CN1087345C - 人血管ibp样生长因子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血管IBP样生长因子多肽(VIGF)、编码这种多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术产生这种多肽的方法。本发明也公开了将这种多肽用于创伤愈合或组织再生、促进植入物固定和血管形成的方法。本发明还公开了针对这种多肽的拮抗剂和它们作为治疗动脉粥样硬化、肿瘤和瘢痕形成的治疗剂的用途。此外，本发明还公开了鉴别VIGF核酸序列中的突变和VIGF多肽改变水平的诊断测定方法。

Description

人血管IBP样生长因子

本发明涉及最新鉴别的多核苷酸、由这种多核苷酸编码的多肽、这种多核苷酸和多肽的用途以及这种多核苷酸和多肽的生产方法。本发明也涉及抑制这种多肽作用的方法。

本发明的多肽与生长调节剂的一个家族(包括cef 10/cyr 61、结缔组织生长因子(CTGF)和nov)以及胰岛素样生长因子结合蛋白质(IBP)家族(调节胰岛素样生长因子(IGF)的活性)相关。与本发明的多肽相应的mRNA在血管细胞-类型(cell-type)中高度表达，因此，下文称这种多肽为人血管IBP样生长因子或“VIGF”。

生长因子和其它促细胞分裂原(包括癌基因)能迅速地诱导被某些细胞表达的一套复杂的基因(Lau，L.F.和Nathans，D.，分子水平的细胞调节，1991，6：165-202)。这些基因(命名为立即早期基因或早期反应基因)在和一种生长因子或促细胞分裂原接触后，数分钟内即可被激活而转录，其不依赖于从头蛋白合成这些立即早期基因编码分泌性的胞外蛋白，这些蛋白对复杂的生物过程如分化、增殖、再生和创伤愈合起协调作用(Ryseck，R.P.等，细胞生长分化，1991，2：235-233)。

属于这组分泌性胞外蛋白的高度相关蛋白包括小鸡的cef10，这种蛋白是在病毒的致癌基因pp60^V-STC诱导后发现的(Simmons，D.L.等，PNAS，美国，1989，86：1178-1182)。一种密切相关蛋白质，cyr 61，血清或血小板衍生生长因子(PDGF)能迅速激活它(O′Brien，T.P.等，分子细胞生物学，1990，10：3569-3577)。cef 10和cyr 61之间所有氨基酸的等同性高达83％。这个家族的第三个成员是人类结缔组织生长因子(CTGF)(Bradham，D.M.等，细胞生物学杂，1991，114：1285-1294)。CTGF是一种富含半胱氨酸的多肽，人类血管内皮细胞在用转化生长因子β(TGF-β)激活后，能高水平地分泌这种多肽。CTGF显示了类PDGF的生物和免疫学活性并和PDGF竞争一种特定的细胞的表面受体。

这种立即早期蛋白家族的第四个成员是fisp-12，血清能诱导这种蛋白产生并且已将其作图在鼠基因组的一个区域(Ryseck，R.P.等，细胞生长分化，1991，2：235-233)。这个家族的另一个成员是小鸡基因nov，这种基因通常在成熟的肾细胞中获得，并且发现其在成髓细胞血症相关病毒1型诱导的肾胚细胞瘤中过量表达。

这些立即早期基因的表达产物在生长因子触发的级联反应中充当第三信使。一般认为整合和协调复杂的生物过程(如以细胞增殖为共同活动的分化和创伤愈合过程)也需要这些基因的表达产物。

这个新出现的生长调节剂家族被称为CCN家族，这个家族由CTGF、cef I0/cyr 61和nov组成。本发明的VIGF多肽被认为是这个生长调节剂家族的一员。VIGF多肽也包含一段和胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白高度同源的半胱氨酸序列。

已在成人血清中鉴别了至少两种不同的结合蛋白质，即IGF-结合蛋白53和IGF-结合蛋白1。IGF-结合蛋白对IGF既有刺激效应又有抑制效应。Clemmonsetal(J.Clin.Invest.，77：1548(1986))等研究表明了成纤维细胞及平滑肌细胞表面IGF受体在和其结合蛋白复合时结合增加。已经表明了IGF-结合蛋白在体外对各种IGF活动的抑制作用，这种作用包括刺激脂肪细胞的葡萄糖运输、软骨细胞的硫酸盐并合和成纤维细胞中的胸苷的并合(Zapf，等，J.Clin.Invest.，1979，63：1077)。此外，研究表明IGF-结合蛋白质对生长因子介导的促细胞分裂剂活性具有抑制作用。

按照本发明的一个方面，本发明提供了新的成熟多肽(其是VIGF)以及生物活性的和其诊断上或治疗上有用的片段、类似物和衍生物。

按照本发明的另一个方面，本发明提供了编码人类VIGF的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及其类似物和生物学活性的和诊断上或治疗上有用的片段和衍生物。

按照本发明的另一个方面，本发明提供了通过重组技术产生所说多肽的方法，这种方法包括在有利于所说的蛋白表达和随后回收的条件下，培养含有人类VIGF核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。

按照本发明的另一个方面，本发明提供了把这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸用于治疗的方法，例如治疗肌肉消耗症(muscle wasting disease)和骨质疏松、帮助植入物固定、刺激创伤愈合或组织再生、促进血管形成、促进血管平滑肌增殖和内皮细胞产生。

按照本发明的另一个方面，本发明提供这种多肽的抗体。

按照本发明的另一个方面，本发明提供了这种多肽的拮抗剂，其可用于抑制这种多肽的作用，例如在创伤愈合或肺部纤维化期间限制过量结缔组织的产生。

按照本发明的另一个方面，本发明也提供了包含足够长度的和VIGF序列特异性杂交的核酸分子的核酸探针。

按照本发明的另一个方面，本发明提供了检测与VIGF多肽表达不足和表达过量及编码这种多肽的核酸序列中的突变相关的疾病的诊断测定方法。

从本文的教导中，本领域技术人员会清楚本发明的这些和其它方面。

下列图是用来说明本发明实施方案，而无意于用来限制本发明权利要求所包括的范围。

图1显示VIGF多肽的cDNA和相应的推导的氨基酸序列。开始的21个氨基酸代表推定的前导序列，这样，成熟的多肽由163个氨基酸组成。用标准的单字母缩写表示氨基酸。使用373自动DNA测序仪(应用生物系统公司)进行测序。预计测序精确度超过97％。

图2表明了VIGF和CCN家族其它蛋白之间氨基酸序列的同源性。

图3是一种SDS-聚丙烯酰胺凝胶，其显示了VIGF细菌纯化和电泳的结果。

图4是一种凝胶，显示了VIGF的Northern杂交分析结果。

图5是一种凝胶，显示了在所列不同组织中VIGF基因表达的细胞类型分析结果。道1是脐静脉内皮细胞，道2是主动脉平滑肌细胞，道3是真皮包皮成纤维细胞。图5A是露置2小时后的结果，图5B是露置36小时后的结果。

