CN1129666C - 金属蛋白酶－4的人组织抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了金属蛋白酶-4多肽的人组织抑制剂，编码该多肽的DNA(RNA)和以重组技术生产该多肽的方法，还公开了利用该多肽治疗包括关节炎和癌症的疾病的方法。还公开了针对该多肽的拮抗剂及其作为再吸收瘢痕组织的治疗剂的用途。还公开了用于检测人TIMP-4蛋白水平和人TIMP-4核酸序列的突变的诊断方法。

Description

金属蛋白酶-4的人组织抑制剂

本发明涉及新鉴定的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸和多肽的应用以及该多核苷酸和多肽的生产。更具体地说，本发明的多肽是金属蛋白酶-4多肽的人组织抑制剂，下文称为“人TIMP-4”。本发明还涉及对该多肽的作用的抑制。

胞外基质是一种复合结构，它含有胶原，蛋白聚糖，糖胺聚糖，糖蛋白(纤连蛋白，软骨粘连蛋白，层粘连蛋白)，且在有些组织中还含有弹性蛋白(Hay，E.D.，细胞生物学杂志.91：205-223(1981))。

基质金属蛋白酶(MMP′s)构成锌结合内肽酶的主要部分，锌结合内肽酶在正常生理和有些病理过程中在结缔组织的重建中降解胞外基质蛋白，例如结缔组织，胶原和明胶。MMP的过度活性可导致广泛的组织降解，且这些酶涉及各种疾病过程，包括肿瘤细胞侵入，肿瘤血管生成和类风湿性关节炎(Okada，Y.等，生物化学杂志，261：14245-14255(1986))。MMP作为无活性的酶原从细胞中分泌，且其在胞外环境中的活性受各种激活剂和抑制剂的调节(Matrisian，L.M.，Trends Genet.，6：121-125(1990))。

金属蛋白酶介导的蛋白水解的调节可受天然存在的抑制剂蛋白，如金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)引发。MMP的生产和活化之间的平衡，以及它们被天然抑制剂如TIMP的抑制，无论在生理还是病理情况下，决定着结缔组织是否被降解。

MMP包括许多蛋白酶，例如间质(I型)胶原酶本身，溶基质素(也称为蛋白聚糖酶或transin)，成纤维细胞和多形核白细胞明胶酶(也称为胶原IV酶)，和“pump-1”(推断的金属蛋白酶1，子宫金属蛋白酶)〖Goldberg等，生物化学杂志2610：6600(1986)；Witham等，生化杂志，240：913(1986)；Breathnach等，核酸研究，15：1139(1987)；Muller等，生化杂志，253：187(1988)；Collier等，生物化学杂志，263：6579(1988)；Murphy等，生化杂志，258：463(1989)；Quantin等，生化，(N.Y.)，28：5327(1989)；Birkedal-Hansen，口腔病理学杂志，17：445(1988)〗。

一般来说，蛋白酶的哺乳动物家族具有一种或多种下列特征：(a)在大约中性pH时的最佳蛋白水解活性；(b)酶活性依赖于锌的存在，证据为当用二价金属离子螯合剂如1.10邻二氮杂菲(优先螯合锌)或EDTA(螫合特性限制较少；EDTA和EGTA也通过螯合为酶稳定性所需的钙离子导致酶失活)处理时失去活性；(c)受TIMP抑制；(d)中性含锌金属蛋白酶其它家族的已知抑制剂，如热分解，血管紧张肽转化酶和脑啡肽酶缺乏明显的抑制作用；(e)生物合成并以潜伏前体形式(酶原)分泌，需要胞外激活。以许多内切蛋白酶，有机汞制剂和离液剂实现活化。

一般来说，中性金属蛋白酶家族的成员有明显的底物特异性。因此，胶原酶I型在其裂解间质胶原(例如，I，II和III型)天然纤丝内的特异性肽键的能力上有专一性。明胶酶对这些胶原只有微弱的活性，便能降解变性的间质胶原及非纤维性胶原，例如：IV型，如在基底膜中发现的。pumpl据报道优先作用于变性的胶原(明胶)，尽管其特征不同于溶基质素或胶原酶IV型。溶基质素和明胶酶也能降解非胶原性结构蛋白，如蛋白聚糖的核心蛋白和弹性蛋白。在细胞与基质和细胞与细胞的相互作用中涉及的大分子，如层粘连蛋白和纤连蛋白也对由一些这类金属蛋白酶引起的降解敏感。

这一家族的酶由滑膜和皮肤成纤维细胞，软骨细胞，外周单核细胞，角质细胞和牙龈组织产生，也存在于多形核白细胞(PMNL)的颗粒储存泡囊内。

目前的信息表明存在一个金属蛋白酶抑制剂的家族，包括TIMP-1(金属蛋白酶1的组织抑制剂)；TIMP-2；已被克隆、表达并定位于人染色体22上的人TIMP-3；金属蛋白酶的鸡组织抑制剂(ChIMP-5)。本发明的多肽根据氨基酸序列的同源性经推断鉴定为新的人TIMP多肽。

根据本发明的一个方面，提供了一个是人TIMP-4的新的成熟多肽及其生物学有活性的和诊断上或治疗上有用的片段，类似物和衍生物。

根据本发明的另一方面，提供了分离的编码人TIMP-4的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因组DNA及其有生物活性的和诊断或治疗上有用的片段，类似物及衍生物。

根据本发明进一步的方面，提供了通过重组技术生产这一多肽的方法，包括在促进该蛋白质表达的条件下培养含有人TIMP-4核酸序列的重组的原核和/或真核宿主细胞及随后回收上述蛋白质。

根据本发明进一步的方面，提供了治疗涉及人TIMP-4活性不足的症状的方法，包括对需要该酶的患者施用含有本发明的人TIMP-4蛋白的药用组合物，该组合物可有效地补充患者的内源性人TIMP-4从而缓解上述症状，例如，包括关节炎疾病，如类风湿和骨关节炎，软组织风湿症，多发软骨炎和腱炎；骨再吸收疾病如骨质疏松，Paget′s疾病，副甲状腺机能亢进和胆脂瘤；与糖尿病并发的增强的胶原损伤；隐性营养不良性表皮溶解泡；牙周病，牙槽炎和与胶原酶牙龈产物有关的后果；角膜溃烂；皮肤和胃肠道溃烂及不正常伤口愈合；胶原酶水平升高的后效症状，由于组织基底膜破坏受抑制而导致癌转移的癌症，中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病；气喘；肾小球硬化症；脓毒性休克和感染；及牛皮癣。

