CN1147505C - G蛋白受体htnad29 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人G蛋白PAF受体多肽和编码这种多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了使用这种多肽鉴别这种多肽的拮抗剂和兴奋剂的方法，和使用所述的拮抗剂和兴奋剂治疗与PAF受体多肽的低表达和过量表达相关的疾病的方法。本发明还公开了检测PAF受体核酸序列中的突变的诊断方法以及检测从宿主获得的样品中受体的可溶形式的水平的诊断方法。

Description

G蛋白受体HTNAD29

本发明涉及最新鉴别的多核苷酸，由这些多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的用途以及这种多核苷酸和多肽的产生方法。本发明的多肽已被推定性鉴别为血小板活化因子受体的人7-跨膜受体，有时本文也称作“G蛋白PAF受体”。本发明也涉及抑制这些多肽的作用方法。

已非常明确许多医学上显著的生物学过程是由参与信号转导途径的蛋白介导的，所述的信号转导途径涉及G蛋白和/或第二信使如cAMP(Lefkowitz，Nature，351：353-354(1991))。本文中这些蛋白质被称为是参与具有G蛋白的途径的蛋白或称PPG蛋白。这些蛋白质的例子包括GPC受体，如那些肾上腺素能受体和多巴胺受体(Kobilka，B.K.，et al.，PNAS 84：46-50(1987)；Kobilka，B.K.，et al.，Science，238：650-656(1987)；Bunzow，J.R.，et al.，Nature，336：783-787(1988))；G蛋白本身；效应蛋白如磷脂酶C、腺苷酸环化酶及磷酸二酯酶；促蛋白如蛋白激酶A和蛋白激酶C(Simon，M.T.，et al.，Science，252：802-8(1991)。

例如，在信号转导的一种方式中，激素结合的作用是使细胞内的一种酶--腺苷酸环化酶活化。激素使酶活化要依赖于GTP核苷酸的存在，而且GTP也影响激素结合。G蛋白使激素受体与腺苷酸环化酶相连，当G蛋自由激素受体激活时可呈现出将结合的GDP变换成GTP，GTP携带形式然后与活化的腺苷酸环化酶结合。经G蛋白自身的催化将GTP水解成GDP，将G蛋白恢复成其基态无活性形式。这样，G蛋白具有双重作用，做为中间体将信号从受体传至效应器，并作为时钟来调节信号的持续时间。

G蛋白偶联受体的膜蛋白基因超家族特征在于具有7个推定的跨膜域。该区域据信可代表由胞外或胞质环连接的跨膜α-螺旋。G蛋白偶联受体包括许多生物活性受体，如激素、病毒、生长因子及神经受体。

G蛋白偶联受体特征在于包括这些大约20～30个氨基酸的7个保守的疏水段，并至少与8个趋异进化亲水环相连。偶联受体的G蛋白家族包括可与用于治疗精神病及神经错乱的药物结合的多巴胺受体。该家族其它成员包括降钙素、肾上腺素、内皮素、cAMP，腺苷、毒蝇碱、乙酰胆碱、5-羟色胺、组胺、凝血酶、细胞分裂素、促滤泡激素、视蛋白、内皮分化基因-1受体和视紫红质、添味剂、巨细胞病毒受体等。

大多数G蛋白偶联受体在头两个胞外环的每个环上具有单个的保守半胱氨酸残基，半胱氨酸残基形成据信有稳定功能蛋白质结构的二硫键。7个跨膜区被标记为TM1，TM2，TM3，TM4，TM5，TM6和TM7，TM3已被包含在信号转导中。

半胱氨酸残基的磷酸化和脂质化(十六烷基化或法呢基化)可影响一些G蛋白偶联受体的信号转导。大多数G蛋白偶联受体在第3个胞质环和/或羧基末端内含有潜在的磷酸化位点。由蛋白激酶A和/或特异性受体激酶所致的一些G蛋白偶联受体如β-肾上腺素受体的磷酸化可介导受体脱敏。

G蛋白偶联受体的配体结合位点据信包括一个由一些G蛋白偶联受体跨膜区形成的亲水穴，该穴被G蛋白偶联受体的疏水残基环绕。每个G蛋白偶联受体跨膜螺旋的亲水侧均面向内侧并形成极性配体结合位点。TM3由于具有一配体结合位点如含有TM3天冬氨酸残基而被包含在一些G蛋白偶联受体中。另外，TM5丝氨酸，TM6天冬酰胺和TM6或TM7苯丙氨酸或酪氨酸也参与配体结合。

G蛋白偶联受体可用异源三聚体G蛋白与各种胞内酶、离子通道和转运蛋白胞内偶联(见Johnson et al.，Endoc.，Rev.，10：317-331(1989))。不同的G蛋白α-亚基优先刺激特定效应器以在细胞内调节各种生物学功能。G蛋白偶联受体的胞质残基的磷酸化已被鉴定为是某些G蛋白偶联受体调节G蛋白偶联的重要机制。在哺乳动物宿主内的众多位点内发现有G蛋白偶联受体。

根据本发明的一方面，提供了新的成熟多肽及其生物学活性的并在诊断或治疗上有用的片段，类似物和衍生物。本发明的受体多肽是人源的。

根据本发明的另一方面，提供了编码本发明受体多肽的分离的核酸分子，包括mRNAs，DNAs，cDNAs，基因组DNA及其反义类似物和其生物学活性的并在诊断或治疗上有用的片段。

根据本发明的再一方面，提供了通过重组技术生产受体多肽的方法，该方法包括在促进所述多肽表达及随后所述多肽的回收的条件下培养含有编码本发明受体多肽之核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。

根据本发明的又一方面，提供了抗该受体多肽的抗体。

根据本发明的再一方面，提供了筛选化合物的方法，该化合物与本发明受体多肽结合并使其活化或抑制其活化。

根据本发明的另一方面，提供了将化合物给予宿主的方法，该化合物与本发明受体多肽结合并使其活化以通过诱导血小板用于预防和/或治疗血小板聚集所致血友病，并促进伤口愈合。

根据本发明的另一方面，提供了将化合物给予宿主的方法，该化合物与本发明的受体多肽结合并抑制其活化从而用于预防和/或治疗变态反应、炎症、血管成形术后的再狭窄、不稳定型心绞痛、心肌梗塞和脑血栓中风。

根据本发明的另一方面，提供了核酸探针，该核酸探针包含长度足以特异性地与本发明的多核苷酸序列杂交的核酸分子。

根据本发明的又一方面，提供了检测与编码该多肽的核酸序列突变相关的疾病的诊断方法及检测该受体多肽的可溶形式的变动水平的诊断方法。

根据本发明的再一方面，提供了将这些受体多肽或编码这些多肽的多核苷酸体外用于与科学研究、DNA合成及DNA载体的人工合成有关之目的的方法。

从本文的教导中，本领域技术人员会清楚本发明的这些和其它方面。

下列附图旨在说明本发明的实施方案，而无意于用来限制本发明权利要求所包括的范围。

图1描述了本发明的已被推定性鉴别为血小板活化因子受体的G蛋白受体的cDNA序列及相应的推导的氨基酸序列。使用了氨基酸标准单字母缩写。利用-373自动DNA测序仪进行测序(AppliedBiosystems.Inc.)。

图2描述了本发明的G蛋白受体(顶行)和人PAF受体(底行)的氨基酸序列对比。

根据本发明的一方面，提供了一种分离的核酸(多核苷酸)，这种核酸编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID No：2)的成熟多肽或编码由1995年6月1日以保藏号ATCC NO.97184保藏的cDNA克隆编码的成熟多肽。

