CN1194009A - 结肠特异性基因及蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人类结肠特异性基因多肽和编码这些多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术产生这些多肽的方法。本发明也公开了将这种多核苷酸和多肽用作结肠癌诊断标记和用作确定结肠癌是否已转移之药剂的方法。本发明也公开了对结肠特异性基因多肽特异性的抗体,其可以用于导向肿瘤细胞和用作结肠癌疫苗的一部分。本发明还公开了筛选所述多肽的兴奋剂和拮抗剂的方法以及所述拮抗剂的治疗用途。

Description

结肠特异性基因及蛋白质
本发明涉及最新鉴别的多核苷酸、由这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途。本发明还涉及抑制本发明的这些多核苷酸的功能和产生的方法。
胃肠道是每年在美国发生的新诊断的癌症和致命癌症(男人比女人的数量要高一些)两者的最普通的位点。结肠癌在美国的发生率逐渐增加，而胃癌则减少，小肠癌稀有。胃肠癌的发生率随地理位置变化。胃癌在日本普遍在美国不普遍。而结肠癌在日本不普遍在美国普通。环境病原学因子由统计数据(显示移居至高-风险区的人承担高的风险)强烈地表明。表明胃癌的一些病原学因子包括黄曲霉毒素、由在污染食品中存在的黄曲霉形成的致癌因子、烟熏鱼、酒精和维生素A和镁缺陷。膳食高脂肪和低的大(和可能的)甾醇代谢降解产物可能是结肠癌的病因。一些疾病可以预示着癌症，例如，恶性贫血预示着胃癌，未治疗非热带口炎性腹泻和免疫缺陷预示着淋巴瘤和癌，溃烂和肉芽肿结肠炎、分离的息肉遗传性家族息肉病预示着结肠癌。
结肠最普通的肿瘤是腺瘤息肉。在结肠原发性淋巴瘤很少，在小肠中常见。
腺瘤息肉是最普通的良性胃肠肿瘤。它们在整个GI道中发生，最一般地在结肠和胃部，在男性中比在女性中更常见。它们可以单一的或者更常见的是多重的，无蒂的或有蒂的。它们可以遗传，如同在家族息肉病和Gardener’s综合症中，这主要涉及结肠。结肠癌的发展在家族息肉病中普遍。息肉经常造成流血，可以隐藏或者是显露，但是很少造成疼痛除非症状复杂。一种不太常见的乳头状的腺瘤仅在结肠中发现，也可以引起电解质丧失和类粘蛋白流出。
恶性肿瘤包括结肠癌可以是渗透的或者是植外的，同时最一般地发生于直肠乙状结肠之中。因为上行结肠的内含物为液态，在这个区域中的癌通常不造成阻碍，但是病人在病程后期易于出现贫血，腹腔疼痛，或者腹腔团块或可触知的团块。
结肠肿瘤的预后取决于肠壁入侵的程度区域淋巴节介入和远距离转移的存在。直肠和下行结肠癌的预后意想不到地十分好。在结入侵发展之前，对早期切除，80至90％的治愈率是可能的。由于这一原因，当不能解释的贫血、隐藏的胃肠流血或在肠道习惯方面改变在以前健康的病人中发展时，必须特别注意排除这种疾病。在其扩散到淋巴结之前完全除去病灶对结肠癌病人提供了生存的最好机会。通过潜隐性出血病人中的血筛选检测导致最高5年的存活。
临床怀疑的恶性损伤通常可以经放射线学检测。不到1cm的息肉容易被错过，尤其是在乙上面的状结肠中在憩室病的存在中。在食道、胃部或结肠中的临床怀疑和放射线学检测的损伤可以由纤维光学内窥镜检查与直接活组织检查和营养学进行的组织学组织诊断结合证实。结肠镜检查是检测结肠疾病所利用的另一个方法。尚不能由X光预见的良性和恶性息肉经常用结肠镜检查检测。此外，在X光上具有一种损伤的患者经常在结肠镜检查上有另外的损伤。然而，乙状结肠镜检查发现大约50％的结肠肿瘤。
检测结肠癌的上述方法有一些缺点，通过以上描述的所有方法，小的结肠肿瘤可以被错过。检测结肠癌的重要性对预防转移也极端重要。
按照本发明的一个方面，本发明提供了核酸探针，这种核酸探针包含长度足以特异性地与从本发明的人类结肠特异性基因转录的RNA杂交或者与相应于这种RNA的DNA杂交的核酸分子。
按照本发明的另一方面，本发明提供了一种通过检测来源于宿主的样品中的从本发明的人类结肠特异性基因转录的RNA或者相应于这种RNA的DNA的存在，来诊断结肠癌转移的方法和产品。
按照本发明的另一方面，本发明提供了一种通过检测来源于宿主的样品中的相应于本发明的结肠特异性基因的多肽的改变的水平来诊断结肠癌转移的方法和产品。所述多肽提高的水平指示结肠癌诊断。
按照本发明的另一方面，本发明提供了编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及其反义类似物和其生物学活性的并且在诊断上或治疗上有用的片段。
按照本发明的一个方面，本发明提供了由所说多核苷酸编码的新的多肽以及其生物学活性的并且在诊断上或治疗上有用的片段、类似物和衍生物。
按照本发明的另一方面，本发明提供了通过重组技术产生这些多肽的方法，该方法包括在促进所说的蛋白质表达的条件下培养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，随后回收所说的蛋白质。
按照本发明的另一方面，本发明提供了对这些多肽特异性的抗体。
按照本发明的另一方面，本发明提供了使用本发明的多肽治疗结肠癌的方法和使用所说的多肽筛选与该多肽相互作用的化合物的方法，所述化合物例如为抑制或激活本发明的多肽受体的化合物。
按照本发明的另一方面，本发明提供了筛选与所说的多肽相互作用的化合物的方法，所述化合物例如为抑制或激活本发明的多肽的化合物。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了将这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸体外用于与科学研究、DNA合成及DNA载体的人工合成有关的目的的方法。
从本文的教导中，本领域技术人员会清楚本发明的这些和其它方面。
下列附图用来说明本发明的实施方案，而无意于用它们来限制本发明权利要求所包括的范围。
图1显示了相应于本申请中公开的人类结肠特异性基因的cDNA序列和相应的推导的氨基酸序列。使用了氨基酸标准单字母缩写。
术语“结肠特异性基因”指这种基因首先在来源于结肠的组织中表达，并且这种基因可以在来源于非结肠组织的细胞中表达。然而这种基因在来源于结肠组织中的表达明显高于非结肠组织中的表达。
按照本发明的一个方面，本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，这种核酸编码具有图1(SEQ ID NO：2)的推导的氨基酸序列的成熟多肽或由1995年4月28日以保藏号ATCC 97129保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
编码本发明的结肠特异性基因的多核苷酸是从人结肠癌cDNA文库中分离的。该多核苷酸包含一个编码158个氨基酸残基之蛋白质的开放读框。该多核苷酸显示出来源于菱形斑纹响尾蛇的半乳糖特异性凝集素的同源性(具有36％的相同性和54％的相似性)，与人类胰腺结石蛋白质前体具有30％的相同性和52％的相似性。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。这种DNA可以是双链或单链，如果是单链，其可以是编码链或非编码(反义)链。这种编码成熟多肽的编码序列可以和图1(SEQ ID NO：1)所示的编码序列或保藏的克隆的编码序列相同；由于遗传密码的丰余性或简并性，这种编码序列也可以是一种不同的编码序列，其可以和图1(SEQ ID NO：1)的DNA或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1(SEQ ID NO：2)的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括：仅仅是编码成熟多肽的编码序列；编码成熟多肽的编码序列和附加的编码序列，如前导或分泌序列或蛋白原序列；编码成熟多肽的编码序列(和可有可无的附加的编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5′和/或3′非编码序列。
这样，“编码多肽的多核苷酸”这一术语包括只含有多肽编码序列的多核苷酸以及还含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上文描述的多核苷酸变体，这种变体编码具有图1(SEQ ID NO：2)的推导的氨基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这种多核苷酸变体可以是天然产生的多核苷酸等位变体或是非天然产生的多核苷酸变体。
这样，本发明包括编码如图1(SEQ ID NO：2)所示的相同成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及编码如图1(SEQ ID NO：2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽的片段、衍生物和类似物的多核苷酸变体。这些核苷酸变体包括缺失变体、取代变体、添加或插入变体。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一种编码序列，该序列是图1(SEQ ID NO：1)中所示的编码序列或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体。本领域已知等位变体是多核苷酸序列的另一种形式，其可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，而实质上不改变所编码的多肽的功能。
本发明也包括这样的多核苷酸，其中所说的成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框架中与帮助从宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列融合，所述的多核苷酸序列如作为分泌序列在控制多肽从细胞转运中起作用的前导序列。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且可以具有由宿主细胞切割形成成熟形式的多肽的前导序列。这种多核苷酸也编码蛋白原(proprotein)，这种蛋白原是添加有附加的5’氨基酸残基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一种无活性的蛋白形式。一旦切除原序列，留下的就是有活性的成熟蛋白。这样，本发明的多核苷酸例如可以编码一种成熟蛋白或编码具有原序列的蛋白质或编码既有原序列又有前序列(presequence)(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸。在细菌宿主的情况下，所述的标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，其提供来纯化融合进标记的成熟多肽，或例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。所说的HA标记相应于来源于流感血细胞凝集素蛋白质的一种表位(Wilson，I.等，细胞，37：767(1984))。