根据本发明进一步的方面，提供了抗此类多肽的抗体。

根据本发明进一步的方面，提供了含有可与人TIMP-4序列特异性杂交的足够长度的核酸分子的核酸探针。

根据本发明进一步的方面，提供了可用于治疗目的的针对此多肽的拮抗物，例如，用来进行组织的重建和修复及瘢痕组织的破坏。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测涉及人TIMP-4序列内突变和多肽过度表达的疾病的诊断方法。

根据本文的教导，本发明的这些和其它方面对本领域的技术人员而言是显而易见的。

以下附图用以说明本发明的实施方案，不用以限制权利要求书所包含的本发明的范围。

图1表示全长人TIMP-4多肽的cDNA序列和相应的推导氨基酸序列。使用标准的单字母氨基酸简写。使用373自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.)进行测序，预计测序的准确率大于97％。

图2是本发明的多肽和其他人TIMP多肽的氨基酸序列比较。

图3显示Northern印迹的分析结果，表明人TIMP-4在不同人组织中的表达。

根据本发明的一个方面，提供了一个分离的核酸(多核苷酸)，它编码具有图1的推导氨基酸序列的成熟多肽或编码由以ATCC保藏号75946于1994年11月11日保藏的cDNA克隆编码的成熟多肽。

编码本发明多肽的多核苷酸可以从早期人脑中得到。它包含一个开放阅读框并且编码有224个氨基酸残基的蛋白质，其中大约前29个残基代表前导序列，成熟的蛋白质包含195个氨基酸残基。本发明的多核苷酸是从来自于早期人脑的cDNA文库中发现的。该蛋白显示与人TIMP-2有最高程度的同源性，在超过136个氨基酸的长度上，有48％的相同性和72％的相似性。人TIMP-4具有12个在TIMP家族的所有成员中都保守的半胱氨酸残基。在TIMP-1和TI MP-2中这12个半胱氨酸残基都是以二硫键连接的。这一证据强烈地表明本发明的多肽是TIMP家族的一个新成员。

本发明的多核苷酸可以是RNA的形式或是DNA的形式，DNA包括cDNA，基因组DNA和人工合成DNA。DNA可以是双链的或是单链的。如果是单链，可以是编码链或非编码链(反义链)。编码成熟多肽的编码序列可与图1所示的或保藏克隆的编码序列相同，或由于遗传密码的重复性和简并性也可能编码与图1所示DNA或保藏cDNA相同的成熟多肽，但编码序列不同。

编码图1所示成熟多肽或保藏cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可包括：只有成熟多肽的编码序列，成熟多肽的编码序列和附加编码序列如前导序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(及任选的附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”既包括仅含有多肽的编码序列的多核苷酸，也包括还含有附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上文所描述的多核苷酸的变异体，它们编码具有图1的推导氨基酸序列的多肽或保藏克隆cDNA编码的多肽的片段，类似物及衍生物。多核苷酸的变异体可以是天然存在的多核苷酸等位基因变异体或非天然存在的多核苷酸变异体。

因此，本发明包括编码与图1所示相同的成熟多肽的多核苷酸或保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及编码图1所示多肽或保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物的多核苷酸变异体。这些多核苷酸的变异体包括缺失变异体，取代变异体和添加或插入变异体。

如上文所示，多核苷酸可能具有天然存在的图1所示的编码序列或保藏克隆编码序列的等位基因变异体的编码序列。在本领域内已知等位基因变异体是一个多核苷酸序列的另外一种形式，它可能具有一个或多个核苷酸的替换，缺失或添加且基本上不改变所编码的多肽的功能。

本发明也包括成熟多肽的编码序列与辅助多肽从宿主细胞中表达和分泌的多核苷酸序列，例如，控制多肽从细胞中运输、起分泌序列功能的前导序列融合在一个阅读框中的多核苷酸。具有前导序列的多肽是一个前蛋白(preprotein)，并且可能由宿主细胞切去前导序列从而形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可编码一个由成熟蛋白质加上另外的5’氨基酸残基组成的蛋白原(proprotein)。具有序列原的成熟蛋白质是一个蛋白原，它是蛋白质的非活性形式。一旦切除序列原就会得到一个有活性的成熟蛋白质。

因此，例如，本发明的多核苷酸可编码一个成熟的蛋白质，或编码一个具有序列原的蛋白质，或编码一个既有序列原又有前序列(前导序列)的蛋白质。

本发明的多核苷酸还可具有与标记序列融合在一个读框内的编码序列，它可帮助对本发明的多肽进行纯化。标记序列可以是由pQE-9载体提供的6组氨酸标记，在宿主为细菌时，标记序列可对与标记融合在一起的成熟多肽提供纯化，或者，例如，当使用一个哺乳动物细胞宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是一个血细胞凝集素(HA)标记。HA标记对应一个来源于流感血细胞凝集素蛋白的抗原决定基(Wilson，I.，et al.，Cell，37：767(1984))。

本发明进一步涉及多核苷酸，它们若与上述序列有至少50％，优选有70％的相同性，就可进行杂交。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所使用的名词“严格条件”，是指在序列间至少有95％的相同性、优选有至少97％的相同性时才发生的杂交。在优选实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽实质上保留与图1的cDNA或保藏cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。

本文提及的保藏物是按用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的要求进行保藏。这些保藏物只是为本领域的技术人员的方便而提供而并非对根据35 U.S.C.§112索取保藏物的许可。包含于保藏物中的多核苷酸序列，以及由此编码的多肽的氨基酸序列编人本文以供参考，并且在任何与本文序列的任何描述中相冲突的情况中是决定性的。制造、使用或售卖此保藏物需要许可，本文没有允许此种许可。

本发明进一步涉及具有图1的推导氨基酸序列或保藏cDNA编码的氨基酸序列的人TIMP-4多肽及此多肽的片段，类似物及衍生物。

当提及图1或保藏cDNA所编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”指基本上保留与该多肽相同生物学功能或活性的多肽，因此，类似物包括能经蛋白原部分裂解激活，以产生活性成熟多肽的蛋白原。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或人工合成多肽，优选重组多肽。

图1所示的多肽或由保藏cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代并且此取代氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含一个取代的基团；或(iii)其中成熟多肽与另一化合物，如提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)融合；或(iv)其中的成熟多肽与附加的氨基酸如前导序列，分泌序列，或用于纯化成熟多肽的序列，或蛋白原序列融合。相信根据本文的教导，这些片段、衍生物或类似物在本领域的技术人员掌握的范围内。

