CN1214050A - 人肿瘤坏死因子δ和ε - Google Patents

Abstract

本发明涉及人TNFδ和TNFε多肽,编码所述多肽的多核苷酸,生产所述多肽的方法,特别是通过表达所述多核苷酸生产所述多肽的方法,以及所述多肽的兴奋剂和拮抗剂。本发明还涉及在研究、诊断和临床中使用这些多肽、多核苷酸、兴奋剂和拮抗剂的方法。

Description

人肿瘤坏死因子δ和ε

本发明部分涉及新鉴定的多核苷酸和多肽，所述多核苷酸和多肽的变体和衍生物，制备所述多核苷酸和多肽及其变体和衍生物的方法，所述多肽的兴奋剂和拮抗剂，以及所述多核苷酸、多肽、变体、衍生物、兴奋剂和拮抗剂的应用。具体地，在这些方面及其他方面，本发明涉及人肿瘤坏死因子δ和ε，以下有时称作“TNFδ”和“TNFε”。

背景技术

人肿瘤坏死因子α(TNF-α)和β(TNF-β或淋巴细胞毒素)是一大类多肽介体的相关成员，这些多肽介体包括干扰素、白介素和生长因子，总称为细胞因子(Beutler,B.And Cerami,A.,Annu.Rev.Immunol.,7:625-655,1989)。

最初肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)是由于其抗肿瘤活性而发现的。然而，现在它被看作是一个具有多种活性的多效性细胞因子，这些活性包括某些转化细胞系的细胞编程性死亡，细胞活化和增殖的介导以及在免疫调节和炎症中起重要作用。

至今，有9种已知的TNF配体超家族成员，TNF-α、TNF-β(淋巴细胞毒素α)、LT-β、OX40L、FASL、CD30L、CD27L、CD40L和4-1BBL。所述的TNF配体超家族的配体是酸性的类似TNF的分子，其在胞外功能域中约有20％序列同源性(范围：12％-36％)并主要以膜结合形式存在，生物学活性形式是三聚体/多聚体复合物。TNF配体超家族的可溶形式目前仅鉴定出TNF、LTα和FASL(综述见Gruss,H.And Dower,S.K.,Blood,85(12):3378-3404(1995)，该文引入本文作参考)。

这些蛋白质参与细胞增殖、活化和分化的调节，如通过细胞编程性死亡或细胞毒性控制细胞存活或死亡(Armitage,R.J.,Curr.Opin.Immunol.,6:407(1994)和Smith,C.A.,Cell,75:959,1994)。

TNF可由许多细胞类型、包括单核细胞、成纤维细胞、T细胞、天然杀伤细胞(NK)并主要由激活的巨噬细胞产生。已经有人报道TNF-α在肿瘤的快速坏死、免疫刺激、自身免疫疾病、移植排斥、抵抗寄生虫、产生抗病毒应答、败血休克、生长调节、血管内皮效应和代谢效应中起作用。TNF-α还激发内皮细胞分泌各种因子，包括PAI-1、IL-1、GM-CSF和IL-6来促进细胞增殖。另外，TNF-α正调节各种细胞粘附分子如E-选择因子、ICAM-1和VCAM-1。

诱导由TNF配体超家族成员介导的各种细胞应答的第一步是它们与特异性细胞表面受体结合。TNF受体超家族含有10个目前已知的膜蛋白和编码TNFR相关分子的几个病毒开放读框。p75低亲和神经生长因子(NGF)受体是这一家族中第一个克隆到的受体(Johnson,D．等，细胞，47:545(1986))。后来克隆到两个TNF特异性受体，显示出它们与NGF受体相关(Loetscher,H．等，细胞，61:351(1990))。近几年来已建立了一个新的Ⅰ型转膜TNF受体超家族，这一家族包括p75神经生长因子受体，p60TNFR-Ⅰ,p80TNFR-Ⅱ,TNFR-RP/TNFR-Ⅲ,CD27,CD30,CD40,4-1BB,OX40和FAS/APO-1。另外，已鉴定了几种编码可溶TNF受体的病毒开放读框，如兔纤维瘤病毒中的SFV-T2(Smith,C.A.等，生物化学生物物理研究通讯，176:335,1991)和痘苗病毒中的Va53或SaIF19R(Howard,S.T.，病毒学，180:633,1991)。这些受体的特征在于在胞外(氨基末端)功能域有多个富半胱氨酸功能域，它们参与配体结合。人家族成员间的富半胱氨酸胞外区的平均同源性为25-30％。

很明显，目前需要调节正常和异常细胞的活化和分化的因子，因此也需要鉴定这种调节正常和病态细胞活化和分化的因子。特别是需要分离和鉴定控制转化细胞系的细胞编程性死亡、介导细胞活化和增殖并且作为免疫调节和炎症应答的初级介导物起作用的、以及在预防、消灭或校正机能失调或疾病中起作用的与TNF配体超家族同族的其他TNF配体。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供新的多肽，称为新的TNFδ和TNFε，根据图1和图2的氨基酸序列与肿瘤坏死因子家族其他蛋白如人TNFα和TNFβ的已知氨基酸序列之间的同源性，本发明的多肽已被推断鉴定为肿瘤坏死因子配体。

根据结构和生物学的相似性，已经鉴定本发明的多肽是TNF配体超家族的一个新成员。

本发明的另一个目的是提供编码TNFδ和TNFε的多核苷酸，特别是编码本文称作TNFδ和TNFε的多肽的多核苷酸。

在本发明这一方面的一个特别优选的实施方案中，所述的多核苷酸包括编码图1和图2所示序列的人TNFδ和TNFε的区域。

根据本发明的这一方面，提供了编码人TNFδ的分离的核酸分子，包括mRNA,DNA,cDNA，基因组DNA及在本发明这一方面的另一些实施方案中的生物学、诊断学、临床或治疗上有用的变体、类似物或其衍生物，或其片段，包括变体、类似物和衍生物的片段。

在本发明的这一方面的特别优选实施方案是人TNFδ和TNFε的天然存在的等位基因变体。

根据本发明的这一方面，提供了编码人的成熟TNF多肽和人的成熟TNFε多肽的分离的核酸分子，所述TNFδ多肽由1995年12月8日保藏的ATCC保藏号97377所含的人cDNA表达，所述TNFε多肽由1996年3月1日保藏的ATCC保藏号97457所含的人cDNA表达。

本发明的另一目的是提供能破坏某些转化的细胞系、介导细胞活化和增殖并且作为免疫调节和炎症应答的初级介导物起作用的TNFδ多肽，特别是人TNFδ和TNFε多肽。

根据本发明的这一方面，提供了人源的新的多肽，本文称作TNFδ和TNFε，及其生物学、诊断学或治疗上有用的片段、变体和衍生物，所述片段的变体和衍生物以及前述物质的类似物。

本发明的这一方面的特别优选的实施方案是由人TNFδ和TNFε基因的天然存在的等位基因编码的人TNFδ和TNFε变体。

本发明的另一目的是提供一种生产上述多肽、多肽片段、变体和衍生物、变体和衍生物的片段以及类似物的方法。在本发明这一方面的优选的实施方案中提供了生产上述TNFδ和TNFε多肽的方法，包括在用于在宿主中表达人TNFδ和TNFε的条件下培养已以可表达方式掺入了外源衍生的编码人TNFδ的多核苷酸和编码TNFε的多核苷酸的宿主细胞，然后回收表达的多肽。

本发明的再一目的是使用上述多肽和多核苷酸用于研究、生物学、临床学和治疗目的的产物、组合物和方法。

根据本发明的这一方面的某些优选的实施方案，提供了如下的产物、组合物和方法，所述的产物、组合物和方法用于通过测定TNFδ和TNFε多肽或编码TNFδ或TNFε的mRNA而评估TNFδ和TNFε在细胞中的表达；分析TNFδ和TNFε基因中的遗传变异和异常如缺陷；以及将TNFδ或TNFε多肽或多核苷酸给予生物体以增强TNFδ或TNFs功能或补偿TNFδ或TNFε的功能时常。

根据本发明的这一方面和其他方面的某些优选的实施方案，提供了与人TNFδ或TNFε序列杂交的多核苷酸特别是探针。

根据本发明的这一方面的某些优选的实施方案，提供了抗TNFδ或TNFε多肽的抗体，在特别优选的实施方案中，抗体是针对人TNFδ或TNFε高度选择性的。

根据本发明的另一方面，提供了TNFδ或TNFε兴奋剂，优选的兴奋剂是模拟TNFδ或TNFε、与TNFδ结合分子或受体分子、或者TNFε结合分子或受体分子结合的、并激发或增强TNFδ诱导的或TNFε诱导的应答的分子。优选的兴奋剂还包括与TNFδ和TNFε或TNFδ和TNFε多肽、或者TNFδ活性的其他调节物相互作用从而加强或增强TNFδ和TNFε的一种或一种以上作用的分子。

根据本发明的再一方面，提供了TNFδ和TNFε拮抗剂。优选的拮抗剂是那些模拟TNFδ和TNFε从而与TNFδ和TNFε受体或结合分子结合但不引发一种或一种以上TNFδ和TNFε诱导的应答的分子。优选的拮抗剂还包括与TNFδ和TNFε结合或相互作用从而抑制TNFδ和TNFε的一种或一种以上作用或阻止TNFδ和TNFε的表达的分子。

兴奋剂和拮抗剂可以用于模拟、增强或抑制TNFδ和TNFε多肽的作用，例如它们可用于防止败血休克、炎症、脑疟疾、HIV病毒的活化、移植宿主排斥、骨骼再吸附、风湿性关节炎和恶病质。

在本发明的另一方面，提供了用于体外给予细胞、来自体内给予细胞及体内给予细胞或给予多细胞生物体的包括TNFδ和TNFε多核苷酸或TNFδ和TNFε多肽的组合物。在本发明这一方面的某些特别优选的实施方案中，组合物包括用于在宿主生物体中表达TNFδ和TNFε多肽以治疗疾病的TNFδ和TNFε多核苷酸。这一点上特别优选的是在人类患者中表达以治疗与TNFδ和TNFε的异常内源性活性相关的功能失调。

本发明的其他目的、特征、优点和方面经如下描述对于本领域技术人员是显而易见的。然而应理解的是以下描述和特异性实施例尽管指出了本发明的优选的实施方案，但仅仅是举例给出。通过阅读下面的描述及阅读本文的其他部分，在所披露的本发明的实质和范围之内的各种变化和修改对于本领域技术人员是显而易见的。

附图的简要描述

下述附图描述了本发明的某些实施方案，它们仅仅是描述性的而非限制本文所披露的发明。

图1示出了人TNFδ的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。

图2示出了人TNFε的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。

图3示出了TNFα、TNFβ、TNFδ和TNFε多肽的氨基酸序列之间的相似性区域(序列对比报告)。

图4示出了由所示技术推导的TNFδ的结构和功能特征，其是氨基酸序列的功能。

图5示出了由所示技术推导的TNFε的结构和功能特征，其是氨基酸序列的功能。

下述示意性解释用于促进对本文特别是实施例中常用的某些术语的理解，该解释是为方便而提供并非对本发明的限制。

术语DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的某些序列的限制性内切酶催化裂解DNA，本文所指的各种限制性内切酶是可商购的并且其反应条件、辅因子和其他应用需求是本领域技术人员公知的并且是常规的。

