DE69630710T2

DE69630710T2 - Humaner tumornekrosefaktor delta und epsilon

Info

Publication number: DE69630710T2
Application number: DE69630710T
Authority: DE
Inventors: Jian Ni; Guo-Liang Yu; L. Reiner GENTZ; Patrick J. Dillon
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: EP0897390A1; CA2247285A1; EP0897390A4; DK0897390T3; PT897390E; EP1362916A2; AU5366596A; ES2210354T3; EP0897390B1; EP1362916A3; JP2001501453A; WO1997033902A1; CA2247285C; AU726486C; AU726486B2; DE69630710D1; ATE254135T1; CN1214050A

Description

Diese Erfindung betrifft zum Teil neu identifizierte Polynucleotide und Polypeptide; Varianten und Derivate der Polynucleotide und Polypeptide; Verfahren zur Herstellung der Polynucleotide und Polypeptide und ihrer Varianten und Derivate; Agonisten und Antagonisten der Polypeptide; und Verwendungen der Polynucleotide, Polypeptide, Varianten, Derivate, Agonisten und Antagonisten. Im Besonderen betrifft die Erfindung in diesen und in anderen Sichtweisen Polynucleotide und Polypeptide des humanen Tumornekrosefaktor delta und epsilon, manchmal hierin nachfolgend als "TNF delta" und "TNF epsilon" bezeichnet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Menschlicher Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und β (TNF-β oder Lymphotoxin) sind verwandte Mitglieder einer ausgedehnten Klasse von Polypeptid-Mediatoren, die die Interferone, Interleukine und Wachstumsfaktoren beinhalten, die gemeinsam als Zytokine bezeichnet werden (Beutler, B. and Cerami, A., Annu. Rev. Immunol., 7: 625–655, 1989).
Der Tumornekrosefaktor (TNF-α und TNF-β) wurde ursprünglich aufgrund seiner Antitumor-Aktivität entdeckt, wird jedoch jetzt als ein pleiotropes Zytokin angesehen, das zu zahlreichen biologischen Aktivitäten in der Lage ist, einschließlich Apoptose einiger transformierter Zelllinien, die Vermittlung von Zell-Aktivierung und Proliferation und spielt auch wichtige Rollen bei der Immunregulation und Entzündung.
Bis heute sind neun Mitglieder der TNF-Liganden-Superfamilie bekannt, TNF-α, TNF-β (Lymphotoxin-α), LT-β, OX40L, FASL, CD30L, CD27L, CD40L und 4-1BBL. Die Liganden der TNF-Liganden-Superfamilie sind säurehaltige TNF-ähnliche Moleküle mit ungefähr 20% Sequenz-Homologie (im Bereich von 12% bis 36%) in den extrazellulären Domänen und treten hauptsächlich als membrangebundene Formen auf, wobei die biologisch aktive Form ein trimerer/multimerer Komplex ist. Lösliche Formen der TNF-Liganden-Superfamilie sind bis heute ausschließlich für TNF, LT-α und FASL identifiziert worden (als einen allgemeinen Übersichtartikel siehe Gruss, H. and Dower, S. K., Blood, 85 (12): 3378–3404 (1995)), der hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit enthalten ist. ESTs sind von Seed in EP-A1 330 191 (EST N 90606) und von Adams, Nature 355: 632–634 (EST M 78230) berichtet worden. Zusätzlich wurde ein genomisches DNA-Fragment mit der Hinterlegungs-Nr. Z 60180 oder Z 60980 hinterlegt.
Diese Proteine sind bei der Regulation von Zell-Proliferation, Aktivierung und Differenzierung beteiligt, einschließlich der Kontrolle des Zell-Überlebens oder Todes durch Apoptose oder Zytotoxizität (Armitage, R. J., Curr. Opin. Immunol., 6: 407 (1994) und Smith, C. A. Cell, 75: 959, 1994).
TNF wird von einer Vielzahl von Zelltypen hergestellt, einschließlich Monozyten, Fibroblasten, T-Zellen, natürliche Killer (NK)-Zellen und überwiegend von aktivierten Makrophagen. Es wurde berichtet, dass TNF-α bei der schnellen Nekrose von Tumoren, bei der Immunstimulation, bei der Autoimmun-Erkrankung, der Transplantat-Abstoßung, der Resistenz gegen Parasiten, bei der Bereitstellung einer antiviralen Antwort, beim septischen Schock, bei der Wachstumsregulation, bei Effekten des Gefäßendothels und bei metabolischen Effekten eine Rolle spielt. TNF-α ist auch der Auslöser dafür, dass Endothelzellen verschiedene Faktoren sekretieren, einschließlich PAF-1, IL-1, GM-CSF und IL-6, um Zellproliferation zu verstärken. Zusätzlich reguliert TNF-α verschiedene Zell-Adhäsionsmoleküle hoch, wie E-Selectin, ICAM-1 und VCAM-1.
Der erste Schritt bei der Induktion verschiedener zellulärer Antworten, die durch die Mitglieder der TNF-Liganden-Superfamilie vermittelt werden, ist deren Bindung an spezifische Zelloberflächen-Rezeptoren. Die TNF-Rezeptor-Superfamilie beinhaltet derzeit 10 bekannte Membranproteine und einige virale offene Leserahmen, die TNFR-verwandte Moleküle codieren. Der p75 niedrig affine Nerven-Wachstumsfaktor (nerve growth factor; (NG)F-Rezeptor) war der erste clonierte Rezeptor dieser Familie (Johnson, D. et al., Cell, 47: 545 (1986)). Darauf folgend zeigt die Clonierung von zwei spezifischen Rezeptoren für TNF, dass sie mit dem NGF-Rezeptor verwandt sind (Loetscher, H. et al., Cell, 61: 351 (1990)). In den vergangenen Jahren wurde eine neue Typ I-Transmembran-TNF-Rezeptor-Superfamilie festgestellt. Diese Familie beinhaltet den p75 Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor, p60 TNFR-I, p80 TNFR-II, TNFR-RP/TNFR-III, CD27, CD30, CD40, 4-1BW, OX40 und FAS/APO-1. Zusätzlich sind einige virale offene Leserahmen identifiziert worden, die lösliche TNF-Rezeptoren codieren, wie SFV-T2 im Shope-Fibrom-Virus (Smith, C. A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 335, 1991) und Va53 oder SaIF19R im Vaccinia-Virus (Howard, S. T., Virology, 180: 633, 1991). Diese Rezeptoren sind durch multiple cysteinreiche Domänen in der extrazellulären (aminoterminalen) Domäne charakterisiert, von denen gezeigt wurde, dass sie an der Ligandenbindung beteiligt sind. Die durchschnittliche Homologie zwischen den Familienmitgliedern in der cysteinreichen extrazellulären Region liegt im Bereich von 25– 30%.
Es gibt ganz klar einen Bedarf für Faktoren, die die Aktivierung und Differenzierung von normalen und abnormalen Zellen regulieren. Es gibt deshalb einen Bedarf dafür, solche Faktoren zu identifizieren und zu charakterisieren, die die Aktivierung und Differenzierung von Zellen modulieren, sowohl normalerweise als auch in Stadien der Erkrankung. Im Besonderen gibt es einen Bedarf zusätzliche TNF-Liganden zu isolieren und zu charakterisieren, die mit der TNF-Liganden-Superfamilie verwandt sind, die die Apoptose von transformierten Zelllinien kontrollieren, Zell-Aktivierung und Proliferation vermitteln und die als primäre Mediatoren von Immunregulation und Entzündungsantwort funktionell miteinander verknüpft sind und, unter anderem, bei der Verhinderung, Verbesserung oder der Korrektur von Fehlfunktionen oder Erkrankungen eine Rolle spielen können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Für diese und andere Zwecke ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung neue Peptide bereitzustellen, die als ein neues TNF-delta und TNF-epsilon bezeichnet werden, die aufgrund von Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen, die in den 1 und 2 dargelegt sind und bekannten Aminosäuresequenzen von anderen Proteinen aus der Tumornekrosefaktor-Familie, wie humaner TNF-α und TNF-β, als vermeintliche Tumornekrosefaktor-Liganden identifiziert worden sind.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide wurden auf der Grundlage von strukturellen und biologischen Ähnlichkeiten als neue Mitglieder der TNF-Liganden-Superfamilie identifiziert.
Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, darüber hinaus Polynucleotide bereitzustellen, die TNF-delta und TNF-epsilon codieren, insbesondere Polynucleotide, die diejenigen Polypeptide codieren, die hierin als TNF-delta und TNF-epsilon bezeichnet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfassen die Polynucleotide den Bereich, der humanen TNF-delta und TNF-epsilon in den Sequenzen codiert, die in den 1 und 2 dargelegt sind.
In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung werden isolierte Nucleinsäure-Moleküle bereitgestellt, die menschlichen TNF-delta codieren, einschließlich mRNAs, cDNAs, genomische DNAs und in weiteren Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Aspekts, biologisch, diagnostisch, klinisch oder therapeutisch zweckmäßige Varianten, Analoge oder Derivate davon, oder Fragmente davon, einschließlich Fragmente der Varianten, Analoge und Derivate.
Unter den besonders bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung sind naturgemäß auftretende allelische Varianten von humanem TNF-delta und TNF-epsilon enthalten.
In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäure-Moleküle bereitgestellt, die ein reifes menschlicher TNF-delta-Polypeptid codieren, das von der menschlichen cDNA exprimiert wird, die in der ATCC-Hinterlegung-Nr. 97377 enthalten ist, die am 8. Dezember 1995 hinterlegt wurde, und ein reifes menschlicher TNF-epsilon-Polypeptid, das von der menschlichen cDNA exprimiert wird, die in der ATCC-Hinterlegung-Nr. 97457 enthalten ist, die am 1. März 1996 hinterlegt wurde.
Es ist ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung TNF-delta-Polypeptide bereitzustellen, im Besonderen humaner TNF-delta und TNF-epsilon-Polypeptide, die einige transformierte Zelllinien vernichten, Zell-Aktivierung und Proliferation vermitteln und die als primäre Mediatoren von Immunregulation und inflammatorischer Antwort funktionell gekoppelt sind.
In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung werden neue Polypeptide menschlichen Ursprungs bereitgestellt, die hierin als TNF-delta und TNF-epsilon bezeichnet werden, sowie biologisch, diagnostisch oder therapeutisch zweckmäßige Fragmente, Varianten und Derivate davon, Varianten und Derivate der Fragmente und Analoge des Vorangehenden.
Unter den besonders bevorzugten Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Aspekts sind Varianten von humanem TNF-delta und TNF-epsilon, die durch naturgemäß auftretende Allele des humanen TNF-delta- und TNF-epsilon-Gens codiert werden.
Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten Polypeptide, Polypeptid-Fragmente, Varianten und Derivate, Fragmente der Varianten und Derivate und Analoge des Vorangehenden bereitzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspektes werden Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptide bereitgestellt, die die Züchtung von Wirtszellen umfassen, die in sich ein exogenabstammendes menschlichen TNF-delta-codierendes Polynucleotid und TNF-epsilon-codierendes Polynucleotid exprimierbar inkorporiert haben, wobei Bedingungen zur Expression von humanem TNF-delta und TNF-epsilon im Wirt vorliegen und dann die Gewinnung der exprimierten Polypeptide.
In Übereinstimmung mit einem anderen Gegenstand der Erfindung werden Produkte, Verbindungen, Prozesse und Verfahren bereitgestellt, die die oben erwähnten Polypeptide und Polynucleotide für Forschung, biologische, klinische und therapeutische Zwecke, unter anderem verwenden.
