .   .     .   .     .   C     2.79   *     . F     2.02   2.78
  Pro   324 . .   .     .   .     T   C     2.90   .     . F     2.56   2.68
  Pro   325 . .   .     .   T     T   .     2.86   *     . F     3.40   3.86
  Ser   326 . .   .     .   .     T   C     2.27   .     . F     2.86   4.01
  Asp   327 . .   .     .   .     T   C     2.30   .     . F     2.52   2.62
  Arg   328 A A   .     .   .     .   .     2.27   .     . F     1.58   2.94
  Asp   329 A A   .     .   .     .   .     2.23   *     . F     1.24   2.98
  Ala   330 A A   .     .   .     .   .     2.44   *     . .     0.90   2.80
  Glu   331 A A   .     .   .     .   .     2.43   *     . .     0.75   2.38
  His   332 A .   .     .   .     T   .     1.84   *     . .     1.15   2.06
  Tyr   333 A .   .     .   .     T   .     0.84   *     . .     0.85   2.06
  Asp   334 A .   .     .   .     T   .     0.03   .     . .     0.70   0.83
  Thr   335 A .   .     .   .     T   .     -0.08   .     . .     -0.20   0.51
 Res  Pos. Garni…Alpha   Chou-…Alpha   Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala   336 A     A     .     .   .   .   .     -0.39   *   . .     -0.60   0.28
  Ile   337 A     A     .     .   .   .   .     -0.24   *   . .     -0.60   0.24
  Leu   338- .     A     B     .   .   .   .     0.00   .   . .     -0.60   0.33
  Phe   339 .     A     B     .   .   .   .     0.00   .   * .     -0.60   0.56
  Thr   340 .     A     B     .   .   .   .     -0.50   .   . F     0.00   1.34
  Arg   341 .     A     B     .   .   .   .     -0.58   .   * F     0.25   1.34
  Gln   342 .     A     .     .   T   .   .     -0.03.   .   * F     1.35   0.83
  Asp   343 .     A     .     .   T   .   .     0.48   .   * F     1.60   0.57
  Leu   344 .     A     .     .   T   .   .     1.18   *   . F     2.15   0.39
  Cys   345 .     .     .     .   T   T   .     1.18   .   * F     2.50   0.39
  Gly   346 .     .     .     .   T   T   .     0.40   .   * F     2.25   0.34
  Ser   347 .     .     .     .   T   T   .     0.40   .   . F     1.10   0.22
  Gln   348 .     .     B     .   .   T   .     0.09   .   . F     1.35   0.68
  Thr   349 .     .     B     .   .   .   .     0.09   .   . F     0.90   0.99
  Cys   350 .     .     B     .   .   .   .     0.41   .   . F     0.05   0.61
  Asp   351 .     .     B     .   .   T   .     0.16   *   . F     0.25   0.35
  Thr   352 .     .     B     .   .   T   .     -0.13   .   . F     0.25   0.24
  Leu   353 .     .     B     .   .   T   .     -0.13   .   . .     0.10   0.45
  Gly   354 .     .     B     .   .   T   .     -0.68   .   . .     0.70   0.45
  Met   355 .     .     B     .   .   .   .     -0.36   .   . .     -0.10   0.23
  Ala   356 .     .     B     .   .   .   .     -0.67   .   . .     -0.10   0.28
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta   Karpl…Flexi…   James…Antig… EminiSurfa…
  Asp  357 . .   B     .   .   T   .     -1.21 .   .     .     0.10 0.41
  Val  358 . .   B     .   .   T   .     -1.07 .   .     .     0.10 0.30
  Gly  359 . .   B     .   .   T   .     -0.72 .   .     .     0.10 0.16
  Thr  360 . .   B     .   .   T   .     -0.33 .   .     .     0.70 0.16
  Val  361 . .   B     .   .   .   .     -0.04 .   *     .     0.24 0.34
  Cys  362 . .   B     .   .   .   .     0.07 *   .     .     1.18 0 46
  Asp  363 . .   B     .   .   T   .     0.62 *   .     F     1.87 0.62
  Pro  364 . .   .     .   T   T   .     0.30 *   .     F     3.06 1.12
  Ser  365 . .   .     .   T   T   .     0.31 *   .     F     3.40 1.12
  Arg  366 . .   .     .   T   T   .     0.31 *   .     F     2.91 0.90
  Ser  367 . .   .     B   T   .   .     0.09 *   .     F     1.87 0.43
  Cys  368 . .   B     B   .   .   .     0.09 *   .     .     0.38 0.22
  Ser  369 . .   B     B   .   .   .     0.30 *   .     .     0.64 0.20
  Val  370 . .   B     B   .   .   .     0.60 *   .     .     0.30 0.25
  Ile  371 . .   B     B   .   .   .     0.14 *   .     .     0.60 0.77
Glu 372 . . B B . . . -0.37 . . . 0.60 0.57
  Asp  373 A .   .     .   .   T   .     0.30 .   .     F     1.15 0.63
  Asp  374 A .   .     .   .   T   .     0.01 *   .     .     1.30 1.56
  Gly  375 A .   .     .   .   T   .     0.28 .   .     .     1.00 0.91
  Leu  376 A .   .     .   .   T   .     0.47 *   .     .     0.70 0.55
  Gln  377 A A   .     .   .   .   .     0.16 .   .     .     -0.30 0.29
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha   Garni…Beta   Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil   Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…   James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala   378 A A     .     .   .   .   .     -0.16   *   . .     -0.60   0.42
  Ala   379 A A     .     .   .   .   .     -0.74   *   . .     -0.60   0.73
  Phe   380 A A     .     .   .   .   .     -0.43   *   . .     -0.60   0.43
  Thr   381 A A     .     .   .   .   .     0.38   *   * .     -0.60   0.57
  Thr   382 A A     .     .   .   .   .     -0.43   *   . .     -0.30   0.98
  Ala   383 A A     .     .   .   .   .     -0.19   *   . .     -0.60   0.94
  His   384 A A     .     .   .   .     0.37   *   . .     -0.30   0.64
  Glu   385 A A     .     .   .   .   .     0.21   *   . .     -0.30   0.61
  Leu   386 A A     .     .   .   .   .     -0.18   *   . .     -0.30   0.45
  Gly   387 A .     .     B   .   .   .     0.13   *   . .     -0.60   0.28
  His   388 A .     .     B   .   .   .     0.12   *   . .     -0.60   0.26
  Val   389 A .     .     B   .   .   .     -0.06   *   . .     -0.60   0.32
  Phe   390 A .     .     B   .   .   .     -0.09   *   . .     -0.60   0.49
  Asn   391 . .     B     B   .   .   .     0.72   *   . .     -0.60   0.49
  Met   392 . .     B     .   .   T   .     1.07   *   . .     0.25   1.11
  Pro   393 A .     .     .   .   T   .     0.51   *   . .     0.85   2.14
  His   394 . .     .     .   T   T   .     1.41   *   . F     1.70   1.34
  Asp   395 A .     .     .   .   T   .     2.11   *   . F     1.30   2.72
  Asp   396 A A     .     .   .   .   .     1.44   *   . F     0.90   3.04
  Ala   397 A A     .     .   .   .   .     1.46   *   . F     0.90   1.20
  Lys   398 A A     .     .   .   .   .     1.37   *   * F     0.75   0.73
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gln  399 A A   .     .   .   .   .     0.59 .   * .     0.60   0.58
  Cys  400 . A   B     .   .   .   .     0.59 .   * .     -0.30   0.48
  Ala  401 . A   B     .   .   .   .     0.24 .   * .     0.30   0.38
  Ser  402 . .   B     .   .   T   .     -0.02 .   * .     0.10   0.22
  Leu  403 . .   B     .   .   T   .     -0.07 .   . .     0.04   0.30
  Asn  404 . .   .     .   T   T   .     -0.07 .   . .     0.68   0.48
  Gly  405 . .   .     .   T   T   .     0.60 .   . F     1.37   0.62
  Val  406 . .   .     .   .   .   C     0.89 .   . F     1.96   1.26
  Asn  407 . .   .     .   .   T   C     1.16 .   . F     2.40   1.05
  Gln  408 A .   .     .   .   T   .     1.37 *   . F     1.96   1.44
  Asp  409 A .   .     .   .   T   .     0.77 *   . F     1.72   1.92
  Ser  410 A .   .     .   .   T   .     0.52 .   . .     1.33   1.18
  His  411 A A   .     .   .   .   .     1.08 .   * .     -0.06   0.69
  Met  412 A A   .     .   .   .   .     0.48 .   . .     0.30   0.55
  Met  413 A A   .     .   .   .   .     -0.33 .   . .     -0.60   0.41
  Ala  414 A A   .     .   .   .   .     -0.63 .   . .     -0.60   0.25
  Ser  415 A A   .     .   .   .   .     -0.33 *   . .     -0.60   0.34
  Met  416 A A   .     .   .   .   .     -1.11 *   * .     -0.60   0.55
  Leu  417 A .   .     .   .   T   .     -0.51 *   . .     -0.20   0.45
  Ser  418 A .   .     .   .   T   .     0.06 *   . .     0.38   0.56
  Asn  419 A .   .     .   .   T   .     0.34 .   . .     0.66   0.76
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Leu  420 . .   .     .   .   T   C     0.64 .   .   .     1.29   1.24
  Asp  421 . .   .     .   T   T   .     1.03 .   .   .     2.37   1.60
  His  422 . .   .     .   T   T   .     1.56 .   .   F     2.80   1.54
  Ser  423 . .   .     .   .   T   C     1.56 .   .   F     1.72   1.97
  Gln  424 . .   .     .   .   T   C     1.34 .   .   F     1.44   1.58
  Pro  425 . .   .     .   T   .   .     1.49 .   .   F     0.86   1.79
  Trp  426 . .   .     .   T   .   .     1.19 .   .   F     0.43   0.72
  Ser  427 . .   .     .   .   T   C     0.63 .   .   F     0.15   0.55
  Pro  428 . .   .     .   T   T   .     0.69 .   .   F     0.35   0.36
  Cys  429 . .   .     .   T   T   .     0.09 .   .   .     0.20   0.54
  Ser  430 . .   B     .   .   T   .     -0.59 .   .   .     -0.20   0.40
  Ala  431 . .   B     B   .   .   .     -0.61 .   .   .     -0.60   0.18
  Tyr  432 . .   B     B   .   .   .     -0.61 .   .   .     -0.60   0.49
  Met  433 . .   B     B   .   .   .     -1.10 .   .   .     -0.60   0.49
  Ile  434 . .   B     B   .   .   .     -1.24 *   .   .     -0.60   0.42
  Thr  435 . .   B     B   .   .   .     -0.94 *   .   .     -0.60   0.22
  Ser  436 . .   B     B   .   .   .     -0.36 *   .   .     -0.60   0.37
  Phe  437 . .   B     B   .   .   .     -0.46 *   .   .     -0.60   0.85
  Leu  438 . .   B     .   .   T   .     0.11 *   .   F     0.56   0.58
  Asp  439 . .   .     .   T   T   .     0.66 *   .   F     1.27   0.59
  Asn  440 . .   .     .   .   T   C     0.97 .   .   F     1.38   0.68
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gly  441 .   .   .     .   T   T   .     0.60 .   .     F     2.94   1.42
  His  442 .   .   .     .   T   T   .     0.49 .   .     F     3.10   0.46
  Gly  443 A   .   .     .   .   T   .     0.70 .   .     F     1.49   0.23
  Glu  444 A   .   .     .   .   T   .     0.70 .   .     .     1.03   0.23
  Cys  445 .   .   B     .   .   T   .     0.74 .   *     .     1.32   0.29
  Leu  446 .   A   B     .   .   .   .     0.88 .   .     .     1.25   0.58
  Met  447 .   A   B     .   .   .   .     0.91 *   .     .     1.28   0.52
  Asp  448 .   A   .     .   T   .   .     1.26 *   .     F     2.02   1.67
  Lys  449 .   A   .     .   .   .   C     1.04 *   .     F     2.16   3.26
  Pro  450 .   .   .     .   T   T   .     0.82 *   *     F     3.40   5.10
  Gln  451 .   .   .     .   T   T   .     1.63 *   *     F     3.06   2.14
  Asn  452 .   .   B     .   .   T   .     1.42 *   *     F     2.02   1.85
  Pro  453 .   .   B     .   .   T   .     1.21 *   *     F     0.63   0.99
  Ile  454 .   .   B     .   .   .   .     0.82 *   *     F     0.09   0.88
  Gln  455 .   .   B     .   .   .   .     1.03 *   *     F     -0.25   0.54
  Leu  456 .   .   B     .   .   T   .     0.22 *   *     F     0.25   0.59
  Pro  457 .   .   B     .   .   T   .     0.01 *   *     F     0.25   0.69
  Gly  458 .   .   B     .   .   T   .     -0.12 .   *     F     0.25   0.62
  Asp  459 .   .   B     .   .   T   .     0.46 .   *     F     0.25   0.74
  Leu  460 .   .   .     .   .   T   C     0.16 .   *     F     1.05   0.69
  Pro  461 .   .   B     .   .   T   .     0.72 .   *     F     0.85   0.93
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha   Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garnl…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gly   462 .   .    B     .   .   T   .     0.93 .   .   F     0.25   0.88
  Thr   463 .   .    B     .   .   T   .     0.69 .   *   F     0.74   1.78
  Ser   464 .   .    B     .   .   .   .     0.69 *   .   F     1.48   1.16
  Tyr   465 .   .    .     .   T   .   .     1.61 *   .   F     2.22   1.88
Asp 466 . . . . T T . 1.82 . . . 2.61 2.56
  Ala   467 .   .    .     .   T   T   .     1.50 *   .   F     3.40   3.31
  Asn   468 .   .    .     .   T   T   .     1.81 .   *   F     2.76   1.13
  Arg   469 .   .    B     .   .   T   .     1.41 .   *   F     2.32   1.17
  Gln   470 .   .    B     B   .   .   .     1.34 *   *   .     0.53   1.01
  Cys   471 .   .    B     B   .   .   .     0.64 *   *   .     0.04   0.90
  Gln   472 .   .    B     B   .   .   .     0.89 .   .   .     -0.60   0.40
  Phe   473 .   .    B     B   .   .   .     0.89 .   .   .     -0.26   0.23
  Thr   474 .   .    B     B   .   .   .     0.78 .   .   .     0.08   0.74
  Phe   475 .   .    .     B   T   .   .     0.48 .   *   .     1.72   0.71
  Gly   476 .   .    .     .   T   T   .     1.19 .   *   F     2.76   1.10
  Glu   477 .   .    .     .   T   T   .     1.16 .   *   F     3.40   1.52
  Asp   478 .   .    .     .   T   T   .     1.19 *   .   F     3.06   2.39
  Ser   479 .   .    .     .   T   T   .     1.29 *   .   F     2.72   1.30
  Lys   480 .   .    .     .   T   .   .     1.99 *   .   F     2.43   1.16
  His   481 .   .    .     .   T   .   .     1.74 *   .   F     2.34   1.16
  Cys   482 .   .    .     .   .   T   C     1.16 *   .   F     2.10   0.87
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Pro  483 A .   .     .   .   T   .     0.86 .   .   F     2.15   0.44
  Asp  484 . .   .     .   T   T   .     0.84 *   .   F     2.50   0.43
  Ala  485 A .   .     .   .   T   .     0.13 *   .   F     2.00   1.17
  Ala  486 A .   .     .   .   .   .     -0.13 .   .   F     1.40   0.41
Ser 487 . . B . T T . 0.22 . . F 1.75 0.33
  Thr  488 . .   B     .   .   T   .     -0.38 *   .   F     0.50   0.46
  Cys  489 . .   B     .   .   T   .     -0.67 *   .   F     -0.05   0.38
  Ser  490 . .   B     .   .   T   .     -0.74 .   .   F     -0.05   0.30
  Thr  491 . .   B     B   .   .   .     -0.47 .   .   .     -0.60   0.11
  Leu  492 . .   B     B   .   .   .     -0.51 .   .   .     -0.60   0.30
  Trp  493 . .   B     B   .   .   .     -0.51 .   .   .     -0.60   0.22
  Cys  494 . .   B     B   .   .   .     -0.14 .   .   .     -0.60   0.22
  Thr  495 . .   B     B   T   .   .     -0.19 .   .   F     -0.05   0.36
  Gly  496 . .   .     B   T   .   .     -0.22 .   .   F     -0.05   0.34
  Thr  497 . .   .     .   T   T   .     -0.27 .   .   F     0.65   0.62
  Ser  498 . .   .     .   T   T   .     -0.79 .   .   F     0.65   0.32
  Gly  499 . .   .     .   T   T   .     -0.98 .   .   F     0.35   0.27
  Gly  500 . .   .     .   T   T   .     -1.33 .   .   F     0.35   0.14
  Val  501 . .   B     B   .   .   .     -0.99 .   .   .     -0.60   0.05
  Leu  502 . .   B     B   .   .   .     -0.99 .   .   .     -0.60   0.10
  Val  503 . .   B     B   .   .   .     -0.64 .   .   .     -0.60   0.14
Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
Cys  504 . .   B     .   .   T   .     -0.33 .   .     .     -0.20   0.38
Gln  505 . .   B     .   .   T   .     -0.69 .   .     .     0.10   0.62
Thr  506 . .   B     .   .   T   .     -0.04 .   .     F     0.25   0.72
Lys  507 . .   B     .   .   T   .     0.48 .   .     F     0.40   2.09
His  508 . .   .     .   .   .   C     0.74 .   .     .     -0.05   1.27
Phe  509 . .   B     .   .   .   .     1.41 .   .     .     -0.40   0.89
Pro  510 . .   .     .   T   .   .     1.07 .   .     .     0.30   0.74
Trp  511 . .   .     .   T   T   .     1.07 .   .     .     0.20   0.54
Ala  512 . .   .     .   T   T   .     0.72 .   .     .     0.51   0.90
Asp  513 . .   .     .   T   T   .     0.09 .   .     F     1.27   0.78
Gly  514 . .   .     .   T   T   .     0.44 .   .     F     1.58   0.40
Thr  515 . .   .     .   T   T   .     0.66 .   .     F     2.49   0.39
Ser  516 . .   .     .   T   T   .     0.60 .   *     F     3.10   0.40
Cys  517 . .   .     .   T   T   .     1.23 .   *     F     2.49   0.40
Gly  518 . .   .     .   T   T   .     0.94 .   *     F     2.48   0.56
Glu 519 . . . . T . . 0.62 . * F 1.67 0.44
Gly  520 . .   .     .   T   .   .     0.04 .   *     F     1.36   0.44
Lys  521 . .   .     .   T   .   .     0.34 .   *     F     0.45   0.31
Trp  522 . .   .     .   T   .   .     0.67 .   *     .     0.90   0.29
Cys 523 . . B . . T . 1.06 . * . -0.20 0.29
Ile  524 . .   B     .   .   T   .     0.39 .   *     .     0.70   0.29
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Asn   525 .   .     .     .   T   T   .     -0.12 .   *   .     0.20   0.15
  Gly   526 .   .     .     .   T   T   .     -0.17 *   *   F     0.65   0.20
  Lys   527 .   .     .     .   T   .   .     0.17 *   *   F     0.45   0.47
  Cys   528 .   .     .     .   T   T   .     0.52 .   *   .     1.40   0.58
  Val   529 .   .     B     .   .   T   .     1.41 *   *   .     1.04   0.85
  Asn   530 .   .     B     .   .   T   .     1.52 *   .   F     1.83   0.71
  Lys   531 .   .     B     .   .   T   .     1.91 *   .   F     2.32   2.58
  Thr   532 .   .     B     .   .   T   .     1.83 *   .   F     2.66   6.96
  Asp   533 .   .     .     .   T   T   .     1.80 *   .   F     3.40   5.89
  Arg   534 .   .     .     .   T   T   .     2.66 *   .   F     3.06   2.55
  Lys   535 .   .     B     .   .   T   .     2.34 *   .   F     2.32   2.95
  His   536 .   .     B     .   .   .   .     2.09 *   .   F     1.78   2.55
Phe 537 . . B . . . . 1.70 * . F 1.44 2.01
  Asp   538 .   .     B     .   .   .   .     1.67 *   .   F     0.65   0.87
  Thr   539 .   .     B     .   .   .   .     1.21 *   .   F     -0.25   0.87
  Pro   540 .   .     .     .   .   .   C     0.87 *   *   F     -0.05   1.00
  Phe   541 .   .     .     .   T   .   .     0.61 .   *   F     0.45   0.80
  His   542 .   .     .     .   T   T   .     0.97 .   *   .     0.20   0.58
  Gly   543 .   .     .     .   T   T   .     0.37 .   *   .     0.20   0.37
  Ser   544 .   .     .     .   T   T   .     0.39 .   *   .     0.20   0.43
  Trp   545 .   .     .     .   T   T   .     0.26 .   *   .     0.20   0.33
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gly  546 . .   .     .   .   .   C     0.74 .   *     .     -0.20   0.33
  Met  547 . .   .     .   T   .   .     0.49 .   .     .     0.00   0.38
  Trp  548 . .   .     .   T   .   .     0.49 .   .     .     0.00   0.38
  Gly  549 . .   .     .   .   T   C     0.79 .   .     .     0.00   0.38
  Pro  550 . .   .     .   T   T   .     0.41 .   .     F     0.35   0.64
  Trp  551 . .   .     .   T   T   .     0.46 *   .     F     0.66   0.33
  Gly  552 . .   .     .   T   T   .     1.17 *   .     F     1.27   0.44
  Asp  553 . .   .     .   T   .   .     1.14 *   .     F     1.98   0.56
  Cys  554 . .   .     .   T   T   .     0.82 *   .     F     2.49   0.77
  Ser  555 . .   .     .   T   T   .     0.69 *   .     F     3.10   0.42
  Arg  556 . .   .     .   T   T   .     0.63 *   .     F     2.79   0.25
  Thr  557 . .   .     .   T   T   .     0.63 *   .     F     2.18   0.46
  Cys  558 . .   .     .   T   T   .     -0.22 *   .     F     1.87   0.34
  Gly  559 . .   .     .   T   T   .     0.44 *   .     F     1.56   0.13
  Gly  560 . .   .     .   T   T   .     0.50 *   .     F     0.65   0.15
  Gly  561 . .   .     .   T   T   .     0.08 *   *     F     0.35   0.45
  Val  562 . .   B     B   .   .   .     -0.21 *   *     .     -0.60   0.65
  Gln  563 . .   B     B   .   .   .     0.57 *   *     .     -0.60   0.65
  Tyr  564 . .   B     B   .   .   .     0.91 *   *     .     -0.15   1.29
  Thr  565 . .   B     B   .   .   .     0.59 *   *     .     0.79   3.01
  Met  566 . .   B     B   .   .   .     0.93 *   *     .     0.98   0.93
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Arg  567 .     .   B     B   .   .     .     1.79 *   *     .   1.62   0.99
  Glu  568 .     .   .     .   T   .     .     1.58 *   *     F   2.86   1.11
  Cys  569 .     .   .     .   T   T     .     0.97 *   .     F   3.40   1.73
  Asp  570 .     .   .     .   T   T     .     1.07 *   .     F   2.91   0.66
  Asn  571 .     .   .     .   .   T     C     1.71 *   .     F   2.37   0.59
  Pro  572 .     .   .     .   .   T     C     1.60 *   .     F   2.52   2.18
  Val  573 .     .   .     .   .   .     C     1.26 *   .     F   2.32   2.10
  Pro  574 .     .   .     .   T   T     .     1.58 *   .     F   2.42   1.29
  Lys  575 .     .   .     .   T   T     .     1.62 *   .     F   2.61   0.83
  Asn  576 .     .   .     .   T   T     .     1.38 *   .     F   3.40   2.23
  Gly  577 .     .   .     .   T   T     .     0.92 *   .     F   3.06   2.26
  Gly  578 .     .   .     .   T   T     .     1.78 *   .     F   2.27   0.61
  Lys  579 .     .   B     .   .   T     .     1.64 .   .     F   1.53   0.65
  Tyr  580 .     .   B     .   .   T     .     1.64 .   .     F   1.19   0.65
  Cys  581 .     .   B     .   .   T     .     1.76 .   .     F   1.30   1.32
  Glu  582 .     .   B     .   .   .     .     1.24 .   *     F   1.10   1.29
  Gly  583 .     .   B     B   .   .     .     1.70 .   *     F   0.75   0.61
  Lys  584 .     .   B     B   .   .     .     1.41 .   *     F   0.90   2.24
  Arg  585 .     .   B     B   .   .     .     1.77 .   *     F   1.15   2.02
  Tyr  586 .     .   B     B   .   .     .     2.13 .   *     .   1.25   4.01
  Arg  587 .     .   B     B   .   .     .     1.47 *   *     .   1.50   2.68
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Gayni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Tyr   588 . .   B     .   .     T     .     1.81 *   *     .     2.00   0.73
  Arg   589 . .   .     .   T     T     .     0.96 *   *     .     2.50   1.59
  Ser   590 . .   .     .   T     T     .     0.84 *   *     .     2.10   0.67
  Cys   591 . .   .     .   T     T     .     1.70 .   *     .     1.85   0.74
  Asn   592 . A   .     .   T     .     .     0.92 .   *     .     1.50   0.63
  Leu   593 . A   B     .   .     .     .     0.96 .   .     .     0.89   0.25
  Glu   594 . A   B     .   .     .     .     0.84 .   .     F     1.13   0.73
  Asp   595 . A   .     .   T     .     .     1.17 .   .     F     2.17   0.76
  Cys   596 . .   B     .   .     T     .     1.81 .   .     F     2.66   1.48
  Pro   597 . .   .     .   T     T     .     1.47 *   *     F     3.40   1.37
  Asp   598 . .   .     .   T     T     .     2.32 *   *     F     2.91   0.81
  Asn   599 . .   .     .   T     T     .     2.01 *   .     F     3.02   3.03
  Asn   600 . .   .     .   T     T     .     1.31 *   .     F     2.98   2.83
  Gly   601 . .   .     .   T     T     .     2.09 *   .     F     2.94   1.47
  Lys   602 . .   .     .   .     T     C     2.30 *   *     F     2.70   1.79
  Thr   603 . .   .     .   .     T     C     2.30 *   .     F     3.00   1.92
  Phe   604 A A   .     .   .     .     .     2.30 *   .     F     2.10   3.37
  Arg   605 A A   .     .   .     .     .     1.63 .   .     F     1.80   2.91
  Glu   606 A A   .     .   .     .     .     1.98 *   .     F     1.50   1.08
  Glu   607 A A   .     .   .     .     .     1.34 *   .     F     1.20   2.17
  Gln   608 A A   .     .   .     .     .     1.62 *   .     F     0.90   1.12
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Cys  609 A     A   .     . .   .   .     2.32     *   *   .     0.60   0.88
 Glu  610 A     A   .     . .   .   .     2.21     .   *   .     0.60   0.81
 Ala  611 A     A   .     . .   .   .     1.51     .   *   .     0.60   0.81
 His  612 A     A   .     . .   .   .     1.21     *   .   .     0.45   1.32
 Asn  613 A     A   .     . .   .   .     1.26     *   *   .     0.45   1.02
 Glu  614 A     A   .     . .   .   .     1.33     *   .   .     0.45   2.02
 Phe  615 A     A   .     . .   .   .     1.03     *   *   F     0.60   1.50
 Ser  616 A     A   .     . .   .   .     0.92     .   .   F     0.90   1.25
 Lys  617 A     A   .     . .   .   .     0.61     .   .   F     0.45   0.62
 Ala  618 .     A   .     . T   .   .     0.31     .   .   F     0.25   0.71
 Ser  619 .     A   .     . T   .   .     -0.03     .   .   F     0.85   0.71
 Phe  620 .     .   .     . T   .   .     0.46     .   .   F     1.26   0.35
 Gly  621 .     .   .     . T   T   .     0.17     .   .   F     1.07   0.54
 Ser  622 .     .   .     . .   T   C     -0.73     .   *   F     1.08   0.41
 Gly  623 .     .   .     . .   T   C     -0.14     .   .   F     0.99   0.35
 Pro  624 .     .   .     . .   T   C     -0.13     .   .   F     2.10   0.61
 Ala  625 .     A   .     . .   .   C     -0.32     .   .   F     0.89   0.48
 Val  626 .     A   B     . .   .   .     -0.19     *   .   .     0.03   0.34
 Glu  627 .     A   B     . .   .   .     0.16     *   .   .     -0.18   0.34
 Trp  628 .     A   B     . .   .   .     0.26     *   .   .     -0.09   0.67
 Ile  629 .     .   B     . .   .   .     -0.12     *   .   .     -0.25   1.42
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Pro   630 .     .   B     . .   T     .     0.12 *   . .     0.10   0.83
  Lys   631 .     .   .     . T   T     .     0.12 *   . .     0.20   0.78
  Tyr   632 .     .   .     . T   T     .     -0.18 *   . .     0.20   0.82
  Ala   633 .     .   .     . T   T     .     -0.10 *   . .     0.84   0.71
  Gly   634 .     .   .     . T   .     .     0.83 *   . .     0.98   0.55
  Val   635 .     .   B     . .   .     .     1.04 .   * .     0.92   0.70
  Ser   636 .     .   B     . .   T     .     1.11 .   * F     2.66   1.17
  Pro   637 .     .   .     . T   T     .     0.69 .   * F     3.40   2.31
  Lys   638 .     .   .     . T   T     .     1.32 .   * F     3.06   1.67
  Asp   639 .     .   .     . T   T     .     0.86 .   * F     2.72   2.49
  Arg   640 A     A   .     . .   .     .     0.82 .   * F     1.58   1.33
  Cys   641 A     A   .     . .   .     .     0.46 *   * F     1.09   0.46
  Lys   642 .     A   B     . .   .     .     0.67 *   * .     0.30   0.15
  Leu   643 .     A   B     . .   .     .     0.03 .   * .     0.30   0.13
  Ile   644 .     A   B     . .   .     .     0.08 .   * .     -0.60   0.25
  Cys   645 .     A   B     . .   .     .     -0.38 .   * .     0.30   0.25
  Gln   646 .     A   B     . .   .     .     -0.60 *   * .     -0.30   0.30
  Ala   647 .     A   B     . .   .     .     -0.99 *   * .     -0.30   0.30
  Lys   648 .     A   B     . .   .     .     -0.42 *   * F     -0.15   0.55
  Gly   649 .     .   .     . T   T     .     -0.23 *   . F     0.65   0.50
  Ile   650 .     .   .     . T   T     .     -0.27 .   * .     0.20   0.43
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Gly   651 . .   B     .   .   T     .     -1.12 .   *   .     -0.20   0.18
 Tyr   652 . .   B     .   .   T     .     -1.34 .   .   .     -0.20   0.14
 Phe   653 . .   B     B   .   .     .     -1.39 .   .   .     -0.60   0.16
 Phe   654 . .   B     B   .   .     .     -1.26 .   *   .     -0.60   0.29
 Val   655 . .   B     B   .   .     .     -0.32 .   *   .     -0.60   0.28
 Leu   656 . .   B     B   .   .     .     -0.83 .   *   .     -0.60   0.65
 Gln   657 . .   B     .   .   T     .     -1.44 .   .   .     -0.20   0.56
 Pro   658 . .   B     .   .   T     .     -0.74 *   .   F     -0.05   0.56
 Lys   659 . .   .     .   T   T     .     -0.39 .   *   F     1.40   1.13
 Val   660 . .   B     .   .   T     .     0.16 .   .   F     0.85   0.65
 Val   661 . .   B     .   .   T     .     0.76 .   *   F     0.85   0.60
 Asp   662 . .   B     .   .   T     .     0.09 .   .   F     1.06   0.47
 Gly   663 . .   B     .   .   T     .     0.00 *   .   F     0.67   0.34
 Thr   664 . .   B     .   .   T     .     -0.26 *   .   F     1.48   0.61
 Pro   665 . .   B     .   .   .     .     0.60 .   .   F     1.49   0.56
 Cys   666 . .   .     .   T   .     .     1.16 .   .   F     2.10   0.95
 Ser   667 . .   .     .   .   T     C     0.84 .   .   F     1.89   0.88
 Pro   668 . .   .     .   T   T     .     0.89 .   .   F     1.88   0.82
 Asp   669 . .   .     .   T   T     .     0.34 .   .   F     1.82   2.06
 Ser   670 . .   .     .   T   T     .     -0.11 .   .   F     1.61   1.14
 Thr   671 . .   .     B   T   .     .     -0.30 .   *   F     0.85   0.39
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alph  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ser  672 . .   B     B   .   .   .     0.00 .   *     F     -0.15     0.18
  Val  673 . .   B     B   .   .   .     -0.13 .   *     .     -0.60     0.23
  Cys  674 . .   B     B   .   .   .     -0.13 .   *     .     -0.60     0.16
  Val  675 . .   B     B   .   .   .     -0.50 .   *     .     -0.60     0.20
Gln 676 . . B B . . . -1.04 . * F -0.45 0.15
  Gly  677 . .   B     B   .   .   .     -0.70 .   *     F     -0.45     0.20
  Gln  678 . .   B     B   .   .   .     -0.43 .   *     F     -0.15     0.54
  Cys  679 . .   B     B   .   .   .     -0.11 .   .     .     0.30     0.32
  Val  680 . .   B     B   .   .   .     0.08 *   *     .     0.30     0.32
  Lys  681 . .   B     .   .   T   .     0.08 *   .     .     0.10     0.10
  Ala  682 . .   B     .   .   T   .     0.53 *   .     .     0.70     0.30
  Gly  683 . .   B     .   .   T   .     -0.36 *   .     .     1.00     0.80
  Cys  684 . .   B     .   .   T   .     -0.58 *   .     .     1.00     0.28
  Asp  685 A .   .     B   .   .   .     0.28 *   .     .     0.30     0.20
  Arg  686 A .   .     B   .   .   .     -0.07 *   .     .     0.60     0.33
  Ile  687 A .   .     B   .   .   .     0.57 *   .     .     0.60     0.82
  Ile  688 A .   .     B   .   .   .     0.96 *   .     F     0.75     0.99
  Asp  689 A .   .     .   .   T   .     1.67 *   *     F     1.30     1.01
  Ser  690 A .   .     .   .   T   .     0.97 *   *     F     1.30     2.88
  Lys  691 A .   .     .   .   T   .     0.86 *   .     F     1.61     3.55
  Lys  692 . .   .     .   T   T   .     1.79 *   *     F     2.32     3.55
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Lys   693 . .   .     .   T   .   .     2.01 *   *     F   2.43   5.30
  Phe   694 . .   .     .   T   .   .     1.67 *   *     F   2.74   1.42
  Asp   695 . .   .     .   T   T   .     1.11 *   .     F   3.10   0.70
  Lys   696 . .   B     .   .   T   .     0.40 *   .     F   2.39   0.26
Cys 697 . . B . . T . 0.01 * . . 1.63 0.16
  Gly   698 . .   B     .   .   T   .     -0.38 *   .     .   1.32   0.10
  Val   699 . .   B     .   .   .   .     0.32 *   .     .   0.21   0.05
  Cys   700 . .   .     .   T   .   .     -0.02 .   .     .   0.00   0.14
  Gly   701 . .   .     .   T   T   .     -0.37 .   .     F   0.65   0.14
  Gly   702 . .   .     .   T   T   .     -0.01 .   .     F   0.65   0.26
  Asn   703 . .   .     .   T   T   .     -0.33 .   .     F   0.65   0.69
  Gly   704 . .   .     .   T   T   .     0.57 .   .     F   0.65   0.37
  Ser   705 . .   .     .   T   T   .     1.28 .   .     F   1.25   0.76
  Thr   706 . .   B     .   .   T   .     0.73 .   .     F   1.41   0.94
  Cys   707 . .   B     .   .   T   .     0.78 .   *     F   1.37   0.67
  Lys   708 . .   B     .   .   T   .     0.43 .   *     F   1.63   0.67
  Lys   709 . .   B     .   .   .   .     0.48 *   *     F   1.69   0.46
  1le   710 . .   B     .   .   T   .     -0.08 *   *     F   2.60   1.14
  Ser   711 . .   B     .   .   T   .     -0.08 *   *     F   1.89   0.42
  Gly   712 . .   B     .   .   T   .     0.29 *   *     F   1.03   0.31
  Ser   713 . .   B     .   .   T   .     -0.34 *   *     F   0.77   0.58
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Val  714 .   .     B     B .   .     .     -0.34   .   *     F     0.11   0.44
  Thr  715 .   .     B     B .   .     .     0.33   .   .     F     0.73   0.89
  Ser  716 .   .     B     B .   .     .     0.29   .   .     F     1.16   1.03
  Ala  717 .   .     B     . .   .     .     0.39   .   .     F     1.64   1.37
  Lys  718 .   .     .     . .   T     C     0.66   .   .     F     2.32   1.49
  Pro  719 .   .     .     . T   T     .     1.51   *   .     F     2.80   1.51
  Gly  720 .   .     .     . T   T     .     0.93   *   .     F     2.52   2.50
  Tyr  721 .   .     B     . .   T     .     0.34   *   .     .     1.54   0.88
  His  722 .   .     B     B .   .     .     0.62   *   .     .     -0.04   0.40
  Asp  723 .   .     B     B .   .     .     -0.31   *   .     .     -0.32   0.58
  Ile  724 .   .     B     B .   .     .     -0.31   *   .     .     -0.60   0.26
  Ile  725 .   .     B     B .   .     .     -0.28   *   .     .     -0.60   0.29
  Thr  726 .   .     B     B .   .     .     -0.38   *   .     .     -0.60   0.25
  Ile  727 .   .     B     . .   T     .     -0.93   *   .     .     -0.20   0.36
  Pro  728 .   .     B     . .   T     .     -1.24   *   .     F     -0.05   0.52
  Thr  729 .   .     .     . .   T     C     -0.36   *   .     F     0.15   0.52
  Gly  730 .   .     .     . .   T     C     -0.36   .   *     F     0.30   1.19
  Ala  731 .   .     .     B .   .     C     -0.04   .   *     F     -0.25   0.54
  Thr  732 .   .     .     B .   .     C     -0.01   .   *     F     0.65   0.65
  Asn  733 .   .     B     B .   .     .     0.24   .   *     F     -0.15   0.48
  Ile  734 .   .     B     B .   .     .     0.56   .   *     F     0.45   0.96
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Glu   735 .     .     B     B   .   .     .     1.01 .   *     F     0.60   1.15
  Val   736 .     .     B     B   .   .     .     1.60 .   *     F     0.90   1.40
  Lys   737 .     .     B     B   .   .     .     1.91 .   *     F     1.24   3.21
  Gln   738 .     .     B     .   .   .     .     2.02 .   *     F     1.78   3.21
Arg 739 . . B . . . . 2.57 * * F 2.12 8.48
  Asn   740 .     .     B     .   .   T     .     2.27 *   *     F     2.66   4.20
  Gln   741 .     .     .     .   T   T     .     3.23 *   *     F     3.40   3.25
  Arg   742 .     .     .     .   T   T     .     3.19 *   .     F     3.06   3.25
  Gly   743 .     .     .     .   T   T     .     3.19 *   .     F     3.00   3.25
  Ser   744 .     .     .     .   T   .     .     2.73 *   .     F     2.74   3.02
  Arg   745 .     .     .     .   .   .     C     2.43 *   *     F     2.48   1.52
  Asn   746 .     .     .     .   T   T     .     1.73 *   .     F     2.82   2.06
  Asn   747 .     .     .     .   T   T     .     0.81 *   .     F     2.80   1.33
  Gly   748 .     .     .     .   .   T     C     0.57 .   *     F     1.57   0.56
  Ser   749 .     .     B     .   .   T     .     -0.02 .   *     F     0.79   0.35
  Phe   750 .     A     B     .   .   .     .     -0.09 .   *     .     -0.04   0.15
  Leu   751 .     A     B     .   .   .     .     -0.68 .   .     .     -0.32   0.31
  Ala   752 .     A     B     .   .   .     .     -1.27 *   .     .     -0.60   0.23
  Ile   753 .     A     B     .   .   .     .     -0.92 .   .     .     -0.60   0.27
  Lys   754 A     A     .     .   .   .     .     -0.97 .   .     .     0.30   0.55
  Ala   755 A     A     .     .   .   .     .     -0.58 .   .     .     0.30   0.54
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Ala  756 A     A     .     .   .   .   .     -0.01 .   .     F     0.60   1.12
 Asp  757 A     .     .     .   .   T   .     -0.31 .   .     F     0.85   0.87
 Gly  758 .     .     B     .   .   T   .     -0.23 .   *     F     0.25   0.61
 Thr  759 .     .     B     .   .   T   .     -0.28 .   .     F     -0.05   0.50
 Tyr  760 .     .     B     .   .   T   .     -0.03 .   *     .     -0.20   0.48
 Ile  761 .     .     B     .   .   .   .     0.56 .   *     .     -0.40   0.48
 Leu  762 .     .     B     .   .   .   .     0.31 .   *     .     -0.40   0.55
 Asn  763 .     .     B     .   .   T   .     0.34 .   *     F     -0.50   0.55
 Gly  764 .     .     .     .   T   T   .     -0.16 .   *     F     0.50   1.14
 Asp  765 .     .     .     .   T   T   .     -0.21 .   *     F     0.50   1.14
 Tyr  766 .     .     .     .   .   T   C     0.37 .   *     F     0.45   0.95
 Thr  767 .     .     B     B   .   .   .     0.37 .   *     .     -0.15   1.38
 Leu  768 .     .     B     B   .   .   .     0.37 *   *     .     -0.60   0.68
 Ser  769 .     .     B     B   .   .   .     0.71 *   .     F     -0.45   0.75
 Thr  770 .     .     B     B   .   .   .     0.71 *   *     F     -0.15   0.90
 Leu  771 A     .     .     B   .   .   .     0.07 *   .     F     0.60   1.83
 G1u  772 A     .     .     B   .   .   .     -0.22 *   .     F     0.45   0.96
 Gln  773 A     .     .     B   .   .   .     0.34 *   *     F     0.45   0.66
 Asp  774 A     .     .     B   .   .   .     0.69 .   *     F     0.00   1.25
 Ile  775 A     .     .     B   .   .   .     0.66 .   *     .     0.75   1.44
 Met  776 A     .     .     B   .   .   .     0.61 .   *     .     0.30   0.82
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Tyr  777 . .   B     B   .     .   .     -0.24   .     *   .     -0.30   0.37
  Lys  778 . .   B     B   .     .   .     -1.06   .     *   .     -0.60   0.39
  Gly  779 . .   B     B   .     .   .     -0.94   .     *   .     -0.60   0.32
  Val  780 . .   B     B   .     .   .     -0.30   .     *   .     -0.30   0.40
  Val  781 . .   B     B   .     .   .     0.00   .     *   .     -0.30   0.32
  Leu  782 . .   B     B   .     .   .     -0.10   .     *   .     -0.60   0.43
  Arg  783 . .   B     B   .     .   .     -0.44   .     *   .     -0.60   0.57
  Tyr  784 . .   B     .   .     T   .     -0.40   *     *   .     0.25   1.03
  Ser  785 . .   .     .   T     T   .     -0.13   .     *   F     0.80   1.68
  Gly  786 . .   .     .   .     T   C     0.13   *     *   F     1.05   0.86
  Ser  787 . .   .     .   .     T   C     0.13   .     *   F     0.45   0.56
  Ser  788 . A   .     .   .     .   C     0.02   .     *   F     0.05   0.34
  Ala  789 A A   .     .   .     .   .     0.38   *     .   F     0.45   0.60
  Ala  790 A A   .     .   .     .   .     -0.21   *     *   .     0.60   0.88
  Leu  791 A A   .     .   .     .   .     0.24   *     *   .     0.30   0.46
  Glu  792 A A   .     .   .     .   .     0.24   *     *   .     0.60   0.89
  Arg  793 . A   B     B   .     .   .     -0.16   *     *   F     0.90   1.18
  Ile  794 A A   .     B   .     .   .     0.13   *     *   F     0.60   1.24
  Arg  795 A A   .     B   .     .   .     0.51   *     *   F     0.75   0.96
  Ser  796 . A   .     .   T     .   .     0.51   .     *   F     1.13   0.76
  Phe  797 . .   .     .   .     .   C     0.56   .     *   F     0.81   0.89
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ser   798 . .   .     .   .   T   C     0.44   .   *     F     1.89   0.91
  Pro   799 . .   .     .   .   T   C     1.12   *   *     F     2.32   1.17
  Leu   800 . .   .     .   T   T   .     0.20   *   *     F     2.80   2.10
  Lys   801 . .   .     .   .   T   C     0.19   *   *     F     2.32   1.29
Glu 802 . . . . . . C 0.00 . * F 1.84 1.20
  Pro   803 A .   .     B   .   .   .     0.30   .   *     F     1.16   1.02
  Leu   804 A .   .     B   .   .   .     -0.34   .   *     F     0.73   0.89
  Thr   805 . .   B     B   .   .   .     -0.34   .   *     .     -0.30   0.38
  Ile   806 . .   B     B   .   .   .     -0.70   .   *     .     -0.60   0.20
  Gln   807 . .   B     B   .   .   .     -1.56   .   .     .     -0.60   0.35
  Val   808 . .   B     B   .   .   .     -1.69   .   *     .     -0.60   0.18
  Leu   809 . .   B     B   .   .   .     -0.88   .   *     .     -0.60   0.26
  Thr   810 . .   B     B   .   .   .     -1.16   .   .     .     -0.60   0.24
  Val   811 . .   B     B   .   .   .     -1.08   .   *     .     -0.60   0.33
  Gly   812 . .   B     B   .   .   .     -0.97   *   *     .     -0.60   0.33
  Asn   813 A .   .     .   .   .   .     -0.32   *   *     .     0.12   0.44
  Ala   814 A .   .     .   .   .   .     0.53   *   *     .     0.34   0.92
  Leu   815 A .   .     .   .   .   .     -0.04   *   *     F     1.76   1.86
  Arg   816 . .   B     .   .   .   .     0.86   *   *     F     1.53   0.81
  Pro   817 . .   B     .   .   .   .     0.96   *   *     F     2.20   1.61
  Lys   818 . .   B     B   .   .   .     0.64   *   *     F     1.48   3.05
 Res  Pos. Garni…Alpha Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ile   819 . .   B     B   .   .     .     0.99 .   *     F     1.56     2.25
  Lys   820 . .   B     B   .   .     .     1.10 *   *     F     0.44     2.28
  Tyr   821 . .   B     B   .   .     .     0.13 *   *     .     -0.38     0.99
  Thr   822 . .   B     B   .   .     .     0.39 .   *     .     -0.45     1.04
Tyr 823 A . . B . . . 0.39 . * . -0.45 1.04
  Phe   824 A .   .     B   .   .     .     1.32 .   *     .     -0.45     1.33
  Val   825 A .   .     B   .   .     .     1.32 .   .     .     0.45     1.85
  Lys   826 A .   .     B   .   .     .     1.57 .   .     F     0.90     2.36
  Lys   827 A A   .     .   .   .     .     1.58 *   .     F     0.90     4.71
  Lys   828 A A   .     .   .   .     .     1.12 *   .     F     0.90     8.51
  Lys   829 A A   .     .   .   .     .     1.82 *   .     F     0.90     3.68
  Glu   830 A A   .     .   .   .     .     2.09 *   .     F     0.90     2.96
  Ser   831 A A   .     .   .   .     .     1.16 *   .     F     0.90     1.50
  Phe   832 A A   .     .   .   .     .     0.90 .   .     .     0.30     0.52
  Asn   833 . A   B     .   .   .     .     0.54 *   .     .     -0.30     0.47
  Ala   834 . .   B     .   .   .     .     -0.20 *   *     .     -0.40     0.50
  Ile   835 . .   .     .   .   .     C     -0.50 *   .     .     -0.20     0.50
  Pro   836 . .   .     .   .   T     C     -0.79 .   .     .     0.00     0.42
  Thr   837 . .   .     .   T   T     .     -0.38 *   *     .     0.20     0.42
  Phe   838 A .   .     .   .   T     .     -1.23 *   .     .     -0.20     0.63
  Ser   839 . .   .     .   .   T     C     -1.53 *   .     .     0.00     0.30
 Res  Pos.   Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Ala  840   .   A   B     B   .   .   .     -0.64   *   .     .     -0.60   0.15
 Trp  841   .   A   B     B   .   .   .     -0.43   .   .     .     -0.60   0.29
 Val  842   A   A   .     B   .   .   .     -0.41   .   .     .     -0.30   0.38
 Ile  843   A   A   .     B   .   .   .     -0.06   *   .     .     -0.60   0.40
 Glu  844   A   A   .     B   .   .   .     0.24   *   .     .     -0.60   0.37
 Glu  845   A   A   .     .   .   .   .     0.17   *   .     .     0.30   0.87
 Trp  846   A   A   .     .   .   .   .     0.16   *   .     .     0.61   0.66
 Gly  847   A   A   .     .   .   .   .     1.06   *   .     F     1.37   0.51
 Glu  848   .   A   .     .   T   .   .     1.64   *   .     F     2.08   0.59
 Cys  849   .   A   .     .   T   .   .     0.98   *   .     F     2.09   0.76
 Ser  850   .   .   .     .   T   T   .     0.98   .   .     F     3.10   0.41
 Lys  851   .   .   .     .   T   T   .     0.46   .   .     F     2.79   0.41
 Ser  852   .   .   .     .   T   T   .     0.46   .   .     F     2.18   0.63
 Cys  853   .   .   .     .   T   T   .     0.17   *   *     .     2.02   0.47
 Glu  854   A   A   .     .   .   .   .     0.83   *   .     .     0.61   0.24
 Leu  855   A   A   .     .   .   .   .     1.24   .   .     .     -0.30   0.32
 Gly  856   .   A   .     .   .   .   .     1.31   .   *     .     0.85   1.16
 Trp  857   A   A   .     .   .   .   .     0.80   *   *     .     0.75   1.31
 Gln  858   A   A   .     .   .   .   .     0.61   *   *     .     -0.15   1.31
 Arg  859   A   A   .     .   .   .   .     0.61   *   *     .     -0.30   0.98
 Arg  860   .   A   B     .   .   .   .     0.76   .   *     .     0.45   1.61
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Leu  861   .     A   B     .   .     .   .   1.21   *   .     .   0.60   0.50
 Val  862   .     A   B     .   .     .   .   1.50   *   .     .   0.60   0.50
 Glu  863   .     A   B     .   .     .   .   0.61   .   .     .   0.94   0.43
 Cys  864   .     A   B     .   .     .   .   0.50   .   .     .   0.98   0.36
 Arg  865   .     A   .     .   T     .   .   0.04   .   .     F   2.17   0.78
 Asp  866   .     .   .     .   T     T   .   0.86   .   .     F   2.91   0.45
 Ile  867   .     .   .     .   T     T   .   1.50   .   .     F   3.40   1.45
 Asn  868   .     .   .     .   T     T   .   0.91   .   .     F   3.06   1.14
 Gly  869   .     .   .     .   .     T   C   1.28   .   .     F   2.07   0.69
 Gln  870   .     .   .     .   .     T   C   1.17   .   *     F   1.28   1.32
 Pro  871   .     .   .     .   .     T   C   0.50   .   *     F   1.54   1.42
 Ala  872   .     .   .     .   .     T   C   0.80   .   *     F   1.05   0.77
 Ser  873   A     .   .     .   .     T   .   0.84   *   .     F   0.85   0.45
 Glu  874   A     A   .     .   .     .   .   1.19   *   .     F   0.75   0.58
 Cys  875   A     A   .     .   .     .   .   0.33   *   .     .   0.60   1.00
 Ala  876   A     A   .     .   .     .   .   0.59   *   .     .   0.60   0.55
 Lys  877   A     A   .     .   .     .   .   0.97   *   .     F   0.75   0.64
 Glu  878   A     A   .     .   .     .   .   0.68   *   .     F   0.90   1.84
 Val  879   A     A   .     .   .     .   .   0.38   *   .     F   0.90   1.84
 Lys  880   A     A   .     .   .     .   .   0.73   *   .     F   0.90   1.23
 Pro  881   A     .   .     .   .     T   .   1.43   *   .     F   1.30   1.03
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala   882 .   .   .     .   T     T   .     1.18 *   .     F     2.01   2.71
  Ser   883 .   .   .     .   T     T   .     0.51 .   *     F     2.32   2.10
  Thr   884 .   .   .     .   T     T   .     0.78 .   *     F     2.18   0.73
  Arg   885 .   .   B     .   .     T   .     0.73 .   *     F     2.09   0.73
Pro 886 . . . . T T . 0.91 . * F 3.10 0.91
  Cys   887 .   .   .     .   T     T   .     1.29 .   *     .     2.64   0.85
  Ala   888 .   .   .     .   T     T   .     0.92 .   *     .     2.43   0.67
  Asp   889 .   .   .     .   T     .   .     1.02 .   *     .     1.72   0.23
His 890 . . . . . T C 0.91 . * . 1.51 0.67
  Pro   891 .   .   .     .   T     T   .     0.83 .   .     .     1.65   1.16
  Cys   892 .   .   .     .   T     T   .     1.50 .   *     .     1.00   0.73
  Pro   893 .   .   .     .   T     T   .     1.28 .   *     .     0.60   0.93
  Gln   894 .   A   .     .   T     .   .     0.93 .   .     .     0.10   0.49
  Trp   895 .   A   B     .   .     .   .     0.97 .   .     .     -0.40   0.91
  Gln   896 .   A   B     .   .     .   .     0.89 .   .     .     -0.05   1.02
  Leu   897 .   A   B     .   .     .   .     1.26 .   .     .     -0.60   0.62
  Gly   898 .   .   .     .   T     .   .     1.17 .   .     .     0.00   0.79
  Glu   899 .   .   .     .   T     .   .     0.50 .   .     F     0.45   0.61
  Trp   900 .   .   .     .   T     .   .     0.49 .   .     F     0.45   0.40
  Ser   901 .   .   .     .   T     T   .     0.53 .   .     F     0.65   0.54
  Ser   902 .   .   .     .   T     T   .     1.03 .   .     F     1.25   0.62
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Cys   903 .   .   .     .   T   T   .     0.71   .   *     F     0.65   0.85
  Ser   904 .   .   .     .   T   T   .     0.37   *   *     F     1.25   0.34
  Lys   905 .   .   .     .   T   .   .     0.70   *   *     F     1.05   0.25
  Thr   906 .   .   .     .   T   .   .     0.66   *   *     F     1.69   0.94
  Cys   907 .   .   .     .   T   .   .     0.71   *   .     F     2.03   0.69
  Gly   908 .   .   .     .   T   T   .     1.42   *   *     F     2.27   0.54
  Lys   909 .   .   .     .   T   T   .     1.77   *   *     F     2.61   0.75
  Gly   910 .   .   .     .   T   T   .     1.83   *   *     F     3.40   2.81
  Tyr   911 .   .   .     .   T   T   .     1.84   .   .     F     3.06   5.57
  Lys   912 .   A   B     .   .   .   .     1.70   *   .     F     1.92   3.73
  Lys   913 .   A   B     .   .   .   .     2.09   *   .     F     1.58   3.11
  Arg   914 .   A   B     .   .   .   .     1.38   *   .     F     1.24   3.97
  Ser   915 .   A   B     .   .   .   .     0.91   *   .     F     0.90   1.06
  Leu   916 .   A   B     .   .   .   .     0.86   *   .     F     0.75   0.44
  Lys   917 .   A   B     .   .   .   .     0.78   *   .     .     0.30   0.30
  Cys   918 .   A   B     .   .   .   .     0.73   *   .     .     -0.30   0.30
  Leu   919 .   A   B     .   .   .   .     0.28   *   .     .     0.30   0.62
  Ser   920 .   .   B     .   .   .   .     0.23   .   .     .     0.50   0.31
  His   921 .   .   B     .   .   T   .     0.19   *   .     F     0.85   0.56
  Asp   922 .   .   .     .   T   T   .     -0.67   *   .     F     0.65   0.51
  Gly   923 .   .   .     .   T   T   .     -0.30   .   .     F     0.65   0.31
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gly  924 .   .   .     .   T   T   .     0.48 .   .     F     0.65     0.31
Val 925 . . B . . . . 0.78 . . . -0.10 0.25
  Leu  926 .   .   B     .   .   .   .     0.51 .   .     .     -0.10     0.44
  Ser  927 .   .   B     .   .   .   .     -0.16 .   .     .     -0.10     0.59
  His  928 .   .   B     .   .   T   .     0.19 .   .     .     0.10     0.43
  Glu  929 .   .   B     .   .   T   .     0.32 .   .     F     0.85     0.87
  Ser  930 A   .   .     .   .   T   .     0.37 *   .     F     1.30     1.00
  Cys  931 A   .   .     .   .   T   .     1.22 *   .     F     0.85     0.61
  Asp  932 A   .   .     .   .   T   .     1.57 *   .     F     1.15     0.70
  Pro  933 A   .   .     .   .   T   .     1.39 *   .     F     1.30     1.05
  Leu  934 A   .   .     .   .   T   .     1.43 *   .     F     1.30     3.02
  Lys  935 A   .   .     .   .   T   .     1.70 *   .     F     1.30     3.62
  Lys  936 A   A   . .   .   .   .     1.67 *   .     F     0.90     3.18
  Pro  937 A   A   .     .   .   .   .     0.78 *   .     F     0.90     3.34
  Lys  938 A   A   .     .   .   .   .     0.99 *   *     F     0.90     1.17
  His  939 A   A   .     .   .   .   .     1.10 *   *     .     0.60     0.98
  Phe  940 .   A   B     .   .   .   .     0.39 *   *     .     -0.30     0.55
  Ile  941 .   A   B     .   .   .   .     0.03 *   *     .     -0.30     0.15
  Asp  942 A   A   .     .   .   .   .     -0.36 *   *     .     -0.60     0.16
  Phe  943 A   A   .     .   .   .   .     -0.99 *   *     .     -0.60     0.18
  Cys  944 A   A   .     .   .   .   .     -0.96 .   .     .     -0.60     0.26
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Thr  945   A   A   .     .   .   .   .     -0.92 .   *     .     0.30   0.27
  Met  946   A   A   .     .   .   .   .     -0.33 .   *     .     -0.60   0.16
  Ala  947   A   A   .     .   .   .   .     -0.72 .   .     .     -0.30   0.41
  Glu  948   A   A   .     .   .   .   .     -0.41 .   .     .     0.30   0.36
  Cys  949   A   A   .     .   .   .   .     -0.13 .   .     .     0.30   0.47
  Ser  950   A   A   .     .   .   .   .     -0.21 .   .     .     0.30   0.60
                                                                                                 表2
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Met   1 .   .   B     .   .     .   .     -0.37   .   .     .     -0.40   0.50
  Phe   2 .   .   B     .   .     .   .     -0.57   .   .     .     -0.40   0.61
  Pro   3 .   .   B     .   .     .   .     -0.77   .   .     .     -0.40   0.48
  Ala   4 .   .   .     .   .     .   C     -0.59   .   *     .     -0.20   0.49
  Pro   5 .   .   .     .   .     .   C     -0.09   .   *     .     -0.20   0.87
  Ala   6 .   .   .     .   .     .   C     0.22   *   *     .     0.85   1.11
  Ala   7 .   .   .     .   .     T   C     0.11   *   *     .     0.45   1.15
  Pro   8 A   .   .     .   .     T   .     0.11   *   .     .     -0.20   0.61
  Arg   9 .   .   .     .   T     T   .     0.00   *   .     .     0.20   0.94
  Trp   10 .   .   B     .   .     T   .     -0.60   *   .     .     -0.20   0.81
  Leu   11 .   A   B     .   .     .   .     -0.82   *   .     .     -0.60   0.43
  Pro   12 .   A   B     .   .     .   .     -1.04   *   .     .     -0.60   0.18
  Phe   13 .   A   B     .   .     .   .     -1.64   *   .     .     -0.60   0.14
  Leu   14 A   A   .     .   .     .   .     -2.57   *   .     .     -0.60   0.14
  Leu   15 A   A   .     .   .     .   .     -3.09   .   .     .     -0.60   0.08
  Leu   16 A   A   .     .   .     .   .     -3.09   .   .     .     -0.60   0.07
  Leu   17 A   A   .     .   .     .   .     -3.69   .   .     .     -0.60   0.07
  Leu   18 A   A   .     .   .     .   .     -3.80   .   .     .     -0.60   0.07
  Leu   19 A   A   .     .   .     .   .     -3.20   .   .     .     -0.60   0.07
  Leu   20 A   A   .     .   .     .   .     -3.20   .   .     .     -0.60   0.14
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Leu   21 A   A   .     .   .     .   .     -2.98 *   .     .     -0.60     0.14
  Leu   22 .   A   B     .   .     .   .     -2.06 *   .     .     -0.60     0.17
  Pro   23 .   A   B     .   .     .   .     -1.59 *   .     .     -0.60     0.39
  Leu   24 A   A   .     .   .     .   .     -1.37 *   .     .     -0.60     0.47
  Ala   25 A   A   .     .   .     .   .     -0.77 *   .     .     -0.04     0.58
  Arg   26 .   A   B     .   .     .   .     -0.54 *   .     .     0.82     0.58
  Gly   27 .   A   B     .   .     .   .     0.38 .   .     F     0.63     0.71
  Ala   28 .   .   B     .   .     .   .     0.38 .   .     F     2.14     1.37
  Pro   29 .   .   .     .   .     .   C     0.60 .   .     F     2.60     1.08
  Ala   30 .   .   B     .   .     .   .     0.60 .   .     F     1.84     1.11
  Arg   31 .   .   B     .   .     .   .     0.14 .   .     F     1.58     1.11
  Pro   32 .   .   B     .   .     .   .     0.14 .   *     F     1.17     0.71
  Ala   33 .   .   B     .   .     T   .     0.73 .   *     F     1.11     0.69
  Ala   34 A   .   .     .   .     T   .     0.36 .   *     F     0.85     0.61
  Gly   35 .   .   .     .   .     T   C     0.64 .   *     F     0.45     0.40
  Gly   36 .   .   .     .   .     T   C     0.53 .   *     F     0.45     0.53
  Gln   37 A   .   .     .   .     .   .     -0.07 .   .     F     0.65     0.91
  Ala   38 .   .   B     .   .     .   .     -0.33 .   .     F     0.65     0.76
  Ser   39 .   .   B     B   B     .   .     -0.60 .   .     F     -0.15     0.57
  Glu   40 .   .   B     B   B     .   .     -0.47 .   .     F     -0.15     0.24
  Leu   41 .   .   B     B   B     .   .     -0.43 .   *     .     -0.30     0.37
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Val  42 .   .   B     B   B   .   .     -0.32 .   *     .     -0.30     0.40
 Val  43 .   .   B     B   B   .   .     -0.54 .   *     .     0.30     0.46
 Pro  44 .   .   B     B   B   .   .     -0.46 .   *     F     -0.24     0.46
 Thr  45 .   .   B     B   B   .   .     -0.80 .   *     F     0.27     0.95
Arg 46 . . B B B . . -0.29 . * F 0.63 1.26
 Leu  47 .   .   .     .   .   T   C     -0.02 .   *     F     2.04     1.10
 Pro  48 .   .   .     .   .   T   C     0.49 *   *     F     2.10     0.77
 Gly  49 .   .   .     .   .   T   C     0.70 *   *     F     1.89     0.39
 Ser  50 .   .   .     .   .   T   C     0.20 *   *     F     1.68     0.81
 Ala  51 A   A   .     .   .   .   .     -0.50 *   *     F     0.87     0.43
 Gly  52 A   A   .     .   .   .   .     -0.50 .   .     F     0.66     0.44
 Glu  53 A   A   .     .   .   .   .     -0.32 .   *     .     -0.30     0.27
 Leu  54 A   A   .     .   .   .   .     -0.79 .   *     .     -0.30     0.37
 Ala  55 A   A   .     .   .   .   .     -0.79 .   *     .     -0.60     0.31
 Leu  56 A   A   .     .   .   .   .     -0.79 .   *     .     -0.60     0.24
 His  57 A   A   .     .   .   .   .     -1.14 .   *     .     -0.60     0.29
 Leu  58 A   A   .     .   .   .   .     -1.49 *   *     .     -0.60     0.25
 Ser  59 A   A   .     .   .   .   .     -0.63 *   *     .     -0.60     0.30
 Ala  60 A   A   .     .   .   .   .     -0.39 *   *     .     -0.30     0.44
 Phe  61 A   A   .     .   .   .   .     -0.28 *   *     .     -0.30     0.53
 Gly  62 .   .   .     .   T   T   .     -1.10 *   .     .     0.50     0.34
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Lys   63 A   .   .     .   .     T   .     -1.10 .   *     F     -0.05     0.25
  Gly   64 .   .   B     .   .     T   .     -0.69 .   *     .     -0.20     0.24
  Phe   65 .   .   B     .   .     T   .     -0.91 .   *     .     0.70     0.47
  Val   66 .   .   B     B   .     .   .     -0.80 *   *     .     -0.30     0.19
  Leu   67 .   .   B     B   .     .   .     -0.67 *   *     .     -0.30     0.20
  Arg   68 .   .   B     B   .     .   .     -0.71 .   *     .     0.00     0.35
  Leu   69 .   .   B     B   .     .   .     -0.37 *   *     .     1.20     0.80
  Ala   70 .   .   .     .   .     T   C     0.03 .   *     .     2.55     1.61
  Pro   71 .   .   .     .   .     T   C     0.19 *   *     F     3.00     1.10
  Asp   72 .   .   .     .   T     T   .     0.19 .   *     F     2.60     1.16
  Asp   73 A   .   .     .   .     T   .     -0.51 .   *     F     1.75     0.95
  Ser   74 A   A   .     .   .     .   .     0.09 .   .     .     0.90     0.62
  Phe   75 A   A   .     .   .     .   .     0.68 .   .     .     0.60     0.57
  Leu   76 A   A   .     .   .     .   .     0.19 .   *     .     0.30     0.59
  Ala   77 A   A   .     .   .     .   .     0.23 .   *     .     -0.60     0.38
  Pro   78 A   A   .     .   .     .   .     -0.66 .   *     .     -0.30     0.89
  Glu   79 A   A   .     .   .     .   .     -0.36 *   *     F     -0.15     0.75
  Phe   80 A   A   .     .   .     .   .     0.46 *   .     F     0.90     1.29
  Lys   81 A   A   .     .   .     .   .     0.46 *   *     F     0.90     1.63
  Ile   82 A   A   .     .   .     .   .     0.70 *   .     F     0.75     0.78
  Glu   83 A   A   .     .   .     .   .     0.57 *   *     F     0.45     0.89
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Arg   84 A   A   .       .   .     .   .     0.27   *     *     F     0.75     0.44
  Leu   85 .   A   .       .   T     .   .     0.62   *     *     F     0.85     0.84
  Gly   86 .   A   .       .   T     .   .     0.69   *     *     F     1.15     0.48
  Gly   87 .   .   .       .   .     T   C     0.99   *     *     F     1.35     0.48
  Ser   88 .   .   .       .   .     T   C     0.68   *     *     F     1.05     0.59
  Gly   89 .   .   .       .   .     T   C     0.22   *     *     F     1.05     0.86
  Arg   90 .   .   B       .   .     T   .     0.69   .     *     F     1.19     0.86
  Ala   91 .   .   .       .   .     T   C     1.03   .     *     F     1.73     0.63
  Thr   92 .   .   B       .   .     T   .     1.49   .     *     F     2.32     1.11
  Gly   93 .   .   B       .   .     T   .     1.44   .     *     F     2.66     1.11
  Gly   94 .   .   .       .   T     T   .     0.98   *     *     F     3.40     1.09
  Glu   95 .   .   B       .   .     .   .     0.98   *     *     F     2.31     0.62
  Arg   96 .   .   B       .   .     .   .     1.22   *     .     F     2.12     1.23
  Gly   97 .   .   .       .   T     .   .     0.87   *     *     F     2.18     1.23
  Leu   98 .   .   B       .   .     T   .     0.51   *     .     F     1.49     0.38
  Arg   99 .   .   B       .   .     T   .     0.16   *     .     .     0.70     0.17
  Gly   100 .   .   B       .   .     T   .     -0.14   *     .     .     -0.20     0.15
  Cys   101 .   .   B       .   .     T   .     -0.60   *     .     .     -0.20     0.24
  Phe   102 .   .   B       .   .     .   .     -0.57   .     *     .     -0.10     0.12
  Phe   103 .   .   B       .   .     T   .     -0.61   .     *     .     -0.20     0.18
  Ser   104 .   .   B       .   .     T   .     -0.72   .     *     F     -0.05     0.24
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
Gly 105 . . . . . T C -0.72 . * F 0.15 0.45
  Thr  106 .     .   .     .   .     T   C     -0.06   *   *     F     0.45   0.52
  Val  107 .     .   .     B   .     .   C     0.43   .   *     F     1.25   0.67
  Asn  108 .     .   .     B   .     .   C     1.13   .   *     F     1.70   1.05
  Gly  109 .     .   .     B   .     .   C     1.13   .   *     F     2.30   1.26
  Glu  110 .     .   .     .   .     T   C     0.67   .   *     F     3.00   2.27
  Pro  111 A     .   .     .   .     T   .     0.39   .   *     F     2.50   1.16
  Glu  112 A     .   .     .   .     T   .     0.66   .   *     F     2.20   1.19
  Ser  113 A     .   .     .   .     T   .     -0.20   .   .     F     1.75   0.69
  Leu  114 A     A   .     B   .     .   .     -0.16   .   .     .     0.00   0.33
  Ala  115 A     A   .     B   .     .   .     -0.97   .   .     .     -0.30   0.26
  Ala  116 A     A   .     B   .     .   .     -1.42   .   .     .     -0.60   0.16
  Val  117 A     A   .     B   .     .   .     -1.31   .   .     .     -0.60   0.10
  Ser  118 .     A   B     B   .     .   .     -1.36   *   .     .     -0.30   0.20
  Leu  119 .     .   B     B   .     .   .     -1.36   *   .     .     -0.30   0.20
  Cys  120 .     .   B     .   .     T   .     -1.07   *   .     .     0.10   0.22
  Arg  121 .     .   B     .   .     T   .     -0.82   *   .     .     0.10   0.22
  Gly  122 .     .   .     .   T     T   .     -0.27   *   .     F     0.65   0.26
  Leu  123 .     .   .     .   T     T   .     -0.67   *   .     F     1.25   0.65
  Ser  124 .     .   .     .   .     T   C     -0.67   *   .     F     0.45   0.29
  Gly  125 .     .   B     .   .     T   .     -0.81   .   *     F     -0.05   0.24
 Res  Pos. Garni…A1pha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ser   126 .     .   B     .   .     T   .     -0.92   .   *     F     -0.05   0.24
  Phe   127 .     .   B     .   .     T   .     -0.92   .   *     .     0.10   0.30
  Leu   128 .     A   B     .   .     .   C     -0.11   .   *     .     -0.30   0.30
  Leu   129 .     A   .     .   .     .   .     0.19   .   *     F     0.65   0.39
Asp 130 A A . . . . . -0.17 . . F 0.45 0.77
  Gly   131 A     A   .     .   .     .   .     -0.18   .   .     F     0.45   0.81
  Glu   132 A     A   .     .   .     .   .     -0.37   .   *     F     0.90   1.42
  Glu   133 A     A   .     .   .     .   .     0.44   .   *     F     0.75   0.60
  Phe   134 A     A   .     .   .     .   .     1.04   .   *     .     0.45   1.04
  Thr   135 .     A   B     .   .     .   .     1.04   .   *     .     0.30   0.93
  Ile   136 .     .   B     .   .     .   .     1.04   .   *     F     0.05   0.93
  Gln   137 .     .   B     .   .     .   .     0.46   .   *     F     -0.10   1.06
  Pro   138 .     .   .     .   .     .   C     0.11   .   *     F     0.25   0.75
  Gln   139 .     .   .     .   T     .   .     0.47   .   *     F     0.60   1.05
  Gly   140 .     .   .     .   .     T   C     0.48   .   *     F     0.45   0.60
  Ala   141 .     .   .     .   T     T   .     0.56   .   *     F     1.25   0.52
  Gly   142 .     .   .     .   .     T   C     -0.03   .   .     F     0.45   0.25
  Gly   143 .     .   .     .   .     T   C     0.18   .   .     F     0.65   0.25
  Ser   144 .     .   .     .   .     .   C     -0.03   .   .     F     0.65   0.43
  Leu   145 .     .   B     .   .     .   .     0.28   *   .     F     0.65   0.68
  Ala   146 .     .   B     .   .     .   .     0.98   *   .     F     0.85   0.93
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gln  147 .     .   B     .   .     T   .     0.51   .   *     F   2.00   1.36
  Pro  148 .     .   B     .   .     T   .     0.86   *   .     .   1.05   1.36
  His  149 .     .   B     .   .     T   .     1.27   *   .     .   1.45   2.34
  Arg  150 .     .   B     .   .     T   .     1.79   *   .     .   1.55   2.64
  Leu  151 .     .   B     .   .     .   .     2.03   *   .     .   0.85   1.80
  Gln  152 .     .   B     .   .     .   .     1.82   *   .     .   0.65   1.31
  Arg  153 .     .   .     .   T     .   .     1.44   *   .     .   1.05   1.03
  Trp  154 .     .   .     .   T     .   .     1.13   *   .     F   0.84   1.26
  Gly  155 .     .   .     .   .     T   C     0.43   *   .     F   0.93   0.72
  Pro  156 .     .   .     .   .     T   C     1.36   *   .     F   1.17   0.37
  Ala  157 .     .   .     .   T     T   .     1.14   *   .     F   1.61   0.69
  Gly  158 .     .   .     .   .     T   C     0.22   *   .     F   2.40   1.08
  Ala  159 .     .   .     .   .     .   C     0.30   *   *     F   1.81   0.58
  Arg  160 .     .  .B     .   .     .   .     0.76   *   *     F   1.37   0.89
  Pro  161 .     .   B     .   .     .   .     0.62   *   *     F   1.58   1.75
  Leu  162 .     .   .     .   .     .   C     1.00   *   *     F   1.84   1.72
  Pro  163 .     .   .     .   .     .   C     1.34   *   *     F   1.90   1.35
  Arg  164 .     .   .     .   .     .   C     1.64   *   *     F   2.20   1.52
  Gly  165 .     .   .     .   .     T   C     1.53   *   *     F.   2.40   1.93
  Pro  166 .     .   .     .   .     T   C     0.89   *   .     F   3.00   2.17
  Glu  167 .     .   .     .   .     T   C     1.70   *   .     F   2.55   0.82
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chon-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Trp  168   A   .   .     .   .     T     .     1.60   *   .     .     2.05   1.44
  Glu  169   A   .   .     .   .     .     .     1.14   *   .     .     1.85   1.34
  Val  170   A   .   .     .   .     .     .     1.49   .   .     F     1.85   0.77
  Glu  171   A   .   .     .   .     .     .     1.36   .   *     F     2.00   1.26
Thr 172 A . . . . . . 1.36 . * F 2.15 0.72
  Gly  173   .   .   .     .   .     T     C     1.76   .   .     F     3.00   1.68
  Glu  174   A   .   .     .   .     T     .     1.76   .   .     F     2.50   1.90
  Gly  175   A   .   .     .   .     T     .     2.61   .   .     F     2.20   2.28
  Gln  176   A   .   .     .   .     T     .     2.72   .   .     F     1.90   4.00
  Arg  177   A   A   .     .   .     .     .     2.69   .   *     F     1.54   4.52
  Gln  178   A   A   .     .   .     .     .     3.03   .   *     F     1.58   4.52
  Glu  179   .   A   .     .   T     .     .     3.00   *   *     F     2.32   4.36
  Arg  180   .   A   .     .   T     .     .     3.34   *   .     F     2.66   3.03
  Gly  181   .   .   .     .   T     T     .     3.34   .   *     F     3.40   3.03
  Asp  182   .   .   .     .   .     T     C     3.23   .   .     F     2 86   3.03
  His  183   .   .   .     .   .     T     C     2.93   .   *     F     2.52   2.58
  Gln  184   .   .   .     .   .     T     C     2.93   .   *     F     2.18   3.50
  Glu  185   .   A   .     .   .     .     C     2.82   .   *     F     1.44   3.63
  Asp  186   A   A   .     .   .     .     .     3.17   .   .     F     0.90   4.61
  Ser  187   A   A   .     .   .     .     .     2.87   .   .     F     0.90   4.61
  Glu  188   A   A   .     .   .     .     .     2.90   .   .     F     0.90   3.57
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Glu  189 A   A   .   .   .       .   .     2.90 .   .     F   0.90     3.70
 Glu  190 A   A   .   .   .       .   .     2.90 .   .     F   0.90     4.79
 Ser  191 A   A   .   .   .       .   .     2.90 .   .     F   0.90     4.79
 Gln  192 A   A   .   .   .       .   .     2.61 .   .     F   0.90     4.79
 Glu  193 A   A   .   .   .       .   .     2.61 .   .     F   0.90     2.79
 Glu  194 A   A   .   .   .       .   .     2.27 .   .     F   0.90     3.61
 Glu  195 A   A   .   .   .       .   .     1.68 .   .     F   0.90     2.06
 Ala  196 A   A   .   .   .       .   .     1.68 .   .     F   1.16     1.20
 Glu  197 A   A   .   .   .       .   .     1.68 .   .     F   1.27     0.93
 Gly  198 A   A   .   .   .       .   .     1.47 .   .     F   1.53     0.93
 Ala  199 .   A   .   .   T       .   .     1.26 .   .     F   2.34     1.42
 Ser  200 .   .   .   .   .       .   C     1.04 .   .     F   2.60     1.27
 Glu  201 .   .   .   .   .       .   C     1.42 *   .     F   2.04     1.99
 Pro  202 .   .   .   .   .       .   C     0.61 *   .     F   1.78     3.04
 Pro  203 .   .   .   .   .       .   C     0.61 .   .     F   1.52     1.87
 Pro  204 .   .   .   .   .       T   C     0.61 .   .     F   1.46     1.07
 Pro  205 .   .   .   .   .       T   C     0.60 .   .     F   0.45     0.70
 Leu  206 .   .   .   .   .       T   C     0.30 *   *     F   0.45     0.65
 Gly  207 .   .   B   .   .       T   .     0.62 .   *     F   0.51     0.57
 Ala  208 .   .   B   .   .       .   .     0.52 .   *     F   1.17     0.72
 Thr  209 .   .   B   .   .       .   .     0.78 *   *     F   1.58     1.25
Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
Ser   210 .   .   B     .   .   T   .     1.10 *   .   F     2.34   2.53
Arg   211 .   .   B     .   .   T   .     1.21 *   .   F     2.60   4.91
Thr   212 .   .   B     .   .   T   .     0.70 *   .   F     2.34   2.95
Lys   213 .   .   B     .   .   T   .     0.99 *   .   F     2.08   1.63
Arg   214 .   .   B     B   .   .   .     1.30 *   .   F     1.42   1.12
Phe   215 .   .   B     B   .   .   .     1.01 *   *   .     1.01   1.34
Val   216 .   .   B     B   .   .   .     1.01 *   *   .     0.60   0.68
Ser   217 A   .   .     B   .   .   .     0.62 *   *   .     0.60   0.68
Glu   218 A   A   .     .   .   .   .     -0.28 *   *   .     -0.30   0.68
Ala   219 A   A   .     B   .   .   .     -0.39 *   *   .     0.30   0.68
Arg   220 A   A   .     B   .   .   .     0.00 *   *   .     0.60   0.87
Phe   221 A   A   .     B   .   .   .     0.04 *   .   .     0.60   0.73
Val   222 A   A   .     B   .   .   .     -0.47 *   *   .     -0.30   0.59
Glu   223 A   A   .     B   .   .   .     -1.32 *   *   .     -0.30   0.25
Thr   224 A   A   .     B   .   .   .     -1.32 *   *   .     -0.60   0.21
Leu   225 A   A   .     B   .   .   .     -1.43 *   *   .     -0.60   0.29
Leu   226 A   A   .     B   .   .   .     -1.32 .   .   .     0.30   0.28
Val   227 A   A   .     B   .   .   .     -0.77 .   .   .     -0.60   0.20
Ala   228 A   A   .     B   .   .   .     -1.37 .   .   .     -0.30   0.32
Asp   229 A   A   .     B   .   .   .     -1.64 .   .   .     -0.30   0.38
Ala   230 A   A   .     .   .   .   .     -1.42 .   .   .     -0.30   0.52
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Ser  231 A     A   .     . .     .   .     -1.31   .   .     .     0.30   0.52
 Met  232 A     A   .     . .     .   .     -0.70   .   .     .     -0.30   0.27
 Ala  233 A     A   .     . .     .   .     -0.46   .   .     .     -0.60   0.42
 Ala  234 A     A   .     . .     .   .     -1.04   .   .     .     -0.60   0.31
 Phe  235 A     A   .     . .     .   .     -0.46   .   .     .     -0.60   0.32
 Tyr  236 A     A   .     . .     .   .     -0.97   .   .     .     -0.60   0.52
 Gly  237 A     A   .     . .     .   .     -0.37   .   .     .     -0.60   0.43
 Ala  238 A     A   .     . .     .   .     0.22   .   .     .     -0.60   0.86
 Asp  239 A     A   .     . .     .   .     0.78   *   *     .     -0.30   0.88
 Leu  240 A     A   .     . .     .   .     0.59   *   .     .     0.45   1.21
 Gln  241 A     A   .     B .     .   .     0.02   *   *     .     -0.30   0.84
 Asn  242 A     A   .     B .     .   .     0.06   *   .     .     -0.30   0.41
 His  243 .     A   B     B .     .   .     -0.17   *   *     .     -0.60   0.72
 Ile  244 .     A   B     B .     .   .     -0.77   *   .     .     -0.60   0.35
 Leu  245 .     A   B     B .     .   .     -0.26   *   .     .     -0.60   0.21
 Thr  246 .     A   B     B .     .   .     -1.11   *   .     .     -0.60   0.21
 Leu  247 .     A   B     B .     .   .     -1.70   *   .     .     -0.60   0.22
 Met  248 A     A   .     B .     .   .     -2.26   *   *     .     -0.60   0.27
 Ser  249 A     A   .     B .     .   .     -1.26   *   *     .     -0.60   0.19
 Val  250 A     A   .     B .     .   .     -1.33   *   *     .     -0.30   0.45
 Ala  251 A     A   .     B .     .   .     -1.27   *   *     .     -0.30   0.32
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Ala   252 A   A   .     B   .     .   .     -0.41 *   *     .     -0.60   0.37
 Arg   253 A   A   .     B   .     .   .     0.16 *   *     .     -0.15   1.01
 Ile   254 A   A   .     B   .     .   .     0.24 *   *     .     0.45   1.36
 Tyr   255 A   .   .     .   .     .   .     0.80 *   *     .     0.99   2.08
 Lys   256 .   .   B     .   .     .   .     0.50 *   *     .     1.33   1.42
 His   257 .   .   B     .   .     T   .     1.13 .   *     F     1.12   1.42
 Pro   258 .   .   .     .   .     T   C     1.02 .   *     F     2.56   1.81
 Ser   259 .   .   .     .   T     T   .     1.61 .   *     F     3.40   1.46
 Ile   260 .   .   .     .   T     T   .     0.97 .   *     F     2.76   1.44
 Lys   261 .   .   B     .   .     .   .     0.92 .   *     F     1.67   0.65
 Asn   262 .   .   .     .   T     .   .     0.14 *   *     F     1.73   0.78
 Ser   263 .   .   B     B   .     .   .     -0.24 *   *     F     0.19   0.92
 Ile   264 .   .   B     B   .     .   .     -0.80 *   *     .     -0.30   0.45
 Asn   265 .   .   B     B   .     .   .     -0.77 *   *     .     -0.60   0.21
 Leu   266 .   .   B     B   .     .   .     -0.77 .   *     .     -0.60   0.12
Met 267 A . . B . . . -1.62 * . . -0.60 0.33
 Val   268 .   .   B     B   .     .   .     -2.13 .   *     .     -0.60   0.15
 Val   269 .   .   B     B   .     .   .     -2.13 .   .     .     -0.60   0.15
 Lys   270 A   .   .     B   .     .   .     -2.99 .   .     .     -0.60   0.11
 Val   271 .   .   B     B   .     .   .     -2.18 .   .     .     -0.60   0.11
 Leu   272 .   .   B     B   .     .   .     -1.58 .   .     .     -0.30   0.25
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ile   273 A     .   .     B   .     .   .     -0.72   .   .     .     0.30     0.21
  Val   274 A     .   .     B   .     .   .     0.18   .   *     .     0.30     0.49
  Glu   275 A     .   .     B   .     .   .     -0.16   .   .     .     0.75     1.19
  Asp   276 A     A   .     .   .     .   .     0.36   .   .     F     0.90     1.79
  Glu   277 A     A   .     .   .     .   .     0.96   *   .     F     0.90     2.39
  Lys   278 .     A   .     .   T     .   .     1.84   *   *     F     1.30     2.13
  Trp   279 .     A   .     .   .     .   C     1.84   .   *     F     1.10     2.21
  Gly   280 .     .   .     .   .     T   C     1.54   *   .     F     1.35     0.95
  Pro   281 .     .   .     .   .     T   C     1.54   *   *     F     1.36     0.64
  Glu   282 .     .   B     .   .     T   .     1.54   *   *     F     1.62     1.01
  Val   283 .     .   B     .   .     T   .     1.16   *   *     F     2.23     1.64
  Ser   284 .     .   .     .   .     T   C     1.10   .   *     F     2.74     1.05
  Asp   285 .     .   .     .   T     T   .     0.63   .   .     F     3.10     0.60
  Asn   286 .     .   .     .   T     T   .     0.53   .   *     F     2.49     0.67
  Gly   287 .     .   .     .   T     T   .     -0.28   *   *     F     2.18     0.72
  Gly   288 .     .   .     .   T     .   .     0.69   *   *     F     1.07     0.35
  Leu   289 .     .   B     .   .     .   .     0.99   *   *     F     0.36     0.43
  Thr   290 .     .   B     .   .     .   .     0.29   *   *     .     -0.10     0.70
  Leu   291 .     .   B     .   .     .   .     -0.38   *   *     .     -0.40     0.61
  Arg   292 .     .   B     .   .     .   .     -0.03   *   *     .     -0.40     0.40
  Asn   293 .     .   B     .   .     .   .     0.02   *   *     .     -0.10     0.44
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Phe   294 .   .   .     .   T     T     .     0.83   *   *     .     0.20     0.57
 Cys   295 .   .   .     .   T     T     .     1.26   *   *     .     0.20     0.50
 Asn   296 .   .   .     .   T     T     .     2.18   *   *     .     0.20     0.61
 Trp   297 .   .   .     .   T     T     .     1.37   *   *     .     0.65     1.38
 Gln   298 .   .   .     .   T     .     .     1.37   *   .     .     0.45     2.23
 Arg   299 .   .   .     .   T     .     .     2.07   *   .     .     1.05     2.23
 Arg   300 .   .   .     .   T     .     .     2.52   *   *     F     1.20     3.67
 Phe   301 .   .   .     .   T     .     .     2.22   *   *     F     1.84     3.28
 Asn   302 .   .   .     .   T     .     .     2.51   *   *     F     2.18     2.24
 Gln   303 .   .   .     .   .     T     C     2.62   *   .     F     2.52     1.91
 Pro   304 .   .   .     .   .     T     C     2.48   *   .     F     2.86     4.33
 Ser   305 .   .   .     .   T     T     .     2.16   *   *     F     3.40     3.66
 Asp   306 .   .   .     .   T     T     .     2.86   *   .     F     3.06     3.27
 Arg   307 .   .   .     .   .     .     C     2.82   *   .     F     2.32     3.66
 His   308 .   .   .     .   .     .     C     2.58   *   .     F     1.98     3.72
 Pro   309 .   .   .     .   .     .     C     2.79   *   .     F     1.64     3.49
 Glu   310 .   .   .     .   T     .     .     2.78   *   .     F     1.50     2.97
 His   311 A   .   .     .   .     T     .     2.19   *   .     F     1.00     3.15
 Tyr   312 A   .   .     .   .     T     .     1.19   *   .     F     1.00     2.06
 Asp   313 A   .   .     .   .     T     .     0.41   .   .     F     0.85     0.83
 Thr   314 A   .   .     .   .     T     .     -0.19   .   .     .     -0.20     0.51
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala   315 A     .   .     B     .   .   .     -0.50 *   .   .     -0.60   0.27
  Ile   316 .     .   B     B     .   .   .     -0.36 *   .   .     -0.60   0.23
  Leu   317 .     .   B     B     .   .   .     -0.11 .   .   .     -0.60   0.31
  Leu   318 .     .   B     B     .   .   .     -0.11 .   *   .     -0.60   0.53
  Thr   319 .     .   B     B     .   .   .     -0.50 .   .   F      0.00   1.23
  Arg   320 .     .   B     B     .   .   .     -0.58 .   *   F     -0.08   1.29
  Gln   321 .     .   .     B     T   .   .     -0.03 .   *   F     0.69   0.84
  Asn   322 .     .   .     .     T   T   .     0.78 .   *   F     1.31   0.57
  Phe   323 .     .   .     .     T   T   .     1.59 .   .   .     1.98   0.51
  Cys   324 .     .   .     .     T   T   .     1.56 .   *   .     2.20   0.51
  Gly   325 .     .   .     .     T   T   .     0.63 .   *   F     1.53   0.31
  Gln   326 .     .   .     .     T   .   .     -0.03 .   .   F     1.11   0.30
  Glu   327 .     .   .     .     T   .   .     -0.03 .   .   F     0.89   0.30
  Gly   328 .     .   .     .     T   .   .     0.36 .   .   F     1.27   0.50
  Leu   329 .     .   B     .     .   .   .     0.21 .   .   F     0.65   0.42
  Cys   330 .     .   B     .     .   .   .     0.21 .   .   .     0.50   0.20
  Asp   331 .     .   B     .     .   T   .     -0.64 .   .   .     0.10   0.20
  Thr   332 .     .   B     .     .   T   .     -1.23 *   .   .     -0.20   0.18
  Leu   333 .     .   B     .     .   T   .     -0.89 .   .   .     0.10   0.34
  Gly   334 .     .   B     .     .   T   .     -0.97 .   .   .     0.70   0.34
  Val   335 .     .   B     .     .   .   .     -0.64 .   .   .     -0.40   0.16
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Ala   336 .   .   B     .   .     .   .     -0.96 .   .     .     -0.10   0.20
 Asp   337 .   .   B     .   .     T   .     -1.53 .   .     .     0.10   0.29
 Ile   338 .   .   B     .   .     T   .     -1.39 .   .     .     -0.20   0.27
