WO2006025345A1

WO2006025345A1 - 抗ヒトｂａｆｆ抗体

Info

Publication number: WO2006025345A1
Application number: PCT/JP2005/015696
Authority: WO
Inventors: Tsutomu Takeuchi; Keiko Yoshimoto
Original assignee: Kowa Company, Ltd.
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2005-08-30
Publication date: 2006-03-09
Also published as: EP1826218A1; US20080050381A1; US20110081351A1; JP2011191316A; US20140024055A1; EP1826218B1; JPWO2006025345A1; JP5570681B2; EP1826218A4; US20210215705A1

Abstract

　本発明は、ヒトＢＡＦＦ(B cell activating factor belonging to the TNF family)タンパク質の１３４～１４６番目の、ＡＶＱＧＰＥＥＴＶＴ　ＱＤＣ（アミノ酸１文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体、好ましくは当該モノクローナル抗体に関する。また、本発明は、前記本発明の抗体の製造方法、当該抗体を含有してなる医薬組成物、当該抗体の使用、及び当該抗体を用いたＢＡＦＦの阻害作用又は活性化作用をスクリーニングする方法に関する。

Description

抗ヒト BAFF抗体

技術分野

[0001] 本発明は、新規な抗ヒト BAFF抗体、好ましくは抗ヒト BAFFモノクローナル抗体、及びその製造方法に関する。また、本発明は、当該抗体、好ましくは当該モノクロ一ナル抗体を用いた、全身性エリテマトーデス (SLE)、慢性関節リウマチ (RA)、シエーダレン症候群 (SS)、自己免疫性糖尿病、 AIDS又は B細胞の活性ィ匕を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防，治療のための医薬組成物、それを含有してなる診断剤及び診断方法、並びに当該抗体の有効量を投与することからなる自己免疫疾患の予防 '治療方法に関する。さらに本発明は、当該抗体、好ましくは当該モノクロ一ナル抗体を用いた、 BAFFの定量方法、及び BAFFに対する阻害作用又は活性ィ匕作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。

背景技術

[0002] BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)は、 T細胞、単球 Zマクロファージ、榭状細胞等から産生'分泌され、 B細胞上の 3種の受容体を介して B細胞の分化、活性化、生存等を制御することが知られている（Mooreら Science(1999)28 5,260-263)。

[0003] ヒト BAFFは、 285個アミノ酸力もなる膜貫通型の蛋白質である。そのアミノ酸配列中には、 46アミノ酸の細胞質ドメインと 218アミノ酸の細胞外ドメインが存在し、また、 Nグリコシル化部位が 2ケ所有り、 3量体を形成するとヽつた構造的な特徴を有する。さらに C末端から 152アミノ酸の細胞外ドメインは、 Furinファミリーのプロテアーゼによつて切断され、可溶型として遊離されると考えられている。ヒト BAFFのアミノ酸配列は当初、 Neutrokine aとの名称で、国際特許出願公開 W098Z18921号公報中の配列番号 1又は 2として開示された。この他別名称として、 Kay、 TNFSF13B、 Blys 、 TALL— 1、 THANK, zTNF4等も知られている。

[0004] BAFFの受容体としては、 BAFF— R、 TACI(transmembrane activator and calciu m modulator and cyclophilin ligand interactor)、及び BCMA(B cell maturation antig en)が知られている。 BAFF— R及び BCMAは主に B細胞に発現しており、 TACIは B細胞と活性化 T細胞に発現してヽる。

[0005] BAFFの生理的作用は、上述のように B細胞の分化、活性化、生存等の制御である力近年、病態との関わりも次第に明らかとなった。即ち、 BAFFを過剰に発現するマウスでは、末梢血 B細胞の増多、リンパ節や脾臓の肥大、血清中 IgG濃度上昇、抗核抗体産生、腎内に免疫複合体の沈着、蛋白尿、腎炎等の、 SLE様の症状を示すことが報告されている（Mackayら J.Exp.Med.,(1999)190,1697-1710、及び Khareら Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA (2000)97,3370-3375) ₀さらにこのマウスは、加齢と共に唾液腺炎、唾液腺破壊等の、 SS様の症状を示すことも判明した (Groomら J.Clin.Invest.( 2002)109,59-68) oまた SLE、 RA、 SSの患者において、血清中 BAFF濃度が増加していることも報告されており（Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59-68、 Zhangら J.Imm unol.(2001)166,6- 10、及び Cheemaら Arthritis Rheum.(2001)44,1313- 1319)、さらには RA患者の滑液中 BAFFレベルは血清中に比べて高いこと（Cheemaら Arthritis R heum.(2001)44,1313-1319)や、 SS患者の唾液腺浸潤白血球における BAFFの発現 (Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59- 68)、 SLE患者における血清 BAFFレベルとィムノグロブリンゃ抗 dsDNA抗体との相関性（Zhangら J.Immunol.(2001)166,6-10)、 R A患者における BAFFとリウマトイド因子との相関性（Cheemaら Arthritis Rheum. (200 1)44,1313- 1319)等、数多くの報告がある。

