CN1475570A - 角质形成细胞生长因子-2 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种人体多肽、编码这种多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术产生这种多肽的方法。本文也公开了使用这种多肽刺激上皮细胞生长的方法，该方法可用于刺激创伤愈合、减少瘢痕形成以及预防脱发。本发明也公开了抗这种多肽的拮抗剂以及使用它们作为治疗增殖疾病(如癌、牛皮癣、卡波济氏肉瘤、瘢痕瘤、视网膜病和restcnosis)的治疗剂。本文还公开了检测KGF－2编码序列中的突变和在来源于宿主的样品中的KGF－2浓度的改变的诊断方法。

Description

角质形成细胞生长因子-2

本发明涉及新鉴别的多核苷酸、由这种多核苷酸编码的多肽、这种多核苷酸和多肽的用途以及产生这种多核苷酸和多肽的方法。更具体地说，本发明的多肽是一种角质形成细胞生长因子，在下文有时作为“KGF-2”。本发明也涉及抑制这种多肽的作用。

成纤维细胞生长因子家族是参与软组织生长和新生的生长因子的一个大家族。它目前包括几个成员，它们在蛋白质水平上有不同程度的同源性，一个例外的情况是看来似乎有类似的广阔的促有丝分裂谱，即它们促进中胚层和神经外胚层起源的各种细胞的增殖和/或促进血管形成。

该家族的不同成员的表达方式十分不同，从发育的某些阶段的极其有限的表达至不同组织和器官中的相当普遍存在的表达。所有成员在胞外基质中看来似乎结合肝磷脂和肝素硫酸盐蛋白多糖和糖胺聚糖并强烈浓缩。KGF最初通过序列同源性或因子纯化和克隆鉴别为PGP家族的成员。

角质形成细胞生长因子(KGF)作为培养的鼠角质形成细胞细胞系的促细胞分裂剂分离(Rubin，J.S.等，美国科学院学报，86：802-806(1989))。不同于FGF家族的其它成员，它对间质衍生的细胞活性很小，但刺激上皮细胞的生长。角质形成细胞生长因子基因编码194个氨基酸的多肽(Finch，P.W.等，科学，245，752-755(1989))。N-末端的64个氨基酸是独特的，但是蛋白质的其余部分和bFGF有大约30％的同源性。KGF是FGF家族的最不同的成员。该分子有疏水信号序列并且高效分泌。翻译后的修饰包括信号序列的裂解和在一个位点上N-连接的葡基化，产生28kDa的蛋白质。角质形成细胞生长因子通过衍生自皮肤和胎儿肺脏的成纤维细胞产生(Rubin等，(1989))。发现角质形成细胞生长因子mRNA在成人肾、结肠和髂骨中但不在脑或肺脏中表达(Finch，P.W.，等，科学，245：752-755(1989))。KGF显示在FGP蛋白质家族之内的保守区。KGF和FGP-2受体高亲和性结合。

本发明的多肽被推定鉴别为FGF家族的成员，更具体地说，由于和FGP家族的其它成员的氨基酸序列同源，多肽被推定鉴别为KGF-2。

按照本发明的一个方面提供了新的成熟多肽，这种多肽是KGF-2及其生物学活性的和诊断或治疗有用的片段、类似物和衍生物。本发明多肽是人体起源的。

按照本发明的一个方面提供了分离的编码人KGF-2的分离的核苷酸分子，包括mRNA、DNAs、染色体DNA以及其反义类似物和其有生物学活性的和诊断或治疗有用的片段的。

按照本发明的另一个方面提供了通过使用重组载体(如在KGF-2蛋白质、重组原核生物和/或包含人KGF-2核酸序列的真核宿主细胞的重组产生中作为试剂有用的克隆和表达载体)用重组技术产生这类多肽的方法。

按照本发明的另一方面提供了使用这类多肽或编码这类多肽的多核苷酸以用于治疗目的方法，例如，为治疗创伤刺激表皮细胞的增殖，刺激毛囊产生，并治愈皮肤的创伤。

按照本发明的另外的一个方面提供了抗这类多肽的抗体。

按照本发明的另一方面提供了包含和人KGF-2序列特异性杂交的足够长度的核酸分子的核酸探针。

按照本发明的另一个方面提供了抗这类多肽的拮抗剂，此类拮抗剂可用于抑制这类多肽的作用，例如，在创伤治愈过程中减少结疤、预防和/或治疗瘤增殖、糖尿病的视网膜病、风湿性关节炎和肿瘤生长。

按照本发明的另一个方面提供了检测与KGF-2核酸序列突变或由这类序列编码的多肽的过量表达有关的疾病或疾病易感性的诊断测定方法。

按照本发明的另一个方面提供了为与科学研究有关的体外目的将这类多肽或编码这类多肽的多核苷酸用于合成DNA或产生DNA载体的方法。

由本文教导，本发明的这些和其它方面对本领域技术人员应该是明显的。

下列附图是本发明的具体实施方案的说明，并不是限制权利要求所包括的本发明的范围。

图1说明本发明的多肽的cDNA和相应的推断的氨基酸序列。初始的36个氨基酸残基代表推定的前导序列(画线部分)。使用了标准的氨基酸单字母缩写。试图确定多核苷酸序列时，测序不精确性是常见的问题。使用373自动DNA测序仪进行测序(Applied Biosystem公司)。预测测序精确性大于97％精确度。

图2是本发明的多肽和其它成纤维细胞生长因子的氨基酸序列的比较的图解。

按照本发明的一个方面提供了这种分离的核酸(多核苷酸)，该核酸编码具有图1的推定的氨基酸序列(SEQ ID No.2)的成熟多肽或由1994年12月16日保藏的ATCC 75977的克隆的cDNA编码的成熟多肽。

编码本发明的多肽的多核苷酸可以从人前列腺和胎儿的肺脏中获得。编码多肽的cDNA片段首先从衍生自人正常前列腺的文库中分离出来。随后编码全长蛋白质的开放读框从随机致敏的(primed)人胎儿肺脏cDNA文库分离到。它与FGF家族在结构上相关。它包含编码268个氨基酸残基的的蛋白质的开放读框，在这些氨基酸残基中，前36个氨基酸残基是推定的前导序列以使成熟蛋白质包含172个氨基酸。蛋白质表现出和人角质形成细胞生长因子最高程度的同源性，在206个氨基酸的链上，45％相同，82％相似。同样重要的是，发现FGF家族保守的序列在本发明的蛋白质中是保守的。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中的DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。如果单链可以是编码链或非编码(反义)链，则DNA可以是双链或单链。编码成熟多肽的编码序列可以和图1中显示的编码序列(SEQ ID No.1)或保藏的克隆的编码序列相同，或可以是编码序列的不同的编码序列，此编码序列由于基因密码的冗余和简并，编码与图1(SEQ IDNo.1)的DNA或保藏的cDNA相同的成熟多肽。

编码图1(SEQ ID No.2)的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的序列；编码成熟多肽的序列和附加的编码序列(如前导或分泌序列或前蛋白质序列)；成熟多肽的编码序列(和选择性的附加编码序列)和非编码序列(如成熟多肽的编码序列的内含子或非编码序列的5′和/或3′)。