术语“基因”是指和产生多肽链有关的DNA区段；其包括在编码区前面的和后面的区(前导区和尾随序列)以及在各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
全长结肠特异性基因片段可以用作cDNA文库的杂交探针，用来分离全长基因和与此基因有高度的序列类似性或类似生物活性的其它基因。这种类型的探针优选地是具有至少30个碱基，并且可以含有，例如50个或更多的碱基。所说的探针也可以用于鉴别相应于全长转录物的cDNA克隆和基因组克隆或含有包含调节和启动子区、外显子和内含子的完整的结肠特异性基因的克隆。筛选的实例包括通过利用已知DNA序列合成寡核苷酸探针来分离基因的编码区。具有互补于本发明的基因序列之序列的标记可以用来筛选人类cDNA、基因组DNA或mRNA文库，以确定探针和哪些文库成员杂交。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(如果两个序列之间具有至少70％，优选地具有至少90％，更优选地具有至少95％的等同性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语“严格条件”指仅在序列间具有至少95％，优选地具有至少97％的同源性时杂交才可以发生。在一个优选的实施方案中，与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码这样一种多肽，其实质上保持与由图1(SEQ ID NO：1)的cDNA或保藏的cDNA(s)编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
此外，所述多核苷酸可以具有至少20个碱基，优选地是至少30个碱基，更优选地是至少50个碱基，其与本发明的多核苷酸杂交，并且具有如上文所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，这种多核苷酸可以用作图1(SEQ ID NO：1)多核苷酸的探针，例如用于回收多核苷酸或作为诊断探针或作为PCR引物。
这样，本发明涉及与编码图1(SEQ ID NO：2)多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，优选地至少90％相同性并且更优选地至少95％相同性的多核苷酸及其片段(这种片段具有至少30个碱基，优选地至少50个碱基)和这些多核苷酸编码的多肽。
本文所提及的保藏物将按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定保持。这些保持物仅仅是为了给本领域技术人员提供方便，并不是35 U.S.C 112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列本文一并参考，并且用于解决本文序列描述上的任何矛盾。对保藏材料的任何制造、使用或销售需要经过许可，在此未给予任何这样的许可。
按照本发明的另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，该多核苷酸优选地具有与以下序列杂交并且与以下具有至少70％的相同性的至少10个碱基对，所述序列是从人类基因转录的RNA(或相应的DNA)，所说的基因具有与图1(SEQ ID NO：1)的DNA序列的编码序列至少90％相同的编码序列。
这样，如上所述的杂交的多核苷酸序列可以用来杂交到它们所相应的人类基因上，和用来检测所述人类基因的表达，以用于此后描述的诊断测定中。
按照本发明的另一方面，本发明提供了用于在宿主中检测结肠癌微转移的诊断测定法。虽然申请人不希望将本发明的推论限制在任何特定的理论上，但可以相信在宿主细胞中本发明的结肠特异性基因(而不是来源于结肠的那些)的活性转录的存在是结肠癌转移指示性的。这是真实的，因为尽管结肠特异性基因在身体的所有细胞中均有发现，但是在非有病的个体中其转录成mRNA，cDNA以及表达产物主要限制在结肠中。然而，如果存在结肠癌，结肠癌细胞从癌向其它细胞迁移，以使这些其它细胞以较高的水平活化转录和表达结肠特异性基因，所述水平高于通常在非有病个体中通常发现的，即转录高于在健康个体的非结肠组织中发现的。正是在不是来源于结肠的那些细胞中检测到这种增强的转录或增强的蛋白质表达才是指示结肠癌转移。
在这样一种诊断测定的一个例子中，通过与探针杂交检测在来源于不是结肠组织的样品中的RNA序列。所说的样品包含核酸或核酸混合物，其中至少之一怀疑包含从本发明的人类结肠特异性基因转录的RNA(或相应的cDNA)。这样，例如，在确定细胞中特异性RNA的存在的测定形式中，最初的RNA是从细胞分离的。
样品可以从来源于不是结肠的组织的细胞获得，包括但不限于血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料。在从非结肠细胞获得的样品中使用这种方法检测从本发明的人类结肠特异性基因转录成mRNA的增强在本文的教导下完全在本领域技术人员的知识范围内。
mRNA的分离包括经裂解细胞和进行示差离心分离总细胞RNA。一旦分离总RNA，通过用本领域技术人员所知的腺苷酸残基形成的几乎在每一种真核mRNA分子3’末端发现的poly(A)尾分离mRNA。由脱氧胸苷组成的寡核苷酸[oligo(dT)]连接到纤维素上，并且oligo(dT)-纤维素被填充到小柱中。当总细胞RNA制备物流过这样一个柱时，mRNA分子通过poly(A)尾结合到oligo(dT)上，而剩下的RNA流过柱。然后从柱洗脱mRNA并收集。
检测从编码本发明的多肽的本发明的结肠特异性基因或其片段转录的分离的mRNA的一个例子包括用设计用来与待检测的mRNA杂交的特定的寡核苷酸探针筛选所收集的mRNA。所述寡核苷酸探针包含与至少一部分从一种或多种本发明的结肠特异性基因或其片段转录的分离的mRNA(或从这种RNA产生的cDNA)杂交的多核苷酸序列。所述的多核苷酸序列至少70％相同于从本发明的人类结肠特异性基因或其片段转录的分离的mRNA(或从这种RNA产生的cDNA)并与其杂交，所述的基因具有外显子并包括与图1的DNA序列(SEQID NO：1)具有至少90％，优选地至少95％，最优选地至少97％的相同性的DNA。
也应认识到可以用分析上可检测的试剂标记这些探针，并且优选地是如此。有用的试剂包括但不限于放射性，荧光染料或能够催化形成可检测产物的酶。
检测互补于mRNA序列的多核苷酸(cDNA)的一个例子是采用聚合酶链反应(PCR)以及逆转录酶。PCR是用于特异性扩增DNA或者RNA的一种十分有力的方法(Saiki等，自然，234：163-166(1986))。这种技术的一种应用是使以低拷贝数存在的核酸序列达到可检测水平的核酸探针技术。H.A.Erlich编辑的《(PCR技术原理和在DNA扩增上的应用》(Stockton出版社，USA，1989)中，和M.A.Inis(编者)在PCR方案(学术出版社，San Diego，USA，1990)中描述了这一方法的许多诊断和科学应用。
RT-PCR是将PCR与逆转录酶的结合。逆转录酶是一种从相应mRNA分子产生cDNA分子的酶。这是重要的，因为PCR扩增核酸分子，特别是DNA，这一DNA可以从由来源于宿主的样品中分离的mRNA产生。
RT-PCR诊断测定的一个特定的例子涉及从宿主组织移取样品。这种样品将来源于不是结肠的组织，例如血液。因此，这样的诊断测定的例子包括全血梯度分离有核的细胞，总RNA抽提，总RNA的RT-PCR和PCR产物的凝胶电泳。PCR产物包含互补于从本发明的结肠特异性基因或其片段转录的RNA的cDNA。更具体地说，获得血液样品，将全血与磷酸缓冲盐水合并，离心，以及小心抽吸淋巴细胞和粒细胞层，再次用磷酸缓冲液盐水稀释并再离心。弃去上清液，含有有核的细胞的沉淀用于用如制造者(Tel-Test Inc.，Friendswood，TX)所描述的RNazole B法提取RNA。
用对本发明的DNA序列高度特异性的DNA序列制备寡核苷酸引物和探针。所述探针长度至少为10个碱基对，优选地至少30个碱基对，可以是至少50个碱基对或更多。逆转录酶反应和PCR扩增依次进行无须中断。在PCR期间使用Taq聚合酶，浓缩PCR产物，使整个样品在包含溴化乙锭的Tris-硼酸盐-乙二胺四乙酸琼脂糖凝胶上电泳。
按照本发明另一方面，本发明提供了一种通过检测来源于不是结肠的组织的生物样品中本发明的特异性多肽的改变的水平诊断结肠疾病(例如结肠癌)的方法。本发明的结肠特异性多肽的提高的水平指示相应的结肠特异性基因产物的活性转录和表达。用于检测得自宿主的样品中结肠特异性多肽的水平的分析方法对本领域的技术人员是公知的，所说的方法包括：放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析、ELISA测定和“夹心”测定。生物样品可以包括但不限于组织提取物、细胞样品或生物体液，然而，按照本发明，生物样品具体来说不包括结肠组织或细胞。
ELISA测定(Coligan等，免疫学当代方案，1(2)，第6章(1991))最初包括制备对本发明的结肠特异性多肽特异性的抗体，优选地是单克隆抗体。此外，制备单克隆抗体的报道抗体。将可检测的试剂和报道抗体结合，所说的试剂如放射性、荧光或者在这一实例中是辣根过氧化物酶。由宿主获得样品，并将其在与样品中蛋白质结合的固体支持物(如聚苯乙烯皿)中温育。通过和非特异性蛋白质(如BSA)一起温育，将覆盖皿中任何游离的蛋白质结合位点。接下来，将单克隆抗体在皿中温育，在此期间单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上的本发明任何多肽结合。用缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的报道抗体放入皿中，结果导致报道抗体和任何结合到结肠特异性基因多肽上的单克隆抗体结合。然后将未结合的报道抗体洗掉。接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即是给定体积的患者样品中存在的结肠特异性多肽的量。