In Übereinstimmung mit bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Aspekts werden unter anderem Produkte, Verbindungen und Verfahren bereitgestellt für, unter anderem: die Bewertung der TNF-delta- und TNF-epsilon-Expression in Zellen durch Bestimmung von TNF-delta und TNF-epsilon Polypeptiden oder TNF-delta-codierender mRNA oder TNF-epsilon-codierender mRNA; Testen von genetischer Variation und von Anomalien, wie Defekte in TNF- delta- und TNF-epsilon-Genen; und die Verabreichung eines TNF-delta- oder TNF-epsilon-Polypeptids oder Polynucleotids an einen Organismus, um die TNF-delta- oder TNF-epsilon-Funktion zu steigern oder TNF-delta- oder TNF-epsilon-Fehlfunktion wiederherzustellen.
In Übereinstimmung mit einzelnen bevorzugten Ausführungsformen dieses und anderer Aspekte der Erfindung werden Polynucleotide bereitgestellt und im Besonderen Sonden, die mit humanen TNF-delta- oder TNF-epsilon-Sequenzen hybridisieren.
In bestimmten zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Aspektes werden Antikörper gegen TNF-delta- oder TNF-epsilon-Polypeptide bereitgestellt. In bestimmten, besonders bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht, sind die Antikörper hochgradig selektiv für humanen TNF-delta oder TNF-epsilon.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden TNF-delta- oder TNF-epsilon-Agonisten bereitgestellt. Unter bevorzugten Agonisten sind Moleküle, die TNF-delta oder TNF-epsilon nachahmen, die an TNF-delta-bindende Moleküle oder -Rezeptor-Moleküle oder an TNF-epsilon-bindende Moleküle oder -Rezeptor-Moleküle binden und die TNF-delta-induzierte oder TNF-epsilon-induzierte Antworten auslösen oder verstärken. Ebenfalls zu den bevorzugten Agonisten gehören Moleküle, die mit TNF-delta- und TNF-epsilon- oder TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptiden interagieren oder mit anderen Modulatoren von TNF-delta-Aktivitäten und dabei eine Wirkung von TNF-delta und TNF-epsilon oder mehr als eine Wirkung von TNF-delta und TNF-epsilon vervielfältigen oder steigern.
In Übereinstimmung mit noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden TNF-delta- und TNF-epsilon-Antagonisten bereitgestellt. Zu den bevorzugten Antagonisten gehören diejenigen, die TNF-delta und TNF-epsilon nachahmen, derart dass sie an TNF-delta- und TNF-epsilon-Rezeptoren oder bindende Moleküle binden, aber keine TNF-delta- und TNF-epsilon-induzierte Antwort oder mehr als eine TNF-delta- und TNF-epsilon-induzierte Antwort auslösen. Ebenfalls zu den bevorzugten Antagonisten gehören Moleküle, die TNF-delta und TNF-epsilon binden oder damit interagieren, um eine Wirkung von TNF-delta und TNF-epsilon oder mehr als eine Wirkung von TNF-delta und TNF-epsilon zu inhibieren oder solche, die die Expression von TNF-delta und TNF-epsilon verhindern.
Die Agonisten und Antagonisten können verwendet werden, um die Wirkung von TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptiden nachzuahmen, zu verstärken oder zu inhibieren. Sie können zum Beispiel verwendet werden, um septischen Schock, Entzündung, zerebrale Malaria, Aktivierung des HIV-Virus, Transplantat-Wirt-Abstoßung, Knochenresorption, rheumatoide Arthritis und Cachexie (Abmagerung) zu verhindern.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein TNF-delta- und TNF-epsilon-Polynucleotid oder ein TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptid umfassen, zur Verabreichung an Zellen in vitro, an Zellen ex vivo und an Zellen in vivo oder an einen multizellulären Organismus. In bestimmten besonders bevorzugten Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Aspektes umfassen diese Zusammensetzungen ein TNF-delta- und TNF-epsilon-Polynucleotid zur Expression eines TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptids in einem Wirtsorganismus zur Behandlung von Krankheit. Besonders bevorzugt ist in dieser Hinsicht die Expression in einem menschlichen Patienten zur Behandlung einer Funktionsstörung, die mit einer anormalen endogenen Aktivität von TNF-delta und TNF-epsilon assoziiert ist.
Andere Gegenstände, Merkmale, Vorteile und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann anhand der nachfolgenden Beschreibung offensichtlich sein. Die nachfolgende Beschreibung und die spezifischen Beispiele sollten jedoch so verstanden werden, dass diese, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, ausschließlich zum Zweck der Veranschaulichung dienen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die nachfolgenden Zeichnungen beschreiben bestimmte Ausführungsformen der Erfindung. Sie dienen nur der Veranschaulichung und schränken die Erfindung, wie sie hierin offenbart ist, ansonsten nicht ein.
1 zeigt die Nucleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem TNF-delta.
2 zeigt die Nucleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem TNF-epsilon.
3 zeigt die Bereiche von Ähnlichkeit (Abgleich-Bericht) zwischen Aminosäuresequenzen von TNF-α-, TNF-β-, TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptiden.
4 zeigt strukturelle und funktionelle Merkmale von TNF-delta, wie sie durch die angegebenen Verfahren abgeleitet wurden, als eine Funktion der Aminosäuresequenz.
5 zeigt strukturelle und funktionelle Merkmale von TNF-epsilon, wie sie durch die angegebenen Verfahren abgeleitet wurden, als eine Funktion der Aminosäuresequenz.
Die nachfolgenden veranschaulichenden Erklärungen werden bereitgestellt, um das Verständnis von bestimmten Begriffen zu erleichtern, die hierin häufig verwendet werden, besonders in den Beispielen. Die Erklärungen werden als eine Dienlichkeit bereitgestellt und schränken die Erfindung nicht ein.
Der Begriff "Spaltung" von DNA betrifft die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das ausschließlich an bestimmten Sequenzen innerhalb der DNA wirkt. Die verschiedenen Restriktionsenzyme, die hierin bezeichnet sind, sind kommerziell erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und andere Erfordernisse für deren Verwendung sind bekannt und gehören zur Routine der Fachleute.
Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Reaktionspuffer gespalten. Zum Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Erzeugung eines Plasmids werden typischerweise 5–50 μg DNA mit 20–250 Einheiten Enzym in entsprechend größerem Volumen gespalten.
Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind in Standard-Labor-Handbüchern, wie denjenigen beschrieben, die nachfolgend bezeichnet sind und sind durch die kommerziellen Anbieter spezifiziert.
Gewöhnlich werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C verwendet, die Bedingungen können aber in Übereinstimmung mit Standard-Verfahren, den Anleitungen der Anbieter und den Einzelheiten der Reaktion variieren. Nach der Spaltung können die Reaktionen mit Hilfe von Elektrophorese durch ein Agarose- oder Polyacrylamid-Gel analysiert werden und Fragmente aufgereinigt werden, indem gut bekannte Verfahren verwendet werden, die für die Fachleute zur Routine gehören.
Der Begriff "genetisches Element" bedeutet im Allgemeinen ein Polynucleotid, das eine Region umfasst, die ein Polypeptid codiert oder eine Region, die Transkription oder Translation oder andere Prozesse reguliert, die für die Expression des Polypeptids in einer Wirtszelle wichtig sind oder ein Polypeptid, das sowohl eine Region umfasst, die ein Polypeptid codiert, als auch eine Region, die funktionell damit verknüpft ist, die die Expression reguliert.
Genetische Elemente können innerhalb eines Vektors umfasst sein, der als ein episomales Element repliziert; das bedeutet als ein Molekül, das physikalisch vom Wirtszell-Genom unabhängig ist. Sie können innerhalb eines Minichromosoms umfasst sein, wie diejenigen, die während der Amplifikation von transfizierter DNA durch Methotrexat-Selektion in eukaryontischen Zellen entstehen. Genetische Elemente können auch innerhalb eines Wirtszell-Genoms umfasst sein; nicht in ihrem natürlichen Stadium, sondern vielmehr nach einer Manipulation wie Isolierung, Clonierung und Einbringen in eine Wirtszelle in Form von gereinigter DNA oder in einem Vektor, unter anderem.
Der Begriff "isoliert" bedeutet verändert "mit jemandes Hilfe" bezüglich des natürlichen Stadiums; d. h., falls ein natürliches Auftreten vorliegt, wurde dieses verändert oder aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt oder beides. Ein natürlicherweise vorkommendes Polypeptid zum Beispiel oder ein Polypeptid, das natürlicherweise in einem lebenden Tier in seinem natürlichen Stadium vorliegt, ist nicht "isoliert", das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid aber, das von den coexistierenden Materialien seines natürlichen Stadiums abgetrennt wurde, ist "isoliert", wie der Begriff hierin verwendet wird. Im Hinblick auf Polynucleotide zum Beispiel bedeutet der Begriff isoliert, dass dieses von dem Chromosom und der Zelle abgetrennt wurde, in dem (der) es natürlicherweise vorkommt.
Als Teil der Isolierung oder nachfolgend können solche Polynucleotide mit anderen Polynucleotiden zum Beispiel für Mutagenese, um Fusionsproteine zu bilden und zur Vermehrung oder zur Expression in einem Wirt, verknüpft werden. Die isolierten Polynucleotide, alleine oder verknüpft mit andere Polynucleotiden, wie Vektoren, können in Wirtszellen eingebracht werden, in Kultur oder im gesamten Oganismus, wonach solche DNAs immer noch als isoliert bezeichnet werden würden, in dem Sinne, wie der Begriff hierin verwendet wird, weil sie nicht in ihrer natürlicherweise vorkommenden Form oder Umgebung vorliegen würden.
In ähnlicher Weise können die Polynucleotide und Polypeptide in einer Zusammensetzung auftreten, sowie als Medien-Formulierungen, Lösungen zum Einbringen von Polynucleotiden oder Polypeptiden, zum Beispiel in Zellen, Zusammensetzungen oder Lösungen für chemische oder enzymatische Reaktionen, zum Beispiel solche, bei denen es sich um nicht natürlicherweise auftretende Zusammensetzungen handelt und verbleiben darin isolierte Polynucleotide oder Polypeptide im Rahmen der Bedeutung dieses Begriffes, wie er hierin verwendet wird.
Der Begriff "Ligierung" betrifft das Verfahren zur Erzeugung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei oder mehreren Polynucleotiden, wobei es sich am häufigsten um doppelsträngige DNAs handelt. Verfahren zur Ligierung sind im Stand der Technik gut bekannt und Protokolle zur Ligierung sind in Standard-Labor-Handbüchern und Bezugnahmen, wie zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausg.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) und Maniatis et al., S. 146, wie nachfolgend zitiert, beschrieben.
Der Begriff "Oligonucleotid(e)" bezeichnet relativ kurze Polynucleotide. Häufig bezeichnet der Begriff einzelsträngige Desoxyribonucleotide, aber er kann ebenfalls einzel- oder doppelsträngige Ribonucleotide, RNA:DNA-Hybride und doppelsträngige DNAs, unter anderem, bezeichnen.
Oligonucleotide, wie einzelsträngige DNA-Sonden-Oligonucleotide, werden häufig mit Hilfe von chemischen Verfahren synthetisiert, wie diejenigen, die in Oligonucleotid-Synthese-Automaten integriert sind.
Oligonucleotide können jedoch mit Hilfe einer Vielzahl anderer Verfahren hergestellt werden, einschließlich in vitro rekombinanten DNA-vermittelten Verfahren und mit Hilfe von Expression von DNAs in Zellen und Organismen.
Zunächst werden chemisch synthetisierte DNAs typischerweise ohne ein 5'-Phosphat erhalten. Die 5'-Enden solcher Oligonucleotide sind keine Substrate für Phosphodiester-Bindungsbildung durch Ligierungsreaktionen, die von DNA-Ligasen typischerweise verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen. Wo die Ligierung solcher Oligonucleotide gewünscht wird, kann mit Hilfe von Standard-Verfahren, wie diejenigen, die eine Kinase und ATP verwenden, ein Phosphat hinzugefügt werden.