按照本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的核酸(多核苷酸)，这种核酸编码具有图1的推导的氨基酸序列的成熟多肽或由以保藏号ATCC 75874(1994年8月25日)保藏的cDNA克隆编码的成熟多肽。

可以从人类脐静脉和主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、肺动脉中得到编码本发明多肽的多核苷酸。在人类脐静脉内皮细胞cDNA文库中发现了本发明的多核苷酸。其在结构上与IBP和CCN家族相关。它包含一个编码具有184个氨基酸残基的蛋白的开放阅读框架，其中大约起始的21个氨基酸残基是推定的前导序列，这样，这种成熟的蛋白包含163种氨基酸。

作为CCN生长因子和IBP两个家族杂交成员的VIGF的标志主要基于氨基酸序列的保守性。由VIGF和CCN家族整条多肽上40-45％的相似性(全部VIGF的18个半胱氨酸有12个是保守的)和IBP特征区域(GCGCCXXCAXXXXXXC)94％的等同性(这种IBP特征在CCN家族所有成员中是相当保守的)推定VIGF和CCN家族的相似性。

VIGF多肽和IBP家族也有明显的相似性。在第30-44(IBP特征区)和55-69氨基酸两个邻近区内和IBP家族至少有80％的等同性。这些区包含在推定的IBPs IGF结合区内。通过Northern杂交分析方法，确定了人类组织和细胞-类型特异性表达。使用实施例4的方法在成人肺和肾中定位了2.3-2.4kb的VLGF mRNA。在心脏、人脑、胎盘、肝脏、骨骼肌和胰脏中没有发现VIGF基因的表达。培养的人类脐静脉内皮和主动脉平滑肌细胞是能高水平表达VLGF mRNA的细胞-类型，而真皮的包皮成纤维细胞的表达水平则很低。总的来说，这些结果表明VIGF主要是血管起源的。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。这种DNA可以是双链或单链，如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。这种编码成熟多肽的编码序列可以和图1所示的或保藏的克隆的编码序列相同；由于遗传密码的丰余性或简并性，这种编码序列也可以是一种不同的编码序列，其能和图1的DNA或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括：仅仅是编码成熟多肽的编码序列；编码成熟多肽的编码序列和附加的编码序列，如前导或分泌序列或前蛋白序列；编码成熟多肽的编码序列(和有或无附加的编码序列)和非编码序列，如内含子或编码成熟多肽的编码序列5′和/或3′端的非编码序列。

这样，“编码多肽的多核苷酸”这一术语包括只含有多肽编码序列的多核苷酸以及还含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上文描述的多核苷酸变体，这种变体编码具有图1的推导的氨基酸序列的多肽或由保藏的cDNA克隆编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这种多核苷酸变体可以是天然产生的多核苷酸等位变体或是非天然产生的多核苷酸变体。

这样，本发明包括编码如图1所示的成熟多肽或由保藏的cDNA克隆编码的成熟多肽的多核苷酸，以及编码如图1所示的成熟多肽或由保藏的cDNA克隆编码的成熟多肽的片段、类似物和衍生物的多核苷酸变体。这些核苷酸变体包括缺失变体、取代变体、添加或插入变体。

正如上文所表明的，这种多核苷酸可以具有图1中所示的或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体的编码序列。在本领域大家都知道等位变体是多核苷酸序列的另一种形式，多核苷酸序列可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，这不会从实质上改变编码多肽的功能。

本发明也包括这样的多核苷酸，其中所说的编码成熟多肽的序列可以在相同的阅读框架中融合进多核苷酸序列，这种多核苷酸序列有助于宿主细胞中多肽的表达和分泌，比如说具有分泌序列功能的前导序列控制细胞中多肽的转运。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein)，宿主细胞切除这种前导序列形成成熟的多肽形式。这种多核苷酸也编码蛋白原(proprotein)，这种蛋白原是5’端有附加的氨基酸残基的成熟蛋白。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一种无活性的蛋白形式。切除前序列，留下的是有活性的成熟蛋白。

这样，本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白或有前序列的蛋白或既有序列原又有前序列(presequence)(前导序列)的蛋白。

本发明的多核苷酸也可以具有读框中融合进标记序列的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸，在细菌宿主的情况下，所述的标记序列可以是由pQE-9载提供的六组氨酸标记，其使得融合进标记的成熟多肽可以纯化，或者例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)。所说的血细胞凝集标记相应于源于流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson，I.，等，细胞，37：767(1984))。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(如果两个序列之间具有至少50％，优选的具有70％的同一性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语″严格条件″指仅在序列间具有至少95％，优选的具有97％的同一性时杂交才可以发生。在一个优选的实施方案中，杂交到以上所述的多核苷酸上的多核苷酸编码这样一种多肽，其实质上保持与由图1的cDNA或保藏的cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。

本文所提及的保藏物按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定于1994年8月25日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC75874。

这些保持物仅仅是为了给本领域技术人员提供方便，并不是35U.S.C112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列本文一并参考，并且用于解决本文序列描述上的任何矛盾，对保藏材料的任何制造，使用或者销售需要经过许可，在此未给予任何这样的许可。

本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列的VIGF多肽或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的VIGF多肽，以及这种多肽的片段，类似物和衍生物。

术语″片段″，″衍生物″和″类似物″，当有关图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，指基本上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选地是重组多肽。

所说的图1的或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代并且取代的氨基酸可以是可以不是由遗传密码子编码的。或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)，或者(IV)这样一种，其中附加氨基酸融合进成熟多肽，其用来纯化成熟多肽。通过本文的阐述，这样的片段、衍生物以及类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明优选提供分离型的多肽和多核苷酸，同时把多肽和多核苷酸优选纯化成同质性的。

术语″分离的″意指所述的物质脱离了其原始环境(例如，天然环境，如果其是天然产生的)。例如，一种存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，只要这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分其仍然是分离的。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明的多肽的方法。

宿主细胞是用本发明的载体经基因工程产生的(转导、转化或转染)，所说的载体可以是克隆载体或表达载体，该载体可以是例如，质粒、病毒颗粒噬菌体等形式。所说的工程宿主细胞可以在修饰的常规营养培养基中的培养，所述培养基修饰得适于激活启动子，选择转化子或扩增VIGF基因。培养条件，例如pH值和温度等，是以前用于选择来表达的宿主细胞的那些。对普通技术人员是显而易见的。

本发明的多核苷酸可以用来经重组技术生产多肽。这样，例如，多核苷酸可以包含在各种表达多肽的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，例如猿猴病毒40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA组合衍生的载体；病毒DNA(如牛痘，腺病毒，家禽痘病毒，和假狂犬病病毒)。然而，任何其它载体也可以使用，只要其在宿主中可复制和稳定。

可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，用本领域已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。