也可以使用竞争测定，其中将对结肠特异性多肽特异性的抗体连接到固体支持物上，然后，标记结肠特异性多肽，使标记的多肽和来源于宿主的样品通过固体支持物，经例如液体闪烁层析检测的标记的量可以与样品中结肠特异性多肽的量相关联。
“夹心”测定类似于ELISA测定。在“夹心”测定中，将本发明的多肽通过固体支持物并连接到结合在固体支持物上的抗体上。然后将第二抗体连接到结肠特异性多肽上。使标记的并且对第二抗体特异性的第三抗体通过固体支持物并连接到第二抗体上，可以定量结合的量。
在可替性方法中，使用结肠特异性多肽的标记抗体。在一步测定中，将靶分子(如果其存在)固定化并且与标记的抗体一起温育。标记的抗体结合到固定化的靶分子上。在洗涤除去未结合的分子后，检测样品中标记的存在。在两步测定中，将固定化的靶分子与非荧光素标记抗体一起温育。然后，使靶分子-标记抗体复合物(如果其存在)结合到对未标记的抗体是特异性的第二标记抗体上。洗涤样品，检测样品中标记的存在。
对用于标记的标记物的选择随应用而变化，然而，标记物的选择易于由本领域技术人员确定。这些标记的抗体可以用于免疫测定以及组织学应用中，以检测蛋白质的存在。标记的抗体可以是多克隆的或者单克隆的。
非结肠细胞中结肠特异性基因的活性转录(其大于通常发现的)的存在(存在mRNA，cDNA或者表达产物的改变的水平)是存在已转移的结肠癌的重要的指示，因为结肠癌细胞迁移到总的循环中。因此，这一现象可以具有重要的临床暗示，因为治疗局部肿瘤的方法完全不同于治疗转移的肿瘤的方法。
以上所描述的方法也可以用于检测在化疗前所保存的骨髓是否由结肠癌细胞的微转移所污染。在测定中，从骨髓分离血液细胞，并且按如上所述处理。这一方法使得人们可以测定所保存的骨髓是否在化疗之后仍然适合于移植。
对结肠特异性多肽特异性的抗体(例如单克隆抗体)也可以用于导向结肠癌细胞，例如，在导向相互作用剂方法中，这些药剂在接触结肠癌细胞时消灭它们。这是真实的，因为所述抗体对首先在结肠中表达的结肠特异性多肽是特异性的，相互作用剂与抗体的连接会引起相互作用剂被直接携带到前列腺。
这种类型的抗体也可以用来进行体内造影，例如通过标记的抗体，以促进扫描骨盆区和结肠。一种造影方法包括将待造影的任何结肠肿瘤细胞与用可检测的标记物标记的抗结肠特异性抗体接触。所述方法在使标记抗体结合到任何接触特异性多肽的条件下进行。在一个特定的例子中，抗体与结肠(例如结肠癌细胞)相互作用，使结肠造影和基于这种接触的可见的荧光被增强，使得可以测定结肠的疾病或非疾病状态。
本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的结肠特异性基因多肽或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的多肽，以及这些多肽的片段、类似物和衍生物。
术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，当有关图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，指基本上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽。这样，类似物包括蛋白原，这种类似物可以由蛋白原部分切除进而产生活性的成熟多肽激活。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选地是重组多肽。
所说的图1(SEQ ID NO：2)的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(i)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代(优选地是保守氨基酸残基取代)并且取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码子编码的氨基酸残基；或(ii)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基；或(iii)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)这样一种，其中附加氨基酸与成熟多肽融合，例如前导或分泌序列或用来纯化成熟多肽的序列或原序列。通过本文的阐述，可以认为这样的片段、衍生物以及类似物在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明优选地是提供分离形式的多肽和多核苷酸，并且优选地是将所述多肽和多核苷酸纯化成同质性的。
术语“分离的”意指所述的物质脱离了其原始环境(例如，天然环境，如果其是天然产生的)。例如，一种存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，其仍然是分离的，这是因为这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。
本发明的多肽包括图1的多肽(SEQ ID NO：2)特别是成熟多肽以及和图1的多肽(SEQ ID NO：2)具有至少70％的相似性(最好是70％的相同性)，更优选地是90％的相似性(最好是90％的相同性)，最优选地是95％的相似性(最好是90％相同性)的多肽，也包括这些多肽的部分，这些多肽的部分通常包含至少30个氨基酸，并且优选地是至少50个氨基酸。
如本领域所熟知的，两个多肽之间的“相似性”是通过比较一个多肽和另一个多肽序列的氨基酸序列和其保守氨基酸取代来确定的。
本发明多肽的片段或部分通过肽合成可以用于产生相应的全长多肽；因此，此片段可以用作产生全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明的多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体经基因工程(转导、转化或转染)产生的，所说的载体可以是克隆载体或表达载体。该载体可以是例如，质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程宿主细胞可以在修饰得适于激活启动子、选择转化体或扩增结肠特异性基因的常规营养培养基中培养。培养条件，例如温度和pH值等，是以前用于表达选择的宿主细胞的那些，对普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可以用来经重组技术产生多肽。这样，例如，多核苷酸可以包含在各种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA组合衍生的载体、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和假狂犬病病毒。然而，任何其它载体也可以使用，只要其在宿主中可复制和稳定。
可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，用本领域已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。
在表达载体中的所说的DNA序列是可操作地连接到适当的指导mRNA合成表达控制序列(启动子)上的。这样的启动子的代表性例子可以提到的是：LTR或SV40启动子，大肠杆菌的lac或trp、噬菌体λPL启动子，和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。所说的表达载体也包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。该载体也可以包含供扩增表达的合适的序列。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。
包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体可以用于转化适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。
作为合适宿主的代表性例子，这里可以提到的是：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。通过本文的阐述，对适当的宿主的选择在本领域技术人员的知识范围之内。
更具体地说，本发明也包括重组构建体，该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体，如质粒或病毒的载体，该载体已正向或反向插入了本发明的序列。在这一实施方案的更为理想的情况下，构建体还包含可操作连接到所述序列上的调节序列，包括，例如，启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是通过商业途径可获得的。以举例的方式给出下列载体：细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD1O、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它质粒或载体都可以使用，只要它们在宿主中可复制和稳定。
可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。对适当的载体与启动子的选择在本领域普通技术人员的水平之内。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含以上所述构建体的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法(1986))。
宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式产生由重组序列编码的基因产物。此外，本发明的多肽可以由常规肽合成仪合成产生。
蛋白质可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当的启动子控制下表达。采用来源于本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用来产生这种蛋白质。Sambrook等，分子克隆：实验室手册，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。