[0006] これらの事実から、 SLE、 RA、 SS等の自己免疫疾患の患者はもとより、その発症前においても、血清中あるいは組織中（例えば、 RA患者の滑液など）の BAFFを測定することは、病態の進展の把握、即ち診断に役立つということができる。また、 BAF Fの機能を阻害することにより、 SLE、 RA、 SS等の自己免疫疾患の予防'治療も可能となる。

[0007] BAFFのような蛋白質の測定には、その蛋白質を認識できる抗体を用いる方法が一般的である。実際、 BAFFに対する抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体併せていくつかの市販品（例えば、 R&D Systems社の抗ヒトモノクローナル抗体 (Ca talog Number:MAB124)や、 Santa Cruz Biotech社のャギ抗ヒト BAFFポリクローナル抗体 (Catalog Number:SC- 5743)、 ALEXIS社のマウス抗ヒト BAFFモノクローナル抗体 (Catalog Number:ALX- 804- 128- C100)など）が存在する力これらの抗体は、 BA FFの全長又は C末端側のアミノ酸配列を抗原として作製されたものであり、ゥエスタンブロット法においてヒトリコンビナント BAFFに対する高い特異性を示さず、また、 E LISAにおける検出限界の面においても充分とはいえず、高感度の診断に耐えうるほど満足できるものは知られてヽな、。

[0008] また、 SLE、 RA、 SS等の自己免疫疾患の予防'治療として BAFFの機能を阻害する方法としては、 BAFF遺伝子発現抑制等の BAFF産生を抑制又は阻害する方法、 BAFF受容体拮抗薬等による BAFF受容体を阻害する方法、及び、抗 BAFF抗体等による BAFFの機能自体を阻害する方法等が考えられる。例えば、 Human Genom e Sciences社による抗ヒト BAFF(BLyS™)モノクローナル抗体（開発名： LymphoStat- B^TM)の、 SLE、 RA患者に対する臨床試験力米国で第 2相の臨床試験まで進められて、ることが知られて!/、るが、その治療薬としての可能性は必ずしも充分とは、えず、予防薬あるいは治療薬としてさらに有効な作用効果を有する抗体の開発が求められている。

発明の開示

[0009] 本発明の目的は、自己免疫疾患の診断に使用しうるより高感度の抗ヒト BAFF抗体を提供することにある。また、そのような抗ヒト BAFF抗体を用いることにより、多くの自己免疫疾患をより効率的に予防 ·治療することが可能となり、本発明はこのような医薬組成物、それを用いた予防 *治療方法を提供する。さらに、そのような抗ヒト BAFF抗体を用いることにより、ヒト BAFFの阻害薬又は活性ィ匕薬のスクリ一ユング方法をも提供でさること〖こなる。

[0010] そこで本発明者らは鋭意検討した結果、ヒト BAFFのアミノ酸配列中、細胞外ドメインの膜近傍に相当する 13アミノ酸 (配列番号 1)をノヽプテンとして、 KLH(Keyhole lim pet hemocyanin)を結合させたものを抗原として作製した新規なモノクローナル抗体（以下 4H4と表記する)が、ヒト BAFFを検出する ELIS Aにお、てこれを検出抗体として用いる場合には、 0. 5ngZmLの検出限界が得られるという驚くべき高感度での検出が可能となることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、ヒト BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)タンパク質の 134〜146番目の、 AVQGPEETVT QDC (アミノ酸 1文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体、好ましくは当該モノクローナル抗体に関する。