在表达载体中的所说的DNA序列可有效连接到适当的表达控制序列(启动子)上，以指导mRNA合成。这样的启动子的代表性例子可以提到的是：LTR或猿猴病毒40启动子，大肠杆菌、lac或trp、噬菌体λP_L启动子，和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。所说的表达载体也包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。该载体也可以包含供扩增表达的合适的序列。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，例如真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。

包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或者控制序列的载体可以用于转变适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。

作为合适宿主的代表性例子，这里可以提到的是：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇S2和Sf9；动物细胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；  植物细胞，等。通过本文的阐述，对适当的宿主的选择被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

更具体地说，本发明也包括重组构建体，该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体，如质粒或病毒的载体，其中已正向或反向插入了本发明的序列。在这一实施方案的更为理想的情况下，构建体还包括可有效连接到所述序列上的调节序列，包括，例如，启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是通过商业途径可获得的。以举例的方式给出下列载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)。真核：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它质粒或载体，只要它们在宿主中可复制和稳定，都可以使用。

可以用CAT(氯霉素转移酶的基因)载体或者其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L、和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和完全SV40、得自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-F。对适当的载体与启动子的选择健康在普通的技巧本领域的水平之内。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含以上所述构建体的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法，(1986))。

宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式生产由重组序列编码的基因产物。此外，本发明的多肽可以由常规肽合成仪合成生产。

成熟蛋白质可以在哺乳动物细胞，酵母，细菌，或适当的启动子的控制之下的其它细胞中表达，采用得自本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用来生产这种蛋白质。Sambrook等，分子克隆：实验室手册，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用合适的克隆和表达载体。

高等生物编码本发明的多肽的DNA的转录被插入到载体中的增强子序列增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点后侧100至270bp上的猿猴病毒40增强子，细胞肥大病毒早期启动子增强子，复制起点后侧上的多形瘤增强子和腺病毒增强子。

一般地，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如，大肠杆菌和啤酒糖酵母TRP1基因的氨苄青霉素抗性基因)以及源于高表达基因的指导下游结构基因转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))，α-因子，酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列在适当的阶段与翻译起始和终止序列装配，优选地，与能够指导翻译的蛋白质分泌进周质空间或细胞外培养基的前导序列装配。异源序列可以也可以不编码融合蛋白，包括赋予所需特征的N-末端鉴别肽，所需特征例如，表达的重组产物稳定或纯化简单。

通过与具有功能性启动子的可操作阅读相(poerable reading phase)中的合适的翻译起始和终止信号一起插入编码所需蛋白质的结构DNA序列构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以保证载体的保持和在合适时在宿主内提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，假单胞菌属，链霉菌属，和葡萄球菌属的各个种，虽然其它的也可以选择来使用。

作为一个代表性的但不是限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司，Vppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322″骨架″片段与适当的启动子和待表达的结构序列组合。

在合适的宿主菌株转化和合适的宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用合适的方法(例如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞培养另外一段时间。

典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保持所形成的粗产物用于进一步的纯化。

可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，所述方法包括冻结-解冻循环，声处理，机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员知道的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组体蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman，细胞，23：175(1981)，描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物的表达载体包括复制起点，适合的启动子和增强子，也可以包含任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。

所说的VIGF多肽可以用多种方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽取、阴离子或阳离子交换层析、磷纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和性层析、羟基磷灰石层析和外源凝集素层析。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)作为最后的纯化步骤。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌，酵母，高等植物，培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。

本发明的VIGF多肽可以用于创伤愈合和与组织(如结缔组织、皮肤、骨、软骨、肌肉、肺或肾)再生有关的疗法中。

可以用本发明的VIGF多肽促进具有刺激血管形成作用的血管平滑肌和内皮细胞的生长。介导的VIGF在血管形成过程中的增加有利于冠状狭窄心脏的局部缺血组织和附属冠状组织的发育。

也可以利用VIGF多肽刺激植入物周围细胞的生长，因而有利于植入物缚着在预定的位点。

也可以利用VIGF多肽增加组织中或血清IGF稳定性。也可以增加其和IGF受体的结合。既然离体条件下已显示了IGF能提高人类骨髓红细胞和粒细胞祖细胞的生长，因此也可以利用VIGF多肽刺激红细胞生成或粒细胞生成。

按照本发明的另一个方面，本发明提供了这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸作为体外科学研究、DNA合成、DNA载体制造的研究试剂，并用来发展对人类疾病治疗有用的治疗学和诊断学的方法。

全长VIGF基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，用来分离全长VIGF基因和与VIGF基因有高度的序列类似性或类似生物活性的其它基因。这种类型的探针可以在例如20到20000碱基之间。然而，优选的探针在30到50个碱基对之间。所说的探针也可以用于鉴别相应于全长转录物和基因组克隆或包含调节和启动子区、外显子和内含子在内的完全基因克隆的cDNA克隆。筛选的实施例包括利用已知DNA序列分离VIGF基因的编码区，以合成寡核苷酸探针。标记的寡核苷酸具本发明基因的互补序列，可以用来筛选人类cDNA文库、基因组DNA或mRNA，以确定探针和哪些文库成员杂交。

本发明提供了用于鉴别VIGF受体的方法。可以用本领域技术人员已知的许多方法来鉴别编码所说受体的基因，如配体淘选和FACS分类法(Coligan等免疫学最新草案，1(2)，第5章，(1991))。优选使用的是表达克隆，其中的聚腺苷酸RNA由对VIGF响应的细胞制备，把由所说的RNA创造的cDNA文库划分成不同的库，用来转染COS细胞或对VIGF不响应的其它细胞。生长在载玻片上的转染细胞暴露在标记的VIGF中。VIGF可以用包括特异性位点蛋白激酶识别部位碘化或其包含体在内的各种手段标记。下列固定和培养中，载玻片易于放射自显影分析。鉴别了阳性集合，同时利用重复亚集合(iterative sub-pooling)和再筛选(rescreen)方法制备和再转染子集合，最终产生编码推定受体的单克隆。

作为另一种受体鉴别方法，标记VIGF可以是光亲和性的，可以和能表达受体分子的细胞膜或提取物制剂连接。用PAGE分辨交叉连接的材料并把其暴光在X光胶卷上。可以把包含VIGF-受体的标记复合物切断、分解成易于蛋白质微测序的肽片段。从微测序中获得的氨基酸序列可以用来设计一套简并寡核苷酸探针以筛选用来鉴别编码推定的受体基因的cDNA文库。

本发明也涉及筛选化合物以鉴别模拟VIGF(刺激剂)或阻止VIGF作用的那些化合物的方法。这种方法的一个实例利用VIGF在共促分裂原ConA存在的情况下刺激内皮细胞增殖的能力。获得人类脐静脉内皮细胞并将其培养在96-孔平底培养平板上(Costar，剑桥，MA)，培养中添加适合用作促进细胞增殖的反应混合物，这种混合物包括ConA(Calbiochem，La Jolla，CA)。把筛选的Con-A和这种化合物添加到培养基中，37℃培养后，用脉冲向培养物中输送³[H]-胸腺苷，同时在玻璃纤维过滤器上收获培养物(PhD；剑桥技术，Watertown，MA)。利用液态闪烁计数器确定三重培养物中间的³[H]-胸苷结合物(cpm)(Beekman仪器Irvine，CA)。值得注意的³[H]-胸苷结合物表明对内皮细胞增殖的刺激作用。