本发明的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，并且优选纯化成同质。

名词“分离”意指物质从它的原始环境中分离出来(如，如果它是天然存在的时指其自然环境)。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但从天然系统中一些或全部共存的物质中分离的同样的多核苷酸或多肽是分离的。这些多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且只要这些载体或组合物不是它的自然环境的一部分，其仍然是分离的。

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，使用本发明的载体进行遗传改造的宿主细胞和通过重组技术生产的本发明的多肽。

宿主细胞可使用本发明的载体，例如克隆载体或表达载体，进行遗传工程化(转导或转化或转染)。载体可以是，例如，质粒，病毒颗粒，噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可以在经调整适合于启动子激活，转化子选择或人TIMP-4基因扩增的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如温度，pH等是以前用于选择的宿主细胞表达的条件，并且对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。

本发明的多核苷酸可用于通过重组技术生产多肽。例如，多核苷酸可包含于任何一个不同的表达载体中，以表达多肽。这些载体包括染色体的，非染色体的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，杆状病毒，酵母菌质粒，来源于质粒和噬菌体DNA组合的载体，诸如牛痘病毒，腺病毒，鸡痘病毒，假狂犬病毒的病毒DNA。然而，任何一种可复制并可在宿主中存活的其它载体都可以使用。

适当的DNA序列可通过一系列方法插入到载体中。通常，通过本领域内已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性内切酶位点，相信这些方法和其他方法在本领域的技术人员掌握的范围内。

表达载体中的DNA序列与一个适当的表达控制序列(启动子)有效连接，以指导mRNA的合成。作为该启动子的有代表性的例子，可提及的有：LTR或SV40启动子，大肠杆菌Lac或trp，噬菌体λP_L启动子和其他已知的可控制基因在原核或真核细胞及它们的病毒中表达的启动子。表达载体还包括一个用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。载体也可包括用于过量表达的适当序列。

另外，表达载体优选包括一个或多个选择标记基因以便为转化宿主细胞的选择提供表型特征。如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

上文所述的包含有适当DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体，可用于转化一个适当的宿主以允许主表达该蛋白质。

可提到的有代表性的适当的宿主例子有：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌，真菌细胞如酵母，昆虫细胞如果蝇S2和Sf9，动物细胞如CHO，CO S或Bowes黑色素瘤；腺病毒，植物细胞等。相信根据本文的教导，适当宿主的选择在本领域技术人员掌握的范围内。

更具体地说，本发明也包括包含一个或多个上述广义序列的重组构建体，该构建体包含一个载体，如质粒或病毒载体，其中以正向或反向插入了本发明的序列。从本实施方案优选的一方面，该构建体还包括调节序列，例如，包括一个与序列有效连接的启动子。本领域的技术人员已知大量的合适载体及启动子，而且在商业上可获得。下列载体以举例的方式提供：细菌：pQE70，pQE60，pQE9(Qiagen)，pbs，pDi0，phagescript，pSiX174，pbluescriptSK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核：pWLNEO，pSV2 CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，只要能够在宿主中复制并存活，任何其他质粒或载体都可使用。

使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其他带有选择标记的载体可以从任何需要的基因中选择启动子区。两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。尤其应提到的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，Lambda P_R，P_L和trP。真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒中的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。本领域的普通技术人员的水平可进行适当载体和启动子的选择。

在进一步的实施方案中，本发明涉及包含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。构建体向宿主细胞的导入可通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔来进行(Davis，L.，Dibner，M.，Batey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。

宿主细胞中的构建体可用于传统方法生产由重组序列编码的基因产物。另外，本发明的多肽可通过传统的肽合成仪进行人工合成。

成熟的蛋白质可在哺乳动物细胞，酵母，细菌或其他细胞中在适当启动子控制下表达。无细胞翻译系统也可用于使用来源于本发明的DNA构建体的RNAs生产此类蛋白质。原核和真核宿主使用的适当的克隆和表达载体详见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Mannal，Second Edition，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989))的描述，本文将它列为参考文献。

高等真核细胞中编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一个增强子序列而提高。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约10到300bp，作用于启动子以提高它的转录。例子包括位于复制起点晚期位点100-270bp的SV40增强子，细胞肥大病毒的早期启动子增强子，位于复制起点晚期位点的多形瘤增强子及腺病毒增强子。

通常，重组表达载体包括复制起点及允许宿主细胞转化的选择标记，如，大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母的TRP1基因，及来源于指导下游结构序列转录的高表达基因的启动子。这类启动子可来源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，或热休克蛋白等的操纵子。异源结构序列与翻译起始和终止序列以合适的方式结合在一起，而且优选的是，与能够指导翻译的蛋白质分泌到细胞周质空间或胞外介质的前导序列结合。或者，异源序列可编码一个包括赋予所需特征，例如，使表达的重组产物稳定或易于纯化的N-末端识别肽的融合蛋白。

细菌中使用的表达载体是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列及合适的翻译起始和终止信号以有效的阅读方式与功能性启动子一起插入而构建的。载体可包含一个或多个表型上可选择的标记及一个保证载体存在并且如果需要可在宿主内提供扩增的复制起点，适于转化的原核宿主包括大肠杆菌，枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏菌及小单胞菌属，链霉菌属及葡萄球菌属内的各种种类，然而也可选择使用其他宿主。

作为一个有代表性但非限制性的例子，细菌中使用的有用的表达载体包括一个选择性标记及来源于商业上或获得的包含已知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传成份的质粒的细菌复制起点。这些商业载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322的“骨架”部分与一个适当的启动子和要表达的结构序列结合在一起。

适当的宿主菌株被转化并生长到适当的细胞密度后，应使用适当的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。

经离心典型地收获细胞，通过物理或化学方法破碎，所得的粗提物留待进一步纯化。

在蛋白质表达中使用的微生物细胞可通过任何方便的方法包括冻融循环，超声处理，机械破碎或使用细胞溶胞剂进行破碎。这些方法都是本领域的技术人员所熟知的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞COS-7系，详见Gluzman，Cell，23：175(1981)，及其它可用来表达相容载体的细胞系如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含一个复制起点，一个适当的启动子和增强子，及任何必要的核糖体结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，及5’侧翼非转录序列。来源于SV40剪接及多腺苷酸位点的DNA序列可用于提供需要的非转录遗传成份。

人TIMP-4多肽通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和植物凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收及纯化。如有必要，在完成成熟蛋白质的构型时可以使用蛋白质的重折叠步骤。最后在最后纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)。