また、本発明は、前記本発明の抗体の製造方法を提供するものであり、本発明は、少なくとも AVQGPEETVT QDC (アミノ酸 1文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含有する抗原を用いて、動物、好ましくはヒト以外の動物を感作し、当該動物の免疫産生細胞から前記ペプチドに対する抗体を製造する方法に関する。

[0011] 本発明は、前記した本発明の抗体の各種の用途又は使用を提供するものである。

即ち、本発明は、前記本発明の抗体、及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物、好ましくは自己免疫疾患を予防，治療するための医薬組成物に関する。また、本発明は、自己免疫疾患の患者又は自己免疫疾患の可能性が有る患者に、前記本発明の抗体の有効量を投与することからなる自己免疫疾患の予防又は治療方法に関する。さらに本発明は、自己免疫疾患の予防'治療用の医薬組成物、又は自己免疫疾患の診断用の組成物を製造するための前記本発明の抗体の使用に関する。

[0012] また、本発明は、前記本発明の抗体を含有してなる自己免疫疾患の診断剤、及びそれを用いた診断方法に関する。

[0013] さらに、本発明は、検体中に前記本発明の抗体を添加して、当該抗体と結合した B

AFFを測定することからなる検体中の BAFFを検出又は定量する方法に関する。

[0014] また、本発明は、 BAFFを含有する試料中に試験物質を添加し、試験物質の添カロによる BAFFの量の変化を前記本発明の抗体を用いて測定することからなる、試験物質が有する BAFFの阻害作用又は活性ィ匕作用をスクリ一二ングする方法に関する図面の簡単な説明

[0015] [図 1]図 1は、本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体 (4H4)及び対照として Chemic on製ゥサギ抗ヒト BAFFポリクローナル抗体 (Chem)を用い、常法のウェスタンブロッテイング法にてリコンビナントのヒト BAFF(Chemicon製)を検出した図である。 [図 2]図 2は、 4H4を用いて確立した ELISAによる、リコンビナントのヒト BAFF(Chemi con製)を用いて作成した標準曲線である。

[図 3]図 3は、健常人由来又は SLE患者由来の PBLに対し抗 CD3抗体刺激により誘導された IgGの産生に対する 4H4の効果を示す図である。

[図 4]図 4は、健常人由来又は SLE患者由来の PBLに対し抗 CD3抗体刺激により誘導された IFN yの産生に対する 4H4の効果を示す図である。

[図 5]図 5は、健常人由来又は SLE患者由来の PBLに対し抗 CD3抗体刺激により誘導された TNF aの産生に対する 4H4の効果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 本発明の抗体は、 285個のアミノ酸からなるヒト BAFFのアミノ酸配列中における細胞外ドメインの膜近傍に相当する 134〜 146番目の次に示す、

AVQGPEETVT QDC

のアミノ酸配列 (配列番号 1参照)からなるペプチドを含有する抗原を用いて製造されたものであることを特徴とするものである。

通常の抗体は、タンパク質の N末端側や C末端側のアミノ酸配列を抗原として使用して製造される。タンパク質の中央部付近のアミノ酸配列は、立体的にタンパク質の内部に来る場合があり、抗原として不適切である場合が多々あるからである。タンパク質の N末端側や C末端側は、多くの場合立体的に露出した構造となり、このようにして製造された抗体が充分な感度を有することが多、こともよく知られて、ることである。このようなことから、抗ヒト BAFF抗体も従来は N末端側や C末端側のアミノ酸配列に基づいて製造されていた。しかし、本発明者らは、このようにして製造された抗ヒト B AFF抗体が必ずしも充分な感度を有するものではないことを見出した。その理由の詳細については明確ではないが、ヒト BAFFの N末端側又は C末端側が、通常のタンパク質とは異なり充分に露出した構造になっていないことが予想される。即ちヒト B AFFの特異的な 3次元構造のためと考えられる力その詳細は明らかでない。今後、ヒト BAFFの 3次元構造が解明されることにより明確になると予想される。

[0017] 本発明の抗体は、ヒト BAFFのほぼ中央部のアミノ酸配列力なるペプチドを抗原として使用することを特徴とするものであり、このような中央部のアミノ酸配列が抗原として適切であることは驚くべきことであり、ヒト BAFFタンパク質の特異的な 3次元構造によるちのと予測される。