Das 3'-Ende eines chemisch synthetisierten Oligonucleotids besitzt im Allgemeinen eine freie Hydroxylgruppe und kann in Anwesenheit einer Ligase, wie T4-DNA-Ligase, eine Phosphodiester-Bindung mit einem 5'-Phosphat eines anderen Polynucleotids, wie einem anderen Oligonucleotid, ausbilden. Es ist gut bekannt, dass diese Reaktion, wo gewünscht, selektiv verhindert werden kann, indem die 5'-Phosphate des (der) anderen Polynucleotids (e) vor der Ligierung entfernt werden.
Plasmide werden hierin im Allgemeinen durch ein vorangestelltes p in Kleinbuchstaben und/oder gefolgt von Großbuchstaben und/oder Zahlen bezeichnet, in Übereinstimmung mit Standard-Namenskonventionen, die den Fachleuten vertraut sind. Ausgangsplasmide, die hierin offenbart sind, sind entweder kommerziell erhältlich, auf einer uneingeschränkten Basis öffentlich erhältlich oder können von vorliegenden Plasmiden mit Hilfe von gut bekannten publizierten Verfahren in einer Routine-Anwendung erzeugt werden. Zahlreiche Plasmide und andere Clonierungs- und Expressions-Vektoren, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind gut bekannt und für die Fachleute leicht erhältlich. Darüber hinaus können Fachleute leicht jede beliebige Anzahl anderer Plasmide erzeugen, die zur Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet sind. Die Eigenschaften, Erzeugung und Verwendung solcher Plasmide, sowie anderer Vektoren, wird den Fachleuten anhand der vorliegenden Offenbarung in der vorliegenden Erfindung leicht ersichtlich sein.
Der Begriff "Polynucleotid(e)" bezeichnet im Allgemeinen jedes beliebige Polyribonucleotid oder Poly-desoxyribonucleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. Somit bezeichnen Polynucleotide, wie hierin verwendet, zum Beispiel, unter anderem, einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen darstellt, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen darstellt, Hybrid-Moleküle, die DNA und RNA umfassen, die einzelsträngig sein können oder typischer doppelsträngig oder ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen. Zusätzlich bezeichnen Polynucleotide, wie sie hierin verwendet werden, dreifachsträngige Regionen, die RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA umfassen. Die Stränge in solchen Regionen können von dem gleichen Molekül oder von verschiedenen Molekülen stammen. Die Regionen können alles von einem bis mehrere der Moleküle beinhalten, beinhalten aber typischerweise nur eine Region von einigen der Moleküle. Eines der Moleküle einer dreifachhelicalen Region ist häufig ein Oligonucleotid.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff Polynucleotid DNAs oder RNAs, wie vorstehend beschrieben, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten. Somit sind DNAs oder RNAs mit einem modifizierten Rückgrat zum Zweck der Stabilität oder aus anderen Gründen "Polynucleotide" in dem Sinne, wie dieser Begriff hierin gedacht ist. Darüber hinaus sind DNAs oder RNAs, die ungewöhnliche Basen umfassen, wie Inosin oder modifizierte Basen, wie tritylierte Basen, um einfach zwei Beispiele zu nennen, Polynucleotide in dem Sinne, wie dieser Begriff hierin verwendet wird.
Es wird geschätzt, dass eine große Vielzahl von Modifikationen mit DNA und RNA durchgeführt wurden, die für zahlreiche Zwecke hilfreich sind, die den Fachleuten bekannt sind. Der Begriff Polynucleotid, wie er hierin verwendet wird, umfasst solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierten Formen von Polynucleotiden, sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen charakteristisch sind, einschließlich einfache und komplexe Zellen, unter anderem.
Der Begriff "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, beinhaltet alle Polypeptide, wie nachfolgend beschrieben. Die grundlegende Struktur von Polypeptiden ist gut bekannt und ist in unzähligen Lehrbüchern und anderen Veröffentlichungen im Stand der Technik beschrieben worden. In diesem Zusammenhang wird der Begriff hierin verwendet, um irgendein Peptid oder Protein zu bezeichnen, das zwei oder mehr Aminosäuren umfasst, die miteinander verknüpft sind, wobei dies durch Peptid-Bindungen in Form einer linearen Kette erfolgt. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff sowohl kurze Ketten, zum Beispiel solche, die im Allgemeinen im Stand der Technik auch als Peptide, Oligopeptide und Oligomere bezeichnet werden, und längere Ketten, die im Allgemeinen im Stand der Technik als Proteine bezeichnet werden, von welchen es viele Arten gibt.
Es wird eingeschätzt, dass Polypeptide häufig andere Aminosäuren enthalten, als die 20 Aminosäuren, die im Allgemeinen als die 20 natürlich auftretenden Aminosäuren bezeichnet werden und dass zahlreiche Aminosäuren, einschließlich der terminalen Aminosäuren, in einem bestimmten Peptid modifiziert sein können, entweder aufgrund natürlicher Prozesse, wie durch das Prozessieren und andere posttranslationale Modifikationen, aber auch durch chemische Modifikationsverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Sogar die gewöhnlichen Modifikationen, die natürlicherweise in Polypeptiden auftreten, sind zu zahlreich, um sie hier erschöpfend aufzulisten, sie sind jedoch in der Grundlagenliteratur und in detaillierteren Monographien, sowie in einer umfangreichen Forschungsliteratur gut beschrieben und sie sind den Fachleiten gut bekannt. Unter den bekannten Modifikationen, die in den erfindungsgemäßen Polypeptiden vorliegen können, sind, um einige wenige veranschaulichend zu benennen, Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalentes Anheften von Flavin, kovalentes Anheften einer Häm-Untereinheit, kovalentes Anheften eines Nucleotids oder Nucleotid-Derivats, kovalentes Anheften eines Lipids oder Lipid-Derivats, kovalentes Anheften von Phosphatidylinositol, Über-Kreuz-Vernetzung, Ringschluss, Disulfit-Bindungsbildung, Ausbildung von kovalenten Über-Kreuz-Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristilierung, Oxidierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Pränylierung, Racematisierung, Selenylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Anheftung von Aminosäuren an Proteine, wie Arginylierung und Ubiquitinylierung.
Solche Modifikationen sind den Fachleuten gut bekannt und sind in der wissenschaftlichen Literatur in großer Ausführlichkeit beschrieben worden. Einige besonders allgemeine Modifikationen, zum Beispiel Glycosylierung, Lipid-Anheftung, Sulfatierung, Gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung sind in den meisten grundlegenden Texten beschrieben worden, wie zum Beispiel Proteins-Structure and Molecular Properties, 2. Ausg., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993). Viele ausführliche Übersichtsartikel sind über diesen Gegenstand erhältlich, wie zum Beispiel diejenigen, die von Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, S. 1–12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors. Meth. Enzymol., 182: 626–646 (1990) und Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci., 663: 48–62 (1992), bereitgestellt sind.
Es wird eingeschätzt, wie es gut bekannt ist und vorstehend bemerkt wurde, dass Polypeptide nicht immer vollständig linear sind. Polypeptide können zum Beispiel verzweigt sein, als ein Ergebnis von Ubiquitinylierung und sie können ringförmig sein, mit oder ohne Verzweigung, im Allgemeinen als ein Ergebnis von posttranslationalen Ereignissen, einschließlich eines natürlichen Prozessierungs-Ereignisses und Ereignissen, die durch menschliche Manipulation herbeigeführt wurden, die natürlicherweise nicht auftreten. Zirkuläre, verzweigte und verzweigte zirkuläre Polypeptide können durch nicht-translationale natürliche Prozesse und genauso durch vollständig synthetische Verfahren synthetisiert werden.
Modifikationen können überall in einem Polypeptid auftreten, einschließlich dem Peptid-Rückgrat, den Aminosäure-Seitenketten und dem Amino- oder Carboxy-terminalen Ende. In der Tat ist das Blockieren der Amino- oder Carboxyl-Gruppe in einem Polypeptid oder von beiden, mit Hilfe einer kovalenten Modifikation, in natürlicher Weise auftretenden und synthetischen Polypeptiden allgemein verbreitet und solche Modifikationen können in den erfindungsgemäßen Polypeptiden ebenfalls vorliegen. Der Amino-terminale Rest von Polypeptiden, die in E. coli hergestellt wurden, zum Beispiel, wird vor dem proteolytischen Prozessieren nahezu ausnahmslos N-Formylmethionin sein.
Die Modifikationen, die in einem Polypeptid auftreten, werden häufig eine Funktion dessen sein, wie dieses hergestellt wurde. Für Polypeptide, die durch Expression eines clonierten Gens in einem Wirt hergestellt wurden, zum Beispiel, wird die Natur und das Ausmaß der Modifikationen zum großen Teil durch die posttranslationale-Modifikationsfähigkeit der Wirtszelle und die Modifikationssignale, die in der Polypeptid-Aminosäuresequenz vorliegen, bestimmt werden. So tritt zum Beispiel, was gut bekannt ist, Glycosylierung häufig nicht in bakteriellen Wirten, wie E. coli, auf. Demgemäß sollte, wenn Glycosylierung gewünscht ist, ein Polypeptid in einem glycosylierenden Wirt exprimiert werden, im Allgemeinen in einer eurkaryontischen Zelle. Insektenzellen führen häufig die gleichen posttranslationalen Glycosylierungen wie Säugerzellen durch und aus diesem Grund sind Insektenzell-Expressionssysteme entwickelt worden, um wirkungsvoll Säugerproteine zu exprimieren, die ein natürliches Muster von Glycosylierungen aufweisen, unter anderem. Ähnliche Betrachtungen gelten (auch) für andere Modifikationen. Es wird eingeschätzt, dass die gleiche Art von Modifikation im gleichen oder in einem variierenden Ausmaß an verschiedenen Seiten in einem bestimmten Polypeptid vorliegen kann. Ein bestimmtes Polypeptid kann auch zahlreiche Arten von Modifikationen enthalten. Im Allgemeinen umfasst der Begriff Polypeptid, wie er hierin verwendet wird, alle solchen Modifikationen, besonders diejenigen, die in Polypeptiden vorliegen, die durch Expression eines Polynucleotids in einer Wirtszelle synthetisiert wurden.
Der Begriff "Variante(n)" von Polynucleotiden oder Polypeptiden, wie der Begriff hierin verwendet wird, betrifft Polynucleotide und Polypeptide, die sich von einem Bezugs-Polynucleotid bzw. -Polypeptid unterscheiden. Varianten in diesem Sinne sind nachfolgend und an anderer Stelle in der vorliegenden Offenbarung in größerer Ausführlichkeit beschrieben.
Eine Polynucleotid-Variante ist ein Polynucleotid, das sich in der Nucleotidsequenz von einem anderen Bezugs-Polynucleotid unterscheidet. Im Allgemeinen sind die Unterschiede begrenzt, sodass die Nucleotidsequenz der Bezugnahme und der Variante sich insgesamt in sehr engem Maße ähneln und in zahlreichen Regionen identisch sind. Wie nachfolgend angemerkt, können Veränderungen in der Nucleotidsequenz der Variante still sein. Das bedeutet, es kann sein, dass sie die Aminosäuren, die von dem Polynucleotid codiert werden, nicht verändern. Wo Veränderungen auf stille Veränderungen dieses Typs beschränkt sind, codiert eine Variante ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz, wie die Bezugnahme. Wie ebenfalls nachfolgend angemerkt, können Veränderungen der Nucleotidsequenz der Variante die Aminosäuresequenz des Polypeptids verändern, das von dem Bezugs-Polynucleotid codiert wird. Solche Nucleotid-Veränderungen können in Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, -Deletionen, -Fusionen und -Trunkierungen in dem Polypeptid resultieren, das von der Bezugs-Sequenz codiert wird, wie nachfolgend diskutiert.