这样，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅包含编码多肽的序列的多核苷酸以及包含附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与本文以上所述的编码具有图1(SEQ ID No.2)推定的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物的多核苷酸的变体。多核苷酸的变体可以是多核苷酸的天然产生的等位变体或多核苷酸的非天然产生的变体。

这样，本发明包括编码如图1(SEQ ID No.2)中显示的相同的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的相同的成熟多肽的多核苷酸以及这类多核苷酸的变体，其变体编码图1(SEQ ID No.2)的多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物。这类核苷酸变体包括缺失变体、取代变体和添加或插入变体。

如上文所述，所述多核苷酸可以有如图1(SEQ ID No.2)中显示的编码序列或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体的编码序列。如本领域所已知的，等位变体是可以具有一种或多种没有实质上改变编码的多肽的功能的核苷酸的取代、缺失或添加的多核苷酸序列的一种替代形式。

本发明也包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可与这种多核苷酸序列融合到相同的阅读框架中，这种多核苷酸帮助多肽从宿主细胞中表达和分泌，例如，作为控制多肽从细胞中运输的分泌序列起作用的前导序列。具有前导序列的多肽是前蛋白质并具有前导序列，该前导序列由宿主细胞裂解以形成成熟形式的多肽。多核苷酸也可以编码成熟蛋白质加其它的5氨基酸残基的前蛋白。具有原序列的成熟蛋白质是前蛋白(proprotein)，是蛋白质的失活形式。一旦裂解了原序列，就产生活性的成熟蛋白质。

这样，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白质、或具有原序列的蛋白质、或具有原序列(prosenquence)和前序列(presequence)(前导序列)的蛋白质。

本发明的多核苷酸可以具有符合读框地融合进使得可以纯化本发明的多肽的标记序列上的编码序列。在细菌宿主的情况下，标记序列可以通过pQB-9载体提供的六个组氨酸标记(tag)以提供融合到标记上的成熟多肽的纯化，或，例如，当使用哺乳动物宿主(如COS-7细胞时)，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。HA标记对应于衍生自流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson，I.等，细胞，37：767(1984))。

本发明还涉及和上述序列杂交的多肽(如果在两种序列之间至少50％相同，优选地70％相同)。具体来说，本发明涉及在严格条件下和上述的多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用的术语“严格条件”指杂交仅发生在序列之间至少95％相同，优选地至少97％相同时。和上文优选的实施方案中所述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码和图1的cDNA(SEQ ID No.1)或保藏的cDNA编码的成熟多肽实质上相同的生物功能或活性的多肽。

本文所指的保藏按照用于专利程序的国际承认的布达佩斯条约的条款保藏。这些保藏仅为了方便本领域技术人员而提供，不是35 U.S.C§112所需的保藏。本文一并参考了包含在保藏材料中的多核苷酸序列以及由其编码的多肽的氨基酸序列，如果和本文描述的任何序列发生冲突时是对照性的(controlling)。制造、使用或销售所述保藏材料需要得到许可，这里没有给予这种许可。

本发明还涉及具有图1推定的氨基酸序列(SEQ ID No.2)的多肽，或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的多肽及这种多肽的片段、类似物和衍生物。

当指图1的多肽(SEQ ID No.2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”意思是保持和这种多肽保持本质上相同的生物功能或活性的多肽。这样，类似物包括可由原蛋白部分裂解活化以产生活性的成熟多肽的原蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选地是重组多肽。

图1中的(SEQ ID No.2)或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(i)一种多肽，其中一种或多种氨基酸残基由保守或非保守的氨基酸残基(优选地是保守的氨基酸残基)取代，这种氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)一种多肽，其中一种或多种氨基酸残基包括取代基，或(iii)一种多肽，其中成熟多肽与另一种化合物，如一种提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)融合，或(iv)一种多肽，其中另外的氨基酸融合到成熟多肽上，如前导或分泌序列或用于成熟多肽纯化的序列或原蛋白序列。通过本文的教导，这种片段、衍生物和类似物是在本领域技术人员的知识范围内。

本发明的多肽和多核苷酸优选地是以分离形式提供，优选地是纯化至同质。

术语“分离的”意思是从其原来的环境(例如，如果它是天然产生时的天然环境)分离到的材料。例如，在生活动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是分离自自然系统的某些或所有共存材料的相同多核苷酸或多肽是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，而且可以分离，其中这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。

本发明也涉及包括本发明的多核苷酸的载体、用本发明的载体遗传工程操作的宿主细胞以及通过重组技术产生本发明的多肽。

宿主细胞是用本发明的载体经遗传工程(转导、转化或转染)操作的，所述载体如克隆载体或表达载体。例如，载体可以以质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。工程宿主细胞可以在修饰得适于活化启动子、选择转化体或扩增KGF-2基因的常规营养培养基中培养。培养条件(如温度、pH等)是以前用于选择表达的宿主细胞的条件，是本领域的普通技术人员所知的。

本发明的多核苷酸通过重组技术可用于产生多肽。这样，例如，多核苷酸可以包含在各种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列。例如，SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；得自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA结合物的载体，如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病病毒。然而，也可以使用任何其它载体(只要它在宿主中可复制并能生存)。

适当的DNA序列可以通过各种方法插入到载体中。通常，DNA序列通过本领域已知的方法插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这种和其它方法被认为在本领域技术人员的范围之内。

把在表达载体中的DNA序列可操作地连接到适当的表达控制序列(启动子)上以指导mRNA的合成。这种启动子的代表性例子如下：LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λP_L启动子以及其它已知在真核细胞和原核细胞或其病毒中控制基因表达的启动子。表达载体也可以包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。载体也可以包含用于扩增表达的适当序列。

另外，表达载体优选地包含一种或多种可选择的标记基因以提供用于转化的宿主细胞选择的表型特征，如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含如上所述的适当DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体可用于转化适当的宿主以使得宿主表达所说的蛋白质。

适当的宿主有代表性的例子如下：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇属S2和夜蛾属Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。根据本发明的教导，适当的宿主选择被认为是在本领域的技术人员的知识范围之内。

更具体来说，本发明也包括含有一种或多种如上广泛叙述的序列的重组构建体。构建体包含本发明的序列正或反方向插入的载体，如质粒或病毒载体。在实施方案的一个优选的方面中，构建体还包括可操作地与序列连接的调节序列，该调节序列包括，例如，启动子。许多适合的载体和启动子是本领域技术人员熟知的并可购买到。下列的载体以例证的方式提供：细菌的：pCP70、pQE60、PQB-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核细胞的：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。但是，可以使用任何其它的质粒或载体(只要它在宿主中可复制并能生存)。

使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择性标记的载体可从任何所需的基因选择启动子区。两个适当的载体是pKK232-8和pCM7。具体命名的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L和trp。真核细胞的启动子包括CMV极早期、HSV胸腺嘧啶核甙激酶、早期和晚期SV40、反转录病毒的LTRs以及小鼠金属硫蛋白-I。适当的载体与启动子的选择在本领域普通技术人员的水平之内。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)或低等真核细胞(如酵母细胞)，宿主细胞也可以是原核细胞(如细菌细胞)。把构建体导入宿主细胞可由磷酸钙转染、DEAB-葡聚糖介导的转染或电穿孔影响(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学的基本方法(1986))。

