PL198934B1

PL198934B1 - Zastosowanie przeciwciała swoistego wobec rozpuszczalnego BAFF lub aktywnego fragmentu przeciwciała i zastosowanie rozpuszczalnego BAFF lub jego aktywnego fragmentu

Info

Publication number: PL198934B1
Application number: PL349772A
Authority: PL
Inventors: Jeffrey Browning; Christine Ambrose; Fabienne Mackay; Jurg Tschopp; Pascal Schneider
Original assignee: Apoxis Sa; Biogen Idec Inc
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2008-08-29
Also published as: DK1415659T3; SK10442001A3; HK1040628A1; IL144202A0; JP2014141527A; SK286665B6; MXPA01007464A; PL349772A1; DE60004635D1; HUP0105283A2; EP1146892B1; EP2298332A1; IL200498A0; AU762839B2; PT1146892E; NZ513284A; TR200102147T2; EP1415659B1; JP2012087145A; EP1415659A1

Abstract

Wynalazek dotyczy zastosowa n przeciwcia la swoistego wobec rozpuszczalnego BAFF lub ak- tywnego fragmentu przeciwcia la do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby autoimmunizacyjnej lub do leczenia zaburzenia rozrostowego uk ladu ch lonnego limfocytów B, oraz zastosowania rozpuszczalnego BAFF lub jego aktywnego fragmentu do wytwarzania kompozycji do leczenia choroby immunosupresyjnej. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zastosowania przeciwciała swoistego wobec rozpuszczalnego BAFF lub aktywnego fragmentu przeciwciała i zastosowanie rozpuszczalnego BAFF lub jego aktywnego fragmentu.

Niniejszy wynalazek dotyczy stosowania BAFF, czynnika aktywującego limfocyty B należącego do rodziny czynnika martwicy nowotworów i czynników go blokujących albo do stymulacji, albo do hamowania ekspresji limfocytów B i immunoglobulin. To białko i jego receptor mogą być przydatne w zastosowaniach przeciwnowotworowych i/lub innych zastosowaniach immunoregulacyjnych jak i w zastosowaniach do leczenia zaburzeń immunosupresyjnych, takich jak HIV. W szczególności, BAFF i czynniki go blokujące mogą odgrywać rolę w rozwoju nadciśnienia i pokrewnych schorzeń. Co więcej, komórki transfekowane genem dla BAFF mogą być przydatne w terapii genowej do leczenia guzów, chorób autoimmunizacyjnych lub odziedziczonych chorób genetycznych, w których biorą udział limfocyty B. Czynniki blokujące, takie jak przeciwciała swoiste w stosunku do BAFF lub jego aktywnego fragmentu mogą także mieć zastosowania immunoregulacyjne. Rozważane jest zastosowanie BAFF jako stymulatora limfocytów B w chorobach z supresją odporności obejmujące na przykład zastosowania u pacjentów otrzymujących przeszczepy narządów (tzn. przeszczep szpiku) jak i u osób wracają cych do zdrowia po terapii raka w celu stymulacji produkcji limfocytów B. Rozważ ane jest również zastosowanie BAFF jako adiuwanta i lub kostymulatora, aby zwiększyć lub przywrócić poziomy limfocytów B do poziomów w przybliżeniu normalnych.

Cytokiny pokrewne do czynnika martwicy nowotworów (TNF) są mediatorami obrony gospodarza i regulacji immunologicznej. Członkowie tej rodziny istnieją w postaciach zakotwiczonych w błonie, działając miejscowo przez kontakt komórka-komórka lub jako wydzielane białka zdolne do dyfuzji do bardziej odległych celów. Równoległa rodzina receptorów sygnalizuje obecność tych cząsteczek prowadząc do inicjacji śmierci komórek lub proliferacji komórek i różnicowania do tkanki docelowej.

Obecnie rodzina ligandów i receptorów TNF ma przynajmniej 11 znanych par receptor-ligand, obejmujących: TNF:TNF-R; LT-a:TNF-R; LT-a/e:LT-e-R; FasL:Fas; CD40L:CD40; CD30L:CD30;

CD27L:CD27:OX40L:OX40 i 4-1BBL:4-1BB. Sekwencje DNA kodujące te ligandy mają zaledwie około 25% do około 30% identyczności w nawet najbardziej spokrewnionych przypadkach, choć podobieństwo aminokwasów wynosi około 50%.

Definiująca cecha tej rodziny receptorów cytokin znajduje się w bogatej w cysteinę domenie zewnątrzkomórkowej pierwotnie wykazanej przez klonowanie molekularne dwóch odrębnych receptorów TNF. Ta rodzina genów koduje glikoproteiny charakterystyczne dla białek transmembranowych Typu I z zewnątrzkomórkową domeną wiążącą ligand, pojedynczym regionem łączącym błonę i regionem cytoplazmatycznym biorącym udział w aktywacji funkcji komórkowych. Region wiążący ligand bogaty w cysteinę wykazuje ściśle powiązaną mostkami disiarczkowymi domenę rdzenia, która, w zależności od konkretnego członka rodziny, jest powtórzona wiele razy. Większość receptorów ma cztery domeny, choć może być ich zaledwie trzy albo aż sześć.

Białka z rodziny ligandów TNF charakteryzują się krótkim N-końcowym odcinkiem normalnie krótkich hydrofilowych aminokwasów, często zawierającym kilka reszt lizyny lub argininy, uważanych za służące jako sekwencje hamujące transfer. Następnie obecny jest region transbłonowy i region zewnątrzkomórkowy o zmiennej długości, który rozdziela C-końcową domenę wiążącą receptor od błony. Region ten czasem jest określany jako szkieletowy. C-końcowy region wiążący obejmuje większą część białka, i często, choć nie zawsze, zawiera miejsca glikozylacji. Geny te są pozbawione klasycznych sekwencji sygnałowych charakterystycznych dla białek błonowych typu I, białek błonowych typu II z C-końcem położonym poza komórką, i krótką domeną N-końcową leżącą w cytoplazmie. W niektórych przypadkach, np. TNF i LT-α wcześnie w czasie obróbki białka może zajść cięcie w regionie szkieletowym i ligand wówczas znajduje się przede wszystkim w formie wydzielanej. Jednak większość ligandów istnieje w postaci błonowej, pośrednicząc w lokalnej sygnalizacji.

Struktura tych ligandów została dobrze zdefiniowana przez analizy krystalograficzne TNF, LT-α, i CD40L. Zarówno TNF jak i limfotoksyna-a(LT-a) są ułożone w kanapkę (ang. sandwich) z dwóch antyrównoległych pofałdowanych arkuszy β z topologią „zwiniętej galaretki lub klucza greckiego. Odchylenie rms między resztami Ca i β wynosi 0,61 C, sugerując wysoki stopień podobieństwa w ich topologii molekularnej. Cechą strukturalną wynikającą z badań molekularnych CD40L, TNF i LT-α jest zdolność do składania się w kompleksy oligomeryczne. Nieodłączną cechą struktury oligomerycznej jest tworzenie miejsca wiązania receptora na styku między sąsiadującymi podjednostkami tworząc

PL 198 934 B1 ligand multiwalentny. Wykazano za pomocą analizy ich struktur krystalicznych, że czwartorzędowe struktury TNF, CD40L i LT -α występują jako trimery. Wiele z aminokwasów konserwowanych między różnymi ligandami jest w odcinkach szkieletowej arkusze β. Jest prawdopodobne, że podstawowa struktura kanapkowa jest zachowywana we wszystkich tych cząsteczkach, ponieważ części tych sekwencji szkieletowych są konserwowane u różnych członków rodziny. Struktura czwartorzędowa może być też utrzymywana, ponieważ prawdopodobnie konformacja podjednostek pozostanie podobna.

Członków rodziny TNF najlepiej można opisać jako główne przełączniki w układzie odpornościowym kontrolujące zarówno przeżycie jak i zróżnicowanie komórek. Obecnie tylko TNF i LT-α są znane jako wydzielane cytokiny w przeciwieństwie do pozostałych przeważnie zakotwiczonych w błonie członków rodziny TNF. Podczas gdy forma błonowa TNF została dobrze scharakteryzowana i zapewne pełni unikalne role biologiczne, wydzielany TNF działa jako ogólny alarm sygnalizujący do komórek bardziej odległych od miejsca wydarzenia wywołującego. Tak więc wydzielanie TNF może zamplifikować zdarzenie prowadząc do dobrze opisanych zmian w wyściółce naczyń i stanu zapalnego komórek. Przeciwnie, członkowie rodziny związani z błonami przesyłają sygnały przez receptory typu TNF tylko do komórek będących w bezpośrednim kontakcie. Na przykład, limfocyty T dostarczają pomocy z udziałem CD40 tylko tym komórkom B, które są wprowadzane w bezpośredni kontakt przez odpowiednie interakcje TCR. Podobne ograniczenia kontaktu komórka-komórka w zdolności do indukowania śmierci komórek dotyczą dobrze badanego systemu Fas.

Wydaje się, że można segregować ligandy TNF w trzy grupy na podstawie ich zdolności do indukcji śmierci komórkowej. Po pierwsze, TNF, ligand Fas i TRAIL mogą wydajnie indukować śmierć komórkową w wielu liniach i ich receptory najprawdopodobniej posiadają dobre kanoniczne domeny śmierci. Przypuszczalnie ligand DR-3 (TRAMP/WSL-1) także należałby do tej kategorii. Następnie są ligandy, które wywołują słabszy sygnał śmierci ograniczony do kilku typów komórek i przykładami tej klasy są TWEAK, ligand CD30 i LTa1b2. Jak grupa ta może wywoływać śmierć komórek w nieobecności kanonicznej domeny śmierci jest interesującym pytaniem i sugeruje, że istnieje słabszy mechanizm sygnalizacji śmierci. W końcu, są ci członkowie, którzy nie potrafią skutecznie przekazać sygnału śmierci. Prawdopodobnie wszystkie grupy mogą mieć działanie antyproliferacyjne na pewne typy komórek w efekcie indukowania różnicowania komórek np. CD40. Funakoshi i wsp. (1994).

Rodzina TNF rozrosła się bardzo znacznie w ostatnich latach i obejmuje przynajmniej 11 różnych szlaków sygnalizacji związanych z regulacją układu immunologicznego. Szeroko rozpowszechnione wzory ekspresji TWEAK i TRAIL wskazują, że jeszcze pozostali do wykrycia inni członkowie tej rodziny o różnorodnych funkcjach. Ten aspekt został szczególnie podkreślony ostatnio przy odkryciu dwóch receptorów, które wpływają na zdolność replikacji wirusa mięsaka Rousa i wirusa opryszczki jak i przez historyczne obserwacje, że TNF ma aktywność antywirusową, a wirusy ospy kodują przynętowe receptory TNF. Brojatsch i wsp. (1996); Montgomery i wsp. (1996); Smith i wsp. (1994), 76 Cell 959-962; Vassalli i wsp. (1992), 10 Immunol. 411-452.

TNF jest mediatorem wstrząsu septycznego i kacheksji i bierze udział w regulacji rozwoju komórek hematopoetycznych. Wydaje się odgrywać ważną rolę jako mediator zapalenia i obrony przeciwko zakażeniom bakteryjnym, wirusowym i pasożytniczym, a także ma aktywność przeciwnowotworową. TNF jest również włączony w kilka różnych chorób autoimmunizacyjnych. TNF może być produkowany przez kilka typów komórek w tym makrofagi, fibroblasty, limfocyty T i komórki naturalnych zabójców. TNF wiąże się z dwoma różnymi receptorami, z których każdy działa przez specyficzne wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnalizujące, z czego wynika różne działanie TNF. TNF może istnieć albo jako forma związana z błoną albo jako rozpuszczalna wydzielana cytokina.

LT-α ma wiele aktywności wspólnych z TNF, tzn. wiązanie z receptorami TNF, ale w odróżnieniu od TNF wydaje się być wydzielana przede wszystkim przez aktywowane limfocyty T i niektóre guzy β-limfoblastoidalne. Heteromeryczny kompleks LT-α i LT-β jest kompleksem związanym z błoną, który wiąże się z receptorem LT-β. System LT (LT i LT-R) wydaje się brać udział w rozwoju obwodowych narządów limfoidalnych, ponieważ genetyczna dysrupcja LT-β prowadzi do dezorganizacji limfocytów T i B w śledzionie i braku węzłów chłonnych. System LT-β także bierze udział w śmierci komórek niektórych linii komórkowych gruczolakoraka.

Fas-L, inny członek rodziny TNF, jest wyrażany przede wszystkim na aktywowanych limfocytach T. Indukuje śmierć komórek niosących jego receptor, w tym komórek guza i komórek zakażonych przez HIV, za pomocą mechanizmu znanego jako programowana śmierć komórki czyli apoptoza. Co więcej, niedobory Fas albo FasL mogą doprowadzić do zaburzeń limfoproliferacyjnych potwierdzając rolę systemu Fas w regulacji odpowiedzi immunologicznych. System Fas także bierze udział w uszko4

PL 198 934 B1 dzeniach wątroby wynikających z przewlekłego zakażenia wirusem zapalenia wątroby i autoimmunizacji u pacjentów zakażonych HIV. System Fas także bierze udział w niszczeniu limfocytów T u pacjentów z HIV. TRAIL, inny członek tej rodziny, też wydaje się brać udział w śmierci szerokiego zakresu transformowanych linii komórkowych o różnym pochodzeniu.

CD40-L, inny członek rodziny TNF, jest wyrażany na limfocytach T i indukuje regulację limfocytów B niosących CD40. Co więcej, zmiany w genie CD40-L dają chorobę znaną jako zespół hiper-IgM sprzężony z X. System CD40 także bierze udział w różnych chorobach autoimmunizacyjnych i wiadomo, że CD40-L ma właściwości antywirusowe. Choć system CD40 bierze udział w ratowaniu apoptotycznych limfocytów B, w komórkach nieimmunologicznych indukuje apoptozę. Wielu dodatkowych limfocytowych członków rodziny TNF także bierze udział w kostymulacji.

Ogólnie, członkowie rodziny TNF odgrywają podstawowe funkcje regulacyjne w kontroli układu immunologicznego i aktywacji ostrych układów obronnych gospodarza. Ze względu na obecny postęp w manipulowaniu członkami rodziny TNF w celach korzyści terapeutycznych, jest prawdopodobne, ż e członkowie tej rodziny mogą dostarczyć unikalnych środków do zwalczania chorób. Niektóre ligandy tej rodziny mogą bezpośrednio indukować apoptotyczną śmierć wielu transformowanych komórek np. LT, TNF, ligand Fas i TRAIL. Nagata (1997) 88 Cell 355-365. Aktywacja receptora Fas i prawdopodobnie TNF i CD30, może indukować śmierć komórkową w nietransformowanych limfocytach, co może odgrywać rolę immunoregulacyjną. Amakawa i wsp. (1996) 84 Cell 551-562; Nagata (1997) 88 Cell 355-365; Sytwu i wsp. (1996); Zheng i wsp. (1995) 377 Nature 348-351. Na ogół śmierć jest wywoływana po agregacji domen śmierci, które leżą po cytoplazmatycznej stronie receptora TNF. Domena śmierci steruje montowaniem różnorodnych składników sygnału transdukcji, co powoduje aktywację kaskady kaspaz. Nagata (1997) 88 Cell 355-365. Niektóre receptory są pozbawione typowych domen śmierci np. receptor LTb i CD30 (Browning i wsp. (1996); Lee i wsp. (1996)), jednak mogą indukować śmierć komórkową, chociaż znacznie słabiej. Jest prawdopodobne, że te receptory działają przede wszystkim by zaindukować różnicowanie komórek, a śmierć jest konsekwencją zaburzeń w niektórych transformowanych liniach komórkowych, choć obraz ten jest niejasny i badania nad myszą bez CD30 sugerują rolę śmierci w negatywnej selekcji w grasicy. Amakawa i wsp. (1996) 84 Cell 551-562. Przeciwnie, sygnalizacja przez inne szlaki, takie jak CD40 jest wymagana by utrzymać przeżycie komórek. Tak więc istnieje potrzeba identyfikacji i scharakteryzowania dodatkowych cząsteczek, które są członkami rodziny TNF i w ten sposób dostarczenia dodatkowych środków zwalczania choroby i manipulacji układem immunologicznym.