为进行分析，典型地是用约2单位酶在约20微升反应缓冲液中消化1微克质粒或DNA片段。为分离DNA片段用于质粒构建，典型地用20-250单位酶在成比例放大的体积中消化5-50微克DNA。

用于特定限制性内切酶的合适的缓冲液和底物量在标准的实验室手册中有描述，例如见下述，它们也由供应商提供。

通常使用在37℃1小时的保温时间，但是可以根据标准程序、供应商指导及反应细节改变条件。消化后，可使用本领域技术人员公知的方法分析反应并用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化片段。

术语“遗传元件”通常指这样一种多核苷酸，其包括编码一种多肽的区域或调节转录或翻译或对于该多肽在宿主细胞中的表达很重要的其他过程的区域，或者这样一种多核苷酸，其包括编码多肽的区域和与其可操作连接的调节表达的区域。

遗传元件可以包括在作为游离元件复制的载体中，即作为与宿主细胞基因组生理上独立的分子。它们可以包含在微型染色体中，如那些当用氨甲蝶呤在真核细胞中筛选进行转染DNA的扩增时出现的微型染色体。遗传元件也可包括在宿主细胞基因组中，但不是以其天然状态而是在诸如分离、克隆和导入宿主细胞等操作后以纯DNA形式或载体形式包括在宿主细胞基因组中。

术语“分离的”是指“经人工”从其天然状态而改变，即假如其在自然中发生，那么其已从其原始环境变化或脱离出，或者两者都发生。例如，以天然状态天然存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存物质中分离出的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。例如，对于多核苷酸来说，术语分离的是指其从其天然存在的染色体和细胞中分离出。

作为分离的一部分或在分离后，这种多核苷酸可与其它用于诱变的多核苷酸连接在一起形成融合蛋白，以及用于繁殖或在宿主中表达。分离的多核苷酸单独或与其它多核苷酸如载体连接在一起可被导入培养的或整个生物体的宿主细胞中，导入后这种DNA仍然是分离的，因为它们不处于其天然发生的形式或环境。

类似地，多核苷酸和多肽可形成组合物，如作为培养基配制品、溶液以将多核苷酸或多肽导入细胞，以及作为化学或酶反应的组合物或溶液(其不是天然发生的组合物)，在这些组合物中仍保持分离的多核苷酸或多肽。

术语“连接”是指在两个或多个多核苷酸之间、通常是双链DNA之间形成磷酸二酯键的过程。连接技术是本领域公知的，连接方案在标准实验手册和参考书中均有描述，例如参见Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)和Maniatis等，第146页，见下述。

术语“寡核苷酸”是指相对较短的多核苷酸，通常该术语是指单链脱氧核糖核苷酸，但是其也可指单链或双链核糖核苷酸，RNA：DNA杂合子和双链DNA。

寡核苷酸如单链DNA探针寡核苷酸通常由化学方法合成，如那些手工或自动寡核苷酸合成仪。然而也可用各种其它方法制备寡核苷酸，如体外重组DNA介导的技术及在细胞和生物体内表达DNA。

最初，典型的是得到无5’磷酸的化学合成的DNA。这种寡核苷酸的5’末端不是采用形成重组DNA分子的DNA连接酶的连接反应形成磷酸二酯键的底物。当需要连接这种寡核苷酸时，可用标准技术如采用激酶和ATP加上磷酸。

化学合成的寡核苷酸的3’末端通常具有游离羟基，在连接酶如T4DNA连接酶存在下可以容易地与另一个多核苷酸如另一个寡核苷酸的5’磷酸形成磷酸二酯键。正如所公知的，当需要时可通过在连接前除去另一个多核苷酸的5’磷酸而选择性地防止这一反应。

本文中的质粒通常是根据本领域人员熟知的标准命名原则以在前的小写p和/或接着的大写字母和/或数字命名。本文的起始质粒是可商购的，可由公众不受限制地获得的，或者可以根据公知的公布的程序从可获得的质粒构建的。根据本发明可使用的许多质粒和其它克隆和表达载体是本领域人员公知的和容易获得的。另外，本领域人员可以容易地构建出适用于本发明的其它质粒。本发明中的这些质粒和其它载体的性质、构建和应用对于本领域人员根据本文的披露是显而易见的。

术语“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA或是修饰的RNA或DNA。因此，例如，本文所用的多核苷酸是指单链和双链DNA，单链和双链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，单链和双链区的混合物的RNA，包含DNA或RNA的杂合分子，所述的杂合分子可以是单链的或典型地是双链的，或者是单链和双链区的混合物。另外，本文所用的多核苷酸也指包含RNA或DNA或者RNA和DNA的三链区，这种区域的链可以来自相同或不同的分子。这种区域可以包括一或多个这种分子的全部，但更典型地是仅涉及这种分子的一个区域。三螺旋区的分子通常是一种寡核苷酸。

如本文所用的，术语多核苷酸包括含有一或多个修饰碱基的如上所述的DNA或RNA。因此，具有为稳定性或其它原因而修饰的骨架的DNA或RNA也是本文的术语“多核苷酸”所意在包括的。另外包含非通用碱基如肌苷或修饰的碱基如三苯甲基化碱基的DNA或RNA也属于本文所定义的多核苷酸。

应理解的是已对DNA和RNA作了许多修饰以满足本领域公知的各种目的。本文所用术语多核苷酸包含这些多核苷酸的化学、酶学或代谢修饰形式，以及病毒和细胞包括简单和复杂细胞的特征性DNA和RNA的化学形式。

如本文所用的术语“多肽”包括下述所有多肽。多肽的基本结构是公知的并已在无数教科书和现有技术文献中描述。根据这一点，本文所用的这一术语是指任何包括以肽键连接成线性链的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用的，该术语指短链，例如通常在现有技术中称为肽、寡肽和寡聚物，也指较长的链，通常在现有技术中称为蛋白质，其有各种类型。

应理解的是多肽通常含有不同于20个天然存在的氨基酸的氨基酸，并且在一给定多肽中许多氨基酸包括末端氨基酸均可被修饰，可通过天然过程修饰，如加工和其它翻译后修饰，但也可以通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。即使是在多肽中天然发生的通常修饰种类也太多而不能在此一一列出，但是在基本教科书、专著、各种研究文献中均有描述，并且其是本领域人员公知的。在本发明多肽中可能存在的公知修饰中，举例性地有乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素基元共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂类或脂类衍生物的共价附着、磷酯酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白裂解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加如精氨酰化和遍在蛋白化。

这种修饰对本领域人员来说是公知的并在科学文献中有详述。例如，几种特别通用的修饰如糖基化、脂类附着、硫化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化及ADP-核糖基化在最基本的教科书中有描述，例如参见蛋白质-结构和分子特性，第2版，T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company，纽约(1993)。关于这一主题的更详细综述例如参见Wold,F.，翻译后蛋白修饰：前景和展望，第1-12页，蛋白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson编辑，学术出版社，纽约(1983),Seifter等，蛋白修饰分析和非蛋白辅因子，酶学方法182:626-646(1990),Rattan等，蛋白质合成：翻译后修饰和成熟，Ann.N.Y.Acad.Sci.,663:48-62(1992)。

应理解的是，正如公知的及如上所述，多肽并不总是完全线性的，例如多肽可由于遍在蛋白化而有分支，其也可以因翻译后事件如天然加工事件以及非天然发生的由人工操作而导致的事件而环化，有或没有分支。环化、分支以及分支环化多肽可通过非翻译天然过程合成，也可通过完全合成方法合成。

修饰可发生在多肽中的任何地方，如肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。事实上经共价修饰而阻断多肽中的氨基或羧基是天然和合成多肽中最普遍的，这种修饰也可存在于本发明的多肽中。例如，在蛋白裂解加工前在大肠杆菌中制备的多肽的氨基末端残基几乎均是N-甲酰甲硫氨酸。

发生在多肽中的修饰经常是其制备的结果，例如对于在宿主中表达克隆基因而制备的多肽，修饰的性质和程度很大程度上取决于宿主细胞翻译后修饰能力及存在于多肽氨基酸序列中的修饰信号。例如，正如公知的，通常在细菌宿主如大肠杆菌中不发生糖基化，因此当需要糖基化时，应在糖基化宿主，通常为真核细胞中表达多肽。昆虫细胞通常进行与哺乳细胞相同的翻译后糖基化作用，因此，已开发了昆虫细胞表达系统以有效表达具有天然形式的糖基化的哺乳动物蛋白质。类似的考虑也适用于其它修饰。应理解的是在一给定的多肽中，在几个位点可以存在相同或不同程度的同种修饰。另外，一种多肽可以含有多种修饰。通常，本文所用术语多肽包含所有修饰，特别是那些存在于由在宿主细胞中表达多肽而合成的多肽中的修饰。

术语多核苷酸或多肽的“变体”是指与参照多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。下面描述了这种意义上的变体，在本文它处有更详细的描述。

多核苷酸变体是核苷酸序列与另一种参照多核苷酸不同的多核苷酸，通常这种不同是有限度的，参照多核苷酸和变体的核苷酸序列是整体上紧密相似的，并且在许多区域是相同的。如下所述，变体的核苷酸序列中的变化可能是沉默的，也就是说它们不会改变由该多核苷酸编码的氨基酸。当改变仅限于这种沉默变化时，变体将编码与参照相同氨基酸序列的多肽。另外还如下所述，变体核苷酸序列中的变化还可以改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列，这种核苷酸变化可导致由参照序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，见下述。

多肽变体是一种氨基酸序列与另一个参照多肽不同的多肽，通常这种不同是有限的，参照序列和变体序列在整体上是紧密相似的并且在许多区域是相同的。变体和参照多肽氨基酸序列的不同可以是一或多个取代、添加、缺失、融合和截短，可以任何组合形式存在。

本文所用术语“受体分子”是指与本发明的TNFδ或TNFε多肽特异结合或相互作用的分子，不仅包括经典的受体(其是优选的)，也包括与本发明的多肽特异结合或相互作用的其它分子，其也称作“结合分子”和“相互作用分子”，以及称作“TNFδ结合分子”和“TNFδ相互作用分子”或“TNFε结合分子”和“TNFε相互作用分子”。本发明的多肽与这种分子如受体或结合或相互作用分子之间的结合对于本发明的多肽可以是唯一的(这是非常高度优选的)，或者可以是高度特异于本发明多肽的(这是高度优选的)，或者可以是高度特异于包括本发明的多肽的一组蛋白质的(这是优选的)，或者可以是特异于几组蛋白质的，其中至少一组包括本发明的多肽，