在宿主细胞中的构建体可以按照常规方法使用以产生由重组序列编码的基因产物。另外，本发明的多肽可以通过常规的肽合成仪合成产生。

成熟蛋白质可于适当的启动子的控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。也可以使用无细胞翻译系统使用得自本发明的DNA构建体的RNA产生这种蛋白质。用于原核和真核宿主的适当的克隆和表达载体由Sambrook等描述，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，N.Y.，(1989)，本发明一并参考了其说明书。

编码本发明的多肽的DNA通过高等真核生物的转录可通过把增强子序列插入到载体中提高。增强子是DNA的顺式作用元件，通常为大约10至300bp，它作用于启动子以增强其转录。例子包括在复制起点100至270bp的晚期侧向的SV40增强子、巨细胞病毒的早期启动子增强子、在复制起点的晚期侧向的多形瘤增强子以及和腺病毒增强子。

通常，重组体表达载体包括使得可以进行宿主细胞的转化的复制起点和可选择性标记(例如，大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和S.cerevisiaeTRP1基因，以及衍生自高度表达的基因的启动子)以指导下游结构序列的转录，这种启动子可以得自编码在其它酶中的糖酵解酶(如3-磷酸甘油酸盐激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或热击蛋白)的操纵子。异源结构序列和翻译起始和终止序列(优选的是能指导翻译的蛋白质分泌进周质空间和胞外培养基的前导序列)在适当的阶段装配。异源序列可有可无地编码包括N-末端鉴别肽的融合蛋白质，该鉴别肽传递所需的特征，如表达的重组产物的稳定和简单纯化。

通过把编码所需的蛋白质的结构DNA序列和适合的翻译起始和终止信号一道插入具有功能启动子的可操作的阅读相(phase)中构建用于细菌的有用的表达载体。载体包括一种或多种表型可选择性标记以及复制起点以确保载体的保持并(如果需要)提供在宿主内的扩增。虽然其它的原核宿主也可选择，适当的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单孢菌属、链霉菌属和葡萄球菌的不同物种。

作为代表性的而非限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可包含得自市售的质粒的可选择性标记和细菌复制起点，包括熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件。这种商业载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“主链”部分和适当的启动子和要表达的结构序列结合。

在适合宿主菌株的转化和宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，选择的启动子通过适当的方式诱导(如温度变换或化学诱导)，然后再培养细胞另外一个时期。

细胞典型地通过离心收获，通过物理或化学方式破坏，形成的粗提取物留待进一步纯化。

用于蛋白质表达的微生物细胞可由任何常规技术破坏，包括冷冻-解冻循环、声处理、机械破坏或使用细胞水解试剂，这种方法对本领域技术人员是熟知的。

也可使用各种哺乳动物细胞培养系统以表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系(由Gluzman，细胞，23：135(1981)描述)以及其它能表达相容的载体的细胞系，如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包括复制起始位点、适合的启动子和增强子以及必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5侧翼非转录序列。衍生自SV40剪接位点和聚腺苷酸化位点的DNA序列可用于提供所需的非转录遗传元件。

可以通过以下方法从细胞培养物中回收和纯化KGF-2多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和外源凝集素色谱。如果需要，可以使用蛋白质再折叠步骤完成成熟蛋白质的构型。最后，可以使用高效液相色谱(HPLC)为最后的纯化步骤。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成过程的产物，或通过重组技术从原核或真核宿主(例如，培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生。依赖于用于重组产生过程的宿主，本发明的多肽可以是葡基化或非葡基化的。本发明的多肽也可以包括一种初始的甲硫氨酸残基。

可以使用本发明的多肽刺激新血管生长或血管形成。具体来说，本发明的多肽可以刺激角质形成细胞细胞生长和增殖。因此，可以使用本发明的多肽刺激创伤治愈并刺激与脱发预防有关的角质形成细胞。

本发明的多肽也可通过表皮刺激细胞增殖治愈皮创伤。

本发明的多肽也可用于刺激细胞(例如，肌肉细胞和神经组织、前列腺细胞和肺脏细胞)分化。

KGF-2的编码氨基酸1至36的信号序列通常可通过杂交和/或计算搜索算法鉴别分泌的蛋白质。

KGF-2的核苷酸序列可用于通过杂交分离5序列。然后，包含在其天然的启动子/增强子序列的控制之下的KGF-2基因的质粒可用于目的旨在研究KGF-2基因表达的内源细胞和病毒的反式激活蛋白鉴别的体外试验。

KGF-2蛋白质在设计用于KGF-2受体鉴别的肽模拟的实验中可用作阳性对照。

按照本发明的另一个方面提供了使用这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸用于与科学研究、DNA合成、DNA载体的制造有关的体外目的的方法以及用于提供人体疾病治疗的诊断和治疗目的的方法。

全长KGF-2基因的片段可用作cDNA文库的杂交探针以分离全长KGF-2基因并分离和这些基因具有高度的序列相似性或类似的生物活性的其它基因。这种类型的探针通常具有至少20个碱基。虽然探针也可以具有很多碱基，然而，优选地探针具有至少30个碱基，并且一般不超过50个碱基。探针也可用于鉴别对应于全长转录的cDNA克隆或基因组克隆或包含含有调节和启动子区、外显子和内含子的完全的KGF-2基因克隆。筛选的例子包括通过使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针分离KGF-2基因的编码区。具有和本发明的基因的序列互补的序列的标记的寡核苷酸可用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA的文库以确定探针和文库的哪些成员杂交。

本发明提供了用于KGF-2多肽受体鉴别的方法。编码受体的基因可通过许多本领域技术人员已知的方法鉴别，例如，配位体panning和PACS分类整理(Coligan等，免疫学当前方案，1(2)，第5章，(1991))。优选地，使用其中多聚腺苷化的RNA从对多肽有作用的细胞中制备的表达克隆，从这种RNA产生的cDNA文库划分成库并用于转染对多肽有作用的COS细胞或其它细胞。在载玻片上生长的转染细胞接触标记的多肽。多肽可通过各种手段标记，包括位点特异性蛋白质激酶识别位点的碘化或包含。在固定和培养之后，载玻片进行放射自显影分析。鉴别阳性库，制备子库并使用反复的子库和再筛选过程再转染，最终产生编码推定受体的单一克隆。

作为用于受体鉴别的一种替代方法，标记的多肽可与表达受体分子的细胞膜或提取物制剂光亲和连接。交联的材料通过PAGE分析和对x-射线底片曝光解析。可以去除包含多肽受体的标记复合物并使其分解为肽片段，并经受蛋白质微测序。从微测序获得的氨基酸序列可用于设计一组退化的寡核苷酸探针筛选cDNA文库以鉴别编码推定受体的基因。