可从白细胞，肺及肾脏中得到编码本发明多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸在衍生自人甲状腺的cDNA文库中发现。其在结构上与G蛋白-PAF受体家族相关，其包含一个编码337个氨基酸残基之蛋白的开放读框。所述蛋白质和人PAF受体显示出最高程度的同源性，在一段334个氨基酸序列上具有29.375％的相同性和53.438％的相似性。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因组DNA和合成DNA。这种DNA可以是双链或单链，如果是单链，其可以是编码链或非编码(反义)链。这种编码成熟多肽的编码序列可以和图1所示的编码序列(SEQ ID NO：1)或保藏的克隆的编码序列相同；由于遗传密码的丰余性或简并性，这种编码序列也可以是一种不同的编码序列，其能和图1的DNA(SEQ ID NO：1)或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽(SEQ ID NO：2)或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括：仅仅是编码成熟多肽的编码序列；编码成熟多肽的编码序列和附加的编码序列；编码成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5′和/或3′非编码序列。

这样，“编码多肽的多核苷酸”这一术语包括只含有多肽编码序列的多核苷酸以及还含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上文描述的多核苷酸变体，这种变体编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽或由保藏的cDNA克隆编码的多肽的片段，类似物和衍生物。这种核苷酸变体可以是天然产生的多核苷酸等位变体或是非天然产生的多核苷酸变体。

这样，本发明包括编码如图1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA克隆编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及编码如图1所示的成熟多肽或由保藏的cDNA克隆编码的成熟多肽的片段，衍生物和类似物的多核苷酸变体。这些核苷酸变体包括缺失变体，取代变体，添加或插入变体。

正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一种编码序列，该序列是图1中所示的编码序列(SEQ ID NO：1)或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体。本领域已知等位变体是多核苷酸序列的另一种形式，其可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，而实质上不改变所编码的多肽的功能。

所述多核苷酸也可编码PAF受体多肽的可溶形式，其是从本发明全长多肽的TM和胞内区上裂解的多肽胞外部分。

本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸。在细菌宿主情况下，所述的标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，

其用来纯化融合有标记的成熟多肽，或者例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。所述HA标记相应于源于流感血细胞凝集素蛋白质的一种表位(Wilson，I.，et al.，cell，37：767(1984))。

本发明还涉及与以上所述的序列杂交的多核苷酸(条件是两个序列之间具有至少70％，优选具有至少90％，更优选具有至少95％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语“严格条件”指仅在序列间具有至少95％，优选具有至少97％的相同性时杂交才可以发生。在一优选的实施方案中，与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码这样一种多肽，其实质上保持与图1的cDNA(SEQ ID NO：1)或保藏的cDNA(S)编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性，即，即使在该多肽不行使膜结合PAF受体的功能(如经诱导第二信使应答)时，其也可通过保持其与受体配体结合的能力行使可溶的PAF受体功能。

此外，所述多核苷酸可以具有至少20个碱基，优选是至少30个碱基，更优选地是至少50个碱基，其与本发明的多核苷酸杂交并具有如上所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，这种多核苷酸可以用作SEQ ID NO：1多核苷酸或其变体的探针，例如用于回收多核苷酸或作为诊断探针或作为PCR引物。

这样，本发明涉及与编码SEQ ID NO：2多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，优选至少90％相同性且更优选具有95％相同性的多核苷酸及其片段(这种片段具有至少30个碱基，优选至少50个碱基)和这些多核苷酸编码的多肽。

本文所提及的保藏物将按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定保持。这些保持物仅是为给本领域技术人员提供方便，并不是35 U.S.C 112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列本文一并参考，并用于解决本文序列描述上的任何矛盾。对保藏材料的任何制造、使用或销售需经许可，在此未给予任何这样的许可。

本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的PAF受体多肽或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的PAF受体多肽及其片段、类似物及衍生物。

术语“片段”“衍生物”和“类似物”当有关图1的多肽(SEQ IDNO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，指基本上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽，即作为PAF受体的功能，或即使该多肽不具有G蛋白PAF受体的功能但仍保持与受体配体结合的能力，如受体的可溶形式。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽。优选地是重组多肽。

所述的图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(i)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代(优选是保守氨基酸残基取代)，并且取代的氨基酸残基可以是也可以不是由选传密码子编码的氨基酸残基，或者(ii)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(iii)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)这样一种，其中附加氨基酸与成熟多肽融合，其可用于纯化成熟多肽或蛋白原序列，或者(v)这样一种，所述多肽的片段是可溶的，即非膜结合的但仍与膜结合受体的配体结合。通过本文的阐述，可以认为这样的片段、衍生物及类似物在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明优选是提供分离形式的多肽和多核苷酸，并且优选地是将所述多肽和多核苷酸纯化成同质性的。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽(特别是成熟多肽)以及和SEQ ID NO：2的多肽具有至少70％的相似性(最好是70％相同性)，更优选地是90％相似性(最好是90％相同性)，最优选地是95％相似性(最好是95％相同性)的多肽，也包括这些多肽的部分，这种多肽的部分通常包含至少30个氨基酸，并且优选地是至少50个氨基酸。

如本领域所熟知的，两个多肽之间的相似性是通过比较一个多肽和另一个多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代来确定的。

本发明的多肽的片段或部分通过肽合成可以用于产生相应的全长多肽；因此该片段可以用作产生全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长多核苷酸。

术语“基因”是指和产生多肽链有关的DNA区段：其包括编码区前面的区域和随后的区域(前导区和尾随序列)以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

术语“分离的”意指所述的物质脱离了其原始环境(如天然环境，如果其是天然产生的)。例如，一种存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或多肽则是分离的。该多核苷酸可以是载体的一部分和/或该多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，其仍是分离的，这是因为这种载体或组合物不是天然环境的一部分。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术生产本发明多肽的方法。

宿主细胞是用本发明载体经基因工程操作(转导、转化或转染)产生的，所述载体可以是克隆载体或表达载体。该载体可以是如质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在改良的适于激活启动子，选择转化体或扩增本发明的基因的常规营养培养基中培养。培养条件，如温度和pH值等是以前用于表达选择的宿主细胞的那些，对普通技术人员是显而易见的。

本发明的多核苷酸可以用来经重组技术生产多肽。这样，例如多核苷酸可以包含在各种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体DNA序列，非染色体DNA序列，合成DNA序列，例如SV 40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA组合衍生的载体，病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。然而其它载体只要在宿主中可复制及稳定也可以使用。

可用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来讲用本领域已知方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。

在表达载体中的所述DNA序列是可操作地连接到适当的指导mRNA合成的表达控制序列(启动子)上的。这样的启动子的代表性例子可以提到的是：LTR或SV 40启动子，大肠杆菌的lac或trp、噬菌体λP_L启动子，和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。表达载体还含有用于翻译起始和翻译终止的核糖体结合位点，所述表达载体也可包括供扩增表达的合适的序列。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体可以用于转化适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。

作为合适宿主的代表性例子，这里可以提到的是：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。通过本文的阐述，对适当宿主的选择在本领域技术人员的知识范围内。

更具体地，本发明也包括重组构建体，该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体，如质粒或病毒载体，该载体已正向或反向插入了本发明的序列。在该实施方案的一更理想情况下，构建体还包含可操作连接到所述序列上的调节序列，包括如启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并是通过商业途径可获得的。例如有以下载体：细菌载体：pQE 70、pQE 60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX 174、pbluescriptSK、pbsks、pNH 8A、pNH 16a、pNH 18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc 99a、pKK 223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT 5(Pharmacia)；真核载体：pWLNEO，pSV2CAT、pOG 44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而任何其它质粒或载体只要它们在宿主中可复制和稳定都可以使用。