 Gly   339 .   .   B     .   .     T   .     -1.04 *   .     .     0.10   0.14
 Thr   340 .   .   B     .   .     T   .     -0.40 .   .     .     0.70   0.14
 Ile   341 .   .   B     .   .     .   .     0.19 .   .     .     0.24   0.32
 Cys   342 .   .   B     .   .     .   .     0.23 .   .     .     1.18   0.52
 Asp   343 .   .   B     .   .     T   .     0.82 *   .     F     1.87   0.72
 Pro   344 .   .   .     .   T     T   .     0.50 .   .     F     3.06   1.37
 Asn   345 .   .   .     .   T     T   .     0.51 .   .     F     3 40   1.37
 Lys   346 .   .   .     .   T     T   .     0.54 *   .     F     3.06   1.10
 Ser   347 .   .   .     B   T     .   .     0.32 .   .     F     1.87   0.53
 Cys   348 .   .   B     B   .     .   .     0.32 *   .     .     0.38   0.23
 Ser   349 .   .   B     B   .     .   .     0.53 *   .     .     0.64   0.20
 Val   350 .   .   B     B   .     .   .     0.53 *   .     .     0.30   0.25
 Ile   351 .   .   B     B   .     .   .     0.14 *   .     .     0.60   0.80
 Glu   352 A   .   .     B   .     .   .     -0.37 .   .     .     0.60   0.59
 Asp   353 A   A   .     .   .     .   .     0.30 .   .     F     0.75   0.66
 Glu   354 A   A   .     .   .     .   .     0.01 *   .     F     0.90   1.62
 Gly   355 A   A   .     .   .     .   .     0.28 *   .     F     0.75   0.95
 Leu   356 A   A   .     .   .     .   .     1.13 *   .     .     0.30   0.57
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gln   357 A   A   .     .   .     .   .     0.82 *   .   .     -0.30   0.45
  Ala   358 A   A   .     .   .     .   .     0.01 *   .   .     -0.60   0.66
  Ala   359 A   A   .     .   .     .   .     -0.58 *   .   .     -0.60   0.66
  His   360 A   A   .     .   .     .   .     -0.27 *   .   .     -0.60   0.38
  Thr   361 A   A   .     .   .     .   .     0.54 *   .   .     -0.60   0.52
  Leu   362 A   A   .     .   .     .   .     -0.27 *   .   .     -0.30   0.88
  Ala   363 A   A   .     .   .     .   .     -0.02 *   .   .     -0.30   0.54
  His   364 A   A   .     .   .     .   .     0.53 *   .   .     -0.30   0.37
  Glu   365 A   A   .     .   .     .   .     -0.29 *   .   .     -0.30   0.61
  Leu   366 A   A   .     B   .     .   .     -0.79 *   .   .     -0.30   0.45
  Gly   367 A   A   .     B   .     .   .     -0.28 *   .   .     -0.60   0.27
  His   368 A   A   .     B   .     .   .     -0.29 *   .   .     -0.30   0.21
  Val   369 A   A   .     B   .     .   .     -0.47 *   .   .     -0.60   0.25
  Leu   370 .   A   B     B   .     .   .     -0.50 *   .   .     -0.26   0.39
  Ser   371 .   A   B     B   .     .   .     0.31 *   .   .     0.08   0.39
  Met   372 .   .   B     .   .     .   .     0.66 .   .   .     0.92   0.88
  Pr0   373 .   .   .     .   T     .   .     0.39 *   .   .     2.41   1.78
  His   374 .   .   .     .   T     T   .     1.29 *   .   F     3.40   1.78
  Asp   375 .   .   .     .   T     T   .     1.89 .   .   F     3.06   3.61
  Asp   376 .   .   .     .   T     T   .     1.52 .   .   F     2.89   3.61
  Ser   377 .   .   .     .   T     T   .     1.81 *   *   F     2.72   1.42
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Lys  378 .   .   B     .   .     T   .     2.13   *   *     F     2.15   1.23
 Pro  379 .   .   .     .   T     T   .     1.36   *   *     F     2.38   1.44
 Cys  380 .   .   B     .   .     T   .     0.66   *   *     F     1.70   0.89
 Thr  381 .   .   B     .   .     T   .     0.31   *   *     F     1.53   0.38
 Arg  382 .   .   B     B   .     .   .     0.40   *   *     F     0.36   0.25
 Leu  383 .   .   B     B   .     .   .     -0.24   *   *     .     0.04   0.71
 Phe  384 .   .   B     B   .     .   .     -0.38   *   .     .     -0.43   0.49
 Gly  385 .   .   .     B   .     .   C     0.33   *   .     F     0.05   0.25
 Pro  386 .   .   .     .   .     T   C     0.61   *   *     F     0.45   0.59
 Met  387 .   .   .     .   T     T   .     0.47   *   *     F     0.65   0.93
 Gly  388 A   .   .     .   .     T   .     0.42   .   .     F     1.00   1.29
 Lys  389 A   .   .     .   .     T   .     0.52   .   .     .     0.10   0.62
 His  390 A   A   .     .   .     .   .     0.28   .   .     .     -0.30   0.62
 His  391 A   A   .     .   .     .   .     0.28   .   *     .     -0.30   0.63
 Val  392 .   A   B     .   .     .   .     0.07   .   .     .     -0.30   0.49
 Met  393 A   A   .     .   .     .   .     -0.29   .   *     .     -0.60   0.30
 Ala  394 A   A   .     .   .     .   .     -1.19   .   *     .     -0.60   0.19
 Pro  395 A   A   .     .   .     .   .     -1.19   .   *     .     -0.60   0.19
 Leu  396 A   A   .     .   .     .   .     -1.97   .   *     .     -0.60   0.26
 Phe  397 A   A   .     .   .     .   .     -1.11   *   *     .     -0.60   0.21
 Val  398 A   A   .     .   .     .   .     -0.51   *   .     .     -0.60   0.22
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  His  399   .     A   B     .   .   .     .     -0.23 *   *     .     -0.60   0.46
  Leu  400   .     A   B     .   .   .     .     -0.83 *   *     .     -0.60   0.77
  Asn  401   .     A   .     .   T   .     .     -0.23 *   *     F     -0.05   0.85
  Gln  402   .     A   .     .   T   .     .     0.18 .   *     F     -0.05   0.97
  Thr  403   .     A   .     .   T   .     .     0.73 .   *     F     0.10   1.24
  Leu  404   .     A   .     .   .   .     C     0.56 .   *     F     -0.10   1.03
  Pro  405   .     .   .     .   T   .     .     0.70 .   .     .     0.00   0.92
  Trp  406   .     .   .     .   T   .     .     0.40 .   .     .     0.00   0.34
  Ser  407   .     .   .     .   .   T     C     -0.19 .   .     .     0.00   0.55
  Pro  408   .     .   .     .   T   T     .     -0.48 .   .     .     0.20   0.36
  Cys  409   .     .   .     .   T   T     .     0.09 .   .     .     0.20   0.34
  Ser  410   .     .   B     .   .   T     .     -0.51 .   .     .     -0.20   0.40
  Ala  411   .     A   B     .   .   .     .     -0.53 .   .     .     -0.60   0.21
  Met  412   .     A   B     .   .   .     .     -0.23 .   .     .     -0.60   0.57
  Tyr  413   .     A   B     .   .   .     .     -0.83 .   .     .     -0.60   0.74
  Leu  414   .     A   B     .   .   .     .     -0.98 *   .     .     -0.60   0.60
  Thr  415   .     A   B     .   .   .     .     -0.68 *   .     .     -0.60   0.50
  Glu  416   A     A   .     .   .   .     .     -0.43 *   .     .     -0.30   0.54
  Leu  417   A     A   .     .   .   .     .     -0.18 *   .     F     0.76   0.64
  Leu  418   A     .   .     .   .   T     .     0.03 *   .     F     1.47   0.44
  Asp  419   .     .   .     .   T   T     .     0.50 *   .     F     2.18   0.35
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garnl…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Gly   420 .     .   .     .   T     T     .     0.81   .   .     F     1.89   0.42
 Gly   421 .     .   .     .   T     T     .     0.14   .   .     F     3.10   0.84
 His   422 .     .   .     .   T     T     .     0.14   .   .     F     2.79   0.27
 Gly   423 .     .   .     .   T     T     .     0.14   .   .     F     1.58   0.23
 Asp   424 .     .   B     .   .     T     .     0.14   .   *     .     0.72   0.19
 Cys   425 .     .   B     .   .     T     .     -0.10   .   *     .     1.01   0.23
 Leu   426 .     .   B     .   .     .     .     0.03   .   *     .     0.50   0.24
 Leu   427 .     .   B     .   .     .     .     -0.28   .   *     .     0.50   0.22
 Asp   428 .     .   B     .   .     .     .     -0.52   *   *     .     -0.10   0.40
 Ala   429 .     .   B     .   .     T     .     -1.11   *   .     F     0.25   0.49
 Pro   430 A     .   .     .   .     T     .     -1.26   .   .     F     0.25   0.60
 Gly   431 .     .   .     .   T     T     .     -0.66   .   .     F     0.65   0.30
 Ala   432 .     .   B     .   .     T     .     -0.66   .   .     .     -0.20   0.46
 Ala   433 .     .   B     .   .     .     .     -0.87   .   .     .     -0.40   0.24
 Leu   434 .     .   B     .   .     .     .     -0.59   .   .     .     -0.40   0.38
 Pro   435 .     .   B     .   .     .     .     -0.72   .   .     .     -0.40   0.54
 Leu   436 .     .   B     .   .     T     .     -1.19   .   .     .     -0.20   0.53
 Pro   437 .     .   B     .   .     T     .     -0.81   .   .     F     0.00   0.53
 Thr   438 .     .   .     .   T     T     .     -0.57   .   *     F     0.45   0.53
 Gly   439 .     .   .     .   .     T     C     0.36   .   *     F     0.30   0.64
 Leu   440 .     .   .     .   .     T     C     -0.03   .   *     F     1.25   0.81
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Pro   441   .   .   B     .   .     T   .     0.19 .   *     F     0.50   0.55
  Gly   442   .   .   B     .   .     T   .     -0.41 .   *     F     0.45   0.57
  Arg   443   .   .   B     .   .     T   .     -0.34 .   *     .     0.25   0.57
  Met   444   .   A   B     .   .     .   .     0.00 .   *     .     -0.50   0.57
Ala 445 . A B . . . . 0.00 * * . -0.10 1.00
  Leu   446   .   A   B     .   .     .   .     0.21 *   .     .     -0.60   0.42
  Tyr   447   .   A   B     .   .     .   .     0.56 *   *     .     -0.60   0.71
  Gln   448   .   A   B     .   .     .   .     0.44 *   *     .     -0.45   1.22
  Leu   449   A   A   .     .   .     .   .     0.38 *   *     .     -0.15   2.57
  Asp   450   A   A   .     .   .     .   .     1.08 *   *     F     -0.15   0.88
  Gln   451   .   A   B     .   .     .   .     1.89 *   *     F     0.75   0.99
  Gln   452   .   A   B     .   .     .   .     1.24 *   *     F     0.90   2.09
  Cys   453   .   A   B     .   .     .   .     0.54 *   *     F     0.75   0.88
  Arg   454   .   A   B     .   .     .   .     1.01 *   *     .     -0.30   0.44
  Gln   455   .   A   B     .   .     .   .     0.80 *   *     .     -0.30   0.25
  Ile   456   .   A   B     .   .     .   .     0.80 *   .     .     -0.30   0.72
  Phe   457   .   A   .     .   T     .   .     0.10 *   *     .     0.70   0.62
  Gly   458   .   .   .     .   .     T   C     0.88 *   *     .     0.00   0.31
  Pro   459   .   .   .     .   T     T   .     0.73 *   *     F     0.65   0.86
  Asp   460   .   .   .     .   T     T   .     0.07 *   *     F     1.40   1.35
  Phe   461   .   .   .     .   T     T   .     0.74 *   *     .     1.35   0.73
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Arg  462 .   .   .     .   T     .   .     1.44 *   *     .     1.40   0.73
  His  463 .   .   .     .   T     .   .     1.48 *   *     .     1.65   0.71
  Cys  464 .   .   .     .   .     T   C     1.39 *   *     .     1.45   1.18
  Pro  465 .   .   .     .   T     T   .     0.80 *   .     F     2.50   0.80
  Asn  466 .   .   .     .   T     T   .     1.50 *   *     F     1.65   0.60
  Thr  467 .   .   .     .   T     T   .     1.39 *   *     F     1.55   1.93
  Ser  468 .   A   .     .   T     .   .     0.57 *   .     F     1.50   2.08
  Ala  469 .   A   .     .   T     .   .     0.57 .   .     F     1.10   0.96
  Gln  470 .   A   B     .   .     .   .     0.19 .   .     F     0.45   0.36
  Asp  471 .   A   B     .   .     .   .     0.19 *   *     F     0.45   0.27
  Val  472 .   A   B     .   .     .   .     -0.31 *   .     .     -0.30   0.46
  Cys  473 .   A   B     .   .     .   .     -0.30 *   .     .     -0.30   0.22
  Ala  474 .   A   B     .   .     .   .     -0.38 *   *     .     -0.60   0.14
  Gln  475 .   A   B     .   .     .   .     -0.41 .   *     .     -0.60   0.10
  Leu  476 .   A   B     .   .     .   .     -0.72 *   *     .     -0.60   0.25
  Trp  477 .   A   B     .   .     .   .     0.13 .   *     .     -0.60   0.36
  Cys  478 .   A   B     .   .     .   .     0.46 .   .     .     -0.26   0.35
  His  479 .   .   .     .   T     T   .     0.46 .   .     .     0.88   0.42
  Thr  480 .   .   .     .   T     T   .     0.46 .   *     .     1.52   0.40
  Asp  481 .   .   .     .   T     T   .     1.06 .   .     F     3.06   1.30
  Gly  482 .   .   .     .   T     T   .     0.53 .   .     F     3.40   1.48
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala   483     .     .   .     .   T     .   C   0.53   *   .     F   2.41   0.85
  Glu   484     A     .   .     .   .     .   .   0.53   *   .     F   1.67   0.27
  Pro   485     A     .   .     .   .     .   .   0.53   .   .     F   0.73   0.37
  Leu   486     A     .   .     .   .     .   .   0.58   *   .     .   0.24   0.53
  Cys   487     A     .   .     .   .     .   .   0.92   .   .     .   0.78   0.62
  His   488     .     .   B     .   .     .   .   1.17   .   .     F   0.61   0.64
  Thr   489     .     .   .     .   T     T   .   0.87   .   .     F   1.49   0.77
  Lys   490     .     .   .     .   T     T   .   0.27 .   .     F   2.52   1.92
  Asn   491     .     .   .     .   T     T   .   0.87   .   .     F   2.80   1.16
  Gly   492     .     .   .     .   T     T   .   1.24   .   .     F   2.52   1.25
  Ser   493     .     .   .     .   .     .   C   0.69   .   .     F   1.09   0.66
  Leu   494     .     .   .     .   .     .   C   1.00   .   .     .   0.36   0.41
  Pro   495     .     .   B     .   .     .   .   0.61   .   .     .   0.18   0.69
  Trp   496     .     .   .     .   T     T   .   0.30   .   .     .   0.50   0.51
  Ala   497     .     .   B     .   .     T   .   0.43   .   .     .   0.05   0.90
  Asp   498     .     .   .     .   T     T   .   0.07   .   .     F   1.15   0.90
  Gly   499     .     .   .     .   T     T   .   0.53   .   .     F   1.40   0.46
  Thr   500     .     .   .     .   .     T   C   0.53   .   .     F   2.05   0.45
  Pro   501     .     .   .     .   T     T   .   0.48   .   .     F   2.50   0.42
  Cys   502     .     .   .     .   T     T   .   1.03   .   *     F   1.65   0.42
  Gly   503     .     .   .     .   .     T   C   0.22   .   .     F   1.20   0.39
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Pro  504 .   .   .     .   T     .   .     -0.10 .   .     F     0.65   0.21
  Gly  505 .   .   .     .   T     .   .     -0.09 .   .     .     0.25   0.21
  His  506 .   .   B     .   .     .   .     0.12 .   .     .     -0.40   0.28
  Leu  507 .   .   B     .   .     .   .     0.44 .   .     .     0.50   0.32
  Cys  508 .   .   B     .   .     T   .     0.49 .   *     .     0.91   0.32
  Ser  509 .   .   .     .   T     T   .     0.03 .   .     F     1.67   0.31
  Glu  510 .   .   .     .   T     T   .     -0.43 .   .     F     1.28   0.20
  Gly  511 .   .   .     .   T     T   .     -0.61 *   .     F     1.49   0.31
  Ser  512 .   .   .     .   T     .   .     0.20 *   .     F     2 10   0.36
  Cys  513 .   A   .     .   .     .   C     0.87 .   .     F     1.79   0.36
  Leu  514 .   A   .     .   .     .   C     1.17 .   .     F     1.58   0.63
  Pro  515 A   A   .     .   .     .   .     0.31 .   .     F     1.17   0.81
  Glu  516 A   A   .     .   .     .   .     0.66 *   .     F     1.11   1.13
  Glu  517 A   A   .     .   .     .   .     1.07 *   .     F     0.90   2.37
  Glu  518 A   A   .     .   .     .   .     1.52 .   .     F     0.90   3.00
  Val  519 A   A   .     .   .     .   .     2.38 .   .     F     0.90   2.68
  Glu  520 A   A   .     .   .     .   .     2.38 *   .     F     0.90   3.09
  Arg  521 A   .   .     .   .     T   .     1.52 *   .     F     1.30   2.76
  Pro  522 A   .   .     .   .     T   .     0.67 *   *     F     1.30   2.76
  Lys  523 A   .   .     .   .     T   .     0.67 *   *     F     1.30   1.18
  Pro  524 .   .   B     .   .     T   .     1.18 *   *     F     1.30   1.01
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Gartni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Val  525 .     .   B     .   .     .   .     0.83 *   *     F     0.65   0.65
  Val  526 .     .   B     .   .     .   .     0.43 .   *     F     0.65   0.32
  Asp  527 .     .   B     .   .     T   .     0.06 *   .     F     -0.05   0.22
  Gly  528 .     .   B     .   .     T   .     -0.20 *   .     F     -0.05   0.30
  Gly  529 .     .   .     .   T     T   .     -0.28 .   .     F     0.65   0.62
  Trp  530 .     .   .     .   .     T   C     0.23 .   .     .     0.00   0.39
  Ala  531 .     .   .     .   .     .   C     0.88 .   .     .     -0.20   0.39
  Pro  532 .     .   .     .   T     .   .     0.59 .   .     .     0.00   0.61
  Trp  533 .     .   .     .   T     .   .     0.59 .   .     .     0.00   0.61
  Gly  534 .     .   .     .   .     T   C     0.93 .   .     .     0.00   0.59
  Pro  535 .     .   .     .   T     T   .     0.56 .   .     F     0.35   0.66
  Trp  536 .     .   .     .   T     T   .     0.84 *   .     F     0.66   0.34
  Gly  537 .     .   .     .   .     T   C     1.17 *   .     F     1.07   0.46
  Glu  538 .     .   .     .   T     .   .     1.14 *   .     F     1.98   0.58
  Cys  539 .     .   .     .   T     T   .     0.82 *   .     F     2.49   0.80
  Ser  540 .     .   .     .   T     T   .     0.69 *   .     F     3.10   0.43
  Arg  541 .     .   .     .   T     T   .     0.63 *   .     F     2.79   0.25
  Thr  542 .     .   .     .   T     T   .     0.63 *   .     F     2.18   0.46
  Cys  543 .     .   .     .   T     T   .     -0.22 *   .     F     1.87   0.34
  Gly  544 .     .   .     .   T     T   .     0.44 *   .     F     1.56   0.13
  Gly  545 .     .   .     .   T     T   .     0.04 *   *     F     0.65   0.15
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Gly  546 .   .   .     .   T     T   .     -0.37 *   *     F     0.35     0.25
 Val  547 .   .   B     B   .     .   .     -0.09 *   *     .     -0.60     0.33
 Gln  548 .   .   B     B   .     .   .     0.69 *   *     .     -0.60     0.46
 Phe  549 .   .   B     B   .     .   .     1.03 *   *     .     -0.30     0.91
Ser 550 . . B B . . . 0.71 * * . 0.79 2.13
 His  551 .   .   B     .   .     .   .     1.10 *   *     .     1.18     0.66
 Arg  552 .   .   .     .   T     .   .     1.96 *   *     .     2.37     1.52
 Glu  553 .   .   .     .   T     .   .     1.74 *   *     F     2.86     1.89
 Cys  554 .   .   .     .   T     T   .     2.44 *   .     F     3.40     2.15
 Lys  555 .   .   .     .   T     T   .     2.53 *   .     F     3.06     1.90
 Asp  556 .   .   .     .   .     T   C     2.57 *   .     F     2.52     1.70
 Pro  557 .   .   .     .   .     T   C     2.46 *   .     F     2.52     5.49
 Glu  558 .   .   .     .   .     .   C     2.11 .   .     F     2.32     4.41
 Pro  559 .   .   .     .   T     T   .     2.43 .   *     F     2.72     2.62
 Gln  560 .   .   .     .   T     T   .     2.50 .   *     F     2.76     1.67
 Asn  561 .   .   .     .   T     T   .     2.26 *   *     F     3.40     1.89
 Gly  562 .   .   .     .   T     T   .     1.80 *   *     F     2.76     1.92
 Gly  563 .   .   .     .   T     T   .     0.99 *   *     F     2.27     0.59
 Arg  564 .   .   B     .   .     T   .     0.86 *   .     F     0.93     0.30
 Tyr  565 .   .   B     .   .     T   .     0.97 .   .     .     0.44     0.30
 Cys  566 .   .   B     .   .     T   .     1.08 .   .     .     1.00     0.60
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Leu  567 .     .   B     .   .     .   .     0.83   .   *     .   1.40   0.60
  Gly  568 .     .   B     .   .     .   .     1.22   .   *     F   1.55   0.39
  Arg  569 .     .   B     .   .     .   .     0.87   .   *     F   2.30   1.45
  Arg  570 .     .   .     .   T     .   .     1.11   *   *     F   3.00   2.75
Ala 571 . . . . T . . 1.48 * * F 2.70 4.82
  Lys  572 .     .   .     .   T     .   .     1.62   *   *     F   2.40   3.30
  Tyr  573 .     .   .     .   T     T   .     1.93   *   .     F   1.85   0.90
  Gln  574 .     .   .     .   T     T   .     1.51   .   .     F   1.10   1.22
  Ser  575 .     .   .     .   T     T   .     1.40   .   *     .   0.50   0.88
  Cys  576 .     .   .     .   T     T   .     1.99   .   .     .   0.50   0.97
  His  577 .     A   B     .   .     .   .     1.28   .   .     .   0.60   0.97
  Thr  578 .     A   .     .   T     .   .     1.31   .   .     F   0.85   0.39
  Glu  579 .     A   .     .   T     .   .     1.10   .   .     F   1.00   1.12
  Glu  580 .     A   .     .   T     .   .     1.40   .   .     F   1.64   1.27
  Cys  581 .     A   B     .   .     .   .     1.72   .   *     F   1.58   1.47
  Pro  582 .     .   .     .   .     T   C     1.80   .   *     F   2.37   0.84
  Pro  583 .     .   .     .   T     T   .     1.81   *   .     F   2.91   0.97
  Asp  584 .     .   .     .   T     T   .     1.11   *   .     F   3.40   2.43
  Gly  585 .     .   .     .   T     T   .     1.22   *   .     F   3.06   1.36
  Lys  586 .     A   .     .   T     .   .     1.89   *   .     F   2.32   1.72
  Ser  587 A     A   .     .   .     .   .     2.10   .   .     F   1.58   1.79
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
Phe 588 A A . . . . . 2.31 . . F 1.24 3.13
 Arg   589 A     A   .     .   .     .   .     1.64 .   .     F     0.90     2.71
 Glu   590 A     A   .     .   .     .   .     1.99 .   .     F     0.60     1.08
 Gln   591 A     A   .     .   .     .   .     1.99 .   .     F     0.90     2.17
 Gln   592 A     A   .     .   .     .   .     2.04 .   *     F     0.90     2.21
 Cys   593 A     A   .     .   .     .   .     2.74 .   *     F     1.15     2.00
 Glu   594 .     A   .     .   T     .   .     2.04 .   .     F     1.50     1.86
 Lys   595 .     A   .     .   T     .   .     1.80 .   .     F     1.75     1.08
 Tyr   596 .     .   .     .   T     .   .     1.80 .   .     .     2.05     3.17
 Asn   597 .     .   .     .   T     T   .     1.56 .   .     .     2.50     2.94
 Ala   598 .     .   .     .   T     T   .     1.91 .   .     .     1.35     2.30
 Tyr   599 .     .   B     .   .     T   .     1.91 .   .     .     0.70     2.12
 Asn   600 .     .   B     .   .     T   .     1.27 .   *     .     0.75     2.20
 Tyr   601 .     .   B     .   .     .   .     1.51 .   .     .     0.25     2.16
 Thr   602 .     .   B     .   .     .   .     1.17 .   *     F     0.70     2.30
 Asp   603 .     .   B     .   .     T   .     1.76 .   *     F     1.75     1.42
 Met   604 .     .   B     .   .     T   .     1.19 .   *     F     2.00     1.45
 Asp   605 .     .   .     .   T     T   .     0.38 *   .     F     2.50     0.83
 Gly   606 .     .   B     .   .     T   .     0.62 *   *     F     1.85     0.41
 Asn   607 .     .   B     B   .     .   .     0.64 *   *     F     0.60     0.72
 Leu   608 A     .   .     B   .     .   .     -0.21 *   *     .     -0.10     0.45
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Leu   609 .     .   B     B   .     .   .     0.18 *   *     .     -0.35   0.34
  Gln   610 .     .   B     B   .     .   .     0.22 *   .     .     -0.60   0.33
  Trp   611 .     .   B     B   .     .   .     0.32 *   .     .     -0.60   0.79
  Val   612 .     .   B     B   .     .   .     -0.27 *   .     .     -0.45   1.50
  Pro   613 .     .   B     .   .     T   .     0.20 *   .     .     -0.20   0.88
  Lys   614 .     .   B     .   .     T   .     0.16 *   *     .     -0.20   0.82
  Tyr   615 .     .   B     .   .     T   .     -0.14 .   .     .     0.10   0.82
  Ala   616 .     .   .     .   T     T   .     -0.07 *   *     .     0.50   0.71
  Gly   617 .     .   .     .   T     .   .     0.90 *   .     .     0.64   0.55
  Val   618 .     .   B     .   .     .   .     1.11 .   *     .     0.58   0.69
  Ser   619 .     .   B     .   .     T   .     1.18 .   *     F     2.32   1.14
  Pro   620 .     .   B     .   .     T   .     0.76 .   *     F     2.66   2.26
  Arg   621 .     .   .     .   T     T   .     1.39 .   *     F     3.40   1.63
  Asp   622 .     .   .     .   T     T   .     0.92 .   *     F     3.06   2.43
  Arg   623 .     A   .     .   T     .   .     1.08 .   *     F     2.32   1.30
  Cys   624 .     A   B     .   .     .   .     0.71 *   *     F     1.43   0.57
  Lys   625 .     A   B     .   .     .   .     1.03 *   *     .     0.64   0.18
  Leu   626 .     A   B     .   .     .   .     0.33 *   *     .     0.30   0.18
  Phe   627 .     A   B     .   .     .   .     0.44 .   *     .     0.04   0.35
  Cys   628 .     A   B     .   .     .   .     -0.01 .   *     .     0.98   0.34
  Arg   629 .     A   B     .   .     .   .     0.77 *   *     .     1.32   0.41
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala  630   A     .   .     .   .     T     .     0.42 *   *     .     2.36   0.92
  Arg  631   .     .   .     .   T     T     .     1.23 .   *     F     3.40   2.31
  Gly  632   .     .   .     .   T     T     .     1.23 .   *     F     3.06   2.04
  Arg  633   .     .   .     .   T     T     .     1.94 .   *     F     2.72   1.75
Ser 634 A A . . . . . 0.98 * * F 1.58 1.79
  Glu  635   A     A   .     .   .     .     .     0.87 *   .     F     1.24   1.34
  Phe  636   A     A   .     .   .     .     .     0.76 *   *     F     0.45   0.59
  Lys  637   A     A   .     .   .     .     .     0.51 *   *     .     0.30   0.77
  Val  638   A     A   .     .   .     .     .     0.44 *   *     .     0.30   0.45
  Phe  639   A     A   .     .   .     .     .     -0.11 .   .     .     0.45   1.03
  Glu  640   A     A   .     .   .     .     .     -1.00 *   .     .     0.30   0.38
  Ala  641   A     .   .     B   .     .     .     -0.30 *   .     .     -0.30   0.36
  Lys  642   A     .   .     B   .     .     .     -0.69 .   .     .     0.30   0.70
  Val  643   A     .   .     B   .     .     .     -0.14 .   .     .     0.60   0.40
  Ile  644   A     .   .     B   .     .     .     -0.26 .   *     F     0.45   0.57
  Asp  645   .     .   B     B   .     .     .     -0.92 .   .     F     0.45   0.23
  Gly  646   .     .   B     B   .     .     .     -0.68 *   .     F     -0.45   0.17
  Thr  647   .     .   B     B   .     .     .     -0.93 *   .     F     -0.15   0.24
  Leu  648   .     .   .     B   .     .     C     -0.08 .   .     F     0.05   0.22
  Cys  649   .     .   .     B   T     .     .     0.50 *   *     .     0.10   0.39
  Gly  650   .     .   .     .   .     T     C     -0.31 .   .     F     0.45   0.39
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Pro   651 .   .   .     .   T     T   .     -0.56   .   .     F     0.65   0.39
  Glu   652 A   .   .     .   .     T   .     -1.13   .   .     F     0.25   0.73
  Thr   653 A   .   .     .   .     T   .     -0.99   .   .     F     0.25   0.52
  Leu   654 A   .   .     B   .     .   .     -1.18   *   *     .     -0.30   0.18
  Ala   655 .   .   B     B   .     .   .     -0.72   *   *     .     -0.60   0.08
  Ile   656 .   .   B     B   .     .   .     -0.86   .   *     .     -0.60   0.10
  Cys   657 .   .   B     B   .     .   .     -0.86   .   *     .     -0.60   0.13
  Val   658 A   .   .     B   .     .   .     -1.21   .   *     .     -0.30   0.21
  Arg   659 .   .   B     B   .     .   .     -1.26   .   *     .     -0.30   0.16
  Gly   660 .   .   .     B   T     T   .     -0.62   .   *     F     0.25   0.23
  Gln   661 .   .   B     B   .     .   .     -0.32   .   *     F     0.45   0.61
  Cys   662 .   .   B     B   .     .   .     0.00   .   *     .     0.30   0.32
  Val   663 .   .   B     B   .     .   .     0.19   .   *     .     0.30   0.32
  Lys   664 .   .   B     .   .     T   .     0.08   .   *     .     0.10   0.10
  Ala   665 .   .   B     .   .     T   .     0.39   *   .     .     0.70   0.30
  Gly   666 .   .   B     .   .     T   .     -0.47   *   .     .     0.70   0.56
  Cys   667 .   .   B     .   .     T   .     -0.66   *   *     .     0.70   0.21
  Asp   668 .   .   B     B   .     .   .     0.20   *   *     .     -0.30   0.15
  His   669 .   .   B     B   .     .   .     -0.14   *   .     .     0.30   0.26
  Val   670 .   .   B     B   .     .   .     0.23   *   .     .     0.30   0.64
  Val   671 .   .   B     B   .     .   .     0.69   *   .     .     0.64   0.59
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Asp   672   .   .   B     B   .     .   .     1.40   *   .     F     1.13   0.86
  Ser   673   .   .   B     .   .     T   .     0.59   *   .     F     2.32   2.31
  Pro   674   A   .   .     .   .     T   .     0.62   *   .     F     2.66   2.56
  Arg   675   .   .   .     .   T     T   .     1.52   *   .     F     3.40   2.56
  Lys   676   .   .   .     .   T     T   .     1.71   *   .     F     3.06   3.82
  Leu   677   .   .   .     .   T     .   .     1.37   *   .     F     2.52   1.33
  Asp   678   .   .   .     .   T     T   .     0.81   *   .     F     2.23   0.67
  Lys   679   .   .   B     .   .     T   .     0.36   *   .     F     1.49   0.25
  Cys   680   .   .   B     .   .     T   .     -0.10   *   .     .     0.70   0.16
  Gly   681   .   .   B     .   .     T   .     -0.49   *   .     .     0.70   0.10
  Val   682   .   .   B     .   .     .   .     0.37   *   .     .     -0.10   0.05
  Cys   683   .   .   B     .   .     T   .     0.02   .   .     .     0.10   0.18
  Gly   684   .   .   .     .   T     T   .     -0.02   .   .     F     1.59   0.18
  Gly   685   .   .   .     .   T     T   .     0.34   .   .     F     1.93   0.38
  Lys   686   .   .   .     .   T     T   .     0.02   .   .     F     2.27   0.96
  Gly   687   .   .   .     .   T     .   .     0.99   .   .     F     2.41   0.52
  Asn   688   .   .   .     .   T     T   .     1.70   .   .     F     3.40   1.03
  Ser   689   .   .   B     .   .     T   .     1.19   .   .     F     2.66   1.03
  Cys   690   .   .   B     .   .     T   .     1.23   .   .     F     2.34   0.77
  Arg   691   .   .   B     .   .     T   .     0.84   .   .     F     2.17   0.64
  Lys   692   .   .   B     .   .     .   .     0.89   *   .     F     1.80   0.47
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Val   693 .     .   B     .   .     T   .     0.08 *   .     F     1.98     1.18
  Ser   694 .     .   B     .   .     T   .     0.07 *   .     F     1.70     0.50
  Gly   695 .     .   B     .   .     T   .     0.52 *   .     F     0.93     0.36
  Ser   696 .     .   B     .   .     T   .     0.10 *   .     F     0.46     0.75
  Leu   697 .     .   B     .   .     .   .     0.06 .   *     F     0.39     0.81
  Thr   698 .     .   B     .   .     .   .     0.67 .   .     F     0.37     1.31
  Pro   699 .     .   B     .   .     T   .     0.62 .   .     F     0.10     1.53
  Thr   700 .     .   .     .   T     T   .     0.72 .   .     F     0.50     1.84
  Asn   701 .     .   B     .   .     T   .     1.02 .   .     F     0.10     2.00
  Tyr   702 .     .   .     .   T     T   .     1.83 *   .     .     0.35     2.08
  Gly   703 .     .   .     .   T     T   .     1.26 *   .     .     0.65     2.41
  Tyr   704 .     .   .     .   T     T   .     0.61 *   .     .     0.35     1.05
  Asn   705 .     .   B     .   .     T   .     0.61 *   .     .     -0.20     0.50
  Asp   706 .     .   B     .   .     T   .     -0.28 *   .     .     0.10     0.72
  Ile   707 .     .   B     B   .     .   .     -0.24 *   .     .     -0.60     0.32
  Val   708 .     .   B     B   .     .   .     -0.49 .   .     .     -0.30     0.31
  Thr   709 .     .   B     B   .     .   .     -0.59 *   .     .     -0.60     0.19
  Ile   710 .     .   B     B   .     .   .     -1.18 .   .     .     -0.60     0.27
  Pro   711 .     .   B     .   .     T   .     -1.49 *   .     .     -0.20     0.36
  Ala   712 .     .   B     .   .     T   .     -0.60 *   .     .     -0.20     0.36
  Gly   713 .     .   .     .   .     T   C     -0.63 .   *     .     0.00     0.83
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala  714 .     .   .     .   .     T   C     -0.32   .   *     F     0.15     0.38
  Thr  715 .     .   B     B   .     .   .     -0.29   .   *     F     0.45     0.62
  Asn  716 .     .   B     B   .     .   .     -0.03   .   *     F     -0.15     0.47
  Ile  717 .     .   B     B   .     .   .     0.56   .   *     F     0.45     0.92
  Asp  718 .     .   B     B   .     .   .     1.01   .   *     F     0.60     1.11
  Val  719 .     .   B     B   .     .   .     1.30   .   *     F     0.90     1.35
  Lys  720 .     .   B     B   .     .   .     1.58   .   *     F     0.90     2.58
  Gln  721 .     .   B     .   .     .   .     1.37   .   *     F     1.10     2.10
  Arg  722 .     .   B     .   .     .   .     1.91   .   *     F     1.10     4.38
  Ser  723 .     .   .     .   .     .   C     1.06   *   *     F     1.30     2.17
  His  724 .     .   .     .   .     T   C     1.91   *   *     F     1.05     0.93
  Pro  725 .     .   .     .   .     T   C     1.87   .   *     F     1.33     0.82
  Gly  726 .     .   .     .   T     T   .     1.87   *   *     F     1.21     0.99
  Val  727 .     .   B     .   .     T   .     1.41   *   *     F     1.84     1.21
  Gln  728 .     .   B     .   .     .   .     1.71   .   *     F     1.77     0.77
  Asn  729 .     .   B     .   T     T   .     1.50   *   .     F     2.80     1.26
  Asp  730 .     .   .     .   T     T   .     0.90   *   .     F     1.92     2.66
  Gly  731 .     .   .     .   T     T   .     0.66   .   .     F     1.64     1.27
  Asn  732 .     .   B     .   .     T   .     0.70   .   *     F     0.81     0.80
  Tyr  733 .     A   B     .   .     .   .     0.74   .   .     .     -0.32     0.39
  Leu  734 .     A   B     .   .     .   .     0.43   *   .     .     -0.60     0.79
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ala   735 .   A   B     .   .     .   .     -0.16   *   .     .     -0.60   0.71
  Leu   736 .   A   B     .   .     .   .     0.19   .   .     .     -0.40   0.46
  Lys   737 .   A   B     .   .     .   .     -0.16   .   .     F     0.85   0.93
  Thr   738 .   .   B     .   .     T   .     0.09   .   .     F     1.45   0.91
Ala 739 A . . . . T . 0.66 . . F 2.10 1.91
  Asp   740 .   .   B     .   .     T   .     0.43   .   .     F     2.00   1.50
  Gly   741 .   .   B     .   .     T   .     0.43   .   *     F     1.05   0.86
  Gln   742 .   .   B     .   .     .   .     0.39   .   *     F     0.35   0.70
  Tyr   743 .   .   B     .   .     .   .     0.36   .   *     .     0.30   0.67
  Leu   744 .   .   B     .   .     .   .     0.94   .   *     .     -0.20   0.67
  Leu   745 .   .   B     .   .     .   .     0.13   .   *     .     -0.40   0.63
  Asn   746 .   .   B     .   .     T   .     -0.11   .   *     F     -0.05   0.33
  Gly   747 .   .   .     .   T     T   .     -1.00   .   *     F     0.35   0.40
  Asn   748 .   .   .     .   .     T   C     -1.06   .   *     .     0.00   0.34
  Leu   749 .   .   .     .   .     T   C     -0.83   .   *     .     0.00   0.29
  Ala   750 A   A   B     .   .     .   .     -0.91   .   *     .     -0.60   0.29
  Ile   751 .   A   B     .   .     .   .     -0.91   *   *     .     -0.60   0.13
  Ser   752 .   A   B     .   .     .   .     -0.57   *   .     .     -0.60   0.27
  Ala   753 A   A   .     .   .     .   .     -0.57   *   *     .     -0.30   0.46
  Ile   754 A   A   .     .   .     .   .     -0.64   *   .     .     0.45   1.09
  Glu   755 A   A   .     .   .     .   .     -0.87   *   .     F     0.45   0.57
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gln   756 A     .   .     B   .     .   .     -0.83 .   *     F     0.45   0.47
  Asp   757 A     .   .     B   .     .   .     -0.49 .   *     F     -0.15   0.49
  Ile   758 A     .   .     B   .     .   .     -0.24 .   *     .     0.60   0.57
  Leu   759 A     .   .     B   .     .   .     0.33 .   *     .     0.30   0.33
  Val   760 A     .   .     B   .     .   .     -0.56 .   *     .     0.30   0.28
  Lys   761 A     .   .     B   .     .   .     -1.37 .   *     F     -0.45   0.28
  Gly   762 .     .   B     B   .     .   .     -1.32 .   *     F     -0.45   0.28
  Thr   763 .     .   B     B   .     .   .     -0.68 .   *     F     0.45   0.76
  Ile   764 .     .   B     B   .     .   .     -0.17 .   .     F     -0.15   0.59
  Leu   765 .     .   B     B   .     .   .     0.34 .   *     .     -0.60   0.80
  Lys   766 .     .   B     B   .     .   .     0.00 .   *     F     -0.45   0.55
  Tyr   767 .     .   B     .   .     T   .     -0.54 *   *     F     0.40   1.05
  Ser   768 .     .   .     .   .     T   C     -0.82 *   *     F     0.45   0.89
  Gly   769 .     .   .     .   .     T   C     -0.24 *   .     F     0.45   0.45
  Ser   770 .     .   .     .   .     T   C     -0.24 .   *     F     0.15   0.42
  Ile   771 .     A   B     .   .     .   .     -0.29 *   *     .     -0.60   0.26
  Ala   772 .     A   B     .   .     .   .     0.07 *   .     .     -0.30   0.45
  Thr   773 .     A   B     .   .     .   .     -0.44 *   *     .     0.30   0.66
  Leu   774 .     A   B     .   .     .   .     -0.10 *   .     .     -0.30   0.77
  Glu   775 A     A   .     .   .     .   .     -0.10 *   .     .     0.45   1.32
  Arg   776 .     A   B     .   .     .   .     0.09 .   .     F     0.60   1.23
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Leu   777 .   A   .     .   T     .   .     0.79 .   .     F     1.00   1.29
  Gln   778 .   A   .     .   T     .   .     0.89 .   .     F     1.30   1.46
  Ser   779 .   A   .     .   T     .   .     0.89 .   .     F     1.00   1.15
  Phe   780 .   .   B     .   .     .   .     0.68 *   .     F     0.41   1.15
  Arg   781 .   .   .     .   .     .   C     0.57 .   *     F     0.82   1.03
  Pro   782 .   .   .     .   .     .   C     1.17 *   .     F     1.63   1.33
  Leu   783 .   .   .     .   .     T   C     0.36 *   .     F     2.04   2.37
  Pro   784 .   .   .     .   .     T   C     0.34 *   *     F     2.10   1.00
  Glu   785 .   .   .     .   .     T   C     0.19 *   *     F     1.29   0.93
  Pro   786 .   .   B     .   .     T   .     0.08 *   *     F     0.88   0.84
  Leu   787 .   .   B     B   .     .   .     -0.52 .   *     F     0.27   0.94
  Thr   788 .   .   B     B   .     .   .     -0.52 .   *     .     -0.09   0.45
  Val   789 .   .   B     B   .     .   .     -0.62 .   .     .     -0.60   0.24
  Gln   790 .   .   B     B   .     .   .     -1.48 .   .     .     -0.60   0.42
  Leu   791 .   .   B     B   .     .   .     -1.48 .   .     .     -0.60   0.21
  Leu   792 .   .   B     B   .     .   .     -1.01 .   *     .     -0.60   0.45
  Thr   793 .   .   B     B   .     .   .     -0.70 .   *     .     -0.60   0.26
  Val   794 .   .   B     .   .     T   .     -0.70 *   .     F     0.25   0.54
  Pro   795 .   .   B     .   .     T   .     -1.40 *   .     F     0.25   0.48
  Gly   796 .   .   B     .   .     T   .     -0.80 *   .     F     -0.05   0.29
  Glu   797 .   .   B     .   .     T   .     -0.20 .   *     F     0.25   0.60
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Val   798 .     .   B     .   .     .   .     0.16 .   *     F     0.05   0.60
  Phe   799 .     .   B     .   .     .   .     0.16 .   *     F     1.00   1.22
  Pro   800 .     .   B     .   .     T   .     0.41 *   *     F     1.25   0.52
  Pro   801 .     .   .     .   T     T   .     0.51 *   *     F     2.00   1.41
Lys 802 . . . . T T . 0.20 * * F 1.60 2.55
  Val   803 .     .   B     .   .     T   .     0.36 .   *     F     2.00   2.38
  Lys   804 .     .   B     B   .     .   .     0.36 .   *     F     0.80   1.33
  Tyr   805 .     .   B     B   .     .   .     -0.29 .   *     .     0.00   0.58
  Thr   806 .     .   B     B   .     .   .     -0.29 .   *     .     -0.20   0.58
  Phe   807 .     .   B     B   .     .   .     -0.33 .   *     .     -0.40   0.45
  Phe   808 .     .   B     B   .     .   .     0.52 *   *     .     -0.60   0.46
  Val   809 .     .   B     .   .     T   .     -0.38 *   *     .     -0.20   0.53
  Pro   810 .     .   B     .   .     T   .     -0.13 .   *     F     -0.05   0.45
  Asn   811 .     .   .     .   T     T   .     -0.52 .   *     F     1.25   0.88
  Asp   812 .     .   .     .   T     T   .     -0.12 .   *     F     1.40   1.02
  Val   813 A     .   .     .   .     .   .     -0.02 *   *     F     0.65   0.89
  Asp   814 A     .   .     .   .     .   .     0.83 *   *     .     0.50   0.54
  Phe   815 A     .   .     .   .     .   .     0.74 .   *     .     0.80   0.57
  Ser   816 A     .   .     .   .     .   .     0.44 .   *     .     0.65   1.02
  Met   817 A     .   .     .   .     .   .     0.49 .   *     .     1.40   0.82
  Gln   818 A     .   .     .   .     T   .     1.34 .   *     F     2.20   1.89
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha   Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Ser   819 .   .   .     .   .     T   C     1.46 .   *     F     3.00   2.44
  Ser   820 .   .   .     .   .     T   C     1.57 .   *     F     2.70   4.84
  Lys   821 A   .   .     .   .     T   .     1.56 .   *     F     2.20   2.82
  Glu   822 A   .   .     .   .     .   .     1.84 .   *     F     1.70   3.04
  Arg   823 A   .   .     B   .     .   .     1.84 *   *     F     1.20   3.27
  Ala   824 A   .   .     B   .     .   .     1.26 *   *     F     0.90   2.63
  Thr   825 .   .   B     B   .     .   .     0.67 *   *     F     0.60   1.06
  Thr   826 .   .   B     B   .     .   .     0.62 *   *     F     -0.15   0.38
  Asn   827 .   .   B     B   .     .   .     0.41 *   *     .     -0.60   0.65
  Ile   828 .   .   B     B   .     .   .     -0.51 *   *     .     -0.60   0.70
  Ile   829 .   .   B     B   .     .   .     -0.73 *   .     .     -0.60   0.40
  Gln   830 .   A   B     .   .     .   .     -0.46 *   .     .     -0.60   0.21
  Pro   831 .   A   B     .   .     .   .     -0.73 *   .     .     -0.60   0.40
  Leu   832 .   A   B     .   .     .   .     -0.73 *   *     .     -0.60   0.57
  Leu   833 .   A   B     .   .     .   .     -0.13 .   .     .     -0.60   0.57
  His   834 .   A   B     .   .     .   .     -0.10 .   *     .     -0.60   0.39
  Ala   835 .   A   B     B   .     .   .     -0.91 .   *     .     -0.60   0.35
  Gln   836 .   A   B     B   .     .   .     -1.04 .   .     .     -0.60   0.35
  Trp   837 .   A   B     B   .     .   .     -0.23 .   .     .     -0.60   0.26
  Val   838 .   A   B     B   .     .   .     0.29 .   *     .     -0.60   0.42
  Leu   839 .   .   B     .   .     T   .     0.02 *   .     .     -0.20   0.26
 Res  Pos.  Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Gly   840   .   .   .     .   T     T   .     0.61 *   .     .     0.45   0.33
  Asp   841   .   .   .     .   T     T   .     -0.06 .   .     F     1.15   0.76
  Trp   842   .   .   .     .   T     T   .     -0.07 .   .     F     2.00   0.50
  Ser   843   .   .   .     .   .     T   C     0.49 *   .     F     2.05   0.67
  Glu   844   .   .   .     .   T     T   .     0.99 .   .     F     2.50   0.54
  Cys   845   .   .   .     .   T     T   .     0.67 .   .     F     1.65   0.74
  Ser   846   .   .   .     .   T     T   .     0.32 .   .     F     2.00   0.30
  Ser   847   .   .   .     .   T     .   .     0.02 .   .     F     1.55   0.17
  Thr   848   .   .   .     .   T     .   .     -0.02 .   .     F     0.70   0.32
  Cys   849   .   .   .     .   T     .   .     -0.31 .   .     F     0.45   0.24
  Gly   850   .   .   .     .   T     T   .     0.36 *   .     .     0.20   0.18
  Ala   851   .   .   .     .   T     T   .     0.77 .   .     .     0.20   0.22
  Gly   852   .   .   .     .   T     T   .     1.18 .   .     .     0.50   0.81
  Trp   853   .   .   .     .   T     T   .     1.18 *   .     .     1.25   1.60
  Gln   854   .   .   B     B   .     .   .     0.99 *   .     F     0.60   2.29
  Arg   855   .   .   B     B   .     .   .     1.33 *   .     F     0.60   1.72
  Arg   856   .   .   B     B   .     .   .     1.26 .   *     F     0.90   2.83
  Thr   857   .   .   B     B   .     .   .     1.71 .   .     F     1.05   0.87
  Val   858   .   .   B     B   .     .   .     2.00 .   .     .     1.20   0.87
  Glu   859   .   .   B     B   .     .   .     1.79 .   .     .     1.50   0.75
  Cys   860   .   .   .     .   T     .   .     1.38 .   *     .     2.40   0.80
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro… Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
 Arg  861 .   .   .     .   T   .   .     0.92 .   .   F     3.00     1.44
 Asp  862 .   .   .     .   .   T   C     1.23 .   *   F     2.55     0.82
 Pro  863 .   .   .     .   T   T   .     1.50 .   *   F     2.60     2.66
 Ser  864 .   .   .     .   T   T   .     1.20 .   *   F     2.30     1.37
 Gly  865 .   .   .     .   T   T   .     1.28 .   .   F     1.70     1.10
 Gln  866 A   .   .     .   .   .   .     0.86 .   *   F     0.05     0.72
 Ala  867 .   .   B     .   .   .   .     0.19 .   *   F     0.05     0.78
 Ser  868 .   .   B     .   .   .   .     0.40 .   *   .     -0.10     0.42
 Ala  869 A   .   .     .   .   .   .     0.74 .   *   .     -0.10     0.39
 Thr  870 A   .   .     .   .   T   .     0.50 *   .   .     0.70     0.77
 Cys  871 A   .   .     .   .   T   .     -0.31 *   .   .     0.70     0.58
 Asn  872 A   .   .     .   .   T   .     0.32 *   .   .     0.10     0.48
 Lys  873 A   .   .     .   .   T   .     0.41 .   .   F     0.85     0.66
 Ala  874 A   .   .     .   .   .   .     1.00 *   .   F     0.80     1.90
 Leu  875 A   .   .     .   .   .   .     1.31 *   .   F     1.10     2.05
 Lys  876 A   .   .     .   .   T   .     1.39 .   .   F     1.30     1.71
 Pro  877 A   .   .     .   .   T   .     1.43 .   .   F     1.30     1.71
 Glu  878 A   .   .     .   .   T   .     1.18 .   .   F     1.30     4.14
 Asp  879 A   .   .     .   .   T   .     1.10 .   .   F     1.30     3.20
 Ala  880 A   .   .     .   .   .   .     1.91 .   .   F     1.10     1.11
 Lys  881 A   .   .     .   .   T   .     1.57 .   .   F     1.30     1.11
 Res  Pos. Garni…Alpha  Chou-…Alpha  Garni…Beta  Chou-…Beta  Garni…Turn  Chou-…Turn  Garni…Coil  Kyte-…Hydro…  Eisen…Alpha  Eisen…Beta  Karpl…Flexi…  James…Antig…  EminiSurfa…
  Pro   882 A   .   .     .   .     T   .     1.78   *   .     F     1.15   0.89
  Cys   883 A   .   .     .   .     T   .     0.97   *   .     F     1.30   1.53
  Glu   884 A   .   .     .   .     T   .     0.30   .   .     F     1.15   0.63
  Ser   885 A   A   .     .   .     .   .     0.68   *   .     F     -0.15   0.22
  Gln   886 .   A   B     .   .     .   .     -0.18   *   .     F     -0.15   0.63
  Leu   887 .   A   B     .   .     .   .     -0.36   .   .     .     -0.30   0.30
  Cys   888 .   A   B     .   .     .   .     -0.08   .   .     .     -0.60   0.29
  Pro   889 .   A   B     .   .     .   .     -0.47   .   .     .     -0.60   0.21
  Leu   890 .   .   B     .   .     .   .     -0.56   .   .     .     -0.40   0.33
发明详述
通过用编码TSP-1抗血管生成结构域的cDNA筛选cDNA文库，本发明发明者已鉴定了两种新的蛋白质METH1和METH2(作为血管内皮生长拮抗物也分别称VEGA-1和VEGA-2)，它们包括TSP-1的抗血管生成结构域、金属蛋白酶结构域和类去整联蛋白结构域。本发明发明者已证实METH1和METH2均具抗血管生成活性。
因而，本发明提供了含编码具SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的METH1多肽之多核苷酸的分离核酸分子，它是通过对cDNA克隆测序进行测定的。本发明METH1蛋白与血小板反应蛋白-1和pNPI具序列同源性。SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列是通过对cDNA克隆测序而获得，该克隆于1998年1月15日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manasssas，Virginia20110-2209，接收号为209581。ATCC保藏号209581中所含的cDNA克隆包括编码SEQ ID NO：2中1-950位氨基酸的METH1序列。
本发明还提供了含编码具SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的METH2多肽之多核苷酸的分离核酸分子，它是通过对cDNA克隆测序而部分测定的。本发明METH2蛋白与血小板反应蛋白-1和pNPI具序列同源性。SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列是通过对cDNA克隆测序而部分获得的，该克隆于1998年1月15日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manasssas，Virginia20110-2209，接收号为209582。ATCC保藏号209582中所含的cDNA克隆包括编码SEQ ID NO：4中112-890位氨基酸的部分METH2序列。含有完整METH2序列的cDNA克隆于2000年3月14日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manasssas，Virginia20110-2209，接收号为PTA1478。
核酸分子
此处通过DNA分子测序确定的一些核苷酸序列是用自动DNA测序仪测定的(如来自Applied Biosystem，Inc的Model 373)，本文所测定DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列是通过翻译以上所测DNA序列而推测的。因此，正如本领域已知用此自动方法所测任何DNA序列一样，本文所测的任何核苷酸序列可能含有某些错误。自动化测定的核苷酸序列一般与所测DNA分子的真实核苷酸序列至少约90％相同，更通常地至少约95％-99.9％相同。真实的序列可用其它方法更准确地测定，包括本领域众所周知的人工DNA测序方法。又如本领域中已知的，与真实的序列相比，所测核苷酸序列中单个插入或缺失将造成该核苷酸序列翻译中发生移码，以至由所测核苷酸序列编码的预计氨基酸序列自所说的插入或缺失位点开始将完全不同于所测DNA分子真正编码的氨基酸序列。
利用本文提供的信息，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中的核苷酸序列，可用标准克隆和筛选方法获得编码METH1或METH2多肽的本发明核酸分子，诸如那些用于以mRNA为原材料的克隆cDNA的方法。作为本发明的例证，SEQ ID NO：1中所述核酸分子发现于来自人心脏的cDNA文库，而SEQ ID NO：3中所述核酸分子发现于来自人肺的cDNA文库。所测的SEQ ID NO：1中METH1 cDNA核苷酸序列含编码约950个氨基酸残基长蛋白质的开放阅读框架，其中包括约28个氨基酸残基长的预计前导序列。本发明发明者已测定SEQ ID NO：3中METH2 cDNA核苷酸序列含编码约890个氨基酸残基长蛋白质的开放阅读框架，其中包括约23个氨基酸残基长的预计前导序列。
本发明还提供了成熟形式的本发明METH1和METH2蛋白质。按照信号假说，哺乳动物细胞所分泌的蛋白质具有信号或分泌前导序列，一旦正在生长的蛋白质链已开始穿越粗面内质网，这种序列即从成熟蛋白质上切割下来。大部分哺乳动物细胞和甚至昆虫细胞以相同的特异性切割分泌的蛋白质。然而，在某些情况下，分泌蛋白质的切割不完全相同，这将导致两个或多个成熟种类的蛋白质。此外，长期以来已知分泌蛋白质的切割特异性最终由完整蛋白质的一级结构所决定，也就是说，它是多肽氨基酸序列内所固有的。因此，本发明提供了编码成熟METH1多肽的核苷酸序列，该多肽具有由鉴定为ATCC保藏号209581的宿主所含cDNA克隆编码并如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明也提供了编码成熟METH2多肽的核苷酸序列，该多肽具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。成熟METH1蛋白质具有由鉴定为ATCC保藏号209581的宿主所含cDNA克隆编码的氨基酸序列表示通过被保藏宿主内载体所含克隆之人DNA序列编码的完整开放阅读框架在哺乳动物细胞(如下述的COS细胞)的表达中产生的成熟形式的METH1蛋白质。如下所示，具有由ATCC保藏号209581中cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟METH1可以相同或不同于SEQ ID NO：2所示(约第29-950位氨基酸)的预计“成熟”METH1蛋白质，这取决于以计算机分析为基础的预计切割位点的精确度；而成熟METH2可以相同或不同于SEQ ID NO：4所示(约第24-890位氨基酸)的预计“成熟”METH2蛋白质，这也取决于以计算机分析为基础的预计切割位点的精确度。此外，蛋白质的成熟形式可以再经历甚至当前结构域已被切割后的进一步加工(例如前结构域远端的二次切割)。因此，蛋白质的“成熟”形式不仅包括由前结构域切割产生的形式，也包括其它蛋白质加工形式。
用于预计蛋白质是否具有分泌前导序列以及该前导序列切割位点的方法是可获得的。例如，可利用McGeoch(病毒研究3：271-286(1985))和vonHeinje(核酸研究14：4683-4690(1986))的方法。这些方法中每一个预计已知哺乳动物分泌蛋白质切割点的精确度范围为75-80％。Von Heinie，同上。然而，对于所给蛋白质，两种方法并非总能得到相同的预计切割点。
在本文中，用计算机软件(“PSORT”)(K.Nakai和M.Kanehisa，Genomics14：897-911(1992))分析本发明完整METH1和METH2多肽的预计氨基酸序列，这是一个基于氨基酸序列预计蛋白质之细胞定位的专门系统。作为此计算机预计定位的部分，也使用McGeoch和yon Heinie的方法。用PSORT软件进行的分析预测切割位点在SEQ ID NO：2中是氨基酸28-29之间，而在SEQ ID NO：4中是氨基酸23-24之间。其后，应用简单形式的von Heinje(-1、-3)规则通过目测进一步分析该完整的氨基酸序列。von Heinje，同上。因而，预计METH1蛋白质的前导序列由SEQ ID NO：2中约1-28位氨基酸残基组成，而预计成熟METH1蛋白质由约29-950位氨基酸残基组成；预计METH2蛋白质的前导序列由SEQ ID NO：4中约1-23位氨基酸残基组成，而预计成熟METH2蛋白质由约24-890位氨基酸残基组成。另一种预计成熟METH1蛋白质由SEQ ID NO：2中30-950位残基组成。另一种预计成熟的METH1蛋白质由SEQ ID NO：2中35-950位残基组成。另一种预计成熟的METH2蛋白质由SEQ ID NO：4中31-890位残基组成。
作为常规技术人员应当理解，由于测序的可能性错误以及在不同已知蛋白质中前导序列切割位点的可变性，由所保藏cDNA编码的预计METH1多肽包括约950个氨基酸，但也可以是910-990个氨基酸范围内任何数目；预计该蛋白质的前导序列约为28个氨基酸，但也可以是约18-38个氨基酸范围内任何数目。此外，预计METH2多肽包括约890个氨基酸，但也可以是850-约930个氨基酸范围内任何数目；预计该蛋白质的前导序列约为23个氨基酸，但也可以是约13-33个氨基酸范围内任何数目。
正如所表明的，本发明的核酸分子可以是诸如mRNA之类的RNA形式，或是DNA形式，包括例如通过克隆或合成产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链，也已知为有义链，或可以是非编码链，也称反义链。
“分离的”核酸分子意指已脱离自其天然环境的核酸分子、DNA或RNA。例如，为本发明的目的，载体中所含的重组DNA分子也视为分离的。分离DNA分子的另外例子包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中的(部分地或基本上)纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子在体内或体外的RNA转录物。按照本发明，分离的核酸分子还包括合成产生的这些分子。
本发明的分离核酸分子包括含有如SEQ ID NO：1所示开放阅读框架(ORF)的DNA分子；含成熟METH1蛋白质编码序列的DNA分子；以及含有基本不同于上述分子，但由于遗传密码的简并性依然编码METH1蛋白质的序列的DNA分子。还包括含有如SEQ ID NO：3所示开放阅读框架(ORF)的DNA分子；含成熟METH2蛋白质编码序列的DNA分子；以及含有基本不同于上述分子，但由于遗传密码的简并性依然编码METH2蛋白质的序列的DNA分子。当然，遗传密码在本领域中是众所周知的。因此，对本领域技术熟练人员来说产生所说的简并变体是常规工作。
本发明的多核苷酸不仅包括编码全长序列的多核苷酸，也包括编码蛋白质、缺失突变体、替换变体、等位变体、类似物、衍生物等的成熟形式、前蛋白质、加工形式的多核苷酸。
另一方面，本发明提供了编码METH1或METH2多肽的分离核酸分子，所述多肽具有分别由以下两质粒中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列：于1998年1月15日保藏的ATCC保藏号209581或于1998年1月15日保藏的ATCC保藏号209582。或提供了METH2多肽，其具有如含有完整METH2序列的cDNA克隆(于2000年3月14日保藏于美国典型培养物保藏中心，接收号为PTA 1478)所编码的氨基酸序列。在另外的实施方案中，提供了编码成熟METH1或METH2多肽或缺少N-末端甲硫氨酸的全长METH1或METH2多肽的核酸分子。本发明还提供了具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列或上述保藏克隆中所含METH1或METH2 cDNA的核苷酸序列的分离核酸分子，或具有与上述序列之一互补的序列的核酸分子。这样的分离分子，尤其是DNA分子可用作探针，通过染色体原位杂交用于基因作图，以及通过例如NORTHERN印迹分析用于检测在人组织中METH1或METH2基因的表达。
本发明还涉及本文所述分离核酸分子的片段。具有保藏cDNA的或者如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的分离核酸分子的片段指至少约15nt，更优选至少约20nt，还更优选至少约30nt，更优选至少约40nt长的片段，如本文所述它们可用作诊断探针和引物。当然，按照本发明，相应于保藏cDNA或者如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列大部分甚至全部的较长片段，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、或3000nt长的片段也是有用的。例如，至少20nt长的片段意指该片段包括来自保藏cDNA或如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的20个或更长的连续碱基。
本发明优选的核酸片段包括编码METH1或METH2蛋白质之带表位部分的核酸分子。确定METH1或METH2蛋白质之带表位部分的方法如下所详述。
其它本发明优选的核酸片段包括编码以下部分的核酸分子：METH1的金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：2中的第235-459位氨基酸；METH1的去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：2中的第460-544位氨基酸；METH1的第一个TSP样结构域，SEQ ID NO：2中的第545-598位氨基酸；METH1的第二个TSP样结构域，SEQ ID NO：2中的第841-894位氨基酸；METH1的第三个TSP样结构域，SEQ ID NO：2中的第895-934位氨基酸；SEQ ID NO：2中的第536-613位氨基酸；SEQ ID NO：2中的第549-563位氨基酸；METH2的金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：4中的第214-439位氨基酸；METH2的去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：4中的第440-529位氨基酸；METH2的第一个TSP样结构域，SEQ ID NO：4中的第530-583位氨基酸；METH2的第二个TSP样结构域，SEQ ID NO：4中的第837-890位氨基酸；SEQ ID NO：4中的第280-606位氨基酸；SEQID NO：4中的第529-548位氨基酸；和编码这些结构域的组合之核酸分子。
因此，优选的实施方案中包括缺乏信号序列(对于METH1切割发生于约1-24至约1-34，对于METH2发生于约1-23至约1-30)的METH1或METH2蛋白质；缺乏信号序列、前结构域(prodomain)(对于METH1中前结构域的切割发生于约232-236之间的氨基酸，对于METH2在约211-215氨基酸之间)的METH1或METH2蛋白质；缺乏信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域的METH1或METH2蛋白质；缺乏信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域的METH1或METH2蛋白质；缺乏信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1的METH1或METH2蛋白质；缺乏信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2的METH1或METH2蛋白质。还优选由这些核苷酸编码的多肽。
类似地，优选实施方案包括一种编码这样的蛋白质的核酸：缺乏TSP3的METH1蛋白质；缺乏TSP2和TSP3的METH1蛋白质；缺乏TSP3，TSP2和TSP1的METH1蛋白质；缺乏富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3的METH1蛋白质；缺乏金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3的METH1蛋白质；缺乏前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3的METH1蛋白质；缺乏TSP2的METH2蛋白质；缺乏TSP1和TSP2的METH2蛋白质；缺乏富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2的METH2蛋白质；缺乏金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2的METH2蛋白质；缺乏前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2的METH2蛋白质。还优选由这些核苷酸编码的多肽。
还优选编码METH1结构域的任一组合的核酸。例如，编码包含如下METH1结构域之多肽的核酸分子是优选的：信号序列和前结构域；信号序列、前结构域和金属蛋白酶结构域；信号序列和金属蛋白酶结构域；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；信号序列和富含半胱氨酸结构域；信号序列、金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；信号序列、前结构域、和富含半胱氨酸结构域；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列和TSP1；信号序列、前结构域和TSP1；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域和TSP1；信号序列、金属蛋白酶结构域和TSP1；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；信号序列和TSP2；信号序列、前结构域和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域和TSP2；信号序列、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、TSP1和TSP2；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、和TSP2；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、前结构域、TSP1和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；信号序列和TSP3；信号序列、前结构域和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP3；信号序列、富含半胱氨酸结构域和TSP3；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；信号序列、TSP1和TSP3；信号序列、前结构域、TSP1和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP3；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；信号序列、TSP2和TSP3；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TST3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；信号序列、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；信号序列、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；信号序列、富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；信号序列、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP3；信号序列、金属蛋白酶结构域、TSP2和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP3；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP2和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域；前结构域、富含半胱氨酸结构域；前结构域和TSP1；前结构域和TSP2；前结构域和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；前结构域、金属蛋白酶结构域、和TSP1；前结构域、金属蛋白酶结构域和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP3；前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3；前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；前结构域、TSP1和TSP2；前结构域、TSP1和TSP3；前结构域、TSP2和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP2和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；前结构域、TSP1和TSP2；前结构域、TSP1和TSP3；前结构域、TSP2和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP2和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1、TSP2和TSP3；金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；金属蛋白酶结构域和TSP1；金属蛋白酶结构域和TSP2；金属蛋白酶结构域和TSP3；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP3；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP3；金属蛋白酶结构域、TSP2和TSP3；金属蛋白酶结构域、TSP1、TSP2和TSP3；富含半胱氨酸结构域和TSP1；富含半胱氨酸结构域和TSP2；富含半胱氨酸结构域和TSP3；富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP3；富含半胱氨酸结构域、TSP2和TSP3；富含半胱氨酸结构域、TSP1、TSP2和TSP3；TSP1和TSP2；TSP1和TSP3；TSP2和TSP3；和/或TSP1、TSP2和TSP3。这些结构域可以与天然分子相同或不同的顺序存在于METH1分子中。也优选由这些核苷酸编码的多肽。
还优选编码METH2结构域的任一组合的核酸。例如，编码包含如下METH2结构域之多肽的核酸分子是优选的：信号序列和前结构域；信号序列、前结构域和金属蛋白酶结构域；信号序列和金属蛋白酶结构域；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；信号序列和富含半胱氨酸结构域；信号序列、金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；信号序列、前结构域、和富含半胱氨酸结构域；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列和TSP1；信号序列、前结构域和TSP1；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域和TSP1；信号序列、金属蛋白酶结构域和TSP1；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；信号序列和TSP2；信号序列、前结构域和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域和TSP2；信号序列、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、TSP1和TSP2；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、和TSP2；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、前结构域、TSP1和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；信号序列、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；信号序列、前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；信号序列、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域；前结构域、富含半胱氨酸结构域；前结构域和TSP1；前结构域和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；前结构域、金属蛋白酶结构域、和TSP1；前结构域、金属蛋白酶结构域和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；前结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；前结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；前结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；前结构域、金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；金属蛋白酶结构域和富含半胱氨酸结构域；金属蛋白酶结构域和TSP1；金属蛋白酶结构域和TSP2；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP1；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域和TSP2；金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2；金属蛋白酶结构域、TSP1和TSP2；富含半胱氨酸结构域和TSP1；富含半胱氨酸结构域和TSP2；富含半胱氨酸结构域、TSP1和TSP2。这些结构域可以与天然分子相同或不同的顺序存在于METH2分子中。也优选由这些核苷酸编码的多肽。
此外，METH1和METH2结构域可组合形成杂合分子。METH1的任一结构域可与METH2的任一结构域组合形成杂合分子。例如，METH1的TSP1结构域可用METH2的TSP1结构域替换，形成杂合分子，保留剩余的METH1分子不变。此外，METH1的TSP1结构域可用METH2的TSP2结构域替换，形成杂合分子，保留剩余的METH1分子不变。此外，METH1的TSP1结构域可与METH2的TSP2结构域组合，形成杂合分子，而没有任何额外的METH1和/或METH2序列。这些结构域可以如天然存在的分子中的相同或不同顺序存在。也优选由这些核苷酸编码的多肽。
另外的实施方案中还包括编码METH1或METH2多肽的核苷酸，其中：一个或多个TSP结构域已经用其他已知的TSP结构域替换；金属蛋白酶结构域已用其他已知金属蛋白酶结构域替换；去整联蛋白结构域已用其他已知去整联蛋白蛋白酶结构域替换。一个或多个结构域可用此方式替换。例如，可将金属蛋白酶和去整联蛋白结构域同时替换。或者，所有三个TSP结构域可被替换。也优选由这些核苷酸编码的多肽。
优选的实施方案利用编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列(除了以任一组合的数个、5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸残基被替换、删除或加入)的多核苷酸。
此外，本发明人已鉴定了如下与示于SEQ ID NO：1中序列的部分所相关的cDNA克隆：HOUCQ17RA(SEQ IDNO：14)，HPLBM11R(SEQ ID NO：15)，HGBI07R(SEQ ID NO：16)，HNTMA49R(SEQID NO：17)，HNALE27R(SEQ ID NO：18)和HIBDB45R(SEQ ID NO：19).
也已鉴定了与SEQ ID NO：1的部分相关的下列公共EST：
        D67076(SEQ ID NO：20)，AB001735(SEQ ID NO：21)，X14787(SEQID NO：22)，U64857(SEQ ID NO：23)，X04665(SEQ ID NO：24)，M64866(SEQ IDNO：25)，L07803(SEQ ID NO：26)，U08006(SEQ ID NO：27)，M16974(SEQ ID NO：28)，L13855(SEQ ID NO：29)，AL021529(SEQ ID NO：30)，D86074(SEQ ID NO：31)，L05390(SEQ ID NO：32)，Z69361(SEQ ID NO：33)，X99599(SEQ ID NO：34)，AF018073(SEQ ID NO：35)，L23760(SEQ ID NO：36)，Z46970(SEQ ID NO：37)，AC004449(SEQ ID NO：38)，Z69589(SEQ ID NO：39)，Z22279(SEQ ID NO：40)，X17524(SEQ ID NO：41)，AI126019(SEQ ID NO：103)，AI571069(SEQ ID NO：104)，AI148739(SEQ ID NO：105)，AI335849(SEQ ID NO：106)，AA677116(SEQ IDNO：107)，H27128(SEQ IDNO：108)，AA368429(SEQ ID NO：109)，AA345812(SEQID NO：110)，AA373718(SEQ ID NO：111)，AI537518(SEQ ID NO：112)，N88341(SEQID NO：113)，C03600(SEQ ID NO：114)，AA066142(SEQ ID NO：115)，AI40095(SEQID NO：94)，AA288689(SEQ ID NO：116)，AI464076(SEQ ID NO：97)，R13547(SEQID NO：117)，R19976(SEQ ID NO：118)，Z43925(SEQ ID NO：119)，AA670987(SEQID NO：120)，AA635657(SEQ ID NO：96)，W24878(SEQ ID NO：121)，W47316(SEQID NO：122)，W35345(SEQ ID NO：123)和N27243(SEQ ID NO：124).
此外，本发明人已鉴定了如下与示于SEQ ID NO：3中序列的部分所相关的cDNA克隆：
HCE4D69FP02(SEQ ID NO：42)，HIBDB45F(SEQ IDNO：43)，HKIXH64R(SEQ ID NO：44)，HIBDB45R(SEQ ID NO：19)，HCE3295R(SEQID NO：45)，HTLEQ90R(SEQ ID NO：46)，HMWEF45R(SEQ ID NO：47)，HTOFC34RA(SEQ ID NO：48)，HHFDI20R(SEQ ID NO：49)，HMSHY47R(SEQ ID NO：50)，HCESF90R(SEQ ID NO：51)，HMCAO46R(SEQ ID NO：52)，HTTAQ67R(SEQ IDNO：53)，HFKCF19F(SEQ ID NO：54)，HMCAS31R(SEQ ID NO：55)，HMWGP26R(SEQ ID NO：56)，HLHTP36R(SEQ ID NO：57)，HE8AN11R(SEQ ID NO：58)，HEONN73R(SEQ ID NO：59)，HBNBG53R(SEQ ID NO：60)和HMSCH94R(SEQID NO：61).
也已鉴定了与SEQ ID NO：3的部分相关的下列公共EST：
D67076(SEQ ID NO：20)，AB001735(SEQ IDNO：21)，AB005287(SEQ ID NO：62)，X87619(SEQ ID NO：63)，X14787(SEQ IDNO：22)，X04665(SEQ ID NO：24)，M87276(SEQ ID NO：64)，M62458(SEQ ID NO：65)，AB002364(SEQ ID NO：66)，AB005297(SEQ ID NO：67)，X69161(SEQ ID NO：68)，X16619(SEO ID NO：69)，I36448(SEQ ID NO：70)，L12260(SEQ ID NO：71)，I36352(SEO ID NO：72)，X15898(SEQ ID NO：73)，I07789(SEQ ID NO：74)，I08 144(SEQ IDNO：75)U31814(SEQ ID NO：76)，AF001444(SEQ ID NO：77)，AI400905(SEQ IDNO：94)，AI378857(SEQ ID NO：95)，AA635657(SEQ ID NO：96)，AI464076(SEQ IDNO：97)，CO6578(SEQ ID NO：98)，AA855532(SEQ ID NO：99)，H11881(SEQ IDNO：100)，AA350801(SEQ ID NO：101)和AA350802(SEQ ID NO：102).
在特殊的实施方案中，本发明的多核苷酸小于300kb、200kb、100kb、50kb、15kb、10kb或7.5kb长。在另外的实施方案中，本发明的多核苷酸包括METH1或METH2编码序列的至少15个连续核苷酸，但不包括任何METH1或METH2内含子的全部或部分。在另一实施方案中，含METH1或METH2编码序列的核酸不包含基因组侧翼基因的编码序列(即基因组中METH1或METH2基因的5’或3’)。
另一方面，本发明提供了所含的多核苷酸在严谨的杂交条件下与上述本发明核酸分子内的多核苷酸一部分可杂交的分离核酸分子，所述本发明核酸分子例如是ATCC保藏号209581、ATCC保藏号209582或ATCC保藏号PTA1478中所含cDNA克隆。“严谨的杂交条件”指在含以下组分的溶液中于42℃温育过夜：50％甲酰胺、5xSSC(750mM  ，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt's溶液、10％葡聚糖硫酸和20μg/ml变性的剪切鲑精DNA，随后在0.1xSSC中约65℃洗涤滤膜。
与多核苷酸的“部分”可杂交的多核苷酸指与参照多核苷酸至少约15个核苷酸(nt)，更优选至少约20nt，还更优选至少约30nt，更优选至少约30、40、50、60或70nt可杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。如上述及下文详述，它们可用作诊断探针和引物。
例如，“至少20nt长”的多核苷酸部分指来自参照多核苷酸之核苷酸序列(如保藏的cDNA或如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列)的20个或更多个连续核苷酸。当然，只与polyA序列(分别诸如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中所示METH1或METH2 cDNA的3’末端polyA)或一段T(或u)残基互补序列杂交的多核苷酸不包括在用于与本发明核酸一部分杂交的本发明多核苷酸内，因为这样的多核苷酸会与任何含poly(A)或其互补序列的核酸分子(如，几乎任何双链cDNA克隆)杂交。
在适度的高严谨条件下与METH1或METH2多核苷酸可杂交的核酸分子也是所预期的。主要通过控制甲酰胺浓度(较低百分率的甲酰胺导致较低的严谨度)、盐浓度或温度完成杂交严谨度和信号检测的改变。例如，适度的高严谨条件包括在含以下成分的溶液中37℃温育过夜：6XSSPE(20X SSPE＝3M  ；0.2M  ；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑精封闭DNA；随后在1X SSPE、0.1％SDS中50℃洗涤。此外，为了达到较低的严谨度，可在严谨杂交后在较高的盐浓度下(如5XSSC)进行洗涤。
应注意，以上条件的变化可通过包含和/或替代杂交实验中用于抑制背景的封闭剂而完成。典型的封闭剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA及可购得的配方。由于相容性的问题，具体封闭试剂的加入可能需要对上述严谨条件进行改良。
当然，只与polyA+序列(诸如序列表中所示cDNA的任何3’末端polyA+)或一段T(或U)残基互补序列杂交的多核苷酸不包括在“多核苷酸”的定义内，因为这样的多核苷酸会与任何含poly(A)或其互补序列的核酸分子(如，几乎任何双链cDNA克隆)杂交。
METH1或METH2多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，它们可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，METH1或METH2多核苷酸的组成可以是单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混合的RNA、含DNA和RNA的杂合分子，它们可以是单链或更通常是双链，或单链和双链区混合物。此外，METH1或METH2多核苷酸可由含RNA或DNA或二者的三链区组成。METH1或METH2多核苷酸还可包含一个或多个修饰碱基或为了稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和如次黄嘌呤核苷之类的稀有碱基。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包含化学、酶促或代谢修饰的形式。
“SEQ ID NO：1”指METH1多核苷酸序列，而“SEQ ID NO：2”指METH1多肽序列。“SEQ ID NO：3”指METH2多核苷酸序列，而“SEQ ID NO：4”指METH2多肽序列。
正如所表明的，本发明编码METH1或METH2多肽的核酸分子可包括，但不局限于，自身编码成熟多肽氨基酸序列的分子；含有成熟多肽的编码序列和附加序列，诸如前导或分泌序列如前-、原-或前原-蛋白质序列的编码序列；成熟多肽的编码序列，有或无前述附加编码序列，另有附加的非编码序列，包括例如，但不局限于内含子和非编码的5’和3’序列，如在转录、mRNA加工包括剪接和多聚腺苷酸化信号中起作用(例如用于核糖体结合和mRNA稳定)的被转录而不翻译的序列；编码附加氨基酸的附加编码序列，如提供附加功能的序列。此外，编码多肽的序列可与标记序列融合，如所编码肽方便融合多肽纯化的序列。在本发明此方面的某些优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标记等等，其中许多标记均可购得。例如，如在Gentz等人，美国国家科学院报86：821-824(1989)中所述，六组氨酸可方便融合蛋白质的纯化。“HA”标记(tag)是可用于纯化的另一肽，其相应于流感血凝素蛋白质表位，如Wilson等人，细胞37：767-778(1984)中所述。如下所述，其它这样的融合蛋白质包括在N-或C-末端与Fc融合的METH1或METH2。其它融合蛋白质包括在N-或C-末端与Flag融合的METH1或METH2。其它融合蛋白质包括在N-或C-末端与Flag或Fc融合的METH1或METH2片段。特别优选地是在N-或C-末端与Flag或Fc融合的METH1或METH2片段，如SEQ ID NO：2的H541-Q894、M1-P799、F236-E614或K801-Q950。
如上述，METH1或METH2可以与FLAG多肽序列融合(见美国专利4,581,341；见HOPP等，生物/技术，6：1204，1988)。FLAG多肽序列是高抗原性的，提供用于特异性单克隆抗体结合的表位，使得表达的重组蛋白质快速纯化。此序列也由牛粘膜肠激酶在紧随Asp-Lys配对残基处特异性切割。
本发明进一步涉及编码METH1或METH2蛋白质部分、同系物或衍生物的本发明核酸分子变体。变体可天然，如天然等位基因变体。“等位基因变体”指占据生物染色体上一给定位置的数种可变形式基因之一。Lewin，B.编辑，基因II，John Wiley&Sons，纽约(1985)。非天然变体可用本领域已知诱变技术产生。
这类变体包括可能涉及一个或多个核苷酸替换、缺失或添加而产生的变体。变体可能在编码区、非编码区或二者内有改变。编码区内的改变可产生保守或非保守氨基酸的替换、缺失或添加。其中尤其优选的是沉默的替换、缺失或添加，不会改变METH1或METH2蛋白质或其部分的特征和活性。在这点上尤其优选的是保守性替换。
本发明的其它实施方案包括含有多核苷酸的分离核酸分子，该多核苷酸的核苷酸序列与以下核苷酸序列至少80％相同，更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同：编码具SEQ ID NO：2中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ IDNO：2中氨基酸序列但缺少N-端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：2中约第29-950位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209581中cDNA克隆编码之氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209581中cDNA克隆编码之氨基酸序列的成熟METH1多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸的核苷酸序列(METH1的金属蛋白酶结构域)；编码SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸的核苷酸序列(METH1的去整联蛋白结构域)；编码SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸的核苷酸序列(METH1的第一类TSP结构域)；编码SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸的核苷酸序列(METH1的第二TSP样结构域)；编码SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸的核苷酸序列(METH1的第三类TSP样结构域)；编码SEQ IDNO：2中第536-613位氨基酸的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：2中第549-563位氨基酸的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中氨基酸序列但缺少N-端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中约第24-890位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209582或PTA1478中cDNA克隆编码之氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码具ATCC保藏号209582或PTA1478中cDNA克隆编码之氨基酸序列的成熟METH2多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸的核苷酸序列(METH2的金属蛋白酶结构域)；编码SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸的核苷酸序列(METH2的去整联蛋白结构域)；编码SEQ IDNO：4中第530-583位氨基酸的核苷酸序列(METH2的第一TSP样结构域)；编码SEQ ID NO：4中第837-890位氨基酸的核苷酸序列(METH2的第二TSP样结构域)；编码SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4中第529-548位氨基酸的核苷酸序列；或与任何上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
具有与编码METH1或METH2多肽的参照核苷酸序列至少例如95％相同的核苷酸序列的多核苷酸指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列大致相同，只是该多核苷酸序列与编码METH1或METH2多肽的参照核苷酸序列相比每100个核苷酸可包括最多5个点突变。换而言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中最多5％的核苷酸可被缺失或用另外的核苷酸取代，或数目最多为参照序列总核苷酸数5％的核苷酸可插入参照序列中。参照序列的这些突变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置间的任何位置，它们或分别散布于参照序列的核苷酸中或以一个或多个连续组散布于参照序列中。
在实际情况中，例如，任何特殊核酸分子是否与SEQ ID NO：1或SEQID NO：3中所示核苷酸序列或者各保藏cDNA克隆的核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同可用已知的诸如Bestfit软件(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch ParK，575 Science Drive，Madison，WI 53711)之类计算机软件常规地确定。Bestfit利用了Smith和Waterman，应用数学进展(Ad vances inApplied Mathematics)2：482-489(1981)中的局部同源性运算法则来寻找两序列间的最佳同源区段。当用Bestfit或任何其它序列对比软件确定一特殊序列是否与本发明参照序列具如95％相同时，参数当然设置成对参照核苷酸序列全长计算相同性百分比，且高达参照序列总核苷酸数5％的同源缺口允许存在。
确定待查序列(本发明序列)和指示序列间最佳总体匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于原rutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，待查和指示序列均为DNA序列。可通过将U转变为T来比较RNA序列。所说综合序列对比的结果以相同性百分比表示。在DNA序列的FASTDB对比中，用于计算相同性百分比的优选参数为：矩阵(Matrix)＝Unitary，k-tuple＝4，错配罚分(Mismatch Penalty)＝1，连接罚分(Joining Penalty)＝30，随机化分组长度(Randomization Group Length)＝0，截断分(Cutoffscore)＝1，缺口罚分(Gap Penalty)＝5，缺口大小罚分(Gap Size Penalty)＝0.05，窗口大小(Window Size)＝500或指示核苷酸序列长度(选择较短者)。
若指示序列(subject sequence)由于5’或3’缺失，不是由于内部缺失而比待查序列(query sequence)短，必须对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软件不考虑指示序列的5’和3’截短。对于相对待查序列而言5’或3’端截短的指示序列，通过计算位于指示序列5’和3’的不相配/匹配的待查序列碱基数作为待查序列总碱基的百分比，矫正相同性百分比。核苷酸是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的相同性百分比值。此修正值即本发明中涉及的值。正如FASTDB序列对比所展示的，人工调整相同性百分比值时，只计算与待查序列不相配/匹配的、位于指示序列5’和3’碱基外的碱基。
例如，一90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列5’端，因此FASTDB序列对比显示5’端头10个碱基不相配/匹配。这10个未配对碱基代表了序列的10％(不匹配的5’和3’端碱基数/待查序列的总碱基数)，因此从FASTDB软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个碱基完全匹配，则最终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的5’和3’端无与待查序列不相配/匹配的碱基。这种情况下，对用FASTDB计算的相同性百分比不作人为的修正。再者，只对与待查序列不相配/匹配的指示序列的5’和3’碱基人为修正。为了本发明的目的，不进行其它的人工修正。
本申请涉及与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或所保藏cDNA的核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸分子，不管它们是否编码具METH1或METH2活性的多肽。这是因为即使一特殊核酸分子不编码具METH1或METH2活性的多肽，本领域技术熟练人员仍应知如何利用此核酸分子，例如，作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具METH1或METH2活性的多肽的本发明核酸分子的应用特别地包括(1)在cDNA文库中分离的METH1或METH2基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体丝进行原位杂交(如“FISH”)以得到METH1或METH2基因的准确染色体位置，如Verma等，人染色体：基础技术手册(Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques)，Pergamon Press，纽约(1988)中所述；及(3)用于检测在特异组织中METH1或METH2 mRNA表达的RNA印迹分析。
然而，优选的是与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或所保藏cDNA的核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，且确实编码具METH1或METH2蛋白活性的多肽的核酸分子。“具METH1活性的多肽”指在特定生物实验中展现METH1活性的多肽。例如，可用尿囊绒膜试验(Iruela-Arispe等，血栓形成和止血(Thrombosis and Haemostasis)78(1)：672-677(1997))或角膜囊试验(Tolsma等，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)122：497-511(1993))检测METH1蛋白质活性，这两种试验均可见于以下实施例4中。“具METH2活性的多肽”指在特殊生物实验中展现METH2活性的多肽。例如，可用尿囊绒膜试验(Iruela-Arispe等，血栓形成和止血78(1)：672-677(1997))或角膜囊试验(Tolsma等，细胞生物学杂志122：497-511(1993))检测METH2蛋白质的活性，这两种试验均可见于以下实施例4中。
简单的说，在尿囊绒膜试验中，将潜在抗血管生成的目的化合物与bFGF之类的血管生长因子一起加入I型胶原蛋白团块(Vitrogen)中。样品混合并放至尼龙网上，使其聚合。聚合完全后，将网放于12日龄鸡胚的尿囊绒膜上并在37℃放置24小时。然后用FITC-葡聚糖之类的荧光剂注射胚，并将网固定和安放好以便在荧光显微镜下观察。
在角膜囊试验中，将含目的化合物和bFGF之类的血管生长因子的亲水球植入大鼠或小鼠的角膜边缘1-2mm中。一段时间，如5天后，检查反应情况。通过检测角膜边缘毛细管的迁移来评估血管生成的程度。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域技术熟练人员将立即认识到，含有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或所保藏cDNA的核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的许多核酸分子可编码“具METH1或METH2蛋白活性的”多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变体均编码相同的多肽，即使不进行以上比较实验，这对于本领域技术熟练人员也是显而易见的。在本领域中还将进一步认识到的是，对于非简并变体的核酸分子，其中相当一部分也将编码具METH1或METH2蛋白质活性的多肽。这是因为本领域技术熟练人员完全清楚不太可能或不可能严重影响蛋白质功能的氨基酸替换(如用第二种脂肪族氨基酸置换第一种脂肪族氨基酸)。
特别的，提供了一种或多种具有如下核酸替换和/或缺失的METH2核酸：在位置3用“C”替换“T”；在位置32用“C”替换“T”；在位置37用“C”替换“T”；在位置65-67的“TGC”缺失；在位置99用“C”替换“T”；在位置303用“C”替换“T”；在位置36用“C”替换“T”；在位置309用“C”替换“T”；在位置950用“C”替换“T”；在位置1292用“C”替换“G”；在位置1577用“C”替换“T”；和/或在位置2377用“G”替换“A”。类似地，提供了一种或多种具有如下氨基酸替换和/或缺失的METH2多肽：在位置2用“L”替换“F”；在位置12用“P”替换“L”；在位置14用“L”替换“F”；在位置23的“L”缺失；在位置318用“ P”替换“L”；在位置432用“A”替换“G”；在位置527用“A”替换“V”；和/或在位置794用“A”替换“T”。
例如，关于怎样制备表型沉默的氨基酸替换的指导可见于Bowie，J.U.等，“蛋白质序列的信息解译：对氨基酸替换的容忍(Deciphering theMessage in Protein Sequences：Tolerance to Amino AcidSubstitutions)”，科学247：1306-1310(1990)中，其中作者指出蛋白质对氨基酸替换具有惊人的容忍性。
载体和宿主细胞
本发明还涉及含本发明分离DNA分子的载体、遗传工程改造的含重组载体的宿主细胞及利用重组技术生产METH1或METH2多肽或其片段。也可利用无细胞翻译系统用来自本发明DNA构建体的RNA产生这类蛋白质。
多核苷酸可连接到含选择标记的载体内以在宿主中增殖。通常，通过磷酸钙沉淀之类的沉淀法或与带电荷脂类形成复合物而导入质粒载体。若载体为病毒，可用适当的包装细胞系将其在体外包装并随后转导入宿主细胞。
DNA插入片段应与适当的启动子有效连接，诸如噬菌体入PL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早、晚期启动子、逆转录病毒LTR启动子，等等。本领域技术熟练人员应知道其他的合适启动子。表达构建体将进一步包括转录起始、终止位点和在转录区内用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达之成熟转录物的编码区将优选包括开始处的翻译起点和恰当定位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
正如已表明的，表达载体将优选包括至少一个选择标记。所说的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418，或新霉素抗性和用于大肠杆菌及其它细菌培养的四环素卡那霉素，或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的典型例子包括，但不局限于，细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC保藏号201178))；昆虫细胞，如果蝇S2和Spodoptera sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS，293和Bowes黑素瘤细胞；及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域所已知的。
载体中优选用于细菌中的包括pQE70、pQE60和pQE-9，可购自Qiagen；pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可购自Stratagene克隆系统；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可购自Pharmacia Biotech，Inc。优选的真核载体包括来自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；及来自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。优选的为用于酵母体系中的表达载体，包括但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K和PAO815(均可获自Invitrogen，Carlbad，CA)。其它的合适载体对本领域技术熟练人员来说将是显然的。
除了表达载体在本发明实践中的应用外，本发明进一步包括含与编码目的蛋白之核苷酸序列有效连接的操纵基因和启动子元件的新表达载体。这种载体的一个例子是下文详述的pHE4-5。
如图8和9中所概述的，pHE4-5载体(SEQ ID NO：12)的组成包括：1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌的复制起点，3)T5噬菌体启动子序列，4)两个lac操纵基因序列，5)SD序列，6)乳糖操纵子阻抑蛋白基因(lacIq)。复制起点(oriC)来自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子序列和操纵基因序列通过合成制备。核苷酸序列的合成产生在本领域是众所周知的。CLONTECH 95/96 Catalog，第215-216页，CLONTECH，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，CA94303。通过将核苷酸序列插入pHE4-5载体中NdeI和Asp718位点之间，编码METH1(SEQ ID NO：2)或METH2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列即与启动子和操纵基因有效连接。
如上所提及，pHE4-5载体含lacIq基因。LacIq是严密调控lac操纵基因的lacI基因的等位基因。Amann，E.等，基因69：301-315(1988)；Stark，M.，基因51：255-267(1987)。LacIq基因编码可与lac操纵基因序列结合并封闭下游(即3’)序列的转录的阻遏蛋白。然而，存在乳糖或某些乳糖类似物，如异丙基B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)时，lacIq基因产物与lac操纵基因解离。因此在含pHE4-5载体的未诱导宿主细胞中不产生大量METH1或METH2。可是，加入IPTG之类的物质诱导这些宿主细胞，可导致METH1或METH2编码序列的表达。
pHE4-5载体的启动子/操纵基因序列(SEQ ID NO：13)包括T5噬菌体启动子和两个lac操纵基因序列。一操纵基因位于转录起始位点的5’而另一个位于其3’。这些操纵基因与lacIq基因产物一起存在时，在缺少lac操纵子诱导剂如IPTG情况下，它们紧密抑制下游序列。通过加入lac操纵子诱导剂，如IPTG，可诱导位于lac操纵基因下游的有效连接序列的表达。lac诱导剂与lacIq蛋白质的结合导致其脱离lac操纵基因序列，以及有效连接序列的转录起始。基因表达的lac操纵子调节综述于Devlin，T.，生化与临床相互关系(TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRYWITH CLINICAL CORRELATIONS)，第4版(1997)，第802-807页中。
pHE4系列载体包含pHE4-5载体中除METH1或METH2编码序列外的所有组分。pHE4载体的特征包括优化过的合成T5噬菌体启动子、lac操纵基因和SD序列。此外，这些序列还被最佳地间隔开，以便可严密调控插入基因的表达并在诱导时产生高水平的表达。
适用于本发明蛋白质产生的已知细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、入PR和PL启动子及trp启动子等。合适的真核启动子包括CMV即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早、晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子如劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，和金属硫蛋白启动子如金属硫蛋白-1启动子。
pHE4-5载体还包含位于AUG起始密码子5’的SD序列。SD序列是通常位于AUG起始密码子上游(即5’)约10个核苷酸处的短序列。这些序列本质上是指导原核核糖体至AUG起始密码子处。
此外，本发明还涉及可用于本发明蛋白质生产的表达载体。本发明的这一方面通过pHE4-5载体(SEQ ID NO：12)举例说明。
可用磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法将构建体引入宿主细胞。这样的方法可见于许多标准实验室手册中，如Davis等，分子生物学基本方法(BasicMethods In Molecular Biology)(1986)。特别构思了METH1和/或METH2多肽可实际上由缺乏重组载体的宿主细胞表达。
多肽可以融合蛋白之类的修饰形式表达，不仅可包含分泌信号肽，还可包含附加的异源功能区。例如，可将另外的氨基酸区域，尤其是带电荷氨基酸加到多肽的N-末端以提高在宿主细胞内、纯化或随后的处理和保存中的稳定性和持续性。此外，可将肽部分加到多肽上以便于纯化。这样的区域可在多肽最终制备前去除。添加肽部分至多肽上以便分泌或排泄、提高稳定性和方便纯化等等是本领域所熟知和常规的技术。优选的融合蛋白包含来自免疫球蛋白的可用于溶解蛋白质的异源区。例如，EP-A-O 464533(加拿大对应文件2045869)公开了含免疫球蛋白分子恒定区不同部分及另一种人蛋白质或其部分的融合蛋白。在许多情况中，融合蛋白内的Fc部分非常利于在治疗和诊断中使用，因而导致例如改善药物动力学特性(EP-A0232 262)。另一方面，为了某些用途，可能期望在融合蛋白以上述有利形式表达、检测和纯化后能删除Fc部分。当Fc部分被证实妨碍治疗和诊断使用，例如当融合蛋白用作免疫抗原时即是如此。例如，在药物开发中，为了达到鉴定hIL-5拮抗物的高流通量筛选试验的目的，已将hIL5-受体之类的人蛋白质与Fc部分融合。参阅，D.Bennett等，J.Mol.Recognition8：52-58(1995)和K.Johanson等，生物化学杂志270(16)：9459-9471(1995)。
用众所周知的方法可从重组细胞培养物中回收和纯化METH1或METH2蛋白质，包括硫酸铵或酒精沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和外源凝集素层析。最优选高效液相层析(“HPLC”)用于纯化。
METH1和/或METH2多肽(优选分泌型式)也可从如下获得：由如下天然来源纯化的产品，包括体液、组织和细胞(无论直接分离或是培养的)；化学合成方法的产物；和由重组技术从原核或真核宿主中产生的产物，包括例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。依据在重组生产方法中所用的宿主，METH1和/或METH2多肽可以是糖基化或非糖基化的。此外，METH1和/或METH2多肽也可以包括起始修饰的甲硫氨酸残基，在某些情况中作为宿主介导的方法之结果。因此，本领域周知由翻译起始密码编码的N-末端甲硫氨酸在所有真核细胞中一般在任意蛋白质翻译后被从蛋白质上高效移去。当多数蛋白质上的N-末端甲硫氨酸在多数原核细胞中从某些蛋白质上被有效移去时，此原核移去方法是低效的，取决于N-末端甲硫氨酸与之共价连接的氨基酸的性质。
在一个实施方案中，酵母巴氏毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，其能代谢甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢途径中的主要步骤是甲醇利用氧气被氧化至甲醛。此反应由醇氧化酶催化。为了代谢甲醇作为其唯一碳源，巴氏毕赤酵母必须产生高水平的醇氧化酶，这部分是由于醇氧化酶对氧气相对较低的亲和性。因此，在依赖甲醇作为主要碳源的生长培养基中，两种醇氧化酶基因之一(AOX1)的启动子区域十分活跃。在甲醇存在下，由AOX1基因产生的两个醇氧化酶占高达约30％的巴氏毕赤酵母总可溶性蛋白。见Ellis，S.B.，等，分子细胞生物学，5：1111-21(1985)；Koutz，P.J.等，酵母，5：167-77(1989)；Tschopp，J.E.，等，核酸研究，15：3859-76(1987)。因此，异源编码序列，如本发明METH1和/或METH2多肽(在全部或部分AOX1调控序列之转录调节之下)，在甲醇存在下于巴氏毕赤酵母中以异常高的水平表达。
在一个例子中，利用质粒载体pPIC9K在毕赤酵母体系中表达编码本发明METH1和/或METH2多肽DNA，如此处所述，基本依照“毕赤酵母方法：分子生物学”D.R.Higgins和J.Cregg编，The Humana Press，Totowa，NJ，1998中所述。该表达载体允许本发明METH1和/或METH2蛋白质的表达和分泌，其利用了位于多克隆位点上游与巴氏毕赤酵母碱性磷酸酶(PHO)分泌信号肽(即，前导序列)的强AOX1启动子。
也可用许多其他酵母载体替代pPIC9K，例如，pYES2，pYD1，pTEF1/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZα，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-S1，pPIC3.5K和PAO815，如本领域人员容易知晓，只要目标表达构建体提供合适定位的用于转录、翻译、分泌(如需要)等的信号，包括需要时的符合读框的AUG。
在另一实施方案中，异源编码序列(如本发明的METH1和/或METH2多核苷酸)的高水平表达可通过将本发明的异源多核苷酸克隆到一种表达载体，如pGAPZ或pGAPZα中，并在没有甲醇的酵母培养基中生长来实现。
除了使宿主细胞包含在此讨论的载体构建体之外，本发明还构思了脊椎动物来源的原代、次代和永生宿主细胞，特别是哺乳动物来源的，其经基因工程构建缺失或替换了内源遗传材料(如METH1和/或METH2编码序列)，和/或包含了与本发明的METH1和/或METH2多核苷酸有效连接的遗传材料(如，异源多核苷酸序列)，并且其活化、改变和/或扩增内源METH1和/或METH2多核苷酸。例如，本领域已知的技术可用于通过同源重组使异源控制区(例如，启动子和/或增强子)与内源METH1和/或METH2多核苷酸序列有效连接，从而形成新转录单位(见如美国专利5641670,1997年6月24日授权；美国专利5733761,1998年3月授权；国际公开文本WO96/29411，1996年9月26日出版；国际公开文本WO94/12650，1994年8月4日出版；Koller等，美国国家科学院院报，86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然，342：435-438(1989)，所述公开均在此引入作为参考)。
本发明的多肽包括天然纯化产物、化学合成方法的产物，和用重组技术自真核或原核宿主生产的产物，包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明多肽可以是糖基化或非糖基化的，这取决于重组生产方法中所用宿主。此外，本发明多肽还可包括起始的修饰甲硫氨酸，在某些情况下是宿主介导加工的结果。
此外，本发明的多肽可以利用本领域已知的方法化学合成(例如，见Creighton，1983，蛋白质：结构和分子原理，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，和Hunkapiller，M.等，1984，自然，310：105-111)。例如，相应于本发明METH1和/或METH2多肽的片段之肽可利用肽合成仪合成。此外，如需要，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为替代或添加导入METH1和/或METH2多肽序列。非经典氨基酸包括但不限于，常见氨基酸的D-异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正戊氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，胱氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己丙氨酸，β-丙氨酸，氟氨基酸，设计物氨基酸，如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和通常的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。
非天然存在的变体可以利用本领域周知的突变技术制备，其包括但不限于寡核苷酸介导的诱变，丙氨酸扫描，PCR诱变，定点诱变(见如，Carter等，核酸研究，13：4331(1986)；和Zoller等，核酸研究，10：6487(1982))，盒式诱变(见如Wells等，基因，34：315(1985))，限制性选择诱变(见如，Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London Ser A317：415(1986))。
本发明还构思了在翻译过程中或翻译后被不同地修饰的METH1和/或METH2多肽，例如，被糖基化，酰化，磷酸化，酰胺化，有已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白切割，与抗体分子或其他细胞配体连接，等。可利用已知技术进行多种化学修饰的任何一种，包括但不限于，利用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶， 进行特异性化学裂解；乙酰化，甲酰化，氧化，还原；在衣霉素存在下代谢性合成；等。
本发明构思的其他翻译后修饰包括，例如，N-联或O-联糖链，N-末端或C-末端的加工)，化学基团向氨基酸骨架的附着，N-联或O-联糖链的化学修饰，以及N-末端甲硫氨酸残基作为原核宿主细胞表达结果的添加或缺失。多肽也可用可检测的标记修饰，诸如酶、荧光素、同位素或亲和标记，用于蛋白质的检测和分离。
本发明还提供了METH1和/或METH2的化学修饰的衍生物，其可提供额外的优点，例如多肽之增加的溶解度、稳定性和循环时间，或降低的免疫原性(见如美国专利4179337)。用于衍生化的化学基团可选自水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。多肽也可被在分子内的随机位置上修饰，或在分子内预定的位置上修饰，且可包括一个、两个、三个或多个附着的化学基团。
聚合物可以是任何分子量，且可以是分支或不分支的。对于聚乙二醇，优选的分子量为约1kDa-100kDa之间(术语“约”表明在聚乙二醇制备中，有些分子会比标准分子量高些或低些。)以便于处理和操作。其他大小也可采用，取决于期望的治疗曲线(例如，期望的缓释持续时间，对生物活性的效果(如果有的话)，处理的容易程度，抗原性的程度和有无，以及其他聚乙二醇对治疗蛋白质或类似物的已知作用)。例如，聚乙二醇可具有大约如下的分子量：200,500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,4000,4500,5000,5500,6000,6500,7000,7500,8000,8500,9000,9500,10,000,10,500,11,000,11,500,12,000,12,500,13,000,13,500,14,000,14,500,15,000,15,500,16,000,16,500,17,000,17,500,18,000,18,500,19,000,19,500,20,000,25,000,30,000,35,000,40,000,50,000,55,000,60,000,65,000,70,000,75,000,80,000,85,000,90,000,95,000,或100,000kDa.