高等真核生物编码本发明的多肽的DNA的转录被插入到载体中的增强子序列增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点后侧100至270bp上的SV40增强子、细胞肥大病毒早期启动子增强子、复制起点后侧上的多形瘤增强子以及腺病毒增强子。
一般来说，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如，大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列以合适的方式(phase)与翻译起始和终止序列装配。异源序列可以也可以不编码融合蛋白，这种蛋白质包括赋予所需特征的N-末端鉴别肽，所需特征例如，表达的重组产物稳定或简化纯化步骤。
通过将带有合适的翻译起始和终止信号的编码所需蛋白质的结构DNA序列与功能性启动子一起插入可操作读框中来构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以在宿主来保证保持载体和需要时提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种(虽然其它的也可以选择来使用)。
作为一个代表性的但不是限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”片段与适当的启动子和待表达的结构序列组合。
在合适的宿主菌株转化和合适的宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用合适的方法(例如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞培养另外一段时间。
典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保持所形成的粗产物用于进一步的纯化。
可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，所述方法包括冻-融循环、声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman(细胞，23：175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、适合的启动子和增强子，也可以包含任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。
结肠特异性基因多肽可以用多种方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽取、阴离子或阳离子交换层析、磷纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和性层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)作为最后的纯化步骤。
本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸。在细菌宿主的情况下，标记序列的一个例子是可以由载体(优选地是pQE-9载体)提供的六组氨酸标记，其提供来纯化融合进标记的成熟多肽，或例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。所说的HA标记相应于来源于流感血细胞凝集素蛋白质的一种表位(Wilson，I.等，细胞，37：767(1984))。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
按照本发明的另一方面，本发明提供了可以用于筛选抑制本发明的结肠特异性基因或结肠特异性蛋白质的作用的治疗剂的测定法。一种测定利用这些蛋白质的还原酶功能。本发明公开了用于选择以足够的亲和性与结肠特异性基因蛋白质形成复合物以阻止它们的生物学功能的治疗剂的方法。所述方法包括各种测定法，包括竞争测定法，其中蛋白质固定化在支持物上，并同时或先后与天然底物和标记的治疗剂接触，以确定治疗剂是否以足以阻止所说的蛋白质与其底物结合的方式有效地与天然底物竞争。
在另一个实施方案中，将底物固定化在支持物上，与标记的结肠特异性多肽和治疗剂(或非标记的蛋白质和标记的治疗剂)两者接触，确定结合到底物上的结肠特异性多肽的量与没有添加治疗剂的测定比较是否降低。所述的结肠特异性多肽可以用抗体标记。
在另一个这样的筛选测定的例子中，本发明提供了表达本发明的结肠特异性多肽的哺乳动物细胞或膜制剂，其是在待筛选的化合物存在下在有利于氧化还原反应的条件(其中氢和氧形成水)下与同时经历氧化和还原的成分一起温育的，所述成分例如一起形成水的氢和氧，其中的氢可以被放射活性物(例如氚)标记。然后可以测定化合物阻断这一相互作用的能力。
本发明提供了鉴别本发明的多肽之受体的方法。可以用许多本领域技术人员已知的方法鉴别编码所说受体的基因。所述方法如配体淘选和FACS分选(Coligan等，免疫学当代方案，1(2)，第5章，(1991))。优选地，使用表达克隆，其中从对所述多肽反应性的细胞制备多聚腺苷酸RNA，将从这一RNA产生的cDNA文库分成小集合体，用于转染COS细胞或对所述多肽非反应性的其它细胞。使生长在载波片上的标记后的转染细胞暴露在本发明的多肽下，所述多肽可以由多种方法(包括碘化或引入位点特异性蛋白质激酶的位点)标记。在固定和温育后，将载波片进行放射自显影分析。鉴别阳性集合体，制备亚集合体，用交互式亚集合和再筛选方法再转染，最终产生编码推定的受体的单克隆。
受体鉴别的另一种方法是可以将标记的多肽与表达受体分子的细胞膜和抽提制剂光亲和连接，经PAGE分离交联材料，并对X-光胶片曝光。可以切下包含所述多肽受体的标记复合物，分离成肽片段进行蛋白质微测序。从微测序获得的氨基酸序列用于设计一套筛选cDNA文库简并寡核苷酸探针，以鉴别编码推定的受体的基因。
此外，因为本发明的结肠特异性基因和基因产物是生长调节物，所述多肽的兴奋剂和拮抗剂可以通过这样一种测定法来测定，其中包括将包含多肽受体的膜制剂与待筛选的化合物组合，并且测定从受体产生的信号。在测定拮抗剂的情况下，将本发明的多肽添加到测定中，然后可以测定化合物竞争结合位点(即，不从受体产生信号)的能力。
结肠特异性多肽的潜在的拮抗剂包括以上描述的抗体和抗独特型抗体，或者在某些情况下包括结合到其上的寡核苷酸。
另一个潜在的拮抗剂化合物是采用反义技术制备的反义构建体，其针对结肠特异性多肽以阻止转录。反义技术可以通过三螺旋形成或反义DNA或RNA来控制基因的表达，这两种方法都基于多核苷酸和DNA或RNA的结合。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用来设计长度约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。一种DNA寡核苷酸被设计成与转录所涉及的基因区互补(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456，(1988)；和Dervan等，科学，251：1360(1991))，进而阻止结肠特异性多核苷酸的转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内和mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译成为结肠特异性基因多肽(反义-Okano，J.Neurochem.，56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以传送到细胞中，以便可以体内表达反义RNA和DNA，抑制结肠特异性多肽的产生。
潜在的拮抗剂也包括小分子，这些小分子结合并占据结肠特异性多肽的活性位点，从而使活性位点不能接近底物，使正常的生物学活性被阻断。小分子的例子包括但不限于小肽或类肽分子。
所述的拮抗剂可以用于治疗结肠癌，因为它们以足以抑制结肠癌细胞存活所必需的天然功能的方式影响结肠特异性多肽的功能。拮抗剂可以用于与药学上可接受的载体组合，例如如此后所描述的。
本发明的多肽和拮抗剂可以与合适的药物载体组合使用。这样的组合物包含治疗有效量的所说多肽或拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它们的组合物。其配方应该适宜于施用的方式。
本发明也提供了药物包或试剂盒，它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物的一种或多种成份的容器。与这种容器相关联的可以是管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构规定形式的告示，这一告示反映了制造、使用或销售人类使用品的政府机构的同意。此外，所述的药物组合物可以与其它治疗化合物结合使用。
所述药物组合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口头、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、肛门内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说，它们以至少大约10微克/千克体重的量施用，在大多数情况下，它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下，考虑用药途径和病症等因素，剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重。
结肠特异性基因多肽和多肽形式的兴奋剂和拮抗剂，可以依据本发明通过体内表达这样的多肽来利用，这常被称作“基因治疗”。
这样，例如，可以体外对患者细胞用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)进行基因工程操作，用工程细胞向被治疗的患者提供所说的多肽。这样的方法是本领域众所周知的。例如，可以用包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。