可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L、和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV 40，得自逆转录病毒的LTR_s和小鼠金属硫蛋白-I。对适当的载体与启动子的选择在本领域普通技术人员的水平之内。

在另一实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。该宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或宿主细胞可是原核细胞(细菌细胞)。可由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、或电穿孔有效地将构建体引入宿主细胞中(Davis，L，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。

宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式生产由重组序列编码的基因产物。此外，本发明的多肽可以由常规肽合成仪合成产生。

成熟蛋白质可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当的启动子控制下表达。采用源于本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用来生产这种蛋白质。Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition.Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。

编码本发明的多肽的DNA在高等真核生物的转录被插入到载体中的增强子序列增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10～300bp，作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点晚期侧100～270bp上的SV 40增强子，细胞肥大病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧上的多形瘤增强子以及腺病毒增强子。

一般来说，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP 1基因)以及源于高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列以合适的方式与翻译起始和终止序列装配，优选地与能够指导翻译的蛋白质分泌进周质空间或细胞外培养基的前导序列装配。异源序列可以也可以不编码融合蛋白，这种蛋白质包括赋予所需特征的N-未端鉴别肽，所需特征例如表达的重组产物稳定或简化纯化步骤。

通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列及合适的翻译起始和终止信号以可操作阅读方式与功能性启动子一起插入来构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以保证在宿主中保持载体和需要时提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种(虽然其它的也可以选择来使用)。

作为一个代表性而非限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR 322(ATCC37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括，如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM 1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR 322“骨架”片段与适当的启动子和待表达的结构序列组合。

在合适的宿主菌株转化和宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用合适的方法(如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞培养另外一段时间。

典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保留所形成的粗产物用于进一步的纯化。

可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，所述方法包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员熟知的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman(Cell，23：175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系，例如C127，3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、适合的启动子和增强子，也可以包含任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列和5′侧翼非转录序列。得自SV 40剪接和腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。

本发明的G蛋白PAF受体多肽可以用多种方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和性层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)作为最后纯化步骤。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组生产方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸残基。

本发明的多核苷酸和多肽可以用作人类疾病的治疗和诊断的研究试剂和材料。

本发明的G蛋白PAF受体可用于筛选可激活(兴奋剂)或抑制(拮抗剂)本发明的受体多肽的化合物的方法中。

一般地，该筛选步骤包括提供一种适当的细胞，其可在其表面表达本发明的受体多肽。如此的细胞包括来自哺乳动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。尤其编码本发明的受体的多核苷酸可用于转染细胞从而表达G蛋白PAF受体。然后将表达的受体与测试化合物相接触以观察结合状况，是刺激或抑制功能性应答。

一种如此的筛选步骤包括应用被转染以表达本发明的G蛋白PAF受体的黑素细胞。该筛选技术见PCT WO92/01810，1992年2月6日公开)所述。

这样，例如这种方法可用于筛选抑制本发明受体多肽活化的化合物，这是通过将编码受体的黑素细胞与受体配体和待筛选的化合物接触而进行的。对配体产生的信号的抑制表明该化合物是受体潜在的拮抗剂，即可抑制其活化。

通过将细胞与待筛选的化合物接触并检测该化合物是否可产生信号(即激活受体)，该筛选可以用于确定激活受体的化合物。

其它筛选技术包括一种如Science，卷246，181-296页(October1989)中所述的，在一种测定由受体活化导致的胞外pH变化的系统中应用表达G蛋白PAF受体的细胞(如转染的CHO细胞)的方法。例如将该化合物与表达本发明受体多肽的细胞结合，并测定第二信使应答(如信号转导或pH变化)以检测该潜在化合物是激活还是抑制受体。

另一种筛选技术包括将编码G蛋白受体的RNA导入非洲爪蟾卵母细胞中以瞬时表达受体。然后将该受体卵母细胞与受体配体和待筛选的化合物接触，随后如果筛选化合物被认为抑制受体活化，即检测钙信号的抑制或激活。

另一种筛选技术包括表达G蛋白PAF受体，其中该受体与磷脂酶C或D相连。如此细胞的代表性例子可提及的有内皮细胞、平滑肌细胞、胚肾细胞等。上述筛选的完成可通过从磷脂酶第二信号检测受体的活化或受体活化的抑制来进行。

另一种涉及筛选抑制本发明受体多肽的活化的化合物方法是通过检测标记的配体与在其表面有受体的细胞结合的抑制。该方法包括用编码G蛋白PAF受体的DNA转染真核细胞，如此该细胞在其表面表达受体，在已知配体的标记形式存在下将该细胞与化合物接触，配体可被例如放射性标记。可用例如测定受体的放射性对与受体结合的标记的配体的量加以测定。如果检测到与受体结合的标记配体减少，说明该化合物与受体结合，则标记配体与受体的结合被抑制。

G蛋白PAF受体普遍存在于哺乳动物宿主中，并负责许多生物学功能，也包括一些病理状态。据此，就需要找到一方面能刺激G蛋白PAF受体，另一方面能抑制G蛋白PAF受体的化合物和药物。

例如，激活G蛋白PAF受体的化合物可用于治疗目的，如治疗哮喘、帕金森氏症、急性心衰、低血压，尿储留及骨质疏松等。

一般地，抑制G蛋白PAF受体的活化的化合物可用于许多治疗目的，如治疗高血压，心绞痛、心肌梗塞、溃疡、哮喘、过敏症、良性前列腺增生、精神病及神经错乱(包括精神分裂症、狂躁刺激症、抑郁症、谵妄、痴呆、智力低下)及运动障碍如Huntington病或Gillesdila Tourett综合症等。抑制G蛋白PAF受体的化合物也可用于逆转内源性厌食及控制食欲过剩。

抗体可拮抗本发明的G蛋白PAF受体，或在某些情况下寡肽可与G蛋白PAF受体结合但不引起第二信使应答，如此可防止G蛋白PAF受体激活。抗体包括抗独特型抗体，其可识别通常与抗体的抗原结合位点结合的单一决定簇。潜在的拮抗剂化合物也包括与G蛋白PAF受体的配体紧密相关的蛋白质，即配体的片段，其已失去生物学功能且当与G蛋白PAF受体结合时不引发应答。

经反义技术制备的反义构建体可以通过三螺旋形成或反义DNA或RNA来控制基因的表达，这两种方法都基于多核苷酸和DNA或RNA的结合。例如编码本发明成熟多肽的多核苷酸序列的5′编码部分可以用来设计长度约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。一种DNA寡核苷酸被设计成与涉及转录的基因区互补(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456，(1988)；和Dervan等，科学，251：B60(1991))，进而阻止G蛋白PAF受体的转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内和mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译成G蛋白PAF受体(反义-Okano，J.Neurochem，56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸也可以输送到细胞中，以便可以体内表达反义RNA和DNA，抑制G蛋白PAF受体的产生。