如上所述，聚乙二醇可具有分支结构。分支聚乙二醇如美国专利5643575；Morpurgo等，应用生物化学生物技术杂志(Appl.Biochem.Biotechnol.)，56：59-72(1996)；Vorobjev等，核苷酸，18：2745-2750；和Caliceti等，生物偶联物化学(Bioconjng.Chem.)，10：638-646(1999)所述；此处每一公开在此引入作为参考。
聚乙二醇分子(或其他化学基团)应当与蛋白质结合，同时考虑对蛋白质的功能或抗原结构域的作用。本领域已有多种用于连接的方法，例如，EP0401384，在此引入作为参考(偶联PEG至G-CSF)，也参见Malik等，Exp.Hematol.，20：1028-1035(1992)(报道了利用三氟乙磺酰氯对GM-CSF的PEG化)。例如，聚乙二醇可通过反应基团，如自由的氨基或羧基通过氨基酸残基共价连接。反应基团是那些活化的聚乙二醇分子可连接的那些。具有自由氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N-末端氨基酸残基；具有自由羧基的那些可包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C-末端残基。巯基基团也可用做反应基团用于结合聚乙二醇分子。优选用于治疗目的是在氨基的连接，如在N-末端或赖氨酸基团的连接。如上述，聚乙二醇可以通过与一系列氨基酸残基中任一个连接而与蛋白质结合。例如，聚乙二醇可通过与赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的共价键被连接到蛋白质上。可利用一个或多个反应化学将聚乙二醇结合到蛋白质的特定氨基酸残基(例如，赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸)，或结合到蛋白质的一种以上类型的氨基酸残基(例如，赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和其组合)。
人们可能特别期望在N-端化学修饰的蛋白质。利用聚乙二醇作为本发明组合物的例子，可以选择多种聚乙二醇分子(通过分子量，分支等)，聚乙二醇分子与蛋白质(或肽)分子在反应混合物中的比例，待进行的聚乙二醇化类型，和获得所选N-末端聚乙二醇化蛋白质的方法。获得N-末端聚乙二醇化制备的方法(即：将此基团与其他单聚乙二醇化基团分离，如需要)可以是通过从多种聚乙二醇化蛋白质分子中纯化N-末端聚乙二醇材料在N-末端修饰之选择性化学修饰蛋白质可利用还原烷基化进行，方法中利用了在特定蛋白质衍生化中可用的不同类型的伯氨基团(赖氨酸对N-末端)的不同反应性。在适当的反应条件下，可基本上实现在N-末端的蛋白质用羧基基团的选择性衍生化。
如上述，本发明的蛋白质聚乙二醇化可用任何方法实现。例如，可直接或通过间隔连接子将聚乙二醇结合到蛋白质上。无须连接子的将聚乙二醇结合到蛋白质上的体系如Delgado等人，Crit.Rev.Thera.DrugCarier Sys.，9：249-304(1992)；Francis等，Intern.J.of Hematol.68：1-18(1998)；美国专利4002531；5349052；WO95/06058；和WO98/32466，此处引入作为参考。
一种将聚乙二醇直接结合到蛋白质之氨基酸残基而无须间隔连接子的体系利用了三氟乙磺酰化MPEG，其由单甲氧基聚乙二醇(MPEG)利用三氟乙磺酰氯( )进行修饰而得到。一经蛋白质与三氟乙磺酰化MPEG反应，聚乙二醇直接结合到蛋白质的氨基基团。由此，本发明包括有本发明的蛋白质与聚乙二醇分子(带有2，2，2-三氟乙磺酰基)反应所产生的蛋白质-聚乙二醇偶联物。
聚乙二醇也可利用多种不同的间隔连接子连接到蛋白质。例如，美国专利5612460，其全文在此引入作为参考，其公开了用于将聚乙二醇与蛋白质连接的尿烷。其中聚乙二醇分子与蛋白质结合的蛋白质-聚乙二醇偶联物可利用蛋白质与多种化合物反应制备，所述化合物诸如MPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯，用1，1’-羰基二咪唑活化的MPEG，MPEG-2，4，5-三氯苯羧酸酯，MPEG-对硝基苯甲酸酯，和多种MPEG琥珀酸酯衍生物。一系列其他聚乙二醇衍生物和用于将聚乙二醇衍生物与蛋白质连接的反应化学见WO98/32466所述，其全文在此引入作为参考。利用此处所述反应化学制备的聚乙二醇化蛋白质产物包括在本发明的范围中。
结合到本发明的各个蛋白质上的聚乙二醇基团的数目可以不同。例如，本发明的聚乙二醇化蛋白质可以平均连接至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多聚乙二醇分子。类似地，取代的平均程度在如下范围内，诸如每个蛋白质分子1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19，或18-20个聚乙二醇分子。用于测定取代的程度的方法在例如Delgado等，Crit.l Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304(1992)中所述。
本发明的METH1和/或METH2多肽可为单体或多聚体(即：二聚体，三聚体，四聚体和高级多聚体)。因此，本发明涉及本发明METH1和/或METH2多肽的单聚体和多聚体，及其制备和含有其的组合物(优选为药物组合物)。在一个特定实施方案中，本发明的多肽为单体，二聚体，三聚体，四聚体。在其他实施方案中，本发明的多聚体至少为二聚体，三聚体，四聚体。
本发明的多聚体可为同聚体或异聚体。如此处所用，术语同聚体是指仅含有本发明METH1和/或METH2(包括METH1和/或METH2片段，变体，剪接变体，和融合蛋白，如此处所述)的多聚体。这些同聚体可含有具有相同或不同氨基酸序列的本发明METH1和/或METH2多肽。在一个特定实施方案中，本发明的同聚体是仅含有相同氨基酸序列的METH1和/或METH2多肽的多聚体。在另一个实施方案中，本发明的同聚体是含有具有不同氨基酸序列的METH1和/或METH2多肽的多聚体。在一个特定实施方案中，本发明的多聚体是同聚二体，(如含有相同或不同氨基酸序列的METH1和/或METH2多肽)。在另一个实施方案中，本发明的同聚体至少是同聚二体，同聚三体或至少是同聚四体。
如此处所用，术语异聚体是指含有除了本发明的METH1和/或METH2多肽之外的一个或多个异源多肽(即：不同蛋白质的肽)的多聚体。在一个实施方案中，本发明的多聚体是异聚二体，异聚三体或是异聚四体。在另一个实施方案中，本发明的同聚体至少是同聚二体，同聚三体或至少是同聚四体。
本发明的多聚体可以是疏水性、亲水性、离子性和/或共价结合的结果，和/或可间接通过例如脂质体形成而连接。由此，在一个实施方案中，本发明的多聚体(如例如同聚二体或同聚三体)在当本发明的多肽与溶液中的另一个接触时形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的异多聚体(如例如异聚三体或异聚四体)在当本发明的多肽与溶液中本发明多肽的抗体接触(包括针对本发明融合抗体中异源多肽序列的抗体)时形成。在另一实施方案中，本发明的多聚体通过与和/或位于本发明METH1和/或METH2多肽之间的共价结合形成。这种共价结合可包括一种或多种多肽序列中所包含的氨基酸残基(例如，示于SEQ ID NO：2或4中，或包含于由克隆HATCK89或保藏于ATCC，保藏号209581或209582或PTA1478所编码的多肽中)。在一种情况中，共价结合为位于多肽序列中的半胱氨酸之间(其在天然(即天然存在)多肽中相互作用)的交联。在另一种情况中，共价结合为化学或重组处理后的结果。或者，这种共价结合可包括一种或多种含于METH1和/或METH2融合蛋白中的异源多肽序列内的氨基酸残基。在一个实施例中，共价结合在含于本发明融合蛋白质中异源序列之间(见如美国专利5478925)。在一个特定实施例中，共价结合在含于本发明融合蛋白质METH1和/或METH2-Fc中异源序列之间。在另一个实施例中，本发明的融合蛋白质的共价结合在来自另一个成纤维生长因子家族成员的异源多肽序列之间，所述纤维生长因子家族成员的异源多肽能形成共价结合多聚体，如例如，oseteoprotegerin(见如，国际公开文本WO98/49305，其内容在此引入作为参考。)在另一实施方案中，两个或多个本发明的多肽通过肽连接子结合。实例包括在美国专利5073627中描述的那些肽连接子(在此引入作为参考)。包含由肽连接子分隔的本发明多重肽的蛋白质可利用常规重组DNA技术制备。
制备本发明的多聚体多肽的另一种方法包括利用与亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列融合的本发明的多肽。亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链结构域是促进其中所含的蛋白质多聚化的多肽。最初亮氨酸拉链是在数种DNA-结合蛋白质中发现(Landschulz等，科学，240：1759(1988))，由此从多种不同蛋白质发现。在已知的亮氨酸拉链中由天然存在的肽和二聚或三聚的其衍生物。适于制备本发明的可溶性多聚蛋白质之亮氨酸拉链的例子见PCT申请WO94/10308中所述，此处引入作为参考。包含与在溶液中二聚或三聚的多肽融合的本发明多肽的之重组融合蛋白质在适当的宿主细胞中表达，其所得可溶性多聚融合蛋白质利用本领域已知方法从培养物上清液中回收。
本发明的三聚多肽可提供改进的生物活性的益处。优选的亮氨酸拉链基团和异亮氨酸基团是优势形成三聚体的那些。一个例子是来自肺表面活性剂蛋白质D(SPD)的亮氨酸拉链，见Hoppe等，FEBS Letters，344：191，(1994))和美国专利申请08/446922所述，此处引入作为参考。来自天然存在的三聚体蛋白质的其他肽也可在制备本发明的三聚体多肽中采用。
在另一例子中，本发明的蛋白质通过FLAG_多肽序列之间的相互作用而结合，所述FLAG_多肽序列存在于包含FLAG_多肽序列的本发明融合蛋白质中。在一个实施方案中，本发明的蛋白质结合是通过本发明的FLAG_融合蛋白质所含异源多肽序列与抗FLAG_抗体的相互作用结合的。
本发明多聚体可利用本领域已知的化学技术产生。例如，期望包含于本发明的多聚体中的多肽可利用连接子分子和本领域已知的连接子分子长度优化技术被化学交联(见如美国专利5478925，在此引入作为参考)。此外，本发明的多聚体可利用本领域已知的方法形成一个或多个半胱氨酸残基间的分子内交联产生，所述半胱氨酸位于期待包含于多聚体中的多肽序列中(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。此外，本发明的多肽可被常规修饰，方法是向多肽的C-或N-末端添加半胱氨酸或生物素，可利用本领域已知的方法产生含有一个或多个如此修饰的多肽(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。另外，本领域已知的技术可用来产生含有期望被包含于本发明多聚体中的多肽成分之脂质体(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。
或者，本发明的多聚体可利用本领域已知的遗传工程技术产生。在一个实施方案中，包含于本发明多聚体的多肽利用此处所述或本领域已知的融合蛋白质技术重组产生(见如美国专利5478925，在此引入作为参考)。在一个特定实施方案中，编码本发明同聚二体的多核苷酸这样制备：将编码本发明多肽的多核苷酸序列于编码一种连接子多肽的序列连接，然后进一步与合成的多核苷酸连接，所述多核苷酸编码反方向(由C-末端到N-末端)的肽的翻译产物(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。在另一实施方案中，此处所述或本领域已知的重组技术应用于制备本发明的重组多肽，其含有跨膜结构域(或疏水或信号肽)且能利用膜重构技术被掺入脂质体中(见如美国专利5478925，在此引入作为参考)。
METH1和METH2多肽及片段
本发明进一步提供了由保藏cDNA编码之氨基酸序列或SEQ ID NO：2中氨基酸序列的分离METH1多肽，或含上述多肽一部分的肽或多肽。本发明进一步提供了具保藏cDNA编码之氨基酸序列或SEQ ID NO：4中氨基酸序列的分离METH2多肽，或含上述多肽一部分的肽或多肽。
本发明的多肽不仅包括全长多肽，也包括蛋白质、缺失突变体、替换变体、等位变体、类似物、衍生物等等的成熟形式、原蛋白形式、加工形式。
METH1或METH2多肽可由彼此通过肽键或被修饰肽键相互连接的氨基酸组成，即肽同配基(isosteres)，并可包含20种基因编码氨基酸之外的氨基酸。可通过诸如翻译后加工之类的天然加工或本领域众所周知的化学修饰技术修饰METH1或METH2多肽。在基础课本和更详尽的专论及许多研究文献中对这些修饰都有很好的描述。修饰可发生于METH1或METH2多肽中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。应当理解，在所给METH1或METH2多肽的数个位点处可存在相同或不同程度的同类修饰。此外，所给METH1或METH2多肽可包含多种类型的修饰。METH1或METH2多肽可以是分枝的，例如由于遍在蛋白化的结果，它们也可以是环状的，有或无分枝。环状、分枝和分枝环状的METH1或METH2多肽可在翻译后天然加工产生或可用合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价添加、血红素部分的共价添加、核苷酸或核苷酸衍生物的共价添加、脂类或脂类衍生物的共价添加、磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol)的共价添加、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、如精氨酰化之类的转移RNA介导的氨基酸加入蛋白质中和遍在蛋白化。(参阅，例如，蛋白质的结构和分子特性(PROTEINS STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，纽约(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS)，B.C.Johnson编辑，Academic Press，纽约，第1-12页(1983)；Seifter等，酶学方法182：626-646(1990)；Rattan等，Ann NY AcadSci 663：48-62(1992))。
在本领域中应当认识到，METH1或METH2多肽的一些氨基酸序列可变化而不显著影响蛋白质的结构和功能。如果这些序列中的差异也包括在内，应当记住在蛋白质中存在决定活性的关键区域。
本项发明者已表明，METH1和METH2可抑制体外和体内的血管形成。METH1和METH2均含金属蛋白酶结构域、去整联蛋白结构域和TSP样结构域。金属蛋白酶结构域可能具催化活性。去整联蛋白结构域可能通过与整联蛋白相互作用而在抑制血管形成中起作用，因为整联蛋白在增殖和转移信号的介导中是必需的。本项发明者已表明，来自METH1和METH2类TSP结构域的肽可抑制体外和体内的血管形成。
此外，本发明还包括显示实质性METH1多肽活性或含如下述蛋白质部分之METH1蛋白区的METH1多肽变种；和显示实质性METH2多肽活性或含如下述蛋白质部分之METH2蛋白区的METH2多肽变种。所说的突变体包括缺失、插入、倒置、重复和类型取代。如上所表明的，关于哪些氨基酸可能是表型沉默的指导可见如下文献：Bowie，J.U.等，“蛋白质序列的信息解译：对氨基酸取代的容忍”，科学247：1306-1310(1990)。
因此，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4多肽或由保藏cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)替换，该替换氨基酸残基可由或可不由遗传密码编码，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基含取代基团，或(iii)其中成熟多肽与另一化合物如提高多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合，如IgG Fc融合区域肽或者前导或者分泌序列或者用于成熟多肽纯化的序列或前蛋白序列。根据本文教导，这样的片段、衍生物和类似物在本领域技术熟练人员的范围内。
特别令人感兴趣的是用另一带电氨基酸和用中性或带相反电荷的氨基酸替换带电氨基酸。后者产生带更少正电荷的蛋白质，以改善METH1或METH2蛋白质的性质。十分期望的是防止聚集。蛋白质的聚集不仅导致活性的丧失，还可能在制备药用配方时产生问题，因为它们可能是免疫原性的。(Pinckard等，临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)2：331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845(1987)；Cleland等，治疗给药物载体系统评述(Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrieerSystems)10：307-377(1993))。
如上所指出，优选较小特性的改变，如不显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸替换(见表3)。
表3保守氨基酸替换
芳香族氨基酸疏水氨基酸极性氨基酸碱性氨基酸酸性氨基酸小氨基酸 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸谷氨酰胺天冬酰胺精氨酸赖氨酸组氨酸天冬氨酸谷氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸甘氨酸
当然，本领域技术熟练人员进行氨基酸取代的数目由许多因素决定，包括上述因素。一般说来，任何所给METH1或METH2多肽的氨基酸替换数目应不超过50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个。
特别是，优选的METH1含有一个或多个如下的保守性替换：M1替换为A，G，I，L，S，T，或V；G2替换为A，I，L，S，T，M，或V；N3替换为Q；A4替换为G，I，L，S，T，M，或V；E5替换为D；R6替换为H，或K；A7替换为G，I，L，S，T，M，或V；G9替换为A，I，L，S，T，M，或V；S10替换为A，G，I，L，T，M，或V；R11替换为H，或K；S12替换为A，G，I，L，T，M，或V；F13替换为W，或Y；G14替换为A，I，L，S，T，M，或V；V16替换为A，G，I，L，S，T，或M；T18替换为A，G，I，L，S，M，或V；L19替换为A，G，I，S，T，M，或V；L20替换为A，G，I，S，T，M，或V；L21替换为A，G，I，S，T，M，或V；L22替换为A，G，I，S，T，M，或V；A23替换为G，I，L，S，T，M，或V；A24替换为G，I，L，S，T，M，或V；A25替换为G，I，L，S，T，M，或V；L26替换为A，G，I，S，T，M，或V；L27替换为A，G，I，S，T，M，或V；A28替换为G，I，L，S，T，M，或V；V29替换为A，G，I，L，S，T，或M；S30替换为A，G，I，L，T，M，或V；D31替换为E；A32替换为G，I，L，S，T，M，或V；L33替换为A，G，I，S，T， M，或V；G34替换为A，I，L，S，T，M，或V；R35替换为H，或K；S37替换为A，G，I，L，T，M，或V；E38替换为D；E39替换为D；D40替换为E；E41替换为D；E42替换为D；L43替换为A，G，I，S，T，M，或V；V44替换为A，G，I，L，S，T，或M；V45替换为A，G，I，L，S，T，或M；E47替换为D；L48替换为A，G，I，S，T，M，或V；E49替换为D；R50替换为H，或K；A51替换为G，I，L，S，T，M，或V；G53替换为A，I，L，S，T，M，或V；H54替换为K，或R；G55替换为A，I，L，S，T，M，或V；T56替换为A，G，I，L，S，M，或V；T57替换为A，G，I，L，S，M，或V；R58替换为H，或K；L59替换为A，G，I，S，T，M，或V；R60替换为H，或K；L61替换为A，G，I，S，T，M，或V；H62替换为K，或R；A63替换为G，I，L，S，T，M，或V；F64替换为W，或Y；D65替换为E；Q66替换为N；Q67替换为N；L68替换为A，G，I，S，T，M，或V；D69替换为E；L70替换为A，G，I，S，T，M，或V；E71替换为D；L72替换为A，G，I，S，T，M，或V；R73替换为H，或K；D75替换为E；S76替换为A，G，I，L，T，M，或V；S77替换为A，G，I，L，T，M，或V；F78替换为W，或Y；L79替换为A，G，I，S，T，M，或V；A80替换为G，I，L，S，T，M，或V；G82替换为A，I，L，S，T，M，或V；F83替换为W，或Y；T84替换为A，G，I，L，S，M，或V；L85替换为A，G，I，S，T，M，或V；Q86替换为N；N87替换为Q；V88替换为A，G，I，L，S，T，或M；G89替换为A，I，L，S，T，M，或V；R90替换为H，或K；K91替换为H，或R；S92替换为A，G，I，L，T，M，或V；G93替换为A，I，L，S，T，M，或V；S94替换为A，G，I，L，T，M，或V；E95替换为D；T96替换为A，G，I，L，S，M，或V；L98替换为A，G，I，S，T，M，或V；E100替换为D；T101替换为A，G，I，L，S，M，或V；D102替换为E；L103替换为A，G，I，S，T，M，或V；A104替换为G，I，L，S，T，M，或V；H105替换为K，或R；F107替换为W，或Y；Y108替换为E，W；S109替换为A，G，I，L，T，M，或V；G110替换为A，I，L，S，T，M，或V；T111替换为A，G，I，L，S，M，或V；V112替换为A，G，I，L，S，T，或M；N113替换为Q；G114替换为A，I，L，S，T，M，或V；D115替换为E；S117替换为A，G，I，L，T，M，或V；S118替换为A，G，I，L，T，M，或V；A119替换为G，I，L，S，T，M，或V；A120替换为G，I，L，S，T，M，或V；A121替换为G，I，L，S，T，M，或V；L122替换为A，G，I，S，T，M，或V；S123替换为A，G，I，L，T，M，或V；L124替换为A，G，I，S，T，M，或V；E126替换为D；G127替换为A，I，L，S，T，M，或V；V128替换为A，G，I，L，S，T，或M；R129替换为H，或K；G130替换为A，I，L，S，T，M，或V；A131替换为G，I，L，S，T，M，或V；F132替换为W，或Y；Y133替换为E，或W；L134替换为A，G，I，S，T，M，或V；L135替换为A，G，I，S，T， M，或V；G136替换为A，I，L，S，T，M，或V；E137替换为D；A138替换为G，I，L，S，T，M，或V；Y139替换为E，或W；F140替换为W，或Y；1141替换为A，G，L，S，T，M，或V；Q142替换为N；L144替换为A，G，I，S，T，M，或V；A146替换为G，I，L，S，T，M，或V；A147替换为G，I，L，S，T，M，或V；S148替换为A，G，I，L，T，M，或V；E149替换为D；R150替换为H，或K；L151替换为A，G，I，S，T，M，或V；A152替换为G，I，L，S，T，M，或V；T153替换为A，G，I，L，S，M，或V；A154替换为G，I，L，S，T，M，或V；A155替换为G，I，L，S，T，M，或V；G157替换为A，I，L，S，T，M，或V；E158替换为D；K159替换为H，或R；A162替换为G，I，L，S，T，M，或V；L164替换为A，G，I，S，T，M，或V；Q165替换为N；F166替换为W，或Y；H167替换为K，或R；L168替换为A，G，I，S，T，M，或V；L169替换为A，G，I，S，T，M，或V；R170替换为H，或K；R171替换为H，或K；N172替换为Q；R173替换为H，或K；Q174替换为N；G175替换为A，I，L，S，T，M，或V；D176替换为E；V177替换为A，G，I，L，S，T，或M；G178替换为A，I，L，S，T，M，或V；G179替换为A，I，L，S，T，M，或V；T180替换为A，G，I，L，S，M，或V；G182替换为A，I，L，S，T，M，或V；V183替换为A，G，I，L，S，T，或M；V184替换为A，G，I，L，S，T，或M；D185替换为E；D186替换为E；E187替换为D；R189替换为H，或K；T191替换为A，G，I，L，S，M，或V；G192替换为A，I，L，S，T，M，或V；K193替换为H，或R；A194替换为G，I，L，S，T，M，或V；E195替换为D；T196替换为A，G，I，L，S，M，或V；E197替换为D；D198替换为E；E199替换为D；D200替换为E；E201替换为D；G202替换为A，I，L，S，T，M，或V；T203替换为A，G，I，L，S，M，或V；E204替换为D；G205替换为A，I，L，S，T，M，或V；E206替换为D；D207替换为E；E208替换为D；G209替换为A，I，L，S，T，M，或V；Q211替换为N；W212替换为F，或Y；S213替换为A，G，I，L，T，M，或V；Q215替换为N；D216替换为E；A218替换为G，I，L，S，T,M，或V；L219替换为A，G，I，S，T，M，或V；Q220替换为N；G221替换为A，I，L，S，T,M，或V；V222替换为A，G，I，L，S，T，或M；G223替换为A，I，L，S，T，M，或V；Q224替换为N；T226替换为A，G，I，L，S，M，或V；G227替换为A，I，L，S，T，M，或V；T228替换为A，G，I，L，S，M，或V；G229替换为A，I，L，S，T，M，或V；S230替换为A，G，I，L，T，M，或V；I231替换为A，G，L，S，T，M，或V；R232替换为H，或K；K233替换为H，或R；K234替换为H，或R；R235替换为H，或K；F236替换为W，或Y；V237替换为A，G，I，L，S，T，或M；S238替换为A，G，I，L，T，M，或V；S239替换为A，G，I，L，T，M，或V；H240替换为K，或R；R241替换为H，或K；Y242替换为F，或W；V243替换为A，G，I，L，S，T，或M；E244替换为D；T245替换为A，G，I，L，S，M，或V；M246替换为A，G，I，L，S，T，或V；L247替换为A，G，I，S，T， M，或V；V248替换为A，G，I，L，S，T，或M；A249替换为G，I，L，S，T，M，或V；D250替换为E；Q251替换为N；S252替换为A，G，I，L，T，M，或V；M253替换为A，G，I，L，S，T，或V；A254替换为G，I，L，S，T，M，或V；E255替换为D；F256替换为W，或Y；H257替换为K，或R；G258替换为A，I，L，S，T，M，或V；S259替换为A，G，I，L，T，M，或V；G260替换为A，I，L，S，T，M，或V；L261替换为A，G，I，S，T，M，或V；K262替换为H，或R；H263替换为K，或R；Y264替换为F，或W；L265替换为A，G，I，S，T，M，或V；L266替换为A，G，I，S，T，M，或V；T267替换为A，G，I，L，S，M，或V；L268替换为A，G，I，S，T，M，或V；F269替换为W，或Y；S270替换为A，G，I，L，T，M，或V；V271替换为A，G，I，L，S，T，或M；A272替换为G，I，L，S，T，M，或V；A273替换为G，I，L，S，T，M，或V；R274替换为H，或K；L275替换为A，G，I，S，T，M，或V；Y276替换为F，或W；K277替换为H，或R；H278替换为K，或R；S280替换为A，G，I，L，T，M，或V；I281替换为A，G，L，S，T，M，或V；R282替换为H，或K；N283替换为Q；S284替换为A，G，I，L，T，M，或V；V285替换为A，G，I，L，S，T，或M；S286替换为A，G，I，L，T，M，或V；L287替换为A，G，I，S，T，M，或V；V288替换为A，G，I，L，S，T，或M；V289替换为A，G，I，L，S，T，或M；V290替换为A，G，I，L，S，T，或M；K291替换为H，或R；I292替换为A，G，L，S，T， M，或V；L293替换为A，G，I，S，T，M，或V；V294替换为A，G，I，L，S，T，或M；I295替换为A，G，L，S，T，M，或V；H296替换为K，或R；D297替换为E；E298替换为D；Q299替换为N；K300替换为H，或R；G301替换为A，I，L，S，T，M，或V；E303替换为D；V304替换为A，G，I，L，S，T，或M；T305替换为A，G，I，L，S，M，或V；S306替换为A，G，I，L，T，M，或V；N307替换为Q；A308替换为G，I，L，S，T，M，或V；A309替换为G，I，L，S，T，M，或V；L310替换为A，G，I，S，T， M，或V；T311替换为A，G，I，L，S，M，或V；L312替换为A，G，I，S，T，M，或V；R313替换为H，或K；N314替换为Q；F315替换为W，或Y；N317替换为Q；W318替换为F，或Y；Q319替换为N；K320替换为H，或R；Q321替换为N；H322替换为K，或R；N323替换为Q；S326替换为A，G，I，L，T，M，或V；D327替换为E；R328替换为H，或K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也优选METH1多肽具有一个或多个如下非保守性替换：M1替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G2替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N3替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A4替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E5替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R6替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A7替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P8替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G9替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S10替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R11替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S12替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F13替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G14替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P15替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；V16替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P17替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；T18替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L19替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L20替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L21替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L22替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A23替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A24替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A25替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L26替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，T，P，或C；L27替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A28替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V29替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S30替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D31替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A32替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L33替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G34替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R35替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，E，W，Y，P，或C；P36替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S37替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E38替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E39替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D40替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E41替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E42替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L43替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V44替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V45替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P46替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E47替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L48替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E49替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R50替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A51替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P52替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G53替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H54替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G55替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T56替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T57替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R58替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L59替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R60替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L61替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H62替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A63替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F64替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D65替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q66替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q67替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L68替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D69替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L70替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E71替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L72替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R73替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P74替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；D75替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S76替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S77替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F78替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L79替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A80替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P81替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G82替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F83替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T84替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L85替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q86替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N87替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；V88替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G89替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R90替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K91替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S92替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G93替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S94替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E95替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T96替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P97替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L98替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P99替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E100替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T101替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D102替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L103替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A104替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H105替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C106替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；F107替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Y108替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S109替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G110替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T111替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V112替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，Y，P，或C；N113替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G114替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D115替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P116替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S117替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S118替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A119替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A120替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A121替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L122替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S123替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L124替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C125替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；E126替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G127替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V128替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R129替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G130替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A131替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F132替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Y133替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L134替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L135替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G136替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E137替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A138替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y139替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F140替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；1141替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q142替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P143替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，或C；L144替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P145替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A146替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A147替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S148替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E149替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R150替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L151替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A152替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T153替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A154替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A155替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P156替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G157替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E158替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K159替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P160替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P161替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A162替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P163替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L164替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q165替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F166替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；H167替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L168替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L169替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R170替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R171替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N172替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R173替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q174替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G175替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D176替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V177替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G178替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G179替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T180替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C181替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G182替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V183替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V184替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D185替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D186替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E187替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P188替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；R189替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P190替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；T191替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G192替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K193替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A194替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E195替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T196替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E197替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D198替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E199替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D200替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E201替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G202替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T203替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E204替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G205替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E206替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D207替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E208替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G209替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P210替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Q211替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W212替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S213替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P214替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Q215替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D216替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P217替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A218替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L219替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q220替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G221替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V222替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G223替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q224替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P225替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；T226替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G227替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T228替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G229替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S230替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I231替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R232替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K233替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K234替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R235替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F236替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V237替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S238替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S239替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H240替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R241替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y242替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V243替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E244替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T245替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M246替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L247替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V248替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A249替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D250替换为H，K，R，A，G，I，L，S，Y，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q251替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S252替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M253替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A254替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E255替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F256替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；H257替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G258替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S259替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G260替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L261替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K262替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H263替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y264替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L265替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L266替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T267替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L268替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F269替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S270替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V271替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A272替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A273替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R274替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L275替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y276替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；K277替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H278替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P279替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S280替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I281替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R282替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N283替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S284替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V285替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S286替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L287替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V288替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V289替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V290替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K291替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I292替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L293替换为D，E，H，K，I，N，Q，F，W，Y，P，或C；V294替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I295替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H296替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D297替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E298替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q299替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K300替换为D，E，A，G，I，L，S，Y，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G301替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P302替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E303替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V304替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T305替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S306替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N307替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A308替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A309替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L310替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T311替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L312替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R313替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N314替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F315替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C316替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；N317替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W318替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q319替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K320替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q321替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，C，F，W，Y，P，或C；H322替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N323替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P324替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P325替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S326替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D327替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R328替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D329替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A330替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E331替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H332替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y333替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D334替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T335替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A336替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I337替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L338替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F339替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T340替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R341替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，R，或C；Q342替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D343替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L344替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C345替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G346替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S347替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q348替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T349替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C350替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，或P；D351替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T352替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L353替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G354替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M355替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A356替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D357替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V358替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G359替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T360替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V361替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C362替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；D363替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P364替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S365替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R366替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S367替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C368替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S369替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V370替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I371替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E372替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D373替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D374替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G375替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L376替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q377替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A378替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A379替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F380替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T381替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T382替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A383替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H384替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E385替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L386替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G387替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H388替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V389替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F390替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N391替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；M392替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P393替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；H394替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D395替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D396替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W， Y，P，或C；A397替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K398替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q399替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C400替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；A401替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S402替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L403替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y， P，或C；N404替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G405替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V406替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N407替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q408替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D409替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S410替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H411替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；M412替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M413替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A414替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S415替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M416替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L417替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S418替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N419替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L420替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D421替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H422替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S423替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q424替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P425替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；W426替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S427替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P428替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，Y，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；C429替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S430替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A431替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y432替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；M433替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I434替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T435替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S436替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F437替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L438替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D439替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N440替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G441替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H442替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G443替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E444替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C445替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；L446替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M447替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D448替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K449替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P450替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Q451替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N452替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P453替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；I454替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q455替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L456替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P457替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G458替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D459替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y， P，或C；L460替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P461替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，或C；G462替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T463替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S464替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y465替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D466替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W， Y，P，或C；A467替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N468替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R469替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q470替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C471替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Q472替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F473替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T474替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F475替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G476替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E477替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D478替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S479替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K480替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，P，或C；H481替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C482替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；P483替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，或C；D484替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A485替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A486替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S487替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T488替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C489替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S490替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T491替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L492替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；W493替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C494替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；T495替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G496替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T497替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S498替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G499替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G500替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V501替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L502替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V503替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C504替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Q505替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T506替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K507替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H508替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F509替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；P510替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V ，N，Q，F，W，Y，或C；W511替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A512替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D513替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G514替换为D，E，H，K，R，N，Q，F， W，Y，P，或C；T515替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S516替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C517替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G518替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E519替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G520替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K521替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W522替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C523替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；I524替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N525替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G526替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K527替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C528替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；V529替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N530替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K531替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T532替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W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替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V925替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L926替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S927替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H928替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E929替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S930替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C931替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；D932替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P933替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L934替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K935替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K936替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P937替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；K938替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H939替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F940替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I941替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D942替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F943替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C944替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；T945替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M946替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A947替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E948替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C949替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S950替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C。
也优选METH2多肽具有一个或多个如下的保守性氨基酸替换：M1替换为A，G，I，L，S，T，或V；F2替换为W，或Y；A4替换为G，I，L，S，T，M，或V；A6替换为G，I，L，S，T，M，或V；A7替换为G，I，L，S，T，M，或V；R9替换为H，或K；W10替换为F，或Y；L11替换为A，G，I，S，T，M，或V；F13替换为W，或Y；L14替换为A，G，I，S，T，M，或V；L15替换为A，G，I，S，T，M，或V；L16替换为A，G，I，S，T，M，或V；L17替换为A，G，I，S，T，M，或V；L18替换为A，G，I，S，T，M，或V；L19替换为A，G，I，S，T，M，或V；L20替换为A，G，I，S，T，M，或V；L21替换为A，G，I，S，T，M，或V；L22替换为A，G，I，S，T，M，或V；L24替换为A，G，I，S，T，M，或V；A25替换为G，I，L，S，T，M，或V；R26替换为H，或K；G27替换为A，I，L，S，T，M，或V；A28替换为G，I，L，S，T，M，或V；A30替换为G，I，L，S，T，M，或V；R31替换为H，或K；A33替换为G，I，L，S，T，M，或V；A34替换为G，I，L，S，T，M，或V；G35替换为A，I，L，S，T，M，或V；G36替换为A，I，L，S，T，M，或V；Q37替换为N；A38替换为G，I，L，S，T，M，或V；S39替换为A，G，I，L，T，M，或V；E40替换为D；L41替换为A，G，I，S，T，M，或V；V42替换为A，G，I，L，S，T，或M；V43替换为A，G，I，L，S，T，或M；T45替换为A，G，I，L，S，M，或V；R46替换为H，或K；L47替换为A，G，I，S，T，M，或V；G49替换为A，I，L，S，T，M，或V；S50替换为A，G，I，L，T，M，或V；A51替换为G，I，L，S，T，M，或V；G52替换为A，I，L，S，T，M，或V；E53替换为D；L54替换为A，G，I，S，T，M，或V；A55替换为G，I，L，S，T，M，或V；L56替换为A，G，I，S，T，M，或V；H57替换为K，或R；L58替换为A，G，I，S，T，M，或V；S59替换为A，G，I，L，T，M，或V；A60替换为G，I，L，S，T，M，或V；F61替换为W，或Y；G62替换为A，I，L，S，T，M，或V；K63替换为H，或R；G64替换为A，I，L，S，T，M，或V；F65替换为W，或Y；V66替换为A，G，I，L，S，T，或M；L67替换为A，G，I，S，T，M，或V；R68替换为H，或K；L69替换为A，G，I，S，T，M，或V；A70替换为G，I，L，S，T，M，或V；D72替换为E；D73替换为E；S74替换为A，G，I，L，T，M，或V；F75替换为W，或Y；L76替换为A，G，I，S，T，M，或V；A77替换为G，I，L，S，T，M，或V；E79替换为D；F80替换为W，或Y；K81替换为H，或R；I82替换为A，G，L，S，T，M，或V；E83替换为D；R84替换为H，或K；L85替换为A，G，I，S，T，M，或V；G86替换为A，I，L，S，T，M，或V；G87替换为A，I，L，S，T，M，或V；S88替换为A，G，I，L，T，M，或V；G89替换为A，I，L，S，T，M，或V；R90替换为H，或K；A91替换为G，I，L，S，T，M，或V；T92替换为A，G，I，L，S，M，或V；G93替换为A，I，L，S，T，M，或V；G94替换为A，I，L，S，T，M，或E；E95替换为D；R96替换为H，或K；G97替换为A，I，L，S，T，M，或V；L98替换为A，G，I，S，T，M，或V；R99替换为H，或K；G100替换为A，I，L，S，T，M，或V；F102替换为W，或Y；F103替换为W，或Y；S104替换为A，G，I，L，T，M，或V；G105替换为A，I，L，S，T，M，或V；T106替换为A，G，I，L，S，M，或V；V107替换为A，G，I，L，S，T，或M；N108替换为Q；G109替换为A，I，L，S，T，M，或V；E110替换为D；E112替换为D；S113替换为A，G，I，L，T，M，或V；L114替换为A，G，I，S，T，M，或V；A115替换为G，I，L，S，T，M，或V；A116替换为G，I，L，S，T，M，或V；V117替换为A，G，I，L，S，T，或M；S118替换为A，G，I，L，T，M，或V；L119替换为A，G，I，S，T，M，或V；R121替换为H，或K；G122替换为A，I，L，S，T，M，或V；L123替换为A，G，I，S，T，M，或V；S124替换为A，G，I，L，T，M，或V；G125替换为A，I，L，S，T，M，或V；S126替换为A，G，I，L，T，M，或V；F127替换为W，或Y；L128替换为A，G，I，S，T，M，或V；L129替换为A，G，I，S，T，M，或V；D130替换为E；G131替换为A，I，L，S，T，M，或V；E132替换为D；E133替换为D；F134替换为W，或Y；T135替换为A，G，I，L，S，M，或V；I136替换为A，G，L，S，T，M，或V；Q137替换为N；Q139替换为N；G140替换为A，I，L，S，T，M，或V；A141替换为G，I，L，S，T，M，或V；G142替换为A，I，L，S，T，M，或V；G143替换为A，I，L，S，T，M，或V；S144替换为A，G，I，L，T，M，或V；L145替换为A，G，I，S，T，M，或V；A146替换为G，I，L，S，T，M，或V；Q147替换为N；H149替换为K，或R；R150替换为H，或K；L151替换为A，G，I，S，T，M，或V；Q152替换为N；R153替换为H，或K；W154替换为F，或Y；G155替换为A，I，L，S，T，M，或V；A157替换为G，I，L，S，T，M，或V；G158替换为A，I，L，S，T，M，或V；A159替换为G，I，L，S，T，M，或V；R160替换为H，或K；L162替换为A，G，I，S，T，M，或V；R164替换为H，或K；G165替换为A，I，L，S，T，M，或V；E167替换为D；W168替换为F，或Y；E169替换为D；V170替换为A，G，I，L，S，T，或M；E171替换为D；T172替换为A，G，I，L，S，M，或V；G173替换为A，I，L，S，T，M，或V；E174替换为D；G175替换为A，I，L，S，T，M，或V；Q176替换为N；R177替换为H，或K；Q178替换为N；E179替换为D；R180替换为H，或K；G181替换为A，I，L，S，T，M，或V；D182替换为E；H183替换为K，或R；Q184替换为N；E185替换为D；D186替换为E；S187替换为A，G，I，L，T，M，或V；E188替换为D；E189替换为D；E190替换为D；S191替换为A，G，I，L，T，M，或V；Q192替换为N；E193替换为D；E194替换为D；E195替换为D；A196替换为G，I，L，S，T，M，或V；E197替换为D；G198替换为A，I，L，S，T，M，或V；A199替换为G，I，L，S，T，M，或V；S200替换为A，G，I，L，T，M，或V；E201替换为D；L206替换为A，G，I，S，T，M，或V；G207替换为A，I，L，S，T，M，或V；A208替换为G，I，L，S，T，M，或V；T209替换为A，G，I，L，S，M，或V；S210替换为A，G，I，L，T，M，或V；R211替换为H，或K；T212替换为A，G，I，L，S，M，或V；K213替换为H，或R；R214替换为H，或K；F215替换为W，或Y；V216替换为A，G，I，L，S，T，或M；S217替换为A，G，I，L，T，M，或V；E218替换为D；A219替换为G，I，L，S，T，M，或V；R220替换为H，或K；F221替换为W，或Y；V222替换为A，G，I，L，S，T，或M；E223替换为D；T224替换为A，G，I，L，S，M，或V；L225替换为A，G，I，S，T，M，或V；L226替换为A，G，I，S，T，M，或V；V227替换为A，G，I，L，S，T，或M；A228替换为G，I，L，S，T，M，或V；D229替换为E；A230替换为G，I，L，S，T，M，或V；S231替换为A，G，I，L，T，M，或V；M232替换为A，G，I，L，S，T，或V；A233替换为G，I，L，S，T，M，或V；A234替换为G，I，L，S，T，M，或V；F235替换为W，或Y；Y236替换为F，或W；G237替换为A，I，L，S，T，M，或V；A238替换为G，I，L，S，T，M，或V；D239替换为E；L240替换为A，G，I，S，T，M，或V；Q241替换为N；N242替换为Q；H243替换为K，或R；I244替换为A，G，L，S，T，M，或V；L245替换为A，G，I，S，T，M，或V；T246替换为A，G，I，L，S，M，或V；L247替换为A，G，I，S，T，M，或V；M248替换为A，G，I，L，S，T，或V；S249替换为A，G，I，L，T，M，或V；V250替换为A，G，I，L，S，T，或M；A251替换为G，I，L，S，T，M，或V；A252替换为G，I，L，S，T，M，或V；R253替换为H，或K；I254替换为A，G，L，S，T，M，或V；Y255替换为F，或W；K256替换为H，或R；H257替换为K，或R；S259替换为A，G，I，L，T，M，或V；I260替换为A，G，L，S，T，M，或V；K261替换为H，或R；N262替换为Q；S263替换为A，G，I，L，T，M，或V；I264替换为A，G，L，S，T，M，或V；N265替换为Q；L266替换为A，G，I，S，T，M，或V；M267替换为A，G，I，L，S，T，或V；V268替换为A，G，I，L，S，T，或M；V269替换为A，G，I，L，S，T，或M；K270替换为H，或R；V271替换为A，G，I，L，S，T，或M；L272替换为A，G，I，S，T，M，或V；I273替换为A，G，L，S，T，M，或V；V274替换为A，G，I，L，S，T，或M；E275替换为D；D276替换为E；E277替换为D；K278替换为H，或R；W279替换为F，或Y；G280替换为A，I，L，S，T，M，或V；E282替换为D；V283替换为A，G，I，L，S，T，或M；S284替换为A，G，I，L，T，M，或V；D285替换为E；N286替换为Q；G287替换为A，I，L，S，T，M，或V；G288替换为A，I，L，S，T，M，或V；L289替换为A，G，I，S，T，M，或V；T290替换为A，G，I，L，S，M，或V；L291替换为A，G，I，S，T，M，或V；R292替换为H，或K；N293替换为Q；F294替换为W，或Y；N296替换为Q；W297替换为F，或Y；Q298替换为N；R299替换为H，或K；R300替换为H，或K；F301替换为W，或Y；N302替换为Q；Q303替换为N；S305替换为A，G，I，L，T，M，或V；D306替换为E；R307替换为H，或K；H308替换为K，或R；E310替换为D；H311替换为K，或R；Y312替换为F，或W；D313替换为E；T314替换为A，G，I，L，S，M，或V；A315替换为G，I，L，S，Y，M，或V；1316替换为A，G，L，S，T，M，或V；L317替换为A，G，I，S，T，M，或V；L318替换为A，G，I，S，T，M，或V；T319替换为A，G，I，L，S，M，或V；R320替换为H，或K；Q321替换为N；N322替换为Q；F323替换为W，或Y；G325替换为A，I，L，S，T，M，或V；Q326替换为N；E3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也优选METH2多肽具有一个或多个如下的保守性氨基酸替换：M1替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F2替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；P3替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A4替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P5替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A6替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A7替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P8替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；R9替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W10替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L11替换为D，E，H，K，R，N，Q，F， W，Y，P，或C；P12替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；F13替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L14替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L15替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L16替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L17替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L18替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L19替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L20替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L21替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L22替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P23替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L24替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A25替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R26替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G27替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A28替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P29替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A30替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R31替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P32替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A33替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A34替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G35替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G36替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q37替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A38替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S39替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E40替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L41替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V42替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V43替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P44替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；T45替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R46替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F， W，Y，P，或C；L47替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P48替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G49替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S50替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A51替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G52替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E53替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L54替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A55替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L56替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H57替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L58替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S59替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A60替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F61替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G62替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K63替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G64替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F65替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V66替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L67替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R68替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L69替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A70替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P71替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；D72替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D73替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S74替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F75替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L76替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A77替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P78替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E79替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F80替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；K81替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I82替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E83替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R84替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L85替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G86替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G87替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S88替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G89替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R90替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A91替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T92替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G93替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G94替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E95替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R96替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G97替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L98替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R99替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G100替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C101替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；F102替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F103替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S104替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G105替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T106替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V107替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N108替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G109替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E110替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P111替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E112替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S113替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L114替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A115替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A116替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V117替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S118替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L119替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C120替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；R121替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G122替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L123替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S124替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G125替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S126替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F127替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L128替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L129替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D130替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G131替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E132替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E133替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F134替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T135替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；1136替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q137替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P138替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Q139替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G140替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A141替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G142替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G143替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S144替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L145替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A146替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q147替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P148替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；H149替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R150替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L151替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q152替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R153替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W154替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G155替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P156替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A157替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G158替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A159替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R160替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P161替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L162替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P163替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；R164替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G165替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P166替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E167替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W168替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；E169替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V170替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E171替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T172替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G173替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E174替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G175替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q176替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R177替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q178替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E179替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R180替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G181替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D182替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H183替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q184替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E185替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D186替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S187替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E188替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E189替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E190替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S191替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q192替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E193替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E194替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E195替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A196替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E197替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G198替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A199替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S200替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E201替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P202替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P203替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P204替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P205替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L206替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G207替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A208替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T209替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S210替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R211替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T212替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K213替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R214替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F215替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V216替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S217替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E218替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A219替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R220替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F221替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V222替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E223替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T224替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L225替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L226替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V227替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A228替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D229替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A230替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S231替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M232替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A233替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A234替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F235替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Y236替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G237替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A238替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D239替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L240替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q241替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N242替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；H243替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I244替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L245替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T246替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L247替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M248替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S249替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V250替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A251替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A252替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R253替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I254替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y255替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；K256替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H257替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P258替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S259替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I260替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K261替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N262替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S263替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I264替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N265替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L266替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M267替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V268替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V269替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K270替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V271替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L272替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I273替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V274替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E275替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D276替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E277替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K278替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W279替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G280替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P281替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E282替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V283替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S284替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D285替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N286替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G287替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G288替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L289替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T290替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L291替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R292替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N293替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F294替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C295替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；N296替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W297替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q298替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R299替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R300替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F301替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N302替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q303替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P304替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S305替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D306替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R307替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H308替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P309替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E310替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H311替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y312替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D313替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T314替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A315替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I316替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L317替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L318替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T319替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R320替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q321替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N322替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F323替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C324替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G325替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q326替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E327替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G328替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L329替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C330替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；D331替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T332替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L333替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G334替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V335替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A336替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D337替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I338替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G339替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T340替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I341替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C342替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；D343替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P344替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；N345替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K346替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S347替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C348替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S349替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V350替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I351替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E352替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D353替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E354替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G355替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L356替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q357替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A358替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A359替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H360替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T361替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L362替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A363替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H364替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E365替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L366替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G367替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H368替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V369替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L370替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S371替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M372替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P373替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；H374替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D375替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D376替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S377替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K378替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P379替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；C380替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；T381替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R382替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L383替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F384替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G385替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P386替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；M387替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G388替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K389替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H390替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H391替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V392替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M393替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A394替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P395替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L396替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F397替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V398替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H399替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L400替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N401替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q402替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T403替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L404替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P405替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；W406替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S407替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P408替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；C409替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S410替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A411替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M412替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y413替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L414替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T415替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E416替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L417替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L418替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D419替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G420替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G421替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H422替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G423替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D424替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C425替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，Y，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；L426替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L427替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D428替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A429替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P430替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G431替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A432替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A433替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L434替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P435替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L436替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P437替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；T438替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G439替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L440替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P441替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G442替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R443替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；M444替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y， P，或C；A445替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L446替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y447替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q448替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L449替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D450替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q451替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q452替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C453替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；R454替换为D，E，A，G，I，L，S，T， M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q455替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；I456替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F457替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G458替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P459替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；D460替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F461替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；R462替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H463替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C464替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；P465替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；N466替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T467替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S468替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A469替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q470替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D471替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V472替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C473替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；A474替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q475替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L476替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；W477替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C478替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；H479替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T480替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D481替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G482替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A483替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E484替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P485替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L486替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C487替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；H488替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T489替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K490替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N491替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G492替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S493替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L494替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P495替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；W496替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A497替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D498替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G499替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T500替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P501替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；C502替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G503替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P504替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G505替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H506替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L507替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C508替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，Y，M，V，N，Q，G，W，Y，或P；S509替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E510替换为H，K，R，A，G，I，L，S，V，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G511替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S512替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C513替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；L514替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P515替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E516替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E517替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E518替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V519替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E520替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R521替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P522替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；K523替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P524替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；V525替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V526替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D527替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G528替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G529替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；W530替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A531替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P532替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；W533替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G534替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P535替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；W536替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G537替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E538替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C539替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S540替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R541替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T542替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C543替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G544替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G545替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G546替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V547替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q548替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F549替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S550替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H551替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R552替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，P，或C；E553替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C554替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；K555替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D556替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P557替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E558替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P559替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Q560替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N561替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G562替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G563替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R564替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y565替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C566替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；L567替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G568替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R569替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R570替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A571替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K572替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y573替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q574替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S575替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C576替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；H577替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T578替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E579替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E580替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C581替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；P582替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，或C；P583替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，或C；D584替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G585替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K586替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S587替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F588替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；R589替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E590替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q591替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q592替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C593替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；E594替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K595替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y596替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N597替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A598替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y599替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，Y，P，或C；N600替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y601替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，Y，P，或C；T602替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D603替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；M604替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D605替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G606替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N607替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L608替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L609替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q610替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W611替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V612替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P613替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；K614替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y615替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A616替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G617替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V618替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S619替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P620替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y ，或C；R621替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D622替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R623替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C624替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；K625替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L626替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F627替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C628替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；R629替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A630替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R631替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G632替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R633替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S634替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E635替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F636替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；K637替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V638替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F639替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；E640替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A641替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K642替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V643替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；1644替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D645替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G646替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T647替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L648替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C649替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G650替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P651替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E652替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T653替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L654替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A655替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I656替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C657替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；V658替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R659替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G660替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q661替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C662替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；V663替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K664替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A665替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G666替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C667替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；D668替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H669替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V670替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V671替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D672替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S673替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P674替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；R675替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K676替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L677替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D678替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K679替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C680替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G681替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V682替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C683替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G684替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G685替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K686替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G687替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N688替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S689替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C690替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；R691替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K692替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V693替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S694替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G695替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S696替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L697替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T698替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P699替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；T700替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N701替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y702替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G703替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y704替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N705替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D706替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I707替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V708替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T709替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I710替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P711替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；A712替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G713替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A714替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T715替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N716替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；1717替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D718替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V719替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K720替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q721替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R722替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S723替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H724替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P725替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G726替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V727替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q728替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N729替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D730替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G731替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N732替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，T，P，或C；Y733替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L734替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A735替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L736替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K737替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T738替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A739替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D740替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G741替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q742替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y743替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L744替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L745替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N746替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G747替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N748替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L749替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A750替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I751替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S752替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A753替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I754替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E755替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q756替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D757替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I758替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L759替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V760替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K761替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G762替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T763替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I764替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L765替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K766替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y767替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S768替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G769替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S770替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I771替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A772替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T773替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L774替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E775替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R776替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L777替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q778替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S779替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F780替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；R781替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P782替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L783替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P784替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E785替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P786替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L787替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T788替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V789替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q790替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L791替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L792替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T793替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V794替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P795替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G796替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E797替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V798替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F799替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；P800替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P801替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；K802替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V803替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K804替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y805替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T806替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F807替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F808替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V809替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P810替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；N811替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D812替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V813替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D814替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F815替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S816替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M817替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q818替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S819替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S820替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K821替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E822替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R823替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A824替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T825替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T826替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N827替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；I828替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I829替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q830替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P831替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L832替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L833替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H834替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A835替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q836替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W837替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V838替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L839替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G840替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D841替换为H，K，K，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W842替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S843替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E844替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C845替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S846替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S847替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T848替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C849替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；G850替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A851替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G852替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；W853替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q854替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R855替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R856替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T857替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V858替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E859替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C860替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；R861替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D862替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P863替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S864替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G865替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q866替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A867替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S868替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A869替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T870替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C871替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；N872替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K873替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A874替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L875替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K876替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P877替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E878替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；D879替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A880替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K881替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P882替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；C883替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；E884替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S885替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q886替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L887替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C888替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；P889替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L890替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C。
METH1或METH2多肽可含有50，40，30，10，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个保守性或非保守性氨基酸替换。另外，METH1或METH2多肽可含有任意组合的保守性或非保守性替换。METH1或METH2多肽在同一多肽中可含有50，40，30，10，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个保守性氨基酸替换，和50，40，30，10，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个非保守性氨基酸替换。例如，一个特定的多肽可含有10个保守性氨基酸替换以及10个非保守性氨基酸替换。编码具有这类替换的METH1或METH2多肽的多核苷酸也包括在本发明的范围内。
替换可在全长METH1或METH2，成熟METH1或METH2，和任何其他此处公开的其他METH1或METH2变体中进行，包括带有N-和/或C-末端氨基酸缺失的METH1或METH2多肽；缺少一个或多个结构域的METH1或METH2；或杂合METH1/METH2分子。
本发明的METH1和METH2蛋白质中对于功能重要的氨基酸可利用本领域已知方法(诸如定点诱变或丙氨酸扫描(Cunningham和Wells，科学，244：1081-1085(1989))鉴定。在后者的步骤中在分子的每一残基处导入单一的丙氨酸突变。所得突变的分子用来测试生物活性，诸如体外或体内血管生成的抑制。对于血管生成抑制关键的位点可通过结构分析来确定，诸如结晶法、核磁共振法或光亲和标记法(Smith et al.，J.Mol. Biol.，224：899-904(1992)和de Vos et al.，科学，255：306-312(1992))。
特别优选的是在每一结构域边界处带有氨基酸替换的多肽(例如，在金属蛋白酶结构域的边界处)。在这些边界处的氨基酸替换可进行以改变蛋白质的活性，例如，防止被切割。氨基酸替换也可以不影响蛋白质活性的方式进行。例如，可用如下氨基酸在METH1中进行下列氨基酸替换：
L-19可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-20可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-21可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-22可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-23可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-24可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-25可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-26可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-27可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-28可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；V-29可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；S-30可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；D-31可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-32可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，Y，V，W或Y；L-33可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-34可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-35可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；P-36可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；S-37可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；E-38可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；E-39可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-225可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；T-226可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；G-227可被替换为  A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；T-228可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；G-229可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-230可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；I-231可被替换为A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-232可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；K-233可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；K-234可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-235可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；F-236可被替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；V-237可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；S-238可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；S-239可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；H-240可被替换为A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-241可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；Y-242可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；V-243可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；E-244可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；T-245可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；K-449可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或T；P-450可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；Q-451可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；N-452可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-453可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；I-454可被替换为A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；Q-455可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；L-456可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-457可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；G-458可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；D-459可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-460可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-461可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；G-462可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；T-463可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，Y； W或Y；S-464可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；Y-465可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；D-466可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-467可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；N-468可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-469可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；R-534可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；K-535可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；H-536可被替换为A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；F-537可被替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；D-538可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；T-539可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；P-540可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；F-541可被替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，T，W或YL；H-542可被替换为A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-543可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-544可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；W-545可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；G-546可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，R，Q，R，S，T，V，W或Y；M-547可被替换为A，C，D，E，F， G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；W-548可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；G-549可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-550可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；W-551可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；G-552可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；D-553可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-554可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-831可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；F-832可被替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；N-833可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-834可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；I-835可被替换为A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-836可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；T-837可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；F-838可被替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-839可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；A-840可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；W-841可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或Y；V-842可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；I-843可被替换为A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；E-844可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；E-845可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，T，V，W或Y；W-846可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；G-847可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；E-848可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；C-849可被替换为A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-850可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V， W或Y；K-851可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-885可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；P-886可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；C-887可被替换为A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-888可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；D-889可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；H-890可被替换为A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-891可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；C-892可被替换为A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-893可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；Q-894可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；W-895可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；Q-896可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；L-897可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-898可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；E-899可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；W-900可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；S-901可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；S-902可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或T；C-903可被替换为A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-904可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；和/或K-905可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y。
此外，在METH2中可用如下氨基酸进行下列氨基酸替换：L-14可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-15可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-16可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-17可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-18可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-19可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-20可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-21可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-22可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-23可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；L-24可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-25可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-26可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；G-27可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-28可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-29可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；A-30可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-31可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；P-32可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；A-33可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-34可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-204可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；P-205可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；L-206可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-207可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-208可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；T-209可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；S-210可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；R-211可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；T-212可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；K-213可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-214可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；F-215可被替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；V-216可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；S-217可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；E-218可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-219可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-220可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V， W或Y；F-221可被替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；V-222可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；E-223可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；T-224可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；P-430可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；G-431可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-432可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-433可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-434可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-435可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；L-436可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-437可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；T-438可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W或Y；G-439可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-440可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-441可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；G-442可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-443可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；M-444可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-445可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-446可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；Y-447可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；Q-448可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；L-449可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；D-450可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；E-520可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；R-521可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；P-522可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；K-523可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-524可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；V-525可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；V-526可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；D-527可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-528可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-529可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；W-530可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；A-531可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-532可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；W-533可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；G-534可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；P-535可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；W-536可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或Y；G-537可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；E-538可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；C-539可被替换为A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-540可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；N-827可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；I-828可被替换为A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；I-829可被替换为A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；Q-830可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；P-831可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；L-832可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；L-833可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；H-834可被替换为A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；A-835可被替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；Q-836可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；W-837可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；V-838可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；L-839可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；G-840可被替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；D-841可被替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；W-842可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或Y；  S-843可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；E-844可被替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；C-845可被替换为A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；S-846可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；和/或S-847可被替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y。
METH1和/或METH2多肽变体包括替换、缺失和/或添加变体，其含有氨基酸替换，可利用此处所述的任意方式检测其活性，例如尿囊绒膜分析或角膜袋分析。优选的是具有保守性替换的METH1和/或METH2多肽：保持全部野生型蛋白质活性和/或性质的；或具有一种或多种与野生型蛋白质相比增强的活性和/或性质的。也优选具有非保守性替换的METH1和/或METH2多肽：缺乏全部野生型蛋白质活性和/或性质的而保持其他所有活性和/或性质；或缺乏一种或多种与野生型蛋白质相比增强的活性和/或性质的。
例如，可被在METH1和/或METH2多肽中利用保守或非保守替换的METH1和/或METH2的活性或性质包括但不限于：刺激血管生成；刺激表皮细胞增殖；抗体结合；配体结合；稳定性；溶解性；和/或影响纯化的性质。
优选以分离形式提供本发明多肽。“分离多肽”指脱离其天然环境的多肽。因此，为了本发明的目的，重组宿主细胞中产生和/或包含的多肽被视作是分离的。“分离多肽”还指已自重组宿主细胞或天然来源部分或基本上纯化的多肽。例如，用Smith和Johnson，基因67：31-40(1988)中所述的一步方法可基本纯化重组产生的METH1或METH2多肽。
本发明多肽包括由含前导序列之保藏cDNA编码的METH1多肽；由不含前导序列之保藏cDNA编码的成熟METH1多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ ID NO：2中约第1-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第2-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第29-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基酸的多肽；含METH1金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸的多肽；含METH1去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸的多肽；含METH1第一TSP样结构域，SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸的多肽；含METH1第二TSP样结构域，SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸的多肽；含METH1第三TSP样结构域，SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第549-563位氨基酸的多肽；由含前导序列之保藏cDNA编码的METH2多肽；由不含前导序列之保藏cDNA编码的成熟METH2多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ ID NO：4中约第1-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第2-890位氨基酸的多肽；含SEQID NO：4中约第24-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸的多肽；含METH2金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸的多肽；含METH2去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸的多肽；含METH2第一TSP样结构域，SEQ IDNO：4中第530-583位氨基酸的多肽；含METH2第二TSP样结构域，SEQID NO：4中第837-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中第529-548位氨基酸的多肽；以及与上述多肽至少80％相同，更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，并且包含这些多肽的至少30个氨基酸、更优选至少50个氨基酸的部分的多肽。
具有与METH1或METH2多肽的参照氨基酸序列有至少例如95％相同的氨基酸序列的多肽指该多肽的氨基酸序列除了与METH1或METH2多肽的参照氨基酸序列相比每100个氨基酸可包括最多5个氨基酸改变之外，其余与参照序列相同。换而言之，为了获得具有与参照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参照序列中最多5％的氨基酸可被缺失或用另外的氨基酸取代，或数目最多为参照序列总氨基酸残基数5％的氨基酸可插入参照序列中。参照序列的这些改变可发生于参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置间的任何位置，它们或者各自散布于参照序列的残基中，或者以一个或多个连续组的形式存在于参照序列中。
事实上，例如，任何特殊多肽分子是否与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列或由保藏cDNA克隆所编码的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％或99％相同可用已知的诸如Bestfit软件(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)之类计算机软件常规地确定。当用Bestfit或任何其它序列对比软件确定一特殊序列是否按本发明与参照序列例如95％相同时，参数当然设置成针对参照氨基酸序列全长计算相同性百分比，且允许有高达参照序列总氨基酸残基数5％的同源性缺口。
确定待查序列(query sequence)(本发明序列)和指示序列(subjectsequence)间最佳完全匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于Brutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，待查序列和指示序列均为核苷酸序列或均为氨基酸序列。所说综合序列对比的结果表示为相同性百分比。在氨基酸序列的FASTDB对比中用于计算相同性百分比的优选参数为：矩阵＝PAM 0，k-tuple＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化分组长度＝0，截断分＝1，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或指示氨基酸序列长度(取较短者)。
若指示序列由于N-或C-端缺失，不是由于内部缺失而比待查序列短，必须对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软件不考虑指示序列的N-和C-端截短。对于相对待查序列而言在N-和C-端截短的指示序列，通过计算待查序列中位于指示序列N-和C-端的不相配/匹配的残基数作为待查序列总残基的百分数，矫正相同性百分比。残基是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的相同性百分比值。此最终的相同性百分比值是用于本发明目的的。人工调整相同性百分比值时，只计算与待查序列不相配/匹配的、在指示序列N-和C-端外的残基。即，只考虑指示序列N-和C-最末端残基外的待查残基位置。
例如，将90个氨基酸残基长的指示序列与100个残基长的待查序列排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列N-端，FASTDB序列对比不显示N-端头10个碱基的相配/匹配。这10个未配对残基代表了序列的10％(不匹配的N-和C-端残基数/待查序列的总残基数)，因此从FASTDB软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个残基完全匹配，则最终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个残基长的指示序列与100个残基长的待查序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的N-和C-端无与待查序列不相配/匹配的残基。这种情况下，用FASTDB计算的相同性百分比不用人为的修正。再者，正如在FASTDB序列对比中所展示的，只有与待查序列不相配/匹配的位于指示序列N-和C-末端的残基位置需人为修正。为了本发明的目的不进行其它的人工修正。
通过本领域技术熟练人员众所周知的方法可以将本发明多肽用作SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤中的分子量标准。
另一方面，本发明提供含本发明多肽之带表位部分的肽或多肽。此多肽的表位部分是本文所述多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”定义为当整个蛋白质作为免疫原时会引起抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可结合的蛋白质分子区定义为“抗原性表位”。蛋白质免疫原性表位数通常少于抗原性表位数。参阅，例如，Geysen等，美国国家科学院院报81：3998-4002(1983)。
至于带抗原性表位的肽或多肽(即，含抗体可结合的蛋白质分子区)的选择，在本领域中众所周知，模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽通常能引发与部分模拟蛋白质可反应的抗血清。参阅，例如，Sutclifie，J.G.等，“与蛋白质中特定位点反应的抗体(Antibodies that react withpredetermined sites on proteins)”，科学219：660-666(1983)。能引起蛋白质反应性血清的肽经常用蛋白质的一级序列表示，它们可用一套简单的化学规则鉴定，既不限制在完整蛋白质的免疫显性区(即，免疫原性表位)，也不限制在氨基或羧基末端。
因此，本发明之带抗原性表位的肽和多肽可用于产生与本发明多肽可特异结合的抗体，包括单克隆抗体。参阅，例如，Wilson等，细胞37：767-778(1984)的第777页。
本发明之带抗原性表位的肽和多肽优选包含本发明多肽氨基酸序列中至少7个，更优选至少9个及更优选至少约15-30个氨基酸的序列。
本发明之带表位的肽和多肽可用任何常规方法产生。Houghten，R.A.，“肽的大量快速固相合成通用方法：在单个氨基酸水平上的抗原-抗体相互作用特异性”，美国国家科学院院报82：5131-5135(1985)。此“同时多种肽合成(SMPS)”的方法进一步描述于Houghten等的美国专利号4631211(1986)中。
本领域技术熟练人员应当理解，上述本发明的METH1或METH2多肽及其带表位片段可与免疫球蛋白(IgG)的恒定结构域部分结合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白质可方便纯化并且体内半寿期延长。这点已在如由人CD4多肽头两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白质中得到证实(EPA394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988))。在结合和中和其他分子方面，由于IgG部分而具二硫键连接之二聚体结构的融合蛋白比仅有单体METH1或METH2蛋白质或蛋白质片段更有效(Fountoulakis等，生化杂志(J.Biochem.)270：3958-3964(1995))。
METH1和METH2多核苷酸和多肽片段
在本发明中，“多核苷酸片段”指具保藏克隆中所含或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的短多核苷酸。该短核苷酸片段优选至少约15nt，更优选至少约20nt，还更优选至少约30nt，更优选至少约40nt的长度。例如，“长度至少为20nt”的片段表示包括来自保藏克隆中所含cDNA序列或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列的20个或更多个连续碱基。这些核苷酸片段可如本文所述用作诊断探针和引物。当然，更大的片段是优选的(例如，50、150、500、600、2000个核苷酸)。
此外，METH1或METH2多核苷酸片段的代表性例子包括，例如，具SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中核苷酸数约第1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、551-600、651-700、701-750、751-800、800-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300、1301-1350、1351-1400、1401-1450、1451-1500、1501-1550、1551-1600、1601-1650、1651-1700、1701-1750、1751-1800、1801-1850、1851-1900、1901-1950、1951-2000或2001-结尾，或者保藏克隆中所含cDNA之序列的片段。在此上下文中“大约”包括了在任一端或两端更多或更少几个核苷酸(5、4、3、2或1)的特别列举范围。优选这些片段编码具生物活性的多肽。更优选这些多核苷酸可如文所述用作探针或引物。
在本发明中，“多肽片段”指具保藏克隆中所含cDNA编码的或者SEQID NO：2或SEQ ID NO：4中所含的短氨基酸序列。蛋白质片段可以是“独立的”或包含于较大多肽内形成其中一部分或一个区域，最优选作为单个连续区存在于其中。本发明多肽片段的典型例子包括，例如，来自SEQID NO：2或SEQ ID NO：4编码区约第1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、102-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280或281-结尾氨基酸的片段。此外，多肽片段可为约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸长。在此上下文中“大约”包括了特别列举范围，在其任一端或两端值更多或更少几个氨基酸(5、4、3、2或1)的范围。
优选的多肽片段包括被分泌的METH1或METH2蛋白质及其成熟形式。更优选的多肽片段包括从氨基或羧基末端或两端具连续缺失残基的被分泌METH1或METH2蛋白质及其成熟形式。例如，可从分泌METH1或METH2多肽或其成熟形式的氨基端缺失1-60个范围内的任何数目氨基酸。类似地，可从分泌METH1或METH2蛋白质或其成熟形式的羧基端缺失1-30个范围内的任何数目氨基酸。而且，优选上述氨基或羧基末端缺失的任何组合。同样地，也优选编码这些METH1或METH2多肽片段的核苷酸片段。
尤其是，METH1多肽的N-端缺失体可用通式m-950描述，其中m是2-949的整数，其中m相应于SEQ ID NO：2中所定的氨基酸残基位置。优选如SEQ ID NO：2所示之本发明METH1多肽的N-端缺失体包括含如下氨基酸残基序列的多肽：SEQ ID NO：2的G-2至S-950；N-3至S-950；A-4至S-950；E-5至S-950；R-6至S-950；A-7至S-950；P-8至S-950；G-9至S-950；S-10至S-950；R-11至S-950；S-12至S-950；F-13至S-950；G-14至S-950；P-15至S-950；V-16至S-950；P-17至S-950；T-18至S-950；L-19至S-950；L-20至S-950；L-21至S-950；L-22至S-950；A-23至S-950；A-24至S-950；A-25至S-950；L-26至S-950；L-27至S-950；A-28至S-950；V-29至S-950；S-30至S-950；D-31至S-950；A-32至S-950；L-33至S-950；G-34至S-950；R-35至S-950；P-36至S-950；S-37至S-950；E-38至S-950；E-39至S-950；D-40至S-950；E-41至S-950；E-42至S-950；L-43至S-950；V-44至S-950；V-45至S-950；P-46至S-950；E-47至S-950；L-48至S-950；E-49至S-950；R-50至S-950；A-51至S-950；P-52至S-950；G-53至S-950；H-54至S-950；G-55至S-950；T-56至S-950；T-57至S-950；R-58至S-950；L-59至S-950；R-60至S-950；L-61至S-950；H-62至S-950；A-63至S-950；F-64至S-950；D-65至S-950；Q-66至S-950；Q-67至S-950；L-68至S-950；D-69至S-950；L-70至S-950；E-71至S-950；L-72至S-950；R-73至S-950；P-74至S-950；D-75至S-950；S-76至S-950；S-77至S-950；F-78至S-950；L-79至S-950；A-80至S-950；P-81至S-950；G-82至S-950；F-83至S-950；T-84至S-950；L-85至S-950；Q-86至S-950；N-87至S-950；V-88至S-950；G-89至S-950；R-90至S-950；K-91至S-950；S-92至S-950；G-93至S-950；S-94至S-950；E-95至S-950；T-96至S-950；P-97至S-950；L-98至S-950；P-99至S-950；E-100至S-950；T-101至S-950；D-102至S-950；L-103至S-950；A-104至S-950；H-105至S-950；C-106至S-950；F-107至S-950；Y-108至S-950；S-109至S-950；G-110至S-950；T-111至S-950；V-112至S-950；N-113至S-950；G-11 4至S-950；D-115至S-950；P-116至S-950；S-117至S-950；S-118至S-950；A-119至S-950；A-120至S-950；A-121至S-950；L-122至S-950；S-123至S-950；L-124至S-950；C-125至S-950；E-126至S-950；G-127至S-950；V-128至S-950；R-129至S-950；G-130至S-950；A-131至S-950；F-132至S-950；Y-133至S-950；L-134至S-950；L-135至S-950；G-136至S-950；E-137至S-950；A-138至S-950；Y-139至S-950；F-140至S-950；I-141至S-950；Q-142至S-950；P-143至S-950；L-144至S-950；P-145至S-950；A-146至S-950；A-147至S-950；S-148至S-950；E-149至S-950；R-150至S-950；L-151至S-950；A-152至S-950；T-153至S-950；A-154至S-950；A-155至S-950；P-156至S-950；G-157至S-950；E-158至S-950；K-159至S-950；P-160至S-950；P-161至S-950；A-162至S-950；P-163至S-950；L-164至S-950；Q-165至S-950；F-166至S-950；H-167至S-950；L-168至S-950；L-169至S-950；R-170至S-950；R-171至S-950；N-172至S-950；R-173至S-950；Q-174至S-950；G-175至S-950；D-176至S-950；V-177至S-950；G-178至S-950；G-179至S-950；T-180至S-950；C-181至S-950；G-182至S-950；V-183至S-950；V-184至S-950；D-185至S-950；D-186至S-950；E-187至S-950；P-188至S-950；R-189至S-950；P-190至S-950；T-191至S-950；G-192至S-950；K-193至S-950；A-194至S-950；E-195至S-950；T-196至S-950；E-197至S-950；D-198至S-950；E-199至S-950；D-200至S-950；E-201至S-950；G-202至S-950；T-203至S-950；E-204至S-950；G-205至S-950；E-206至S-950；D-207至S-950；E-208至S-950；G-209至S-950；P-210至S-950；Q-211至S-950；W-212至S-950；S-213至S-950；P-214至S-950；Q-215至S-950；D-216至S-950；P-217至S-950；A-218至S-950；L-219至S-950；Q-220至S-950；G-221至S-950；V-222至S-950；G-223至S-950；Q-224至S-950；P-225至S-950；T-226至S-950；G-227至S-950；T-228至S-950；G-229至S-950；S-230至S-950；I-231至S-950；R-232至S-950；K-233至S-950；K-234至S-950；R-235至S-950；F-236至S-950；V-237至S-950；S-238至S-950；S-239至S-950；H-240至S-950；R-241至S-950；Y-242至S-950；V-243至S-950；E-244至S-950；T-245至S-950；M-246至S-950；L-247至S-950；V-248至S-950；A-249至S-950；D-250至S-950；Q-251至S-950；S-252至S-950；M-253至S-950；A-254至S-950；E-255至S-950；F-256至S-950；H-257至S-950；G-258至S-950；S-259至S-950；G-260至S-950；L-261至S-950；K-262至S-950；H-263至S-950；Y-264至S-950；L-265至S-950；L-266至S-950；T-267至S-950；L-268至S-950；F-269至S-950；S-270至S-950；V-271至S-950；A-272至S-950；A-273至S-950；R-274至S-950；L-275至S-950；Y-276至S-950；K-277至S-950；H-278至S-950；P-279至S-950；S-280至S-950；I-281至S-950；R-282至S-950；N-283至S-950；S-284至S-950；V-285至S-950；S-286至S-950；L-287至S-950；V-288至S-950；V-289至S-950；V-290至S-950；K-291至S-950；I-292至S-950；L-293至S-950；V-294至S-950；I-295至S-950；H-296至S-950；D-297至S-950；E-298至S-950；Q-299至S-950；K-300至S-950；G-301至S-950；P-302至S-950；E-303至S-950；V-304至S-950；T-305至S-950；S-306至S-950；N-307至S-950；A-308至S-950；A-309至S-950；L-310至S-950；T-311至S-950；L-312至S-950；R-313至S-950；N-314至S-950；F-315至S-950；C-316至S-950；N-317至S-950；W-318至S-950；Q-319至S-950；K-320至S-950；Q-321至S-950；H-322至S-950；N-323至S-950；P-324至S-950；P-325至S-950；S-326至S-950；D-327至S-950；R-328至S-950；D-329至S-950；A-330至S-950；E-331至S-950；H-332至S-950；Y-333至S-950；D-334至S-950；T-335至S-950；A-336至S-950；I-337至S-950；L-338至S-950；F-339至S-950；T-340至S-950；R-341至S-950；Q-342至S-950；D-343至S-950；L-344至S-950；C-345至S-950；G-346至S-950；S-347至S-950；Q-348至S-950；T-349至S-950；C-350至S-950；D-351至S-950；T-352至S-950；L-353至S-950；G-354至S-950；M-355至S-950；A-356至S-950；D-357至S-950；V-358至S-950；G-359至S-950；T-360至S-950；V-361至S-950；C-362至S-950；D-363至S-950；P-364至S-950；S-365至S-950；R-366至S-950；S-367至S-950；C-368至S-950；S-369至S-950；V-370至S-950；I-371至S-950；E-372至S-950；D-373至S-950；D-374至S-950；G-375至S-950；L-376至S-950；Q-377至S-950；A-378至S-950；A-379至S-950；F-380至S-950；T-381至S-950；T-382至S-950；A-383至S-950；H-384至S-950；E-385至S-950；L-386至S-950；G-387至S-950；H-388至S-950；V-389至S-950；F-390至S-950；N-391至S-950；M-392至S-950；P-393至S-950；H-394至S-950；D-395至S-950；D-396至S-950；A-397至S-950；K-398至S-950；Q-399至S-950；C-400至S-950；A-401至S-950；S-402至S-950；L-403至S-950；N-404至S-950；G-405至S-950；V-406至S-950；N-407至S-950；Q-408至S-950；D-409至S-950；S-410至S-950；H-411至S-950；M-412至S-950；M-413至S-950；A-414至S-950；S-415至S-950；M-4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此外，METH1的C-末端缺失也可用通式1-n1表示，其中，n1是2-950的整数，其中n相应于在SEQ ID NO：2中鉴定的氨基酸残基的位置。优选地，如SEQ ID NQ：2所示的本发明METH1多肽C-端缺失包括含有如下残基的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2的M-1至C-949；M-1至E-948；M-1至A-947；M-1至M-946；M-1至T-945；M-1至C-944；M-1至F-943；M-1至D-942；M-1至I-941；M-1至F-940；M-1至H-939；M-1至K-938；M-1至P-937；M-1至K-936；M-1至K-935；M-1至L-934；M-1至P-933；M-1至D-932；M-1至C-931；M-1至S-930；M-1至E-929；M-1至H-928；M-1至S-927；M-1至L-926；M-1至V-925；M-1至G-924；M-1至G-923；M-1至D-922；M-1至H-921；M-1至S-920；M-1至L-919；M-1至C-918；M-1至K-917；M-1至L-916；M-1至S-915；M-1至R-914；M-1至K-913；M-1至K-912；M-1至Y-911；M-1至G-910；M-1至K-909；M-1至G-908；M-1至C-907；M-1至T-906；M-1至K-905；M-1至S-904；M-1至C-903；M-1至S-902；M-1至S-901；M-1至W-900；M-1至E-899；M-1至G-898；M-1至L-897；M-1至Q-896；M-1至W-895；M-1至Q-894；M-1至P-893；M-1至C-892；M-1至P-891；M-1至H-890；M-1至D-889；M-1至A-888；M-1至C-887；M-1至P-886；M-1至R-885；M-1至T-884；M-1至S-883；M-1至A-882；M-1至P-881；M-1至K-880；M-1至V-879；M-1至E-878；M-1至K-877；M-1至A-876；M-1至C-875；M-1至E-874；M-1至S-873；M-1至A-872；M-1至P-871；M-1至Q-870；M-1至G-869；M-1至N-868；M-1至I-867；M-1至D-866；M-1至R-865；M-1至C-864；M-1至E-863；M-1至V-862；M-1至L-861；M-1至R-860；M-1至R-859；M-1至Q-858；M-1至W-857；M-1至G-856；M-1至L-855；M-1至E-854；M-1至C-853；M-1至S-852；M-1至K-851；M-1至S-850；M-1至C-849；M-1至E-848；M-1至G-847；M-1至W-846；M-1至E-845；M-1至E-844；M-1至I-843；M-1至V-842；M-1至W-841；M-1至A-840；M-1至S-839；M-1至F-838；M-1至T-837；M-1至P-836；M-1至I-835；M-1至A-834；M-1至N-833；M-1至F-832；M-1至S-831；M-1至E-830；M-1至K-829；M-1至K-828；M-1至K-827；M-1至K-826；M-1至V-825；M-1至F-824；M-1至Y-823；M-1至T-822；M-1至Y-821；M-1至K-820；M-1至I-819；M-1至K-818；M-1至P-817；M-1至R-816；M-1至L-815；M-1至A-814；M-1至N-813；M-1至G-812；M-1至V-811；M-1至T-810；M-1至L-809；M-1至V-808；M-1至Q-807；M-1至I-806；M-1至T-805；M-1至L-804；M-1至P-803；M-1至E-802；M-1至K-801；M-1至L-800；M-1至P-799；M-1至S-798；M-1至F-797；M-1至S-796；M-1至R-795；M-1至I-794；M-1至R-793；M-1至E-792；M-1至L-791；M-1至A-790；M-1至A-789；M-1至S-788；M-1至S-787；M-1至G-786；M-1至S-785；M-1至Y-784；M-1至R-783；M-1至L-782；M-1至V-781；M-1至V-780；M-1至G-779；M-1至K-778；M-1至Y-777；M-1至M-776；M-1至I-775；M-1至D-774；M-1至Q-773；M-1至E-772；M-1至L-771；M-1至T-770；M-1至S-769；M-1至L-768；M-1至T-767；M-1至Y-766；M-1至D-765；M-1至G-764；M-1至N-763；M-1至L-762；M-1至I-761；M-1至Y-760；M-1至T-759；M-1至G-758；M-1至D-757；M-1至A-756；M-1至A-755；M-1至K-754；M-1至I-753；M-1至A-752；M-1至L-751；M-1至F-750；M-1至S-749；M-1至G-748；M-1至N-747；M-1至N-746；M-1至R-745；M-1至S-744；M-1至G-743；M-1至R-742；M-1至Q-741；M-1至N-740；M-1至R-739；M-1至Q-738；M-1至K-737；M-1至V-736；M-1至E-735；M-1至I-734；M-1至N-733；M-1至T-732；M-1至A-731；M-1至G-730；M-1至T-729；M-1至P-728；M-1至I-727；M-1至T-726；M-1至I-725；M-1至I-724；M-1至D-723；M-1至H-722；M-1至Y-721；M-1至G-720；M-1至P-719；M-1至K-718；M-1至A-717；M-1至S-716；M-1至T-715；M-1至V-714；M-1至S-713；M-1至G-712；M-1至S-711；M-1至I-710；M-1至K-709；M-1至K-708；M-1至C-707；M-1至T-706；M-1至S-705；M-1至G-704；M-1至N-703；M-1至G-702；M-1至G-701；M-1至C-700；M-1至V-699；M-1至G-698；M-1至C-697；M-1至K-696；M-1至D-695；M-1至F-694；M-1至K-693；M-1至K-692；M-1至K-691；M-1至S-690；M-1至D-689；M-1至I-688；M-1至I-687；M-1至R-686；M-1至D-685；M-1至C-684；M-1至G-683；M-1至A-682；M-1至K-681；M-1至V-680；M-1至C-679；M-1至Q-678；M-1至G-677；M-1至Q-676；M-1至V-675；M-1至C-674；M-1至V-673；M-1至S-672；M-1至T-671；M-1至S-670；M-1至D-669；M-1至P-668；M-1至S-667；M-1至C-666；M-1至P-665；M-1至T-664；M-1至G-663；M-1至D-662；M-1至V-661；M-1至V-660；M-1至K-659；M-1至P-658；M-1至Q-657；M-1至L-656；M-1至V-655；M-1至F-654；M-1至F-653；M-1至Y-652；M-1至G-651；M-1至I-650；M-1至G-649；M-1至K-648；M-1至A-647；M-1至Q-646；M-1至C-645；M-1至I-644；M-1至L-643；M-1至K-642；M-1至C-641；M-1至R-640；M-1至D-639；M-1至K-638；M-1至P-637；M-1至S-636；M-1至V-635；M-1至G-634；M-1至A-633；M-1至Y-632；M-1至K-631；M-1至P-630；M-1至I-629；M-1至W-628；M-1至E-627；M-1至V-626；M-1至A-625；M-1至P-624；M-1至G-623；M-1至S-622；M-1至G-621；M-1至F-620；M-1至S-619；M-1至A-618；M-1至K-617；M-1至S-616；M-1至F-615；M-1至E-614；M-1至N-613；M-1至H-612；M-1至A-611；M-1至E-610；M-1至C-609；M-1至Q-608；M-1至E-607；M-1至E-606；M-1至R-605；M-1至F-604；M-1至T-603；M-1至K-602；M-1至G-601；M-1至N-600；M-1至N-599；M-1至D-598；M-1至P-597；M-1至C-596；M-1至D-595；M-1至E-594；M-1至L-593；M-1至N-592；M-1至C-591；M-1至S-590；M-1至R-589；M-1至Y-588；M-1至R-587；M-1至V-586；M-1至R-585；M-1至K-584；M-1至G-583；M-1至E-582；M-1至C-581；M-1至Y-580；M-1至K-579；M-1至G-578；M-1至G-577；M-1至N-576；M-1至K-575；M-1至P-574；M-1至V-573；M-1至P-572；M-1至N-571；M-1至D-570；M-1至C-569；M-1至E-568；M-1至R-567；M-1至M-566；M-1至T-565；M-1至Y-564；M-1至Q-563；M-1至V-562；M-1至G-561；M-1至G-560；M-1至G-559；M-1至C-558；M-1至T-557；M-1至R-556；M-1至S-555；M-1至C-554；M-1至D-553；M-1至G-552；M-1至W-551；M-1至P-550；M-1至G-549；M-1至W-548；M-1至M-547；M-1至G-546；M-1至W-545；M-1至S-544；M-1至G-543；M-1至H-542；M-1至F-541；M-1至P-540；M-1至T-539；M-1至D-538；M-1至F-537；M-1至H-536；M-1至K-535；M-1至R-534；M-1至D-533；M-1至T-532；M-1至K-531；M-1至N-530；M-1至V-529；M-1至C-528；M-1至K-527；M-1至G-526；M-1至N-525；M-1至I-524；M-1至C-523；M-1至W-522；M-1至K-521；M-1至G-520；M-1至E-519；M-1至G-518；M-1至C-517；M-1至S-516；M-1至T-515；M-1至G-514；M-1至D-513；M-1至A-512；M-1至W-511；M-1至P-510；M-1至F-509；M-1至H-508；M-1至K-507；M-1至T-506；M-1至Q-505；M-1至C-504；M-1至V-503；M-1至L-502；M-1至V-501；M-1至G-500；M-1至G-499；M-1至S-498；M-1至T-497；M-1至G-496；M-1至T-495；M-1至C-494；M-1至W-493；M-1至L-492；M-1至T-491；M-1至S-490；M-1至C-489；M-1至T-488；M-1至S-487；M-1至A-486；M-1至A-485；M-1至D-484；M-1至P-483；M-1至C-482；M-1至H-481；M-1至K-480；M-1至S-479；M-1至D-478；M-1至E-477；M-1至G-476；M-1至F-475；M-1至T-474；M-1至F-473；M-1至Q-472；M-1至C-471；M-1至Q-470；M-1至R-469；M-1至N-468；M-1至A-467；M-1至D-466；M-1至Y-465；M-1至S-464；M-1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类似地，如SEQ ID NO：2所示的本发明多肽的C-末端缺失包括含有如下残基的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2的F-236至S-950；F-236至C-949；F-236至E-948；F-236至A-947；F-236至M-946；F-236至T-945；F-236至C-944；F-236至F-943；F-236至D-942；F-236至I-94 1；F-236至F-940；F-236至H-939；F-236至K-938；F-236至P-937；F-236至K-936；F-236至K-935；F-236至L-934；F-236至P-933；F-236至D-932；F-236至C-931；F-236至S-930；F-236至E-929；F-236至H-928；F-236至S-927；F-236至L-926；F-236至V-925；F-236至G-924；F-236至G-923；F-236至D-922；F-236至H-921；F-236至S-920；F-236至L-919；F-236至C-918；F-236至K-917；F-236至L-916；F-236至S-915；F-236至R-914；F-236至K-913；F-236至K-912；F-236至Y-911；F-236至G-910；F-236至K-909；F-236至G-908；F-236至C-907；F-236至T-906；F-236至K-905；F-236至S-904；F-236至C-903；F-236至S-902；F-236至S-901；F-236至W-900；F-236至E-899；F-236至G-898；F-236至L-897；F-236至Q-896；F-236至W-895；F-236至Q-894；F-236至P-893；F-236至C-892；F-236至P-891；F-236至H-890；F-236至D-889；F-236至A-888；F-236至C-887；F-236至P-886；F-236至R-885；F-236至T-884；F-236至S-883；F-236至A-882；F-236至P-881；F-236至K-880；F-236至V-879；F-236至E-878；F-236至K-877；F-236至A-876；F-236至C-875；F-236至E-874；F-236至S-873；F-236至A-872；F-236至P-871；F-236至Q-870；F-236至G-869；F-236至N-868；F-236至I-867；F-236至D-866；F-236至R-865；F-236至C-864；F-236至E-863；F-236至V-862；F-236至L-861；F-236至R-860；F-236至R-859；F-236至Q-858；F-236至W-857；F-236至G-856；F-236至L-855；F-236至E-854；F-236至C-853；F-236至S-852；F-236至K-851；F-236至S-850；F-236至C-849；F-236至E-848；F-236至G-847；F-236至W-846；F-236至E-845；F-236至E-844；F-236至I-843；F-236至V-842；F-236至W-841；F-236至A-840；F-236至S-839；F-236至F-838；F-236至T-837；F-236至P-836；F-236至I-835；F-236至A-834；F-236至N-833；F-236至F-832；F-236至S-831；F-236至E-830；F-236至K-829；F-236至K-828；F-236至K-827；F-236至K-826；F-236至V-825；F-236至F-824；F-236至Y-823；F-236至T-822；F-236至Y-821；F-236至K-820；F-236至I-819；F-236至K-818；F-236至P-817；F-236至R-816；F-236至L-815；F-236至A-814；F-236至N-813；F-236至G-812；F-236至V-811；F-236至T-810；F-236至L-809；F-236至V-808；F-236至Q-807；F-236至I-806；F-236至T-805；F-236至L-804；F-236至P-803；F-236至E-802；F-236至K-801；F-236至L-800；F-236至P-799；F-236至S-798；F-236至F-797；F-236至S-796；F-236至R-795；F-236至I-794；F-236至R-793；F-236至E-792；F-236至L-791；F-236至A-790；F-236至A-789；F-236至S-788；F-236至S-787；F-236至G-786；F-236至S-785；F-236至Y-784；F-236至R-783；F-236至L-782；F-236至V-781；F-236至V-780；F-236至G-779；F-236至K-778；F-236至Y-777；F-236至M-776；F-236至I-775；F-236至D-774；F-236至Q-773；F-236至E-772；F-236至L-771；F-236至T-770；F-236至S-769；F-236至L-768；F-236至T-767；F-236至Y-766；F-236至D-765；F-236至G-764；F-236至N-763；F-236至L-762；F-236至I-761；F-236至Y-760；F-236至T-759；F-236至G-758；F-236至D-757；F-236至A-756；F-236至A-755；F-236至K-754；F-236至I-753；F-236至A-752；F-236至L-751；F-236至F-750；F-236至S-749；F-236至G-748；F-236至N-747；F-236至N-746；F-236至R-745；F-236至S-744；F-236至G-743；F-236至R-742；F-236至Q-741；F-236至N-740；F-236至R-739；F-236至Q-738；F-236至K-737；F-236至V-736；F-236至E-735；F-236至I-734；F-236至N-733；F-236至T-732；F-236至A-731；F-236至G-730；F-236至T-729；F-236至P-728；F-236至I-727；F-236至T-726；F-236至I-725；F-236至I-724；F-236至D-723；F-236至H-722；F-236至Y-721；F-236至G-720；F-236至P-719；F-236至K-718；F-236至A-717；F-236至S-716；F-236至T-715；F-236至V-714；F-236至S-713；F-236至G-712；F-236至S-711；F-236至I-710；F-236至K-709；F-236至K-708；F-236至C-707；F-236至T-706；F-236至S-705；F-236至G-704；F-236至N-703；F-236至G-702；F-236至G-701；F-236至C-700；F-236至V-699；F-236至G-698；F-236至C-697；F-236至K-696；F-236至D-695；F-236至F-694；F-236至K-693；F-236至K-692；F-236至K-691；F-236至S-690；F-236至D-689；F-236至I-688；F-236至I-687；F-236至R-686；F-236至D-685；F-236至C-684；F-236至G-683；F-236至A-682；F-236至K-681；F-236至V-680；F-236至C-679；F-236至Q-678；F-236至G-677；F-236至Q-676；F-236至V-675；F-236至C-674；F-236至V-673；F-236至S-672；F-236至T-671；F-236至S-670；F-236至D-669；F-236至P-668；F-236至S-667；F-236至C-666；F-236至P-665；F-236至T-664；F-236至G-663；F-236至D-662；F-236至V-661；F-236至V-660；F-236至K-659；F-236至P-658；F-236至Q-657；F-236至L-656；F-236至V-655；F-236至F-654；F-236至F-653；F-236至Y-652；F-236至G-651；F-236至I-650；F-236至G-649；F-236至K-648；F-236至A-647；F-236至Q-646；F-236至C-645；F-236至I-644；F-236至L-643；F-236至K-642；F-236至C-641；F-236至R-640；F-236至D-639；F-236至K-638；F-236至P-637；F-236至S-636；F-236至V-635；F-236至G-634；F-236至A-633；F-236至Y-632；F-236至K-631；F-236至P-630；F-236至I-629；F-236至W-628；F-236至E-627；F-236至V-626；F-236至A-625；F-236至P-624；F-236至G-623；F-236至S-622；F-236至G-621；F-236至F-620；F-236至S-619；F-236至A-618；F-236至K-617；F-236至S-616；F-236至F-615；F-236至E-614；F-236至N-613；F-236至H-612；F-236至A-611；F-236至E-610；F-236至C-609；F-236至Q-608；F-236至E-607；F-236至E-606；F-236至R-605；F-236至F-604；F-236至T-603；F-236至K-602；F-236至G-601；F-236至N-600；F-236至N-599；F-236至D-598；F-236至P-597；F-236至C-596；F-236至D-595；F-236至E-594；F-236至L-593；F-236至N-592；F-236至C-591；F-236至S-590；F-236至R-589；F-236至Y-588；F-236至R-587；F-236至V-586；F-236至R-585；F-236至K-584；F-236至G-583；F-236至E-582；F-236至C-581；F-236至Y-580；F-236至K-579；F-236至G-578；F-236至G-577；F-236至N-576；F-236至K-575；F-236至P-574；F-236至V-573；F-236至P-572；F-236至N-571；F-236至D-570；F-236至C-569；F-236至E-568；F-236至R-567；F-236至M-566；F-236至T-565；F-236至Y-564；F-236至Q-563；F-236至V-562；F-236至G-561；F-236至G-560；F-236至G-559；F-236至C-558；F-236至T-557；F-236至R-556；F-236至S-555；F-236至C-554；F-236至D-553；F-236至G-552；F-236至W-551；F-236至P-550；F-236至G-549；F-236至W-548；F-236至M-547；F-236至G-546；F-236至W-545；F-236至S-544；F-236至G-543；F-236至H-542；F-236至F-541；F-236至P-540；F-236至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类似地，如SEQ ID NO；2所示的本发明多肽的C-末端缺失包括含有如下残基的氨基酸序列的多肽；SEQ ID NO；2的L-33至S-950；L-33至C-949；L-33至E-948；L-33至A-947；L-33至M-946；L-33至T-945；L-33至C-944；L-33至F-943；L-33至D-942；L-33至I-941；L-33至F-940；L-33至H-939；L-33至K-938；L-33至P-937；L-33至K-936；L-33至K-935；L-33至L-934；L-33至P-933；L-33至D-932；L-33至C-931；L-33至S-930；L-33至E-929；L-33至H-928；L-33至S-927；L-33至L-926；L-33至V-925；L-33至G-924；L-33至G-923；L-33至D-922；L-33至H-92 1；L-33至S-920；L-33至L-919；L-33至C-918；L-33至K-917；L-33至L-916；L-33至S-915；L-33至R-914；L-33至K-913；L-33至K-912；L-33至Y-911；L-33至G-910；L-33至K-909；L-33至G-908；L-33至C-907；L-33至T-906；L-33至K-905；L-33至S-904；L-33至C-903；L-33至S-902；L-33至S-901；L-33至W-900；L-33至E-899；L-33至G-898；L-33至L-897；L-33至Q-896；L-33至W-895；L-33至Q-894；L-33至P-893；L-33至C-892；L-33至P-891；L-33至H-890；L-33至D-889；L-33至A-888；L-33至C-887；L-33至P-886；L-33至R-885；L-33至T-884；L-33至S-883；L-33至A-882；L-33至P-881；L-33至K-880；L-33至V-879；L-33至E-878；L-33至K-877；L-33至A-876；L-33至C-875；L-33至E-874；L-33至S-873；L-33至A-872；L-33至P-871；L-33至Q-870；L-33至G-869；L-33至N-868；L-33至I-867；L-33至D-866；L-33至R-865；L-33至C-864；L-33至E-863；L-33至V-862；L-33至L-861；L-33至R-860；L-33至R-859；L-33至Q-858；L-33至W-857；L-33至G-856；L-33至L-855；L-33至E-854；L-33至C-853；L-33至S-852；L-33至K-851；L-33至S-850；L-33至C-849；L-33至E-848；L-33至G-847；L-33至W-846；L-33至E-845；L-33至E-844；L-33至I-843；L-33至V-842；L-33至W-841；L-33至A-840；L-33至S-839；L-33至F-838；L-33至T-837；L-33至P-836；L-33至I-835；L-33至A-834；L-33至N-833；L-33至F-832；L-33至S-831；L-33至E-830；L-33至K-829；L-33至K-828；L-33至K-827；L-33至K-826；L-33至V-825；L-33至F-824；L-33至Y-823；L-33至T-822；L-33至Y-821；L-33至K-820；L-33至I-819；L-33至K-818；L-33至P-817；L-33至R-816；L-33至L-815；L-33至A-814；L-33至N-813；L-33至G-812；L-33至V-811；L-33至T-810；L-33至L-809；L-33至V-808；L-33至Q-807；L-33至I-806；L-33至T-805；L-33至L-804；L-33至P-803；L-33至E-802；L-33至K-801；L-33至L-800；L-33至P-799；L-33至S-798；L-33至F-797；L-33至S-796；L-33至R-795；L-33至I-794；L-33至R-793；L-33至E-792；L-33至L-791；L-33至A-790；L-33至A-789；L-33至S-788；L-33至S-787；L-33至G-786；L-33至S-785；L-33至Y-784；L-33至R-783；L-33至L-782；L-33至V-781；L-33至V-780；L-33至G-779；L-33至K-778；L-33至Y-777；L-33至M-776；L-33至I-775；L-33至D-774；L-33至Q-773；L-33至E-772；L-33至L-771；L-33至T-770；L-33至S-769；L-33至L-768；L-33至T-767；L-33至Y-766；L-33至D-765；L-33至G-764；L-33至N-763；L-33至L-762；L-33至I-761；L-33至Y-760；L-33至T-759；L-33至G-758；L-33至D-757；L-33至A-756；L-33至A-755；L-33至K-754；L-33至I-753；L-33至A-752；L-33至L-751；L-33至F-750；L-33至S-749；L-33至G-748；L-33至N-747；L-33至N-746；L-33至R-745；L-33至S-744；L-33至G-743；L-33至R-742；L-33至Q-74 1；L-33至N-740；L-33至R-739；L-33至Q-738；L-33至K-737；L-33至V-736；L-33至E-735；L-33至I-734；L-33至N-733；L-33至T-732；L-33至A-731；L-33至G-730；L-33至T-729；L-33至P-728；L-33至I-727；L-33至T-726；L-33至I-725；L-33至I-724；L-33至D-723；L-33至H-722；L-33至Y-721；L-33至G-720；L-33至P-719；L-33至K-718；L-33至A-717；L-33至S-716；L-33至T-715；L-33至V-714；L-33至S-713；L-33至G-712；L-33至S-711；L-33至I-710；L-33至K-709；L-33至K-708；L-33至C-707；L-33至T-706；L-33至S-705；L-33至G-704；L-33至N-703；L-33至G-702；L-33至G-701；L-33至C-700；L-33至V-699；L-33至G-698；L-33至C-697；L-33至K-696；L-33至D-695；L-33至F-694；L-33至K-693；L-33至K-692；L-33至K-691；L-33至S-690；L-33至D-689；L-33至I-688；L-33至I-687；L-33至R-686；L-33至D-685；L-33至C-684；L-33至G-683；L-33至A-682；L-33至K-681；L-33至V-680；L-33至C-679；L-33至Q-678；L-33至G-677；L-33至Q-676；L-33至V-675；L-33至C-674；L-33至V-673；L-33至S-672；L-33至T-67 1；L-33至S-670；L-33至D-669；L-33至P-668；L-33至S-667；L-33至C-666；L-33至P-665；L-33至T-664；L-33至G-663；L-33至D-662；L-33至V-661；L-33至V-660；L-33至K-659；L-33至P-658；L-33至Q-657；L-33至L-656；L-33至V-655；L-33至F-654；L-33至F-653；L-33至Y-652；L-33至G-651；L-33至I-650；L-33至G-649；L-33至K-648；L-33至A-647；L-33至Q-646；L-33至C-645；L-33至I-644；L-33至L-643；L-33至K-642；L-33至C-641；L-33至R-640；L-33至D-639；L-33至K-638；L-33至P-637；L-33至S-636；L-33至V-635；L-33至G-634；L-33至A-633；L-33至Y-632；L-33至K-631；L-33至P-630；L-33至I-629；L-33至W-628；L-33至E-627；L-33至V-626；L-33至A-625；L-33至P-624；L-33至G-623；L-33至S-622；L-33至G-621；L-33至F-620；L-33至S-619；L-33至A-618；L-33至K-617；L-33至S-616；L-33至F-615；L-33至E-614；L-33至N-613；L-33至H-612；L-33至A-611；L-33至E-610；L-33至C-609；L-33至Q-608；L-33至E-607；L-33至E-606；L-33至R-605；L-33至F-604；L-33至T-603；L-33至K-602；L-33至G-601；L-33至N-600；L-33至N-599；L-33至D-598；L-33至P-597；L-33至C-596；L-33至D-595；L-33至E-594；L-33至L-593；L-33至N-592；L-33至C-591；L-33至S-590；L-33至R-589；L-33至Y-588；L-33至R-587；L-33至V-586；L-33至R-585；L-33至K-584；L-33至G-583；L-33至E-582；L-33至C-58 1；L-33至Y-580；L-33至K-579；L-33至G-578；L-33至G-577；L-33至N-576；L-33至K-575；L-33至P-574；L-33至V-573；L-33至P-572；L-33至N-571；L-33至D-570；L-33至C-569；L-33至E-568；L-33至R-567；L-33至M-566；L-33至T-565；L-33至Y-564；L-33至Q-563；L-33至V-562；L-33至G-561；L-33至G-560；L-33至G-559；L-33至C-558；L-33至T-557；L-33至R-556；L-33至S-555；L-33至C-554；L-33至D-553；L-33至G-552；L-33至W-551；L-33至P-550；L-33至G-549；L-33至W-548；L-33至M-547；L-33至G-546；L-33至W-545；L-33至S-544；L-33至G-543；L-33至H-542；L-33至F-541；L-33至P-540；L-33至T-539；L-33至D-538；L-33至F-537；L-33至H-536；L-33至K-535；L-33至R-534；L-33至D-533；L-33至T-532；L-33至K-531；L-33至N-530；L-33至V-529；L-33至C-528；L-33至K-527；L-33至G-526；L-33至N-525；L-33至I-524；L-33至C-523；L-33至W-522；L-33至K-521；L-33至G-520；L-33至E-519；L-33至G-518；L-33至C-517；L-33至S-516；L-33至T-515；L-33至G-514；L-33至D-513；L-33至A-512；L-33至W-511；L-33至P-510；L-33至F-509；L-33至H-508；L-33至K-507；L-33至T-506；L-33至Q-505；L-33至C-504；L-33至V-503；L-33至L-502；L-33至V-501；L-33至G-500；L-33至G-499；L-33至S-498；L-33至T-497；L-33至G-496；L-33至T-495；L-33至C-494；L-33至W-493；L-33至L-492；L-33至T-491；L-33至S-490；L-33至C-489；L-33至T-488；L-33至S-487；L-33至A-486；L-33至A-485；L-33至D-484；L-33至P-483；L-33至C-482；L-33至H-481；L-33至K-480；L-33至S-479；L-33至D-478；L-33至E-477；L-33至G-476；L-33至F-475；L-33至T-474；L-33至F-473；L-33至Q-472；L-33至C-471；L-33至Q-470；L-33至R-469；L-33至N-468；L-33至A-467；L-33至D-466；L-33至Y-465；L-33至S-464；L-33至T-463；L-33至G-462；L-33至P-461；L-33至L-460；L-33至D-459；L-33至G-458；L-33至P-457；L-33至L-456；L-33至Q-455；L-33至I-454；L-33至P-453；L-33至N-452；L-33至Q-451；L-33至P-450；L-33至K-449；L-33至D-448；L-33至M-447；L-33至L-446；L-33至C-445；L-33至E-444；L-33至G-443；L-33至H-442；L-33至G-441；L-33至N-440；L-33至D-439；L-33至L-438；L-33至F-437；L-33至S-436；L-33至T-435；L-33至I-434；L-33至M-433；L-33至Y-432；L-33至A-431；L-33至S-430；L-33至C-429；L-33至P-428；L-33至S-427；L-33至W-426；L-33至P-425；L-33至Q-424；L-33至S-423；L-33至H-422；L-33至D-421；L-33至L-420；L-33至N-419；L-33至S-418；L-33至L-417；L-33至M-416；L-33至S-415；L-33至A-414；L-33至M-413；L-33至M-412；L-33至H-411；L-33至S-410；L-33至D-409；L-33至Q-408；L-33至N-407；L-33至V-406；L-33至G-405；L-33至N-404；L-33至L-403；L-33至S-402；L-33至A-401；L-33至C-400；L-33至Q-399；L-33至K-398；L-33至A-397；L-33至D-396；L-33至D-395；L-33至H-394；L-33至P-393；L-33至M-392；L-33至N-391；L-33至F-390；L-33至V-389；L-33至H-388；L-33至G-387；L-33至L-386；L-33至E-385；L-33至H-384；L-33至A-383；L-33至T-382；L-33至T-381；L-33至F-380；L-33至A-379；L-33至A-378；L-33至Q-377；L-33至L-376；L-33至G-375；L-33至D-374；L-33至D-373；L-33至E-372；L-33至I-371；L-33至V-370；L-33至S-369；L-33至C-368；L-33至S-367；L-33至R-366；L-33至S-365；L-33至P-364；L-33至D-363；L-33至C-362；L-33至V-361；L-33至T-360；L-33至G-359；L-33至V-358；L-33至D-357；L-33至A-356；L-33至M-355；L-33至G-354；L-33至L-353；L-33至T-352；L-33至D-351；L-33至C-350；L-33至T-349；L-33至Q-348；L-33至S-347；L-33至G-346；L-33至C-345；L-33至L-344；L-33至D-343；L33至Q-342；L-33至R-341；L-33至T-340；L-33至F-339；L-33至L-338；L-33至I-337；L-33至A-336；L-33至T-335；L-33至D-334；L-33至Y-333；L-33至H-332；L-33至E-331；L-33至A-330；L-33至D-329；L-33至R-328；L-33至D-327；L-33至S-326；L-33至P-325；L-33至P-324；L-33至N-323；L-33至H-322；L-33至Q-321；L-33至K-320；L-33至Q-319；L-33至W-318；L-33至N-317；L-33至C-316；L-33至F-315；L-33至N-314；L-33至R-313；L-33至L-312；L-33至T-311；L-33至L-310；L-33至A-309；L-33至A-308；L-33至N-307；L-33至S-306；L-33至T-305；L-33至V-304；L-33至E-303；L-33至P-302；L-33至G-301；L-33至K-300；L-33至Q-299；L-33至E-298；L-33至D-297；L-33至H-296；L-33至I-295；L-33至V-294；L-33至L-293；L-33至I-292；L-33至K-291；L-33至V-290；L-33至V-289；L-33至V-288；L-33至L-287；L-33至S-286；L-33至V-285；L-33至S-284；L-33至N-283；L-33至R-282；L-33至I-281；L-33至S-280；L-33至P-279；L-33至H-278；L-33至K-277；L-33至Y-276；L-33至L-275；L-33至R-274；L-33至A-273；L-33至A-272；L-33至V-271；L-33至S-270；L-33至F-269；L-33至L-268；L-33至T-267；L-33至L-266；L-33至L-265；L-33至Y-264；L-33至H-263；L-33至K-262；L-33至L-261；L-33至G-260；L-33至S-259；L-33至G-258；L-33至H-257；L-33至F-256；L-33至E-255；L-33至A-254；L-33至M-253；L-33至S-252；L-33至Q-251；L-33至D-250；L-33至A-249；L-33至V-248；L-33至L-247；L-33至M-246；L-33至T-245；L-33至E-244；L-33至V-243；L-33至Y-242；L-33至R-241；L-33至H-240；L-33至S-239；L-33至S-238；-33至V-237；L-33至F-236；L-33至R-235；L-33至K-234；L-33至K-233；L-33至R-232；L-33至I-231；L-33至S-230；L-33至G-229；L-33至T-228；L-33至G-227；L-33至T-226；L-33至P-225；L-33至Q-224；L-33至G-223；L-33至V-222；L-33至G-221；L-33至Q-220；L-33至L-219；L-33至A-218；L-33至P-217；L-33至D-216；L-33至Q-215；L-33至P-214；L-33至S-213；L-33至W-212；L-33至Q-211；L-33至P-210；L-33至G-209；L-33至E-208；L-33至D-207；L-33至E-206；L-33至G-205；L-33至E-204；L-33至T-203；L-33至G-202；L-33至E-201；L-33至D-200；L-33至E-199；L-33至D-198；L-33至E-197；L-33至T-196；L-33至E-195；L-33至A-194；L-33至K-193；L-33至G-192；L-33至T-191；L-33至P-190；L-33至R-189；L-33至P-188；L-33至E-187；L-33至D-186；L-33至D-185；L-33至V-184；L-33至V-183；L-33至G-182；L-33至C-181；L-33至T-180；L-33至G-179；L-33至G-178；L-33至V-177；L-33至D-176；L-33至G-175；L-33至Q-174；L-33至R-173；L-33至N-172；L-33至R-171；L-33至R-170；L-33至L-169；L-33至L-168；L-33至H-167；L-33至F-166；L-33至Q-165；L-33至L-164；L-33至P-163；L-33至A-162；L-33至P-161；L-33至P-160；L-33至K-159；L-33至E-158；L-33至G-157；L-33至P-156；L-33至A-155；L-33至A-154；L-33至T-153；L-33至A-152；L-33至L-151；L-33至R-150；L-33至E-149；L-33至S-148；L-33至A-147；L-33至A-146；L-33至P-145；L-33至L-144；L-33至P-143；L-33至Q-142；L-33至I-141；L-33至F-140；L-33至Y-139；L-33至A-138；L-33至E-137；L-33至G-136；L-33至L-135；L-33至L-134；L-33至Y-133；L-33至F-132；L-33至A-131；L-33至G-130；L-33至R-129；L-33至V-128；L-33至G-127；L-33至E-126；L-33至C-125；L-33至L-124；L-33至S-123；L-33至L-122；L-33至A-121；L-33至A-120；L-33至A-119；L-33至S-118；L-33至S-117；L-33至P-116；L-33至D-115；L-33至G-114；L-33至N-113；L-33至V-112；L-33至T-111；L-33至G-110；L-33至S-109；L-33至Y-108；L-33至F-107；L-33至C-106；L-33至H-105；L-33至A-104；L-33至L-103；L-33至D-102；L-33至T-101；L-33至E-100；L-33至P-99；L-33至L-98；L-33至P-97；L-33至T-96；L-33至E-95；L-33至S-94；L-33至G-93；L-33至S-92；L-33至K-91；L-33至R-90；L-33至G-89；L-33至V-88；L-33至N-87；L-33至Q-86；L-33至L-85；L-33至T-84；L-33至F-83；L-33至G-82；L-33至P-81；L-33至A-80；L-33至L-79；L-33至F-78；L-33至S-77；L-33至S-76；L-33至D-75；L-33至P-74；L-33至R-73；L-33至L-72；L-33至E-71；L-33至L-70；L-33至D-69；L-33至L-68；L-33至Q-67；L-33至Q-66；L-33至D-65；L-33至F-64；L-33至A-63；L-33至H-62；L-33至L-61；L-33至R-60；L-33至L-59；L-33至R-58；L-33至T-57；L-33至T-56；L-33至G-55；L-33至H-54；L-33至G-53；L-33至P-52；L-33至A-51；L-33至R-50；L-33至E-49；L-33至L-48；L-33至E-47；L-33至P-46；L-33至V-45；L-33至V-44；L-33至L-43；L-33至E-42；L-33至E-41；L-33至D-40；和/或L-33至E-39。
METH 1的缺失突变可如下进行以包含如SEQ ID NO：125中所述的全部或部分额外序列。例如，示例性缺失突变体包括：Q-2至S-967；R-3至S-967；A-4至S-967；V-5至S-967；P-6至S-967；E-7至S-967；G-8至S-967；F-9至S-967；G-10至S-967；R-11至S-976；R-12至S-967；K-13至S-967；L-14至S-967；G-15至S-967；S-16至S-967；D-17至S-967；和M-18至S-967。
尤其是，METH 2多肽的N-端缺失体可用通式m2-890描述，其中m2是2-889的整数，其中m相应于SEQ ID NO：4中所定的氨基酸残基位置。优选如SEQ ID NO：4所示之本发明METH 2多肽的N-端缺失体包括含如下氨基酸残基序列的多肽：SEQ ID NO：4的F-2至L-890；P-3至L-890；A-4至L-890；P-5至L-890；A-6至L-890；A-7至L-890；P-8至L-890；R-9至L-890；W-10至L-890；L-11至L-890；P-12至L-890；F-13至L-890；L-14至L-890；L-15至L-890；L-16至L-890；L-17至L-890；L-18至L-890；L-19至L-890；L-20至L-890；L-21至L-890；L-22至L-890；P-23至L-890；L-24至L-890；A-25至L-890；R-26至L-890；G-27至L-890；A-28至L-890；P-29至L-890；A-30至L-890；R-31至L-890；P-32至L-890；A-33至L-890；A-34至L-890；G-35至L-890；G-36至L-890；Q-37至L-890；A-38至L-890；S-39至L-890；E-40至L-890；L-41至L-890；V-42至L-890；V-43至L-890；P-44至L-890；T-45至L-890；R-46至L-890；L-47至L-890；P-48至L-890；G-49至L-890；S-50至L-890；A-51至L-890；G-52至L-890；E-53至L-890；L-54至L-890；A-55至L-890；L-56至L-890；H-57至L-890；L-58至L-890；S-59至L-890；A-60至L-890；F-61至L-890；G-62至L-890；K-63至L-890；G-64至L-890；F-65至L-890；V-66至L-890；L-67至L-890；R-68至L-890；L-69至L-890；A-70至L-890；P-71至L-890；D-72至L-890；D-73至L-890；S-74至L-890；F-75至L-890；L-76至L-890；A-77至L-890；P-78至L-890；E-79至L-890；F-80至L-890；K-81至L-890；I-82至L-890；E-83至L-890；R-84至L-890；I-85至L-890；G-86至L-890；G-87至L-890；S-88至L-890；G-89至L-890；R-90至L-890；A-91至L-890；T-92至L-890；G-93至L-890；G-94至L-890；E-95至L-890；R-96至L-890；G-97至L-890；L-98至L-890；R-99至L-890；G-100至L-890；C-101至L-890；F-102至L-890；F-103至L-890；S-104至L-890；G-105至L-890；T-106至L-890；V-107至L-890；N-108至L-890；G-109至L-890；E-110至L-890；P-111至L-890；E-112至L-890；S-113至L-890；L-114至L-890；A-115至L-890；A-116至L-890；V-117至L-890；S-118至L-890；L-119至L-890；C-120至L-890；R-121至L-890；G-122至L-890；L-123至L-890；S-124至L-890；G-125至L-890；S-126至L-890；F-127至L-890；L-128至L-890；L-129至L-890；D-130至L-890；G-131至L-890；E-132至L-890；E-133至L-890；F-134至L-890；T-135至L-890；I-136至L-890；Q-137至L-890；P-138至L-890；Q-139至L-890；G-140至L-890；A-141至L-890；G-142至L-890；G-143至L-890；S-144至L-890；L-145至L-890；A-146至L-890；Q-147至L-890；P-148至L-890；H-149至L-890；R-150至L-890；L-151至L-890；Q-152至L-890；R-153至L-890；W-154至L-890；G-155至L-890；P-156至L-890；A-157至L-890；G-158至L-890；A-159至L-890；R-160至L-890；P-161至L-890；L-162至L-890；P-163至L-890；R-164至L-890；G-165至L-890；P-166至L-890；E-167至L-890；W-168至L-890；E-169至L-890；V-170至L-890；E-171至L-890；T-172至L-890；G-173至L-890；E-174至L-890；G-175至L-890；Q-176至L-890；R-177至L-890；Q-178至L-890；E-179至L-890；R-180至L-890；G-181至L-890；D-182至L-890；H-183至L-890；Q-184至L-890；E-185至L-890；D-186至L-890；S-187至L-890；E-188至L-890；E-189至L-890；E-190至L-890；S-191至L-890；Q-192至L-890；E-193至L-890；E-194至L-890；E-195至L-890；A-196至L-890；E-197至L-890；G-198至L-890；A-199至L-890；S-200至L-890；E-201至L-890；P-202至L-890；P-203至L-890；P-204至L-890；P-205至L-890；L-206至L-890；G-207至L-890；A-208至L-890；T-209至L-890；S-210至L-890；R-211至L-890；T-212至L-890；K-213至L-890；R-214至L-890；F-215至L-890；V-216至L-890；S-217至L-890；E-218至L-890；A-219至L-890；R-220至L-890；F-221至L-890；V-222至L-890；E-223至L-890；T-224至L-890；L-225至L-890；L-226至L-890；V-227至L-890；A-228至L-890；D-229至L-890；A-230至L-890；S-231至L-890；M-232至L-890；A-233至L-890；A-234至L-890；F-235至L-890；Y-236至L-890；G-237至L-890；A-238至L-890；D-239至L-890；L-240至L-890；Q-241至L-890；N-242至L-890；H-243至L-890；I-244至L-890；L-245至L-890；T-246至L-890；L-247至L-890；M-248至L-890；S-249至L-890；V-250至L-890；A-251至L-890；A-252至L-890；R-253至L-890；I-254至L-890；Y-255至L-890；K-256至L-890；H-257至L-890；P-258至L-890；S-259至L-890；I-260至L-890；K-261至L-890；N-262至L-890；S-263至L-890；I-264至L-890；N-265至L-890；L-266至L-890；M-267至L-890；V-268至L-890；V-269至L-890；K-270至L-890；V-271至L-890；L-272至L-890；I-273至L-890；V-274至L-890；E-275至L-890；D-276至L-890；E-277至L-890；K-278至L-890；W-279至L-890；G-280至L-890；P-281至L-890；E-282至L-890；V-283至L-890；S-284至L-890；D-285至L-890；N-286至L-890；G-287至L-890；G-288至L-890；L-289至L-890；T-290至L-890；L-291至L-890；R-292至L-890；N-293至L-890；F-294至L-890；C-295至L-890；N-296至L-890；W-297至L-890；Q-298至L-890；R-299至L-890；R-300至L-890；F-301至L-890；N-302至L-890；Q-303至L-890；P-304至L-890；S-305至L-890；D-306至L-890；R-307至L-890；H-308至L-890；P-309至L-890；E-310至L-890；H-311至L-890；Y-312至L-890；D-313至L-890；T-314至L-890；A-315至L-890；I-316至L-890；L-317至L-890；L-318至L-890；T-319至L-890；R-320至L-890；Q-321至L-890；N-322至L-890；F-323至L-890；C-324至L-890；G-325至L-890；Q-326至L-890；E-327至L-890；G-328至L-890；L-329至L-890；C-330至L-890；D-331至L-890；T-332至L-890；L-333至L-890；G-334至L-890；V-335至L-890；A-336至L-890；D-337至L-890；I-338至L-890；G-339至L-890；T-340至L-890；I-341至L-890；C-342至L-890；D-343至L-890；P-344至L-890；N-345至L-890；K-346至L-890；S-347至L-890；C-348至L-890；S-349至L-890；V-350至L-890；I-351至L-890；E-352至L-890；D-353至L-890；E-354至L-890；G-355至L-890；L-356至L-890；Q-357至L-890；A-358至L-890；A-359至L-890；H-360至L-890；T-361至L-890；L-362至L-890；A-363至L-890；H-364至L-890；E-365至L-890；L-366至L-890；G-367至L-890；H-368至L-890；V-369至L-890；L-370至L-890；S-371至L-890；M-372至L-890；P-373至L-890；H-374至L-890；D-375至L-890；D-376至L-890；S-377至L-890；K-378至L-890；P-379至L-890；C-380至L-890；T-381至L-890；R-382至L-890；L-383至L-890；F-384至L-890；G-385至L-890；P-386至L-890；M-387至L-890；G-388至L-890；K-389至L-890；H-390至L-890；H-391至L-890；V-392至L-890；M-393至L-890；A-394至L-890；P-395至L-890；L-396至L-890；F-397至L-890；V-398至L-890；H-399至L-890；L-400至L-890；N-401至L-890；Q-402至L-890；T-403至L-890；L-404至L-890；P-405至L-890；W-406至L-890；S-407至L-890；P-408至L-890；C-409至L-890；S-410至L-890；A-411至L-890；M-412至L-890；Y-413至L-890；L-414至L-890；T-415至L-890；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尤其是，METH 2多肽的C-端缺失体可用通式1-n2描述，其中n2是2-890的整数，其中n相应于SEQ ID NO：4中所定的氨基酸残基位置。优选如SEQ ID NO：4所示之本发明METH 2多肽的C-端缺失体包括含如下氨基酸残基序列的多肽：SEQ ID NO：4的M-1至P-889；M-1至C-888；M-1至L-887；M-1至Q-886；M-1至S-885；M-1至E-884；M-1至C-883；M-1至P-882；M-1至K-881；M-1至A-880；M-1至D-879；M-1至E-878；M-1至P-877；M-1至K-876；M-1至L-875；M-1至A-874；M-1至K-873；M-1至N-872；M-1至C-871；M-1至T-870；M-1至A-869；M-1至S-868；M-1至A-867；M-1至Q-866；M-1至G-865；M-1至S-864；M-1至P-863；M-1至D-862；M-1至R-861；M-1至C-860；M-1至E-859；M-1至V-858；M-1至T-857；M-1至R-856；M-1至R-855；M-1至Q-854；M-1至W-853；M-1至G-852；M-1至A-851；M-1至G-850；M-1至C-849；M-1至T-848；M-1至S-847；M-1至S-846；M-1至C-845；M-1至E-844；M-1至S-843；M-1至W-842；M-1至D-841；M-1至G-840；M-1至L-839；M-1至V-838；M-1至W-837；M-1至Q-836；M-1至A-835；M-1至H-834；M-1至L-833；M-1至L-832；M-1至P-831；M-1至Q-830；M-1至I-829；M-1至I-828；M-1至N-827；M-1至T-826；M-1至T-825；M-1至A-824；M-1至R-823；M-1至E-822；M-1至K-821；M-1至S-820；M-1至S-819；M-1至Q-818；M-1至M-817；M-1至S-816；M-1至F-815；M-1至D-814；M-1至V-813；M-1至D-812；M-1至N-811；M-1至P-810；M-1至V-809；M-1至F-808；M-1至F-807；M-1至T-806；M-1至Y-805；M-1至K-804；M-1至V-803；M-1至K-802；M-1至P-801；M-1至P-800；M-1至F-799；M-1至V-798；M-1至E-797；M-1至G-796；M-1至P-795；M-1至V-794；M-1至T-793；M-1至L-792；M-1至L-791；M-1至Q-790；M-1至V-789；M-1至T-788；M-1至L-787；M-1至P-786；M-1至E-785；M-1至P-784；M-1至L-783；M-1至P-782；M-1至R-781；M-1至F-780；M-1至S-779；M-1至Q-778；M-1至L-777；M-1至R-776；M-1至E-775；M-1至L-774；M-1至T-773；M-1至A-772；M-1至I-771；M-1至S-770；M-1至G-769；M-1至S-768；M-1至Y-767；M-1至K-766；M-1至L-765；M-1至I-764；M-1至T-763；M-1至G-762；M-1至K-761；M-1至V-760；M-1至L-759；M-1至I-758；M-1至D-757；M-1至Q-756；M-1至E-755；M-1至I-754；M-1至A-753；M-1至S-752；M-1至I-751；M-1至A-750；M-1至L-749；M-1至N-748；M-1至G-747；M-1至N-746；M-1至L-745；M-1至L-744；M-1至Y-743；M-1至Q-742；M-1至G-741；M-1至D-740；M-1至A-739；M-1至T-738；M-1至K-737；M-1至L-736；M-1至A-735；M-1至L-734；M-1至Y-733；M-1至N-732；M-1至G-731；M-1至D-730；M-1至N-729；M-1至Q-728；M-1至V-727；M-1至G-726；M-1至P-725；M-1至H-724；M-1至S-723；M-1至R-722；M-1至Q-721；M-1至K-720；M-1至V-719；M-1至D-718；M-1至I-717；M-1至N-716；M-1至T-715；M-1至A-714；M-1至G-713；M-1至A-712；M-1至P-711；M-1至I-710；M-1至T-709；M-1至V-708；M-1至I-707；M-1至D-706；M-1至N-705；M-1至Y-704；M-1至G-703；M-1至Y-702；M-1至N-701；M-1至T-700；M-1至P-699；M-1至T-698；M-1至L-697；M-1至S-696；M-1至G-695；M-1至S-694；M-1至V-693；M-1至K-692；M-1至R-691；M-1至C-690；M-1至S-689；M-1至N-688；M-1至G-687；M-1至K-686；M-1至G-685；M-1至G-684；M-1至C-683；M-1至V-682；M-1至G-681；M-1至C-680；M-1至K-679；M-1至D-678；M-1至L-677；M-1至K-676；M-1至R-675；M-1至P-674；M-1至S-673；M-1至D-672；M-1至V-671；M-1至V-670；M-1至H-669；M-1至D-668；M-1至C-667；M-1至G-666；M-1至A-665；M-1至K-664；M-1至V-663；M-1至C-662；M-1至Q-661；M-1至G-660；M-1至R-659；M-1至V-658；M-1至C-657；M-1至I-656；M-1至A-655；M-1至L-654；M-1至T-653；M-1至E-652；M-1至P-651；M-1至G-650；M-1至C-649；M-1至L-648；M-1至T-647；M-1至G-646；M-1至D-645；M-1至I-644；M-1至V-643；M-1至K-642；M-1至A-641；M-1至E-640；M-1至F-639；M-1至V-638；M-1至K-637；M-1至F-636；M-1至E-635；M-1至S-634；M-1至R-633；M-1至G-632；M-1至R-631；M-1至A-630；M-1至R-629；M-1至C-628；M-1至F-627；M-1至L-626；M-1至K-625；M-1至C-624；M-1至R-623；M-1至D-622；M-1至R-621；M-1至P-620；M-1至S-619；M-1至V-618；M-1至G-617；M-1至A-616；M-1至Y-615；M-1至K-614；M-1至P-613；M-1至V-612；M-1至W-611；M-1至Q-610；M-1至L-609；M-1至L-608；M-1至N-607；M-1至G-606；M-1至D-605；M-1至M-604；M-1至D-603；M-1至T-602；M-1至Y-601；M-1至N-600；M-1至Y-599；M-1至A-598；M-1至N-597；M-1至Y-596；M-1至K-595；M-1至E-594；M-1至C-593；M-1至Q-592；M-1至Q-591；M-1至E-590；M-1至R-589；M-1至F-588；M-1至S-587；M-1至K-586；M-1至G-585；M-1至D-584；M-1至P-583；M-1至P-582；M-1至C-581；M-1至E-580；M-1至E-579；M-1至T-578；M-1至H-577；M-1至C-576；M-1至S-575；M-1至Q-574；M-1至Y-573；M-1至K-572；M-1至A-571；M-1至R-570；M-1至R-569；M-1至G-568；M-1至L-567；M-1至C-566；M-1至Y-565；M-1至R-564；M-1至G-563；M-1至G-562；M-1至N-561；M-1至Q-560；M-1至P-559；M-1至E-558；M-1至P-557；M-1至D-556；M-1至K-555；M-1至C-554；M-1至E-553；M-1至R-552；M-1至H-551；M-1至S-550；M-1至F-549；M-1至Q-548；M-1至V-547；M-1至G-546；M-1至G-545；M-1至G-544；M-1至C-543；M-1至T-542；M-1至R-541；M-1至S-540；M-1至C-539；M-1至E-538；M-1至G-537；M-1至W-536；M-1至P-535；M-1至G-534；M-1至W-533；M-1至P-532；M-1至A-531；M-1至W-530；M-1至G-529；M-1至G-528；M-1至D-527；M-1至V-526；M-1至V-525；M-1至P-524；M-1至K-523；M-1至P-522；M-1至R-521；M-1至E-520；M-1至V-519；M-1至E-518；M-1至E-517；M-1至E-516；M-1至P-515；M-1至L-514；M-1至C-513；M-1至S-512；M-1至G-511；M-1至E-510；M-1至S-509；M-1至C-508；M-1至L-507；M-1至H-506；M-1至G-505；M-1至P-504；M-1至G-503；M-1至C-502；M-1至P-501；M-1至T-500；M-1至G-499；M-1至D-498；M-1至A-497；M-1至W-496；M-1至P-495；M-1至L-494；M-1至S-493；M-1至G-492；M-1至N-491；M-1至K-490；M-1至T-489；M-1至H-488；M-1至C-487；M-1至L-486；M-1至P-485；M-1至E-484；M-1至A-483；M-1至G-482；M-1至D-481；M-1至T-480；M-1至H-479；M-1至C-478；M-1至W-477；M-1至L-476；M-1至Q-475；M-1至A-474；M-1至C-473；M-1至V-472；M-1至D-471；M-1至Q-470；M-1至A-469；M-1至S-468；M-1至T-467；M-1至N-466；M-1至P-465；M-1至C-464；M-1至H-463；M-1至R-462；M-1至F-461；M-1至D-460；M-1至P-459；M-1至G-458；M-1至F-457；M-1至I-456；M-1至Q-455；M-1至R-454；M-1至C-453；M-1至Q-452；M-1至Q-451；M-1至D-450；M-1至L-449；M-1至Q-448；M-1至Y-447；M-1至L-446；M-1至A-445；M-1至M-444；M-1至R-443；M-1至G-442；M-1至P-441；M-1至L-440；M-1至G-439；M-1至T-438；M-1至P-437；M-1至L-436；M-1至P-435；M-1至L-434；M-1至A-433；M-1至A-432；M-1至G-431；M-1至P-430；M-1至A-429；M-1至D-428；M-1至L-427；M-1至L-426；M-1至C-425；M-1至D-424；M-1至G-423；M-1至H-422；M-1至G-421；M-1至G-420；M-1至D-419；M-1至L-418；M-1至L-417；M-1至E-416；M-1至T-415；M-1至L-414；M-1至Y-413；M-1至M-412；M-1至A-411；M-1至S-410；M-1至C-409；M-1至P-408；M-1至S-407；M-1至W-406；M-1至P-405；M-1至L-404；M-1至T-403；M-1至Q-402；M-1至N-401；M-1至L-400；M-1至H-399；M-1至V-398；M-1至F-397；M-1至L-396；M-1至P-395；M-1至A-394；M-1至M-393；M-1至V-392；M-1至H-391；M-1至H-390；M-1至K-389；M-1至G-388；M-1至M-387；M-1至P-386；M-1至G-385；M-1至F-384；M-1至L-383；M-1至R-382；M-1至T-381；M-1至C-380；M-1至P-379；M-1至K-378；M-1至S-377；M-1至D-376；M-1至D-375；M-1至H-374；M-1至P-373；M-1至M-372；M-1至S-371；M-1至L-370；M-1至V-369；M-1至H-368；M-1至G-367；M-1至L-366；M-1至E-365；M-1至H-364；M-1至A-363；M-1至L-362；M-1至T-361；M-1至H-360；M-1至A-359；M-1至A-358；M-1至Q-357；M-1至L-356；M-1至G-355；M-1至E-354；M-1至D-353；M-1至E-352；M-1至I-351；M-1至V-350；M-1至S-349；M-1至C-348；M-1至S-347；M-1至K-346；M-1至N-345；M-1至P-344；M-1至D-343；M-1至C-342；M-1至I-341；M-1至T-340；M-1至G-339；M-1至I-338；M-1至D-337；M-1至A-336；M-1至V-335；M-1至G-334；M-1至L-333；M-1至T-332；M-1至D-331；M-1至C-330；M-1至L-329；M-1至G-328；M-1至E-327；M-1至Q-326；M-1至G-325；M-1至C-324；M-1至F-323；M-1至N-322；M-1至Q-321；M-1至R-320；M-1至T-319；M-1至L-318；M-1至L-317；M-1至I-316；M-1至A-315；M-1至T-314；M-1至D-313；M-1至Y-312；M-1至H-311；M-1至E-310；M-1至P-309；M-1至H-308；M-1至R-307；M-1至D-306；M-1至S-305；M-1至P-304；M-1至Q-303；M-1至N-302；M-1至F-301；M-1至R-300；M-1至R-299；M-1至Q-298；M-1至W-297；M-1至N-296；M-1至C-295；M-1至F-294；M-1至N-293；M-1至R-292；M-1至L-291；M-1至T-290；M-1至L-289；M-1至G-288；M-1至G-287；M-1至N-286；M-1至D-285；M-1至S-284；M-1至V-283；M-1至E-282；M-1至P-281；M-1至G-280；M-1至W-279；M-1至K-278；M-1至E-277；M-1至D-276；M-1至E-275；M-1至V-274；M-1至I-273；M-1至L-272；M-1至V-271；M-1至K-270；M-1至V-269；M-1至V-268；M-1至M-267；M-1至L-266；M-1至N-265；M-1至I-264；M-1至S-263；M-1至N-262；M-1至K-261；M-1至I-260；M-1至S-259；M-1至P-258；M-1至H-257；M-1至K-256；M-1至Y-255；M-1至I-254；M-1至R-253；M-1至A-252；M-1至A-251；M-1至V-250；M-1至S-249；M-1至M-248；M-1至L-247；M-1至T-246；M-1至L-245；M-1至I-244；M-1至H-243；M-1至N-242；M-1至Q-241；M-1至L-240；M-1至D-239；M-1至A-238；M-1至G-237；M-1至Y-236；M-1至F-235；M-1至A-234；M-1至A-233；M-1至M-232；M-1至S-231；M-1至A-230；M-1至D-229；M-1至A-228；M-1至V-227；M-1至L-226；M-1至L-225；M-1至T-224；M-1至E-223；M-1至V-222；M-1至F-221；M-1至R-220；M-1至A-219；M-1至E-218；M-1至S-217；M-1至V-216；M-1至F-215；M-1至R-214；M-1至K-213；M-1至T-212；M-1至R-211；M-1至S-210；M-1至T-209；M-1至A-208；M-1至G-207；M-1至L-206；M-1至P-205；M-1至P-204；M-1至P-203；M-1至P-202；M-1至E-201；M-1至S-200；M-1至A-199；M-1至G-198；M-1至E-197；M-1至A-196；M-1至E-195；M-1至E-194；M-1至E-193；M-1至Q-192；M-1至S-191；M-1至E-190；M-1至E-189；M-1至E-188；M-1至S-187；M-1至D-186；M-1至E-185；M-1至Q-184；M-1至H-183；M-1至D-182；M-1至G-181；M-1至R-180；M-1至E-179；M-1至Q-178；M-1至R-177；M-1至Q-176；M-1至G-175；M-1至E-174；M-1至G-173；M-1至T-172；M-1至E-171；M-1至V-170；M-1至E-169；M-1至W-168；M-1至E-167；M-1至P-166；M-1至G-165；M-1至R-164；M-1至P-163；M-1至L-162；M-1至P-161；M-1至R-160；M-1至A-159；M-1至G-158；M-1至A-157；M-1至P-156；M-1至G-155；M-1至W-154；M-1至R-153；M-1至Q-152；M-1至L-151；M-1至R-150；M-1至H-149；M-1至P-148；M-1至Q-147；M-1至A-146；M-1至L-145；M-1至S-144；M-1至G-143；M-1至G-142；M-1至A-141；M-1至G-140；M-1至Q-139；M-1至P-138；M-1至Q-137；M-1至I-136；M-1至T-135；M-1至F-134；M-1至E-133；M-1至E-132；M-1至G-131；M-1至D-130；M-1至L-129；M-1至L-128；M-1至F-127；M-1至S-126；M-1至G-125；M-1至S-124；M-1至L-123；M-1至G-122；M-1至R-121；M-1至C-120；M-1至L-119；M-1至S-118；M-1至V-117；M-1至A-116；M-1至A-115；M-1至L-114；M-1至S-113；M-1至E-112；M-1至P-111；M-1至E-110；M-1至G-109；M-1至N-108；M-1至V-107；M-1至T-106；M-1至G-105；M-1至S-104；M-1至F-103；M-1至F-102；M-1至C-101；M-1至G-100；M-1至R-99；M-1至L-98；M-1至G-97；M-1至R-96；M-1至E-95；M-1至G-94；M-1至G-93；M-1至T-92；M-1至A-91；M-1至R-90；M-1至G-89；M-1至S-88；M-1至G-87；M-1至G-86；M-1至L-85；M-1至R-84；M-1至E-83；M-1至I-82；M-1至K-81；M-1至F-80；M-1至E-79；M-1至P-78；M-1至A-77；M-1至L-76；M-1至F-75；M-1至S-74；M-1至D-73；M-1至D-72；M-1至P-71；M-1至A-70；M-1至L-69；M-1至R-68；M-1至L-67；M-1至V-66；M-1至F-65；M-1至G-64；M-1至K-63；M-1至G-62；M-1至F-61；M-1至A-60；M-1至S-59；M-1至L-58；M-1至H-57；M-1至L-56；M-1至A-55；M-1至L-54；M-1至E-53；M-1至G-52；M-1至A-51；M-1至S-50；M-1至G-49；M-1至P-48；M-1至L-47；M-1至R-46；M-1至T-45；M-1至P-44；M-1至V-43；M-1至V-42；M-1至L-41；M-1至E-40；M-1至S-39；M-1至A-38；M-1至Q-37；M-1至G-36；M-1至G-35；M-1至A-34；M-1至A-33；M-1至P-32；M-1至R-31；M-1至A-30；M-1至P-29；M-1至A-28；M-1至G-27；M-1至R-26；M-1至A-25；M-1至L-24；M-1至P-23；M-1至L-22；M-1至L-21；M-1至L-20；M-1至L-19；M-1至L-18；M-1至L-17；M-1至L-16；M-1至L-15；M-1至L-14；M-1至F-13；M-1至P-12；M-1至L-11；M-1至W-10；M-1至R-9；M-1至P-8；M-1至A-7。优选地，任何以上列举的N-或C-端缺失可组合而产生N-和C-端缺失的METH 2多肽。
本发明还提供了在氨基和羧基端两端均具一个或多个氨基酸缺失的多肽，它们通常可描述为具SEQ ID NO：2的m1-n1残基或SEQ ID NO：4的m2-n2残基，其中n和m是如上所述的整数。
本发明还提供了METH 1金属蛋白酶结构域的突变体，其由通式m3-n3表示，其中m3是从205-265的整数，n3是从285-290的整数，其中m3和n3相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。本发明还提供了METH 1金属蛋白酶结构域的突变体，其由通式m4-n4表示，其中m4是从1-409的整数，n4是从429-489的整数，其中m4和n4相应于示于SEQID NO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 1去整联蛋白结构域的突变体，其由通式m5-n5表示，其中m5是从430-490的整数，n5是从510-950的整数，其中m5和n5相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 1去整联蛋白结构域的突变体，其由通式m6-n6表示，其中m6是从1-494的整数，n6是从514-574的整数，其中m6和n6相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 1 TSP1结构域的突变体，其由通式m7-n7表示，其中m7是从515-575的整数，n7是从595-950的整数，其中m7和n7相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 1 TSP1结构域的突变体，其由通式m8-n8表示，其中m8是从1-548的整数，n8是从568-628的整数，其中m8和n8相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 1 TSP2结构域的突变体，其由通式m9-n9表示，其中m9是从801-871的整数，n9是从891-950的整数，其中m9和n9相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 1 TSP2结构域的突变体，其由通式m10-n10表示，其中m10是从1-834的整数，n10是从864-924的整数，其中m10和n10相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 1 TSP3结构域的突变体，其由通式m11-n11表示，其中m11是从865-925的整数，n11是从945-950的整数，其中m11和n11相应于示于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基的位置。本发明还提供了METH 1 TSP3结构域的突变体，其由通式m12-n12表示，其中m12是从1-884的整数，n12是从904-950的整数，其中m12和n12相应于示于SEQ IDNO：2中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 2金属蛋白酶结构域的突变体，其由通式m13-n13表示，其中m13是从184-244的整数，n13是从264-890的整数，其中m13和n13相应于示于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基的位置。本发明还提供了METH 2金属蛋白酶结构域的突变体，其由通式m14-n14表示，其中m14是从1-389的整数，n14是从409-469的整数，其中m14和n14相应于示于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 2去整联蛋白结构域的突变体，其由通式m15-n15表示，其中m15是从400-470的整数，n15是从490-890的整数，其中m15和n15相应于示于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基的位置。本发明还提供了METH 2去整联蛋白结构域的突变体，其由通式m16-n16表示，其中m16是从1-479的整数，n16是从499-559的整数，其中m16和n16相应于示于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 2 TSP1结构域的突变体，其由通式m17-n17表示，其中m17是从500-560的整数，n17是从580-890的整数，其中m17和n17相应于示于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基的位置。本发明还提供了METH 2 TSP1结构域的突变体，其由通式m18-n18表示，其中m18是从1-533的整数，n18是从553-613的整数，其中m18和n18相应于示于SEQ IDNO：4中的氨基酸残基的位置。
本发明还提供了METH 2 TSP2结构域的突变体，其由通式m19-n19表示，其中m19是从807-867的整数，n19是从887-890的整数，其中m19和n19相应于示于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基的位置。本发明还提供了METH 2 TSP2结构域的突变体，其由通式m20-n20表示，其中m20是从1-840的整数，n20是从860-890的整数，其中m20和n20相应于示于SEQ IDNO：4中的氨基酸残基的位置。
也优选以结构或功能结构域为特征的METH 1或METH 2多肽和多核苷酸片段。本发明的优选实施方案包括含以下区域的片段：α-螺旋和α-螺旋形成区(“α-区”)、β-折叠和β-折叠形成区(“β-区”)、转角和转角形成区(“转角区”)、卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)、亲水区、疏水区、α两亲区、β两亲区、柔性区、表面形成区、底物结合区和高抗原性指数区。如图中所列出的，这样的优选区包括Garnier-Robson α-区、β-区、转角区和卷曲区、Chou-Fasman α-区、β-区和转角区、Kyte-Doolittle亲水区和疏水区、Eisenberg α和β两亲区、Karplus-Schulz柔性区、Emini表面形成区和Jameson-Wolf高抗原性指数区。本发明特别包括落在保守结构域内的SEQ ID NO：2多肽片段。(参阅图10&11和表1&2)。此外，本发明也包括编码这些结构域的多核苷酸片段。
其他优选片段是生物活性的METH 1或METH 2片段。生物活性片段是那些展示与METH 1或METH 2多肽活性相似但不必完全相同的活性的片段。这些片段的生物活性包括提高的期望活性或降低的不理想活性。但是，如EST序列之类的许多多核苷酸序列可公开地从序列数据库获得。其中一些与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3有关，并可能在本发明构思前已可公开地获得。优选地，这种相关多核苷酸排除在本发明范围之外。将每个相关序列一一列举是繁琐的。因此，优选从本发明中排除的是含通式a-b所描述之核苷酸序列的一个或多个多核苷酸，其中a是SEQ ID NO：1第1-936位的任何整数，b是第15-950位整数，其中a和b都相应于SEQ ID NO：1中所示的核苷酸残基位置，且b大于或等于a+14。此外，优选从本发明中排除的是含通式a-b所描述之核苷酸序列的一个或多个多核苷酸，其中a是SEQ ID NO：3中第1-876位间的任何整数，b是第15-890位整数，其中a和b都相应于SEQ ID NO：3中所示的核苷酸残基位置，且b大于或等于a+14。
上述片段可用于制备融合蛋白，例如下面所述的Fc或Flag融合蛋白。
表位和抗体
本发明的优选实施方案涉及含表位的METH 1或METH 2多肽片段以及编码该片段的多核苷酸。这些表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”定义为当本发明的完整多肽或其片段为免疫原时体内引发抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可结合的多肽之区域定义为“抗原决定簇”或“抗原表位”。蛋白质体内免疫原性表位的数目一般少于抗原表位的数目。(参阅，例如，Geysen等，美国国家科学院院报81：3998-4002(1983))。但是，抗体可利用诸如噬菌体展示的方法针对任何抗原性表位产生，无论其是否为免疫原性表位。见如Petersen G.等，(1995)分子普通遗传学，249：425-431。因此，本发明中所包括的是免疫原性表位和抗原性表位。
包含免疫原性表位的示范性氨基酸序列的清单示于表1和2。要指出表1和2仅列出了包含预期具有最高抗原产生活性的表位之氨基酸，这是利用Jameson和Wolf，(1988)Comp.Appl.Biosci.，4：181-186的算法得出的(此处引入作为参考)。Jameson-Wolf抗原分析是利用计算机程序使用默认参数进行的(Power MacIntosh，DNASTAR，Inc.，1228South Park Street Madison，WI，版本3.11)。表1和2及未列在表1和2中的多肽的部分不认为是非免疫原性的。表1和2的免疫原性表位为示范性的清单，而不是排他性的清单，因为其他免疫原性表位仅仅因为所用的特定算法而未被识别。包含其他免疫原性表位的氨基酸残基可被利用类似于Jameson和Wolf分析的算法或利用本领域已知的用于抗原发生应答的方法体内检测而常规测定。见如Geysen等，出处同前；美国专利4708781；5194392；4433092和5480971(此处全文引入作为参考)。
在本发明中，带有抗原性表位的肽或多肽优选包括至少7个，更优选至少9个，最优选包含于本发明的多肽之氨基酸序列中的约15-30个氨基酸的序列。
利用DNAstar分析，发现SEQ ID NO：2在以下处有抗原性氨基酸：
2-14，
32-44，47-60，66-78，87-103，109-118，146-162，168-180，183-219，223-243，275-284，
296-306，314-334，341-354，357-376，392-399，401-410，418-429，438-454，456-471，
474-488，510-522，524-538，550-561，565-626，630-643，659-671，679-721，734-749，
784-804，813-820，825-832，845-854，860-894，899-917，919-924和928-939.