同样地，可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作，以便体内表达多肽。如本领域已知的，可以将产生反转录病毒颗粒(含有编码本发明多肽的RNA)的产生细胞施用于患者，以便体内将细胞基因工程化并体内表达所说的多肽。经本发明的描述，通过这种方式施用本发明多肽的这些或其它方法对本领域技术人员是清楚的。例如，工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，如可以在与合适的运送载体组合后用于体内工程化细胞的腺病毒。
可以得自上文描述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿猩猩白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒、和乳房肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体来自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于：反转录病毒LTR；SV40启动子；和人类巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller，等，生物技术，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或其它任何启动子(例如真核细胞启动子，如包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。使用的其它病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的描述，合适的启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。
编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制下。可以使用的合适的启动子包括但不限于：腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或异源启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人类生长激素启动子。所说的启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。
使用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以便形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于：PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系(Miller、人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部内容本文一并参考)。可以通过本领域任何已知的方法用所述载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于：电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，反转录病毒质粒载体可以包囊在脂质体中，或和脂类偶合，然后施用到宿主中。
生产细胞系产生感染性的反转录病毒载体颗粒，这种颗粒包含编码所述多肽的核酸序列。然后可以使用这些反转录病毒载体颗粒体内或体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于：胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
本发明也涉及用本发明的结肠特异性基因作为诊断剂。例如，某些疾病产生遗传缺陷基因。本发明的结肠特异性基因在结肠癌中超量表达。本发明的结肠特异性基因中的突变可以用各种技术在DNA水平上检测。可以从患者的不是结肠的细胞(如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸(基因组DNA，mRNA等)。基因组DNA可以直接用于检测，或在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同的目的。作为一个例子，可以用与本发明的核酸互补的PCR引物鉴别和分析本发明的结肠特异性多肽中的突变。例如，可以通过与正常遗传型比较的扩增产物大小上的改变来检测缺失或插入。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的结肠特异性RNA或放射性标记的反义DNA序列杂交鉴别。
另一个用于筛选在PCR扩增后DNA特定区段中的突变的成熟方法是单链形成多态性(SSCP)分析。经再扩增10个循环掺入32P-dCTP制备用于SSCP的PCR产物，以适当的限制性内切酶消化产生200-300bp片段，由加热至85℃5分钟变性。然后投入至冰中。接着在非变性凝胶(5％甘油，5％丙烯酰胺)中进行电泳(Glavac，D.和Dean，M.，人类突变，2：404-414(1993))。
通过直接的DNA测序方法揭示参照基因和“突变体”间的序列差异。此外，克隆的DNA区段(segment)可以用作探针以检测特异性DNA区段。当和PCR结合时，这种方法的敏感性大大提高。例如，将测序引物和双链的PCR产物或由改良的PCR方法产生的单链模板分子一起使用。通过常规的放射标记核苷酸方法或具有荧光标记的自动测序方法确定序列。
基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示出。不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上的区别，其中不同的DNA片段的迁移按照其特定的熔点或部分融化温度而停滞在凝胶的不同位置(参见，例如，Myers等，科学，230：1242(1985))。此外，可以按DNA迁移模式的变化测定序列改变，特别是小的缺失。
也可以由核酸酶保护测定法揭示特定位置上的序列变化，所述测定法如核糖核酸酶保护和S1保护以及化学裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。
这样，可以由以下方法检测特定DNA序列，所述方法例如杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序、或使用限制酶(例如，限制片段长度多形性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法。
本发明的序列对染色体鉴别也有价值。所说的序列特异性地导向单个人染色体的特定位置，并与之杂交。此外，也需要鉴别染色体上的特定位点。极少的基于实际序列数据(重复多形性)的染色体标识试剂现在可用来标记染色体位置。在关联与疾病有关基因的那些序列中，按照本发明的染色体的DNA作图是重要的第一步。
简言之，可以通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)对染色体序列作图。3’未翻译区的计算机分析用来迅速选择引物，该引物不跨越一个以上的基因组DNA中的外显子，否则使扩增方法复杂化。然后，这些引物用于经PCR筛选包含单独的人染色体的体细胞杂合子。仅包含相应于引物的人基因的那些杂种产生扩增片段。
体细胞杂合子的PCR作图是指定特定DNA到特定染色体的快速方法。利用本发明及相同的寡核苷酸引物，可以由一组特定染色体的片段或一组大的基因组克隆以类似的方式获得亚定位。可以类似地用于对其染色体作图的其它作图策略包括原位杂交、用标记的流式分选染色体预筛选和经杂交预选择以构建染色体特异性-cDNA文库。
在一个步骤中，中期染色体涂片的cDNA克隆的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的染色体位置。这一技术可以与短至50或60碱基的cDNA一起使用。这种技术的综述，参见Verma等，人染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦序列定位至精确的染色体位置上，染色体上的序列的物理位置就可以与遗传图数据关联。这样的数据可以在例如V.McKusick，在人中的孟德尔式遗传中找到(可联机到Johns Hopkins大学Welch医学文库上使用)。然后，基因和已定位到相同的染色体区的疾病之间的相互关系经连锁分析(物理邻近基因的共遗传)鉴别。
接着，有必要确定感染和未感染个体之间cDNA或基因组序列中的不同。如果在某些或全部感染个体中观察到突变，但在任何正常个体中观察不到，则所述的突变很可能是疾病的病因。
采用现有分辨率的物理作图和遗传作图技术，精确定位到与疾病相关的染色体区上的cDNA可能是50和500之间的潜在致病基因的一个(这假定1兆碱基作图分辨率，每20kb一个基因)。
所说的多肽，其片段或衍生物或类似物，或表达它们的细胞可以用作免疫原由此产生抗体。这些抗体可以是例如，多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链和人化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本领域中已知的各种方法可以用于产生这样的抗体和片段。
可以通过对动物直接注射多肽或对动物(优选地是非人动物)施用多肽获得抗相应于本发明的序列的多肽产生的抗体。然后如此获得的抗体结合多肽本身。按这种方式，即使是编码多肽的一个片段的序列也可以用于产生结合全部天然多肽的抗体。用这种抗体从表达多肽的组织中分离多肽。
对于单克隆抗体的制备，可以使用任何提供由传代细胞系培养物产生的抗体的技术。例子包括产生人单克隆抗体的杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、三瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，当今免疫学，4：72)和EB病毒-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌疗法，Alan R.Liss，公司，pp.77-96)。