还可采用小分子抑制本发明的受体多肽的活化，这些小分子和G蛋白PAF受体结合并阻断其与配体结合，这样就阻断了正常的生物学活性。

G蛋白PAF受体的可溶形式如受体的片段通过与本发明多肽的配体结合可用于抑制受体的活化并防止配体与膜结合G蛋白PAF受体的相互作用。

本发明还提供了一种检测未知能否与G蛋白PAF受体结合的配体是否能与该受体结合的方法，其包括将表达G蛋白PAF受体的哺乳动物细胞与配体在允许配体与G蛋白PAF受体结合的条件下接触，检测与受体结合的配体的存在从而确定配体是否与G蛋白PAF受体结合。上述用于检测兴奋剂和/或拮抗剂的系统也可用于确定与受体结合的配体。

本发明还提供了一种通过检测编码受体的mRNA的存在以检测本发明的G蛋白PAF受体多肽在细胞表面的表达的方法，其包括从细胞中获得总mRNA，并将该mRNA与含有至少10个能与包含在编码受体的核酸分子序列中的序列在杂交条件下特异性杂交的核苷酸的核酸探针接触，检测mRNA与探针的杂交，从而检测受体由细胞的表达。

本发明还提供一种鉴定与本发明受体多肽相关的受体的方法。这些相关受体可通过与本发明的G蛋白PAF受体多肽的同源性、低严格性交叉杂交，或通过与相关的天然或合成配体相互作用而鉴别受体或在本发明的G蛋白PAF受体多肽经遗传或药理阻断后引发相似性能加以鉴定。

由上述筛选法鉴定的兴奋剂可通过诱导血小板凝聚治疗血友病及刺激伤口愈合。

G蛋白PAF受体的拮抗剂化合物可用于预防和/或治疗血管成形术后的再狭窄、不稳定型心绞痛，血栓性中风，变态反应、炎症及心肌梗塞。

拮抗剂和药学可接受的载体(如下所述)可一起用于组合物中。

拮抗剂或兴奋剂化合物可以与合适的药物载体组合使用。这样的组合物包含治疗有效量的多肽，和药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水，缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它们的组合物。其配方应适于施用的方式。

本发明也提供了药物包或试剂盒，它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物一种或多种成份的容器。这种容器中可以附有管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构规定形式的告示，这一告示反映了制造、使用或销售人类使用品得到政府机构的同意。此外，本发明的多肽或组合物可以与其它治疗化合物结合使用。

所述药物组合物可以以方便的方式施用，所述方式例如、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说，它们以至少大约10微克/千克体重的量施用，在大多数情况下，它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下，考虑用药途径和病症等因素，剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重。

G蛋白PAF受体多肽和多肽形式的兴奋剂和拮抗剂，可以依据本发明通过体内表达这样的多肽来利用，这常被称作“基因治疗”。

这样，例如，可以体外对患者细胞用编码多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)进行基因工程操作，用工程细胞向被治疗的患者提供所说的多肽。这样的方法是本领域众所周知的，并且由本文的描述也显而易见。例如，可以用包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。

同样地，可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作，以便体内表达多肽。例如，可以将生产含有编码本发明多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产细胞施用给患者以便体内将细胞基因工程化并体内表达所说的多肽。经本发明的描述，通过这种方式施用本发明多肽的这些或其它方法对本领域技术人员是清楚的。例如，用于工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，而是例如腺病毒，其与合适的输送载体结合后可用于体内工程化细胞。

可以衍生上文描述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿猩猩白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒、和乳房肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体来自莫洛尼氏鼠白血病病毒。

所述载体包含一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于：反转录病毒LTR；SV 40启动子；和人类巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller，等，生物技术，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或者其它任何启动子(例如真核细胞启动子，如包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。使用的其它病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的描述，合适的启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。

编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制下。可以使用的合适的启动子包括，但不限于：腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人类生长激素启动子。所说的启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。

使用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以便形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于：PE501、PA317、-2、-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、-CRE、--CRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系(Miller，人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述，其全部内容本文一并参考)。可以通过本领域任何已知的方法用所述载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于：电穿孔、使用脂质体和CaPO₄沉淀。另外，反转录病毒质粒载体可以包在脂质体中，或者和脂类偶联，然后施用到宿主中。

生产细胞系产生感染性的反转录病毒载体颗粒，这种颗粒包含编码所述多肽的核酸序列。然后可以使用这些反转录病毒载体颗粒体内或者体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于：胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。

本发明也涉及本发明的基因作为诊断剂的用途。例如，诊断一些由遗传缺陷基因所致的某些疾病。这些基因可通过将缺陷基因的序列与正常序列对比而被检测出。随后可证实“突变体”基因与异常受体活性有关。此外可将突变受体基因插入一合适载体中在功能分析系统中表达(如比色分析、在MacConkey平板上表达、互补试验、在HEK293细胞的受体缺陷系中)，去证实或鉴别突变体。一旦“突变体”被鉴别出，然后就可以筛选突变受体基因载体。

可以用各种技术在DNA水平上检测具有本发明的人基因突变的个体。可以从患者的细胞(如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作为一例子，可以用与本发明的核酸互补的PCR引物鉴别和分析本发明基因中的突变。例如，可以通过与正常遗传型比较的扩增产物大小上的改变来检测缺失或者插入。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的本发明的RNA或者放射性标记的本发明的反义DNA序列杂交鉴别。经核糖核酸酶A消化，或者从熔点温度的不同辨别完全配对的序列和错配双链体。该诊断尤其适用于出生前或出生后一月内体检。

通过直接的DNA测序方法揭示参照基因和具有突变的基因间的序列差异。此外，克隆的DNA区段可以用作探针以检测特异性DNA区段。当和PCR结合时，这种方法的灵敏性大大提高。例如，将测序引物和双链的PCR产物或由改良的PCR方法产生的单链模板分子一起使用。通过常规的放射标记核苷酸方法或具有荧光标记的自动测序方法确定序列。

基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。特异位置上的序列改变还可以通过核保护分析揭示，如RNase和S1保护或者由化学裂解法揭示(例如，Cotton等，PNAS，USA，85：4397-4401，1985)。

另外，某些疾病是基因表达改变所致或特征在于基因表达改变，其可通过在mRNA中的变化而被检测。另外，本发明的基因可在鉴别与该型受体相关的功能过低表达的个体时用作参考。

本发明也涉及用于检测各种组织中本发明的PAF受体多肽的可溶形式之改变的水平的诊断分析方法。用于检测得自宿主样品中可溶受体多肽水平的分析方法对本领域的技术人员是公知的，所说的方法包括：放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析，优选地是ELISA测定。

ELISA测定最初包括制备PAF受体多肽之抗原的特异性抗体，优选地是单克隆抗体。此外，制备单克隆抗体的报道抗体。将可检测的试剂和报道抗体结合，所说的试剂如放射性、荧光或在这一实例中是辣根过氧化物酶。由宿主获得样品，并将其在与样品中蛋白质结合的固体支持物(如聚苯乙烯皿)中温育。通过和非特异性蛋白质(如牛血清清蛋白)一起温育，将覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来将单克隆抗体在皿中温育，在此期间单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上的任何PAF受体蛋白结合。用缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的报道抗体放入皿中，结果导致报道抗体和任何结合到PAF受体蛋白上的单克隆抗体结合。然后将未结合的报道抗体洗掉。接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即是给定体积的患者样品中存在的PAF受体蛋白的量。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向位于单个的人染色体上的特定位置并能与之杂交。此外，现在需要鉴定染色体上的特定位点。目前，仅有少数几种以实际的序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可以用于标记染色体的位置。本发明的DNA染色体作图是将这些序列和疾病相关基因相关联的重要的第一步。