本发明提供了筛选化合物以鉴定拮抗KGF-2的作用或阻断KGF-2的功能的化合物的方法。这种测定例子包括：把哺乳动物角质形成细胞、要筛选的化合物和³[H]胸苷在角质形成细胞正常增殖的细胞培养条件下组合。对照测定可以在无筛选的化合物时进行并比较在化合物存在下角质形成细胞增殖的量以确定化合物是否刺激角质形成细胞的增殖。

为筛选拮抗剂，可以在KGF-2存在时进行相同的测定，测定化合物阻止角质形成细胞增殖的能力并测定拮抗剂的能力。通过测定³[H]胸苷的掺入的液态闪烁色谱测定角质形成细胞细胞增殖的量。

在另一个方法，表达KGF-2受体的哺乳动物细胞或膜制备物在在化合物的存在下和标记的KGF-2培养。可测定化合物提高或封闭这种相互作用的能力。在化合物存在或不存在时测定和比较KGF-2和受体相互作用之后的已知的第二信使系统的反应。这种第二信使系统包括但不限于：cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解。

潜在的KGF-2拮抗剂的例子包括和多肽结合的抗体，或在某些情况下，包括寡核苷酸。另外，潜在的KGF-2拮抗剂可以是结合KGF-2受体的突变形式，然而，没有引发第二信使反应，因而有效地封闭了KGF-2的作用。

另一个潜在的KGF-2拮抗剂是使用反义技术制备的反义构建体。反义技术可通过三股螺旋结构或反义DNA或RNA，两种方法基于多核苷酸和DNA或RNA结合。例如，多核苷酸5编码部分(编码本发明的成熟多肽)可用于设计长度从10至40碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计了和参与转录的基因区域互补的DNA寡核苷酸(三股螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456(1988)；Dervan等，科学，251：1360(1991))，由此防止KGF-2的转录和产生。反义RNA寡核苷酸和mRNA在体内杂交以封闭mRMA分子翻译成KGF-2多肽(反义-Okano，神经化学杂志，56：60(1991)；寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)。可以把上述的寡核苷酸施用给细胞以便在体内表达反义RNA或DNA，从而抑制KGF-2的产生。

潜在的拮抗剂包括结合KGF-2并具有KGF-2受体结合位点的小分子，因而使受体难以接近这种KGF-2而阻止了正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小肽或类似肽的分子。

可以使用KGF-2拮抗剂预防肿瘤中的新血管生长或血管生成的诱导。由KGF-2刺激的血管形成也产生几个可以通过本发明的拮抗剂治疗的病状，这些病状包括糖尿病视网膜病、抑制病理组织(如风湿性关节炎)的生长。

也可以使用KGF-2拮抗剂治疗小球肾炎，该疾病的特征是血管小球的上皮细胞的显著增殖，这些细胞形成了填充鲍曼氏空间的细胞团。

拮抗剂也可以用于抑制在外科后瘢痕瘤形成中所见的瘢痕组织的过量产生、心肌梗塞之后的纤维变性或与肺部纤维变性和再狭窄有关的纤维变性损伤。可以使用KGF-2拮抗剂以治疗其它由KGF-2刺激的增殖疾病，包括癌症和卡波济氏肉瘤。

KGF-2拮抗剂也可用于治疗角膜的深层被眼色素层炎症慢性渗透的角膜炎，该疾病的特征是上皮细胞的增殖。

拮抗剂可用于含有药学上可接受的载体的如下文所述的组合物中。

本发明的多肽、激动剂和拮抗剂可与适当的药学载体结合使用以组成药物组合物。该组合物包含治疗有效量的多肽、激动剂或拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合物，制剂应适于施用方式。

本发明也提供包含一种或多种用一种或多种本发明的药物组合物填充的容器的药物包或试剂盒。与这种容器有关的可以是管理制造、使用或销售药物或生物学产物的的政府机构规定形式的通告，该通告反映管理机构同意制造、使用或销售供人使用的产品。另外，本发明的多肽、激动剂和拮抗剂可与其它治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式施用，如口服、局部施用、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、真皮内路线。药物组合物以有效治疗和/或预防特定疾病的量施用。通常，它们以至少大约10μg/kg体重的量施用，大多数情况下，它们以每天不超过大约8mg/kg体重施用。在大多数情况下，剂量是每天大约10μg/kg至大约1mg/kg体重，考虑到施用路线、症状等。在局部施用的特异性情况下，药剂施用的量优选地是每m²大约0.1μg至9mg。

KGF-2多肽、多肽的激动剂和拮抗剂也按照本发明通过这种多肽在体内表达使用，这就是所说的“基因治疗”。

这样，例如，患者的细胞可以在体外用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)进行基因工程操作，然后把工程细胞提供给用所述多肽治疗的患者。这种方法在本领域中是众所周知的。例如，细胞可以按照本领域已知的方法通过使用包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒进行工程操作。

同样地，也可以通过，例如，本领域已知的方法在体内工程操作细胞以在体内表达多肽。如本领域中所知的，产生包含RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞可以施用给患者以在体内工程细胞并在体内表达多肽。这些通过这种方法施用本发明的多肽的方法其它方法按照本发明的教导对本领域技术人员是明显的。例如，工程细胞的表达载体可不使用逆转录病毒，例如，用于在与适当的载体组合之后在体内工程操作细胞的腺病毒。其它施用载体的例子包括基于HSV的载体系统、腺有关的病毒载体以及惰性载体，例如，葡聚糖包衣的铁酸盐颗粒。

本发明也涉及将KGF-2基因用作检测与KGF-2核酸序列中突变存在有关的疾病或疾病易感性的诊断测定的一部分。

KGF-2基因的单个携带突变可在DNA水平通过各种技术检测到。用于诊断的核酸可从患者的细胞中获得，如血液、尿、唾液、活组织检查和尸体解剖材料。基因组DNA可直接用于检测，或在分析前通过使用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同的目的。作为例子，和编码KGF-2的核酸互补的引物可用于鉴别和分析KGF-2突变。例如，可以通过扩增产物的大小和正常的遗传型比较的变化检测缺失和插入。点突变可以通过扩增的DNA和放射性标记的KGF-2RNA杂交，或替代地与放射性标记的KGF-2反义DNA序列杂交鉴别。完全匹配的序列可通过核糖核酸酶A消化或通过解链温度的区别从错配的双链中区分。

基于DNA序列区别的遗传试验可通过有或无变性剂的凝胶中DNA片段的电泳迁移率改变的检测达到。小序列的缺失和插入可通过高分辨率凝胶电泳可视化。不同序列的DNA片段可在变性的甲酰胺梯度凝胶上区别，其中不同的DNA片段的迁移率按照其特异性解链或部分解链的温度在不同的位置的凝胶中滞留(参见，例如，Myers等，科学，230：1242(1985))。

在特异性位置的序列改变也可以通过核酸酶保护测定显示，如核糖核酸酶和S1保护或化学裂解方法(例如，Cotton等，美国科学院学报，85：4397-4401(1985))。

这样，特异性DNA序列的检测可通过如下方法完成，如杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序或使用限制酶(例如，限制片段长度多态性(RFLP))、基因组DNA的Southern印迹。

