CN1183725A - 松果腺特异性基因－1 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人松果腺特异性基因－1的多肽及编码此多肽的DNA(RNA)和方法。还公开了使用此多肽对脑垂体进行调节和调节生物学节律的方法。还公开了针对此多肽的兴奋剂和拮抗剂及它们用作控制此多肽的作用的治疗剂的用途。还公开了检测编码此多肽的多核苷酸内突变和检测宿主中多肽水平改变的诊断测定法。

Description

松果腺特异性基因-1

本发明涉及新鉴定的多核苷酸，此多核苷酸编码的多肽，此多核苷酸和多肽的用途以及此多核苷酸的和多肽的生产。更具体地说本发明的多肽推断性地鉴定为松果腺特异性基因-1，有时下文中称为“PGSG-1”。

人和其它哺乳动物的松果腺(松果腺或脑松果体)被认为具有内分泌功能。然而，在脊椎动物中它们的起源和进化中，它还具有其它的功能。基于显微结构和神经生理学表明在低级形式中的松果体的光感受能力是其主要功能。

哺乳动物的松果体是神经内分泌系统的一个特殊组成部分。在松果腺内，神经输入和激素输入相互作用以调节松果体特有的实质细胞松果体细胞的合成和分泌活性。据信这些细胞合成和分泌的激素为2个化学家族：吲哚胺如褪黑激素，和类似下丘脑垂体系统的肽类。松果腺主要的内分泌功能是介导或调节一些生物学节律的定时，称为24小时周期节律。这种调节涉及对环境提示，如白昼的开始和光线的结束的反应而改变24小时(以二十四小时为周期)和季节或年(以年为周期)的时期中的定时。松果腺富于交感神经的神经分布和其与压力和觉醒间的生理学相互关系也表明它的内分泌功能可能与这些因素相关。

在某些情况下松果体还作用于脑化学和兴奋性的某些方面。在一些光周期物种的生殖器官的季节性退化中松果体的功能得到了最清楚的证实。在金仓鼠中，此物种最好的研究显示由黑暗或缩短的白昼光周期促进的生殖退化依赖于松果腺的存在。在人类与在其它物种一样，松果体褪黑激素的血液水平出现显著的24小时和季节性节律。

人类松果腺发生于第二胚胎期的早期。虽然在成年人中它是一个单一的中央结构，但在胚胎中它通常有2个部分，起源于松果体缰的神经连合的前部实体部分和起源于位于松果体缰和其后部神经连合间的间脑盖顶永久性外突的后部中空部分。哺乳动物松果腺由婴儿期至成年的成长主要是通过松果体细胞的增大，其次，且更可变地是通过神经胶质和基原细胞及其产物的增长来完成的。

成人松果腺长5至8毫米，宽3至5毫米。它的薄结缔组织小囊外部与脑(脊)膜组织相连，并在基部被松果体柄所打断。

主要观点认为松果体的神经支配是绝对自主的，而且松果体细胞的内分泌功能依赖于它的交感神经的神经分布。松果腺的解剖学位置对颅内的静脉流出是关键的。它靠近位于中间和深层硬脑膜静脉弯内的深层大脑静脉的外流连接处。松果体肿瘤通常通过将它压迫到胼胝体压部上而阻碍或牵制这种流动。

松果体的细胞具有活跃的氧化代谢和蛋白质合成的细胞器，而且至少具有与中枢神经或视网膜组织的突触接触相联系的部分结构。松果体细胞内含有小泡或高密度的小体，有些人认为内含分泌前物质。然而，这些小泡和小体的局部浓度和数量通常不高。松果体细胞的线粒体由于其相当高的数目或在核周质中的高浓度，它的多态性和通常较大的体积而引人注目。

松果体细胞的很多细胞器和内含物遵从24小时周期的变化。对这一课题的兴趣开始于在松果体5-羟色胺(5-HT)及突触带状结构区同样表现了显著的24小时周期。其中很多成份在日周期的夜间或黑暗期具有日高峰或高潮期。这表明哺乳动物松果体细胞内的突触带状结构可能普遍参与化学介质的运送和释放。

松果体的产物在功能上是激素，并且认为它们作用于大脑内的其它器官和小体。松果体的产物属于两种生化类型，吲哚胺和肽或蛋白质。血液中正常水平的褪黑激素需要松果体，因为在松果体切除的动物中该激素的水平会下降。在人类和其它被研究的物种中血浆中褪黑激素的浓度随白昼的时间和随季节或年的时间而变化，在交感神经控制下早产动物松果体的生物合成和代谢活动明显出现一种先天性的24小时周期，且该器官后天获得交感神经的神经支配。这种交感神经的控制通过去甲肾上腺素和环AMP的作用进行。

松果腺产生的很多肽都可发现于下丘脑垂体中。松果腺产生的其它肽包括精氨酸，后叶加压素，8-精加压催产素，LN-KH，TRH，生长激素抑制素，2-MSH，血管紧张肽2，和P物质(Quay，W.B.，组织学细胞和组织生物学(第5版)，1079-1089页)，(Weiss，L编辑)。

松果腺肿瘤，也称为germinomas，被认为破坏松果腺对脑垂体的抑制作用而导致儿童的青春期早熟。已知松果体肿瘤在儿童中是最普遍的。

根据本发明的一个方面，提供了新的成熟多肽及其有生物学活性的并可用于诊断和治疗的片段，类似物和衍生物。本发明的多肽来源于人。

根据本发明的另一个方面；提供了分离的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因组DNA及其类似物，和其有生物学活性并可用于诊断和治疗的片段。

根据本发明进一步的方面，提供了通过重组技术生产此多肽的方法，包括在促进所说蛋白质表达的条件下培养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，随后回收上述蛋白质。

根据本发明的更进一步的方面，提供了将该多肽或编码该多肽的多核苷酸用于治疗目的，如调节脑垂体分泌和调节生物学节律的方法。

根据本发明更进一步的方面，还提供了包含长度足以与本发明的核酸序列特异性杂交的核酸分子的核酸探针。

根据本发明的进一步的方面，提供了抗此类多肽的抗体。

根据本发明的另一个方面，提供了筛选化合物的方法，以测定与本发明的多肽受体结合和使之激活的化合物，及与本发明的多肽受体结合并抑制该受体的化合物。

根据本发明的另一个方面，提供了使用与本发明多肽受体结合并激活该受体的化合物用于治疗目的的方法。

根据本发明的另一个方面，提供了使用可与本发明的多肽受体结合并使之失活的化合物用于治疗目的的方法。

根据本发明的另一个方面，提供了用于检测与编码本发明多肽的核酸序列突变相关的疾病及检测本发明的多肽水平改变的诊断测定法。

根据本发明的进一步的方面，提供了一种利用这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸用于与科学研究、DNA合成以及DNA载体的生产有关的体外目的的方法。