用以上所描述的测定方法测定拮抗剂，然而，在这种测定中，VIGF和筛选化合物一同添加，在VIGF存在的情况下，这种化合物抑制³[H]-胸苷结合的能力表明这种化合物是VIGF的拮抗剂。另外，在适合竞争性抑制测定的条件之下把VIGF、潜在的拮抗剂和膜-结合的VIGF受体或重组受体组合，检测VIGFD的拮抗剂。可以标记VIGF，如通过放射性，这样，和受体结合的VIGF分子的数量能决定潜在拮抗剂的效能。

也可以把哺乳动物的细胞或表达VIGF受体膜制剂，在这种化合物存在的情况下和标记的VIGF一起培养。然后可以测定这种化合物提高或阻断这种相互作用的能力。另外，在VIGF能天然和IGF结合的条件下，可以培养VIGF、标记的IGF和一种潜在的化合物。测定这种相互作用的程度，以确定这种化合物是有效的拮抗剂或刺激剂。

潜在的VIGF拮抗剂的例子包括抗体、或在某些情况下为和这种多肽连接的寡核苷酸。另外，潜在的拮抗剂可以是一种密切相关的蛋白质，例如，VIGF的突变形式，其能识别VIGF受体但不能传递影响，进而竞争性地抑制了VIGF的作用。

另一个潜在的拮抗剂是采用反义技术制备的反义构建体，反义技术可以通过三螺旋形成或反义DNA或者RNA来控制基因的表达，这两种方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的结合。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用来设计长度约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。一种DNA寡核苷酸被设计成与转录所涉及的基因区互补(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456，(1988)；和Dervan等，科学，251：1360(1991))，进而阻止转录和VIGF的产生。反义RNA体内寡核苷酸杂交到mRNA上，并阻断mRNA分子翻译成为VIGF(反义-Okano，J.Neurochem.，56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以传送到细胞中，以便可以体内表达反义RNA和DNA，抑制VIGF的产生。

潜在的VIGF拮抗剂包括小分子，这些小分子和多肽的活性位点、受体结合位点、IGF或者是其它生长因子结合位点结合，进而阻断VIGF的正常生物活性。小分子例子包括但不限于小肽或类肽的分子。

使用这种拮抗剂可以在继气囊血管形成术之后，抑制肿瘤新生血管化(neovascularization)和在粥样硬化和再狭窄中常见的平滑肌细胞新生内膜增殖。

使用拮抗剂抑制在瘢痕瘤中所看见的瘢痕组织的过分产生，这种瘢痕在外科手术、心肌梗塞之后的纤维化，或和肺部纤维化相关纤维变性损伤之后形成。拮抗剂可用来与药学上可接受的载体一起组合成组合物，例如，下文描述的。

本发明的VTGF多肽和刺激剂或拮抗剂可以与合适的药物载体组合使用。这样的组合物包括所说多肽治疗的有效量和药学上可接受的载体或者赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，右旋糖，水，甘油，乙醇，和它们的组合物。其配方应该适宜于施用的方式。

本发明也提供了药物包或试剂盒，它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物的一种或多种成份的容器。与这种容器相关联的可以是管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构所规定形式的告示，这一告示反映了制造、使用或销售人类使用品的政府机构的同意。此外，本发明的组合物可以与其它治疗化合物结合使用。

所述药物组合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服，局部，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，鼻内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说，它们以至少大约10微克/千克体重的量施用，在大多数情况下，它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下，考虑用药途径和病症等因素，剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重。

VIGF与其它生长因子结合，可以加速其生理反应，这一点在创伤愈合中已见。这些生长因子包括但不限于PDGF、IGF、FGF、EGF或TGF-B。

VIGF多肽和多肽形式的刺激剂和拮抗剂，可以依据本发明用于体内表达这样的多肽，这常被称作″基因治疗″。

这样，例如，可以对患者细胞用体外编码多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)进行基因工程操作，用工程细胞向被治疗的患者提供所说的多肽。这样的方法是本领域众所周知的。例如，可以经本领域公知的方法用包括编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。

同样地，可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作，以便体内表达多肽。如本领域已知的，可以将产生包括编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞施用给患者，以便体内对细胞进行基因工程处理和体内表达多肽。通过本发明的阐述，由这种方式经施用本发明的多肽的这些和其它方法对本领域技术人员是显而易见的。例如，工程化细胞的载体可以不是逆转录病毒载体，如，在与合适的运送载体结合后，腺病毒可以用于体内工程化细胞。

本发明也涉及VIGF基因作为诊断剂的用途。VIGF变异形式的检测可以诊断疾病或对疾病的易感性，如肿瘤，既然VIGF的突变可以引起肿瘤。

可以用各种技术在DNA水平上检测具有人VIGF基因突变的个体。可以从患者的细胞(如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作为一个例子，可以用和编码VIGF的核苷酸互补的PCR引物鉴别和分析VIGF突变。可以通过与正常遗传型比较扩增产物大小的变化检测缺失或者插入。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的VIGF RNA或者放射性标记的VIGF反义DNA序列杂交鉴别。经核糖核酸酶A消化，或者从熔点温度的不同辨别完美配对的序列和错配双链体。

基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示出。不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上的区别，其中不同的DNA片段的迁移按照其特定的熔点或部分融化温度而停滞在凝胶的不同位置(参见，例如，Myers等，科学，230：1242(1985))。

也可以由核酸酶保护测定法揭示特定位置上的序列变化，所述测定法如核糖核酸酶保护和S1保护以及化学裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。

这样，可以由以下方法检测特定DNA序列，所述方法例如杂交，核糖核酸酶保护，化学裂解，直接DNA测序，或使用限制酶(例如，限制片段长度多形性)和基因组DNA的Southern印迹法。

除很多常规凝胶-电泳和DNA测序法之外，也可用原位分析检测突变。

VIGF蛋白质表达和血管病或与肿瘤形成相关的新血管化相关联。VIGF具有单链多肽，同时mRNA在内皮细胞中高度表达，在平滑肌细胞中则较少，这表明蛋白质存在于血清中。因此，可以用抗VIGF抗体来诊断血管病或与肿瘤形成相关的新血管化，因为可用多肽的改变水平表明这种紊乱。

可以使用竞争测定方法，其中VIGF特异性抗体吸附在一种固体支持物上，标记的VIGF和来源于宿主细胞的样品通过所说的固体支持物，检测出的吸附在固体支持物上的标记物数量和样品中VIGF数量相关。