[0018] 本発明の抗体は、前記ペプチドを抗原として使用することを特徴とするものであり、抗体としては、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、特異性の観点からはモノクローナル抗体であることが好ましい。

[0019] 本発明の抗体は、抗体製造方法の常法にしたがって抗原を非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得る組換えキメラモノクローナル抗体及び組換えヒト型モノクローナル抗体（CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジヱニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体を包含する。またモノクローナル抗体の場合には、 IgG、 IgM、 IgA、 IgDあるいは IgE等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、 IgG又は Ig Mが挙げられる。

[0020] より具体的には、例えば、本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法に従って、本発明の特徴であるヒト BAFFのアミノ酸配列中における細胞外ドメインの膜近傍に相当する 13アミノ酸 (配列番号 1)をノヽプテンとして、 KLH を結合させたものを抗原として、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuva nt)と共に、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ゥサギ、二ヮトリ、ネコ、ィヌ、ブタ、ャギ、ゥマあるいはゥシ、より好ましくはマウス、ラット、ノ、ムスタ一、モルモット又はゥサギに免疫することにより得られる当該抗体産生細胞 (脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓の B細胞)と抗体産生能のない骨髄腫系細胞 (ミエローマ細胞)力もハイプリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローンィ匕し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを免疫学的測定法 (ELISAなど）により選択することによって製造される。

[0021] さらに具体的には、次のようにして本発明のモノクローナル抗体を製造することができる。即ち、本発明の、ヒト BAFFのアミノ酸配列中における細胞外ドメインの膜近傍に相当する 13アミノ酸（配列番号 1)をノヽプテンとして、 KLH(Keyhole limpet hemocy anin)を結合させたものを抗原として、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's A djuvant)と共に、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、 -ヮトリあるいはゥサギ、好ましくはマウス、ラットあるいはハムスター（ヒト抗体産生トランスジエニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に 1乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫力も約 1乃至 14日毎に 1 乃至 4回免疫を行って、最終免疫より約 1乃至 5日後に免疫感作された該哺乳動物力抗体産生細胞を取得し、上述の方法に従ってモノクローナル抗体を産生するクローンを得ることができる。

[0022] 好ましくは、次のようにして本発明のモノクローナル抗体を製造することができる。即ち、 100 Lの lmgZmL上記抗原ペプチド生理食塩水溶液を、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってェマルジヨンィ匕し、マウス（BalbZc, 6週齢)腹腔内に免疫する。初回免疫 2週間後に 100 Lの lmgZmL抗原ペプチド生理食塩水溶液、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってェマルジヨン化したものを追加免疫し、以降 2週間毎に追加免疫を 2回行い、その後は上述の方法に従ってモノクロ一ナル抗体を産生するクローンを得ることができる。

[0023] モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature (1975)256, 495-497)及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物力も取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ノ、ムスター、ゥサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。

[0024] 細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマ P3Z X63-AG8. 653(653 ;ATCC No. CRL1580)、 P3/NSI/1 - Ag4- 1(NS- 1)、 P3/X63-Ag8. U1(P3U1)、 SP2/O-Agl4(Sp2/0, Sp2)、 PAI、 FOあるいは BW5147、ラット由来ミエローマ 210RCY3— Ag. 2. 3、ヒト由来ミエローマ U - 266AR1, GM1500— 6TG— A1— 2、 UC729— 6、 CEM— AGR、 D1R11あるいは CEM— T15を使用することができる。 [0025] モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたゥエルの培養上清の前述のマウス免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えば RIAや ELISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。ハイブリド一マからのモノクローナル抗体の製造は、ハイプリドーマをインビトロ、又はマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はゥサギ等、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離すること〖こより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイプリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。

[0026] 基本培地としては、例えば、 Ham' sF12培地、 MCDB153培地あるいは低カルシゥム MEM培地等の低カルシウム培地及び MCDB104培地、 MEM培地、 D— ME M培地、 RPMI1640培地、 ASF104培地あるいは RD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイト力イン及び Z又は種々の無機あるいは有機物質等を含有することができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモ-ゥム、ュ一グロブリン沈澱法、力プロイン酸法、力プリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（D EAE又は DE52等）、抗ィムノグロブリンカラムあるいはプロテイン Aカラム等のァフィ二ティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。また、当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクロー-ングし、トランスジェニック動物作製技術を用ヽて当該抗体コーディング遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジエニックなゥサギ、ャギ、ヒッジ又はブタを作製し、当該トランスジェニック動物のミルク中から当該抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（日経サイエンス、 1997年 4月号、第 78頁乃至 84頁)。