Eine Polypeptid-Variante ist ein Polypeptid, das sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen Bezugs-Polypeptid unterscheidet. Im Allgemeinen sind die Unterschiede begrenzt, sodass die Sequenzen der Bezugnahme und der Variante sich insgesamt in sehr engem Maße ähnlich sind und in zahlreichen Regionen identisch. Eine Variante und ein Bezugs-Polypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Trunkierungen unterscheiden, die in jeder beliebigen Kombination vorliegen können.
Der Begriff "Rezeptor-Molekül", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die spezifisch mit erfindungsgemäßen TNF-delta- oder TNF-epsilon-Polypeptiden interagieren oder daran binden, wobei nicht nur klassische Rezeptoren beinhaltet sind, die bevorzugt sind, sondern auch andere Moleküle, die spezifisch mit erfindungsgemäßen Polypeptiden (die auch als "bindende Moleküle" bzw. "interagierende Moleküle" und als "TNF-delta-bindende Moleküle" und "TNF-delta-interagierende Moleküle" bezeichnet werden können oder "TNF-epsilon-bindende Moleküle" und "TNF-epsilon-interagierende Moleküle") interagieren oder daran binden. Die Bindung zwischen erfindungsgemäßen Polypeptiden und solchen Molekülen, einschließlich Rezeptor- oder Bindungs- oder interagierenden Molekülen, kann ausschließlich mit erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgen, was in äußerst höchstem Maße bevorzugt wird, oder sie kann hochspezifisch für erfindungsgemäße Polypeptide erfolgen, was in hohem Maße bevorzugt wird, oder sie kann hochspezifisch sein für eine Gruppe von Proteinen, die erfindungsgemäße Polypeptide beinhaltet, was bevorzugt ist, oder sie kann spezifisch sein für einige Gruppen von Proteinen, wovon mindestens eine die erfindungsgemäßen Polypeptide beinhaltet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem neue TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptide und Polynucleotide, wie nachfolgend in größerer Ausführlichkeit beschrieben. Im Besonderen betrifft die Erfindung Polypeptide und Polynucleotide, die durch Aminosäuresequenz-Homologie mit der TNF-Liganden-Superfamilie verwandt sind. Die Erfindung betrifft im Speziellen TNF-delta, der die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen besitzt, wie in 1 dargestellt und die TNF-Nucleotid- und Aminosäuresequenz der menschlichen cDNA mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 97377. Die Erfindung betrifft auch im Speziellen TNF-epsilon, der die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen besitzt, wie in 2 dargestellt und die TNF-epsilon Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der menschlichen cDNA mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 97457. Die Hinterlegungen werden hierin nachfolgend als die hinterlegten Clone oder als "die cDNA der hinterlegten Clone" bezeichnet. Es wird eingeschätzt, dass die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen, wie in den 1 und 2 dargestellt, durch Sequenzierung der menschlichen cDNA der hinterlegten Clone erhalten wurde. Infolgedessen ist die Sequenz der hinterlegten Clone die Kontrolle für jede beliebige Unstimmigkeit zwischen den beiden und jede Bezugnahme auf die Sequenzen der 1 und 2 beinhaltet die Bezugnahme auf die Sequenzen der menschlichen cDNAs der hinterlegten Clone.
In Übereinstimmung mit einem Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden isolierte Polynucleotide bereitgestellt, die TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptide codieren, die die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der 1 und 2 besitzen.
Indem die Information verwendet wird, die hierin bereitgestellt wird, wie die Polynucleotidsequenz, die in 1 dargestellt ist, kann ein erfindungsgemäßes Polynucleotid, das das menschliche TNF-delta-Polypeptid codiert, erhalten werden, indem Standard-Clonierungs- und Durchmusterungs-Verfahren verwendet werden, wie diejenigen, die zur Clonierung von cDNAs die mRNA aus Zellen von menschlichen Gewebe als Ausgangsmaterial benutzen.
Veranschaulichend für die Erfindung wurde das Polynucleotid, das in 1 dargstellt ist, in einer cDNA-Bibliothek entdeckt, die von Zellen aus menschlichem Herzgewebe abstammt.
Erfindungsgemäßer menschlicher TNF-delta ist strukturell mit anderen Proteinen der TNF-Liganden-Superfamilie verwandt, wie durch die Ergebnisse der Sequenzierung der cDNA gezeigt ist, die menschliches TNF-delta in dem hinterlegten Clon codiert. Die cDNA-Sequenz, die so erhalten wurde, ist in 1 dargestellt. Sie enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein von etwa 233 Aminosäureresten codiert, das ein abgeleitetes Molekulargewicht von etwa 25,871 kDa besitzt. Das Protein zeigt unter den bekannten Proteinen die höchste Homologie mit TNF-α. Die gesamte Aminosäuresequenz von TNF-delta von 1 besitzt etwa 38% Identität mit der Aminosäuresequenz von TNF-α.
Ein erfindungsgemäßes Polynucleotid, das das menschliche TNF-epsilon-Polypeptid codiert, kann unter Verwendung von Standard-Clonierungs- und Durchmusterungs-Verfahren erhalten werden, wie diejenigen, die zur Clonierung von cDNAs die mRNA von Zellen aus menschlichen Gewebe als Ausgangsmaterial benutzen. Veranschaulichend für die Erfindung wurde das Polynucleotid, das in 2 dargestellt ist, in einer cDNA-Bibliothek entdeckt, die von Zellen aus menschlichem Herzgewebe abstammt.
Erfindungsgemäßer menschlicher TNF-epsilon ist strukturell mit anderen Proteinen der TNF-Liganden-Superfamilie verwandt, wie durch die Ergebnisse der Sequenzierung der cDNA gezeigt ist, die menschlichen TNF-epsilon in dem hinterlegten Clon codiert. Die cDNA-Sequenz, die so erhalten wurde, ist in 2 dargestellt. Die TNF-epsilon-Sequenz ist nahezu identisch mit der Sequenz von TNF-delta, wie sie in 1 dargestellt ist, abzüglich der anfänglichen 50 Aminosäuren und einer Region von TNF-delta, die die Aminosäure 86 bis Aminosäure 92 umfasst. Demgemäß ist TNF-epsilon eine Spleiss-Variante von TNF-delta. TNF-epsilon umfasst 168 Aminosäurereste und die Sequenz von 2 zeigt das reife Protein von TNF-epsilon ohne irgendeine N-terminale hydrophobe Region. Das Protein zeigt die höchste Homologie mit TNF-α. TNF-epsilon von 2 besitzt etwa 20% Identität mit der Aminosäuresequenz von TNF-α.
Erfindungsgemäße Polynucleotide können in Form von RNA vorliegen, wie mRNA oder in Form von DNA, einschließich zum Beispiel cDNA und genomische DNA, die durch Clonierung erhalten wurden oder durch chemische Synthese-Verfahren hergestellt wurden oder durch eine Kombination von beidem. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Einzelsträngige DNA kann der codierende Strang sein, der auch als der Sense-Strang bekannt ist oder sie kann der nicht-codierende Strang sein, der auch als der Antisense-Strang bezeichnet wird.
Die codierende Sequenz, die das Polypeptid codiert, kann mit der codierenden Sequenz des Polynucleotids identisch sein, die in den 1 und 2 gezeigt ist. Sie kann auch ein Polynucleotid mit einer davon verschiedenen Sequenz sein, die als ein Ergebnis der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen Codes das Polypeptid der DNA aus den 1 und 2 codiert.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide, die die Polypeptide der 1 und 2 codieren, können selbst die codierende Sequenz für das reife Polypeptid beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und zusätzliche codierende Sequenzen, wie solche, die eine Führungs- (Leader-) oder sekretorische Sequenz, wie eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz; die codierende Sequenz des reifen Polypeptids mit oder ohne die vorstehend erwähnten zusätzlichen codierenden Sequenzen, zusammen mit zusätzlichen nicht-codierenden Sequenzen, einschließlich zum Beispiel Introns und nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenzen, wie die transkribierten, nicht-translatierten Sequenzen, die bei der Transkription, der mRNA-Prozessierung – einschließlich Spleiss- und Polyadenylierungs-Signale, zum Beispiel –, der Ribosomenbindung und der Stabilität von mRNA eine Rolle spielen, wobei sie nicht darauf beschränkt sind; zusätzliche codierende Sequenz, die zusätzliche Aminosäuren codiert, wie diejenigen, die zusätzliche Funktionalitäten bereitstellen.
Somit kann das Polypeptid zum Beispiel mit einer Markersequenz fusioniert sein, wie ein Peptid, das die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Marker-Sequenz ein Hexa-Histidin-Peptid, wie der Anhang (tag), der in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt wird, unter anderen, wovon zahlreiche kommerziell erhältlich sind. Wie in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 821–824 (1989) beschrieben, gewährleistet Hexa-Histidin zum Beispiel die bequeme Aufreinigung des Fusions-Proteins. Das HA-tag zum Beispiel entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein abstammt, das von Wilson et al., Cell, 37: 767 (1984) beschrieben wurde.
In Übereinstimmung mit dem Vorangehenden umfasst der Begriff "Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert", wie hierin verwendet, Polynucleotide, die eine Sequenz beinhalten, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, insbesondere menschlichen TNF-delta und TNF-epsilon, die die Aminosäuresequenzen besitzen, die in den 1 und 2 dargestellt sind. Der Begriff umfasst Polynucleotide, die eine einzelne kontinuierliche Region beinhalten oder diskontinuierliche Regionen, die das Polypeptid codieren (zum Beispiel unterbrochen durch Introns), zusammen mit zusätzlichen Regionen, die ebenfalls codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen enthalten können.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Varianten der hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoge und Derivate der Polypeptide codieren, die die abgeleitete Aminosäuresequenz der 1 und 2 besitzen. Eine Variante des Polynucleotids kann eine natürlicherweise vorkommende Variante, wie eine natürlicherweise vorkommende allelische Variante sein oder es kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, dass sie natürlicherweise auftritt. Solche nicht natürlicherweise vorkommenden Varianten des Polynucleotids können durch Mutagenese-Verfahren hergestellt werden, einschließlich derjenigen, die für Polynucleotide, Zellen oder Organismen verwendet werden.
Unter Varianten in dieser Hinsicht sind Varianten, die sich von den vorstehend erwähnten Polynucleotiden durch Nucleotid-Substitutionen, Deletionen oder Additionen unterscheiden. Die Substitutionen, Deletionen oder Additionen können eines oder mehrere Nucleotide beinhalten. Die Varianten können in den codierenden oder nicht codierenden Regionen oder in beidem verändert sein. Veränderungen in den codierenden Regionen können konservative oder nicht konservative Aminosäure-Substitutionen, Deletionen oder Additionen hervorrufen.
Unter den besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind in dieser Hinsicht Polynucleotide, die Polypeptide codieren, die die Aminosäuresequenz von TNF-delta und TNF-epsilon besitzen, wie in den 1 und 2 dargestellt; Varianten, Analoge, Derivate und Fragmente davon und Fragmente der Varianten, Analoge und Derivate.