简而言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)便可以把序列定位到染色体上。采用cDNA的计算机分析可以快速地选择引物，其中引物不应跨越超过基因组DNA上的一个外显子，否则使得扩增方法复杂化。然后采用这些引物用于PCR筛选含有单个的人染色体的体细胞杂交体。只有那些含有与该引物对应的人基因的杂交体才会生产扩增片段。

体细胞杂交体的PCR作图是将一个特定的DNA定位于特定的染色体上的快速程序。根据本发明采用同样的寡核苷酸引物，用来自于特定染色体或者大基因组克隆集合体的一组片段、按照类似方式可以实现亚定位(sublocalization)。可以类似地用于对染色体作图的其它的作图策略包括原位杂交，用标记的经流式分选的染色体进行预筛选以及通过杂交进行预选，从而构建出染色体特异性的cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来实现一步法准确染色体定位。该技术可以采用50或60个碱基长短cDNA。关于该技术的综述参阅Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦序列已定位到一个准确的染色体位置，则染色体上该序列的物理位置可与遗传图谱数据相关联。这些数据例如可在V.McKusick，人类的孟德尔遗传中找到(可以通过Johns Hopkins大学Welch医学文库联机得到)。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)来鉴定基因与已定位到相同染色体区域上的疾病之间的关系。

接下来需要测定在受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果突变是在一些或所有的受影响个体中观察到的、但是又没有在任何一个正常个体中被观察到的话，那么该突变可能是疾病的病因。

根据物理作图和遗传作图技术目前的分辨率，一个被准确定位到与疾病有关的染色体区域的cDNA可以是50-500个潜在的致病(causative)基因中的一种(其中假定有1兆碱基的作图分辨率且每20kb为一个基因)。

所述的多肽、其片段或衍生物或类似物、或者表达上述物质的细胞可以用作生产其抗体的免疫原。这些抗体可以是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明也包括嵌合，单链和人源化的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于生产这些抗体和片段。

针对相应于本发明的序列的多肽而产生的抗体可以通过将该多肽直接注射入动物体内或者通过将该多肽向动物给药来得到，其中的动物优选非人类。然后，如此得到的抗体会结合到该多肽上。通过这种方式，即使是仅仅编码该多肽的一个片段的序列也可用于产生能结合整个天然多肽的抗体。然后，该抗体可以用于从表达该多肽的组织中分离这种多肽。

为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler与Milstein，1975，自然，256：495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，4：72)以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体与癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

可以将用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)进行修改从而生产针对本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。也可以使用转基因小鼠来表达针对本发明免疫原性多肽产生的人源化抗体。

本发明将参照下面的实施例进一步加以说明；但是，应当了解本发明并不局限于这些实施例。除非另作声明的以外，所有的份或量均为重量。

为了利于理解以下的实施例，现叙述一些经常出现的方法和/或术语。

“质粒”通过一个在前的小写p和/或跟随几个大写字母和/或数字加以命名。本文中的起始质粒或者可以通过商业途径得到或在不受限制的基础上公众可得到，或者可以根据已公开的方法从可得到的质粒中构建出来。此外，对于与那些所述等价的质粒是本领域已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。

DNA的“消化”是指用一种仅对DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多种限制性酶可以通过商业途径得到，并且其反应条件、辅因子和其它使用要求对本领域普通技术人员是已知的。为了分析目的，通常把1g的质粒或DNA片段与溶于约20 l缓冲溶液的约2单位的酶一起使用。为了分离用于质粒构建的DNA片段，通常在一个更大的体积内用20至250单位的酶消化5至50g的DNA。针对具体的限制性酶而言，合适的缓冲溶液和底物的量是由生产者规定的。通常采用在37摄氏度下约1小时的温育时间，但是该时间可以根据产品供应者的指示而变化。在消化后，反应混合物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离出所需的片段。

采用由Goeddel，D.等，核酸研究，8：4057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离。

“寡核苷酸”或指一种单链多脱氧核苷酸，或指可以通过化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不具有5′磷酸，因此如果不在一种激酶存在下以ATP添加一个磷酸时，该寡核苷酸将不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸将连接到未被去磷酸化的片段上。

“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，出处同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的缓冲液和条件、每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)来实现连接。

除非另有说明，按Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)所述的方法进行转化。

                     实施例1

细菌表达和纯化G蛋白偶联受体HTNAD29(PAF受体)

利用PCR寡核苷酸引物起始扩增编码PAF受体的DNA序列(ATCC NO.97184)，所说的引物相当于加工的蛋白质的5′序列(减去信号肽序列)和PAF受体基因3′的载体序列。将相应于PAF受体的附加核苷酸分别加入到5′和3′序列中。所说的5′寡核苷酸引物具有序列5′CGAATTCCTCCATGAACAGCACATGTATT3′，此引物含有一个EcoRI限制性内切酶位点，后接由加工的蛋白质密码子的假定的末端氨基酸开始的PAF受体编码序列的18个核苷酸。所说的3′序列5′CGGAAGCTTCGTCAAGGACCTCTAATTCC3′包含和Hind III位点互补的序列，并接着编码PAF受体的18个核苷酸。所说的限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-9的限制性内切酶位点(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)。pQE-9编码抗生素抗性(Amp^r)、细菌复制起点(ori)、IPTG可调节启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用EcoRI和HindIII消化pQE-9。将扩增的序列连接到pQE-9中并将其插入到带有编码组氨酸标记和RBS之序列的框架中。然后通过Sambrook等(分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep 4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝，这种质粒表达lacI阻遏物同时赋予卡那霉素抗性(Kan^r)。通过转化体在LB平板上的生长能力鉴定转化体，并筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。通过限制分析分离并确认质粒DNA。将含有所需构建体的菌落在补充了Amp(100g/ml)和Kan(25g/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)培养。将O/N培养物以1∶100至1∶250的比率用于接种大体积培养物。细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(O.D.⁶⁰⁰)时，加入IPTG(异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷)至最终浓度为1mM。IPTG通过失活lacI阻遏物，清除P/O，引起基因表达的增加。将细胞再培养3至4小时。通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶解在6M盐酸胍离液剂中。澄清后，在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，在镍-螯合物柱中通过层析从溶液中纯化溶解的PAF受体(Hochuli，E.等，层析法杂志411：177-184(1984))。将PAF受体以6M盐酸胍(pH值5.0)从柱中洗脱下来，为了复性，调至3mM盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在溶液中温育12小时后，将蛋白质对10mM磷酸钠透析。

                    实施例2

             在COS细胞中表达重组PAF受体

表达质粒PAF受体HA来源于载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含：1)SV 40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，其后为多接头区、SV 40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整的PAF受体前体和在读框中融合进其3′末端的HA标记的DNA片段克隆到所说的载体的多接头区，因此，重组蛋白质的表达在CMV启动子控制之下。HA标记相应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位，这一点以前已经描述过(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，细胞37：767，(1984))。HA和靶蛋白的融合，使得用识别HA表位的抗体很容易检测重组蛋白质。