Charakteryzujemy właściwości funkcjonalne BAFF z rodziny cytokin TNF. Wydaje się, że nowy ligand, określony jako BAFF (czynnik aktywujący limfocyty B należący do rodziny TNF) jest wyrażany przez limfocyty T i komórki dendrytyczne w celu kostymulacji limfocytów B i może więc odgrywać ważną rolę w kontroli funkcji limfocytów B. Dodatkowo, wytworzyliśmy myszy transgeniczne nadwyrażające BAFF pod kontrolą promotora specyficznego dla wątroby. Te myszy mają nadmierne ilości dojrzałych limfocytów B, spontaniczne reakcje ośrodka rozmnażania, wydzielają autoprzeciwciała i mają wysokie ilości komórek plazmatycznych we wtórnych narzą dach chł onnych i odkł adanie Ig w nerce.

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała swoistego wobec rozpuszczalnego BAFF lub jego aktywnych fragmentu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób autoimmunizacyjnych.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała swoistego wobec rozpuszczalnego BAFF lub aktywnego fragmentu przeciwciała do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzenia rozrostowego układu chłonnego limfocytów B.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie rozpuszczalnego BAFF lub jego aktywnego fragmentu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby immunosupresyjnej, korzystnie wywołanej przez HIV.

Cząsteczki związane z BAFF, takie jak ujawnione w tym wynalazku, mogą być pożyteczne w leczeniu chorób autoimmunizacyjnych, zaburzeń związanych z proliferacją i dojrzewaniem komórek B, regulacją BAFF i zapaleniami.

Dodatkowe cechy i zalety wynalazku będą przedstawione w dalszej części opisu bądź będą z niej wynikać. Cele i inne zalety wynalazku mogą być realizowane i osiągnięte sposobami konkretnie wskazanymi w opisie i zastrzeżeniach, a także na załączonych rysunkach.

BAFF lub jego aktywny fragment stymuluje wzrost limfocytów B. Polipeptyd może być stosowany sam lub z ligandem CD40 lub przeciwciałem anty-mysim. BAFF lub jego aktywne fragmenty stymuPL 198 934 B1 lują wzrost i dojrzewania limfocytów B indukowane przez komórki dendrytyczne. I w tym przypadku polipeptyd może być stosowany sam lub z ligandem CD40 lub przeciwciałami anty-μ.

Czynniki blokujące BAFF stosowano do hamowania wzrostu limfocytów B i wydzielania immunoglobulin. Te czynniki są przeciwciałami specyficznymi wobec BAFF, przeciwciałami specyficznymi wobec receptora BAFF.

BAFF lub jego aktywny fragment wywołują odpowiedź immunologiczną przez wpływanie na wzrost i/lub dojrzewanie limfocytów B i wydzielanie immunoglobulin.

Rozpuszczalne konstrukty zawierające BAFF mogą być stosowane bezpośrednio do wywoływania zdarzeń farmakologicznych wywoływanych przez BAFF. Takie zdarzenia mogą mieć pożyteczne korzyści terapeutyczne w leczeniu raka, guzów lub manipulacji układem immunologicznym w celu leczenia chorób immunologicznych.

W innych wykonaniach wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciał skierowanych przeciwko BAFF do wytwarzania leku do leczenia raka lub manipulacji układem immunologicznym w celu leczenia chorób immunologicznych.

Farmaceutyczne preparaty wytworzone zgodnie z zastosowaniem według wynalazku mogą ewentualnie zawierać dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, adiuwanty, wypełniacze lub inne kompozycje farmaceutyczne, i mogą być podawane w licznych postaciach lub drogami dobrze znanymi w tej dziedzinie.

Należy rozumieć, że zarówno uprzedni opis ogólny jak i następujący opis szczegółowy stanowią przykład i wyjaśnienie, i mają na celu dostarczenie dodatkowych wyjaśnień zastrzeganego wynalazku.

Załączone rysunki są włączone w celu lepszego zrozumienia wynalazku i ilustrują kilka wykonań wynalazku i razem z opisem służą do wyjaśnienia zasad wynalazku.

Opis rysunków

Na Figurze 1(A) przedstawiono przewidywaną sekwencję aminokwasów ludzkiego [Sekw. Id. Nr 1] i mysiego BAFF [Sekw. Id. Nr 2]. Wskazane są przewidywana domena transbłonowa (TMD, linia przerywana), potencjalne miejsca związane z N-glikozylacją (gwiazdki) i naturalne miejsce obróbki ludzkiego BAFF (strzałka). Podwójna linia powyżej hBAFF wskazuje sekwencję uzyskaną za pomocą degradacji Edmana obrabianej formy BAFF. (B) Przedstawia porównanie sekwencji zewnątrzkomórkowego białka BAFF [Sekw. Id. Nr 3] i niektórych członków rodziny ligandów TNF [Sekw. Id. Nr 4; (hAPRIL); Sekw. Id. Nr:5 (hTNF alfa); Sekw. Id. Nr:6 (hFasL); Sekw. Id. Nr:7 (hLTalfa); Sekw. Id. Nr :8 (hRANKL)]. Identyczne i homologiczne reszty są przedstawione odpowiednio jako czarne i cieniowane obszary. (C) Przedstawia dendrogram ligandów rodziny TNF.

Na Figurze 2 schematycznie przedstawiono zrekombinowane konstrukty BAFF. Rozpuszczalne rekombinowane BAFF zaczynające się od Leu83 i Gln136 są wyrażane w postaci fuzji z N-końcowym znacznikiem Flag i linkerem z 6 aminokwasów. Długa postać jest cięta między Arg133 i Ala134 (strzałka) w limfocytach 293 T, z wytworzeniem obrobionej formy BAFF. Asn124 i Asn242 należą do miejsc zgodności N-glikozylacji. N-połączony glikan obecny na Asn124 jest przedstawiony jako Y. TMD, domena transbłonowa. (B) Działanie N-glikanazą peptydową F (PNGaza) na zrekombinowany BAFF. Zatężone supernatanty zawierające znakowane Flag BAFF i APRIL poddano deglikozylacji i analizowano techniką Western blotting stosując poliklonalne przeciwciała anty-BAFF lub anty-Flag M2, jak wskazano. Wszystkie prążki oprócz obrobionych BAFF także reagowały z anty-Flag M2 (dane nieprzedstawione).

(C) BAFF pełnej długości jest obrabiany do formy rozpuszczalnej. Komórki 293T transfekowano przejściowo BAFF pełnej długości. Transfekowane komórki i ich zatężone supernatanty analizowano techniką Western blotting stosując poliklonalne przeciwciała anty-BAFF. Supernatanty odpowiadające 10x ilości komórek nakładano na żel. (D) Chromatografia wykluczania ze względu na wielkość rozpuszczalnego BAFF na Superdex-200. Zatężone supernatanty zawierające rozpuszczalny BAFF/krótki frakcjonowano na kolumnie Superdex-200 i wyeluowane frakcje analizowano za pomocą techniki Western blotting stosując przeciwciało anty-Flag M2. Pozycje migracji markerów masy cząsteczkowej (w kDa) wskazano z lewej strony dla SDS-PAGE i na górze figury dla chromatografii wykluczania ze względu na wielkość.

Na Figurze 3 przedstawiono ekspresję BAFF (A) bloty z techniki Northern (2 μg poliA+ RNA na ścieżkę) różnych tkanek ludzkich hybrydyzowano z antysensownym mRNA dla BAFF. (B) Amplifikacja BAFF, łańcucha alfa receptora IL-2 i aktyny z RNA oczyszczonych z krwi limfocytów T za pomocą odwrotnej transkryptazy w różnych punktach czasowych aktywacji PHA, E-rozetujące ujemne komórki krwi (limfocyty B i monocyty), uzyskane in vitro niedojrzałe komórki dendrytyczne, komórki 292 i komórki 292 sterylnie transfekowane BAFF pełnej długości (293-BAFF). Amplifikacje kontrolne przepro6

PL 198 934 B1 wadzono pod nieobecność dodanego cDNA. Łańcuch alfa receptora IL-2 amplifikowano jako marker aktywacji limfocytów T.

Na Figurze 4 przedstawiono wiązanie BAFF do dojrzałych limfocytów B. (A) Wiązanie rozpuszczalnego BAFF do linii komórkowych BJAB i Jurkat, i do oczyszczonych komórek CD19⁺ krwi pępowinowej. Komórki barwiono wskazaną ilością (w ng/50 ul) Flag-BAFF i analizowano metodą cytometrii przepływowej. (B) Wiązanie rozpuszczalnego BAFF do PBL. PBL barwiono anty-CD8-FITC lub anty-CD19-FITC (oś pozioma) i FLAG-BAFF plus M2-biotyna i awidyna-PE (oś pionowa). Flag-BAFF pominięto w kontrolach.

Na Figurze 5 przedstawiono kostymulację proliferacji limfocytów B przez BAFF. (A) Ekspresja powierzchniowa BAFF w stabilnie transfekowanych komórkach 293. Komórki 293-BAFF i 293 typu dzikiego barwiono mAb 43.9 anty-BAFF i analizowano metodą cytometrii przepływowej. (B) Kostymulacja PBL przez komórki 293-BAFF. PBL (10⁵/studzienkę) inkubowano z 15000 komórek 293 (293 typ dziki lub 293 BAFF) utrwalonych glutaraldehydem w obecności lub nieobecności przeciwciała przeciw receptorowi limfocytów B (anty-μ). Same utrwalone komórki 293 obejmowały 100 cpm. (C) Zależna od dawki kostymulacja proliferacji PBL przez rozpuszczalny BAFF w obecności anty-μ. Proliferację określono po 72 godzinach inkubacji przez włączanie [³H]-tymidyny. Kontrole obejmowały komórki traktowane samym BAFF, denaturowanym termicznie BAFF lub z przeciwciałem sparowanym pod względem nieistotnego izotypu zamiast anty-μ. (D) Porównanie (ko)stymulujących działań sCD40L i sBAFF na proliferację PBL. Eksperyment przeprowadzono jak opisano w panelu C. (E) BAFF kostymuluje wydzielanie Ig przez uprzednio aktywowane ludzkie limfocyty B. Oczyszczone limfocyty B CD19⁺ aktywowano przez hodowlę razem z limfocytami T EL-4 i aktywowanymi supernatantami limfocytów T przez 5-6 dni, następnie izolowano je i hodowano przez dalsze 7 dni w obecności samego podłoża (-) lub zawierającego 5% supernatanty aktywowanych limfocytów T (T-SUP) lub mieszaninę cytokin (IL-2, IL-4, IL-10). Kolumny reprezentują średnie stężenia Ig dla hodowli z lub bez 1 μg/ml BAFF. Średnie ± SD jako wzrost pofałdowania wynosiły 1,23 ± 0,11 dla samego podłoża, 2,06 ± 0,18 z supernatantami limfocytów T (4 doświadczenia) i 1,45 ± 0,06 z IL-2, IL-4 i IL-10 (2 doświadczenia). Doświadczenia przeprowadzono z krwią obwodową (3 doświadczenia) lub komórkami B krwi pępowinowej (jedno doświadczenie; 2,3-krotne zwiększenie z supernatantami limfocytów T, 1,5-krotne zwiększenie z IL-2, IL-4 i IL-10). (F) Krzywa dawka-odpowiedź dla wpływu BAFF w hodowlach z supernatantami limfocytów T, jak pokazano na panelu D. Średnia ± SD z 3 doświadczeń.

Na Figurze 6 pokazano, że BAFF działa jako kofaktor w proliferacji limfocytów B. Mierzono proliferację ludzkich PBL samych (500 cpm), w obecności samego ligandu BAFF, w obecności samego anty-mysiego(mu) kozy, i z ligandem BAFF i anty-mu razem. Kombinacja zarówno anty-mu i BAFF znacząco podwyższyła proliferację PBL w miarę wzrostu stężenia BAFF, sugerując działanie BAFF jako kofaktora.

Na Figurze 7 przedstawiono zwiększone ilości limfocytów B u myszy BAFF Tg.

(A) Zwiększona liczba limfocytów u myszy BAFF Tg. Na wykresie porównano 12 kontrolnych myszy z tego samego miotu (lewy panel) z 12 myszami BAFF Tg (prawy panel). Zliczenia limfocytów są przedstawione jako kółka, natomiast granulocytów (w tym komórek obojętnochłonnych, eozynofilnych i zasadochłonnych) jako romby.

(B) Zwiększone proporcje limfocytów B w PBL od u myszy BAFF Tg. PBL barwiono zarówno anty-B220-FITC jak i anty-CD4-PE do analizy FACS i bramkowano na żywych komórkach stosując rozpraszanie czołowe/boczne. Wskazano procenty komórek CD4 i B220 dodatnich. Przedstawiono jedną kontrolną mysz (z lewej) i dwie myszy BAFF Tg (z prawej), a wyniki są reprezentatywne dla 7 zwierząt analizowanych w każdej grupie.

(C) Analiza FACS stosunku limfocytów B do T w PBL. Różnica między zwierzętami kontrolnymi i myszami BAFF Tg w (A) i (C) była statystycznie istotna (p<0,001).

(D) Zwiększona ekspresja MHC klasy II na limfocytach B w PBL od myszy BAFF Tg. Ekspresję MHC klasy II analizowano za pomocą FACS.

(E) Zwiększona ekspresja Bcl-2 w limfocytach B z PBL od myszy BAFF Tg. Ekspresję Bcl-2 mierzono za pomocą barwienia wewnątrzcytoplazmatycznego i komórki analizowano za pomocą FACS.

Zarówno w (D) i (E) żywe komórki bramkowano na rozproszeniu czołowym/bocznym. Przedstawiono cztery myszy kontrolne z tego samego miotu (białe słupki) i 4 myszy BAFF Tg, które są reprezentatywne dla przynajmniej 12 zwierząt analizowanych z każdej grupy. MFI: średnia intensywności fluorescencji. Różnica między zwierzętami kontrolnymi i myszami BAFF Tg była statystycznie istotna (P<0,005).

PL 198 934 B1 (F) Zwiększona ekspresja efektorowych limfocytów T u myszy BAFF Tg. PBL barwiono anty-CD4-cytochromem, anty-CD44-FITC i anty-L selektyną-PE. Pokazano komórki bramkowane CD4⁺. Wskazano procenty komórek CD44^hi/L-selektyna^lo. Przedstawiono jedną mysz kontrolną (z lewej) i dwie myszy BAFF Tg (z prawej), a wyniki są reprezentatywne dla 8 zwierząt analizowanych z każ dej grupy.

Na Figurze 8 przedstawiono zwiększone przedziały limfocytów B w śledzionie, ale nie szpiku kostnym myszy BAFF Tg.

(A) Barwienie FACS dla dojrzałych limfocytów B przy użyciu zarówno anty-IgM-FITC jak i anty-B220-PE, w śledzionie (panel górny), szpiku kostnym (panel środkowy) i MLN (panel dolny). Wskazano procenty dojrzałych komórek B220+/IgM+.