Weiter sind in dieser Hinsicht Polynucleotide besonders bevorzugt, die TNF-delta und TNF-epsilon codieren, die die Aminosäuresequenz der TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptide der 1 und 2 besitzen, in denen einige, einige wenige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, deletiert oder addiert, in jeder beliebigen Kombination vorliegen. Darunter speziell bevorzugt sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten von TNF-delta und TNF-epsilon nicht verändern. Ebenfalls speziell bevorzugt in dieser Hinsicht sind konservative Substitutionen. In höchstem Maße bevorzugt sind Polynucleotide, die Polypeptide codieren, die die Aminosäuresequenz der 1 und 2 besitzen, ohne Substitutionen. Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynucleotide, die mindestens 70% identisch sind mit einem Polynucleotid, das TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptide codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in den 1 und 2 dargestellt ist und Polynucleotide, die zu solchen Polynucleotiden komplementär sind. Alternativ dazu sind Polynucleotide in höchstem Maße bevorzugt, die eine Region umfassen, die mindestens zu 80% identisch ist mit einem Polynucleotid, das TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptide codiert und Polynucleotide, die komplementär dazu sind. In dieser Hinsicht werden Polynucleotide, die zu mindestens 90% identisch sind mit demselben besonders bevorzugt und unter diesen besonders bevorzugten Polynucleotiden werden diejenigen mit mindestens 95% besonders bevorzugt. Darüber hinaus werden diejenigen mit mindestens 97% von denjenigen mit mindestens 95% stark bevorzugt und unter diesen werden diejenigen mit mindestens 98% und mindestens 99% besonders stark bevorzugt, wobei mindestens 99% die am meisten bevorzugten darstellen.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen in dieser Hinsicht sind darüber hinaus Polynucleotide, die Polypeptide codieren, die im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität erhalten, wie das reife Polypeptid, das durch die cDNA der 1 und 2 codiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung im Speziellen Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "stringente Bedingungen", dass die Hybridisierung auftritt, wenn mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% der Basen zwischen den Sequenzen komplementär sind (z. B. G : C; A : T).
Wie hierin im Hinblick auf erfindungsgemäße Polynucleotid-Tests zusätzlich diskutiert, können zum Beispiel erfindungsgemäße Polynucleotide, wie vorstehend diskutiert, als eine Hybridisierungssonde für cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAs von vollständiger Länge und genomische Clone zu isolieren, die TNF-delta und TNF-epsilon codieren und um cDNA und genomische Clone von anderen Genen zu isolieren, die eine hohe Sequenz-Ähnlichkeit mit dem menschlichen TNF-delta- und TNF-epsilon-Gen aufweisen. Solche Sonden umfassen im Allgemeinen mindestens 15 Basen. Vorzugsweise haben solche Sonden mindestens 30 Basen und können mindestens 50 Basen besitzen.
Die codierende Region des TNF-delta- und TNF-epsilon-Gens, zum Beispiel, kann mit Hilfe von Durchmusterung isoliert werden, wobei die bekannte DNA-Sequenz verwendet wird, um eine Oligonucleotid-Sonde herzustellen. Ein markiertes Oligonucleotid, das eine Sequenz besitzt, die derjenigen eines erfindungsgemäßen Gens komplementär ist, wird dann verwendet, um eine Bibliothek von menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu durchmustern, um zu bestimmen mit welchen Mitgliedern der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Polypeptide können als Forschungsreagenzien und als Materialien für die Entdeckung von Behandlungsarten und Diagnostika für menschliche Erkrankungen verwendet werden, wie hierin weiter diskutiert wird in Bezug auf Polynucleotid-Tests, unter anderem.
Die Polynucleotide können ein Polypeptid codieren, das das reife Protein plus zusätzliche Amino- oder Carboxy-terminale Aminosäuren codiert, oder Aminosäuren im Inneren des reifen Polypeptids (wenn zum Beispiel die reife Form mehr als eine Polypeptidkette besitzt). Solche Sequenzen können bei der Prozessierung eines Proteins aus einer Vorläufer- in eine reife Form eine Rolle spielen, können den Proteintransport erleichtern, können die Halbwertszeit des Proteins verlängern oder verkürzen oder können die Manipulation eines Proteins für einen Test oder die Herstellung erleichtern, unter anderem. Wie es im Allgemeinen in situ der Fall ist, können die zusätzlichen Aminosäuren mit Hilfe von zellulären Enzymen von dem reifen Protein entfernt werden.
Ein Vorläufer-Protein, das die reife Form des Polypeptids fusioniert mit einer oder mehreren Pro-Sequenzen besitzt, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Sobald die Pro-Sequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven Vorstufen im Allgemeinen aktiviert. Einige oder alle Pro-Sequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Im Allgemeinen werden solche Vorläufer als Pro-Proteine bezeichnet.
In der Summe kann ein erfindungsgemäßes Polynucleotid ein reifes Protein codieren, ein reifes Protein plus eine Leadersequenz (die als ein Prä-Protein bezeichnet werden kann), eine Vorstufe eines reifen Proteins, das eine oder mehrere Pro-Sequenzen besitzt, die nicht die Leadersequenzen eines Prä-Proteins darstellen, oder ein Prä-Protein, das eine Vorstufe für ein Pro-Protein ist, das eine Leadersequenz und eine oder mehrere Pro-Sequenzen besitzt, die im Allgemeinen während der Prozessierungsschritte entfernt werden, um aktive und reife Formen des Polypeptids erzeugen.
Hinterlegungen, die menschliche TNF-delta- und menschliche TNF-epsilon-cDNA enthalten, sind, wie vorstehend bemerkt, bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden. Die cDNA-Hinterlegung wird hierin ebenfalls entsprechend dem vorstehend Bemerkten als "der hinterlegte Clon" oder "die cDNA des hinterlegten Clons" bezeichnet. Die Clone wurden am 8. Dezember 1995 und am 1. März 1996 bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt und mit den ATCC-Hinterlegungs-Nrn. 97377 bzw. 97457 bezeichnet. Die hinterlegten Materialien sind pBluescript SK (–) Plasmide (Stratagene, La Jolla, CA), die die TNF-delta- und TNF-epsilon-menschliche cDNA von vollständiger Länge enthalten.
Die Hinterlegungen sind gemäß den Richtlinien des Budapester Vertrages zur internationalen Erkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren gemacht worden. Die Stämme werden im Rahmen der Erteilung eines Patents unwiderruflich und ohne Einschränkung oder Bedingung für die Öffentlichkeit freigegeben. Die Hinterlegungen werden lediglich zum Nutzen für den Fachmann bereitgestellt und stellen keine Erlaubnis derart dar, dass eine Hinterlegung für eine Berechtigung erforderlich ist, wie diejenige, die gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, die in dem hinterlegten Material enthalten ist, sowie die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das davon codiert wird, dienen als Kontrolle für den Fall, dass irgendein Konflikt mit irgendeiner Beschreibung der Sequenzen hierin auftritt. Zur Herstellung, Verwendung oder zum Verkauf der hinterlegten Materialien kann eine Lizenz erforderlich sein und keine solche Lizenz ist hierdurch erteilt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Polypeptide für menschlichen TNF-delta und TNF-epsilon, die die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der 1 und 2 besitzen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können ein rekombinantes Polypeptid, ein natürlicherweise vorkommendes Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist es ein rekombinantes Polypeptid.
Die Erfindung betrifft auch Fragmente, Analoge und Derivate dieser Polypeptide. Die Begriffe "Fragment", "Derivat" und "Analog", wenn sie sich auf das Polypeptid der 1 und 2 beziehen, bedeuten ein Polypeptid, das im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität erhält, wie ein solches Polypeptid. Somit beinhaltet ein Analog ein Pro-Protein, das durch Spaltung des Pro-Protein-Bereichs aktiviert werden kann, wobei ein aktives reifes Polypeptid erzeugt wird.
Das Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids der 1 und 2 kann Folgendes sein: (i) eines, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise ein konservierter Aminosäurerest) substituiert ist (sind) und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann einer sein, der durch den genetischen Code codiert ist oder nicht, oder (ii) eines, in dem einer oder mehrere Aminosäurerest(e) eine Substituentengruppe beinhaltet, oder (iii) eines, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie beispielsweise eine Verbindung um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (zum Beispiel Polyethylenglycol) oder (iv) eines, in dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie beispielsweise eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die für die Aufreinigung des reifen Polypeptids verwendet wird oder eine Pro-Protein-Sequenz. Es wird erachtet, dass solche Fragmente, Derivate und Analoge durch die hierin vorliegenden Lehren innerhalb des Anwendungsbereichs von Fachleuten liegen.
Unter den besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind in dieser Hinsicht Polypeptide, die die Aminosäuresequenz von TNF-delta und TNF-epsilon, die in den 1 und 2 dargestellt sind, Varianten, Analoge, Derivate und Fragmente davon und Varianten, Analoge und Derivate der Fragmente. Alternativ dazu sind in dieser Hinsicht besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen Polypeptide, die die Aminosäuresequenz des TNF-delta und TNF-epsilon der menschlichen cDNA des hinterlegten Clons besitzen, Varianten, Analoge, Derivate und Fragmente davon und Varianten, Analoge und Derivate der Fragmente.
Unter den bevorzugten Varianten sind diejenigen, die sich von einer Bezugnahme durch konservative Aminosäure-Substitutionen unterscheiden. Solche Substitutionen sind diejenigen, die eine bestimmte Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Merkmalen substituieren. Typischerweise als konservative Substitutionen angesehen sind die gegenseitigen Austausche unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile, Austausche der Hydroxylreste Ser und Thr, Austausche der sauren Reste Asp und Glu, die Substitution zwischen den Amid-Resten Asn und Gln, der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und Austausche unter den aromatischen Resten Phe, Tyr.
Weiter besonders bevorzugt sind in dieser Hinsicht Varianten, Analoge, Derivate und Fragmente und Varianten, Analoge und Derivate der Fragmente, die die Aminosäuresequenz des TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptids der 1 und 2 besitzen oder der cDNA des hinterlegten Clons, in der einige, einige wenige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste, in jeder beliebigen Kombination, substituiert, deletiert oder hinzugefügt sind. Besonders bevorzugt sind darunter stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten des TNF-delta und TNF-epsilon nicht verändern. In höchstem Maße bevorzugt sind Polypeptide, die die Aminosäuresequenz der 1 und 2 besitzen, ohne Substitutionen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Polynucleotide werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise bis zur Homogenität aufgereinigt.
Die erfindungsgemäßen TNF-delta-Polypeptide beinhalten die Polypeptide von SEQ ID NR: 2 (insbesondere das reife Polypeptid) sowie Polypeptide, die mindestens 70% Ähnlichkeit besitzen (vorzugsweise mindestens 70% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NR: 4 und mehr bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt mindestens 90% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NR: 4 und noch mehr bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit (noch mehr bevorzugt mindestens 95% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NR: 4 und beinhalten auch Teile solcher Polypeptide, wobei ein solcher Teil des Polypeptids im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren enthält.
Die erfindungsgemäßen TNF-epsilon Polypeptide beinhalten das Polypeptid von SEQ ID NR: 4 (insbesondere das reife Polypeptid), sowie Polypeptide, die mindestens 70% Ähnlichkeit haben (vorzugsweise mindestens 70% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NR: 4 und mehr bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt mindestens 90% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NR: 4 und noch mehr bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit (noch mehr bevorzugt mindestens 95% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NR: 4 und beinhalten auch Teile solcher Polypeptide, wobei ein solcher Teil des Polypeptids im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren enthält.
Wie im Stand der Technik bekannt ist, wird die "Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden durch Vergleichen der Aminosäuresequenz und deren konservierten Aminosäure-Substituenten von einem Polypeptid mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids bestimmt.
Fragmente oder Teile der erfindungsgemäßen Polypeptide können verwendet werden, um das entsprechende Polypeptid von vollständiger Länge mit Hilfe von Peptidsynthese herzustellen; deshalb können die Fragmente als Zwischenprodukte für die Herstellung der Polypeptide von vollständiger Länge verwendet werden. Fragmente oder Teile der erfindungsgemäßen Polynucleotide können verwendet werden, um erfindungsgemäße Polynucleotide von vollständiger Länge zu synthetisieren.