本发明详述

本发明涉及如下详述的新的TNFδ和TNFε多肽和多核苷酸，本发明具体涉及由氨基酸序列同源性而与TNF配体超家族相关的多肽和多核苷酸。本发明特别涉及具有图1所示核苷酸序列和氨基酸序列的TNFδ，以及ATCC保藏号97377中的人cDNA的TNF核苷酸序列和氨基酸序列。本发明还特别涉及具有图2所示核苷酸序列和氨基酸序列的TNFε，以及ATCC保藏号97457中的人cDNA的TNFε核苷酸序列和氨基酸序列。以下称保藏物为保藏克隆或“保藏克隆的cDNA”。应理解的是图1和图2所示的核苷酸序列和氨基酸序列是通过测序保藏克隆的人cDNA而获得。因此，当两者之间有偏差时，保藏克隆的序列是决定性的，并且引述图1和图2的序列包括引述保藏克隆的人cDNA的序列。

根据本发明的一个方面，提供了编码具有图1和2推导的氨基酸序列的TNFδ和TNFε多肽的分离的多核苷酸。

使用本文提供的信息如图1所示的多核苷酸序列，可以使用标准的克隆和筛选程序获得编码人TNFδ多肽的本发明的多核苷酸，所述的程序例如那些用来自人组织细胞的mRNA作为起始材料克隆cDNA的程序。例如，图1的多核苷酸在来源于人心脏组织细胞的cDNA的cDNA文库中发现。

如测序保藏克隆中的编码人TNFδ的cDNA的结果所示，本发明的人TNFδ在结构上与TNF配体超家族的其它蛋白相关，如此获得的cDNA序列如图1所示，其含有编码约233个氨基酸残基、推导分子量约25.871KDa的蛋白的开放读枢。在已知蛋白中该蛋白与TNFα具有最大同源性，图1的TNFδ的完整氨基酸序列与TNFα的氨基酸序列约有38％相同性。

编码人TNFε多肽的本发明的多核苷酸可以用标准克隆和筛选程序获得，例如那些用来自人组织细胞的mRNA作为起始材料克隆cDNA的程序。举例来说，图2的多核苷酸在来源于人心脏组织细胞的cDNA文库中发现。

如测序保藏克隆中的编码人TNFε的cDNA的结果所示，本发明的人TNFε在结构上与TNF配体超家族的其它蛋白相关，如此获得的cDNA序列如图2所示。TNFε序列与图1所示的TNFδ序列减去前50个氨基酸及TNFδ的第86-92位氨基酸区域后的序列基本相同。因此，TNFε是TNFδ的剪接变体。TNFε包含168个氨基酸残基，图2所示序列示出了不含N-末端疏水区的TNFε的成熟蛋白。该蛋白与TNFα有最大同源性，图2的TNFε与TNFα的氨基酸序列有20％的相同性。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式如mRNA或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因组DNA，其通过克隆或由化学合成技术产生或由两者结合产生。DNA可以是双链或单链，单链DNA可以是编码链(也称为有义链)或非编码链(反义链)。

编码多肽的编码序列可以相同于图1和图2显示的多核苷酸的编码序列或者可以是一个具有不同的编码序列的多核苷酸，其中由于遗传密码的丰余或简并的结果，该不同的编码序列编码图1和图2的DNA编码的多肽。

编码图1和图2的多肽的本发明的多核苷酸包括，但不限于：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和附加编码序列如编码前导或分泌序列的序列，如前蛋白序列、蛋白原序列或前蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(包括或不包括前述附加编码序列)和附加的非编码序列，例如包括但不限于内含子和非编码5’和3’序列，如在转录、mRNA加工(包括剪接和聚腺苷酸化信号)、核糖体结合和mRNA的稳定性等方面起重要作用的转录的非翻译序列；编码如提供额外功能的附加的氨基酸的附加编码序列。

因此，例如，多肽可以与促进融合多肽纯化的标记序列如一种肽融合。在本发明这一方面的某些优选实施方案中，标记序列是六组氨酸肽，如由pQE载体(Qiager,Inc.)提供的标记，这些均是可商购的。如Gentz等，美国科学院院刊86:821-824(1989)所述，六组氨酸能方便地使融合蛋白纯化。HA标记对应于来源于流感血细胞凝集素蛋白质的一个表位，见Wilson等，细胞37:767(1984)所述。

如前所述，本文所用术语“编码多肽的多核苷酸”包含了包括编码本发明的多肽、特别是具有图1和图2的氨基酸序列的人TNFδ和TNFε的序列的多核苷酸。该术语涵盖了包括编码多肽的单个连续区域或非连续区域(例如由内含子间隔)及附加的也可含编码和/或非编码序列的区域的多核苷酸。

本发明进一步涉及上文中叙述的多核苷酸的变体，它编码具有图1和图2的推导的氨基酸序列的多肽的片段，类似物和衍生物。多核苷酸的变体可以是天然存在的变体如天然存在的等位多核苷酸变体或多核苷酸的已知非天然存在的变体。多核苷酸的这种非天然存在的变体可以由诱变技术制备，如那些施加到多核苷酸、细胞或生物体上的诱变技术。

在这一点上变体是通过核苷酸取代、缺失或添加而与上述多核苷酸不同的变体，所述的取代、缺失或添加可以涉及一或多个核苷酸。变体可以在编码区或非编码区或两个区域中发生改变。编码区的改变可以产生保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。

关于这一点的本发明的特别优选的实施方案是编码具有图1和图2的TNFδ和TNFε的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，及其变体、类似物、衍生物和片段，以及变体、类似物和衍生物的片段。

在这一点上特别优选的是这样的多核苷酸，其编码具有图1和图2的TNFδ和TNFε多肽的氨基酸序列的TNFδ和TNFε，其中有一些、几个、5-10、1-5、1-3、2或1个氨基酸残基被取代、缺失或添加，或者无氨基酸残基被取代、缺失或添加。其中特别优选的是不改变TNFδ和TNFε的性质和活性的沉默取代、添加和缺失。在这一点上还特别优选的是保守取代。最优选的是编码具有不含取代的图1和图2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。本发明的进一步优选的实施方案是与编码具有图1和图2的氨基酸序列的TNFδ和TNFε多肽的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸以及与这种多核苷酸互补的多核苷酸。或者，最优选的是包含与编码TNFδ和TNFε多肽的多核苷酸至少有80％相同性的区域的多核苷酸以及与这种多核苷酸互补的多核苷酸。在这一点上，特别优选的是与其有至少90％相同性的多核苷酸，在这些特别优选的多核苷酸中，具有至少95％相同性的多核苷酸是特别优选的。另外，在95％相同性的多核苷酸中具有至少97％相同性的多核苷酸是高度优选的，而这些当中具有至少98％和至少99％相同性的多核苷酸是特别优选的，而具有至少99％相同性的多核苷酸是更优选的。

另外，在这一方面特别优选的实施方案是编码基本保留了与图1和图2的cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能和活性的多肽的多核苷酸。

本发明还进一步涉及与本文上述序列杂交的多核苷酸，本发明特别涉及在严格条件下与本文上述多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严格条件”是指当序列间的碱基至少95％、优选至少97％互补(例如G:C,A:T)时才发生杂交。

正如本文所讨论的本发明的多核苷酸分析所示，例如，上述的本发明的多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码TNFδ和TNFε的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与人TNFδ和TNFε基因具有高度序列相似性的其它基因的cDNA和基因组克隆。这种探针通常包含至少15个碱基，优选地，这种探针具有至少30个碱基，也可以具有至少50个碱基。

例如，TNFδ和TNFε基因的编码区可以用已知DNA序列合成的寡核苷酸探针的筛选而分离。然后用与本发明的基因序列互补的标记的寡核苷酸筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA的文库以确定探针与文库的哪些成员杂交。

本发明的多核苷酸和多肽可以用作研究试剂和材料以发现人类疾病治疗和诊断法，见如下关于多核苷酸分析的描述。

多核苷酸可以编码这样一种多肽，其是成熟蛋白加额外的氨基或羧基端氨基酸、或成熟多肽内部的氨基酸(例如，当成熟形式具有一条以上多肽链时)。这些序列可以在蛋白质从前体加工至成熟形式中起作用，可以促进蛋白运输，可以延长或缩短蛋白质半寿期或可以促进蛋白质的操作以进行分析或生产。通常是原位情形，额外的氨基酸可以通过细胞酶从成熟蛋白中加工去除。

多肽的成熟形式与一或多个原序列融合在一起的前体蛋白可以是多肽的非活性形式，当原序列被除去时，这种未活化的前体通常被活化。在活化之前一些或全部原序列被除去。通常这种前体被称为蛋白原。

总之，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，成熟蛋白加前导序列(其可被称为前蛋白)，具有一或多个不是前蛋白的前导序列的原序列的成熟蛋白的前体，或者前蛋白原(其是蛋白原的前体，具有前导序列和一或多个原序列，其通常在加工步骤中被除去从而产生多肽的活性成熟形式)。

如上所述，含有人TNFδ和人TNFε cDNA的保藏物已保藏于美国典型培养物保藏中心。另外还如上所述，所述的cDNA保藏物在本文被称为“保藏克隆”或“保藏克隆的cDNA”。这些克隆分别于1995年12月8日和1996年3月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，12301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USA，保藏号分别为ATCC 97377和97457。保藏材料是含有全长TNFδ和TNFε人cDNA的pBluescript SK(-)质粒(Stratagene,La Jolla,CA)。

保藏物是根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行保藏。在授予专利权后菌株将不受限制地向公众发放。保藏物的提供仅是为了本领域技术人员的方便而非是对如根据35U.S.C.§112而为用于实施而索取保藏物的认可。当出现与本文描述的序列的任何冲突时，保藏材料中所含的多核苷酸的序列以及由其编码的多肽的氨基酸序列是参照物。制造、使用或销售保藏材料需经许可，本文不授予这种许可。

本发明还涉及具有图1和图2的推导的氨基酸序列的人TNFδ和TNFε多肽，本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。在某些优选实施方案中其是重组多肽。

本发明还涉及这些多肽的片段、类似物和衍生物。当指图1和图2的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这种多肽的相同生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，其可通过裂解除去蛋白原部分而活化产生活性成熟多肽。

图1和图2的多肽的片段、类似物和衍生物可以是(ⅰ)这样的多肽，其中的一或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代，并且这种取代的氨基酸残基可以是由遗传密码编码的或不是由遗传密码编码的；或(ⅱ)这样的多肽，其中的一或多个氨基酸残基包括一个取代基；或(ⅲ)这样的多肽，其中的成熟多肽与另一种化合物融合，如增加多肽的半寿期的化合物(如聚乙二醇)；或(ⅳ)这样的多肽，其中的成熟多肽融合有额外的氨基酸，如前导或分泌序列或用来纯化成熟多肽的序列或蛋白原序列。这些片段、类似物和衍生物被认为属于本领域技术人员根据本文教导而理解的范畴。

在这一点上本发明特别优选的实施方案是具有图1和图2的TNFδ和TNFε的氨基酸序列的多肽，及其变体、类似物、衍生物和片段，以及片段的变体、类似物和衍生物。或者，在这一点上本发明特别优选的实施方案是具有保藏克隆中人cDNA的TNFδ和TNFε的氨基酸序列的多肽，及其变体、类似物、衍生物和片段，以及片段的变体、类似物和衍生物。