质粒构建策略描述如下：

用两种引物通过PCR方法构建编码PAF受体的DNA序列(ATCCNo.97184)，所说的引物是：5′引物5′GTCCAAGCTTGCCACCATGAACAGCACATGTATT3′包含HindIII位点，之后是由起始密码子开始的PAF受体编码序列的18个核苷酸：3′引物5′CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAAGGACCTCTAATTCCATA3′，其包含互补于XhoI位点，翻译终止密码子，HA标记和PAF受体编码序列的最后18个核苷酸(不包括终止密码子)的序列。因而PCR产物包含一位点，PAF受体编码序列，后接融入框架的HA标记，HA标记后的翻译终止密码子和一个XhoI位点。用HindIII和XhoI限制性内切酶消化和连接PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(可从Stratagene克隆系统，11099 North Torrey Pines Roads，LaJolla，CA 92037得到)，将转化的培养物涂布在氨苄青霉素培养基平板上，并筛选抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA，并用限制分析检测是否存在正确的片段。为了表达重组PAF受体，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版，(1989))。通过放射标记和免疫沉淀法检测PAF受体HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，抗体实验手册，冷泉港实验室出版(1988))。将细胞在转染后两天用¹⁵S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养物并用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37：767(1984))。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养基。在15％SDS-PAGE凝胶上分析蛋白质沉淀。

                        实施例3

利用杆状病毒表达系统克隆和表达G蛋白偶联受体(PAF受体)

利用PCR寡核苷酸引物扩增编码全长PAF受体蛋白质的DNA序列(ATCC No.97184)，所说引物相应于该基因的5’和3’序列：

5′引物：5′-CGGGATCCCTCCATGAACAGCACATGTATT-3′，含有一个BamHI限制性内切酶位点(粗体)，后接代表真核细胞有效翻译起始信号的4个核苷酸(J.Mol.Biol.1987，196，947-950，Kozak，M)，之后是PAF受体基因的头18个核苷酸(翻译起止密码子ATG之下划线)。

所说的3′引物序列为5′-CGGGATCCCGCTCAAGGACCTCTAATTCCATA-3′，包含限制性核酸内切酶BamHI切割位点，以及与PAF受体基因的3′非翻译序列互补的18个核苷酸。用市售试剂盒(“Geneclean”，BIO101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增的序列。将所说的片段用核酸内切酶BamHI消化，并在1％琼脂糖凝胶上再次纯化。此片段指定为F2。

用载体pRG1(由pVL941载体修饰而成，见下文讨论)由杆状病毒表达系统表达PAF受体蛋白质(综述参见：Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养过程的方法手册，得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包含苜蓿银纹夜蛾核型多角病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，其后面是限制性核酸内切酶BamHI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同样的方向插入，其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替pRG1，所说的载体如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒学，170：31-39)。

用限制酶BamHI消化所说的质粒，然后由本领域已知的方法利用小牛肠磷酸酶使质粒去磷酸化。如上所述从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA称为V2。

用T4 DNA连接酶连接F2片段和所说的去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌HB101细胞并利用酶BamHI鉴别含有所说带PAF受体基因的质粒(pBacPAF受体)的细菌。通过DNA测序确认克隆片段的序列。

用脂转染法(FELGNER等，美国科学院学报，84：7413-7417(1987))将5μg质粒pBacPAF受体与1.0μg市售的线性杆病毒(“BaculoGold^TM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。

将1μg BaculoGold^TM病毒DNA和5μg质粒pBacPAF受体在含有50微升无血清Grace′s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。在添加10微升脂转染试剂和90微升Grace′s培养基后，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中，所说细胞接种在具有1ml无血清Grace′s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1微升补充有10％胎牛血清的Grace′s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。

4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。一点改变是使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑。(“噬斑测定”的详尽描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。

四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于包含200微升Grace′s培养基的Eppendorf管中。经简短离心除去琼脂，将包含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。

使Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace′培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-PAF受体感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900II培养基(减去甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi³⁵S甲硫氨酸和5μCi³⁵S半胱氨酸(Amersham)。在经离心收获之前，将细胞进一步培养16小时，标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。

                        实施例4

                   经由基因治疗的表达

成纤维细胞是通过皮肤活组织检查从一个研究对象中得到的。将得到的组织放置在组织培养基上并且分割成小块。将小组织块放置在组织培养瓶的湿表面上，其中每瓶中放置约10块组织。将瓶颠倒放置，盖紧并于室温下过夜。在室温下放置24小进后反转瓶，组织块仍固定在瓶底部，加放新鲜培养基(例如含有10％FBS，青霉素和链霉素的Ham′sF12培养基)，然后于37℃下温育大约1周。这时加入新鲜培养基，随后每隔几天更换一次培养基。再培养2周后，出现了一单层成纤维细胞。将单层细胞经胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。

用EcoRI和Hind III消化旁侧有Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))，接下来用小牛肠磷酸酶进行处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分级分离并使用玻璃珠加以纯化。

采用分别与5′和3′末端序列对应的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5′引物包含一个EcoRI位点，3′引物含有一个Hind III位点。在T4DNA连接酶存在下，将等量的Moloney鼠肉瘤病毒的线性化骨架与扩增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在适于两个片段连接的条件下保持所得到的混合物。将该连接混合物用于转化细菌HB101，然后为了证实该载体具有插入正确的感兴趣基因而将细菌涂布在含有卡那霉素的琼脂平板上。

将兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco′s改良Eagles培养基(DMEM)的组织培养板上进行培养，直至达到铺满密度。然后将含有所述基因的载体加入培养基中并用该载体转导包装细胞。包装细胞随即生产含有该基因的具有感染性的病毒颗粒(现在包装细胞被称作生产细胞)。

向转导的生产细胞中加入新鲜的培养基，接下来从一个铺满生产细胞的10cm平板中收集培养基。含有感染性病毒颗粒的培养基经微孔过滤器过滤以除去脱附(detached)的生产细胞，然后利用该培养基去感染成纤维细胞。从成纤维细胞的亚铺满平板中除去培养基并迅速地代之以来自于生产细胞的培养基。除去该培养基并代之以新鲜的培养基。如果病毒的滴度很高，那么实质上所有的成纤维细胞均被感染并且无需选择。如果滴度非常低，那么就需要采具有如neo或his这样的可选择性标记的逆转录病毒。

然后将工程化的成纤维细胞注射入宿主，它或单独注射或在一个cytodex3微载体珠上已生长至铺满之后再注射。此时成纤维细胞产生蛋白质产物。

根据以上的教导，本发明的许多改进和变化都是可能的，因此在附加的权利要求的范围内可以另外的方式实施本发明。

                       序列表(1)一般信息：

(i)申请人：李毅，丽贝卡·A·富得那

(ii)发明名称：G蛋白受体HTNAD29

(iii)序列数：9

(iv)联系地址：

    (A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，

               CECCHI，STEWART & OLSTEIN

    (B)街道：6 BECKER FARM ROAD

    (C)城市：ROSELAND

    (D)州： 新泽西

    (E)国家：美国

    (F)邮政码：07068

(v)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本1.30

(vi)目前申请数据：

    (A)申请号：PCT/US95/07288

    (B)申请日：1995年6月6日

    (C)分类：

(viii)律师/代理人信息：

    (A)姓名：MULLINGS，J.G.