(B) Barwienie FACS dla komórek pre-B (B220+/CD43-) i komórek proB (B220+/CD43+) w szpiku kostnym przy użyciu anty-CD43-FITC, oraz anty-B220-cytochrom i anty-IgM-PE równocześnie. Pokazano komórki bramkowane na populacji IgM ujemnej. Wskazano procenty komórek pre-B (B220+/CD43-) i proB (B220+/CD43+).

Dla wszystkich figur (A i B) przedstawiono jedną kontrolną mysz (z lewej) i dwie myszy BAFF Tg (z prawej), a wyniki są reprezentatywne dla 7 zwierząt analizowanych z każdej grupy.

Na Figurze 9 przedstawiono zwiększone poziomy Ig, RF i CIC u myszy BAFF Tg.

(A) SDS-PAGE dwóch surowic kontrolnych (-) i 4 surowic od myszy BAFF Tg (+) obok siebie ze wskazaną ilością oczyszczonego IgG myszy jako referencją. Intensywność prążka albuminy jest podobna we wszystkich ścieżkach wskazując, że nałożony na żel materiał jest ekwiwalentny dla każdej próbki. Oparta na teście ELISA analiza całkowitego Ig myszy (B), RF (C) i CIC (D) w surowicach 19 kontrolnych myszy z tego samego miotu (białe słupki) i 21 myszy BAFF Tg (czarne słupki). W nieobecności właściwej kontroli RF, miano (logarytm przy podstawie 2) dla RF jest definiowane jako rozcieńczenie surowicy dające O.D. trzy razy wyższe niż tła. Ilość CIC jest definiowana jako ilość PAP wymagana do generacji O.D. równoważnego, do O.D. uzyskanego z testowaną surowicą. Różnica między zwierzętami kontrolnymi i myszami BAFF Tg była statystycznie istotna (P<0,001 w (B) i (C), P<0,003 w (D)).

Na Figurze 10 przedstawiono obecność autoprzeciwciał przeciwko ssDNA i dsDNA u niektórych myszy BAFF Tg.

(A) Analiza za pomocą ELISA autoprzeciwciał przeciw ssDNA u 19 kontrolnych myszy z tego samego miotu (szare słupki) i 21 myszy BAFF Tg (czarne słupki).

(B) Analiza za pomocą ELISA autoprzeciwciał przeciw ssDNA u 5 kontrolnych myszy z tego samego miotu i 5 zwierząt wykazujących poziomy wykazujących poziomy autoprzeciwciał przeciw ssDNA z (A).

(C) Skrawki parafinowe nerek od myszy kontrolnej (z lewej) i myszy BAFF Tg (z prawej), barwione anty-mysim Ig-HRP kozy. Odkładanie Ig jest pokazane przez brązową barwę. Te obrazy są reprezentatywne dla 6 analizowanych myszy BAFF Tg.

Na Figurze 11 przedstawiono powiększone kępki Peyera u myszy BAFF Tg.

Fotografia kępek Peyera (wskazanych strzałką) na jelicie cienkim kontrolnej myszy (z lewej) i myszy BAFF Tg (z prawej). Ten obrazek jest reprezentatywny dla przynajmniej 12 myszy uśmierconych z każdej grupy. Powiększenie 5x.

Na Figurze 12 przedstawiono przerwaną organizację limfocytów T i B, intensywne reakcje ośrodka rozmnażania, zmniejszoną ilość komórek dendrytycznych i zwiększoną ilość komórek plazmatycznych w śledzionie myszy BAFF Tg. Mysz kontrolną przedstawiono w A, C, E i G, a w B, D, F i H mysz BAFF Tg. Limfocyty B są niebieskie a limfocyty T brązowe (A i B). Ośrodki rozmnażania są pokazane strzałką (C i D). U myszy kontrolnych widać tylko kilka resztkowych ośrodków rozmnażania (C). CD11c dodatnie komórki dendrytyczne są brązowe i pojawiają się w strefie limfocytów T, łącząc kanały i strefę brzeżną (E). Bardzo nieliczne są obecne u myszy BAFF Tg (F). Komórki plazmatyczne dodatnie pod względem syndekanu 1 były tylko wykrywalne w miazdze czerwonej myszy BAFF Tg, ale nie u myszy kontrolnych (G).

Te obrazy są reprezentatywne dla przynajmniej 12 analizowanych myszy BAFF Tg i 12 myszy kontrolnych. Powiększenie jest 100x dla wszystkich obrazów z wyjątkiem C i D, które są 50x. B: pęcherzyk limfocytu B, T: PALS, WP: miazga biała, RP: miazga czerwona.

Na Figurze 13 przedstawiono przerwaną organizację limfocytów T i B, intensywne reakcje ośrodka rozmnażania i dużą liczbę komórek plazmatycznych w MLN myszy BAFF Tg.

PL 198 934 B1

Mysz kontrolną przedstawiono w A, C, E i G, a w B, D, F i H mysz BAFF Tg. Immunocytochemię przeprowadzono jak opisano na Figurze 6. Barwienie limfocytów T i B przedstawiono w A i B, ośrodki rozmnażania w C i D, komórki dendrytyczne w E i F i komórki plazmatyczne w G i H. GC: ośrodek rozmnażania. Powiększenie 100x.

BAFF produkowany przez gospodarzy transformowanych sekwencjami nukleotydowymi jak i natywny BAFF oczyszczany za pomocą procesów znanych w dziedzinie lub wytwarzanych na podstawie znanych sekwencji aminokwasów są użyteczne w wielu zastosowaniach - przeciw rakowi, przeciw guzom i do immunoregulacji. Są też użyteczne w terapii i sposobach nastawionych na inne choroby.

C. BAFF

BAFF jak omówiono powyżej jest członkiem rodziny TNF i jest opisany w zgłoszeniu PCT numer PCT/US98/19037 (WO 99/12964). Białko, jego fragmenty lub homologi mogą mieć szerokie zastosowania terapeutyczne i diagnostyczne.

BAFF jest obecny przede wszystkim w śledzionie i w limfocytach krwi obwodowej, co silnie wskazuje na rolę regulacyjną w układzie odpornościowym. Porównanie sekwencji BAFF z innymi członkami ludzkiej rodziny TNF ujawnia znaczne podobieństwa strukturalne. Wszystkie białka mają wspólnych kilka regionów konserwacji sekwencji w domenie zewnątrzkomórkowej.

Choć precyzyjna trójwymiarowa struktura BAFF nie jest znana, przewiduje się, że jako członek rodziny TNF może mieć wspólne cechy strukturalne z innymi członkami rodziny.

Fragmenty BAFF mogą być wytworzone kilkoma sposobami, np. przez rekombinację, PCR, trawienie proteolityczne czy syntezę chemiczną. Wewnętrzne lub końcowe fragmenty polipeptydu mogą być generowane przez usunięcie jednego lub więcej nukleotydów z jednego lub obu końców kwasu nukleinowego, który koduje polipeptyd. Ekspresja mutagenizowanego DNA produkuje fragmenty polipeptydu.

Fragmenty polipeptydu mogą być też chemicznie syntetyzowane przy użyciu technik znanych w dziedzinie, takich jak konwencjonalna synteza chemiczna na fazie stałej Merrifielda f-moc lub f-boc. Na przykład peptydy i sekwencje DNA mogą być arbitralnie podzielone na fragmenty o pożądanej długości niezachodzące na siebie lub podzielone na zachodzące na siebie fragmenty o pożądanej długości. Takie sposoby, są opisane bardziej szczegółowo poniżej.

Generacja rozpuszczalnych form BAFF.

Rozpuszczalne formy BAFF często mogą skutecznie sygnalizować i wobec tego mogą być podawane jako lek, który obecnie imituje naturalną formę błonową. Jest możliwe, że BAFF są naturalnie wydzielane jako rozpuszczalne cytokiny, jednak jeśli nie, można przekonstruować gen by wymusić wydzielanie. Aby wytworzyć rozpuszczalną wydzielaną formę BAFF, należy usunąć na poziomie DNA regiony N-końcowe transbłonowe i pewną część regionu szkieletowego, i zastąpić je sekwencją liderową typu I lub alternatywnie sekwencją liderową typu II, która pozwoli na wydajne cięcie proteolityczne w wybranym systemie ekspresji. Specjalista może zmieniać ilość zatrzymywanego regionu szkieletowego w konstrukcie ekspresyjnym do sekrecji, aby zoptymalizować zarówno właściwości wiązania receptora i wydajność wydzielania. Na przykład, konstrukty zawierające wszystkie możliwe długości szkieletu, tzn. obcięte na N-końcu, mogłyby być przygotowane tak, żeby powstały białka zaczynające się od aminokwasów 81 do 139. Z tego typu analizy wynikłaby optymalna długość szkieletu.

E. Generacja przeciwciał reagujących z BAFF.

Wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała lub jego aktywnego fragmentu swoiście reagującego z BAFF lub jego receptorami. Surowice przeciw białkom/przeciw peptydom lub przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowane według standardowych protokołów (zobacz na przykład Antibodies: A Laboratory Manual red. Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press:1998). Ssak taki jak mysz, chomik, lub królik może być immunizowany immunogenną częścią peptydu. Techniki nadawania immunogenności białkom lub peptydom obejmują koniugację z nośnikami, lub inne techniki dobrze znane w technice.

Immunogenna część BAFF lub jego aktywnego fragmentu może być podana w obecności adiuwantu. Postęp immunizacji można śledzić przez wykrycie mian przeciwciała w osoczu lub surowicy. Standardowa ELISA lub inne immunooznaczenia mogą być stosowane z immunogenem jako antygenem w celu oceny poziomu przeciwciał.

Przeciwciała są immunospecyficzne dla antygenowych determinant BAFF lub jego receptorów (tzn. antygenowych determinant polipeptydu o Sekw. Id. Nr:2; ta sekwencja jest opisana w zgłoszeniu PCT numer PCT/US98/19037 (WO99/12964) i jest tu włączona w całości) lub blisko spokrewnionego

PL 198 934 B1 ludzkiego lub nie-ludzkiego homologu od ssaka (np. homologiczny w 70, 80 lub 90%, bardziej korzystnie homologiczny w przynajmniej 95%). Przeciwciała anty-BAFF albo anty-receptor ligandu BAFF zasadniczo nie reagują krzyżowo (tzn. reagują specyficznie) z białkiem, które jest np. mniej niż w 80% homologiczne z Sekw. Id Nr:2 lub 6, która jest taka jak opisano w PCT numer zgłoszenia PCT/US98/19037 (W099/12964) i jest korzystnie mniej niż w 90% homologiczne z Sekw. Id Nr:2, która jest taka jak opisano w PCT numer zgłoszenia PCT/US98/19037 (WO99/12964) i jest tu włączona w całości i najbardziej korzystnie mniej niż w 95% homologiczne z Sekw. Id. Nr:2, która jest jak opisano w PCT numer zgłoszenia PCT/US98/19037 (WO99/12964). Przez zasadniczo nie reagują krzyżowo rozumie się, że przeciwciało ma powinowactwo wiązania do niehomologicznego białka, które wynosi mniej niż 10%, bardziej korzystnie mniej niż 5%, i jeszcze bardziej korzystnie mniej niż 1% powinowactwa wiązania z białkiem o Sekw. Id. Nr: 2, która jest jak opisana w PCT numer zgłoszenia PCT/US98/19037 (WO99/12964) i jest tu włączona w całości.

Stosowany tu termin „przeciwciało obejmuje fragmenty, które także specyficznie reagują z BAFF lub jego receptorami. Przeciwciała mogą być pofragmentowane przy użyciu konwencjonalnych technik i fragmenty przeglądane pod kątem użyteczności w ten sam sposób jak opisano powyżej dla całych przeciwciał. Na przykład mogą być wygenerowane fragmenty F(ab')2 przez działanie na przeciwciało pepsyną. W uzyskanym fragmencie F(ab')2 można zredukować istniejące mostki disiarczkowe by wytworzyć fragmenty Fab'. Termin „przeciwciała obejmuje też cząsteczki biospecyficzne i chimeryczne mające aktywność anty- BAFF lub anty-receptor BAFF. Tak więc do blokowania działania BAFF i ich odpowiedniego receptora mogą być stosowane zarówno monoklonalne i poliklonalne przeciwciała (Ab) skierowane przeciw BAFF, ligandowi Tumor i ich receptorom, a fragmenty przeciwciała, takie jak Fab' i F(ab')2.

Można też wytworzyć różne formy przeciwciał stosując standardowe techniki rekombinacji DNA. (Winter i Milstein (1991) Nature 349:293-299). Na przykład, można skonstruować przeciwciała chimeryczne, w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego jest połączona z ludzką domeną stałą (np. Cabilly i wsp., Patent US 4,816,517). Chimeryczne przeciwciała mogą zmniejszyć zaobserwowane odpowiedzi immunologiczne wywołane przez przeciwciała zwierzęce, gdy będą stosowane w terapiach klinicznych u ludzi.

Ponadto można zsyntetyzować zrekombinowane humanizowane przeciwciała, które rozpoznają BAFF lub jego receptory.

Humanizowane przeciwciała są chimerami zawierającymi głównie ludzkie sekwencje IgG, do których wstawiono regiony odpowiedzialne za specyficzne wiązanie antygenu. Zwierzęta immunizuje się żądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała i usuwa się część sekwencji z regionu zmiennego odpowiedzialnych za specyficzne wiązanie antygenu. Następnie pochodzące od zwierzęcia regiony wiążące antygen wklonowuje się do odpowiedniej pozycji ludzkich genów dla przeciwciał, w których regiony wiążące antygen zostały usunięte. Humanizowane przeciwciała zmniejszają zastosowanie heterologicznych (to znaczy między gatunkami) sekwencji w przeciwciałach ludzkich, a zatem jest mniej prawdopodobne, że wywołają odpowiedzi immunologiczne u leczonego osobnika.

Różne klasy przeciwciał zrekombinowanych można także skonstruować przez przygotowanie chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał zawierających domeny zmienne i ludzkie domeny stałe (CH1, CH2, CH3) wyizolowane z różnych klas immunoglobulin. Na przykład, przeciwciała ze zwiększonymi wartościowościami miejsca wiązania antygenu można otrzymać techniką rekombinacji przez wklonowanie miejsca wiązania antygenu do wektorów niosących ludzkie stałe regiony łańcucha (Arulanandam i wsp. (1993) J. Exp. Med. 177:1439-1450).

Ponadto standardowe techniki rekombinacji DNA mogą być stosowane, w celu zmiany powinowactwa wiązania zrekombinowanych przeciwciał z ich antygenami przez zmianę reszt aminokwasów w pobliżu miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo do wiązania antygenu humanizowanego przeciwciała może być zwiększone przez mutagenezę opartą na modelowaniu molekularnym. (Queen i wsp. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-33).

F. Materiały i metody wynalazku

Monoklonalne przeciwciało anty-Flag, biotynylowane przeciwciało anty-Flag M2 i przeciwciało anty-Flag-M2 sprzężone, z agarozą nabyto od Sigma. Odczynniki do hodowli komórek nabyto od Life Sciences (Bazylea, Szwajcaria) i Biowhittaker (Walkersville, MD). Oznakowany Flag rozpuszczalny ludzki APRIL (reszty K110-L250) wytworzono w komórkach 293 jak opisano (10, 11). Oznakowane FITC przeciwciała anty-CD4, anty-CD8 i anty CD-19 nabyto od Pharmingen (San Diego, CA). Kozi F(ab')2 specyficzny dla fragmentu F% ludzkiego IgM nabyto od Jackson Immunoresearch (West Grove, PA).