优选的变体是与参照序列有保守氨基酸取代的不同的变体，这种取代是用另一个相似特征的氨基酸取代多肽中的给定氨基酸的取代。典型视作保守取代的是在脂族(aliphatic)氨基酸Ala,Val,Leu和Ile之间的一一置换；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn和Gln之间的取代；碱性残基Lys和Arg的交换；以及芳香残基Phe,Tyr的置换。

在这一点上特别优选的是这样的变体、类似物、衍生物和片段以及片段的变体、类似物和衍生物，其具有图1和图2或保藏克隆中cDNA的TNFδ和TNFε多肽的氨基酸序列的TNFδ和TNFε，其中有一些、几个、5-10、1-5、1-3、2或1个氨基酸残基被取代、缺失或添加，或者无氨基酸残基被取代、缺失或添加。其中特别优选的是不改变TNFδ和TNFε的性质和活性的沉默取代、添加和缺失。在这一点上还特别优选的是保守取代。最优选的是具有不含取代的图1和图2的氨基酸序列的多肽。

优选地，本发明的多肽和多核苷酸可以分离形式提供，并优选地纯化到同质。

本发明的TGFδ多肽包括SEQ ID NO:2的多肽(特别是成熟多肽)，以及与SEQ ID NO:2的多肽有至少70％相似性(优选至少70％相同性)的多肽，更优选与SEQ ID NO:2的多肽有至少90％相似性(更优选至少90％相同性)的多肽，还更优选与SEQ ID NO:2的多肽有至少95％相似性(还更优选至少95％相同性)的多肽，并还包括这些多肽的一部分，这种多肽部分通常含有至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸。

本发明的TGFε多肽包括SEQ ID NO:4的多肽有至少70％相似性(优选至少70％相同性)的多肽，更优选与SEQ ID NO:4的多肽有至少90％相似性(更优选至少90％相同性)的多肽，还更优选与SEQ ID NO:4的多肽有至少95％相似性(还更优选至少95％相同性)的多肽，并还包括这些多肽的一部分，这种多肽部分通常含有至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸。

如现有技术中已知的，两个多肽间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与第二个多肽的序列相比而确定。

通过肽合成可用本发明的多肽的片段或部分产生相应的全长多肽，因此，片段可用作中间体来产生全长多肽。本发明的多核苷酸的片段或部分可用于合成本发明的全长多核苷酸。

片段是具有与上述TNFδ和TNFε多肽及其变体或衍生物部分而非全部氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。这种片段可以是“游离的”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分或与其融合，或者片段也可包含在一个更大多肽之内，它们形成一个部分或区域，当包含在一个更大多肽之内时，本文讨论的片段最优选地是形成单一的连续区域。然而，可有几个片段包含在一个单个的更大的多肽之内。例如某些优选的实施方案涉及包含在一个设计用于在宿主中表达的前体多肽之内的本发明的TNFδ和TNFε多肽的一个片段，在TNFδ和TNFε片段的氨基末端融合有异源的前多肽区和多肽原区，在片段的羧基末端融合有一个额外的区域。因此，在本文的含义的一个方面，片段是指从TNFδ和TNFε衍生的融合多肽或融合蛋白的一个部分或多个部分。

作为本发明的多肽片段的代表性例子，可以提及的是具有大约30-233个氨基酸的片段。在这一点上，“大约”包括所提及的特定范围，以及比上限或下限或者上限和下限多或少一些、几个、5、4、3、2或1个氨基酸的范围。例如，大约100-233个氨基酸是指具有100加或减一些、几个、5、4、3、2或1个氨基酸至233加或减一些、几个、5、4、3、2或1个氨基酸残基的多肽片段，即宽至100减一些氨基酸至233加一些氨基酸、窄至100加一些氨基酸至233减一些氨基酸的这样一个范围。

在这一点上高度优选的是在上限或下限或者在上限和下限加上或减去多至5个氨基酸的所述范围。特别高度优选的是在上限或下限或在上限和下限加上或减去多至3个氨基酸的所述范围。还特别高度优选的是在上限或下限或者在上限和下限加上或减去1个氨基酸的范围或者无添加或缺失的范围。最高度优选的是约15-233个氨基酸的片段。

本发明的特别优选的片段是TNFδ和TNFε的截短突变体。截短突变体包括具有图1或图2的氨基酸序列或其变体或衍生物的氨基酸序列的TNFδ和TNFε多肽，只是缺失了包括氨基末端在内的一系列连续残基(即连续的区域或部分)，或者缺失了包括羧基末端在内的一系列连续残基，或者如在双截短突变体中那样，缺失了两段连续残基，一段包括氨基末端，一段包括羧基末端。具有上述大小范围的片段也是截短片段的优选实施方案，通常其是片段中特别优选的。

具有TNFδ和TNFε的结构或功能特征的片段也是本发明这一方面优选的。关于这一点的本发明的优选实施方案包括如下的片段，这些片段包含TNFδ和TNFε的α-螺旋和α-螺旋形成区(“α-区”)，β-折叠和β-折叠形成区(“β-区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α-两亲区，β-两亲区，柔性区，表面形成区和高抗原指数区。

这些方面的某些优选区域示于图4(针对TNFδ)和图5(针对TNFε)，其包括但不限于经分析图1和图2的氨基酸序列而鉴定的上述类型的区域。如图4和图5所示，这种优选的区域包括Gamier-Robsonα-区，β-区，转角区和卷曲区，Chou-Fasmanα-区，β-区和转角区，Kyte-Doolittle亲水区和亲水区，Eisenbergα和β-两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区和Jameson-Wolf高抗原指数区。

在这一点上高度优选的片段是那些包括了结合有几种结构特征如上述几种特征的TNFδ和TNFε区域的片段。特别优选的区域是由图1、2、4和5的信号肽区之后的残基限定的区域，它们的特征均在于具有高度特征性的转角区、亲水区、柔性区、表面形成区和高抗原指数区的氨基酸组成。这种区域可以包含在一较大多肽之内，或者其本身即可是本发明的优选片段。应理解的是这一段落中的术语“大约”与上述段落中关于片段中提到的含义相同。

进一步优选的区域是那些介导TNFδ和TNFε的活性的区域，关于这一点最优选的是具有TNFδ和TNFε的化学、生物学或其它活性的片段，包括那些具有相似或改善的活性或不希望的活性降低的片段。这一点上高度优选的是含有是相关多肽、如图3所示相关多肽(包括人TNFα和β)的序列同系物或位置同系物或者序列及活性区同系物的区域的片段。特别优选的片段是如上所述的截短突变体。

应理解的是本发明还涉及编码上述片段的多核苷酸，与编码上述片段的多核苷酸杂交的多核苷酸，特别是那些在严格条件下杂交多核苷酸，以及用于扩增编码上述片段的多核苷酸的多核苷酸如PCR引物。优选的多核苷酸是与上述优选片段对应的那些多核苷酸。

本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体进行遗传工程加工的宿主细胞和通过重组技术生产本发明多肽。

宿主细胞可经基因工程化而掺入本发明的多核苷酸并表达本发明的多肽。例如，可用公知的技术如感染、转导、转染、转载和转化将多核苷酸导入宿主细胞。多核苷酸可单独导入或与其它多核苷酸一起导入，这种其它的多核苷酸可以独立导入、共导入或与本发明的多核苷酸联合导入。因此，例如，使用标准的共转染技术并例如在哺乳动物细胞中筛选而可以将本发明的多核苷酸与另一种独立的编码选择标记的多核苷酸转染进宿主细胞。在这种情况下多核苷酸通常稳定地掺入到宿主细胞基因组内。

或者，多核苷酸可以与含选择标记的载体结合以在宿主中繁殖，可通过上述技术将载体构建物导入宿主细胞。通常质粒载体是作为在沉淀物如磷酸钙沉淀物的DNA导入或者与荷电脂类形成复合物而导入。也可使用电穿孔将多核苷酸导入宿主。如果载体是病毒，其可在体外包装或导入到包装细胞中，包装后的病毒可被转导进细胞。根据本发明这一方面适用于制备多核苷酸并将多核苷酸导入细胞的各种技术是本领域人员公知的和常规的。这类技术在上述Sambrook等中有详细描述，其是详述这些技术的许多实验手册中的一个代表。根据本发明的这一方面，载体可以是例如质粒载体、单链或双链噬菌体载体、单链或双链RNA或DNA病毒载体。这种载体可作为多核苷酸优选DNA经公知的将DNA或RNA导入细胞的技术导入到细胞内。当载体是噬菌体和病毒载体时，其也可以并且优选是作为包装的或包囊化的病毒由公知的感染和转导技术导入到细胞中。病毒可以是复制活性或复制缺陷的，在后一情况下病毒繁殖通常仅在互补宿主细胞中发生。

在某些方面优选的载体是那些用于表达本发明的多核苷酸和多肽的载体。通常这种载体包括与待表达的多核苷酸可操作连接的用于在宿主中有效表达的顺式作用控制区。合适的反式作用因子或者由宿主提供，或者由互补载体提供或由载体本身在导入宿主后提供。

在这一点的某些实施方案中，载体提供了特异表达，这种特异表达可以是可诱导表达或仅在某些类型细胞中表达，或者既是可诱导的又是细胞特异性的。特别优选的可诱导载体是可由易于操作的环境因子如温度和营养添加剂诱导表达的载体。本领域技术人员熟知并常规采用了各种适于本发明这一方面的载体，如用于原核细胞和真核细胞宿主的组成型和诱导型表达载体。

遗传工程化的宿主细胞可以在为适合于激活启动子，筛选转化体或扩增基因而修饰的传统营养培养基中培养。先前用于宿主细胞表达筛选的培养条件，如温度，PH诸如此类通常适于本发明多肽的表达，这是普通技术熟练人员显而易见的。

可使用各种表达载体表达本发明的多肽，这些载体包括染色体的、附加型的和病毒衍生的载体，例如衍生自细胞质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、拟狂犬病毒和反转录病毒的载体，以及由上述组合衍生的载体如那些衍生自质粒和噬菌体遗传元件的载体如粘粒和噬菌粒，所有这些载体均可用于本发明这一方面的表达。通常，任何适合在宿主中保持、繁殖或表达多核苷酸以表达多肽的载体均可用于表达。

可通过各种已知和常规技术将合适的DNA插入到载体中，通常通过用一或多种限制性内切酶裂解DNA序列和表达载体，然后用T4DNA连接酶将限制片段连接在一起。可用于此目的的限制酶切和连接的程序是常规公知的。Sambrook等的书中详细描述了用于构建表达载体的合适的程序。

表达载体中的DAN序列可操作地与合适的表达控制序列例如启动子连接以指导mRNA转录，这类启动子的代表包括噬菌体λPL启动子，E.coli lac,trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及反转录病毒LTR的启动子，这些仅是熟知的启动子中的几个。应理解的是未提到的各种启动子均适用于本发明的这一方面，并且是本领域人员公知的，可以以本文实施例所述方式使用。