所描述的有关单链抗体产生的技术(美国专利4,946,778)可以用来产生抗本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。也可以利用转基因小鼠产生抗体。
所述的抗体也可以用于导向结肠癌细胞，例如，在导向相互作用剂这些药剂在接触结肠癌细胞时消灭它们方法中。这是真实的，因为所述抗体对本发明的结肠特异性多肽是特异性的，相互作用剂与抗体的连接会引起相互作用剂被直接携带到结肠。
这种类型的抗体也可以用来进行体内造影，例如通过标记的抗体，以促进扫描骨盆区和结肠。一种造影方法包括将待造影的任何结肠肿瘤细胞与用可检测的标记物标记的抗结肠特异性抗体接触。所述方法在使标记抗体结合到任何接触特异性多肽的条件下进行。在一个特定的例子中，抗体与结肠(例如结肠癌细胞)相互作用，使结肠造影和基于这种接触的可见的荧光被增强，使得可以测定结肠的疾病或非疾病状态。
将参照以下实施例进一步描述本发明。然而应该清楚本发明不限于这些实施例。除非特别指明，所有分数或数量均指重量。
为了有利于理解下列实施例，以下描述一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”由前面的小写p和/或后续的大写字母和/或数字指定。本文的起始质粒是市售的、公众可无限制获得的或是可以按已出版的方法从可获得的质粒构建的。此外，所描述的质粒的等同质粒在本领域中是已知的，对普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”指以限制性内切酶催化切割DNA，这种限制性内切酶仅作用在DNA一定的序列上。本发明所有的各种限制酶是市售的，如普通技术人员所知采用它们的反应条件，辅因子和其它需要。为了分析的目的，一般地是在约20微升缓冲液中使用1微克质粒或DNA片段以及约2单位的酶。为了分离用于质粒构建体之DNA片段的目的，一般是在较大体积中用20至250单位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的缓冲液和底物的量由制造者规定。通常使用37℃约1小时的培养时间，但可以按照供应者的说明变化。在消化之后，反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需的片段。
用Goeddel等，核酸研究，8：4057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行切割片段的大小分离。
“寡核苷酸”指单链多脱氧核苷酸链或两条互补的多脱氧核苷酸链，其可以是化学合成的。这样合成的寡核苷酸没有5’磷酸，因此若不在激酶存在下用ATP添加磷酸时，其不连接另一个寡核苷酸。合成的寡核苷酸将连接没有去磷酸化的片段。
“连接”指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.等，Id.，p.146)。除非提供其它方式，可以采用已知缓冲液和条件用每0.5微克大约等摩尔量的待连接的DNA片段10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)进行连接。除非有其它说明，按Graham，F.和van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)的描述进行转化。
                      实施例1
              测定结肠特异性基因的转录
为了评估结肠特异性基因RNA的活性转录存在或不存在，以标准的静脉穿刺术用肝素化管获得大约6ml静脉血液。将全血与相等体积的磷酸缓冲盐水混合，然后在15ml聚苯乙烯试管中的8mlFicoll(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上分层。于5℃在1800Xg下梯度离心20分钟。小心吸取淋巴细胞和粒细胞层(约5ml)，在50ml试管中用磷酸盐缓冲盐水再稀释至50ml，再一次于5℃在1800Xg下离心20分钟。弃去上清液，含有有核的细胞的沉淀用于用如制造者(Tel-Test Inc.，Friendswood，TX)所描述的RNazole B法提取RNA。
为了测定来源于感兴趣基因的mRNA的量，设计与从人类基因(其编码部分包括图1的DNA序列)转录的mRNA序列具有相同性的探针。将这一探针与抽提的RNA混合，混合的DNA与RNA于-70℃下用乙醇沉淀15分钟。将沉淀重悬于杂交缓冲液中并溶解。在72℃的水浴中将包含混合物的试管温育10-15分钟，以使DNA变性。将试管迅速转移至所需杂交温度的水浴中。杂交温度取决于DNA的G+C含量。进行杂交3小时。添加0.3ml核酸酶-S1缓冲液，并且充分混合。加入50μl4.0M醋酸铵和0.1M乙二胺四乙酸停止反应。用苯酚/三氯甲烷抽提混合物，加入20μg载体tRNA，用等体积的异丙醇进行沉淀。将沉淀溶解在40μl的TE(pH7.4)中，在碱性琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，对RNA微测序，以证实核苷酸序列(更详细的描述参见Favaloro，J.等，酶学方法，65：718(1980))。
将两个寡核苷酸引物用于扩增从以上方法分离的序列。5’引物20个核苷酸长，3’引物是分离的mRNA的3’末端的互补序列。按分离mRNA常规设计引物，在Perkin Elmer 9600 PCR仪(Emeryville，CA)中不间断地进行逆转录酶反应和PCR扩增。将在20μl焦碳酸二乙酯处理过的水中的400ng总RNA置于65℃的水浴中5分钟。在添加PCR试剂之前在冰上迅速冷却。50μl总PCR体积由以下成分组成：2.5单位Taq聚合酶(Perkin-Elmer)；2单位禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)；dCTP，dATP，dGTP和dTTP(Perkin Elmer)各200μM；引物各18pM；10mMTris-HCl；50mM KCl和2mM MgCl2(PerkinElmer)。PCR如下：循环1为42℃15分钟，然后97℃15秒钟(1个循环)；循环2为95℃1分钟，60℃1分钟，72℃30秒钟(15个循环)；循环3为95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟(10个循环)；循环4为95℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟(8个循环)；循环5为72℃15分钟(1个循环)；最后的循环是在4℃下保持直到样品从仪器中取出。经真空离心将50μl样品浓缩成10μl，然后将样品在含溴化乙锭的薄的1.2％Tris-硼酸盐-乙二胺四乙酸琼脂糖凝胶上电泳。预期大小的条带表明这一基因存在于组织中。在沉淀中的RNA的量可以用多种方法定量，例如，可以称量。
经微测序证实PCR产物核苷酸序列。按照制造者的描述用QiagenPCR产物纯化试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化PCR产物。按照应用生物系统(Foster CA)的描述在Perkin-Elmer 9600 PCR仪中用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle测序试剂盒对1μgPCR产物进行PCR测序。按照厂商的描述用Centri-Sep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)纯化测序产物。然后用ABI型373A DNA测序系统(应用生物系统)以及Macintosh IIci计算机分析这一产物。
                     实施例2细菌表达和纯化结肠特异性基因蛋白质以及用于制备单克隆抗体
利用PCR寡核苷酸引物起始扩增编码本发明的多肽的DNA序列ATCC#97129，所说的引物相当于加工过的蛋白质的5’序列(减去信号肽序列)和所述基因的3’的载体序列。将相应于DNA序列的附加核苷酸分别加入到5’和3’序列中。所说的5’寡核苷酸引物GCAGGATCCTGGCTTCCAGAAGCATG(BAMHI)(SEQ ID NO：3)可以含有例如限制性内切酶位点，接着由加工过的蛋白质的假定的末端氨基酸开始的编码序列的核苷酸。3’序列TACGGGTACCTTGCTCTATGGTCGGTAC(ASP718)(SEQ ID NO：4)可以包含例如与限制酶位点互补的序列，并且也接着编码感兴趣蛋白质的核酸序列的核苷酸。所说的限制性内切酶位点相应于在细菌表达载体例如pQE-32(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)上的限制性内切酶位点。pQE-32编码抗生素抗性(Ampr)、细菌的复制起点(ori)、IPTG可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用相应于包含在引物序列中的限制酶位点的限制酶消化pQE-9。将扩增的序列连接到pQE-9中并将其插入到带有编码组氨酸标记和RBS之序列的框架中。然后通过Sambrook等(分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株，例如M15/rep 4(Qiagen)。M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝，这种质粒表达lacI阻遏物，同时赋予卡那霉素抗性(Kanr)。通过转化体在LB平板上的生长能力鉴定转化体，并筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。通过限制分析分离并确认质粒DNA。将含有所需构建体的菌落在补充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)生长。将O/N培养物以1∶100至1∶250的比率用于接种大体积培养物。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4和0.6之间时，加入IPTG(异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)至最终浓度为1mM。IPTG通过失活lacI阻遏物，清除P/O，增加基因表达。将细胞再培养3至4小时。通过离心收获细胞，将细胞沉淀溶解在6M盐酸胍离液剂中。澄清后，在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，在镍-螯合物柱中通过层析从溶液中纯化溶解的蛋白质(Hochuli，E.等，层析法杂志411：177-184(1984))。将蛋白质以6M盐酸胍(pH值5.O)从柱中洗脱下来，为了复性，调至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在溶液中温育12小时后，将蛋白质对10mM磷酸钠透析。