本发明的序列对染色体鉴别也有价值。所说的序列特异性地导向单个人染色体的特定位置，并与之杂交。此外，也需要鉴别染色体上的特定位点。极少的基于实际序列数据(重复多形性)的染色体标识试剂现在可用来标记染色体位置。在关联与疾病有关基因的那些序列中，按照本发明的染色体的DNAs作图是重要的第一步。

简言之，可以通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)对染色体序列作图。对cDNA的计算机分析用来迅速选择引物，该引物不跨越一个以上的基因组DNA中的外显子，这样使扩增方法复杂化。然后，这些引物用于PCR筛选包含单独的人染色体的体细胞杂种。仅包含相应于引物的人基因的那些杂种产生扩增片段。

体细胞杂种的PCR作图是指定特定DNA到特定染色体的快速方法。利用本发明及相同的寡核苷酸引物，可以由一组特定染色体的片段或一组大的基因组克隆以类似的方式获得亚定位。其它可以类似地用于对其染色体作图的作图策略，所述策略包括原位杂交、用标记的流式分选染色体预筛选和经杂交预选择构建染色体特异性-cDNA文库。

在一个步骤中，中期染色体扩散的cDNA克隆的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的染色体位置。这一技术可以与短至500或600碱基的cDNA一起使用；然而，比2,000bp更大的克隆具有更大的可能性结合到单一染色体位置，这个单一染色体位置具有供检测的足够的信号强度。FISH需要衍生出EST的克隆，越长越好。例如，2,000bp是好的，4,000是更好的，超过4,000对获得好的结果时间的合理的百分比很可能是不必要的。这种技术的综述，参见Verma等，人染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦序列精确定位到染色体位置，染色体上的序列的物理位置就可以与遗传图谱数据关联。这样的数据可以在例如V.McKusick，在人中的孟德尔式遗传(可联机到JohnsHopkins大学Welch医学文库上使用)中找到。然后，基因和已定位到相同的染色体区的疾病之间的相互关系经连锁分析(物理邻近基因的共遗传)鉴别。

接着，有必要确定感染和未感染个体之间cDNA或者基因组序列中的不同。如果在某些或全部感染个体中观察到突变，但在任何正常个体中观察不到，则，所述的突变很可能是疾病的病因。

采用现有分辨率的物理作图和遗传作图技术，精确定位到与疾病相关的染色体区上的cDNA是50和500之间的致病性基因的一个(这假定1兆碱基作图分辨率，每20kb一个基因)。

所说的多肽，其片段或衍生物或类似物，或表达它们的细胞可以用作免疫原由此产生抗体。这些抗体可以是例如，多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链和人化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本领域中已知的各种方法可以用于产生这样的抗体和片段。

可以通过对动物直接注射多肽或者对动物(优选的是非人动物)施用多肽获得产生来针对相应于本发明的序列的多肽的抗体。然后如此获得的抗体结合多肽本身。按这种方式，即使是编码多肽的一个片段的序列也可以用于产生结合全部天然多肽的的抗体。用这种抗体从表达多肽的组织中分离多肽。

对于单克隆抗体的制备，可以使用任何提供由传代细胞系培养物产生的抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、所说的三瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，当今免疫学，4：72)和产生人单克隆抗体的EB病毒-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体和癌疗法，Alan R.Liss，公司，pp.77-96)。

有关产生单链抗体描述的技术(美国专利4,946,778)可以采用来产生针对本发明的免疫原性多肽产品的单链抗体。也可以利用转基因鼠表达针对于本发明的免疫原性多肽产品人化的抗体。

将参照以下实施例进一步描述本发明。然而应该清楚本发明不限于这些实施例。除非特别指明，所有分数或数量均指重量。

为了有利于理解下列实施例，以下描述一些经常出现的方法和/或术语。

“质粒”由前面的小写p和/或后续的大写字母和/或数字指定。本文的起始质粒是市售的、无限制的公众可获得的或者是可以按已出版的方法从可获得的质粒构建的。此外，所描述的质粒的等同质粒在本领域中是已知的，对普通技术人员是显而易见的。

DNA的″消化″指以限制性内切酶催化切割DNA，这种限制性内切酶仅作用在DNA一定的序列上。本发明所有的各种限制酶是市售的，使用它们的反应条件，辅因子和其它需要作为普通技术人员应了解的知识。为了分析的目的，一般地是在约20微升缓冲液中使用1微克质粒或DNA片段以及约2单位的酶。为了质粒构建体分离DNA片段的目的，一般地是在较大体积中用20至250单位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的缓冲液和底物的量由制造者规定。  通常使用37℃约1小时的培养时间，但可以按照供应者的说明变化。在消化之后，反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需的片段。

用Goeddel等，核酸研究，8：4057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行切割片段的大小分离。

″寡核苷酸″指单链多脱氧核苷酸或两条互补的多脱氧核苷酸链，其可以是化学合成的。这样合成的寡核苷酸没有5’磷酸基，同时在激酶存在下不添加带有ATP的磷酸盐时，其不连接另一个寡核苷酸。合成的寡核苷酸将连接没有去磷酸化的片段。

″连接″指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，Id.，p.145)。除非提供其它方式，可以采用已知缓冲液和条件用每0.5微克大约等摩尔量的待连接的DNA片段10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)进行连接。

除非有其它说明，按Graham，F.和van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)的描述进行转化。

                           实施例1

                    VIGF的细菌表达和纯化

用相应于加工过的VIGF蛋白质(负单链肽序列)的5’序列的PCR寡核苷酸引物和VIGF基因载体序列3’起始扩增编码VIGF的DNA序列，ATCC#75874。

把相应于VIGF的附加核苷酸分别加入到5’和3’的序列中。具有5′CGCAAGCTTA AATAATTATGCGGTGGACTGC 3′序列的寡核苷酸引物包含一个Hind III限制性内切酶位点(加黑的碱基序列)，后接从假定加工蛋白质的末端氨基酸密码子(下面划线)起始的VIGF编码序列的21个核苷酸。3’端的寡核苷酸引物5′CGCTCTAGA TCAGCGTGGATTTAACCA 3′含有一个Xba I限制性内切酶位点(加黑的碱基序列)，其后有相应于所说的羧基末端5个氨基酸的核苷酸的反向互补序列和翻译终止密码子(下划线)。所说的限制性内切酶位点相当于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Chatsworth公司，CA)限制性内切酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Amp^r)、细菌复制起点(ori)、IPTG-调节启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。