根据本文的教导，本发明的这些和其它方面对本领域的技术人员而言是显而易见的。

以下附图用以说明本发明的实施方案，不用以限制权利要求书所包含的本发明的范围。

图1表示PGSG-1的cDNA序列和相应的推导氨基酸序列，下划线区代表推断的信号序列，使用标准的单字母氨基酸简写。

根据本发明的一个方面，提供了分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的成熟多肽或者编码由1995年5月24日保藏于ATCC、保藏号为__的克隆的cDNA所编码的成熟多肽。

编码本发明的多肽的多核苷酸发现于来源于人松果腺组织的cDNA文库中。它含有一个编码344个氨基酸残基的蛋白质的开放阅读框，其中大约前21个氨基酸残基是推断的前导序列，从而成熟蛋白包括323个氨基酸。蛋白的推断的可溶成熟部分包括SEQ ID NO：1的氨基酸1至氨基酸262，超出SEQ ID NO：1的氨基酸262的蛋白是不溶的。蛋白包括一转膜部分，该转膜部分推断鉴别为包括SEQ INNO：1的氨基酸262-323。

本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA的形式，其中DNA包括cDNA，基因组DNA和合成DNA。该DNA可以是双链或者是单链的，如果是单链则可以是编码链和非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与显示在图1中的编码序列(SEQ ID NO：1)或者保藏克隆的编码序列相同，或者该序列可以是一个不同的编码序列，但由于遗传密码的丰余性或简并性它编码与图1的DNA(SEQ IDNO：1)或保藏的cDNA相同的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽(SEQ ID NO：2)或者编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括但不限于：仅编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列与附加的编码序列，诸如前导或分泌序列或者蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(以及任选的附加的编码序列)与非编码序列，如内含子或者成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括：仅含有该多肽编码序列的多核苷酸以及含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明进一步涉及如上所述的多核苷酸的变异体，其编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽的片段、类似物与衍生物或者由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物与衍生物。该多核苷酸的变异体可以是该多核苷酸的天然存在的等位基因变异体，或者是该多核苷酸的非天然存在的变异体。

因此，本发明包括编码如图1所示的相同成熟多肽(SEQ IDNO：2)或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸及其变异体，其中该变异体编码图1的多肽(SEQ ID NO：2)或者由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或者类似物。该核苷酸变异体包括缺失变异体，取代变异体以及添加或插入变异体。

如上文所示，该多核苷酸可以具有是图1所示的编码序列(SEQID NO：1)或者保藏克隆的编码序列的天然存在的等位基因变异体的编码序列。正如在本领域中已知的，等位基因变异体是多核苷酸序列的可变形式，它可以具有一个或多个核苷酸的取代，缺失或添加，但它基本上不改变所编码多肽的功能。

本发明也包括多核苷酸，其中可以在同一读框内将该成熟多肽的编码序列与这样一种多核苷酸序列融合，所述多核苷酸序列协助多肽从宿主细胞表达与分泌，例如作为控制多肽从细胞转运的分泌序列发挥作用的前导序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白质，它可以经宿主细胞裂解前导序列而形成该多肽的成熟形式。该多核苷酸也可以编码一种为成熟蛋白加上附加的5’氨基酸残基的蛋白原。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是一种蛋白原并且是该蛋白的非活性形式。一旦该原序列被裂解，活性成熟蛋白便保留下来。

因此，例如本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或者编码具有原序列的蛋白，或者编码具有原序列与前序列(前导序列)的蛋白。

本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列，标记序列便于本发明的多肽纯化。在细菌宿主的情况下标记序列可以是由pQE-9载体所提供的六组氨酸标记物从而保证与标记物融合的成熟多肽的纯化，或者例如当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素(HA)标记物。该HA标记对应于从流感血凝素蛋白得到的一个表位(Wilson，I.，等，细胞，37：767(1984))。

本发明进一步涉及与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间存在至少70％、优选至少90％且更优选至少95％的相同性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。文中所使用的术语“严格条件”是指只有序列间存在至少95％且优选至少97％的相同性时才发生杂交。在一个优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽基本上保留了与由图1的cDNAs(SEQ ID NO：1)或保藏的cDNA(s)所编码的成熟多肽所具有的同样的生物学功能或活性。即，即使该多肽没有例如经过诱导第二信使反应作为膜结合神经肽受体的功能，但通过保留与受体的配体的结合能力而具有可溶性神经肽受体的功能。

另一方面，多核苷酸可以含有至少20个碱基，优选30个碱基并且更优选至少50个碱基并与本发明的多核苷酸杂交且与之具有如上所述相同性，并且可以保留或不保留活性。例如这样的多核苷酸可以用作SEQ ID NO：1的多核苷酸的探针，例如用于回收多核苷酸或用作诊断探针或PCR引物。

本文所涉及的保藏物将按照关于国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行保存。这些保藏物仅为了本领域技术人员的方便而提供，不是对按35 U.S.C.§112要求保藏物的许可。包含在保藏材料中的多核苷酸的序列及其所编码的多肽的氨基酸序列在本文中作为参考而附入，并且在与本文序列描述有冲突的任意的一种情况下起决定作用。制造、使用或销售该保藏材料需要许可证，并且此处不颁发这样的许可证。

本发明进一步涉及一种具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)或者具有由保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽以及该多肽的片段、类似物和衍生物。

当涉及图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”与“类似物”是指基本上保留了该多肽的同样的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括可以通过该蛋白原部分的裂解而激活从而产生有活性的成熟多肽的蛋白原。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。

图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(i)一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基被一个保的或非保守的氨基酸残基(优选一个保守的氨基酸残基)所取代并且被取代的氨基酸残基可以是或可以不是由该遗传密码所编码，或者(ii)一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基包含一个取代基，或者(iii)一种多肽，其中成熟多肽与另一种化合物，诸如一种提高该多肽的半寿期的化合物(例如聚7醇)融合，或者(iv)一种多肽，其中成熟多肽与附加的氨基酸融合，诸如融合前导或分泌序列或者用于该成熟多肽的纯化的序列或者蛋白原序列。从本文的教导出发，这样的片段、衍生物与类似物视为是在本领域的技术人员所熟知的范围内的。

本发明的多肽与多核苷酸优选以一种分离的形式而提供，并且优选将其纯化成均一物质。

术语“分离的”是指从其原始环境(例如如果该物质是天然存在的，即指天然环境)中分离出该物质。例如，一种存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但是从天然系统中一些或所有的共存物质里分离出的同样的多核苷酸或DNA或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是一种组合物的一部分，并且如果该载体或组合物并非是其天然环境的一部分，则其仍然是分离的。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ ID NO：2的多肽具有至少70％的相似性(优选至少70％的相同性)的多肽、更优选与SEQ ID NO：2的多肽具有至少90％的相似性(更优选至少90％的相同性)的多肽、并且特别优选与SEQ ID NO：2的多肽具有至少95％的相似性(特别优选至少95％的相同性)的多肽，本发明的多肽也包括该多肽的部分，其中该多肽的这些部分通常含有至少30个氨基酸并且更优选至少50个氨基酸。