以这种方式纯化的蛋白质可以用作表位产生对这种蛋白质特异性的单克隆抗体。针对多肽和分离的蛋白质的单克隆抗体可以经直接将多肽注射到动物中或者经向动物施用多肽获得。如此获得的抗体将结合蛋白质本身。然后，通过使用例如ELISA测定，这种抗体可以用于从表达该多肽的组织分离蛋白质。
                     实施例3
                经由基因治疗的表达
从患者中经皮肤活组织检查获得成纤维细胞。将得到的组织放置在组织培养基中并将其分成小块。将小组织块放置在湿组织培养瓶的表面，每瓶放置大约10块。将瓶倒转，盖紧，在室温下过夜。在室温下放置24小时后，将瓶旋转过来，组织块仍然固着在烧瓶底部，加入新鲜培养基(如Ham’s F12培养基，其中含有10％FBS、青霉素和链霉素)。然后，在37℃下培养大约1周。此时，加入新鲜培养基，以后每隔几天换一次培养基。又培养2周之后，出现单层的成纤维细胞。将单层细胞用胰蛋白酶消化，并放入在大瓶中。
将pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))(其两侧是Moloney鼠肉瘤病毒的长末端重复区)用EcoRI和HindIII消化，之后用牛犊肠磷酸酶处理。在琼脂糖凝胶上分级分离线性载体，并用玻璃珠纯化。
利用PCR引物扩增编码本发明的多肽的cDNA，所说的引物分别相应于5’和3’末端序列。5’引物包含EcoRI位点，3’引物包含HindIII位点。在T4DNA连接酶存在下，将等量的Moloney鼠肉瘤病毒线性骨架和EcoRI和HindIII片段一起加入。在适于这两种片段连接的条件下，保持得到的反应混合物。用连接混合物转化细菌HB101，然后将细菌HB101在含卡那霉素的琼脂中平板上涂布，以确认载体中是否含有正确插入的感兴趣基因。
将兼嗜性pA317或GP+aml2包装细胞在Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)(含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素)中组织培养至其铺满。然后将含有所说的基因的MSV载体加入到培养基中，并用载体转导包装细胞。此时，包装细胞产生含有所说的基因的感染性病毒颗粒(此时，包装细胞称为生产细胞)。
将新鲜培养基加入到转导的生产细胞中，随后，在铺满生产细胞的10cm平板上收获培养基。通过微孔滤膜过滤含有感染性病毒颗粒的用过的培养基，以除去脱附的(detached)生产细胞，然后用这种培养基感染成纤维细胞。从亚铺满成纤维细胞的平板中除去培养基，并迅速地用来源于生产细胞的培养基替换。将此培养基除去，以新鲜培养基代替。如果病毒的滴度很高，事实上所有的成纤维细胞都将被转染，而不需要选择。如果病毒的滴度很低，有必要利用具有选择性标记如neo或his的反转录病毒载体。
然后将工程化的成纤维细胞注射到宿主中，或单独或在cytodex 3微载体珠上生长至铺满再注射。此时，成纤维细胞产生蛋白质产物。
                      实施例4
  利用杆状病毒表达系统克隆和表达结肠特异性基因多肽
利用PCR寡核苷酸引物扩增编码全长蛋白质的DNA序列，ATCC#97129，所说引物相应于所说基因的5’和3’序列：
5’引物具有序列5′ATCGGGATCCGCCATCATGGCTTCCAGAAGCATGCG(SEQ ID NO：5)，包含BamHI限制位点(粗体)，接着为代表在真核细胞中起始转录的有效信号的6个核苷酸(Kozak，M.，分子生物学杂志，196：947-950(1987))，其后为结肠特异性基因的头20个核苷酸(转录起始密码子“ATG”有下划线)。
3’引物具有序列5′TACGGGTACCTTGCTCTATGGTCGGTAC3’(SEQ ID NO：6)，包含限制性内切酶Asp718的切割位点和互补于结肠特异性基因3’-非翻译序列的5个核苷酸。用市售试剂盒(“Geneclean”BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增的序列。然后将所说的片段用核酸内切酶BamHI和Asp718消化，并在1％琼脂糖凝胶上再次纯化。此片段指定为F2。
使用载体pA2(由pVL941载体修饰而成，见下文讨论)由杆状病毒表达系统表达结肠特异性蛋白质(综述参见：Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养过程的方法手册，得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包含苜蓿银纹夜蛾核型多角病毒(AcMNPV)强多角体蛋白启动子，其后面是限制性核酸内切酶BamHI和Asp718的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同样的方向插入，其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替pRG1，所说的载体如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒学，170：31-39)。
用限制酶消化所说的质粒，然后由本领域已知的方法利用牛犊肠磷酸酶使质粒去磷酸化。然后用市售试剂盒(“Geneclean”，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA命名为V2。
用T4DNA连接酶连接F2片段和所说的去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌DH5c细胞(Stratagene克隆系统，11011 North TorreyPines Road La Jolla，Ca.92037)并利用酶BamHI和Asp718鉴别含有带结肠特异性基因的所说质粒(pBac-结肠特异性多肽)的细菌。通过DNA测序确认所克隆的片段的序列。
用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报，84：7413-7417(1987))将5μg质粒pBac-结肠特异性多肽与1.0μg市售的线性杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。
将1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg质粒pBac结肠特异性基因在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。在添加10微升脂转染试剂和90微升Grace’s的培养基后，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中，所说细胞接种在具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养27小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1微升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。
4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。一点改变是使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑。(“噬斑测定”的详尽的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-1O页中找到)。
四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于包含200微升Grace’s培养基的Eppendcrf管中。经简短离心除去琼脂，将包含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。
使Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-结肠特异性基因感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900II培养基(减甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi 35S甲硫氨酸和5μCi 35S半胱氨酸(Amersham)。感染72小时后在低渗磷酸盐缓冲液中进行细胞裂解，从感染细胞纯化结肠特异性蛋白质，并进一步经离子交换层析、筛选层析和反相层析纯化。
在以上所述的教导下，本发明的许多改良和变化是可能的，因此，在附属权利要求的范围内，可以以不同于以上特定描述的方式实施本发明。
                    序列表(1)一般信息：(i)申请人：LI，ET AL.(ii)发明名称：人类结肠特异性基因(iii)序列数：6个(iv)通讯地址：
   (A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，
              CECCHI，STEWART和OLSTEIN
   (B)街道：6 BECKER FARM ROAD
   (C)城市：ROSELAND
   (D)州：新泽西州
   (E)国家：美国
   (F)ZIP：07068(v)计算机可读形式：
   (A)介质类型：3.5英寸磁盘
   (B)计算机：IBM PS/2
   (c)操作系统：MS-DOS
   (D)软件：WORD PERFECT 5.1(Vi)当前申请的数据：
   (A)申请号：
   (B)申请日：
   (C)分类号：(Vii)在先申请的数据
   (A)申请号：
   (B)申请日：(viii)律师/代理人信息：
   (A)姓名：FERRARO，GREGORYD.