用Hind III和Xba I消化VIGF PCR产物和pQE-9，然后用T4DNA连接酶，把它们连接在一起。所需重组体将包含从编码组氨酸标记物位点的下游插人的VIGF编码序列和核糖体结合位点。按Sambrook J.等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，(1989)中描述的方法用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15[pREP4](Qiagen，公司)。M15[pREP4]包含多拷贝的质粒pREP4，这种质粒表达lacI抑制子并赋予卡那霉素抗性(Kan)。由其在LB平板上的生长能力来鉴别这种转化体同时选择抗氨苄青霉素/卡那霉素的菌落。分离质粒DNA，并且通过限制分析确认。在补充Amp(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培养基的液体培养中过夜(O/N)培养包含所需构建体的克隆。所说的O/N培养物用来以1∶100到1∶250的比率接种大量培养物。使细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(O.D.⁶⁰⁰)。添加IPTG(异丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至终浓度1mM。IPTG通过灭活lacI抑制子，清除导致增加的基因表达的P/O诱导。将细胞另外培养3至4小时，这样出现指数生长的培养物。然后由离心收获细胞。含有VIGF/6-组氨酸的M15[pREP4]细胞在6M GnHCl、pH8.0的溶液中裂解。把裂解物上螯合镍柱和通过流出物收集。用6M GnHCl、50mM NaPO₄，pH值为8.0、6.0、5.0的溶液洗柱。pH值2.0时洗脱下VIGF融合蛋白(＞90％纯化)。用脱氧胆酸钠和三氯乙酸沉淀来源于预柱裂解物(图3，2道)、柱流出物(3道)、pH值5.0洗脱液(4道)、pH值2.0洗脱液(5道)的样品。为了复性的目的，把pH值2.0的洗脱液调节至3摩尔GnHCl、100mM磷酸盐钠、10mmolar谷胱甘肽(还原性)和2mmolar谷胱甘肽(氧化性)。在这种溶液中培养24小时后，将所说的蛋白质对10mmolar磷酸盐钠透析。为了跑胶，将颗粒状沉淀再悬浮在装载缓冲液的SDS/NaOH和SDS-PAGE中，热变性，然后在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。也电泳了Gibco BRL低分子量标准物(1道)。用考马斯亮蓝染色剂显示所说的蛋白质。图3是显示VIGF纯化结果的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。

                             实施例2

               利用杆状病毒表达系统克隆和表达VIGF

用限制酶PvuII和XbaI消化编码全长蛋白质的DNA序列。639个核苷酸的PvuII、XbaI片段包含全部VIGF编码区、5’和3’端分别附加11个和77个核苷酸的非翻译DNA。消化的F₂这个片段是用商品试剂盒(″Geneclean″，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离出来的。

用载体pA2由细菌表达系统表达VIGF蛋白质(综述参见：Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养过程的方法手册，得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包括苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)强大的多角体蛋白启动子，其后面是限制性核酸内切酶SmaI和XbaI的识别位点。这种猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因作为多角体蛋白启动子以同样的方向插入，其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA的同源再重组体的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替pA2，所说的载体如pRG1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒学，170：31-39)。

用限制酶SmaI和XbaI消化所说的质粒，然后由本领域已知的方法利用牛犊肠磷酸酶使质粒去磷酸化。然后用商业试剂盒(″Geneclean″，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA指定为V₂。

用T4 DNA连接酶连接F₂片段和所说的去磷酸化质粒。然后转化大肠杆菌菌株XLIBlue(Stratagene克隆系统，11011 North Torrey Pines Road La Jolla，Ca.92037)并利用酶BamHI和XbaI由VIGF cDNA鉴别含有所说质粒(pBac VIGF)的细菌。通过DNA测序确认所克隆的片段的序列。

用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报，84：7413-7417(1987))将5μg质粒pBacVIGF用1.0μg市售的线性杆状病毒(″BaculoGold^TM杆状病毒DNA″，Pharmingen，SanDiego，CA.)共转染。

将1μgBaculoGold^TM病毒DNA和5μg质粒pBac VIGF在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。添加10微升脂转染试剂和90微升Grace’s的培养基后，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中，所说细胞接种在具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1微升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。

4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。作为一种改变，使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(Life Technologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑。(″噬斑测定″的详尽的描述也可以在LifeTechnologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。

四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于包含200微升Grace’s培养基的Eppendcrf管中。经简短离心除去琼脂，将包含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。

将Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-VIGF感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900II培养基(减甲硫氨酸和半胱氨酸)(Life Technologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi³⁵S甲硫氨酸和5μCi ³⁵S半胱氨酸(Amersham)。在经离心收获之前，将细胞进一步培养16小时，标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。

                           实施例3

                  重组VIGF在CHO细胞中的表达

用载体pN346表达所说的VIGF蛋白，质粒pN346是质粒pSV2-dhfr[ATCC 37146]的衍生物。这两种质粒都含有受SV40早期启动子控制的小鼠dhfr基因。可以通过在附加了化疗剂氨甲蝶呤的选择培养基(alpha-MES，Lift技术)中生长中国仓鼠卵巢或用这些质粒转染的缺乏二氢叶酸活性的其它细胞来选择这些细胞。DHFR基因在抗氨甲蝶呤(MTX)的细胞中的扩增已很好地报道了(参见，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，and Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志，253：1357-1370，Hamlin，J.L.and Ma，C.1990，Biochem.et Biophys.Acta，1097：107-143，Page，M.J.and Sydenham，M.A.1991，生物技术，Vol.9：64-68)。生长在增加了MTX浓度的培养基中的细胞通过过度产生所说的目标酶DHFR发展了对药物的抗性，结果使所说的DHFR基因扩增。如果把另一个基因和所说的dhfr基因连接，这个基因通常被共-扩增和过度表达。然后，当撤除氨甲蝶呤时，细胞系包含整合在所说染色体上的扩增基因。

质粒pN346包含用于肉瘤病毒(Cullen等，分子和细胞生物学，1985年3月，438-447)的长末端重复(LTR)的一个强大启动子基因的表达部分，附加一个从人类细胞肥大病毒(CMV)的立即早期基因增强子中分离出来的片段(Boshart等，细胞41：521-530，1985)。所说的启动子下游是下列单一限制性酶切位点，其使得所说的基因整合：BamHI、Pvull和Nrul。在三个读框中，这些编码位点之后，所说的质粒包含翻译终止密码子，其后是大鼠前胰岛素原基因的内含子和聚腺苷酸化位点。也可以用其它高效的启动子来进行表达，例如，人β-肌动蛋白启动子、所说的SV40早期或晚期启动子、或来源于其它逆转录病毒的长末端重复，如HIV和HTLVI。为了所说的mRNA其它信号的聚腺苷酸化，例如，也可以用人的生长激素和或珠蛋白基因。

也可以根据用选择性标记(如gpt、G418或潮霉素)共转染来选择携带整合在所说的染色体上兴趣基因的稳定细胞系。开始时，使用不只一个的选择性基因是有利的，如附加氨甲蝶呤的G418。

所说的质粒pN346用限制性内切酶BamHI消化，然后通过本领域已知的方法用牛犊肠磷酸酶脱磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离所说的载体。

采用相应于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码全长VIGF蛋白质的DNA序列，ATCC#75874：