利用DNAstar分析，发现SEQ ID NO：4在以下处有抗原性氨基酸：26-
38，45-52，69-76，80-99，105-113，129-136，138-217，254-263，273-289，294-313，321-
331，339-356，371-383，417-427，438-443，459-471，479-505，507-526，535-546，550-
607，615-640，648-653，660-667，669-681，683-704，717-732，737-743，775-787，797-
804，811-825，840-867和870-884.
因此，这些METH 1和/或METH 2的区域是可用作表位以产生抗METH 1和/或METH 2特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制性例子。
特别指出的是表1和2的氨基酸序列包含免疫原性表位。表1和2仅列举了由Jameson和Wolf分析所确定的免疫原性表位的关键残基。因此，在N-末端或C-末端或者N-和C-末端二者的其他侧翼残基可添加到表1和2中的序列产生带有表位的本发明的多肽。因此，表1和2的免疫原性表位可包括额外的N-末端或C-末端氨基酸残基。额外的侧翼氨基酸残基可为连续的侧翼N-末端和/或C-末端序列，包括来自本发明多肽的，异源多肽序列的，或可包括来自本发明多肽和异源多肽序列二者的连续侧翼序列。
本发明的多肽包含长度至少为7个氨基酸残基的免疫原性或抗原性表位。“至少”表示本发明的多肽包含长度可为7个氨基酸残基的免疫原性或抗原性表位，或任何在7个氨基酸和本发明多肽之全长氨基酸残基数目之间的任何整数个氨基酸的长度。优选的多肽包含长度为至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸残基的多肽。但是，需指出每一个长度在7和全长氨基酸残基数目之间的多肽均包括在本发明中。
带有免疫原性和抗原性表位的片段可利用连续氨基酸残基明确化(如上述)，或进一步通过这些片段的N-末端和C-末端在SEQ ID NO：2或4上的位置来表示。能够占据SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列之长度为例如至少7个或至少15个连续氨基酸残基的片段的每一N-末端或C-末端位置均包括在本发明中。再次，“长度为至少7个连续氨基酸残基”表示长度为7个氨基酸残基或任何在7个氨基酸和本发明多肽之全长多肽的氨基酸残基数目之间的任何整数。具体的，每一个在7和全长多肽的氨基酸残基数目之间的整数均包括在本发明中。
本发明的带有免疫原性和抗原性表位的多肽可用于例如制备特异性地与本发明多肽结合的抗体，和用于免疫检测中以检测本发明的多肽。抗体可例如用于本发明多肽的亲和纯化。抗体也可常规地用于多种定量或定性免疫检测，特别是利用本领域已知的方法用于本发明多肽的检测。见如Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)。
本发明的带有表位的多肽可利用任何制备多肽的常规方法制备，包括本领域已知的合成和重组方法。例如，带有表位的肽可利用化学合成的已知方法合成。例如，Houghten已描述了一种合成大量肽的简单方法，诸如10-20mg的248个单独和独特的13残基肽，其代表HA1多肽的单一氨基酸变体的一个区段，所有这些残基肽均在不到4周内被制备和表征(利用ELISA型结合研究)(Houghten，R.A.，美国国家科学院院报，82：5131-5135(1985))。此“同时多重肽合成法(SMPS)”进一步在美国专利4631211(Houghten和同事)中描述。在此方法中，在分隔的溶剂可渗透型口袋中含有用于固相合成多种肽的单独的树脂，使得许多在固相方法中相同的重复步骤优化使用。一个完整的操作步骤允许同时进行500-1000或更多的合成(Houghten，R.A.，美国国家科学院院报，82：5131-5135(1985))。
本发明包括包含，或者由如下表位组成的多肽：具有SEQ ID NO：2和/或4的氨基酸序列的多肽之表位，或由包含在ATCC保藏号209581或209582或PTA 1478的多核苷酸序列编码的表位，或者在如前所述严谨杂交条件或较低严谨条件下可与SEQ ID NO：1和/或3的序列的互补物或包含于ATCC保藏号209581或209582或PTA 1478的多核苷酸序列的互补物杂交的多核苷酸编码的表位。本发明还包括编码本发明的多肽序列之表位的多核苷酸序列(诸如，例如公开于SEQ ID NO：1或3中的序列)，编码本发明的多肽序列之表位的多核苷酸序列的互补链的多核苷酸序列，和在如前所述严谨杂交条件或较低严谨条件下可与互补链杂交的多核苷酸序列。
术语“表位”如此处所用是指具有在动物(优选哺乳动物，最优选人)中的抗原性或免疫原性活性的多肽的部分。在一个优选实施方案中，本发明包括包含一种表位的多肽，以及编码此多肽的多核苷酸。一种“免疫原性表位”如此处所用是指如本领域已知的任一种方法所测定的在动物中引发抗体反应的蛋白质的部分，所述方法例如下面所述的用于产生抗体的方法(见例如Geysen等，美国国家科学院院报，81：3998-4002(1983))。术语“抗原性表位”如此处所用是指抗体可免疫特异性结合其抗原的蛋白质上的一部分，如本领域已知任何方法所测的，例如通过此处所述的免疫检测。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其他抗原的交叉反应性。抗原性表位不一定是免疫原性的。
其功能作为表位的片段可利用任何常规方法制备(见如，Houghten，R.A.，美国国家科学院院报，82：5131-5135(1985)，进一步描述于美国专利4631211)。
本发明中，抗原性表位优选含有至少4，至少5，至少6，至少7，更优选至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，且最优选在约15-约30氨基酸之间。优选的包含免疫原性或抗原性表位的多肽的长度至少为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。其他优选的METH 1的抗原性表位包括，或者由如下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：2的M-1至P-15；G-2至V-16；N-3至P-17；A-4至T-18；E-5至L-19；R-6至L-20；A-7至L-21；P-8至L-22；G-9至A-23；S-10至A-24；R-11至A-25；S-12至L-26；F-13至L-27；G-14至A-28；P-15至V-29；V-16至S-30；P-17至D-31；T-18至A-32；L-19至L-33；L-20至G-34；L-21至R-35；L-22至P-36；A-23至S-37；A-24至E-38；A-25至E-39；L-26至D-40；L-27至E-41；A-28至E-42；V-29至L-43；S-30至V-44；D-31至V-45；A-32至P-46；L-33至E-47；G-34至L-48；R-35至E-49；P-36至R-50；S-37至A-51；E-38至P-52；E-39至G-53；D-40至H-54；E-41至G-55；E-42至T-56；L-43至T-57；V-44至R-58；V-45至L-59；P-46至R-60；E-47至L-61；L-48至H-62；E-49至A-63；R-50至F-64；A-51至D-65；P-52至Q-66；G-53至Q-67；H-54至L-68；G-55至D-69；T-56至L-70；T-57至E-71；R-58至L-72；L-59至R-73；R-60至P-74；L-61至D-75；H-62至S-76；A-63至S-77；F-64至F-78；D-65至L-79；Q-66至A-80；Q-67至P-81；L-68至G-82；D-69至F-83；L-70至T-84；E-71至L-85；L-72至Q-86；R-73至N-87；P-74至V-88；D-75至G-89；S-76至R-90；S-77至K-91；F-78至S-92；L-79至G-93；A-80至S-94；P-81至E-95；G-82至T-96；F-83至P-97；T-84至L-98；L-85至P-99；Q-86至E-100；N-87至T-101；V-88至D-102；G-89至L-103；R-90至A-104；K-91至H-105；S-92至C-106；G-93至F-107；S-94至Y-108；E-95至S-109；T-96至G-110；P-97至T-111；L-98至V-112；P-99至N-113；E-100至G-114；T-101至D-115；D-102至P-116；L-103至S-117；A-104至S-118；H-105至A-119；C-106至A-120；F-107至A-121；Y-108至L-122；S-109至S-123；G-110至L-124；T-111至C-125；V-112至E-126；N-113至G-127；G-114至V-128；D-115至R-129；P-116至G-130；S-117至A-131；S-118至F-132；A-119至Y-133；A-120至L-134；A-121至L-135；L-122至G-136；S-123至E-137；L-124至A-138；C-125至Y-139；E-126至F-140；G-127至I-141；V-128至Q-142；R-129至P-143；G-130至L-144；A-131至P-145；F-132至A-146；Y-133至A-147；L-134至S-148；L-135至E-149；G-136至R-150；E-137至L-151；A-138至A-152；Y-139至T-153；F-140至A-154；I-141至A-155；Q-142至P-156；P-143至G-157；L-144至E-158；P-145至K-159；A-146至P-160；A-147至P-161；S-148至A-162；E-149至P-163；R-150至L-164；L-151至Q-165；A-152至F-166；T-153至H-167；A-154至L-168；A-155至L-169；P-156至R-170；G-157至R-171；E-158至N-172；K-159至R-173；P-160至Q-174；P-161至G-175；A-162至D-176；P-163至V-177；L-164至G-178；Q-165至G-179；F-166至T-180；H-167至C-181；L-168至G-182；L-169至V-183；R-170至V-184；R-171至D-185；N-172至D-186；R-173至E-187；Q-174至P-188；G-175至R-189；D-176至P-190；V-177至T-191；G-178至G-192；G-179至K-193；T-180至A-194；C-181至E-195；G-182至T-196；V-183至E-197；V-184至D-198；D-185至E-199；D-186至D-200；E-187至E-201；P-188至G-202；R-189至T-203；P-190至E-204；T-191至G-205；G-192至E-206；K-193至D-207；A-194至E-208；E-195至G-209；T-196至P-210；E-197至Q-211；D-198至W-212；E-199至S-213；D-200至P-214；E-201至Q-215；G-202至D-216；T-203至P-217；E-204至A-218；G-205至L-219；E-206至Q-220；D-207至G-221；E-208至V-222；G-209至G-223；P-210至Q-224；Q-211至P-225；W-212至T-226；S-213至G-227；P-214至T-228；Q-215至G-229；D-216至S-230；P-217至I-231；A-218至R-232；L-219至K-233；Q-220至K-234；G-221至R-235；V-222至F-236；G-223至V-237；Q-224至S-238；P-225至S-239；T-226至H-240；G-227至R-241；T-228至Y-242；G-229至V-243；S-230至E-244；I-231至T-245；R-232至M-246；K-233至L-247；K-234至V-248；R-235至A-249；F-236至D-250；V-237至Q-251；S-238至S-252；S-239至M-253；H-240至A-254；R-241至E-255；Y-242至F-256；V-243至H-257；E-244至G-258；T-245至S-259；M-246至G-260；L-247至L-261；V-248至K-262；A-249至H-263；D-250至Y-264；Q-251至L-265；S-252至L-266；M-253至T-267；A-254至L-268；E-255至F-269；F-256至S-270；H-257至V-271；G-258至A-272；S-259至A-273；G-260至R-274；L-261至L-275；K-262至Y-276；H-263至K-277；Y-264至H-278；L-265至P-279；L-266至S-280；T-267至I-281；L-268至R-282；F-269至N-283；S-270至S-284；V-271至V-285；A-272至S-286；A-273至L-287；R-274至V-288；L-275至V-289；Y-276至V-290；K-277至K-291；H-278至I-292；P-279至L-293；S-280至V-294；I-281至I-295；R-282至H-296；N-283至D-297；S-284至E-298；V-285至Q-299；S-286至K-300；L-287至G-301；V-288至P-302；V-289至E-303；V-290至V-304；K-291至T-305；I-292至S-306；L-293至N-307；V-294至A-308；I-295至A-309；H-296至L-310；D-297至T-311；E-298至L-312；Q-299至R-313；K-300至N-314；G-301至F-315；P-302至C-316；E-303至N-317；V-304至W-318；T-305至Q-319；S-306至K-320；N-307至Q-321；A-308至H-322；A-309至N-323；L-310至P-324；T-311至P-325；L-312至S-326；R-313至D-327；N-314至R-328；F-315至D-329；C-316至A-330；N-317至E-331；W-318至H-332；Q-319至Y-333；K-320至D-334；Q-321至T-335；H-322至A-336；N-323至I-337；P-324至L-338；P-325至F-339；S-326至T-340；D-327至R-341；R-328至Q-342；D-329至D-343；A-330至L-344；E-331至C-345；H-332至G-346；Y-333至S-347；D-334至Q-348；T-335至T-349；A-336至C-350；I-337至D-351；L-338至T-352；F-339至L-353；T-340至G-354；R-341至M-355；Q-342至A-356；D-343至D-357；L-344至V-358；C-345至G-359；G-346至T-360；S-347至V-361；Q-348至C-362；T-349至D-363；C-350至P-364；D-351至S-365；T-352至R-366；L-353至S-367；G-354至C-368；M-355至S-369；A-356至V-370；D-357至I-371；V-358至E-372；G-359至D-373；T-360至D-374；V-361至G-375；C-362至L-376；D-363至Q-377；P-364至A-378；S-365至A-379；R-366至F-380；S-367至T-381；C-368至T-382；S-369至A-383；V-370至H-384；I-371至E-385；E-372至L-386；D-373至G-387；D-374至H-388；G-375至V-389；L-376至F-390；Q-377至N-391；A-378至M-392；A-379至P-393；F-380至H-394；T-381至D-395；T-382至D-396；A-383至A-397；H-384至K-398；E-385至Q-399；L-386至C-400；G-387至A-401；H-388至S-402；V-389至L-403；F-390至N-404；N-391至G-405；M-392至V-406；P-393至N-407；H-394至Q-408；D-395至D-409；D-396至S-410；A-397至H-411；K-398至M-412；Q-399至M-413；C-400至A-414；A-401至S-415；S-402至M-416；L-403至L-417；N-404至S-418；G-405至N-419；V-406至L-420；N-407至D-421；Q-408至H-422；D-409至S-423；S-410至Q-424；H-411至P-425；M-412至W-426；M-41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E-830至E-844；S-831至E-845；F-832至W-846；N-833至G-847；A-834至E-848；I-835至C-849；P-836至S-850；T-837至K-851；F-838至S-852；S-839至C-853；A-840至E-854；W-841至L-855；V-842至G-856；I-843至W-857；E-844至Q-858；E-845至R-859；W-846至R-860；G-847至L-861；E-848至V-862；C-849至E-863；S-850至C-864；K-851至R-865；S-852至D-866；C-853至I-867；E-854至N-868；L-855至G-869；G-856至Q-870；W-857至P-871；Q-858至A-872；R-859至S-873；R-860至E-874；L-861至C-875；V-862至A-876；E-863至K-877；C-864至E-878；R-865至V-879；D-866至K-880；I-867至P-881；N-868至A-882；G-869至S-883；Q-870至T-884；P-871至R-885；A-872至P-886；S-873至C-887；E-874至A-888；C-875至D-889；A-876至H-890；K-877至P-891；E-878至C-892；V-879至P-893；K-880至Q-894；P-881至W-895；A-882至Q-896；S-883至L-897；T-884至G-898；R-885至E-899；P-886至W-900；C-887至S-901；A-888至S-902；D-889至C-903；H-890至S-904；P-891至K-905；C-892至T-906；P-893至C-907；Q-894至G-908；W-895至K-909；Q-896至G-910；L-897至Y-911；G-898至K-912；E-899至K-913；W-900至R-914；S-901至S-915；S-902至L-916；C-903至K-917；S-904至C-918；K-905至L-919；T-906至S-920；C-907至H-921；G-908至D-922；K-909至G-923；G-910至G-924；Y-911至V-925；K-912至L-926；K-913至S-927；R-914至H-928；S-915至E-929；L-916至S-930；K-917至C-931；C-918至D-932；L-919至P-933；S-920至L-934；H-921至K-935；D-922至K-936；G-923至P-937；G-924至K-938；V-925至H-939；L-926至F-940；S-927至I-941；H-928至D-942；E-929至F-943；S-930至C-944；C-931至T-945；D-932至M-946；P-933至A-947；L-934至E-948；K-935至C-949；和/或K-936至S-950。
类似地，优选的METH 2的抗原表位包含或由如下氨基酸残基的序列组成：SEQ ID NO：4的M-1至L-15；F-2至L-16；P-3至L-17；A-4至L-18；P-5至L-19；A-6至L-20；A-7至L-21；P-8至L-22；R-9至P-23；W-10至L-24；L-11至A-25；P-12至R-26；F-13至G-27；L-14至A-28；L-15至P-29；L-16至A-30；L-17至R-31；L-18至P-32；L-19至A-33；L-20至A-34；L-21至G-35；L-22至G-36；P-23至Q-37；L-24至A-38；A-25至S-39；R-26至E-40；G-27至L-41；A-28至V-42；P-29至V-43；A-30至P-44；R-31至T-45；P-32至R-46；A-33至L-47；A-34至P-48；G-35至G-49；G-36至S-50；Q-37至A-51；A-38至G-52；S-39至E-53；E-40至L-54；L-41至A-55；V-42至L-56；V-43至H-57；P-44至L-58；T-45至S-59；R-46至A-60；L-47至F-61；P-48至G-62；G-49至K-63；S-50至G-64；A-51至F-65；G-52至V-66；E-53至L-67；L-54至R-68；A-55至L-69；L-56至A-70；H-57至P-71；L-58至D-72；S-59至D-73；A-60至S-74；F-61至F-75；G-62至L-76；K-63至A-77；G-64至P-78；F-65至E-79；V-66至F-80；L-67至K-81；R-68至I-82；L-69至E-83；A-70至R-84；P-71至L-85；D-72至G-86；D-73至G-87；S-74至S-88；F-75至G-89；L-76至R-90；A-77至A-91；P-78至T-92；E-79至G-93；F-80至G-94；K-81至E-95；I-82至R-96；E-83至G-97；R-84至L-98；L-85至R-99；G-86至G-100；G-87至C-101；S-88至F-102；G-89至F-103；R-90至S-104；A-91至G-105；T-92至T-106；G-93至V-107；G-94至N-108；E-95至G-109；R-96至E-110；G-97至P-111；L-98至E-112；R-99至S-113；G-100至L-114；C-101至A-115；F-102至A-116；F-103至V-117；S-104至S-118；G-105至L-119；T-106至C-120；V-107至R-121；N-108至G-122；G-109至L-123；E-110至S-124；P-111至G-125；E-112至S-126；S-113至F-127；L-114至L-128；A-115至L-129；A-116至D-130；V-117至G-131；S-118至E-132；L-119至E-133；C-120至F-134；R-121至T-135；G-122至I-136；L-123至Q-137；S-124至P-138；G-125至Q-139；S-126至G-140；F-127至A-141；L-128至G-142；L-129至G-143；D-130至S-144；G-131至L-145；E-132至A-146；E-133至Q-147；F-134至P-148；T-135至H-149；I-136至R-150；Q-137至L-151；P-138至Q-152；Q-139至R-153；G-140至W-154；A-141至G-155；G-142至P-156；G-143至A-157；S-144至G-158；L-145至A-159；A-146至R-160；Q-147至P-161；P-148至L-162；H-149至P-163；R-150至R-164；L-151至G-165；Q-152至P-166；R-153至E-167；W-154至W-168；G-155至E-169；P-156至V-170；A-157至E-171；G-158至T-172；A-159至G-173；R-160至E-174；P-161至G-175；L-162至Q-176；P-163至R-177；R-164至Q-178；G-165至E-179；P-166至R-180；E-167至G-181；W-168至D-182；E-169至H-183；V-170至Q-184；E-171至E-185；T-172至D-186；G-173至S-187；E-174至E-188；G-175至E-189；Q-176至E-190；R-177至S-191；Q-178至Q-192；E-179至E-193；R-180至E-194；G-181至E-195；D-182至A-196；H-183至E-197；Q-184至G-198；E-185至A-199；D-186至S-200；S-187至E-201；E-188至P-202；E-189至P-203；E-190至P-204；S-191至P-205；Q-192至L-206；E-193至G-207；E-194至A-208；E-195至T-209；A-196至S-210；E-197至R-211；G-198至T-212；A-199至K-213；S-200至R-214；E-201至F-215；P-202至V-216；P-203至S-217；P-204至E-218；P-205至A-219；L-206至R-220；G-207至F-221；A-208至V-222；T-209至E-223；S-210至T-224；R-211至L-225；T-212至L-226；K-213至V-227；R-214至A-228；F-215至D-229；V-216至A-230；S-217至S-231；E-218至M-232；A-219至A-233；R-220至A-234；F-221至F-235；V-222至Y-236；E-223至G-237；T-224至A-238；L-225至D-239；L-226至L-240；V-227至Q-241；A-228至N-242；D-229至H-243；A-230至I-244；S-231至L-245；M-232至T-246；A-233至L-247；A-234至M-248；F-235至S-249；Y-236至V-250；G-237至A-251；A-238至A-252；D-239至R-253；L-240至I-254；Q-241至Y-255；N-242至K-256；H-243至H-257；I-244至P-258；L-245至S-259；T-246至I-260；L-247至K-261；M-248至N-262；S-249至S-263；V-250至I-264；A-251至N-265；A-252至L-266；R-253至M-267；I-254至V-268；Y-255至V-269；K-256至K-270；H-257至V-271；P-258至L-272；S-259至I-273；I-260至V-274；K-261至E-275；N-262至D-276；S-263至E-277；I-264至K-278；N-265至W-279；L-266至G-280；M-267至P-281；V-268至E-282；V-269至V-283；K-270至S-284；V-271至D-285；L-272至N-286；I-273至G-287；V-274至G-288；E-275至L-289；D-276至T-290；E-277至L-291；K-278至R-292；W-279至N-293；G-280至F-294；P-281至C-295；E-282至N-296；V-283至W-297；S-284至Q-298；D-285至R-299；N-286至R-300；G-287至F-301；G-288至N-302；L-289至Q-303；T-290至P-304；L-291至S-305；R-292至D-306；N-293至R-307；F-294至H-308；C-295至P-309；N-296至E-310；W-297至H-311；Q-298至Y-312；R-299至D-313；R-300至T-314；F-301至A-315；N-302至I-316；Q-303至L-317；P-304至L-318；S-305至T-319；D-306至R-320；R-307至Q-321；H-308至N-322；P-309至F-323；E-310至C-324；H-311至G-325；Y-312至Q-326；D-313至E-327；T-314至G-328；A-315至L-329；I-316至C-330；L-317至D-331；L-318至T-332；T-319至L-333；R-320至G-334；Q-321至V-335；N-322至A-336；F-323至D-337；C-324至I-338；G-325至G-339；Q-326至T-340；E-327至I-341；G-328至C-342；L-329至D-343；C-330至P-344；D-331至N-345；T-332至K-346；L-333至S-347；G-334至C-348；V-335至S-349；A-336至V-350；D-337至I-351；I-338至E-352；G-339至D-353；T-340至E-354；I-341至G-355；C-342至L-356；D-343至Q-357；P-344至A-358；N-345至A-359；K-346至H-360；S-347至T-361；C-348至L-362；S-349至A-363；V-350至H-364；I-351至E-365；E-352至L-366；D-353至G-367；E-354至H-368；G-355至V-369；L-356至L-370；Q-357至S-371；A-358至M-372；A-359至P-373；H-360至H-374；T-361至D-375；L-362至D-376；A-363至S-377；H-364至K-378；E-365至P-379；L-366至C-380；G-367至T-381；H-368至R-382；V-369至L-383；L-370至F-384；S-371至G-385；M-372至P-386；P-373至M-387；H-374至G-388；D-375至K-389；D-376至H-390；S-377至H-391；K-378至V-392；P-379至M-393；C-380至A-394；T-381至P-395；R-382至L-396；L-383至F-397；F-384至V-398；G-385至H-399；P-386至L-400；M-387至N-401；G-388至Q-402；K-389至T-403；H-390至L-404；H-391至P-405；V-392至W-406；M-393至S-407；A-394至P-408；P-395至C-409；L-396至S-410；F-397至A-411；V-398至M-412；H-399至Y-413；L-400至L-414；N-401至T-415；Q-402至E-416；T-403至L-417；L-404至L-418；P-405至D-419；W-406至G-420；S-407至G-421；P-408至H-422；C-409至G-423；S-410至D-424；A-411至C-425；M-412至L-426；Y-413至L-427；L-414至D-428；T-415至A-429；E-416至P-430；L-417至G-431；L-418至A-432；D-419至A-433；G-420至L-434；G-421至P-435；H-422至L-436；G-423至P-437；D-424至T-438；C-425至G-439；L-426至L-440；L-427至P-441；D-428至G-442；A-429至R-443；P-430至M-444；G-431至A-445；A-432至L-446；A-433至Y-447；L-434至Q-448；P-435至L-449；L-436至D-450；P-437至Q-451；T-438至Q-452；G-439至C-453；L-440至R-454；P-441至Q-455；G-442至I-456；R-443至F-457；M-444至G-458；A-445至P-459；L-446至D-460；Y-447至F-461；Q-448至R-462；L-449至H-463；D-450至C-464；Q-451至P-465；Q-452至N-466；C-453至T-467；R-454至S-468；Q-455至A-469；I-456至Q-470；F-457至D-471；G-458至V-472；P-459至C-473；D-460至A-474；F-461至Q-475；R-462至L-476；H-463至W-477；C-464至C-478；P-465至H-479；N-466至T-480；T-467至D-481；S-468至G-482；A-469至A-483；Q-470至E-484；D-471至P-485；V-472至L-486；C-473至C-487；A-474至H-488；Q-475至T-489；L-476至K-490；W-477至N-491；C-478至G-492；H-479至S-493；T-480至L-494；D-481至P-495；G-482至W-496；A-483至A-497；E-484至D-498；P-485至G-499；L-486至T-500；C-487至P-501；H-488至C-502；T-489至G-503；K-490至P-504；N-491至G-505；G-492至H-506；S-493至L-507；L-494至C-508；P-495至S-509；W-496至E-510；A-497至G-511；D-498至S-512；G-499至C-513；T-500至L-514；P-501至P-515；C-502至E-516；G-503至E-517；P-504至E-518；G-505至V-519；H-506至E-520；L-507至R-521；C-508至P-522；S-509至K-523；E-510至P-524；G-511至V-525；S-512至V-526；C-513至D-527；L-514至G-528；P-515至G-529；E-516至W-530；E-517至A-531；E-518至P-532；V-519至W-533；E-520至G-534；R-521至P-535；P-522至W-536；K-523至G-537；P-524至E-538；V-525至C-539；V-526至S-540；D-527至R-541；G-528至T-542；G-529至C-543；W-530至G-544；A-531至G-545；P-532至G-546；W-533至V-547；G-534至Q-548；P-535至F-549；W-536至S-550；G-537至H-551；E-538至R-552；C-539至E-553；S-540至C-554；R-541至K-555；T-542至D-556；C-543至P-557；G-544至E-558；G-545至P-559；G-546至Q-560；V-547至N-561；Q-548至G-562；F-549至G-563；S-550至R-564；H-551至Y-565；R-552至C-566；E-553至L-567；C-554至G-568；K-555至R-569；D-556至R-570；P-557至A-571；E-558至K-572；P-559至Y-573；Q-560至Q-574；N-561至S-575；G-562至C-576；G-563至H-577；R-564至T-578；Y-565至E-579；C-566至E-580；L-567至C-581；G-568至P-582；R-569至P-583；R-570至D-584；A-571至G-585；K-572至K-586；Y-573至S-587；Q-574至F-588；S-575至R-589；C-576至E-590；H-577至Q-591；T-578至Q-592；E-579至C-593；E-580至E-594；C-581至K-595；P-582至Y-596；P-583至N-597；D-584至A-598；G-585至Y-599；K-586至N-600；S-587至Y-601；F-588至T-602；R-589至D-603；E-590至M-604；Q-591至D-605；Q-592至G-606；C-593至N-607；E-594至L-608；K-595至L-609；Y-596至Q-610；N-597至W-611；A-598至V-612；Y-599至P-613；N-600至K-614；Y-601至Y-615；T-602至A-616；D-603至G-617；M-604至V-618；D-605至S-619；G-606至P-620；N-607至R-621；L-608至D-622；L-609至R-623；Q-610至C-624；W-611至K-625；V-612至L-626；P-613至F-627；K-614至C-628；Y-615至R-629；A-616至A-630；G-617至R-631；V-618至G-632；S-619至R-633；P-620至S-634；R-621至E-635；D-622至F-636；R-623至K-637；C-624至V-638；K-625至F-639；L-626至E-640；F-627至A-641；C-628至K-642；R-629至V-643；A-630至I-644；R-631至D-645；G-632至G-646；R-633至T-647；S-634至L-648；E-635至C-649；F-636至G-650；K-637至P-651；V-638至E-652；F-639至T-653；E-640至L-654；A-641至A-655；K-642至I-656；V-643至C-657；I-644至V-658；D-645至R-659；G-646至G-660；T-647至Q-661；L-648至C-662；C-649至V-663；G-650至K-664；P-651至A-665；E-652至G-666；T-653至C-667；L-654至D-668；A-655至H-669；I-656至V-670；C-657至V-671；V-658至D-672；R-659至S-673；G-660至P-674；Q-661至R-675；C-662至K-676；V-663至L-677；K-664至D-678；A-665至K-679；G-666至C-680；C-667至G-681；D-668至V-682；H-669至C-683；V-670至G-684；V-671至G-685；D-672至K-686；S-673至G-687；P-674至N-688；R-675至S-689；K-676至C-690；L-677至R-691；D-678至K-692；K-679至V-693；C-680至S-694；G-681至G-695；V-682至S-696；C-683至L-697；G-684至T-698；G-685至P-699；K-686至T-700；G-687至N-701；N-688至Y-702；S-689至G-703；C-690至Y-704；R-691至N-705；K-692至D-706；V-693至I-707；S-694至V-708；G-695至T-709；S-696至I-710；L-697至P-711；T-698至A-712；P-699至G-713；T-700至A-714；N-701至T-715；Y-702至N-716；G-703至I-717；Y-704至D-718；N-705至V-719；D-706至K-720；I-707至Q-721；V-708至R-722；T-709至S-723；I-710至H-724；P-711至P-725；A-712至G-726；G-713至V-727；A-714至Q-728；T-715至N-729；N-716至D-730；I-717至G-731；D-718至N-732；V-719至Y-733；K-720至L-734；Q-721至A-735；R-722至L-736；S-723至K-737；H-724至T-738；P-725至A-739；G-726至D-740；V-727至G-741；Q-728至Q-742；N-729至Y-743；D-730至L-744；G-731至L-745；N-732至N-746；Y-733至G-747；L-734至N-748；A-735至L-749；L-736至A-750；K-737至I-751；T-738至S-752；A-739至A-753；D-740至I-754；G-741至E-755；Q-742至Q-756；Y-743至D-757；L-744至I-758；L-745至L-759；N-746至V-760；G-747至K-761；N-748至G-762；L-749至T-763；A-750至I-764；I-751至L-765；S-752至K-766；A-753至Y-767；I-754至S-768；E-755至G-769；Q-756至S-770；D-757至I-771；I-758至A-772；L-759至T-773；V-760至L-774；K-761至E-775；G-762至R-776；T-763至L-777；I-764至Q-778；L-765至S-779；K-766至F-780；Y-767至R-781；S-768至P-782；G-769至L-783；S-770至P-784；I-771至E-785；A-772至P-786；T-773至L-787；L-774至T-788；E-775至V-789；R-776至Q-790；L-777至L-791；Q-778至L-792；S-779至T-793；F-780至V-794；R-781至P-795；P-782至G-796；L-783至E-797；P-784至V-798；E-785至F-799；P-786至P-800；L-787至P-801；T-788至K-802；V-789至V-803；Q-790至K-804；L-791至Y-805；L-792至T-806；T-793至F-807；V-794至F-808；P-795至V-809；G-796至P-810；E-797至N-811；V-798至D-812；F-799至V-813；P-800至D-814；P-801至F-815；K-802至S-816；V-803至M-817；K-804至Q-818；Y-805至S-819；T-806至S-820；F-807至K-821；F-808至E-822；V-809至R-823；P-810至A-824；N-811至T-825；D-812至T-826；V-813至N-827；D-814至I-828；F-815至I-829；S-816至Q-830；M-817至P-831；Q-818至L-832；S-819至L-833；S-820至H-834；K-821至A-835；E-822至Q-836；R-823至W-837；A-824至V-838；T-825至L-839；T-826至G-840；N-827至D-841；I-828至W-842；I-829至S-843；Q-830至E-844；P-831至C-845；L-832至S-846；L-833至S-847；H-834至T-848；A-835至C-849；Q-836至G-850；W-837至A-851；V-838至G-852；L-839至W-853；G-840至Q-854；D-841至R-855；W-842至R-856；S-843至T-857；E-844至V-858；C-845至E-859；S-846至C-860；S-847至R-861；T-848至D-862；C-849至P-863；G-850至S-864；A-851至G-865；G-852至Q-866；W-853至A-867；Q-854至S-868；R-855至A-869；R-856至T-870；T-857至C-871；V-858至N-872；E-859至K-873；C-860至A-874；R-861至L-875；D-862至K-876；P-863至P-877；S-864至E-878；G-865至D-879；Q-866至A-880；A-867至K-881；S-868至P-882；A-869至C-883；T-870至E-884；C-871至S-885；N-872至Q-886；K-873至L-887；A-874至C-888；L-875至P-889；和/或K-876至L-890。
编码这些多肽片段的多核苷酸均包括在本发明中。
其他非排他性优选抗原性表位包括此处公开的抗原性表位，以及其部分。抗原性表位可用于例如产生抗体，包括单克隆抗体，其特异性结合表位。优选的抗原性表位包括此处公开的抗原性表位以及两个、三个、四个、五个或更多这些抗原性表位的任意组合。抗原性表位可用做免疫检测中的靶分子。(见如，Wilson等，细胞37：767-778(1984)；Sutcliffe等，科学219：660-666(1983))。
类似地，免疫原性表位可用于例如根据本领域已知的方法诱导抗体(见如，Sutcliffe等，出处同前；Wilson等，出处同前；Chow等，美国国家科学院院报，82：910-914；和Bittle等，普通病毒学杂志，66：2347-2354(1985))。优选的免疫原性表位包括处公开的免疫原性表位以及两个、三个、四个、五个或更多这些免疫原性表位的任意组合。包含一个或多个免疫原性表位的多肽可被呈递用于和载体蛋白(如白蛋白)一起引发动物体系(如兔或鼠)抗体应答，或者，如果多肽是足够长(至少约25个氨基酸)，多肽可被呈递而无须载体。但是，包含少至8-10个氨基酸的免疫原性表位已显示足以引发能结合至至少在变性多肽的线性表位上的抗体(例如，在Western印迹)。
本发明的带有表位的多肽可根据本领域周知的方法用于诱导抗体，包括但不限于体内免疫，体外免疫和噬菌体展示方法。见如Sutcliffe等，出处同前；Wilson等，出处同前；和Bittle等，普通病毒学杂志，66：2347-2354(1985)。如果使用体内免疫，动物可用游离肽免疫；但是，抗肽抗体的效价可利用将肽偶联于大分子载体(如匙孔槭血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素)的方法加强免疫。例如，含有半胱氨酸残基的肽可利用如间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)的连接子偶联到载体上，而其他肽可利用更一般的连接剂(如戊二醛)偶联到载体。利用游离或载体偶联的肽免疫接种动物，如兔、大鼠和小鼠，方法是例如利用含有于100μg肽或载体蛋白以及福氏佐剂(或任何已知用于刺激免疫反应的其他佐剂)的乳液腹膜内和/或真皮内注射。可需要数次加强免疫注射，例如以约两周间隔，以提供可被利用吸附到固相表面的游离肽例如ELISA检测的抗肽抗体的有用的效价。来自免疫动物血清中抗肽抗体的效价可通过抗肽抗体是筛选而增加，方法是例如利用肽对固体支持物的吸附以及根据本领域已知方法的所选抗体的洗脱。
本领域技术人员知晓，且如上所述，包含免疫原性或抗原性表位的本发明的多肽可被融合到其他多肽序列上。例如，本发明的多肽可与免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的恒定区或其部分(CH1，CH2，CH3，或其任意组合和其部分)融合，得到嵌合多肽。这种融合蛋白质可促进纯化且可增加体内的半寿期。这已经由这样的蛋白质所证实：由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链之恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白质。见，如EP394827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988)。对于偶联于FcRn结合配偶体(partner，如IgG或Fc片段)的抗原已证实了具有增强的抗原跨表皮屏障向免疫系统的递送(见，如PCT公开文本WO 96/22024和WO 99/04813)。由于IgG部分二硫键而具有二硫键连接的二聚结构IgG融合蛋白质也发现在结合及中和其他分子方面比仅仅是单体多肽或其片段更有效。见，如，Fountoulakis等，生物化学杂志，270：3958-3964(1995)。编码上述表位的核酸也可作为表位标签(tag)与目标基因重组(例如血凝素(HA)标签或flag标签)以帮助表达的多肽之检测和纯化。例如，由Janknecht等描述的系统允许对在人类细胞系中表达的非变性融合蛋白质的方便的纯化(Janknecht等，1991，美国国家科学院院报，88：8972-897)。在该系统中，将目标基因亚克隆入牛痘重组质粒，使得基因的开放阅读框架翻译性融合到由6组氨酸残基组成的氨基末端标签。标签用做一种用于融合蛋白质的基质结合结构域。用重组痘苗病毒感染的细胞之提取物上样于 次氮基乙酸-琼脂糖柱且组氨酸标记的蛋白质可被选择性的用含咪唑的缓冲液洗脱。
本发明的其他融合蛋白质可用基因改构(shuffling)、基元改构、外显子改构和/或密码子改构(一并称为“DNA改构”)技术来产生。DNA改构可用来调节本发明多肽的活性，这种方法可用于产生具有改变的活性之多肽，以及多肽的激动剂和拮抗剂。见美国专利5605793；5811238；5830721；5834252和5837458，以及Patten等，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33(1997)；Harayama，Trends biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson等，分子生物学杂志，287：265-76(1999)；以及Lorenzo和Blasco，生物技术，24(2)：308-13(1998)(在此各个全文引入作为参考)。在一个实施方案中，相应于SEQ ID NO：1或3的多肽以及由这些多核苷酸编码的多肽之改变可通过DNA改构实现。DNA改构包括通过同源或定点重组组装两个或多个DNA区段以产生多核苷酸序列中的变化。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸或编码的多肽可通过由差错倾向的PCR经历随机突变而被改变。在另一个实施方案中，编码本发明多肽的多核苷酸之一个或多个元件、基元、区段、部分、结构域、片段等可与一个或多个异源分子的元件、基元、区段、部分、结构域、片段等重组。
由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚结构之融合蛋白质也发现在结合及中和其他分子方面比仅仅是单体多肽或其片段更有效。见，如，Fountoulakis等，生物化学杂志，270：3958-3964(1995)。编码上述表位的核酸也可作为表位标签与目标基因重组以帮助表达的多肽之检测和纯化。
本发明还涉及抗体和可特异性与本发明的多肽结合之T细胞抗原受体(TCR)。本发明的抗体包括IgG(包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgA(包括IgA1和IgA2)，IgD，IgE，或IgM和IgY。此处所用术语“抗体”(Ab)是指包括完整抗体(包括单链完整抗体)及其抗原结合片段。最优选的抗体是本发明的人类抗原结合抗体片段，包括但不限于Fab，Fab’，F(ab’)2，Fd，单链Fv(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗体可为任何动物来源的，包括鸟类和哺乳动物类。优选的，抗体是人，鼠，兔，山羊，豚鼠，骆驼，马或鸡。
抗原结合抗体的片段(包括单链抗体)可包括单独的可变区，或与完整或部分的如下分子相组合：铰链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区与铰链区，CH1，CH2和CH3结构域的任意组合。本发明进一步包括单克隆抗体，多克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体和人单克隆抗体和多克隆抗体，其特异性结合本发明的多肽。本发明还包括与本发明的抗体为抗独特型(anti-idiotypic)的抗体
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或者更高的多重特异性。多重特异性抗体可对本发明的多肽之不同的表位具有特异性，或可对本发明的多肽以及对异源组分(如异源多肽或固体支持物材料)均具有特异性。见如WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt，A，等，(1991)免疫学杂志，147：60-69；美国专利5573920，4474893，5601819，4714681，4925648；Kostelny，S.A.等，(1992)免疫学杂志，148：1547-1553。
本发明的抗体可用本发明的多肽之表位或部分来描述或明晰，所述表位或部分可被抗体识别或特异性结合。表位或多肽部分可如此处所述明晰，例如，通过N-末端和C-末端位置，通过相邻氨基酸残基的大小，或如表和图中所罗列的方法。特异性结合任意本发明表位或多肽的抗体也可被排除。因此本发明包括特异性结合本发明多肽的抗体，且允许这些抗体被排除。
本发明的抗体也可被用其交叉反应性来描述或明晰。包括了不与本发明的多肽之任何其他类似物、定向进化同源物或同源物结合的抗体。不与同本发明的多肽低于如下同一性的多肽相结合的抗体也包括在本发明中：低于95％，低于90％，低于85％，低于80％，低于75％，低于70％，低于65％，低于60％，低于55％，低于50％(如利用此处所述的方法或本领域已知的方法计算)。还包括在本发明中的是仅于由这样的多核苷酸编码的多肽结合的抗体，其中所述多核苷酸在严谨条件下(如此处所述)可与本发明的多核苷酸杂交。本发明的抗体也可用其结合亲和性描述或明晰。优选的结合亲和性包括那些具有低于如下所述值的解离常数或Kd的那些：5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M。
本发明的抗体具有如下用途，包括但不限于，本领域已知的纯化、检测和靶定本发明的多肽的方法，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，抗体具有在免疫检测中的用途用于定性和定量测定本发明多肽在生物学样品中的水平。见如，Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)(此处引入作为参考)。
本发明的抗体也可单独或与其他组分结合使用。抗体可进一步与异源多肽在N-或C-末端融合，或与多肽或其他组分化学偶联(包括共价的和非共价的偶联)。例如，本发明的抗体可与用做检测分析中的标记之分子和效应物分子(如异源多肽、药物或毒素)重组融合或偶联。见如WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5314995和EP0396387。
本发明的多肽可利用本领域已知的任何适当的方法制备。例如，本发明的多肽或其抗原性片段可被施用于动物，以诱导含有多克隆抗体的血清的产生。术语“单克隆抗体”是指来自单一克隆的抗体，包括真核、原核或噬菌体克隆，而不是由产生该克隆的方法制备。单克隆抗体可利用多种本领域已知的方法制备，包括利用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。
杂交瘤技术包括本领域周知的技术，如Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤，563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中教导(此处全文引入作为参考)。Fab和F(ab’)2片段可使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胰蛋白酶(产生F(ab’)2片段)利用蛋白质切割制备。
或者，本发明的抗体可通过应用重组DNA技术和噬菌体展示技术或通过利用本领域已知的合成方法制备。例如，本发明的抗体可利用多种本领域已知的噬菌体展示技术制备。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在带有编码本发明抗体的多核苷酸序列之噬菌体颗粒的表面。具有期望的结合性质的噬菌体从文库或组合抗体库中筛选(例如人或鼠)，方法是用抗原直接筛选，一般是抗原结合或被捕获到固体表面或珠上。用在这些方法中的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括带有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组地融合的Fab，Fv或二硫键稳定化的Fv抗体结构域。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括在如下中公开的那些：Brinkman U.et al.(1995)J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames，R.S.et al.(1995)J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough，C.A.et al.(1994)Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic，L.et al.(1997)Gene 187：9-18；Burton，D.R.et al.(1994)Advances in Immunology 57：191-280；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO95/20401；和US Patents 5,698,426，5,223,409，5,403,484，5,580,717，5,427,908，5,750,753，5,821,047，5,571,698，5,427,908，5,516,637，5,780,225，5,658,727和5,733,743(此处全文引入作为参考)
如上述文献所述，在噬菌体筛选后，来自噬菌体的抗体编码区可被分离，且用于产生完整抗体，包括人类抗体，或任何其他期望的抗原结合片段，并在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母和细菌。例如，用于重组产生Fab，Fab’和F(ab’)2片段的技术可利用本领域已知的那些方法，见如WO 92/22324；Mullinax，R.L.等(1992)生物技术，12(6)：864-869；和Sawai，H等(1995)，AJRI34：26-34；和Better，M.等，(1988)科学，240：1041-1043(此处引入作为参考)。
本发明进一步的多肽涉及与本发明的SEQ ID NO：2和/或4的多肽、多肽片段或变体和/或与表位免疫特异性结合的抗体和T细胞抗原受体(TCR)如本领域已知的针对特异性抗体-抗原结合的分析之免疫检测测定)。本发明的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、多重特异性、人、人源化或嵌合的抗体，单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab片段表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗本发明的抗体之抗Id抗体)和任意上述带有表位的片段。术语“抗体”如此处所用，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，即：含有免疫特异性结合一种抗原的抗原结合位点之分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任意类型的(例如，IgG，IgA，IgD，IgE，或IgM和IgY)、分型(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)和免疫球蛋白分子的亚型。
最优选的抗体是本发明的人抗原结合抗体片段，包括但不限于Fab，Fab’，F(ab’)2，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合抗体的片段(包括单链抗体)可包括单独的可变区，或与完整或部分的如下分子相组合：铰链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区与铰链区，CH1，CH2和CH3结构域的任意组合。抗体可为任何动物来源的，包括鸟类和哺乳动物类。优选的，抗体是人，鼠(包括大鼠和小鼠)，驴、ship兔，山羊，豚鼠，骆驼，马或鸡。此处所用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或从动物中分离，所述动物利用一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源免疫球蛋白(如下所述)，例如美国专利5939598(Kucherlapati等)所述。
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或者更高的多重特异性。多重特异性抗体可对本发明的多肽之不同的表位具有特异性，或可对本发明的多肽以及对异源组分(如异源多肽或固体支持物材料)均具有特异性。见如WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt，A，等，(1991)免疫学杂志，147：60-69；美国专利5573920，4474893，5601819，4714681，4925648；Kostelny，S.A.等，(1992)免疫学杂志，148：1547-1553。
本发明的抗体可用本发明的多肽之表位或部分来描述或明晰，所述表位或部分可被抗体识别或特异性结合。表位或多肽部分可如此处所述明晰，例如，通过N-末端和C-末端位置，通过相邻氨基酸残基的大小，或如表和图中所罗列的方法。优选的本发明的表位包括：SEQ ID NO：2的氨基酸2-14，32-44，47-60，66-78，87-103，109-118，146-162，168-180，183-219，223-243，275-284，296-306，314-334，341-354，357-376，392-399，401-410，418-429，438-454，456-471，474-488，510-522，524-538，550-561，565-626，630-643，659-671，679-721，734-749，784-804，813-820，825-832，845-854，860-894，899-917，919-924和928-939和SEQ ID NO：4的氨基26-38，45-52，69-76，80-99，105-113，129-136，138-217，254-263，273-289，294-313，321-331，339-356，371-383，417-427，438-443，459-471，479-505，507-526，535-546，550-607，615-640，648-653，660-667，669-681，683-704，717-732，737-743，775-787，797-804，811-825，840-867和870-884，以及包括编码这些表位的多核苷酸。特异性结合任意本发明表位或多肽的抗体也可被排除。因此本发明包括特异性结合本发明多肽的抗体，且允许这些抗体被排除。
本发明的抗体也可被用其交叉反应性来描述或明晰。包括了不与本发明的多肽之任何其他类似物、定向进化同源物或同源物结合的抗体。不与同本发明的多肽低于如下同一性的多肽相结合的抗体也包括在本发明中：低于95％，低于90％，低于85％，低于80％，低于75％，低于70％，低于65％，低于60％，低于55％，低于50％(如利用此处所述的方法或本领域已知的方法计算)。在一个特定实施方案中，本发明的抗体与人类蛋白质和其相应的表位之小鼠、大鼠和/或兔同源物交叉反应。不与同本发明的多肽低于如下同一性的多肽相结合的抗体也包括在本发明中：低于95％，低于90％，低于85％，低于80％，低于75％，低于70％，低于65％，低于60％，低于55％，低于50％(如利用此处所述的方法或本领域已知的方法计算)。在一个特定实施方案中，上述交叉反应性是任一单一抗原性或免疫原性多肽，或是此处公开的2，3，4，5或更多特定抗原性和/或免疫原性多肽的组合。还包括在本发明中的是仅于由这样的多核苷酸编码的多肽结合的抗体，其中所述多核苷酸在严谨条件下(如此处所述)可与本发明的多核苷酸杂交。本发明的抗体也可用其结合亲和性描述或明晰。优选的结合亲和性包括那些具有低于如下所述值的解离常数或Kd的那些：5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M。
本发明还提供了竞争性抑制一种抗体与本发明的表位结合的抗体，所述抑制利用本领域周知的用于确定竞争性结合的任一方法测定，例如此处所述的免疫检测。在优选的实施方案中，抗体竞争性抑制与表位的至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，至少50％的结合。
本发明的抗体还可作为本发明多肽的拮抗剂或激动剂。例如，本发明包括部分或全部破坏受体/配体与本发明的多肽相互作用的抗体。优选地，本发明的抗体结合此处公开的抗原性表位，或其部分。本发明包括了受体特异性抗体和配体特异性抗体。本发明还包括了不阻止配体结合但阻止受体活化的受体特异性抗体。受体活化(即：信号传递)可利用此处所述的技术或本领域周知的技术测定。例如，受体活化可利用免疫沉淀检测受体或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)随后是Western印迹分析(例如，出处同前)来确定。在一个特定的实施方案中，提供了可抑制在缺乏抗体时配体活性或受体活性之至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，至少50％的抗体。
本发明还包括受体特异性抗体(其既阻止配体结合和受体活化)，以及识别受体配体复合物的抗体，且优选不特异性识别未结合的受体或未结合的配体。类似地，本发明包括了中和抗体，其结合配体，并阻止配体与受体的结合，以及结合配体由此阻止受体活化(但不阻止配体结合受体)的抗体。这些抗体可作为受体激动剂，即：增效或活化配体介导的受体活化之生物活性的全部或部分，例如通过诱导受体的二聚化。抗体可明晰为生物活性的激动剂、拮抗剂或反向激动剂，所述生物活性包括此处公开的本发明的肽之特定的生物活性。上述抗体激动剂可利用本领域周知的方法制备。见PCT公开文本WO96/40281；美国专利5811097；Deng et al.，Blood92(6)：1981-1988(1998)；Chen et al.，Cancer Res.58(16)：3668-3678(1998)；Harrop etal.，J.Immunol.161(4)：1786-1794(1998)；Zhu et al.，Cancer Res.58(15)：3209-3214(1998)；Yoon et al.，J.Immunol.160(7)：3170-3179(1998)；Prat et al.，J.Cell.Sci.111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard et al.，J.Immunol.Methods 205(2)：177-190(1997)；Liautard et al.，Cytokine 9(4)：233-241(1997)；Carlson et al.，J.Biol.Chem.272(17)：11295-11301(1997)；Taryman et al.，Neuron 14(4)：755-762(1995)；Muller etal.，Structure6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek et al.，Cytokine8(1)：14-20(1996)(此处全文引入作为参考)
本发明的抗体具有如下用途，包括但不限于，例如本领域已知的纯化、检测和靶定本发明的多肽的方法，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，抗体具有在免疫检测中的用途用于定性和定量测定本发明多肽在生物学样品中的水平。见如，Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)(此处引入作为参考)。
本发明的抗体也可单独或与其他组分结合使用。抗体可进一步与异源多肽在N-或C-末端融合，或与多肽或其他组分化学偶联(包括共价的和非共价的偶联)。例如，本发明的抗体可与用做检测分析中的标记之分子和效应物分子(如异源多肽、药物或毒素)重组融合或偶联。见如WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5314995和EP0396387。
本发明的抗体包括如下修饰的衍生物，即通过共价结合任一类型的分子到抗体，使得共价结合不阻止抗体产生抗独特型反应。例如，但不是限制性的，抗体衍生物包括具有如下修饰的抗体，包括糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护基团/封闭基团的衍生化、蛋白质切割、连接到细胞配体或其他蛋白质等。可利用本领域抑制的技术进行任一多种化学修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢性合成等。另外，衍生可含有一个或多个非经典氨基酸。
本发明的抗体可利用本领域已知的适当方法制备。针对目标抗原的多克隆抗体可利用本领域已知的多种方法制备。例如，本发明的多肽可施用于多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等以诱发含有对该抗原特异的多克隆抗体之血清的产生。可利用多种佐剂增加免疫反应，取决于宿主种类，包括但不限于，弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人类佐剂，如BCG(bacille calmette-Guerin)和Corynebacterium parvum。这类佐剂为本领域周知。
本发明的单克隆抗体可利用本领域已知的任何适当的方法制备。包括利用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合。例如可利用杂交瘤技术包括那些本领域已知的方法和教导制备单克隆抗体，例如在Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)；Hammerling等，单克隆抗体和T-细胞杂交瘤563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述文献此处引入作为参考)。术语“单克隆抗体”在此处所用不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指一种来源于一种单一克隆，例如任一原核的、真核的或噬菌体克隆，且不是其所产生的方法。
利用杂交瘤技术制备和筛选特异性抗体的方法为本领域已知的常规方法，且在实施例中详细描述。在非限定性实施例中，小鼠用本发明的多肽或表达该多肽的细胞免疫。一旦检测到免疫反应，例如在小鼠血清中检测到特异于抗原的抗体，则收获小鼠脾脏，分离脾细胞。然后利用已知的技术将脾细胞与适当的杂交瘤细胞融合，例如与来自ATCC的细胞系SP20融合。利用有限稀释法筛选并克隆杂交瘤。然后利用本领域已知技术分析杂交瘤克隆中分泌能结合本发明多肽的抗体之细胞。可利用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠以产生通常含有高水平抗体的腹水。
因此，本发明提供了产生单克隆抗体的方法，以及由如下方法产生抗体的方法，包括：培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地杂交瘤由从用本发明的抗原免疫之小鼠分离的脾细胞同骨髓瘤细胞融合而产生，然后筛选由融合得到的杂交瘤之分泌能结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。
识别特异性表位的抗体片段可利用已知技术产生。例如，本发明的Fab和F(ab’)2片段可使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胰蛋白酶(产生F(ab’)2片段)利用蛋白质切割免疫球蛋白分子制备。F(ab’)2含有可变区，轻链恒定区和重链的CH1结构域。
例如，本发明的抗体可利用多种本领域已知的噬菌体展示技术产生。在噬菌体展示方法中，在带有编码功能性抗体结构域的多核苷酸序列之噬菌体颗粒表面上展示了该功能性抗体结构域。在一个特定实施方案中，这种噬菌体可用于展示从“药库”或组合抗体文库(例如，人和鼠)中表达的抗原结合结构域。表达与目标抗原结合的抗原结合结构域之噬菌体可利用抗原筛选或鉴定，例如使用标记的抗原或结合(或俘获)到固相表面或珠上的抗原。用于这些方法中的噬菌体一般为丝状噬菌体，包括fd和M13结合结构域，其从这样的噬菌体中表达：带有Fab、Fv或二硫键稳定化的Fv抗体结构域(与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组性融合)之噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括那些公开在如下文献中的：
Brinkman et al.，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ameset al.，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187：9-18(1997)；Burton et al.，Advances inImmunology 57：191-280(1994)；PCT application No.PCT/GB91/01134；PCTpublications WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和U.S.Patent Nos.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；
(此处全文引入作为参考)
如上述文献所述，噬菌体筛选后，来自噬菌体的抗体编码区可被分离并用于产生完整抗体，包括人类抗体，或任何其他期望的抗体结合片段，并表达在任一期望的宿主，包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌等，如下面详述。例如，重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术可以利用本领域已知的方法采用，例如那些公开在PCT公开文本WO92/22324；Mullinax等，生物技术，12(6)864-869；和Sawai等，AJRI，34：26-34(1995)；和Better等，科学，240：1041-1043(1998)(此处全文引入作为参考)。
可用于制备单链Fv和抗体的技术的例子包括那些公开在美国专利4946778和5258498；Huston等，酶学方法，203：46-88(1991)；shu等，PNAS，90：7995-7999(1993)；和Skerra等，科学，240：1038-1040(1988)。对于一些用途，包括抗体在人体内的应用和体外检测分析，优选地使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是这样一种分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物种类，诸如抗体具有来自鼠单克隆抗体的可变区，以及人免疫球蛋白恒定区。用于产生嵌合抗体的方法为本领域已知，例如见Morrison等，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术，4：214(1986)；Gillies等，(1989)免疫方法杂志，125：191-202；美国专利5807715；4816567和4816397，在此引入作为参考。人源化抗体是来自非人种类的抗体分子：其具有来自非人种类的一种或多种互补决定区(CDR)的期望的抗原，以及一个来源于人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区中的框架分子可用来自CDR供体的相应残基替代，以改变，优选地改善抗原结合。这些框架替换可通过本领域已知的方法鉴定，例如CDR与框架残基的相互作用建模，以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，和序列比较以鉴定在特定位置的非常用框架残基(见，如Queen等，美国专利5585089；Riechmann等，自然，332：323(1988)，在此引入作为参考)。可利用多种本领域知晓的方法人源化抗体，包括例如CDR-移植(EP239400；PCT公开文本WO91/09967；美国专利5225539；5530101和5585089)，修饰(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP 592106；EP 519596；Padlan，分子免疫学，28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程，7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS91：969-973(1994))和链改构(shuffling)(美国专利5565332)。
完整的人抗体特别期望用于人类患者的治疗性处理。人抗体可利用多种本领域已知方法制备，包括上面描述的利用来自人免疫球蛋白分子的抗体文库之噬菌体展示方法。见，如美国专利4444887；和4716111；和PCT公开文本WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741；在此引入作为参考。
人类抗体也可利用转基因小鼠制备，所述小鼠不能表达有功能的内源性免疫球蛋白，但是能表达人免疫球蛋白基因。例如，可随机引入或通过同源重组方法将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物导入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，将人可变区、恒定区和多变区导入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可为非功能性的分别引入，或用同源重组方法与人免疫球蛋白基因座引入。特别地，JH区的纯合性缺失防止了内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射入胚泡中产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠产生表达人抗体的纯合后代。用所选抗原(例如，所有或部分本发明的多肽)用常规方法免疫转基因小鼠。可利用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化中重新排列(rearrange)，随后经历了类型转换合体细胞突变。因此，利用这类技术，可能制备治疗上有用的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。关于制备人类抗体的技术综述，参见Lonberg和Huszar，国际免疫学综述，13：65-93(1995)。对于制备人抗体和人单克隆抗体的技术以及制备这类抗体的方案的详细讨论见例如，PCT公开文本WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/33735；欧洲专利0598877；美国专利5413923；5625126；5633425；5569825；5661016；5545806；5814318；5885793；5916771和5939598，在此引入作为参考。此外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和GenPharm(San Jose，CA)可用类似于上述的方法来提供针对所选抗原的人抗体。
可利用称为“指导性选择”的技术产生识别所选表位的完整人抗体。在此方法中，所选的非人单克隆抗体例如鼠抗体可用于指导识别相同表位的完整人抗体的选择(Jespers等，生物/技术，12：899-903)。
此外，针对本发明多肽的抗体可反过来用于产生“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体，方法是利用本领域已知的技术(见，如Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)：437-444(1989)和Nissinoff，免疫学杂志，147：(8)2429-2438(1991))。例如，可利用结合且竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体结合之抗体来产生这样的抗独特型，其“模拟”多肽聚合化和/或结合结构域(以及作为结果)结合并中和多肽和/或其配体。这类中和抗独特型或这类抗独特型的Fab片段可用于治疗方案中以中和多肽配体。例如，这类抗独特型抗体可被用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，由此阻断其生物学活性。
可用于产生单链Fv和抗体的技术的例子包括那些可用于制备单链Fv和抗体的技术的例子包括那些公开在美国专利4946778和5258498；Huston等，酶学方法，203：46-88(1991)；shu等，PNAS，90：7995-7999(1993)；和Skerra等，科学，240：1038-1040(1988)。对于一些用途，包括抗体在人体内的应用和体外检测分析，优选地使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是这样一种分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物种类，诸如抗体具有来自鼠单克隆抗体的可变区，以及人免疫球蛋白恒定区。用于产生嵌合抗体的方法为本领域已知，例如见Morrison等，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术，4：214(1986)；Gillies等，(1989)免疫方法杂志，125：191-202；美国专利5807715。可利用多种本领域知晓的方法人源化抗体，包括例如CDR-移植(EP239400；PCT公开文本WO91/09967；美国专利5225539；5530101和5585089)，修饰(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP 592106；EP 519596；Padlan，分子免疫学，28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程，7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS91：969-973(1994))和链重构(shuffling)(美国专利5565332)。人抗体可用多种本领域已知的方法制备，包括如上述的噬菌体展示技术。见例如，美国专利4444887；4716111；5545806和5814318；和WO98/46645(此处引入作为参考)。
还包括在本发明中的是与本发明的多肽重组性融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)的抗体。抗体可特异于本发明多肽之外的抗原。例如，抗体可用于靶定本发明多肽至特定的细胞类型，无论是体内还是体外，方法是将本发明的多肽与特异于特定细胞表面受体的抗体偶联或融合。与本发明的多肽偶联或融合的抗体也可利用本领域已知的方法用于体外免疫检测和纯化。见如，Harbor等，出处同前和WO93/21232；EP0439095；Naramura，M.等，(1994)免疫学通讯，39：91-99；美国专利5474981；Gillies，S.O.，等(1992)，PNAS 89：1428-1432；Fell，H.P.等，(1991)免疫学杂志，146：2446-2452(此处引入作为参考)。
本发明还包括含有与可变区之外的抗体结构域融合或偶联的本发明多肽之组合物。例如，本发明的多肽可与抗体Fc区或其部分融合或偶联。与本发明抗体融合或偶联的抗体可包含铰链区，CH1结构域，CH2结构域，CH3结构域或完整结构域或其部分的任一组合。本发明的多肽可与上述抗体部分融合或偶联以增加多肽的体内半寿期，或用于利用本领域已知方法的免疫检测。多肽也可与上述抗体部分融合或偶联以形成多聚体。例如，与本发明多肽融合的Fc部分可通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。利用多肽与IgA和IgM部分融合可制备更高的多聚体形式。用于将本发明多肽融合或偶联与抗体部分的方法为本领域周知。见如，美国专利5336603；5622929；5359046；5349053；5447851；5112946；EP0307434；EP0367166；WO96/04388；WO91/06570；Ashkenazi，A.等(1991)，PNAS 88：10535-10539；Zheng，X.X.等，(1995)免疫学杂志，154：5590-5600；和Vil，H.等(1992)PNAS 89：11337-11341(此处引入作为参考)。
本发明还涉及作为本发明多肽之激动剂或拮抗剂的抗体。作为本发明多肽之激动剂或拮抗剂的抗体包括例如，部分或全部破坏本发明的多肽与受体/配体相互作用的抗体。例如，本发明包括破坏本发明蛋白质多聚化能力的抗体。在另一例中，本发明包括允许本发明蛋白质多聚化但是破坏本发明蛋白质与一种或多种METH 1和/或METH 2受体/配体结合的能力的抗体。在另一例中，本发明包括允许本发明蛋白质多聚化且与一种或多种METH 1和/或METH 2受体/配体结合，但是阻断与METH 1和/或METH 2受体/配体复合物相关的生物活性的能力的抗体。
作为本发明多肽之激动剂或拮抗剂的抗体还包括受体特异性抗体和配体特异性抗体。包括不阻断配体结合但是阻断受体活化的受体特异性抗体。受体活化(即信号传递)可利用此处所述的技术测定或用本领域已知的技术完成。还包括既阻断配体结合又阻断受体活化的受体特异性抗体。类似地，包括结合配体并阻止配体与受体结合的中和抗体，以及结合配体，由此阻止受体活化但是不阻止配体结合受体的抗体。也包括活化受体的抗体。这些抗体可作为由配体介导的受体活化所实现的全部或不足全部的生物活性之激动剂。这些抗体可表示为生物活性(包括此处所述的特定活性)之激动剂或拮抗剂。上述抗体激动剂可利用本领域已知方法制备，见如
                                      WO 96/40281；US Patent Number 5,811,097；Deng，B.et al.，Blood 92(6)：1981-1988(1998)；Chen，Z.et al.，Cancer Res.58(16)：3668-3678(1998)；Harrop，J.A.et al.，J.Immunol.161(4)：1786-1794(1998)；Zhu，Z.et al.，Cancer Res.58(15)：3209-3214(1998)；Yoon，D.Y.et al.，J.Immunol.160(7)：3170-3179(1998)；Prat，M.et al.，J.Cell.Sci.111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard，V.et al.，J.Immunol.Methods 205(2)：177-190(1997)；Liautard，J.et al.，Cytokine 9(4)：233-241(1997)；Carlson，N.G.et al.，J.Biol.Chem.272(17)：11295-11301(1997)；Taryman，R.E.et al.，Neuron 14(4)：755-762(1995)；Muller，Y.A.et al.，Structure 6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek，P.et al.，Cytokine 8(1)：14-20(1996)
(此处引入作为参考)
如上述，针对本发明METH 1和/或METH 2蛋白质的抗体可反过来利用本领域已知的技术用于产生“模拟”METH 1和/或METH 2的抗独特型抗体。(见如Greenspan & Bona，FASEB J.，7(5)：437-444；(1989)和Nissionff，免疫学杂志，147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合METH 1和/或METH 2且竞争性抑制METH 1和/或METH 2多聚化和/或结合至配体的抗体可用于产生“模拟”METH 1和/或METH 2多聚化和/或结合结构域的抗独特型抗体，且作为结果，结合并中和METH 1和/或METH 2和/或其配体。这类抗独特型抗体或其Fab片段可用在治疗方案中以中和METH 1和/或METH 2配体。例如这类抗独特型抗体可用于结合METH 1和/或METH 2，或结合METH 1和/或METH 2配体/受体，由此阻断METH 1和/或METH 2的生物学活性。
编码抗体的多肽
本发明还包括包含编码本发明抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括在严谨或低度严谨杂交条件下(例如，如前述)可与编码抗体(优选地特异性结合于本发明多肽的抗体，优选地，结合于具有SEQ ID NO：2和/或4的氨基酸序列之多肽的抗体)杂交的多核苷酸。
可获得多核苷酸并利用本领域知晓的任一方法确定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果知晓抗体的核苷酸序列，编码抗体的多核苷酸可由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier等，生物技术，17：242(1994)中所述)，其，简言之，包括含有编码抗体之序列部分的重叠寡核苷酸的合成，将这些寡核苷酸退火并连接，然后利用PCR扩增所连接的寡核苷酸。
或者，可从适当来源的核苷酸中产生编码抗体的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核苷酸之克隆不可得，但是抗体分子的序列已知，可化学合成或从适当的来源获得编码免疫球蛋白的核苷酸(例如，从抗体CDNA文库，或从核酸(优选poly A+RNA)产生的cDNA文库中，所述核酸从表达该抗体的任何组织或细胞(如筛选用来表达本发明抗体的杂交瘤)中分离。)，方法是利用可与序列的3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或利用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针克隆，以鉴定例如来自cDNA文库的编码该抗体的cDNA克隆。由PCR产生的扩增核苷酸可利用本领域周知的任一方法被克隆到可复制克隆载体中。
一旦抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列测定，抗体的核苷酸序列可利用本领域周知的核苷酸序列操作方法加以操作，例如重组DNA技术，定点突变，PCR等(见，例如，Sambrook等，1990，分子克隆：实验室手册，2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY和Ausubel等编，1998，分子生物学现代方法，John Wiley & Sons，NY，均在此引入作为参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替换、缺失和/或插入。
在特定实施方案中，重链和/或轻链可变区结构域的氨基酸序列可利用本领域周知的方法(例如，与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定高可变区序列的区域)被研究，以鉴定互补性决定区(CDR)。利用常规的重组DNA技术，可在框架区中插入一个或多个CDR，例如，插入人框架区以人源化非人类抗体，如前述。框架区可为天然存在的或共有序列的框架区，且优选为人框架区(见如，Chothia等，分子生物学杂志，278：457-479(1998)给出了人框架区的列表)。优选的，由框架区与CDR之组合产生编码特异性结合本发明多肽之抗体。优选的，如上述，可在框架区内进行一个或多个氨基酸替换，且优选地，氨基酸替换改善了抗体与其抗原的结合。此外，这种方法可用于进行一个或多个参与链间二硫键的可变区半胱氨酸的替换或删除，以产生缺乏一个或多个链间二硫键的抗体分子。其他多核苷酸的改变也包括在本发明的范围中且为本领域技术人员知识范围内。
此外，可使用制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等，美国国家科学院院报，81：851-855(1984)；Neuberger等，自然，312：604-608(1984)；Takeda等，自然，314：452-454(1985))，方法是将合适的抗原特异性之来自鼠抗体分子的基因与具有适当的生物学活性的人抗体分子基因一起剪接。如前述，嵌合抗体是一种不同部分来自与不同动物种类的分子，如那些具有来自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子，例如人源化抗体。
或者，可采用制备单链抗体的技术(美国专利，4946778；Bird，科学，242：423-42(1988)；Houston等，美国国家科学院院报，85：5879-5883(1988)；和Ward等，自然，334：544-54(1989))制备单链抗体。单链抗体可通过将Fv区的重链和轻链片段用氨基酸桥连接来形成，得到单链多肽。用于在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术也可采用(Skerra等，科学，242：1038-1041(1988))。
制备抗体的方法
本发明的抗体可利用本领域已知的用于合成抗体(特别是用化学合成或优选的重组表达技术)任何方法制备。
本发明抗体或其片段、衍生物或其类似物(例如本发明抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达需要含有编码该抗体的多核苷酸之表达载体的构建。一旦获得编码本发明抗体分子或抗体的重链/轻链或其部分(优选含有重链或轻链可变区结构域)的多核苷酸，可通过重组DNA技术利用本领域已知的方法制备产生本发明抗体分子的载体。由此，在此描述了制备蛋白质的方法，其是通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸。本领域已知的方法均可用于构建含有抗体编码序列、合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术，合成技术和体内遗传重组。本发明因此提供了含有与启动子有效连接的编码本发明抗体分子(或其重链/轻链，或其重链/轻链可变区)之核苷酸序列的可复制载体。这类载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见如，PCT公开文本WO 86/05807；PCT公开文本WO89/01036；和美国专利5122464)，且抗体的可变区结构域可被克隆到用于表达完整重链或轻链的载体中。
表达载体可利用常规方法转化到宿主细胞中，转化的细胞然后通过常规方法培养以产生本发明的抗体。由此，本发明包括含有与异源启动子有效连接的编码本发明抗体、或其重链/轻链、本发明单链抗体的多核苷酸之宿主细胞。在表达双链抗体的一个优选实施方案中，编码重链及轻链的载体可在用于表达完整免疫球蛋白分子的宿主细胞中共表达，如下详述。
多种宿主表达载体系统可用于表达本发明的抗体分子。这类宿主表达系统代表了可产生目标编码序列且随后被纯化的载体，以及当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于如下微生物，如用含有本发明抗体编码序列之重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母、毕赤酵母)；用含有抗体编码分子的重组病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒)；用含有抗体编码分子之病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；马铃薯花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)感染的植物细胞系统；或者带有含来自哺乳动物细胞的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子，痘苗病毒7.5K启动子)的启动子之重组表达构建体之哺乳动物细胞系统。优选地，诸如大肠杆菌的细菌细胞，和更优选地，真核细胞可用于表达重组抗体分子，特别是对于完整重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与诸如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子的载体结合，是一个用于抗体的有效表达系统(Foecking，et al.，Gene，45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/technology 8：2(1990))。
在细菌系统中，可根据待表达的抗体分子的用途有利地选择多种表达载体。例如，当大量这类蛋白需要产生时，用于抗体分子药物组合物的产生，希望直到易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达之载体。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，EMBO J.，2：1791(1983))，其中抗体编码序列可单独地与lacZ编码序列符合读框地连接到载体中，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nuclei Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；等。pGEX载体可用于表达带有谷胱甘肽-S转移酶(GST)。通常，这类融合蛋白质可溶，可利用吸附并结合到谷胱甘肽琼脂糖珠基质中，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱，从裂解的细胞中容易地纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可从GST部分释放。
在昆虫系统中，Autographa californica核多角体蛋白病毒(AcNPV)用作载体表达异源基因。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可被单独克隆入病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)，且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体时，目标抗体编码分子可被连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三个拷贝的前导序列中。此嵌合基因可然后通过体外或体内重组被插入腺病毒基因组中。在病毒基因组非必需区的插入(例如，E1或E3区域)将得到有生命的且能在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(见，如Logan & Shenk，美国国家科学院院报，81：355-359(1984))。可能需要特定起始信号用来有效翻译插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。此外，起始密码子必需于期望的编码序列同相，以确保完整的插入序列的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可为多种来源，天然或合成的。表达的效率可通过包含适当的转录增强子元件，转录终止子等而提高。(见，如Bittner et al，酶学方法，153：51-544(1987))。
此外，宿主细胞菌株可选择以特定的希望的方式调节插入序列表达，或修饰和加工基因产物的那些。蛋白质产物的这类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可能对于蛋白质的功能非常重要。不同宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白质与基因产物之翻译后加工及修饰的机理。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为达到此目的，可使用具有正确加工初级转录子、蛋白质的糖基化和磷酸化的细胞机构之真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERA、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38和特别是乳腺癌细胞系，例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺细胞系，例如CRL7030和Hs578Bst。
为了长期、高产制备重组蛋白质，优选稳定表达。例如，可构建稳定表达抗体分子的细胞系。不是利用含有病毒复制起点的表达载体，而是利用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA转化。外源DNA导入后，可允许构建的细胞在加富培养基中生长1-2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，允许细胞稳定地将质粒整合入其染色体并生长，形成可被克隆的噬斑，并扩展到细胞系。此方法可有利地用于构建表达抗体分子的细胞系。这类构建的细胞系可特别用于筛选和评估直接或间接与抗体分子相互作用的化合物。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler et al，细胞，11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，美国国家科学院院报，48：202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al，细胞，22：817(1980))基因可分别用于tk-，hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物抗性可用于筛选如下基因的基础：dhfr，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler et al，美国国家科学院院报，77：357(1980)；O’Hare et al，美国国家科学院院报，78：1527(1981))；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，美国国家科学院院报，78：2072(1981))；new，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspielet al，Clinical Pharmacy，12：488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science，260：926-932(1993)；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，1993，TIB TECH 11(5)：155-215)；y以及hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre et al.，基因，30：147(1984))。本领域已知的重组DNA方法可常规用于选择期望的重组克隆，并且所述方法可见例如Ausubel et at.，(eds.)，当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，基因转移和表达(Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，Stockton Press，NY(1990)；和第12及13章，Dracopoli et al.(eds)，人类遗传学现代方法(Current Protocols in Human Genetics)，John Wiley &Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.，150：1(1981)，此处引入作为参考。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增而增加(综述见Bebbington和Hentschel，基于基因扩增的载体用于在DNA克隆中于哺乳动物细胞中表达克隆的基因之用途(The use of vectors based on gene amplification forthe expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统之中的标记可扩增，在宿主细胞培养物中的抑制物水平增加将增加标志基因拷贝数的数目。由于扩增的基因于抗体基因相关，抗体的产生将增加(Crouse etal.，Mol.Cell.Biol.，3：257(1983))。
宿主细胞可用两个本发明的表达载体共转染，第一个载体编码重链来源的多肽，第二个载体编码轻链来源的多肽。两个载体可含有相同的选择标记，其允许重链和轻链多肽的等量表达。或者，可利用单一载体，其编码且能表达重链以及轻链多肽。在这种情况中，轻链可被置于重链前，以避免有毒的游离重链的过量(Proudfoot，自然，322：52(1986)；Kohler，美国国家科学院院报，77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列包括cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子由动物产生、化学合成或重组表达，其可用本领域已知的用于免疫球蛋白纯化的任何方法纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和、特别是针对蛋白A的特异性抗原的亲和，以及体积排阻色谱)、离心、溶解度差异或利用任何其他用于蛋白质纯化的标准方法。此外，本发明的抗体或其片段可被融合到在此所述的或其他本领域已知的异源多肽序列，以便于纯化。
本发明构思了重组地融合或化学偶联到(包括共价和非共价)本发明的多肽(或其部分，优选至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸的多肽)，以产生融合蛋白。融合不一定被导向，也可通过连接头序列发生。抗体可特异于本发明多肽(或其部分，优选至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸的多肽)之外的抗原。例如，抗体可用于将本发明的多肽靶向到特定的细胞类型，无论体外或体内，方法是将本发明的多肽与特异于特定细胞表面受体之抗体偶联或融合。融合或偶联于本发明多肽的抗体也可用于体外免疫检测和本领域已知的纯化方法中。见，如Harbor et al.，出处同前，和PCT公开文本WO 93/231232；EP 439,095；Naramura，et al.，Immunol.Lett.39：91-99(1994)；美国专利5474981；Gillies et al.，PNAS 89：1428-1432(1992)；Fellet al.，J.Immunol.，146：2446-2452(1991)，在此引入作为参考。
本发明还包括与可变区以外的抗体结构域融合或偶联的本发明多肽之组合物。例如，本发明的多肽可融合或偶联于抗体Fc区域，或其部分。融合于本发明多肽的抗体可包含恒定区，铰链区，CH1结构域，CH2结构域和CH3结构域，或完整结构域或其部分的任一组合。多肽也可融合或偶联于上述多肽部分以形成多聚体。例如，融合于本发明多肽的Fc部分可通过Fc部分间的二硫键形成二聚体。较高的多聚体形式可通过将多肽与IgA和IgM的部分融合制备。融合或偶联本发明多肽至抗体部分的方法为本领域已知。见，如美国专利5336603，5622929，5359046，5349053，5447851，5112946；EP307434；EP367166；PCT公开文本WO96/04388；WO91/06570；Ashkenazi et al.，美国国家科学院院报，88：10535-10539(1991)；Zheng et al.，J.Immunol.154：5590-5600(1995)；和Vil et at，美国国家科学院院报89：11337-11341(1992)(此处引入作为参考)。
如上述，相应于SEQ ID NO：2和/或4的多肽、多肽片段或变体之多肽可与上述抗体部分融合或偶联，以增加多肽的体内半寿期，或用于利用本领域周知的方法之免疫检测中。此外，相应于SEQ ID NO：2和/或4的多肽可与上述抗体部分融合或偶联，以促进纯化。一个报道的例子描述了由人CD4多肽的前两个结构域与哺乳动物免疫球蛋白之重链或轻链恒定区组成的嵌合蛋白质。(EP 394827；Traunecker et al.，自然，331：84-86(1988)。与具有二硫键连接的二聚体结构之抗体融合或偶联的本发明的多肽可在结合和中和其他分子时比单体性分泌蛋白质或其片段自身的效率更高。(Fountoulakis et al.，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。在许多情况中，融合蛋白质中的Fc部分在治疗和诊断中有益，因此可得到例如改善的药代动力学性质(EP A 232262)。或者，在融合蛋白质表达、检测并纯化后删去Fc部分是期望的。例如，Fc部分可能阻碍治疗和诊断，如果融合蛋白质用作免疫接种的抗原的话。在药物筛选中，例如人蛋白质，诸如hIL-5受体，已经与Fc部分融合，用于高通量筛选检测以鉴定hIL-5的拮抗剂。(见，Bennett et al.，J.Molecular Recoginition8：52-58(1995)；Johanson et at.，J.Biol.Chem.270：9459-9471(1995))。
此外，本发明的抗体或其片段可与标记序列融合，诸如一种促进纯化的肽。在一个优选的实施方案中，标记氨基酸是六组氨酸肽，如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，尤其是，有许多可为市售的。如Gentz等人所述，美国国家科学院院报86：821-824(1989)，例如，六组氨酸提供用于融合蛋白质的方便的纯化。其他用于纯化的肽标记包括但不限于“HA”标记，其相应于来自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson等，细胞，37：767(1984))和“flag”标记。
本发明还包含与诊断或治疗剂偶联的抗体或其片段。抗体可被诊断性地用于例如检测肿瘤发育或进程，作为临床实验程序的一个部分，以确定例如实施的治疗方案的功效。可通过将抗体偶联于可检测的物质帮助检测。可检测物质的例子包括但不限于多种酶，修复基团，荧光材料，萤光材料，生物发光材料，放射活性材料，利用多种正电子发射断层扫描法的正电子发射材料，和非放射活性顺磁性金属离子。可检测物质可被直接或间接偶联或结合到抗体(或其片段)上，方法是利用本领域已知的技术通过一种中间体(诸如，本领域已知的接头)进行。见，例如，美国专利4741900关于一种金属离子，其可被偶联于抗体用来作为根据本发明的诊断。适合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的修补基团符合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素，和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三丫嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；萤光素材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；适当的放射活性材料的例子包括 、 、 或 。
此外，抗体或其片段可与治疗性单元如细胞毒素，例如，细胞增殖抑制剂或细胞自杀剂偶联，治疗剂偶联，或与放射活性金属离子，例如α-发射体，如 偶联。细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害的药剂。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊甙、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、萘心安和嘌罗霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲喋呤，6-巯基嘌呤)、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazene)，烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU))、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环霉素(例如，柔红霉素(以前称道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素、博来霉素、普卡霉素、安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
本发明的偶联物可用于改善特定的生物应答，所述治疗剂或药物不应被解释成仅限于传统的化学治疗剂。例如，药物可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可包括例如，毒素，诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞凋亡剂、例如，TNF-α、TNF-β、AIM I(见，国际公开文本WO97/33899)，AIM II(见，国际公开文本WO97/34911)，Fas配体(Takahashi et al.，INt.Immunol.，6：1567-1574(1994))，VEGI(见，国际公开文本WO997/23105)，溶栓剂或抗血管生成剂，例如，血管他丁或内皮他丁；或者生物反应调节剂，诸如，淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生长因子。
抗体也可被结合到固体支持物上，其特别用于免疫检测或靶抗原的纯化。这样的固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚丙烯、聚氯乙烯或聚苯乙烯。
将这些治疗性抗体分子偶联的技术为本领域周知，见例如
Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，inControlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pincheraet al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe et al.，″The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982).