通常表达构建物含有转录起始和终止的位点，以及在转录区中的用于翻译的核糖体结合位点。由构建物表达的成熟转录物的编码区包括在开头处的翻译起始AUG以及在待翻译的多肽的末端合适处的终止密码子。

另外，构建体还可含有调控以及引起表达的调控区。通常，根据许多通用的程序，这种区域将通过控制转录如阻遏物结合位点和增强子而操纵。

用于繁殖和表达的载体通常包括选择标记，这种标记也可适用于扩增，或者载体也可含有用于此目的的附加的标记。表达载体优选含有一个或多个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的选择标记基因，优选的标记包括对于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli或其它细菌中为四环素或氨苄青霉素抗性基因。

含有本文其它处所述的合适的DNA序列以及合适的启动子和其它合适的调控序列的载体可以用各种公知的在宿主中表达所需多肽的技术导入合适的宿主。作为合适的宿主的例子，可以提及的有：细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞；植物细胞。针对各种表达构建体的宿主是公知的，根据本文的披露，本领域技术人员能够选择宿主表达本发明的多肽。

更具体地，本发明还包括重组构建体如表达构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入了本发明的序列。在这一点的某些优选实施方案中，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，有许多可商购的载体适用于本发明。

以下举出载体的例子，优选用于细菌的载体是：pQE70,pQE60,pQE-9(来自Qiagen)，pBS载体，phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A(来自Stratagene)；prtc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5(来自Pharmacia)。优选的真核载体是pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1,pSG(来自Stratagene),pSVK3,pBPV,pMSG,pSVL(来自Pharmacia)。这些载体仅是举例示出了许多可商购的公知的载体，本领域技术人员可以将这些载体用于本发明的这一方面。应理解的是其它适于在宿主中导入、保持、繁殖或表达本发明的多核苷酸或多肽的质粒或载体也可用于本发明的这一方面。

利用如下的载体可从任何希望的基因中筛选启动子区，该载体含有缺少启动子区的报道转录单位，如氯霉素乙酰转移酶(cat)转录单位，该转录单位位于用于导入候选启动子片段即可能含有启动子的片段的限制位点的下游。正如所公知的，在载体中cat基因上游的限制位点导入含启动子片段可产生CAT活性，该活性可用标准CAT分析检测。适合此目的的载体是公知的并很容易获得，两个这种载体是pKK232-8和pCM7。所以，用于表达本发明的多核苷酸的启动子不仅包括公知的很容易获得的启动子，而且包括可用上述技术用报道基因很容易获得的启动子。

适合表达本发明的多核苷酸和多肽的公知细菌启动子有大肠杆菌lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，λPR,PL启动子，和trp启动子。公知真核启动子包括CMV立即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，逆转录病毒LTR的启动子如Rous肉瘤病毒启动子，和金属硫蛋白启动子如鼠金属硫蛋白-I启动子。选择适当的载体和启动子在宿主细胞中表达是公知程序，表达载体构建、将载体导入宿主及在宿主中表达所需技术是在普通技术人员的水平中的。

本发明还涉及含有上面叙述的构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或者低等真核生物细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核生物细胞，如细菌细胞。

通过磷酸钙转染，DEAE-Dextran介导的转染，阳离子脂类介导的转染，电穿孔转导，感染或其它方法可将构建体导入宿主细胞，这些方法在许多标准实验手册，如Davis等，Basic Methods inMolecular Biology,(1986)中有述。宿主细胞中的这些构建体可以常规方式用于生产由重组序列编码的基因产物。或者，本发明的多肽可以通过常规的肽合成仪合成生产。

在合适的启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞，酵母，细菌或其他细胞中表达。利用起源于本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用于生产这样的蛋白质。Sambrook etal.,分子克隆实验手册，第二版，Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)叙述了原核和真核宿主一起使用的适当的克隆和表达载体。

一般来说，重组表达载体包括复制源点，一个起源于高表达基因指导下游结构基因的转录的启动子和一个在细胞与载体接触后用于分离含载体的细胞的选择标记。合适的启动子可以起源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，或热休克蛋白等的基因的那些启动子。选择标记包括大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母trpl基因。

在载体中插入增强子序列可以提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用因子，通常为10到300个bp，作用于特定宿主细胞中的启动子以增强它的转录活性。例子包括在复制源点晚期一侧的bp100到270的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制源点晚期一侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。

编码本发明的多肽的异源结构序列的本发明的多核苷酸通常是利用标准技术插入到载体中，从而其与启动子可操作连接以用于表达。多核苷酸的定位是使转录起点大约位于核糖体结合位点的5’。核糖体结合位点位点和起始AUG之间没有其它的起自起始密码子(通常为AUG)的开放读框。另外，通常在多肽的末端有一翻译终止密码子，并且在转录区的3’末端的合适位置有聚腺苷化信号和转录终止信号。

为了翻译的蛋白能分泌进内质网腔、周质空间或分泌到胞外环境，可将合适的分泌信号掺入进表达的多肽。这些信号对于多肽可以是内源的或可以是异源信号。

多肽可以以修饰的形式表达，如作为融合蛋白表达，并且不仅可以包括分泌信号，也可以包括附加的异源功能区。因此，例如可将附加的氨基酸，特别是带电氨基酸组成的一个区域加到多肽的N一末端以增加在纯化过程中或在随后的处理和贮存过程中在宿主细胞中的稳定性和持续性。另外，也可向多肽加入促进纯化的区域，这种区域可在多肽的最终制备之前除去。向多肽添加促进分泌、增加稳定性和促进纯化的肽基序是本领域所熟悉的常规技术。

合适的用于本发明的多核苷酸和多肽的繁殖、保持或表达的原核生物宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。假单胞菌属，链霉菌属，和葡萄球菌属内的各个种也是合适的宿主，当然本领域人员已知的许多其它的宿主也可以选择来使用。

作为一个代表性但非限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含来源于包含已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商业途径可获得的质粒的选择标记和细菌复制源点。这样的商业载体包括例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)和GEMI(Promega Biotec,Madison,WI,USA)。这些Pbr322“骨架”部分与合适的启动子和待表达的结构序列结合。

在合适宿主菌株转化和宿主菌株生长到合适的细胞密度之后，当所选启动子是诱导型的时，通过合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导所选择的启动子并且将细胞培养另外一段时间。通常通过离心收集细胞，通过物理或方法破碎细胞，并且保留得到的粗提取物以进一步纯化。可以通过任何常规的方法来破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，包括冻融循环，超声波处理，机械破碎，或用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员熟知的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达。哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，如Gluzman，细胞，23:175(1981)所述。其它能表达相容载体的细胞系包括，例如，C127,3T3,CHO,HeLa，人肾293和BHK细胞系。

哺乳动物表达载体包含复制源点，合适的启动子和增强子，还有任何必要的核糖体结合位点，聚腺苷化位点，拼接供体和受体位点，转录终止序列，和表达所需的5’侧接非转录序列。在某些优选实施方案中，来源于SV40拼接位点和聚腺苷化作用位点的DNA序列可以用于提供所需要的非转录遗传元件。

通过多种方法可以从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。最优选地，高效液相层析(HPLC)可以用于纯化。当在分离和/或纯化过程中多肽被变性时，可采用公知的再折叠蛋白质的步骤以再生活性构象。

本发明的多肽包括天然纯化的产物，化学合成过程的产物，通过重组技术从原核生物或真核生物宿主(例如，细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。依据在重组生产过程中所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，在某些情况下由于宿主介导的过程本发明的多肽也可以包括一个起始的修饰的甲硫氨酸氨基酸残基。

根据本发明，本发明的多核苷酸和多肽可以有各种应用，特别是用于那些利用TNFδ和TNFε的化学和生物学性质的应用中。这些应用包括转化细胞系的细胞编程性死亡，细胞活化和增殖的介导，免疫调节的初级介体，对病原体的抗微生物性、抗病毒性和炎症应答易感性。其它的应用涉及细胞、组织和生物体的失调的诊断和治疗。本发明的这些方面将在以下讨论中进一步描述。

本发明还涉及将本发明的多核苷酸用作例如诊断试剂以检测互补多核苷酸。对与功能失调相关的本发明多肽的突变形式的检测提供了一种诊断工具，其可以诊断或确定由本发明的多肽的表达不足、过量表达或变化表达产生的疾病或疾病的易感性，所述疾病例如为瘤形成如肿瘤。

通过各种技术可以在DNA水平检测携带本发明基因中的突变的个体。为了诊断可以从病人的细胞，如血液，尿，唾液，组织活体检查和尸体剖检的材料得到核酸。基因组DNA可以直接用于检测或可以在分析之前利用PCR(Saiki et al,,Nature,324:163-166(1986))进行酶促扩增。RNA或cDNA也可以用于同样目的。作为一个例子，互补于编码TNFδ和TNFε的核酸的PCR引物可以用于鉴定和分析TNFδ和TNFε表达和突变。例如，与正常基因型相比扩增产物的大小的变化可以检测缺失和插入。通过把扩增的DNA与放射性标记TNFδ和TNFεRNA或与放射标记的TNFδ和TNFε反义DNA序列杂交可以鉴定点突变。通过RNase A消化或解链温度的差异可以把错配双螺旋与正确配对序列区别开来。

参照基因与具有突变的基因之间的序列差异也可以通过直接DNA测序揭示。另外，可采用克隆的DNA区段作为探针以检测特异的DNA区段。这种方法的灵敏性可通过合适应用PCR或其它扩增方法而大大增加。例如，测序引物可使用双链PCR产物或由修改的PCR产生的单链模板。用放射性标记的核苷酸经常规程序测序，或用带荧光标记的自动测序程序进行测序。

通过在有或没有变性剂时检测凝胶上DNA片段的电泳迁移率的改变可以完成基于DNA序列差异的遗传测试。通过高分辨凝胶电泳可以显现小序列缺失和插入。在变性的甲酰胺梯度胶上可以区别不同序列的DNA片段，其中根据它们特有的解链或部分解链温度，不同的DNA片段迁移停留在凝胶的不同位置(参见，例如Myers et al.,Science,230:1242(1985))。

通过核酸酶保护测定，如RNase和S1保护或化学裂解方法也可以发现特定位置的序列变化(例如Cotton et al.,PNAS,USA,85:4397-440l(1985))。所以，通过如杂交，RNase保护，化学裂解，直接DNA序列分析或使用限制性酶(例如，限制片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹分析方法可以完成特定DNA序列的检测。除了较方便的凝胶电泳和DNA序列分析，还可以通过原位分析检测突变。

本发明的序列对于染色体鉴定也是有价值的。该序列可特异性地靶击并与个体的人染色体的特定位置杂交。此外，目前需要鉴定染色体上的特定位点。目前只有少数几个根据实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可用于标记染色体位置。本发明对染色体DNA的物理作图是将这些序列与疾病相关的基因相联的重要的第一步。

在某些优选的实施方案中，用本文公开的cDNA克隆本发明基因的基因组DNA，这可以使用各种公知的技术及可商购的文库完成。使用公知的技术将基因组DNA用于原位染色体作图。典型地，根据常规的染色体作图程序，需经反复试验才能鉴定出能给出好的原位杂交信号的基因组挥针。