正如在本领域中已知的，两种多肽之间的“相似性”是通过把一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与第二个多肽的序列进行比较而测定的。

通过肽合成，本发明多肽的片段或部分可以用于生产相应的全长的多肽；因此，该片段可以用作生产全长多肽的中间体。本发明的多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长的多核苷酸。

本发明也涉及含有本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体基因工程化的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明的多肽。

宿主细胞可以是用本发明的载体进行基因工程化的(转导或转化或转染)，其中载体例如可以是克隆载体或表达载体，载体例如可以呈质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。改造的宿主细胞可以在经改良以适于激活启动子、筛选转化体或扩增PGSG-1基因的常规营养培养基上培养。培养条件(诸如温度、pH及其它)是为了表达而选择的宿主细胞以前所采用的条件，并且对本领域的普通技术人员来讲是显而易见的。

通过重组技术，本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。因此，例如该多核苷酸序列可以包含在表达多肽的多种表达载体中的任意一种中，具体而言如载体或质粒中。这样的载体包括染色体、非染色体及合成DNA序列，例如：SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；质粒与噬菌体DNA结合所得到的载体、病毒DNA(诸如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒与假狂犬病)。但是，只要任意一种其它的载体或质粒在宿主中可以复制并且存活便可以使用它们。

可通过许多种方法把合适的DNA序列插入到载体中。一般而言，通过本领域已知的方法可以把DNA序列插入到合适的限制性内切酶位点上。该方法及其它方法被视为是在本领域的技术人员所熟知的范围之内。

表达载体中的DNA序列可操作地与一个合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA的合成。作为上述启动子有代表性的实例可以提到的有：LTR或SV40启动.子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λP_L启动子以及其它已知调控原核细胞或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。表达载体也含有用于翻译起始的核糖体结合位点与转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。

此外，表达载体优选含有一个或多个为转化宿主细胞的筛选而提供表型性状的选择标记基因，诸如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者诸如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

含有如上所述的合适的DNA序列以及一个合适的启动子或调控序列的载体可以用于转化一种合适的宿主从而允许该宿主表达蛋白。

作为合适宿主有代表性的实例可以提到的有：细菌细胞，诸如大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇S2与苜蓿银纹夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。根据本文的教导，选择合适的宿主被认为是在本领域的技术人员所熟知的范围之内。

更具体地讲，本发明也包括含有一个或多个如上广义所述的序列的重组构建体。构建体包括将本发明的序列以正向或逆向插入其中的载体，如质粒或病毒载体。在这一实施方案一个优选方面，构建体进一步包括可操作地与序列连接的调节序列，例如启动子。许多合适的载体与启动子是本领域的技术人员所熟知的并且可以通过商业途径得到。下面的载体以举例的方式提供：细菌：pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)；真核细胞：pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。但是，只要任意一种其它的质粒或载体在该宿主中可以复制并存活便可以使用它们。

采用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择标记的载体，可以从任意一种所需要的基因中筛选出启动子区域。两个合适的载体为pKK232-8与pCM7。特别指出的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λP_R，P_L和trp。真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期与晚期SV40，来自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体与启动子在本领域普通的技术水平上是可以完成的。

在更进一步的实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或是低等真核细胞(如酵母细胞)，或者宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔可以实现该构建体向宿主细胞的引入(Davies，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学基本方法，(1986))。

宿主细胞中的构建体可以以常规的方式使用从而生产由该重组序列所编码的基因产物。另一方面，本发明的多肽也可以通过常规的肽合成仪合成生产。

本发明的多肽片段可通过肽合成的方法用于生产相应的全长多肽，因此，片段可用做生产全长多肽的中间物。本发明的多核苷酸片段也可用相似的方法合成本发明的全长多核苷酸。

在合适的启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。采用从本发明的DNA构建体得到的RNAs，也可通过无细胞翻译系统生产该蛋白。用于原核与真核宿主的合适的克隆与表达载体在Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册第二版》(纽约冷泉港，1989)中进行了描述，此处以参考文献引用其公开内容。

通过向载体中插入一个增强子序列可提高通过高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，一般大约从10至300bp，它作用于启动子以提高其转录。例子包含有位于复制起点晚期一侧的SV40增强子(bp100至270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点晚期一侧的多瘤增强子与腺病毒增强子。

一般而言，重组表达载体包括复制起点与允许宿主细胞转化的选择标记(例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母TRP1基因)以及从一个高度表达的基因中得到的指导下游结构序列的转录的启动子。这些启动子可以从编码如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)这样的糖酵解酶、α因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白等的操纵子中得到。异源结构序列以合适的方式与翻译起始和终止序列，以及优选地一个能够指导被翻译的蛋白分泌至周质空间或胞外培养基中的前导序列进行装配。异源序列可以任选地编码一种融合蛋白，该蛋白含有一个N-末端鉴定肽，其中的鉴定肽赋予了表达的重组产物所需要的特征，例如稳定性或易于纯化的特性。

通过将编码所需蛋白的结构DNA序列与合适的翻译起始与终止信号以可操纵的阅读方式和一个功能启动子一起插入，可以构建对细菌的使用而言有用的表达载体。该载体将包括一个或多个表型选择标记和一个复制起点，以确保维持该载体并且如果需要的话可以保证在宿主中进行扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及属于假单胞杆菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的许多种，当然其它种的生物也可以采用。

作为代表性但却无限制性的例子，对细菌的使用而言有用的表达载体可以包括一个选择标记和来自含有所熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的细菌复制起点。这些商购载体包括如pKK223-3(Phamacia精细化学公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”部分与一种合适的启动子和待表达的结构序列相结合。

适当的宿主菌株被转化并生长到适当的细胞密度后，使用适当的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。

典型地经离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎，所得的粗提物留待进一步纯化。

在蛋白质表达中使用的微生物细胞可通过任何方便的方法包括冻融循环，声处理，机械破碎或使用细胞溶胞剂进行破碎。这些方法都是本领域的技术人员所熟知的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞COS-7系，详见Gluzman，23：175(1981)及其它可用来表达相容载体的细胞系如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含一个复制起点，一个适当的启动子和增强子，及任何必要的核糖体结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5′侧翼非转录序列。来源于SV40剪接及多腺苷酸位点的DNA序列可用于提供需要的非转录遗传元件。

多肽可通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲合层析，羟基磷灰石层析和植物凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收及纯化。如有必要，在完成成熟蛋白质的构型时可以使用蛋白质的重折叠步骤。在最后纯化步骤中可使用高效液相层析(HPLC)。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或通过重组技术从原核或真核宿主(如，通过细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞培养物)产生的产物。根据在重组生产过程中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽也可包括一个起始的甲硫氨酸残基。