[0027] 以上のごとく得られる本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体は、後記実施例に示すように 0. 5ngZmLの検出限界が得られるという驚くべき特徴を有するので、感度の良い自己免疫疾患の診断方法はもとより、自己免疫疾患の予防'治療方法、さらにはヒト BAFFの阻害薬又は活性ィ匕薬のスクリーニング方法を実現することができる。なお実施において本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体は、抗体、その抗体の断片及びそれらの誘導体として利用することができる。また、本発明の抗ヒト BAFF モノクローナル抗体は、細胞又は血液由来の BAFFの精製に利用することもできる。さらに本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体を利用し精製されたヒト BAFF蛋白質及びその誘導体は、 B細胞の活性ィ匕薬などの試薬あるいは医薬品としても利用されうる。またさらに、本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体、その抗体の断片及びそれらの誘導体を利用し、免疫染色など当該分野で公知な技術により BAFF蛋白質の画像ィ匕を行うことができる。

[0028] 本発明の医薬組成物における製薬上許容される担体としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。本発明の医薬組成物は、非経口的に投与することができる。非経口投与のための形態としては、本発明の抗体を含有し、常法により処方される注射剤、腸溶内投与のための坐剤及びペッサリーの他、点眼剤、点鼻剤などが含まれる。

[0029] 本発明の医薬組成物の有効成分の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき 1 μ g力ら 1000mg、好ましくは 10 μ gから 500mgの範囲で投与することができる。し力しながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。例えば、注射剤の場合には、生理食塩水ある!ヽは注射用蒸留水等の非毒性の製薬上許容される担体中に 0. 1 μ g抗体 ZmL担体〜 lOmg抗体 ZmL担体の濃度となるように溶解又は懸淘すること〖こより製造することができる。

[0030] このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、 1回の投与【こおヽて lkg体重あたり、 1 μ g〜100mgの害合で、好ましく ίま 50 μ g〜50mgの害 U 合で、 1日あたり 1回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ォリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、ノクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合又は照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。

[0031] 本発明の医薬組成物は、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス (SLE)、慢性関節リウマチ (RA)、シエーダレン症候群 (SS)、自己免疫性糖尿病、 AIDS,又は B細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防及び Z又は治療に有用である。

[0032] また、本発明の診断剤は、本発明の抗体を含有するものであり、検体中の BAFFタンパク質に特異的にかつ高感度で結合し、形成された複合体を測定可能にする各種の試薬を含有するものである。本発明の診断用の組成物は、前記した本発明の診断剤又は当該診断剤及び診断用の担体力もなるものである。また、本発明の抗体自体を測定可能にするために標識ィ匕することもできる。このような標識化としては、放射性元素や蛍光物質などによる通常の方法を採用することができる。

[0033] 本発明における自己免疫疾患の診断方法としては、例えば、本発明の抗ヒト BAFF モノクローナル抗体を用いて後記する実施例に記載のごとく ELISA系を構築し、この ELISA系にて自己免疫疾患の患者等の被験者から採取された血清中あるいは組織中の BAFF濃度を測定することにより、自己免疫疾患の進行度合いを調べることができる。さらにまた、治療の効果を知るためのモニタリングや予後の予測にも利用できる。

[0034] 本発明の BAFFを検出又は定量する方法としては、検体中に本発明の抗体を添加して、当該抗体と結合した BAFFを測定することにより行うことができる。本発明の抗体と結合した BAFFを測定する方法としては、公知の各種の抗原抗体反応による検出又は定量ィ匕の手法を使用することができ、例えば、 ELISA法などを使用することがでさる。

本発明の診断方法や検出又は定量ィ匕方法における BAFFとしては、ヒト BAFFが好ましい。

本発明における自己免疫疾患の予防'治療方法の場合、本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体を薬学的に許容される担体と共に、自己免疫疾患の予防'治療が必要な患者に投与することにより、その予防 ·治療が実現できる。