PL 198 934 B1

Drugorzędowe przeciwciała uzyskano albo od Pharmingen albo od Jackson ImmunoResearch i stosowano w zalecanych rozcieńczeniach.

Komórki ludzkiej linii zarodkowej nerki 293T (12) i linie fibroblastów (Tabela 1) trzymano w DMEM zawierają cym 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielę cej (FCS). Ludzką linię zarodkową nerki 293 trzymano w DMEM-mieszaninie składników odżywczych F12 (1:1) uzupełnionej 2% FCS. Linie limfocytów T, linie limfocytów B i linie komórek makrofagów (Tabela 1) hodowano w RPMI uzupełnionym 10% FCS. Komórki Molt-4 hodowano w poż ywce Iscove'a uzupełnionej 10% FCS. Nabłonkowe linie komórkowe hodowano w pożywce MEM-alfa zawierającej 10% FCS, 0,5mM nieistotnych aminokwasów, 10 mM Na-Hepes i 1 mM pirogronianu Na. HUVEC utrzymywano w podłożu M199 uzupełnionym 20% FCS, 100 μg/ml czynnika wzrostu komórek nabłonkowych (Collaborative Research, Inotech, Dottikon, Szwajcaria) i 100 μg/ml soli sodowej heparyny (Sigma). Wszystkie podłoża zawierały antybiotyki penicylinę i streptomycynę. Limfocyty krwi obwodowej izolowano z heparynizowanej krwi zdrowych dorosłych ochotników za pomocą wirowania w gradiencie Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) i hodowano w RPMI, 10% FCS.

Limfocyty T uzyskano z nieprzylegających PBL przez rozetkowanie z poddanymi działaniu neuraminidazy czerwonymi krwinkami owcy i oddzielono od komórek nierozetujących (głównie limfocytów B i monocytów) za pomocą wirowania w gradiencie Ficoll-Paque. Oczyszczone limfocyty T aktywowano przez 24 g fitohemaglutyniną (Sigma) (1 μg/ml), płukano i hodowano w RPMI, 10% FCS, 20 U/ml IL-2. Monocyty CD14⁺ oczyszczono za pomocą magnetycznego sortowania komórek stosując przeciwciała anty-CD14, mikroperełki pokryte kozim anty-mysim przeciwciałem i urządzenie Minimacs™ (Miltenyi Biotech), i hodowano w obecności GM-CSF (800 U/ml, Leucomax^®, Essex Chemie, Lucerna, Szwajcaria) i IL-4 (20 ng/ml, Lucerna Chem, Lucerna, Szwajcaria) przez 5 dni, a następnie z GM-CSF, IL-4 i TNF alfa (200 U/ml, Bender, Wiedeń, Austria) przez dodatkowe 3 dni, aby uzyskać populację dendrytopodobną CD83⁺. Ludzkie limfocyty B o czystości >97% izolowano z obwodowej krwi lub krwi pępowinowej stosując magnetyczne perełki anty-CD19 (M450, Dynal, Oslo, Norwegia) jak opisano (13).

Analiza typu Northern blotting

Analizę typu Northern przeprowadzono stosując Human Multiple Tissue Northern Blot I i II (Clontech #7760-1 i #7759-1). Błony inkubowano w roztworze do hybrydyzacji (50% formamid, 2,5xDenhardt, 0,2% SDS, 10 mM EDTA, 2 x SSC, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6,5, 200 μg/ml sonikowanego DNA ze spermy łososia) przez 2 godz. w 60°C. Sondę z antysensownym RNA zawierającą nukleotydy odpowiadające aminokwasom 136-285 hBAFF zdenaturowano za pomocą ciepła i dodano w ilości 2x10⁶ cpm/ml w świeżym roztworze do hybrydyzacji. Membranę hybrydyzowano przez 16 godz. w 62°C, płukano jeden raz w 2 x SSC, 0,05% SDS (30 min w 25°C), jeden raz w 0,1 x SSC, 0,1% SDS (20 min w 65°C) i eksponowano w -70°C na kliszę rentgenowską.

Charakterystyka cDNA BAFF

Częściowa sekwencja ludzkiego cDNA BAFF była zawarta w kilku klonach EST (np. GenBank numery dostępu T87299 i AA166695) pochodzących z bibliotek z wątroby i śledziony płodowej i raka jajnika. Część 5' cDNA otrzymano za pomocą amplifikacji 5'RACE-PCR (Marathon-Ready cDNA, Clonetech, Palo Alto, CA) z oligonukleotydami AP1 i JT1013 (5'-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3') [Sekw. Id. Nr:9] stosując dostarczoną bibliotekę cDNA z puli leukocytów ludzkich jako matrycę, według zaleceń producenta. Uzyskany produkt PCR klonowano w PCR-0 blunt (Invitrogen, NV Leek, Holandia) i subklonowano jako fragment EcoRI/Pstl do wektora pT7T3 Pac (Pharmacia) zawierającego klon EST T87299. cDNA hBAFF pełnej długości otrzymano więc przez połączenie fragmentów 5' i 3' stosując wewnętrzne miejsce Pstl BAFF. Sekwencji przypisano numer dostępu GenBank AF116456.

Częściowa sekwencja 617 bp mysiego BAFF była zawarta w dwóch zachodzących na siebie klonach EST (AA422749 i AA254047). Fragment PCR obejmujący nukleotydy 158 do 391 tej sekwencji zastosowano jako sondę do przeszukiwania biblioteki cDNA ze śledziony myszy (Stratagene, La Jolla, CA).

Ekspresja zrekombinowanego BAFF hBAFF pełnej długości zamplifikowano stosując oligonukleotydy JT1069 (5'-GACAAGCTTGCCACCATGGATGACTCCACA-3') [Sekw.Id. Nr: 10] i JT637 (5'-ACTAGTCACAGCAGTTTCAATGC-3') [Sekw. Id. Nr: 11]. Produkt PCR wklonowano do PCR-0 blunt i ponownie subklonowano jako fragment Hindlll/EcoRI do ssaczego wektora ekspresyjnego PCR-3. Krótką wersję rozpuszczalnego BAFF (aminokwasy Q136-L285) amplifikowano przy użyciu oligonukleotydów JT636 (5'-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3') [Sekw. Id. Nr: 12] i JT637. Długą wersję rozpuszczalnego BAFF (aminokwasy

PL 198 934 B1

L83-L285) otrzymano z BAFF pełnej długości stosując wewnętrzne miejsce Pstl. Rozpuszczalny BAFF ponownie subklonowano jako fragmenty Pstl/EcoRI za peptydem sygnałowym hemaglutyniny i sekwencją Flag zmodyfikowanego wektora PCR-3 i jako fragment Pstl/Spel do zmodyfikowanego bakteryjnego wektora ekspresyjnego w ramce z N-końcową sekwencją Flag (14). Konstrukty sekwencjonowano na obu niciach. Ustalenie stabilnych linii komórkowych 293 wyrażających krótką formę rozpuszczalną lub BAFF pełnej długości i ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego rozpuszczalnego BAFF z bakterii i komórek ssaków były przeprowadzone jak opisano (14, 15).

PGR z użyciem odwrotnej transkryptazy

Całkowity RNA wyekstrahowany z limfocytów T, limfocytów B, uzyskanych in vitro niedojrzałych komórek dendrytycznych, 293 wt i 293-BAFF (pełnej długości) poddano odwrotnej transkrypcji stosując system Ready to Go (Pharmacia) według zaleceń producenta. cDNA BAFF i β-aktyny wykrywano za pomocą amplifikacji PCR z polimerazą DNA Taq (etapy po 1 min każdy w 94°C, 55°C i 72°C przez 30 cykli) stosując specyficzne oligonukleotydy: dla BAFF, JT1322 5'-GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3' [Sekw. Id. Nr:13] i JT1323 5'-CAATTCATCCCCAAAGACATGGAC-3' [Sekw. Id. Nr: 14]; dla łańcucha alfa receptora IL-2, JT1368 5'-TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3' [Sekw. Id. Nr: 15] i JT1369 5'-CTTCTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3' [Sekw. Id. Nr: 16]; dla β-aktyny 5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' [Sekw. Id. Nr: 17] i 5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3' [Sekw. Id. Nr: 18].

Chromatografia żelowa

Komórki 293T transfekowano przejściowo krótką formą rozpuszczalnego BAFF i hodowano w wolnym od surowicy podłożu Optimem przez 7 dni. Kondycjonowane supernatanty zatężono 20 x, zmieszano z wewnętrznymi standardami, katalazą i owoalbuminą, i nałożono na kolumnę Superdex-200 HR 10/30. Białka eluowano PBS przy 0,5 ml/min i frakcje (0,25 ml) strącano kwasem trichlorooctowym i analizowano techniką Western blotting stosując przeciwciało anty-Flag M2. Kolumnę kalibrowano standardowymi białkami: ferrytyną (440 kDa), katalazą (232 kDa), aldolazą (158 kDa), albuminą surowicy bydlęcej (67 kDa), owoalbuminą (43 kDa), chymotrypsynogenem A (25 kDa) i rybonukleazą A (13,7 kDa).

Działanie PNGazą F

Próbki podgrzewano w 20 μl 0,5% SDS, 1% 2-merkaptoetanolu przez 3 min w 95°C, następnie schłodzono i uzupełniono 10% Nonidet P40 (2 μθ, 0,5 M fosforanem sodu, pH 7,5 (2 μθ i N-glikanazą peptydową F (125 jednostek/il, 1 μl lub brak enzymu w kontrolach). Próbki inkubowano przez 3 godz w 37°C przed analizą za pomocą techniki Western blotting.

Sekwencjonowanie EDMANA

Komórki 293T transfekowano przejściowo długą formą rozpuszczalnego BAFF i hodowano w wolnym od surowicy podłożu Optimem przez 7 dni. Kondycjonowane supernatanty zatężono 20 x, frakcjonowano za pomocą SDS-PAGE i przenoszono na błonę z poli(difluorkuwinylidenu (BioRad Labs, Hercules, CA) jak opisano uprzednio (16) a następnie sekwencjonowano stosując sekwenator w fazie gazowej (ABI 120A, Perkin Elmer, Foster City, CA) połączony z analizatorem (ABI 120A, Perkin Elmer) wyposażonym w kolumnę fenylotiohydantoinową C18 2,1 x 250 mm. Dane analizowano stosując oprogramowanie ABI 610 (Perkin Elmer).

Przeciwciała

Poliklonalne przeciwciała generowano przez immunizację królików (Eurogentec, Seraing, Belgia) zrekombinowanym rozpuszczalnym BAFF. Śledziony szczurów immunizowanych tym samym antygenem poddawano fuzji z komórkami mysiego szpiczaka x63Ag8.653 i przeszukiwano hybrydom na IgG specyficznych dla BAFF. Jedno z tych przeciwciał monoklonalnych, 43.9 jest IgG2a, które specyficznie rozpoznaje hBAFF.

Komórki barwiono w 50 μl buforu FACS (PBS, 10% FCS, 0,02% NaN₃) z 50 ng (lub wskazaną ilością) znakowanego Flag krótkiego rozpuszczalnego hBAFF przez 20 min. w 4°C, a następnie z anty-Flag M2 (1 μg) i drugorzędowym przeciwciałem. mAb 43.9 anty-BAFF stosowano przy 40 μg/ml. Dla analizy FACS z dwoma kolorami, limfocyty krwi obwodowej barwiono wyznakowanym Flag rozpuszczalnym BAFF/long (2 μg/ml) a następnie biotynylowanym anty-Flag M2 (1/400) i oznakowaną PE streptawidyną (1/100), a następnie znakowanym FITC anty-CD4, anty-CD8 lub anty-CD19.

Oznaczenie proliferacji PBL

Leukocyty krwi obwodowej inkubowano w płytkach 96-studzienkowych (10⁵ komórek/studzienkę w 100 μl RPMI uzupełnionego 10% FCS) przez 72 godz. w obecności lub pod nieobecność 2 μg/ml przeciwciała koziego przeciw-ludzkiemu łańcuchowi μ (Sigma) lub kontrolnego F(ab')2 i ze wskazanym stężeniem natywnego lub gotowanego rozpuszczalnego BAFF/long. Komórki poddawano pulsowo

PL 198 934 B1 przez dodatkowe 6 godzin [³H]tymidyny (1 μCi/studzienkę) i zbierano je. Sprawdzano inkorporację [3H] tymidyny przez zliczenie w ciekłym liczniku scyntylacyjnym. W niektórych doświadczeniach zrekombinowany rozpuszczalny BAFF zastąpiono komórkami 293 stabilnie transfekowanymi BAFF pełnej długości (lub 293 dzikimi jako kontrolą), które utrwalano przez 5 min w 25°C w 1% paraformaldehydzie. Oznaczenia przeprowadzono jak opisano (17). W dalszych eksperymentach wyizolowano komórki CD19⁺ z PBL za pomocą magnetycznych perełek a pozostałe komórki CD19^- napromieniano (3000 rad) przed rekonstytucją z komórkami CD19⁺. Następnie przeprowadzono oznaczenie proliferacji z sBAFF jak opisano powyżej.

Oznaczenie aktywacji limfocytów B

Oczyszczone limfocyty B aktywowano w systemie hodowli EL-4 jak opisano (13). Pokrótce 10⁴limfocytów B zmieszanych z 5 x 10⁴ napromienianych komórek mysiego grasiczaka EL-4 (klon B5) hodowano przez 5-6 dni w 200 μl podłoża zawierającego 5% obj./obj. supernatantów hodowli z ludzkich limfocytów T (10⁶/ml), które były aktywowane przez 48 godz. PHA (1 μg/ml i PMA (1 ng/ml). Następnie limfocyty B ponownie izolowano z perełek anty-CD19 i hodowano przez następne 7 dni (5 x 10⁴komórek w 200 μ!, w dwóch lub trzech powtórzeniach w płaskodennych płytkach 96-studzienkowych) w samym podłożu lub podłożu uzupełnionym 5% supernatantami limfocytów T, lub 50 ng/ml IL-2 (uprzejmy prezent od byłego Glaxo Institute dla Molecular Biology, Genewa) i 10 ng/ml każdego z IL-4 i IL-10 (Peprotech, Londyn, UK) w obecności lub braku sBAFF. Przeciwciało M2-anty-Flag dodano w stężeniu 2 μg/ml i samo nie miało żadnego działania. IgM, IgG i IgA w supernatantach hodowli określono ilościowo za pomocą oznaczeń ELISA jak opisano (13).

Ludzki BAFF zidentyfikowano na podstawie homologii sekwencji jako możliwego nowego członka rodziny ligandów TNF podczas przeszukiwań publicznych baz danych z zastosowaniem ulepszonego przeszukiwania profili (18). cDNA kodujący całkowite białko o wielkości 285 aminokwasów (aa) uzyskano przez połączenie klonów EST (obejmujących region 3') z fragmentem (region 5') zamplifikowanym za pomocą PCR. Brak peptydu sygnałowego sugerował, że BAFF był białkiem błonowym typu II, które jest typowe dla członków rodziny ligandów TNF. Białko ma przewidywaną domenę cytoplazmatyczną z 46 aminokwasów, hydrofobowy region transbłonowy i zewnątrz-komórkową domenę z 218 aminokwasów mającą dwa potencjalne miejsca N-glikozylacji (Fig. 1A). Sekwencja zewnątrzkomórkowej domeny BAFF wykazuje najwyższą homologię do APRIL (33% identyczności aminokwasów, 48% homologii), podczas gdy identyczność z innymi członkami rodziny, takimi jak TNF, FasL, LTa, TRAIL lub RANKL jest poniżej 20% (Fig. 1B, C). Mysi klon cDNA BAFF wyizolowany z biblioteki ze śledziony kodował nieco dłuższe białko (309 aminokwasów) ze względu na insercję między regionem transbłonowym i pierwszą z kilku nici β, które stanowią domenę wiązania receptora u wszystkich członków ligandów TNF (19). Ta ektodomena bogata w nici β jest nieomal identyczna w mysim i ludzkim BAFF (86% identyczności, 93% homologii), co sugeruje, że gen BAFF był wysoce konserwowany w czasie ewolucji (Fig. 1A).