或者，抗体可被偶联到次级抗体上形成如Segal在美国专利4676980中所述的抗体异偶联物，此处引入作为参考。
抗体，无论是否带有与之偶联的治疗性分子，是单独施用还是与细胞毒性因子和/或细胞因子一起施用，均可用作治疗物。
免疫分型
本发明抗体可用于细胞系和生物样品的免疫分型。本发明基因的翻译物可用作细胞标记或更具体地，作为在特定细胞类型中分化和/或成熟的不同阶段差异性表达的细胞标记。针对特异性表位或表位组合的的单克隆抗体允许筛选表达该标记的细胞群。利用单克隆抗体有多种方法可用于筛选表达该标记的细胞群，包括利用抗体包被的磁珠之磁力分选，用结合与固体基质(即：平板)的抗体之“淘选”，和流式细胞仪(见，美国专利5985660；和Morrison et al.，Cell，96：737-49(1999))。
这些技术允许筛选特定的细胞群，诸如见于恶性血液病中的(即，急性白血病患者中的最小存活疾病(MRD))和移植中的“非己”细胞，以防止移植物对抗宿主疾病(GVHD)。或者，这些技术允许筛选造血干细胞和能够经历增殖和/或分化的先祖细胞，如见于人类脐带血中的那些。
抗体结合的检测
本发明的抗体可利用本领域已知的方法检测免疫特异性结合。可采用的免疫检测包括但不限于竞争性和非竞争性检测系统，利用诸如蛋白质印迹、放射免疫检测、ELISA(酶联免疫检测)、夹心免疫检测、免疫沉淀检测、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散检测、聚集反应检测、补体固定检测、免疫放射计量检测、荧光免疫检测、蛋白A免疫检测，等等。这类检测为常规且本领域周知。(见，如，Ausubel et al.，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，此处引入作为参考)。示范性免疫检测的例子在下面简述(但不意味仅限于此)
免疫沉淀方法一般包括如下步骤：在裂解缓冲液(诸如，RIPA缓冲液，(1％，NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15 ，0.01M磷酸钠，pH7.2，1％ Trasylol)，其中补加了蛋白磷酸化酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶、钒酸钠))中裂解细胞群，将目标抗体加入细胞裂解物中，4摄氏度下温育一段时间，例如1-4小时，将蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠加入细胞裂解物中，4摄氏度下温育约1小时左右，在裂解缓冲液中洗涤珠，并在SDS/样品缓冲液中重新悬浮珠。目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员能理解可修改参数以增加抗体同抗原的结合并降低背景(例如，用琼脂糖珠预清洗细胞裂解物)。关于进一步的免疫沉淀方法的论述见，如，如，Ausubel et al.，eds，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，10。16。1部分。
蛋白质印迹分析一般包括制备蛋白质样品，蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳(例如，8％-20％SDS-PAGE，根据抗原的分子量)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶中转移到膜(诸如硝酸纤维素，PVDF或尼龙)上，在封闭液(例如，含3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭膜，用洗涤缓冲液(例如，PBS-土温20)洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的初级抗体(目标抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，用与一种酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联或与放射活性分子(例如， 或 )偶联的在封闭缓冲液中稀释的次级抗体(其失败初级抗体，例如，一种抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，检测抗原存在与否。本领域技术人员知晓，可改变参数以增加检测的信号并降低背景噪音。关于进一步的蛋白质印迹方法的论述见，如，Ausubel et al.，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley &Sons，Inc.，New York，10.8.1部分。
ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔微孔板的孔，将与可检测化合物诸如酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的目标抗体加入孔中，温育一段时间，检测抗原存在与否。在ELISA中，目标抗体不必偶联于可检测化合物，相反，可将偶联到可检测化合物的次级抗体(其可识别目标抗体)加入到孔中。此外，不是用抗原包被孔，抗体可包被到孔上。在这种情况下，在目标抗原加入到包被的孔中后，偶联与可检测化合物的次级抗体可被加入。本领域技术人员知晓，可改变参数以增加检测的信号以及其他本领域已知的ELISA变化。关于进一步的ELISA方法的论述见，如，Ausubel et al.，eds，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，11.2.1部分。
抗体与抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的解离速率可利用竞争性结合检测确定。竞争性结合检测的一个例子是放射免疫检测，包括在存在增加量的未标记抗原的情况下，温育标记的抗原(例如， 或 )与目标抗体，检测结合到标记抗原上的抗体。目标抗体对于特定抗原的亲和力以及结合-解离速率可从所得数据中利用Scatchard曲线分析确定。与次级抗体竞争也可利用放射免疫检测确定。在这种情况下，，在存在数量增加的未标记次级抗体的情况下，抗原与偶联于标记化合物(例如， 或 )之目标抗体一起温育。
本发明抗体的治疗用途
本发明还涉及基于抗体的疗法，其包括将本发明的抗体施用于动物，优选哺乳动物，且最优选人，以治疗一种或多种已知的疾病，紊乱或病症。本发明的治疗性化合物包括但不限于，本发明抗体(包括此处公开的片段、类似物和其衍生物)和表面本发明抗体的核酸(包括此处公开的片段、类似物和其衍生物以及抗独特型抗体)。本发明的抗体可用于治疗、抑制或防止与本发明的多肽表达和/或活性异常相关的疾病、病症和紊乱，包括但不限于，此处所述的一种或多种疾病、紊乱和病症。治疗和/或防止与本发明的多肽表达和/或活性异常相关的疾病、病症和紊乱包括但不限于，缓解与这些疾病、紊乱或病症相关的症状。本发明的抗体可以本领域已知的或如此处所述的药学可接受的组合物形式提供。
本发明抗体的治疗性使用的途径总体上包括将本发明的多核苷酸或多肽在体内局部或系统性地结合或通过抗体的直接细胞毒性(例如由补体(CDC)或效应细胞(ADCC)介导的)。这类途径的一些在下面详述。根据此处提供的教导，本领域技术人员无需过分的实验即可知晓如何使用本发明的抗体用于诊断、监测或治疗目的。
本发明的抗体可有利地与其他单克隆或嵌合抗体结合或与淋巴因子或造血生长因子(诸如，IL-2、IL-3、IL-7)一起，例如用于增加与抗体相互作用的效应细胞的活性。
本发明的抗体可单独施用或与其他类型的治疗(例如，放射治疗、化疗、激素疗法、免疫治疗和抗肿瘤剂疗法)一起施用。通常，与患者同源的物种或物种反应性相同(对于抗体而言)的产物的施用是优选的。因此，在一个优选实施方案中，将人抗体、片段衍生物、类似物或核酸施用到人类患者用于治疗或预防。
对于优选采用对于免疫疗法所施用的对象和与本发明的多核苷酸或多肽或其片段相关的疾病而言有高亲和力和/或强体内抑制和/或中和活性的抗体，其针对本发明的多肽或多核苷酸，片段或其中的区域。这类抗体、片段或区域优选地具有针对本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)的亲和力。优选的结合亲和力包括那些具有低于如下所述值的解离常数或Kd的那些：5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M和10-15M。
诊断和成像
特异性结合目标多肽的标记的抗体、其衍生物和类似物可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与本发明的多肽之表达和/或活性异常相关的疾病、紊乱和/或病症。本发明提供了用于检测目标多肽表达异常的方法，包括(a)利用一种或多种目标多肽特异性的抗体检测个体的细胞或体液中目标多肽的表达；和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平相比较，籍此，相对于标准表达水平的所检测的多肽基因表达水平之增加或降低就是异常表达的指征。
本发明提供了用于诊断紊乱的诊断方法，包括(a)利用一种或多种目标多肽特异性的抗体检测个体的细胞或体液中目标多肽的表达；和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平相比较，籍此，相对于标准表达水平的所检测的多肽基因表达水平之增加或降低就是特定紊乱的指征。具体到癌症，来自个体的活检组织之相对高的转录物的存在可能提示疾病形成的易感性，或提供了一种在实际临床症状表现之前检测疾病的方法。这种类型的更为确定的诊断可允许健康个体采用预防性措施或早期的介入性治疗，由此防止了疾病的发生或进展。
本发明的抗体可用于利用本领域已知的经典免疫组织学方法检测生物样品中蛋白质的水平(见如，Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；alkanen，et al.，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。其他基于抗体的用于检测蛋白质基因表达的方法包括免疫检测，诸如酶联免疫检测(ELISA)和放射免疫检测(RIA)。适当的抗体检测标记为本领域周知，包括酶标记，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘( ， )，碳( )，硫( )，氚( )铟( )和锝( )；萤光素标记，如鲁米诺；和荧光素标记，如荧光黄和罗丹明，和生物素。
本发明的一个方面是一种与本发明的多肽异常表达相关的动物，优选哺乳动物，最优选人中的疾病或紊乱之检测和诊断方法。在一个优选的实施方案中，诊断包括：a)向受试者施用(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)治疗有效量可特异性与目标多肽结合的标记分子；b)在施用后等候一段时间，使得标记的分子在该多肽(和对于待清除至背景水平的非结合的标记)表达的患者部位优势性聚集；c)确定背景水平；以及d)检测受试者中标记分子，使得高于背景水平的标记分子的检出表明该受试者具有与目标多肽的异常表达相关的特定疾病或紊乱。标记水平可通过多种方法确定，并将所检测的标记分子与事先确定的特定系统之标准值相比较。
本领域技术人员知晓，受试者的体积和所用的成像系统将确定需要生成诊断性图象之成像分子的数量。对于放射性同位素分子，和人受试者而言，注射入的放射活性的量之范围一般在大约5-20毫居里的 。标记的抗体或抗体片段将优势性聚集在含有特异性蛋白质的细胞所在之处。体内肿瘤成像见S.W.Bruchiel et al.，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments”(Chpt.13，TumorImaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Bruchiel & B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)中所述。
取决于多种变化，包括所用标记的类型和给药方式，以允许标记分子优势性聚集于受试者的位点以及对于待清除至背景水平之未结合分子而言，给药后的时间间隔在6-48小时或6-24小时或6-12小时。在另一实施方案中，给药后的间隔为5-20天，或5-10天。
在一个实施方案中，疾病或紊乱的监测是通过重复诊断该疾病或紊乱来进行的，例如，在首次诊断后1个月，首次诊断后6个月，首次诊断后1年再次诊断。
利用本领域已知的关于体内筛查的方法可检测患者中标记分子的存在与否。这些方法取决于所用标记的类型。本领域技术人员能够确定检测特定标记的适当方法。可用于本发明的检测之方法和装置包括但不限于，计算机断层扫描技术(CT)，全身扫描，诸如正电子发射断层摄影术，磁共振成象和超声仪。
在一个特定实施方案中，用一种放射性同位素标记分子，利用放射应答型手术器械在患者中检测(Thurston et al.，美国专利5441050)。在另一个实施方案中，用一种荧光化合物标记分子，利用荧光应答型扫描装置检测患者。在又一种实施方案中，用正电子发射金属标记分子，利用正电子发射断层扫描术检测患者。在又一种实施方案中，分子用顺磁标记分子标记，用磁共振成像仪(MRI)检测患者。
融合蛋白
任何METH 1或METH 2多肽可用于产生融合蛋白。例如，当与第二种蛋白质融合时，METH 1或METH 2多肽可用作抗原标记。产生的抗METH 1或METH 2多肽的抗体可通过与METH 1或METH 2结合而用于间接检测第二种蛋白质。而且，因为分泌蛋白质基于运输信号而定向于细胞位置，故METH 1或METH 2多肽一旦与其它蛋白质融合就可用作靶向分子。
可与METH 1或METH 2多肽融合的结合域例子不仅包括异源信号序列，还包括其他异源功能区。融合不必一定是直接的，也可通过连接序列产生。
在某些优选实施方案中，本发明的METH 1或METH 2包含这样的融合蛋白，其中METH 1或METH 2多肽分别为如上所述的m1-n1或m2-n2。在一个优选实施方案中，本申请涉及与编码多肽的核苷酸序列至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的核酸分子，所述多肽具有此处所述的特定缺失或C-末端缺失的氨基酸序列。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
此外，融合蛋白质还可通过基因工程改造以改善METH 1或METH 2多肽的特性。例如，可将附加氨基酸区，尤其是带电氨基酸加入METH 1或METH 2多肽的N-末端，从而提高其在从宿主细胞中纯化或随后的处理和储藏中的稳定性和持久性。此外，可将肽部分加入METH 1或METH2多肽中以方便纯化。在METH 1或METH 2多肽最后制成前可将这样的区域去除。添加肽部分以方便多肽处理是本领域所熟悉和常规的技术。
此外，METH 1或METH 2多肽，包括片段和特异性表位可与免疫球蛋白(IgG)的恒定区部分结合产生嵌合多肽。这些融合蛋白方便了纯化且显示体内半寿期增长。已报道的一个例子描述了由人CD4多肽的头两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区多个结构域组成的嵌合蛋白。(EP A394827；Traunecker等，自然331：84-89(1988)。)与单独的单体分泌蛋白或蛋白质片段相比，具二硫键连接之二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白在结合和中和其他分子方面更有效。(Fountoulakis等，生化杂志270：3958-3964(1995)。)
类似的，EP-A-O 464 533(加拿大相应文本2045869)公开了含免疫球蛋白分子恒定区多个部分及另一种人蛋白质或其片段的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分有益于治疗和诊断，并因此导致例如改善的药物动力学特性。(EP-A 0232 262)或者，可能期望在融合蛋白表达、检测和纯化后删除Fc部分。例如，若融合蛋白用作免疫反应抗原，Fc部分可能会妨碍治疗和诊断。例如，在药物的开发中，已将如hIL-5之类的人蛋白质与Fc部分融合以达到进行高流通量试验鉴定hIL-5拮抗物的目的。(参阅，D.Bennett等，分子识别杂志(J.Molecular Recognition)8：52-58(1995)；K.Johanson等，生物化学杂志270：9459-9471(1995)。)
此外，METH 1或METH 2多肽可与标记序列融合，诸如方便METH1或METH 2纯化的肽。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatswirth，CA，91311)中提供的标记，其它许多标记可购买得到。例如，如Gentz等，美国国家科学院院报86：821-824(1989)中所述，六组氨酸可便于融合蛋白的纯化。另一可用于纯化的肽标签，“HA”标签相应于来自流感血凝素蛋白的表位。(Wilson等，细胞37：767(1984)。)
如此说来，可用METH 1或METH 2多核苷酸或多肽加工得到任何以上融合体。
METH 1和/或METH 2的生物学活性
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于试验中以检测其一种或多种生物学活性。如果在特殊试验中METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂，确实呈现了活性，那么在与此生物学活性相关的疾病中可能涉及METH 1和/或METH 2。因此，METH 1和/或METH 2可用于治疗此相关疾病。
免疫活性
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可通过激活或抑制免疫细胞的增殖、分化或转移(趋化性)而用于治疗免疫系统的缺乏或疾病。免疫细胞通过从多能干细胞产生骨髓(血小板、血红细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)和淋巴(B和T淋巴细胞)细胞的称为血细胞生成的过程而发育。这些免疫缺乏或疾病的病因可能是遗传的、体细胞的(如癌症或一些自身免疫疾病)、获得性的(如通过化疗或毒素)或传染性的。此外，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用作特殊免疫系统疾病或疾病的标记或检测物。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测造血细胞的缺乏或疾病。在治疗与某些(或许多)类型造血细胞的减少相关的疾病时，METH 1和/或METH2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于增加包括多能干细胞在内的造血细胞的分化和增殖。免疫缺陷综合症的例子包括，但不局限于：血液蛋白质疾病(如丙球蛋白缺乏血症、异常γ球蛋白血症)、共济疾病毛细血管扩张血症、常见的可变型免疫缺陷症、Digeorge综合症、HIV感染、HTLV-BLV感染、白细胞附着缺陷综合症、淋巴球减少症、吞噬细胞杀菌功能紊乱、严重联合免疫缺损(SCID)、Wiskott-Aldrich疾病、贫血、血小板减少症或血红蛋白尿症。
此外，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可用于调节止血(停止出血)或溶栓活性(血凝块形成)。例如，通过提高止血或溶栓活性，METH 1和/或METH2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗血液凝结疾病(如纤维蛋白原缺乏血症、因子缺乏症)、血小板疾病(如血小板减少症)或创伤、手术或其他原因引起的伤口。或者，能降低止血或溶栓活性的METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于抑制凝血或溶解血块，这在治疗心脏病发作(梗塞)、中风或瘢疤形成中是重要的。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂也可用于治疗或检测自身免疫疾病。许多自身免疫疾病是由于自身免疫细胞不适当地将自身物质识别成外来物而产生的。此不适当的识别引起免疫应答，导致宿主组织的破坏。因此，服用能抑制免疫应答，尤其是T-细胞增殖、分化或趋化性的METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可能是预防自身免疫疾病的有效治疗方法。
用METH 1和/或METH 2可治疗或检测的自身免疫疾病例子包括，但不局限于：艾迪生病、溶血性贫血、抗磷脂综合症、类风湿性关节炎、皮炎、变应性脑脊髓炎、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合症、Graves病、多发性硬化症、重症肌无力、神经炎、眼炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌腺病、紫癜、赖特病、僵人综合症、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性肺炎、Guillain-Barre综合症、胰岛素依赖性糖尿病和自身免疫性炎症性眼疾。
类似地，诸如哮喘(尤其是过敏性哮喘)之类的过敏性反应和状态或其他呼吸问题也可用METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗。此外，这些分子可用于治疗过敏性反应、对抗原分子的超敏性或血型不合。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂也可用于治疗和/或防止器官排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。宿主细胞通过免疫应答破坏移植组织产生器官排斥。类似地，在GVHD中也涉及免疫应答，但在此情况下是外来移植的免疫细胞破坏宿主组织。服用能抑制免疫应答，尤其是T-细胞增殖、分化或趋化性的METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可能是预防器官排斥或GVHD的有效治疗方法。
类似地，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂也可用于缓解炎症。例如，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可抑制参与炎症反应的细胞的增殖和分化。这些分子可用于治疗慢性或急性炎症，包括与感染(如，脓毒性休克、脓毒病或全身炎性反应综合症(SIRS)、局部缺血-重灌注损伤、内毒素致死性、关节炎、补体介导的超急性排斥、肾炎、细胞因子或趋化因子诱发的肺损伤、感染性肠炎、局限性回肠炎或细胞因子过量产生引起的炎症(如，TNF或IL-1)。
过度增殖疾病
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测包括瘤形成在内的过度增殖疾病。METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可通过直接或间接的相互作用抑制疾病的增殖。或者，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可使其他能抑制过度增殖疾病的细胞增殖。
例如，可通过提高免疫应答，尤其是提高过度增殖疾病的抗原性或通过T-细胞增殖、分化或转移来治疗过度增殖疾病。通过增强现有免疫应答或激发新的免疫应答可增加该免疫应答。或者，减少免疫应答可能也是治疗过度增殖疾病的方法，如化疗物质。
可用METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的过度增殖疾病例子包括，但不局限于以下部位的瘤形成：腹部、骨、乳腺、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和外周神经、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖系统。
类似地，其他的过度增殖疾病也可用METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测。这些过度增殖疾病例子包括，但不局限于：高丙球蛋白血症、淋巴组织增生疾病、异常蛋白血症、紫癜、结节病、赛塞综合症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、戈谢病、组织细胞增多病和位于上述器官系统中除瘤形成外的任何其他过度增殖疾病。
心血管疾病
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH2的拮抗剂或激动剂，或编码METH 1和/或METH 2的均可用于治疗心血管疾病，包括外周动脉疾病，如肢体缺血。
心血管疾病包括心血管异常，诸如动脉-动脉瘘、动静脉瘘、脑动静脉畸形、先天性心脏缺陷、肺动脉瓣闭锁和弯刀综合征(部分肺静脉回流异常)。先天性心脏缺陷包括主动脉缩缝、三房心、冠脉异常、十字心、右位心、动脉导管未闭、Ebstein异常、艾森曼格尔复征(先天性心脏病)、左心发育不全综合征、左位心、法洛四联症、大血管移位、右心室双出口、三尖瓣闭锁、persistent truncus arteriosus、和心隔缺损，如主动脉肺动脉间隔缺损、心内膜垫缺损、卢特包阿舍尔综合征(二尖瓣狭窄伴有室间隔缺损)、法洛三联症、心室缺损。
心血管紊乱还包括心脏疾病，诸如心律失常、类癌心脏病、高心排出量、低心排出量、心脏填塞、心内膜炎(包括细菌性)、心动脉瘤、心脏停搏、充血性心力衰竭、充血性心肌病、阵发性呼吸困难、心源性水肿、心脏肥大、充血性心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗塞后心脏破裂、室中隔破裂、心瓣膜疾病、心脏疾病、心肌缺血、心包渗漏、心包炎(包括收缩性的和结核性的)、心包积气、心包切开术后综合征、肺心病、风湿性心脏病、室性障碍、充血、心血管妊娠综合征、弯刀综合征、心血管梅毒、和心血管结核。
心律失常包括窦性心律失常、房性纤颤、房性扑动、心搏徐缓、期前收缩、阿-斯综合征、束支传导阻滞、窦房阻断、QT延长综合征、并行收缩、劳-甘-莱综合征、曼海姆型刺激前综合征、沃-佩-怀综合征、病窦综合征、心动过速、和心室颤动。心动过速包括阵发性心动过速、室上性心动过速、心室自身性心动过速、房室结心动过速或心律不齐、异位房性心动过速、异位交接区性心动过速、窦房结心动过速或心律不齐、窦性心动过速、扭转峰值、和室性心动过速。
心瓣膜疾病包括主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、[心脏]杂音、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁、肺动脉瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、三尖瓣闭锁、三尖瓣闭锁不全、和三尖瓣狭窄。
心脏疾病包括酒精性心肌病、充血性心肌病、肥大性心肌病、主动脉瓣膜下狭窄、肺动脉瓣膜下狭窄、限制型心肌病、Chagas心肌病、心内膜弹力纤维增生症、心肌内膜纤维化、Kearns综合征、心肌响应损伤和心肌炎。
心脏缺血包括冠脉疾病，诸如，心绞痛、冠脉瘤、冠状动脉粥样硬化症、冠状动脉血栓形成、冠脉血管痉挛、心肌梗死、心肌击昏。
心血管疾病还包括血管疾病，诸如动脉瘤、血管发育不良、血管瘤病、杆菌性血管瘤病、Hippel-Lindau疾病、克-特-韦综合征、Sturge-WeberSyndrome、血管神经性水肿、主动脉疾病、高安动脉炎、主动脉炎、Leriche综合征、动脉闭锁疾病、动脉炎、enarteritis、结节性多动脉炎、脑血管疾病、糖尿病性血管病、糖尿病性视网膜炎、栓塞、血栓形成、红斑性肢痛病、痔疮、肝静脉闭合疾病、高血压、低血压、缺血、周围血管疾病、静脉炎、肺静脉闭塞性疾病、雷诺氏病、肢端硬皮综合征、视网膜静脉闭塞、弯刀综合征、上腔静脉综合征、毛细管扩张、atacia毛细管扩张、遗传性出血性毛细血管扩张、静脉节瘤、静脉曲张、静脉曲张性溃疡、静脉性不全。
动脉瘤包括夹层动脉瘤、假性动脉瘤、传染性动脉瘤、破裂性动脉瘤、主动脉动脉瘤、脑动脉瘤、冠脉动脉瘤、心动脉瘤和回肠动脉瘤。
动脉闭塞病包括动脉硬化、间歇性跛行、颈动脉狭窄、纤维肌性发育不良、肠系膜血管闭塞、Moyamoya疾病、肾动脉梗塞、视网膜动脉阻塞和血栓性脉管炎消灭。
脑血管疾病包括颈动脉病、脑淀粉样蛋白血管病、大脑瘤、脑缺氧、大脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成、颈动脉血栓形成、窦血栓形成、Wallenberg综合征、大脑出血、硬膜外血肿、硬膜下血肿、subaraxhnoid血肿、脑梗塞、脑缺血(包括瞬时性的)、锁骨下动脉盗血综合征、脑室周围白质软化、血管性头痛、丛集性头痛、偏头痛、椎基底动脉供血不足。
栓塞包括空气栓塞、羊水栓塞、胆固醇栓塞、蓝趾综合征、脂肪栓塞、肺栓塞和血栓栓塞。血栓形成包括冠状动脉血栓形成、肝静脉血栓形成、视网膜静脉闭塞、颈动脉血栓形成、窦血栓形成、Wallenberg综合征和血栓性静脉炎。
缺血包括脑缺血、缺血性结肠炎、筋膜室综合征、前筋膜室综合征、心肌缺血、再灌注损伤和周围肢体缺血。血管炎包括主动脉炎、动脉炎、Behcet综合征、Churg-Strauss综合征、皮肤粘膜淋巴结综合征、血栓性脉管炎、血栓闭塞性血管炎、过敏性脉管炎、Schoenlein-Henoch紫癜、过敏性皮肤脉管炎、Wegener肉芽肿病。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽或METH 1和/或METH2的拮抗剂或激动剂，特别有效地用于治疗临界肢体缺血和冠脉疾病。
可利用任何本领域已知的方法施用METH 2，包括但不限于在递送部位直接针头注射、静脉内注射、局部注射、导管灌注、颗粒轰击注射器、颗粒加速器、凝胶泡沫海绵储药物、其他市售的储药材料、蠕动泵、经口、suppositorial固体药物制剂、滗析或在手术中局部应用、气溶胶递送。这些方法为本领域已知。METH 1和/或METH 2多肽可作为药物组合物中的一部分施用，如下面详述。递送METH 1和/或METH 2多核苷酸的方法在下面详述。
细胞水平的疾病
与细胞存活或细胞凋亡的抑制有关的、可由METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的疾病，包括癌症(诸如卵泡淋巴癌、带有p53突变的肉瘤和激素依赖的肿瘤，包括但不限于，结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波济肉瘤和卵巢癌)；自身免疫病(如，多发性硬化症、Sjogren’s综合征、Hashimoto’s甲状腺炎、胆汁肝硬变、Behcet’s病、Crohn’s病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎以及类风湿关节炎)和病毒感染(如肝炎病毒，痘病毒和腺病毒)，炎症、移植物对抗宿主疾病，急性移植排斥和慢性移植排斥。在优选实施方案中，本发明的METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或拮抗剂用于抑制特别是上述所述癌症的生长、发展和/或转移。
与细胞存活提高有关的、可由METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的疾病，包括但不限于恶病质及相关疾病的进展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、单核细胞和红细胞白血病)和慢性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链疾病，和实体肿瘤，包括但不限于，肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊素瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮层肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、味蕾、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、气管发生癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌性细胞、肾母细胞瘤、颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质[细胞]瘤、menangioma、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
与细胞凋亡提高有关的、可由METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的疾病，包括但不限于AIDS；神经变性疾病(诸如，Alzheimer病、Parkinson病、肌萎缩侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性和大脑肿瘤或先前相关的疾病)；自体免疫病(诸如，如，多发性硬化症、Sjogren’s综合征、Hashimoto’s甲状腺炎、胆汁肝硬变、Behcet’s病、Crohn’s病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎以及类风湿关节炎)；骨髓增生异常综合征〔诸如，再生障碍性贫血〕移植物对抗宿主疾病，缺血损伤(诸如，由心肌梗塞、中风和再灌注损伤引起的)；肝损伤(例如，与肝损伤相关的肝炎，缺血/再灌注损伤、cholestosis(胆管损伤)和肝癌)；毒物诱导的肝脏疾病(诸如由酒精引起的)、感染性休克、cachexia和厌食症。
创伤愈合以及上皮细胞增生
根据本发明的另一方面，提供了一种利用METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂用于治疗目的的方法，例如刺激上皮细胞增生和基底角质形成细胞用于创伤愈合目的，以及刺激头发毛囊产生和真皮创伤的愈合。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可临床上用于刺激创伤愈合，包括手术创伤、切割伤、涉及真皮和表皮破坏的深度创伤、眼组织创伤、牙组织创伤、口腔创伤、糖尿病性溃疡、皮肤溃疡、肘溃疡、动脉溃疡、静脉停滞溃疡、由于热接触或化学物接触造成的烧伤和其他异常创伤愈合疾病，诸如尿毒症、营养不良、维生素缺乏和与、使用类固醇、放疗和抗肿瘤剂/抗代谢物的系统性治疗相关的并发症。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于促进在皮肤丧失后的皮肤重建。
METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于增加皮肤移植物与创伤床的粘附，并刺激由创伤床的上皮再形成。下面是METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于增加皮肤移植物与创伤床的粘附之粘附物的类型：自体移植、人工皮肤、同种异体移植、自体皮肤移植、autoepdermic移植、avacular移植、Blair-Brown移植、骨移植、brephoplastic移植、膜皮移植、延迟移植物、真皮植皮片、表皮植皮片、筋膜移植物、全厚移植物、异源移植物、异种移植物、同源移植物、增生性移植物、板状移植物、筛状移植物、粘膜移植物、Ollier-Thiersch移植物、omenpal移植物、片移植、蒂状皮肤移植片、贯通移植物、分裂皮肤移植物、厚分裂移植。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于促进皮肤强度和改善老化皮肤的外观。
据信，METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂也会产生如下方面的改变：肝细胞增生、和肺、乳腺、胰腺、胃、小肠、大肠中上皮细胞增生。METH 1和/或METH2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂也能促进上皮细胞的增生，诸如皮脂细胞、毛发毛囊、肝细胞、II型肺细胞、产生粘蛋白杯状细胞和其他上皮细胞及其包含在皮肤、肺、肝和胃肠道中的先祖细胞。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可促进内皮细胞、角质形成细胞和基底角质形成细胞的增生。
METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可用于减少由于放疗、化疗或病毒感染造成的胃肠道毒性的副作用。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可具有对小肠粘膜的细胞保护作用。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可刺激由于化疗和病毒感染造成的粘膜炎(粘膜溃疡)的愈合。
METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可用于皮肤在全部或部分厚度的皮肤损伤中的完全再生，包括烧伤(即：毛发毛囊、汗腺和皮脂腺的细胞重新形成)，其他皮肤缺损的治疗，诸如牛皮癣。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可用于治疗大疱性表皮松解症，一种表皮与下层皮肤粘附缺陷，其通过加速这些损伤的重新上皮细胞化而造成经常性、开放且疼痛的大庖。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可用于治疗胃溃疡和doudenal溃疡，并通过粘膜衬里的疤痕形成和腺粘膜与doudenal粘膜衬里的再生帮助愈合更加迅速。炎性肠疾病诸如局限性肠炎和溃疡性结肠炎，为分别造成小肠或大肠粘膜表明破坏的疾病。因此，METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于促进粘膜表面的重新形成，以帮助更快的愈合和防止炎性肠疾病的发展。期望利用METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂的治疗可具有对通过胃肠道之粘液产生具有明显作用，且可被用于保护肠粘膜免受摄入的或手术后之损伤性物质的破坏。METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可被用于治疗与METH 1和/或METH 2表达不足相关的疾病。
此外，METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于防止和治疗由于多种病理状态造成对肺的损伤。生长因子，诸如METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可刺激增生和分化，并促进肺泡和细支气管上皮的修复，以防止或治疗急性或慢性肺损伤。例如，肺气肿，其造成肺泡的进行性损失，和吸入性损伤(即由于烟雾吸入造成的)，和烧伤(其引起细支气管上皮和肺泡的坏死)均可由METH1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂有效的治疗。另外，METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于刺激II型肺泡细胞的增生和分化，其可帮助早产婴儿中疾病(诸如透明膜病、诸如婴儿呼吸窘迫综合征和支气管肺displasia)的治疗或预防。
METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可刺激肝细胞的增殖和分化，因此可用于缓解或治疗肝脏疾病，诸如由于肝硬化。造成的爆发性肝衰竭，由病毒性肝炎和毒性物质(即对乙酰氨基酚、四氯化碳和其他已知的肝脏毒性物质)造成的肝脏损伤。
此外，METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或预防糖尿病的发病。在新近诊断为I或II型糖尿病的患者中，如果有些胰岛细胞功能仍保留，METH1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于维持胰岛功能，使得缓解、延迟或防止疾病的永久性发作。此外，METH 1和/或METH 2多核苷酸(或多肽)以及METH1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用作胰岛细胞移植的辅助剂，以改善或促进胰岛细胞功能。
感染性疾病
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测传染因子。例如，通过提高免疫应答，尤其是提高B和/或T-细胞的增殖和分化，可治疗传染病。可通过增强现有免疫应答或激发新的免疫应答来增加免疫应答。或者，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂也可直接抑制传染因子，无需引起免疫反应。
病毒是能引起可被METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测之疾病或症状的传染因子例子。病毒的例子包括，但不局限于以下DNA和RNA病毒科：虫媒病毒、腺病毒科、砂粒病毒科、动脉病毒、双RNA病毒、Bunyaviridae、杯状病毒科、环状病毒科、冠形病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科(肝炎)、疱疹病毒科(如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹)、Mononegavirus(如副粘病毒科、麻疹病毒科、弹状病毒科)、正粘病毒科(如流感病毒)、乳多空病毒科、细小病毒科、微小RNA病毒科、痘病毒科(如天花病毒或痘苗病毒)、呼肠孤病毒科(如轮状病毒)、逆转录病毒科(HTLV-I、HTLV-II或慢病毒属)和披膜病毒科(如风疹病毒)。在这些科内的病毒可引起多种疾病或症状，包括但不局限于：关节炎、细支气管炎、脑炎、眼部感染(如结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合症、肝炎(A、B、C、E、慢性活动性、丁型肝炎)、脑膜炎、机会性感染(如AIDS)、肺炎、伯基特淋巴瘤、水痘、出血热、麻疹、流行性腮腺炎、副流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤病(如卡波西病、疣)和病毒血症。METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。
类似地，能引起可被METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测之疾病或症状的细菌和真菌包括，但不局限于以下革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌及真菌：放线菌目(如棒杆菌、分枝杆菌、Norcardia)、曲霉、芽孢杆菌科(如炭疽、梭菌)、拟杆菌科、芽酵母、博德特氏菌、疏螺旋体、普鲁氏杆菌、念珠菌、弯曲杆菌、球孢子菌、隐球菌、Dermatocycoses、肠杆菌科(克雷伯氏菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、耶尔森氏菌)、丹毒丝菌、螺杆属菌、军团菌、钩端螺旋体病、利斯特氏菌、枝原体目、奈瑟氏球菌科(如不动杆菌、淋病、Menigococcal)、巴斯德氏菌科感染(如放线菌、嗜血菌(Heamophilus)、巴斯德氏菌)、假单胞菌、立克次氏体科、衣原体科、梅毒和葡萄球菌。这些细菌或真菌家族能引起以下疾病或症状，包括但不局限于：菌血症、心内膜炎、眼感染(如结膜炎、结核病、眼色素层炎)、齿龈炎、机会感染(如AIDS相关感染)、甲沟炎、与修复术相关的感染、赖特氏病、呼吸道感染(如百日咳或脓胸)、脓毒症、莱姆病、猫抓病、痢疾、副伤寒热、食物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑膜炎、衣原体、梅毒、白喉、麻风病、类结核、结核病、狼疮、肉毒中毒、坏疽、破伤风、脓胞病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤病(如蜂窝织炎、dermatocycoses)、毒血症、尿道感染、伤口感染。METH 1和/或METH2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。
此外，能引起可被METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂治疗或检测之疾病或症状的寄生物包括，但不局限于以下家族：变形虫、巴贝虫、球虫、隐孢子虫双核阿米巴(Dientamoebiasis)、姌疫(Dourine)、外寄生虫、贾第鞭毛虫、蠕虫、利什曼虫、泰勒尔梨浆虫、弓形体、锥虫和毛滴虫(Trichomonas)。这些寄生虫能引起多种疾病或症状，包括但不局限于：疥疮、恙螨病、眼感染、肠疾病(如痢疾、贾第鞭毛虫病)、肝病、肺病、机会感染(如AIDS相关疾病)、症疾、妊娠并发症和弓形体病。METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。
优选的，利用METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂进行的治疗可通过施用有效量METH 1和/或METH 2多肽于病人，或从患者体内取出细胞，给细胞提供METH1和/或METH 2多核苷酸，并将该改造后的细胞重新引入患者体内(离体疗法)而进行。此外，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用作疫苗中的抗原以产生抗传染病的免疫应答。
再生
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于分化、增殖和吸引细胞，导致组织再生。(见，科学276：59-87(1997)。)组织的再生可用于修复、置换或保护由于先天缺陷、损伤(创伤、烧伤、割伤或溃疡)、年龄、疾病(如骨质疏松症、骨性关节炎、牙周疾病、肝衰竭)、外科手术，包括整容手术、纤维变性症、重灌注损伤或系统性细胞因子损伤而受损的组织。
可用本发明再生的组织包括器官(如胰、肝、肠、肾、皮肤、内皮)、肌肉(平滑肌、骨胳肌或心肌)、血管(包括血管内皮)、神经、造血和骨胳(骨、软骨、腱和韧带)组织。优选地，再生发生时无或减少瘢疤形成。再生也可包括血管形成。
此外，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可促进难于愈合的组织的再生。例如，促进腱/韧带再生会加快损伤后的恢复时间。也可预防性地使用本发明的METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂以避免损伤。可治疗的特异疾病包括腱炎、腕管综合症和其他腱或韧带损伤。非愈合性创伤的组织再生的其他例子包括强制性溃疡(pressure ulcer)、与血管不足相关的溃疡、外科手术创伤和外伤。
类似地，通过利用METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂增殖和分化神经细胞也可再生神经和脑组织。用此方法可治疗的疾病包括中枢和外周神经系统疾病、神经病或机械性和创伤性疾病(如脊髓紊乱、头部创伤、脑血管疾病和中风)。特别是，与外周神经损伤相关的疾病、外周神经病(如由于化疗或其他医学治疗所产生)、局部神经病和中枢神经系统疾病(如早老性痴呆、帕金森症、亨亭顿氏舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化和Shy-Drager综合症)均可用METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH2的激动剂或拮抗剂治疗。
趋化性
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可能具趋化活性。趋化分子吸引或迁移细胞(如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞、T-细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞和/或内皮细胞)至身体的特殊位点，如发炎、感染或过度增殖位点。然后迁移细胞去除和/或治愈特殊损伤或异常。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可增加特殊细胞的趋化性。然后这些趋化分子可通过增加定向于身体内特殊位置的细胞数而用于治疗炎症、感染、过度增殖疾病或任何免疫系统疾病。例如，趋化分子可通过吸引免疫细胞至受伤部位而用于治疗组织的创伤和其他损伤。作为趋化分子，METH 1和/或METH 2还能吸引可用于治疗创伤的成纤维细胞。
也考虑到METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可抑制趋化活性。这些分子也可用于治疗疾病。因此，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用作趋化性的抑制剂。
结合活性
METH 1和/或METH 2多肽可用于筛选可结合METH 1和/或METH2的分子或者METH 1和/或METH 2结合的分子。METH 1和/或METH2与分子的结合可激活(激动剂)、提高、抑制(拮抗物)或降低METH 1和/或METH 2或者所结合分子的活性。所说分子的例子包括抗体、寡核苷酸、蛋白质(如受体)或小分子。
优选地，该分子与METH 1和/或METH 2的天然配基紧密相关，如配基片段、天然底物、配基、结构或功能模拟物。(见，Coligan等，免疫学通用方法(Current protocols in Immunology)1(2)：第5章(1991)。)类似的，该分子可能与METH 1和/或METH 2所结合的天然受体或至少能被METH 1和/或METH 2结合的受体片段(如活性位点)紧密相关。任何一种情况中分子均可用已知技术合理设计。
优选地，这些分子的筛选包括产生表达METH 1和/或METH 2(作为分泌蛋白或在细胞膜上)的适当细胞。优选的细胞包括哺乳动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。然后将表达METH 1和/或METH 2的细胞(或含表达多肽的细胞膜)与可能含此分子的检测化合物接触，以观察METH 1和/或METH 2或此分子的结合、活性的刺激或抑制。
试验可只检测候选化合物与METH 1和/或METH 2的结合，其中结合用标记或包括与标记竞争物竞争的试验来检测。另外，试验可检测候选化合物是否通过与METH 1和/或METH 2结合产生信号。
或者，可用无细胞制品、粘附于固相支持物的多肽/分子、化学药品或天然产物混合物进行试验。试验也可简单地包括以下步骤：混合候选化合物与含METH 1和/或METH 2的溶液，检测METH 1和/或METH 2/分子的活性或结合，并与标准品比较METH 1和/或METH 2/分子的活性或结合。
优选地，ELISA试验可用单克隆抗体或多克隆抗体检测样品(如生物样品)中METH 1和/或METH 2水平或活性。抗体可通过直接或间接地与METH 1和/或METH 2结合或与METH 1和/或METH 2竞争底物而检测METH 1和/或METH 2的水平或活性。
此外，与METH 1和/或METH 2结合的受体可由本领域已知的多种方法鉴别，例如，配体淘选(panning)和FACS分选(Coligan等，Currentprotocols in Immun.，1(2)，第5章，(1991))。例如，利用表达克隆，其中从应答多肽的细胞中制备多聚腺苷酸化的RNA，例如从已知含有FGF家族蛋白质的多种受体之NIH3T3细胞，和SC-3细胞，和由此RNA产生的cDNA文库被分成了多个集合(pools)且用于转染COS细胞或其他不能应答多肽的细胞。在玻璃载玻片上生长的转染的细胞接触本发明的多肽(已经被标记)。可利用包括碘化作用或包涵对于位点特异性蛋白激酶的识别位点的多种方法标记多肽。
在固定和温育后，将载玻片经过自动放射显影分析。鉴定阳性集合，制备亚集合(subpools)，利用反复亚集合和再筛选方法重新转染，最终产生了编码推定受体的单一克隆。
作为鉴定受体的另一种方法，标记的多肽可被光亲和连接到细胞膜或表达受体分子的提取物制剂。利用PAGE解析交联的材料，并对X-射线胶片暴光。含有多肽之受体的标记的复合物可被从胶上切割，解析成肽片段，并经历蛋白质微量测序。获自微量测序的氨基酸序列将用于设计一套简并性寡核苷酸探针筛选cDNA文库，鉴定编码推定受体的基因。
此外，可用基因改构、基元改构、外显子改构和/或密码子改构(一并称为“DNA改构”)技术来调节METH 1或METH 2的活性，由此有效的产生METH 1或METH 2的激动剂和拮抗剂。见例如，美国专利5605793；5811238；5830721；5834252和5837458，以及Patten等，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33(1997)；Harayama，Trends biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson等，分子生物学杂志，287：265-76(1999)；以及Lorenzo和Blasco，生物技术，24(2)：308-13(1998)(在此各个全文引入作为参考)。在一个实施方案中，METH 1或METH 2的多核苷酸以及相应的的多肽之改变可通过DNA改构实现。DNA改构包括通过同源或定点重组组装两个或多个DNA区段以产生期望的METH 1或METH 2分子。
在另一个实施方案中，METH 1或METH 2多核苷酸和相应的多肽可被改变，方法是在重组前经过差错倾向PCR、随机核苷酸插入或其他方法。在另一个实施方案中，可将METH 1或METH 2的一个或多个成分、基元、区段、部分、结构域、片段等与一个或多个异源分子的一个或多个成分、基元、区段、部分、结构域、片段等重组。在一个优选实施方案中，异源分子是生长因子，诸如，例如血小板衍生的生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGI-I)，转化生长因子(TGF)-α，表皮生长因子(EGF)，成纤维生长因子(FGF)，TGF-β，骨形态生成蛋白(BMP)-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP7，激活素A和B，decapentaplegic(dpp)，60A，OP-2，dorsalin，生长分化因子(GDF)，节(nodal)，MIS，抑制素α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β5，和神经胶质衍生的嗜中性因子(GDNF)。
其他优选的片段为生物活性的METH 1或METH 2片段。生物活性片段是那些显示与METH 1或METH 2多肽活性相似但不一定相同的片段。片段的生物活性可包括改善的期望活性，或降低的不期望的活性。
此外，本发明提供了一种筛选化合物以从中鉴定那些调节本发明多肽的作用化合物之方法。这种检测的一个例子包括在成纤维细胞可正常增殖的细胞培养条件下，结合哺乳动物细胞、本发明多肽、待筛选的化合物以及3[H]胸腺嘧啶。在不存在待筛选化合物的条件下进行对照检测，并与在存在化合物时成纤维细胞增殖的数量，以通过测定每一例中3[H]胸腺嘧啶的摄入确定该化合物是否刺激增殖。利用测量3[H]胸腺嘧啶的掺入之液体闪烁色谱测量成纤维细胞增殖的量。用此方法可鉴别激动剂和拮抗剂化合物。
在另一个方法中，用标记的本发明多肽在存在化合物的条件下，温育表达本发明多肽的受体之哺乳动物细胞或膜制剂。化合物增加或阻断此相互作用的能力由此可测。或者，在待筛选化合物与METH 1和/或METH2受体相互作用测量后，可测量METH 1和/或METH 2抑制第二信号系统的反应，和测量化合物结合到受体并引发第二信号反应的能力，以鉴定是否该化合物是潜在的激动剂或拮抗剂。这类第二信号系统包括但不限于，cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解。
所有以上试验均可用作诊断或预后标记。用这些试验发现的分子可用于通过活化或抑制METH 1和/或METH 2分子而治疗疾病或在患者中产生特殊的效果(如血管生长)。此外，这些试验能发现可抑制或增强适当处理细胞或组织中METH 1和/或METH 2产生的物质。因此，本发明包括鉴定与METH 1和/或METH 2可结合的化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)温育候选结合化合物与METH 1和/或METH 2；和(b)测定结合是否发生。另外，本发明包括鉴定激动剂/拮抗物的方法，该方法含以下步骤：(a)温育候选化合物与METH 1和/或METH 2；(b)检测生物学活性，和(c)测定METH 1和/或METH 2的生物学活性是否已改变。
此外，可以利用在图10和11以及表1和2中公开的β-片层区实验性鉴定结合METH 1和/或METH 2的分子。因此，本发明的特定实施方案涉及编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括或者由在图10/表1以及在图11/表2中公开的每一个β-片层区之氨基酸序列组成。本发明的额外的实施方案涉及编码METH 1和/或METH 2多肽的多核苷酸，所述多肽包括或者由在图10/表1以及在图11/表2中公开的β-片层区之氨基酸序列的任一组合以及其全部组成。本发明额外优选的实施方案涉及这样的多肽，所述多肽包括或者由在图10/表1以及在图11/表2中公开的β-片层区之METH 1和/或METH 2氨基酸序列组成。本发明额外的实施方案涉及METH 1和/或METH 2多肽，所述多肽包括或者由在图10/表1以及在图11/表2中公开的β-片层区的任一组合或全部组成。
反义与核酶(拮抗剂)
在特定实施方案中，根据本发明的拮抗剂是相应于包含在SEQ IDNO：1或3中的核酸，或其互补链，和/或包含在保藏的克隆中的核苷酸序列。在一个实施方案中，反义序列在生物体内部产生。在另一实施方案中，反义序列分别施用(见如，O’Connor，J.Neurochem.56：560(1991)。Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。反义技术通过反义DNA或RNA，或通过三链螺旋形成，可用于控制基因表达。反义技术详述见例如，Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。三链螺旋形成详述于例如Lee et al.，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney et al.，科学，241：456(1988)；和Dervan et at.，科学，251：1300(1991)。这些方法均基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。
例如，表明本发明多肽之多核苷酸的5’编码部分可用于设计长度约10-40碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计互补于基因的一个区域之DNA寡核苷酸，所述基因参与转录，籍此防止了转录和受体的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，并阻断了mRNA分子翻译为受体多肽。
在一个实施方案中，本发明的METH 1和/或METH 2反义核酸通过外源序列的转录在细胞内产生。例如，转录了一个载体或其部分，产生本发明的反义核酸(RNA)。这类载体含有编码METH 1和/或METH 2反义核酸的序列。这类载体可在染色体外保留或整合入染色体，只要它能够被转录以产生期望的反义RNA。这类载体可通过本领域标准的重组DNA技术构建。载体可为用于在脊椎动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或其他本领域已知的材料。编码METH 1和/或METH 2的序列或其片段之表达可由本领域已知的在脊椎动物优选为人中有功能的任一启动子引导。这样的启动子可为诱导型的或组成型的。这类启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，自然，29：304-310(1981))，包含于劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中的启动子(Wagner et al.，美国国家科学院院报，78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白的调控序列(Brinster et al.，自然，296：39-42(1982))等等。
本发明的反义核酸序列包括互补于METH 1和/或METH 2基因的RNA转录物的至少一部分的序列。但是，绝对的互补性(虽然优选)并不必需。“与RNA的至少一部分互补”的序列在此是指具有足够的互补性，能够与RNA杂交形成稳定的双螺旋的序列；在双链METH 1和/或METH 2反义核酸的情况中，双螺旋DNA的单链由此可被检测，或可鉴定三螺旋的形成。杂交的能力将取决于互补性的程度和反义核酸的长度。一般地，杂交的核酸越大，含有的与METH 1和/或METH 2RNA错配就越多，但仍形成稳定的双螺旋(或三螺旋)。本领域技术人员利用确定杂交复合物熔点的标准方法可确定错配的可容忍程度。
与信息的5’端例如，5’非翻译序列甚至包括到AUG起始密码子，互补的寡核苷酸在起始翻译中最有效。但是，互补于mRNA 3’非翻译序列的序列显示在起始mRNA翻译中也有效。见如，Wagner，R，1994，自然，372：333-335。因此，互补于示于图1中的METH 1和/或METH2之5’或3’非翻译、非编码区的寡核苷酸可用于反义方法中以抑制内源性METH 1和/或METH 2 mRNA的翻译。互补于mRNA的5’非翻译区的寡核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补物。互补于mRNA的编码区之反义寡核苷酸不是那么有效的翻译抑制物，但是根据本发明可以使用。无论是否设计用来与METH 1和/或METH 2 mRNA的5’、3’或编码区域杂交，反义核酸长度应当至少为6核苷酸，且优选为长度从6-约50个核苷酸的反义核酸。在特定的方面，寡核苷酸至少为10个核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核苷酸，或至少50个核苷酸。
本发明的多核苷酸可为DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰的版本，单链或双链。寡核苷酸可在碱基基团、糖基团或磷酸骨架部分被修饰，例如，以改善核酸的稳定性、杂交等等。寡核苷酸可包括其他附加的基团，诸如肽(例如，为了体内靶定宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的因子(见如，Lestinger et al.，1989，美国国家科学院院报，86：6553-6556；Kemaitre et al.，1987，美国国家科学院院报，84：648-652；PCT公开文本WO88/09810，公开于1988年12月15日。)或是促进跨越血-脑屏障的因子(见如，PCT公开文本WO89/10134，公开于1988年4月25日)，杂交引发的切割剂(见如，Krol et al.，1988，BioTechniques6：958-976)或嵌入剂(见如，Zon，1988，Pharm.Res.，5：539-549)。为此，寡核苷酸可与其他分子例如肽、杂交引发的交联剂、转运剂、杂交引发的切割剂等偶联。
反义寡核苷酸可包括至少一种修饰的碱基基团，其选自如下但不限于此：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基化queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基化queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧-乙酸(V)，wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸可还包含至少一种修饰的糖基团，其选自，包括但不限于，阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一种修饰的磷酸骨架，其选自包括但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和formacetal或其类似物。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸是一种异头物化寡核苷酸。一种异头物化寡核苷酸与互补RNA形成特定的双链杂合体，其中与通常的b单元不同，链彼此以平行方向延伸(Gautier et al.，1987，核酸研究，15：6625-6641)。寡核苷酸是2’-O-甲基核苷酸(Inoue et al.，1987，核酸研究15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue et al.，1987，FEBSLett.，215：327-330)。
本发明的多核苷酸可利用本领域周知的方法合成，例如利用自动DNA合成仪(诸如市售的Biosearch，Applied Biosystems，等)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可利用Stein et al，1988，核酸研究16：3209，的方法合成。甲基磷酸酯寡核苷酸可利用控制孔径的玻璃聚合物支持物制备(Sarin etal，1988，美国国家科学院院报，85：7448-7451)等。
虽然互补于METH 1和/或METH 2编码区序列的反义核苷酸可以使用，那些互补于转录的非翻译区的是最优选的。
根据本发明的潜在拮抗剂业包括催化性RNA，或核酶(见如，PCT公开文本/11364；公开于1990年10月4日；Sarver et al，.科学，247：1222-1225(1990))。虽然在特定识别位点切割mRNA序列的核酶可用于破坏METH 1和/或METH 2的mRNA，优选使用锤头核酶。锤头核酶在由侧翼区表明的位置切割mRNA，所述侧翼区与靶mRNA形成互补性碱基对。唯一的要求是靶mRNA具有如下的两个碱基序列：5’-UG-3’。锤头核酶的构建和产生为本领域周知，且在Haseloff和Gerlach，自然，334：585-591(1988)中有描述。在METH 1和/或METH 2的核苷酸序列内有多种潜在的锤头核酶切割位点(图1和2)。优选地，核酶被构建使得切割识别位点位于靠近METH 1和/或METH 2 mRNA的5’端；即：增加效率和减小非功能性mRNA转录物的胞内积累。
在反义途径中，本发明的核酶可由修饰的寡核苷酸组成(例如，用于改进稳定性，靶向性等)，且应被递送到体内表达METH 1和/或METH 2的细胞中。编码核酶的DNA构建体可以如上述导入反义编码DNA的相同的方法被导入细胞中。递送的优选方法包括利用“编码”在强组成型启动子，如pol III或pol II启动子，控制下的核酶之DNA构建体，使得转染的细胞产生足够量的核酶以破坏内源性METH 1和/或METH 2信息，并抑制翻译。由于核酶，不同于反义分子，其是催化性的，需要较低的胞内浓度以发挥功效。
拮抗剂/激动剂化合物可用于抑制细胞生长和本发明的多肽对肿瘤细胞和组织的增殖作用，即肿瘤所血管生成的刺激，因此阻滞或防止异常细胞生长和增殖，例如在肿瘤形成或生长中。
拮抗剂/激动剂也可用于防止血管过多的疾病，防止在囊外白内障手术后上皮角膜细胞的增殖。本发明多肽之促有丝分裂活性的防止在有些情况中，例如气囊血管扩张术后的再狭窄中，也是期望。
拮抗剂/激动剂也可用于防止在创伤愈合过程中疤痕组织的生长。
拮抗剂/激动剂也可用于治疗此处所述的疾病。
其它活性
如下述，METH 1和METH 2与ADAM家族成员具有结构和序列同源性。ADAM蛋白质显示蛋白切割性加工膜锚定蛋白质，包括TNF(Black等，自然，385：729(1997)；Moss等，自然，385：733(1997))。由此，METH 1和/或METH 2可用于膜锚定蛋白质的蛋白质切割性加工。可被METH 1和/或METH 2蛋白质切割性加工的膜锚定蛋白质包括细胞因子，生长因子，细胞因子受体和生长因子受体。
除了以上所述的造血细胞系外，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可增加或减少胚胎干细胞的分化或增殖。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可用于调节哺乳动物的特性，如身高、体重、发色、眼的颜色、皮肤、脂肪组织的百分比、色素沉着、大小和形状(如整容手术)。类似地，METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于调节哺乳动物的代谢，影响分解代谢、合成代谢、加工、利用和能量的储存。
由于血管发生是支持脂肪组织的关键因子，METH 1或METH 2多肽或多核苷酸，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于控制体重、降低体重、治疗肥胖和/或控制个体中的脂肪组织。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂可用于通过影响生物节律、抑郁(包括抑郁性疾病)、暴力倾向、耐痛力、生殖能力(优选通过活化素或类抑制素活性)、激素或内分泌水平、食欲、性欲、记忆力、应激力或其他认知性而改变哺乳动物的精神状态或身体状况。
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂还可用做食品添加剂或防腐剂，如用于增加或减少储存能力、脂肪含量、脂类、蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、辅助因子或其他营养成分。
上述应用可用于多种宿主。这些宿主包括但不限于人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、微型猪、鸡、牛、绵羊、狗、猫、非人灵长类动物和人。在特定实施方案中，宿主是小鼠、兔、山羊、豚鼠、鸡、大鼠、仓鼠、猪、绵羊、狗或猫。在优选实施方案中，宿主是哺乳动物。在最优选实施方案中宿主是人。
抗血管生成
如实施例4和5所述，METH 1和METH 2抑制血管生成。因此，本发明提供了一种治疗与血管生成相关疾病和/或紊乱的方法，包括向需要的个体施用治疗有效量的METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂。
例如，本发明的METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂为了治疗癌症或肿瘤可用于多种其他方法中。可用METH 1和/或METH2多核苷酸、多肽和/或激动剂治疗的癌症包括但不限于实体瘤，包括前列腺、肺、乳腺、卵巢、胃、喉、食管、睾丸、肝、腮腺、胆道、结肠、直肠、子宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、甲状腺癌；原发肿瘤和转移瘤；黑素瘤；胶质母细胞瘤；卡波济肉瘤；平滑肌肉瘤；非小细胞肺癌；结肠直肠癌；晚期恶性肿瘤；和血液产生的肿瘤，如白血病。例如，METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂可局部递送，以治疗诸如皮肤癌、头颈肿瘤、乳腺肿瘤、和卡波济肉瘤的癌症。在另一方面，METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂可用于治疗浅表型膀胱癌，方法是例如通过囊泡内给药。METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂可通过注射或导管直接递送到肿瘤或靠近肿瘤的位点。当然，本领域普通技术人员知晓，合适的施用方式将根据所要治疗的肿瘤而改变。在此也讨论了其他递送方式。
METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂可用于治疗除了肿瘤之外的其他涉及血管生成的疾病。这些疾病包括但不限于：良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、生脓性肉芽肿、artheroscleric plaques、眼血管生成疾病，例如糖尿病性视网膜病变、早熟性视网膜病变、斑点退化、角膜移植排斥、新血管青光眼、晶体后纤维增生症、潮红、成视网膜细胞瘤、uvietis和眼部翼状胬肉(异常血管生长)、类风湿性关节炎、牛皮癣、延迟的创伤愈合、子宫内膜异位症、血管发生、肥厚性瘢痕(瘢痕)、不连接性骨折、硬皮病、沙眼、血管粘附、心肌血管生成、冠脉旁路、大脑旁路、动静脉畸形、缺血肢血管生成、Osler-Webber综合征、斑块新血管生成、毛细管扩张、血友病关节、血管纤维瘤、纤维肌性发育不良、创伤肉芽、Crohn’s病和动脉粥样硬化。
例如，在本发明的一方面中，提供了用于治疗肥厚性瘢痕(瘢痕)的方法，包括施用METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂到肥厚性瘢痕或瘢痕中。在本发明的一个实施方案中，将METH 1和/或METH2多核苷酸、多肽和/或激动剂直接注射到肥厚性瘢痕或瘢痕中以防止这些损伤发展。这种疗法在已知会造成肥厚性瘢痕或瘢痕的病症(例如烧伤)的预防性处理中特别有用，且优选在增生期开始形成后(大约在初始创伤后14天)立即施用，但是在肥厚性瘢痕或瘢痕形成前。
如上述，本发明还提供了用于治疗眼部新血管疾病的治疗方法，包括例如角膜新血管生成、新血管青光眼、增生性糖尿病视网膜病变、晶状体后纤维组织形成、斑点退化，以及其他眼部炎症疾病，眼部肿瘤和与脉络膜或虹膜新血管生成相关的疾病。见如，Waltman et al.，Am.J.Ophthal85：704-710(1978)和Gartner et al.，Surv.Ophthal，22：291-312(1978)。
因此，本发明的一个方面提供了治疗眼部新血管生成疾病，诸如角膜新血管生成(包括角膜移植新血管生成)的方法，包括向患者角膜施用治疗有效量的METH 1和/或METH 2化合物(如前述)的步骤，使得血管的形成被抑制。简言之，角膜是一个正常情况下缺乏血管的组织。在特定病理条件下，毛细血管会从边缘的角膜外周血管丛中伸入角膜。当角膜被血管化后，其变为雾状，造成患者视力下降。如果角膜完全不透明则视力完全丧失。
多种疾病可能导致角膜新血管生成，包括例如，角膜感染(例如，砂眼、单纯疱疹角膜炎、利什曼病和盘尾丝虫病)，免疫过程(例如，移植排斥和Stevens-Johnson’s综合征)，碱烧伤，创伤，炎症(任何原因引起的)，毒性和营养缺乏状况，以及由于佩戴角膜接触镜的并发症。
在本发明优选的实施方案中，METH 1和/或METH 2可优选地制成用于局部施用的生理盐水形式(结合了任一防腐剂和眼部用制剂中常用的抗微生物剂)，且以眼药水的形式施用。溶液或悬液可以其纯的形式制备，每日施用数次。或者，如上述制备的抗血管生成组合物也可直接施用于角膜。在优选的实施方案中，用结合于角膜的粘液性粘附聚合物制备抗血管生成组合物。在其他实施方案中，抗血管生成因子或抗血管生成组合物可用作常规激素治疗的佐剂。
局部治疗也可预防性地用于角膜损伤，移植角膜损伤极易引起血管生成反应(如化学烧伤)。在这种情况中，一般与类固醇联合施用，可立即开始帮助防止形成随后的并发症。
在其他实施方案中，上述化合物可在显微镜指导下由眼科医生直接被注射入角膜基质中。优选的注射位点可根据个体损伤的情况而变化，但是施用的目标是将组合物置于血管生成的最前沿(即：介于血管和正常角膜之间)。在多数情况下，这将涉及周缘角膜注射以保护“角膜”进一步形成血管。此方法可在角膜刺激后尽快采用，以预防发生角膜新血管生成。在这种情况中，可将物质注射到介于角膜损伤与其不期望的潜在边缘血液供应之间的周缘角膜处。这种方法可以相类似的用来防止移植角膜的毛细血管侵入。在持续释放形式的注射中，可能每年需要注射2-3次。类固醇也可加入该注射制剂中以减少由于注射本身带来的炎症。
在本发明的另一方面，提供了用于治疗新血管青光眼的方法，包括向患者眼部施用治疗有效量的METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂的步骤，使得血管形成被抑制。在一个实施方案中，化合物可被局部施用到眼部以治疗新血管青光眼的早期形式。在另一实施方案中，化合物可通过注射被置于前房角。在另一实施方案中，化合物也可被置于任一位置使得化合物被持续释放入水性液中。
在本发明的另一方面，提供了用于治疗增生性糖尿病视网膜病变的方法，包括向患者眼部施用治疗有效量的METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂的步骤，使得血管形成被抑制。在一个实施方案中，通过向水性液或玻璃体中注射治疗增生性糖尿病视网膜病变，使得增加在视网膜中METH 1和/或METH 2多核苷酸、多肽和/或激动剂的局部浓度。优选地，此治疗可在需要光焊接治疗的严重的疾病采集前开始。
在本发明的另一方面，提供了用于治疗晶状体后纤维组织形成的方法，包括向患者眼部施用治疗有效量的METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂的步骤，使得血管形成被抑制。化合物可通过玻璃体内注射和/或眼内移植被局部施用到眼部。
METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂可被用于具有作为病理性后果之血管生成的疾病的治疗，如猫抓伤病(Rochele minaliaquintosa)、溃疡(Helicobacter pylori)、巴尔通体病病、杆菌性血管瘤病。
METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂可用作计划生育药物，方法是通过防止胚胎植入所需的血管生成。在计划生育方法的一个方面，足以阻断胚胎植入的化合物的量在性交前或性交且受精完成后施用，由此提供了计划生育的有效方法，甚至可能是“事后”的生育控制有效方法。
METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂也可用于控制月经周期或作为腹膜灌洗液或用来腹膜植入在治疗子宫内膜异位中施用。
本发明的METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂可掺入手术缝线中以防止缝线肉芽肿。
METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂可在多种手术方法中利用。例如，在本发明的一个方面，METH 1和/或METH 2组合物(以例如喷雾剂或薄膜形式)可被用来在移出肿瘤之前包被或喷雾，以从恶性组织中分离正常的周围组织，和/或防止疾病扩散到周围组织。在本发明的另一方面，METH 1和/或METH 2组合物(例如以喷雾形式)可通过内窥镜方法递送，以包被肿瘤，或抑制期望的部分的血管生成。在本发明的另一方面，包被有本发明抗血管生成组合物的手术筛可用在任何使用手术筛的方法中。例如，在一个本发明的实施方案中，在腹部癌症切除手术中载有抗血管生成组合物的手术筛可以利用(例如，在结肠切除后)，以提供对结构的支持，并释放一定量的抗血管生成因子。
在本发明的另一方面，提供了用于治疗肿瘤切除位点的方法，包括在切除后将METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂施用到切面边缘，从而抑制癌症的局部复发和在该位点新血管的形成。在本发明的一个实施方案中，抗血管生成化合物直接施用到肿瘤切割部位(例如，通过用抗血管生成化合物擦拭、涂抹或者包被到肿瘤的切面边缘)。或者，抗血管生成化合物可在施用前被掺入已知的手术膏药中。在特定的优选实施方案中，抗血管生成化合物在恶性病变的肝脏切除以及在神经手术操作后应用。
在本发明的一个方面，METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂可被施用到多种肿瘤的切割边缘，包括例如，乳腺、结肠、脑和肝脏肿瘤。例如，在本发明的一个实施方案中，抗血管生成化合物可在切除后被施用到神经肿瘤的位点，使得在该位点的新血管形成被抑制。
本发明的METH 1和/或METH 2多肽、多核苷酸和/或激动剂也可被与其他抗血管生成因子一起施用。其他抗血管生成因子的代表性例子包括：抗侵入性因子、视黄酸和其衍生物、紫杉醇、苏拉明、金属蛋白酶-1组织抑制剂、金属蛋白酶-2组织抑制剂、纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1、纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-2、和多种形式的较轻的“d族”过渡金属。
较轻的“d族”过渡金属包括例如，钒、钼、钨、钛、铌、钽等的种类。这类过渡金属种类可形成过渡金属复合物。上述过渡金属种类的适合的复合物包括含氧过渡金属复合物。
钒复合物的代表性例子是含氧钒(oxo vanadium)复合物，诸如钒酸(盐)和氧钒基复合物。适合的钒酸盐复合物包括间钒酸盐和正钒酸盐复合物，诸如例如，间钒酸铵，间钒酸钠和正钒酸钠。适合的氧钒基复合物包括例如氧钒基乙酰基丙酮酸和氧钒基硫酸盐，包括氧钒基硫酸氢盐，诸如氧钒基硫酸单氢盐和三氢盐。
钨和钼复合物的代表性例子也包括含氧复合物。适当的含氧钨(oxotungsten)复合物包括钨酸和氧化钨复合物。适合的钨酸复合物包括钨酸铵、钨酸钙、钨酸二氢钠和钨酸。适合的氧化钨包括氧化钨(IV)和氧化钨(VI)。适合的含氧钼(oxo molybdenum)复合物包括钼酸、氧化钼和氧钼基复合物。适合的钼酸复合物包括钼酸铵和其水合物、钼酸钠和其水合物以及钼酸钾和其水合物。适合的氧化钼包括氧化钼(VI)、氧化钼(VI)和钼酸。适合的氧钼基复合物包括例如氧钼基乙酰丙酮酸。其他合适的钨及钼复合物包括由例如甘油、酒石酸和糖类衍生的羟基(hydroxo)衍生物。
其他多种抗血管生成因子也可用于本发明的内容中。代表性例子包括血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸化几丁质衍生物(从王后蟹壳制备)(Murata et al.，癌症研究，51：22-26，1991)；硫酸化多糖肽聚糖复合物(SP-PG)(此化合物的功能可通过类固醇(如雌激素和柠檬酸他莫昔芬)的存在增强其功能)；癌基因抑活药；基质代谢调节剂；包括例如脯氨酸类似物、顺式羟脯氨酸、D，L-3，4-脱氢脯氨酸、硫脯氨酸、α，α-二吡啶基，β-氨基丙腈富马酸；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-恶唑酮；氨甲蝶呤；米托蒽醌；肝素；干扰素；2-巨球蛋白血清；ChIMP-3(Pavloff et al.，J.Bio.Chem.，267：17321-17326，1992)；抑糜蛋白酶素(Tomkinson et at.，Biochem J.286：475-480，1992)；6-环糊精十四硫酸酯；eponemycin；喜树碱；夫马菌素(Ingber et at.，自然，348：555-557，1990)；金硫代苹果酸钠(“GST”；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.，79：1440-1446，1987)；β-1-抗胶原酶-血清；α-抗纤溶酶原激活物(Holmes etal.，J.Biol.Chem.262(4)l；1659-1664，1987)；白三烯(国立癌症研究所)；Lobenzarit二钠(N-(2)-羧苯基-4-氯邻氨基苯甲酸二钠或“CCA”)；Takeuchi et al.，Agents Actions 36：312-316，1992)；反应停；angostatic类固醇；AGM-1470；羧基氨基咪唑；和金属蛋白酶抑制剂如BB94。
诊断方法
本发明还涉及METH 1或METH 2多核苷酸用于诊断试剂的用途。与功能异常相关的METH 1或METH 2基因的成熟形式的检测提供了一种能补充或确定对某些疾病或疾病易感性的诊断的诊断方法，所述疾病或易感性是由于METH 1或METH 2的表达不足、表达过量或表达改变。带有METH 1或METH 2基因突变的个体可在DNA水平上用多种技术检测。
用于诊断的核酸可从受试者细胞中获得，例如从血、尿、唾液、组织活检或尸检材料中获得。基因组DNA可直接用于检测或利用PCR进行酶促扩增，或在分析前用其他方法扩增。RNA或cDNA也可以类似方式使用。删除和插入可通过与正常基因型比较扩增产物的大小改变而检测。点突变可通过将扩增的DNA与标记的METH 1或METH 2核苷酸序列杂交而鉴定。完美匹配的序列可与错配的双链通过RNase消化或通过熔点温度差异而区分开来。DNA序列差异也可通过DNA片段在凝胶(含或不含变性剂)中电泳运动的改变而检测，或通过直接DNA测序检测。见如，Myers et al.，科学，230：1242(1985)。在特定位置的序列改变可通过核酸酶保护分析，例如RNase和S1保护或化学切割方法来发现。见Cotton et al.，美国国家科学院院报，85：4397-4401(1985)。在另一个实施方案中，可构建包含METH 1或METH 2核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针的阵列，以进行例如遗传突变的高效筛选。阵列技术方法为周知，且具有普遍适用性，可用于解决在分子遗传学上包括基因表达、基因连锁和遗传变异的多种问题(见，如，M.Chee et al.，科学，274：610-613(1996))。
诊断性阵列提供了一种通过所述方法检测METH 1或METH 2基因中的突变，用于诊断或确定对血管生成疾病(癌症，癌症转移，慢性炎症性疾病，类风湿关节炎，altherosclerosis，斑点退化，糖尿病视网膜病变)、再狭窄、阿尔茨海默症和组织再建模(remodeling)易感性的方法。
此外，血管生成疾病(癌症，癌症转移，慢性炎症性疾病，类风湿关节炎，altherosclerosis，斑点退化，糖尿病视网膜病变)、再狭窄、阿尔茨海默症和组织再建模可通过如下方法诊断，包括确定来自受试者的样品中METH 1或METH 2多肽或METH 1或METH 2 mRNA水平的异常降低或增加。表达的降低或增加可在RNA水平利用本领域已知的定量多核苷酸的方法(如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹和其他杂交方法)测定。可用于确定来自宿主样品之蛋白质(诸如METH 1或METH 2多肽)水平的分析技术为本领域周知。这类分析方法包括放射免疫分析、竞争性结合分析、Western印迹分析和ELISA分析。
癌症诊断和预后
现认为，与相应的标准哺乳动物(即未患癌症的同种哺乳动物)相比，患癌哺乳动物体内的某些组织表达明显减少水平的METH 1或METH 2蛋白质和编码METH 1或METH 2蛋白质的mRNA。进一步认为与来自未患癌症的同种哺乳动物的血清相比，在来自患癌哺乳动物的某些体液(如血清、血浆、尿和脊髓液)中可检测到水平减少的METH 1或METH2蛋白质。因此，本发明提供了一种肿瘤诊断中有用的诊断方法，包括检测哺乳动物细胞或体液中编码METH 1蛋白质的基因的表达水平，并比较此基因表达水平与标准的METH 1基因表达水平，基因表达水平降低到标准之下是某些肿瘤的指示。本发明还提供了一种肿瘤诊断中有用的诊断方法，包括检测哺乳动物细胞或体液中编码METH 2蛋白质的基因的表达水平，并比较此基因表达水平与标准的METH 2基因表达水平，基因表达水平降低到标准之下是某些肿瘤的指示。
在已可按常规方法进行的肿瘤诊断中，本发明可用做预后指示剂，呈现减少METH 1或METH 2基因表达的病人，其临床结果比以较低水平表达此基因的病人更坏。
“检测编码METH 1或METH 2蛋白质的基因表达水平”指直接(如测定或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平)或相对(如与第二种生物样品中的METH 1或METH 2蛋白质的水平或mRNA水平相比较)地定性或定量检测或估计在第一种生物样品中METH 1或METH 2蛋白质的水平或编码METH 1或METH 2蛋白质的mRNA水平。
优选地，对第一种生物样品中的METH 1或METH 2蛋白质水平或mRNA水平进行检测或估计，并与标准METH 1或METH 2蛋白质水平或mRNA水平相比较，作为标准的第二种生物样品获自未患癌症的个体。正如本领域中应理解的，一旦标准的METH 1或METH 2蛋白质水平或mRNA水平已知，它可重复使用作为比较的标准。
“生物样品”指获自含METH 1或METH 2蛋白质或mRNA之个体、细胞系、组织培养物或其他来源的任何生物样品。生物样品包括含分泌型成熟METH 1或METH 2蛋白质的哺乳动物体液(如血清、血浆、尿、滑液和脊髓液)，以及肾上腺、甲状腺、胃、脑、心、胎盘、肺、肝、肌肉、肾、胰、睾丸和卵巢组织(对于METH 1)；及前列腺、小肠、结肠、脑和肺组织(对于METH 2)。
本发明可用于检测哺乳动物的癌症。本发明特别可用于哺乳动物以下类型癌症的诊断中：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌和睾丸癌。优选的哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、牛、猪、马、兔和人。尤其优选人。
用Chomczynski和Sacchi，生化分析(Anal.Biochem.)162：156-159(1987)中所述的一步硫氰酸胍-酚-氯仿法可从生物样品中分离细胞的总RNA。然后用任何恰当的方法检测编码METH 1或METH 2蛋白质的mRNA水平。这些方法包括RNA印迹分析(Harada等，细胞63：303-312(1990))、S1核酸酶作图(Fujita等，细胞49：357-367(1987))、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录与聚合酶链式反应联合(RT-PCR)(Makino等，技术(Technique)2：295-301(1990))和逆转录与连接酶链式反应联合(RT-LCR)。
可用以抗体为基础的技术检验生物样品中的METH 1或METH 2蛋白质水平。例如，可用传统的免疫组织学方法(Jalkanen，M.等，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)101：976-985(1985)；Jalkanen等，细胞生物学杂志105：3087-3096(1987))研究组织中METH 1或METH 2蛋白质的表达。
其他以抗体为基础、可用于检测METH 1或METH 2蛋白质基因表达的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放免测定(RIA)。
合适的标记是本领域已知的，包括酶标记(如葡萄糖氧化酶)、放射性同位素(如碘( 、 )、碳( )、硫( )、氚( )、铟( )和锝( ))和荧光标记(如荧光素和罗丹明)和生物素。
疫苗
本发明的另一方面涉及一种在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包括用METH 1或METH 2多肽或其片段接种哺乳动物，以足以产生抗体和/或T细胞免疫反应，从而保护该动物免受尤其是血管发生疾病(癌症、癌症转移、慢性炎性疾病、类风湿关节炎、动脉粥样性硬化、斑点退化、糖尿病性视网膜病变)、再狭窄、老年性痴呆和组织重构(remodeling)等。在另一方面，本发明涉及一种在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，包括将METH 1或METH 2多肽通过指导METH 1或METH 2多核苷酸在体内表达的载体递送，以诱导这样的免疫反应以产生保护动物免受疾病的抗体。
本发明又一方面涉及一种免疫性/疫苗制剂(组合物)，当导入哺乳动物宿主中时，其在该哺乳动物中诱导针对METH 1或METH 2多肽的免疫反应，其中该组合物包含METH 1或METH 2多肽或者METH 1或METH 2基因。该疫苗制剂可还包含一种适当的载体。由于METH 1或METH 2多肽可在肠胃中裂解，因此优选胃肠外施用(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内等注射)。适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与受试者血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬液，其可包括悬浮剂或增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿或小瓶中，可被贮存在冷冻干燥条件，仅需要在用前加入无菌液体载体。疫苗制剂也可包括用于增强制剂免疫原性的佐剂系统，诸如水包油系统和其他本领域已知的系统。剂量取决于疫苗的比活且油常规实验可方便的确定。
给药方式
现已认识到血管供应的增加在肿瘤发展和转移中起中心作用；因此，可证实将血管生成抑制剂用做癌症病人的辅助治疗是有效的。一些目前已知的血管生成抑制剂由于严重的副作用而不适合用于全身性治疗。本发明的发明者已发现，METH 1和METH 2在体内和体外均为血管生成的强抑制剂。与其他血管生成抑制剂相比，METH 1和METH 2的优点在于它们通常与生理性血管生成的抑制相关；因此，它们无毒性和内皮特异性。此外，METH 1和METH 2具有限制性表达模式，可能在器官特异性方面有优势。
因此，本发明多肽可用于治疗癌症。本发明的METH 1和METH 2多肽还可用于治疗患与血管生成相关之其他疾病的个体，包括异常伤口愈合、炎症、类风湿性关节炎、牛皮癣、子宫内膜出血紊乱、糖尿病性视网膜病、一些形式的黄斑变性、血管瘤和动脉-静脉畸形。
因而，本发明提供了抑制个体内血管生成的方法，包括将含有效剂量的本发明分离METH 1多肽的药物组合物施用于该个体，有效地提高其体内的METH 1活性水平。本发明还提供了抑制个体内血管生成的方法，包括将含有效剂量的本发明分离METH 2多肽的药物组合物施用于该个体，有效地提高其体内的METH 2活性水平。
可以此方式用于抑制血管生成的METH 1多肽包括：由含前导序列之保藏cDNA编码的METH 1多肽；由不含前导序列之保藏cDNA编码的成熟METH 1多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ ID NO：2中约第1-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第2-950位氨基酸的多肽；含SEQID NO：2中约第29-950位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第30-950位氨基酸的多肽；含METH 1金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸的多肽；含METH 1去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸的多肽；含METH 1第一TSP样结构域，SEQ IDNO：2中第545-598位氨基酸的多肽；含METH 1第二TSP样结构域，SEQID NO：2中第841-894位氨基酸的多肽；含METH 1第三TSP样结构域，SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：2中约第549-563位氨基酸的多肽；包含SEQ ID NO：2的542-894位氨基酸的多肽；和包含SEQ ID NO：2中801-950位氨基酸的多肽。
可以此方式用于抑制血管生成的METH 2多肽包括：由含前导序列之保藏cDNA编码的METH 2多肽；由不含前导序列之保藏cDNA编码的成熟METH 2多肽(即，成熟蛋白质)；含SEQ ID NO：4中约第1-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第2-890位氨基酸的多肽；含SEQID NO：4中约第24-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第112-890位氨基酸的多肽；含METH 2金属蛋白酶结构域，SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸的多肽；含METH 2去整联蛋白结构域，SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸的多肽；含METH 2第一TSP样结构域，SEQ IDNO：4中第530-583位氨基酸的多肽；含METH 2第二TSP样结构域，SEQID NO：4中第837-890位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸的多肽；含SEQ ID NO：4中约第529-548位氨基酸的多肽。
还包括的是缺乏TSP3的METH 1或METH 2蛋白质；缺乏TSP2和TSP3的METH 1或METH 2蛋白质；缺乏TSP3，TSP2和TSP1的METH1或METH 2蛋白质；缺乏富含半胱氨酸的结构域，TSP1，TSP2和TSP3之METH 1或METH 2蛋白质；缺乏金属蛋白酶结构域，富含半胱氨酸的结构域，TSP1，TSP2和TSP3之METH 1或METH 2蛋白质；缺乏原结构域，金属蛋白酶结构域，富含半胱氨酸的结构域，TSP1，TSP2和TSP3之METH 1或METH 2蛋白质。最后，也优选所有这些结构域的组合。例如，METH 1的富含半胱氨酸结构域可与METH 1的1，2或3 TSP结构域组合。METH 2的富含半胱氨酸结构域可与METH 2的1，2或3 TSP结构域组合。METH 1的金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的结构域可与METH 1的TSP1，TSP2和TSP3结构域组合。METH 2的金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的结构域可与METH 2的TSP1，TSP2和TSP3结构域组合。METH 1的原结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的结构域可与METH 1的TSP1，TSP2和TSP3结构域组合。METH 2的原结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的结构域可与METH 2的TSP1，TSP2和TSP3结构域组合。METH 1的信号序列、原结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的结构域可与METH 1的TSP1，TSP2和TSP3结构域组合。METH 2的信号序列、原结构域、金属蛋白酶结构域、富含半胱氨酸的结构域可与METH 2的TSP1，TSP2和TSP3结构域组合。
尽管如上所提及，治疗剂量应根据治疗情况而定，但通常建议的非胃肠施用METH 1或METH 2多肽的每剂总药学有效量是约1μg/kg病人体重/天-10mg/kg病人体重/天。更优选剂量为至少0.01mg/kg/天，对于人来说最优选约为0.01-1mg/kg/天。如果持续给药，一般METH 1或METH2多肽给药速率是约1μg/kg/小时-50μg/kg/小时，由注射1-4次/天或持续皮下输注，如用微型泵进行。也可使用静脉袋溶液。
含本发明METH 1或METH 2的药物组合物可口服、直肠给药、非肠道给药、脑池内给药、阴道内给药、腹膜内给药、局部给药(如用粉剂、药膏、滴剂或经皮片剂)、经颊给药或作为口或鼻喷雾剂给药。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的辅助配方。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。
基因治疗方法
本发明的另一方面是基因治疗方法，其用于治疗紊乱、疾病和情况。基因治疗方法涉及将核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列导入动物，以获得本发明之METH 1或METH 2多肽的表达。该方法需要编码METH 1和/或METH 2多肽的多核苷酸，其与目标组织表达此多肽所必需的启动子和任意其它遗传因子有效连接。此类基因治疗和递送技术为本领域公知，见例如WO90/11092，其于此处引用作为参考。
这样，例如来自患者的细胞可用多核苷酸(DNA或RNA)进行离体构建，其中所述多核苷酸包含启动子，后者与METH 1和/或METH 2多核苷酸有效连接，然后将构建的细胞提供给患者，使患者可被多肽治疗。此类方法为本领域周知。例如见Belldegrun，A.等人，国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)85：207-216(1993)；Ferrantini，M.等人，肿瘤研究(Cancer Research)53：1107-1112(1993)；Ferrantini，M.等人，免疫学杂志(J.Immunology)153：4604-4615(1994)；Kaido，T.等人，国际肿瘤杂志(Int.J.Cancer)60：221-229(1995)；Ogura，H.等人，肿瘤研究50：5102-5106(1990)；Santodonato，L.等人，人类基因治疗(Human GeneTherapy)7：1-10(1996)；Santodonato，L.等人，基因治疗(Gene Therapy)4：1246-1255(1997)；以及Zhang，J.-F.等人，肿瘤基因治疗(Cancer GeneTherapy)3：31-38(1996)，它们于此处引用作为参考。在一个实施方案中，被构建的细胞为动脉细胞。通过直接注射至动脉、围绕动脉的组织，或通过导管注射，可将动脉细胞重新导入患者。
如下详述，METH 1和/或METH 2多核苷酸构建体可用任一方法递送，其中所述方法将可注射材料递送至动物细胞，例如注射入组织间隙(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝等)。METH 1和/或METH 2多核苷酸构建体可以药学可接受的液体或含水载体递送。
在一个实施方案中，METH 1和/或METH 2多核苷酸以裸核苷酸形式递送。术语“裸”多核苷酸(DNA或RNA)指不含任一递送载体的序列，其中所述递送载体起到辅助、促进或利于进入细胞的作用，其包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂质转染物或沉淀试剂等。但METH1和/或METH 2多核苷酸也可以脂质体制剂递送，并且脂质转染物制剂可通过本领域技术人员周知的方法制备。此类方法例如于美国专利号5,593,972、5,589,466和5,580,859中进行了描述，它们于此处引用作为参考。
用于基因治疗方法的METH 1和/或METH 2多核苷酸载体构建体优选既不整合入宿主基因组，也不含有允许复制之序列的构建体。合适的载体包括可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；以及可从Invitrogen获得的pEF1/V5、pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它合适的载体对本领域技术人员是显然的。
本领域技术人员公知的任一强启动子可用于驱动METH 1和/或METH 2 DNA的表达。合适的启动子包括腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导型启动子，例如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶激酶启动子，例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子；逆转录病毒LTR；b-肌动蛋白启动子；以及人生长激素启动子。启动子也可以是METH 1和/或METH 2本身的启动子。
与其它的基因治疗技术不同，将裸核酸序列导入目标细胞的一个主要优点在于细胞内多核苷酸合成的暂时本性。研究表明可将非复制的DNA序列导入细胞，以提供长达6个月的目标多肽的产生。
METH 1和/或METH 2多核苷酸构建体可递送至动物的组织间隙，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织间隙包含位于器官组织的网状纤维、血管壁或房壁弹性纤维、纤维组织的胶原纤维之间的细胞间流动粘多糖基质，或者包盖肌肉细胞之结缔组织内或骨腔隙内的相同基质。循环的血浆和淋巴管的淋巴液所占据的间隙也是同样的。因为下述原因，优选向肌肉组织间隙递送。它们可通过注射方便地递送至包含这些细胞的组织。虽然可在非分化的或不完全分化的细胞中进行递送和表达(例如血干细胞或皮肤成纤维细胞)，但优选地将它们递送至已分化之持续的、非分裂细胞并于其中表达。体内肌肉细胞摄入并表达多肽的能力特别强。
对于裸核酸序列的注射，DNA或RNA的有效剂量在从约0.05mg/kg体重至约50mg/kg体重的范围间。优选地剂量从约0.05mg/kg至约20mg/kg，以及更优选地从约0.05mg/kg至约5mg/kg。当然作为一般技术的技术人员，可以理解该剂量根据所注射之组织位点而不同。本领域一般技术人员很容易即可测定核酸序列的合适及有效剂量，并且该剂量依据治疗情况和使用途径的不同而不同。
优选的施用途径是通过肠胃外途径注射至组织间隙，但也可用其它肠胃外途径，例如气雾剂吸入法特别地用于向肺或支气管组织、咽喉或鼻粘膜的递送。另外裸METH 1和/或METH 2 DNA构建体可在血管成形术过程中通过导管递送至动脉。
可通过本领域公知的任一方法递送裸多核苷酸，其包括但不限于，直接注射于递送位点、静脉内注射、局部施用、导管输入以及所谓的“基因枪”。这些递送方法为本领域公知。
构建体也可用递送载体递送，例如病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂质转染物、沉淀试剂等。此类递送方法为本领域公知。
在某些实施方案中，METH 1和/或METH 2多核苷酸构建体复合于脂质体制备物中。用于本发明的脂质体制备物包括阳离子的(带正电荷)、阴离子的(带负电荷)和中性制备物。但特别优选阳离子脂质体，因为阳离子脂质体和聚阴离子核酸之间可形成紧密的电荷复合体。阳离子脂质体已显示可介导质粒DNA(Felgner等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1987)84：7413-7416，其于此处引用作为参考)；mRNA(Malone等人，美国国家科学院院报(1989)86：6077-6081，其于此处引用作为参考)；和纯化的转录因子(Debs等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1990)265：10189-10192，其于此处引用作为参考)以有功能形式递送至胞内。
阳离子脂质体易于获得。例如N[1-(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三乙胺(DOTMA)脂质体尤其有用，并且可从GIBCO BRL，GrandIsland，纽约的Lipofectin商标下获得(也见，Felgner等人，美国国家科学院院报(1987)84：7413-7416，其于此处引用作为参考)。其它可购买到的脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。
使用本领域周知的技术可从易于获得的材料制备其它阳离子脂质体。见例如PCT公开号WO90/11092(其于此处引用作为参考)描述的DOTAP(1，2-双(油酰基氧)-3-(三甲胺基)丙烷)脂质体。文献中解释了DOTMA脂质体的制备，见例如P.Felgner等人，美国国家科学院院报84：7413-7417，其于此处引用作为参考。可用类似方法从其它阳离子脂类制备脂质体。
阴离子脂质体和中性脂质体同样地易于获得，例如从Avanti PolarLipids(Birmingham，Ala.)获得，或可容易地用易于得到的材料制备。此类材料包括磷脂酰、胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。这些材料可与DOTMA和DOTAP起始材料以合适比例混合。用这些材料制备脂质体的方法为本领域周知。
例如，市售的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)可用于以多种组合、在加或不加胆固醇时，制备常规的脂质体。这样，例如DOPG/DOPC囊泡可通过将氮气通入超声小玻璃瓶，干燥50mg DOPG和50mg DOPC而制备。样品置于真空泵下过夜，并且第二天用去离子水使其水合。然后在一有盖小玻璃瓶中，用带有倒转杯(水浴型)探头的Heat Systems 350型超声仪，在最大设置下，水浴以15EC循环时，对样品超声2小时。另外，负电荷囊泡可不用超声制备，以产生多层囊泡，或通过挤压使通过核孔膜，以产生不连续大小的单层囊泡。其它方法为本领域技术人员公知并且可以应用。
脂质体包括多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)或大单层囊泡(LUV)，其中优选SUV。可用本领域周知的方法制备多种脂质体-核酸复合体。见例如，Straubinger等人，免疫学方法(Methods ofImmunology)(1983)，101：512-517，其于此处引用作为参考。例如含有核酸的MLV可通过以下方法制备：将磷脂薄膜沉淀于玻璃管壁，接下来用含有欲包封材料的溶液使之水化。通过充分超声MLV制备SUV，以产生单层脂质体的均一群。将欲包封材料加至做好的MLVs悬液，然后超声。当使用含有阳离子脂质的脂质体时，用合适的溶液(例如无菌水或等渗缓冲液如10mM Tris/ )重悬干燥的脂质膜，超声，然后将做好的脂质体直接与DNA混合。因为正电荷的脂质体与负电荷的DNA结合，故脂质体和DNA形成很稳定的复合体。发现SUV可用于小的核酸片段。用本领域周知的许多方法可制备LUV。常用方法包括 螯合法(Papahadjopoulos等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)(1975)394：483；Wilson等人，细胞(Cell)(1979)17：77)；乙醚注射(Deamer，D.和Bangham，A.生物化学与生物物理学报(1976)443：629；Ostro等人，生物化学与生物物理学研究快讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)(1977)76：836；Fraley等人，美国国家科学院院报(1979)76：3348)；去污剂透析(Enoch，H.和Strittmatter，P.，美国国家科学院院报(1979)76：145)；以及反相蒸发法(REV)(Fraley等人，生物化学杂志(1980)255：10431；Szoka，F.和Papahadjopoulos，D.，美国国家科学院院报(1978)75：145；Schaefer-Ridder等人，科学(Science)(1982)215：166)，它们于此处引用作为参考。
通常DNA与脂质体的比率从约10∶1至约1∶10，优选地该比率为从约5∶1至约1∶5，更优选地该比率为从约3∶1至约1∶3。而更优选地该比率为1∶1。
美国专利号5,676,954(其于此处引用作为参考)报道了对小鼠注射与阳离子脂质体载体复合的基因材料。美国专利号4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055，以及国际公开号WO94/29469(其于此处引用作为参考)提供了用于向细胞和哺乳动物转染DNA的阳离子脂质。美国专利号5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055，以及国际公开号WO94/29469(其于此处引用作为参考)提供了用于向哺乳动物递送DNA-阳离子脂质复合体的方法。
在某些实施方案中，使用含有RNA的逆转录病毒颗粒，离体或体内基因工程设计细胞，其中所述RNA含有编码METH 1和/或METH 2的序列。可衍生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括，但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)、脾坏死病毒(spleennecrosis virus)、劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、Harvey肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒(Myeloproliferative Sarcoma Virus)、乳腺肿瘤病毒。
使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系，以形成生产者细胞系。可被转染之包装细胞系的实例包括，但不限于，Miller在人类基因治疗1：5-14(1990)中描述的PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系，其全部于此处引用作为参考。可通过本领域公知的任一方法将载体转导包装细胞。此类方法包括，但不限于，电穿孔、使用脂质体以及 沉淀。在另一个可选择的方案中，可将逆转录病毒质粒载体包封于脂质体中或与脂质偶联，然后施与宿主。
生产者细胞系产生感染性的逆转录病毒载体颗粒，其包含编码METH1和/或METH 2的多核苷酸。然后此类逆转录病毒载体颗粒可用于体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达METH 1和/或METH 2。
在某些其它的实施方案中，用包含于腺病毒载体中的METH 1和/或METH 2多核苷酸，离体或体内基因工程设计细胞。可对腺病毒进行操作，使其编码并表达METH 1和/或METH 2，同时就它在正常裂解病毒生存周期中的复制能力而言可被失活。腺病毒的表达可实现，但病毒DNA不整合入宿主细胞染色体，因此减轻了对插入诱变的担心。进一步地，腺病毒被用作活的小肠疫苗已多年，具有相当好的安全特性(Schwartz，A.R.等人，(1974)美国呼吸道疾病综论(Am.Rev.Respir.Dis.)109：233-238)。最后，已在许多例子中对腺病毒介导的基因转移进行了阐述，包括将α-1-抗胰蛋白酶和CFTR转移至棉鼠肺(Rosenfeld，M.A.等人，(1991)科学252：431-434；Rosenfeld等人，(1992)细胞68：143-155)。而且，尝试建立腺病毒作为人肺癌引起因子的深入研究均为阴性结果(Green，M.等人，(1979)美国国家科学院报76：6606)。
可用于本发明的合适的腺病毒载体例如，于Kozarsky和Wilson，遗传学与发展的最新观点(Curr.Opin.Genet.Devel.)3：499-503(1993)；Rosenfeld等人，细胞68：143-155(1992)；Engellhardt等人，人类遗传治疗(Human Genet.Ther.)4：759-769(1993)；Yang等人，自然遗传学(Nature Genet.)7：362-369(1994)；Wilson等人，自然(Nature)365：691-692(1993)；以及美国专利号5,652,224中进行了描述，它们于此处引用作为参考。例如，腺病毒载体Ad2是有用的，其可于293细胞中生长。这些细胞含有腺病毒的E1区，并组成型地表达E1a和E1b，后者通过提供从载体上删除之基因的产物，而与缺陷的腺病毒互补。除Ad2外，其它腺病毒变体(例如Ad3、Ad5和Ad7)也可用于本发明。
优选地，用于本发明的腺病毒为复制缺陷的。复制缺陷的腺病毒需要辅助病毒和/或包装细胞系的帮助，以形成感染性颗粒。所得到的病毒可感染细胞，并且可表达与启动子有效连接的目标多核苷酸，但在大多数细胞中不能复制。复制缺陷的腺病毒可以是对一个或多个下列基因的全部或部分删除：E1a、E1b、E3、E4、E2a，或L1至L5。
在某些其它的实施方案中，用腺伴随病毒(AAV)离体或体内基因工程设计细胞。AAV是自然产生的缺陷病毒，其需要辅助病毒以产生感染性颗粒(Muzyczka，N.，微生物学和免疫学的当前课题(Curr.Topics inMicrobiol.Immunol.)158：97(1992))。它也是可将其DNA整合至非分裂细胞的为数不多的病毒之一。载体可被包装和整合，但外源DNA的空间限制在约4.5kb，其中所述载体含有AAV中的少至300的碱基对。产生和使用此类AAVs的方法为本领域公知。见例如美国专利号5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,953、5,478,745以及5,589,377。
例如，用于本发明的合适的AAV载体包括所有DNA复制、包装和宿主细胞整合的所有必需序列。用标准的克隆方法将METH 1和/或METH 2多核苷酸构建体插入AAV载体，例如那些可在Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，纽约(1989)中找到的方法。然后将重组AAV用任一标准技术转染入感染了辅助病毒的包装细胞，其中所述标准技术包括脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀等。合适的辅助病毒包括腺病毒、巨细胞病毒、痘苗病毒或疱疹病毒。一旦包装细胞被转染和感染，它们将产生感染性的AAV病毒颗粒，其包含METH 1和/或METH 2多核苷酸构建体。这些病毒颗粒然后用于或离体或体内转导真核细胞。转导的细胞将含有整合入其基因组的METH 1和/或METH 2多核苷酸构建体，并将表达METH 1和/或METH 2。
基因治疗的另一方面涉及通过同源重组而有效连接异源控制区和内源多核苷酸序列(例如编码METH 1和/或METH 2)(见例如，美国专利号5,641,670，于1997年6月24日公布；国际公开号WO96/29411，于1996年9月26日公开；国际公开号WO94/12650，于1994年8月4日公开；Koller等人，美国国家科学院院报86：8932-8935(1989)；以及Zijlstra等人，自然342：435-438(1989)。该方法涉及基因的活化，其中所述基因存在于目标细胞中，但在细胞中往往不表达，或以较希望的水平要低的水平表达。
用本领域公知的标准技术制备多核苷酸构建体，其包含启动子和启动子侧翼的靶向序列。合适的启动子为此处所描述的启动子。靶向序列与内源序列充分互补，以允许启动子-靶向序列与内源序列之间的同源重组。靶向序列将充分靠近METH 1和/或METH 2目标内源多核苷酸序列的5’末端，以使启动子可通过同源重组而与内源序列有效连接。
启动子和靶向序列可用PCR扩增。优选地，扩增的启动子5’和3’末端含有不同的限制性酶切位点。优选地，第一个靶向序列的3’末端含有与扩增的启动子5’末端相同的限制性酶切位点，并且第二个靶向序列的5’末端含有与扩增的启动子3’末端相同的限制性酶切位点。消化扩增的启动子和靶向序列，并连接在一起。
启动子-靶向序列或以裸核苷酸形式，或以与转染-促进剂(例如上面详述的脂质体、病毒序列、病毒颗粒、全病毒、脂质转染物、沉淀剂等)连接的形式递送至细胞。P启动子-靶向序列可通过任一方法递送，包括直接的针注射、静脉内注射、局部施用、导管输入、粒子加速器等。这些方法在下面进行详述。
启动子-靶向序列构建体被细胞摄入。构建体和内源序列间发生同源重组，以使内源METH 1和/或METH 2序列置于启动子的控制下。然后启动子驱动内源METH 1和/或METH 2序列的表达。
编码METH 1和/或METH 2的多核苷酸可与编码其它蛋白质的其它多核苷酸一同施用。此类蛋白质包括，但不限于，酸性和碱性成纤维细胞生长因子、VEGF-1、VEGF-2、VEGF-3、VEGF-E、PIGF 1和2、表皮生长因子α和β、血小板来源的内皮细胞生长因子、血小板来源的生长因子α和β、肿瘤坏死因子α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、氧化氮合酶。
优选地，编码METH 1和/或METH 2的多核苷酸含有分泌信号序列，其促进蛋白质的分泌。信号序列一般位于欲表达的多核苷酸编码区，朝向或在编码区的5’末端。信号序列对于目标多核苷酸而言，可为同源或异源的，并且信号序列对于被转染的细胞而言，可为同源或异源的。此外，信号序列可用本领域公知的方法化学合成。
可用任一施用模式施用任一上述多核苷酸构建体，只要该模式导致一种或多种分子以足够提供治疗效果的量表达。它包括直接的针注射、系统注射、导管输入、弹道发射注射、粒子加速器(即“基因枪”)、明胶海棉长效药剂、其它市售的长效药剂材料、渗透泵(例如Alza微型泵)、口服的或栓剂的固体(片或丸)药学制剂，以及外科手术过程中的植入或局部应用。例如，将磷酸钙沉淀的裸质粒直接注射至大鼠肝和大鼠脾，或将蛋白质包裹的质粒直接注射入门静脉，可导致大鼠肝中外源基因的表达(Kaneda等人，科学243：375(1989))。
局部施用的优选方法是通过直接注射。优选地，将与递送载体复合的本发明之重组分子通过直接注射施用入或局部施用在动脉区内。将组合物局部施用在动脉区内是指将组合物注射在动脉内数厘米并优选地数毫米。
局部施用的另一种方法是将本发明的多核苷酸构建体与外科伤口接触或在其周围。例如患者可经历外科手术，并且将多核苷酸构建体包被于伤口内的组织表面，或将该构建体直接注射入伤口内的组织区内。
用于系统施用的治疗组合物包括与本发明之目标递送载体复合的本发明之重组分子。合适的用于系统施用之递送载体包含含有配体的脂质体，其用于将载体靶向特定的位点。
系统施用的优选方法包括静脉内注射、气雾剂、口服的和经皮的(局部)递送。静脉内注射可用本领域的方法标准进行。气雾剂递送也可用本领域的方法标准进行(见例如，Stribling等人，美国国家科学院报189：11277-11281(1992)，其于此处引用作为参考)。口服递送可通过将本发明的多核苷酸构建体与载体复合而进行，其中所述载体能承受动物肠道消化酶的降解。此类载体的实例包括可塑胶囊或片，正如本领域公知的载体。局部递送可通过将本发明的多核苷酸构建体与可透过皮肤的亲脂试剂(例如DMSO)混合而进行。
对欲递送之物质有效剂量的确定依赖许多因素，包括例如，物质的化学结构和生物活性、动物的年龄和体重、需要治疗的精确情况和其严重性，以及施用途径。治疗频率依赖许多因素，例如每剂施用的多核苷酸构建体的量，以及受试者的健康和历史。精确的量、剂量数及剂量时间将由主治的内科医生或兽医确定。
本发明的治疗组合物可施与任一动物，优选哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪，其中人是特别优选的。
在一个特定的实施方案中，通过基因治疗方法施用核酸，以治疗、抑制或阻止与本发明之多肽的异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱，其中所述核酸包含编码抗体或其功能衍生物的序列。基因治疗指通过施与受试者表达的或可表达的核酸而治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生由它们编码的蛋白质，后者介导了治疗效应。
根据本发明，本领域用于基因治疗的任一方法均可使用。实例方法如下所述。
基因治疗的概述性综述，见Goldspiel等人，临床药学(ClinicalPharmacy)12：488-505(1993)；Wu和Wu，生物治疗(Biotherapy)3：87-95(1991)；Tolstoshev，药理学与毒理学年评(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32：573-596(1993)；Mulligan，科学260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，生物化学年评(Ann.Rev.Biochem.)62：191-217(1993)；May，生物技术趋势(TIBTECH11)(5)：155-215(1993)。本领域普遍公知的可使用之重组DNA技术方法于Ausubel等人(eds.)，分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons，纽约(1993)；以及Kriegler，基因转移和表达，实验室手册(GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual)，Stockton Press，纽约(l990)中进行了描述。
在一个优选的方面，化合物包括编码抗体的核酸序列，所述的核酸序列为表达载体的一部分，在合适的宿主内表达载体可表达抗体或其片段或其嵌合蛋白质或其重链或轻链。特别地，此类核酸序列具有与抗体编码区有效连接的启动子，所述的启动子可以为可诱导型的或组成型的，和任选的组织特异的启动子。在另一个特定的实施方案中，于所用的核酸分子内，抗体编码序列和任一其它目标序列的侧翼区域为促进在基因组目标位点处进行同源重组的区域，这样提供了核酸编码之抗体的染色体内表达(Koller和Smithies，美国国家科学院院报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等人，自然342：435-438(1989))。在特定的实施方案中，表达的抗体分子是单链抗体；另外地，核酸序列包括编码抗体之重链和轻链的序列，或其片段。
核酸可直接或间接地递送给患者，在直接递送的情况时，患者直接接触核酸或携带核酸的载体；在间接递送的情况时，首先体外用核酸转化细胞，然后移植入患者。这两个方法分别公知为体内或离体基因治疗。
在一个特定的实施方案中，体内直接施用核酸序列，在体内该序列表达，产生编码产物。这可通过任一本领域公知的众多方法完成，例如通过将它们构建为合适的核酸表达载体的一部分，并例如，通过缺陷的或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体(见美国专利号4,980,286)感染，或通过裸DNA的直接注射，或通过微颗粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，使包封于脂质体、微颗粒或微胶囊内，或通过与已知可进入核的肽连接而施用它们，通过与配体连接而施用它们，其中所述配体可进行受体介导的内吞(见例如，Wu和Wu，生物化学杂志262：4429-4432(1987))(其可用于特异地靶向表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合体，其中配体包含破坏内体的融合病毒肽，使核酸可避免溶酶体的降解。又在另一个实施方案中，可将核酸体内靶向，通过靶向特异性受体，使细胞特异性地摄入和表达(见例如，PCT公开号WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188；WO93/20221)。另外地，可将核酸导入细胞内，并通过同源重组掺入宿主细胞DNA而表达(见Koller和Smithies，美国国家科学院院报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等人，自然342：435-438(1989)))。
在一个特定的实施方案中，使用了病毒载体，其含有编码本发明之抗体的核酸序列。例如，可使用逆转录病毒载体(见Miller等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有病毒基因组正确包装及整合入宿主细胞DNA所必需的成分。将用于基因治疗中的编码抗体之核酸序列克隆入一个或多个载体，其中载体促进基因递送给患者。在Boesen等人，生物治疗6：291-302(1994)中可找到对逆转录病毒载体的较详细描述，其描述了将mdr1基因递送至造血干细胞，使干细胞更能耐受化学治疗。阐述逆转录病毒载体用途的其它文献为：Clowes等人，临床检查杂志(J.Clin.Invest.)93：644-651(1994)；Kiem等人，血液学(Blood)83：1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人基因治疗4：129-141(1993)；以及Grossman和Wilson，遗传学与发展的最新观点3：110-114(1993).
腺病毒为可用于基因治疗的另一种病毒载体。腺病毒是将基因递送至呼吸道上皮的特别有吸引力的载体。腺病毒可自然感染呼吸道上皮，它们在那儿引起轻微的疾病。基于腺病毒递送系统的其它目标为肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒有可感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，遗传学与发展的最新观点3：499-503(1993)一文中给出了基于腺病毒基因治疗的综述。Bout等人，人类基因治疗5：3-10(1994)一文中阐述了用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸道上皮。腺病毒用于基因治疗的其它例子见Rosenfeld等人，科学252：431-434(1991)；Rosenfeld等人，细胞68：143-155(1992)；Masrangeli等人，临床检查杂志91：225-234(1993)；PCT公开号WO94/12649；以及Wang等人，基因治疗2：775-783(1995)。在一个优选的实施方案中，使用了腺病毒载体。
腺伴随病毒(AAV)也被提出可用于基因治疗(Walsh等人，实验生物学与医学会学报(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)204：289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。
基因治疗的另一种方法涉及将基因转移至组织培养中的细胞，所用方法如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染，或病毒感染。通常转移方法包含将选择标记转移至细胞中。然后将细胞置于选择条件下，以分离那些已摄入并且正在表达转移基因的细胞。然后将这些细胞递送给患者。
在这个实施方案中，先将核酸导入细胞，然后将所获得的重组细胞体内施用。此类导入可通过本领域公知的任一方法进行，其包括(但不限于)转染、电穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。外源基因导入细胞的许多技术为本领域公知(见例如Loeffler和Behr，酶学方法217：599-618(1993)；Cohen等人，酶学方法217：618-644(1993)；Cline，药学治疗(Pharmac.Ther.)29：69-92m(1985)，只要其不破坏受体细胞必需的进化功能和生理学功能，根据本发明均可使用。该技术应提供核酸至细胞的稳定转移，以使细胞可表达核酸，并且优选地，可被细胞子代遗传和表达。
可用本领域公知的多种方法将所得到的重组细胞递送至患者。重组血细胞(例如造血干细或胞共祖细胞)优选静脉内施用。拟使用的细胞量依据所希望的效果、患者状况等的不同而不同，并且本领域技术人员可确定之。
为了基因治疗目的，可被导入核酸的细胞包括任一希望的、可获得的细胞类型，并且包括(但不限于)上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞，如T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；多种于细胞或祖细胞，特别是例如来自骨髓、脐带血、外周血、胚肝等的造血干细胞或祖细胞。
在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。
在重组细胞用于基因治疗的一个实施方案中，将编码抗体的核酸序列导入细胞，使细胞或其子代可表达它们，然后将重组细胞体内施用，以发挥治疗作用。在一个特定的实施方案中，使用了干细胞或祖细胞。根据本发明的这个实施方案，任一可于体外分离和维持的干细胞和/或祖细胞具有使用潜力(见例如PCT公开号WO94/08589；Stemple和Anderson，细胞71：973-985(1992)；Rheinwald，细胞生物学方法(Meth.Cell Bio)21A：229(1980)；以及Pittelkow和Scott，梅欧医院会议录(Mayo Clinic Proc.)61：771(1986))。
在一个特定的实施方案中，为了基因治疗目的而被导入的核酸包含与编码区有效连接的可诱导型启动子，这样通过控制合适的转录诱导剂之存在与否，以使核酸的表达是可控制的。
本发明的化合物或药物组合物优选地，在应用于人之前，对目标治疗或预防活性先进行体外试验，然后进行体内试验。例如阐述化合物或药物组合物之治疗或预防用途的体外测定法包括化合物对细胞系或患者组织样本的作用效果。化合物或组合物对细胞系和/或患者组织样本的作用效果可用本领域技术人员公知的技术测定，其包括，但不限于，玫瑰花结形成测定法、细胞裂解测定法。根据本发明，体外测定法可用于确定是否可施用特定化合物，其包括体外细胞培养测定法，其中患者组织样本生长于培养物中，并且暴露于化合物或施与化合物，观察化合物对组织样本的作用效果。
治疗/预防的施用以及组合物
本发明通过施与受试对象有效量的本发明之化合物或药物组合物，优选地本发明之抗体，提供治疗、抑制和预防方法。在一个优选的方面，化合物是基本上纯的(例如，基本上不含有限制其作用效果或产生不希望之副作用的物质)。受试对象优选动物，包括(但不限于)母牛、猪、马、鸡、猫、狗等，并且优选哺乳动物，最优选人。
当化合物包含核酸或免疫球蛋白时，可使用的制剂和施用方法如上所述；额外的合适制剂和施用途径可选自下述。
多种递送系统是公知的，并且可用于施与本发明的化合物，例如包封于脂质体、微颗粒或微胶囊内、可表达该化合物的重组细胞、受体介导的内吞(见例如，Wu和Wu，生物化学杂志262：4429-4432(1987))、将核酸构建为逆转录病毒或其它病毒载体的一部分等。导入方法包括(但不限于)真皮内的、肌内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、硬脑膜外的和经口的途径。化合物或组合物可用任一便捷途径施用，例如通过输液或大丸剂(bolus)注射、通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜)吸收，并且可与其它生物活性剂一同施用。施用可以是系统的或局部的。另外，可希望通过任一合适的途径将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；通过例如，与容器(例如Ommaya容器)连接的脑室内导管可使脑室内注射变得容易。例如通过使用吸入器或喷雾器，以及具有气雾剂的剂型，可进行肺部施用。
在一个特定的实施方案中，可希望将本发明的药物化合物或组合物局部施用于需要治疗处，这一点可通过例如外科手术过程中的局部输注、局部应用来完成，并且以不受限制的方式，其中所述局部应用为，例如与外科手术后的伤口包扎相联系的局部应用、通过注射、通过导管、通过栓剂，或通过植入物方式的局部应用，所述的植入物为多孔的、非多孔的或凝胶状材料，包括膜，例如sialastic膜或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用蛋白质对其不吸收的材料。
在另一个实施方案中，化合物或组合物可于囊泡内递送，特别是脂质体(见Langer，科学249：1527-1533(1990)；Treat等人，脂质体在感染性疾病和肿瘤中的治疗(Liposomes in the Therapy of InfectiousDisease and Cancer)，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，纽约，353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同前，317-327页；一般来说见上。)
又在另一个实施方案中，化合物或组合物用受控制的释放系统递送。在一个实施方案中，可使用泵(见Langer，supra；Sefton，加拿大红十字会生物医学工程评论(CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.)14：201(1987)；Buchwald等人，外科学(Surgery)88：507(1980)；Saudek等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)321：574(1989))。在另一个实施方案中，可使用高分子材料(见受控制释放的医学应用(MedicalApplications of Controlled Release)，Langer和Wise(eds.)，CRCPres.，Boca Raton，弗罗里达(1974)；受控制药物的生物利用度，药物产品设计和性能(Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Designand Performance)，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，大分子科学杂志大分子化学综论(J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.)23：61(1983)；也见Levy等人，科学228：190(1985)；During等人，神经学纪事(Ann.Neurol.)25：351(1989)；Howard等人，神经外科学杂志(J.Neurosurg.)71：105(1989))。又在另一个实施方案中，受控制释放系统可置于治疗目标(即脑)的附近，这样只需要系统剂量的一小部分剂量(见例如Goodson，受控制释放的医学应用(Medical Applications of Controlled Release)，supra，第2卷，115-138页(1984))。
其它受控制的释放系统在Langer(科学249：1527-1533(1990))所写的综述中进行了讨论。
在一个特定的实施方案中，本发明的化合物是编码蛋白质的核酸，该核酸可体内施用，以促进其编码的蛋白质之表达。通过将该核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分，并且施用它使它成为胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过微颗粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂类或细胞表面受体或转染试剂包被，或通过将它连接至已知可入核的同源异型框样肽(见例如Joliot等人，美国国家科学院院报88：1864-1868(1991))而施用它，等等。另外可将核酸胞内导入，并通过同源重组掺入宿主细胞DNA而表达。
本发明也提供了药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的化合物和药学可接受的载体。在一个特定的实施方案中，术语“药学可接受的”是指：经联邦或州政府的调节机构批准的，或列在美国药典或其它公认药典上的可用于动物，并且更明确地可用于人。术语“载体”是指：稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，治疗化合物和它一同施用。此类药学载体可为无菌液体，例如水和油，包括来源于石油、动物、植物或合成的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药学物合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可用作液体载体，尤其是可注射溶液。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、化钠、干燥的脱脂奶、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如果希望的话，组合物也可包含少量的湿润剂及乳剂，或pH缓冲剂。这些组合物可为溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等。组合物可与传统的结合剂和载体(例如三甘油三酯)制剂为栓剂。口服制剂可包括标准的载体，例如药物级的D-甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、含糖的钠盐、碳酸镁等。E.W.Martin在“Remington’s PharmaceuticalSciences”中描述了合适的药学载体的实例。此类组合物包含治疗有效量的化合物，优选地以纯化形式、与适量的载体一起，以提供合适的施用形式施与患者。
在一个优选的实施方案中，组合物根据常规步骤配制为适于静脉内施与人的药物组合物。一般地，静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液的溶液。必要时，组合物也可包含溶解剂和局部麻醉剂(如利多卡因)，以减轻注射位点的疼痛。一般，分别地或混合在一起，以单位剂量形式提供成分，例如标有活性因子量的密封容器(例如安瓿或sachette)中的干燥之冷冻干燥粉或无水浓缩物。其中组合物通过输液施用，可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶来执行之。其中组合物通过注射施用，可提供用于注射的一安瓿无菌水或盐水，以使诸成分可于施用前混合。
本发明的化合物可制剂为中性或盐形式。药学可接受的盐包括那些与阴离子形成的盐，例如那些来自盐酸、磷酸、醋酸、草酸和酒石酸等，以及那些与阳离子形成的盐，例如那些来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等。
本发明之化合物的量可通过标准的临床技术测定，其中所述的量是治疗、抑制和阻止与本发明之多肽的异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱的有效量。此外，可任选体外测定法用于帮助鉴定最佳的剂量范围。在制剂中使用的精确剂量也依赖于施用途径，以及疾病或紊乱的严重性，并且应根据开业医的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可从来自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线外推。
至于抗体，施与患者的剂量一般为0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，施与患者的剂量在0.1mg/kg至20mg/kg患者体重之间，更优选地为1mg/kg至10mg/kg患者体重。通常人抗体与来自其它种的抗体比较，因为对外源多肽的免疫反应，前者在人体内具有较长的半寿期。这样，施用较低剂量的人抗体和较少的注射频率往往是可能的。进一步地，本发明之抗体的施用剂量和频率可通过改进抗体(例如脂质化)，加强抗体的摄入和组织穿透力(例如，入脑)而减少。
本发明也提供了药物包装或试剂盒，其包含一种或多种容器，其中填充有本发明之药物组合物的一种或多种成分。任选地，与此容器相关的简介可以政府机构规定的形式给出，其中政府机构为系统管理药物或生物产品之生产、使用或销售的政府机构，简介反映了施用于人的生产、使用或销售之机构的批准。
染色体试验
本发明的核酸分子还可用于染色体鉴别。该序列特异地定向到单个人染色体上的特殊位置并与其杂交。按本发明绘图DNA至染色体上是将那些序列与疾病相关基因联系起来的重要的第一步。
在此方面的某些优选实施方案中，此处公开的cDNA用于克隆METH1或METH 2蛋白质基因的基因组DNA。这可通过各种众所周知的技术和一般可购得的文库来完成。然后用此方面众所周知的技术将基因组DNA进行原位染色体作图。
另外，在某些情况中可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列作图于染色体上。利用基因3’非翻译区的计算机分析以迅速选择跨度不超过基因组DNA中一个以上外显子的引物，因而使扩增过程复杂化。然后将这些引物用于含单个人染色体之体细胞杂合体的PCR筛选。
cDNA克隆与中期染色体的荧光原位杂交(“FISH”)可一步提供其准确的染色体定位。此技术可利用来自cDNA的短至50或60bp的探针。此技术综述于Verma等，人染色体：基础技术手册(HumanChromosomes：A Manual Of Basic Techniques)，Pergamon Press，纽约(1988)。
其他作图策略也可类似地用于定位于染色体，包括放射杂交作图，用标记的流式分选染色体预筛选和利用与结构染色体特异性cDNA文库杂交的预选择。放射杂交(RH)作图依赖于人染色体用X-射线的片段化，和这些随机片段在仓鼠A23宿主细胞中的保留。用于RH作图的DNA由Research Genetics(美国)提供。从可扩增80-300bp的产物之EST序列中设计Oligo对。在93人/仓鼠杂合DNA上进行PCR，所得结果与框架图比较(http：//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl；Gyapay等，人分子遗传学，5：39-346(1996))。RH作图提供了比FISH更高的精度，表明了基因簇以及疾病基因座/基因相关性。
一旦序列已做图于准确的染色体位置，就可将该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相联系。例如，在V.McKusick，人类孟德尔遗传(Mendelian Ingeritance In Man)(可在线获自Johns HopkinsUniversity，Welch Medical Library)中即有所说的数据。然后已作图于同一染色体区域之基因和疾病的联系通过连锁分析鉴定(物理图谱上相邻基因的共遗传)。
下一步，必须测定在受影响和未受影响个体之间cDNA或基因组序列的差异。若在某些或所有受影响个体中可观察到突变但在任何正常个体中都观察不到，那么此突变很可能是该疾病的一个病因。
METH 1基因图谱在STS标记D21S1435和D21S1442之间，其翻译为21q21。这是一个与淀粉样前体蛋白质(APP)相似的染色体位置。APP和METH 1大约相距3百万个碱基，在人类基因组中不是一个巨大的距离。染色体位置包括重要基因，如肠激酶(通过将其转化为胰蛋白酶而活化胰蛋白酶原的酶)和负责阿尔茨海默症的基因。
利用下面的用于放射杂交作图之寡核苷酸将METH 1作图于21q21。
5’引物：ACTGTGTGTGATCCGAG(SEQ ID NO：126)
3’引物：GTTGGAAAGCATTGACG(SEQ ID NO：127)
试剂盒
本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括在一个或多个容器中的本发明抗体，优选为纯化的抗体。在一个特定实施方案中，本发明的试剂盒含有基本上分离的多肽，其包含可与试剂盒中所含抗体有特异性免疫反应的一种表位。优选的，本发明的试剂盒还包括一种不与目标多肽反应的对照抗体。在另一个特定实施方案中，本发明的试剂盒含有一种用于检测抗体与目标多肽结合的手段(例如，抗体可与一种可检测底物(如荧光素化合物、酶底物、放射活性化合物或萤光素化合物)偶联，或可识别第一种抗体的第二种抗体可与可检测底物偶联。)。
在本发明的另一个特定实施方案中，试剂盒是一种用于筛选血清的诊断试剂盒，所述血清含有特异于增殖性和/或癌症性多核苷酸和多肽的抗体。这种试剂盒可包括不与目标多肽反应的一种对照抗体。这种试剂盒可包括基本上分离的多肽抗原，其含有与至少一种抗多肽抗原的抗体特异性免疫反应的表位。此外，这种试剂盒包括用于检测该抗体与抗原结合的手段(例如，抗体可与荧光化合物(如荧光素或罗丹明，其可被流式细胞仪检测)偶联)。在一个特定实施方案中，试剂盒可包括重组制备的或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原也可与一种固相支持物结合。
在又一特定实施方案中，上述试剂盒的检测手段包括该多肽抗原所附着的一种固相支持物。这类试剂盒还可包含非附着的报道分子标记的抗人抗体。在此实施方案中，抗体与多肽抗原的结合可利用该报道分子标记的抗体的结合检测。
在一个额外的实施方案中，本发明包括一种用于筛选血清的诊断试剂盒，所述血清含有本发明多肽的抗原。诊断试剂盒包含一种基本上分离的与多肽或多核苷酸抗原特异性免疫反应的抗体，以及一种用于检测多核苷酸或多肽抗原与抗体结合的手段。在一个实施方案中，抗体与一种固相支持物结合。在一个特定实施方案中，抗体可为单克隆抗体。试剂盒的检测手段可包括第二种标记的单克隆抗体。或者，检测手段可包括一种标记的竞争性抗原。
在一个诊断方法中，待测血清与具有表面结合的抗原(通过本发明的方法获得)之固相试剂反应。用特异性抗原抗体结合该试剂，并用洗涤去除未结合的血清成分，将该试剂与报道分子标记的抗人抗体反应，以固相支持物上结合的抗抗原抗体之比例结合报道分子到该试剂上。再次洗涤该试剂以去除未结合的标记的抗体，确定与该试剂结合的报道分子的量。通常，报道分子是一种可被检测的酶，检测方法为通过在适当的荧光、萤光或发色底物存在下温育固相。(Sigma，St.Louis，MO)。
上述检测中的固相表面试剂可利用本领域已知的用于将蛋白质材料结合到固相支持物(诸如聚合物珠、试纸条(dip sticks)、96孔板或过滤材料)上的方法制备。这些结合方法一般包括蛋白质对支持物的非特异性吸附或蛋白质，一般地，通过游离氨基对固相支持物上化学活泼的基团(如活化的羧基、羟基或醛基)之共价连接。或者，链亲和素包被的板可用于与生物素化的抗原结合。
因此，本发明提供了一种用于进行这样的诊断方法的检测系统或试剂盒。试剂盒一般包括带有表面结合的重组抗原和报道分子标记的抗人抗体的支持物，用于检测表面结合的抗抗原抗体。
以上已对本发明进行了综述，参照举例说明的以下实施例将更易理解本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
                   实施例
实施例1：METH 1和METH 2的鉴定和克隆
为了寻找具TSP样结构域的新基因，在约90000个表达序列标签(EST)组成的人cDNA大数据库中筛选与第二种TSP1I类重复区同源的序列。预计数种EST编码具TSP样结构域的蛋白质。两个来自人心脏和肺文库的cDNA克隆被进一步测序并选作功能分析。
按制造商说明书用cDNA末端的5’快速扩增(RACE)PCR技术获得METH 1的氨基末端(Marathon cDNA扩增试剂盒，Clontech)。通过5’RACE PCR获得METH 2的部分氨基端末端并随后证实和用基因组筛选完成。为进行基因组筛选，最初用PCR鉴定BAC克隆(GenomeSystems)。然后将含150-200bp的阳性BAC克隆作为小片段亚克隆入pGEM载体并测序。
将推断的氨基酸序列与GenBank、EMBL和Swissprot数据库一起分析和比较，显示这些基因属于一新的金属蛋白酶家族，在其 末端与reprolysin家族具同源性，而 末端有数个类TSP基元。这些cDNA称为METH 1和METH 2；ME指金属蛋白酶，而TH指血小板反应蛋白。METH 1的小鼠同系物被鉴定和称为ADAMTS1(Kuno，K等，生物化学杂志272：556-562(1997))。人和小鼠序列的直接比较显示有高水平的保守(83.4％的氨基酸相同)。迄今为止未鉴定到METH 2的同系物。
有趣的是，一最近鉴定称为pNPI的蛋白质(前胶原IN-蛋白酶；(Colidge，A.等，美国国家科学院院报94：2374-2379(1997))显示出与METH 1和METH 2有显著的序列和结构类似性(图3)。作为在此描述的新蛋白质，pNPI在羧基末端还包括金属蛋白酶(reprolysin亚家族)和TSP结构域。尽管pNPI的序列是牛源的，序列对比还是显示了相同的结构特性。METH 1和METH 2之间的氨基酸相似性为51.7％，而METH 1或METH 2和pNPI之间的同源性分别少于33.9％和36.3％。
序列分析显示METH 1和METH 2的ORF分别编码950和890个氨基酸的蛋白质。在所有的三种蛋白质中， 末端均包括一推定的信号肽，其后是位于氨基酸300左右的另一推断的跨膜结构域，这是由亲水性图推断的。还不清楚这些蛋白质是否与膜结合。可是，根据初步的数据，更可能是此第二跨膜结构域将组成疏水性口袋，而METH 1、METH2和pNPI事实上是分泌蛋白质。跨信号肽的 末端与锌蛋白酶超家族具同源性，可再细分为前结构域、金属蛋白酶结构域和富半胱氨酸区域。
图3中位于前结构域和金属蛋白酶结构域间边界线处的METH 1(氨基酸232-235)和METH 2(氨基酸211-214)内双下划线序列是诸如成对碱性氨基酸蛋白酶之类哺乳动物枯草杆菌蛋白酶的可能切割位点(Barr，1991)。蛋白水解加工过程发生于SVMP内，产生可溶性金属蛋白酶和去整联蛋白(Bjarnason，J.B.和Fox，J.W.，酶学方法248：345-368(1995))，这还在一些ADAM内检测到(综述于Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))。在这点上，最初的实验显示蛋白水解加工发生于METH 1和METH 2内(见下)内。此外，METH1和METH 2均存在由于某些功能重要氨基酸的保守而被认为具催化活性的 结合位点(图3中的点线)(Rawlings，N.D.和Barrett，A.J.，酶学方法248：183-228(1995))，表明这些蛋白质可能是活性蛋白酶。
金属蛋白酶结构域之后是一含两个推定的去整联蛋白环的富半胱氨酸区域(Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))(图3中用箭头标出)。在金属蛋白酶超家族中的蛇毒金属蛋白酶(SVMP)和ADAM(含一去整联蛋白和一金属蛋白酶结构域的哺乳动物蛋白质)内找到了去整联蛋白结构域，它们可能具有抑制整联蛋白与SVMP内其配基结合的功能。相反，作为膜锚定蛋白一部分的ADAM样去整联蛋白结构域可促进而非破坏细胞与细胞间的相互作用(Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))。TSP样结构域位于METH1和METH 2蛋白质的 半侧。METH 1包括由未知功能的间隔区分隔的两个保守TSP结构域、具较小同源性的亚结构域及只5个半胱氨酸，位于第二个抗血管生成区域之后。METH 2包括由间隔区分隔的两个TSP结构域。METH 1和METH 2的类TSP结构域与TSP1和TSP2的序列对比如图5所示。在所有TSP重复区中，同源性变化在19.2％-52％氨基酸相似性范围内。1-6号半胱氨酸和星号标记的色氨酸高度保守。
人基因组DNA的DNA印迹表明基因组中存在METH 1和METH 2。METH 1和METH 2探针显示不同大小的条带，表明它们转录自不同基因。
I类重复片段的共有序列包括有6个完全保守半胱氨酸的16个残基。通常它开始于序列基元WSXWS(SEQ ID NO：82))，已表明它可与肝素结合(Guo，N.等，生物化学杂志267：19349-19355(1992))。此区域与肝素的亲和性推测是TSP-1抗血管生成活性的一部分(Guo，N.等，肽研究杂志(J.Peptide Res.)49(1997))。在TSP家族蛋白质的5个成员中，只有TSP-1和TSP-2可抑制血管生成并含I类重复片段(Tolsma，S.S.等，细胞生物学杂志122：497-511(1993)；Kyriakides，T.R.等，细胞生物学杂志140：419-430(1998))。这很可能是在500-900百万年前通过外显子改组而将I类或备解素重复片段加入到了TSP-1和2的前体中(Adams，J.等，血小板反应蛋白基因家族(The Thrombospondin Gene Family)，第一版，Molecular Biology Intelligence Unit(Springer，Ed.)，R.G.LandesCompany，德国(1995))。很可能此结构域的获得使TSP-1和TSP-2前体具有如调节新血管形成之类的功能。最近，BAI-1(脑血管生成抑制剂-1)，由于其被p53调控的能力而分离自脑文库的一种蛋白质，也已显示含TSP-1的I类重复，为此分子提供了抗血管生成的潜能(Nishimori，H.等，致癌基因(Oncogene)15：2145-2150(1997))。不过，似乎附加序列或前后序列也是重要的，因为其他含I类重复片段的蛋白质未显示有清楚或更确定的抗血管生成特性，如：备解素、F-spondin和补体家族的其他成员。
由于METH 1和METH 2中TSP重复片段的存在及其抗血管生成特性，这些蛋白质最初被认为是TSP超家族成员。不过，它们与其他TSP无另外的同源性，事实上，它们与TSP-1和TSP-2的相似性局限于I类重复区。而且，该蛋白质还与ADAM家族成员具很高的序列和结构同源性。这些特性使Kuno和同事将ADAMTS称为MWTH1的小鼠同系物(Kuno，K.等，生物化学杂志272：556-562(1997))。pNPI的最新鉴定及其与此处所述蛋白质的显著序列同源性提示所有这3种蛋白质属于一称为metallospondins的亚家族。在这点上，尚不清楚pNPI是否具抗血管生成特性或者METH 1和/或METH 2是否参与α1(I)前胶原氨基末端前肽的切割。
实施例2：DNA和RNA印迹分析
如前所述(Chomczynski，P.和Sacchi，N.，生化分析162：156-159(1987))，用异硫氰酸胍抽提法从细胞中纯化总RNA。用BoehringerMannheim(BMB，Indianapolis，IN)试剂盒按制造商说明书提取Poly(A)+RNA。其他Poly(A)+RNA印迹购自Clontech(Palo Alto，CA)。在含以下成分的溶液中进行预杂交：50％甲酰胺、6X SSPE、1X Denhardt’s溶液、0.1％SDS和100ug/ml热变性鲑精DNA，42℃12-18小时。利用标记cDNA探针的杂交反应在相同溶液中于42℃进行12-18小时。TSP1和METH 1探针相应于全长人cDNA。METH 2探针相应于人cDNA的KpnI-EcoRI片段。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的1.3Kb长PstI片段用于对上样和转移效率进行标准化。膜曝光于Kodak Biomax MS胶片(Kodak，New Haven，CT)上。
购自Promega(Madison，WI)、用于DNA杂交的人基因组DNA在65℃加热10分钟并用EcoRI和PstI 37℃消化过夜。5μg消化DNA分离于1％琼脂糖凝胶上，转移至nytran膜上并用紫外线交联。cDNA探针以及预杂交和杂交条件与上述RNA印迹的相同。用高严谨性洗涤印迹膜(0.2XSSC、0.2％SDS，50℃)。
在成人和胚胎组织中检查METH 1和METH 2的表达模式。对包括人组织Poly(A)+RNA的RNA印迹分析在高严谨条件下进行。METH 1和METH 2的转录物分别显示4.6和3.7Kb的单条带。在肾上腺、心脏、胎盘观察到丰富的METH 1 mRNA表达，骨胳肌、甲状腺和胃中表达水平稍低一些。在胚胎组织分析中，肾显出METH 1 mRNA表达量最高。不过，在所有被分析组织中均有较弱的METH 1 mRNA表达。METH 2mRNA的分布更窄，并较METH 1的弱。胚胎和成人均在肺中可见最高表达。有趣的是，METH 1和METH 2的表达不重叠。结合起来说，结构相似性和它们的表达模式显示它们在功能上有重复，但转录调节不同。为进行比较，还分析了同一印迹中TSP1转录物的表达水平。在被分析的成人胎盘和所有胚胎组织中可见TSP1 mRNA的最高表达。与METH 1和METH 2相对照，我们在所有被检测的其他组织中观察到恒定水平的TSP1转录物。
通过Poly(A)+RNA的RNA印迹分析还研究了细胞类型分布情况。在皮肤成纤维细胞、血管平滑肌、子宫内膜基质细胞和两个癌细胞系Hela和G631、腺癌和黑素瘤中可分别检测到低水平的METH 1 mRNA。METH2 mRNA只在SW480，一种结肠癌细胞系中检测到，在被分析的任何其他细胞系和原株中均未见表达。
血管生成和抗血管生成因子组可能涉及调节特异器官中血管网形成，很可能是真实的，但未经证实。至少总体水平上，明显不同且几乎不重叠的METH 1和METH 2表达模式是令人迷惑的。TSP1和TSP2还共有相同的结构、高水平的氨基酸相似性，而它们的表达模式却显著不同(Iruela-Arispe，M.L.，Dev.Dyn.197：40-56(1993))。如前所提及，差异很可能是基于它们启动子中的不同顺式作用元件和不同的调节机制。尽管METH 1和2的启动子尚未被鉴定，但很可能它们对每个基因的调节都有独特的特征。不过，具已被证实的抗血管生成特性的一个基元抗血管生成/I类重复区可能存在于具不同组织特异性的数种蛋白质中这一推测颇引人注意。或者，同一家族之紧密相关成员间序列中的小差异可能具有功能重复之外的重要性。以TSP1和TSP2为例，除了显著的功能相似性和可能具有共同的抗血管生成特性外，TSP1和TSP2还具有自身独特的、不太可能与其类似相关物共有的功能。这些基因的敲除结果明显证实了这一点。TSP1无效动物首先出现肺疾病(Lawler，J.等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)101：982-992(1998))，其次是血管畸形，但只在特异病理状态下或有限器官中如此。相反，TSP2敲除小鼠呈现未预期的胶原装配异常，伴随着对皮肤、腱和骨的不良影响(Kyriakides，T.R.等，细胞生物学杂志140：419-430(1998))。此外，这些动物还呈现皮肤中毛细管密度全面增加。不太能理解的是新描述的metallospondin家族成员的类同处怎样在功能上体现出来。明显地，pNIP显示有切割I类前胶原蛋白的活性，因而具有蛋白水解活性(Colidge，A.等，美国国家科学院院报94：2374-2379(1997))。
第二个目的功能区与去整联蛋白结构域相应。此结构域已在显示可与αIIbβ3结合并抑制其与血小板相互作用而阻止凝血的蛇毒金属蛋白酶相关成员中有更完整的描述(Pfaff，M.等，Cell Adhes Commun.2：491-501(1994)；Usami，Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.201：331-339(1994))。去整联蛋白基元由13-15个结构域组成，其中经常包括一RGD或在天冬氨酸处有带负电残基。RGD或其等价物与整联蛋白结合并充当拮抗物或信号配基(Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))。METH 2，而非METH 1，具有位于去整联蛋白氨基端侧的RGD序列。另外，两种分子均在去整联蛋白基元内有相对高度但非完全的半胱氨酸保守。这似乎在此区域的四级结构及其与整联蛋白的相互作用能力上有重要作用。此外，其中一些结构域已显示出可作为功能性粘附分子，尤其是那些具跨膜区域的分子(Wolsberg，T.G.和White，J.M.，发育生物学180：389-401(1996))。这对于METH 1和METH 2是不可能的，因为这两种蛋白质似乎是分泌型的。
实施例3：重组蛋白质的表达和纯化
制备了用于His标记的融合蛋白质表达之重组构建体用于在细菌中表达。METH 1 nt 605-1839(自ATG)通过PCR利用包含BamHI和PstI位点的引物扩增，并亚克隆入pRSET载体(Invitrogen，Carlsbad，CA).测定构建体序列以确证读框和序列忠实性，然后转化入BL21；DE3大肠杆菌菌株(Stratagene cloning Systems，La Jolla，CA)。通过在 柱上亲和层析进行纯化。重组蛋白质用500mM咪唑PBS溶液洗脱。含有重组蛋白质的级分对不含酚红的DMEM透析，并用于产生抗血清。
1∶1的重组蛋白质(500微克/毫升)和弗氏佐剂混合物通过肌肉内注射产生抗血清。八只动物(包括五只豚鼠和三只兔子)每15天注射，共三个循环。在第三次注射后，血清用来评价抗METH 1抗体的存在，仅有其中的两只豚鼠显示明显的滴度。在蛋白质印迹中识别重组蛋白质的抗体能从细胞提取物中免疫沉淀METH 1蛋白质，并通过免疫细胞化学识别该蛋白质。每次实验均包括免疫前血清作为对照。一只豚鼠的抗体能识别METH 2。
为了哺乳动物表达，将全长METH 1和METH 2 cDNA克隆入pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)。载体在CMV启动子的调节控制下。进行克隆使得构建体含有其自身的终止密码子。
利用标准的磷酸钙沉淀法通过表达载体在293T细胞中的瞬时转染获得重组蛋白质。一经转染，将细胞在含有血清的培养基中温育6-16小时，然后转换到不含血清的培养基中培养36小时，用于积累重组蛋白质。作为对照，pcDNA3.1载体单独在平行的培养板中瞬时转染。蛋白质的纯化包括30％硫酸铵沉淀随后是对HS缓冲液(DB＝10mM HEPES，150mM ，1mM  和1mM  )。然后将样品经过肝素亲和层析。用含有550mM  的HS缓冲液实现从肝素柱上的洗脱。然后将级分上样于5-30％蔗糖梯度，于48K旋转。通过蛋白质印迹评估在蔗糖梯度上的分离，纯度用考马斯亮蓝和硝酸银染色确定。
重组蛋白质的产生最初在细菌中完成。产生了含有一个帮助纯化的氨基末端His标记之METH 1表达载体。所得蛋白质编码所有METH 1翻译的序列，除了原结构域(prodomain)。基于 -珠的亲和层析显示68kD的单一条带。分离和纯化总是在变性条件下进行，并且对蛋白质重折叠的尝试均未成功，可能是由于与大量半胱氨酸相关的大量分子内二硫键造成的。此外，蛋白质用于产生抗体。注射的八只动物中，只有两只能产生免疫反应，并产生特异性抗体，可能是由于种间的高度保守性。在用 柱纯化前和后，两种抗体均能识别重组METH 1蛋白质。抗体还用于在细胞裂解物的蛋白质印迹上评估蛋白质的表达。大约105-110kD的单链在基质成纤维细胞和平滑肌细胞中检测到。
为检验METH 1和METH 2可作为血管生成的调节物的假说，在哺乳动物细胞中产生重组全长蛋白质。正确阅读框和分子量的评估最初是通过体外翻译检测。METH 1开放阅读框的翻译显示一个110kD蛋白质，略微高于由cDNA序列的翻译所推定的大小。如前述所示，其中有两个糖基化位点，蛋白质较高的大小很可能由于糖残基的加入。类似地，METH 2也略微高于其推定的大小，显示一个98kD蛋白质。
重组蛋白质从293T上清液中在非变性条件下分离，以保持二级结构。通过推定的氨基酸序列和公开的关于鼠同系物信息之分析，推定两种蛋白质可结合肝素，并用亲和层析纯化。利用以METH 1、METH 2和载体对照转染的293T细胞之细胞层和条件控制的培养基进行纯化。METH 1和METH 2的分子量类似于那些来自网织红细胞的。如推定的，两种蛋白质均分泌。有趣的是，培养基中同时含有全长(110kD)和两种加工形式之METH 1(85和67kD)和METH 2(79和64kD)。85和79kD分子量与两种蛋白质在共有的sublisin位点切割后的推定大小相符。但是，必须发生第二个加工事件，以产生分别在67和64kD观察到的最丰富的片段。这些形式在纯化后甚至在缺乏蛋白酶抑制剂的情况下稳定。为了纯化，通过硫酸铵沉淀进行蛋白质的初始浓缩，随后是透析。所得的蛋白质悬浮液然后经过肝素琼脂糖柱。重组METH 1和METH 2用含有550mM  的洗脱缓冲液洗脱。级分同时含有原METH 1以及加工过的形式。因为尚不清楚是否加工与蛋白质的功能有关，在蔗糖梯度上分离了两种形式。在血管生成实验中使用全长和加工形式的两种蛋白质。
用于截短融合蛋白表达的重组构建体如下：(1)pRSET-METH 1-I类：用以下引物通过聚合酶链式反应扩增METH 1的第1605-1839位核苷酸(距离起始密码子)：5’-GCATTTTGGATCCGCCTTTTCATG-3’(SEQID NO：78)和5’-GTTGTGTGCTGCAGATTGTTCC-3’(SEQ IDNO：79)。将扩增片段亚克隆入pRSET载体的BamHI和PstI位点；(2)pGEX-METH 1-TSP，通过平头连接将来自pRSET-METH 1-TSP的BamHI-EcoRI片段连入pGEX-5X载体(Pharmacia BiotechInc.，Piscataway，NJ)的SmaI位点而产生；(3)pGEX-1.0-METH 2：将METH 2 cDNA的第838-1818位核苷酸片段(从起始密码子开始)连入pGEM-2TK的BamHI-EcoRI位点。用以下引物通过PCR扩增METH 2片段：5’-GAAAAATGGGGATCCGAGGTG-3’(SEQ ID NO：80)和5’-GCAGGAGAATTCCGTCCATG-3’(SEQ ID NO：81)产生BamHI和EcoRI限制位点；(4)pGEX-METH 2-TSP：将分离自pGEX-1.0-METH2的0.5Kb XmaI-EcoRI片段亚克隆入pGEM-2TK载体的XmaI和EcoRI位点。所有构建体均测序证实其序列无误并有正确的开放阅读框架。
重组蛋白质命名为6H-METH 1(质粒pRSET-METH 1-TSP表达)、GST-METH 1(质粒pGEX-METH 1-TSP表达)和GST-METH 2(质粒pRSET-METH 2-TSP表达)。
将表达质粒转化入大肠杆菌菌株BL21：DE3(Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA)并按制造商推荐方法诱导融合蛋白。简单地说，就是将被诱导菌体重悬于PBS中并在冰里超声处理1分钟。然后将悬浮液在1％triton X-100中室温保温20分钟，4℃离心。再用 珠(Qiagen，Chatsworth，CA)通过4℃保温20ml上清和1ml珠子(50％的浆液)2小时而纯化组氨酸标记的融合蛋白。将悬浮液转入柱子并用10个柱床体积含10mM咪唑的PBS洗涤，随后用含50mM咪唑的PBS洗涤，最后用含100mM咪唑的PBS洗涤。用含500mM咪唑的PBS洗脱蛋白质。含重组蛋白质的部分用无酚红DMEM透析。样品4℃离心30分钟，部分蛋白质不溶而在离心中丢失。上清保存于-70℃并用作增殖试验、角膜囊试验和尿囊绒膜(CAM)试验。
为了纯化GST融合蛋白质，离心澄清提取物并上GST亲和柱(Pharmacia)。先用含0.1mM还原型谷胱甘肽的PBS-1％triton X-100洗涤柱子，然后用含0.5mM还原型谷胱甘肽的同一缓冲液洗涤。用含10mM还原型谷胱甘肽的50mM Tris- ，pH7.5洗脱融合蛋白质。含此蛋白质的部分用DMEM透析，-70℃保存并用作增殖、角膜囊和尿囊绒膜(CAM)试验。
在12.5％或15％的聚丙烯酰胺凝胶上用考马斯兰染色分析重组蛋白质的完整性和纯度。
含TSP头两个I类重复区的重组GST融合蛋白质在功能试验前也用DMEM透析。如前所述从血小板中纯化完整TSP1(Roberts，D.D.等，组织培养方法杂志(J.Tissue Cult.Methods)16：217-222(1994))。
在细菌中产生重组融合蛋白质，以检验METH 1和METH 2 TSP结构域可充当血管生成调节剂的假说。构建体包括METH 1或METH 2的第一个TSP结构域。此结构域是最保守的，与TSP1的第二个I类重复区具52％的氨基酸相似性，(此结构域含推测的CD36结合位点)。所有重组蛋白质均在非变性条件下分离以尽可能地保留其二级结构。6H-METH 1和GST-METH 1含METH 1第一个类TSP结构域，以及分别与之融合的组氨酸标记或GST。由于纯化和结构优势，将METH 1重组蛋白质制成带两个不同标记。由于标记大小的不同造成其大小的差异，组氨酸是6KDa，GST是27KDa。GST-METH 2含METH 2第一个TSP结构域，以及与之融合的GST。相应于TSP1最后两个I类重复区并与GST融合的片段，以及纯化自血小板之完整TSP1为阳性对照。另外，在所有实验中均用GST本身为阴性对照。
实施例4：METH 1和METH 2中的TSP结构域破坏体内血管生成角膜囊试验
瑞士Webster雌性和雄性小鼠购自Charles River(Boston，MA)并在8-10周大时用于团块的移植。如Kenyon和同事所述方法，基本不做改动进行角膜囊试验(Kenyon，B.M.等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：1625-1632(1996))。简单地说，即将10ug重组bFGF加5mg sucralfate的溶液与10ul海昌(200mg/ml于乙醇中；New Brunswick，NJ)和目的重组蛋白质(2ug)混合。然后将悬浮液点到无菌尼龙网(孔径大小500um；TetkoInc.，Briarcliff Manor，NY)上并干燥30分钟。拉出网的纤维形成500μm3的团块，-20℃保存。在显微镜下选择同样大小的团块用于实验。
用三溴乙醇麻醉小鼠。在Nikon SMZ-U解剖显微镜下用手术刀切开角膜。将单个团块植入囊中。团块植入5天后评估角膜的血管生成并拍照。
CAM试验
对胚胎发育12-14天的Leghorn鸡胚(SPAFAS，MA)进行尿囊绒膜试验。混合Matrigel(750ug/ml)、VEGF(250ng/网)和待测蛋白质或肽，放于尼龙网(孔径大小250um；Tetko Inc.)上并相继保温于37℃30分钟及4℃2小时以诱导聚合。对各CAM还准备有阳性(matrigel和VEGF)和阴性(只有VEGF)对照。将聚合的网置于CAM的第三个外区域上并保温24小时。将400μl异硫氰酸荧光素葡聚糖(10mg/ml，SIGMA)注入小鸡血流中以使血管显现。保温5-10分钟后，用3.7％的甲醛局部固定小鸡5分钟。然后将网切片并固定在载片上。用计算机辅助图象软件(NIHImage1.59)分析荧光密度。
用于此实验的肽由Chiron(Raleigh，NC)合成。序列相应于氨基酸：P-TSP1，430-447；P-METH 1，549-563；P-METH 2，529-548。
血管生成或抗血管生成反应的评估很大程度上依赖于测定反应的试验的灵敏度和特异性。为了评估这些片段在体内的抗血管生成活性，使用两个流行且普遍接受的血管生成试验：角膜囊试验和尿囊绒膜试验。角膜的可见性、易接近性和无血管性非常有利并便于观察新血管生成反应及检验物质的局部应用。将已知量的血管生成因子以团块的形式植入眼角膜内制成的囊中。为了检测血管生成抑制剂，将分子与同一团块中的刺激物一起移植，与只有刺激物的反应比较。
在这些实验中，将bFGF用作血管形成刺激物。含重组蛋白质的团块移植入小鼠角膜并将其抑制bFGF诱导的血管生成反应的能力与对照相比。当含GST的bFGF团块被植入后，新的毛细管在5天内自角膜缘产生、穿过角膜并进入团块。相反，添加GST-METH 1或GST-METH 2至bFGF团块则完全阻止了血管生长。表4为所进行的41个试验的结果概述。纯化自血小板的完整TSP1和GST-TSP1用做阳性对照。所有实验以同一浓度进行，显示METH 1和METH 2在抑制血管生成中具有与TSP1相似的潜能。另外，当使用浓度为标准浓度一半时，观察到弱的，但可见的反应，表明为剂量依赖效应。
                                                                表4
                                   在角膜囊试验中METH 1和METH 2重组蛋白质的活性
  bFGF团块   形成血管的角膜/总角膜
  载体   5/5
  TSP1   0/5
  GST   11/11