除了更常规的凝胶电泳和DNA测序之外，突变也可以通过原位分析检测。

本发明也涉及用于检测在各种组织中KGF-2蛋白质改变的水平的诊断测定方法，因为与正常的对照组织样品相比，蛋白质的超量表达可以检测疾病或疾病易感性(例如，肿瘤)的存在。用于检测样品中得自宿主的KGF-2蛋白质的水平的测定方法对本领域技术人员是众所周知的，包括放射免疫测定、竞争性结合测定、Western印迹分析、ELISA测定和“三明治形”测定。ELISA测定(Coligan等，免疫学当前方案，1(2)，第6章，(1991))最初包括制备对KGF-2抗原特异性的抗体，优选地是单克隆抗体。此外，制备了抗单克隆抗体的报道抗体。把可检测的试剂(如放射性，荧光，或在此例中的辣根过氧物酶)吸附到报道抗体上；把样品从宿主中除去并在固相支持体上(例如，聚苯乙烯盘，其结合样品中的蛋白质)培养。然后通过和非特异性蛋白质(如，牛血清蛋白)温育封闭盘上的任何自由的蛋白质结合位点。接着，单克隆抗体在盘中温育，在此期间，单克隆抗体连接任何吸附到聚苯乙烯盘上的KGF-2蛋白质。所有未结合的单克隆抗体通过缓冲液洗去。把连接到辣根过氧物酶上的报道抗体置于盘中，引起报道抗体和任何连接KGF-2的单克隆抗体结合，然后洗去未吸附的报道抗体，接着把过氧物酶底物添加到盘中，在给定的时间段内显色的量和标准曲线相比时，可测定给定体积的患者样品中存在的KGF-2蛋白质的量。

可以使用竞争性测定，其中把对KGF-2特异性的抗体吸附到标记的固相支持体上，标记的KGF-2和得自宿主的样品通过固相支持体，然后通过(例如，通过液态闪烁色谱)检测到的标记的量和样品中KGF-2的量相关联。

“三明治”测定类似于ELISA测定。在“三明治”测定中，KGF-2通过固相支持体并和吸附到固相支持体上的抗体结合。然后使第二抗体和KGF-2结合。接着使标记的并对第二种抗体是特异性的第三抗体通过固相支持体并和第二抗体结合，然后进行定量测定。

本发明的序列对于染色体鉴别也有价值。序列对单个人染色体的特定位置是特异性地并可与其杂交。此外，目前有需要鉴别染色体上的特定位点。基于实际序列数据(重复多态性)的极少染色体标记试剂目前可用于标记染色体定位。按照本发明的DNA对染色体图在序列和与疾病有关的基因相关中是重要的第一步。

简言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)，序列可以对染色体作图。3端未翻译区的计算机分析快速选择不跨越基因组DNA中一个外显子以上的引物，这样使扩增过程复杂化。然后这些引物用于包含单个人染色体的体细胞杂合体的筛选。只有那些包含与上述引物相对应的人基因的杂合体才产生扩增片段。

体细胞杂合体的PCR图谱是把特定的DNA分配给特定染色体的快速方法。使用具有相同寡核苷酸引物的本发明，亚定位可用得自特定的染色体或大的基因组克隆库的片段组(panel)以类似的方式达到。其它可相似地用于其染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流式分选染色体预筛选以及通过和构建的染色体特异性-cDNA文库杂交预选择。

cDNA克隆和中期染色体伸展的荧光原位杂交(FISK)可用于提供一个步骤的精确染色体定位。这些技术可与短至500或600个碱基的cDNA一起使用；然而，大于2,000bp的大克隆和具有用于简单检测的充足的信号强度的单一染色体位点具有更高的结合可能性。FISH需要使用衍生EST的克隆，克隆越长越好。例如，2,000bp良好，更好的是4,000，要达到合理的时间百分比的良好的结果，超过4,000有可能不必要。对于这种技术的综述，参见Verma等，人染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦序列对精确的染色体位点作图，染色体上的序列的物理位点可以与遗传图数据相关。这种数据在，例如，V.McKusick，人类的孟德尔遗传(可以联机通过Johns Hopkins大学Welch医学图书馆中得到)中找到。然后对相同的染色体区作图的基因和疾病之间的关系通过联接分析鉴别(物理邻近的基因的共遗传)。

接着，必须确定影响的和不受影响的个体之间cDNA和基因组序列的区别。如果在一些或所有受影响的个体中观察到突变但在任何正常的个体中没有观察到，突变就很有可能是疾病的病原体。

随着目前物理作图和基因组作图技术的解析，精确定位到与疾病有关的染色体区的cDNA可能是50至500个潜在的致病基因的一个(这需要1兆碱基图谱解析，每20kb一个基因)。

多肽、它们的片段或其它衍生物或类似物，或表达它们的细胞可用作免疫原产生抗体。这些抗体可以是，例如，多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合片段、单链和人源化抗体以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的各种方法可用于这种抗体和片段的产生。

产生抗与本发明的序列相应的多肽的抗体可通过直接把多肽注射进动物或对动物(优选地是非人类)施用多肽获得。然后这样获得的抗体和多肽自身结合。以这种方式，即使仅编码多肽片段的序列也可用于产生和整个天然多肽结合的抗体。然后可使用这种抗体从表达这种多肽的组织分离多肽。

对于单克隆抗体的制备，可以使用任何提供通过传代细胞系培养物产生的抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、trioma技术、人体B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，当今免疫学，4：72)以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss公司，77-96页)。

可使用描述来产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)以产生抗本发明的致免疫多肽产物的单链抗体。转基因小鼠也可用于表达抗本发明的致免疫多肽产物的人源化抗体。

本发明将还参考下列实施例描述；然而，可以理解，本发明不限于这种实施例。所有部分或量，除非特别指出，是指重量。

为了有利于理解下列的实施例，现描述某些常出现的方法和/或术语。

“质粒”通过小写p在大写字母之前和/或其后和/或数字指定。本文的起始质粒是市售的、基于非限制的基础公开可得到的或按照出版的方法从可得到的质粒构建。此外，和所述的质粒等价的质粒在本领域中是已知的，而且对普通技术人员是明显的。

DNA的“消化”指使用仅作用于DNA的某些序列的限制性酶催化裂解DNA。本文所使用的各种限制酶是市售的，所使用的反应条件、辅因子或其它需要对普通技术人员来说是已知的。为了分析，典型地使用1μg质粒或DNA片段和在20ml缓冲液中的大约2单位酶。要分离用于质粒构建的DNA片段，典型地用更大体积的20至250单位的酶消化5至50μg的DNA用于特定的限制酶的适当缓冲液和底物量由制造厂商指定。通常使用在37℃下大约1小时的温育时间，但是可按照供给者的指导变化。消化之后，反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需的片段。

按照Goeddel，D.等，核酸研究，8：4057(1980)所述使用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行所裂解的片段的大小分离。

“寡核苷酸”指可以化学合成的单链的聚脱氧核苷酸或两条互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成寡核苷酸没有5磷酸盐，这样不和另一个寡核苷酸连接(在激酶存在下不以ATP添加磷酸盐)。合成的寡核苷酸可与没有脱磷酸化的片段连接。