本发明的多肽可以是一个天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或通过重组技术从原核或真核宿主(如，通过细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞培养物)产生的产物。根据在重组生产过程中使用的宿主细胞，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽也可包括一个起始的甲硫氨酸残基。

本发明亦部分涉及具有限定的抑制MMP′s活性的能力之特征的人TIMP-4。人TIMP-4多肽可用于作为一个金属蛋白酶抑制剂以阻止肿瘤入侵和血管生成及其后的转移。人TIMP-4多肽也可用于治疗关节炎疾病，如类风湿关节炎和骨关节炎，软组织风湿症，多发软骨炎和腱炎，及骨再吸收疾病，如骨质疏松，Paget′s疾病，副甲状腺机能亢进和胆脂瘤。人TIMP-4也可用于防止在与糖尿病，隐性营养缺陷表皮溶解泡，牙周病和胶原酶牙龈生产的相关后果并发的增强的胶原破坏。人TIMP-4也可用于抑制细胞浸润发炎的牙龈后的PMNL胶原酶的释放，包括抵抗糖尿病患者对牙周炎疾病的更大敏感性。

人TIMP-4也可用于治疗由诸如碱或其它灼伤，放射，维生素E或视黄醛(retinoid)缺乏诱导的角膜溃烂，皮肤和胃肠道溃烂，及不正常伤口愈合，以及包括胶原酶水平升高的结肠网结手术后症状。

MMP′s介导肿瘤的原位生长。因此人TIMP-4可用于阻断细胞基底膜的破坏，后者是癌症细胞转移的机制。MMP′s涉及支持肿瘤生长和存活所需的新血管生成，涉及调节生长的初级和二级肿瘤中所需的组织重建，并涉及肿瘤细胞在转移过程中通过血管壁基底膜的穿透。

MMP′s负责排卵过程中滤泡壁的局部降解和用于胚细胞植入的子宫壁的局部降解。因此，人TIMP-4可用作避孕药。

人TIMP-4也可用作普通生长因子以治疗restenosis及类似疾病。人TIMP-4尤其可用作红细胞胞样细胞谱系的生长历子。

用人TIMP-4可治疗的其他疾病还包括：牙槽炎，气喘，牛皮癣，肾小球硬化症和脓毒休克，因为MMP′s参与某些寄生物的组织侵入。

全长人TIMP-4基因的片段可用作杂交探针，从cDNA文库中分离全长基因并分离与该基因有高序列相似性或相似生物学活性的其他基因。例如，这类探针可介于20和2000个碱基之间。然而优选的探针具有30至50个碱基对。探针还可用来鉴定对应全长转录物的cDNA克隆和一个基因组克隆或含有完整人TIMP-4基因，包括调节区和启动区，外显子和内含子的克隆。筛选的例子包括使用已知的DNA序列分离人TIMP-4基因的编码区以合成一个寡核苷酸探针。具有与本发明的基因互补的序列的标记寡核苷酸用于筛选人cDNA文库，基因组DNA或mRNA文库以决定探针与文库中的哪个成员杂交。

本发明还涉及使用人TIMP-4基因作为检测与人TIMP-4突变存在有关的疾病或易感性的诊断方法的一部分。

在人TIMP-4基因上携带有突变的个体可通过各种各样的技术在DNA水平上检测出来。可从患者的细胞如血，尿，唾液，活体组织检查和尸体解剖材料中得到用于诊断的核酸。基因组DNA可直接用于检测或在分析前使用PCR经酶方法扩增(Saiki et al.，Nature，324：163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于同样目的。例如，与编码人TIMP-4的核酸互补的PCR引物可用于鉴定和分析人TIMP-4的突变。例如，通过与正常基因型的比较从扩增产物大小的变化上可检测出缺失或插入。点突变可通过扩增DNA与放射性标记的人TIMP-4RNA或放射性标记的人TIMP-4反义DNA序列杂交来鉴定。通过RNaseA的消化或解链温度的差异可将完全配对的序列从错配的双链中区分出来。

基于DNA序列差异的遗传学测定可通过在含有或不含有变性剂的凝胶中DNA片段的电泳迁移率变化来实现。通过高分辨率凝胶电泳可看到小的序列缺失或插入。不同序列的DNA片段可在变性甲酰胺梯度凝胶上进行区分，在这种胶中不同DNA片段根据它们特定的熔解或部分熔解温度停滞在不同的凝胶位置上(例如，见Myers et al.，science，230：1241(1985))。

特定位置上的序列变化也可通过核酸酶保护实验如RNase和S1保护或化学切割方法揭示(例如Cotton et al.，PNAS，USA，85：4397-4401(1985))。

因此，特异性DNA序列的检测可通过诸如杂交，RNase保护，化学切割，直接DNA序列测定或使用限制性内切酶(例如限制性酶切片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹实现。

除更方便的凝胶电泳和DNA测序外，也可通过原位分析检测突变。

本发明还涉及检测各种组织中人TIMP-4蛋白水平改变的诊断实验，因为与正常对照组织样品相比较蛋白质的过度表达可检测出由人TIMP-4调节的疾病或疾病的易感性。用于检测来自宿主的样品中人TIMP-4蛋白水平的实验是本领域的技术人员熟知的，并且包括放射免疫测定，竞争结合实验，Western印迹分析，ELISA测定及“夹心”实验。ELISA测定(coligan，et al.，Current Protocols in Immunology，1(2)，Chapter 6，(1991))最初包括制备对人TIMP-4抗原有特异性的抗体，优选单克隆抗体。另外，还要制备抗单克隆抗体的报告抗体。在报告抗体上连接一个可检测的试剂如放射物，荧光物或如在本实施例中，使用一个辣根过氧化物酶。从宿主中取得样品并在可与样品中的蛋白质结合的固体支持物如聚苯乙烯盘上培养。通过与非特异性蛋白质如BSA浊育而覆盖盘上的游离蛋白结合位点。然后，在盘中温育单克隆抗体，在培养时间内单克隆抗体与聚苯乙烯盘上结合的任意人TIMP-4蛋白质结合。用缓冲液洗去所有未结合的单克隆抗体，现在将与辣根过氧化酶结合的报告抗体置于盘中，导致报告抗体与人TIMP-4结合的单克隆抗体结合。然后洗去未结合的报告抗体。向盘中加入过氧化物酶的底物，与标准曲线比较，在给定的时间内显色的量是给定体积的患者样品中存在的人TIMP-4蛋白的量的测量值。

可做竞争实验，其中对人TIMP-4特异性的抗体与固体支持物结合，标记的人TIMP-4及来自宿主的样品通过固体支持物，通过例如液闪色谱检测标记的量与样品中人TIMP-4的量呈相关性。