   (B)登记号：36,134
   (c)卷号/文档号：325800-(ix)电信信息：
   (A)电话：201-994-1700
   (B)传真：201-994-1744   (2)SEQ ID NO：1的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：1114个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：cDNA
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1GCACGAGGCC AAACAGATTT GCAGATCAAG GAGAACCCAG GAGTTTCAAA GAAGCGCTAG   60TAAGGTCTCT GAGATCCTTG CACTAGCTAC ATCCTCAGGG TAGGAGGAAG ATGGCTTCCA  120GAAGCATGCG GCTGCTCCTA TTGCTGAGCT GCCTGGCCAA AACAGGAGTC CTGGGTGATA  180TCATCATGAG ACCCAGCTGT GCTCCTGGAT GGTTTTACCA CAAGTCCAAT TGCTATGGTT  240ACTTCAGGAA GCTGAGGAAC TGGTCTGATG CCGAGCTCGA GTGTCAGTCT TACGGAAACG  300GAGCCCACCT GGCATCTATC CTGAGTTTAA AGGAAGCCAG CACCATAGCA GAGTACATAA  360GTGGCTATCA GAGAAGCCAG CCGATATGGA TTGGCCTGCA CGACCCACAG AAGAGGCAGC  420AGTGGCAGTG GATTGATGGG GCCATGTATC TGTACAGATC CTGGTCTGGC AAGTCCATGG  480GTGGGAACAA GCACTGTGCT GAGATGAGCT CCAATAACAA CTTTTTAACT TGGAGCAGCA  540ACGAATGCAA CAAGCGCCAA CACTTCCTGT GCAAGTACCG ACCATAGAGC AAGAATCAAG  600ATTCTGCTAA CTCCTGCACA GCCCCGTCCT CTTCCTTTCT GCTAGCCTGG CTAAATCTGC  660TCATTATTTC AGAGGGGAAA CCTAGCAAAC TAAGAGTGAT AAGGGCCCTA CTACACTGGC  720TTTTTTAGGC TTAGAGACAG AAACTTTAGC ATTGGCCCAG TAGTGGCTTC TAGCTCTAAA  780TGTTTGCCCC GCCATCCCTT TCCACAGTAT CCTTCTTCCC TCCTCCCCTG TCTCTGGCTG  840TCTCGAGCAG TCTAGAAGAG TGCATCTCCA GCCTATGAAA CAGCTGGGTC TTTGGCCATA  900AGAAGTAAAG ATTTGAAGAC AGAAGGAAGA AACTCAGGAG TAAGCTTCTA GACCCCTTCA  960GCTTCTACAC CCTTCTGCCC TCTCTCCATT GCCTGCACCC CACCCCAGCC ACTCAACTCC 1020TGCTTGTTTT TCCTTTGGCC ATAGGAAGGT TTACCAGTAG AATCCTTGCT AGGTTGATGT 1080GGGCCATACA TTCCTTTAAT AAACCATTGT GTAC                             1114(2)SEQ ID NO：2的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：158个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu
              5                  10                  15Ala Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys
             20                  25                  30Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe
             35                  40                  45Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser
             50                  55                  60Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu
             65                  70                  75Ala Ser Thr Ile Ala Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln
             80                  85                  90Pro Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp
             95                 100                 105Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly
            110                 115                 120Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn
            125                 130                 135Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg Gln
            140                 145                 150His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro
            155

Claims (20)

1.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包括选自下组的成员：
(a)一种编码包含SEQ ID NO：2所示的1至158位氨基酸的多肽的多核苷酸；
(b)一种编码由包含在ATCC 97129号保藏物中的DNA编码的成熟多肽的多核苷酸；
(c)一种能够与(a)或(b)的多核苷酸杂交，并且与(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％的相同性的多核苷酸；和
(d)一种(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA。
3.权利要求2的多核苷酸，该多核苷酸编码包含SEQ ID NO：2所示的1至158位氨基酸的多肽。
4.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸具有与选自下组的成员杂交并且与选自下组的成员具有至少70％的相同性的至少10个碱基对：
(a)从人类基因转录的RNA，所说的基因包括与选自由SEQ IDNO：1组成的组的DNA具有至少90％的相同性的DNA；以及
(b)相应于(a)的RNA的DNA。
5.一种包含权利要求2的DNA的载体。
6.一种用权利要求5的载体经基因工程操作的宿主细胞。
7.一种产生多肽的方法，该方法包括从权利要求6的宿主细胞表达由所说的DNA编码的多肽。
8.一种产生能够表达多肽的细胞的方法，该方法包括用权利要求5的载体对细胞进行基因工程操作。
9.一种由权利要求1的多核苷酸编码的多肽，其包括选自下组的成员：
(i)一种具有SEQ ID NO：2的推导的氨基酸序列的多肽和其片段、类似物及衍生物；
(ii)一种由ATCC 97129号保藏物之cDNA编码的多肽和其片段、类似物及衍生物。
10.一种权利要求9的多肽的兴奋剂。
11.一种权利要求9的多肽的拮抗剂。
12.一种治疗需要抑制结肠特异性基因蛋白质之患者的方法，该方法包括：对患者施用治疗有效量的权利要求11的拮抗剂。
13.权利要求12的方法，其中所说的拮抗剂是一种多肽，并且其中所说的治疗有效量的拮抗剂是通过对患者提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说的多肽来施用的。
14.一种治疗需要结肠特异性基因蛋白质之患者的方法，该方法包括：对患者施用治疗有效量的权利要求9的多肽。
15.权利要求14的方法，其中所说的治疗有效量的多肽是通过对患者提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说的多肽来施用的。
16.一种筛选化合物以鉴别权利要求9的多肽的拮抗剂的方法，该方法包括：
在有利于氧化还原反应的条件下，在待筛选的化合物存在下将所说的多肽与同时进行氧化和还原的组分组合；和
测定所说化合物抑制所说反应的能力。
17.一种诊断宿主中结肠疾病的方法，该方法包括：
测定来源于宿主非结肠组织样品中人类基因的转录，所说的基因具有这样的编码部分，其包括与选自由SEQ ID NO：1的DNA组成的组的DNA具有至少90％的相同性的DNA，其中所说的转录指示宿主中的结肠疾病。
18.权利要求17的方法，其中所说的转录通过检测从所说的人类基因转录的RNA的改变的水平的存在来测定。
19.权利要求17的方法，其中所说的转录通过检测互补于从所说的人类基因转录的RNA的DNA的改变的水平的存在来测定。
20.权利要求17的方法，其中所说的转录通过检测所说的人类基因之表达产物的改变的水平的存在来测定。
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