“连接”指在两条双链核酸片段之间磷酸二酯键形成过程(Maniatis，T.等，同上，146)。除非特别指出，连接可以使用已知的缓冲液和条件用每0.5μg要连接的DNA片段的大约等克分子量10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)完成。

当外源DNA导入细胞膜内部时，细胞就用这种外源DNA“转化”。外源DNA可以或可以不整合(共价连接)进染色体DNA内部，以形成细胞基因组。例如，原核细胞和酵母的外源DNA可以在游离成分(如质粒)上保持。对于真核细胞，稳定地转化或转染的细胞是这种细胞，其中外源DNA整合进染色体以便其通过子代细胞由染色体复制遗传。这种能力是通过真核细胞建立由包含外源DNA的子代细胞群体组成的细胞系或克隆的能力证明。转化的例子参见Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)。

“转导”或“转导的”指这样一种方法，通过这种方法细胞吸收外源DNA并把该外源DNA整合进其染色体。转导可以通过，例如转染(指各种技术，通过这些技术，细胞吸收DNA)或感染(通过其使用病毒把DNA转移进细胞)完成。

                       实施例1

                KGF-2的细菌表达和纯化编码KGF-2的DNA序列(ATCC#35977)最初使用对应于加工的KGF-2 cDNA(包括信号肽序列)的5和3末端序列的PCR寡核苷酸引物扩增。具有序列5CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC 3(SEQ ID No.3)的5寡核苷酸引物包含包括并接着从假定的起始密码子起始的30个核苷酸的KGF-2编码序列Afl III限制性酶位点。3序列5CCCAAGCTTCCACAAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3(SEQ ID No.4)包含和Hind III位点的互补序列，其后为26个核苷酸的KGF-2。限制酶位点与细菌表达载体pQE-60上的限制性酶位点是相容的(Qiagen公司，Chatsworth，CA)。pQE-60抗生素抗性(Amp)、细菌复制起点(ori)、IPTG-可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-His标记和限制性酶位点。然后用NcoI和BindIII消化pQE-60。把扩增的序列连接进pQE-60并符合读框地插入。然后通过Sambrook，J.等在分子扩增：试验室手册。冷泉港试验室出版社(1989)中描述的方法用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep(Qiagen公司)。M15/rep4包含表达lacI阻遏物并传递卡那霉素抗性(Kan)的质粒pREP4的多个拷贝。转化体通过其在LB平板上生长的能力鉴别，选择得到了抗氨苄青霉素/卡那霉素的菌落。分离质粒DNA并通过限制性分析确认。使包含所需的构建体的克隆在用Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)补充的LB培养基中的液体培养中生长过夜(O/N)。使用O/N培养物接种以1∶100至1∶250接种大培养物。细胞生长至光密度600(O.D.⁶⁰⁰)为0.4和0.6之间。然后添加IPTG(“异丙基-B-D-硫代乳吡喃糖苷”)至1mM的最终浓度。IPTG通过灭活lacI阻遏物、清除P/O导致提高的基因表达来诱导。细胞再生长3至4小时。然后通过离心收获细胞。把细胞沉淀溶解在离液剂6克分子的盐酸胍中。澄清之后，溶解的KGF-2通过肝素亲和柱色谱从该溶液中纯化，条件是使得蛋白质可以紧密地结合(Hochuli，B.等，色谱学杂志，411：177-184(1984))。KGF-2(纯度为75％)通过高盐缓冲液从柱中洗脱。

                     实施例2

            截短的KGF-2的细菌表达和纯化编码KGF-2的DNA序列(ATCC#75977)最初使用对应于截短的KGF-2多肽cDNA(包括信号肽序列)的5和3末端序列的PCR寡核苷酸引物扩增。截短的KGF-2包含减(minus)36个氨基酸信号序列的多肽，以及恰好添加在半胱氨酸残基之前的甲硫氨酸和丙氨酸残基，这种残基包括全长蛋白质的氨基酸37。具有序列5 CATGCCATGGCGTGCCAAGCCTTGGTCAGGACATG 3(SEQ ID No.5)的5寡核苷酸引物包含NcoI限制性酶位点，该位点包含并跟随KGF-2编码序列的24个核苷酸。3序列5 CCCAAGCTTCCACAAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3(SEQ ID No.6)包含和Hind III位点互补的序列，其后为KGF-2基因的26个核苷酸。限制酶位点与细菌表达载体pQE-60上的限制性酶位点是相容的(Qiagen公司，Chat sworth，CA)。pQE-60抗生素抗性(Amp)、细菌复制起点(ori)、IPTG-可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-His标记和限制性酶位点。然后用NcoI和BindIII消化pQE-60。把扩增的序列连接进pQE-60并符合读框地插入。然后通过Sambrook，J.等在分子扩增：试验室手册，冷泉港试验室出版社(1989)中描述的方法用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep(Qiagen公司)。M15/rep4包含表达lacI阻遏物并传递卡那霉素抗性(Kan)的质粒pREP4的多个拷贝。转化体通过其在LB平板上生长的能力鉴别，选择得到了抗氨苄青霉素/卡那霉素的菌落。分离质粒DNA并通过限制性分析确认。使包含所需的构建体的克隆在用Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)补充的LB培养基中的液体培养中生长过夜(O/N)。使用O/N培养物接种以1∶100至1∶250接种大培养物。细胞生长至光密度600(O.D.⁶⁰⁰)为0.4和0.6之间。然后添加IPTG(“异丙基-B-D-硫代乳吡喃糖苷”)至1mM的最终浓度。IPTG通过灭活lacI阻遏物、清除P/O导致提高的基因表达来诱导。细胞再生长3至4小时。然后通过离心收获细胞。把细胞沉淀溶解在离液剂6克分子的盐酸胍中。澄清之后，溶解的KGF-2通过肝素亲和柱色谱从该溶液中纯化，条件是使得蛋白质可以紧密地结合(Hochuli，B.等，色谱学杂志，411：177-184(1984))。KGF-2(纯度为75％)通过高盐缓冲液从柱中洗脱。

                          实施例3

            使用杆状病毒表达系统克隆并表达KGF-2

使用对应于基因的5和3序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码全长KGF-2蛋白质的DNA序列(ATCC#75977)。5引物具有序列5GCGGGATCCGCCATC ATGTGGAAATGGATACTCAC 3(SEQ ID No.7)并包含在装配真核细胞翻译起始的有效的信号的6个核苷酸后的BamHI限制性酶位点(粗体)(Kozak，M.，分子生物学杂志，196：947-950(1987)，同时恰好在KGF-2基因的前17个核苷酸后(翻译起始密码子“ATG”有下划线)。3引物具有序列5 GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT(SEQ ID No.8)并包含与KGF-2基因的3-非翻译序列互补的限制性内切核酸酶Asp718和19的裂解位点。扩增的序列使用Qiagen公司，Chatsrorth，CA市售的试剂盒从1％琼脂糖凝胶中分离。然后片段以内切核酸酶BamHI和Asp718消化，然后再在1％琼脂糖凝胶中纯化，该片段定名为F2。