Choć członkowie rodziny TNF są syntetyzowani jako ligandy wstawiane do błony, często obserwuje się cięcie w regionie szkieletowymi między domeną transbłonową i wiążącą receptor. Na przykład TNF lub FasL są łatwo odcinane z powierzchni komórki przez metaloproteinazy (20, 21). Podczas produkcji kilku form zrekombinowanego BAFF w komórkach 293T zauważyliśmy, że zrekombinowana rozpuszczalna postać 32 kDa BAFF (aminokwasy 83-285, sBAFF/long) zawierająca całkowity region szkieletowy i N-końcowy znacznik Flag w dodatku do domeny wiążącej receptora była w znacznym stopniu obrabiana do mniejszego fragmentu 18 kDa (Fig. 2A, B). Cięcie zachodziło w rejonie szkieletowym, ponieważ fragment był do wykrycia tylko za pomocą przeciwciał uzyskanych przeciwko całkowitej domenie interakcji BAFF z receptorem ale nie z przeciwciałami anty-Flag (dane nie przedstawione). Także ujawniono, że tylko N124 (zlokalizowany w szkielecie) ale nie N242 (zlokalizowane na wejściu do kartki F-β) był glikozylowany, ponieważ masa cząsteczkowa nieobrobionego sBAFF/long była zmniejszona z 32 kDa do 30 kDa po usunięciu N-połączonego węglowodanu za pomocą PNGazy F, podczas gdy odcięta forma 18 kDa była niewrażliwa na tę obróbkę. Analiza sekwencji peptydu fragmentu 18 kDa pokazała rzeczywiście, że cięcie występowało między R133 i A134 (Fig. 1A). R133 leży na końcu regionu polizasadowego, który jest konserwowany między człowiekiem (R-N-K-R) i myszą (R-N-R-R). Aby zbadać, czy cięcie nie było po prostu artefaktem ekspresji rozpuszczalnych, nienaturalnych postaci BAFF, związany z błoną pełnej długości BAFF wyrażano w komórkach 293T (Fig. 2C). Całkowity 32kDa BAFF i pewne formy o wyższej masie cząsteczkowej (prawdopodobnie odpowiadające niezdysocjowanym dimerom i trimerom) były łatwo wykrywalne w ekstraktach komórPL 198 934 B1 kowych, ale ponad 95% BAFF odzyskiwanego z supernatantu odpowiadało obrabianej formie 18 kDa wskazując, że BAFF jest także obrabiany, gdy jest syntetyzowany jako ligand związany z błoną.

Technikami inżynierii genetycznej uzyskano rozpuszczalny BAFF (Q136-L285, sBAFF/short), którego sekwencja zaczyna się od 2 aminokwasów poniżej miejsca obróbki (Fig. 1B). Jak przewidywano, znacznik Flag dołączony do N-końca tej zrekombinowanej cząsteczki nie był usunięty (dane nie przedstawione), co pozwoliło na jego oczyszczenie na kolumnie powinowactwa anty-Flag. Aby zbadać jego prawidłowe pofałdowanie, oczyszczony sBAFF/short analizowano za pomocą filtracji żelowej, gdzie białko eluowało przy pozornej masie cząsteczkowej 55 kDa (Fig. 2D). sBAFF/short prawidłowo składa się do homotrimeru (3 x 20 kDa), zgodnie z czwartorzędową strukturą innych członków rodziny TNF (19). W końcu, nieobrobiony sBAFF/long był łatwo wyrażany w bakteriach wskazując, że zdarzenie cięcia było specyficzne dla komórek eukariotycznych.

Analiza Northern blotting BAFF wykazała, że mRNA 2,5 kb BAFF był obecny w dużych ilościach w śledzionie i PBL (Fig. 3A). Grasica, serce, łożysko, jelito cienkie i płuco wykazywały słabą ekspresję. Ta ograniczona dystrybucja sugerowała, że komórki obecne w tkankach limfoidalnych były głównym źródłem BAFF. Przez analizę PCR stwierdziliśmy, że mRNA BAFF był obecny w limfocytach T i komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów krwi obwodowej ale nie w limfocytach B (Fig. 3B). Nawet naiwne, niestymulowane limfocyty T wydawały się wyrażać pewną ilość mRNA BAFF.

Miejsce znakowane sekwencją (STS, SHGC-36171) znaleziono w bazie danych, która zawierała ludzką sekwencję BAFF. To miejsce mapuje się na ludzkim chromosomie 13, w przedziale 9cM między markerami D13S286 i D13S1315. Na mapie cytogenetycznej ten przedział odpowiada 13q32-34. Ze znanych członków rodziny ligandów TNF tylko RANKL (Trance) jest zlokalizowany na tym chromosomie (22), choć całkiem daleko od BAFF (13q14).

Aby ligand mógł wywierać maksymalne działanie biologiczne, było prawdopodobne, że receptor BAFF (BAFF-R) będzie wyrażany albo na tych samych komórkach albo na komórkach sąsiednich obecnych w tkankach limfoidalnych. Stosując zrekombinowany sBAFF jako narzędzie do swoistego określenia ekspresji BAFF-R za pomocą FACS w istocie stwierdziliśmy wysokie poziomy ekspresji receptora w różnych liniach limfocytów B, takich jak chłoniaki Burkitta Raji i BJAB (Fig. 4A, Tabela 1). Przeciwnie, linie komórkowe limfocytów T, fibroblastów, pochodzenia nabłonkowego i śródbłonkowego wszystkie były negatywne. Bardzo słabe zabarwienie zaobserwowano z linią monocytów THP-1, które jednak mogło wynikać z wiązania receptora Fc. Tak więc ekspresja BAFF-R wydaje się być ograniczona do linii limfocytów B. Dwie badane linie limfocytów B myszy były ujemne przy zastosowaniu ludzkiego BAFF jako sondy, choć zaobserwowano słabe wiązanie na splenocytach myszy (dane nie przedstawione). Obecność BAFF-R na limfocytach B potwierdzono przez analizę limfocytów krwi pępowinowej i limfocytów krwi obwodowej. Podczas gdy limfocyty T CD8⁺ i CD4⁺ nie posiadały BAFF-R (Fig. 4B i dane nieprzedstawione), zaobserwowano silne barwienie na limfocytach B CD19⁺ (Fig. 4A i 4B), co wskazuje że BAFF-R jest wyrażany na wszystkich limfocytach B krwi, w tym naiwnych i pamięci.

Ponieważ BAFF wiązał się z limfocytami B pochodzącymi z krwi, przeprowadzono doświadczenia, aby określić czy ligand może dostarczać sygnały stymulujące lub hamujące wzrost. Limfocyty krwi obwodowej (PBL) stymulowano przeciwciałami anty-IgM (μ) razem z ustalonymi komórkami 293 stabilnie wyrażającymi powierzchniowy BAFF (Fig. 5A). Poziomy włączania [³H]tymidyny indukowane przez sam anty-μ nie były zmienione przez obecność komórek kontrolnych, ale wzrastały dwukrotnie w obecności komórek transfekowanych przez BAFF (Fig. 5B). Uzyskano zależną od dawki proliferację PBL, także gdy komórki transfekowane BAFF były zastąpione przez oczyszczony sBAFF (Fig. 5C), co wskazuje, że BAFF nie wymaga przyczepienia się do błony, aby wywierać działanie. W tym zestawie eksperymentalnym proliferacja indukowana przez sCD40L wymagała stężeń przekraczających 1 ^g/ml, ale była mniej zależna od obecności anty-μ, niż ta z udziałem BAFF (Fig. 5D). Gdy oczyszczone limfocyty B CD19⁺ hodowano razem z napromienianymi autologicznymi PBL CD19^- nie wpływało to na kostymulację proliferacji przez BAFF, co wykazuje, że pobieranie [³H]tymidyny było głównie wynikiem proliferacji limfocytów B, a nie pośrednią stymulacją innego typu komórek (dane nieprzedstawione). Obserwowana proliferacja limfocytów B w odpowiedzi na BAFF była całkowicie zależna od obecności przeciwciał anty-μ wskazując, że BAFF działał jako kostymulator proliferacji limfocytów B.

Aby zbadać możliwy wpływ BAFF na wydzielanie immunoglobulin preaktywowano oczyszczone limfocyty B krwi obwodowej lub krwi pępowinowej przez hodowlę wspólnie z limfocytami T EL-4 w obecności mieszaniny cytokin z supernatantów limfocytów T stymulowanych PHA/PMA (23). Te limfocyty B ponownie izolowano do czystości 98% i uzyskano dwukrotny wzrost w wydzielaniu Ig

PL 198 934 B1 w czasie wtórnej hodowli w obecności BAFF i cytokin aktywowanych limfocytów T w porównaniu z samymi cytokinami. Bardzo umiarkowany efekt wystąpił pod nieobecność egzogennych cytokin, a pośredni efekt (1,5-krotny) zaobserwowano w obecności zrekombinowanych cytokin IL-2, IL-4 i IL-10 (Fig. 5E, F).

Analiza biochemiczna BAFF jest także zgodna z typową homotrimerową strukturą członków rodziny TNF. W tej rodzinie ligandów BAFF wykazuje najwyższy poziom podobieństwa sekwencji do APRIL, który niedawno scharakteryzowaliśmy jako ligand stymulujący wzrost komórek różnych guzów (11). W odróżnieniu od TNF i LT beta, które są dwoma członkami rodziny o równie wysokiej homologii (33% identyczności) i których geny są sprzężone na chromosomie 6, APRIL i BAFF nie są skupione na tym samym chromosomie. APRIL jest położony na chromosomie 17 (J.L.B. dane nieopublikowane), podczas gdy BAFF mapuje się do dalszej części ramienia chromosomu ludzkiego 13 (13q34). Zaburzenia tego locus scharakteryzowano w chłoniakach Burkitta jako drugie najczęstsze uszkodzenie (24) oprócz translokacji obejmującej gen myc do locus Ig (25). Wzięcie pod uwagę wysokiego poziomu ekspresji BAFF-R na wszystkich analizowanych liniach komórek chłoniaka Burkitta (zobacz Tabela 1), co sugeruje intrygującą możliwość, że w pewnych chłoniakach Burkitta mogła zajść deregulacja ekspresji BAFF, w ten sposób stymulując wzrost w sposób autokrynny.

Rola limfocytów B specyficznych w stosunku do antygenu w różnych stadiach odpowiedzi immunologicznej w wysokim stopniu zależy od sygnałów i kontaktów od limfocytów pomocniczych T i komórek prezentujących antygen, takich jak komórki dendrytyczne (20). Limfocyty B najpierw otrzymują te sygnały wcześnie w czasie odpowiedzi immunologicznej, gdy oddziałują z limfocytami T na obrzeżu pęcherzyków limfocytów B w tkankach limfoidalnych, prowadząc do ich proliferacji i różnicowania do komórek tworzących przeciwciało o niskim powinowactwie (18). W tym samym czasie niektóre z limfocytów B specyficznych w stosunku do antygenu także migrują do pęcherzyka limfocytu B i biorą udział w tworzeniu ośrodków rozmnażania, innego miejsca proliferacji limfocytów B, ale także dojrzewania powinowactwa i generacji limfocytów pamięci B i komórek plazmatycznych o wysokim powinowactwie (19).

Wykazano, że sygnały wywoływane przez innego członka nadrodziny TNF CD40L okazały się być krytyczne dla funkcji limfocytów B na licznych etapach odpowiedzi immunologicznej zależnej od limfocytów T. Jednak kilka badań jasno wykazało, że interakcja CD40L/CD40 nie jest odpowiedzialna za całą zależną od limfocytów T pomoc dla komórek B. Istotnie, wykazano, że limfocyty T pozbawione CD40L wyizolowane albo od myszy znokautowanych albo od pacjentów ze związanym z X zespołem hiper IgM z powodzeniem indukują proliferację limfocytów B i ich różnicowanie do komórek plazmatycznych. Badania stosujące blokujące przeciwciała przeciwko CD40L wykazały, że podgrupa powierzchniowych limfocytów B dodatnich dla IgD na powierzchni izolowanych z ludzkich migdałków proliferuje i różnicuje się w odpowiedzi na aktywowane limfocyty T w sposób niezależny od CD40. Wykazano także, że inni członkowie rodziny TNF, tacy jak związany z błoną TNF i CD30L biorą udział w niezależnej od CD40 i powierzchniowego Ig stymulacji limfocytów B. Podobnie do naszych wyników z BAFF wykazano, że limfocyty B pozbawione CD40 można stymulować do proliferacji i różnicowania w komórki plazmatyczne za pomocą limfocytów pomocniczych T, o ile w tym samym czasie są uruchomione receptory powierzchniowe Ig. BAFF jak i CD40L i CD30L jest wyrażany przez limfocyty T, ale jego oryginalność polega na jego ekspresji przez komórki dendrytyczne jak i wysoce specyficznym położeniu jego receptora na limfocytach B, w przeciwieństwie do CD40, CD30 i receptora TNF, którego ekspresja była opisana na wielu różnych komórkach. Ta obserwacja sugeruje niezależne i specyficzne indukowane przez BAFF funkcje na limfocytach B.

W poparciu dla roli BAFF we wzroście i potencjalnym dojrzewaniu limfocytów B indukowanym przez limfocyty T i komórki dendrytyczne stwierdziliśmy, że BAFF kostymuluje proliferację limfocytów B pochodzących z krwi razem z wiązaniem poprzecznym receptorów limfocytów B, a zatem niezależnie od sygnalizacji CD40. Co więcej, stosując limfocyty B CD19 dodatnie zróżnicowane in vitro do komórki preplazmatycznej/podobnego do GC limfocytu B (14) zaobserwowaliśmy działanie kostymulacyjne BAFF na wydzielanie Ig przez te limfocyty B w obecności supernatantu ze zaktywowanych limfocytów T lub mieszaniny IL-2, IL-4 i IL-10. Co ciekawe, efekt kostymulacji był silniejszy w obecności supernatantu zaktywowanych limfocytów T w porównaniu z mieszaniną cytokin sugerując dodatkowe czynniki rozpuszczalne wydzielane przez aktywowane limfocyty T biorące udział w produkcji przeciwciał, które mogą synergizować z BAFF lub sam dodatkowy BAFF. Jest więc możliwe, że BAFF aktywnie wpływa na różnicowanie się tych GC-podobnych limfocytów B do plazmatycznych.

PL 198 934 B1

Jest jasne, że BAFF może sygnalizować zarówno w naiwnych limfocytach B jak i limfocytach B na szlaku GC in vitro. Czy ta obserwacja także dotyczy, czy też nie, normalnej odpowiedzi immunologicznej, musi być sprawdzone za pomocą odpowiednich eksperymentów in vivo.