Ein Fragment ist ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die vollständig gleich ist mit einem Teil, jedoch nicht mit der vollständigen Aminosäuresequenz der zuvor erwähnten TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptide und Varianten oder Derivaten davon. Solche Fragmente können "freistehend" sein, d. h. nicht Teil von oder mit anderen Aminosäuren oder Polypeptiden fusioniert sein oder sie können innerhalb eines größeren Polypeptids umfasst sein, von dem sie einen Teil oder eine Region bilden. Wenn sie innerhalb eines größeren Polypeptids umfasst werden, bilden die hierin diskutierten Fragmente am meisten bevorzugt eine einzelne fortlaufende Region. Es können jedoch einige Fragmente innerhalb eines einzelnen größeren Polypeptids umfasst sein. Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen betreffen zum Beispiel ein Fragment eines erfindungsgemäßen TNF-delta- und TNF-epsilon-Polypeptids, das innerhalb eines Vorläufer-Polypeptids enthalten ist, das zur Expression in einem Wirt entworfen wurde und das heterologe Prä- und Pro-Polypeptid-Bereiche besitzt, die an das Amino-terminale Ende des TNF-delta- und TNF-epsilon-Fragments fusioniert sind und eine zusätzliche Region, die an das Carboxy-terminale Ende des Fragments fusioniert ist. Deshalb betreffen Fragmente in einem Aspekt der hierin beabsichtigten Bedeutung den Teil oder Teile eines Fusions-Polypeptids oder Fusions-Proteins, das von TNF-delta und TNF-epsilon abstammt.
Als repräsentative Beispiele für erfindungsgemäße Polypeptid-Fragmente können solche erwähnt werden, die etwa zwischen 30 und 233 Aminosäuren besitzen. In diesem Zusammenhang beinhaltet "etwa" den besonders bezeichneten Bereich und Bereiche, die um einige, einige wenige, 5, 4, 3, 2, oder 1 Aminosäure größer oder kleiner sind, an einem der beiden Enden oder an beiden Enden. Etwa 100 bis 233 Aminosäuren, zum Beispiel, bedeutet in diesem Zusammenhang ein Polypeptid-Fragment von 100 plus oder minus einige, einige wenige, 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäure(n) bis 233 plus oder minus einige, einige wenige, 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäurerest(e), d. h. Bereiche, so breit wie 100 minus einige Aminosäuren bis 233 plus einige Aminosäuren, bis begrenzt als 100 plus einige Aminosäuren bis 233 minus einige Aminosäuren.
In höchstem Maße bevorzugt sind in dieser Hinsicht die festgelegten Bereiche plus oder minus bis zu 5 Aminosäuren an einem der beiden oder an beiden Enden. In besonders hohem Maße bevorzugt sind die festgelegten Bereiche plus oder minus bis zu 3 Aminosäuren an einem der beiden oder an beiden der festgelegten Enden. Speziell in höchstem Maß bevorzugt sind Bereiche plus oder minus 1 Aminosäure an einem der beiden oder an beiden Enden der festgelegten Bereiche ohne Additionen oder Deletionen. In allerhöchstem Maße bevorzugt in dieser Hinsicht sind Fragmente von etwa 15 bis etwa 233 Aminosäuren.
Unter speziell bevorzugten erfindungsgemäßen Fragmenten sind Trunkierungsmutanten von TNF-delta und TNF-epsilon. Trunkierungsmutanten beinhalten TNF-delta- und TNF-epsilon- Polypeptide, die die Aminosäuresequenz der 1 und 2 besitzen, oder von Varianten oder Derivaten davon, mit Ausnahme der Deletion einer fortlaufenden Serie von Resten (das bedeutet eine fortlaufende Region, Bereich oder Teil), der das Amino-terminale Ende beinhaltet oder eine fortlaufende Serie von Resten, die das Carboxy-terminale Ende beinhalten, wie bei Doppelt-Trunkierungsmutanten, die Deletion von zwei fortlaufenden Serien von Resten, wobei die eine das Amino-terminale Ende beinhaltet und eine das Carboxy-terminale Ende beinhaltet. Fragmente, die Größenbereiche besitzen, wie sie in etwa dargelegt sind, sind ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen für Trunkierungs-Fragmente, die im Speziellen unter Fragmenten im Allgemeinen bevorzugt werden.
In diesem Aspekt der Erfindung sind Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Eigenschaften von TNF-delta und TNF-epsilon charakterisiert sind, ebenfalls bevorzugt. Bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen in dieser Hinsicht beinhalten Fragmente, die Alpha-Helix und Alpha-Helix-bildende Regionen ("Alpha-Regionen"), Beta-Faltblatt und Beta-Faltblatt-bildende Regionen ("Beta-Regionen"), Kehrtwende- und Kehrtwende-bildende Regionen ("Kehrtwende-Regionen"), Spiral- und Spiralen-bildende Regionen ("Spiral-Regionen"), hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, Alpha-Amphipathische Regionen, Beta-Amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberflächen-bildende Regionen und Regionen mit einem hohen antigenen Index von TNF-delta und TNF-epsilon, umfassen.
Bestimmte bevorzugte Regionen in dieser Hinsicht sind in 4 für TNF-delta und 5 für TNF-epsilon dargestellt und beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Regionen der vorstehend erwähnten Typen, die durch Analyse der Aminosäuresequenz identifiziert wurden, die in den 1 und 2 dargestellt ist. Wie in den 4 und 5 dargestellt ist, beinhalten solche bevorzugten Regionen Garnier-Robson Alpha-Regionen, Beta-Regionen, Kehrtwende-Regionen und Spiral-Regionen, Chou-Fasman-Alpha-Regionen, Beta-Regionen und Kehrtwende-Regionen, Kyte-Doolittle-Hydrophile-Regionen und Hydrophile Regionen, Eisenberg-Alpha und -Beta-Amphipathische Regionen, Karplus-Schulz-Felxible-Regionen, Emini-Oberflächenbildende Regionen und Jameson-Wolf-Regionen mit hohem antigenen Index.
Zu den stark bevorzugten Fragmenten gehören in dieser Hinsicht diejenigen, die Regionen von TNF-delta und TNF-epsilon umfassen, die einige strukturelle Merkmale vereinen, wie einige der Merkmale, die vorstehend dargestellt sind. In dieser Hinsicht sind in besonders hohem Maße bevorzugte Regionen, die Regionen, die durch die Reste definiert sind, die der Signalpeptid-Region der 1, 2, 4 und 5 nachfolgen, die alle durch Aminosäure-Zusammensetzungen charakterisiert sind, die in hohem Maße charakteristisch sind für Kehrtwende-Regionen, Hydrophile Regionen, Flexible Regionen, Oberfläche-bildende Regionen und Regionen mit hohem antigenen Index. Solche Regionen können innerhalb eines größeren Polypeptids enthalten sein oder können selbst ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Fragment sein, wie vorstehend diskutiert. Es ist vorgesehen, dass der Begriff "etwa", wie er in diesem Absatz verwendet wird, die vorstehend dargestellte Bedeutung hinsichtlich von Fragmenten im Allgemeinen besitzt.
Weitere bevorzugte Regionen sind diejenigen, die Aktivitäten von TNF-delta und TNF-epsilon vermitteln. In höchstem Maße bevorzugt sind in dieser Hinsicht Fragmente, die eine chemische, biologische oder andere Aktivität von TNF-delta und TNF-epsilon besitzen, einschließlich denjenigen mit einer ähnlichen Aktivität oder einer verbesserten Aktivität oder mit einer erniedrigten unerwünschten Aktivität. In hohem Maße bevorzugt sind in dieser Hinsicht Fragmente, die Regionen enthalten, die in der Sequenz oder in der Position oder sowohl in der Sequenz als auch in aktiven Regionen von verwandten Polypeptiden, wie die verwandten Polypeptide, die in 3 dargestellt sind, einschließlich menschliches TNF-α und β, homolog sind. Unter besonders bevorzugten Fragmenten in dieser Hinsicht sind Trunkierungsmutanten, wie vorstehend diskutiert.
Es wird verstanden werden, dass die Erfindung unter anderem auch Polynucleotide betrifft, die die vorstehend erwähnten Fragmente codieren, Polynucleotide, die mit den Polynucleotiden, die die Fragmente codieren, hybridisieren, insbesondere diejenigen, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren und Polynucleotide, wie PCR-Primer zur Amplifikation der Polynucleotide, die die Fragmente codieren. In dieser Hinsicht sind diejenigen Polynucleotide bevorzugt, die den bevorzugten Fragmenten entsprechen, wie vorstehend diskutiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die erfindungsgemäße Polynucleotide beinhalten, Wirtszellen, die mit erfindungsgemäßen Vektoren genetisch manipuliert worden waren und die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden mit Hilfe von rekombinanten Verfahren.
Wirtszellen können genetisch manipuliert sein, um die Polynucleotide aufzunehmen und die erfindungsgemäßen Polypeptide zu exprimieren. Polynucleotide können zum Beispiel unter Verwendung von gut bekannten Verfahren mit Hilfe von Infektion, Transduktion, Transfektion, Transvektion und Transformation in Wirtszellen eingebracht werden. Die Polynucleotide können vereinzelt oder zusammen mit anderen Polynucleotiden eingebracht werden. Solche anderen Polynucleotide können unabhängig voneinander eingebracht werden, gemeinsam eingebracht werden oder an die erfindungsgemäßen Polynucleotide verknüpft eingebracht werden. So können beispielsweise erfindungsgemäße Polynucleotide gemeinsam mit einem anderen getrennten Polynucleotid, das einen selektierbaren Marker codiert, in Wirtszellen transfiziert werden, wobei Standard-Verfahren für Co-Transfektion und -Selektion in zum Beispiel Säugerzellen verwendet werden. In diesem Fall werden die Polynucleotide im Allgemeinen stabil in das Genom der Wirtszelle eingebaut.
Alternativ dazu können die Polynucleotide mit einem Vektor verknüpft sein, der einen selektierbaren Marker zur Vermehrung in einem Wirt enthält. Das Vektor-Konstrukt kann durch die vorstehend erwähnten Verfahren in Wirtszellen eingebracht werden. Im Allgemeinen wird ein Plasmid-Vektor als DNA in einem Präzipitat, wie als ein Kalziumphosphat-Präzipitat oder in einen Komplex mit einem geladenen Lipid eingebracht. Elektroporation kann auch verwendet werden, um Polynucleotide in einen Wirt einzubringen. Falls der Vektor ein Virus ist, kann dieses in vitro verpackt werden oder in eine Verpackungszelle eingebracht werden und das verpackte Virus kann in Zellen transduziert werden. Ein reiches Angebot an Verfahren, die für die Herstellung der Polynucleotide und das Einbringen der Polynucleotide in Zellen in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung geeignet sind, sind gut bekannt und für die Fachleute Routine. Solche Verfahren ausführlich als Übersicht in dem vorstehend zitierten Sambrook et al. dargestellt, das beispielhaft ist für die zahlreichen Labor-Handbücher, die diese detailliert darstellen. In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung kann der Vektor zum Beispiel ein Plasmid-Vektor, ein Einzel- oder Doppelstrang-Phagen-Vektor, ein Einzel- oder Doppelstrang-RNA- oder -DNA-viraler Vektor sein. Solche Vektoren können als Polynucleotide in Zellen eingebracht werden, vorzugsweise DNA, wobei gut bekannte Verfahren zum Einbringen von DNA und RNA in Zellen verwendet werden. Die Vektoren können und vorzugsweise werden im Fall von Phagen- und viralen Vektoren als verpacktes oder Capsid-umschlossenes Virus eingebracht, wobei gut bekannte Verfahren zur Infektion und Transduktion verwendet werden. Virale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefizient sein. In letzterem Fall wird die virale Propagierung im Allgemeinen ausschließlich in komplementierenden Wirtszellen auftreten.