另外，在某些情况下，通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)可以把序列定位于染色体上。该基因的3′未翻译区的计算机分析被用于快速筛选引物，引物不应跨越基因组DNA中一个以上外显子的长度从而使扩增过程复杂化。然后这些引物用于PCR筛选含有单个人的染色体的体细胞杂交体。只有那些含有对应于引物的人基因的杂交体将产生扩增片段。

体细胞杂交体的PCR作图是将特定DNA定位到特定染色体的快速方法。在本发明中利用同样的寡核苷酸引物，以类似的方法由一组特异染色体片段组或大基因组克隆库可以完成亚定位。可以同样用于对它的染色体作图的其它方法包括原位杂交，用标记的流选染色体的预筛选和通过杂交的预选择构建染色体特异cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用于提供一步的精确染色体定位。这项技术可以与短至50或60碱基的cDNA一起使用。回顾这项技术可以见Verma等，人染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦序列定位于精确的染色体位置，序列在染色体上的物理位置就可与遗传图谱数据相关。这样的数据可以在例如McKusick，人类中的孟德尔遗传(在线从约翰霍普金斯大学Welch医学图书馆)中找到。然后通过连锁分析(物理邻接基因的共遗传)鉴定基因和已定位于同一染色体区的疾病的关系。

接着，必须确定感染和未感染的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部感染个体但不在任何正常个体中观察到突变，那么这个突变很可能是引起疾病的原因。

根据目前物理图谱的分辨率和遗传图谱分析技术，精确定位于与疾病相关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在致病基因中的一种。(这假定1兆碱基作图分辨率并且每20kb为一个基因)。

本发明还涉及用于检测细胞和组织中本发明的蛋白的水平(包括确定正常水平和异常水平)的诊断分析法，如定量诊断分析法。因此，例如，根据本发明用于检测与正常对照组织样品相比本发明的TNF蛋白的过量表达的诊断分析可以用来检测瘤形成的存在。可以用于确定来自宿主的样品中蛋白质如本发明的蛋白的分析技术是本领域技术熟练人员已知的，这些分析方法包括放射免疫测定，竞争结合测试，Western印迹分析和ELISA测试，其中ELISA通常是优选的。ELISA测试首先包括制备一个特异于本发明蛋白的抗体，优选的是单克隆抗体。另外通常制备一个结合该单克隆抗体的报道抗体。附着于报道抗体是可检测试剂如放射性，荧光或酶试剂，在这个例子中的辣根过氧化物酶。

为进行ELISA分析，从宿主中取出样品并在一个固体支持物，例如聚苯乙烯皿上温育，皿与样品中的蛋白质结合。然后，通过与非特异蛋白质如牛血清白蛋白温育而覆盖任何自由的蛋白质结合位点。接着，将单克隆抗体在皿中温育，在这个过程中单克隆抗体附着于任何附着于聚苯乙烯皿上的本发明的蛋白。所有未结合的单克隆抗体用缓冲液洗去。将与辣根过氧化物酶结合的报道抗体置于皿中，导致报道抗体与任何与本发明的蛋白结合的单克隆抗体结合，然后洗去未附着的报道抗体。过氧化物酶活性试剂包括比色底物随后加到皿中，通过一级和二级抗体与本发明的蛋白相连的固定化过氧化物酶产生显色反应产物。在给定时间的显色量指示样品中存在的本发明蛋白量。定量结果典型地通过与标准曲线比较而获得。

可使用竞争性测试，其中特异于本发明蛋白的抗体附着于一个固体支持物，标记的本发明蛋白和来源于宿主的样品通过固体支持物，并且检测到的附着于固体支持物的标记的量可以与样品中本发明蛋白的量相关。

多肽，它们的片段或其它衍生物，或其类似物，或表达它们的细胞可以用作免疫原以生产抗体。这些抗体可以例如是多克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的，单链的和人源化的抗体，以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本领域已知的各种技术可以用于这些抗体和片段的生产。

通过把多肽直接注射进入动物或给动物(优选的是非人类)施用该多肽，可以获得针对相应于本发明序列的多肽的抗体。这样得到的抗体然后与多肽本身结合。以这种方式，即使是仅编码多肽的一个片段的序列也可以用于产生结合整个天然多肽的抗体。然后这样的抗体可以用于从表达这一多肽的组织中分离多肽。

为了制备单克隆抗体，可以利用任何能通过连续细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein,1975，自然256:495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学4:72)，产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss,Inc.,pp88-96)。

可采用生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)来生产本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。同样，转基因鼠或其它生物体如其它哺乳动物可用来表达本发明免疫原多肽产物的人源化的抗体。

通过将上述抗体附着于固体支持物上经亲和层析分离和/纯化，可以用所述抗体分离或鉴别表达多肽的克隆或纯化本发明的多肽。

因此，本发明的多肽可以用于抑制瘤形成，如肿瘤细胞生长。本发明的多肽可能通过细胞编程性死亡和对某些细胞的毒性负责破坏肿瘤。本发明的多肽还诱导粘附细胞如LFA-1的正调节，因此可用于伤口愈合。本发明的多肽还可用于治疗需要生长促进活性的疾病如再狭窄，因为本发明的多肽对内皮起源的细胞具有增殖作用。本发明多肽因此还可用于调节内皮细胞发育中的造血机能。

本发明的多肽还刺激T细胞的活化，因此可用于刺激对各种寄生虫、细菌和病毒感染的免疫应答。本发明的多肽还可用于消除自反应性T细胞以治疗和/或防止自身免疫疾病。自身免疫疾病的一个例子是Ⅰ型糖尿病。

本发明还提供了鉴别与本发明的蛋白质结合的分子如受体分子的方法，编码与本发明的蛋白质结合的蛋白质如受体蛋白的基因可用各种本领域技术人员公知的方法进行鉴别，例如配体淘选和FACS分选。这种方法在许多实验手册中有描述，例如Coligan等，免疫学当前方法1(2)：第5章(1991)。

例如，可使用表达克隆法用于此目的，为此，从与本发明的蛋白质反应性的细胞制备聚腺苷化RNA，从此RNA制备cDNA文库，将文库分成各个库，将各个库分别转染进对本发明的蛋白质不反应的细胞。然后将转染的细胞与标记的本发明蛋白质接触，本发明的蛋白质可用各种公知的技术进行标记，如放射性碘化、包含进位点特异性蛋白激酶的识别位点。接触后固定细胞并确定细胞松弛素的结合。这些程序可方便地在玻片上进行。

鉴别库中能产生TNFδ或TNFε结合细胞的cDNA，从这些阳性库中制备亚库，转染进宿主细胞并如上所述筛选。使用重复的亚库和再筛选方法，可以分离出一个或多个编码推定的结合分子如受体分子的单个克隆。

或者，可以将标记的配体与从表达结合分子如受体分子的细胞制备的细胞抽提物如细胞膜或膜抽提物光亲和连接。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离交联连接的材料并暴露于X-光胶片。含有配体-受体的标记复合物可以被切下，分解成肽片段，并进行蛋白质微测序分析。微测序分析获得的氨基酸序列可用于设计一套简并寡核苷酸探针来筛选cDNA文库，以便鉴定编码推定的受体分子的基因。

本发明的多肽还可用于评价细胞或无细胞制备物中的TNFδ或TNFε结合分子如受体分子的TNFδ或TNFε结合能力。

本发明还提供了筛选化合物以鉴别能增强或阻断TNFδ或TNFε对细胞的作用的那些化合物，所述的对细胞的作用例如TNFδ或TNFε与TNFδ或TNFε结合分子如受体分子的相互作用。兴奋剂是增强本发明的多肽的天然生物学功能或以与本发明的多肽类似的方式起作用的化合物，而拮抗剂则降低或消除这种功能。

例如，可从表达与TNFδ或TNFε结合的分子的细胞制备细胞区室如膜或其制备物如膜制备物，所述的分子例如为信号分子或由TNFδ或TNFε调节的调控途径的分子。在可能是TNFδ或TNFε的兴奋剂或拮抗剂的候选分子的存在或不存在下，将制备物与标记的TNFδ或TNFε保温。候选分子与结合分子结合的能力反映在标记配体结合的降低。无偿结合即不诱导TNFδ或TNFε对结合TNFδ或TNFε结合分子的作用的分子最有可能是好的拮抗剂。结合良好并且激发与TNFδ或TNFε相同或紧密相关的作用的分子是兴奋剂。

潜在的兴奋剂和拮抗剂的类TNFδ或TNFε的作用可以通过例如测定候选分子与细胞和合适的细胞制备物的相互作用后的二级信使系统的活性，并将该作用与TNFδ或TNFε或激发与TNFδ或TNFε相同作用的分子的作用相比较而测定。可应用的二级信使包括但不限于AMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇水解二级信使系统。

分析TNFδ或TNFε拮抗剂的另一个实施例是竞争性分析，其是在适合竞争抑制分析的条件下将TNFδ或TNFε和潜在的拮抗剂与膜结合的TNFδ或TNFε受体分子或重组TNFδ或TNFε受体分子合并。可以标记TNFδ或TNFε，如用放射性标记，从而可以精确测定与受体分子结合的TNFδ或TNFε分子的数量以评价潜在的拮抗剂的有效性。

潜在的拮抗剂包括与本发明的多肽结合从而抑制或消除其活性的小的有机分子、肽、多肽和抗体。潜在的拮抗剂还可以是这样的小的有机分子、肽、多肽，如与结合分子如受体分子结合相同的位点的紧密相关的蛋白或抗体，但其不诱导TNFδ或TNFε诱导的活性，从而通过阻止本发明的多肽与其受体结合而防止其作用。

另一种潜在的拮抗剂是与TNFδ或TNFε结合而防止其与膜结合的TNFδ或TNFε受体相互作用的TNFδ或TNFε受体的可溶形式。以这种方式，受体不能被其配体刺激。

潜在的拮抗剂包括与本发明的多肽结合并占据其结合位点从而防止其与细胞结合分子如受体分子的结合的小分子，由此防止了正常的生物学活性。小分子的例子包括但不限于小的有机分子、肽或非肽拮抗剂。

其它的潜在拮抗剂包括反义分子。通过反义DNA或RNA或通过三螺旋形成可用反义技术控制基因表达。反义技术例如在Okano,J.神经生物化学56:560,1991；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton,FL(1988)中有讨论。三螺旋形成的讨论例见Lee等，核酸研究，6:3073(1979)；Cooney等，科学241；456(1988)；和Dervan等，科学251:1360(1991)。这些方法是基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸的5’编码部分可以用于设计长约10-40bp的反义RNA寡核苷酸。设计一种与参与转录的基因的一个区域互补的DNA寡核苷酸从而防止转录及TNFδ或TNFε的产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，阻断mRNA分子翻译成TNFδ或TNFε多肽。上述寡核苷酸也可传递到细胞从而可在体内表达反义RNA或DNA以抑制本发明的多肽的产生。