“夹心”测定与ELISA测定相似。在夹心测定中，人TIMP-4通过一个固体支持物并与结合到固体支持物上的抗体结合。随后第二抗体结合到人TIMP-4上。标记的特异于第二抗体的第三抗体通过固体支持物与第二抗体结合，然后可定量。

本发明也提供了筛选化合物的方法，以确定哪些是人TIMP-4多肽的刺激剂或拮抗剂。此方法的一个例子包括获得含有胞外基质的哺乳动物组织如牛辐射腕关节。将关节软骨切成较小的园片，并在DMEM中用35S-硫酸钠标记(10μCi/ml)足够长的时间使软骨掺入标记的硫酸钠。然后，在适当的条件下，将MMP，例如溶基质素或IL1或TNF加入到软骨园片中以使组织损坏正常发生。随后向反应混合物中加入人TIMP-4和欲筛选的化合物，时间要足够长以使MMP正常破坏软骨园片。收集上清液，它是软骨园片外的介质，并通过液闪计数器计数放射活性。计算释放到介质中的³⁵S的百分率。释放的³⁵S-GAG是软骨胞外基质中蛋白多糖的代表，并反应MMP进行的蛋白多糖的降解。由液闪色谱确定的³⁵S-GAG的量与在没有待筛选的化合物存在的情况下的对照实验相比较，即可确定化合物对人TIMP-4的刺激或拮抗作用的能力。

除上面所鉴定的那些外，潜在的人TIMP-4拮抗剂的例子包括抗体或在某些例子中是与多肽结合的寡核苷酸。另外，潜在的拮抗剂可以是人TIMP-4的突变形式，它可识别天然底物，但无活性，因此阻碍人TIMP-4的作用。

潜在的人TIMP-4拮抗剂还包括使用反义技术制备的反义构建体。反义技术可用于通过形成三螺旋或反义DNA或RNA控制基因表达，两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，用编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列5’编码区设计一个长度为大约10-40碱基对的反义RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计为与参与转录的基因区域互补(三螺旋，见Lee ed al.，Nucl.Acids.Res.6：3073(1979)；Coondy et al.，Science，241：456(1988)；and Dervan et al.，Science，251：136091991))，从而阻止人TIMP-4的转录和生产。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，并且阻止mRNA分子翻译成人TIMP-4(反义-Okano，J.Neurochem.，56：1360(1991))；寡聚脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC出版社，BocaRaton，FL(9188))。上述寡核苷酸也可转入细胞内，使反义RNA或DNA可在体内表达以抑制人TIMP-4的产生。

另一类潜在的人TIMP-4的拮抗剂是一个小分子，它结合并占据人TIMP-4的活性位点，从而阻断人TIMP-4与MMP′s的相互作用，因此阻断正常的生物学活性。小分子的例子包括但不限于小肽或类肽分子，例如肽结合分子。

人TIMP-4拮抗剂可用于组织修复及重建，例如，需要对瘢痕组织进行破坏时。在某些情况下，可能需要提高结缔组织的更新和重建，例如瘢痕组织的再吸收，产后子宫退化，肺，肝或关节的纤维重建。在这些情况下，细胞外基质蛋白的更新的适当控制需要MMP′s和人TIMP-4之间的平衡以适当地控制降解。

根据本发明，多肽及同为多肽的刺激剂或拮抗剂可通过此类多肽的体内表达进行应用，通常称作“基因治疗”。

因此，例如，可使用一个多核苷酸(DNA或RNA)对来自患者的细胞在体外进行工程化，然后将工程化的细胞提供给使用多肽治疗的患者。这些方法在本领域内是熟知的。例如，采用本领域内已知的方法，使用一个含有编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒可工程化细胞。

相似地，也可采用本领域内已知的方法在体内工程化细胞以使多肽在体内表达。如本领域内已知的，用于生产含有编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产细胞可给患者用药以在体内工程化细胞和在体内表达多肽。根据本发明的教导，以这类方法施用本发明的多肽的这类和其它方法对本领域的技术人员而言将是显而易见的。例如，工程细胞的表达载体可以不是反转录病毒，如经与适当的传递载体结合后用于体内工程化细胞的腺病毒。

本发明的多肽及其刺激剂或拮抗剂可与一种合适的药用载体结合使用。此组合物包含一种治疗上有效量的多肽，及一种药用上可接受的载体或赋形剂。载体包括但不限于盐水，缓冲性盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其组合。配方应适合于给药的方式。

本发明也提供了包含一个或多个充满一种或多种本发明药用组合物的成份的容器的药物包装或试剂盒。与此容器一起有一个调节药物或生物制品的生产、使用和销售的政府机构出具的说明书，此说明书反应人类用药的生产使用和销售机构批准。另外，此药用组合物可与其他治疗化合物结合使用。

药用组合物可以方便的形式用药。如通过局部用药，静脉注射，关节内，肿瘤内，腹膜内，肌肉内，皮下，鼻内，或皮内途径进行。药用组合物的施用量以对特定适应症的有效治疗和/或预防为宜。通常，药用组合物的施用量以至少约10ug/kg体重，并且在多数情况下，它们的施用量不超过约每天8mg/kg体重，优选的剂量为每天约10ug/kg到1mg/kg体重，要考虑给药的途径，症状等。

本发明的序列对于染色体鉴定也是有价值的。序列可以特异性地靶向并与单个人染色体上的特殊位点杂交。而且，现在需要在染色体上鉴定特殊位点。现在有很少的基于实际序列数据的染色体标记试剂(重复多态性)可用来标记染色体位置。根据本发明的DNA在染色体上的定位是使这些序列与和疾病有关的基因联系起来的重要的第一步。

简单地说，可通过从cDNA中制备PCR引物(优选15-25bp)将序列定位到染色体上，3’非翻译区的计算机分析可用于快速选择在基因组DNA中长度不超过一个外显子的引物，否则使扩增的过程变得复杂。然后这些引物用来经PCR筛选含有单个染色体的体细胞杂种。只有含有与引物相应的人基因的杂种细胞才会产生一个扩增片段。