Unter den Vektoren sind in bestimmter Hinsicht diejenigen zur Expression der erfindungsgemäßen Polynucleotide und Polypeptide bevorzugt. Im Allgemeinen umfassen solche Vektoren cis-wirkende Kontrollregionen, die für die Expression in einem Wirt wirkungsvoll sind, die funktionell mit dem zu exprimierenden Polynucleotid gekoppelt sind. Entsprechende trans-wirkende Faktoren werden entweder von dem Wirt bereitgestellt, durch einen komplementierenden Vektor bereitgestellt oder durch den Vektor selbst nach Einbringen in den Wirt bereitgestellt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht stellen die Vektoren die spezifische Expression bereit. Eine solche spezifische Expression kann eine induzierbare Expression sein oder eine Expression ausschließlich in bestimmten Zelltypen oder sowohl induzierbar als auch zellspezifisch sein. Besonders bevorzugt unter den induzierbaren Vektoren sind Vektoren, die durch Umweltfaktoren, die leicht zu manipulieren sind, wie Temperatur und Nährstoffzusätze, zur Expression induziert werden. Eine Vielzahl von Vektoren, die für diesen erfindungsgemäßen Aspekt geeignet sind, einschließlich konstitutive und induzierbare Expressions-Vektoren für die Verwendung in prokaryontischen und eukaryontischen Wirten, sind gut bekannt und werden von den Fachleuten routinemäßig verwendet.
Die gentechnisch manipulierten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährstoffmedien gezüchtet werden, die jeweils angemessen modifiziert sein können für, unter anderem, die Aktivierung der Promotoren, die Auswahl von Transformanten oder die Amplifikation von Genen. Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und ähnliches, die früher mit den zur Expression ausgewählten Wirtszellen verwendet wurden, werden im Allgemeinen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide geeignet sein, was für die Fachleute offensichtlich sein wird.
Eine große Vielzahl von Expressions-Vektoren kann verwendet werden, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren. Solche Vektoren beinhalten chromosomale, episomale und von Virus abstammende Vektoren, z. B. Vektoren, die von bakteriellen Plasmiden abstammen, von einem Bakteriophagen, von Hefe-Episomen, von Hefe-chromosomalen Elementen, von Viren wie Baculoviren, Papovaviren, wie SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Hühner-Pockenviren, Pseudo-Tollwut-Viren und Retroviren und Vektoren, die von Kombinationen davon abstammen, wie diejenigen, die von Plasmid- und Bakteriophagen-genetischen Elementen abstammen, wie Cosmide und Phagemide, diese alle können zur Expression in Übereinstimmung mit diesem erfindungsgemäßen Aspekt verwendet werden. Im Allgemeinen kann jeder beliebige Vektor, der dazu geeignet ist, Polynucleotide zu erhalten, zu vermehren oder zu exprimieren, um ein Polypeptid in einem Wirt zu exprimieren, zur Expression in dieser Hinsicht verwendet werden.
Die entsprechende DNA-Sequenz kann mit Hilfe jedes beliebigen aus einer Vielzahl von gut bekannten und routinemäßig vorliegenden Verfahren in den Vektor eingebracht werden. Im Allgemeinen wird eine DNA-Sequenz zur Expression mit einem Expressions-Vektor verknüpft, indem die DNA-Sequenz und der Expressions-Vektor mit einem oder mehreren Restriktionsendonucleasen gespalten wird und dann die Restriktions-Fragmente unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft werden. Verfahren zur Restriktion und Ligierung, die an dieser Stelle verwendet werden können, sind gut bekannt und gehören für die Fachleute zur Routine. Geeignete Verfahren in dieser Hinsicht und zur Erzeugung der Expressions-Vektoren, die alternative Verfahren verwenden, die ebenfalls gut bekannt und für die Fachleute Routine sind, sind ausführlich in Einzelheiten in Sambrook et al. dargestellt, das hierin an anderer Stelle zitiert wurde.
Die DNA-Sequenz in dem Expressions-Vektor ist funktionell mit der (den) entsprechenden Expressions-Kontroll-Sequenz(en) gekoppelt, einschließlich, zum Beispiel, einem Promotor, um die mRNA-Transkription zu veranlassen. Vertreter solcher Promotoren beinhalten den PL-Promotor des Phagen Lambda, die E. coli lac-, trp- und tac-Promotoren, die frühen und späten Promotoren von SV40 und die Promotoren der retroviralen LTRs, um gerade mal einige wenige der gut bekannten Promotoren zu bezeichnen. Es ist so zu verstehen, dass zahlreiche Promotoren, die für die Verwendung in diesem erfindungsgemäßen Aspekt geeignet sind und nicht erwähnt sind, gut bekannt sind und von den Fachleuten auf die Art und Weise, die durch die hierin vorliegende Diskussion und die Beispiele veranschaulicht ist, leicht verwendet werden können.
Im Allgemeinen enthalten Expressions-Konstrukte Stellen für die Initiation und die Termination der Transkription und innerhalb der transkribierten Region eine Ribosomen-Bindungsstelle für die Translation. Der codierende Teil des reifen Transkripts, das durch die Konstrukte exprimiert wird, beinhaltet am Anfang ein Translations-Initiations-AUG und ein Terminationscodon, das in angemessener Weise am Ende des zu translatierenden Polypeptids positioniert ist.
Zusätzlich können die Konstrukte Kontrollregionen enthalten, die die Expression sowohl regulieren als auch erzeugen. Im Allgemeinen funktionieren solche Regionen in Übereinstimmung mit vielen allgemein praktizierten Verfahren durch Kontrolle der Transkription, wie unter anderem als Repressor-Bindungsstellen und Enhancer.
Vektoren für die Vermehrung und Expression beinhalten im Allgemeinen selektierbare Marker. Solche Marker können auch zur Amplifikation geeignet sein oder die Vektoren können zusätzliche Marker für diesen Zweck enthalten. In dieser Hinsicht enthalten die Expressions-Vektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare(s) Markergen(e), um ein phänotypisches Merkmal für die Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen. Bevorzugte Marker beinhalten Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkulturen und Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgene für die Züchtung von E. coli und anderen Bakterien.
Der Vektor, der die entsprechende DNA-Sequenz enthält, wie hierin an anderer Stelle beschrieben, sowie einen entsprechenden Promotor und andere angemessene Kontrollsequenzen, kann in einen entsprechenden Wirt eingebracht werden, wobei eine Vielzahl von gut bekannten Verfahren verwendet werden können, die für die Expression eines gewünschten Polypeptids darin geeignet sind. Stellvertretende Beispiele von angemessenen Wirten beinhalten Bakterienzellen, wie E. coli, Streptomyces und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen, wie Hefezellen; Insektenzellen, wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9-Zellen; tierische Zellen, wie CHO, COS und Bowes-Melanom-Zellen; und Pflanzenzellen. Wirte für eine große Vielzahl von Expressions-Konstrukten sind gut bekannt und die Fachleute sind anhand der vorliegenden Offenbarung dazu in der Lage, leicht einen Wirt für die Expression eines Polypeptids in Übereinstimmung mit diesem erfindungsgemäßen Aspekt auszuwählen.
Mehr besonders beinhaltet die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte, wie Expressions-Konstrukte, die eine oder mehrere (der) Sequenz(en) umfassen, die vorstehend beschrieben sind. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie einen Plasmid- oder viralen Vektor, in den eine solche erfindungsgemäße Sequenz eingebracht worden ist. Die Sequenz kann in einer Vorwärts- oder Rückwärts-Orientierung eingebracht worden sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht umfasst das Konstrukt weiter regulatorische Sequenzen, einschließlich, zum Beispiel, einen Promotor, der funktionell mit der Sequenz gekoppelt ist. Den Fachleuten sind große Mengen geeigneter Vektoren und Promotoren bekannt und es gibt zahlreiche kommerziell erhältliche Vektoren, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Die nachfolgenden Vektoren, die kommerziell erhältlich sind, werden als Beispiele bereitgestellt. Unter den Vektoren, die zur Verwendung in Bakterien bevorzugt werden, sind pQE70, pQE60 und pQE9, die von Qiagen erhältlich sind; pBS-Vektoren, Phageskript-Vektoren, Blueskript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, erhältlich von Stratagene; und ptr1099a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, erhältlich von Pharmacia. Unter den bevorzugten eukaryontischen Vektoren sind pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, erhältlich von Stratagene; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, erhältlich von Pharmacia. Diese Vektoren sind ausschließlich zum Zweck der Veranschaulichung aus den zahlreichen kommerziell erhältlichen und gut bekannten Vektoren aufgelistet, die für die Fachleute zur Verwendung in Übereinstimmung mit diesem erfindungsgemäßen Aspekt erhältlich sind. Es ist willkommen, dass jedes beliebige andere Plasmid oder jeder Vektor, das (der) zum Beispiel für das Einbringen, die Erhaltung, die Vermehrung oder die Expression eines erfindungsgemäßen Polynucleotids oder Polypeptids in einen Wirt, in diesem erfindungsgemäßen Aspekt verwendet werden kann.
Promotor-Regionen können aus jedem beliebigen gewünschten Gen ausgewählt werden, wobei Vektoren verwendet werden, die eine Reporter-Transkriptionseinheit besitzen, der eine Promotor-Region fehlt, wie eine Chloramphenicol-acetyltransferase ("cat")-Transkriptionseinheit, stromabwärts der Restriktionsstelle oder -stellen zum Einbringen eines Kandidaten-Promotor-Fragments; d. h. ein Fragment, das einen Promotor enthalten kann. Wie gut bekannt ist, erzeugt das Einbringen eines Promotor-enthaltenden Fragments in die Restriktionsschnittstelle stromaufwärts des cat-Gens in den Vektor die Produktion von CAT-Aktivität, die mit Hilfe von Standard-CAT-Tests nachgewiesen werden kann. Vektoren, die an dieser Stelle geeignet sind, sind gut bekannt und leicht erhältlich. Zwei solche Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Somit beinhalten Promotoren zur Expression der erfindungsgemäßen Polynucleotide nicht nur gut bekannte und leicht erhältliche Promotoren, sondern auch Promotoren, die unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens leicht erhalten werden können, wobei ein Reportergen verwendet wird.
Unter den bekannten bakteriellen Promotoren, die zur Expression von Polynucleotiden und Polypeptiden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind die E. coli lacI- und lacZ-Promotoren, die T3- und T7-Promotoren, der gpt-Promotor, die lambda-PR, PL-Promotoren und der trp-Promotor. Unter bekannten eukaryontischen Promotoren, die in dieser Hinsicht geeignet sind, sind der CMV sofortige frühe Promotor (immediate early promoter), der HSV-Thymidinkinase-Promotor, die frühen und späten SV40-Promotoren, die Promotoren der retroviralen LTRs, wie diejenigen des Rous-Sarcom-Virus ("RSV") und Metallothionein-Promotoren, wie der Maus-Metallothionein-I-Promotor. Die Auswahl an angemessenen Vektoren und Promotoren für Expression in einer Wirtszelle ist ein gut bekanntes Verfahren und die erforderlichen Verfahren zur Expressionsvektor-Konstruktion, das Einbringen des Vektors in den Wirt und die Expression in dem Wirt sind Routineverfahren im Stand der Technik.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten, die vorstehend diskutiert wurden. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle sein, wie eine Säugerzelle oder eine niedere eukaryontische Zelle sein, wie eine Hefezelle oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein, wie eine Bakterienzelle.