Odpowiedzi biologiczne indukowane w limfocytach B przez BAFF są odmienne od odpowiedzi CD4-L, ponieważ proliferacja indukowana przez CD40L była znacznie mniej zależna od bodźca anty-μ, (17) (i Fig. 5D). Co więcej, CD40L może przeciwdziałać sygnałom apoptotycznym w limfocytach B po zaangażowaniu receptora limfocytów B (29), podczas gdy BAFF nie był zdolny do uratowania linii limfocytów B Ramos od apoptozy z udziałem anty-μ, mimo iż komórki Ramos wyrażają BAFF-R (Tabela 1, F.M. i J.L.B., dane nieopublikowane). Jest więc prawdopodobne, że CD40L i BAFF spełniają odrębne role. Pod tym względem warto zauważyć, że BAFF nie reaguje z żadnym z 16 badanych rekombinantowych receptorów rodziny TNF, w tym CD40 (P.S. i J.T., dane nieopublikowane).

Wzrost limfocytów B był skutecznie kostymulowany zrekombinowanym rozpuszczalnym BAFF pozbawionym domeny transbłonowej. Ta aktywność różni się od aktywności kilku członków rodziny TNF, którzy są aktywni tylko jako ligand związany z błoną, taki jak TRAIL, FasL i CD40L. Rozpuszczalne formy tych ligandów mają słabą aktywność biologiczną, którą można zwiększyć przez ich wiązania poprzeczne w ten sposób imitując ligand związany z błoną (15). Przeciwnie, wiązanie poprzeczne znakowanego Flag sBAFF z przeciwciałami anty-Flag lub zastosowanie związanego z błoną BAFF wyrażanego na powierzchni komórek nabłonka dalej nie zwiększało mitogennej aktywności BAFF, sugerując, że może on działać ogólnoustrojowo jako wydzielana cytokina, tak jak TNF. Jest to zgodne z obserwacją, że polizasadowa sekwencja obecna w szkielecie BAFF działała jako substrat dla proteazy. Podobne sekwencje polizasadowe są także obecne w odpowiednich miejscach zarówno w APRIL jak i TWEAK i dla obu z nich są dowody na obróbkę proteolityczną (30) (N.H. i J.T., dane nieopublikowane). Choć proteaza odpowiedzialna za cięcie nie została jeszcze znaleziona, jest mało prawdopodobne by była to metaloproteaza odpowiedzialna za uwalnianie związanego z błoną TNF, ponieważ ich preferencje względem sekwencji różnią się całkowicie (21). Multizasadowe motywy w BAFF (R-N-K-R), APRIL (R-K-R-R) i Tweak (R-P-R-R) przypominają minimalny sygnał cięcia dla furyny (R-X-K/R-R), prototypu rodziny konwertaz probiałek (31).

W praktycznym wykonaniu niniejszego wynalazku będą stosowane o ile nie jest wskazane inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórkowej, hodowli komórek, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinowanego DNA, chemii białek i immunologii, które mieszczą się w zakresie umiejętności w tej dziedzinie. Takie techniki są opisane w literaturze. Zobacz na przykład, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wydanie 2. (Sambrook, Fritsch i Maniatis, red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, tomy I i II (D.N. Glover, red.), 1985; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, red.), 1984; Patent US N4 4,683,195 (Mullis i wsp.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames i S.J. Higgins, red.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames i S.J. Higgins, red.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, red.). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, tomy 154 i 155 (Wu i wsp., red) Academic Press, Nowy Jork; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller i M.P. Calos, red.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer i Walker, red.) Academic Press, Londyn, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Tomy I-IV (D.M. Weir i C.C. Blackwell, red.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Następujące przykłady są dostarczone w celu ilustracji niniejszego wynalazku, i nie powinny być traktowane jako jego ograniczenia.

P r z y k ł a d y

W przykładach 1-6 stosowano następujące procedury eksperymentalne.

Konstrukt DNA do generacji mysiego BAFF myszy Tg

Sekwencje cDNA BAFF zarówno człowieka jak i myszy opisano uprzednio (Schneider i wsp. 1999). Fragment PCR kodujący mysi BAFF pełnej długości wygenerowano za pomocą RT-PCR. cDNA pierwszej nici zsyntetyzowano z poliA+ z płuca myszy (Clontech, Palo Alto, Ca), stosując oligo dT według protokołu producenta (GibcoBRL, Grand Island, NY). Reakcja PCR zawierała 1 x bufor Pfu (Stratagene, LaJola, CA), 0,2 mM dNTP, 10% DMSO, 12,5 pM startery, 5 jednostek enzymu Pfu (Stratagene) i następujące startery z miejscami restrykcyjnymi Notl

5'-TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3' [Sekw. Id. Nr :19] i 5'-TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3' [Sekw. Id. Nr: 20].

PL 198 934 B1

Matrycę amplifikowano przez 30 cykli w 94°C przez 1 min, w 54°C przez 2 min i w 72°C przez 3 min, a następnie 10 min przedłużanie w 72°C. Ta sekwencja odpowiada nukleotydom 214 do 1171 pliku GenBank AF119383. Fragment PCR strawiono Notl i następnie wklonowano do zmodyfikowanego wektora pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fragment zawierający mysi BAFF usunięto stosując Xbal, aby włączyć sekwencję miejsca addycji poliA SV40. Ten fragment wklonowano do wektora opartego na pUC, gdzie dodano sekwencję promotora. Promotor, 1 kb tępy fragment Bg12-NotI zawierający ludzki enhancer ApoE i promotor AAT (alfa antytrypsyna) oczyszczono z klonu plazmidowego 540B (uprzejmy prezent od dr Katherine Parker Ponder, Washington University, St. Louis, MO). Oczyszczono fragment EcoRV/Bg12 z ostatecznego wektora i zastosowano do otrzymania myszy transgenicznych. Zaszczepione potomstwo samicy C57BL/6J x samiec DBA/2J F1 (BDF1) poddano krzyżówce wstecznej z myszami C57BL/6. Techniki mikroiniekcji i generacji myszy transgenicznych opisano uprzednio (Mcknights i wsp., 1983).

Metody analityczne

Próbki surowicy poddano analizie na zredukowanym SDS-PAGE stosując liniowy żel 12,5%. Całkowity RNA z wątroby myszy przygotowano i obrabiano do Northern blotting stosując zestaw do izolacji od Promega (Madison, WI) według wytycznych producenta. mRNA specyficzny dla transgenu BAFF wykrywano stosując sondę obejmującą ogon poliA SV40 konstruktu transgenu i uzyskaną za pomocą trawienia Xbal i BamHI zmodyfikowanego wektora pCEP4. Sonda rozpoznaje prążek 1,8 Kd odpowiadający mRNA z transgenu BAFF. Analizę PCR DNA z ogona BAFF myszy Tg przeprowadzono stosując 12,5 pM następujących starterów 5'-GCA GTTTCACAGCGATGTCCT-3' [Sekw. Id. Nr :21] i 5'-GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3' [Sekw. Id. Nr:22] w reakcji zawierającej 1 x bufor do polimerazy Tag (Stratagene), 0,2 nM dNTP, 10% DMSO i 5 jednostek polimerazy Taq (Stratagene). Fragment transgenu 719 bp amplifikowano przez 35 cykli w 94°C przez 30 sek., w 54°C przez 1 min, i w 72°C przez 1,5 min, a następnie przedłużenie 10 min w 72°C.

Obecność białek w moczu myszy mierzono stosując paski Multistix 10 SG do analizy moczu (Bayer Corporation, Diangostics Division Elkhart, IN).

Cell-dyn i analiza cytofluorometryczna (FACS).

Zróżnicowane zliczenia białych krwinek (WBC) świeżej krwi pełnej z antykoagulantem EDTA przeprowadzono w aparacie Abbott Cell Dyne 3500 (Chicago, IL). Do analizy FACS, od Pharmingen (San Diego, CA) nabyto znakowane fluorosceiną (FITC), Cy-chromem i fikoerytryną (PE) anty-mysie przeciwciała szczura: anty-B220, anty-CD4, anty-CD8, anty-CD43, anty-IgM, anty-CD5, anty-CD25, anty-CD24, anty-CD38, anty-CD21, anty-CD44, anty-L-selektyna i zestaw Ig chomika anty-Bcl-2/kontrolny chomik. Wytwarzanie zrekombinowanego E. coli jak i pochodzącego od komórek ssaka ludzkiego i mysiego znakowanego Flag BAFF opisano uprzednio (Schneider i wsp., 1999). Wszystkie przeciwciała stosowano zgodnie z instrukcją producenta. PBL oczyszczano z krwi myszy w sposób następujący: krew myszy zbierano do mikroprobówek zawierających EDTA i rozcieńczano ją 1:2 PBS. 500 μl rozcieńczonej krwi nakładano na 1 ml fikolu (Celardane, Hornby, Ontario, Kanada) w 4 ml probówce szklanej, wirowano z gradientem przeprowadzono przy 2000 obr/min przez 30 min. w temperaturze pokojowej i zbierano interfazę zawierającą limfocyty, którą płukano dwa razy w PBS przed barwieniem FACS. Śledziona, szpik kostny i krezkowe węzły chłonne mielono do zawiesiny pojedynczych komórek w podłożu RPMI (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) i płukano w buforze FACS (PBS uzupełniony 2% płodową surowicą cielęcą (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Komórki najpierw zawieszono w buforze FACS uzupełnionym następującymi odczynnikami blokującymi: 10 μg/ml ludzkich Ig (Sandoz, Bazylea, Szwajcaria) i 10 μg/ml przeciwciała blokującego anty-mysie Fc (Pharmingen) i inkubowano 30 min na lodzie przed barwieniem przeciwciałami znakowanymi fluorochromem. Wszystkie przeciwciała rozcieńczano w buforze FACS z odczynnikiem blokującym wymienionym powyżej. Próbki analizowano stosując cytofluorymetr FASCcan (Becton Dickinson).

Wykrywanie całkowitych Ig mysich i czynników reumatoidalnych w surowicach mysich za pomocą oznaczeń ELISA

Płytki ELISA (Corning glass works, Corning, NY) powlekano przez noc w 4°C roztworem 10 ^g/ml przeciwciał kozich anty-całkowite mysie Ig (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) w buforze stanowiącym 50 mM wodorowęglanu sodu pH 9,6. Płytki płukano 3 razy PBS/0,1% Tween i blokowano przez noc 1% żelatyną w PBS. 100 μl/studzienkę seryjnych rozcieńczeń surowicy lub rozcieńczeń standardowych dodawano do płytek przez 30 min w 37°C. Mysie Ig wykrywano stosując 100 μl/studzienkę roztworu 1 μg/ml oznakowanego fosfatazą alkaPL 198 934 B1 liczną (AP) koziego anty-całkowite Ig myszy (Southern Biology Associates) przez 30 min w 37°C. Po ostatnim płukaniu 3 razy PBS/0,1% Tween, rozwijano reakcję enzymatyczną stosując roztwór 10 μg/ml fosforanu p-nitrofenylu (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) w 10% dietanoloaminie. Rekację zahamowano przez dodanie 100 μl 3N NaOH na studzienkę. Gęstość optyczną (O.D.) mierzono przy 405 nm stosując spektrofotometr od Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Krzywe standardowe uzyskano stosując oczyszczone mysie Ig nabyte od Southern Biotechnology Associates. W przypadku wykrywania czynników reumatoidalnych (RF) płytki powleczono normalnymi Ig kozy (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) zamiast koziego Ig antymysie i przeprowadzono detekcję mysiego Ig jak opisano powyżej. Wykrywanie mysich izotypów w oznaczeniu RF przeprowadzono stosując oznakowane AP kozie anty-mysie IgA, IgM, IgG2a, IgG2b i IgG3, jak i oczyszczone mysie IgA, IgM, IgG2a, IgG2b i IgG3 dla krzywych standardowych (Southern Biotechnology Associates Inc.). Wszystkie statystyczne porównania przeprowadzono za pomocą analizy wariancji.

Wykrywanie krążących immunokompleksów (CIC) i strącanie krioglobulin w surowicach mysich

Oznaczenie przeprowadzono jak opisano uprzednio (June i wsp., 1979; Singh i Tingle, 1982) z następującymi modyfikacjami: płytki ELISA (Corning glass works) powlekano przez noc w 4°C 5 μg/ml ludzkiego C1q (Quidel, San Diego, CA) w 50 mM buforu wodorowęglanu sodu pH 9,6. Płytki płukano 3 razy PBA/0,1% Tween. Do płytek dodano 50 μl/studzienkę 0,3 M EDTA plus 50 μl/studzienkę seryjnych rozcieńczeń surowicy lub roztworów o znanych stężeniach standardowego kompleksu immunologicznego (peroksydaza-mysia antyperoksydaza (PAP) od DAKO (Carpinteria, CA). Płytki inkubowano 30 min w 37°C. Płytki płukano 3 razy PBS/0,1% Tween. Mysie Ig w immunokompleksach wykrywano stosując 100 μl/studzienkę roztworu 1 μg/ml znakowanego AP koziego anty-mysie Ig (Southern Biotechnology Associates, Inc.) jak opisano powyżej dla oznaczeń ELISA. Krioglobuliny wykrywano przez inkubację przez noc w 4°C surowicy mysiej rozcieńczonej 1/15 w wodzie i osady oceniano wizualnie.

Oznaczenia przeciw dwuniciowemu (ds) i jednoniciowemu (ss) DNA

Anty-ssDNA wykonano stosując płytki Nunc-immuno Plate MaxiSorp (NUNC A/S, Dania). Płytki powlekano przez noc w 4°C najpierw 100 μg/ml metylowanego BSA (Calbiochem Corp., La Jolla, CA), a następnie 50 μg/ml DNA grasicy cielęcej klasy I (Sigma, St. Louis, MO). DNA grasicy cielęcej fragmentowano przez sonikację i następnie trawiono nukleazą S1 przed użyciem. W teście anty-ssDNA, DNA gotowano przez 10 minut i przed zastosowaniem oziębiano na lodzie. Po zablokowaniu, dodano rozcieńczenia seryjne próbek surowicy i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godz. Autoprzeciwciała wykrywano kozim anty-mysie IgGAP (Sigma) i rozwijano jak opisano powyżej dla oznaczeń ELISA. Przygotowano krzywe standartowe stosując znane ilości mAb 205 anty-DNA, które jest specyficzne zarówno dla ss jak i dsDNA (Datta i wsp., 1987).

Immunohistochemia.

Śledzionę i węzły chłonne zamrożono w podłożu do zatapiania O.C.T. (Miles, Elkhart, IN) i zamontowano do cięcia w kriostacie. Skrawki o grubości 7-10 μm wysuszono i utrwalono w acetonie. Wszystkie inkubacje Ab (10 μg/ml) przeprowadzono przez 1 godz. w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze po rozcieńczeniu w buforowanej Tris soli fizjologicznej A (TBS-A, 0,05M Tris, 0,15M NaCl, 0,05% Tween-20 (obj./obj.), 0,25% BSA), płukano w TBS-B (0,05M Tris, 0,15M NaCl, 0,05% Tween-20) i utrwalono przez 1 min w metanolu przed rozpoczęciem reakcji enzymatycznej. Aktywności peroksydazy chrzanu (HRP) i fosfatazy alkalicznej (AP) rozwijano stosując odpowiednio zestaw substratowy tabletek diaminobenzydyny (DAB) (Sigma) i fosforanu 5-bromo4-chloro-3-indolilu/błękit nitro tetrazolowy (BCIP/NIT, Pierce, Rockford, IL). Barwione skrawki tkanki ostatecznie utrwalono przez 5 min w metanolu i przeciwbarwiono Giemsa (Fluka, Buchs, Szwajcaria). Przeciwciała znakowane biotyną szczurze anty-B220, anty-CD11c, anty-syndekan-1 jak i nieznakowany szczurze anty-CD4, anty CD8e i antyCD8a nabyto od Pharmingen. Znakowaną biotyną aglutyninę z orzeszka ziemnego (PNA) uzyskano od laboratorium Vector (Burlingame, CA) znakowane-(HRP)-mysie anty-szczurze Ig i (HRP)streptawidynę nabyto od Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., a znakowaną AP-streptawidynę od Southern Biotechnology Associates, Inc. Przy immunocytochemii na tkance nerki, aby wykryć odkładanie Ig, stosowano skrawki parafinowe, odwoskowywano je i blokowano stosując rozcieńczoną surowicę końską od Vector (Burlingame, CA), a następnie barwienie HRP-kozy anty-mysia Ig od Jackson Immunoresearch. Wykrywanie przeprowadzono jak opisano powyżej.