体细胞杂种的PCR作图是将特定的DNA定位到特定染色体上的快速方法。使用具有相同寡核苷酸引物的本发明，可通过类似的方法，用一组来自特定染色体或大的基因组克隆库的片段实现亚定位。其他相似的用于定位其染色体的定位方案包括原位杂交，使用标记的流选染色体的预筛选和使用杂交的预选择以建立染色体特异性cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可用于一步提供准确的染色体定位。这一技术可使用短至500至600碱基的cDNA，然而，大于2000bp的克隆与单一染色体位点结合的可能性较高，并能产生可进行简单测定的足够强度的信号。FISH需要使用EST来源的克隆，而且越长越好。例如，2000bp为好，4000bp更好，大于4000bp可能对于在合理的时间比例得到好的结果是不必要的。这一技术的综述见Verma et al.，人类染色体：基础技术手册，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦一个序列已定位到精确的染色体位置上，序列在染色体上物理位置就可与遗传图谱资料相联系。例如，可在V.Mckasick，人类孟德尔遗传(可从John Hopkins大学Welch医学图书馆在线获得)中找到此类资料。然后通过连锁分析(物理临近基因的共遗传)鉴定定位在同一染色体区域上的基因和疾病之间的关系。

以下，需要确定被影响及未被影响的个体间在cDNA或基因组序列中的差别。如果在一些或全部未被影响的个体中发现突变，但在任何正常的个体中未发现突变，那么突变就可能是疾病的起因。

以当今的物理图谱和遗传图谱技术的分辨率，准确定位于与疾病相关的染色体区域的cDNA可能是50-500潜在的致病基因中的一个。(这假定1兆碱基的图谱分辨率和每20kb一个基因)。

多肽，它们的片段或其它衍生物或其类似物，或表达它们的细胞可用作免疫原以生产抗体。例如，这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的，单链的，和人源化的抗体，以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本领域内已知的各种方法可用于这类抗体和片段的产生。

与本发明的序列相对应的多肽的抗体可通过将多肽直接注射进动物或给动物施用该多肽而获得，优选非人类动物。如此获得的抗体就会与多肽本身结合。以这种方式，即使仅编码多肽片段的序列也可用来产生与全长天然多肽结合的抗体。随后此类抗体可用于从表达该多肽的组织中分离多肽。

对于制备单克隆抗体，任何可提供由细胞系培养物产生的抗体的技术都可使用。实施例包括杂文瘤技术(Kolher and Milstein，1975，Nature，256：495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂文瘤技术(Kozbor et al.，1983.今日免疫学4：72)，及EBV杂交瘤技术以生产人单克隆抗体(Cole，et al.，1985，《单克隆抗体和癌症治疗》，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

描述生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)也适用于生产抗本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。也可使用转基因小鼠表达抗本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。

在以下实施例中本发明得到进一步的描述，然而，应理解本发明不限于这些实施例。所有的组份和含量，除非另有说明，都是重量比。

为帮助理解以下实施例，将描述以下一些经常出现的方法和/或术语。

“质粒，用小写的p置于前面和/或后为大写字母和/或数字来表示。本文中的起始质粒都是商业上可获得的，在非限制的基础上可由公众获得或能根据发表的方法从可获得的质粒进行构建。另外，与上述描述等效的质粒在本领域内是已知的并且对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。

DNA的“消化”指的是使用一个只作用于DNA上某些序列的限制性内切酶对DNA进行催化切割。本文中使用的各种限制性内切酶是商业上可获得的，它们的反应条件，辅助因子及其它需要对领域的普通技术人员而言是已知的。为达到分析目的，典型的在约20ul的缓冲液中将1ug质粒或DNA片段与约2单位酶一起使用。为了用于质粒构建而分离DNA片段，典型地将5至50ugDNA在更大体积中用20至250单位的酶消化。特定限制性酶的合适缓冲液及底物的量由厂商限定。通常使用的培养时间为约37℃，1小时，但根据厂商的建议可有所变化。消化完毕反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离所需的片段。

被切割片段的大小分离使用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行，见Goeddel，D.etal.，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)。

“寡核苷酸”指的是单链多聚脱氧核苷酸或可通过化学合成的两个互补的多聚脱氧核苷酸链。此合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此若在激酶存在下不加入ATP以提供磷酸，就不会与另一个寡核苷酸连接。合成寡核苷酸会与一个未经去磷酸化处理的片段连接。

“连接”指在2个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p146)。除非另外提供，连接使用已知的缓冲液和条件，每0.5ug大约等摩尔要连接的DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)。

除非有其它说明，转化的方法参照Graham，F.and Van der Eb，A.，Virology，52：456-457(1973)。

实施例1

人TIMP-4的细菌表达及纯化

首先使用相对于加工的人TIMP-4蛋白质的5′序列(减去信号肽序列)及TIMP-4基因的3′侧的载体序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码人TIMP-4的DNA序列，ATCC#75946。分别向5’和3’序列添加与人TIMP-4相应的附加核苷酸。5’寡核苷酸引物的序列为5’GCCAGAGGATCCTGCAGCTGCGCCCCGGCGCAC3′，含有一个BamH1限制酶切位点，其后是从加工的蛋白质密码子的推断的末端氨基酸开始的人TIMP-4编码序列的21个核苷酸。3’序列5’CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAACGATGTCAAC3’含有一个XbaI位点，其后是人TIMP-4的18个核苷酸。限制酶切位点与细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，C hatsworth，CA，91311)上的限制酶切位点相对应。pQE-9编码抗生素抗性(Amp^r)，一个细菌复制起点(ori)，一个IPTG调节的启动子操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6组氨酸标记及限制酶切位点。然后用BamH1和XbaI消化pQE-9，扩增的序列与pQE-9连接，并连同组氨酸标记和RBS编码序列插入到阅读框内。然后用连接混合物转化大肠杆菌菌株ml5/pREP4，该菌株可从Qiagen得到，方法见Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：A Labo ratory Mannal，Cold Spring Laboratory Press，(1989)。m15/pREP4含有多拷贝的表达lacI阻遏物并提供卡那素抗性(Kan^r)的质粒pREP4。通过在LB平板上生长的能力来鉴别转化子并选择出氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DMA，并通过限制性分析确认。含有所需构建体的克隆在同时补充Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。O/N培养物用于接种大的培养物，比率为1∶100到1∶250。细胞生长至光密度600(O.D.600)在0.4和0.6之间。然后以终浓度1mM加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。IPTG通过使lacI阻遏物失活清除P/O，导致基因表达提高来进行诱导。将细胞再培养3-4小时。然后通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶在离液剂6摩尔盐酸胍中。澄清后，以允许含有6组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，在镍螯合柱上经层析将溶解的人TIMP-4从溶液中纯化出来(Hochul，E.et al.，J.Chromatography 411：177-184(1984)。用pH5.0的6摩尔盐酸胍将人TIMP-4(纯度为90％)从柱子上洗脱下来，为了复性，则调节为3摩尔盐酸胍，100mM磷酸钠，10毫摩尔谷胱甘肽(还原型)及2毫摩尔谷胱甘肽(氧化型)。在这种溶液中培养12小时后，将蛋白质在10毫摩尔的磷酸钠中透析。