使用杆状病毒表达系统(参见综述：Summers，M.P.和Smith，G.E.，1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养步骤方法手册，Texas农业试验站公报1555号)使载体pA2(pVL941载体的改良，讨论如下)用于表达KGF-2蛋白质。该表达载体包含在限制性内切核酸酶BamHI和Asp718的识别位点之后的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的强多面形启动子；猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了易于选择重组病毒，把大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因以和多面体启动子相同的方向插入，其后为多面体基因的聚腺苷酸化信号。多面体序列的两侧是用于共转染的野生型病毒DNA的细胞介导的同源重组的病毒序列。许多其它的杆状病毒载体可用于替代pRG1，如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，病毒学，170：31-39)。

以限制酶BamHI和Asp718消化质粒。然后使用市售的试剂盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)从1％的琼脂糖凝胶分离DNA。该载体DNA定名为V2。

用T4 DNA连接酶连接片段F2和质粒V2。然后转化大肠杆菌HB101细胞，使用两种克隆寡核苷酸的PCR鉴别包含携带KGF-2基因的质粒(pBacKGF-2)。克隆片段的序列通过DNA测序确认。

使用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报。84：7413-7417(1987))用1.0μg的市售的线形化的杆状病毒(“BaculoGold杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diega，CA.)共转染5μg的质粒pBacKGF-2。

把1μg的BaculoGold病毒DNA和5μg的质粒pBacKGF-2在无菌的微滴定板的孔中。包含50μl的无血清Graces培养基(Life Technologies公司，Gaithers-burg，MD)。之后添加10μl的Grace培养基加50μl的脂转染试剂，混合并在室温下温育15分钟。然后把转染混合物滴加至在含有无血清的1ml Graces培养基的35mm组织培养平板中的Sf9昆虫细胞中(ATCC CRL 1711)。平板来回振荡以混合新加入的溶液。然后平板在27℃下培养5小时。5小时之后，从平板中除去转染溶液，添加用10％胎牛血清予以补加的1ml的Graces昆虫培养基。把平板放回恒温箱中，培养保持在27℃下4天。

在4天后，收集上清液，进行类似于Summers和Smith(同上)所述的噬斑测定。改进之处是使用带有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)以使得可以分离染蓝的噬斑(“噬斑测定”的详尽描述可在由Life Technologies公司，Gaithersburg发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学的用户指南第9-10页中找到)。

系列稀释4天之后，把病毒添加到细胞中，以Eppepdorf吸管尖端挑出染蓝的噬斑。然后把包含重组病毒的琼脂重新悬浮在包含200μl的Graces培养基的Bppendorf试管中。通过短时间的离心除去琼脂，使用包含重组杆状病毒的上清液感染在35mm盘中的Sf9细胞。4天后收获这些培养盘的上清液，然后在4℃下保存。

在用10％的热灭活的FB补加的Graces培养基中培养Sf9细胞。以感染复数(MOI)为2用重组杆状病毒V-KGF-2感染细胞。6小时后除去培养基并以SF900减甲硫氨酸和半胱氨酸(Life Technologies公司，Gaithersburg)代替；42小时后添加5μCi的³⁵S-半胱氨酸(Amersbam)。细胞还培养16小时，然后通过离心收获，标记的蛋白质通过SDS-PAGE和放射自显影可视化。

                         实施例4

               重组KGF-2在COS细胞中的表达

质粒KGF-2 HA的表达源自载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，该载体包含：1)SV40的复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，其后为多接头区，SV40内含子和聚腺苷酸化位点。把编码全KGF-2前体和符合读框地融合到其3端的HA标记的DNA片段克隆进载体的多接头区，因此，重组蛋白质表达受CMV启动子的指导。对应于表位的HA标记如上所述得自流感血细胞凝集素蛋白质(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Cannolly和R.Lerner，1984，细胞，37：767，(1984))。HA标记融合到靶蛋白质使得易于用识别HA表位的抗体检测重组蛋白质。

质粒构建策略描述如下：

通过PCR使用两种引物构建编码KGF-2，ATCC#75977的DNA序列：5引物5 CCCAAGCTTATGTGGAAAGGATACTGACACATTGTGCC 3(SEQ ID No.9)包含HindIII位点，其后为从起始密码子开始的30个核苷酸的KGF-2编码序列；3序列5 TGCTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGG(SEQ ID No.10)包含和XbaI位点、翻译终止密码子、HA标记和编码KGF-2序列的最后的32个核苷酸(不包括终止密码子)互补的序列。因此，PCR产物包含HindIII位点、KGF-2编码序列(其后为符合读框地融合的HA标记)、紧接着HA标记的翻译终止密码子以及XbaI位点。用BindIII和XbaI限制酶消化并连接PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp。把连接混合物转化进大肠杆菌菌株XL1 Blue(Stratagene克隆系统，LaJolla，CA)。转化的培养物平板接种于氨苄青霉素培养基平板上并选择抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA并通过PCR和限制性分析检测正确片段的存在。要表达重组KGP-2，使用DEAE-DEXTRAN方法(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆：试验室手册，冷泉港试验室出版社，(1989))用表达载体转染COS细胞。用放射性标记和免疫沉淀方法检测(E.Harlow，D.Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，(1988))KGF-2HA蛋白质。转染2天后，细胞以³⁵S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基，细胞以去垢剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，同上，37：767(1984))水解。细胞水解物和培养基都用HA特异性单克隆抗体沉淀。沉淀的蛋白质沉淀在15％SDS-PAGE凝胶上分析。

                       实施例5

              重组KGF-2在体外的转录和翻译

得自在pA2载体中的克隆的cDNA的PCR产物用于KGF-2的昆虫细胞表达。用于这种PCR的引物是：5 ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3(SEQ IDNo.11)和5 CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3(SEQ ID No.12)。

第一个引物包含T3启动子5至ATG起始密码子的序列；第二个引物和KGF-2的开放读框互补并编码终止密码子的反向互补序列。

形成的PCR产物使用购自Qiagen的试剂盒纯化。0.5μg的这种DNA可用作体外转录翻译反应的模板。反应以TNT的名义使用从Promega购买的试剂盒进行。除了仅使用试剂指定体积的1/2并使反应在33℃下进行1.5小时之外，测定使用放射性标记的甲硫氨酸作为底物如试剂盒的说明中描述的进行。

在变性处理的10至15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离5μl的反应物。凝胶以水∶甲醇∶醋酸(分别以6∶3∶1的体积)的混合物固定30分钟。然后凝胶在高温和真空中干燥，其后对X-射线底片曝光16小时。显影胶卷显示在大小上对应于概念上的翻译的KGF-2的放射性蛋白质带的存在，这有力地表明：KGP-2的克隆的cDNA包含编码预期大小蛋白质的开放读框。