    (B)登记号：33,073

    (C)案号/文档号：325800-368

    (ix)电信信息：

    (A)电话：201-994-1700

    (B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：1753个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

    (A)名称/关键：CDS

    (B)位置：523...1533

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CTGCACGAGA GGCACAGATT TATCAAGCTC CTCAGTCAAC AAACACATCA CCGGAAGAAA     60CATGGAAGGA AAGGAATTTT AAAAGGAAAT ACCAATCTCT GTGCAAACAA AGCCTTGTAT    120ATTCATGTTT GCACCAATCT ACTGTGAGAT TTATGAAGAA AAACAAATTG CGGACAACTC    180TCTATGTACA CTTACAAATG CCTCAGTTGA TGCTTGTGGG CTGTTTGTCA GCGTTCTGTG    240ATAATGAACA CATGGACTTC TGTTTATTAA ATTCAGTTGA CCCCTTTAGC CAATTGCCAG    300GAGCCTGGAT TTTTACTTCC AACTGCTGAT ATCTGTGTAA AAATTGATCT ACATCCACCC    360TTTAAAAGCA TTGATGAATT AATTAGAACT TTAGACAACA AGAAAAATTG AAAAGAATTC    420TCAGTAAAAG CGAATTCGAT GTTCAAAACA AACTACAAAG AGACAAGACT TCTCTGTTTA    480CTTTCTAAGA ACTAATATAA TT CTACCTT AAAAAGGAAA AA ATG AAC AGC ACA       534

                                           Met Asn Ser Thr

                                             1TGT ATT GAA GAA CAG CAT GAC CTG GAT CAC TAT TTG TTT CCC ATT GTT      582Cys Ile Glu Glu Gln His Asp Leu Asp His Tyr Leu Phe Pro Ile Val5                  10                  15                  20TAC ATC TTT GTG ATT ATA GTC AGC ATT CCA GCC AAT ATT GGA TCT CTG      630Tyr Ile Phe Val Ile Ile Val Ser Ile Pro Ala Asn Ile Gly Ser Leu

             25                  30                  35TGT GTG TCT TTC CTG CAA CCC AAG AAG GAA AGT GAA CTA GGA ATT TAC      678Cys Val Ser Phe Leu Gln Pro Lys Lys Glu Ser Glu Leu Gly Ile Tyr

         40                  45                  50CTC TTC AGT TTG TCA CTA TCA GAT TTA CTC TAT GCA TTA ACT CTC CCT      726Leu Phe Ser Leu Ser Leu Ser Asp Leu Leu Tyr Ala Leu Thr Leu Pro

     55                  60                  65TTA TGG ATT GAT TAT ACT TGG AAT AAA GAC AAC TGG ACT TTC TCT CCT      774Leu Trp Ile Asp Tyr Thr Trp Asn Lys Asp Asn Trp Thr Phe Ser Pro

 70                  75                  80GCC TTG TGC AAA GGG AGT GCT TTT CTC ATG TAC ATG AAG TTT TAC AGC    822Ala Leu Cys Lys Gly Ser Ala Phe Leu Met Tyr Met Lys Phe Tyr Ser85                  90                  95                 100AGC ACA GCA TTC CTC ACC TGC ATT GCC GTT GAT CGG TAT TTG GCT GTT    870Ser Thr Ala Phe Leu Thr Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val

            105                 110                 115GTC TAC CCT TTG AAG TTT TTT TTC CTA AGG ACA AGA AGA ATT GCA CTC    918Val Tyr Pro Leu Lys Phe Phe Phe Leu Arg Thr Arg Arg Ile Ala Leu

        120                 125                 130ATG GTC AGC CTG TCC ATC TGG ATA TTG GAA ACC ATC TTC AAT GCT GTC    966Met Val Ser Leu Ser Ile Trp Ile Leu Glu Thr Ile Phe Asn Ala Val

    135                 140                 145ATG TTG TGG GAA GAT GAA ACA GTT GTT GAA TAT TGC GAT GCC GAA AAG    1014Met Leu Trp Glu Asp Glu Thr Val Val Glu Tyr Cys Asp Ala Glu Lys

150                 155                 160TCT AAT TTT ACT TTA TGC TAT GAC AAA TAC CCT TTA GAG AAA TGG CAA    1062Ser Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Asp Lys Tyr Pro Leu Glu Lys Trp Gln165                 170                 175                 180ATC AAC CTC AAC TTG TTC AGG ACG TGT ACA GGC TAT GCA ATA CCT TTG    1110Ile Asn Leu Asn Leu Phe Arg Thr Cys Thr Gly Tyr Ala Ile Pro Leu

            185                 190                 195GTC ACC ATC CTG ATC TGT AAC CGG AAA GTC TAC CAA GCT GTG CGG CAC    1158Val Thr Ile Leu Ile Cys Asn Arg Lys Val Tyr Gln Ala Val Arg His

        200                 205                 210AAT AAA GCC ACG GAA AAC AAG GAA AAG AAG AGA ATC ATA AAA CTA CTT    1206Asn Lys Ala Thr Glu Asn Lys Glu Lys Lys Arg Ile Ile Lys Leu Leu

    215                 220                 225GTC AGC ATC ACA GTT ACT TTT GTC TTA TGC TTT ACT CCC TTT CAT GTG    1254Val Ser Ile Thr Val Thr Phe Val Leu Cys Phe Thr Pro Phe His Val

230                 235                 240ATG TTG CTG ATT CGC TGC ATT TTA GAG CAT GCT GTG AAC TTC GAA GAC    1302Met Leu Leu Ile Arg Cys Ile Leu Glu His Ala Val Asn Phe Glu Asp245                 250                 255                 260CAC AGC AAT TCT GGG AAG CGA ACT TAC ACA ATG TAT AGA ATC ACG GTT    1350His Ser Asn Ser Gly Lys Arg Thr Tyr Thr Met Tyr Arg Ile Thr Val

            265                 270                 275GCA TTA ACA AGT TTA AAT TGT GTT GCT GAT CCA ATT CTG TAC TGT TTT    1398Ala Leu Thr Ser Leu Asn Cys Val Ala Asp Pro Ile Leu Tyr Cys Phe

        280                 285                 290GTT ACC GAA ACA GGA AGA TAT GAT ATG TGG AAT ATA TTA AAA TTC TGC    1446Val Thr Glu Thr Gly Arg Tyr Asp Met Trp Asn Ile Leu Lys Phe Cys

    295                 300                 305ACT GGG AGG TGT AAT ACA TCA CAA AGA CAA AGA AAA CGC ATA CTT TCT    1494Thr Gly Arg Cys Asn Thr Ser Gln Arg Gln Arg Lys Arg Ile Leu Ser

310                 315                 320GTG TCT ACA AAA GAT ACT ATG GAA TTA GAG GTC CTT GAG TAGAACCAAG     1543Val Ser Thr Lys Asp Thr Met Glu Leu Glu Val Leu Glu325                 330                 335GATGTTTTGA AGGGAAGGGA AGTTTAAGTT ATGCATTATT ATATCATCAA GATTACATTT  1603TGAAAAGGAA ATCTAGCATG TGAGGGGACT AAGTGTTCTC AGAGTGATGT TTTAATCCAG  1663TCCAATAAAA ATATCTTAAA ACTGCATTGT ACAGCTCCCT CCCTGCGTTT TATTAAATGA  1723TGTATATTAA ACAAAGATCA ATATTTTCTT                                   1753(2)SEQ ID NO：2信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：337个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Asn Ser Thr Cys Ile Glu Glu Gln His Asp Leu Asp His Tyr Leu1               5                  10                  15Phe Pro Ile Val Tyr Ile Phe Val Ile Ile Val Ser Ile Pro Ala Asn

         20                  25                  30Ile Gly Ser Leu Cys Val Ser Phe Leu Gln Pro Lys Lys Glu Ser Glu

     35                  40                  45Leu Gly Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Ser Leu Ser Asp Leu Leu Tyr Ala

 50                  55                  60Leu Thr Leu Pro Leu Trp Ile Asp Tyr Thr Trp Asn Lys Asp Asn Trp65                  70                  75                  80Thr Phe Ser Pro Ala Leu Cys Lys Gly Ser Ala Phe Leu Met Tyr Met