松果体肿瘤可发生于任何年龄，但最常见在儿童期。早熟的青春期是松果体肿瘤的结果，尤其是在男孩中。肿瘤压近中脑导水管，引起脑积水，乳头状水肿及其它颅内压升高的症状。丘脑的上部区域也受到压迫，导致上视麻痹，上睑下垂及丧失瞳孔的光适应反应。

相应地，施用有效治疗量的PGSG-1多肽可用于治疗上述由松果体肿瘤导致的症状。

PGSG-1基因及基因产物，尤其是该基因产物的可溶形式，也可用于调节生物节律，尤其是二十四小时的节律，因为已知松果腺产生可调节二十四小时节律的褪黑激素。

PGSG-1基因和基因产物也可用于调节垂体激素的分泌，垂体激素可调节青春期的开始，即由垂体释放的促黄体生成激素(LH)，滤泡刺激素(FSH)及生长激素(GH)。

全长PGSG-1基因的片段可用作cDNA文库的杂交探针以分离全长PGSG-1基因及分离其它与该基因有高的序列相似性或相似生物学活性的基因。这类探针有至少20个碱基，优选至少30个碱基，更优选至少50个碱基。探针还可用来鉴定对应全长转录物的cDNA克隆和含有完整基因，包括调节区和启动区、外显子和内含子的一个基因组克隆或多个克隆。筛选的例子包括通过使用已知DNA序列合成一个寡核苷酸探针来分离基因的编码区。与本发明基因有互补序列的标记寡核苷酸用于筛选人cDNA文库、基因组DNA或mRNA文库以测定探针与哪一个文库成员杂交。

本发明的多核苷酸和多肽可用作发现人类疾病的治疗和诊断方法的研究试剂或材料。

本发明提供了鉴别PGSG-1多肽受体的方法。编码受体的基因可以通过许多为本领域普通技术人员已知的方法进行鉴定，例如配体淘选与FACS分选(Coligan，等，免疫学通用方案，1(2)，第五章，(1991))。优选采用表达克隆法，其中从一个对PGSA-1多肽有反应的细胞中制备聚腺苷酸化RNA，并且把从该RNA产生的cDNA文库分割成多个集合体并且将其用于转染COS细胞或其它对PGSG-1无反应的细胞。将生长于玻璃载玻片上的转染细胞与标记的PGSG-1多肽接触，PGSG-1多肽可通过许多方法，包括碘化作用或引入一个位点特异性蛋白激酶的识别位点来标记。固定与温育后，对玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合体并且采用一种重复亚合并与再筛选方法来制备和再转染亚集合体，最终得到一种编码推定的受体的单一克隆。

作为一种用于受体鉴定的替代方法，标记的配体可以和细胞膜或表达该受体分子的提取物制剂光亲和连接。交联物质通过PAGE分析进行分辨并且在X-光胶片上曝光。可以切下含有配体-受体的标记复合物，分解成肽片段并且使之进行蛋白微量测序。从微量测序得到的氨基酸序列可以用来设计一套简并的用于筛选cDNA文库的寡核苷酸探针，从而鉴定编码该推定受体的基因。

本发明还提供了筛选化合物的方法，以鉴别那些增强(兴奋剂)或抑制(拮抗剂)PGSG-1和其受体之间的相互作用的化合物。例如，当筛选与PGSG-1受体结合并使之激活的化合物时，将分离的、固定的或细胞结合形式的PGSG-1受体与多种化合物接触，并选择那些与受体结合并和其相互作用的化合物。通过使用放射性标记的感兴趣的化合物或通过由候选化合物与受体相互作用产生的第二信使信号可直接检测结合或相互作用。

当筛选与PGSG-1的受体结合并抑制PGSG-1与其受体间相互作用的化合物时，对候选的化合物可进行竞争-筛选实验，其中PGSG-1，优选使用一种分析学可检测的试剂标记，最优选为放射性标记，与待检测化合物一起导入，并测量化合物抑制或增强标记的PGSG-1结合的能力。

另一个筛选抑制PGSG-1受体活化的化合物的例子包括将待筛选的化合物和PGSG-1多肽与分离的或膜结合形式的PGSG-1受体接触。对由PGSG-1与其受体相互作用产生的信号的抑制表明化合物通过阻断受体或阻止PGSG-1与其受体间的相互作用而抑制受体的活化。第二信使信号包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇水解。

抑制PGSG-1受体激活的化合物的具体例子包括抗体，或在某些情况下，与多肽结合的寡肽，或与受体位点结合、但是多肽的非活性形式因此阻断受体位点的紧密相关的蛋白。

另一种例子为一种采用反义技术制备的反义构建体。通过三股螺旋形成或反义DNA或RNA，反义技术可以用于控制基因的表达，上述两种方法均是建立在一种多核苷酸结合到DNA或RNA的基础上的。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用于设计一种反义RNA寡核苷酸，其长度从大约10至40个碱基对。将一种DNA寡核苷酸设计成互补于涉及转录的基因区域(三股螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456(1988)；与Dervan等，科学，251：1360(1991))，从而阻止转录以及PGSG-1的生产。反义RNA寡核苷酸在体内杂交到mRNA上并且阻止mRNA分子翻译成PGSG-1多肽(反义-Okano，神经化学杂志，56：560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。还可以把上述寡核苷酸传递至细胞，从而该反义RNA或DNA可以在体内表达以抑制PGSG-1的生产。

另一些例子包括一些小分子，这些小分子可以结合多肽的催化位点使催化位点不能接受底物，从而阻止正常生物学活性。小分子的实例包括但不限于小肽或类肽分子。

这些化合物可用于调节松果腺激素，例如，LH，FSH和GH，的分泌，这些激素可调节生长和分化。它们可与一种药用上可接受的载体结合使用，例如，如下文所述。

本发明的多肽及其拮抗剂和兴奋剂可以与一种药物学可接受的载体一起用于一种合适的药物组合物中。这种组合物包括一种治疗上有效量的多肽以及一种药用可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其混合物。配方应当适合于给药的方式。

本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，它们包括一个或多个容器，该容器中装有一种或多种本发明的药物组合物的成分。与该容器相伴的可以是一则以管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式存在的通知，该通知反映出生产、使用或销售机构对人体给药的批准。此外，该药物组合物可以与其它的治疗化合物结合使用。

该药物组合物可以按照常规的方式给药，如肠胃外途径。该药物组合物以对治疗和/或预防具体症状有效的量进行给药。一般而言，该组合物以至少约10μg/kg体重的量进行给药，并且在大多数情况下该组合物的给药量将不超过约8mg/kg体重/天。在大多数情况下考虑到给药的途径、症状等，该剂量从每天约10μg/kg体重至约1mg/kg体重。