5’引物具有序列5′CGCAGATCTCCGCCACC ATGAAGAGCGTCTTGCTGCTG 3′，包含BglII限制性内切酶位点(粗体)，其后首先为类似真核细胞中翻译起始有效信号的8个核苷酸(Kozak，M.，分子生物学杂志，196：947-950，(1987))，剩下的核苷酸相当于氨基末端包括所说的翻译终止密码子(下划线)在内的7个氨基酸。3’引物具有序列5′CGCAGATCTAGCCTTCTCTCAGAAATCACA 3′，包含限制性核酸内切酶BglII切割位点(粗体)和从翻译终止密码子下游7个核苷酸始的3’非翻译DNA的反向互补链的21个核苷酸。用BglII消化PCR产品和用市售的试剂盒(“Geneclean”BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶纯化该产品。然后用T4 DNA连接酶把这个片段连接到BamHI消化的、带有磷酸酶pN346质粒上。转化X1LBlue(Stratagene)大肠杆菌并在LB平板上铺板(含50μg/ml氨苄青霉素)。在合适的部位，通过PCR方法利用相当于肉瘤病毒启动子的5’引物和相当于VIGF密码子73-79的反向互补序列的3’引物来筛选含有所需重组体的菌落。通过DNA测序确认所克隆片段的序列。CHO-dhfr-细胞的转染

用缺乏活性的DHFR酶的中国仓鼠卵巢细胞进行转染。用脂转染法将所说的表达质粒pN346 VIGF 5μg用0.5μg的质粒pSVneo共转染。所说的质粒pSV-neo含有一个占统治地位的选择性标记，来源于Tn5的基因neo编码能赋予包含G418在内的一组抗生素的抗性，所说的细胞培养在添加1mg/mlG418的alpha-MEM培养基中。两天后，用胰蛋白酶消化这些细胞并种植在杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)上培养10-14天。在这个时期之后，用胰蛋白酶消化单克隆，然后使用不同浓度的氨甲蝶呤(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)种植在6-孔培养皿中。然后把生长在最高氨甲蝶呤浓度中的克隆转移到更高浓度的氨甲蝶呤(500Nm、1μM、2μM、5μM)中。重复同样的方法至克隆生长在100μM的浓度中。

通过Western印迹分析和SDS-PAGF方法分析所要求的基因产物的表达。

                              实施例4

            用Northern印迹分析法组织定位VIGF基因的表达

在Church缓冲液(Church，G.M.& Gilbert，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1991-1995(1984))中对多组织Northern印迹(Clontech实验室，公司，4030Fabian方法：Palo Alto，加利福尼亚96303)60℃下预杂交1小时，每个道中包括的组织有：2μg成年人脑、心脏、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾和胰多聚腺苷酸+mRNA。编码VIGF的DNA序列，ATCC 75874，用M13正向(5′GGGTTTTCCCAGTCACGAC3′)和反向(5′ATGCTTCCGGCTCGTATG3′)引物从在pBluescript SK(-)编码的全长度cDNA中扩增。25ng的PCR产物是用³²P-dCTP放射标记的随机引物(引物-It II，Stratagene克隆系统，11011North Torrey Pine Rd.：La Jolla，加利福尼亚92037)。把热变性VIGF探针直接加入到预杂交缓冲液中并在60℃下培养16小时。60℃下在0.2X SSC 0.1％SDS中洗脱两次，每次10分钟。在-80℃下进行自显影。

照射四天后，在肺和肾中可见已知2.3kb的转录物(图4)。

                               实施例5

             用Northern印迹分析VIGF基因表达的细胞-类型

使人类脐静脉内皮、主动脉平滑肌、真皮的包皮成纤维细胞(Clonetics，9620Chesapeake Drive，Suite 201号；San Diego，加利福尼亚92123)生长至铺满75-90％。按Sambrook等的方法用RNAzol提取全部的RNA(Biotecx实验室，公司，8400Helgerman Ct.，P.O.Box 6009 Gaithersburg，马里兰20884)。所说的RNA过夜转移到Hybond N+膜(Amersham公司，2636 South Clearbrook Drive；Arlington Heights，Illinois 60005)同时用Stratalinker UV交联剂(Stratagene克隆系统，La Jolla，加利福尼亚)结合在膜上。所说的杂交是60℃下在Church缓冲液(Church，G.M.& Gilbert，W.，PNAS，美国81：1991-1995(1984))中预杂交1小时。编码VIGF的DNA序列，ATCC # 75874，用 M13正向(5′GGGTTTTCCCAGTCACGAC  3′)和反向(5′ATGCTTCCGGCTCGTATG3′)引物从在pBluescript SK(-)编码的全长度cDNA中扩增。25ng的PCR产物是用³²P-dCTP放射标记的随机引物(引物-It II，Stratagene)。把热变性VIGF探针直接加入到预杂交缓冲液中并在60℃下温育16小时。60℃下在0.2XSSC 0.1％SDS中洗脱两次，每次10分钟。在-80℃下进行自显影。照射2小时后(图5A)，在脐静脉内皮(1道)和主动脉平滑肌细胞(2道)或照射36小时后(图5B)在真皮包皮成纤维细胞(3道)中可见2.3-2.4kb的转录物(图5B)。

                         序列表(1)一般信息：(i)申请人：HASTINGS等(ii)发明名称：人血管IBP样生长因子(iii)序列数：2(iv)通讯地址：

    (A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，

               CECCHI，STEWART & OLSTEIN

    (B)街道：6 BECKER FARM ROAD

    (C)城市：ROSELAND

    (D)州：新泽西州

    (E)国家：美国

    (F)ZIP：07068(v)计算机可读形式：

    (A)介质类型：3.5英寸磁盘

    (B)计算机：IBM PS/2

    (c)操作系统：MS-DOS

    (D)软件：WORD PERFECT 5.1(vi)当前申请的数据：

    (A)申请号：

    (B)申请日：同时

    (C)分类号：(vii)在先申请的数据

    (A)申请号：

    (B)申请日：(viii)律师/代理人信息：

    (A)姓名：FERRARC，GREGORY D.