实施例2

重组人TIMP-4在COS细胞中的表达

人TIMP-4HA的表达来源于pcDNAI/Amp载体(Invitrogen)，该载体包含1)SV40的复制起点；2)氨苄青霉素抗性基因；3)大肠杆菌复制起点；4)CMV启动子，随后有一个多接头区，一个SV40内含子及多腺苷酸位点。编码全长人TI MP-4前体及一个与它的3’末端在阅读框内融合的HA标记的DNA片段克隆到载体的多接头区，因此，重组蛋白质的表达在CMV启动子的控制下进行。HA标记相应于来源于前面描述过的流感血细胞凝集素蛋白抗原决定基(I.Wilson，H.NIm an，K.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell，37，767)。HA标记与靶蛋白的融合使得使用一个识别HA抗原决定基的抗体检测重组蛋白质易于进行。

质粒构建的策略描述如下：

通过PCR构建编码人TIMP-4的DNA序列ATCC#75946，2个引物为：5’端引物5’GCCAGAGGATCCGCCACCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC3’，含有一个BamHI位点，后随起始于起始密码子的人TIMP-4编码序列的21个核苷酸。3’序列5’CGGCTTCTAGAATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGGCTGAACGATGTCAAC3’含有一个与XbaI位点，翻译终止密码子，HA标记及人TIMP-4编码序列的最后18个核苷酸(不包括终止密码子)互补的序列。因此，PCR产物含有一个BamHI位点，人TIMP-4编码序列及后随的框内融合的HA标记，紧接HA标记的一个翻译终止密码子及一个XbaI位点。用BamHI和XbaI限制酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并连接。连接混合物转化进大肠杆菌菌株SURE(可以从StratageneCloning Systes，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037获得).转化培养物在氨苄青霉素培养基平板上培养并选择抗性克隆.从转化子中分离质粒DNA并通过限制性分析检查正确片段的存在。为重组人TIMP-4的表达，用表达载体通过DEAE-DEXTRAN方法转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社(1989))。通过放射性标记及免疫沉淀的方法检测人TIMP-4HA蛋白的表达(E.Harlow，D.Lane，抗体实验手册，冷泉港实验室出版社，(1988))。转染2天后用³⁵S半胱氨酸对细胞标记8个小时。然后收集培养基并用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％N P-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.et al.，Id.37：767(1984))裂解细胞。使用HA特异性单克隆抗体同时沉淀溶胞产物和培养基。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白。

实施例3

使用杆状病毒表达系统克隆和表达TIMP-4

使用对应于基因的5’和3’序列的PCR的寡核苷酸引物对编码全长TIMP-4蛋白的DNA序列ATCC#75946进行扩增。

5’引物的序列为5’GCCAGAGGATCCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC3’，并在TIMP-4基因(翻译起始密码子ATG下划线)的起始21个核苷酸之后含有一个BamHI限制酶切位点(粗体表示)。

3’引物的序列为5’CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAACGATGTCAAC3’并含有限制性内切酶XbaI的切点和与TIMP-4基因的3’非翻译序列互补的18个核苷酸。使用商品化试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶上分离扩增的序列。然后用核酸内切酶BamHI和XbaI消化片段并再次在1％的琼脂糖凝胶上纯化，这一片段命名为F2。

载体pA2(载体pVL941经修饰而获得，以下讨论)用来在杆状病毒表达系统(综述见：Summers，M.D.and smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序的方法手册，Texas Agricultural Experimen tal StationBulletin NO.1555)中表达TIMP-4蛋白。此表达载体含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子及其后的限制性内切酶BamHI和XbaI的识别位点。猿猴病毒SV40的多聚腺苷酸位点用于有效的多聚腺苷酸化。为使重组病毒易于选择，来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因与多角体蛋白启动子同向插入，其后是多角体蛋白基因的多聚腺苷酸化信号。多角体蛋白的序列的两侧是用于共转染野生型病毒DNA的细胞介导的同源重组的病毒序列。很多其它的杆状病毒载体可用于代替pGR1，如pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.a nd Summers，M.D，，Virology，170：31-39)。

使用限制性内切酶BamHI和XbaI消化质粒，然后用商业化试剂盒从1％的琼脂糖凝胶上分离DNA(“Geneclean”BIO 101.Inc.，La Jolla，Ca.)。此载体DNA命名为V2。

使用T4 DNA连接酶将片段F2和质粒V2连接起来。然后转化大肠杆菌HB 101细胞并用限制酶BamHI和XbaI对含有TIMP-4基因的质粒(pBac TIMP-4)的细菌进行鉴定。通过DNA测序确认克隆片段的序列。

5ug的质粒pBacTIMP-4与1.0ug商业化线形杆状病毒(“Baculogold^TMBaculovirus DNA”.Phamingen，San Diego，CA.)使用脂转染方法(Felgner et al.，Proc.Natl.ACad.Sci.USA，84：7413-7417(1987))共转染。

将1ug BaculoGold^TM病毒DNA和5ug质粒pBac TIMP-4在含50ul无血清的Grace′s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴定板的无菌孔中混合。然后加入10ul脂转染试剂和90ul Grace′s培养基的混合物，在室温下混合并培养15分钟。然后将转染混合物滴加到接种于含1ml无血清Gr ace′s培养液的35mm组织培养板中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中。前后摇动培养板以混匀新加的溶液。将培养盘置于27℃培养5小时。5小时后从平板上倾去转染液，加入1ml含10％胎牛血清的Grace′s昆虫培养基将培养盘放回培养箱并于27℃继续培养4天。

4天后，收集上清液，按Summer和Smith(出处同上)所述相似地进行噬斑分析。作为改进，使用含‘Blue Gal’的琼脂糖凝胶(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)以便于分离蓝色噬斑。(详细的‘噬斑分析’可参考Life Technologies Inc.，Gaithersburg发表的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南第9-10页)。

系列稀释4天后，向细胞中加入病毒，用Eppendorf管头挑取蓝色噬斑.将含有重组病毒的琼脂重悬于含200ul Grace′s培养基的Eppendorf管中。简单离心去除琼脂，用含重组杆状病毒的上清液感染接种于35mm皿上的Sf9细胞。4天后，收集这些培养皿中的上清液，然后4℃保存。