PGSG-1多肽以及同样为多肽的活化或抑制其受体的化合物也可根据本发明经过在体内表达此类多肽来应用，这通常称作“基因治疗”。

因此，例如可以采用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在体外工程化来自患者细胞，随后将工程化的细胞提供给待采用该多肽治疗的患者。上述方法是本领域所熟知的。例如，可以通过本领域已知的方法、采用一种含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒来工程化细胞。

类似的，也可采用本领域内已知的方法在体内改造细胞以使多肽在体内表达。例如，使用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导包装细胞，以便该包装细胞此时产生含有感兴趣基因的感染性病毒颗粒。可将这些生产细胞施用给患者以在体内进行细胞改造和多肽表达。根据本发明的教导，以这类方法施用本发明的多肽的这类和其它方法对本领域的技术人员而言是显而易见的。

可以衍生上文描述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体来自莫洛尼氏鼠白血病病毒。

所述载体包含一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于：反转录病毒LTR；SV 40启动子；和人类巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller，等，生物技术，V01.7，No.9，980-990(1989)描述)；或者其它任何启动子(例如真核细胞启动子，如包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。使用的其它病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的描述，合适的启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。

编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制下。可以使用的合适的启动子包括，但不限于：腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人类生长激素启动子。所说的启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。

使用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以便形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于：PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN细胞系(Miller，人类基因治疗，V0l.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部内容本文一并参考)。可以通过本领域任何已知的方法用所述载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于：电穿孔、使用脂质体和CaPO₄沉淀。另外，反转录病毒质粒载体可以包在脂质体中，或者和脂类偶联，然后施用到宿主中。

生产细胞系产生感染性的反转录病毒载体颗粒，这种颗粒包含编码所述多肽的核酸序列。然后可以使用这些反转录病毒载体颗粒体内或者体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于：胚干细胞、胚癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。

本发明也涉及本发明的基因作为诊断试剂的用途，检测本发明的多核苷酸序列中的突变使得能诊断由PGSG-1的表达不足所致的的疾病或疾病易感性，如青春期早熟。

可以用各种技术在DNA水平上检测具有人PGSG-1基因中的突变的个体。可以从患者的细胞(如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作为一个例子，可以用与编码本发明多肽的核酸互补的PCR引物鉴别和分析其突变。例如，可以通过与正常遗传型比较的扩增产物大小上的改变来检测缺失或者插入。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的PGSG-1RNA或者放射性标记的PGSG-1反义DNA序列杂交鉴别。例如，可通过与正常基因型比较扩增产物大小的改变而检测缺失和插入。点突变可通过将扩增加DNA与放射性标记的PGSG-1RNA或放射性标记的PGSG-1反义DNA序列杂交而鉴定。经核糖核酸酶A消化，或者从熔点温度的不同辨别完全配对的序列和错配双链体。

参照基因与带有突变的基因间的序列差别可通过直接DNA测序方法揭示。另外，克隆DNA片段可用作探针以检测特异性DNA片段。当这个方法与PCR结合使用时，本方法的灵敏度会大大提高。例如，测序引物与双链PCR产物或由修饰PCR产生的单链模板分子一同使用。通过使用放射性标记核素的传统程序或带有荧光标记的自动测序程序来进行序列测定。

基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示出。不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区别，其中不同的DNA片段的迁移按照其特定的熔点或部分融化温度而停滞在凝胶的不同位置(参见，例如，Myers等，科学，230：1242(1985))。

也可以由核酸酶保护测定法揭示特定位置上的序列变化，所述测定法如核糖核酸酶保护和S1保护以及化学裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。

这样，可以由以下方法检测特异DNA序列，所述方法例如杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序、或使用限制酶(例如，限制片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法。

除更常规的凝胶电泳和DNA测序法之外，也可用原位分析检测突变。

本发明还涉及检测与正常对照组织样本比较时低于正常水平的本发明的多肽的水平改变的诊断试验，该试验可用来检测松果体肿瘤的存在。检测宿主样品中本发明多肽水平的试验对本领域的技术人员是熟知的，并且包括放射性免疫实验，竞争结合试验，Western印迹分析及优选的ELISA测定。ELISA测定最初包括制备本发明多肽之抗原的特异性抗体，优选地是单克隆抗体。此外，制备单克隆抗体的报道抗体。将可检测的试剂和报道抗体结合，所说的试剂如放射性、荧光或者在这一实例中是辣根过氧化物酶。由宿主获得样品，并将其在与样品中蛋白质结合的固体支持物(如聚苯乙烯皿)中温育。通过和非特异性蛋白质(如牛血清清蛋白)一起温育，将覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来将单克隆抗体在皿中温育，在此期间单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上的本发明任何多肽结合。用缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的报道抗体放入皿中，结果导致报道抗体和任何结合到本发明多肽上的单克隆抗体结合。然后将未结合的单克隆抗体洗掉。接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即是给定体积的患者样品中存在的蛋白质的量。

也可以使用竞争测定，其中将对PGSG-1蛋白特异性的抗体连接到固体支持物上，使标记的PGSG-1蛋白和来源于宿主的样品通过固体支持物，检测出的附着于固体支持物上的标记量可以与样品中PGSG-1蛋白的量相关联。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向位于单个的人染色体上的特定位置并能与之杂交。此外，现在需要鉴定染色体上的特定位点。目前，仅有少数几种以实际的序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可以用于标记染色体的位置。本发明的DNA染色体作图是将这些序列和疾病相关基因相关联的重要的第一步。

简而言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)便可以把序列定位到染色体上。采用3’未翻译区域的计算机分析可以快速地选择引物，其中引物不应跨越超过基因组DNA上的一个外显子，否则使得扩增方法复杂化。然后采用这些引物用于PCR筛选含有单个的人染色体的体细胞杂交体。只有那些含有与该引物对应的人基因的杂交体才会生产扩增片段。

体细胞杂交体的PCR作图是将一个特定的DNA定位于特定的染色体上的快速程序。根据本发明采用同样的寡核苷酸引物，用来自于特定染色体或者大基因组克隆集合体的一组片段、按照类似方式可以实现亚定位(sublocalization)。可以类似地用于对染色体作图的其它的作图策略包括原位杂交，用标记的经流式分选的染色体进行预筛选以及通过杂交进行预选，从而构建出染色体特异性的cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来实现一步法准确染色体定位。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。关于该技术的综述参阅Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦序列已定位到一个准确的染色体位置，则染色体上该序列的物理位置可与遗传图谱数据相关联。这些数据例如可在V.McKusick，人类的孟德尔遗传中找到(可以通过Johns Hopkins大学Welch医学文库联机得到)。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)来鉴定基因与已定位到相同染色体区域上的疾病之间的关系。

接下来需要测定在受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果突变是在一些或所有的受影响个体中观察到的、但是又没有在任何一个正常个体中被观察到的话，那么该突变可能是疾病的病因。