    (B)登记号：36，134

    (c)证书号：325800-219(ix)电信信息：

    (A)电话：201-994-1700

    (B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：1271个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1CTGCTTCCCA CCAGCAAAGA CCACGACTGG AGAGCCGAGC CGGAGCAGCT GGGAAACATG    60AAGAGCGTCT TGCTGCTGAC CACGCTCCTC GTGCCTGCAC ACCTGGTGGC CGCCTGGAGC   120AATAATTATG CGGTGGACTG CCCTCAACAC TGTGACAGCA GTGAGTGCAA AAGCAGCCCG   180CGCTGCAAGA GGACAGTGCT CGACGACTGT GGCTGCTGCC GAGTGTGCGC TGCAGGGCGG   240GGAGAAACTT GCTACCGCAC AGTCTCAGGC ATGGATGGCA TGAAGTGTGG CCCGGGGCTG   300AGGTGTCAGC CTTCTAATGG GGAGGATCCT TTTGGTGAAG AGTTTGGTAT CTGCAAAGAC   360TGTCCCTACG GCACCTTCGG GATGGATTGC AGAGAGACCT GCAACTGCCA GTCAGGCATC   420TGTGACAGGG GGACGGGAAA ATGCCTGAAA TTCCCCTTCT TCCAATATTC AGTAACCAAG   480TCTTCCAACA GATTTGTTTC TCTCACGGAG CATGACATGG CATCTGGAGA TGGCAATATT   540GTGAGAGAAG AAGTTGTGAA AGAGAATGCT GCCGGGTCTC CCGTAATGAG GAAATGGTTA   600AATCCACGCT GATCCCGGCT GTGATTTCTG AGAGAAGGCT CTATTTTCGT GAYTGTTCAA   660CACACAGCCA ACATTTTAGG AACTTTCTAG ATTATAGCAT AAGGACATGT AATTTTTGAA   720GACCAAATGT GATGCATGGT GGATCCAGAA AACAAAAAGT AGGATACTTA CAATCCATAA   780CATCCATATG ACTGAACACT TGTATGTGTT TGTTAAATAT TCGAATGCAT GTAGATTTGT   840TAAATGTGTG TGTATAGTAA CACTGAAGAA CTAAAAATGC AATTTAGGTA ATCTTACATG   900GAGACAGGTC AACCAAAGAG GGAGCTAGGC AAAGCTGAAG ACCGCAGTGA GTCAAATTAG   960TTCTTTGACT TTGATGTACA TTAATGTTGG GATATGGAAT GAAGACTTAA GAGCAGGAGA  1020AGATGGGGAG GGGGTGGGAG TGGGAAATAA AATATTTAGC CCTTCCTTGG TAGGTAGCTT  1080CTCTAGAATT TAATTRTGCT TTTTTTTTTT TTTTTGGGCT TTGGGAAAAG TCAAAATAAA  1140ACAACCAGAA AACCCCTGAA GGAAGTAAGA TGTTTGAAGC TTATGGAAAT TTGAGTAACA  1200AACAGCTTTG ANCTGAGAGC AATTYCAAAA GGCTGCTGAT GTAGCCCCCG GGTTNCCTNT  1260NTCTNAAGGA C                                                       1271(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：184个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His

-20                 -15                 -10Leu Val Ala Ala Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln

 -5                   1               5His Cys Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys Arg10                  15                  20Thr Val Leu Asp Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly25                  30                  35Arg Gly Glu Thr Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met40                  45                  50Lys Cys Gly Pro Gly Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp55                  60                  65Pro Phe Gly Glu Glu Phe Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly70                  75                  80Thr Phe Gly Met Asp Cys Arg Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly85                  90                  95Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe100                 105                 110Gln Tyr Ser Val Thr Lys Ser Ser Asn Arg Phe Val Ser Leu Thr115                 120                 125Glu His Asp Met Ala Ser Gly Asp Gly Asn Ile Val Arg Glu Glu130                 135                 140Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ser Pro Val Met Arg Lys Trp145                 150                 155Leu Asn Pro Arg160

Claims (26)

1.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：

(a)编码具有图1的推导的氨基酸序列的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子多肽或者所说多肽的保持人血管胰岛素结合蛋白样生长因子活性的片段的多核苷酸；

(b)与图1的核苷酸序列具有至少95％同一性的多核苷酸；

(c)编码具有由包含在ATCC 75874中的cDNA编码的氨基酸序列的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子多肽或者所说多肽的保持人血管胰岛素结合蛋白样生长因子活性的片段的多核苷酸；

(d)与包含在ATCC 75874中的cDNA具有至少95％同一性的多核苷酸。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA。

3.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。

4.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是基因组DNA。

5.权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码具有图1的推导的氨基酸序列的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子。

6.权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由ATCC 75874 cDNA编码的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子多肽。

7.权利要求1的多核苷酸，其具有图1所示的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子编码序列。

8.权利要求2的多核苷酸，其具有以ATCC 75874保藏的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子编码序列。

9.一种含权利要求2的DNA的载体。

10.一种用权利要求9的载体基因工程化的宿主细胞。

11.一种生产多肽的方法，该方法包括：从权利要求10的宿主细胞表达由所说DNA编码的多肽。

12.一种产生能够表达多肽的细胞的方法，该方法包括用权利要求9的载体基因工程化细胞。

13.一种分离的DNA，其可以与权利要求2的DNA杂交，并编码具有人血管胰岛素结合蛋白样生长因子活性的多肽。

14.一种多肽，该多肽选自下组：

(i)具有图1的推导的氨基酸序列的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子多肽

及其保持人血管胰岛素结合蛋白样生长因子活性的片段；

(ii)图1的推导的氨基酸序列中一或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸

残基取代后的多肽，所述多肽保持人血管胰岛素结合蛋白样生长因子活

性；

(iii)由ATCC 75874 cDNA编码的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子多肽以

及所说多肽的保持人血管胰岛素结合蛋白样生长因子活性的片段；

(iv)由ATCC 75874 cDNA编码的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子多肽中

一或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代后的多肽，所述多

肽保持人血管胰岛素结合蛋白样生长因子活性。

15.权利要求14的多肽，其中所说的多肽是具有图1的推导的氨基酸序列的人血管胰岛素结合蛋白样生长因子。

16.一种针对权利要求14的多肽的抗体。

17.一种针对权利要求14的多肽的拮抗剂。

18.一种权利要求14的多肽的刺激剂。

19.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求14的多肽，所述组合物用于治疗需要人血管胰岛素结合蛋白样生长因子的患者。

20.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求17的拮抗剂，所述组合物用于治疗需要抑制人血管胰岛素结合蛋白样生长因子的患者。

21.一种药物组合物，该组合物包含权利要求14的多肽和药学上可接受的载体。

22.权利要求19的药物组合物，其中所说的治疗有效量多肽通过提供给患者编码所述多肽的DNA并在体内表达所述多肽而施用。

23.一种鉴别人血管胰岛素结合蛋白样生长因子拮抗剂的方法，该方法包括：

在人血管胰岛素结合蛋白样生长因子存在时，在适合人血管胰岛素结合蛋白样生长因子刺激细胞增殖的条件下，使细胞和待筛选的化合物接触；和

测量细胞的增殖情况以确定所说的化合物是否是一种有效的拮抗剂。

24.一种鉴别人血管胰岛素结合蛋白样生长因子刺激剂的方法，该方法包括：

在人血管胰岛素结合蛋白样生长因子存在下，在适合人血管胰岛素结合蛋白样生长因子刺激细胞增殖的条件下，使细胞和待筛选的化合物接触；和

测量细胞的增殖情况以确定所说的化合物是否是一种有效的刺激剂。

25.权利要求1的多核苷酸在制备用于诊断与人血管胰岛素结合蛋白样生长因子核酸序列中的突变相关的疾病和易感性的诊断剂中的应用。

26.权利要求14的多肽在制备用于诊断与人血管胰岛素结合蛋白样生长因子核酸序列中的突变相关的疾病和易感性的诊断剂中的应用。

Images