  GST-TSP1-T1   1/4
  GST-METH 1-TSP   0/8
  GST-METH 2-TSP   0/8
在CAM试验中，通过检测含血管生成性生长因子之基质聚合体中生成的血管数量分析血管生成反应。为了测定在CAM试验中重组METH 1和METH 2蛋白质是否抑制VEGF诱导的新血管形成，将含VEGF和重组蛋白质的基质胶(matrigel)聚合体移植入CAM。实验的定量分析，每次处理包括三种不同聚合体的结果如图6A所示。含VEGF和5μgGST-METH 1或GST-METH 2的基质胶聚合体引起血管生成超过80％的抑制。用来自TSP1I类重复区的GST重组蛋白质也发现了相似的潜能。而且，METH 1和METH 2中TSP结构域的抗血管生成作用是剂量依赖型的，当使用15ug/ml的蛋白质时，血管生成完全被抑制(图6C和D)。单独的GST在相同浓度时对VEGF刺激的血管生成无明显作用。用未加工形式的METH 1和METH 2进行CAM试验提供了与加工形式类似的结果。尚不清楚是否加工是其发挥功能所必需的，或是否CAM组织导致了本蛋白质的加工。因此，用完整蛋白质与CAM组织温育24小时，并用蛋白质印迹评估蛋白质。结果表明，CAM组织能够产生68KD的加工过的METH 1蛋白质。
来自人TSP1第二或第三个I类重复区的合成肽可模拟完整TSP1的抗血管生成作用(Tolsma，S.S.等，细胞生物学杂志122：497-511(1993))。事实上，已显示19个残基长的多肽足以阻断大鼠角膜中的体内新血管形成和抑制bFGF诱导的人工培养内皮细胞转移(Vogel，T.等，细胞生化杂志(J.Cell.Biochem.)53：74-84(1993)；Tolsma，S.S.等，细胞生物学杂志122：497-511(1993))。为了检验METH 1和METH 2 TSP结构域是否有相同特性，合成来自同一区域的肽并用CAM试验评估其抗血管生成活性。结果显示于图6B。来自METH 1和METH 2 TSP结构域的肽都与TSP1相似地阻断VEGF诱导的血管生成。相反，混杂肽无明显作用。
实施例5：增殖实验
分离人内皮细胞(HDEC)并培养于VitrogenTM包被平皿上补充有15％胎牛血清、25μg/mlcAMP和1ug/ml皮质醇-21-乙酸的EBM(Clonetics，San Diego，CA)中，使用第3-6代细胞。通过在含0.2％BSA的无酚红EBM中将汇合的单层细胞保温48小时使细胞静止。从新生包皮中酶解分离人皮肤成纤维细胞。成纤维细胞和平滑肌细胞都维持于补充有10％胎牛血清的DMEM中。人乳腺上皮细胞(HMEC)购自Clonetics并保持于推荐培养基(乳腺上皮生长培养基，MEGM)中。
将第3-6代静止人内皮细胞在存在或缺乏重组蛋白质的情况下铺于含补充有0.2％BSA、0.1％胎牛血清和1ng/ml bFGF之EBM的VitrogenTM包被24孔板上，并在5％ 中37℃保温48小时。对于血管平滑肌(VSM)和成纤维细胞增殖实验，细胞在相同条件下保温，但用DMEM取代EBM。人乳腺上皮细胞温育于其生长培养基中。在收获前最后4小时加入[3H]-胸苷(1uCi/ul)脉冲。洗涤细胞并固定于10％TCA中。如前所述用闪烁计数测定[3H]-胸苷掺入量(Iruela-Arispe，M.L.和Sage，E.H.，细胞生化杂志(J.Cell.Biochem.)52：414(1993))。
通过Macintosh上用的In-Stat软件(Graph Pad Software)进行统计分析。假定为正态分布，用单向ANOVA分析数据，然后用T-test Dunnett检测做组间的比较。或用student-Newman-Kleus检测做组间多重比较。
为了认识METH 1和METH 2抑制新血管形成的机制，检测纯化重组蛋白质对内皮细胞增殖的直接作用。将血清缺乏的内皮细胞植入含bFGF和FCS的生长培养基中。重组蛋白质(3ug/ml)在铺板时同时加入。与只加GST时无明显作用相对照，观察到40％(GST-METH 1)、45％(6H-GST)或36％(GST-METH 2)的抑制。来自TSP1 I类重复区的重组蛋白质具有相似的抑制作用。(图7A)。而且，METH 1或METH 2介导的增殖抑制是剂量依赖型的，如图7E所示。处理后1天即可观察到抑制，这种抑制作用无毒性且可逆，因为重组蛋白质去除和随后只添加生长因子可导致内皮细胞增殖的恢复。
用对多种非内皮细胞进行的附加增殖实验评估METH 1和METH 2的抗增殖作用对内皮的细胞特异性。在成纤维细胞或平滑肌细胞培养物中未见明显的增殖抑制。相反，可观察到对这两种细胞类型不显著但可再现的刺激作用。此结果排除了在重组蛋白质制品中任何可能的非特异细胞生长抑制剂的存在。不过，在乳腺上皮细胞中，METH 1和METH 2抑制细胞增殖的程度与对内皮细胞的相同。有趣的是，TSP1也在体外和转基因模型中抑制乳腺上皮细胞增殖。
METH 1和METH 2可充当去整联蛋白的可能性是与其抗血管生成特性相符的。用抗体完全封闭αVβ3和β1整联蛋白已显示可在发育期间和肿瘤中抑制新血管形成(Brooks，P.C.等，细胞85：683-693(1996)；BrooksP.C.等，细胞92：391-400(1998)；Senger，D.R.等，美国国家科学院院报94：13612-13617(1997))。整联蛋白对增殖和迁移信号的介导都是必需的(Schwartz，M.A.和Ingber，D.E.，细胞分子生物学(Mol.Biol.Cell)5：389-393(1994))，因此干扰这些信号对血管生成过程非常不利。用只含METH 1和METH 2 I类重复区的重组蛋白质进行血管生成功能性试验。
关于METH 1和METH 2血管生成抑制活性的作用机制是未知的。到目前为止我们有证据表明这些蛋白质是分泌型的且可与内皮细胞结合。进一步的研究涉及受体鉴定和信号转导机制。从对TSP1的了解中得到的可能假设是METH 1和METH 2都与CD36结合。最近发现此清除剂受体与TSP-1发挥其抗血管生成作用的信号介导有关(Dawson，D.W.等，细胞生物学杂志138：707-717(1997))。推测CSVTCG(SEQ ID NO：83)(Asch，A.S.等，自然262：1436-1439(1993)；Catimel，B.等，生化杂志284：231-236(1992))和GCQXR(SEQ ID NO：84)序列为CD36的主要结合基元(Dawson，D.W.等，细胞生物学杂志138：707-717(1997))。METH 1和METH 2在这些区域都几乎完全保守。互补且也可能发生的是METH 1和METH 2与bFGF的结合。推测与肝素和bFGF的结合为TSP1抗血管生成活性的一部分(Guo，N，等，肽研究杂志49(1997))。似乎此特性通过WSXWS(SEQ ID NO：82)基元介导，该基元在METH 1和METH 2中也保守。未来的努力将集中于由这些新蛋白质介导的抗血管生成特性所涉及的信号和它们作为胞外环境蛋白酶的潜能。
实施例6：从保藏样品中分离METH 1或METH 2 cDNA克隆
两种方法可用于自保藏样品中分离METH 1或METH 2。第一种，用本领域技术熟练人员已知的技术将保藏克隆转化入合适宿主(如XL-1Blue(Stratagene))，如载体供应者提供或在相关出版物或专利中的技术。将转化子以约150个转化子(菌落)/平板的密度接种于1.5％琼脂板上(含恰当的选择物，如氨苄青霉素)。然后通过本领域技术熟练人员众所周知的技术用单菌落制备DNA。(如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，(1989)，冷泉港实验室出版社。)
或者，合成两个来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3两末端(即，在克隆的5’NT和3’NT之间的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3区域内)的17-20个核苷酸长引物，并以保藏cDNA质粒为模板用于扩增METH 1或METH 2 cDNA。在常规条件下进行聚合酶链式反应，例如，在含0.5ug上述cDNA模板的25ul反应混合物中进行。一种方便的反应混合物是1.5-5mM  、0.01％(W/V)明胶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各20uM、引物各25pmol和0.25个单位Taq聚合酶。用Perkin-Elmer Cetus自动热循环仪进行35个PCR循环(94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延伸1分钟)。用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物并将具预期分子量的DNA带切出并纯化。通过DNA产物的亚克隆和测序证实PCR产物是所选序列。
可有多种方法用于鉴定可能不存在于保藏克隆中的METH 1或METH 2基因5’或3’非编码部分。这些方法包括但不局限于，滤膜探查、利用特异探针的克隆富集和与本领域众所周知的5’和3’“RACE”流程相似或相同的方案。例如，有类似于5’RACE的方法可用于产生预期全长转录物丢失的5’端。(Fromont-Racine等，核酸研究21(7)：1683-1684(1993)。)
简单地说，将特异RNA寡核苷酸与推测含全长基因RNA转录物的RNA群的5’端连接。利用含特异于所连接的RNA寡核苷酸的引物和特异于METH 1或METH 2目的基因之已知序列的引物的引物对，PCR扩增METH 1或METH 2全长基因的5’部分。然后将此扩增产物测序并用于产生全长基因。
尽管可用poly-A+RNA，此上述方法以分离自预期来源的总RNA开始。如果必需的话，可用磷酸酶处理RNA制品，以消除可能会干扰后来RNA连接酶步骤的降解或受损RNA之5’磷酸基。随后应使磷酸酶失活并用烟草酸焦磷酸酶处理RNA以去除信使RNA5’端的帽子结构。此反应在去帽RNA的5’端留下一5’磷酸基，该RNA然后可用T4 RNA连接酶与RNA寡核苷酸连接。
此被修饰RNA制品用做通过基因特异性寡核苷酸合成第一条链cDNA的模板。第一链合成产物用做PCR扩增预期5’端的模板，所用的一引物特异于连接的RNA寡核苷酸而另一引物特异于目的基因的已知序列。然后将产生的产物测序并分析，以证实5’端序列属于METH 1或METH 2基因。
实施例7：METH 1或METH 2的细菌表达
用如实施例5中所列的相应于DNA序列5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，扩增编码本发明METH 1或METH 2多肽的METH 1或METH 2多核苷酸，以合成插入片段。为了将扩增产物克隆入表达载体，用于扩增cDNA插入片段的引物应优选在引物5’端包含限制位点，如BamHI和XbaI。例如，BamHI和XbaI相应于细菌表达载体pQE-9上的限制酶位点。(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)此质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG可调节的启动子/操纵基因(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记(6-His)和限制酶克隆位点。用BamHI和XbaI消化pQE-9载体，并将扩增片段连接入pQE-9载体，保持起始于细菌RBS的阅读框架。然后连接混合物用于转化含多拷贝质粒pREP4的大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)，该质粒表达lacI阻遏蛋白并还赋予卡那霉素抗性(Karr)。通过它们在LB平板上生长的能力鉴定转化子并选择氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并用限制酶分析证实。
含预期构建体的克隆在补充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液体培养基中培养过夜(O/N)。以1∶100-1∶250的比率接种O/N培养物于大培养基中。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6之间。然后加入终浓度1mM的IPTG(异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷)。IPTG诱导通过使lacI阻遏蛋白失活、清理P/O而导致增加基因表达。
细胞再生长3-4小时，然后离心收获(6000Xg，20分钟)。细胞沉淀通过4℃搅拌3-4小时而溶于6M盐酸胍离液剂中。离心去除细胞碎片，含多肽的上清加入镍-氮川乙酸(“ ”)亲和树脂柱(获自QIAGEN，Inc.，见上文)。带6xHis标记的蛋白质与 树脂以高亲和性结合，并可用简单的一步法纯化(详见：QIAexpressionist(1995)QIAGEN，Inc.，见上文)。简单单地说，将上清液上6M盐酸胍，pH8的柱子，此柱先用10倍体积的6M盐酸胍，pH8洗涤，然后用10倍体积的6M盐酸胍，pH6洗涤，最后多肽用6M盐酸胍，pH5洗脱。
然后将纯化的METH 1或METH 2蛋白质在磷酸缓冲盐溶液(PBS)或50mM乙酸钠，pH6缓冲液加200mM  中透析复性。或者，当固定于 柱上时，METH 1或METH 2蛋白质可成功地再折叠。推荐条件如下：用在500mM  、20％甘油、20mM Tris/  pH7.4中的6M-1M尿素(其中含蛋白酶抑制剂)线性梯度复性。复性进行时间应不少于1.5小时。复性后加入250mM咪唑洗脱蛋白质。最后用PBS或50mM乙酸钠，pH6缓冲液加200mM  透析除去咪唑。纯化的METH1或METH 2蛋白质在4℃保存或冷冻于-80℃。
除了上述表达载体外，本发明还包括含与METH 1或METH 2多核苷酸有效连接之噬菌体操纵基因和启动子元件的表达载体，称pHE4a。(ATCC接收号209645，保藏于1998年2月25日。)此载体包含：1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌复制起点，3)T5噬菌体启动子序列，4)两个lac操纵基因序列，5)SD序列，和6)乳糖操纵子阻遏蛋白基因(lacIq)。复制起点(oriC)来自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子序列和操纵基因序列通过合成制备。
通过用NdeI和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718限制性酶切载体，凝胶电泳酶切产物并分离较大的片段(填充片段应为约310bp)，将DNA插入pHEa。按实施例5所述PCR流程产生DNA插入片段，所用引物具NdeI(5’引物)和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718(3’引物)的限制性切点。凝胶纯化PCR插入片段并用一致的酶酶切。按标准方案连接插入片段和载体。
在以上流程中可方便地替换基因工程改造载体以在细菌系统中表达蛋白质。
实施例8：从包涵体中纯化METH 1或METH 2多肽
当其以包涵体形式存在时，以下任选方法可用于纯化表达于大肠杆菌中的METH 1或METH 2多肽。除非特别说明，所有以下步骤均在4-10℃进行。
大肠杆菌发酵的生产阶段完成后，细胞培养物冷至4-10℃并在15000rpm(Heraeus Sepatech)连续离心收获细胞。依据预期蛋白质产量/单位细胞团重量和所需的纯化蛋白质量，通过称重，将适当量的细胞团悬浮于含100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4的缓冲液中。用高剪切混合仪分散细胞成为均一悬浮液。
将溶液以4000-6000psi两次通过微流态化仪(microfluidizer)(Microfuidics，Corp.或APV Gaulin，Inc)而溶解细胞。将匀浆液与终浓度0.5M的 溶液混合，然后在7000xg离心15分钟。产生的沉淀再用0.5M  ，100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4洗涤。
用1.5M盐酸胍( )溶解洗涤过的包涵体2-4小时。7000xg离心15分钟后，弃沉淀并将含多肽的上清4℃放置过夜以便进一步的 提取。
高速离心(30000xg)去除不溶颗粒后，通过剧烈搅拌将 提取液与20倍体积含50mM钠，pH4.5，150mM  ，2mM EDTA的缓冲液快速混合从而使 溶解的蛋白质再折叠。重折叠的稀释蛋白质溶液无需混合，在进一步纯化步骤前4℃放置12小时。
为了澄清再折叠的多肽溶液，使用一事先制备的切向过滤装置，其装配有具适当表面积的0.16um滤膜器(如Filtron)，并用40mM  ，pH6.0平衡过。将过滤样品上阳离子交换树脂(如Poros HS-50，PerseptiveBiosystems)。用40mM乙酸钠，pH6.0洗柱，再用同一缓冲液中的250mM、500mM、1000mM和1500mM  逐步洗脱。连续监测流出物在280nm的吸光值。收集组分并用SDS-PAGE进一步分析。
然后将含METH 1或METH 2多肽的级分集中并与4倍体积水混合。稀释样品先后上预先制备好的一套强阴离子交换树脂(Poros HQ-50，Perseptive Biosystems)和弱阴离子交换树脂(Poros CM-20，PerseptiveBiosystems)。用40mM乙酸钠，pH6.0平衡柱子。两柱子均用40mM乙酸钠，pH6.0，200mM  洗涤。然后用10个柱床体积的0.2M ，50mM乙酸钠，pH6.0至1.0M  ，50mM乙酸钠，pH6.5的线性梯度液洗脱CM-20柱。在持续监测流出物A280nm的条件下收集级分。然后集中含该多肽的级分(例如通过16％SDS-PAGE确定)。
经以上重折叠和纯化步骤后，产生的METH 1或METH 2多肽纯度应高于95％。当上样量为5ug纯化蛋白质时，在考马斯兰染色的16％SDS-PAGE凝胶上应观察不到明显的杂带。也可检测纯化METH 1或METH 2蛋白质中是否有内毒素/LPS污染，一般按LAL试验，LPS含量少于0.1ng/ml。
实施例9：在杆状病毒表达系统中METH 1或METH 2的克隆和表达
在此实施例中，质粒穿梭载体pA2用于将METH 1或METH 2多核苷酸插入杆状病毒以表达METH 1或METH 2。此表达载体包含苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，其后是方便的限制位点，如BamHI、XbaI和Asp718。猿猴病毒40(“SV40”)的多聚腺苷酸化位点用于有效的多聚腺苷酸化。为了方便重组病毒的选择，质粒包含来自大肠杆菌、以同一方向在弱果蝇启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因，其后是多角体蛋白基因的多聚腺苷酸化信号。插入基因两侧均为用于与野生型病毒DNA进行细胞介导的同源重组的病毒序列，以产生表达克隆METH 1或METH 2多核苷酸的活病毒。
正如本领域技术熟练人员应理解的，许多其他杆状病毒载体可替代上述载体使用，如pAc373、pVL941和pAcIM1，只要该构建体能为转录、翻译、分泌等等提供恰当的定位信号，包括所要求的信号肽和框架内AUG即可。这样的载体参阅，如，Luckow等，病毒学(Virology)170：31-39(1989)。
具体地说，用实施例5所述的PCR流程扩增保藏克隆中所含的METH1或METH 2 cDNA序列，其中包括AUG起始密码子和任何天然相关的前导序列。如果用天然信号序列生产分泌蛋白质，则pA2载体不需第二个信号肽。或者，可用标准方法将载体修饰成含杆状病毒前导序列(pA2GP)，参阅，Summers等，“杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册(AManual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell CultureProcedures)”德克萨斯农业试验站简报号1555(1987)。
用可购买到的试剂盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶上分离扩增片段。然后用适当的限制酶消化片段并再次于1％的琼脂糖凝胶上纯化。
通过本领域已知的常规方法，用相应的限制酶消化质粒，且任选地，可用小牛肠磷酸酶使其去磷酸化。然后用可购买到的试剂盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶上分离DNA。
用T4 DNA连接酶将片段和去磷酸化质粒连起来。连接混合物转化大肠杆菌HB101或如XL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)之类的其它合适大肠杆菌宿主细胞并铺于培养皿上。通过消化来自单菌落的DNA并凝胶电泳分析消化产物而鉴定含质粒的细菌。DNA测序证实所克隆片段的序列。
用Felgner等，美国国家科学院院报84：7413-7417(1987)所述的脂转染法将5ug含多核苷酸的质粒与1.0ug可购得的线性杆状病毒DNA(“BaculoGolda baculovirus DNA”，Pharmingen，San Diego，CA)共转染。在含50ul无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，ND)的微量滴定板上无菌孔中混合1ug BaculoGolda病毒DNA和5ug质粒。之后，加入10ul Lipofectin和90ul Grace’s培养基，混合并室温保温15分钟。然后将转染混合物滴加到培养于35mm组织培养皿中1ml无血清Grace’s培养基内的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)上。平板27℃保温5小时。随后从平板上除去转染溶液并加入补充有10％胎牛血清的1ml Grace’s昆虫培养基。在27℃继续培养4天。
4天后收集上清并进行空斑测定，如Summers和Smith(同上文)所述。用有“Blue Gal”(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶可方便地鉴定和分离产生兰斑的表达gal克隆。(关于此类型“空斑测定”的详细描述也可参阅Life Technologies Inc.，Gaithersburg提供的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南，第9-10页。)恰当保温后，用微量加液吸头(如Eppendorf)挑出兰斑。将含重组病毒的琼脂重悬于含200ulGrace’s培养基的微量离心管中，用含重组杆状病毒的悬浮液感染培养于35mm平板上的Sf9细胞。4天后收获培养板上清并4℃保存。
为了证实多肽的表达，将Sf9细胞培养于补充有10％热失活FBS的Grace’s培养基中。用含多核苷酸的重组体杆状病毒以感染复数(“MOI”)约2感染细胞。若需放射性标记蛋白质，6小时后去除培养基，换入无甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培养基(购自Life TechnologiesInc.，Rockville，MD)。42小时后，加入5uCi 35S-甲硫氨酸和5uCi 35S-半胱氨酸(购自Amersham)。细胞再保温16小时后离心收获。用SDS-PAGE及随后放射自显影(若放射性标记)分析上清中的蛋白质和胞内蛋白质。
纯化蛋白质氨基末端氨基酸序列的微量测序可用于确定所产生的METH 1或METH 2蛋白质的氨基末端序列。
实施例10：哺乳动物细胞中METH 1或METH 2的表达
METH 1或METH 2多肽可表达于哺乳动物细胞中。典型的哺乳动物细胞表达载体包含介导mRNA转录起始的启动子元件、蛋白质编码序列和转录终止及转录物多聚腺苷酸化所需的信号。另外的元件包括增强子、Kozak序列和两侧为RNA剪切供体和受体位点的间插序列。用SV40早晚期启动子、来自如RSV、HTLVI、HIVI之类逆转录病毒的长末端重复(LTR)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可完成高效表达。不过，还可用细胞元件(如人肌动蛋白启动子)。
本发明应用中合适的表达载体包括，例如，pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2DHFR(ATCC 37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport2.0和pCMVSport3.0之类的载体。可用的哺乳动物宿主细胞包括：人Hela、293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1，Cos7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者，METH 1或METH 2多肽可于含整合入染色体之METH 1或METH 2多核苷酸的稳定细胞系中表达。与诸如DHFR、gpt、新霉素、潮霉素之类的选择标记共转染可鉴定和分离转染细胞。
还可扩增转染的METH 1或METH 2基因以表达大量编码蛋白质。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于获得带数百或甚至数千拷贝目的基因的细胞系(见，如，Alt，F.W.等，生物化学杂志253：1357-1370(1978)；Hamlin，J.L.和Ma，C.，生化和生物物理学报(Biochem.EtBiophys.Acta)1097：107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，生物技术(Biotechnology)9：64-68(1991)。)另一有用的选择标记是谷氨酰胺转移酶(GS)(Murphy等，生化杂志227：277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology10：169-175(1992))。利用这些标记，培养哺乳动物细胞于选择性培养基上并选择具最高抗性的细胞。这些细胞系包含整合入染色体的扩增基因。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NSO细胞经常用于蛋白质的生产。
质粒pSV2-DHFR(ATCC接收号37146)、表达载体pC4(ATCC接收号209649)和pC6(ATCC接收号209647)的衍生物包含劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月))以及CMV-增强子片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。多克隆位点，如限制酶BamHI、XbaI和Asp718的切点，可方便METH1或METH 2的克隆。载体还包含3’内含子、大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化和终止信号及在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。
如果用天然信号序列生产分泌蛋白质，则载体无需第二个信号肽。或者，如果不用天然信号序列，则载体可被修饰成含异源信号肽以便从细胞中分泌蛋白质。(见，如，WO96/34891。)
然后用恰当的限制酶消化扩增片段并用购买到的试剂盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)于1％的琼脂糖凝胶上纯化。用T4 DNA连接酶连接分离片段和去磷酸化载体。随后转化大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，并用如限制酶分析之类的方法鉴定质粒pC6或pC4中含插入片段的细菌。
缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用脂转染法(Felgner等，同上文)共转染5ug表达质粒pC6或pC4和0.5ug质粒pSVneo。质粒pSV2-neo包含一显性选择标记，neo基因来自所编码酶具抗包括抗G418在内的一组抗生素抗性的Tn5。细胞培养于含1mg/ml G418的α-MEM中。2天后，用胰蛋白酶消化细胞并在含10、25或50ng/ml氨甲喋呤和1mg/ml G418的α-MEM中于杂种瘤克隆平板(Greiner，Germany)上培养。约10-14天后用胰蛋白酶水解单克隆并用不同浓度氨甲喋呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)培养于6孔培养皿或10ml瓶中。然后将生长于最高浓度氨甲喋呤中的克隆转移至含甚至更高浓度氨甲喋呤(1uM、2uM、5uM、10mM、20mM)的6孔板上。重复相同步骤直至获得在100-200uM浓度下生长的克隆。用例如SDS-PAGE和蛋白质印迹或反相HPLC之类的方法分析METH 1或METH 2的表达。
实施例11：N-末端和/或C-末端缺失突变体的构建
以下常规方法可用于克隆N-末端或C-末端缺失的METH 1或METH 2缺失突变体。通常，约15-25个核苷酸长的两寡核苷酸引物来自SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3多核苷酸的预期5’和3’位置。以预期METH 1或METH 2多核苷酸片段为基础确定引物的5’和3’位置。如果需要，可在5’和3’引物中分别加入起始和终止密码子以表达此多核苷酸片段编码的METH 1或METH 2多肽片段。优选的METH 1或METH 2多核苷酸片段是编码公开于说明书中“多核苷酸和多肽片段”部分的N-末端和C-末端缺失突变体的那些多核苷酸片段。
含限制位点以方便METH 1或METH 2多核苷酸片段克隆入预期载体的附加核苷酸也可加入5’和3’引物序列中。用恰当的PCR寡核苷酸引物和本文所述或本领域已知条件从基因组DNA或保藏cDNA克隆中扩增METH 1或METH 2多核苷酸片段。尽管由于特异片段和全长多肽间化学和物理特性的差异使得可能需要一些常规改动，由本发明METH 1或METH 2多核苷酸片段编码的METH 1或METH 2多肽片段还是可以与全长多肽相同的一般方式进行表达和纯化。
作为例子但本发明不局限于此，编码METH 1多肽片段R-235至L-934或METH 2多肽片段R-214至Q-830的多核苷酸扩增和克隆如下：产生5’引物，其包含限制酶切点，其后是与分别编码开始于R-235或R-214之多肽片段N-末端部分的多核苷酸序列读框一致的起始密码子。产生互补3’引物，其包含限制酶切点，其后是与分别编码结束于L-934或Q-836之METH 1或METH 2多肽片段C-末端部分的多核苷酸序列读框一致的终止密码子。
用识别引物中这些位点的限制酶消化扩增的多核苷酸片段和表达载体。然后将消化的多核苷酸连在一起。将METH 1或METH 2多核苷酸片段插入限制性消化的表达载体中，优选是将METH 1或METH 2多肽片段编码区放置在启动子下游。用标准方法如本文实施例所述将连接混合物转化入感受态大肠杆菌细胞。从抗性菌落中分离质粒DNA并用限制性酶切分析、PCR和DNA测序证实克隆DNA。
实施例12：METH 1或METH 2的蛋白质融合
METH 1或METH 2多肽优选与其他蛋白质融合。这些融合蛋白质可用于各种用途。例如，METH 1或METH 2多肽与His标记、HA标记、蛋白A、IgG结构域和麦芽糖结合蛋白质融合可方便纯化。(见实施例7；也可参阅EP A 394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988)。)同样地，与IgG-1、IgG-3和白蛋白融合可延长它们在体内的半寿期。与METH 1或METH 2多肽融合的核定位信号可使蛋白质定向于特异亚细胞位置，而共价杂二聚体或同型二聚体可提高或降低融合蛋白质的活性。融合蛋白质还可产生具一种以上功能的嵌合分子。最后，与非融合蛋白质相比，融合的蛋白质可提高被融合的蛋白质的溶解度和稳定性。所有上述类型融合蛋白质均可通过对以下概述多肽与IgG分子融合的流程或实施例7中所述的流程稍作改动而制备。
简单地说，可用跨越下述序列5’和3’端的引物PCR扩增人IgG分子的Fc部分。这些引物还应有方便的限制性酶切位点便于克隆入表达载体，优选哺乳动物表达载体。
例如，若使用pC4(接收号209646)，可将人Fc部分连接到BamHI克隆位点。注意3’BamHI位点应被破坏。然后，用BamHI酶切含人Fc部分的载体，将载体线性化，并将按实施例5中所述PCR方案分离的METH 1或METH 2多核苷酸连入此BamHI位点。注意多核苷酸的克隆无终止密码子，否则不能产生融合蛋白质。
如果用天然信号序列生产分泌蛋白质，pC4无需第二个信号肽。或者，如果不用天然信号序列，载体可修饰成含异源信号序列。(见，如，WO96/34891)
人IgG Fc区：
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC
CCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA
CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGT
GGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG
ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTA
CAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT
GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
ACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC
CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAG
GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGT
GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT
CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG
GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA
TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO：85)
实施例13：抗体的生产
a)本发明的抗体可用多种方法制备。(见通用流程第二章)例如，将表达METH 1或METH 2的细胞施用于动物以诱发含多克隆抗体的血清的产生。在优选的方法中，METH 1或METH 2蛋白质制品被制备和纯化成基本上无天然污染物。然后将这样的制品引入动物以产生更高比活性的多克隆抗血清。
在最优选的方法中，本发明抗体是单克隆抗体(或其蛋白质结合片段)。这样的单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。(Kohler等，自然256：495(1975)；Kohler等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6：511(1976)；Kohler等，欧洲免疫学杂志6：292(1976)；Hammerling等，单克隆抗体和T-细胞杂交瘤，Elsevier，N.Y.，第563-681页(1981)。)大体上，这样的方法包括用METH 1或METH 2多肽，或更优选的用表达分泌METH 1或METH 2多肽的细胞免疫动物(优选小鼠)。所说的细胞可培养于任何合适的组织培养基中；不过，优选培养细胞于含10％胎牛血清(56℃灭活)，并补充有约10g/l非必需氨基酸、约1000U/ml青霉素和约100ug/ml链霉素的Earle改良的Eagle’s培养基中。
提取所说小鼠的脾细胞并与合适的骨髓瘤细胞系融合。按照本发明可用任何合适的骨髓瘤细胞系；不过，优选可获自ATCC的亲代骨髓瘤细胞系(SP20)。融合后，产生的杂交瘤细胞选择性地保持于HAT培养基中，然后如Wands等(肠胃病学80：225-232(1981))所述用有限稀释法克隆。检验这样选择获得的杂交瘤细胞以鉴别所分泌抗体能结合METH1或METH 2多肽的克隆。
或者，可用抗独特型抗体经两步产生能结合METH 1或METH 2多肽的其它抗体。这样的方法利用了抗体本身即为抗原的事实，因此可能得到能结合第二抗体的抗体。按照此方法，蛋白质特异性抗体被用于免疫动物，优选小鼠。用所说动物的脾细胞产生杂交瘤细胞，筛选该杂交瘤细胞以鉴定能产生其结合METH 1或METH 2蛋白质特异性抗体的能力可被METH 1或METH 2阻断的抗体的克隆。这样的抗体包含抗METH 1或METH 2蛋白质特异性抗体的抗独特型抗体，可用于免疫动物以诱发其它METH 1或METH 2蛋白质特异性抗体的形成。
应当理解Fab和F(ab’)2和本发明的其它抗体片段可按本文公开方法利用。这样的片段一般用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)之类的酶进行蛋白水解切割产生。或者，分泌型METH 1或METH 2蛋白质结合片段可通过重组DNA技术的应用或合成化学法产生。
为了抗体在人体内的利用，优选使用“人源化”嵌合单克隆抗体。这样的抗体可用来自上述产单克隆抗体之杂交瘤细胞的基因构建体产生。可用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。(见，综述，Morrison，科学229：1202(1985)；Oi等，BioTechnique4：214(1986)；Cabilly等，美国专利号4816567；Taniguchi等，EP171496；Morrison等，EP173494；Neuberger等，WO8601533；Robinson等，WO8702671；Boulianne等，自然312：643(1984)；Neuberger等，自然314：268(1985)。)
b)从scFv文库中分离针对METH 1和/或METH 2的抗体片段
从人PBL中分离的天然存在的V基因构建入一个大的抗体片段文库中，所述抗体片段对METH 1和/或METH 2有反应，所述METH 1和/或METH 2供体可能已经或尚未接触(见，如美国专利5885793，此处引入作为参考)。
文库拯救
如WO 92/01047所述从人PBL的RNA中构建scFv文库。为拯救噬菌体展示抗体片段，采用带有噬菌粒的大约109大肠杆菌接种50毫升含有1％葡萄糖和100微克/毫升氨苄青霉素的2xTY(2xTY-AMP-GLU)中，振荡生长至OD为0.8。将5毫升此培养物用于接种50毫升的xTY-AMP-GLU，加入2×108TU的Δ基因3辅助噬菌体(M13Δ基因III，见WO 92/01047)，培养物在37℃温育45分钟(不振摇)，然后在37℃振荡培养45分钟。于4000转/分离心培养物10分钟，然后在含有100微克/毫升氨苄青霉素和50微克/毫升卡那霉素的2升2xTY中重悬沉淀，生长过夜。如上述WO92/01047中制备噬菌体。
如下制备M13Δ基因III：M13Δ基因III辅助噬菌体不编码基因III蛋白质，因此，噬菌体(粒)展示抗体片段具有与抗原结合的较大抗体亲抗原性。感染性M13Δ基因III颗粒由在带有pUC19衍生物的细胞中生长的辅助噬菌体制备，所述pUC19衍生物在噬菌体形态发生过程中提供野生型基因III蛋白质。培养物在37℃无振摇温育1小时，然后在37℃振摇1个小时。离心细胞(IEC-Centra 8，4000转/分，10分钟)，重悬于含有100微克/毫升氨苄青霉素和25微克/毫升卡那霉素的2升2xTY培养基(2xTY-AMP-KAN)中，生长过夜，37℃振摇。通过两次PEG沉淀，纯化噬菌体颗粒并从培养液中浓缩(Sambrook等人，1990)，重悬于2毫升PBS中，通过0.45微米滤膜过滤(Minisart NML；Sartorius)，得到大约1013转导单位/毫升的终浓度(氨苄青霉素抗性克隆)。
文库淘选
在PBS中用4毫升本发明的多肽(100微克/毫升或10微克/毫升)包被Immunotube(Nunc)过夜。用2％Marvel-PBS于37℃封闭2小时，然后在PBS中洗3次。大约1013TU的噬菌体加入管中，在翻转转盘上室温温育30分钟，，然后再静置1.5小时。用PBS0.1％土温-20洗涤管10次，然后用PBS洗涤10次。通过加入1毫升100mM三乙胺并在翻转转盘上转动15分钟，然后，溶液立即用0.5毫升1.0M Tris- ，pH7.4中和。此后将噬菌体用于感染10毫升对数中期(mid-log)大肠杆菌TG1，方法是将洗脱的噬菌体与细菌在37℃温育30分钟。然后将大肠杆菌在含有1％葡萄糖和100微克/毫升氨苄青霉素的TYE平板上铺板。所得细菌文库然后用Δ基因3辅助噬菌体如上述拯救，以制备噬菌体用于随后轮次的筛选。此方法然后重复共4轮亲和纯化，其中第3轮和第4轮的管洗涤增加到用PBS、0.1％土温20洗涤20次和用PBS洗涤20次。
结合物的表征
从筛选的第3和第4轮洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌HB 2151，从单克隆中产生可溶性scFv用于分析(Marks，等人，1991)。利用以10pg/ml本发明多肽的50mM磷酸二氢盐溶液包被的微滴定板进行ELISA。在ELISA中呈阳性的克隆进一步用PCR指纹法表征(见，如WO92/01047)，然后测序。
实施例14：用于高流通量筛选试验的METH 1或METH 2蛋白质生产
以下流程可产生含待测METH 1或METH 2多肽的上清。此上清可随后用于实施例16-23所述之筛选试验中。
首先，在PBS(w/o钙或镁17-516F Biowhittaker)中以1∶20的比例稀释多聚-D-赖氨酸(644587Boehringer-Mannheim)母液(1mg/ml于PBS中)至50ug/ml的使用液。每孔(24孔板)中加200ul该溶液并室温放20分钟。保证每孔中分配有溶液(注意：可用12通道移液器，每通道上各有吸头)。吸去多聚-D-赖氨酸溶液并用1ml PBS(磷酸缓冲盐水)漂洗。PBS应保持在孔中直到细胞铺板前，且平板可先被多赖氨酸包被长达两周。
在5ml DMEM(Dulbecco’s Modifide Eagle Medium)(含4.5G/L葡萄糖和L-谷氨酰胺(12-604F Biowhittaker))/10％热失活FBS(14-503FBiowhittaker)/1xPenstrep(17-602E Biowhittaker)中以2×105细胞/孔的密度将293T细胞(没有超过P+20的细胞)铺于板上。使细胞生长过夜。
第二天，在无菌溶液瓶中混合：300ul Lipofectamine(18324-012Gibco/BRL)和5ml Optimem I(31985070 Gibco/BRL)/96孔板。用小体积多通道移液器，将用实施例10-12所述方法产生的含多核苷酸插入片段的表达载体约2ug置于恰当标记的96孔圆底板中。用多通道移液器在每孔中加入50ul Lipofectamine/Optimen I混合物。用移液器上下轻吹吸以混合。室温放15-45分钟。约20分钟后，用多通道移液器在每孔中加入150ulOptimem I。作为对照，无插入片段的载体DNA的平板应与各套转染一起进行转染。
优选地，转染应通过标记协同法(tag-teaming)进行以下工作完成。通过标记协同法，时间减半，细胞不用在PBS中放太长时间。首先，一人从细胞的4个24孔板中吸出培养基，然后另一人用5-1ml PBS漂洗各孔。第一人吸出漂洗PBS液，第二人用每隔一通道带吸头的12通道移液器先在24孔板每行的奇数孔中加入200ul DNA/Lipofectamine/Optimen I复合物，然后加入偶数孔中。37℃保温6小时。
在细胞保温时，制备恰当的培养基，或是在含1xpenstrep的DMEM中的1％BSA，或是HGS CHO-5培养基(116.6mg/L  (无水)；不0.00130mg/L  ；0.050mg/L  ；0.417mg/L ；311.80mg  ；28.64mg/L  ；48.84mg/L  ；6995.50mg/L  ；2400.0mg/L  ；62.50mg/L  ；71.02mg/L  ；4320mg/L  ；0.002mg/L花生四烯酸；1.022mg/L胆固醇；0.070mg/L DL-α-生育酚乙酰酯；0.0520mg/L亚油酸；0.010mg/L亚麻酸；0.010mg/L肉豆蔻酸；0.010mg/L油酸；0.010mg/LPalmitric Acid；0.010mg/L棕榈酸；100mg/L Pluronic F-68；0.010mg/L硬脂酸；2.20mg/L吐温80；4551mg/L D-葡萄糖；130.85mg/ml L-丙氨酸；147.50mg/ml L-精氨酸-HCl；7.50mg/ml L-天冬酰胺-H2O；6.65mg/mlL-天冬氨酸；29.56mg/ml L-半胱氨酸-2HCl-H2O；31.29mg/ml L-半胱氨酸-2HCl；7.35mg/ml L-谷氨酸；365.0mg/ml L-谷氨酰胺；18.75mg/ml甘氨酸；52.48mg/ml L-组氨酸-HCl-H2O；106.97mg/ml L-异亮氨酸；111.45mg/ml L-亮氨酸；163.75mg/ml L-赖氨酸-HCL；32.34mg/ml L-甲硫氨酸；68.48mg/ml L-苯丙氨酸；40.0mg/ml L-脯氨酸；26.25mg/ml L-丝氨酸；101.05mg/ml L-苏氨酸；19.22mg/ml L-色氨酸；91.79mg/ml L-酪氨酸-2Na-2H2O；99.65mg/ml L-缬氨酸；0.0035mg/L生物素；3.24mg/L D-泛酸钙；11.78mg/L胆碱盐酸盐；4.65mg/L叶酸；15.60mg/L I-肌醇；3.02mg/L烟酰胺；3.00mg/L盐酸吡哆醛；0.031mg/L盐酸吡哆素；0.319mg/L核黄素；3.17mg/L盐酸硫胺素；0.365mg/L胸苷；0.680mg/L维生素B12；25mM HEPES缓冲液；2.39mg/L次黄嘌呤钠；0.105mg/L硫辛酸；0.081mg/L二盐酸腐胺钠；55.0mg/L丙酮酸钠；0.0067mg/L亚硒酸钠；20uM乙醇胺；0.122mg/L柠檬酸铁；41.70mg/L与亚油酸得合的甲基-B-环糊精；33.33mg/L与油酸复合的甲基-B-环糊精；10mg/L与乙酸视黄醛复合的甲基-B-环糊精。用2mm谷氨酰胺和1xpenstrep(BSA(81-068-3Bayer)100gm溶于1L DMEM中成10％的BSA母液)调整重量摩尔渗透压浓度为327mOsm.。过滤培养基并收集50ul以在15ml聚苯乙烯圆锥管中进行内毒素检验。
在保温末期优选用标记协同法终止转染。一人吸去转染培养基，而另一人往各孔中加入1.5ml恰当的培养液。37℃保温45或72小时，取决于所用培养液：用1％BSA是45小时，用CHO-5是72小时。
第四天，用300ul多通道移液器将600ul等份试样加入一1ml深孔平板上，剩下的上清加入2ml深孔平板上。然后将各孔上清用于实施例16-23所述的检验中。
特别提出的是，在用上清进行的任何下述实验中得到活性时，此活性或直接来自METH 1或METH 2多肽(如作为分泌蛋白质)或者是METH1或METH 2诱导其它蛋白质的表达，然后该蛋白质分泌到上清中所致。因此，本发明进一步提供了鉴别上清中特征在于在特异检验中有活性的蛋白质的方法。
实施例15：GAS报道基因构建体的构建
在细胞分化和增殖中涉及的一条信号转导途径称为Jaks-STAT途径。在Jaks-STAT途径中活化蛋白质与位于许多基因启动子内的γ活化位点“GAS”元件或干扰素敏感应答元件(“ISRE”)结合。蛋白质与这些元件的结合改变了相关基因的表达。
GAS和ISRE元件由称为信号转导物和转录激活剂或“STAT”的一类转录因子识别。STAT家族有6个成员。如Stat2(对IFN-α的应答广泛存在)一样，Stat1和Stat3存在于许多细胞类型中。Stat4的存在更有限制，尽管在用IL-2处理后的T辅助I类细胞中已有发现，但它在许多细胞中是没有的。Stat5最初称为乳腺生长因子，但已发现在包括脊髓细胞在内的其它细胞中其浓度更高。在组织培养细胞中它可被许多细胞因子活化。
STAT被一套已知为Janus激酶(“Jaks”)家族的激酶通过酪氨酸磷酸化活化，从细胞质转位至细胞核。Jaks代表了一个独特的可溶性酪氨酸激酶家族，它包括Tyk2、Jak1、Jak2和Jak3。这些激酶呈现有显著的序列类似性，且通常在静止细胞中无催化性活性。
Jaks可被概述如下表的多种受体激活。(改编自综述Schidler和Darnell，生化年鉴(Ann.Rev.Biochem.)64：621-51(1995)。)能激活Jaks的细胞因子受体家族分成两组：(a)1类包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、Epo、PRL、GH、G-CSF、GM-CSF、LIF、CNTF和血小板生成素的受体；和(b)2类包括IFN-a、IFN-g和IL-10。1类受体共有保守的半胱氨酸基元(一套4个半胱氨酸和1个色氨酸)和WSXWS基元(编码Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser(SEQ ID NO：82)的近膜区)。
因此，通过配基与受体的结合，Jaks被活化，从而激活STAT，然后STAT转位并与GAS元件结合。此完整过程包含在Jaks-STAT信号转导途径中。
因此，GAS或ISRE元件的结合所反映的Jaks-STAT途径的激活可用于指示细胞增殖和分化中涉及的蛋白质。例如，已知生长因子和细胞因子可激活Jaks-STAT途径。(见下表)这样，通过利用与报道分子连接的GAS元件，可鉴定Jaks-STAT途径的激活剂。
JAK STATS GAS(元件)或ISRE
  配基   tyk2   Jak1   Jak2   Jak3
  IFN家族
  IFN-a/BIFN-gI1-10   ++   ++？   -+？   ---   1，2，311，3   ISREGAS(IRF1＞Lys6＞IFP)
  gp130家族
  IL-6(多效)I1-11(多效)OnM(多效)LIF(多效)CNTF(多效)G-CSF(多效)IL-12(多效)   +？？？-/+？+   ++++++-   +？+++？+   ？？？？？？+   1，31，31，31，31，31，31，3   GAS(IRF1＞Lys6＞IFP)
  g-C家族
  IL-2(淋巴细胞)IL-4(淋巴/骨髓)IL-7(淋巴细胞)IL-9(淋巴细胞)IL-13(淋巴细胞)IL-15   -----？   ++++++   ----？？   ++++？+   1，3，565565   GASGAS(IRF1＝IFP＞＞Ly6)(IgH)GASGASGASGAS
  gp140家族
  IL-3(骨髓)IL-5(骨髓)GM-CSF(骨髓)   ---   ---   +++   ---   555   GAS(IRF1＞IFP＞＞Ly6)GASGAS
  生长激素家族
  GHPRLEPO   ？？？   -+/--   +++   ---   51，3，55   GAS(B-CAS＞IRF1＝IFP＞＞Ly6)
  受体酪氨酸激酶
  EGFPDGFCSF-1   ？？？   +++   +++   ---   1，31，31，3   GAS(IRF1)GAS(非IRF1)
为了构建用于实施例16-17所述生物学检验、含启动子元件的合成GAS，应用以PCR为基础的方法产生GAS-SV40启动子序列。5’引物包含在IRF1启动子中发现的4个串联拷贝GAS结合位点，先前已证实这些位点在一些细胞因子诱导下可与STAT结合(Rothman等，免疫力1：457-468(1994))，尽管如此，其他的GAS或ISRE元件可代替它们使用。5’引物还包含与SV40早期启动子序列互补的18bp序列，侧翼有XhoI位点。5’引物序列是：
5′：GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCC
GAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG：3′(SEQ ID NO：86).
下游引物与SV40启动子互补且侧翼有HindIII位点：
5’：GCGGCAAGCTTTTTG CAAAGCCTAGGC：3’(SEQ ID NO：87).
用获自Clontech的B-gal启动子质粒内的SV40启动子模板进行PCR扩增。用XhoI/HindIII消化产生的PCR片段并亚克隆入BLSK2-(Stratagene)。用正向和反向引物测序证实插入片段含以下序列：
5′：CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAA
TGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCG
CCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCT
CCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCC
TCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTA
GGCTTTTGCAAAAAGCTT：3′(SEQ ID NO：88).
随后用与SV40启动子连接的GAS启动子元件经基因工程构建GAS：SEAP2报道构建体。在此，报道分子是分泌型碱性磷酸酶或“SEAP”。不过，明显地，在此或任何其他实施例中可使用任何报道分子替代SEAP。众所周知可替代SEAP使用的报道分子包括氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、碱性磷酸酶、B-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)或可用抗体检测的任何蛋白质。
用HindIII和XhoI将已经序列确认的合成GAS-SV40启动子元件亚克隆入获自Clontech的pSEAP启动子载体，以扩增的GAS：SV40启动子元件有效置换SV40启动子，从而产生GAS-SEAP载体。然而，此载体不含新霉素抗性基因，因此不优选用于哺乳动物表达系统。
因而，为了产生表达GAS-SEAP报道基因的哺乳动物稳定细胞系，用SaII和NotI从GAS-SEAP载体中取出GAS-SEAP盒，并用多克隆位点内的这些限制位点将其插入含新霉素抗性基因的骨架载体，如pGFP-1(Clontech)，从而产生GAS-SEAP/Neo载体。一旦此载体被转染入哺乳动物细胞，就可随后如实施例16-17所述用作GAS结合的报道分子。
通过使用以上方法并用不同的启动子序列替代GAS可制备其他的构建体。例如，含NFK-B和EGR启动子序列的报道分子的构建如实施例18和19所述。不过，用这些实施例中所述流程可取代许多其他启动子。如，可单独或联合替代SRE、IL-2、NFAT或骨钙蛋白启动子(如GAS/NF-KB/EGR、GAS/NF-KB、IL-2NFAT或NF-KB/GAS)。同样地，其他细胞系可用于检测报道基因构建体活性，如HELA(上皮细胞)、HUVEC(内皮细胞)、Reh(B-细胞)、Saos-2(成骨细胞)、HUVAC(主动脉)或心肌细胞。
实施例16：T-细胞活性的高流通量筛选试验
利用以下流程，通过测定METH 1或METH 2上清是否增殖和/或分化T-细胞而评估METH 1或METH 2的T-细胞活性。用实施例15产生的GAS/SEAP/Neo构建体评估T细胞活性。这样，可提高SEAP活性的因子表明其具有激活Jaks-STAT信号转导途径的能力。尽管Molt-3细胞(ATCC接收号CRL-1552)和Molt-4细胞(ATCC接收号CRL-1582)也可使用，用于本试验的T细胞是Jurkat T细胞(ATCC接收号TIB-152)。
Jurkat T细胞是成淋巴细胞CD4+Th1辅助细胞。为了产生稳定的细胞系，用DMRIE-C(Life Technologies)将GAS-SEAP/Neo载体转染入约两百万个Jurkat细胞中(转染步骤如下)。转染细胞接种密度约20000个细胞/孔，选择抗1mg/ml genticin的转染子。扩展抗性菌落，并随后检测其对逐步提高浓度的γ干扰素的应答。证实所选克隆的剂量应答。
特别是，以下方案将产生足够细胞以用于含200ul细胞的75个孔中。因此，或者比例增大或成倍增加以产生足够细胞用于若干块96孔板。Jurkat细胞维持于含1％Pen-Strep的RPMI+10％血清中。在T25摇瓶中合并2.5ml OPTI-MEM(Life Technologies)和10ug质粒DNA。加入含50ul DMRIE-C的2.5ml OPTI-MEM并室温保温15-45分钟。
在保温期间，计算细胞浓度，离心所要求的细胞数(107/次转染)，并重悬于OPTI-MEM中至终浓度107个细胞/ml。然后将OPTI-MEM中1ml1×107个细胞加入T25摇瓶中，37℃保温6小时。保温后，加10mlRPMI+15％血清。
Jurkat：GAS-SEAP稳定报道体系维持在RPMI+10％血清、1mg/mlGenticin和1％Pen-Strep中。用含METH 1或METH 2多肽或者如实施例14所述方法产生的METH 1或METH 2诱导的多肽的上清处理这些细胞。
在用该上清处理的当天，这些细胞应漂洗并重悬于新鲜RPMI+10％血清中至500000个细胞/ml的密度。所要求的确切细胞数将决定于被筛选的上清量。对于1个96孔板，需要约一千万个细胞(对于10个平板，需要一亿个细胞)。
为了分配细胞至96孔皿里，用12通道移液器转移细胞至三角贮器中。用12通道移液器转移200ul细胞至每一孔中(因此为100000个细胞/孔)。
所有平板均已接种后，用12通道移液器直接将50ul上清从含上清的96孔板转移至各孔中。此外，将不同量外源干扰素γ(0.1、1.0、10ng)加入孔H9、H10和H11中用做检验的阳性对照。
将含有用上清处理过的Jurkat细胞的96孔皿放于培养箱中48小时(注意：此时间可在48-72小时间变化)。然后用12通道移液器将各孔的35ul样品转移至不透明96孔板。此不透明板应覆盖(用sellophene覆盖层)并保存于-20℃直到按实施例20进行SEAP试验。将含剩余处理细胞的平板放置于4℃，需要时用做对特异孔重复试验的材料来源。
用100个单位/ml干扰素γ做阳性对照，已知它可激活Jurkat T细胞。在阳性对照孔中一般可观察到超过30倍的诱导。
实施例17：鉴定脊髓活性的高流通量筛选试验
利用以下流程通过测定METH 1或METH 2是否增殖和/或分化脊髓细胞而评估METH 1或METH 2的脊髓活性。用实施例15产生的GAS/SEAP/Neo构建体评估脊髓细胞活性。这样，可提高SEAP活性的因子表明其具有激活Jaks-STAT信号转导途径的能力。尽管TF-1、HL60或KG1也可使用，用于本试验的脊髓细胞是U937，一种前单核细胞系。
为了用实施例15产生的GAS/SEAP/Neo构建体瞬时转染U937细胞，使用了DEAE-葡聚糖的方法(Kharbanda等，1994，细胞生长和分化5：259-265)。首先，收获2×10e7 U937细胞并用PBS漂洗。U937细胞通常培养于含10％热灭活胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中。
然后，悬浮细胞于含0.5mg/ml DEAE-葡聚糖、8ug GAS-SEAP2质粒DNA、140mM  、5mM  、375uM  、1mM  和675uM  的1ml 20mM Tris- (pH7.4)缓冲液中。37℃保温45分钟。
用含10％FBS的RPMI 1640培养液漂洗细胞，然后重悬于10ml完全培养液中并37℃保温36小时。
通过培养细胞于400ug/ml G418中得到GAS-SEAP/U937稳定细胞。除每1-2个月于含400ug/ml G418的培养液培养数代之外，一般使用无G418培养基进行常规培养。
收获1×108个细胞(足以用于10个96孔板试验)用于检测并用PBS漂洗。悬浮细胞于200ml上述生长培养液中，终浓度5×105个细胞/ml。加200ul细胞/孔于96孔板中(或1×105个细胞/孔)。
加50ul用实施例14所述方法制备的上清。37℃保温48-72小时。用100个单位/ml干扰素γ做阳性对照，已知它可激活U937细胞。在阳性对照孔中一般可观察到超过30倍的诱导。按实施例20所述方法用SEAP检验上清。
实施例18：鉴定神经元活性的高流通量筛选试验
当细胞分化和增殖时，一组基因通过许多不同的信号转导途径被激活。这些基因之一，EGR1(早期生长应答基因1)在激活作用下在多种组织和细胞类型中被诱导。EGR1的启动子负责这种诱导。通过连接于报道分子的EGR1启动子，细胞的激活作用可用METH 1或METH 2评估。
尤其是，用以下方法评估PC12细胞系中的神经无活性。已知PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞)通过许多促有丝分裂素的激活作用增殖和/或分化，如TPA(十四烷酰佛波醇乙酸酯)、NGF(神经生长因子)和EGF(表皮生长因子)。在此处理过程中EGR1基因表达被激活。从而，通过用含与SEAP报道基因连接之EGR启动子的构建体稳定转染PC12细胞，可评估METH 1或METH 2对PC12细胞的激活作用。
EGR/SEAP报道基因构建体可用以下流程装配。EGR-1启动子序列(-633至+1)(Sakamoto K等，癌基因6：867-871(1991))可用如下引物PCR扩增自人基因组DNA：
5’GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3’(SEQ IDNO：89)
5’GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3’(SEQ IDNO：90)
用实施例15产生的GAS：SEAP/Neo载体，将EGR1扩增产物插入此载体中。用限制性酶XhoI/HindIII线性化GAS：SEAP/Neo载体，去除GAS/SV40填充片段。用相同的酶限制性酶切EGR1扩增产物。连接载体和EGR1启动子。
为了制备细胞培养的96孔板，将2ml包被溶液(I类胶原(UpstateBiotech Inc Cat#08-115)在30％乙醇中的1∶30稀释液(过滤灭菌))加入每个10cm平板或96孔板，50ml/孔，空气干燥2小时。
PC12细胞在预先包被的10cm组织培养皿上于含10％马血清(JRHBIOSCIENCES，Cat.#12449-78P)、5％热灭活胎牛血清(FBS)并补充有100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养基(BioWhittaker)中常规培养。每3-4天按1∶4传代。从平板上刮下细胞并上下吹吸15次以上将其重悬。
用实施例14所述Lipofectamine法将EGR/SEAP/Neo构建体转染入PC12。培养细胞于300ug/ml G418中得到EGR-SEAP/PC12稳定细胞。用无G418培养液进行常规培养，但每1-2个月，细胞应在300ug/ml G418中再培养多代。
为检验神经活性，去除旧培养液，筛选约70-80％细胞汇合的10cm平板。用PBS(磷酸缓冲盐水)洗细胞1次。在低血清培养液(含1％马血清和0.5％FBS并补加抗生素的RPMI-1640)中饥饿培养细胞过夜。
第二天早上，弃培养液并用PBS洗细胞。从平板上刮下细胞，充分悬浮细胞于2ml低血清培养液中。细胞计数并加入更低浓度血清的培养液至最终细胞密度为5×105个细胞/ml。
将200ul细胞悬液加入96孔板的各孔中(相当于1×105个细胞/孔)。加50ul实施例14产生的上清，37℃保温48-72小时。可用已知通过EGR激活PC12细胞的生长因子作阳性对照，如50ng/ul神经生长因子(NGF)。在阳性对照孔中一般可观察到超过50倍的SEAP诱导量。按实施例20所述方法用SEAP检验上清。
实施例19：T-细胞活性的高流通量筛选试验
NF-KB(核因子KB)是可被多种物质，包括炎症细胞因子IL-1和TNF、CD30和CD40、淋巴毒素α和淋巴毒素β，通过暴露于LPS或凝血酶，和通过某些病毒基因产物的表达而被激活的转录因子。作为转录因子，NF-KB可调节免疫细胞激活、细胞程序死亡控制(NF-KB似乎可保护细胞免于程序死亡)、B和T-细胞发育、抗病毒和抗微生物反应和多种应激反应中涉及的基因表达。在非刺激条件下，NF-KB与I-KB(抑制剂KB)保持于细胞质中。然而，在受刺激时，I-KB被磷酸化并降解，引起NF-KB进入核，从而激活靶基因的转录。可被NF-KB激活的靶基因包括IL-2、IL-6、GM-CSF、ICAM-1和1类MHC。
由于其重要作用和与多种刺激反应的能力，利用NF-KB启动子元件的报道基因构建体可用于筛选实施例14产生的上清。NF-KB的激活剂或抑制剂可用于治疗疾病。例如，NF-KB的抑制剂可用于治疗与急性或慢性NF-KB活化相关的疾病，如类风湿性关节炎。
为了构建含NF-KB启动子元件的载体，采用了以PCR为基础的方法。上游引物包含4个NF-KB结合位点(GGGGACTTTCCC)(SEQ IDNO：91)的串联拷贝，与SV40早期启动子序列5’端互补的18bp长序列，侧翼有XhoI位点：
5’：GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG：3’(SEQ ID NO：92)
下游引物与SV40启动子的3’端互补且侧翼有HindIII位点：
5’：GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC：3’(SEQ ID NO：93)
用存在于获自Clontech之pB-gal：启动子质粒中的SV40启动子模板进行PCR扩增。用XhoI和HindIII消化产生的PCR片段并亚克隆入BLSK2-(Stratagene)。用T7和T3引物测序确认插入片段含以下序列：
5′：CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCC
ATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCC
ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGA
CTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTA
TTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAA
GCTT：3′(SEQ ID NO：88)
然后用XhoI和HindIII，将该NF-KB/SV40片段置换pSEAP2启动子质粒(Clontech)中的SV40最小启动子元件。不过，此载体不包含新霉素抗性基因，因此不优选用于哺乳动物表达系统。
为了产生稳定的哺乳动物细胞系，用限制酶SalI和NotI从上述NF-KB/SEAP载体中去除NF-KB/SV40/SEAP盒，并插入含新霉素抗性的载体中。特别是，在用限制酶SalI和NotI消化pGFP-1后，将NF-KB/SV40/SEAP盒插入pGFP-1(Clontech)中置换GFP基因。
一旦产生了NF-KB/SV40/SEAP/Neo载体，即按实施例16所述方法建立和维持稳定的Jurkat T-细胞。同样地，用这些稳定的Jurkat T-细胞检验上清的方法也描述于实施例16中。作为阳性对照，将外源TNFα(0.1、1、10ng)加入孔H9、H10和H11中，通常可观察到5-10倍的激活作用。
实施例20：SEAP活性检测
作为实施例16-19中所述试验的报道分子，按以下通用步骤用TropixPhospho-light Kit(Cat.BP-400)检测SEAP活性。Tropix Phospho-light Kit提供了以下所用的稀释、检测和反应缓冲液。
预先准备好2.5x稀释缓冲液并分配15ul 2.5x稀释缓冲液至含35ul上清的Optiplate中。用塑料密封材料密封平板并65℃保温30分钟。隔开Optiplate以避免不均匀加热。
冷却样品至室温15分钟。倾空分配器并准备好检测缓冲液。加入50ml检测缓冲液并室温保温5分钟。倾空分配器并准备好反应缓冲液(见下表)。加入50ul反应缓冲液并室温保温20分钟。因为化学发光信号的强度是时间依赖性的，在光度计上用大约10分钟读5个平板，所以每次应处理5个平板，并于10分钟后处理下一组平板。
在光度计上读相对光单位。以H12为空白，打印结果。化学发光度的增加表明了报道分子的活性。
反应缓冲液配方：
  平板号   Rxn缓冲液稀释剂(ml)   CSPD(ml)
  10   60   3
  11   65   3.25
  12   70   3.5
  13   75   3.75
  14   80   4
  15   85   4.25
  16   90   4.5
  17   95   4.75
  18   100   5
  19   105   5.25
  20   110   5.5
  21   115   5.75
  22   120   6
  23   125   6.25
  24   130   6.5
  25   135   6.75
  26   140   7
  27   145   7.25
  28   150   7.5
  29   155   7.75
  30   160   8
  31   165   8.25
  32   170   8.5
  33   175   8.75
  34   180   9
  35   185   9.25
  36   190   9.5
  37   195   9.75
  38   200   10
  39   205   10.25
  40   210   10.5
  41   215   10.75
  42   220   11
  43   225   11.25
  44   230   11.5
  45   235   11.75
  46   240   12
  47   245   12.25
  48   250   12.5
  49   255   12.75
  50   260   13
实施例21：鉴定小分子浓度和膜渗透性改变的高流通量筛选试验
已知配基与受体的结合可改变如钙、钾、钠之类小分子的细胞内水平和胞内pH，也可改变膜电位。可在实验中检测这些改变以鉴别可结合特异细胞的受体的上清。尽管以下方案只描述了用于检测钙的试验，但此方案可方便地修改后用于检测钾、钠、pH、膜电位或荧光素探针可检测的任何其他小分子的变化。
以下试验用荧光成像平板读数器(“FLIPR”)检测结合小分子的荧光分子(Molecular Probes)的改变。显然，任何检测小分子的荧光分子可用于替代此处所用钙荧光分子，fluo-3。
对于粘附细胞，以10000-20000个细胞/孔的密度接种细胞于底部清晰的Co-star黑色96-孔板。平板在二氧化碳培养箱中保温20小时。在Biotekwasher中用200ul HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗粘附细胞两次，最后一次留下100ul缓冲液。
在10％pluronic acid DMSO中制备1mg/ml fluo-3母液。为了使细胞带上fluo-3，在各孔中加入50ul 12ug/ml fluo-3。平板在二氧化碳培养箱中37℃保温60分钟。在Biotek washer中用HBSS洗平板4次，最后一次留下100ul缓冲液。
对于非粘附细胞，将细胞从培养液中离心下来。在50ml圆锥管中用HBSS以2-5×106个细胞/ml的密度重悬细胞。将在10％pluronic acidDMSO中的1mg/ml fluo-3溶液4ul加入每ml细胞悬液中。然后将管放置于37℃水浴30-60分钟。用HBSS洗细胞两次，重悬为1×106个细胞/ml，分到微量滴定板上，100ul/孔。在1000rpm离心平板5分钟。在DenleyCellWash中用200ul洗平板1次，然后吸出部分至终体积为100ul。
对于不基于细胞的试验，各孔包含有荧光分子，如fluo-3。将上清加入各孔中，检测荧光改变。
为了检测细胞内钙的荧光，FLIPR的参数设置如下：(1)系统增益为300-800mW；(2)曝光时间为0.4秒；(3)相机F数为F/2；(4)激发光为488nm；(5)发射光为530nm；和(6)加入样品为50ul。在530nm处发射光值增加显示有由METH 1或METH 2分子或者被METH 1或METH 2诱导的分子引起的细胞外信号事件，导致细胞内 浓度的提高。
实施例22：鉴定酪氨酸激酶活性的高流通量筛选试验
蛋白质酪氨酸激酶(PTK)代表了一组不同的跨膜和胞质激酶。在受体蛋白质酪氨酸激酶(RPTK)组内有有丝分裂和新陈代谢生长因子的受体，包括PDGF、FGF、EGF、NGF、HGF和胰岛素受体亚家族。此外有一大的RPTK家族，其相应配基是未知的。RPTK的配基主要包括分泌的小蛋白质，但也包括膜结合蛋白和胞外基质蛋白。
RPTK被配基激活涉及配基介导的受体二聚化，导致受体亚单位的转磷酸化作用和胞质酪氨酸激酶的活化。胞质酪氨酸激酶包括src家族的受体相关酪氨酸激酶(如src、yes、lck、lyn、fyn)和非受体相关及胞质蛋白质酪氨酸激酶，如Jak家族，其成员介导由受体细胞因子超家族(如白介素、干扰素、GM-CSF和Leptin)激发的信号转导。
因为能刺激酪氨酸激酶活性的已知因子较多，鉴定METH 1或METH2或者METH 1或METH 2诱导的分子是否能激活酪氨酸激酶信号转导途径是令人感兴趣的。因此设计如下方案以鉴定能激活酪氨酸激酶信号转导途径的这些分子。
以约25000个细胞/孔的密度接种靶细胞(如原初角质细胞)于购自Nalge Nunc(Naperville，IL)的96孔Loprodyne Silent Screen Plates。用100％酒精洗平板两次消毒，30分钟/次，再用水洗并干燥过夜。一些平板用购自Sigma Chemicals(St.Louis，MO)的细胞培养级I类胶原(50mg/ml)、明胶(2％)或聚赖氨酸(50mg/ml)或者购自BectonDickinson(Bedford，MA)的10％Matrigel，或小牛血清100ml包被2小时，用PBS洗并存于4℃。这些平板上细胞生长的检测通过接种5000个细胞/孔于生长培养液中，48小时后按制造商Alamar Biosciences，Inc.(Sacramento，CA)所述用alamarBlue间接定量确定细胞数量进行。来自Becton Dickinson(Bedford，MA)的编号#3071的Falcon平板盖用于覆盖Loprodyne Silent Screen平板。Falcon Microtest III细胞培养板也可用于一些增殖实验中。
为了制备提取物，将A431细胞接种于Loprodyne板的尼龙膜上(20000/200ml/孔)并在完全培养基中培养过夜。在无血清的基本培养液中保温24小时使细胞静止。用EGF(60ng/ml)或实施例14所产生的上清50ul处理5-20分钟后，弃培养液，并在各孔中加入100ml获自Boehringer Mannheim(Indiamapolis IN)的提取缓冲液(20mM HEPESpH7.5，0.15M  ，1％Triton X-100，0.1％SDS，2mM  ，2mM 和蛋白酶抑制剂混合物(#1836170))，平板在旋转摇床上4℃振荡5分钟。然后将平板放于真空转移多歧管中，用室内真空使提取液滤过各孔底部的0.45mm膜。在真空多歧管底部收集提取液于96孔收集/检验平板中，立即置于水上。为了得到澄清的提取液，在去垢剂溶解5分钟后，取各孔中物质并于4℃16000g离心15分钟。
检测滤过提取液的酪氨酸激酶活性水平。尽管已知许多检测酪氨酸激酶活性的方法，但在此只描述了一种。
通常，通过测定其使特异底物(生物素化肽)中酪氨酸残基磷酸化的活性来评估上清的酪氨酸激酶活性。可用于此目的的生物素化肽包括PSK1(相应于细胞分裂激酶cdc2-p34的第6-20位氨基酸)和PSK2(相应于胃泌素的第1-17位氨基酸)。两肽均为多种酪氨酸激酶的底物并可购自Boehringer Mannheim。
通过依次加入以下组分进行酪氨酸激酶反应。首先，加入10ul 5uM生物素化肽，然后是10ul ATP/ (5mM ATP/50mM  )、10ul 5x检测缓冲液(40mM咪唑盐酸，pH7.3，40mM β-甘油磷酸盐，1mMEGTA，100mM  ，5mM  ，0.5mg/mlBSA)、5ul钒酸钠(1mM)和5ul水。温和混合这些组分并将反应混合物30℃预热2分钟。加入10ul对照酶或过滤上清起始反应。
然后加入10ul 120mm EDTA终止酪氨酸激酶测定反应并置于冰上。
通过转移50ul反应混合物的等分试样至微量滴定板(MTP)孔中并37℃保温20分钟测定酪氨酸激酶活性。这使得包被链霉亲和素的96孔板与生物素化肽相连。用300ul/孔的PBS洗MTP孔4次。然后在各孔中加入偶联有辣根过氧化物酶的抗磷酸酪氨酸抗体(抗-P-Tyr-POD(0.5u/ml))75ul并37℃保温1小时。如上所述洗孔。
加入100ul过氧化物酶底物溶液(Boehringer Mannheim)并室温保温至少5分钟(最多30分钟)。用ELISA读数器检测样品在405nm的吸光值。用ELISA读数器定量测定结合过氧化物酶的活性水平，这反映了酪氨酸激酶的活性水平。
实施例23：鉴定磷酸化作用活性的高流通量筛选试验
作为对实施例22中所述蛋白质酪氨酸激酶活性检测的潜在选择和/或补充，也可使用检测主要胞内信号转导中间体活化(磷酸化)的试验。例如，如下所述的特殊实验可检测Erk-1和Erk-2激酶的酪氨酸磷酸化作用。不过，其它分子，如Raf、JNK、p38MAP、Map激酶激酶(MEK)、MEK激酶、Src、肌肉特异性激酶(MuSK)、IRAK、Tec和Janus，以及任何其他磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸分子的磷酸化作用，可通过在以下实验中用这些分子替代Erk-1或Erk-2而检测。
具体地说，通过用0.1ml蛋白G(1ug/ml)室温(RT)包被96-孔ELISA平板的孔2小时制备检测平板。平板用PBS洗并以3％BSA/PBS室温封闭1小时。然后用买来的两种抗Erk-1和Erk-2单克隆抗体(100ng/孔)处理蛋白G平板(室温1小时)(Santa Cruz Biotechnology)。(为检测其它分子，此步可通过用可检测任何上述分子的单克隆抗体替代而方便地作些改动。)用PBS洗3-5次，平板4℃保存待用。
接种A431细胞(20000/孔)于96孔Loprodyne滤板中并在生长培养液里培养过夜。在基本培养液(DMEM)中饥饿细胞48小时，然后用EGF(6ng/孔)或实施例14所获上清50ul处理5-20分钟。然后溶解细胞并直接过滤提取物到检测板中。
室温保温提取液1小时后，再次洗孔。用购得的MAP激酶制剂(10ng/孔)取代A431提取液以做阳性对照。然后用市售的可特异识别Erk-1和Erk-2激酶磷酸化表位的多克隆(兔)抗体(1ug/ml)处理平板(室温1小时)。此抗体用标准方法生物素化。然后通过在Wallac DELFIA装置用铕链霉亲和素和铕荧光增强剂(时间分辨荧光)连续保温来定量测定所结合的多克隆抗体。超过背景的增强荧光信号表明METH 1或METH 2或者METH 1或METH 2诱导的分子的磷酸化作用。
实施例24：测定METH 1或METH 2基因中变化的方法
分离来自呈目的表型(如疾病)之整个家族或个别病人的RNA。用本领域已知方法从这些RNA样品中生产cDNA。(见Sambrook)然后用此cDNA为PCR模板，应用SEQ ID NO：1中目的区周围的引物。建议的PCR条件由35个循环组成，每个循环为95℃30秒；52-58℃60-120秒；和70℃60-120秒，所用缓冲溶液如Sidransky等，科学252：706(1991)描述。
然后用SequiTherm聚合酶(Epicentre Technologies)测定PCR产物序列，所用引物在5’端被T4多核苷酸激酶标记。还确定METH 1或METH 2之所选外显子的内含子-外显子边界，分析基因组PCR产物以确认结果。然后将含METH 1或METH 2中可能带有突变的PCR产物克隆和测序，以证实直接测序的结果。
如Holton，T.A.和Graham，M.W.，核酸研究19：1156(1991)所述将METH 1或METH 2的PCR产物克隆入T结尾的载体并用T7聚合酶(United States Biochemical)测序。通过未患病个体中不存在的METH 1或METH 2的突变而鉴别受影响个体。
测定METH 1或METH 2基因中改变的方法也可观察到基因组的重排。分离的基因组克隆用地高辛脱氧尿苷5’-三磷酸(BoehringerMannheim)进行缺口翻译，并如Johnson，Cg等，细胞生物学方法35：73-99(1991)所述完成FISH。为与METH 1或METH 2基因组位置特异杂交，用大大过量的人cot-1 DNA进行与标记探针的杂交。
用4，6-二氨基-2-苯基吲哚和碘化丙锭负染染色体，同时产生C-和R-带。用三波段过滤装置(Chroma Technology，Brattleboro，VT)与冷却的电荷耦合器件像机(Photometrics，Tucson，AZ)和可变激发波长滤器获得用于精确绘图的序列对比图象(Johnson Cv.等，Genet.Anal.Tech.Appl.8：75(1991))。用Isee Graphical软件系统(InovisionCorporation，Durham，NC.)进行图像收集、分析和染色体部分长度检测。METH 1或METH 2基因组区域(被探针杂交)的染色体改变鉴定为插入、缺失和转位。这些METH 1或METH 2的改变用做相关疾病的诊断标记。
实施例25：检测生物样品中METH 1或METH 2异常水平的方法
可在生物样品内检测METH 1或METH 2多肽，如果检测到METH 1或METH 2水平的提高或降低，则此多肽可用做特异表型的标记。检测方法很多，因此应当理解本领域技术熟练人员可修改以下试验以适合其特殊需要。
例如，抗体夹心ELISA可用于检测样品中的METH 1或METH 2，优选生物样品。用抗METH 1或METH 2的特异抗体包被微量滴定板的孔，终浓度0.2-10ug/ml。抗体是单克隆或多克隆抗体，可用实施例13所述方法产生。封闭各孔以使METH 1或METH 2与孔的非特异结合降低。
然后将包被孔与含METH 1或METH 2的样品室温下保温2小时以上。优选地，应用样品的系列稀释液证实结果。用去离子水或蒸馏水洗平板3次以去除未结合METH 1或METH 2。
下一步，加入浓度为25-400ng的50ul特异抗体-碱性磷酸酶偶联物并室温保温2小时。用去离子水或蒸馏水再洗平板3次以去除未结合的偶联物。
加入75ul磷酸4-甲基伞形酸酯(4-methylumbelliferyl phosphate)(MUP)或对硝基苯基磷酸(NPP)底物溶液于各孔中并室温保温1小时。用微量滴定板读数器测定反应。用对照样品的系列稀释液作标准曲线，METH 1或METH 2多肽浓度绘于X-轴(对数刻度)而荧光值或吸光值绘于Y-轴(线性刻度)。用标准曲线得到样品中METH 1或METH 2的浓度。
实施例26：多肽配制
METH 1或METH 2组合物将以利于药用的方式配制和给药，需考虑到个体病人的临床状况(尤其是单独使用METH 1或METH 2多肽治疗的副作用)、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文的目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。
作为一般的建议，METH 1或METH 2的非肠道用的总药学有效量范围是每剂约1ug-10mg/kg病人体重/天，当然，如上所提及，这将因治疗的个体差异而不同。更优选的剂量是至少0.01mg/kg/天，对于人来说最优选的是给予该激素约0.01-1mg/kg/天。若持续给药，METH 1或METH2的一般给药速率是约1-50ug/kg/小时，这或是注射1-4次/天，或是用例如微型泵持续皮下输注。也可使用静脉内袋溶液。观察到变化所需的治疗时间和治疗后发生反应的间隔依预期效果而变化。
含METH 1或METH 2的药物组合物可口服、直肠给药、非肠道给药、脑池内给药、阴道内给药、腹膜内给药、局部给药(如通过粉剂、药膏、凝胶、滴剂或经皮片剂)、经颊给药或者口或鼻喷雾剂。。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。
METH 1或METH 2还可通过缓释系统恰当地给药。合适的缓释组合物例子包括成形颗粒形式的半透性聚合体基质，如薄膜或微胶囊。缓释基质包括聚交酯(美国专利号3773919，EP58481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman，U.等，生物聚合体22：547-556(1983))、聚(2-羟乙基异丁烯酸酯)(R.Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)和R.Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))、乙烯基醋酸乙烯酯(R.Langer等)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133988)。缓释组合物还包括脂质体包裹的METH 1或METH 2多肽。用已知的方法制备含METH1或METH 2的脂质体：DE 3218121；Epstein等，美国国家科学院院报82：3688-3692(1985)；Hwang等，美国国家科学院院报77：4030-4034(1980)EP 52322；EP 36676；EP 88046；EP 143949：EP 142641；日本专利申请83-118008；美国专利号4485045和4544545；和EP 102324。通常脂质体是小的(约200-800埃)单层脂质形式，其中脂含量大于约30摩尔百分比胆固醇，可调节选择比率以达到最好的分泌多肽疗效。
对于非肠道给药，在一个实施方案中，METH 1或METH 2的配制通常通过将其以所需纯度在可注射形式(溶液、悬浮液或乳状液)剂量单位内与药学可接受载体混合进行，所述载体即在应用剂量和浓度对接受者无毒性且与配方的其他成分相容的载体。例如，配方优选不包括氧化剂和已知对多肽有毒的其他化合物。
通常，通过将METH 1或METH 2均一和密切地与液态载体或精细分散的固态载体或两者接触而制备制剂。然后，如果需要，可将产物成形为预期的形状。优选载体是非肠道载体，更优选是与接受者血液等渗的溶液。这样的载体例子包括水、盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。诸如固定化油和油酸乙酯之类非水载体也可用于此，脂质体也可使用。
载体可恰当地包含少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这样的材料在应用剂量和浓度对接受者无毒性，包括缓冲液，如磷酸、柠檬酸、琥珀酸和其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，如多聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamers)或PEG。
METH 1或METH 2一般以约0.1-100mg/ml、优选1-10mg/ml的浓度，pH约3-8配制于这类载体中。应当理解前述一些赋形剂、载体或稳定剂的使用将导致多肽盐的形成。
治疗用METH 1或METH 2可是无菌的。通过无菌滤膜(0.2um膜)过滤可方便地完成消毒。治疗用多肽组合物通常置于具无菌入口的容器内，例如，带有可被皮下注射针头刺穿之塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
METH 1或METH 2多肽通常以水溶液或用于重熔的冻干状态保存于单或多剂容器内，例如密封的安锫瓶或小瓶中。作为冻干药品的例子，10ml小瓶中填充了5ml无菌过滤的1％(w/v)METH 1或METH 2多肽水溶液，将产生的混合物冻干。用注射专用抑菌水重溶冻干的METH 1或METH 2多肽制备输注溶液。
本发明还提供了含一个或多个容器的药用包装或试剂盒，其中容器中填充了一种或多种本发明药物组合物的成分。与这些容器一起附具的可以有管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府管理部门出具的公告，该公告反映管理部门已批准其生产、使用或销售，以对人给药。此外，METH 1或METH 2可与其他治疗化合物联合使用。
本发明的组合物可以单独或与其它治疗剂一起施用。可与本发明的组合物一起施用的治疗剂包括但不限于，TNF家族的其它成员、化疗剂、抗生素、甾体和非甾体消炎剂、常规免疫治疗剂、细胞因子和/或生长因子。组合可被同时施用，例如，作为混合物；或相互分开但是同时或一起施用；或顺序施用。这包括这样的形式，其中组合的药剂作为治疗混合物一起施用，以及这样的方法，其中组合的药剂相互独立地但是同时施用，例如通过独立的静脉内管线施用于同一个体。“组合”施用进一步包括化合物或药剂中的一种独立地施用在先，然后施用第二种。
在一个实施方案中，本发明的组合物与TNF家族的其它成员组合施用。可与本发明的组合物一起施用的TNF、TNF相关或TNF样分子包括但不限于，TNFα、淋巴毒素α(LT-α，也称为TNFβ)、LT-β(见于复合异源三体LT-α2-β)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际公开文本WO 96/14328)、AIM-I(国际公开文本WO 97/33899)，内因子(endokine)α(国际公开文本WO 98/07880)、TR6(国际公开文本WO 98/30694)、OPG和神经因子α(neutrokine)(国际公开文本WO 98/18921)、OX40和神经生长因子(NGF)，以及Fas的可溶形式、CD30、CD27、CD40和4-IBB，TR2(国际公开文本WO 98/34095)、DR3(国际公开文本WO 97/33904)、DR4(国际公开文本WO 98/32856)、TR5(国际公开文本WO 98/30693)、TR6(国际公开文本WO 98/30694)、TR7(国际公开文本WO 98/41629)、TRANK、TR9(国际公开文本WO 98/56892)、TR10(国际公开文本WO 98/54202)、312C2(国际公开文本WO 98/06842)和TR12，以及CD154、CD70和CD153的可溶形式。
可以与本发明的组合物一起施用的常规非特异性免疫抑制剂包括但不限于，类固醇、环孢霉素、环孢霉素类似物、环磷酰胺、甲基强的松、泼尼松、硫唑嘌呤、FK-506、15-去氧精胍素和其它通过抑制应答T细胞的功能而起作用的免疫抑制剂。
在又一个实施方案中，本发明的组合物与抗生素一起施用。可与本发明的组合物一起施用的抗生素包括但不限于，四环素、甲硝唑、阿莫西林、β-内酰胺酶、氨基葡糖苷、大环内酯类、喹诺酮、氟喹诺酮、头孢菌素、红霉素、环丙沙星和链霉素。
在另一个实施方案中，本发明的组合物单独或与抗炎剂一起施用。可与本发明的组合物一起施用的抗炎剂包括但不限于糖皮质素和非甾体类抗炎剂、氨基芳基羧酸衍生物、芳基衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮、水杨酸衍生物、噻嗪羧基酰胺(thiazinecarboxamides)、6-乙醚氨基己酸、S-腺苷基蛋氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗杀唑和替尼达帕。
在另一实施方案中，本发明的组合物与化疗剂一起施用。可与本发明的组合物一起施用的化疗剂包括但不限于抗生素衍生物(例如，阿霉素、博来霉素、柔红霉素和放线菌素)；抗雌激素(例如他莫昔芬)；抗代谢物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、光辉霉素、巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤)；细胞毒性剂(例如，卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、丙卡巴肼、丝裂霉素、白消安、顺铂、硫酸长春新碱)；激素(例如，甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸盐、乙烯雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、二磷酸己烯雌酚、三茴香基氯乙烯和睾丸酮)；氮芥衍生物(例如，mephalen、chorambucil、双氯乙基甲胺(氮芥)和噻替哌)；类固醇和组合(例如，bethamethasone磷酸钠)；和其它(例如，dicarbazine、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊甙)。
在其它实施方案中，本发明的组合物与细胞因子一起施用。可以与本发明的组合物一起施用的细胞因子包括但不限于，IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、anti-CD40、CD40L、IFN-gamma和TNF-alpha。
在又一实施方案中，本发明的组合物可与血管生成蛋白一起施用。可与本发明的组合物一起施用的血管生成蛋白包括但不限于，神经胶质瘤衍生的生长因子(GDGF)，如欧洲专利EP-399816所公开；血小板衍生的生长因子-A(PDGF-A)，如欧洲专利EP-682110中所公开；血小板衍生的生长因子-B(PDGF-B)，如欧洲专利EP-282317所公开；胎盘生长因子(PIGF)，如国际公开文本WO 92/06194所述；胎盘生长因子-2(PIGF-2)，如Hauser et al.，Growth Factors，4：259-268(1993)所公开；血管内皮生长因子(VEGF)，如国际公开文本WO 90/13649所公开；血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，如欧洲专利EP-506477所公开；血管内皮生长因子-2(VEGF-2)，如国际公开文本WO 96/39515所公开；血管内皮生长因子B-186(VEGF-B 186)，如国际公开文本WO 96/26736所公开；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如国际公开文本WO 98/02543所公开；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如国际公开文本WO 98/07832所述；以及血管内皮生长因子-E(VEGF-E)，如德国专利DE19639601所述。上述参考文献此处引入作为参考。
在又一实施方案中，本发明的组合物与成纤维细胞生长因子一起施用。可以与本发明的组合物一起施用的成纤维细胞生长因子包括但不限于FGF-1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14和FGF-15。
在又一实施方案中，本发明的组合物与其它治疗或预防方案，例如放射性治疗，一起施用。
实施例27：治疗降低水平METH 1或METH 2的方法
本发明涉及体内降低METH 1或METH 2活性水平的个体的治疗方法，包括对这样的个体施用含治疗有效量METH 1或METH 2拮抗物的组合物。优选用于本发明的拮抗物是METH 1或METH 2特异性抗体。
而且，应当理解，由于个体内标准或者正常METH 1或METH 2表达水平降低引起的状况可通过给予METH 1或METH 2而得到治疗，优选以分泌的多肽形式给药。此外，本发明还提供了需增加METH 1或METH 2多肽水平的个体的治疗方法，包括对这样的个体施用含一定量METH 1或METH 2的药物组合物以提高在所说个体中METH 1或METH 2的活性水平。
例如，具降低水平METH 1或METH 2多肽的病人可连续6天接受日剂量0.1-100ug/kg的多肽。优选为分泌形式的多肽。基于给药和配方的精确用药方案详情如实施例26所提供。
实施例28：治疗增高水平METH 1或METH 2的方法
本发明还涉及体内增高METH 1或METH 2活性水平的个体的治疗方法，包括对这样的个体施用含治疗有效量METH 1或METH 2或其激动剂的组合物。
反义技术可用于抑制METH 1或METH 2的生产。由于种种病因，如癌症，此技术是降低METH 1或METH 2多肽(优选分泌形式)水平的方法的一例子。
例如，对诊断为METH 1或METH 2水平异常增高的病人静脉内注射反义多核苷酸21天，0.5、1.0、1.5、2.0或3.0mg/kg/天。若对此治疗能忍受，7天检测期后重复此治疗。反义多核苷酸的配方如实施例26所提供。
实施例29：利用基因疗法的治疗方法-离体
基因治疗的一种方法是将能表达METH 1或METH 2多肽的成纤维细胞移植到病人体内。通常成纤维细胞由皮肤活检获自患者。将产生的组织置于组织培养液内并分成小片。将组织小块置于组织培养瓶的湿表面上，约10片/瓶。将小瓶翻转、拧紧并室温放置过夜。室温24小时后，再将瓶翻过来，保持组织块固定在瓶底并加入新鲜培养液(如Ham’s F12培养液，含10％FBS、青霉素和链霉素)。然后将瓶37℃保温约一周。
此时，加入新鲜培养液并随后每隔几天换液。再培养两周后，单层成纤维细胞出现。用胰蛋白酶消化此单层并放入更大的瓶中。
用EcoRI和HindIII消化侧翼为莫洛尼鼠肉瘤病毒长末端重复片段的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA7：219-25(1988))并随后用小牛肠磷酸酶处理。将线性载体在琼脂糖凝胶上分离并用玻璃珠纯化。
如实施例5所示，用分别相应于5’和3’末端序列的PCR引物扩增编码METH 1或METH 2的cDNA。优选5’引物含EcoRI位点而3’引物含HindIII位点。在存在T4 DNA连接酶的条件下将等量莫洛尼鼠肉瘤病毒线性骨架和扩增的EcoRI和HindIII片段连接到一起。在适于两片段连接的条件下保持混合物。然后用连接混合物转化大肠杆菌HB101，再将细菌铺于含卡那霉素的琼脂板上以确认载体包含正确插入的METH1或METH 2。
在含10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s ModifiedEagles Medium(DMEM)中将双嗜性pA317或GP+am12包装细胞培养于组织培养物里直到汇合的密度。然后将含METH 1或METH 2基因的MSV载体加入培养液中并使其转导包装细胞。这样包装细胞就可生产含METH 1或METH 2基因的感染性病毒颗粒(此时包装细胞称为生产者细胞)。
将新鲜培养液加入转导的生产者细胞中，随后从汇合生产者细胞的10cm板上收获培养基。含感染性病毒颗粒的已耗尽养分的培养基过滤通过微孔滤器以去除分离的生产者细胞，然后用此培养液感染成纤维细胞。从成纤维细胞的次汇合平板上去除培养液并迅速换入生产者细胞的培养液。再去除此培养液并换入新鲜培养液。若病毒滴度高，则几乎所有成纤维细胞将被感染，无需选择。若滴度很低，则必需利用有选择标记，如neo或his的逆转录病毒载体。一旦成纤维细胞已有效感染，分析成纤维以测定METH 1或METH 2蛋白是否产生。
然后将加工过的成纤维细胞或单独或在cytodex3微载体珠上已生长至汇合后移植入宿主。
实施例30：利用基因疗法的治疗方法-在体内
本发明的另一方面是用体内基因疗法治疗疾病、疾病和其他状态。基因疗法涉及将裸核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)METH 1或METH 2序列引入动物以增加或减少METH 1或METH 2多肽的表达。METH 1或METH 2多核苷酸可与启动子或靶组织表达METH 1或METH 2多肽需要的任何其他元件有效连接。这种基因治疗和运送技术和方法是本领域已知的，见，例如，WO90/11092，WO98/11779；美国专利号5693622、5705151、5580859；Tabata H.等(1997)心血管研究(Cardiovasc.Res.)35(3)：470-479，Chao，J.等(1997)药理学研究(Pharmacol.Res.)35(6)：517-522，Wolff J.A.(1997)神经肌肉疾病(Neuromuscul.Disord.)7(5)：314-318，Schwartz，B.等(1996)基因治疗(Gene Ther.)3(5)：405-411，Tsurumi Y.等(1996)循环(Circulation)94(12)：3281-3290(在此收编作为参考)。
METH 1或METH 2多核苷酸构建体可用任何运送可注射物质至动物细胞的方法运送，如注射入组织间隙(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝、小肠等等)。METH 1或METH 2多核苷酸构建体可在药学可接受液态或含水载体内运送。
术语“裸露的”多核苷酸、DNA或RNA指无其他可辅助、促进或方便进入细胞的运送载体，包括病毒序列、病毒颗粒制剂、脂质体、脂转染剂或沉淀剂等的序列。不过，METH 1或METH 2多核苷酸还可以(如Felgner P.L.等(1995)纽约科学年鉴(Ann.NY Acad.Sci.)772：126-139和Abdallah B.等(1995)细胞生物学(Biol.Cell)85(1)：1-7里所教导)以脂质体制剂形式运送，其中脂质体制剂可用本领域技术熟练人员众所周知的方法制备。
用于基因疗法的METH 1或METH 2多核苷酸载体构建体优选不整合入宿主基因组并不含可引起复制的序列的构建体。任何本领域技术熟练人员已知的强启动子均可用于驱动DNA的表达。与其他的基因治疗技术不同的是，将裸露核苷酸序列引入靶细胞的一个主要优势是细胞内多核苷酸合成的瞬时特性。研究表明，非复制DNA序列可引入细胞而在长达6个月的期间内产生预期多肽。
METH 1或METH 2多核苷酸构建体可运送到动物组织胞间隙，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织的胞间隙。组织的胞间隙包含细胞间液、器官组织网状纤维中的粘多糖基质、血管或腔室壁中的弹性纤维、纤维性组织的胶原纤维或者包盖肌肉细胞的结缔组织或骨腔隙中的同样基质。被循环血浆和淋巴管的淋巴液占据的空间也可如此。由于以下原因优选向肌肉组织胞间隙运送。它们可通过注射入含这些细胞的组织而被方便地运送。尽管在非分化或较少完全分化的细胞，如血液干细胞或皮肤成纤维细胞中也能达到运送和表达，但它们优选运送和表达于已分化的永久不分裂细胞。体内肌肉细胞尤其有利用价值，因为它们能吸收和表达多核苷酸。
对于裸露的METH 1或METH 2多核苷酸注射，DNA或RNA的有效剂量范围是约0.05g-50mg/kg体重。优选剂量为约0.005-20mg/kg，更优选约0.05-5mg/kg。当然，正如本领域普通技术人员应理解的，此剂量依注射的组织位点而变化。核苷酸序列的恰当和有效剂量可由本领域普通技术人员很容易测定，并可能决定于待治疗的疾病和给药途经。优选的给药途经是非肠道注射入组织的胞间隙。不过，其他的非肠道途经也可采用，如，吸入喷雾剂，对于向肺或支气管组织、咽喉或鼻黏膜的运送更是如此。此外，裸露的METH 1或METH 2多核苷酸构建体可在血管成形术中通过该项手术中使用的导管运送到动脉处。
体内肌肉中被注射METH 1或METH 2多核苷酸的剂量反应测定如下。按标准重组DNA方法制备用于生产编码METH 1或METH 2多肽之mRNA的恰当METH 1或METH 2模板DNA。环状或线性的模板DNA以裸露DNA形式或与脂质体复合使用。然后用多种剂量的模板DNA注射小鼠四头肌。
用0.3ml 2.5％Avertin腹膜内注射麻醉5-6周大的雌性和雄性Balb/C小鼠。在前腿处切一1.5cm切口，四头肌直接可见。将于0.1ml载体内的METH 1或METH 2模板DNA用1cc注射器通过27号针头从离肌肉远端插入位点约0.5cm处注射入膝盖约0.2cm深，注射1分钟以上。缝合线留在注射位点处以便将来定位，皮肤用不锈钢钳闭合。
适当保温后(如7天)，切开整个四头肌制备肌肉提取物。对各四头肌的每第5个15um横切片进行组织化学染色，分析METH 1或METH 2蛋白质的表达。有关METH 1或METH 2蛋白质的表达时间的试验也可用类似方式进行，只是在不同时间收获不同小鼠的四头肌这一点上不同。注射后肌肉内METH 1或METH 2 DNA的保持可在从被注射小鼠和对照小鼠中制备总细胞DNA和HIRT上清后用DNA印迹分析进行测定。以上小鼠中的实验结果可用于推断在人和其他动物中使用METH 1或METH 2裸露DNA的正确剂量和其他治疗参数。
实施例31：利用内源METH 1和/或METH 2基因的基因治疗
根据本发明的另一种基因治疗方法包括通过同源重组将内源METH1和/或METH 2序列与一个启动子有效地结合，如1997年6月24日公布的美国专利号5,641,670；1996年9月26日公布的国际公开号WO96/29411；1994年8月4日公布的国际公开号WO 94/12650；Koller等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 56：8932-8935(1989)；和Zijlstra等人，Nature 342：435-438(1989)所述。该方法包括在靶细胞中存在，但在细胞中不表达，或以低于希望的水平表达的一种基因的激活。
构建多核苷酸构建体，其含有一个启动子和导向序列，它们与内源METH 1和/或METH 2的5’非编码序列同源，侧翼为启动子。导向序列将充分靠近METH 1和/或METH 2的5’末端，使得同源重组后该启动子与内源序列有效连接。该启动子和导向序列能用PCR扩增。优选地，扩增的启动子在5’和3’端含有不同限制酶切位点。优选地，第一个导向序列的3′末端含有与所扩增的启动子的5′端相同的限制酶切位点，第二个导向序列的5′末端含有与所扩增的启动子的3’末端相同的限制位点。
扩增的启动子和扩增的导向序列用合适的限制酶消化，然后用牛小肠磷酸酶处理。消化的启动子和消化的导向序列在T4 DNA连接酶存在下加在一起。得到的混合物保持在适于此两种片段连接的条件下。该构建体在琼脂糖凝胶上大小分离，然后通过酚抽提和乙醇沉淀纯化。
在该实施例中，多核苷酸构建体作为裸露的多核苷酸通过电穿孔施用。然而，多核苷酸构建体也可与转染促进剂(如脂质体、病毒序列、病毒颗粒、沉淀剂等)一起施用。这些施用方法在本领域中公知。
一旦细胞被转染，即发生同源重组，这使启动子与内源METH 1和/或METH 2序列有效连接。这导致METH 1和/或METH 2在细胞中的表达。表达可利用免疫染色或本领域公知的其它任何方法检测。通过皮肤组织活检从患者获得成纤维细胞。将得到的组织置于DMEM+10％胎牛血清中。用胰蛋白酶消化指数生长的或稳定期早期的成纤维细胞，并用营养培养基从塑料表面上洗下。取出一等份细胞悬液计数，其余的细胞离心。吸出上清液，沉淀用5ml电穿孔缓冲液(20mM HEPES pH 7.3，137mM  ，5mM  ，0.7mM  ，6mM葡萄糖)重悬浮。再次离心细胞，吸出上清液，细胞用含有1mg/ml乙酰牛血清白蛋白的电穿孔缓冲液重悬浮。终细胞悬液含有约3×106细胞/ml。电穿孔应当在重悬浮后立即进行。
质粒DNA按照标准技术制备。例如，为了构建一种导向METH 1和/或METH 2基因座的质粒，用HindIII消化质粒pUC18(MBIFermentas，Amherst，NY)。利用5′端的一个XbaI位点和3′端的一个BamHI位点PCR扩增CMV启动子。两种METH 1和/或METH 2非编码序列通过PCR扩增：利用5′端的一个HindIII位点和3端的一个Xba位点扩增一种METH 1和/或METH 2非编码序列(METH 1和/或METH2片段1)；利用5′端的一个BamHI位点和3′端的一个HindIII位点扩增另一种METH 1和/或METH 2非编码序列(METH 1和/或METH 2片段2)。CMV启动子和METH 1和/或METH 2片段用合适的酶消化(CMV启动子-XbaI和BamHI；METH 1和/或METH 2片段1-XbaI；METH 1和/或METH 2片段2-BamHI)并连接在一起。得到的连接产物用HindIII消化，并与HindIII-消化的pUC18质粒连接。
将质粒DNA加入具有一个0.4cm电极缺口的无菌池中(Bio-Rad)。DNA终浓度通常至少120μg/ml。然后向池中加入0.5ml细胞悬液(含有约1.5×106个细胞)，并将细胞悬液与DNA溶液轻轻混合。电穿孔用Gene-Pulser装置(Bio-Rad)进行。电容和电压分别设置为960μF和250-300V。当电压升高时，细胞存活率降低，但基因组中稳定掺入导入DNA的存活细胞的百分数显著提高。利用这些参数，应当观察到大约14-20mSec的脉冲时间。
电穿孔的细胞在室温下保持大约5分钟，然后用无菌移液管轻轻吸出池中的内容物。将细胞直接加到10cm平皿中的10ml预温的营养培养基(含15％牛血清的DMEM)中，37℃下温育。第二天，吸出培养基，替换为10ml新鲜培养基，再温育16-24小时。
然后将构建的成纤维细胞单独地或在cytodex 3微载体珠上生长为汇合后注射到宿主中。这些成纤维细胞现在产生蛋白质产物。能如上所述将这些成纤维细胞导入患者中。
实施例32：METH 1和/或METH 2转基因动物
METH 1和/或METH 2多肽也能在转基因动物中表达。任何种的动物，包括但不限于：小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、母牛和非人灵长类动物(如狒狒、猴和黑猩猩)可用来产生转基因动物。在一个具体实施方案中，用此处描述的或本领域公知的技术在人体中表达本发明的多肽，作为基因治疗方法的一部分。
可以使用本领域公知的任何技术将转基因(即，本发明的多核苷酸)导入动物中，产生转基因动物的起始系。这些技术包括但不限于：原核显微注射(Paterson等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.40：691-698(1994)；Carver等人，Biotechnology(NY)11：1263-1270(1993)；Wright等人，Biotechnology(NY)9：830-834(1991)；和Hoppe等人，美国专利号4,873,191(1989))；反转录病毒介导的向种系(Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-6152(1985))、胚泡或胚中的基因转移；胚胎干细胞中的基因导向(Thompson等人，Cell 56：313-321(1989))；细胞或胚的电穿孔(Lo，1983，Mol cell Biol.3：1803-1814(1983))；使用基因枪导入本发明的多核苷酸(参见，例如Ulmer等人，Science 259：1745(1993)；向胚胎多能干细胞导入核酸构建体及向胚泡中回输这些干细胞；和精子介导的基因转移(Lavitrano等人，Cell 57：717-723(1989)；等等。关于这些技术的综述，参见Gordon，“转基因动物”Intl.Rev.Cytol.115：171-229(1989)，在此完整引用作为参考。
可以使用本领域公知的任何技术产生含有本发明的多核苷酸的转基因克隆，例如，向来自培养的胚、胎或诱导为静止的成年细胞的核的去核卵母细胞中核转移(Campell等人，Nature 380：64-66(1996)；Wilmut等人，Nature 385：810-813(1997))。
本发明提供在所有细胞中携带转基因的转基因动物，以及在一些(但不是全部)细胞中携带转基因的动物，即嵌合动物或嵌合体。转基因可以整合为单个转基因或多拷贝，如多联体，例如，头-头串联或头-尾串联。也可将转基因选择性导入特定细胞型中并在其中激活，例如，按照Lasko等人所述(Lasko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236(1992))。这种细胞型特异性激活所需的调节序列取决于特定目的细胞型，是本领域技术人员所知的。当希望将多核苷酸转基因整合到内源基因的染色体位点中时，优选基因导向。
简言之，当要使用这种技术时，设计含有与内源基因同源的一些核苷酸序列的载体，用于通过与染色体序列同源重组整合到内源基因的核苷酸序列中，并破坏其功能。转基因也可以选择性导入特定细胞型中，从而只灭活该细胞型中的内源基因，如Gu等人(Gu等人，Science265：103-106(1994))所述。这种细胞型特异的灭活所需的调节序列取决于特定目的细胞型，并且为本领域技术人员所知。本段引用的每一文件的内容均在此完整引用作为参考。
转基因动物产生后，可以利用标准技术测定重组基因的表达。最初的筛选可以通过Southern印迹或PCR技术实现，以分析动物组织，证实已经发生转基因的整合。转基因在转基因动物组织中的mRNA表达水平也可以用以下技术评估，包括但不限于：从动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析和反转录酶-PCR(rt-PCR)。表达转基因的组织的样品也可以用转基因产物特异的抗体免疫细胞化学或免疫组织化学地分析。
待产生起始动物后，它们可以繁殖、近交、远交或杂交，产生特定动物的群体。这些繁殖策略的例子包括但不限于：含一个以上整合位点的起始动物远交繁殖，建立分别的系；分别的系的近交，以产生复合的转基因系，由于每种转基因的加成表达作用，它们以较高的水平表达转基因；杂合转基因动物的杂交，产生特定整合位点纯合的动物，从而加强表达并且不需要通过DNA分析筛选动物；分别的纯合系的杂交，产生复合杂合或纯合系；以及将转基因置于适于目的实验模型的不同背景中的繁殖。
本发明的转基因动物已经使用，包括但不限于：在研究METH 1和/或METH 2多肽的生物学功能、研究与异常METH 1和/或METH 2表达相关的病症和/或疾病、筛选可有效缓解这些病症和/或疾病的化合物中有用的动物模型系统。
实施例33：METH 1和/或METH 2敲除动物
利用靶向同源重组灭活或“敲除”METH 1和/或METH 2基因和/或其启动子也能降低内源METH 1和/或METH 2基因表达。(例如，参见Smithies等人，Nature 317：230-234(1985)；Thomas和Capecchi，Cell51：503-512(1987)；Thompson等人，Cell 5：313-321(1989)；均在此完整引用作为参考)。例如，能使用本发明的突变、无功能多核苷酸(或完全无关的DNA序列)，其侧翼为与内源多核苷酸序列(该基因的编码区或调节区)同源的DNA，含或不含选择性标记和/或阴性选择性标记，来转染体内表达本发明的多肽的细胞。在另一个实施方案中，利用本领域公知的技术在含有但不表达目的基因的细胞中产生敲除。DNA构建体通过导向同源重组的插入引起导向基因的灭活。这些方法特别适用于能利用胚胎干细胞的修饰产生含灭活导向基因的动物后代的研究和农业领域(例如，参见Thomas和Capecchi 1987，和Thompson 1989，同上)。然而，假如直接施用重组DNA构建体或利用本领域技术人员周知的合适的病毒载体体内导向需要的部位，该方法可常规适用于人类。
在本发明的其它实施方案中，对患者体内施用可表达本发明的多肽，或者不能表达本发明的多肽(例如，敲除)的遗传工程细胞。这些细胞可从患者(即动物，包括人)或MHC相容供体中获得，可能包括但不限于：成纤维细胞、骨髓细胞、血细胞(例如，淋巴细胞)、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞等。这些细胞利用重组DNA技术在体外遗传改造，以向细胞中导入本发明的多肽的编码序列，或者通过转导(利用病毒载体，优选地，在细胞基因组中整合了转基因的载体)或转染方法(包括但不限于：使用质粒、粘粒、YAC、裸DNA、电穿孔、脂质体等)破坏与本发明的多肽有关的编码序列和/或内源调节序列。本发明的多肽的编码序列能置于强组成型或诱导型启动子或启动子/增强子控制下，以实现METH 1和/或METH 2多肽的表达(优选地，分泌)。表达(优选地，分泌)本发明的多肽的工程细胞能被全身(例如，在循环中)或腹膜内导入患者中。
此外，能将细胞掺入基质并植入体内，例如遗传工程成纤维细胞能作为皮肤移植物的部分植入；遗传工程内皮细胞能作为淋巴或血管移植物的部分植入。(参见，例如，Anderson等人，美国专利号5,399,349；及Mulligan和Wilson，美国专利号5,460,959，均在此完整引用作为参考)。
当欲施用的细胞是非自体的或非MHC相容的细胞时，能利用众所周知可防止产生针对导入细胞的宿主免疫应答的技术施用。例如，细胞可以以包封的形式导入，这允许成分与直接胞外环境的交换，但不能使导入细胞被宿主免疫系统识别。
本发明的敲除动物已经使用，包括但不限于：在研究METH 1和/或METH 2多肽的生物学功能、研究与异常METH 1和/或METH 2表达相关的病症和/或疾病、筛选可有效缓解这些病症和/或疾病的化合物中有用的动物模型系统。
实施例34：检测B细胞增殖和分化刺激或抑制的测定法
功能性体液免疫应答的产生需要在B系细胞及其微环境之间有可溶的和同源的信号传导。信号可作为一种正刺激，使B系细胞继续其程序性发育，或作为一种负刺激，指导细胞停止其当前的发育途径。迄今为止，已经发现了大量可影响B细胞反应的刺激和抑制信号，包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-13、H-14和H-15。有趣的是，这些信号本身是弱效应物，但与不同共刺激蛋白联合能诱导B细胞群体的激活、增殖、分化、归巢、耐受和死亡。
研究最多的B细胞共刺激蛋白类别之一是TNF-超家族。在该家族中，已经发现CD40、CD27和CD30及其各自的配体CD154、CD70和CD153可调节多种免疫应答。允许检测和/或观察这些B细胞群体及其前体增殖和分化的测定法，在确定不同蛋白质对这些B细胞群体在增殖和分化方面可能具有的影响方面是有价值的工具。以下列出了用来检测B细胞群体及其前体的分化、增殖或抑制的两种测定法。
体外测定——评估纯化METH 1和/或METH 2蛋白(或其截短形式)诱导B细胞群体及其前体激活、增殖、分化或抑制和/或死亡的能力。用标准B淋巴细胞共刺激测定估计METH 1和/或METH 2蛋白对纯化人扁桃体B细胞的活性(在0.1-10,000ng/mL的剂量范围定性测定)，其中在存在甲醛固定的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowan I(SAC)或固定的抗-人IgM抗体作为引发剂的情况下培养纯化的扁桃体B细胞。第二种信号(如IL-2和IL-15)与SAC和IgM协同，它们交联引发B细胞增殖，如通过含氚胸苷掺入法测定的。新型协同剂能用该测定法容易地鉴定。该测定法包括通过CD3-阳性细胞的磁珠(MACS)排除分离人扁桃体B细胞。经CD45R(B220)表达估计，得到的细胞群体有多于95％的B细胞。
将每种样品的不同稀释度置于96孔板的各孔中，其中加入在培养基(RPMI 1640，含有10％FBS、5×10-5M 2ME、100U/ml青霉素、10μg/ml链霉素和10-5稀释的SAC)中悬浮的105B细胞，总体积为150μl。通过从加入因子后72小时开始，用3H-胸苷(6.7Ci/mM)脉冲(1μCi/孔)20小时，定量增殖或抑制。阳性和阴性对照分别是IL2和培养基。
体内测定——BALB/c小鼠每天注射(腹膜内)两次单独的缓冲液，或2mg/Kg METH 1和/或METH 2蛋白，或其截短形式。小鼠接受该处理连续4天，杀死它们，收集不同组织和血清进行分析。来自正常和METH1和/或METH 2蛋白处理的脾脏的H&E切片的比较证实了METH 1和/或METH 2蛋白对脾细胞活性的结果，如动脉周围淋巴鞘的扩散，和/或红髓区有核细胞构成的显著增加，这可能表明B细胞群体的分化和增殖的激活。使用B细胞标记物(抗-CD45R(B220))的免疫组化研究用来确定脾细胞的任何生理变化(如脾结构破坏)是否是由于浸润确定的T细胞区的未精确确定的B细胞区中B细胞表达的增加。
METH 1和/或METH 2蛋白处理的小鼠的脾脏的流式细胞分析用来显示，相比在对照小鼠中可观察到的，METH 1和/或METH 2蛋白是否特异提高ThB+，CD45R(B220)dull B细胞的比例。
同样，成熟B细胞体内表达增加的预测后果是血清Ig滴度的相对增加。因此，比较了缓冲液与METH 1和/或METH 2蛋白处理的小鼠之间的血清IgM和IgA水平。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例35：T细胞增殖测定
对PBMC进行CD3-诱导的增殖测定，并根据3H-胸苷的摄取测定。该测定如下进行。96孔板用100μl/孔抗CD3 mAb(HIT3a，Pharmingen)或同种型匹配的对照mAb(B33.1)4℃包被过夜(1mg/ml，溶于0.05M碳酸氢盐缓冲液，pH 9.5)，然后用PBS洗涤三次。通过F/H梯度离心从人外周血中分离PBMC，并一式四份加入用mAb包被的板的孔中(5×104/孔)，其中有含有10％FCS和P/S的RPMI，含有不同浓度的METH 1和/或METH 2蛋白(总体积200μl)。单独的有关蛋白缓冲液和培养基作为对照。在37℃下培养48小时后，培养板以1000转/分离心2分钟，吸出100μl上清液，贮存于-20℃下，用于在观察到对增殖的影响时测定IL-2(或其它细胞因子)。孔中补加100μl含0.5μCi 3H-胸苷的培养基，在37℃下培养18-24小时。收获板孔，用3H-胸苷的掺入作为增殖的量度。单独的抗-CD3是增殖的阳性对照。IL-2(100U/ml)也用作提高增殖的对照。不能诱导T细胞增殖的对照抗体用作METH 1和/或METH 2蛋白的作用的阴性对照。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例36：METH 1和/或METH 2对MHC II类、共刺激和粘附分子的表达及单核细胞和单核细胞衍生的人树突细胞的细胞分化的影响
通过扩充在外周血中发现的增殖前体产生树突细胞：粘附PBMC或淘选的单核细胞级分与GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(20ng/ml)培养7-10天。这些树突细胞具有不成熟细胞的特有表型(CD1、CD80、CD86、CD40和MHC II类抗原的表达)。用活化因子(如TNF-α)处理引起表面表型的快速改变(MHC I类和II类、共刺激和粘附分子的表达增强，FCγRII下调，CD83上调)。这些改变与提高的抗原递呈能力和树突细胞的功能成熟有关。
表面抗原的FACS分析如下进行。用浓度渐增的METH 1和/或METH 2或LPS(阳性对照)处理细胞1-3天，用含有1％BSA和0.02mM叠氮钠的PBS洗涤，然后与1∶20稀释的适当FITC-或PE-标记的单克隆抗体一起4℃温育30分钟。再次洗涤后，用FACScan(Becton Dickinson)通过流式细胞法分析标记的细胞。
对细胞因子产生的影响。树突细胞产生的细胞因子(特别是IL-12)在T细胞依赖的免疫应答的起始中十分重要。IL-12强烈影响Th1辅助T-细胞免疫应答的发展，并诱导细胞毒性T和NK细胞功能。如下用ELISA测定IL-12的释放。树突细胞(106/ml)用浓度渐增的METH 1和/或METH2处理24小时。将LPS(100ng/ml)加入细胞培养物中作为阳性对照。然后收集细胞培养物的上清液，并用商品ELISA试剂盒(例如，R&DSystems(Minneapolis，MN))分析IL-12含量。使用试剂盒提供的标准方法。
对MHC II类、共刺激和粘附分子表达的影响。在单核细胞上能鉴定三个主要的细胞表面抗原家族：粘附分子、参与抗原递呈的分子和Fc受体。MHC II类抗原和其它共刺激分子(如B7和ICAM-1)的表达的调节可导致单核细胞抗原递呈能力和诱导T细胞激活的能力的改变。Fc受体表达的提高可能与提高的单核细胞细胞毒活性、细胞因子释放和吞噬作用有关。
如下利用FACS分析检测表面抗原。用浓度渐增的METH 1和/或METH 2或LPS(阳性对照)处理单核细胞1-5天，用含有1％BSA和0.02mM叠氮钠的PBS洗涤，然后与1∶20稀释的适当FITC-或PE-标记的单克隆抗体一起4℃温育30分钟。再次洗涤后，用FACScan(BectonDickinson)通过流式细胞法分析标记的细胞。
单核细胞激活和/或提高的存活率。激活(或者，灭活)单核细胞和/或提高单核细胞存活率(或者，降低单核细胞存活率)的分子的测定在本领域中公知，并可常规用于确定本发明的分子是作为单核细胞的抑制剂还是激活剂。METH 1和/或METH 2、METH 1和/或METH 2的激动剂或拮抗剂能用以下所述的三种测定法筛选。对于这些测定法中的每一种，通过Histopaque梯度(Sigma)离心从一个供体leukopacks(AmericanRed Cross，Baltimore，MD)中纯化外周血单核细胞(PBMC)。通过逆流离心淘析从PBMC中分离单核细胞。
1.单核细胞存活率测定。人外周血单核细胞在不含血清或其它刺激物的情况下培养会逐渐丧失生存力。它们的死亡是由于内部调节过程(凋亡)。向培养物中加入激活因子(如TNF-alpha)可显著提高细胞存活率并防止DNA破裂。
如下用碘化丙锭(PI)染色测定凋亡。在100ng/ml TNF-alpha(阴性对照)和不同浓度的待测化合物存在下，将单核细胞在聚丙烯管中的无血清培养基(阳性对照)中培养48小时。将细胞以2×106/ml的浓度在含有终浓度为5μg/ml的PI的PBS中悬浮，然后在室温下温育5分钟，之后进行FACScan分析。在该实验范例中已经证明PI摄取与DNA破裂有关。
2.对细胞因子释放的影响。单核细胞/巨噬细胞的一个重要功能是其在刺激后通过细胞因子的释放对免疫系统中其它细胞群体的调节活性。一种测定细胞因子释放的ELISA如下进行。人单核细胞以5×105细胞/ml的密度与浓度渐增的METH 1和/或METH 2温育，并在相同条件、但不含METH 1和/或METH 2的情况下温育。对于IL-12产生，在METH1和/或METH 2存在下，细胞接触IFN(100U/ml)过夜。然后加入LPS(10ng/ml)。24小时后收集条件培养基，冻存直到使用。然后用可商品获得的ELISA试剂盒(例如R & D Systems(Minneapolis，MN))，并使用试剂盒提供的标准方法进行TNF-alpha、IL-10、MCP-1和IL-8的测定。
3.氧化爆发。纯化的单核细胞以2-1×105细胞/孔的浓度接种于96孔培养板中。向孔中加入浓度渐增的METH 1和/或METH 2，总体积为0.2ml培养基(RPMI 1640+10％FCS、谷氨酰胺和抗生素)。温育3天后，离心培养板，并从孔中取出培养基。向巨噬细胞单层中添加每孔0.2ml酚红溶液(140mM  ，10mM磷酸钾缓冲液pH 7.0，5.5mM葡萄糖，0.56mM酚红和19U/ml HRPO)，以及刺激物(200nM PMA)。培养板在37℃下温育2小时，通过每孔加入20μl 1N  终止反应。读取610nm的吸光度。为了计算巨噬细胞产生的 的量，每一实验均绘制已知体积摩尔浓度的 溶液的标准曲线。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例37：METH 1和/或METH 2的生物学效应
星形胶质细胞和神经元测定。能检测如上所述在大肠杆菌中表达并纯化的重组METH 1和/或METH 2在提高皮质神经元细胞的存活率、轴突生长或表型分化，诱导神经胶质原纤维酸性蛋白免疫阳性细胞(星形胶质细胞)增殖方面的活性。用于生物测定的皮质细胞的选择基于皮质结构中FGF-1和FGF-2的普遍表达和以前报道的由FGF-2处理引起的皮质神经元存活率的提高。例如，能用胸苷掺入测定说明METH 1和/或METH 2对这些细胞的活性。
而且，以前叙述FGF-2(碱性FGF)对体外皮质或海马神经元生物学作用的报道已经证明了神经元存活率和轴突生长都提高(Walicke，P.等人，“成纤维细胞生长因子提高分离海马神经元的存活率，并增强轴突延伸”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 53：3012-3016(1986)，测定在此引用作为参考)。然而，对PC-12细胞进行的实验的报道提示这两种反应不必相同，不仅可取决于检测哪种FGF，而且取决于在靶细胞上表达哪种受体。使用初级皮质神经元培养方案，能将METH 1和/或METH 2诱导轴突生长的能力与利用如胸苷掺入测定用FGF-2实现的反应相比较。
成纤维细胞和内皮细胞测定。人肺成纤维细胞从Clonetics(San Diego，CA)获得，保持在来自Clonetics的生长培养基中。皮肤微血管内皮细胞从Cell Applications(San Diego，CA)获得。对于增殖测定，人肺成纤维细胞和皮肤微血管内皮细胞能以5,000细胞/孔在96-孔培养板中的生长培养基中培养一天。细胞然后在0.1％BSA基础培养基中温育一天。在将培养基替换为新鲜的0.1％BSA培养基后，细胞与待测蛋白质温育3天。向每孔中加入Alamar蓝(Alamar Biosciences，Sacramento，CA)至终浓度为10％。细胞温育4小时。通过用CytoFluor荧光读数仪读取测定细胞生存力。对于PGE2测定，人肺成纤维细胞以5,000细胞/孔在96-孔培养板中培养一天。在将培养基换为0.1％BSA基础培养基后，细胞与含或不含IL-1α的FGF-2或METH 1和/或METH 2温育24小时。收集上清液，用EIA试剂盒(Cayman，Ann Arbor，MI)测定PGE2。对于IL-6测定，人肺成纤维细胞以5,000细胞/孔在96-孔培养板中培养一天。在将培养基换为0.1％BSA基础培养基后，细胞与含或不含IL-1α的FGF-2或METH1和/或METH 2温育24小时。收集上清液，用ELISA试剂盒(Endogen，Cambridge，MA)测定IL-6。
人肺成纤维细胞与FGF-2或METH 1和/或METH 2在基础培养基中培养3天，之后加入Alamar蓝估测对成纤维细胞生长的影响。FGF-2在10-2500ng/ml时显示刺激，这能用来与METH 1和/或METH 2的刺激比较。
帕金森模型。帕金森氏病中运动功能的丧失归因于由黑质纹状体多巴胺能投射神经元退化引起的纹状体多巴胺的缺乏。已经广泛表征的帕金森氏病的一种动物模型包括1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢嘧啶(MPTP)的系统性施用。在CNS中，MPTP被星形胶质细胞摄取，并被B型单胺氧化酶分解代谢为1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)并释放。随后，MPP+通过多巴胺的高亲和力再摄取转运蛋白在多巴胺能神经元中活跃积累。然后由于电化学梯度MPP+在线粒体中浓缩，并选择性抑制烟酰胺腺嘌呤二磷酸：泛醌氧化还原酶(复合体I)，从而干扰电子传递，并最终产生氧自由基。
在组织培养范例中已经证明，FGF-2(碱性FGF)对多巴胺能神经元具有营养活性(Ferrari等人，Dev.Biol.1989)。最近，Unsicker博士的研究小组已经证明，在纹状体的胶状泡沫植入体中施用FGF-2导致几乎完全保护黑质多巴胺能神经元免受与MPTP暴露相关的毒性(Otto和Unsicker，J.Neuroscience，1990)。
根据FGF-2的数据，能估计METH 1和/或METH 2，以确定它在提高体外多巴胺能神经元存活率上是否具有类似于FGF-2的作用，也能体内检测它对纹状体中多巴胺能神经元免受MPTP处理相关损伤的保护。在多巴胺能神经元细胞培养范例中首先体外检测METH 1和/或METH 2的潜在作用。通过从妊娠14天的Wistar大鼠胚胎中解剖中脑底板制备培养物。该组织用胰蛋白酶分解，并以200,000细胞/cm2的密度接种于polyorthinine-层粘连蛋白包被的盖玻片上。细胞保存在含有激素添加物(N1)的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基和F12培养基中。体外8天后培养物用多聚甲醛体外固定，并为酪氨酸羟化酶(多巴胺能神经元的一种特异标记物)处理，免疫组化染色。从胚胎大鼠制备分解的细胞培养物。每3天改变培养基，同时也添加因子。由于多巴胺能神经元是从妊娠14天(跨过多巴胺能前体细胞增殖的阶段的发育时间)的动物中分离的，酪氨酸羟化酶免疫阳性神经元数量的增加将代表体外存活的多巴胺能神经元数量的增加。因此，如果METH 1和/或METH 2用来延长多巴胺能神经元的存活期，将提示METH 1和/或METH 2可能与帕金森氏病有关。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例38：METH 1和/或METH 2对血管内皮细胞生长的影响
在第1天，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以2-5×104细胞/35mm平皿的密度接种于含4％胎牛血清(FBS)、16单位/ml肝素和50单位/ml内皮细胞生长添加剂(ECGS，Biotechnique，Inc.)的M199培养基中。在第2天，将培养基替换为含10％FBS、8单位/ml肝素的M199。以不同浓度加入SEQ ID NO.2的METH 1和/或METH 2蛋白，和阳性对照，如VEGF和碱性FGF(bFGF)。在第4天和第6天，替换培养基。在第8天，用Coulter计数器确定细胞数量。
HUVEC细胞数量的增加表明METH 1和/或METH 2可增加血管内皮细胞。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例39：METH 1和/或METH 2对血管内皮细胞增殖的刺激作用
为了评估生长因子的有丝分裂原活性，使用电子偶联试剂PMS(吩嗪甲硫酸)进行了比色MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)2H-四唑)测定(CellTiter 96 AQ，Promega)。将细胞接种于96孔板(5,000细胞/孔)中的0.1mL补加血清培养基中，使之附着过夜。在0.5％FBS中血清饥饿12小时后，向孔中加入含或不含肝素(8U/ml)的条件(溶于0.5％FBS的bFGF、VEGF165或METH 1和/或METH 2)48小时。每孔加入20mg MTS/PMS混合物(1∶0.05)，使之在37℃下温育1小时，之后用ELISA平板读数器测量490nm的吸光度。减去对照孔(一些培养基，无细胞)的背景吸光度，每一条件平行进行7个孔。参见Leak等人，in vitro Cell.Dev.Biol.30A：512-518(1994)。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例40：PDGF-诱导的血管平滑肌细胞增殖刺激作用的抑制
例如能用BrdUrd掺入法测定HAoSMC增殖。简言之，在4-室玻片上生长的亚汇合静止细胞用CRP或FITC-标记的AT2-3LP转染。然后，细胞用10％小牛血清和6mg/ml BrdUrd脉冲。24小时后，使用BrdUrd染色试剂盒(Zymed Laboratories)进行免疫组织化学。简要地，在接触变性溶液之后，细胞与生物素化小鼠抗-BrdUrd抗体在4℃下温育2小时，然后与链霉亲和素-过氧化物酶和二氨基联苯胺温育。用苏木精复染后，对细胞进行显微镜检查，并计数BrdUrd-阳性细胞。BrdUrd指数计算为BrdUrd-阳性细胞占细胞总数的百分比。另外，通过同时使用亮视野照明和暗视野-UV荧光照明，对单个细胞同时进行BrdUrd染色(核)和FITC摄取(细胞质)的检测。参见，Hayashida等人，J.Biol.Chem.6：271(36)：21985-21992(1996)。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例41：内皮迁移的刺激
该实施例将探讨METH 1和/或METH 2刺激淋巴内皮细胞迁移的可能性。
用48孔微趋化室(Neuroprobe Inc.，Cabin John，MD；Falk，W.，等人，J.Immunological Methods 1980；33：239-247)进行内皮细胞迁移测定。孔径8μm的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤纸(Nucleopore Corp.Cambridge，MA)在室温下用0.1％明胶包被至少6小时，并在无菌空气下干燥。待测物质用补充了0.25％牛血清白蛋白(BSA)的M199稀释为合适的浓度，并将25μl终稀释液置于改进的Boyden装置的下室中。洗涤亚汇合的、早期传代(2-6)的HUVEC或BMEC培养物，并用胰蛋白酶处理实现细胞脱离所需的最短时间。在将滤纸置于下室和上室之间后，将在含1％FBS的50μl M199中悬浮的2.5×105细胞接种于上面的区室中。该装置然后在含5％ 的潮湿容器中37℃温育5小时，使细胞迁移。待温育期后，取出滤纸，并用橡皮刮棒刮含未迁移细胞的滤纸上侧。滤纸用甲醇固定，并用姬姆萨溶液(Diff-Quick，Baxter，McGraw Park，IL)染色。通过计数每一孔中三个随机高倍放大视野(40×)的细胞定量迁移，所有组别一式四份进行。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例42：内皮细胞一氧化氮产生的刺激
血管内皮释放的一氧化氮被认为是血管内皮松弛的一种介质。因此，通过测定内皮细胞应答METH 1和/或METH 2的一氧化氮产生能测定METH 1和/或METH 2的活性。
在饥饿24小时，随后与不同水平的阳性对照(如VEGF-1)和METH 1和/或METH 2接触4小时后，在铺满微血管内皮细胞的96孔板中测定一氧化氮。培养基中的一氧化氮用Griess试剂测定，测定一氧化氮衍生的硝酸盐被硝酸还原酶还原后的总亚硝酸盐。用HUVEC检测METH 1和/或METH 2对一氧化氮释放的影响。
简言之，用与 计( ，World Precision Instruments Inc.)(1049)连接的NO-特异极谱电极测量培养的HUVEC单层的 释放。根据下列方程式进行 成分的校准：
2 +2 +2 + +2 +2
通过向含有 和 的校准溶液中加入分级浓度的 (0，5，10，25，50，100，250和500nmol/L)获得标准校准曲线。以前通过测量真实 气体(1050)的 确定 电极对 的特异性。除去培养基，用Dulbecco′s磷酸盐缓冲液洗涤HUVEC两次。细胞然后在6孔板中在5ml过滤Krebs-Henseleit溶液中水浴，并将细胞培养板置于玻片加热器中(LabLine Instruments Inc.)，保持37℃的温度。将 传感器探针垂直插入孔中，使电极尖在溶液表面下2mm，之后加入不同条件。S-亚硝基乙酰青霉胺(SNAP)用作阳性对照。释放的 的量表示为每1×106个内皮细胞的皮摩尔。报告的所有数值都是每组4-6次测定的平均值(细胞培养孔的数目)。参见Leak等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.277：96-105(1995)。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例43：METH 1和/或METH 2对血管生成中索形成的影响
血管生成中的另一步是索形成，其标志为内皮细胞的分化。该生物测定法检测微血管内皮细胞在体外培养时形成毛细血管样结构(空心结构)的能力。
CADMEC(微血管内皮细胞)购自Cell Applications，Inc.，作为增殖(传代2)细胞，并在Cell Applications的CADMEC生长培养基中培养，在传代5次时使用。对于体外血管生成测定，48孔细胞培养板的孔用CellApplications的附着因子培养基(200ml/孔)37℃包被30分钟。将CADMEC以7,500细胞/孔的浓度接种于包被的孔中，并在生长培养基中培养过夜。然后将该生长培养基替换为含有对照缓冲液或METH 1和/或METH 2(0.1-100ng/ml)的300mg Cell Applications索形成培养基，细胞再培养48小时。毛细血管样索的数量和长度用Boeckeler VIA-170视频图象分析仪定量。所有测定一式三份进行。
用商品(R&D)VEGF(50ng/ml)作为阳性对照。用b-酯二醇(esteradiol)(1ng/ml)作为阴性对照。也用合适的缓冲液(不含蛋白质)作为对照。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例44：兔下肢模型中局部缺血的拯救
为了研究METH 1和/或METH 2对局部缺血的体内作用，如前所述(Takeshita，S.等人，Am J.Pathol 147：1649-1660(1995))通过手术移除一根股动脉建立兔后肢缺血模型。股动脉的切除导致血栓的逆行扩散和髂外动脉的阻塞。因此，流向缺血肢的血流依赖于源自髂内动脉的侧副管(Takeshita，S.等人Am J.Pathol 147：1649-1660(1995))。兔的手术后恢复和内源侧副管的发育允许有10天的间隔。在手术后第10天(第0天)，在进行基线血管造影后，如述(Riessen，R.等人Hum Gene Ther.4：749-758(1993)；Leclerc，G.等人J Clin.Invest.90：936-944(1992))使用水凝胶包被的气泡式导管，通过动脉基因转移技术，用500mg裸METH 1和/或METH 2表达质粒转染缺血肢的髂内动脉。当在处理中使用METH 1和/或METH 2时，在1分钟内通过输液管将一个500mg METH 1和/或METH 2蛋白或对照大丸剂输送到缺血肢的髂内动脉中。在第30天，在这些兔中检测多个参数：(a)BP比——缺血肢与正常肢收缩压的血压比；(b)血流和血流保留(Flow Reserve)——静止FL∶未扩张条件时的血流，最大FL∶完全扩张条件时的血流(也是血管量的一个间接量度)，血流保留反映为最大FL∶静止FL之比；(c)血管造影照片(Angiographic)得分——利用侧副管的血管摄片确定。一种得分根据覆盖栅格中圆形的百分比确定，交叉的不透明动脉除以兔大腿中的总数；(d)毛细血管密度——在采自后肢的光学显微镜切片中确定的侧毛细血管的数量。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例45：METH 1和/或METH 2对血管舒张的影响
由于血管内皮的扩张在降低血压中是重要的，检测了自发性高血压大鼠(SHR)中METH 1和/或METH 2影响血压的能力。对13-14周龄的自发性高血压大鼠(SHR)施用剂量逐渐升高(0、10、30、100、300和900mg/kg)的METH 1和/或METH 2。数据表示为平均值+/-SEM。用配对t-检验进行统计分析，统计学显著性确定为与对单独缓冲液的反应相比，p＜0.05。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例46：大鼠局部缺血皮瓣模型
评价参数包括皮肤血流、皮肤温度和因子VIII免疫组织化学或内皮碱性磷酸酶反应。皮肤局部缺血期间的METH 1和/或METH 2表达用原位杂交研究。
该模型的研究分为以下三个部分：
a)局部缺血皮肤
b)局部缺血皮肤创伤
c)正常创伤
实验方案包括：
a)提起一个3×4cm的单肉茎完整厚度的随机皮瓣(动物下背上的肌皮(myocutaneous)皮瓣)。
b)在局部缺血皮肤(皮瓣)中切割创伤(直径4-6mm)。
c)以下列不同剂量用METH 1和/或METH 2局部处理切伤(创伤后第0、1、2、3、4天)：1mg-100mg。
d)在创伤后第3、5、7、10、14和21天收获创伤组织，用于组织学、免疫组织化学和原位研究。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例47：外周动脉疾病模型
利用METH 1和/或METH 2的血管生成治疗是使外周动脉疾病中缺血周围血流得到恢复的一种新的治疗策略。实验方案包括：
a)结扎股动脉的一端，建立后肢的局部缺血肌肉，后肢的另一端作为对照。
b)静脉内和/或肌肉内施用METH 1和/或METH 2蛋白，剂量范围为20mg-500mg，每周3次(或许更多)，持续2-3周。
c)股动脉结扎后，在1、2、3周收集缺血肌肉组织，用于METH 1和/或METH 2表达和组织学的分析。也对对侧后肢正常肌肉的另一端进行活组织检查。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例48：局部缺血心肌疾病模型
METH 1和/或METH 2被认为是一种有力的有丝分裂原，能刺激侧副管的发育，并在冠状动脉闭塞后重建新血管。原位研究了METH 1和/或METH 2表达的改变。实验方案包括：
a)在大鼠中通过左侧胸廓切开术暴露心脏。立即用细的缝合线(6-0)闭塞左冠状动脉，并闭合胸廓。
b)静脉内和/或肌肉内施用METH 1和/或METH 2蛋白，剂量范围为20mg-500mg，每周3次(或许更多)，持续2-4周。
c)手术30天后，取出心脏，横切，用于形态测量和原位分析。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例49：大鼠角膜创伤愈合模型
该动物模型显示METH 1和/或METH 2对新血管形成的影响。实验方案包括：
a)从角膜中心到基质层切开一个1-1.5mm长的切口。
b)在面对眼睛外角的切口下插入一个药刀。
c)制造一个囊(基基底距眼睛边缘1-1.5mm)。
d)将含有50ng-5ug METH 1和/或METH 2的沉淀置于囊内。
e)也能以20mg-500mg的剂量对角膜伤口局部进行METH 1和/或METH 2处理(每日处理，持续5天)。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例50：糖尿病小鼠和糖皮质激素削弱的创伤愈合模型
A.糖尿病db+/db+小鼠模型。
为了证明METH 1和/或METH 2对愈合过程有影响，使用创伤愈合的遗传糖尿病小鼠模型。db+/db+小鼠的完整厚度的创伤愈合模型是一种极好表征、临床相关并可重复的损伤创伤愈合模型。糖尿病创伤的愈合依赖于肉芽组织的形成和上皮再形成，而不是收缩(Gartner，M.H.等人，J.Surg.Res.52：389(1992)；Greenhalgh，D.G.等人，Am.J.Pathol.136：1235(1990))。
糖尿病动物具有许多在II型糖尿病中发现的特有特征。纯合(db+/db+)小鼠比正常杂合(db+/+m)同窝小鼠肥胖。突变糖尿病(db+/db+)小鼠在染色体4上有一个常染色体隐性突变(db+)(Coleman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：283-293(1982))。这些动物表现多食、烦渴和多尿。突变糖尿病小鼠(db+/db+)血糖升高，胰岛素水平升高或正常，细胞介导的免疫抑制(Mandel等人，J.Immunol.120：1375(1978)；Debray-Sachs，M.等人，Clin.Exp.Immunol.51(1)：1-7(1983)；Leiter等人，Am.J.of Pathol.114：46-55(1985))。这些动物中已经描述周围神经病、心肌并发症、微血管损伤、基底膜增厚和肾小球滤过异常(Norido，E.等人，Exp.Neurol.83(2)：221-232(1984)；Robertson等人.Diabetes 29(1)：60-67(1980)；Giacomelli等人，Lab Invest.40(4)：460-473(1979)；Coleman，D.L.，Diabetes 31(增)：1-6(1982))。这些纯合糖尿病小鼠发展为耐受胰岛素的高血糖症，类似于人II型糖尿病(Mandel等人，J.Immunol.120：1375-1377(1978))。在这些动物中发现的特征提示，该模型的愈合可能类似于在人糖尿病中观察到的愈合(Greenhalgh，等人，Am.J.of Pathol.136：1235-1246(1990))。
在该研究中使用遗传糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠及其非糖尿病(db+/+m)杂合同窝小鼠(Jackson Laboratories)。动物在6周龄时购买，在研究开始时为8周龄。动物分开饲养，随意接受食物和水。所有操作都用无菌技术进行。实验按照Human Genome Sciences，Inc.研究性动物关爱和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)的原则和路线和实验动物饲养与使用的方针进行。
创伤方案按照以前报道的方法进行(Tsuboi，R.和Rifkin，D.B.，J.Exp.Med 172：245-251(1990))。简言之，在创伤的当天，腹膜内注射阿弗丁(0.01mg/mL)(溶于去离子水的2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇)麻醉动物。动物的后背区剃毛，皮肤用70％乙醇溶液和碘洗涤。手术区在创伤前用无菌纱布干燥。然后用Keyes组织打孔器形成8mm完整厚度的伤口。创伤后立即轻轻牵拉周围的皮肤，以防止伤口扩大。伤口在实验过程中保持打开。从创伤之日起，局部给予处理，连续5天。在处理前，用无菌盐水和纱布海绵轻轻清洁伤口。
目视检查伤口，并在手术当天和之后以两天的间隔以固定距离照相。在第1-5天和第8天每日测量，检查伤口闭合。用校准的Jameson卡钳水平和垂直地测量伤口。如果肉芽组织不再可见，并且伤口被连续的上皮覆盖，则认为伤口已经愈合。
使用不同剂量范围的METH 1和/或METH 2(每天每处伤口4mg-500mg，持续8天，在载体中)施用METH 1和/或METH 2。载体对照组接受50mL载体溶液。
在第8天，腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)使动物安乐死。然后收集伤口和周围的皮肤进行组织学和免疫组化分析。组织标本置于活组织检查海绵之间的组织盒中的10％中性缓冲甲醛中，用于进一步处理。
评价了三组动物(每组10只，5只为糖尿病对照，5只为非糖尿病对照)：1)载体安慰剂对照，2)METH 1和/或3)METH 2。
通过以垂直和水平轴测量面积并获得伤口的总正方形面积，分析伤口的闭合。然后通过确定最初伤口面积(第0天)与处理后的伤口面积(第8天)的差，估计其收缩。第1天的伤口面积是64mm2，是皮肤打孔器的相应大小。用下列公式进行计算：
{[第8天的开放面积]-[第1天的开放面积]}/[第1天的开放面积]标本用10％缓冲甲醛固定，石蜡包埋的标本块垂直于伤口表面切片(5mm)，并用Reichert-Jung切片机切片。对对半切开的伤口的横切片进行常规苏木精-伊红(H&E)染色。利用伤口的组织学检查估计METH 1和/或METH 2处理是否改变修复皮肤的愈合过程和形态学外观。该估计包括证实细胞积累、炎症细胞、毛细血管、成纤维细胞、上皮再形成和表皮成熟的出现(Greenhalgh，D.G.等人，Am.J.Pathol 136：1235(1990))。校准透镜测微尺由一名盲目的观测员使用。
组织切片也利用ABC Elite检测系统用多克隆兔抗人角蛋白抗体免疫组化染色。用人皮肤作为阳性组织对照，而用非免疫IgG作为阴性对照。通过用校准透镜测微尺估计伤口上皮再形成的程度确定角质细胞的生长。
皮肤标本中增殖的细胞核抗原/细胞周期蛋白(PCNA)利用ABC Elite检测系统用抗-PCNA抗体(1∶50)证明。人结肠癌作为阳性组织对照，人脑组织作为阴性组织对照。每种标本包括不含第一抗体和非免疫小鼠IgG取代的切片。这些切片的分级是根据增殖的程度，分为0-8级，从反映轻微增殖的较低等级到反映强烈增殖的越高等级。
实验数据用不配对t检验分析。P值＜0.05被认为是显著的。
B.类固醇削弱的大鼠模型
类固醇对创伤愈合的抑制已经在许多体外和体内系统中得到很好的证明(Wahl，S.M.糖皮质激素与创伤愈合。于：《抗炎症类固醇作用：基础与临床方面》280-302(1989)；Wahl，SM.等人，J.Immunol.115：476-481(1975)；Werb，Z.等人，J Exp.Med.147：1684-1694(1978))。糖皮质激素通过抑制血管生成、降低血管通透性(Ebert，R.H.，等人，An.Intern.Med.37：701-705(1952))、成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成(Beck，L.S.等人，Growth Factors.5：295-304(1991)；Haynes，B.F.等人，J.Clin.Invest.61：703-797(1978))并引起循环单核细胞的短暂减少(Haynes，B.F.，等人，J.Clin.Invest.61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，“糖皮质激素与创伤愈合”。于《抗炎症类固醇作用：基础与临床方面》，Academic Press，纽约，280-302页(1989))，延缓创伤愈合。在大鼠中，系统施用类固醇以延缓创伤愈合是一个公认的现象(Beck，L.S.等人，Growth Factors.5：295-304(1991)；Haynes，B.F.，等人，J.Clin.Invest.61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，“糖皮质激素与创伤愈合”。于：《抗炎症类固醇作用：基础与临床方面》，Academic Press，纽约，280-302页(1989)；Pierce，G.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2229-2233(1989))。
为了证明METH 1和/或METH 2对愈合过程有影响，评价了大鼠中多次局部应用METH 1和/或METH 2对完整厚度的切割皮肤创伤的作用，其中甲基强的松龙的全身施用妨碍了愈合。
该实施例中使用体重250-300g的年轻成年雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River Laboratories)。这些动物在8周龄时购买，在研究开始时为9周龄。在创伤时全身施用甲基强的松龙(17mg/kg/大鼠，肌肉内)可削弱大鼠的愈合反应。动物分开饲养，并随意接受食物和水。所有操作都用无菌技术进行。该研究按照Human Genome Sciences，Inc.Institutional Animal Care and Use Committee的原则和方针和实验动物饲养和使用的方针进行。
按照上述部分A施行创伤方法。在创伤当天，肌肉内注射氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)麻醉动物。动物的背区剃毛，皮肤用70％乙醇和碘溶液洗涤。手术区在创伤前用无菌纱布干燥。用Keyes组织打孔器形成8mm的完整厚度伤口。伤口在实验过程中保持打开。从创伤之日起，每天一次局部施用测试物质，连续7天，之后施用甲基强的松龙。在处理前，用无菌盐水和纱布海绵轻轻清洁伤口。
目视检查伤口，并在创伤当天和处理结束时以固定的距离照相。在第1-5天和第8天每日测量，检查伤口闭合。用校准的Jameson卡钳水平和垂直地测量伤口。如果肉芽组织不再可见，并且伤口被连续的上皮覆盖，则认为伤口已经愈合。
使用不同剂量范围的METH 1和/或METH 2(每天每处伤口4mg-500mg，持续8天，在载体中)施用METH 1和/或METH 2。载体对照组接受50mL载体溶液。
在第8天，腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)使动物安乐死。然后收集伤口和周围的皮肤进行组织学分析。组织标本置于活组织检查海绵之间的组织盒中的10％中性缓冲甲醛中，用于进一步处理。
评价了4组动物(每组10只，5只使用甲基强的松龙，5只不使用糖皮质激素)：1)未处理组，2)载体安慰剂对照，3)METH 1和4)METH2处理组。
通过以垂直和水平轴测量面积并获得伤口的总正方形面积，分析伤口的闭合。然后通过确定最初伤口面积(第0天)与处理后的伤口面积(第8天)的差，估计其收缩。第1天的伤口面积是64mm2，这是皮肤打孔器的相应大小。用下列公式进行计算：
{[第8天的开放面积]-[第1天的开放面积]}/[第1天的开放面积]标本用10％缓冲甲醛固定，石蜡包埋的标本块垂直于伤口表面切片(5mm)，并用Olympus切片机切片。对对半切开的伤口的横切片进行常规苏木精-伊红(H&E)染色。对伤口的组织学检查使得能估计METH 1和/或METH 2处理是否改善修复皮肤的愈合过程和形态学外观。校准透镜测微尺由一名盲目的观察者使用，来测量伤口的距离。
实验数据用不配对t检验分析。P值＜0.05被认为是显著的。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例51：淋巴水肿动物模型
该实验方法的目的在于产生一种合适的且一致的淋巴水肿模型，用于检测METH 1和/或METH 2在大鼠后肢淋巴血管生成和淋巴循环系统重建中的治疗效果。通过增加患肢的体积，定量淋巴血管(vasculature)、总血浆蛋白的量和组织病理学，确定功效。在7-10天中发现急性淋巴水肿。也许更重要地，水肿的慢性进展可达3-4周。
在开始手术之前，抽取血样进行蛋白质浓度分析。重约350g的雄性大鼠施以戊巴比妥。随后，右腿从膝部到臀部剃毛。剃毛的区域用70％ 浸泡的纱布擦拭。抽血进行血清总蛋白检测。在标记2个测量水平(踵部以上0.5cm，背爪的中部)之后，向爪注射染料之前，进行圆周和体积测定。右爪和左爪的真皮内背注射0.05ml 1％伊文氏蓝。然后在向爪内注射染料后进行圆周和体积测定。
使用膝关节作为界标，环状进行腿中腹股沟切开术，使股血管定位。用镊子和止血钳解剖并分离皮瓣。在定位股血管后，定位沿血管的和位于其下的淋巴管。然后电凝结或缝合该区域的主淋巴管。
利用显微镜，直接切开腿后的肌肉(靠近半腱肌和内收肌)。然后定位腘淋巴结。之后缝合2条近端和2条远端淋巴管和腘淋巴节的远端血液供应。通过切除结缔组织去除腘淋巴结和任何伴随脂肪组织。
小心控制由该过程引起的任何轻度出血。待淋巴管闭塞后，用液体皮肤封闭皮瓣(Vetbond)(AJ Buck)。分离的皮肤边缘封闭下面的肌肉组织，而在腿周围保留一个约0.5cm的缝隙。必要时皮肤也可通过缝合固定于下面的肌肉上。
为避免感染，动物用网栅(无寝具)分开饲养。每天通过最佳水肿峰检查恢复的动物，这一般到5-7天时发生。然后观察到平台水肿峰。为了估计淋巴水肿的强度，在操作前每天测量每只爪上2个指定部位的圆周和体积，持续7天。确定血浆蛋白对淋巴水肿的影响，也研究蛋白质分析是否是一种有用的检测工具。在2个部位估计对照和水肿肢的重量。以盲法进行分析。
圆周测量：为了防止肢运动，在短暂的气体麻醉下，用布带测量肢圆周。由2名不同人员在踝骨和背爪处进行测量，然后平均这2个读数。读数来自对照和水肿肢。
体积测量：在手术当天，动物在手术前用戊巴比妥麻醉并检测。为了每日体积测量，动物处于短暂的氟烷麻醉剂中(快速固定并快速恢复)，两条腿都剃毛，并在腿上用防水记号笔同样标记。首先将腿在水中浸泡，然后浸入仪器中到每一标记水平，然后用Buxco水肿软件(Chen/Victor)确定。数据由一人记录，而另一人将肢浸至标记的区域。
血浆蛋白测定：在手术前抽血，离心，分离血清，结束时进行总蛋白质和 比较。
肢重量比较：在抽血后，动物准备组织收集。用铡刀截肢，然后在结扎处切下实验组和对照组腿，并称重。在胫-跟骨关节脱落时进行第二次称重，并称重足部。
组织学制备：切下位于膝(腘)区之后的横肌，并排列于金属模子中，充满freezeGel，在冷甲基丁醇中浸泡，在-80EC下置于标记的样品袋中，直到切片。切片后，在荧光显微镜下观察肌肉的淋巴管。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
实施例52.构建体的产生和METH 1的表达
利用本领域周知的方法产生了两种构建体，其在C端含有一个与全长METH 1基因融合的Flag肽序列或人IgGI Fc域。该构建体命名为pFlag-CMV-5a：METH 1(ID 822)，分配为pC4Fc：METH 1(ID 821)。
对于pFlag-CMV-5a：METH 1使用下列引物：
5′：AAGAATGCGGCCGCAGCCACCATGGGGAACGCGGAGCGGGCTCC(SEQ ID NO：128)
3′：GATCGCGGTACCACTGCATTCTGCCATTGTGCAAAAGTCTATG(SEQ ID NO：129)
METH 1利用所述引物扩增，并用Asp718消化。载体pFLAGCMV-5a也用Asp718消化。得到的限制产物连接在一起。
对于pC4Fc：METH 1使用下列引物：
5′：GATCTATGATCAGCCACCATGGGGAACGCGGAGCGGGCTCC(SEQ ID NO：130)
3′：GACTGCTCTAGAACTGCATTCTGCCATTGTGCAAAAGTCTATG(SEQ ID NO：131)
METH 1利用所述引物扩增，并用BelI和Xba消化。载体pC4Fc也用BelI和Xba消化。得到的限制产物连接在一起。
也能制备构建体pA2gp：METH 1(H542-Q894).Fc和pA2gp：METH 1(H542-Q894)。
同样，利用下列引物可制备pC4Fc：Meth1.Ml-P799：
5′引物：GATCTA TGATCA GCCACCATGGGGAACGCGGAGCGGGCTCC(SEQ ID NO：132)
3’引物：GCGTGC TCTAGA AGGGCTAAAGCTGCGAATTC(SEQ ID NO：133)
METH 1利用所述引物扩增，并用BelI和Xba消化。载体pC4Fc也用BelI和Xba消化，并与消化的METH 1片段连接。
pFLAG-CMV-l：Meth1.F236-E614能利用下列引物制备：
5′引物：GTACCC AAGCTT TTTGTGTCCAGTCACCGC(SEQ IDNO：134)
3′引物：GCGTGC TCTAGA TTACTCGTTGTGTGCTTCAC(SEQID NO：135)
METH 1利用所述引物扩增并用HindIII和Xba消化。载体pFLAG-CMV-1也用HindIII和Xba消化，并与消化的METH 1片段连接。
为了证实METH 1的抗血管生成活性，制备构建体。将全长METH 1基因PCR克隆到pC4Fc和pFlagCMV5a载体中。获得pC4Fc：METH 1和pFLAGCMV5a：METH 1，并且序列得到证实。
293T细胞的瞬时转染用lipofectamine plus(LTI)试剂进行，并在无血清条件下持续生产。用抗-huFc Ab或抗-Flag M2 Ab进行Western分析。METH 1-Fc条件培养基显示不同强度的至少5条带。它们的估计的分子量是130-140kD(弱)、110-120kD(弱)、52kD(强)、45-48kD(强)和32-35kD(最强)。也可检测到大约60和90kD的两条较弱的带。METH1-Flag条件培养基显示相同强度的三条主要带。它们大约100-110kD、70-80kD和22kD。METH 1-Fc对293T细胞的瞬时转染。如上所述在含1％血清的培养基中生产第二批METH 1-Fc蛋白。
在第5.5天瞬时转染的细胞的条件培养基过蛋白A柱并洗脱。在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE检查含蛋白质的级分，并用考马斯蓝染色。也制备第二种凝胶进行N端序列分析。
回收197μg蛋白质，其在还原条件下证明有4条带。其中三条带强，一条带弱。这些条带的N端测序提示，两条带含有带封闭N端的蛋白质。在两条给出序列的带中，一条是Fc-衍生的片段，另一条是从L800开始的METH 1.Fc融合体的切割产物(含有两个血小板反应蛋白样结构域)。这提示，METH 1具有至少两个切割位点(也许更多)，因为在蛋白A柱上只能纯化仍与Fc片段连接的C端片段。
转染的293T细胞在含有1％透析的、低IgG、胎牛血清的培养基中培养，以试图减少重组分泌蛋白的蛋白水解。纯化和分析如上所述。蛋白质的产率显著高于第一批，这可能反映了培养基中血清的作用。尽管血清可能延缓某些处理，但大多数蛋白质在还原凝胶中仍保持大约31kD。
在还原条件下对溶解带的N-端测序表明，该蛋白质在METH 1的950个残基的L800处加工，该位点的N端也许发生另一种可能的切割。发现的酶切位点被认为是异常的，因为它在一个Pro之后。总共分离到197.4μg蛋白质(HG12100-D293T1)。对flag蛋白(pFlag-CMV-5a：METH 1)(在Western印迹中至少由三条带组成(120、97和21Kd))的分析表明，只能证实一条带(21kd)是METH 1，其它带是非METH 1来源的。
由于对纯化的METH 1 Fc蛋白的测序提示一个异常的切割位点，所以用在1％FBS中生长的细胞制备第二批METH 1 Fc，以便可能地抑制不希望的加工。对产物的初步估计提示培养基改变不引起加工差异，但蛋白质产量提高。
进行最初Fc和Flag蛋白上清液的功能分析，包括人微血管内皮细胞(HMVEC)的增殖和利用牛主动脉内皮细胞(BAECs)的体外索形成。增殖测定表明，两种培养上清液都引起HMVEC增殖的速率提高，这可归因于条件培养基的高背景刺激。在两个独立的实验中Fc和Flag上清液的索形成测定表明，相对于培养基/胶原蛋白对照，索形成受到抑制。
实施例53：METH 1的体外活性
增殖
在alamar蓝测定中用HMVEC确定METH 1上清液是否具有功能抗血管生成活性，这可根据EC增殖的抑制来检测。用FGF-2作为增殖的初级刺激物，培养上清液以1∶4终稀释度使用。增殖测定表明两种培养上清液都引起HMVEC增殖速率显著提高，这可归因于条件培养基的高背景刺激。使用纯化的蛋白质应能减少或消除这一问题。
索形成
向内皮细胞中加入可溶性I型胶原蛋白和合适的生长因子将诱导管样结构或内皮细胞索在培养物中的产生，这包括内皮细胞的迁移和与这些结构无关的细胞的选择性缺失(凋亡)。在与1∶4稀释的含METH 1-Fc和METH 1-Flag的培养上清液培养时，用牛主动脉内皮细胞(BAEC)检测稳定索形成的抑制。索形成的定性估计表明所测上清液相对于胶原蛋白处理的对照受到抑制。然而，不匹配的条件培养基对照也引起索形成的抑制，提示非特异性细胞毒性也可引起观察到的抑制。
该实施例所述的研究检测METH 1和/或METH 2蛋白的活性。然而，本领域技术人员能轻易地修改所例举的研究，来检测METH 1和/或METH 2多核苷酸(例如，基因治疗)、METH 1和/或METH 2的激动剂和/或拮抗剂的活性。
应当清楚，本发明可以与以上说明书和实施例具体描述的不同地实施。
根据以上所述，本发明的许多修改和变化是可能的，因此也在附加权利要求书的范围之内。
此处引用的所有公开文本(包括专利、专利申请、杂交文章、实验室手册、书或其它文件)的全部内容在此引用作为参考。
1997年4月24日申请的美国申请号08/845,496；1998年1月23日申请的美国申请号60/072,298；1998年8月28日申请的美国申请号60/098,539；1999年1月22日申请的美国申请号09/235,810；1999年5月25日申请的美国申请号09/318,208；1999年7月20日申请的美国临时申请号60/144,882；1999年8月10日申请的美国临时申请号60/147,823；和1999年8月13日申请的美国申请号09/373,658的全部内容在此引用作为参考。
应当清楚除以上描述和实施例之外，本发明还可以其它方式实施。
根据上文教导，可以对本发明进行多种修饰和改变，因此，它们也在附加的权利要求范围内。
此处引用的所有出版物的全部内容(包括专利、专利申请、期刊杂志、实验室手册、书或其他文件)均收编作为参考。
                          序列表
                          序列表
<110> Human Genome Sciences，Inc.
      SmithKline Beecham Corporation
      Beth Israel Deaconess Medical Center
      Iruela-Arispe，Luisa
      Hastings，Gregg A.
      Ruben，Steven M.
      Jonak，Zdenka L.
      Trulli，Stephen H.
      Fornwald，James A.
      Terrett，Jonathan A.
<120> Meth1和Meth2多核苷酸和多肽
<130> 1488.107PCOA
<140>
<141>
<150> 60/183,792
<151> 2000-02-22
<150> 60/171,503
<151> 1999-12-22
<150> 09/373,658
<151> 1999-08-13
<150> 60/147,823
<151> 1999-08-10
<150> 60/144,882
<151> 1999-07-20
<150> 09/318,208
<151> 1999-05-25
<160> 135
<170> PatentIn Ver.2.0
<210> 1
<211> 3261
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2853)
<220>
<221> 不确定
<222> (3095)
<223> 可以为任一核酸
<220>
<221> 不确定
<222> (3248)
<223> 可以为任一核酸
<220>
<221> 不确定
<222> (3255)
<223> 可以为任一核酸
<220>
<221> 不确定
<222> (3261)
<223> 可以为任一核酸
<400> 1
atg ggg aac gcg gag cgg gct ccg ggg tct cgg agc ttt ggg ccc gta    48
Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser Arg Ser Phe Gly Pro Val
  1               5                  10                  15
ccc acg ctg ctg ctg ctc gcc gcg gcg cta ctg gcc gtg tcg gac gca    96
Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ala Val Ser Asp Ala
             20                  25                  30
ctc ggg cgc ccc tcc gag gag gac gag gag cta gtg gtg ccg gag ctg    144
Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu Leu Val Val Pro Glu Leu
         35                  40                  45
gag cgc gcc ccg gga cac ggg acc acg cgc ctc cgc ctg cac gcc ttt    192
Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg Leu Arg Leu His Ala Phe
     50                  55                  60
gac cag cag ctg gat ctg gag ctg cgg ccc gac agc agc ttt ttg gcg    240
Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro Asp Ser Ser Phe Leu Ala
 65                  70                  75                  80
ccc ggc ttc acg ctc cag aac gtg ggg cgc aaa tcc ggg tcc gag acg    288
Pro Gly Phe Thr Leu Gln Asn Val Gly Arg Lys Ser Gly Ser Glu Thr
                 85                  90                  95
ccg ctt ccg gaa acc gac ctg gcg cac tgc ttc tac tcc ggc acc gtg    336
Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys Phe Tyr Ser Gly Thr Val
            100                 105                 110
aat ggc gat ccc agc tcg gct gcc gcc ctc agc ctc tgc gag ggc gtg    384
Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Glu Gly Val
        115                 120                 125
cgc ggc gcc ttc tac ctg ctg ggg gag gcg tat ttc atc cag ccg ctg    432
Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala Tyr Phe Ile Gln Pro Leu
    130                 135                 140
ccc gcc gcc agc gag cgc ctc gcc acc gcc gcc cca ggg gag aag ccg    480
Pro Ala Ala Ser Glu Arg Leu Ala Thr Ala Ala Pro Gly Glu Lys Pro
145                 150                 155                 160
ccg gca cca cta cag ttc cac ctc ctg cgg cgg aat cgg cag ggc gac     528
Pro Ala Pro Leu Gln Phe His Leu Leu Arg Arg Asn Arg Gln Gly Asp
                165                 170                 175
gta ggc ggc acg tgc ggg gtc gtg gac gac gag ccc cgg ccg act ggg     576
Val Gly Gly Thr Cys Gly Val Val Asp Asp Glu Pro Arg Pro Thr Gly
            180                 185                 190
aaa gcg gag acc gaa gac gag gac gaa ggg act gag ggc gag gac gaa     624
Lys Ala Glu Thr Glu Asp Glu Asp Glu Gly Thr Glu Gly Glu Asp Glu
        195                 200                 205
ggg cct cag tgg tcg ccg cag gac ccg gca ctg caa ggc gta gga cag     672
Gly Pro Gln Trp Ser Pro Gln Asp Pro Ala Leu Gln Gly Val Gly Gln
    210                 215                 220