按照以上教导，本发明许多的改良和变化是可能的，因此，在所附的权利要求的范围内(而不是按具体描述)可以实施本发明。

                        序列表(1)一般信息：(i)申请人：GRUBER等(ii)发明名称：角质形成细胞生长因子-2(iii)序列数：12(iv)通讯地址：

  (A)通讯人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCI，STEWERT

             和OLSTEIN

  (B)街道：6 BECKER FARM路

  (C)城市：ROSELAND

  (D)州：新泽西州

  (E)国家：美国

  (F)邮区代码：07068(v)计算机可读形式：

  (A)介质类型：3.5英寸软盘

  (B)计算机：IBM PS/2

  (C)操作系统：MS-DOS

  (D)软件：WORD PERFECT版本#5.1(vi)当前申请的数据：

  (A)申请号：

  (B)申请日：

  (C)分类号：(vii)在先申请的数据：

  (A)申请号：

  (B)申请日：(viii)律师/代理人信息：

  (A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

  (B)登记号：36,134

  (C)证书/档案号：325800-261  (ix)电信信息：

  (A)电话：201-994-1700

  (B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征

  (A)长度：627个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGTGGAAAT GGATACTGAC ACATTGTGCC TCAGCCTTTC CCCACCTGCC CGGCTGCTGC   60TGCTGCTGCT TTTTGTTGCT GTTCTTGGTG TCTTCCGTCC CTGTCACCTG CCAAGCCCTT  120GGTCAGGACA TGGTGTCACC AGAGGCCACC AACTCTTCTT CCTCCTCCTT CTCCTCTCCT  180TCCAGCGCGG GAAGGCATGT GCGGAGCTAC AATCACCTTC AAGGAGATGT CCGCTGGAGA  240AAGCTATTCT CTTTCACCAA GTACTTTCTC AAGATTGAGA AGAACGGGAA GGTCAGCGGG  300ACCAAGAAGG AGAACTGCCC GTACAGCATC CTGGAGATAA CATCAGTAGA AATCGGAGTT  360GTTGCCGTCA AAGCCATTAA CAGCAACTGT TACTTAGCCA TGAACAAGAA GGGGAAACTC  420TATGGCTCAA AAGAATTTAA CAATGACTGT AAGCTGAAGG AGAGGATAGA GGAAAATGGA  480TACAATACCT ATGCATCATT TAACTGGCAG CATAATGGGA GGCAAATGTA TGTGGCATTG  540AATGGAAAAG GAGCTCCAAG GAGAGGACAG AAAACACGAA GGAAAAACAC CTCTGCTCAC  600TTTCTTCCAA TGGTGGTACA CTCATAG                                      627(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征

  (A)长度：208个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：

  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His

-35                 -30                 -25Leu Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val

-20                 -15                 -10Ser Ser Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val

-5                    1               5Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro10                  15                  20Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly25                  30                  35Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu40                  45                  50Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn55                  60                  65Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val70                  75                  80Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn85                  90                  95Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys100                 105                 110Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala115                 120                 125Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu130                 135                 140Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys145                 150                 155Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser160                 165                 170(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征

  (A)长度：36个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CCCCACATGT GGAAATGGAT ACTGACACAT TGTGCC                 36(2)SEQ ID NO：4的信息：  (i)序列特征

  (A)长度：35个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

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  (A)长度：36个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CATGCCATGG CGTGCCAAGC CCTTGGTCAG GACATG                        36(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征

  (A)长度：35个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CCCAAGCTTC CACAAACGTT GCCTTCCTCT ATGAG                         35(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征

  (A)长度：35个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型；单链

  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

  GCGGGATCCG CCATCATGTG GAAATGGATA CTCAC                     35(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CGCGGTACCA CAAACGTTGC CTTCCT                                   26(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CCCAAGCTTA TGTGGAAATG GATACTGACA CATTGTGCC                     39(2)SEQID NO：10的信息：(i)序列特征

(A)长度：69个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：TGCTCTAGAC TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTATGAGTGTACCA CCATTGGAAG AAAGTGAGG                           69(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征

(A)长度：54个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：ATTAACCCTC ACTAAAGGGA GGCCATGTGG AAATGGATACTGACACATTG TGCC                                          54(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征

  (A)长度：35个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CCCAAGCTTC CACAAACGTT GCCTTCCTCT ATGAG                  35

Claims (25)

1.一种选自由下列物质组成的组的分离的多核苷酸：

(a)一种编码具有推定的SEQ ID No.2的氨基酸序列的多肽或所说多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；

(b)一种编码具有由包含在ATCC保藏号75977中的cDNA编码之氨基酸序列的多肽或所说多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；

2.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA。

3.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。

4.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是基因组DNA。

5.权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码具有推定的SEQ IDNo.2的氨基酸序列的多肽。

6.权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由包含在ATCC保藏号75977的cDNA编码的多肽。

7.权利要求1的多核苷酸，该多核苷酸具有在SEQ ID No.1中所示的编码序列。

8.权利要求2的多核苷酸，该多核苷酸具有按照ATCC保藏号75973保藏的多肽的编码序列。

9.一种包含权利要求2的DNA的载体。

10.一种用权利要求9的载体经遗传工程产生的宿主细胞。

11.一种用于产生多肽的方法，该方法包括从权利要求10的宿主细胞表达由所说的DNA编码的多肽。

12.一种产生可以表达多肽的细胞的方法，该方法包括用权利要求9的载体经遗传工程产生细胞。

13.一种可与权利要求2的DNA杂交并编码具有KGF-2活性的多肽的分离的DNA。

14.一种选自由下列物质组成的组的多肽：(i)一种具有推定的SEQ IDNo.2的氨基酸序列的多肽及其片段、类似物或衍生物；(ii)一种由包含在ATCC保藏号75977的cDNA编码的多肽以及所说多肽的片段、类似物或衍生物。

15.权利要求14的多肽，其中所说多肽是具有推定的SEQ ID No.2的氨基酸序列的KGF-2。

16.一种抗权利要求14的多肽的抗体。

17.一种作为权利要求14的多肽的激动剂有效的化合物。

18.一种作为抗权利要求14的多肽的拮抗剂有效的化合物。

19.一种治疗需要KGF-2的患者的方法，该方法包括：给患者施用治疗有效量的权利要求14的多肽。

20.一种治疗需要KGF-2的患者的方法，该方法包括：给患者施用治疗有效量的权利要求18的化合物。

21.权利要求19的方法，其中所说的治疗有效量的多肽通过给患者提供编码所说多肽的DNA和体内表达所说多肽来施用。

22.一种鉴别作为KGF-2激动剂有活性的化合物的方法，该方法包括：

(a)将待筛选的化合物与包含在细胞通常受KGF-2刺激的条件下之细胞的反应混合物组合，所说的反应混合物包含在细胞增殖时掺入细胞的标记；

(b)确定细胞增殖的程度以鉴别所说化合物是否是有效的激动剂。

23.权利要求22的鉴别作为KGF-2拮抗剂有活性的化合物的方法，其中把KGF-2添加到步骤(a)的组合体中。

24.一种诊断与权利要求14的多肽不足表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：

从得自宿主的样品分离编码所说多肽的核酸序列；

确定在编码所说多肽的核酸序列中的突变。

25.一种包括以下步骤的诊断方法：

在得自宿主的样品中分析权利要求14的多肽的存在。

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