[0035] 本発明におけるヒト BAFFの阻害薬又は活性ィ匕薬のスクリーニング方法の場合、本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体を用いて後記実施例に記載のごとく ELISA 系を構築し、この ELISA系にて BAFF受容体を発現している細胞もしくは BAFF受容体蛋白質又はその断片及びそれらの誘導体と被験物質の BAFF結合活性を測定することにより実現することができる。また、ヒト BAFFを産生する細胞に被験物質を接触させ、細胞より産生される BAFFの測定を ELISA等、当該分野において公知慣用である免疫学的技術にて行うことにより、ヒト BAFFの産生阻害薬又は促進薬のスクリーニングを行うことができる。

[0036] 本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体は、後記実施例に示すように 0. 5ng/m Lの検出限界が得られるという驚くべき特徴を有するので、極めて実用性に優れたものである。また、膜タンパク質の中央付近のアミノ酸配列力もなるペプチドから得られる抗体が、特異性及び親和性において極めて優れた抗体となるということも、 BAFF 特有の予想外のことである。

[0037] 本発明の抗体は、抗原とされる部位が特徴的であるだけでなぐ特異性及び親和性 (感度）において極めて優れており、実用的な自己免疫疾患の診断方法はもとより、自己免疫疾患の予防'治療方法、さらにはヒト BAFFの阻害薬又は活性ィ匕薬のスクリーニング方法を実現することができる。

また、本発明の抗体を用いることにより、自己免疫疾患に対する優れた医薬組成物、及び診断剤を提供することができる。

[0038] 実施例以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例 1

[0039] 抗ヒト BAFF抗体の作製

配列表の配列番号 2に示した BAFFの 285個のアミノ酸力細胞外ドメインの膜近傍に該当する 13アミノ酸を選択し、 MBS法を用いて KLHとコンジュゲートし、抗原とした。 100 1^の11!1₈71111^抗原ぺプチド生理食塩水溶液、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってェマルジヨンィ匕し、マウス（BalbZc, 6週齢)腹腔内に免疫した。 2週間後に 100 /z Lの lmgZmL抗原ペプチド生理食塩水溶液、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってェマルジヨンィ匕したものを追加免疫し、以降 2週間毎に追加免疫を 2回行った。初回免疫後 2ヶ月目に脾臓を摘出し、 RPMI 1640 培地 (ペニシリン，ストレプトマイシン入り)中でリンパ球を分離した。分離したリンパ球をポリエチレングリコール（PEG)法によりマウス骨髄腫由来のミエローマ細胞 P3U1 株と融合させ、ハイプリドーマ細胞を作製した。ハイプリドーマ細胞をフィーダ一細胞入りの HAT培地に懸濁し 96穴プレート（Greiner)に分注し 15日間培養した。ハイブリドーマ細胞を培養したゥェルカ培養上清を回収し， ELISA法（enzyme-linked im munosorbent assay)によって抗原ペプチドと反応がある抗体産生細胞を選択した。即ち、まず 96穴プレートに 50 μ L·(D 10 μ gZmL抗原ペプチドをしき、 4°C、ー晚底面に吸着させた後、 100 Lの 2%BSAZPBSで 37°C、 2時間ブロッキングさせた。ハイブリドーマ細胞の上清 100 Lを 4°C、 1晚反応させた後、 HRP標識抗マウス IgGを 1000倍希釈して 37°C、 1時間反応させ、オルトフエ-レンジアミンを基質に用いて発色させた。 50 Lの 2N硫酸で反応を停止させた後、 492nmの吸光度を測定して 1. 0以上の値が得られたノヽイブリドーマを選択し，限界希釈法によるクローユングを行つた。

[0040] 7日前、 3日前にそれぞれ 0. 5mLのプリスタンを腹腔内投与したマウス（BalbZc) に、選択したハイプリドーマ細胞を腹腔内注射し、約 10日後に腹水を採取した。採取した腹水は室温で 30分おいた後、 4°Cでー晚静置し、 15Krpm、 10分間遠心して上清を回収し、マウス IgG画分をプロテイン A-Sepharoseカラムにて分離精製した。以上の方法にて、抗ヒト BAFF抗体 (4H4、アイソタイプは IgGl)を産生するハイブリドーマ細胞株、並びに該抗体 (4H4)を得た。得られた 4H4、及び対照として Chemico n製ゥサギ抗ヒト BAFFポリクローナル抗体 (AB16530 :図中、 Chemと表記)を、常法のウェスタンブロッテイング法にてリコンビナントのヒト BAFF(Chemicon製)の検出に用いた結果、図 1に示すように可溶性ヒト BAFFに該当する 17KDaのバンドが確認された。