ccc aca gga act gga agc ata aga aag aag cga ttt gtg tcc agt cac     720
Pro Thr Gly Thr Gly Ser Ile Arg Lys Lys Arg Phe Val Ser Ser His
225                 230                 235                 240
cgc tat gtg gaa acc atg ctt gtg gca gac cag tcg atg gca gaa ttc     768
Arg Tyr Val Glu Thr Met Leu Val Ala Asp Gln Ser Met Ala Glu Phe
                245                 250                 255
cac ggc agt ggt cta aag cat tac ctt ctc acg ttg ttt tcg gtg gca     816
His Gly Ser Gly Leu Lys His Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Ser Val Ala
            260                 265                 270
gcc aga ttg tac aaa cac ccc agc att cgt aat tca gtt agc ctg gtg     864
Ala Arg Leu Tyr Lys His Pro Ser Ile Arg Asn Ser Val Ser Leu Val
        275                 280                 285
gtg gtg aag atc ttg gtc atc cac gat gaa cag aag ggg ccg gaa gtg     912
Val Val Lys Ile Leu Val Ile His Asp Glu Gln Lys Gly Pro Glu Val
    290                 295                 300
acc tcc aat gct gcc ctc act ctg cgg aac ttt tgc aac tgg cag aag     960
Thr Ser Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Lys
305                 310                 315                 320
cag cac aac cca ccc agt gac cgg gat gca gag cac tat gac aca gca     1008
Gln His Asn Pro Pro Ser Asp Arg Asp Ala Glu His Tyr Asp Thr Ala
                325                 330                 335
att ctt ttc acc aga cag gac ttg tgt ggg tcc cag aca tgt gat act     1056
Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Ser Gln Thr Cys Asp Thr
            340                 345                 350
ctt ggg atg gct gat gtt gga act gtg tgt gat ccg agc aga agc tgc     1104
Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp Pro Ser Arg Ser Cys
        355                 360                 365
tcc gtc ata gaa gat gat ggt tta caa gct gcc ttc acc aca gcc cat    1152
Ser Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ala Ala Phe Thr Thr Ala His
    370                 375                 380
gaa tta ggc cac gtg ttt aac atg cca cat gat gat gca aag cag tgt    1200
Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp Asp Ala Lys Gln Cys
385                 390                 395                 400
gcc agc ctt aat ggt gtg aac cag gat tcc cac atg atg gcg tca atg    1248
Ala Ser Leu Asn Gly Val Asn Gln Asp Ser His Met Met Ala Ser Met
                405                 410                 415
ctt tcc aac ctg gac cac agc cag cct tgg tct cct tgc agt gcc tac    1296
Leu Ser Asn Leu Asp His Ser Gln Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Tyr
            420                 425                 430
atg att aca tca ttt ctg gat aat ggt cat ggg gaa tgt ttg atg gac    1344
Met Ile Thr Ser Phe Leu Asp Asn Gly His Gly Glu Cys Leu Met Asp
        435                 440                 445
aag cct cag aat ccc ata cag ctc cca ggc gat ctc cct ggc acc tcg    1392
Lys Pro Gln Asn Pro Ile Gln Leu Pro Gly Asp Leu Pro Gly Thr Ser
    450                 455                 460
tac gat gcc aac cgg cag tgc cag ttt aca ttt ggg gag gac tcc aaa    1440
Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Cys Gln Phe Thr Phe Gly Glu Asp Ser Lys
465                 470                 475                 480
cac tgc cct gat gca gcc agc aca tgt agc acc ttg tgg tgt acc ggc    1488
His Cys Pro Asp Ala Ala Ser Thr Cys Ser Thr Leu Trp Cys Thr Gly
                485                 490                 495
acc tct ggt ggg gtg ctg gtg tgt caa acc aaa cac ttc ccg tgg gcg    1536
Thr Ser Gly Gly Val Leu Val Cys Gln Thr Lys His Phe Pro Trp Ala
            500                 505                 510
gat ggc acc agc tgt gga gaa ggg aaa tgg tgt atc aac ggc aag tgt    1584
Asp Gly Thr Ser Cys Gly Glu Gly Lys Trp Cys Ile Asn Gly Lys Cys
        515                 520                 525
gtg aac aaa acc gac aga aag cat ttt gat acg cct ttt cat gga agc    1632
Val Asn Lys Thr Asp Arg Lys His Phe Asp Thr Pro Phe His Gly Ser
    530                 535                 540
tgg gga atg tgg ggg cct tgg gga gac tgt tcg aga acg tgc ggt gga    1680
Trp Gly Met Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly
545                 550                 555                 560
gga gtc cag tac acg atg agg gaa tgt gac aac cca gtc cca aag aat    1728
Gly Val Gln Tyr Thr Met Arg Glu Cys Asp Asn Pro Val Pro Lys Asn
                565                 570                 575
gga ggg aag tac tgt gaa ggc aaa cga gtg cgc tac aga tcc tgt aac    1776
Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Lys Arg Val Arg Tyr Arg Ser Cys Asn
            580                 585                 590
ctt gag gac tgt cca gac aat aat gga aaa acc ttt aga gag gaa caa    1824
Leu Glu Asp Cys Pro Asp Asn Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Glu Gln
        595                 600                 605
tgt gaa gca cac aac gag ttt tca aaa gct tcc ttt ggg agt ggg cct    1872
Cys Glu Ala His Asn Glu Phe Ser Lys Ala Ser Phe Gly Ser Gly Pro
    610                 615                 620
gcg gtg gaa tgg att ccc aag tac gct ggc gtc tca cca aag gac agg    1920
Ala Val Glu Trp Ile Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Lys Asp Arg
625                 630                 635                 640
tgc aag ctc atc tgc caa gcc aaa ggc att ggc tac ttc ttc gtt ttg    1968
Cys Lys Leu Ile Cys Gln Ala Lys Gly Ile Gly Tyr Phe Phe Val Leu
                645                 650                 655
cag ccc aag gtt gta gat ggt act cca tgt agc cca gat tcc acc tct    2016
Gln Pro Lys Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Thr Ser
            660                 665                 670
gtc tgt gtg caa gga cag tgt gta aaa gct ggt tgt gat cgc atc ata    2064
Val Cys Val Gln Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile
        675                 680                 685
gac tcc aaa aag aag ttt gat aaa tgt ggt gtt tgc ggg gga aat gga    2112
Asp Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asn Gly
    690                 695                 700
tct act tgt aaa aaa ata tca gga tca gtt act agt gca aaa cct gga    2160
Ser Thr Cys Lys Lys Ile Ser Gly Ser Val Thr Ser Ala Lys Pro Gly
705                 710                 715                 720
tat cat gat atc atc aca att cca act gga gcc acc aac atc gaa gtg    2208
Tyr His Asp Ile Ile Thr Ile Pro Thr Gly Ala Thr Asn Ile Glu Val
                725                 730                 735
aaa cag cgg aac cag agg gga tcc agg aac aat ggc agc ttt ctt gcc    2256
Lys Gln Arg Asn Gln Arg Gly Ser Arg Asn Asn Gly Ser Phe Leu Ala
            740                 745                 750
atc aaa gct gct gat ggc aca tat att ctt aat ggt gac tac act ttg    2304
Ile Lys Ala Ala Asp Gly Thr Tyr Ile Leu Asn Gly Asp Tyr Thr Leu
        755                 760                 765
tcc acc tta gag caa gac att atg tac aaa ggt gtt gtc ttg agg tac    2352
Ser Thr Leu Glu Gln Asp Ile Met Tyr Lys Gly Val Val Leu Arg Tyr
    770                 775                 780
agc ggc tcc tct gcg gca ttg gaa aga att cgc agc ttt agc cct ctc    2400
Ser Gly Ser Ser Ala Ala Leu Glu Arg Ile Arg Ser Phe Ser Pro Leu
785                 790                 795                 800
aaa gag ccc ttg acc atc cag gtt ctt act gtg ggc aat gcc ctt cga    2448
Lys Glu Pro Leu Thr Ile Gln Val Leu Thr Val Gly Asn Ala Leu Arg
                805                 810                 815
cct aaa att aaa tac acc tac ttc gta aag aag aag aag gaa tct ttc    2496
Pro Lys Ile Lys Tyr Thr Tyr Phe Val Lys Lys Lys Lys Glu Ser Phe
            820                 825                 830
aat gct atc ccc act ttt tca gca tgg gtc att gaa gag tgg ggc gaa    2544
Asn Ala Ile Pro Thr Phe Ser Ala Trp Val Ile Glu Glu Trp Gly Glu
        835                 840                 845
tgt tct aag tca tgt gaa ttg ggt tgg cag aga aga ctg gta gaa tgc    2592
Cys Ser Lys Ser Cys Glu Leu Gly Trp Gln Arg Arg Leu Val Glu Cys
    850                 855                 860
cga gac att aat gga cag cct gct tcc gag tgt gca aag gaa gtg aag    2640
Arg Asp Ile Asn Gly Gln Pro Ala Ser Glu Cys Ala Lys Glu Val Lys
865                 870                 875                 880
cca gcc agc acc aga cct tgt gca gac cat ccc tgc ccc cag tgg cag    2688
Pro Ala Ser Thr Arg Pro Cys Ala Asp His Pro Cys Pro Gln Trp Gln
                885                 890                 895
ctg ggg gag tgg tca tca tgt tct aag acc tgt ggg aag ggt tac aaa    2736
Leu Gly Glu Trp Ser Ser Cys Ser Lys Thr Cys Gly Lys Gly Tyr Lys
            900                 905                 910
aaa aga agc ttg aag tgt ctg tcc cat gat gga ggg gtg tta tct cat    2784
Lys Arg Ser Leu Lys Cys Leu Ser His Asp Gly Gly Val Leu Ser His
        915                 920                 925
gag agc tgt gat cct tta aag aaa cct aaa cat ttc ata gac ttt tgc    2832
Glu Ser Cys Asp Pro Leu Lys Lys Pro Lys His Phe Ile Asp Phe Cys
    930                 935                 940
aca atg gca gaa tgc agt taa gtggtttaag tggtgttagc tttgaggcaa       2883
Thr Met Ala Glu Cys Ser
945                 950
ggcaaagtga ggaagggctg gtgcagggaa agcaagaagg ctggagggat ccagcgtatc  2943
ttgccagtaa ccagtgaggt gtatcagtaa ggtgggatta tgggggtaga tagaaaagga  3003
gttgaatcat cagagtaaac tgccagttgc aaatttgata ggatagttag tgaggattat  3063
taacctctga gcagtgatat agcataataa anccccgggc attattatta ttatttcttt  3123
tgttacatct attacaagtt tagaaaaaac aaagcaattg tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa  3183
aaaaaaaaaa aaagggcggc cgctctagag gatccctcga ggggcccaag cttacgcgtg  3243
catgntgtca tnagtctn                                                3261
<210> 2
<211> 950
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser Arg Ser Phe Gly Pro Val
  1               5                  10                  15
Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ala Val Ser Asp Ala
             20                  25                  30
Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu Leu Val Val Pro Glu Leu
         35                  40                  45
Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg Leu Arg Leu His Ala Phe
     50                  55                  60
Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro Asp Ser Ser Phe Leu Ala
 65                  70                  75                  80
Pro Gly Phe Thr Leu Gln Asn Val Gly Arg Lys Ser Gly Ser Glu Thr
                 85                  90                  95
Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys Phe Tyr Ser Gly Thr Val
            100                 105                 110
Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Glu Gly Val
        115                 120                 125
Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala Tyr Phe Ile Gln Pro Leu
    130                 135                 140
Pro Ala Ala Ser Glu Arg Leu Ala Thr Ala Ala Pro Gly Glu Lys Pro
145                 150                 155                 160
Pro Ala Pro Leu Gln Phe His Leu Leu Arg Arg Asn Arg Gln Gly Asp
                165                 170                 175
Val Gly Gly Thr Cys Gly Val Val Asp Asp Glu Pro Arg Pro Thr Gly
            180                 185                 190
Lys Ala Glu Thr Glu Asp Glu Asp Glu Gly Thr Glu Gly Glu Asp Glu
        195                 200                 205
Gly Pro Gln Trp Ser Pro Gln Asp Pro Ala Leu Gln Gly Val Gly Gln
    210                 215                 220
Pro Thr Gly Thr Gly Ser Ile Arg Lys Lys Arg Phe Val Ser Ser His
225                 230                 235                 240
Arg Tyr Val Glu Thr Met Leu Val Ala Asp Gln Ser Met Ala Glu Phe
                245                 250                 255
His Gly Ser Gly Leu Lys His Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Ser Val Ala
            260                 265                 270
Ala Arg Leu Tyr Lys His Pro Ser Ile Arg Asn Ser Val Ser Leu Val
        275                 280                 285
Val Val Lys Ile Leu Val Ile His Asp Glu Gln Lys Gly Pro Glu Val
    290                 295                 300
Thr Ser Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Lys
305                 310                 315                 320
Gln His Asn Pro Pro Ser Asp Arg Asp Ala Glu His Tyr Asp Thr Ala
                325                 330                 335
Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Ser Gln Thr Cys Asp Thr
            340                 345                 350
Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp Pro Ser Arg Ser Cys
        355                 360                 365
Ser Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ala Ala Phe Thr Thr Ala His
    370                 375                 380
Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp Asp Ala Lys Gln Cys
385                 390                 395                 400
Ala Ser Leu Asn Gly Val Asn Gln Asp Ser His Met Met Ala Ser Met
                405                 410                 415
Leu Ser Asn Leu Asp His Ser Gln Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Tyr
            420                 425                 430
Met Ile Thr Ser Phe Leu Asp Asn Gly His Gly Glu Cys Leu Met Asp
        435                 440                 445
Lys Pro Gln Asn Pro Ile Gln Leu Pro Gly Asp Leu Pro Gly Thr Ser
    450                 455                 460
Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Cys Gln Phe Thr Phe Gly Glu Asp Ser Lys
465                 470                 475                 480
His Cys Pro Asp Ala Ala Ser Thr Cys Ser Thr Leu Trp Cys Thr Gly
                485                 490                 495
Thr Ser Gly Gly Val Leu Val Cys Gln Thr Lys His Phe Pro Trp Ala
            500                 505                 510
Asp Gly Thr Ser Cys Gly Glu Gly Lys Trp Cys Ile Asn Gly Lys Cys
        515                 520                 525
Val Asn Lys Thr Asp Arg Lys His Phe Asp Thr Pro Phe His Gly Ser
    530                 535                 540
Trp Gly Met Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly
545                 550                 555                 560
Gly Val Gln Tyr Thr Met Arg Glu Cys Asp Asn Pro Val Pro Lys Asn
                565                 570                 575
Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Lys Arg Val Arg Tyr Arg Ser Cys Asn
            580                 585                 590
Leu Glu Asp Cys Pro Asp Asn Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Glu Gln
        595                 600                 605
Cys Glu Ala His Asn Glu Phe Ser Lys Ala Ser Phe Gly Ser Gly Pro
    610                 615                 620
Ala Val Glu Trp Ile Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Lys Asp Arg
625                 630                 635                 640
Cys Lys Leu Ile Cys Gln Ala Lys Gly Ile Gly Tyr Phe Phe Val Leu
                645                 650                 655
Gln Pro Lys Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Thr Ser
            660                 665                 670
Val Cys Val Gln Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile
        675                 680                 685
Asp Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asn Gly
    690                 695                 700
Ser Thr Cys Lys Lys Ile Ser Gly Ser Val Thr Ser Ala Lys Pro Gly
705                 710                 715                 720
Tyr His Asp Ile Ile Thr Ile Pro Thr Gly Ala Thr Asn Ile Glu Val
                725                 730                 735
Lys Gln Arg Asn Gln Arg Gly Ser Arg Asn Asn Gly Ser Phe Leu Ala
            740                 745                 750
Ile Lys Ala Ala Asp Gly Thr Tyr Ile Leu Asn Gly Asp Tyr Thr Leu
        755                 760                 765
Ser Thr Leu Glu Gln Asp Ile Met Tyr Lys Gly Val Val Leu Arg Tyr
    770                 775                 780
Ser Gly Ser Ser Ala Ala Leu Glu Arg Ile Arg Ser Phe Ser Pro Leu
785                 790                 795                 800
Lys Glu Pro Leu Thr Ile Gln Val Leu Thr Val Gly Asn Ala Leu Arg
                805                 810                 815
Pro Lys Ile Lys Tyr Thr Tyr Phe Val Lys Lys Lys Lys Glu Ser Phe
            820                 825                 830
Asn Ala Ile Pro Thr Phe Ser Ala Trp Val Ile Glu Glu Trp Gly Glu
        835                 840                 845
Cys Ser Lys Ser Cys Glu Leu Gly Trp Gln Arg Arg Leu Val Glu Cys
    850                 855                 860
Arg Asp Ile Asn Gly Gln Pro Ala Ser Glu Cys Ala Lys Glu Val Lys
865                 870                 875                 880
Pro Ala Ser Thr Arg Pro Cys Ala Asp His Pro Cys Pro Gln Trp Gln
                885                 890                 895
Leu Gly Glu Trp Ser Ser Cys Ser Lys Thr Cys Gly Lys Gly Tyr Lys
            900                 905                 910
Lys Arg Ser Leu Lys Cys Leu Ser His Asp Gly Gly Val Leu Ser His
        915                 920                 925
Glu Ser Cys Asp Pro Leu Lys Lys Pro Lys His Phe Ile Asp Phe Cys
    930                 935                 940
Thr Met Ala Glu Cys Ser
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<211> 3008
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<220>
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<220>
<221> 不确定
<222> (2957)
<223> 可以为任一核酸
<220>
<221> 不确定
<222> (2970)
<223> 可以为任一核酸
<220>
<221> 不确定
<222> (2981)
<223> 可以为任一核酸
<400> 3
atg ttc ccc gcc ccc gcc gcc ccc cgg tgg ctt ccg ttc ctg ctg ctg    48
Met Phe Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Trp Leu Pro Phe Leu Leu Leu
  1               5                  10                  15
ctg ctg ctg ctg ctg ctg ccg ctg gcc cgc ggc gcc ccg gcc cgg ccc    96
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Arg Gly Ala Pro Ala Arg Pro
             20                  25                  30
gca gcc ggg ggg cag gcc tcg gag ctg gtg gtg ccc acg cgg ttg ccc    144
Ala Ala Gly Gly Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Pro Thr Arg Leu Pro
         35                  40                  45
ggc agc gcg ggc gag ctc gcg ctc cac ctg tcc gcc ttc ggc aag ggc    192
Gly Ser Ala Gly Glu Leu Ala Leu His Leu Ser Ala Phe Gly Lys Gly
     50                  55                  60
ttc gtg ttg cgc ctg gcg ccc gac gac agc ttc ctg gcg ccc gag ttc    240
Phe Val Leu Arg Leu Ala Pro Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro Glu Phe
 65                  70                  75                  80
aag atc gag cgc ctc ggg ggc tcc ggc cgg gcg acc ggg ggc gag cgg    288
Lys Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ala Thr Gly Gly Glu Arg
                 85                  90                  95
ggg ctg cgc ggc tgt ttt ttt tcc ggc acc gtg aat ggg gag ccc gag    336
Gly Leu Arg Gly Cys Phe Phe Ser Gly Thr Val Asn Gly Glu Pro Glu
            100                 105                 110
tcg ctg gcg gcg gtc agc ctg tgc cgc ggg ctg agc ggc tcc ttc ctg    384
Ser Leu Ala Ala Val Ser Leu Cys Arg Gly Leu Ser Gly Ser Phe Leu
        115                 120                 125
ctg gac ggc gag gag ttc acc atc cag ccg cag ggc gcg ggg ggc tcc    432
Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Ile Gln Pro Gln Gly Ala Gly Gly Ser
    130                 135                 140
ctg gct cag ccg cac cgc ctg cag cgc tgg ggt ccc gcc gga gcc cgc    480
Leu Ala Gln Pro His Arg Leu Gln Arg Trp Gly Pro Ala Gly Ala Arg
145                 150                 155                 160
ccc ctc ccg cga gga ccc gag tgg gag gtg gag acg gga gag ggt cag     528
Pro Leu Pro Arg Gly Pro Glu Trp Glu Val Glu Thr Gly Glu Gly Gln
                165                 170                 175
agg cag gag aga gga gac cac cag gag gac agc gag gag gag agc caa     576
Arg Gln Glu Arg Gly Asp His Gln Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ser Gln
            180                 185                 190
gaa gag gag gca gaa ggc gct agc gag ccg cca ccg ccc ctg ggg gcc     624
Glu Glu Glu Ala Glu Gly Ala Ser Glu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala
        195                 200                 205
acg agt agg acc aag cgg ttt gtg tct gag gcg cgc ttc gtg gag acg     672
Thr Ser Arg Thr Lys Arg Phe Val Ser Glu Ala Arg Phe Val Glu Thr
    210                 215                 220
ctg ctg gtg gcc gat gcg tcc atg gct gcc ttc tac ggg gcc gac ctg     720
Leu Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Tyr Gly Ala Asp Leu
225                 230                 235                 240
cag aac cac atc ctg acg tta atg tct gtg gca gcc cga atc tac aag     768
Gln Asn His Ile Leu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Arg Ile Tyr Lys
                245                 250                 255
cac ccc agc atc aag aat tcc atc aac ctg atg gtg gta aaa gtg ctg     816
His Pro Ser Ile Lys Asn Ser Ile Asn Leu Met Val Val Lys Val Leu
            260                 265                 270
atc gta gaa gat gaa aaa tgg ggc cca gag gtg tcc gac aat ggg ggg     864
Ile Val Glu Asp Glu Lys Trp Gly Pro Glu Val Ser Asp Asn Gly Gly
        275                 280                 285
ctt aca ctg cgt aac ttc tgc aac tgg cag cgg cgt ttc aac cag ccc     912
Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Arg Arg Phe Asn Gln Pro
    290                 295                 300
agc gac cgc cac cca gag cac tac gac acg gcc atc ctg ctc acc aga     960
Ser Asp Arg His Pro Glu His Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg
305                 310                 315                 320
cag aac ttc tgt ggg cag gag ggg ctg tgt gac acc ctg ggt gtg gca     1008
Gln Asn Phe Cys Gly Gln Glu Gly Leu Cys Asp Thr Leu Gly Val Ala
                325                 330                 335
gac atc ggg acc att tgt gac ccc aac aaa agc tgc tcc gtg atc gag     1056
Asp Ile Gly Thr Ile Cys Asp Pro Asn Lys Ser Cys Ser Val Ile Glu
            340                 345                 350
gat gag ggg ctc cag gcg gcc cac acc ctg gcc cat gaa cta ggg cac     1104
Asp Glu Gly Leu Gln Ala Ala His Thr Leu Ala His Glu Leu Gly His
        355                 360                 365
gtc ctc agc atg ccc cac gac gac tcc aag ccc tgc aca cgg ctc ttc    1152
Val Leu Ser Met Pro His Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Arg Leu Phe
    370                 375                 380
ggg ccc atg ggc aag cac cac gtg atg gca ccg ctg ttc gtc cac ctg    1200
Gly Pro Met Gly Lys His His Val Met Ala Pro Leu Phe Val His Leu
385                 390                 395                 400
aac cag acg ctg ccc tgg tcc ccc tgc agc gcc atg tat ctc aca gag    1248
Asn Gln Thr Leu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Met Tyr Leu Thr Glu
                405                 410                 415
ctt ctg gac ggc ggg cac gga gac tgt ctc ctg gat gcc cct ggt gcg    1296
Leu Leu Asp Gly Gly His Gly Asp Cys Leu Leu Asp Ala Pro Gly Ala
            420                 425                 430
gcc ctg ccc ctc ccc aca ggc ctc ccg ggc cgc atg gcc ctg tac cag    1344
Ala Leu Pro Leu Pro Thr Gly Leu Pro Gly Arg Met Ala Leu Tyr Gln
        435                 440                 445
ctg gac cag cag tgc agg cag atc ttt ggg ccg gat ttc cgc cac tgc    1392
Leu Asp Gln Gln Cys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Asp Phe Arg His Cys
    450                 455                 460
ccc aac acc tct gct cag gac gtc tgc gcc cag ctt tgg tgc cac act    1440
Pro Asn Thr Ser Ala Gln Asp Val Cys Ala Gln Leu Trp Cys His Thr
465                 470                 475                 480
gat ggg gct gag ccc ctg tgc cac acg aag aat ggc agc ctg ccc tgg    1488
Asp Gly Ala Glu Pro Leu Cys His Thr Lys Asn Gly Ser Leu Pro Trp
                485                 490                 495
gct gac ggc acg ccg tgc ggg cct ggg cac ctc tgc tca gaa ggc agc    1536
Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser
            500                 505                 510
tgt cta cct gag gag gaa gtg gag agg ccc aag ccc gtg gta gat gga    1584
Cys Leu Pro Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Val Val Asp Gly
        515                 520                 525
ggc tgg gca ccg tgg gga ccc tgg gga gaa tgt tct cgg acc tgt gga    1632
Gly Trp Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly
    530                 535                 540
gga gga gta cag ttt tca cac cgt gag tgc aag gac ccc gag cct cag    1680
Gly Gly Val Gln Phe Ser His Arg Glu Cys Lys Asp Pro Glu Pro Gln
545                 550                 555                 560
aat gga gga aga tac tgc ctg ggt cgg aga gcc aag tac cag tca tgc    1728
Asn Gly Gly Arg Tyr Cys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Tyr Gln Ser Cys
                565                 570                 575
cac acg gag gaa tgc ccc cct gac ggg aaa agc ttc agg gag cag cag    1776
His Thr Glu Glu Cys Pro Pro Asp Gly Lys Ser Phe Arg Glu Gln Gln
            580                 585                 590
tgt gag aag tat aat gcc tac aat tac act gac atg gac ggg aat ctc    1824
Cys Glu Lys Tyr Asn Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Met Asp Gly Asn Leu
        595                 600                 605
ctg cag tgg gtc ccc aag tat gct ggg gtg tcc ccc cgg gac cgc tgc    1872
Leu Gln Trp Val Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Arg Asp Arg Cys
    610                 615                 620
aag ttg ttc tgc cga gcc cgg ggg agg agc gag ttc aaa gtg ttc gag    1920
Lys Leu Phe Cys Arg Ala Arg Gly Arg Ser Glu Phe Lys Val Phe Glu
625                 630                 635                 640
gcc aag gtg att gat ggc acc ctg tgt ggg cca gaa aca ctg gcc atc    1968
Ala Lys Val Ile Asp Gly Thr Leu Cys Gly Pro Glu Thr Leu Ala Ile
                645                 650                 655
tgt gtc cgt ggc cag tgt gtc aag gcc ggc tgt gac cat gtg gtg gac    2016
Cys Val Arg Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp His Val Val Asp
            660                 665                 670
tcg cct cgg aag ctg gac aaa tgc ggg gtg tgt ggg ggc aaa ggc aac    2064
Ser Pro Arg Lys Leu Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Lys Gly Asn
        675                 680                 685
tcc tgc agg aag gtc tcc ggg tcc ctc acc ccc acc aat tat ggc tac    2112
Ser Cys Arg Lys Val Ser Gly Ser Leu Thr Pro Thr Asn Tyr Gly Tyr
    690                 695                 700
aat gac att gtc acc atc cca gct ggt gcc act aat att gac gtg aag    2160
Asn Asp Ile Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Asn Ile Asp Val Lys
705                 710                 715                 720
cag cgg agc cac ccg ggt gtg cag aac gat ggg aac tac ctg gcg ctg    2208
Gln Arg Ser His Pro Gly Val Gln Asn Asp Gly Asn Tyr Leu Ala Leu
                725                 730                 735
aag acg gct gat ggg cag tac ctg ctc aac ggc aac ctg gcc atc tct    2256
Lys Thr Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ile Ser
            740                 745                 750
gcc ata gag cag gac atc ttg gtg aag ggg acc atc ctg aag tac agc    2304
Ala Ile Glu Gln Asp Ile Leu Val Lys Gly Thr Ile Leu Lys Tyr Ser
        755                 760                 765
ggc tcc atc gcc acc ctg gag cgc ctg cag agc ttc cgg ccc ttg cca    2352
Gly Ser Ile Ala Thr Leu Glu Arg Leu Gln Ser Phe Arg Pro Leu Pro
    770                 775                 780
gag cct ctg aca gtg cag ctc ctg aca gtc cct ggc gag gtc ttc ccc    2400
Glu Pro Leu Thr Val Gln Leu Leu Thr Val Pro Gly Glu Val Phe Pro
785                 790                 795                 800
cca aaa gtc aaa tac acc ttc ttt gtt cct aat gac gtg gac ttt agc    2448
Pro Lys Val Lys Tyr Thr Phe Phe Val Pro Asn Asp Val Asp Phe Ser
                805                 810                 815
atg cag agc agc aaa gag aga gca acc acc aac atc atc cag ccg ctg    2496
Met Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Thr Thr Asn Ile Ile Gln Pro Leu
            820                 825                 830
ctc cac gca cag tgg gtg ctg ggg gac tgg tct gag tgc tct agc acc    2544
Leu His Ala Gln Trp Val Leu Gly Asp Trp Ser Glu Cys Ser Ser Thr
        835                 840                 845
tgc ggg gcc ggc tgg cag agg cga act gta gag tgc agg gac ccc tcc    2592
Cys Gly Ala Gly Trp Gln Arg Arg Thr Val Glu Cys Arg Asp Pro Ser
    850                 855                 860
ggc cag gcc tct gcc acc tgc aac aag gct ctg aaa ccc gag gat gcc    2640
Gly Gln Ala Ser Ala Thr Cys Asn Lys Ala Leu Lys Pro Glu Asp Ala
865                 870                 875                 880
aag ccc tgc gaa agc cag ctg tgc ccc ctg tgattcaggg gggcaggggc      2690
Lys Pro Cys Glu Ser Gln Leu Cys Pro Leu
                885                 890
cagtcttgtg ctcctggaca tgcggtactg aggtgcagac aaggtctcca ctgtggtgac  2750
tgggtccctt ggccatatca aggcagcacg gcccacccag gcctcccatt gccgcaaccc  2810
ctccagtact gcacaaattc ctaaggggga agagaaaagg tatggggcgg caaaacctat  2870
catcaactgt ccawtgnaat ggaacttgct cgggttcaat taaaggcata agttaaagta  2930
aattcattat gatcaacaga cctcacntca tctgttgcan gatacaacta ntaaaaaaaa  2990
aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                                3008
<210> 4
<211> 890
<212> PRT
<213> 人
<400> 4
Met Phe Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Trp Leu Pro Phe Leu Leu Leu
  1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Arg Gly Ala Pro Ala Arg Pro
             20                  25                  30
Ala Ala Gly Gly Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Pro Thr Arg Leu Pro
         35                  40                  45
Gly Ser Ala Gly Glu Leu Ala Leu His Leu Ser Ala Phe Gly Lys Gly
     50                  55                  60
Phe Val Leu Arg Leu Ala Pro Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro Glu Phe
 65                  70                  75                  80
Lys Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ala Thr Gly Gly Glu Arg
                 85                  90                  95
Gly Leu Arg Gly Cys Phe Phe Ser Gly Thr Val Asn Gly Glu Pro Glu
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Ser Leu Ala Ala Val Ser Leu Cys Arg Gly Leu Ser Gly Ser Phe Leu
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Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Ile Gln Pro Gln Gly Ala Gly Gly Ser
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Leu Ala Gln Pro His Arg Leu Gln Arg Trp Gly Pro Ala Gly Ala Arg
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Pro Leu Pro Arg Gly Pro Glu Trp Glu Val Glu Thr Gly Glu Gly Gln
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Arg Gln Glu Arg Gly Asp His Gln Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ser Gln
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Ala Glu Gly Ala Ser Glu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala
        195                 200                 205
Thr Ser Arg Thr Lys Arg Phe Val Ser Glu Ala Arg Phe Val Glu Thr
    210                 215                 220
Leu Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Tyr Gly Ala Asp Leu
225                 230                 235                 240
Gln Asn His Ile Leu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Arg Ile Tyr Lys
                245                 250                 255
His Pro Ser Ile Lys Asn Ser Ile Asn Leu Met Val Val Lys Val Leu
            260                 265                 270
Ile Val Glu Asp Glu Lys Trp Gly Pro Glu Val Ser Asp Asn Gly Gly
        275                 280                 285
Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Arg Arg Phe Asn Gln Pro
    290                 295                 300
Ser Asp Arg His Pro Glu His Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg
305                 310                 315                 320
Gln Asn Phe Cys Gly Gln Glu Gly Leu Cys Asp Thr Leu Gly Val Ala
                325                 330                 335
Asp Ile Gly Thr Ile Cys Asp Pro Asn Lys Ser Cys Ser Val Ile Glu
            340                 345                 350
Asp Glu Gly Leu Gln Ala Ala His Thr Leu Ala His Glu Leu Gly His
        355                 360                 365
Val Leu Ser Met Pro His Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Arg Leu Phe
    370                 375                 380
Gly Pro Met Gly Lys His His Val Met Ala Pro Leu Phe Val His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Gln Thr Leu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Met Tyr Leu Thr Glu
                405                 410                 415
Leu Leu Asp Gly Gly His Gly Asp Cys Leu Leu Asp Ala Pro Gly Ala
            420                 425                 430
Ala Leu Pro Leu Pro Thr Gly Leu Pro Gly Arg Met Ala Leu Tyr Gln
        435                 440                 445
Leu Asp Gln Gln Cys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Asp Phe Arg His Cys
    450                 455                 460
Pro Asn Thr Ser Ala Gln Asp Val Cys Ala Gln Leu Trp Cys His Thr
465                 470                 475                 480
Asp Gly Ala Glu Pro Leu Cys His Thr Lys Asn Gly Ser Leu Pro Trp
                485                 490                 495
Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser
            500                 505                 510
Cys Leu Pro Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Val Val Asp Gly
        515                 520                 525
Gly Trp Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly
    530                 535                 540
Gly Gly Val Gln Phe Ser His Arg Glu Cys Lys Asp Pro Glu Pro Gln
545                 550                 555                 560
Asn Gly Gly Arg Tyr Cys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Tyr Gln Ser Cys
                565                 570                 575
His Thr Glu Glu Cys Pro Pro Asp Gly Lys Ser Phe Arg Glu Gln Gln
            580                 585                 590
Cys Glu Lys Tyr Asn Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Met Asp Gly Asn Leu
        595                 600                 605
Leu Gln Trp Val Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Arg Asp Arg Cys
    610                 615                 620
Lys Leu Phe Cys Arg Ala Arg Gly Arg Ser Glu Phe Lys Val Phe Glu
625                 630                 635                 640
Ala Lys Val Ile Asp Gly Thr Leu Cys Gly Pro Glu Thr Leu Ala Ile
                645                 650                 655
Cys Val Arg Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp His Val Val Asp
            660                 665                 670
Ser Pro Arg Lys Leu Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Lys Gly Asn
        675                 680                 685
Ser Cys Arg Lys Val Ser Gly Ser Leu Thr Pro Thr Asn Tyr Gly Tyr
    690                 695                 700
Asn Asp Ile Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Asn Ile Asp Val Lys
705                 710                 715                 720
Gln Arg Ser His Pro Gly Val Gln Asn Asp Gly Asn Tyr Leu Ala Leu
                725                 730                 735
Lys Thr Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ile Ser
            740                 745                 750
Ala Ile Glu Gln Asp Ile Leu Val Lys Gly Thr Ile Leu Lys Tyr Ser
        755                 760                 765
Gly Ser Ile Ala Thr Leu Glu Arg Leu Gln Ser Phe Arg Pro Leu Pro
    770                 775                 780
Glu Pro Leu Thr Val Gln Leu Leu Thr Val Pro Gly Glu Val Phe Pro
785                 790                 795                 800
Pro Lys Val Lys Tyr Thr Phe Phe Val Pro Asn Asp Val Asp Phe Ser
                805                 810                 815
Met Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Thr Thr Asn Ile Ile Gln Pro Leu
            820                 825                 830
Leu His Ala Gln Trp Val Leu Gly Asp Trp Ser Glu Cys Ser Ser Thr
        835                 840                 845
Cys Gly Ala Gly Trp Gln Arg Arg Thr Val Glu Cys Arg Asp Pro Ser
    850                 855                 860
Gly Gln Ala Ser Ala Thr Cys Asn Lys Ala Leu Lys Pro Glu Asp Ala
865                 870                 875                 880
Lys Pro Cys Glu Ser Gln Leu Cys Pro Leu
                885                 890
<210> 5
<211> 1203
<212> PRT
<213> 牛(Bovine)
<400> 5
Met Asp Pro Pro Ala Gly Ala Ala Gly Arg Leu Leu Cys Pro Ala Leu
  1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Pro Ala Asp Ala Arg Leu Ala Ala
             20                  25                  30
Ala Ala Ala Asp Pro Pro Gly Gly Pro Gln Gly His Gly Ala Glu Arg
         35                  40                  45
Ile Leu Ala Val Pro Val Arg Thr Asp Ala Gln Gly Arg Leu Val Ser
     50                  55                  60
His Val Val Ser Ala Ala Thr Ala Pro Ala Gly Val Arg Thr Arg Arg
 65                  70                  75                  80
Ala Ala Pro Ala Gln Ile Pro Gly Leu Ser Gly Gly Ser Glu Glu Asp
                 85                  90                  95
Pro Gly Gly Arg Leu Phe Tyr Asn Val Thr Val Phe Gly Arg Asp Leu
            100                 105                 110
His Leu Arg Leu Arg Pro Asn Ala Arg Leu Val Ala Pro Gly Ala Thr
        115                 120                 125
Val Glu Trp Gln Gly Glu Ser Gly Ala Thr Arg Val Glu Pro Leu Leu
    130                 135                 140
Gly Thr Cys Leu Tyr Val Gly Asp Val Ala Gly Leu Ala Glu Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Val Ala Leu Ser Asn Cys Asp Gly Leu Ala Gly Leu Ile Arg Met
                165                 170                 175
Glu Glu Glu Glu Phe Phe Ile Glu Pro Leu Glu Lys Gly Leu Ala Ala
            180                 185                 190
Lys Glu Ala Glu Gln Gly Arg Val His Val Val Tyr His Arg Pro Thr
        195                 200                 205
Thr Ser Arg Pro Pro Pro Leu Gly Gln Ala Leu Asp Thr Gly Ile Ser
    210                 215                 220
Ala Asp Ser Leu Asp Ser Leu Ser Arg Ala Leu Gly Val Leu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Arg Val Asn Ser Ser Arg Arg Arg Met Arg Arg His Ala Ala Asp Asp
                245                 250                 255
Asp Tyr Asn Ile Glu Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Ser Val Val Gln
            260                 265                 270
Phe His Gly Thr Glu His Val Gln Lys Tyr Leu Leu Thr Leu Met Asn
        275                 280                 285
Ile Val Asn Glu Ile Tyr His Asp Glu Ser Leu Gly Ala His Ile Asn
    290                 295                 300
Val Val Leu Val Arg Ile Ile Leu Leu Ser Tyr Gly Lys Ser Met Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ile Glu Ile Gly Asn Pro Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val Cys Arg
                325                 330                 335
Trp Ala Tyr Leu Gln Gln Lys Pro Asp Thr Asp His Asp Glu Tyr His
            340                 345                 350
Asp His Ala Ile Phe Leu Thr Arg Gln Asp Phe Gly Pro Ser Gly Met
        355                 360                 365
Gln Gly Tyr Ala Pro Val Thr Gly Met Cys His Pro Val Arg Ser Cys
    370                 375                 380
Thr Leu Asn His Glu Asp Gly Phe Ser Ser Ala Phe Val Val Ala His
385                 390                 395                 400
Glu Thr Gly His Val Leu Gly Met Glu His Asp Gly Gln Gly Asn Arg
                405                 410                 415
Cys Gly Asp Glu Val Arg Leu Gly Ser Ile Met Ala Pro Leu Val Gln
            420                 425                 430
Ala Ala Phe His Arg Phe His Trp Ser Arg Cys Ser Gln Gln Glu Leu
        435                 440                 445
Ser Arg Tyr Leu His Ser Tyr Asp Cys Leu Arg Asp Asp Pro Phe Thr
    450                 455                 460
His Asp Trp Pro Ala Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu His Tyr Ser Met
465                 470                 475                 480
Asn Glu Gln Cys Arg Phe Asp Phe Gly Leu Gly Tyr Met Met Cys Thr
                485                 490                 495
Ala Phe Arg Thr Phe Asp Pro Cys Lys Gln Leu Trp Cys Ser His Pro
            500                 505                 510
Asp Asn Pro Tyr Phe Cys Lys Thr Lys Lys Gly Pro Pro Leu Asp Gly
        515                 520                 525
Thr Met Cys Ala Pro Gly Lys His Cys Phe Lys Gly His Cys Ile Trp
    530                 535                 540
Leu Thr Pro Asp Ile Leu Lys Arg Asp Gly Asn Trp Gly Ala Trp Ser
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gly Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly Thr Gly Val Lys Phe Arg
                565                 570                 575
Thr Arg Gln Cys Asp Asn Pro His Pro Ala Asn Gly Gly Arg Thr Cys
            580                 585                 590
Ser Gly Leu Ala Tyr Asp Phe Gln Leu Cys Asn Ser Gln Asp Cys Pro
        595                 600                 605
Asp Ala Leu Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Cys Arg Gln Trp Asp Leu
    610                 615                 620
Tyr Phe Glu His Gly Asp Ala Gln His His Trp Leu Pro His Glu His
625                 630                 635                 640
Arg Asp Ala Lys Glu Arg Cys His Leu Tyr Cys Glu Ser Lys Glu Thr
                645                 650                 655
Gly Glu Val Val Ser Met Lys Arg Met Val His Asp Gly Thr Arg Cys
            660                 665                 670
Ser Tyr Lys Asp Ala Phe Ser Leu Cys Val Arg Gly Asp Cys Arg Lys
        675                 680                 685
Val Gly Cys Asp Gly Val Ile Gly Ser Ser Lys Gln Glu Asp Lys Cys
    690                 695                 700
Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser His Cys Lys Val Val Lys Gly Thr
705                 710                 715                 720
Phe Ser Arg Ser Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Ile Lys Met Phe Glu Ile
                725                 730                 735
Pro Ala Gly Ala Arg His Leu Leu Ile Gln Glu Ala Asp Thr Thr Ser
            740                 745                 750
His His Leu Ala Val Lys Asn Leu Glu Thr Gly Lys Phe Ile Leu Asn
        755                 760                 765
Glu Glu Asn Asp Val Asp Pro Asn Ser Lys Thr Phe Ile Ala Met Gly
    770                 775                 780
Val Glu Trp Glu Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Thr Leu Gln Thr
785                 790                 795                 800
Met Gly Pro Leu His Gly Thr Ile Thr Val Leu Val Ile Pro Glu Gly
                805                 810                 815
Asp Ala Arg Ile Ser Leu Thr Tyr Lys Tyr Met Ile His Glu Asp Ser
            820                 825                 830
Leu Asn Val Asp Asp Asn Asn Val Leu Glu Asp Asp Ser Val Gly Tyr
        835                 840                 845
Glu Trp Ala Leu Lys Lys Trp Ser Pro Cys Ser Lys Pro Cys Gly Gly
    850                 855                 860
Gly Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Gly Cys Arg Arg Arg Leu Asp His Lys
865                 870                 875                 880
Met Val His Arg Gly Phe Cys Asp Ser Val Ser Lys Pro Lys Ala Ile
                885                 890                 895
Arg Arg Thr Cys Asn Pro Gln Glu Cys Ser Gln Pro Val Trp Val Thr
            900                 905                 910
Gly Glu Trp Glu Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Arg Thr Gly Met Gln
        915                 920                 925
Val Arg Ser Val Arg Cys Val Gln Pro Leu His Asn Asn Thr Thr Arg
    930                 935                 940
Ser Val His Thr Lys His Cys Asn Asp Ala Arg Pro Glu Gly Arg Arg
945                 950                 955                 960
Ala Cys Asn Arg Glu Leu Cys Pro Gly Arg Trp Arg Ala Gly Ser Trp
                965                 970                 975
Ser Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Thr Gln Glu Arg Pro Val
            980                 985                 990
Leu Cys Arg Thr Ala Asp Asp Ser Phe Gly Val Cys Arg Glu Glu Arg
        995                1000                1005
Pro Glu Thr Ala Arg Ile Cys Arg Leu Gly Pro Cys Pro Arg Asn Thr
   1010                1015                1020
Ser Asp Pro Ser Lys Lys Ser Tyr Val Val Gln Trp Leu Ser Arg Pro
1025               1030                1035                1040
Asp Pro Asn Ser Pro Val Gln Glu Thr Ser Ser Lys Gly Arg Cys Gln
               1045                1050                1055
Gly Asp Lys Ser Val Phe Cys Arg Met Glu Val Leu Ser Arg Tyr Cys
           1060                1065                1070
Ser Ile Pro Gly Tyr Asn Lys Leu Cys Cys Lys Ser Cys Asn Pro His
       1075                1080                1085
Asp Asn Leu Thr Asp Val Asp Asp Arg Ala Glu Pro Pro Ser Gly Lys
   1090                1095                1100
His Asn Asp Ile Glu Glu Leu Met Pro Thr Leu Ser Val Pro Thr Leu
1105               1110                1115                1120
Val Met Glu Val Gln Pro Pro Pro Gly Ile Pro Leu Glu Val Pro Leu
               1125                1130                1135
Asn Thr Ser Ser Thr Asn Ala Thr Glu Asp His Pro Glu Thr Asn Ala
           1140                1145                1150
Val Asp Val Pro Tyr Lys Ile Pro Gly Leu Glu Asp Glu Val Gln Pro
       1155                1160                1165
Pro Asn Leu Ile Pro Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Glu Lys Thr Arg Asn
   1170                1175                1180
Gln Arg Ile Gln Glu Leu Ile Asp Glu Met Arg Lys Lys Glu Met Leu
1185               1190                1195                1200
Gly Lys Phe
<210> 6
<211> 50
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Asp Asp Gly Trp Ser Pro Trp Ser Glu Trp Thr Ser Cys Ser Thr Ser
  1               5                  10                  15
Cys Gly Asn Gly Ile Gln Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Ser Leu Asn
             20                  25                  30
Asn Arg Cys Glu Gly Ser Ser Val Gln Thr Arg Thr Cys His Ile Gln
         35                  40                  45
Glu Cys
     50
<210> 7
<211> 57
<212> PRT
<213> 人
<400> 7
Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser Val Thr
  1               5                  10                  15
Cys Gly Asp Gly Val Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys Asn Ser Pro Ser
             20                  25                  30
Pro Gln Met Asn Gly Lys Pro Cys Glu Gly Glu Ala Arg Glu Thr Lys
         35                  40                  45
Ala Cys Lys Lys Asp Ala Cys Pro Ile
     50                  55
<210> 8
<211> 57
<212> PRT
<213> 人
<400> 8
Asn Gly Gly Trp Gly Pro Trp Ser Pro Trp Asp Ile Cys Ser Val Thr
  1               5                  10                  15
Cys Gly Gly Gly Val Gln Lys Arg Ser Arg Leu Cys Asn Asn Pro Thr
             20                  25                  30
Pro Gln Phe Gly Gly Lys Asp Cys Val Gly Asp Val Thr Glu Asn Gln
         35                  40                  45
Ile Cys Asn Lys Gln Asp Cys Pro Ile
     50                  55
<210> 9
<211> 50
<212> PRT
<213> 人
<400> 9
Glu Glu Gly Trp Ser Pro Trp Ala Glu Trp Thr Gln Cys Ser Val Thr
  1               5                  10                  15
Cys Gly Ser Gly Thr Gln Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Val Thr Ser
             20                  25                  30
Asn Thr Cys Leu Gly Pro Ser Ile Gln Thr Arg Ala Cys Ser Leu Ser
         35                  40                  45
Lys Cys
     50
<210> 10
<211> 57
<212> PRT
<213> 人
<400> 10
Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser Val Thr
  1               5                  10                  15
Cys Gly Val Gly Asn Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys Asn Ser Pro Val
             20                  25                  30
Pro Gln Met Gly Gly Lys Asn Cys Lys Gly Ser Gly Arg Glu Thr Lys
         35                  40                  45
Ala Cys Gln Gly Ala Pro Cys Pro Ile
     50                  55
<210> 11
<211> 56
<212> PRT
<213> 人
<400> 11
Asp Gly Arg Trp Ser Pro Trp Ser Pro Trp Ser Ala Cys Thr Val Thr
  1               5                  10                  15
Cys Ala Gly Gly Ile Arg Glu Arg Thr Arg Val Cys Asn Ser Pro Glu
             20                  25                  30
Pro Gln Tyr Gly Gly Lys Ala Cys Val Gly Asp Val Gln Glu Arg Gln
         35                  40                  45
Met Cys Asn Lys Arg Ser Cys Pro
     50                  55
<210> 12
<211> 3974
<212> DNA
<213> 人
<400> 12
ggtacctaag tgagtagggc gtccgatcga cggacgcctt ttttttgaat tcgtaatcat    60
ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag   120
ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg   180
cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa   240
tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca   300
ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg   360
taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc   420
agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc   480
cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac   540
tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc   600
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata   660
gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc   720
acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca   780
acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag   840
cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta   900
gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg   960
gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc  1020
agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt  1080
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcgtcga  1140
caattcgcgc gcgaaggcga agcggcatgc atttacgttg acaccatcga atggtgcaaa  1200
acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg  1260
aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc  1320
cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg  1380
atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg  1440
ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg  1500
gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga  1560
agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg  1620
ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact  1680
aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc  1740
tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa  1800
atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg  1860
cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt  1920
gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg  1980
atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg  2040
ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt  2100
tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg  2160
gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc  2220
tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg  2280
ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga  2340
gcgcaacgca attaatgtaa gttagcgcga attgtcgacc aaagcggcca tcgtgcctcc  2400
ccactcctgc agttcggggg catggatgcg cggatagccg ctgctggttt cctggatgcc  2460
gacggatttg cactgccggt agaactccgc gaggtcgtcc agcctcaggc agcagctgaa  2520
ccaactcgcg aggggatcga gcccggggtg ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg  2580
ctggaggatc atccagccgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa  2640
ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc  2700
gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc  2760
gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc  2820
tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc  2880
cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag  2940
gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg  3000
aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga  3060
ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg  3120
caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc  3180
tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc  3240
cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg  3300
gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg  3360
gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag  3420
cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga  3480
gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga  3540
tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact  3600
ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct  3660
gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt  3720
ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt  3780
cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgttccgct tcctttagca gcccttgcgc  3840
cctgagtgct tgcggcagcg tgaagcttaa aaaactgcaa aaaatagttt gacttgtgag  3900
cggataacaa ttaagatgta cccaattgtg agcggataac aatttcacac attaaagagg  3960
agaaattaca tatg                                                    3974
<210> 13
<211> 112
<212> DNA
<213> 人
<400> 13
aagcttaaaa aactgcaaaa aatagtttga cttgtgagcg gataacaatt aagatgtacc   60
caattgtgag cggataacaa tttcacacat taaagaggag aaattacata tg          112
<210> 14
<211> 542
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> 不确定
<222> (3)
<223> 可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(21)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(22)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(361)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(369)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(407)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(427)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(479)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(482)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(535)
<223>可以为任一核酸
<400>14
gtncgaattt cggcacgaga nnttagacgc cttttcatgg aagctgggga atgtgggggc 60
cttggggaga ctgttcgaga acgtgcggtg gaggagtcca gtacacgatg agggaatgtg 120
acaacccagt cccaaagaat ggagggaagt actgtgaagg caaacgagtg cgctacagat 180
cctgtaacct tgaggactgt ccagacaata atggaaaaac ctttagagag gaacaatgtg 240
aagcacacaa cgagttttca aaagcttcct ttgggagtgg gcctgcggtg gaatggattc 300
ccaagtacgc tggcgtctca ccaaaggaca ggtgcaagtt catgttgcca agccaaaggc 360
nttggctant tctttcgttt tgcagcccaa ggttgttagg tgggtantcc atgttaggcc 420
cagattncac ctttgtctgt gtgcaaggac agtgtgttaa aagttggttg tgatccgcnt 480
cntagattcc aaaaggagtt ttgttaatgt ggtgttttcn gggggaatgg tctantttta 540
aa                                                                542
<210>15
<211>320
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>15
cagagaacat tcgccccact cttcaatgac ccatgctgaa aaagtgggga tagcattgaa  60
agattccttc ttcttcttta cgaagtaggt gtatttaatt ttaggtcgaa gggcattgcc  120
cacagtaaga acctggatgg tcaagggctc tttgagaggg ctaaagctgc gaattctttc  180
caatgccgca gaggagccgc tgtacctcaa gacaacacct ttgtacataa tgtcttgctc  240
taaggtggac aaagtgtagt caccattaag aatatatgtg ccatcagcag ctttgatggc  300
aagaaagctg cccttgttcc                                              320
<210>16
<211>316
<212>DNA
<213>Eimeria tenella
<400>16
aatgccgaga cattaatgga cagcctgctt ccgagtgtgc aaaggaagtg aagccagcca 60
gcaccagacc ttgtgcagac catccctgcc cccagtggca gctgggggag tggtcaacat 120
gttctaagac ctgtgggaag ggttacaaaa aaagaagctt gaagtgtctg tcccatgatg 180
gaggggtgtt atctcatgag agctgtgatc ctttaaagaa acctaaacat ttcatagact 240
tttgcacaat ggcagaatgc agttaagtgg tttaagtggt gttagctttg agggcaaggc 300
aaagtgagga agggct                                                 316
<210>17
<211>383
<212>DNA
<213>Caenorhabditis elegans
<220>
<221>不确定
<222>(160)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(326)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(358)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(366)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(377)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(379)
<223>可以为任一核酸
<400>17
gtcgacccac gcgtccggat ggtactccat gtagcccaga ttccacctct gtctgtgtgc 60
aaggacagtg tgtaaaagct ggttgtgatc gcatcataga ctccaaaaag aagtttgata 120
aatgtggtgt ttgcggggga aatggatcta cttgtaaaan aatatcagga tcagttacta 180
gtgcaaaacc tgggatatca tgatatcatc acaattccaa ctgggagcca ccaacatcga 240
agtgaaacag cggaaccaga ggggatccag ggaacaatgg gcagctttct tgccatcaaa 300
gctgctggat ggcacatata ttcttnaatg gtgactacac tttgtccacc ttagaganag 360
acattntgtg acaaagngnt tgt                                         383
<210>18
<211>404
<212>DNA
<213>Crotalus atrox
<220>
<221>不确定
<222>(21)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(301)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(335)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(373)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(378)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(382)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(383)
<223>可以为任一核酸
<400>18
cccacgcgtc cgcccacggt nccgggactt gtgtgggtcc cagacatgtg atactcttgg  60
gatggctgat gttggaactg tgtgtgatcc gagcagaagc tgctccgtca tagaagatga  120
tggtttacaa gctgccttca ccacagccca tgaattaggc cacgtgttta acatgccaca  180
tgatggatgc aaagcagtgt gccagcctta aatggtgtga accagggatt cccacatgat  240
ggcgtcaatg ctttccaacc tgggaccaca gccagccttg ggtcctcctt gcagtggcct  300
nacatggatt gacatcattt ctgggatgaa tggtncatgg gggaatgttt tgattggaca  360
agccttcaga atnccctnac annttcccag gggttctccc tggg                   404
<210>19
<211>152
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(105)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(122)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(135)
<223>可以为任一核酸
<400>19
atcgtagaag atgaaaaatg gggcccagag gtgtccgaca atggggggct tacactgcgt 60
aacttctgca actggcagcg gcgtttcaac cagcccagcg accgncaccc agagcactac 120
gncacggcca tcctnctcac cagacagaac tt                               152
<210>20
<211>4180
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>20
gcagctccga gctaggtgct atcgcaaggc cagagcgcac agcccggcgg agagagcaga 60
tccttgctca gatcgagtca aatcgggcca aggcggagga cgaagagtcc aggctcctat 120
tctggacttg ttccccagct ccgggggcgc ttctaggtcc tgcagcagcc agcagtgcgg 180
agccaccaac tcggtgctgg aatgaaaaaa ttcccgcgcg ccagtgcaga atctttctaa 240
gtgacccgga gcttcgggtg ctagctctgc acgaactttc ccatcaaagt gatcgtgaat 300
tttaagcatc aggagcaggc cagcgaagct ctacgcgtct aaacgtctat ccagaccaag 360
agttctctgc ggtgcagggt gcggtgccat gcagccaaaa gtcccttttg gggtcacgca 420
agcagaagcc ctgctccgac atgggggacg tccagcgggc agcgagatct cggggctctc 480
tgtccgcaca catgctgttg ctgctcctcg cttccataac aatgctgcta tgtgcgcggg 540
gcgcacacgg gcgccccacg gaggaagatg aggagctggt cctgccctcg ctggagcgcg 600
ccccgggcca cgattccacc accacacgcc ttcgtctgga cgcctttggc cagcagctac 660
atctgaagtt gcagccggac agcggtttct tggcgcctgg cttcaccctg cagactgtgg 720
ggcgcagtcc cgggtccgag gcacaacatc tggaccccac cggggacctg gctcactgct 780
tctactctgg cacggtgaac ggtgatcccg gctctgccgc agccctcagc ctctgtgaag 840
gtgtgcgtgg tgccttctac ctacaaggag aggagttctt cattcagcca gcgcctggag 900
tggccaccga gcgcctggcc cctgccgtgc ccgaggagga gtcatccgca cggccgcagt 960
tccacatcct gaggcgaagg cggcggggca gtggcggcgc caagtgcggc gtcatggacg 1020
acgagaccct gccaaccagc gactcgcgac ccgagagcca gaacacccgg aaccagtggc 1080
ctgtgcggga ccccacgcct caggacgcgg gaaagccatc aggaccagga agcataagga 1140
agaagcgatt tgtgtccagc ccccgttatg tggaaaccat gctcgtagct gaccagtcca 1200
tggccgactt ccacggcagc ggtctaaagc attaccttct aaccctgttc tcggtggcag 1260
ccaggtttta caagcatccc agcattagga attcaattag cctggtggtg gtgaagatct 1320
tggtcatata cgaggagcag aagggaccag aagttacctc caatgcagct ctcacccttc 1380
ggaatttctg cagctggcag aaacaacaca acagccccag tgaccgggat ccagagcact 1440
atgacactgc aattctgttc accagacagg atttatgtgg ctcccacacg tgtgacactc 1500
tcggaatggc agatgttgga accgtatgtg accccagcag gagctgctca gtcatagaag 1560
atgatggttt gcaagccgcc ttcaccacag cccatgaatt gggccatgtg tttaacatgc 1620
cgcacgatga tgctaagcac tgtgccagct tgaatggtgt gagtggcgat tctcatctga 1680
tggcctcgat gctctccagc ttagaccata gccagccctg gtcaccttgc agtgcctaca 1740
tggtcacgtc cttcctagat aatggacacg gggaatgttt gatggacaag ccccagaatc 1800
caatcaagct cccttctgat cttcccggta ccttgtacga tgccaaccgc cagtgtcagt 1860
ttacattcgg agaggaatcc aagcactgcc ctgatgcagc cagcacatgt actaccctgt 1920
ggtgcactgg cacctccggt ggcttactgg tgtgccaaac aaaacacttc ccttgggcag 1980
atggcaccag ctgtggagaa gggaagtggt gtgtcagtgg caagtgcgtg aacaagacag 2040
acatgaagca ttttgctact cctgttcatg gaagctgggg accatgggga ccgtggggag 2100
actgctcaag aacctgtggt ggtggagttc aatacacaat gagagaatgt gacaacccag 2160
tcccaaagaa cggagggaag tactgtgaag gcaaacgagt ccgctacagg tcctgtaaca 2220
tcgaggactg tccagacaat aacggaaaaa cgttcagaga ggagcagtgc gaggcgcaca 2280
atgagttttc caaagcttcc tttgggaatg agcccactgt agagtggaca cccaagtacg 2340
ccggcgtctc gccaaaggac aggtgcaagc tcacctgtga agccaaaggc attggctact 2400
ttttcgtctt acagcccaag gttgtagatg gcactccctg tagtccagac tctacctctg 2460
tctgtgtgca agggcagtgt gtgaaagctg gctgtgatcg catcatagac tccaaaaaga 2520
agtttgataa gtgtggcgtt tgtggaggaa acggttccac atgcaagaag atgtcaggaa 2580
tagtcactag tacaagacct gggtatcatg acattgtcac aattcctgct ggagccacca 2640
acattgaagt gaaacatcgg aatcaaaggg ggtccagaaa caatggcagc tttctggcta 2700
ttagagccgc tgatggtacc tatattctga atggaaactt cactctgtcc acactagagc 2760
aagacctcac ctacaaaggt actgtcttaa ggtacagtgg ttcctcggct gcgctggaaa 2820
gaatccgcag ctttagtcca ctcaaagaac ccttaaccat ccaggttctt atggtaggcc 2880
atgctctccg acccaaaatt aaattcacct actttatgaa gaagaagaca gagtcattca 2940
acgccattcc cacattttct gagtgggtga ttgaagagtg gggggagtgc tccaagacat 3000
gcggctcagg ttggcagaga agagtagtgc agtgcagaga cattaacgga caccctgctt 3060
ccgaatgtgc aaaggaagtg aagccagcca gtaccagacc ttgtgcagac cttccttgcc 3120
cacactggca ggtgggggat tggtcaccat gttccaaaac ttgcgggaag ggttacaaga 3180
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<220>
<223>未知生物的描述：未知
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<210>24
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<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
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<210>31
<211>3331
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>31
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tagtttgatt gaataaatta tgttttcgat ataaattttt tttaaattaa attaaacttt  2400
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<210>32
<211>5224
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
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gcccgcgagg gtggacggag gtgccggcgt gacgctccac cagcatgtgc cgcaccccga  120
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<210>34
<211>8009
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>34
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gcgctgatgg aggaatgctg gcgcacgctg ggccccggcg ggcgggcgct gttcatcgtg  1860
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ctatccggcg ctggagaagg ggacgatcga cgcgaccgaa tgggtcggcc cctatgacga  9300
cgagaagctc ggcttcttca aggtggcgcc ctactactac tatcccggct ggtgggaagg  9360
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<213>未知
<220>
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tgagtgtcta ttttttttcg ggttttttta agtgtgaatc acatggttag gagcagttgt  60
cttcaatgtg accaaccatc ccaaggctct aattcaacgt ttgggtgtgg gggcccgctg  120
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<220>
<223>未知生物的描述：未知
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tccctgatct ctgcctccat ctgctcacag ccttctcccc tgtgtgtctc tgtctcttct  120
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ctgtaagaca gggacggggc ggcccagtgg ctgagaggag ccggctgtgg agccccgccc  5880
gccccccacc ctctaggtgg cccccgtccg aggaggatcg ttttctaagt gcaatacttg  5940
gcccgccggc ttcccgctgc ccccatcgcg ctcacgcaat aaccggcccg gcccccgtcc  6000
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agagctttat ttacacactg acaaggctca cggggtgtca gctgaagaag taggtggaac  6360
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aatccaggta gttggggtca gggagcgcct tactcagagc agaaccgctt gaccaggaat  6660
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ctggttcatg acggagacat cagctgcgtg agtccagtaa cagtcgtgca cagagacgaa  6900
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ccaccctcct gcaggcctcg ccccacccct cgccccgccc ctccccaaac atcctgggtt  7080
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acgaggtcag gagatcgaga ccatcccggc taacacggtg aaaccccgtc tctaccaaaa  30480
atacaaaaat tagccgggtg tggtggcggg cgcctgtagt cccagctact cgggaggctg  30540
aggcaggaga atgacgtgaa gccgggaggt ggagcttgca gtgagctgag atcgcgccac  30600
tgccctccac cctgggcgac agagcgagac tccgtctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa  30660
cagtgaatga cgtgaacaag ggtgcaggtg ggtgcgcaga acagtgaacg gcggtgttgg  30720
gaggcacctt gccaggggag gggaggtgca gggcgaggaa ggggccaggg gagatcgtga  30780
cacagacgcc ccagaacaac cacctcaaag acgttcctgt gtgtcctgga aggtcgggct  30840
gggaggctgc cccgaggagc tttcactttg acagggagct ggccgggcac gcagggaact  30900
gtacacccag ctgacaaagc ggcagacacc caggccgggg tgagcgagtg tgggtgagga  30960
gtggcggctg gccccagggt ccttgctgga caagacactt cagctcaggg tggggcaggg  31020
ctcacccagg gctacccaca gacgatggcg tccaaatctg gctctgccac tcccaggcct  31080
caactggccc ctctgcaacg tgggctgctg agcgggcttg gtaggacagc tggcatacag  31140
tcggcgctca agcatgtctg tggtgtccca taaaccaccg gtgtcccact ctaggccact  31200
gccagcccgg cctccagtcc agagtcccag tccggagtcc cagtgactgt gcgtgggccg  31260
ggcagctgag ctgtgagggc cgggctgggg gctccatatg gggtggtgtg agctgtgagg  31320
gccgggctgg gggctccata tggggtggtg tgagctgtga gggccgggct gggggctcca  31380
tatggggtgg tgtgagctgt gagggccggg ctgggggctc catatggggt ggtgtgagct  31440
gtgagggccg ggctgggggg tccctggggt ggtgtgagct gtgagggccg ggctgggggg  31500
tctctggggt ggtgtgagct gtgagggccg ggctgggggc tccatatggg gtggtgtgag  31560
ctgtgagggc cgggctgggg gctccatatg gggtggtgtg agctgtgagg gccgggctgg  31620
ggggtccctg gggtggtgtg agctgtgagg gccgggctgg gggctccctg gggtggtgtg  31680
agctctgagg gccgggctgg ggggtctctg gggtggtgtg agctgtgagg gccgggctgg  31740
gggctccata tggggtggtg tgagctctga gggccgggct gggggctccc tggggtgctg  31800
ctggtcgctg gctcattgac agttatcagt ggtctgggtg ggccctgccc cttctgactc  31860
ccacatccca ggaacccttt cccaaccttc ctcgtggtgt tgctgccccc ctgacgtccg  31920
tccctctggg tgtgtgggag cccccccgcc atacacacac acagatgctg ctcttgggct  31980
gagctgcagg gacagcgctg acctggccct cccacggggt cctcatcgat ctctgcactc  32040
ccccagctcg tgggggccgt cctgcttccc gttccctctg cctgctcctt gctcctccct  32100
cacatgctgg ggggggctcc tggtgtcagt cacggctctg ggggatcctg agtgtccgtc  32160
gtggtcggga ggggactcgt ggtcccgggg gtctcctggt atctgtcgtg gtcctgaggg  32220
ccctgcacga agcacagcgg acagcagcgg tgctgggggt gagccagcaa ggccctcccc  32280
gacccccgcc tcccccaggc atcctggaga tccgctctgt acacgtgggc gtcgtggtca  32340
tcaaagcagt gtcctcaggc ttctacgtgg ccatgaaccg ccggggccgc ctctacgggt  32400
cggtgagtgc cgggcagggc tgggcggcgc gggcagggtg gggagggtgg gccggcctca  32460
cccccgcccg cagcgactct acaccgtgga ctgcaggttc cgggagcgca tcgaagagaa  32520
cggccacaac acctacgcct cacagcgctg gcgccgccgc ggccagccca tgttcctggc  32580
gctggacagg aggggggggc cccggccagg cggccggacg cggcggtacc acctgtccgc  32640
ccacttcctg cccgtcctgg tctcctgagg ccctgagagg ccggcggctc cccaaggtgc  32700
ctgggctggt ggcgaggggc ccggccacgc ttgttcttcc ccctgcgggc tctgtaagcg  32760
ctgagtgccc accgtgtgcg ggcgctgtgg acacagccca ggagccctcc aggggggtcc  32820
cagcctgagg gggtggtggc caccaagcag gttcaatcct gagttgggga cctcgaggac  32880
ccaacagggc gcctctcggg ctgaaggacg cagacgtcga aaggtcgagg gggacgtccc  32940
aggcagggcc cggcagaggc aggggctcgg ggtggggagc acgttgggag tgggggcagg  33000
agcggagggg aggggagggg gccggggaga cggtgacaga cgccgcagaa caccagcctc  33060
gaagccggtc ccgtcccggg aatctgcaaa tacaacgcct tgcgaggaca aaggcacctg  33120
caggtgggac ggagatggag gagcatccag ggtggggggt ccagggcccc agtgtcctca  33180
cagggtcctc acgacaggag gcgggacagt gagagccaga gagagatggg gatgggccgc  33240
gctgtggccg tgaaggggag gaagggccct aagctgaggg acgtgggtgc ctccagatgc  33300
tggggaaggc gggaacggtt ccgcactgga gcccccggga gggaccggcc tgctcctgcc  33360
ttgatatgag cccagtggga cccagtttgg actctggcct ccagaaccgc cagaaaataa  33420
acgtagtaag ccatcaactt tgtggtcttt tgttacagca gacgtcggaa atatgcacac  33480
ggtgtctgaa actgttctca tgacaaaata agcctcagat cccccgggga agggcggagg  33540
ccaacgcctc ggtgttcctc cgatcccccg ggaagggcgg aggccgacgc ctcggtgttc  33600
ctcggatccc ccgggaaggg cagaggccga cgcctcggtg ctcctcagat cccccgggaa  33660
gggcagaggc tgagggcagg agccgtgctg ggtgcagggc aggcctgggg gcttcatgcc  33720
gctgtcctgc gggacgcaga gagggctggc cgtcggtgtg ggggcgcccc cacctgtgcc  33780
cagcgccctc ctgacatcct gactccgctg ggacttctgc ctacagccct gggagtcaaa  33840
ctccagcctc tcagagaaaa ggtcagagcc aagagcccca cagcctggag ccaggcagtg  33900
acaccctggg cctgtctccc cttctgtgtg tggggcgaca gcagcatcgc cctggtgaag  33960
tccccgggga cggccagggc tccatcccca gccgccgcct tccacataaa tacaggaaga  34020
ctgggccgag gcacttgctg ggaggtgctg agcagcctga cacggaaaac ccttctggga  34080
agggagggtc gtgcccggcc cgagagcttc tgctcaccct gcagacagaa gcgagcccca  34140
ccccagggga caccaggcgg cctctgggga catctttggc tggcatggag tgggtggagg  34200
acagggctgc acccaggatg tccccaggtt ggcagtgtga ggggagatcg gcccacgttg  34260
gccagtcgga gggcgtcgcc acttgagttg tcactgggag ctgcacaggt caccacagct  34320
gaaataaaac ttgctggcac cccacgcagg aacgtaacat gtgcctcgaa gaaacgggtc  34380
agcaggccgg gcgcgggggc tcacgcctgt catcccagca ctttgggagg ccgaggcggg  34440
tggatcacga ggtcaggaga tcaaggccat cttggtcaac atggtgaaac cccgtgtcta  34500
ctaaaaatac aaaaaattag ccgggcgtgg tggcgggcgc ctgtaattcc agctacttga  34560
gaggctgagg cggggaatcg cttgaatccg ggaggcggag gttgcagtga gctgagatcg  34620
cgccactgca ctccagcctg ggcgacagag cgagactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa  34680
aagaaacagg tcagcagttg tttctttgtt tctaaaacag agcgtggaat gggcgtacag  34740
ctccgcacat cccagggcag tgaaatcccg gttcacacag agccctcagc agcttattcg  34800
caagcccaaa cctggggacc cccgttgtcc tcaggcagtg aggtgggggc cccccaacag  34860
agaggagcgg cctgggggca cagaaccagc ggctccccag gaaatcgcca gcagtgaaaa  34920
taagacaacc ccaaactgtt gcaaactgtg cttccgctta cgaagcactc ctgagcggca  34980
gggcggatgg ggagagggcg gctgcaggcg cgaggggccc ggggacgcag gggtgcgggc  35040
cttaccaggg ccctgtcctg tcgtgcagca ggctcctggg gcagggaaga caccaggggc  35100
ggccacttct tactgctgtc tgacctcgag caatgcggcc tcacagcccc caccagggtg  35160
ccggtgtcct ctgggcccag cgcccccgag gctcatgcct gggtggggcg aaccaatcgg  35220
tcctgctcct ctggccactc cacgcgaggg aagtcccagc ctcacaggca ggcgcacacc  35280
ccggcagcat ctctgacaaa ggccctccag ttccgagtct ccaggtcccg ccgctgcaag  35340
cctcacctgc ccagccctcc tctccagctc caactccaac tcccaagaac caccacggac  35400
acacagaacc cgagccttgt ctccctcaac gcctcctgac tcaaaactcc atcttccaac  35460
aggaaaacgg ctcggccggg ggactgtgac ccggagcagg cggcccagcc tgtcgcgcag  35520
actcggggcc taaaacactt gttctctcag tccggagatc aaggacgatc cgaggtaacc  35580
tccctacctc ggtgtcctcc atgcaacctc gtcttagggc accgggtacg ttacctcgtg  35640
aggagccgag tccgcgggtc ctggggttga gatgtggacg ccctcagggc tggcactctg  35700
ccctggcggc cacagtcatg gaagtcccaa cgcttctctc ggctccgcaa ccccagaggg  35760
cggccacgag gagggcccgc cacgcacgac cccagagggc ggccaccagg agggcccgcc  35820
acgcgcgacc ccagagggcg gccaccagga gggcccgcca cggcgttgcg gcagcagccc  35880
agaaggtgcc ctgcgcacgg tccggacagg tgggatccga gttacctggc caagggggct  35940
gacgcagaca cgtcgcggga cacagtgaag agtgtggtgc agagcggagg gcgggagtct  36000
ttggagaaca ggtaggggcg tggggcacgc gcctcccacg cgcaggagcc gtctaccgtg  36060
gagggacacg ggtggtcctg ctggaggctc ctctccgtta gctgtctcca tcgtctgatt  36120
cttggatccc aggatggtgg gatcatcagc aactgagatg aacccactgc cccggccccc  36180
tgagcccgca ggtccccacg ccttgccagc tgtgcccgag ctggctgcac cccgggccag  36240
gcatccagca accttgagca gtggggtccg gcttttcaga aggggccagg aacccgcgtg  36300
gctgaggtgt gaccgaagcg tggggcagag gcgctgggcc ctggcgcttt aacgctggtg  36360
tttctggttt taaatttcac gacccagtga cactgccacc ctgctacctc gccagcagcc  36420
ctcctgggct taacttcggg agagcagttt tgctagccgg ccctgggtgc caagccctgc  36480
aggaggcgca gacccctgga gacaggaccg gactctgcag agcccgacca gcctcccagc  36540
ttggcctttt cctgacgcac gggcgcagaa ggaaagccac agcaccggct tctctttgta  36600
agtagtgtat tttaaatagc tttcaagata cacatatttt ttcctttaaa aaagtctgtt  36660
ggagcagttt tgttcttgaa ttttgctggt catcctcatg gtcccgagcc cccctactcc  36720
gggtcgtgga ggcggccgag ggggaggctg ggggcccacg tggcccgtcc tggcggcacc  36780
tgcagcactg ggggagccgc tgaaccccgt gcttcagcgc tgggggagcc gctgggcccc  36840
gtcttccgcc acaaaccatg catggccgcc acgtgagctc aaacgtccgt ttatttcaaa  36900
gcagtaataa tttaaaatta taaaaatctt tccaccgctg aacgtttaga gggtgaggtt  36960
agacagagga cggggaggct ggggacgccc cagaggggac catgtggccc acgccttccc  37020
aagccagggg gccggtgggc cgggcccggg tcctgccctg gaacaggcgg gacctgcagc  37080
gctgaccagc caagcgtggc gccgccgggg cacccagtct gtgggtgccg tgtggcgctg  37140
gctgagggtg ggtgggaaag gccccgtgct ttcccgacgg ccgacgtggg ctcacgagtt  37200
gcttgtggcg ttctcgttgc tgggcgagct ggaggaggac gatgacgacg aggaggagaa  37260
gctcacccca gtgaggccag gggggttcgt ggccgtgttc tgtcccgtga ggctttttcg  37320
gcagacgggg cagctgtcgt gctttgtggg gacagaggca gggacgggag aaggggcagg  37380
ttagaggcgg gagggccgcg gtcggggtgg gggggcgggt gggcggggca ctcacctgct  37440
ccagccaggg cacgatgcag ccgtcgtgga acaggtggtt gcagggcagc tgccgcacac  37500
gctcacccag cgcgtagtcg tccttgcaca cagggcactc gagcccggag cctgcgggag  37560
tgtgcagctg cggtcacagc gggcgtgggg ggcctgccga gccttcaagg gcaggctact  37620
ccacagcctc agccggaggc cgcccctgag cccagcgagg ggagaaaagc cgtgtgtgtg  37680
tcccccgggc tgccagaggg gacctggaca gaaccctctc ctcccagccc accttcaggg  37740
aaatgctcga ggccgggtgc ggtggctcac gcctgtcatc ccagcacttt gggaggccga  37800
ggcaggagga tcacctgagg tcaggagttc gagacctgcc tgaccaacat ggtgaaaccc  37860
tgtctctact gaaaatacaa gtatgagcca ggcgtggcgg cgggtgcctg taattcccac  37920
tactcgggag gctgagctct catacctacg tgctcctcag tgacggggac ggtggggagg  37980
gcctggattt tctctttatc tgccggtggg gggcctgtgt tttcaaactg attgaggagc  38040
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cgcgaggctg caggacctgc aaaagcaccg aggccgcgtt tgtcctgggc cctgggcccc  38160
ttggagcccg cccggggtcg gagatc                                       38186
<210>39
<211>720
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>39
cgccggcgct tgacctgact ttcatgaatc gaaaaggaaa tcctctatga acgcactgca  60
tcgcatcggc gccggaacgc tactggccgt gttgctcgct tttggcctga ccggctgcgg  120
ggagaaggag gaggttcagc agtcgctcga gccggtggct tttcacgact ctgacgagtg  180
tcacgtgtgc ggcatgatca tcactgactt ccccggcccc aagggccagg cggtcgaaaa  240
gcggggagtg aagaaatttt gttccaccgc cgaaatgctt ggttggtggc tgcagccgga  300
aaaccgtctg ctcgatgcca agctctacgt ccacgacatg gggcgcagcg tttgggaaaa  360
gccggatgac ggtcatctga tcgacgcaac cagcgcctac tatgtggtcg gtacgtcact  420
caaaggcgcc atgggcgcgt cgcttgcaag ctttgccgag gagcaggacg ccaaggcgct  480
tgccggcatg cacggcggtc gtgtgctgcg cttcgaggaa atcgatcagg cgctgctgca  540
ggaggctgca agcatgcagc acggcggcat gcacgaccat gcgccaaacg gtgcacataa  600
cgcacacgca ggccactgag cagcagtggt ctgaacagca cacacaagaa atcgaggtaa  660
gcacaatgat gggtatcagc gtctggcaac tcctgatcat tcttctgatc gtcgtcatgc  720
<210>40
<211>127
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(9)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(101)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(119)
<223>可以为任一核酸
<400>40
gcggccgcnc ggcgctggct gctgtgcgga ggccacggcg ggccgcgagc cgcctcgtcc 60
tcgccctcct gccctgggtg cggccccccg ggtcccggcg ncccactcgc cccggcgtnc 120
ccgcgct                                                           127
<210>41
<211>6858
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>41
actcgccaag tgatcgaccg gcccctgagg gccgcgacgc agagggcgcc ccgtgcactg  60
gcacaggcgg ccttgtgcgt tagactctga tattcgtgcg ccctctcgtt ggcaggacca  120
tccatcctgt gtgccggggg ccgcgcacac cgatcccgga tccgcctcgg ccctgccctg  180
cgcgcccctc cgttctcgac ctccccgacg ctgtctgaac acgcgtcgcc gggggacgac  240
ggcgggcggc ccgcctcggg ggaggggtaa gcgtcccggg atgcccgttc aaccgttccg  300
caaggctcgc ccatcgtggg ggagaaccgg cgcgacgcta ggagagacaa gtgatccagc  360
aggagtcgcg gctcaaggtc gccgacaaca ccggtgcgaa ggaaatcctg accatccgtg  420
tgctcggcgg ttccggacgc cgctacgcag gcatcggcga caccatcgtc gccaccgtga  480
aggacgccat ccccggcggc aacgtcaaga aggcgcacgt cgtcaaggcc gtggtggtcc  540
gcacccgcaa gcagtcccgc cgtcccgacg gctcgtacat caagttcgac gagaacgcgg  600
cggtcatcct gaagaccgac ggcgagcccc gtggcacgcg catcttcggc cccgtgggtc  660
gcgagctgcg tgacaagaag ttcatgaaga tcgtgtcgct cgccccggag gtgatctgac  720
ctcatggcca agatcaagaa ggacgacctc gtgcaggtca tcagtggcaa ggacaagggc  780
aagcagggca aggtcctgcg cgtgttcccg acggatgagc gcgtgctcgt cgagggcgtg  840
aaccgcgtga ccaagcacct gcgcgccggc caggacaaca acggttccac cgagggcggc  900
ctgcaggtcg tcgaggcccc gatccacatc tcgaacgtgg ccgtggtgga cccggagacc  960
aagaagccga cccgtgtggg ctaccgcttc gagaccgtcg agaaggacgg cgtgacgaag  1020
accgtgaagg tccgcttcgc caaggcctcg gggaaggagc tgtgatgacc gaggtgcagc  1080
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tcaacatggg cgtcggcgag gccgccaagg actccaagat catcgacgac gccgtcaccg  1260
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tggtgacgac cgccaagaac gacgacgagg gccgcgcgct gctcaaggcg ctgggcttcc  1620
cgttcaagac cgaccagtaa gacctccacg ccacaggtcc tccaccggtg aaccggtggc  1680
ggaaaccacg gcgagaaagg gcgtgaagca catgaccatg accgatcccg tcgcagacat  1740
gctgacccgt ctgcgcaacg caaactcggc ctaccacgac accgtgtcca tgccgtcctc  1800
gaagctgaag actcgcgtcg ccgagatcct caaggccgag ggctacatcc aggactggcg  1860
cgaggaggag gccgaggtcg gcaagaagct gaccatcgac ctgaagttcg gcccgcagcg  1920
tgagcgtgcg atcgccggcc tgcgccgcat ctccaagccg ggcctgcgcg tgtacgcgaa  1980
gtccacgaac ctgccccacg tgctgggcgg cctcggcatc gccatcctgt ccacctcctc  2040
tggtctcctc acgaaccagc aggccgccaa gaaggctggc gtgggcggag aagtcctcgc  2100
ctacgtctgg tgacgggcaa gacggaagaa aggctgaact gacatgtctc gaatcggacg  2160
tctcccgatc accatccccg ccggcgtcga tgtgaccatc gacggcgacc gcgtctccgt  2220
gaagggcccc aagggcccca agggtcagct cgagcactcg ctgcccacgc ccatcacggc  2280
caccctcgag gaggggcagg tcaccgtggc ccgccccgac gacgagcgtg agtcccgctc  2340
cctgcacggt ctgacccgta ccctcatcag caacatggtc gagggcgtga ccaacggctt  2400
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cgagttcgac ctgggctact cccaccccgt cccggtgaag gtgtcccagg gcatcacctt  2520
cacggtggag ggtaacaggg tcaccgtcgc cggtatcgac aagcagcagc aggtcggcga  2580
gaccgccgcc aacatccgca agctgcgccg ccccgacccg tacaagggca agggcgtcta  2640
cgcgggcgag cagatccgcc gcaaggccgg aaagaagtga tgtctactct gaaggtgaag  2700
ggcaagggca agttcaacgc ccgcacccgc cgccacctcc gggtgcgcaa gcggatctcc  2760
ggcaccacgt ccgtcccccg cctcgtcgtc aaccgctctg cacggcacat gttcgtgcag  2820
gtcgtggacg acacgcagag ccgcacgatc gcgtacgcct ccaccatgga ggccgacgtg  2880