             85                  90                  95Lys Phe Tyr Ser Ser Thr Ala Phe Leu Thr Cys Ile Ala Val Asp Arg

        100                 105                 110Tyr Leu Ala Val Val Tyr Pro Leu Lys Phe Phe Phe Leu Arg Thr Arg

    115                 120                 125Arg Ile Ala Leu Met Val Ser Leu Ser Ile Trp Ile Leu Glu Thr Ile

130                 135                 140Phe Asn Ala Val Met Leu Trp Glu Asp Glu Thr Val Val Glu Tyr Cys145                 150                 155             160Asp Ala Glu Lys Ser Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Asp Lys Tyr Pro Leu

            165                 170                 175Glu Lys Trp Gln Ile Asn Leu Asn Leu Phe Arg Thr Cys Thr Gly Tyr

        180                 185                 190Ala Ile Pro Leu Val Thr Ile Leu Ile Cys Asn Arg Lys Val Tyr Gln

    195                 200                 205Ala Val Arg His Asn Lys Ala Thr Glu Asn Lys Glu Lys Lys Arg Ile

210                 215                 220Ile Lys Leu Leu Val Ser Ile Thr Val Thr Phe Val Leu Cys Phe Thr225                 230                 235                 240Pro Phe His Val Met Leu Leu Ile Arg Cys Ile Leu Glu His Ala Val

            245                 250                 255Asn Phe Glu Asp His Ser Asn Ser Gly Lys Arg Thr Tyr Thr Met Tyr

        260                 265                 270Arg Ile Thr Val Ala Leu Thr Ser Leu Asn Cys Val Ala Asp Pro Ile

    275                 280                 285Leu Tyr Cys Phe Val Thr Glu Thr Gly Arg Tyr Asp Met Trp Asn Ile

290                         295                     300Leu Lys Phe Cys Thr Gly Arg Cys Asn Thr Ser Gln Arg Gln Arg Lys305                 310                 315                 320Arg Ile Leu Ser Val Ser Thr Lys Asp Thr Met Glu Leu Glu Val Leu

            325                 330                 335Glu(2)SEQ ID NO：3信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：327个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Asp Ser Ser His Met Asp Ser Glu Phe Arg Tyr Thr Leu Phe Pro Ile1               5                  10                  15Val Tyr Ser Ile Ile Phe Val Leu Gly Val Ile Ala Asn Gly Tyr Val

         20                  25                  30Leu Trp Val Phe Ala Arg Leu Tyr Pro Cys Lys Lys Phe Asn Glu Ile

     35                  40                  45Lys Ile Phe Met Val Asn Leu Thr Met Ala Asp Met Leu Phe Leu Ile

 50                  55                  60Thr Leu Pro Leu Trp Ile Val Tyr Tyr Gln Asn Gln Gly Asn Trp Ile65                  70                  75                  80Leu Pro Lys Phe Leu Cys Asn Val Ala Gly Cys Leu Phe Phe Ile Asn

             85                  90                  95Thr Tyr Cys Ser Val Ala Phe Leu Gly Val Ile Thr Tyr Asn Arg Phe

        100                 105                 110Gln Ala Val Thr Arg Pro Ile Lys Thr Ala Gln Ala Asn Thr Arg Lys

    115                 120                 125Arg Gly Ile Ser Leu Ser Leu Val Ile Trp Val Ala Ile Val Gly Ala

130                 135                 140Ala Ser Tyr Phe Leu Ile Leu Asp Ser Thr Asn Thr Val Pro Asp Ser145                 150                 155                 160Ala Gly Ser Gly Asn Val Thr Arg Cys Phe Glu His Tyr Glu Lys Gly

            165                 170                 175Ser Val Pro Val Leu Ile Ile His Ile Phe Ile Val Phe Ser Phe Phe

        180                 185                 190Leu Val Phe Leu Ile Ile Leu Phe Cys Asn Leu Val Ile Ile Arg Thr

    195                 200                 205Leu Leu Met Gln Pro Val Gln Gln Gln Arg Asn Ala Glu Val Thr Gly

210                 215                 220Arg Ala Leu Trp Met Val Cys Thr Val Leu Ala Val Phe Ile Ile Cys225                 230                 235                 240Phe Val Pro His His Val Val Gln Leu Pro Trp Thr Leu Ala Glu Leu

            245                 250                 255Gly Phe Gln Asp Ser Lys Phe His Gln Ala Ile Asn Asp Ala His Gln

        260                 265                 270Val Thr Leu Cys Leu Leu Ser Thr Asn Cys Val Leu Asp Pro Val Ile

    275                 280                 285Tyr Cys Phe Leu Thr Lys Lys Phe Arg Lys His Leu Thr Glu Lys Phe

290                 295                 300Tyr Ser Met Arg Ser Ser Arg Lys Cys Ser Arg Ala Thr Thr Asp Thr305                 310                 315                 320Val Thr Glu Val Val Val Pro

            325(2)SEQ ID NO：4信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：29个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“引物”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：CGAATTCCTC CATGAACAGC ACATGTATT                                    29(2)SEQ ID NO：5信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：29个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“引物”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CGGAAGCTTC GTCAAGGACC TCTAATTCC                                          29(2)SEQ ID NO：6信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：34个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“引物”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GTCCAAGCTT GCCACCATGA ACAGCACATG TATT                               34(2)SEQ ID NO：7信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：61个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“引物”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CTAGCTCGAG TCAAGCGTAG TCTGGGACGT CGTATGGGTA GCAAGGACCT CTAATTCCAT    60A                                                                    61(2)SEQ ID NO：8信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：30个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“引物”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CGGGATCCCT CCATGAACAG CACATGTATT                                     30(2)SEQ ID NO：9信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：32个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“引物”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CGGGATCCCG CTCAAGGACC TCTAATTCCA TA                                  32

Claims (12)

1.一种分离的多核苷酸，其由选自如下一组的成员组成：

(a)一种编码图1所示多肽的多核苷酸；

(b)一种编码由包含在ATCC保藏号97184中的DNA编码的成熟多肽的多核苷酸。

2.权利要求1的多核苷酸，其中的多核苷酸是DNA。

3.权利要求1的多核苷酸，其由图1所示的第523～1533位核苷酸组成。

4.一种含权利要求2所述DNA的载体。

5.用权利要求4的载体转化或转染的宿主细胞。

6.一种生产多肽的方法，包括：在权利要求5的宿主细胞中表达由权利要求2所述DNA编码的多肽。

7.一种产生能表达多肽之细胞的方法，其包括用权利要求4的载体对细胞进行转化或转染。

8.一种受体多肽，其由选自如下一组的成员组成：

(i)一种具有图1的推导的氨基酸序列的多肽；

(ii)由ATCC保藏号97184的cDNA编码的多肽。

9.一种权利要求8的多肽的抗体。

10.权利要求8的多肽在制备用于诊断与该多肽的低表达相关的疾病或疾病的易感性的诊断剂中的应用。

11.权利要求1的多核苷酸在制备用于诊断与权利要求8的多肽的低表达相关的疾病或疾病的易感性的诊断剂中的应用。

12.一种鉴定与权利要求8的多肽结合并使其激活及与其结合并使其抑制的化合物的方法，包括：

将可在其表面表达受体多肽的细胞与化合物在足以使化合物与受体多肽结合的条件下接触，所述受体与能提供应答化合物与所述受体多肽结合的可检测信号的第二组分相联；

通过检测由所述第二组分产生的信号的存在与否，鉴定化合物是否是有效的兴奋剂或拮抗剂。

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