根据物理作图和遗传作图技术目前的分辨率，一个被准确定位到与疾病有关的染色体区域的cDNA可以是50-500个潜在的致病(causative)基因中的一种(其中假定有1兆碱基的作图分辨率且每20kb为一个基因)。

所述的多肽、其片段或衍生物或类似物、或者表达上述物质的细胞可以用作生产其抗体的免疫原。这些抗体可以是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明也包括嵌合，单链和人源化的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于生产这些抗体和片段。

针对相应于本发明的序列的多肽而产生的抗体可以通过将该多肽直接注射入动物体内或者通过将该多肽向动物给药来得到，其中的动物优选非人类。然后，如此得到的抗体会结合到该多肽上。通过这种方式，即使是仅仅编码该多肽的一个片段的序列也可用于产生能结合整个天然多肽的抗体。然后，该抗体可以用于从表达该多肽的组织中分离这种多肽。

为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler与Milstein，1975，自然，256：495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，4：72)以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体与癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

可以将用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)进行修改从而生产针对本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。也可以使用转基因小鼠来表达针对本发明免疫原性多肽产物的人源化抗体。

本发明将参照下面的实施例进一步加以说明；但是，应当了解本发明并不局限于这些实施例。除非另作声明的以外，所有的份或量均为重量。

为了利于理解以下的实施例，现叙述一些经常出现的方法和/或术语。

“质粒”通过一个在前的小写p和/或跟随几个大写字母和/或数字加以命名。本文中的起始质粒或者可以通过商业途径得到或在不受限制的基础上公众可得到，或者可以根据已公开的方法从可得到的质粒中构建出来。此外，对于与那些所述等价的质粒是本领域已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。

DNA的“消化”是指用一种仅对DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多种限制性酶可以通过商业途径得到，并且其反应条件、辅因子和其它使用要求对本领域普通技术人员是已知的。为了分析目的，通常把1μg的质粒或DNA片段与溶于约20μl缓冲溶液的约2单位的酶一起使用。为了分离用于质粒构建的DNA片段，通常在一个更大的体积内用20至250单位的酶消化5至50μg的DNA。针对具体的限制性酶而言，合适的缓冲溶液和底物的量是由生产者规定的。通常采用在37℃下约1小时的温育时间，但是该时间可以根据产品供应者的指示而变化。在消化后，反应混合物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离出所需的片段。

采用由Goeddel，D.等，核酸研究，8：4057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离。

“寡核苷酸”或指一种单链多脱氧核苷酸，或指可以通过化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一种激酶存在下以ATP添加一个磷酸时，该寡核苷酸将不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸将连接到未被去磷酸化的片段上。

“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，出处同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的缓冲液和条件、每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)来实现连接。

除非另有说明，按Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)所述的方法进行转化。实施例1 PGSG-1蛋白的可溶形式的细菌表达及纯化

首先使用5′寡核苷酸引物和3′序列开始扩增编码PGSG-1，ATCC#__的DNA序列，其中5′寡核苷酸引物具有GCAGATCGACAAGTGTTACTGTCAGTCATC(SEQ ID NO：3)序列，含有一个Bgl II限制酶切位点，后接有从加工的蛋白质密码子假定的末端氨基酸开始的PGSG-1编码序列的24个核苷酸，  3’序列具有GCAAGATCTTAACGCAGGTTGGGCCGGCCTTTGGCTTC(SEQ  IDNO：4)序列，其含有与Bgl II限制酶切位点互补的序列，其后有PGSG-1编码序列的28个核苷酸，并包括在SEQ IDNO：2的第262位氨基酸处的终止密码子。所说的限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)的限制性内切酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Amp^r)、细菌复制起点(ori)、IPTG可调节启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用BamHI消化pQE-9。将扩增的序列连接到pQE-9中并将其插入到带有组氨酸标记编码序列和核糖体结合位点(RBS)的读框中。测序证实含有合适方向的插入物的载体。然后通过Sambrook等(分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep 4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝，这种质粒表达lacI阻遏物同时赋予卡那霉素抗性(Kan^r)。通过转化体在LB平板上的生长能力鉴定转化体，并选择出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。通过限制分析分离并确认质粒DNA。将含有所需构建体的克隆在补充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)培养。将O/N培养物以1∶100至1∶250的比率用于接种大体积培养物。细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(O.D.⁶⁰⁰)时，加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最终浓度为1mM。IPTG通过失活lacI阻遏物，清除P/O，引起基因表达的增加。将细胞再培养3至4小时。通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶解在6M盐酸胍离液剂中。澄清后，在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，在镍-螯合物柱中通过层析从溶液中纯化溶解的PGSG-1(Hochuli，E.等，色谱学杂志411：177-184(1984))。将90％纯度的蛋白质以6M盐酸胍(pH值5.0)从柱中洗脱下来，为了复性，调至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在这一溶液温育12小时后，将蛋白质对10mM磷酸钠透析。实施例2使用杆状病毒表达系统克隆和表达PGSG-1的可溶形式

使用对应于基因5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码全长PGSG-1蛋白的DNA序列，ATCC#＿＿：

5′引物为含有一个Bgl II限制酶切位点(粗体表示)的序列5′GCAGATCTATCATGAAAGGTGAACTGCTCCT3′(SEQ IDNO：4)。3′引物的序列为5′GCAGATCTTTAACGCAGGTTGGCCGGCCTTGGCTT3′，带有一个限制性内切酶Bgl II的切割位点及与PGSG-1基因的3′序列互补的24个核苷酸。使用商品化试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc，La Jolla，Ca)从1％的琼脂糖凝胶上分离扩增的序列。然后用核酸内切酶Bgl II消化该片段并再次在1％的琼脂糖凝胶上纯化。这一片段命名为F2。

载体pA2(由pVL94 1载体修饰而成，见下文讨论)用于表达PGSG-1蛋白质，这种表达使用杆状病毒表达系统(综述参见：Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包含苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)强多角体蛋白启动子，其后面是限制性核酸内切酶BamHI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同样的方向插入，其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替pA2，所说的载体如pRG1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒学，170：31-39)。

用限制酶BamHI消化所说的质粒，并用本领域已知的方法利用小牛肠磷酸酶使质粒去磷酸化。然后用市售试剂盒(““Geneclean”’，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA指定为V2。

用T4 DNA连接酶连接F2片段和所说的去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌XL-1蓝细胞并鉴别含有带编码蛋白的可溶形式的PGSG-1基因的所说质粒(pBac PGSG-1)的细菌。通过DNA测序确认所克隆的片段的序列。

用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报，84：7413-7417(1987))将5μg质粒pBac PGSG-1与1.0μg市售的线性杆状病毒(“BaculoGold^TM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。

在各种情况下，将1μg BaculoGold^TM病毒DNA和5μg质粒pBacPGSG-1在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。在添加10微升脂转染试剂和90微升Grace’s的培养基后，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中，所说细胞接种在具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1毫升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。