PL 198 934 B1

P r z y k ł a d 1

Transgeniczne myszy założycielskie BAFF (BAFF Tg) mają nienormalny fenotyp.

Mysi BAFF pełnej długości wyrażano w transgenicznych myszach stosując specyficzny dla wątroby promotor alfa-1-antytrypsyny ze wzmacniaczem APO E. Wersję pełnej długości wybrano oczekując, że BAFF będzie albo cięty i będzie działać ogólnoustrojowo albo, jeśli będzie zatrzymany w formie związanej z błoną, będą obserwowane lokalne zaburzenia wątroby, być może dając wskazówki co do funkcji. Uzyskaliśmy 13 myszy założycielskich dodatnich dla transgenu BAFF (Tabela 2). Cztery z tych myszy padły w młodym wieku. Przeprowadzono rutynowe badania patologiczne na myszach 811 i 816 (Tabela 2). U myszy tych nie było ewidentnego zakażenia, jednak były widoczne zaburzenia sercowo-naczyniowe oraz zaburzenia nerek, które były podobne do opisanych dla ciężkiego nadciśnienia (Fu, 1995) (Tabela 2). Skrawki tkanki nerki barwione hematoksyliną i eozyną (H&E) założyciela 816 wykazały, że morfologia kłębuszków u tej myszy była nieprawidłowa, podczas gdy reszta nerki wydawała się normalna (dane nie przedstawione). Wiele transgenicznych założycielskich myszy BAFF miało białkomocz (Tabela 2). Immunocytochemia na zamrożonych skrawkach śledziony od myszy 816 wykazała nieprawidłowe i rozległe barwienie limfocytów B i obniżone barwienie limfocytów T i tę obserwację potwierdzono u potomstwa (zobacz poniżej Figura 12).

Stosując analizę FACS z dwoma kolorami wyliczono stosunek % limfocytów B B220 dodatnich do % limfocytów T CD4 dodatnich. Ten stosunek był dwa do siedem razy wyższy u myszy założycielskich BAFF Tg w porównaniu z negatywnymi myszami kontrolnymi BDF1 (Tabela 2) sugerując zwiększenie populacji limfocytów B u myszy BAFF Tg. Wybraliśmy dziewięć myszy założycielskich, by wygenerować nasze różne linie myszy transgenicznych, jak podkreślone w Tabeli 2. Żadna z pozostałych myszy założycielskich BAFF Tg ani pochodzące od nich potomstwo nie wykazywało żadnych oznak słabego zdrowia po miesiącach od wczesnej śmierci założycieli 696, 700, 811 i 816, sugerując, że te 4 myszy mogły wyrażać wyższe poziomy BAFF, co spowodowało ich śmierć. Nadekspresję BAFF w wątrobie myszy transgenicznych potwierdzono przez orthern blotting (dane nie przedstawione). U wszystkich badanych histologicznie myszy BAFF-Tg wątroba nie wykazywała zaburzeń wskazując, że lokalna ekspresja BAFF nie indukowała żadnych efektów immunologicznych czy patologicznych. Nie jest dostępne oznaczenie ELISA dla mysiego BAFF, jednak wykazaliśmy, że 2% surowica od myszy BAFF Tg ale nie od myszy kontrolnych, blokowała wiązanie pochodzącego z komórek ssaczych mysiego rozpuszczalnego znakowanego Flag BAFF z komórkami BJAB. Co więcej, 5% surowica od myszy BAFF Tg ale nie od myszy kontrolnych zwiększała proliferację ludzkich limfocytów B z PBL w obecności anty-μ (dane nie przedstawione). Te dane sugerują, że znaczne ilości rozpuszczalnego BAFF są obecne we krwi BAFF Tg.

P r z y k ł a d 2

Obwodowa limfocytoza u myszy BAFF Tg jest wynikiem podwyższonej ilości limfocytów B.

Stwierdzono, że populacja myszy transgenicznych ma więcej limfocytów w krwi w porównaniu z kontrolną populacją negatywnych myszy z tego samego miotu, osiągając wartości tak wysokie jak 13000 limfocytów/gl, krwi (Figura 7A). Przeciwnie, liczba granulocytów na μl krwi zarówno u myszy BAFF Tg jak i u myszy kontrolnych pozostała w normalnych granicach (Figura 7A). Ponieważ analiza FACS z użyciem przeciwciała anty-CD4 i anty-B220 komórek krwi obwodowej (PBL) od 18 myszy BAFF Tg pochodzących od sześciu różnych myszy założycielskich wykazała podwyższone stosunki B/T (Figura 7B i 7C), podwyższone poziomy limfocytów były wynikiem rozszerzonego podzbioru limfocytów B. Podobnie stosując ten sposób, wyliczenie całkowitej liczby krążących limfocytów T CD4 wykazało 50% obniżenie tego podzbioru limfocytów T u myszy BAFF Tg w porównaniu z myszami kontrolnymi i tej samej obserwacji dokonano dla podzbioru CD8 T (dane nie przedstawione). Wszystkie limfocyty B od PBL myszy BAFF Tg mają zwiększoną ekspresję MHC klasy II i Bcl-2 w porównaniu z limfocytami od myszy kontrolnych (odpowiednio Figura 7D i 7E), wykazując pewien poziom aktywacji limfocytów B w PBL myszy BAFF Tg. Limfocyty T we krwi myszy BAFF Tg nie wyrażały wczesnych markerów aktywacji CD69 czy CD29, jednak 40 do 56% komórek CD4 lub CD8 było aktywowanymi limfocytami efektorowymi T z CD44^hi. Tak więc myszy BAFF Tg wyraźnie wykazują oznaki limfocytozy limfocytów B i globalnej aktywacji limfocytów B wraz ze zmianami limfocytów T.

P r z y k ł a d 3

Rozszerzone przedziały limfocytów B są złożone z komórek dojrzałych.

Aby sprawdzić, czy nadekspresja BAFF u myszy transgenicznych wpływa na przedział limfocytów B centralnie w szpiku kostnym i obwodowo we wtórnych gruczołach limfoidalnych, za pomocą

PL 198 934 B1

FACS zbadaliśmy śledzionę, szpik kostny i krezkowe węzły chłonne od w sumie siedmiu myszy BAFF Tg i siedmiu kontrolnych myszy z tego samego miotu pochodzących od czterech różnych myszy założycielskich. Przedział dojrzałych limfocytów B analizowano przez barwienie zarówno przeciwciałami anty-B220 i anty-IgM. Dwie typowe myszy BAFF Tg i jedna typowa mysz kontrolna z tego samego miotu są przedstawione na Figurze 8. Przedział dojrzałych limfocytów B (IgM+, B220+) był zwiększony zarówno w śledzionie jak i krezkowych węzłach chłonnych (Figura 8A, odpowiednio górny i dolny panel). Analiza limfocytów B B220+/IgM+ (Figura 7A, panel środkowy) lub przedziałów komórek proB (CD43+/B220+) i komórek preB (CD43-B220+) w szpiku kostnym (Figura 8B) wykazała, że myszy BAFF Tg i kontrolne myszy z tego samego miotu były podobne. Te dane wskazują, że nadekspresja BAFF wpływa na proliferację dojrzałych limfocytów B na obwodzie, ale nie komórek rodzicielskich B w szpiku kostnym. Analiza za pomocą FACS podpopulacji limfocytów B w śledzionie wykazała zwiększony udział limfocytów B strefy marginalnej (MZ) u myszy BAFF Tg w porównaniu z myszami kontrolnymi (Tabela 2). Populacja pęcherzykowych limfocytów B pozostała proporcjonalna zarówno u myszy BAFF Tg jak i u myszy kontrolnych, podczas gdy frakcja nowoutworzonych limfocytów B jest nieznacznie obniżona u myszy BAFF Tg (Tabela 3). Ten wynik potwierdzono także na limfocytach B 220⁺ śledziony stosując przeciwciała anty-CD38 przeciw anty-CD24 i przeciwciała anty-IgM przeciw anty-IgD i analizując pod kątem CD38^hi/CD24⁺i IgM^hi/IgD^lo dla populacji limfocytów B MZ, odpowiednio, jak uprzednio opisano (Oliver i wsp., 1997) (dane nie przedstawione). Analiza immunohistochemiczna przy użyciu przeciwciała antymysie IgM wykazała ekspansję obszaru IgM-jasny limfocytów B MZ w śledzionie myszy BAFF Tg w porównaniu z myszami kontrolnymi (dane nie przedstawione). Wszystkie komórki B B220⁺ śledziony także wyrażają wyższe poziomy MHC klasy II (Tabela 3) i Bcl-2 (dane nie przedstawione) w porównaniu z limfocytami B śledziony od myszy kontrolnych, wskazując, że aktywowane są zarówno limfocyty B śledziony jak i limfocyty B z PBL.

P r z y k ł a d 4

Myszy BAFF Tg mają wysokie poziomy całkowitych immunoglobulin, czynników reumatoidalnych i krążących kompleksów immunologicznych w swojej surowicy

Zwiększony przedział limfocytów B u myszy BAFF Tg sugerował, że poziom całkowitego Ig w krwi tych zwierząt też mógłby być zwiększony. SDS-PAGE, analiza surowicy od myszy BAFF Tg i miotów kontrolnych wykazała, że prążki IgG łańcuchów ciężkich i lekkich były przynajmniej 10 razy bardziej intensywne u 3 z 4 myszy BAFF Tg w porównaniu z surowicami kontrolnymi (Figura 9A). Podobnie, oznaczenie ELISA surowic od myszy BAFF Tg pokazuje znacząco wyższe całkowite poziomy Ig w porównaniu z poziomami dla myszy kontrolnej (Figura 9B).

Mimo wysokich poziomów stwierdzanych w SDS-PAGE nadmiernie wysokie poziomy Ig wykrywane przez oznaczenia ELISA u niektórych myszy, np. 697-5, 816-8-3 i 823-20 doprowadziły nas do podejrzewania obecności czynników reumatoidalnych (RF) w surowicach, lub autoprzeciwciał skierowanych przeciwko antygenowym determinantom na fragmencie Fc IgG (Jefferis, 1995). Te przeciwciała mogły wiązać anty-mysi Ig kozy stosowany do powlekania płytek ELISA i dawać błędnie wysokie wartości. Płytki ELISA powleczono normalnym nieistotnym kozim Ig Ig i zmierzono wiązanie Ig BAFF Tg do normalnego Ig kozy. Figura 9C pokazuje, że surowice od większości myszy BAFF Tg zawierały Ig reagujący z normalnym Ig kozy, podczas gdy tylko dwie z 19 myszy kontrolnych wykazywały reaktywność w tym samym oznaczeniu. Te RF pochodziły głównie od izotypów IgM, IgA i IgG2a (dane nie przedstawione).

Obecność RF może być związana z wysokimi poziomami krążących kompleksów immunologicznych (CIC) i krioglobuliny we krwi (Jefferis, 1005). Aby sprawdzić czy myszy BAFF Tg mają nienormalne poziomy CIC w surowicy, zastosowano oznaczenie oparte na C1q, aby wykryć CIC u analizowanych powyżej 21 myszy BAFF Tg. Tylko 5 BAFF Tg wykazało znacząco wysokie poziomy CIC w porównaniu z myszami kontrolnymi, jednak te myszy odpowiadają zwierzętom mającym najwyższe poziomy całkowitego Ig i czynnika reumatoidalnego (Figura 9D). Zaobserwowaliśmy również tworzenie się osadów, gdy rozcieńczano surowice myszy BAFF Tg 1/15 w wodzie ale nie w surowicach kontrolnych, co wskazuje na obecność krioglobuliny u tych myszy (dane nie przedstawione). Zatem w dodatku do hiperplazji limfocytów B myszy BAFF Tg wykazują ostrą hiperglobulinemię związaną z RF i CIC.

P r z y k ł a d 5

Niektóre myszy BAFF Tg mają wysokie poziomy autoprzeciwciał przeciw jednoniciowemu (ss) i dwuniciowemu (ds) DNA.

PL 198 934 B1

Wstępnie obserwowaliśmy zaburzenia nerki przypominające chorobę podobną do tocznia u dwóch z naszych myszy założycielskich (Tabela 2). Obecność autoprzeciwciał anty-DNA opisano również u pacjentów z SLE lub u SLE-podobnej myszy (SWR X NZB) F1 (SNF1) (Datta i wsp., 1987). Wykryto poziomy autoprzeciwciał anty-ssDNA u myszy BAFF Tg, u których uprzednio stwierdzono najwyższy poziom całkowitej Ig w surowicy (Figura 10A). Analizowaliśmy surowicę dwóch myszy BAFF Tg negatywnych pod względem przeciwciał na ssDNA (697-5 i 816-1-1) i trzech transgenicznych myszy wydzielających przeciwciała anty-ssDNA (820-14 816-8-3 i 820-7) na obecność przeciwciał na ssDNA równolegle z pięcioma kontrolnymi myszami z tego samego miotu. Myszy BAFF Tg także wydzielały anty-dsDNA, jednak poziomy wydzielania nie zawsze korelowały z przeciwciałami anty-ssDNA, jako że surowica od myszy BAFF Tg 687-5, która nie zawierała wykrywalnych poziomów przeciwciał anty-ssDNA, była wyraźnie dodatnia dla obecności anty-dsDNA (Figura 10B). Tak więc myszy TAFF Tg wykazujące najbardziej ostrą hiperglobulinemię wydzielają patologiczne poziomy autoprzeciwciał anty-DNA. Dodatkowo, co także przypomina problem podobny do tocznia, u tych myszy wykryliśmy odkładanie się immunoglobulin w nerce sześciu analizowanych myszy BAFF Tg (Figura 10C), a trzy z tych myszy nie wydzielały wykrywalnych poziomów przeciwciał anty-DNA (dane nie przedstawione).

P r z y k ł a d 6

Myszy BAFF Tg mają powiększone pęcherzyki limfocytów B, liczne ośrodki rozmnażania, zmniejszone liczby komórek dendrytycznych i zwiększoną liczbę komórek plazmatycznych zarówno w śledzionie jak i krezkowych węzłach chłonnych.