拮抗剂可以与药物学可接受的载体一起用于组合物中，例如，如下所述。

例如拮抗剂可以用于治疗恶病质，其是由于脂蛋白脂酶系统性缺陷导致的脂类清除缺陷，由TNFδ或TNFε抑制。拮抗剂还可用于治疗脑疟疾，在该病中本发明的多肽似乎起病原作用。拮抗剂也可用于治疗风湿性关节炎，其是通过抑制炎症细胞因子如滑液细胞中的IL1的TNFδ或TNFε诱导产生而治疗。当治疗关节炎时，本发明的多肽优选关节内注射。

拮抗剂也可用于通过防止存在移植物时免疫系统的刺激而防止移植物一宿主排斥。

拮抗剂还可用于抑制骨再吸收，因此可治疗和/或预防骨质疏松。

拮抗剂还可用作抗炎剂以治疗内毒性休克，这一严重症状是对细菌或其它类型感染的过激应答所致。

本发明还涉及包含上述多核苷酸或多肽或兴奋剂或拮抗剂的组合物。因此，本发明的多肽可与用于细胞，组织或生物体的一或多种有菌或无菌载体如适合给予患者的药物学载体联合应用。这样的组合物例如包括一种介质添加剂或治疗有效量的本发明的多肽和药学可接受载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其组合。配制的药剂应该适于给药方式。

本发明还提供了药物包或药盒，它们含有一或多个装填有上述本发明组合物的一种或多种成份的容器。附在这样的容器中的是由控制药物或生物学产品制造，使用或销售的政府部门规定的通告。这样的通知反映出制造，使用或销售该产品供人使用得到政府部门同意。

本发明的多肽和其它化合物可以单独使用或与其它化合物如治疗用的化合物结合使用。

药物组合物可以有效方便的方法如通过局部，口腔，肛门，阴道，静脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，鼻内或皮内途径给药。

该药物组合物通常以治疗或预防特定疾病的有效量使用。一般来说，它们以至少大约10μg/kg体重的量给药，在大多数情况下，它们以每天不超过8mg/kg体重的量给药。优选地，大多数情况下，剂量大约是每天10μg/kg到1mg/kg体重。应理解的是，考虑到症状、严重性、给药途径、并发症等，可根据每种治疗方式和症状用标准方法确定最佳剂量。

根据本发明通过在体内表达所述多肽将本发明的多核苷酸、多肽和属于多肽的兴奋剂和拮抗剂用于治疗方式，这经常被称为“基因疗法”。

所以，例如，可以在体外用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对来自病人的细胞进行遗传工程处理，随后将工程细胞提供给待用多肽治疗的病人。例如，可以利用含有编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒质粒载体对细胞进行遗传工程处理。这些方法都是本领域技术人员已知的，并且根据本文的教导显而易见的。

类似地，为了在体内表达多肽，可以用本领域公知的程序在体内对细胞进行工程化。例如，可如上所述对本发明的多核苷酸进行工程化以在一种复制缺陷型反转录病毒载体中表达。然后分离反转录病毒表达构建体并导入到包装细胞中，用含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒质粒载体转导包装细胞，从而包装细胞可产生含感兴趣的基因的感染性病毒颗粒。可将这些生产细胞给予患者以在体内工程化细胞并表达多肽。通过这种方法给予本发明多肽的这些和其它方法对本领域人员根据本文教导是显而易见的。

衍生本文上述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿猩猩白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体衍生自Moloney鼠白血病病毒。

这种载体包括一或多个用于表达多肽的启动子，可采用的合适的启动子包括但不限于：反转录病毒LTR,SV40启动子，和人巨细胞病毒(CMV)启动子，见Miller等，生物技术7:980-990(1989)所述，或者任何其它启动子(例如，细胞启动子如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、RNA聚合酶Ⅲ和β-肌动蛋白启动子)。可采用的其它病毒启动子包括不限于腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子，B19细小病毒启动子。合适的启动子的选择对于本领域人员根据本文的教导是显而易见的。

编码本发明的多肽的核酸序列置于合适的启动子的控制之下，可采用的合适启动子包括但不限于腺病毒启动子如腺病毒主要晚期启动子；异源启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；诱导型启动子如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；反转录病毒LTR(包括本文上述的修饰的反转录病毒LTR)；β-肌动蛋白启动子；人生长激素启动子。启动子还可以是控制编码多肽基因的天然启动子。

用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产细胞系，可被转染的包装细胞的例子包括但不限于PE501,PA317,Y-2,Y-AM,PA12,T19-14X,VT-19-17-H2,YCRE,YCRIP,GP+E-86,GP+envAm12,DAN细胞系，见Miller,A.，人基因治疗1:5-14(1990)所述。可通过本领域任何公知的方式将载体转导进包装细胞，这类方式包括但不限于电穿孔，使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，反转录病毒质粒可被包囊进脂质体或与脂类偶联，然后给予宿主。

生产细胞系将产生包括编码多肽的核酸序列的感染性反转录病毒载体颗粒，然后可用这种反转录病毒载体颗粒体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于胚干细胞，胚癌细胞，以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成骨髓细胞，角质细胞，内皮细胞和支气管上皮细胞。

本发明进一步参照下述实施例加以描述，实施例仅是以特殊的实施方案为参照描述本发明，这些实施例尽管描述了本发明的某些特殊方面，但是其并非是限制本发明。

除非另有详细描述，所有实施例均是用本领域技术人员熟知的常规标准方法进行。下述实施例的常规分子生物学技术可以参照标准实验手册进行，如Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，本文称作“Sambrook”。

除非另有说明，以下实施例中指出的所有份或量均指重量。除非另有说明，实施例中的片段大小分离均用Sambrook和各种其它参考文献如Goeddel等，核酸研究8:4057(1980)中的标准琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行。除非另有描述，连接反应是用标准缓冲液、保温温度和时间、约等摩尔量的待连接DNA片段和每0.5μg DNA约10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)来完成。

实施例1用细菌表达和纯化人TNFδ和TNFε的可溶形式

利用特异于人TNFδ或TNFε蛋白质的氨基酸羧基端序列和基因3’的载体序列的PCR寡核苷酸引物扩增保藏的多核苷酸中编码λTNFδ和TNFε的DNA序列。将含有促进克隆的限制位点的附加核苷酸各自加到5’和3’序列上。

5’寡核苷酸引物序列为5’-GCG GGA TCC CAG AGC CTCACC ACA G-3’，它含有一个下划线的限制酶位点，接着跟着如图所示编码序列的开始于ATG密码子的第115位碱基的16个核苷酸。

3’引物序列为5‘-CGC AAG CTT ACA ATC ACA GTT TCACAA AC-3’，其含有下划线的HindⅢ位点，并且后接20个互补于图1和图2所示的编码序列的最后13个核苷酸(包括终止密码子)的核苷酸。

限制位点对应于用于这些实施例的细菌表达的细菌表达载体pQE-9(Qiagen公司，Chatsworth,CA)。pQE-9编码氨苄青霉素抗性(“Ampr”)并含有一个细菌复制源点(“ori”)，一个IPTG诱导型启动子，一个核糖体结合位点(“RBS”)，一个6-His标记和限制酶位点。

将扩增的人TNFδDNA和载体pQE-9用BamHⅠ和HindⅢ消化，然后将消化的DNA连接在一起。TNFδDNA插入到pQE-9限制酶切载体是将TNFδ编码区置于载体的IPTG诱导型启动子的下游并与之可操作连接，并与起始AUG位于同一框内，以便于TNFδ翻译。

使用标准程序用连接混合物转化感受态E.coli细胞，这些程序如Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)所述。用大肠杆菌菌株M15/rep4进行本文的所述的举例性实施例，该菌株含有多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达lac阻遏物并赋予卡那霉素抗性(“Kanr”)。该菌株可购自Qiagen，其仅是许多适于表达TNFδ的菌株中的一种。通过转化子在含氨苄青霉素的LB平板上的生长能力鉴别转化子。从抗性菌落中分离质粒DNA并经限制分析证实克隆的DNA。

含有所需构建体的克隆在补充了氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。O/N培养物用于接种一个较大规模的培养物，比例约为1:100到1:250。细胞生长到600nm处光密度(“OD600”)为0.4-0.6。然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至终浓度为1mM以使lacI阻遏物失活，诱导从lac阻遏物敏感型启动子转录。细胞再生长3-4小时，然后离心收获细胞并用标准方法破碎。用常规收集技术从破碎的细胞中纯化包涵体，将包涵体中的蛋白溶解在8M脲中。将含溶解蛋白的8M脲溶液在2X磷酸盐缓冲液(PBS)中通过PD-10柱，由此除去脲，交换缓冲液并重折叠蛋白。再经一层析步骤纯化蛋白，除去内毒素。然后无菌过滤，无菌过滤的蛋白制备物以95μg/ml的浓度在2XPBS中贮存。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳标准方法分析TNFδ制备物揭示出该制备物约含80％单体，预期分子量约为20.8Kda。

在使得含6-His标记蛋白典型结合的条件下，在镍螯合柱上层析纯化蛋白，用6M盐酸胍PH5.0从柱上洗脱蛋白，并复性。

实施例2利用杆状病毒表达系统克隆和表达可溶的人TNFδ和TNFε

利用对应于所述基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物，扩增了保藏克隆中的编码全长人TNFδ和TNFε蛋白质的cDNA序列。

5’引物具有序列5’-GCG GGA TCC CCA GAG CCT CACCAC AG-3’，其含有下划线的BamHⅠ限制酶位点，后面接着图1和图2的TNFδ和TNFε序列的16个碱基。如下所述插入表达载体后，编码人TNFδ和TNFε的扩增片段的5’端提供了一个有效的信号肽。如Kozak,M.,J.Mol.Biol.196:947-950(1987)所述的在真核细胞中起始翻译的有效信号合适地位于构建体的载体部分。

3’引物具有序列5’-CGC TCT AGA ACA ATC ACA GTTTCA CAA AC-3’，其含有下划线的XbaⅠ限制位点，后接互补于图1和图2所示的TNFδ和TNFε编码序列的最后13个核苷酸(包括终止密码子)的核苷酸。

利用商购试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,La Jolla Ca.)从1％琼脂糖凝胶上分离扩增的片段。然后用内切酶BamHⅠ和Asp718消化该片段，然后再一次在1％的琼脂糖胶上纯化。这个片段被命名为F2。

用标准方法，例如如Summers等，杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序的方法手册，Texas农业实验站简报No.1555(1987)所述，在杆状病表达系统中用载体pA2 GP表达TNFδ和TNFε蛋白质。这一表达载体含苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体启动子，后面跟随方便的限制性内切酶位点。包括N-末端甲硫氨酸的AcMNPV gp67的信号肽正位于BamHⅠ位点的上游。猿猴病毒40(“SV40”)的聚腺苷化位点被用于有效的聚腺苷化作用。为了容易地筛选重组病毒，来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以同样于多角体启动子的方向插入，后面接着多角体基因的聚腺苷化信号。为了进行细胞介导的与野生型病毒DNA的同源重组，多角体序列两侧接着病毒序列以产生表达克隆的多核苷酸的活病毒。