実施例 2

[0041] ELISAの確立

1次抗体としてゥサギ抗ヒト BAFFポリクローナル抗体 (AB16530、 Chemicon製）を用ヽ、 96穴プレート【こ Ι /z g/wellで 4°Cー晚コーティングした。 0. 05⁰/₀Tween20 を含む PBSで 3回洗浄後 BlockAce (大日本製薬製)を 150 LZwell加え、 37°C、 2時間反応させた。 0. 05%Tween20を含む PBSで 3回洗浄後検体 50 /z L及びビォチン標識した 4H4を 50 /ζ ΐ 8η₈Ζπιυカ卩え、室温にて 2時間反応させた。 0. 05 %Tween20を含む PBSで 3回洗浄後、 0. 05%Tween20を含む PBSで 1000倍に希釈したストレプトアビジン標識 HRP (Horse radish peroxidase)を 50 μ L添加し、室温にて 30分反応させた。 0. 05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄後 TMB One Sol ution(Clonetech製）を 50 μ Lカロえ、 5分間室温にて反応させた後、 IN HC1 50 μ L· を添加後プレートリーダー (PerkinElmer製)で 450nmの吸光度を測定した。標準物質としてリコンビナントのヒト BAFF (Chemicon製)を用い、標準曲線を作成した。

[0042] その結果図 2に示すように、 BAFF濃度が 25ngZmL力も 0. 2ngZmLまで、良好な直線関係を示す ELISA系の確立が確認された。特に 2ngZmL力も 0. 5ng/mL の範囲は、従来の抗ヒト BAFF抗体では検出できない濃度であるため、この濃度まで信頼性良く検出できるということは、本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体を用いた自己免疫性疾患の診断、あるいは BAFFの阻害薬又は活性ィ匕薬のスクリーニングに極めて有用であることを表す。

実施例 3

[0043] ヒト PBLに対する作用

健常人又は SLEと診断された患者より血液を採取し、 Ficollを用いた比重遠心法によりリンパ球層を分離採取し、ヒト末梢血リンパ球（Peripheral Blood Lymphocytes ： P BL)とした。 PBLを 10%FBS(Fetal bovine serum)を含む RPMI 1640培地に懸濁し、 PBSにより 10 gZmLに希釈した抗 CD3抗体を 24ゥエル培養プレートにしき、 4 °C一晩で底面吸着させた後、 5 X 10⁵cells/wellとなるように PBLを播種した。これと同時に 4H4を最終濃度が 10 gZmLとなるように添カロし、 4日間あるいは 7日間 37°C 、 7%COにて COインキュベータを用いて培養した。培養上清を回収し、培養上清

2 2

中の IgG、 IFN γ、 TNF aをそれぞれに特異的に反応するモノクローナル抗体 (IgG : 1次抗体： BDPharmingen製 Cat. No. 555784、 2次抗体（ビォチン標識） BDPharmin gen製 Cat. No.555785、 IFN y： 1次抗体： BDPharmingen製 Cat. No. 554698、 2次抗体（ビォチン標識） BDPharmingen製 Cat. No.554550、 TNF a： 1次抗体： BDPhar mingen製 Cat. No. 551220、 2次抗体（ビォチン標識） BDPharmingen製 Cat. No.55 4511)を用いたサンドイッチ ELISA法にて測定した。

[0044] 結果を図 3〜5に示す。健常人由来及び SLE患者由来の PBL共に、抗 CD3抗体刺激により誘導された IgG (図 3)、 IFN y (図 4)及び TNF α (図 5)の産生 (全て、図中の左 (オープン)カラム）が、 4Η4の添加（全て、図中の右 (ソリッド)カラム）により抑制された。特に患者 PBLにおいては抗 CD3抗体による IgG、 IFN- γ、 TNF— αの産生誘導が健常人と比較して増強しており、 4Η4によるこれらの産生抑制率も高いことが明ら力となった。特に本抗体の TNF a産生に関しては有意に抑制することが明らかとなつた (t検定)。これらの産生促進は病態形成に深く関与して!/、ると考えられ、その産生を抑制することは SLEなどの自己免疫疾患の治療への新しい試みとなると考えられる。従って、本発明の抗ヒト BAFFモノクローナル抗体力自己免疫疾患の治療薬開発にむけて極めて有用であることが示唆された。産業上の利用可能性