4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。一点改变是使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑(“噬斑测定的详尽的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。

四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于包含200微升Grace’s培养基的Eppendcrf管中。经简短离心除去琼脂，将包含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。

使Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-PGSG-1感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900II培养基(减去甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi ³⁵S甲硫氨酸和5μCi³⁵S半胱氨酸(Amersham)。在经离心收获之前，将细胞进一步培养16小时，标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。实施例3  通过基因治疗的表达

成纤维细胞是通过皮肤活组织检查从一个研究对象中得到的。将得到的组织放置在组织培养基上并且分割成小块。将小组织块放置在组织培养瓶的湿表面上，其中每瓶中放置约10块组织。将瓶颠倒放置，盖紧并于室温下过夜。在室温下放置24小时后反转瓶，组织块仍固定在瓶底部，加入新鲜培养基(例如含有10％FBS，青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基)，然后于37℃下温育大约1周。这时加入新鲜培养基，随后每隔几天更换一次培养基。再培养2周后，出现了一单层成纤维细胞。将单层细胞经胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。

用EcoRI和Hind III消化旁侧有Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))，接下来用小牛肠磷酸酶进行处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分级分离并使用玻璃珠加以纯化。

采用分别与5’和3’末端序列对应的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5’引物包含一个EcoRI位点，3’引物含有一个Hind III位点。在T4 DNA连接酶存在下，将等量的Moloney鼠肉瘤病毒的线性化骨架与扩增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在适于两个片段连接的条件下保持所得到的混合物。将该连接混合物用于转化细菌HB101，然后为了证实该载体具有插入正确的感兴趣基因而将细菌涂布在含有卡那霉素的琼脂平板上。

将兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)的组织培养板上进行培养，直至达到铺满密度。然后将含有所述基因的载体加入培养基中并用该载体转导包装细胞。包装细胞随即生产含有该基因的具有感染性的病毒颗粒(现在包装细胞被称作生产细胞)。

向转导的生产细胞中加入新鲜的培养基，接下来从一个铺满生产细胞的10cm平板中收集培养基。含有感染性病毒颗粒的培养基经微孔过滤器过滤以除去脱附(detached)的生产细胞，然后利用该培养基去感染成纤维细胞。从成纤维细胞的亚铺满平板中除去培养基并迅速地代之以来自于生产细胞的培养基。除去该培养基并代之以新鲜的培养基。如果病毒的滴度很高，那么实质上所有的成纤维细胞均被感染并且无需选择。如果滴度非常低，那么就需要采用具有如neo或his这样的可选择性标记的逆转录病毒。

然后将工程化的成纤维细胞注射入宿主，它或单独注射或在一个cytodex 3微载体珠上已生长至铺满之后再注射。此时成纤维细胞产生蛋白质产物。

根据以上的教导，本发明的许多改进和变化都是可能的，因此在附加的权利要求的范围内可以另外的方式实施本发明。

                     序    列    表(1)一般信息：(i)申请人：HE等(ii)发明名称：松果腺特异性基因-1(iii)序列数：6(iv)通讯地址：

  (A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，

             CECCH I，STEWART和OLSTE IN

  (B)街道：6 BECKER FARM ROAD

  (C)城市：ROSELAND

  (D)州：新泽西州

  (E)国家：美国

  (F)邮码：07068(v)计算机可读形式：

  (A)介质类型：3.5英寸磁盘

  (B)计算机：IBM PS/2

  (C)操作系统：MS-DOS

  (D)软件：WORD PERFECT 5.1(vi)当前申请数据：

  (A)申请号：

  (B)申请日：

  (C)分类号：(vii)在先申请数据

  (A)申请号：无

  (B)申请日：无(viii)律师/代理人信息：

  (A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

  (B)登记号：36，134

  (C)案号/文档号：325800-(ix)电信信息：

  (A)电话：201-994-1700

  (B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

  (A)长度：1198个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1TACGAGGTCA GCAAGGACGC CCAAGAAGAC TCAGTCATGA AAGGTGAACT GCTCCTGTTT    60TCCAGTGTGA TTGTCCTGCT CCAGGTGGTA TGCAGCTGCC CGGACAAGTG TTACTGTCAG   120TCATCTACAA ATTTTGTAGA CTGCAGCCAG CAGGGTCTGG CCGAAATCCC TTCCCATTTA   180CCTCCTCAGA CTCGAACGCT GCATTTACAA GATAATCAGA TACACCATCT TCCTGCTTTT   240GCATTTAGGT CAGTGCCATG GCTCATGACC TTAAACTTGT CCAACAATTC CCTTTCAAAT   300CTGGCCCCTG GAGCTTTCCA TGGGCTTCAG CACTTGCAGG TTTTAAATCT AACCCAGAAT   360TCACTCCTTT CCCTGGAAAG CAGACTTTTC CATTCCCTCC CTCAGCTGAG GGAGCTTGAT   420TTGTCATCAA ACAACATAAG CCACCTTCCC ACATCCTTGG GAGAGACTTG GGAGAACCTA   480ACTATACTTG CGGTTCAACA AAACCAGCTT CAGCAGCTTG ATCGAGCGCT CCTGGAATCC   540ATGCCCAGTG TGAGGCTTTT ACTTCTCAAG GACAACCTCT GGAAATGCAA TTGCCACTTG   600CTCGGTCTTA AACTCTGGCT GGAGAAATTT GTCTATAAAG GGGGACTAAC AGACGGCATC   660ATCTGTGAAT CACCAGACAC CTGGAAGGGA AAGGACCTCC TTAGGATCCC TCATGAGCTG   720TACCAGCCCT GCCCTCTTCC TGCTCCTGAT CCAGTGTCCT CGCAGGCTCA GTGGCCCGGC   780TCTGCCCACG GTGTGGTCCT GAGGCCTCCT GAGAACCACA ACGCGGGGGA GCGAGAACTC   840TTGGAGTGCG AGCTCAAACC CAAGCCAAGG CCGGCCAACC TGCGTCATGC CATTGCCACT   900GTCATCATCA CTGGCGTTGT GTGTGGGATT GTGTGTCTCA TGATGTTGGC AGCTGCCATC   960TATGGCTGCA CCTATGCGGC AATCACAGCC CAGTACCATG GGGGACCCTT GGCTCAAACC  1020AATCATCCTG GGAAGGTGGA AGAAAAAGAG CGATTTGACA GCTCACCAGC CTGAGAGCTT  1080TTGTCTCAAA TAGGATTGGT CATTGCAGGC CAGAAGATAG TGTCTGAGTA GGGCTGATGT  1140GTTTCCTGTT AGTCTGATTT TGCTTTTGCC AAAAGACAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA    1198(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

  (A)长度：344个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：

  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Lys Gly Glu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Val Ile Val Leu Leu