许多其他杆状病毒载体可以用于代替pA2-GP，如pAc373,pVL941和pAcIM1，如本领域技术人员理解的，条件是构建体提供了位置合适的用于转录、翻译、运输等的信号，如所需的框内AUG和信号肽。这类载体可参见Luckow等，病毒学，170:31-39。

用限制酶BamHⅠ和XbaⅠ消化质粒，然后用小牛肠磷酸酶及本领域技术人员已知的程序去磷酸化。然后利用商购的试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)从1％琼脂糖凝胶上分离该DNA。这一载体DNA被命名为“V2”。

用T4DNA连接酶连接片段F2和去磷酸化质粒V2。然后用连接混合物转化大肠杆菌HB101细胞。用BamHⅠ和XbaⅠ消化来自各个菌落的DNA，然后用凝胶电泳分析消化产物，由此鉴别含有携带人TNFδ和TNFε基因的质粒的细菌。经DNA测序证实克隆的片段的序列。该质粒命名为pBac TNFδ。

利用脂转染方法(如Felgner et al.Proc Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417(1987)所述)将1.0μg商购的线性杆状病毒DNA(“BaculoGold^TM杆状病毒DNA”,Pharmingen,San Diego,CA.)与5μg质粒pBac TNFδ一起共转染。在含有50μl的无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)的微滴板的无菌孔中将1μg的BaculoGold^TM病毒DNA和5μg的质粒pBac TNFδ混合。之后将10μl Lipofectin和90μl Grace’s培养基加入，混合并在室温下温育15分钟。然后，把转染混合物滴加入种在具有1mlGrace’无血清培养基的35mm组织培养板中的Sf9昆虫细胞(ATCCCRL1711)上。将平板前后轻摇，以便使新加入的溶液混合。然后平板在27℃温育5小时。5小时后，从平板中移去转染溶液，加入补充了10％胎牛血清的1ml Grace’s昆虫培养基。平板放回一个培养箱并在27℃继续培养4天。

4天后，收集上清液，并如Summers和Smith(上述)所述进行噬斑测定。使用具有“Blue Gal”(Life Technologies Ine.,Gaithersburg)的琼脂糖凝胶，以容易鉴别和分离产生染蓝的噬斑的表达gal的克隆。(这种“噬斑测试”的详细描述也可以参见Life Technolgies Inc.,Gaithesburg分发的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南，9-10页)。

连续稀释四天后，将病毒加入细胞，适当保温后用一个Eppendorf吸管的管尖挑出染蓝的噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂在一个含有200μl Grace’s培养基的Eppendorf管中重新悬浮。短时离心除去琼脂，含有重组杆状病毒的上清液用于感染播种于35mm皿中的Sf9细胞。四天后，收集这些培养皿中的上清液，然后贮存于4℃。经包括限制酶谱和测序的DNA或TNFε分析鉴定含有合适插入的TNFδ或TNFε的克隆，此克隆命名为V-TNFδ。

Sf9细胞生长于补充了10％热失活FBS的Gracs’s培养基中。用重组杆状病毒V-TNFδ以感染复数(MOI)约为2(约1-3)感染细胞。六小时后除去培养基并用没有甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900Ⅱ培养基(购自Life Technologise Inc.,Gaithersburg)替换。42小时后加入5μCi的35S-甲硫氨酸与5μCi的35S半胱氨酸(购自Amersham)。细胞进一步温育16小时，然后离心收集，通过SDS-PAGE和放射自显影可见裂解的标记蛋白质。

实施例3 TNFδ表达在人组织中的分布

使用如Sambrook等(上述)方法进行Northern印迹分析来检查TNFδ在人组织中的表达水平。用RNAzol^TM B系统(BiotecxLaboratories Inc.,6023 South Loop East,Houston,TX 77033)分离总细胞RNA样品。

从组织样品中分离约10μg总RNA，在强变性条件下在1％凝胶上电泳大小分离RNA。将RNA从凝胶印迹到尼龙滤膜上，然后制备滤膜以用于与可检测标记的多核苷酸探针杂交。

作为检测编码TNFδ的mRNA的探针，标记保藏克隆中cDNA插入物的编码区的反义链至高比活性，用得自Stratagene的Prime-It试剂盒经引物延伸标记cDNA，根据厂商推荐的标准反应方案用50ngcDNA进行反应。用得自5-Prime-3-Prime公司，5603 Arapahoe Road,Boulder,CO80303的Select-G-50柱经柱层析将标记的多核苷酸从其它标记的反应成分中纯化出来。

在小体积的7％SDS,0.5M NaPO₄,PH7.4中以1,000,000cpm/ml的浓度将标记的探针与滤膜在65℃杂交过夜。

之后，抽干探针溶液，用0.5×SSC,0.1％SDS在室温和60℃各洗滤膜2次，然后干燥滤膜并用增感屏在-70℃曝光滤膜过夜。放射自显影显示在所有16种组织中均检测到TNFδ的mRNA，其中心脏中有最高表达，其次是胎盘和肾。

实施例4人TNFδ或TNFε的基因治疗表达

从一个患者经皮肤活检获得成纤维细胞，将得到的组织置于组织培养基中并分成小块。将小块组织置于组织培养瓶的湿表面上，每瓶放置约10块。将瓶头朝下盖紧并室温过夜，室温24小时后，倒转瓶，组织块仍固着在瓶的底部，加入新鲜培养基(例如Ham’sF12培养基，加10％FBS，青霉素和链霉素)。然后在37℃培养组织约1周，之后加入新鲜培养基并每隔几天更换一次。再培养2周后出现了成纤维细胞单层，将单层胰酶化并量入大瓶中。

用限制酶消化用于基因治疗的载体以克隆待表达的片段，用小牛肠磷酸酶处理消化的载体以防止自连。在琼脂糖凝胶上分级分离去磷酸化的线性载体并纯化。

分离能表达活性TNFδ或TNFε的cDNA，如果需要，修饰片段的末端以克隆进载体。例如，可用DNA聚合酶处理5’突出以平末端化，3’突出可用S1核酸酶除去。可用T4 DNA连接酶将接头连接至平末端。

将等量的Moloney鼠白血病病毒线性骨架和TNFδ或TNFε片段混合并用T4 DNA连接酶连接，用连接混合物转化大肠杆菌，然后将细菌涂布含卡那霉素的琼脂上。卡那霉素表型和限制分析证实载体中已正确插入了基因。

在含10％小牛血清(CS)，青霉素和链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)中将包装细胞在组织培养物中培养至铺满密度。经标准技术将含TNFδ或TNFε基因的载体导入到包装细胞中。从现称为生产细胞的包装细胞中收集含TNFδ或TNFε基因的感染性病毒颗粒。

向生产细胞中加入新鲜培养基，培养一段合适时间后从铺满的生产细胞的平板收集培养基。将含感染性病毒颗粒的培养基过滤通过Millipore滤膜以除去脱落的生产细胞，然后用过滤的培养基感染成纤维细胞。从成纤维的亚铺满板中除去培养基并迅速用过滤的培养基替换。可将Polybrene(Aldrich)包括进培养基中以促进转导。适当保温后，除去培养基并用新鲜培养基替换。如果病毒滴度高，则几乎所有成纤维细胞均被感染而不需筛选。如果滴度低，则需要使用带选择标记如neo或his的反转录病毒载体以选择出转导细胞用于扩增。

然后工程化的成纤维细胞可以注射进大鼠，单独注射或在微载体珠如cytodex3株上生长至铺满后注射。注射的成纤维细胞产生TNFδ或TNFε产物，蛋白的生物学功能被给予宿主。

应了解的是本发明可以以异于上述描述和实施例所述的方式进行实施。根据上述教导可有各种改进和变化，因此其均在所附权利要求的范围内。

Claims (30)

1、一种分离的多核苷酸，包括与选自如下一组的成员具有至少70％相同性的多核苷酸，所述的组为：

(a)编码包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)编码包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(c)编码包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸的多肽的多核苷酸；

(d)与(a)、(b)或(c)的多核苷酸互补的多核苷酸；以及

(e)包含(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸的至少15个碱基的多核苷酸。

2、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。

3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。

4、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是基因组DNA。

5、权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸的多肽。

6、权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸的多肽。

7、权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO:4的氨基酸的多肽。

8、权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO:4的第1-188位氨基酸的多肽。

9、一种分离的多核苷酸，包括与选自如下一组的成员具有至少70％相同性的多核苷酸，所述的组为：

(a)编码具有由ATCC保藏号97377所含的人cDNA表达的氨基酸序列的成熟多肽的多核苷酸；

(b)编码具有由ATCC保藏号97457所含的人cDNA表达的氨基酸序列的成熟多肽的多核苷酸；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸；以及

(d)包含(a)、(b)或(c)的多核苷酸的至少15个碱基的多核苷酸。

10、权利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1的第447-1717位核苷酸。

11、权利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1的第332-1717位核苷酸。

12、权利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO:3的第1-564位核苷酸。

13、一种包括权利要求2的DNA的载体。

14、一种包括权利要求13的载体的宿主细胞。

15、一种用于生产多肽的方法，包括从权利要求14的宿主细胞表达由所述的DNA编码的多肽。

16、一种用于生产细胞的方法，包括用权利要求12的载体基因工程化所述的细胞，从而表达由载体中所含的人cDNA编码的多肽。

17、一种多肽，包括选自如下一组的成员：

(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；

(b)包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸的多肽；

(c)包括SEQ ID N0:4的第1-188位氨基酸的多肽；

以及

(d)与(a)、(b)或(c)的多肽具有至少70％相同性的多肽。

18、权利要求17的多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO:2的第1-233位氨基酸。

19、权利要求17的多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸。

20、权利要求17的多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO:4的第1-188位氨基酸。

21、一种抑制权利要求17的多肽的活化的化合物。

22、一种治疗需要TNFδ的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求17的多肽。

23、一种治疗需要TNFε的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求17的多肽。

24、权利要求22的方法，其中治疗有效量的多肽是通过向患者提供编码所述多肽的DNA并在体内表达所述多肽而给予。

25、权利要求23的方法，其中治疗有效量的多肽是通过向患者提供编码所述多肽的DNA并在体内表达所述多肽而给予。

26、一种治疗需要抑制TNFδ多肽的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求21的化合物。

27、一种治疗需要抑制TNFε多肽的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求21的化合物。

28、一种诊断与权利要求17的多肽的表达不足相关的疾病或疾病易感性的方法，包括确定在编码所述多肽的核酸序列中的突变。

29、一种诊断方法，包括分析来自宿主的样品中是否存在权利要求17的多肽。

30、一种鉴定与权利要求17的多肽结合并抑制该多肽的活化的化合物的方法，包括

将在其表面表达所述多肽的受体的细胞与分析学可检测的TNFδ多肽以及一种化合物在允许与受体结合的条件下接触，所述的受体与能够提供应答化合物与所述受体结合的可检测信号的第二种组分相连；以及

通过检测从TNFδ与受体的相互作用产生的信号的不存在而确定是否该化合物结合受体并抑制受体。

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