[0045] 本発明は、全身性エリテマトーデス (SLE)、慢性関節リウマチ (RA)、シエーダレン症候群 (SS)、自己免疫性糖尿病、 AIDS又は B細胞の活性ィ匕を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患との関係が明らかにされてきている BAFF、特にヒト BAFFに対する極めて特異的でかつ高感度の抗体を提供するものであり、自己免疫疾患の治療、予防、診断に有用なだけでなぐ自己免疫疾患の治療や予防に有効な新しい物質をスクリーニングするための手法を提供するものであり、産業上の利用可能性がある _c

Claims

請求の範囲

[I] ヒト BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)タンパク質の 134〜

146番目の、 AVQGPEETVT QDC (アミノ酸 1文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体。

[2] 抗体が、モノクローナル抗体である請求項 1に記載の抗体。

[3] 少なくとも AVQGPEETVT QDC (アミノ酸 1文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含有する抗原を用いて、動物を感作し、当該動物の抗体産生細胞力前記ペプチドに対する抗体を製造する方法。

[4] ペプチド力 AVQGPEETVT QDC (アミノ酸 1文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項 3に記載の方法。

[5] 抗原がハプテンをさらに現有するものである請求項 3又は 4に記載の方法。

[6] 動物が、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモット、ニヮトリ又はゥサギである請求項 3

〜5の!、ずれかに記載の方法。

[7] 請求項 1又は 2に記載の抗体、及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物。

[8] 医薬組成物が、自己免疫疾患を予防 ·治療するためのものである請求項 7に記載の医薬組成物。

[9] 自己免疫疾患が、 SLE、 RA、 SS、自己免疫性糖尿病、 AIDS,又は B細胞の活性化を伴う自己免疫疾患である請求項 8に記載の医薬組成物。

[10] 請求項 1又は 2に記載の抗体を含有してなる自己免疫疾患の診断剤。

[II] 自己免疫疾患が、 SLE、 RA、 SS、自己免疫性糖尿病、 AIDS,又は B細胞の活性化を伴う自己免疫疾患である請求項 10に記載の診断剤。

[12] 診断が、 ELISAによるものである請求項 10又は 11に記載の診断剤。

[13] 検体中に請求項 1又は 2に記載の抗体を添加して、当該抗体と結合した BAFFを測定することからなる検体中の BAFFを検出又は定量する方法。

[14] BAFFが、ヒト BAFFである請求項 13に記載の方法。

[15] 抗体と結合した BAFFを測定する方法力 ELISAによるものである請求項 13又は 14に記載の方法。

[16] BAFFを含有する試料中に試験物質を添カ卩し、試験物質の添カ卩による BAFFの量の変化を請求項 1又は 2に記載の抗体を用いて測定することからなる、試験物質が有する BAFFの阻害作用又は活性ィ匕作用をスクリーニングする方法。

[17] BAFFが、ヒト BAFFである請求項 16に記載の方法。

[18] BAFFの阻害作用をスクリーニングする方法が、自己免疫疾患の予防'治療薬のスクリーニングである請求項 16又は 17に記載の方法。

[19] 自己免疫疾患の予防'治療用の医薬糸且成物を製造するための、請求項 1又は 2に記載の抗体の使用。

[20] 自己免疫疾患の診断用組成物を製造するための、請求項 1又は 2に記載の抗体の使用。

[21] 自己免疫疾患が、 SLE、 RA、 SS、自己免疫性糖尿病、 AIDS,又は B細胞の活性化を伴う自己免疫疾患である請求項 19又は 20に記載の使用。

[22] 自己免疫疾患の患者又は自己免疫疾患の可能性のある患者に、請求項 1又は 2に記載の抗体の有効量を投与することからなる自己免疫疾患を予防又は治療する方法。

[23] 自己免疫疾患が、 SLE、 RA、 SS、自己免疫性糖尿病、 AIDS,又は B細胞の活性化を伴う自己免疫疾患である請求項 22に記載の方法。