Myszy BAFF Tg miały duże śledziony, MLN (dane nie przedstawione) i kępki Peyera (Figura 11). Immunohistochemia wykazała obecność powiększonych pęcherzyków limfocytów B i zmniejszone obwodowe tętniczkowe arkusze limfoidalne (PALS lub obszar komórek T) u myszy BAFF Tg (Figura 12B). Co ciekawe, zaobserwowano nieliczne ośrodki rozmnażania u nieimmunizowanych myszy kontrolnych z tego samego miotu (co ogólnie jest typowe dla tej kolonii) i obecne są małe (Figura 12C), podczas gdy myszy BAFF Tg pod nieobecność immunizacji mają liczne ośrodki rozmnażania (Figura 12D). Barwienie anty-CD11c komórek dendrytycznych w strefie limfocytów T i strefie brzeżnej myszy kontrolnych (Figura 12E) było znacznie obniżone u myszy BAFF Tg (Figura 12F). Komórki plazmatyczne syndekan-1-dodatnie były nieomal niewykrywalne w śledzionie od kontrolnych myszy z tego samego miotu (Figura 12G), jednak czerwona miazga myszy BAFF Tg była silnie dodatnia dla syndekanu-1 (Figura 12H). Bardzo podobne obserwacje zrobiono dla MLN (Figura 13), W MLN myszy BAFF Tg obszary limfocytów B były dramatycznie rozszerzone (Figura 13B) w porównaniu z normalnym węzłem, gdzie pęcherzyki limfocytów B można było łatwo rozpoznać na obrzeżu węzła pod kapsułką z typową parakortykalną strefą limfocytów T (Figura 13A). Rdzeń MLN od myszy BAFF Tg był wypełniony komórkami syndekan-1 dodatnimi, które przypuszczalnie są komórkami plazmatycznymi (Figura 13H). Konkludując, analiza wtórnych narządów limfoidalnych u myszy BAFF Tg była zgodna z rozszerzonym fenotypem limfocytów B wykazującym wielokrotne komórkowe anomalie i intensywną aktywność immunologiczną.

T a b e l a 1. Ekspresja MARCH w różnych liniach komórkowych

Typ komórek	Linie komórkowe	Wiązanie MARCH	Specyficzne szczegóły
1	2	3	4
Nabłonkopodobne	HT-29	_-	gruczolakorak jelita grubego
	A375	-/+	czerniak
	MCF-7	-	gruczolakorak sutka
	ME260	-	czerniak
	Cos	+	komórki nerki małpy
Fibroblasty	WI-38	_-	płuco
	Hs-68	-	napletek
	Hs-27	-	napletek
Komórki śródbłonka	HUVEC	-	żyła pępowinowa
Makrofagi/monocyty	THP-1	-/+	monocyt
Linie limfocytów T	Molt-4	_-	białaczka limfoblastyczna
	Hut-78	-	chłoniak skórny
	Jurkat	-	białaczka limfoblastyczna

PL 198 934 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4
Linie limfocytów B	BJAB	+++	chłoniak Burkitta
	Namalwa	+ +	chłoniak Burkitta
	Daudi	+/-	chłoniak Burkitta EBNA + VCA+
	Ramos	+ +	chłoniak Burkitta EBV-
	Raji	+++	chłoniak Burkitta
	JIYOYE	+	chłoniak Burkitta
	SKW.64	+ +	IgM EBV+ wydzielający
	RPMI 1788	+++	krew obwodowa, wydzielający IgM
	IM-9	+++	limfoblast wydzielający Ig
	NC-37	+++	limfoblast EBV+
Linie komórek myszy	WEHI-231	-	chłoniak limfocytów B
	A20	-	chłoniak limfocytów B

Ekspresję powierzchniową MARCH określano za pomocą FACS stosując MARCH znakowany FLAG jak opisano w Materiałach i Metodach

T a b e l a 2. Założyciele transgenicznych myszy BAFF

Mysz numer	Białkomocz³	B/T^b
690 samica^d	ND	2
696 samiec^c	ND	ND
697 samica	+++	ND
700 samiec^c	ND	ND
802 samiec	++	4,6
804 samica	+++	5,4
807 samica	ND	4
810 samiec	+++	7,8
811 samiec^c/e	ND	ND
813 samiec	+	5,4
816 samica^e/f	++	ND
820 samiec	++	3
823 samiec	++	2,9
kontrolna samica BDF1	+/-	1,5
kontrolny samiec BDF1	+/-	2,5

^a Białkomocz mierzono stosując medyczne paski barwne zanurzone w moczu myszy i określano następująco:

- brak białkomoczu, + /- ślad, + (30 mg/dl), ++ (100 mg/dl), +++ (300 mg/dl), ++++ (>2000 mg/dl).

^b B/T jest proporcją % limfocytów B do % T w PBL określoną przez analizę FACS, stosując znakowany PE anty-B220 i znakowane FITC przeciwciała przeciwko CD4 do barwienia podwójnego.

^c Wczesna nagła śmierć.

^d Brak przekazywania transgenu u potomstwa.

^e W sekcji zaobserwowano nieprawidłowości sercowo-naczyniowe i nerek.

^f Mysz uśmiercono ze względu na obecność krwi w moczu. Po analizie skrawków ze wszystkich tkanek barwionych H&E zaobserwo wano zaburzenia serca, nerek i tętnic. Zwiększoną populację limfocytów B śledziony określono za pomocą immunocytochemii na zamrożonych skrawkach śledziony przy użyciu znakowanych biotyną przeciwciał antymysich B220 i przeciwciała przeciwko CD4 myszy, a następnie streptoawidyny znakowanej fosfatazą alkaliczną i Ig przeciw szczurowi znakowanej peroksydazą chrzanową.

Podkreślono myszy założycielskie stosowane do rozmnażania ND: nie badano

PL 198 934 B1

T a b e l a 3. Zwiększona ekspresja MHC klasy II na limfocytach B i zwiększony udział limfocytów MZ B w śledzionie myszy BAFF Tg

	Poziom ekspresji MHC klasy II na limfocytach B B220+(MFI)	% pęcherzykowych limfocytów B (B220+/IgM^lo/CD21^int)	% pęcherzykowych limfocytów B (B220+/IgM^lo/CD21^int)	% pęcherzykowych limfocytów B (B220+/lgM^lo/CD21^int)
Myszy kontrolne 816-1-10	1170	45	6	12
802-21	1029	48	10,5	9
823-1	1240	39	9	6,5
Myszy BAFF Tg 802-6	1707	49	18	5,9
820-7	1900	39	23	6,3
816-1-1	2088	40	23	5,8
Splenocyty analizowano za pomocą FACS i bramkowano na populacji B220+
Przedstawiono reprezentatywny eksperyment MFI: średnia intensywności fluorescencji

Lista sekwencji <110> BIOGEN, INC ^<120> BAFF, pokrewne czynniki blokujące i ich zastosowanie w stymulacji i hamowaniu komórek B i immunoglobulin w odpowiedziach immunologicznych <13 0> A070PCT <140> PCT/USOO/01788 <141> 2000-01-25 <150> 60/143,228 <151> 1999-07-09 <150> 60/117,169 <151> 1999-01-25 <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gin Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu

1

5

10

15

Lys

Arg

Glu

Met

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

Val

Ser

Ile

Leu

Pro

20

25

30

Arg

Lys

Glu

Ser

Pro

Ser

Val

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Val

35

40

45

Ser

Phe

Tyr

Gin

Val

Ala

Leu

Gin

Gly

Asp

Leu

Ala

Ser

Leu

Arg

50

55

60

Ala

Glu

Leu

Gin

Gly

His

Ala

Glu

Lys

Leu

Pro

Ala

Gly

Ala

Lys

65

70

75

80

Ile

Phe

Glu

Pro

Ala

Pro

Gly

Glu

Gly

Asn

Ser

Gin

Asn

Ser

85

90

95

Arg

Asn

Lys

Arg

Ala

Val

Gin

Gly

Pro

Glu

Thr

Val

Thr

Gin

Asp

PL 198 934 B1

100

105

110

Cys

Leu

Gin

Leu

Ile

Ala

Asp

Ser

Glu

Thr

Pro

Thr

Ile

Gin

Lys

Gly

115

120

125

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

Ser

Ala

130

135

140

Leu

Tyr

Gly

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

His

145

150

155

160

Leu

Ile

Gin

Arg

Lys

Val

His

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

165

170

175

Val

Thr

Leu

Phe

Arg

Cys

Ile

Gin

Asn

Leu

Glu

Gly

Asp

Glu

Leu

180

185

190

Gin

Leu

Ala

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

Ile

Ser

Leu

Asp

Gly

Asp

195

200

205

Val

Thr

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

210 215 <210> 2 <211> 232 <212> PRT ^<213> Mysi <400> 2

Met 1

Asp

Glu

Ser

Ala 5

Lys

Thr

Leu

Pro

Pro 10

Pro

Cys

Leu

Cys

Phe 15

Cys

Ser

Glu

Lys

Gly 20

Glu

Asp

Met

Lys

Val 25

Gly

Tyr

Asp

Pro

Ile 30

Thr

Pro

Gin

Lys

Glu 35

Glu

Gly

Ala

Val

Leu 40

Leu

Ser

Phe 45

Thr

Ala

Met

Ser

Leu 50

Tyr

Gin

Leu

Ala

Ala 55

Leu

Gin

Ala

Asp

Leu 60

Met

Asn

Leu

Arg

Met 65

Glu

Leu

Gin

Ser

Tyr 70

Arg

Gly

Ser

Ala

Thr 75

Pro

Ala

Lys 80

Leu

Thr

Pro

Ala

Pro

Arg

Pro

His

Asn

Ser

Arg

Gly

His

90 95

PL 198 934 B1

Arg Asn Arg Arg Ala Phe Pro Gly Pro Glu Glu Thr Glu Gin Asp Val

100

105

110

Asp

Leu

Ser

Ala

Pro

Ala

Leu

Arg

Asn

Ile

Gin

Asp

Cys

Leu

115

120

125

Gin

Leu

Ile

Ala

Asp

Ser

Asp

Thr

Pro

Thr

Ile

Arg

Lys

Gly

Thr

Tyr

130

135

140

Thr

Phe

Val

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

Asn

Ala

Leu

Tyr

145

150

155

160

Ser

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Pro

Ile

Phe

Ala

Met

Gly

His

Val

Ile

165

170

175

Gin

Arg

Lys

Lye

Val

His

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

ISO

185

190

Leu

Phe

Arg

Cys

Ile

Gin

Asn

Leu

Glu

Gly

Asp

Glu

Ile

Gin

Leu

195

200

205

Ala

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

Ile

Ser

Arg

Asn

Gly

Asp

Thr

210

215

220

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

225 230 <210> 3 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Val Thr Gin Asp Cys Leu Gin Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro

Thr

1

5

10

15

Ile

Gin

Lys

Gly

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

20

25

30

Arg

Gly

Ser

Ala

Leu

Glu

Lys

Tyr

Gly

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

35

40

45

Lys

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

His

Leu

Ile

Gin

Arg

Lys

Val

His

Val

50

55

60

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Asn

Ser

Cys

Tyr

Ser

Ala

Gly

Ile

Ala

65

70

75

80

PL 198 934 B1

Lys Leu

Glu

Glu Gly

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Ala

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

85

90

95

Ala Gin

Ile

Ser

Leu

Asp

100

<210> 4

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Lys Gin

His

Ser

Vąl

Leu

His

Leu

Val

Pro

Ile

Asn

Ala

Thr

Ser

Lys

1

5

10

•1 c

j__?

Asp Asp

Ser

Asp

Val

Thr

Glu

Val

Met

Trp

Gin

Pro

Ala

Leu

Arg

20

25

30

Gly Arg

Gly

Leu

Gin

Ala

Gin

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

Gin

Asp

Val

35

40

45

Thr Phe

Thr

Met

Gly

Gin

Val

Ser

Arg

Glu

Gly

Gin

Gly

Arg

Ala

50

55

60

Tyr Asn

Ser

Cys

Tyr

Ser

Ala

Gly

Val

Phe

His

Leu

His

Gin

Gly

Asp

65

70

75

80

Ile Leu

Ser

Val

Ile

Pro

Arg

Ala

Arg

Ala

Lys

Leu

Asn

Leu

Ser

85

90

95

<210>

5

<211>

104

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

5

Ser Asp Lys Pro Val

Ala

His

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

1

5

10

15

Gin Leu Gin Trp Leu

Asn

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Gly

25 30

PL 198 934 B1

Val

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

35

40

45

Val

Leu

Thr

His

Thr

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

50

55

60

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

65

70

75

80

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

85

90

95

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

100 <210> 6 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 6 Glu Leu 1

Arg

Lys

Val 5

Ala

His

Leu

Thr

Gly 10

Lys

Ser

Asn

Ser

Arg 15

Ser

Met

Pro

Leu

Glu 20

Trp

Glu

Asp

Thr

Tyr 25

Gly

Ile

Val

Leu

Leu 30

Ser

Gly

Val

Lys

Tyr 35

Ser

Lys

Val

Tyr

Phe 40

Arg

Gly

Gin

Ser

Cys 45

Asn

Leu

Pro

Leu 50

Ser

His

Lys

Val

Tyr 55

Met

Arg

Asn

Ser

Lys 60

Tyr

Pro

Gin

Met

Trp 65

Ala

Arg

Ser

Tyr 70

Leu

Gly

Ala

Val

Phe 75

Asn

Leu

Thr

Ser

Ala 80

Asp

His

Leu

Tyr

Val 85

Asn

Val

Ser

Glu

Leu 90

Ser

Leu

Val

Asn

Phe 95

Glu

Glu <210> 7 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 198 934 B1

<400> 7

Pro

Ser

Lys

Gin 15

Asn

Thr 1

Leu Lys

Pro Ala Ala His Leu Ile Gly

Asp

5

10

Ser

Leu

Trp

Arg

Ala

Asn

Thr

Asp

Arg

Ala

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

20

25

30

Phe

Tyr

Ser

Gin

Val

Phe

Ser

Gly

Lys

Ala

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ala

35

40

45

Thr

Ser

Pro

Leu

Tyr

Leu

Ala

His

Glu

Val

Gin

Leu

Phe

Ser

50

55

60

Gin

Tyr

Pro

Phe

Pro

Trp

Leu

His

Ser

Met

Tyr

His

Gly

Ala

Phe

65

70

75

80

Gin

Leu

Thr

Gin

Gly

Asp

Gin

Leu

Ser

Thr

His

Thr

Asp

Gly

Ile

Pro

85

90

95

His

Leu

Val

Leu

Ser

Phe

100 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 8

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Thr

Asp

Ile

Pro

1

5

10

15

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Ser

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

20

25

30

Trp

Gly

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

35

40

45

Glu

Thr

Ser

Gly

Asp

Leu

Ala

Thr

Glu

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

50

55

60

Val

Thr

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser

65

70

75

80

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ser

Gly

Glu

Ile

Ser

90 95

PL 198 934 B1

Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin

	100	105
<210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 9 actgtttctt	ctggaccctg	aacggc	26
<210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 10 gacaagcttg	ccaccatgga	tgactccaca	30
<210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 11 actagtcaca	gcagtttcaa	tgc	23
<210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 12 ctgcagggtc	cagaagaaac	ag	22
<210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 13 ggagaaggca	actccagtca	gaac	24
<210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Homo	sapiens

PL 198 934 B1 <400> 14 caattcatcc ccaaagacat ggac 24 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tcggaacaca acgaaacaag tc 22 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 16
cttctccttc acctggaaac tgactg	26
<210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ggcatcgtga tggactccg	19
<210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gctggaaggt ggacagcga	19
<210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 taagaatgcg gccgcggaat ggatgagtct gcaaa	35
<210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens

PL 198 934 B1 <400> 20 taagaatgcg gccgcgggat cacgcactcc agcaa 35 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gcagtttcac agcgatgtcc t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gtctccgttg cgtgaaatct g 21

Claims

1. Zastosowanie przeciwciała swoistego wobec rozpuszczalnego BAFF lub aktywnego fragmentu przeciwciała do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby autoimmunizacyjnej.

2. Zastosowanie przeciwciała swoistego wobec rozpuszczalnego BAFF lub aktywnego fragmentu przeciwciała do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzenia rozrostowego układu chłonnego limfocytów B.

3. Zastosowanie rozpuszczalnego BAFF lub jego aktywnego fragmentu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby immunosupresyjnej.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że choroba immunosupresyjna spowodowana jest przez HIV.