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cgtgccaagg cggccggcat cgaggccgcg gtcttcgacc gggcgggcaa caagtaccac  3000
gggcgcgtcg cggccgtggc cgacggtgcg cgagagggtg ggctgcagct gtgaccgaga  3060
acatcaacca gaaggacact caggtgaccg agagcaccga gaccaccgtc tccgagaccg  3120
ggtcgggctc gcgagccaga ccaccgagcg cgccaccggt ggccgcggcg gtcgcgacgg  3180
cggccgcggt ggccggacgg cgatcgtcgt ggcggccgtc ggacgaccga accgtcgtgg  3240
cgcccaggac gacgaggaag gaccagttcc tcgagcgcgt cgtgggcatc aaccgcgtct  3300
ccaaggtcgg ccgccgcttc tccttcaccg ccctcgtggt ggtgggtgac ggcgacggca  3360
ccgtcggcgt cggctacggc aaggcgaagg aggtccccgc tgcgatccag aaggccgtgg  3420
aggaggccaa gaagtccttc ttccgcgtcc cccgcgtcgg ctccaccatc ccgcacctgg  3480
tgcagggtga ggacgccgcc ggcgtcgtgc tgctccgccc ggcctccccg ggtaccgcgg  3540
tgatcgccgg cggtccggtg cgcgccgtgc tcgagtgcgc cggcatccac gacgtgctct  3600
ccaagtccat gggctccgtg aacgcgatca acatcgtgcg cggcacggtg gagggcctca  3660
agaagctgaa gagcccccag gccgtcgccg cccgccgcgg caaggccctg gacgagatcg  3720
ccccccatgc gatgctgcgc accatggaga acgatcgcgc ccagaagagc gcgaaggcag  3780
gtgcgtgacg cgtgtttgag tccactcgca agaacatcca gccctcggac gccaccctgg  3840
tcatcaccca gacccgcggc gtcacgggct ccaagcagaa ccatcgggac accctgcgct  3900
cgctgggcct gaagcggatc ggccaccagg tcacccgcaa ggccgacgcg gtgacggtcg  3960
gcatggtcaa caccgtgccg cacctggtgt ccgtggagga ggtcaacaat ggctgacaac  4020
gacgccatca aggtccacga cctgcgtccg gcccccggtg ccaagaccgc caagacccgc  4080
gtgggtcgcg gtgaggcgtc gaagggcaag accgccggtc gcggcaccaa gggcaccaag  4140
gcccgttacc aggtccgtgc gggcttcgag ggcggtcagc tgcccctgca gatgcgtctg  4200
ccgaagctcc gcggcttcaa gaacccgttc cgcacggagt accaggtcgt gaacctggac  4260
aagctctccg cgcacttccc cgagggcggt gaggtcaccg tggacgcgct cgtctccaag  4320
ggcctcgtcc gtcgtggcca gcccgtgaag gtgctgggca cgggggagat caccgcggcc  4380
gtgcaggtga aggcgaacgc cttctctgcg tccgccgtgg agaagatcca ggccgccggc  4440
gggtccaccg agaccctctg acacgccgac ccatcgaccg agggccctgg ccggagcagc  4500
cgctcgggcc aggccctggt ccgtccgtgt agactcgcac agccgccccg gtgtggccgc  4560
cgtctcgtgc ccccgccccg cggaacggcg cacgccccac aggaccagcc gcaggaggac  4620
tcgtgctcaa ggccatcgcc cggatcgtcc ggacgcctga cctgttgcgg aagatcgcct  4680
tcacgctcgg gctcatcgcc gtctatcgga tgggcgactt cgtgccggcc accggcgtgg  4740
actacccggc ggtgcagcag tgcctggcag cgggcaacgc ccagggcggc ctgtactcct  4800
tcgtgaacat gttctcgggc ggggcgctcc tgcaggtgtc tgtcttcgcg ctgggcatca  4860
tgccgtacat cacggcgtcg atcatcgtgc agctgctgcg cgtggtgatc ccgcgcttcg  4920
agcagctcca ccaggagcgc cgcaggggcc aggcgacgct gacgcagtac acccgctacc  4980
tgaccctcgc cctcgccctg ctgcaggcga ccacgatggc ctcgctggcc cgcaccgggg  5040
ccctgctcgg atgcagcctg ccgctgctgc gcgacggctc catcctcacg gtgctgctcg  5100
tggtcatcgc cctgaccacc ggctgtctca tcgtcatgtg gttcggggag cggatcaccg  5160
agaacggcgt gggcaacggc atgtccctgc tcatcttcac ctccatcgcg gcaggcttcc  5220
cggccggtct cggccaggtg gtccagacgc agggctggcg cgtgttcgcg atcgtcatgg  5280
ggatcggcct gctcaccatg ctggccatcg tcttcgtgga ggagtcgcag cgccggatcc  5340
cggtccagta cgccaagcgg cagatcggct cacggaccgt gggcgggtcg agcacctaca  5400
tcccggtcaa ggtgaacatg gccaacgtca tcccggtcat cttcgcctcc tccgtgctga  5460
tgctcccggg catcctcatc cagttcaaca cgccgcagga cggcagtgcg ccggccccgt  5520
ggatcacgtg gctgagccgg tacttcggct ccggtgacca cccggtgtac atggccctgt  5580
acttcctgct catcatcggc ttcacgtact tctacgtgtc catcacgttc aacccggtgg  5640
agatctcgga caacatgaag cgctacggcg gcttcatccc ggcgtccgcg ccggccggcc  5700
ccaccgagcg ttacctgcag tacgtcatca gccgcatcac gttcgtggtg ggggccctct  5760
acctcggtat cgtggccatg atcccgctga tcgccttcgc ggtgatcggc accagccaga  5820
acttcccgct cggcggcacg tccatcctca tcatggtggg cgtcggcctc cagaccgtga  5880
agcaggtcag cgcacagatg gagcagcgcc actacgaggg cctgctgcgc tgagccccga  5940
cccgatcccg caacgccgtc cgtatcgaca gtgaggaaca cacgatgacc cgcatgctgc  6000
tcatgggccc tcccggttcc ggcaagggca cccaggccac ccggatcgcc gacaagctgg  6060
ggatcgtccc gatctccacc ggtgacatct tccgccacaa cgtgaagtcg atgacgccgc  6120
tcggcgtcga ggccaagagg tacatcgaca acggcgactt cgtccccgat gaggtcacga  6180
accgcatggt cgccgaccgc atcgcccagg ccgacgcgga gcacggcttc ctgctggacg  6240
gctacccgcg cacgaagggc caggtcgagg cgctggacgc catgctcgcc gaggccggcc  6300
agtcgctgtc cgccgtcgtc gagctggagg tgcccgacga ggagctcgtg gagcgcctgc  6360
tcaagcgtgc cgagatcgag ggccgcgcgg acgacaccca ggaggtcatc gagcaccgcc  6420
tggacctgta ccaccgcgag accgagtccg tcatccagga gtacgtggag cgcggcatcg  6480
tcgcccgcgt ggacggcacc ggccagatcg acgacgtcac cgagcgcctg ctgcaggccg  6540
tgtactccgt gcgctccgcc acgggctccc tgcccgtgat ccagccgggc gcggagtcct  6600
gaccccgtga tcggccgccg ctcgctcgag ctcaagaccg ccccccagct gctggccatg  6660
cagcgcgcgg gggtggtcct gtccgaggca ctggacgccg cgctggccgg cgcgccgggc  6720
ttcaccaccg cggagctgga cgccgtgttc gcggtggtgc tggccgaacg cggtgcgacc  6780
tccaacttcc tgggctacta cgacttcccg gcctcgatct gcacctcggt caacgaggag  6840
gtcgtgcacg gcatcccc                                                6858
<210>42
<211>578
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
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<220>
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<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(558)
<223>可以为任一核酸
<400>42
ttctngtcta tggcagagat ggncaggttg ncgttgagca ggtactgncc atcagccgtc 60
ttcagcgcca ggtagttccc atcgttctgc acacccgggt ggctccgctg cttcacgtca 120
atattagtgg caccagctgg gatggtgaca atgtcattgt agccataatt ggtgggggtg 180
agggacccgg agaccttcct gcaggagttg nctttgcccc cacacacccc gcatttgtcc 240
agcttccgag gcgagtccac cacatggtca cagccggcct tgacacactg gncacggaca 300
cagatggnca gtgtttctgg cccacacagg gtgccatcaa tcaccttggn ctcgaacact 360
ttggaactcg ctcctccccc gggntcggga ggaacaactt gcaggggtcc cgggggggac 420
aacccagcat tcttggggga cccactgcag gaggattccc cgtccatgtc aagtgtnatt 480
ggtgggcatt attcttctca caattgntgc tccctgaagg ttttcccgnc aaggggggat 540
tcccccccng ntggaatnat tggtacttgg gtctccga                         578
<210>43
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(146)
<223>可以为任一核酸
<400>43
catttaagtt tgctagtcct ttgcaaacag actgacgctg agtgtcctgt ctgagtcaat 60
aagtgcactt ttacctttta acctatgccc tctacttgaa cccgagcaag gtccagtcca 120
ctggacangt tgatgatagg gtctgncgcc ccataccctc tcctcttccc ccttaggaat 180
ttgtgcagta ctggaggggt tgcggcaatg ggaggcctgg gtgggccgtg ctgccttgat 240
atggccaagg gacccagtca ccacagtgga gacccttgtc tgcacctcag taccgcatgt 300
ccagg                                                             305
<210>44
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
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<220>
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<220>
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<400>44
ggcacaggtg actttagcat gcagagcagc aaagagagag caaccaccaa catcatccag 60
ccgctgctcc acgcacagtg gntgctgggg gactggtctg agtgctctag cactgcgggg 120
ccggctggca gaggcgaact gtagagtgca gggacccctc cggtgcaggc ctctgccacc 180
tgcaacaagg ctctggaaac ccgaggatgc caagccctgg cagaaccagc tgtgccccct 240
gtgatttcag ggggncaggg gccattttgt gctcngggac atgcggtaat ggaggttgnc 300
agacaaggtc ttncattgtg gtgnatgggt tcc                              333
<210>45
<211>102
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
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<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(72)
<223>可以为任一核酸
gcagcagcag cgcagcgcag agagagcagc agcagcagca gcagcagcag cagagcagat 60
cntnctggna nnaaaaaatc gcggcagcag ctgctctagc ag                    102
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<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<400>46
caggcaagnc ggcacgtagg agcagcagca gcagcagcag cagcagtaac nnagtcnacg 60
agggggngcc cgggacccaa ggcgcccgaa cagagaggcg gagcacaatc cactggtcgg 120
cgn                                                               123
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<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(107)
<223>可以为任一核酸
<400>47
ggcacgcagg agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agagagagag cagcagagag 60
agagagcagc agagcagagc agagcanagt agagnagagc anagcnnac             109
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(86)
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<400>48
ggcacgaggg ggaaactgct ccgcgcgcgc cggggaggag gaaccgcccg gtcctttagg 60
gtccgggccc ggccgggcat ggattnaatg cctgagcccg ggtcccgctg tcttctgctt 120
cttcccttgc tgctgctgct gctgctgctg ctgccggccc cggagntggg cccgagccag 180
gccgnagctg aggagaacga cttgggttng cctncccana aaatgggaag gganttgggg 240
ttaatcgaag tcattgggac cattttaaaa ggggcttcct ggattatagn ctt        293
<210>49
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(283)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(342)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
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<220>
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<220>
<221>不确定
<222>(461)
<223>可以为任一核酸
<400>49
aattcggcac gagcacccgg ccactgcagt cttctgccct gctggacagc agcagcagca 60
gcagcagcag cagcagcagc agcagcaaca gtaacagcag cagttcgtcc ggacccaacc 120
cttctacctc ctttgagccc atcaaggcag accccacagg tgttttggaa ctccccaaag 180
agctgtcaga aatctttgat cccacacgag agtgcatgag ctcggagctg ctggaggagt 240
tgatgtcctc agaagtgttt gcccctctgc tttcgtcttt ctncaccccc gggagaccac 300
gattatatct acaacctgga cgagagtgaa ggtgtttgtg anctcttttg atgtgnctgt 360
tntnaacntt tgactgacag ggacatgcct tttttggttg ggacccagat tttttgactt 420
gggggtttnc ttgggacttt tcaaccgacc ctanagagtt nagagcaaan aggttggttt 480
ttcggcttcc ttaacgaaag ttttgg                                      506
<210>50
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(137)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(221)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(259)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(327)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(385)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(389)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(416)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(418)
<223>可以为任一核酸
<400>50
tttaagcacc aaaacttgtg ttttaatgat gttggatgga aatctttcct aaatgtgtca 60
tgcatgctct tgtctccctt aatggagaga gtgtgacact gcttagcact tggatggctt 120
ggggtggtgg ttatgancag cagtctgtca cagctcagcg aggtgaagcc tgtgggcgtt 180
ttgctctgtg ctgaatggct cagtggccct acaaagcgga ntcagctctt ggtggctttc 240
tgttgtggtg ggctgctgnt gctgctgctg ctgctgctgc tgctgccctt gcctctaaaa 300
gaactcactt cctcttcctc ctgctgncac ctgtcttttg gcttgtggga ttggagtcat 360
ggggcccaga tggagccttg ctccntgant tatgataggc ccctcggtct cttttntnc  419
<210>51
<211>495
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<221>不确定
<222>(177)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(322)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(328)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(342)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(368)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(380)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(386)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(404)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(423)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
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<220>
<221>不确定
<222>(436)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(443)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(456)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(460)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(467)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(468)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(471)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(474)
<223>可以为任一核酸
<400>51
aattcggcac gagcaaagtt ctgcgctcca ttgtgggcat caaacgacac gtcaaagccc 60
tccatctggg ggacacagtg gactctgatc agttcaagcg ggaggaggat ttctactaca 120
cagaggtgca gctgaaggag gaatctgctg ctgctgctgc tgctgctgcc gcagacnccc 180
agtccctggg actcccacct ccgagccagc tcccaccccc agcatgactg gcctgcctct 240
gtctgctctt ccaccacctc ttgcacaaag cccagtcctc cggcccagaa catcctgggc 300
ccggagttcc ttccttgcct tnaggggntt ttcagcaagt tnagttcctt gggtcctttt 360
tgggaaantt naggnagttn aaggantacc aggttnttgc catnctttcc agatccaagt 420
ttnacnaaaa attttnaaca gtntaaattg ggtttnttgn ccctttnngg nggntgtttt 480
ttttttcggg tccgg                                                  495
<210>52
<211>81
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(65)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(67)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(71)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(75)
<223>可以为任一核酸
<400>52
ggcacgcagg agcagagcag cagcagcaga gagagcagca gcagcagcag cagcagcaga 60
gagananata natanatata t                                           81
<210>53
<211>305
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(11)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(62)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(81)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(256)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(289)
<223>可以为任一核酸
<400>53
aggcacttga nttgaaaatg gaaaacccta ctgctggtgg tgctgcggtg atgaggccta 60
tnatgcagcc ccagggtttt nttaatgctc aaatggtcgc ccaacgcagc agagagctgc 120
taagtcatca cttccgacaa cagagggtgg ctataatgat gcagcagcag cagcagcagc 180
aacagcagca gcagcagcag cagcagcagc aacagcaaca gcaacagcaa cagcagcaac 240
agcagcaaac ccaggncttc agcccacctc ctaatgtgac tgcttcccnc agcatggatg 300
ggctt                                                             305
<210>54
<211>307
<212>DNA
<213>Hepatitis C virus
<220>
<221>不确定
<222>(212)
<223>可以为任一核酸
<400>54
tggggtgtga agctccggtg ctggtgcggc gggggactgc ggggccagcc tcagtttaaa 60
ccccctcagc agtctttctg tcgttgccct ccacactgcg agactctgga gggcgatctg 120
gaggtctgga agataaccga ttcctgggag atttgggggt agtctccaat ctgtccctgg 180
ctcatcttgt gacccgaagc cggcggcctt gncaggagta ttctagaatg agtgcacata 240
aaaatacctt caaacggtag cagcagcagc agcagcagca gcagcaagca gcagcagcag 300
cagcagc                                                           307
<210>55
<211>88
<212>DNA
<213>未知
<220>
<221>不确定
<222>(6)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(7)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(78)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(83)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(87)
<223>可以为任一核酸
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>55
ggacanngac tactctctct ctctctctct ctctctctgc tgctgctgct gtgctgctgc 60
tgctgctgct gctgccgntg tgngcana                                    88
<210>56
<211>346
<212>DNA
<213>未知
<220>
<221>不确定
<222>(278)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(288)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(299)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(313)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(342)
<223>可以为任一核酸
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>56
ggcacagccc aactggtgat gctgctgctg ctgctgctgc tgccgccgcc gcctctattg 60
ctgatactct agtggggctg gaagggtggt tcctattcgc accatcgcca accagagaca 120
gagggaaaaa aaaaaccggc agccactgct gaatgttggg ttcggaggct gcatccgact 180
cggtcacaag gaaaatggat tcagtttgca tctctccctc ctttaaacag cttctccggg 240
tctcagcatg ggcttccagg gcagcgattg aggagacntt accaaggngc accacacant 300
agatgctgag acntcgtgac tccaggataa gaaacattaa cngggg                346
<210>57
<211>496
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(11)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(78)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(195)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(197)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(286)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(291)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(293)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(315)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(328)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(329)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(344)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(346)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(352)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(354)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(358)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(366)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(399)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(406)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(410)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(418)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(420)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(435)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(443)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(453)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(454)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(459)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(471)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(473)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(474)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(481)
<223>可以为任一核酸
<400>57
gaattcggca naggtgcaca gatgtggtgg atggggaggg ccgcacggga cagaagttct 60
ccctgtgtat tctgacgnct gagaaaggag catttcatcc gggcggagac caaggagatc 120
gtcaatgggt ggctggagat gctcatggtc tatccccgga ccaacaagca gaatcagaag 180
aagaaacgga aagtngnagc cccccacacc acaggagcct gggactgcca agttgggctg 240
ttaccagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcat ccccantgct ntnggaaagt 300
tcccaccacc aagtnccaca atttgggnna aaaccaaggt tgtngnagac gngntttngg 360
gatttnggca ttgtgggttg cttgcatgga aggacattng gttgtnggtn ccttggangn 420
tacaattacc atttncggtt gtnaaggtta aanntccgnc attcagaagg ntnnaaggtg 480
ntttgaagtc catttg                                                 496
<210>58
<211>268
<212>DNA
<213>Drosophila sp
<220>
<221>不确定
<222>(16)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(51)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(60)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(202)
<223>可以为任一核酸
<400>58
aacacttatc cttganagct ctgtttggga agcaggacaa agctacatgt naggaaactn 60
tggagcctcc gcagactctc caccagcagc agcagcagca gcagcagcag caagagaagc 120
ttccaattag gcagggggtt gtacgctccc tgtcctatga ggaacccaga agacactcac 180
cccccattga gaagcagctc tntccagcca ttcagaaact catggtcagg agcgcagacc 240
tccacccatt gtcagagctg cctgaaaa                                    268
<210>59
<211>471
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(249)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(386)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(449)
<223>可以为任一核酸
<400>59
tcgacccacg cgtccgctga ggaacagacg ttccctggcg gccctggcgc cttcaaaccc 60
agacatgctg ctgctgctgc tgctgctgcc cctgctctgg gggacaaagg ggatggaggg 120
agacagacaa tatggggatg gttacttgct gcaagtgcag gagctggtga cggtgcagga 180
gggcctgtgt gtccatgtgc cctgctcctt ctcctacccc caggatggct ggactgactc 240
tgacccagnt catggctact ggttccgggc aggagacaga ccataccaag acgctccagt 300
ggccacaaac aacccagaca gagaagtgca ggcagagacc cagggccgat tccaactcct 360
tggggacatt tggagcaacg actgcnccct gagcatcaga gacgccagga agagggataa 420
ggggtcatat ttctttcggc tagagagang aagcatgaaa tggagttaca a          471
<210>60
<211>379
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(2)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(14)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(31)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(135)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(315)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(332)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(349)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(357)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(374)
<223>可以为任一核酸
<400>60
anttcggcan aggnaaggga gagggtgacc ngcatcccaa ctagatttca gtggagtgaa 60
gttcaggagg catggagctg acaaccatga ggcctcggca gccaccgcca ccaccgccgc 120
cgccaccacc gtagncagca gcagcagcag cagcagcagc aagagttaac tctgacttag 180
ggaatagaga cagccagaga gaaatgtgat caatgaagga gacatctgga gtgtgcgtgc 240
ttcttcagag gggacgggtg atgggcagat ttggaaaaag caccgcagat tgggaacctt 300
atcttttctt tttcntaaaa ttgttgttat gnaaatttgg gtttttccng taacttntta 360
aaaacttaaa agtnggttt                                              379
<210>61
<211>255
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(121)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(183)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(254)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(255)
<223>可以为任一核酸
<400>61
aattccgaca atggaaagca ctcttagcct tgcagtggtc tacattttta aggaaccaat 60
atttcagcat tctttattac ccggcacgct gtgtcctttg tcagagttca agtttatggt 120
nactgccagg gtcagacagt ccatttgctg ctgctgctgc tgctgctgct ttctcgaact 180
ggnatggcat tagggaagct gctgtctgag tgttagggaa tgtcttggct aagtaaagcc 240
aatgttcttt  cctnn                                                  255
<210>62
<211>5289
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>62
cgagctctcc cagccgcagc ctccgaatcc acggcctcca ccccgcgcct ctccagcgct  60
ctatcccgtc gctgcgccct tgtcgccggc cccggccgct gcatccgcgt ccgcacaggc  120
tccttgctgg gcacaaatag ctccaccatg gggctggcct ggggactcgg tgtcctgctc  180
ctgttgcatg cctgcggctc caaccgcatt ccagagtctg ggggagacaa cagtgtgttt  240
gacatctttg aactcaccgg agctgcccgc aagcggtctg ggcgccgact ggtgaagggc  300
cctgaccctt ctagcccagc tttccgcatc gaggatgcca acctgatccc ccctgtgcct  360
gacaagaagt tccaagacct agtggatgct gtgcgggcgg agaaaggttt cctcctcctg  420
gcctccctga ggcaaatgaa gaagacccgg ggtaccctgc tggctgtgga gcggaaagac  480
cactctggcc aggtcttcag cgtgatctcc aatggcaagg cgggcaccct ggacctgagc  540
ctgaccgtgc aggggaagca gcatgtggtg tcggtggaag aagcactcct ggcgactggc  600
cagtggaaga gcatcaccct gtttgtgcag gaggacaggg cccagctgta catcgactgt  660
gagaagatgg agaatgcgga gctggatgtc cccatccaga gcatcttcac cagggacctg  720
gccagcatcg ccaggctccg cattgccaaa ggaggtgtca acgacaattt ccagggggtg  780
ctgcagaatg taaggtttgt ctttggaacc acaccagaag acatcctcag gaacaaaggc  840
tgctccagct ctaccagtgt ctttgtcacc cttgacaaca acgtggtgaa tgggtccagc  900
cctgccatcc gcaccgacta cattggccac aagacaaagg acctgcaagc catctgtggc  960
atctcatgtg acgagctgtc cagcatggtc ctggagctca ggggtctacg caccatcgtg  1020
accacgctgc aggacagtat ccgcaaagtg accgaagaga acaaagagct ggccaacgag  1080
ctgaggaggc ccccactctg ctaccacaac ggagtgcagt acaggactgg cgacgagtgg  1140
acggtggaca gctgcactga gtgtcgctgc cagaactcag ttaccatctg caaaaaagtg  1200
tcctgtccca tcatgccctg ctccaatgcc acagttccgg atggagaatg ctgcccacgg  1260
tgctggccca gcgactctgc agacgatggc tggtccccgt ggtctgagtg gacctcttgc  1320
tctgtgacct gtggcaatgg aatccagcag cgtggccgct cctgcgacag cctcaacaac  1380
agatgcgagg gctcctctgt gcagacgcgg acctgccaca tccaggagtg tgacaagaga  1440
tttaaacagg atggcggctg gagccactgg tccccatggt catcttgctc cgtaacatgt  1500
ggagacggtg tgatcacaag gatccggctc tgcaactccc ccagccccca gatgaatggg  1560
aagccatgtg agggcaaagc ccgggagacc aaagcctgcc agaaagactc ctgccccatc  1620
aatggaggct ggggaccttg gtcaccatgg gacatctgtt ctgtcacctg tggaggaggg  1680
gtacagaaac gtagccggct ctgcaacaac cccaaacccc agtttggagg caaggactgc  1740
gttggtgatg tgacagaaaa ccagatctgc aacaagcagg actgtcccat tgacggatgc  1800
ctgtccaatc cctgctttgc tggtgtccag tgtaccagct accctgatgg cagctggaag  1860
tgtggtgcct gtcccccagg ctatagtgga gatggagtcg agtgcaaaga cgttgatgag  1920
tgcaaagaag tccctgatgc ctgcttcaac cacaatggag agcacaggtg tgagaacaca  1980
gaccccggct acaactgcct gccctgccca ccgcgcttca ctggctcgca gccctttggc  2040
cggggcgtgg aacatgccac cgccaacaag caggtatgca agccccgaaa cccctgcaca  2100
gacgggacac acgactgcaa caagaacgcc aagtgcaact acctgggcca ctacagcgac  2160
cccatgtacc gctgcgagtg caagcctggc tacgccggca acggcatcat ctgcggggag  2220
gacacagacc tggacggctg gcccaatgag gacctgctgt gcgtggccaa cgcaacttac  2280
cactgcagaa aggataattg ccccaacctt cccaactcag ggcaggaaga ctatgacaag  2340
gatggaatcg gcgatgcctg cgatgatgac gatgacaatg ataagattcc agatgacagg  2400
gacaactgtc cattccatta caacccagcc cagtacgact atgacagaga tgacgtggga  2460
gaccgctgtg acaactgccc ctacaaccac aacccagacc aggctgacac agataacaat  2520
ggggaaggag acgcctgtgc agctgacatt gatggggaca gtatcctcaa tgaacgggac  2580
aactgccagt atgtctacaa tgtggaccag aaagacactg acatggacgg ggttggtgat  2640
cagtgtgaca actgccccct ggaacacaat ccagaccagc tcgactctga ctcggaccgc  2700
attggagaca cctgtgacaa caatcaggat attgatgaag acggccacca gaacaatctg  2760
gacaactgtc cctacgtgcc caacgccaac caggctgacc atgacaagga tggcaaaggc  2820
gatgcctgtg accatgatga cgacaatgat ggcattcctg atgaccggga caactgcagg  2880
ctggtgccca atcctgacca gaaggactct gatggtgatg gtcgaggtga tgcttgcaaa  2940
gatgattttg accaggacaa ggtgccagac attgatgaca tctgtcccga aaatgttgat  3000
atcagtgaga ctgatttccg ccgattccag atgattcctc tagatcccaa agggacatcc  3060
cagaatgacc ctaactgggt tgtacgccat cagggtaaag aactcgtcca gactgtcaac  3120
tgtgaccctg gacttgctgt aggttatgac gaatttaacg ccgtggactt cagtggcacc  3180
ttcttcatca acaccgagag ggatgacgac tatgccggct ttgtgtttgg ctaccagtcc  3240
agcagccgct tctatgttgt gatgtggaag caagtcactc agtcctactg ggacaccaac  3300
cccacgaggg ctcaggggta ctctggactt tccgtgaagg ttgtaaactc caccacgggg  3360
cctggcgagc acctgcggaa tgccctgtgg cacacaggaa acacctctgg ccaggtgcgc  3420
acactgtggc atgaccctcg tcacattggc tggaaagatt tcactgccta cagatggcat  3480
ctgagccaca ggccaaagac aggtttcatc agagtggtaa tgtatgaagg gaagaaaatc  3540
atggctgact caggacccat ctatgacaaa acctatgctg gtgggaggct aggcttgttc  3600
gtcttctctc aagaaatggt gttcttctcc gacctgaaat atgaatgcag agactcctaa  3660
tcatcaaact gttgatcaaa agactgatca taaaccaatg ctggtattgc accttctgga  3720
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<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>63
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<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
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acctaaacaa gggagctgga gcgaggccaa atctgaacgt gacatcgccc gcctcctccc  4560
gctgcctgct cccccacctc ctcccccatc tcgccccccc ccccacacac acacaggctt  4620
cacgcacctt cagaatgcca tgactgtgcg ctggagccac tggctgatga gccacgccgc  4680
ggcctggcag cgcgacgaca tgcggctgcg ggacctgctg ccgcgggtgg ccacactgcc  4740
gctgggctcg ggtgggtgag ggaggggagg ggaggggagg gggggagggg gagggagagg  4800
aggggagaag ggggggggag acgaggaggg tggaagggtg ggggcggggc ggtggaggct  4860
agagggtggg gctgggtggg tggacggagt gcactggtag aggagggata gggtacattg 4920
agacgggagg agggatgcag gggcgaaggt ggggaggagg ggaggggagg aggcgtggag 4980
ctggagtggg ccgacgagtg tgcggacggg gcaggcggca acggggatta aacggcgggg 5040
ggccggggcg tgtgcacgac aggggcttgc gcgtctgcga ttgtgggggc acacagggac 5100
aggagcacga cgtgggacac gcatagatac gccgcattga caacacacac acacacacac 5160
acacacacac acacacacac acacacacaa acacaaacac acacaaacac aaacacacac 5220
acgccccccc ccctacacac acgccccctc cccaggcgcc ctggccggca acccctttct 5280
ggtggaccgc cagttcatcg ccaaggagtt gggtttcggc ggcggcgtgt gccccaactc 5340
catggacgcg gtgaggggag gaggaggggg aggagggcgg gggggggcag gaggggggag 5400
gaggaggggg ggagggggtt aactttgaag cgtaaggaaa cagtcgggag gaggggggga 5460
aggagggggc ctggaggagg gggggaggag gagggtggct ggagggggct gggggaggag 5520
gagggggagg attgggaggg ggctggggga gggtgcccgc agctggggga ggtggggagg 5580
gagggggttg ctgctggtgt aaagggcctg taggcactga gagcactgtg gggagccggg 5640
gtactgcctg gggccccgcg ctgcagaggt gtcgcgcagt gtggcggcgc atcccccgca 5700
tccccacacg cgggccgctg ccgctgcccg ccacaccctt gccactttgt gtgctttcct 5760
aggatataca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaaa cacaaacaca 5820
cacgggcgcg ggctttcgtt tcgtttttta acacaaacac acactccccc tgtgctcctc 5880
aacacactcc atctttctca cacaaacaca cacgcacaca cacatgcgca ggtgtctgac 5940
cgcgactttg tgatcgagac ggtgtttgcg gccagcctgc tgtgcgtgca cctgtcgcgc 6000
tgggcggagg acctcatcat ctacagctcc ggccccttcg gctacgtgca gtgcagcgac 6060
gcctacgcca ccggctcctc gctcatgccg cagaagaaga accccgacgc cctggagctc 6120
atcaggtgcg ggagggatgg ggtgggggtg ggggggttac attcatggtt agttaagaag 6180
tgaaggcgta gggggtggat ggggtgggtt acattcatga acatttaaga agtgaaggcg 6240
tagccaggaa cagtagtaga gcagacgcgt tgtagtgtgt gggtttgggt gggagggatg 6300
gttgggtaaa gcggtacagg atgtactgag gactgcagac cgaaggagcg ggggaggggg 6360
agcaggcagg cggggcgagg ggcgtggggg cgggggttac tggcaccgtg ccgggtaagc 6420
aacacgtgac acggagatgc accacacaaa gagggacgtg gggagtggca ggcgggggcc 6480
agggctgaga ggcgcgtgtg gaggggtgcg gggttgggcg gggggctgtt tcatgatacc 6540
gctgcctcca cctcctccac cgcctcctgc cacctccacc tcccccactg cccctccccg 6600
cctcctcctg ctgcaggggc aagggcggtc gtgtgcaggg caacctgatg ggcgtcatgg 6660
cggtgctcaa gggcacgccc accacataca acaaggactt ccaggcgaga gagcgagagc 6720
gagggaggga gggagagcga gggagaggga gggagaggga gggagaggga gacagaggga 6780
cagggacagg gacagggaca gggacaggga cagggacagg ggcaggggca ggggcagggg 6840
caggggcagg ggcaggggag gccccccggg ggcggcgggc ccggggcatg aggtcagaca 6900
taggggcgct gcactgaggc cgcgaggcgg gcgggaggca gggggcgggg ggcggggggc 6960
gggagcggac atgcgccgca aacacagacg ggttgagaaa gcacaacgac tggaacgcag 7020
tgggcttact gacaattcat cattgtgcgc atatgtgtgt atgtgtatgt gtgtgtttgt 7080
ttgtgcagga gtgttgggag ctgctgtttg acacggtgga cacggtgcac gacgtggtgc 7140
gcatcgccac cggcgtgctg tccaccctgc ggatcaagcc cgaccgcatg aaggccggtg 7200
agcgtagccg agcagggctg gagcagcagc cgggcagcag tagcagcagg gcaggggagc 7260
agcgggagcg ggagcagcag gaggggtggt tgggaagcgg tgggggtagg gtgggagcgg 7320
aggaagggaa ggaggagcag gagcaggagg aagaggagga ggaagggcgg tggggggtgg 7380
ggggtcgtgt ccttggccgc atgggcggag gcggggaggc ggggaggagg cggggaagca 7440
gagcctgcac ccacgctccg cgggtcccta ccgtcttgcg cctaaccccg tgcgcctagc 7500
ctcttgcgcc caccccctta gtgcatcctg tacccctctt tccaaacatc cttgcaactc 7560
cctgacctcc tcgccaaacc tcccccgccc ccaggcctgt ccgccgacat gctcgccacg 7620
gacttggccg agtacctggt gcgcaagggc gtgccgttcc gggagacaca ccaccacagg 7680
tgcggccggg cgggagggcg tgagggcgtg ggtggggcat gcccggggtt gtgagagcta 7740
tcgaacgttg tgccgcgcct gtttcacaat gtcgggccac agggtatgca gtttcctctc 7800
catatgtata acaaactgac caccaatcat gcacgctcac acgctctccc acacacacgc 7860
gcaccacgcc accacagcgg cgccgccgtg aagatggccg aggaccgcgg ctgcacgctg 7920
ttcgacctca ccgtggacga cctcaagacc atccacccgc tcttcaccga cgacgtggcg 7980
gcggtgagcg gcggcgcgga gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag  8040
tagcctgggg gggagcgtgt gggaggaacg gcgggggagg ggaggcgggg ggtgtcgttt  8100
gcagccgagc gcacgtggtg ctttgcccca ttccatgcca gcagggtgac acacctgacc  8160
atgctggtgt gctgctaggt ggttcacacc tacgtgtgaa tttgtgctgg cgtgcgcaca  8220
ccttactgtg gccatgtgaa cggcatcctc atgtcctcgt gattgcgccc ggcacattgc  8280
ccacaacccc gcaccaccca gctcctcaat ccagtgcaag gaaaggaaat gcacgcccgc  8340
cgcaccaaca acacgacgca tgtgtttgcc acgtgcgcgc acacacgcgc aggtgtggga  8400
cttcaaccgc agcgccgaga tgcgcgacac ggagggcggc accagcaagc gctcggtgct  8460
ggagcaggtg cagaagatgc gcacctacct ggcggcggag ggacagcact gagcgggtcg  8520
ggggaggggg ggcgggtgtg tatgtgtgtg tgtgtgcgtg tgtaagtctc ggtggagggg  8580
tggtcctcta tatggcggcg gggccacagg gggacgggtg tgacagagtt acggccggag  8640
ccagcggagt cccgggatgg attaaggatc                                   8670
<210>70
<211>745
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>70
atgagatggc gacgcgcccc gcgccgctcc gggcgtcccg gcccccgggc ccagcgcccc  60
ggctccgccg cccgctcgtc gccgccgctg ccgctgctgc cactactgct gctgctgggg  120
accgcggccc tggcgccggg ggcggcggcc ggcaacgagg cggctcccgc gggggcctcg  180
gtgtgctact cgtccccgcc cagcgtggga tcggtgcagg agctagctca gcgcgccgcg  240
gtggtgatcg agggaaaggt gcacccgcag cggcggcagc agggggcact cgacaggaag  300
gcggcggcgg cggcgggcga ggcaggggcg tggggcggcg atcgcgagcc gccagccgcg  360
ggcccacggg cgctggggcc gcccgccgag gagccgctgc tcgccgccaa cgggaccgtg  420
ccctcttggc ccaccgcccc ggtgcccagc gccggcgagc ccggggagga ggcgccctat  480
ctggtgaagg tgcaccaggt gtgggcggtg aaagccgggg gcttgaagaa ggactcgctg  540
ctcaccgtgc gcctggggac ctggggccac cccgccttcc cctcctgcgg gaggctcaag  600
gaggacagca ggtacatctt cttcatggag cccgacgcca acagcaccag ccgcgcgccg  660
gccgccttcc gagcctcttt cccccctctg gagacgggcc ggaacctcaa gaaggaggtc  720
agccgggtgc tgtgcaagcg gtgcg                                        745
<210>71
<2l1>1986
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>71
gaattccttt tttttttttt ttttttcttt ttttttttgc ccttatacct cttcgccttt  60
ctgtggttcc atccacttct tccccctcct cctcccataa acaactctcc tacccctgca  120
cccccaataa ataaataaaa ggaggagggc aaggggggag gaggaggagt ggtgctgcga  180
ggggaaggaa aagggaggca gcgcgagaag agccgggcag agtccgaacc gacagccaga  240
agcccgcacg cacctcgcac catgagatgg cgacgcgccc cgcgccgctc cgggcgtccc  300
ggcccccggg cccagcgccc cggctccgcc gcccgctcgt cgccgccgct gccgctgctg  360
ccactactgc tgctgctggg gaccgcggcc ctggcgccgg gggcggcggc cggcaacgag  420
gcggctcccg cgggggcctc ggtgtgctac tcgtccccgc ccagcgtggg atcggtgcag  480
gagctagctc agcgcgccgc ggtggtgatc gagggaaagg tgcacccgca gcggcggcag  540
cagggggcac tcgacaggaa ggcggcggcg gcggcgggcg aggcaggggc gtggggcggc  600
gatcgcgagc cgccagccgc gggcccacgg gcgctggggc cgcccgccga ggagccgctg  660
ctcgccgcca acgggaccgt gccctcttgg cccaccgccc cggtgcccag cgccggcgag  720
cccggggagg aggcgcccta tctggtgaag gtgcaccagg tgtgggcggt gaaagccggg  780
ggcttgaaga aggactcgct gctcaccgtg cgcctgggga cctggggcca ccccgccttc  840
ccctcctgcg ggaggctcaa ggaggacagc aggtacatct tcttcatgga gcccgacgcc  900
aacagcacca gccgcgcgcc ggccgccttc cgagcctctt tcccccctct ggagacgggc  960
cggaacctca agaaggaggt cagccgggtg ctgtgcaagc ggtgcgcctt gcctccccaa  1020
ttgaaagaga tgaaaagcca ggaatcggct gcaggttcca aactagtcct tcggtgtgaa 1080
accagttctg aatactcctc tctcagattc aagtggttca agaatgggaa tgaattgaat 1140
cgaaaaaaca aaccacaaaa tatcaagata caaaaaaagc cagggaagtc agaacttcgc 1200
attaacaaag catcactggc tgattctgga gagtatatgt gcaaagtgat cagcaaatta 1260
ggaaatgaca gtgcctctgc caatatcacc atcgtggaat caaacgctac atctacatcc 1320
accactggga caagccatct tgtaaaatgt gcggagaagg agaaaacttt ctgtgtgaat 1380
ggaggggagt gcttcatggt gaaagacctt tcaaacccct cgagatactt gtgcaagtgc 1440
ccaaatgagt ttactggtga tcgctgccaa aactacgtaa tggccagctt ctacagtacg 1500
tccactccct ttctgtctct gcctgaatag gagcatgctc agttggtgct gctttcttgt 1560
tgctgcatct cccctcagat tccacctaga gctagatgtg tcttaccaga tctaatattg 1620
actgcctctg cctgtcgcat gagaacatta acaaaagcaa ttgtattact tcctctgttc 1680
gcgactagtt ggctctgaga tactaatagg tgtgtgaggc tccggatgtt tctggaattg 1740
atattgaatg atgtgataca aattgatagt caatatcaag cagtgaaata tgataataaa 1800
ggcatttcaa agtctcactt ttattgataa aataaaaatc attctactga acagtccatc 1860
ttctttatac aatgaccaca tcctgaaaag ggtgttgcta agctgtaacc gatatgcact 1920
tgaaatgatg gtaagttaat tttgattcag aatgtgttat ttgtcacaaa taaacataat 1980
aaaagg                                                            1986
<210>72
<211>2003
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(31)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(32)
<223>可以为任一核酸
<400>72
ggaattcctt tttttttttt tttttttctt nntttttttt tgcccttata cctcttcgcc  60
tttctgtggt tccatccact tcttccccct cctcctccca taaacaactc tcctacccct  120
gcacccccaa taaataaata aaaggaggag ggcaaggggg gaggaggagg agtggtgctg  180
cgaggggaag gaaaagggag gcagcgcgag aagagccggg cagagtccga accgacagcc  240
agaagcccgc acgcacctcg caccatgaga tggcgacgcg ccccgcgccg ctccgggcgt  300
cccggccccc gggcccagcg ccccggctcc gccgcccgct cgtcgccgcc gctgccgctg  360
ctgccactac tgctgctgct ggggaccgcg gccctggcgc cgggggcggc ggccggcaac  420
gaggcggctc ccgcgggggc ctcggtgtgc tactcgtccc cgcccagcgt gggatcggtg  480
caggagctag ctcagcgcgc cgcggtggtg atcgagggaa aggtgcaccc gcagcggcgg  540
cagcaggggg cactcgacag gaaggcggcg gcggcggcgg gcgaggcagg ggcgtggggc  600
ggcgatcgcg agccgccagc cgcgggccca cgggcgctgg ggccgcccgc cgaggagccg  660
ctgctcgccg ccaacgggac cgtgccctct tggcccaccg ccccggtgcc cagcgccggc  720
gagcccgggg aggaggcgcc ctatctggtg aaggtgcacc aggtgtgggc ggtgaaagcc  780
gggggcttga agaaggactc gctgctcacc gtgcgcctgg ggacctgggg ccaccccgcc  840
ttcccctcct gcgggaggct caaggaggac agcaggtaca tcttcttcat ggagcccgac  900
gccaacagca ccagccgcgc gccggccgcc ttccgagcct ctttcccccc tctggagacg  960
ggccggaacc tcaagaagga ggtcagccgg gtgctgtgca agcggtgcgc cttgcctccc  1020
caattgaaag agatgaaaag ccaggaatcg gctgcaggtt ccaaactagt ccttcggtgt  1080
gaaaccagtt ctgaatactc ctctctcaga ttcaagtggt tcaagaatgg gaatgaattg  1140
aatcgaaaaa acaaaccaca aaatatcaag atacaaaaaa agccagggaa gtcagaactt  1200
cgcattaaca aagcatcact ggctgattct ggagagtata tgtgcaaagt gatcagcaaa  1260
ttaggaaatg acagtgcctc tgccaatatc accatcgtgg aatcaaacgc tacatctaca  1320
tccaccactg ggacaagcca tcttgtaaaa tgtgcggaga aggagaaaac tttctgtgtg  1380
aatggagggg agtgcttcat ggtgaaagac ctttcaaacc cctcgagata cttgtgcaag  1440
tgcccaaatg agtttactgg tgatcgctgc caaaactacg taatggccag cttctacagt  1500
acgtccactc cctttctgtc tctgcctgaa taggagcatg ctcagttggt gctgctttct 1560
tgttgctgca tctcccctca gattccacct agagctagat gtgtcttacc agatctaata 1620
ttgactgcct ctgcctgtcg catgagaaca ttaacaaaag caattgtatt acttcctctg l680
ttcgcgacta gttggctctg agatactaat aggtgtgtga ggctccggat gtttctggaa 1740
ttgatattga atgatgtgat acaaattgat agtcaatatc aagcagtgaa atatgataat 1800
aaaggcattt caaagtctca cttttattga taaaataaaa atcattctac tgaacagtcc 1860
atcttcttta tacaatgacc acatcctgaa aagggtgttg ctaagctgta accgatatgc 1920
acttgaaatg atggtaagtt aattttgatt cagaatgtgt tatttgtcac aaataaacat 1980
aataaaagga aaaaaaaaaa aaa                                         2003
<210>73
<211>957
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(809)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(810)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(811)
<223>可以为任一核酸
<400>73
tctcgcccca actttttccc ccgcgctccg cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60
caaaatggca gacctcttca gcggactcgt gggcggcgtc gtcggcgctg ttgctgcagc 120
agatttgcct gcggagggcg agagggcccc ccgccccgcc cccggcactg cctggacttg 180
ctgctgcagc aaactgcaag aaggggcccg cgagctggag ggttttgtgc agcagctgag 240
ttttgttgca gggaagctgg cctgctgcct gcgggtgggg gcggagcagc tggcgcgctg 300
cgctgcggag gggcggctgc ccagcagcag cagcagcagc agctgctgcg cgctgctgca 360
gctcgagaag caggacctcg agcagagcct cgaggccggc aagcagggcg cggagtgcct 420
cttgaggagc agcaaactgg ccctcgaggc cctcctcgag ggggcccgcg ttgcagcaac 480
gcggggtttg ctgctggtcg agagcagcaa agacacggtg ctgcgcagca ttccccacac 540
ccaggagaag ctggcccagg cctacagttc tttcctgcgg ggctaccagg gggcagcagc 600
ggggaggtct ctgggctacg gggcccctgc tgctgcttac ggccagcagc agcagcccag 660
cagctacggg gcgccccccg cctccagcca gcagccctcc ggcttcttct ggtagccctg 720
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcgcgggc ggcagccgcg gcggggccgg 780
ggcgccgctg cagcaacagc agcagccgnn ncggctagcg ccgcggagca ctcgcaggga 840
actccacagg cagcgggaga gcagcaggga cgagaagcag gtcatgtagc gcaggcagca 900
gcgccagctg cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagctcc tgcaccg    957
<210>74
<211>957
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(809)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(810)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(811)
<223>可以为任一核酸
<400>74
tctcgcccca actttttccc ccgcgctccg cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60
caaaatggca gacctcttca gcggactcgt gggcggcgtc gtcggcgctg ttgctgcagc 120
agatttgcct gcggagggcg agagggcccc ccgccccgcc cccggcactg cctggacttg 180
ctgctgcagc aaactgcaag aaggggcccg cgagctggag ggttttgtgc agcagctgag 240
ttttgttgca gggaagctgg cctgctgcct gcgggtgggg gcggagcagc tggcgcgctg 300
cgctgcggag gggcggctgc ccagcagcag cagcagcagc agctgctgcg cgctgctgca 360
gctcgagaag caggacctcg agcagagcct cgaggccggc aagcagggcg cggagtgcct 420
cttgaggagc agcaaactgg ccctcgaggc cctcctcgag ggggcccgcg ttgcagcaac 480
gcggggtttg ctgctggtcg agagcagcaa agacacggtg ctgcgcagca ttccccacac 540
ccaggagaag ctggcccagg cctacagttc tttcctccgg ggctaccagg gggcagcagc 600
ggggaggtct ctgggctacg gggcccctgc tgctgcttac ggccagcagc agcagcccag 660
cagctacggg gcgccccccg cctccagcca gcagccctcc ggcttcttct ggtagccctg 720
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcgcgggc ggcagccgcg gcggggccgg 780
ggcgccgctg cagcaacagc agcagccgnn ncggctagcg ccgcggagca ctcgcaggga 840
actccacagg cagcgggaga gcagcaggga cgagaagcag gtcatgtagc gcaggcagca 900
gcgccagctg cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagctcc tgcaccg    957
<210>75
<211>1089
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<220>
<221>不确定
<222>(376)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(377)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(847)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(849)
<223>可以为任一核酸
<220>
<221>不确定
<222>(850)
<223>可以为任一核酸
<400>75
gaattccctc caactcttcg cgactctctc tctctcgccc caactttttc ccccgcgccc 60
cgcagcagca gcagcagcag cagcagcaaa atggcagacc tcttcagcgg actcgtgggc 120
ggcgtcgtcg gcgctgttgc tgcagcagat ttgcctgcgg agggcgagag ggccccccgc 180
cccgcccccg gcactgcctg gacttgctgc tgcagcaaac tgcaagaagg ggcccgcgag 240
ctggagggtt ttctgcagca gctgagtttt gttgcaggga agctggcctg ctgcctgcgg 300
gtgggggcgg agcagctggc gcgctgcgct gcggaggggc ggctgcccag cagcagcagc 360
agcagcagct gctgcnngct gctgcagctc gagaagcagg acctcgagca gagcctcgag 420
gccggcaagc agggcgcgga gtgcctcttg aggagcagca aactggccct cgaggccctc 480
ctcgaggggg cccgcgttgc agcaacgcgg ggtttgctgc tggtcgagag cagcaaagac 540
acggtgctgc gcagcattcc ccacacccag gagaagctgg ctcaggccta cagttctttc 600
ctgcggggct accagggggc agcagcgggg aggtctctgg gctacggggc ccctgctgct 660
gcttacggcc agcagcagca gcccagcagc tacggggcgc cccccgcctc cagccagcag 720
ccctccggct tcttctggta gccctgcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 780
ggcggcggca gccgcggcgg ggccggggcg ccgctgcagc aacagcagca gccgcggcgg 840
ctagcgnnnn gagcactcgc agggaactcc acaggcagcg ggagagcagc agggacgaga 900
agcaggtcta tgtagcgcag gcagcagcgc cagctgcagc agcagcagca gcagcagcag 960
cagcagcagc agctcctgca ccgcagcgtt gtgtcattta ttacgttggc agctctgagg 1020
cctcggcgca gccaacgcgc ctcaggtatc tttcagactc ttttctctaa ggtcttccag 1080
acggaattc                                                         1089
<210>76
<211>1985
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>76
cgccgagctt tcggcacctc tgccgggtgg taccgagcct tcccggcgcc ccctcctctc  60
ctcccaccgg cctgcccttc cccgcgggac tatcgccccc acgtttccct cagccctttt  120
ctctcccggc cgagccgcgg cggcagcagc agcagcagca gcagcaggag gaggagcccg  180
gtggcggcgg tggccgggga gcccatggcg tacagtcaag gaggcggcaa aaaaaaagtc  240
tgctactact acgacggtga tattggaaat tattattatg gacagggtca tcccatgaag  300
cctcatagaa tccgcatgac ccataacttg ctgttaaatt atggcttata cagaaaaatg  360
gaaatatata ggccccataa agccactgcc gaagaaatga caaaatatca cagtgatgag  420
tatatcaaat ttctacggtc aataagacca gataacatgt ctgagtatag taagcagatg  480
catatattta atgttggaga agattgtcca gcgtttgatg gactctttga gttttgtcag  540
ctctcaactg gcggttcagt tgctggagct gtgaagttaa accgacaaca gactgatatg  600
gctgttaatt gggctggagg attacatcat gctaagaaat acgaagcatc aggattctgt  660
tacgttaatg atattgtgct tgccatcctt gaattactaa agtatcatca gagagtctta  720
tatattgata tagatattca tcatggtgat ggtgttgaag aagcttttta tacaacagat  780
cgtgtaatga cggtatcatt ccataaatat ggggaatact ttcctggcac aggagacttg  840
agggatattg gtgctggaaa aggcaaatac tatgctgtca attttccaat gtgtgatggt  900
atagatgatg agtcatatgg gcagatattt aagcctatta tctcaaaggt gatggagatg  960
tatcaaccta gtgctgtggt attacagtgt ggtgcagact cattatctgg tgatagactg  1020
ggttgtttca atctaacagt caaaggtcat gctaaatgtg tagaagttgt aaaaactttt  1080
aacttaccat tactgatgct tggaggaggt ggctacacaa tccgtaatgt tgctcgatgt  1140
tggacatatg agactgcagt tgcccttgat tgtgagattc ccaatgagtt gccatataat  1200
gattactttg agtattttgg accagacttc aaactgcata ttagtccttc aaacatgaca  1260
aaccagaaca ctccagaata tatggaaaag ataaaacagc gtttgtttga aaatttgcgc  1320
atgttacctc atgcacctgg tgtccagatg caagctattc cagaagatgc tgttcatgaa  1380
gacagtggag atgaagatgg agaagatcca gacaagagaa tttctattcg agcatcagac  1440
aagcggatag cttgtgatga agaattctca gattctgagg atgaaggaga aggaggtcga  1500
agaaatgtgg ctgatcataa gaaaggagca aagaaagcta gaattgaaga agataagaaa  1560
gaaacagagg acaaaaaaac agacgttaag gaagaagata aatccaagga caacagtggt  1620
gaaaaaacag ataccaaagg aaccaaatca gaacagctca gcaacccctg aatttgacag  1680
tctcaccaat ttcagaaaat cattaaaaag aaaatattga aaggaaaatg ttttcttttt  1740
gaagacttct ggcttcattt tatactactt tggcatggac tgtatttatt ttcaaatggg  1800
actttttcgt ttttgttttt ctgggcaagt tttattgtga gattttctaa ttatgaagca  1860
aaatttcttt tctccaccat gctttatgtg atagtattta aaattgatgt gagttattat  1920
gtcaaaaaaa ctgatctatt aaagaagtaa ttggcctttc tgagctgaaa aaaaaaaaaa  1980
aaaag                                                              1985
<210>77
<211>476
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>77
ccaccctcct ccccctcccc cggccacttc gctaacttgg tggctgttgt gatgcgtatt  60
cctgtagatc cgagcaccag ccggcgcttc agccccccct ccagcagcct gcagcccggc  120
aaaatgagcg acgtgagccc ggtggtggct gcgcaacagc agcagcaaca gcagcagcag  180
caacagcagc agcagcagca gcaacagcag cagcagcagc aggaggcggc ggcggcggct  240
gcggcggcag cggcggctgc ggcggcggca gctgcagtgc cccggttgcg gccgccccac  300
gacaaccgca ccatggtgga gatcatcgcc gaccacccgg ccgaactcgt ccgcaccgac  360
agccccaact tcctgtgctc ggtgctgccc tcgcactggc gctgcaacaa gaccctgccc  420
gtggccttca aggtaagagg ctaccccgcc ccccgccccc ggccgggagc ggcgga      476
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：DNA引物
<400>78
gcattttgga  tccgcctttt  catg                                      24
<210>79
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：DNA引物
<400>79
gttgtgtgct  gcagattgtt  cc                                        22
<210>80
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：DNA引物
<400>80
gaaaaatggg gatccgaggt  g                                          21
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：DNA引物
<400>81
gcaggagaat  tccgtccatg                                            20
<210>82
<211>5
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(3)
<223>可以为任一氨基酸
<400>82
Trp Ser Xaa Trp Ser
1               5
<210>83
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>83
Cys Ser Val Thr Cys Gly
1               5
<210>84
<211>5
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>不确定
<222>(4)
<223>可以为任一氨基酸
<400>84
Gly Cys Gln Xaa Arg
1               5
<210>85
<211>733
<212>DNA
<213>人
<400>85
gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg  60
aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga  120
tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg  180
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg  240
aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact  300
ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg  360
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc  420
catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct  480
atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga  540
ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg  600
acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc  660
acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc  720
gactctagag gat                                                     733
<210>86
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：DNA引物
<400>86
gcgcctcgag atttccccga aatctagatt tccccgaaat gatttccccg aaatgatttc  60
cccgaaatat ctgccatctc aattag                                       86
<210>87
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：DNA引物
<400>87
gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc                                      27
<210>88
<211>271
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR片段
<400>88
ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg  60
aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc  120
gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat  180
ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt  240
ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct t                                 271
<210>89
<211>32
<212>DNA
<213>人
<400>89
gcgctcgagg gatgacagcg atagaacccc gg                                32
<210>90
<211>31
<212>DNA
<213>人
<400>90
gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c                                 31
<210>91
<211>12
<212>DNA
<213>人
<400>91
ggggactttc cc                                                      12
<210>92
<211>73
<212>DNA
<213>人
<400>92
gcggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatcctg  60
ccatctcaat tag                                                     73
<210>93
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR片段
<400>93
gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc                                      27
<210>94
<211>652
<212>DNA
<213>人
<400>94
ggcataagat cacactttag ttcagagaca catttgcata aatacttgaa atggatccac  60
ccctgcaggt ggcagcctga gaacatggcg ctgcaggggg accagggcag cgtctggttc  120
aggtggacga acagcggtgc catcacgtgg tgcttgccca tgggcccgaa gagccgtgtg  180
cagggcttgg agtcgtcgtg gggcatgctg aggacgtgcc ctagttcatg ggccagggtg  240
tgggccgcct ggagcccctc atcctcgatc acggagcagc ttttgttggg gtcacaaatg  300
gtcccgatgt ctgccacacc cagggtgtca cacagcccct cctgcccaca gaagttctgt  360
ctggtgagca ggatggccgt gtcgtagtgc tctgggtggc ggtcgctggg ctggttgaaa  420
cgccgctgcc agttgcagaa gttacgcagt gtaagccccc cattgtcgga cacctctggg  480
ccccattttt catcttctac gatcagcact tttaccacca tcangttgat ggaattcttg  540
atgctggggt gcttgtagaa tcgggcttgc cacgaaaatt aacctcagga tgtggttctg  600
caggtcggcc cgtaaagggc gccatggacg catcggccac caacagcgtt tc          652
<210>95
<211>716
<212>CDNA
<213>人
<400>95
taagtttgct agtcctttgc aaacagactg acgctgagtg tcctgtctga gtcaataagt  60
gcacttttac cttttaacct atgccctcta cttgaacccg agcaaggtcc agtccactgg  120
acagttgatg atagggtctg ccgccccata ccctctcctc ttccccctta ggaatttgtg  180
cagtactgga ggggttgcgg caatgggagg cctgggtggg ccgtgctgcc ttgatatggc  240
caagggaccc agtcaccaca gtggagaccc ttgtctgcac ctcagtaccg catgtccagg  300
agcacaagac tggcccctgc ccccctgaat cacagggggc acagctggct ttcgcagggc  360
ttggcatcct cgggtttcag agccttgttg caggtggcag aggcctggcc ggaggggtcc  420
ctgcactcta cagttcgcct ctgccagccg gccccgcagg tgctagagca ctcagaccag  480
tcccccagca cccactgtgc gtggagcagc ggctggatga tgttggtggt tgctctctct  540
ttgctgctct gcatgctaaa agtcacgtca ttaggaanca aagaaggtgt atttgacttt  600
ttggggggaa gaacctcgcc caggactgtc aggagctgca ctgtcagaag gctctgcnaa  660
ggcccngaag ctctgcangc gctccagggt ggcgatggag ccgtgtactt caggat      716
<210>96
<211>543
<212>DNA
<213>人
<400>96
ggcataagat cacactttag ttcagagaca catttgcata aatacttgaa atggatccac  60
ccctgcaggt ggcagcctga gaacatggcg ctgcaggggg accagggcag cgtctggttc  120
aggtggacga acagcggtgc catcacgtgg tgcttgccca tggcctcgaa gagccgtgtg  180
cagggcttgg agtcgtcgtg gggcatgctg aggacgtgcc ctagttcatg ggccagggtg  240
tgggccgctg gagccctcat cctcgatcac ggagcagctt ttgttggggt cacaaatggt  300
cccgatgtct gccacaccca gggtgtcaca cagcccctcc tgcccacaga agttctgtct  360
ggtgagcagg atggccgtgt cgtagtgctc tgggtggcgg tcgctgggct ggttgaaacg  420
ccgctgccag ttgcagaagt tacgcagtgt aaggccccca ttgtcggaca gctctggggc  480
ccatttttca tcttctacga tcagcacttt taaccacatc aggttgatgg aattcttgat  540
gcc                                                                543
<210>97
<211>377
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>97
gcaaagtgcc accacccttc ggatccaaaa ctagaagcaa gaggtttgtg tccgaggctc  60
gcttcgtgga aacacttctg gtggctgatg cgtccatggc tgccttctat gggaccgacc  120
tgcagaacca catcctcacg gtgatgtcaa tggcagcccg aatctacaag cacccgagca  180
tcaagaactc cgtcaacctt gtggtggtga aagtgctaat agtggaagag gaaggatggg  240
gcccggaggt gtcggacaac ggggggctca cactgcgcaa cttctgcagc tggcaacggc  300
gtttcaacaa gcccagtgac cgccacccgg agcactatga cactgccatc ttgttcacca  360
gacagaactt ctgtggg                                                 377
<210>98
<211>432
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>98
ctaaagtaca gtggttccat ggccaccctg gagcggctgc anagcttcca agccctccct  60
gagcctctta cagtacagct cctgactgtg tctggtgagg tcttccctcc aaaagtcaaa  120
tataccttct tcgtccccaa tgacacggac ttcaacgtgc agagtagcaa agaaagagca  180
agcaccaaca tcattcagtc cttgccctat gcanagtggg tgctggggga ctggtctgaa  240
tgtccaagca catgtggagg tggctggcag cggcggactg tggaatgcag ggacccctca  300
ggtcaggcct ctgacacctg tgatgaggct ctgaaacctg aggatgccaa gccctgtgga  360
agccagccat gtctcctctg atccccttgg tggacatgtc taaggcttat ggatttgggc  420
tactggcgtt tt                                                      432
<210>99
<211>354
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>99
caaagtgcac cacccttcgg atccaaaact agaagcaaga ggtttgtgtc cgaggctcgc  60
ttcgtggaaa cacttctggt ggctgatgcg tccatggctg ccttctatgg gaccgacctg  120
cagaaccaca tcctcacggt gatgtcaatg gcagccacga atctacaagc acccgagcat  180
caggaactcc gtcaaccttg tggtggtgaa agtgctaata gtggaagagg aaggatgggg  240
cccggagtgt cggacaacgg ggggctcaca ctgcgcaact tctgcagctg gcaacggcgt  300
ttcaacaagc ccagtgaccg ccacccggag cactatgaca ctgccatctt gttc        354
<210>100
<211>389
<212>DNA
<213>人
<400>100
ttgtgcccag aagacactgg ccctggggcc tgggttgagt tcaaaaccaa aagaaagaag  60
aaaagtgctg taaattcggg atttctccac cggatgctcc tgcttccgca tgggtgtcac  120
ctccatgccg ttcctncctc tttctaggga aaagcttcag ggagcagcag tgtgagaagt  180
ataatgccta caattacact gacatggacg ggaatctcct gcagtgggtc cccaagtatg  240
ctggggtgtc cccccgggac cgcctggcaa gttgttctgc cgagcccggg ggaggagcga  300
gttcaaagtg ttcgaggcca aggtgagaat caccctgggg gacttcagat ccagagatgg  360
ggggagggaa ggtcggcctg ttccccaca                                    389
<210>101
<211>305
<212>DNA
<213>人
<400>101
catttaagtt tgctagtcct ttgcaaacag actgacgctg agtgtcctgt ctgagtcaat  60
aagtgcactt ttacctttta acctatgccc tctacttgaa cccgagcaag gtccagtcca  120
ctggacangt tgatgatagg gtctgncgcc ccataccctc tcctcttccc ccttaggaat  180
ttgtgcagta ctggaggggt tgcggcaatg ggaggcctgg gtgggccgtg ctgccttgat  240
atggccaagg gacccagtca ccacagtgga gacccttgtc tgcacctcag taccgcatgt  300
ccagg                                                              305
<210>102
<211>152
<212>DNA
<213>人
<400>102
atcgtagaag atgaaaaatg gggcccagag gtgtccgaca atggggggct tacactgcgt  60
aacttctgca actggcagcg gcgtttcaac cagcccagcg accgncaccc agagcactac  120
gncacggcca tcctnctcac cagacagaac tt                                152
<210>103
<211>632
<212>DNA
<213>人
<400>103
tttaataata ataatgcccg gggctttatt atgctgtatc actgctcaga ggttaataat  60
cctcactaac tatcctatca aatttgcaac tggcagttta ctctgatgat tcaactcctt  120
ttctatctac ccccataatc ccaccttact gatacacctc actggttact ggcaagatac  180
gctggatccc tccagccttc ttgctttccc tgcaccagcc cttcctcact ttgccttgcc  240
ctcaaagcta acaccactta aaccacttaa ctgcattctg cchttgtgca aaagtctatg  300
aaatgtttag gtttctttaa aggatcacag ctctcatgag ataacacccc tccatcatgg  360
gacagacact tcaagcttct ttttttgtaa cccttcccac aagtcttaga acatgatgac  420
cactccccca gctgccactg ggggcaggga tggtctgcac aaggtctggt gctggctggc  480
ttcacttcct ttgcacactc ggaagcaggc tgtccattaa tgtctcggca ttctaccagt  540
cttctctgcc aacccaattc acatgactta gaacattcgc cccactcttc aatgacccat  600
gctgaaaaag tggggatagc attgaaagaa tc                                632
<210>104
<211>519
<212>DNA
<213>人
<400>104
tttttttcta aacttgtaat agatgtaaca aaagaaataa taataataat gcccggggct  60
ttattatgct atatcactgc tcagaggtta ataatcctca ctaactatcc tatcaaattt  120
gcaactggca gtttactctg atgattcaac tccttttcta tctaccccca taatcccacc  180
ttactgatac acctcactgg ttactggcaa gatacgctgg atccctccag ccttcttgct  240
ttccctgcac cagcccttcc tcactttgcc ttgccctcaa agctaacacc acttaaacca  300
cttaactgca ttctgccatt gtgcaaaagt ctatgaaatg tttaggtttc tttaaaggat  360
cacagctctc atgagataac acccctccat catgggacag acacttcaag cttctttttt  420
tgtaaccctt cccacaggtc ttagaacatg atgaccactc ccccagctgc cactgggggc  480
agggatgtct gcacaagggc tggtgctggc tgcccggac                         519
<210>105
<211>475
<212>DNA
<213>人
<400>105
gagtcatgat gcgatcacaa ccagctttta cacactgtcc ttgcacacag acagaggtgg  60
aatctgggct acatggagta ccatctacaa ccttgggctg caaaacgaag aagtagccaa  120
tgcctttggc ttggcagatg agcttgcacc tgtcctttgg tgagacgcca gcgtacttgg  180
gaatccattc caccgcaggc ccactcccaa aggaagcttt tgaaaactcg ttgtgtgctt  240
cacattgttc ctctctaaag gtttttccat tattgtctgg acagtcctca aggttacagg  300
atctgtagcg cactcgtttg ccttcacagt acttccctcc attctttggg actgggttgt  360
cacattccct catcgtgtac tggactcctc caccgcacgt tctcgaacag tctccccaag  420
gcccccacat tccccagctt ccatgaaaag gcgtatcaaa atgctttctg tcggt       475
<210>106
<211>455
<212>DNA
<213>人
<400>106
aataataata atgcccgggg ctttattatg ctgtatcact gctcagaggt taataatcct  60
cactaactat cctatcaaat ttgcaactgg cagtttactc tgatgattca actccttttc  120
tatctacccc cataatccca ccttactgat acacctcact ggttactggc aagatacgct  180
ggatccctcc agccttcttg ctttccctgc accagccctt cctcactttg ccttgccctc  240
aaagctaaca ccacttaaac cacttaactg cattctgcca ttgtgcaaaa gtctatgaaa  300
tgtttaggtt tctttaaagg atcacagctc tcatgagata acacccctcc atcatgggac  360
agacacttca agcttctttt tttgtaaccc ttcccacagg tcttagaaca tgatgaccac  420
tcccccagct gccactgggg gcagggatgg tctgg                             455
<210>107
<211>515
<212>DNA
<213>人
<400>107
aacccttccc acaggtctta gaacatgatg accactcccc cagctgccac tgcggggcag  60
ggatggtctg cacaaggtct ggtgctggct ggcttcactt cctttgcaca ctcggaagca  120
ggctgtccat taatgtctcg gcattcttcc agtcttctct gccaacccaa ttcacatgac  180
ttagaacatt cgccccactc ttcaatgacc catgctgaaa aagtggggat agcattgaaa  240
gattccttct tcttctttac gaagtaggtg tatttaattt taggtcgaag ggcattgcca  300
cagtaagaac ctggatggtc aagggctctt tggagcaggc taaagctgcg aattctttcc  360
aatgccgcag aggagccgct gtacctcaag acaacacctt tgtacataat gtcttgctct  420
aaggtggaca aagtgtagtc accataaaga atatatgtgc catcagcagc ttttgatggc  480
aggaagctgt cattgttctt ggatccctct gttcc                             515
<210>108
<211>359
<212>DNA
<213>人
<400>108
acttcgtaaa gaagaagaag gaatctttca atgctatccc cactttttca gcatgggtca  60
ttgaagagtg gggcgaatgt tctaagtcat gtgaattggg ttggcagaga agactggtag  120
aatgccgaga cattaatgga cagcctgctt ccgagtgtgc aaaggaagtg aagccagcca  180
gcaccagacc ttgtgcagac catccctgcc cccagtggca gctgggggaa gtggtcatca  240
tgttctaaga cctgcgggaa gggttacaaa aaaagaagct ttgaagtgtc ttgtcccatg  300
atggaggggt gttatctcat tgagagctgt gatcctttaa agaaacctaa acatttcat   359
<210>109
<211>320
<212>DNA
<213>人
<400>109
cagagaacat tcgccccact cttcaatgac ccatgctgaa aaagtgggga tagcattgaa  60
agattccttc ttcttcttta cgaagtaggt gtatttaatt ttaggtcgaa gggcattgcc  120
cacagtaaga acctggatgg tcaagggctc tttgagaggg ctaaagctgc gaattctttc  180
caatgccgca gaggagccgc tgtacctcaa gacaacacct ttgtacataa tgtcttgctc  240
taaggtggac aaagtgtagt caccattaag aatatatgtg ccatcagcag ctttgatggc  300
aagaaagctg cccttgttcc                                              320
<210>110
<211>316
<212>DNA
<213>人
<400>110
aatgccgaga cattaatgga cagcctgctt ccgagtgtgc aaaggaagtg aagccagcca  60
gcaccagacc ttgtgcagac catccctgcc cccagtggca gctgggggag tggtcatcat  120
gttctaagac ctgtgggaag ggttacaaaa aaagaagctt gaagtgtctg tcccatgatg  180
gaggggtgtt atctcatgag agctgtgatc ctttaaagaa acctaaacat ttcatagact  240
tttgcacaat ggcagaatgc agttaagtgg tttaagtggt gttagctttg agggcaaggc  300
aaagtgagga agggct                                                  316
<210>111
<211>318
<212>DNA
<213>人
<400>111
agantnccga gacattaatg gacagcctgc ttccgagtgt gcaaaggaag tgaagccagc  60
cagcaccaga ccttgtgcag accatccctg cccccagtgg cagctggggg agtggtcatc  120
atgttctaag acctgtggga agggttacaa aaaaagaagc ttgaagtgtc tgtcccatga  180
tggaggggtg ttatctcatg agagctgtga tcctttaaag aaacctaaac atttcataga  240
cttttgcaca atggcagaat ncagttaagt ggtttaagtg gtgttagctt tgagggcaag  300
gcaaagtgag gaagggct                                                318
<210>112
<211>314
<212>DNA
<213>人
<400>112
ttttttttct aaacttgtaa tagatgtaac aaaagaaata ataataataa tgcccggggc  60
tttattatgc tatatcactg ctcagaggtt aataatcctc actaactatc ctatcaaatt  120
tgcaactggc agtttactct gatgattcaa ctccttttct atctaccccc ataatcccac  180
cttactgata cacctcactg gttactggca agatacgctg gatccctcca gccttcttgc  240
tttccctgca ccagcccttc ctcactttgc cttgccctca aagctaacac cacttaaacc  300
acttaactgc attc                                                    314
<210>113
<211>316
<212>DNA
<213>人
<400>113
aaggaatcct tcaatgctat ccccactgtt tcagcatggg tcattgaaga gtggggcgaa  60
tgttctaagt catgtgaatt gggttggcag aaaagacttg tagaatgccg agacattaat  120
gghcagcctg cgtccgagtg tgcaaaggaa gtgaagccag ccagcaccag accttgtgca  180
gaccatccct gcccccagtg gcagctgggg ggagtggtca tcatgttcta agacctgtgg  240
gaaggggtac aaaaaaagag gcgtgaagtg tctgtcccat gatggagggg tttatctcat  300
gagaactgtg atcctt                                                  316
<210>114
<211>265
<212>DNA
<213>人
<400>114
agcagtttan ncctntcaaa gagcccttga ccatccaggt tcttactgtg ggcaatgccc  60
ttcgacctaa aattaaatac acctacttcg taaagangaa gaaggaatct ttcaatgcta  120
tccccacttt ttcagcatgg gtcattgaag agtggggcga atgttctaag tcatgtgaat  180
tgggttggca gagaagactg gtagaatgcc gagacattaa tggacagcct ncttccgagt  240
gtgcaaagna agtgaagcca gccag                                        265
<210>115
<211>334
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>115
cgtttgtgga ggaaacggtt ccacatgcaa gaagatgtca ggaatagtca ctagtacaag  60
acctgggtat catgacattg tcacaattcc tgctggagcc accaacattg aagtgaaaca  120
tcggaatcaa agggggtcca gaaacaatgg cagctttctg gctattagag ccgctgatgg  180
tacctatatt ctgaatggaa acttcactct gtccacacta gagcaagacc tcacctacaa  240
aggtactgtc ttaaggtaca gtggttcctc ggctgcgctg gagagaatcc gcagctttag  300
tccactcaaa gaacccttaa ccatccaggt tctt                              334
<210>116
<211>528
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>116
agaattcctg gatgatggtc atggtaattg cttccgtggt aggtctagca aacaattacc  60
atgaccatca tccaggaatt ctgtgatggt ggctgacgtg catttggacc agggcttgga  120
tgcatcgatg ctggtaagga ttgaagacat taaacgcttg tcttctgtag taccgaagtt  180
ctcttcacag aatttggaat cgtcatgaga aaggccaagt agatgcccaa tttcatgagc  240
cacagtgaag gctgcatgga ggccatcatc ttcaatcact gcacagctgc gctccggaga  300
acatatggtc ccaacgtctg ccattcccag ggtgtcacat gaatgatgcc cacataaatc  360
ctctcgggtg aacaggatgg ctgcatcgta gtgctcttcg tgatcatccc ctagctggtt  420
atgttggtgc tgccatttgc aaaagttctt gagggtcgtg gccgcattct tgctcacctc  480
cagactcgtg tccttgtccg tcagcaccac caccttcacc accgccag               528
<210>117
<211>438
<212>DNA
<213>人
<400>117
atttgatagg atagttagtg aggattatta acctctgagc agtgatatag cataataaag  60
ccccgggcat tattattatt atttcttttg ttacatctat tacaagttta gaaaaaacaa  120
agcaattgtc aaaaaaagtt agaactatta caacccctgt ttcctggtac ttatcaaata  180
cttagtatca tgggggttgg gaaatgaaaa gtaggagaaa agtgagattt tactaagacc  240
tgttttactt tacctcacta acaatggggg gagaaaggag tacaaatagg atctttgacc  300
agcactgttt atgggctgct atgggtttca gaggaatgtt tatacattat ttctacccga  360
ggatttaaaa cttcagattg ttccaaccng gaggggaagg gcttccggcc aacgtggaat  420
taaccggcaa tnggcctt                                                438
<210>118
<211>455
<212>DNA
<213>人
<400>118
atttgatagg atagttagtg aggattatta acctctgagc agtgatatag cataataaag  60
ccccgggcat tattattatt atttcttttg ttacatctat tacaagttta gaaaaaacaa  120
agcaattgtc aaaaaaagtt agaactatta caacccctgt ttcctggtac ttatcaaata  180
cttagtatca tgggggttgg gaaatgaaaa gtaggagaaa agtgagattt tactaagacc  240
tgttttactt tacctcacta acaatggggg gagaaaggag tacaaatagg atctttgacc  300
agcactgttt atggctgcta tggtttcaga gaatgtttat acattatttc taccgaggat  360
taaaacttcc agattgtttc aacatggaga ggaaaggctc aggcaacgtg gaaataacgc  420
aaatgggctt cctcttttcc tttttgggac cntct                             455
<210>119
<211>380
<212>DNA
<213>人
<400>119
aatttgatag gatagttagt gaggnttatt aacctctgag cagtgatata gcataataaa  60
gccccgggca ttattattat tattnctttt gttacatcta ttacaagttt agaaaaaaca  120
aagcaattgt caaaaaaagt tagaactatt acaacccctg tttcctggta cttatcaaat  180
acttagtatn atgggggttg ggaaatgaaa agtaggagaa aagtgagatt ttactaagac  240
ctgttttact ttacctcact aacaatgggg ggagaaagga gtacanatag gatctttgac  300
cagcactgtt tatggctgct atggtttcag aggaatgttt atacattatt tctaccgaga  360
nttaaaactt cagattgttc                                              380
<210>120
<211>199
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>120
caatggcagc ttgctggcta taatagccgc tgatggtacc tatatactga atggaaactt  60
cactctgtcc acactagagc aagacctcac ctacgaatgt actgtcttaa ggtacagtgg  120
ttcctcggct gcgcaggaaa gagtccgcag ctttagtcca ctcaaataac ccttaaccat  180
ccaggttctt atggtagga                                               199
<210>121
<211>439
<212>DNA
<213>人
<400>121
atttaacctc tgagcagtga tatagcataa taaagccccg ggcattatta ttattatttc  60
ttttgttaca tctattacaa gtttagaaaa aacaaagcaa ttgtcaaaaa aagttagaac  120
tattacaacc cctgtttcct ggtacttatc aaatacttag tatcatgggg gttgggaaat  180
gaaaagtagg aggaaagnng agnttttact aagacctgtt ttacctttac ctcactaaca  240
atggggggag aaaggagtac aaataggatc tttgaccagc actgtttatg gctgctatgg  300
tttcagagaa tgtttataca ttatttctac cgagaattaa aacttcagat tgttcaacat  360
ggagagaaag gctcagcaac gtggaaataa cgcaaatggg cttccccctt tccctttttt  420
gggaccatct caggtcctt                                               439
<210>122
<211>471
<212>DNA
<213>人
<400>122
cagagtaaac tgccagttgc aaatttgata ggatagttag tgaggattat taacctctga  60
gcagtgatat agcataataa agccccgggc attattatta ttattatttc ttttgttaca  120
tctattacaa gtttagaaaa aacaaagcaa ttgtcaaaaa aagttagaac tattacaacc  180
cctgtttcct ggtacttatc aaatacttag tatcatgggg gttgggaaat gaaaagtagg  240
agaaaagtga gattttacta agacctgttt tacttttcct cactaacaat ggggggagaa  300
aggagtacaa ataggatctt tgaccagcac tgtttatggc tgctatggtt tcagagaatg  360
tttatacatt atttctaccc gagaattaaa acttcagatt ggttcaacat gagagaaagg  420
ctccagcaac gtgaaattaa cgccaatggc ttcctccttc ccttttttgg a           471
<210>123
<211>424
<212>DNA
<213>人
<400>123
cgtgaggatt attaacctct gagcagtgat atagcatant aaagccccgg nattattatt  60
attatttctt ttgttacatc tattacaagt ttagaaaaaa caaagcaatt gtcaaaaaaa  120
gttagaacta ttacaacccc tgtttcctgg tacttatcaa atacttagta tcatgggggt  180
tgggaaatga aaagtaggag aaaagtgaga ttttactaag acctgtttta ctttacctca  240
ctaacaatgg ggggagaaag gagtacaaat aggatctttg accagcactg tttatggctg  300
ctaatggttt cagagaatgt ttatacatta tttctacccg agaattaaaa cttcagattg  360
ttcaacctga gagaaaggct cagcaacgtg aaatnacgcc aatggcttcc tctttccctt  420
tttg                                                               424
<210>124
<211>458
<212>DNA
<213>人
<400>124
tacatctatt acaagtttag aaaaaacaaa gcaattgtca aaaaaagtta gaactattac  60
aacccctgtt tcctggtact tatcaaatac ttagtatcat gggggttggg aaatgaaaag  120
taggagaaaa gtgagatttt actaagacct gttttacttt acctcactaa caatgggggg  180
agaaaggagt acaaatagga tctttgacca gcactgttta tggctgctat ggtttcagag  240
aatgtttata cattatttct accgagaatt aaaacttcag attgttcaac atgagagaaa  300
ggctcagcaa cgtgaaataa cgcaaatggc ttcctctttc cttttttgga ccacagccag  360
ccttggtctc cttgcagtgg ctacatgatt acatcatttc tggataatag tcatggggaa  420
tgtttgatgg acaagctcag aatcccatac agntccca                          458
<210>125
<211>968
<212>PRT
<213>人
<400>125
Met Gln Arg Ala Val Pro Glu Gly Phe Gly Arg Arg Lys Leu Gly Ser
 1               5                   10                  15
Asp Met Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser Arg Ser Phe Gly
             20                  25                  30
Pro Val Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ala Val Ser
         35                  40                  45
Asp Ala Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu Leu Val Val Pro
     50                  55                  60
Glu Leu Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg Leu Arg Leu His
 65                  70                  75                  80
Ala Phe Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro Asp Ser Ser Phe
                 85                  90                  95
Leu Ala Pro Gly Phe Thr Leu Gln Asn Val Gly Arg Lys Ser Gly Ser
            100                 105                 110
Glu Thr Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys Phe Tyr Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Val Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Glu
    130                 135                 140
Gly Val Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala Tyr Phe Ile Gln
145                 150                 155                 160
Pro Leu Pro Ala Ala Ser Glu Arg Leu Ala Thr Ala Ala Pro Gly Glu
                165                 170                 175
Lys Pro Pro Ala Pro Leu Gln Phe His Leu Leu Arg Arg Asn Arg Gln
            180                 185                 190
Gly Asp Val Gly Gly Thr Cys Gly Val Val Asp Asp Glu Pro Arg Pro
        195                 200                 205
Thr Gly Lys Ala Glu Thr Glu Asp Glu Asp Glu Gly Thr Glu Gly Glu
    210                 215                 220
Asp Glu Gly Pro Gln Trp Ser Pro Gln Asp Pro Ala Leu Gln Gly Val
225                 230                 235                 240
Gly Gln Pro Thr Gly Thr Gly Ser Ile Arg Lys Lys Arg Phe Val Ser
                245                 250                 255
Ser His Arg Tyr Val Glu Thr Met Leu Val Ala Asp Gln Ser Met Ala
            260                 265                 270
Glu Phe His Gly Ser Gly Leu Lys His Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Ser
        275                 280                 285
Val Ala Ala Arg Leu Tyr Lys His Pro Ser Ile Arg Asn Ser Val Ser
    290                 295                 300
Leu Val Val Val Lys Ile Leu Val Ile His Asp Glu Gln Lys Gly Pro
305                 310                 315                 320
Glu Val Thr Ser Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp
                325                 330                 335
Gln Lys Gln His Asn Pro Pro Ser Asp Arg Asp Ala Glu His Tyr Asp
            340                 345                 350
Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Ser Gln Thr Cys
        355                 360                 365
Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp Pro Ser Arg
    370                 375                 380
Ser Cys Ser Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ala Ala Phe Thr Thr
385                 390                 395                 400
Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp Asp Ala Lys
                405                 410                 415
Gln Cys Ala Ser Leu Asn Gly Val Asn Gln Asp Ser His Met Met Ala
            420                 425                 430
Ser Met Leu Ser Asn Leu Asp His Ser Gln Pro Trp Ser Pro Cys Ser
        435                 440                 445
Ala Tyr Met Ile Thr Ser Phe Leu Asp Asn Gly His Gly Glu Cys Leu
    450                 455                 460
Met Asp Lys Pro Gln Asn Pro Ile Gln Leu Pro Gly Asp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Thr Ser Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Cys Gln Phe Thr Phe Gly Glu Asp
                485                 490                 495
Ser Lys His Cys Pro Asp Ala Ala Ser Thr Cys Ser Thr Leu Trp Cys
            500                 505                 510
Thr Gly Thr Ser Gly Gly Val Leu Val Cys Gln Thr Lys His Phe Pro
        515                 520                 525
Trp Ala Asp Gly Thr Ser Cys Gly Glu Gly Lys Trp Cys Ile Asn Gly
    530                 535                 540
Lys Cys Val Asn Lys Thr Asp Arg Lys His Phe Asp Thr Pro Phe His
545                 550                 555                 560
Gly Ser Trp Gly Met Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys
                565                 570                 575
Gly Gly Gly Val Gln Tyr Thr Met Arg Glu Cys Asp Asn Pro Val Pro
            580                 585                 590
Lys Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Lys Arg Val Arg Tyr Arg Ser
        595                 600                 605
Cys Asn Leu Glu Asp Cys Pro Asp Asn Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu
    610                 615                 620
Glu Gln Cys Glu Ala His Asn Glu Phe Ser Lys Ala Ser Phe Gly Ser
625                 630                 635                 640
Gly Pro Ala Val Glu Trp Ile Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Lys
                645                 650                 655
Asp Arg Cys Lys Leu Ile Cys Gln Ala Lys Gly Ile Gly Tyr Phe Phe
            660                 665                 670
Val Leu Gln Pro Lys Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser
        675                 680                 685
Thr Ser Val Cys Val Gln Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp Arg
    690                 695                 700
Ile Ile Asp Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly
705                 710                 715                 720
Asn Gly Ser Thr Cys Lys Lys Ile Ser Gly Ser Val Thr Ser Ala Lys
                725                 730                 735
Pro Gly Tyr His Asp Ile Ile Thr Ile Pro Thr Gly Ala Thr Asn Ile
            740                 745                 750
Glu Val Lys Gln Arg Asn Gln Arg Gly Ser Arg Asn Asn Gly Ser Phe
        755                 760                 765
Leu Ala Ile Lys Ala Ala Asp Gly Thr Tyr Ile Leu Asn Gly Asp Tyr
    770                 775                 780
Thr Leu Ser Thr Leu Glu Gln Asp Ile Met Tyr Lys Gly Val Val Leu
785                 790                 795                 800
Arg Tyr Ser Gly Ser Ser Ala Ala Leu Glu Arg Ile Arg Ser Phe Ser
                805                 810                 815
Pro Leu Lys Glu Pro Leu Thr Ile Gln Val Leu Thr Val Gly Asn Ala
            820                 825                 830
Leu Arg Pro Lys Ile Lys Tyr Thr Tyr Phe Val Lys Lys Lys Lys Glu
        835                 840                 845
Ser Phe Asn Ala Ile Pro Thr Phe Ser Ala Trp Val Ile Glu Glu Trp
    850                 855                 860
Gly Glu Cys Ser Lys Ser Cys Glu Leu Gly Trp Gln Arg Arg Leu Val
865                 870                 875                 880
Glu Cys Arg Asp Ile Asn Gly Gln Pro Ala Ser Glu Cys Ala Lys Glu
                885                 890                 895
Val Lys Pro Ala Ser Thr Arg Pro Cys Ala Asp His Pro Cys Pro Gln
            900                 905                 910
Trp Gln Leu Gly Glu Trp Ser Ser Cys Ser Lys Thr Cys Gly Lys Gly
        915                 920                 925
Tyr Lys Lys Arg Ser Leu Lys Cys Leu Ser His Asp Gly Gly Val Leu
    930                 935                 940
Ser His Glu Ser Cys Asp Pro Leu Lys Lys Pro Lys His Phe Ile Asp
945                 950                 955                 960
Phe Cys Thr Met Ala Glu Cys Ser
                965
<210>126
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：寡核苷酸
<400>126
actgtgtgtg atccgag                                                 17
<210>127
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：寡核苷酸
<400>127
gttggaaagc  attgacg                                                17
<210>128
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>128
aagaatgcgg ccgcagccac catggggaac gcggagcggg  ctcc                  44
<210>129
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>129
gatcgcggta ccactgcatt ctgccattgt gcaaaagtct  atg                   43
<210>130
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>130
gatctatgat cagccaccat ggggaacgcg gagcgggctc c                      41
<210>131
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>131
gactgctcta gaactgcatt ctgccattgt gcaaaagtct  atg                   43
<210>132
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>132
gatctatgat cagccaccat ggggaacgcg gagcgggctc c                      41
<210>133
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>133
gcgtgctcta gaagggctaa agctgcgaat  tc                               32
<210>134
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>134
gtacccaagc tttttgtgtc cagtcaccgc                                   30
<210>135
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>135
gcgtgctcta gattactcgt tgtgtgcttc  ac                               32

Claims (23)

1.一种含有选自下述多核苷酸的分离的核酸分子：
(a)编码SEQ ID NO：2中第1-950位氨基酸的多核苷酸；
(b)编码SEQ ID NO：2中第2-950位氨基酸的多核苷酸；
(c)编码SEQ ID NO：2中第29-950位氨基酸的多核苷酸；
(d)编码SEQ ID NO：2中第30-950位氨基酸的多核苷酸；
(e)编码由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的多核苷酸；
(f)编码由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的成熟氨基酸序列的多核苷酸；
(g)编码SEQ ID NO：125中第1-968位氨基酸的多核苷酸；
(h)编码SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸的多核苷酸；
(i)编码SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸的多核苷酸；
(j)编码SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸的多核苷酸；
(k)编码SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸的多核苷酸；
(l)编码SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸的多核苷酸；
(m)编码SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸的多核苷酸；
(n)编码SEQ ID NO：2中第549-563位氨基酸的多核苷酸；
2.一种制备重组载体的方法，包括将权利要求1的分离的核酸分子插入载体与启动子有效连接。
3.一种由权利要求2的方法产生的重组载体。
4.一种制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求3的重组载体导入宿主细胞。
5.一种用权利要求4的方法产生的重组宿主细胞。
6.一种生产多肽的重组方法，包括在使所述多肽表达的条件下培养权利要求5的重组宿主细胞，和回收该多肽。
7.一种分离的核酸分子，包含SEQ ID NO：1编码区的50个连续核苷酸，或其互补物，其中所述核酸分子不包含SEQ ID NO：14-41中的任一个。
8.一种含有选自下述多核苷酸的分离的核酸分子：
(a)编码SEQ ID NO：4中的第1-890位氨基酸的多核苷酸；
(b)编码SEQ ID NO：4中的第2-890位氨基酸的多核苷酸；
(c)编码SEQ ID NO：4中的第24-890位氨基酸的多核苷酸；
(d)编码SEQ ID NO：4中的第112-890位氨基酸的多核苷酸；
(e)编码由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的多核苷酸；
(f)编码由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的成熟氨基酸序列的多核苷酸；
(g)编码SEQ ID NO：4中的第214-439位氨基酸的多核苷酸；
(h)编码SEQ ID NO：4中的第440-529位氨基酸的多核苷酸；
(i)编码SEQ ID NO：4中的第530-583位氨基酸的多核苷酸；
(j)编码SEQ ID NO：4中的第837-890位氨基酸的多核苷酸；
(k)编码SEQ ID NO：4中的第280-606位氨基酸的多核苷酸；
(l)编码SEQ ID NO：4中的第529-548位氨基酸的多核苷酸。
9.一种用于制备重组载体的方法，包括将权利要求8中的分离的核酸分子插入载体与启动子有效连接。
10.一种由权利要求9的方法制备的重组载体。
11.一种制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求10的重组载体导入宿主细胞。
12.一种由权利要求11的方法制备的重组宿主细胞。
13.一种制备多肽的重组方法，包括在使所述多肽表达的条件下培养权利要求12的重组宿主细胞，并回收所述多肽。
14.一种分离的核酸分子，包括SEQ ID NO：3编码区中50个连续核苷酸，或其互补物，其中所述核酸分子不包含SEQ ID NO：19-22、24或42-77中的任一个。
15.一种含有选自下述氨基酸序列的分离的多肽：
(a)SEQ ID NO：2中第1-950位氨基酸；
(b)SEQ ID NO：2中第2-950位氨基酸；
(c)SEQ ID NO：2中第29-950位氨基酸；
(d)SEQ ID NO：2中第30-950位氨基酸；
(d)由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；
(e)由ATCC保藏号209581中所含cDNA克隆编码的成熟氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：125中第1-968位氨基酸；
(g)SEQ ID NO：2中第235-459位氨基酸；
(h)SEQ ID NO：2中第460-544位氨基酸；
(i)SEQ ID NO：2中第545-598位氨基酸；
(j)SEQ ID NO：2中第841-894位氨基酸；
(k)SEQ ID NO：2中第895-934位氨基酸；
(l)SEQ ID NO：2中第536-613位氨基酸；和
(m)SEQ ID NO：2中第549-563位氨基酸；
16.一种含有选自下述氨基酸序列的分离的多肽：
(a)SEQ ID NO：4中第1-890位氨基酸；
(b)SEQ ID NO：4中第2-890位氨基酸；
(c)SEQ ID NO：4中第24-890位氨基酸；
(d)SEQ ID NO：4中第112-890位氨基酸；
(e)由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；
(f)由ATCC保藏号209582中所含cDNA克隆编码的成熟氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：4中第214-439位氨基酸；
(h)SEQ ID NO：4中第440-529位氨基酸；
(i)SEQ ID NO：4中第530-583位氨基酸；
(j)SEQ ID NO：4中第837-890位氨基酸；
(k)SEQ ID NO：4中第280-606位氨基酸；和
(l)SEQ ID NO：4中第529-548位氨基酸。
17.一种含SEQ ID NO：2中m-n氨基酸序列的多肽，其中m是1-950的整数，而n是10-950的整数。
18.一种含SEQ ID NO：4中m-n氨基酸序列的多肽，其中m是1-890的整数，而n是10-890的整数。
19.一种用于抑制个体中血管生成的方法，包括施用有效量的METH1或METH 2。
20.权利要求19的方法，其中该方法用于治疗癌症、良性肿瘤、眼血管生成疾病、类风湿关节炎、牛皮癣、延迟性创伤愈合、子宫内膜异位症、血管生成、肉芽形成、肥厚性瘢痕、不连接骨折、硬皮病、沙眼、血管粘附、心肌血管生成、冠脉侧突、大脑侧突、动静脉畸形、缺血性肢体血管生成、Osler-Webber综合征、斑块肿瘤血管形成、毛细管扩张、血友病关节、血管纤维瘤、纤维肌性发育不良、创伤肉芽形成、Crohn′s病或动脉粥样硬化。
21.权利要求19的方法，其中所述方法用于生育控制。
22.权利要求19的方法，其还包括施用另一种血管生成化合物。
23.权利要求19的方法，其中所述METH 1或METH 2通过细胞或基因治疗方法施用，其中细胞已经被修饰以产生和分泌METH 1或METH 2。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101971033A (zh) * 2007-06-04 2011-02-09 戴诺普雷克斯公司 用于结直肠癌的生物标志物组合
CN111381049A (zh) * 2020-03-30 2020-07-07 天津纽赛生物技术有限公司 一种快速新冠病毒抗体的血清学类别检测试纸及检测方法

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