-20                 -15                 -10Gln Val Val Cys Ser Cys Pro Asp Lys Cys Tyr Cys Gln Ser Ser

-5                    1              5Thr Asn Phe Val Asp Cys Ser Gln Gln Gly Leu Ala Glu Ile Pro10                   15                  20Ser His Leu Pro Pro Gln Thr Arg Thr Leu His Leu Gln Asp Asn25                   30                  35Gln Ile His His Leu Pro Ala Phe Ala Phe Arg Ser Val Pro Trp40                   45                  50Leu Met Thr Leu Asn Leu Ser Asn Asn Ser Leu Ser Asn Leu Ala55                   60                  65Pro Gly Ala Phe His Gly Leu Gln His Leu Gln Val Leu Asn Leu70                   75                  80Thr Gln Asn Ser Leu Leu Ser Leu Glu Ser Arg Leu Phe His Ser85                   90                  95Leu Pro Gln Leu Arg Glu Leu Asp Leu Ser Ser Asn Asn Ile Ser100                 105                 110His Leu Pro Thr Ser Leu Gly Glu Thr Trp Glu AsrnLeu Thr Ile115                 120                 125Leu Ala Val Gln Gln Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala Leu130                 135                 140Leu Glu Ser Met Pro Ser Val Arg Leu Leu Leu Leu Lys Asp Asn145                 150                 155Leu Trp Lys Cys Asn Cys His Leu Leu Gly Leu Lys Leu Trp Leu160                 165                 170Glu Lys Phe Val Tyr Lys Gly Gly Leu Thr Asp Gly Ile Ile Cys175                 180                 185Glu Ser Pro Asp Thr Trp Lys Gly Ley Asp Leu Leu Arg Ile Pro190                 195                 200His Glu Leu Tyr Gln Pro Cys Pro Leu Pro Ala Pro Asp Pro Val205                 210                 215Ser Ser Gln Ala Gln Trp Pro Gly Ser Ala His Gly Val Val Leu220                 225                 230Arg Pro Pro Glu Asn His Asn Ala Gly Glu Arg Glu Leu Leu Glu235                 240                 245Cys Glu Leu Lys Pro Lys Pro A rg Pro Ala Asn Leu Arg His Ala250                 255                 260Ile Ala Thr Val Ile Ile Thr Gly Val Val Cys Gly Ile Val Cys265                 270                 275Leu Met Met Leu Ala Ala Ala Ile Tyr Gly Cys Thr Tyr Ala Ala280                 285                 290Ile Thr Ala Gln Tyr His Gly Gly Pro Leu Ala Gln Thr Asp Pro295                 300                 305Gly Lys Val Glu Glu Lys Glu Arg Phe Asp Ser Ser Pro Ala310                 315                 320

(2)SEQ ID NO：3的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：31个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (xi)序列描述：SEQ ID N0：3GCAGATCTGA CAAGTGTTAC TGTCAGTCAT C             31

(2)SEQ ID NO：4的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：35个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4GCAAGATCTT AACGCAGGTT GGCCGGCCTT GGCTT         35

(2)SEQ ID NO：5的信息：

  (i)序列特征：

     (A)长度：31个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：5GCAGATCTAT CATGAAAGGT GAACTGCTCC T             31

(2)SEQ ID N0：6的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：34个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：6GCAGATCTTA ACGCAGGTTG GCCGGCCTTG GCTT          34

申请人或代理人档案号USLD201

国际申请号    PCT/US95/07067

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

A.对说明书第5、28、29页，第9、3、13行所述的微生物的说明.
		B.保藏事项                                               其他保藏在补充页中□
保藏单位名称                           美国典型培养物保藏中心
		保藏单位地址(包括邮政编码和国名)美国马里兰州洛克维尔帕克隆大道12301号(20852)
保藏日期1995年5月24日	保藏编号97162
		C.补充说明(必要时)                                                              本栏内容有补充页□
		D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作时)
		E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如“保藏的编号”)

           由受理局填写                                                            由国际局填写

□本页已经和国际申请一起收到
	受权官员

□国际局收到本页日期：
	受权官员

Claims (20)

1.一种分离的多核苷酸，包含选自以下的一个成员：

(a)编码SEQ ID NO：2所示的多肽的多核苷酸；

(b)编码包括SEQ ID NO：2所示的第1至第262位氨基酸的多肽的多核苷酸；

(c)能与(a)或(b)的多核苷酸杂交且与之有至少70％相同性的多核苷酸；以及

(d)(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。

2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。

3.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是RNA。

4.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是基因组DNA。

5.权利要求2的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2所示的多肽。

6.一种分离的多核苷酸，包含选自以下的一个成员：

(a)编码由ATCC保藏号__所含的DNA编码的成熟多肽的多核苷酸；

(b)编码由ATCC保藏号__所含的DNA所表达的多肽的多核苷酸；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸有至少70％相同性并可与之杂交的多核苷酸；

(d)(a)、(b)和(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。

7.含有权利要求2的DNA的载体。

8.用权利要求7的载体基因工程化的宿主细胞。

9.一种生产多肽的方法，包括：从权利要求8的宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽。

10.一种生产可表达多肽的细胞的方法，包括使用仅利要求7的载体转化或转染细胞。

11.一种多肽，选自(i)具有SEQ ID NO：2的推导的氨基酸序列的多肽及其片段，类似物和衍生物，(ii)包含SEQ ID NO：2的第1至第262位氨基酸的多肽，及(iii)由ATCC保藏号__的cDNA编码的多肽及所述多肽的片段，类似物和衍生物。

12.一种作为权利要求11的多肽的兴奋剂有效的化合物。

13.一种作为权利要求11的多肽的拮抗剂有效的化合物。

14.治疗需要PGGS-1的患者的方法，包括：对患者施用治疗有效量的权利要求11的多肽。

15.权利要求14的方法，其中所说的治疗有效量的多肽是经过给病人提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说的多肽来用药。

16.治疗需要PGSG-1的患者的方法，包括：对患者施用治疗有效量的权利要求12的化合物。

17.治疗需要抑制PGSG-1的患者的方法包括：对患者施用治疗有效量的权利要求13的拮抗剂。

18.用于诊断与权利要求11的多肽的表达有关的疾病或对该疾病的敏感性的方法，包括：测定编码所述多肽的核酸序列内的突变。

19.一种诊断方法，包括：在来自宿主的样品中分析权利要求11的多肽的存在。

20.一种鉴定与权利要求11的多肽的受体结合并激活或抑制其受体的化合物的方法，包括：

在允许与受体结合的条件下，将在其表面表达该多肽的受体的细胞与待筛选的化合物接触，所述受体与能够提供应答化合物与所述受体结合的可检测信号的第二种组分相联；以及

通过检测由化合物与受体的相互作用产生的信号是否存在来确定该化合物是否结合并激活或抑制该受体。