Sf9细胞生长于含10％热灭活FBS的Grace′s培养基中。用重组杆状病毒V-TIMP-4感染细胞，感染复数(MOI)为2。6小时后除去培养基，用不含甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)替代。42小时后加入5uCi³⁵S-甲硫氨酸和5uCi35S-半胱氨酸(Amersham)。继续培养细胞16小时，然后，离心收集细胞，用SDS-PAGE和放射自显影观察标记蛋白。

实施例4

人TIMP-4在人组织中的表达模式

将上述各组织的20ul总RNA变性，进行1.2％甲醛琼脂糖凝胶电泳，毛细印迹到尼龙膜上，过夜。经UV交联将RNA固定在滤膜上。从部分TIMP-4核酸序列的EcoRI-Xhol插入片段制备随机引物探针，并用于经过用100ug/ml变性鲑精DNA作封闭剂，在Church缓冲液中杂交过夜探查印迹。依次用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS在65℃进行洗涤。大小标准样是BRL RNA序列梯和18S，28S核糖体RNA带，见图3。

序列表

(1)一般信息

(i)申请人：GREENE，ET AL.

(ii)发明名称：人TIMP-4

(iii)序列数：2

(iv)联系地址：

    (A)联系人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN

    (B)街道：6 BECKE FARM ROAD

    (C)城市：ROSELAND

    (D)州：NEW JERSEY

    (E)国别：USA

    (F)邮政编码：07068

(v)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：3.5英寸盘

    (B)计算机：IBM PS/2

    (C)操作系统：MS-DOS

    (D)软件：WORD PERFECT 5.1

(vi)本申请资料

    (A)申请号：

    (B)申请日：

    (C)分类

(vii)在先申请资料

    (A)申请号：

    (B)申请日：

(viii)律师/代理人信息

    (A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

    (B)登记号：36，134

    (C)参考/文档号：325800-278

(ix)电信信息：

    (A)电话：201-994-1700

    (B)传真：201-994-1744

(2)SEQ ID NO：1的信息

(i)序列特征

   (A)长度：675个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1ATGCCTGGGA GCCCTCGGCC CGCGCCAAGC TGGGTGCTGT TGCTGCGGCT GCTGGCGTTG    60CTGCGGCCCC CGGGGCTGGG TGAGGCATGC AGCTGCGCCC CGGCGCACCC TCAGCAGCAG   120ATCTGCCACT CGGCACTTGT GATTCGGGCC AAAATCTCCA GTGAGAAGGT AGTTCCGGCC   180AGTGCAGACC CTGCTGACAC TGAAAAAATG CTCCGGTATG AAATCAAACA GATAAAGATG   240TTCAAAGGGT TTGAGAAAGT CAAGGATGTT CAGTATATCT ATACGCCTTT TGACTCTTCC   300CTCTGTGGTG TGAAACTAGA AGCCAACAGC CAGAAGCAGT ATCTCTTGAC TGGTCAGGTC   360CTCAGTGATG GAAAAGTCTT CATCCATCTG TGCAAGTACA TCGAGCCCTG GGAGGACCTG   420TCCTTGGTGC AGAGGGAAAG TCTGAATCAT CACTACCATC TGAACTGTGG CTGCCAAATC   480ACCACCTGCT ACACAGTACC CTGTACCATC TCGGCCCCTA ACGAGTGCCT CTGGACAGAC   540TGGCTGTTGG AACGAAAGCT CTATGGTTAC CAGGCTCAGC ATTATGTCTG TATGAAGCAT   600CTTGACTTCA CCTGCAGCTG GTACCGGGGC CACCTGCCTC TCAGGAAGGA GTTTGTTGAC   660ATXGTTCAGC CCTAG                                                    675

(2)SEQ ID NO：2的信息

(i)序列特征

   (A)长度：224个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：

   (D)拓扑：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(Xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Pro Gly Ser Pro Arg Pro Ala Pro Ser Trp Val Leu Leu Leu

            -25                 -20                 -15Arg Leu Leu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Gly Leu Gly Glu Ala Cys

            -10                 -5                    1Ser Cys Ala Pro Ala His Pro Gln Gln His Ile Cys His Ser Ala

          5                  10                  15Leu Val Ile Arg Ala Lys Ile Ser Ser Glu Lys Val Val Pro Ala

         20                  25                  30Ser Ala Asp Pro Ala Asp Thr Glu Lys Met Leu Arg Tyr Glu Ile

         35                  40                  45Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys Gly Phe Glu Lys Val Lys Asp Val

         50                  55                  60Gln Tyr Ile Tyr Thr Pro Phe Asp Ser Ser Leu Cys Gly Val Lys

         65                  70                  75Leu Glu Ala Asn Ser Gln Lys Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Gln Val

         80                  85                  90Leu Ser Asp Gly Lys Val Phe Ile His Leu Cys Asn Tyr Ile Glu

         95                 100                 105Pro Trp Glu Asp Leu Ser Leu Val Gln Arg Glu Ser Leu Asn His

        110                 115                 120His Tyr His Leu Asn Cys Gly Cys Gln Ile Thr Thr Cys Tyr Thr

        125                 130                 135val Pro Cys Thr Ile Ser A la Pro Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp

        140                  145                 150Trp Leu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala Gln His Tyr

        155                 160                 165Val Cys Met Lys His Val Asp Gly Thr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly

        170                 175                 180His Leu Pro Leu Arg Lys Glu Phe Val Asp Ile Val Gln Pro

        185                 190                 195

Claims (14)

1、一种分离的多核苷酸，选自：

(a)编码由图1的推导的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；

(b)编码由包含于ATCC保藏号75946的cDNA编码的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。

2、权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。

3、权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是RNA。

4、权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是基因组DNA。

5、权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由图1的推导的氨基酸序列组成的多肽。

6、权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由ATCC保藏号75946的cDNA编码的多肽。

7、权利要求1的多核苷酸，其由图1所示的编码序列组成。

8、权利要求2的多核苷酸，其由以ATCC保藏号75946保藏的编码序列组成。

9、一种载体，含有权利要求2的DNA。

10、一种用权利要求9的载体遗传工程化的宿主细胞。

11、生产一种多肽的方法，包括从权利要求10的宿主细胞表达由所说DNA编码的多肽。

12、生产能表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求9的载体对细胞进行遗传工程化。

13、一种多肽，选自(i)由图1的推导的氨基酸序列组成的多肽，和(ii)由ATCC保藏号75946的cNDA编码的多肽。

14、权利要求13的多肽，其中的多肽由图1的推导的氨基酸序列组成。

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