Das Einbringen des Konstrukts in die Wirtszelle kann mit Hilfe von Kalziumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextranvermittelter Transfektion, kationisches Lipid-vermittelter Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder andere Verfahren bewirkt werden. Solche Verfahren sind in vielen Standard-Laborhandbüchern beschrieben, wie Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, (1986). Konstrukte in Wirtszellen können in einer herkömmlichen Art und Weise verwendet werden, um das Genprodukt herzustellen, das von der rekombinanten Sequenz codiert wird. Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Polypeptide mit Hilfe von herkömmlichen Peptid-Syntheseautomaten synthetisch hergestellt werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch verwendet werden, um solche Proteine herzustellen, wobei RNAs verwendet werden, die von den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten abstammen. Geeignete Clonierungs- und Expressions-Vektoren zur Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten sind beschrieben von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).
Im Allgemeinen beinhalten rekombinante Expressions-Vektoren Replikationsursprünge, einen Promotor, der von einem stark exprimierten Gen stammt, um die Transkription einer stromabwärts liegenden strukturellen Sequenz zu veranlassen und einen selektierbaren Marker, um die Isolierung von Vektorenthaltenden Zellen nach Aufnahme des Vektors zu erlauben. Unter geeigneten Promotoren sind diejenigen, die von den Genen abstammen, die glycolytische Enzyme codieren, wie 3-Phosphoglyceratkinase ("PGK"), a-Faktor, saure Phosphatase und Hitzeschock-Proteine, unter anderen. Selektionierbare Marker beinhalten das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das trp1-Gen von S. cerevisiae.
Die Transkription der DNA, die die erfindungsgemäßen Polypeptide codiert, durch höhere Eukaryonten, kann durch Einfügen einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, gewöhnlich von etwa 10 bis 300 bp, die in einem bestimmten Wirts-Zelltyp wirken, um die Transkriptions-Aktivität eines Promotors zu erhöhen. Beispiele für Enhancer beinhalten den SV40-Enhancer, der auf der späten Seite des Replikationsursprungs an den bp 100 bis 270 lokalisiert ist, der frühe Promotor-Enhancer des Cytomegalie-Virus, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und der Adenovirus-Enhancer.
Erfindungsgemäße Polynucleotide, die die heterologe strukturelle Sequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids codieren, werden im Allgemeinen unter Verwendung von Standard-Verfahren in den Vektor eingebracht, sodass diese zur Expression funktionell mit dem Promotor gekoppelt sind. Das Polynucleotid wird so positioniert, dass die Transkriptions-Startstelle in geeigneter Weise 5' zu einer Ribosomen-Bindungsstelle lokalisiert ist. Die Ribosomen-Bindungsstelle liegt 5' zu dem AUG, das die Translation des zu exprimierenden Polypeptids initiiert. Im Allgemeinen gibt es keine anderen offenen Leserahmen, die mit einem Initiationscodon beginnen, gewöhnlich AUG, und liegen zwischen der Ribosomen-Bindungsstelle und dem Initiations-AUG. Im Allgemeinen gibt es auch ein Translations-Stop-Codon am Ende des Polypeptids, und es gibt ein Polyadenylierungssignal und ein Transkription-Terminationssignal, in geeigneter Anordnung am 3'-Ende der transkribierten Region.
Für die Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung können geeignete Sekretionssignale in dem exprimierten Polypeptid enthalten sein. Die Signale können endogen in Bezug auf das Polypeptid sein oder es können heterologe Signale sein.
Das Polypeptid kann in einer modifizierten Form exprimiert werden, wie als ein Fusionsprotein und kann nicht nur Sekretionssignale beinhalten, sondern auch zusätzlich heterologe funktionelle Regionen. Somit kann zum Beispiel eine Region aus zusätzlichen Aminosäuren, besonders geladene Aminosäuren, zu dem N-terminalen Ende des Polypeptids hinzugefügt werden, um die Stabilität und das Verharren (die Persistent) in der Wirtszelle, während der Aufreinigung oder während der nachfolgenden Handhabung und Aufbewahrung verbessern. Es kann auch eine Region an das Polypeptid angeheftet werden, um die Aufreinigung zu erleichtern. Solche Regionen können vor der endgültigen Herstellung des Polypeptids entfernt werden. Das Hinzufügen von Peptideinheiten an Polypeptide, um Sekretion oder Exkretion zu veranlassen, um Stabilität zu verbessern und Aufreinigung zu erleichtern, unter anderem, sind geläufig und Routineverfahren im Stand der Technik.
Geeignete prokaryontische Wirte zur Vermehrung, Erhaltung oder Expression von Polynucleotiden und Polypeptiden in Übereinstimmung mit der Erfindung beinhalten E. coli, Bacillus subtilis und Salmonella typhimurium. Verschiedene Arten von Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus sind geeignete Wirte in dieser Hinsicht. Darüber hinaus können viele andere Wirte, die den Fachleuten ebenfalls bekannt sind, in dieser Hinsicht verwendet werden.
Als ein repräsentatives, jedoch nicht einschränkendes Beispiel, können zweckmäßige Expressions-Vektoren zur Verwendung in Bakterien einen selektionierbaren Marker und den bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden stammen, die genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 umfassen (ATCC 37017). Solche kommerziellen Vektoren beinhalten zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese Teilbereiche des pBR322-"Rückgrats" werden mit einem entsprechenden Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nachfolgend der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Wachstum des Wirtsstammes auf eine angemessene Zelldichte, bei der der ausgewählte Promotor induzierbar ist, wird dieser durch entsprechende Mittel (z. B. Temperatur-Veränderung oder Einwirkung eines chemischen Induktors) induziert und die Zellen werden für einen weiteren Zeitraum gezüchtet. Typischerweise werden die Zellen dann durch Zentrifugation geerntet, mit Hilfe von physikalischen oder chemischen Mitteln aufgebrochen und die resultierenden Rohextrakte zur weiteren Aufreinigung erhalten. Mikrobielle Zellen, die für die Expression von Proteinen verwendet werden, können mit jedem beliebigen herkömmlichen Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftau-Zyklen, Ultraschallbehandlung, mechanisches Aufbrechen oder durch Verwendung von Mitteln, die Zellen lysieren, wobei solche Verfahren den Fachleuten gut bekannt sind.
Verschiedene Säuger-Zellkultursysteme können ebenfalls für die Expression verwendet werden. Beispiele für Säuger-Expressionssysteme beinhalten die COS-7-Linien der Affen-Nieren-Fibroblasten, die von Gluzman et al., Cell, 23: 175 (1981) beschrieben wurden. Andere Zelllinien, die in der Lage sind einen passenden Vektor zu exprimieren, beinhalten zum Beispiel die C127, 3T3, CHO, HeLa, Menschliche Nieren 293 und BHK-Zelllinien.
Säuger-Expressions-Vektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch alle notwendigen Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleiss-Donor- und Akzeptor-Stellen, Transkriptions-Terminations-Sequenzen und 5'-flankierende nicht transkribierte Sequenzen, die für die Expression notwendig sind. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht werden DNA-Sequenzen von den SV40-Spleiss-Stellen und den SV40-Polyadenylierungsstellen für die erforderlichen nicht transkribierten genetischen Elemente dieses Typs verwendet.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen unter Verwendung von gut bekannten Verfahren gewonnen und aufgereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie. Am meisten bevorzugt wird Hochdurchsatz-Flüssigkeitschromatographie ("HPLC") zur Aufreinigung verwendet. Gut bekannte Verfahren zur Zurückfaltung des Proteins können verwendet werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der Isolierung und/oder Aufreinigung denaturiert wird.
Erfindungsgemäße Polypeptide beinhalten natürlicherweise aufgereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Synthese-Verfahren und Produkte, die mit Hilfe von rekombinanten Verfahren aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt hergestellt wurden, einschließlich zum Beispiel Bakterien, Hefe, höhere Pflanzen, Insekten und Säugerzellen. In Abhängigkeit von dem Wirt, der in einem rekombinanten Herstellungs-Verfahren verwendet wird, kann das erfindungsgemäße Polypeptid glycosyliert oder nicht glycosyliert sein. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch einen initialen modifizierten Methioninrest beinhalten, in einigen Fällen als ein Ergebnis von Wirtvermittelten Prozessen.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Polypeptide können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, insbesondere diejenigen, die sich die chemischen und biologischen Eigenschaften von TNF-delta und TNF-epsilon zu Nutze machen. Unter diesen sind Anwendungen bei der Apoptose von transformierten Zelllinien, die Vermittlung von Zellaktivierung und Proliferation und primäre Mediatoren der Immunregulation antimikrobieller, antiviraler und inflammatorischer Antwort-Suszeptibilität von Genen. Zusätzliche Verwendungen betreffen die Diagnose und Behandlung von Funktionsstörungen von Zellen, Geweben und Organismen. Diese Aspekte der Erfindung werden durch die nachfolgende Diskussion weiter veranschaulicht.
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Polynucleotide, um komplementäre Polynucleotide nachzuweisen, wie zum Beispiel als ein diagnostisches Mittel. Nachweis einer mutierten Form eines erfindungsgemäßen Polypeptids, das mit einer Fehlfunktion assoziiert ist, stellt ein diagnostisches Werkzeug bereit, das eine Diagnose einer Erkrankung oder eine Suszeptibilität für eine Erkrankung hinzufügen oder definieren kann, was von einer verringerten Expression, verstärkten Expression oder veränderten Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids resultiert, wie zum Beispiel neoplastische Veränderungen, wie Tumoren.
Individuen, die Mutationen in einem erfindungsgemäßen Gen tragen, können mit einer Vielzahl von Verfahren auf DNA-Ebene nachgewiesen werden. Nucleinsäuren für die Diagnose können aus den Zellen eines Patienten erhalten werden, wie aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie- und Autopsie-Material. Die genomische DNA kann direkt für den Nachweis verwendet werden oder kann enzymatisch amplifiziert werden, indem vor der Analyse eine PCR verwendet wird. PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 1986). RNA oder cDNA kann ebenfalls auf die gleiche Art verwendet werden. Als ein Beispiel können PCR-Primer verwendet werden, die zu den Nucleinsäuren komplementär sind, die TNF-delta oder TNF-epsilon codieren, um TNF-delta oder TNF-epsilon Expression und Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Deletionen und Insertionen können zum Beispiel durch eine Veränderung in der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit dem normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können identifiziert werden, indem amplifizierte DNA mit radioaktiv markierter TNF-delta- oder TNF-epsilon-RNA oder alternativ dazu mit radioaktiv markierten TNF-delta- oder TNF-epsilon-Antisense-DNA-Sequenzen hybridisiert werden. Perfekt übereinstimmende Sequenzen können von Doppelsträngen mit Fehlpaarungen durch RNaseA-Spaltung oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Sequenzunterschiede zwischen einem Referenzgen und Genen, die Mutationen tragen, können auch durch direkte DNA-Sequenzierung aufgedeckt werden. Zusätzlich können clonierte DNA-Abschnitte als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA-Abschnitte nachzuweisen. Die Sensitivität solcher Verfahren kann durch geeignete Verwendung von PCR oder einem anderen Amplifikations-Verfahren in hohem Maße verstärkt werden. Ein Sequenzierungs-Primer wird zum Beispiel mit einem doppelsträngigen PCR-Produkt oder einem einzelsträngigen Matrizen-Molekül verwendet, das durch eine modifizierte PCR erzeugt wurde. Die Sequenzbestimmung wird mit Hilfe herkömmlicher Verfahren mit radioaktiv markiertem Nucleotid oder durch automatische Sequenzierungs-Verfahren mit fluoreszierenden Kennzeichnungen (tag) durchgeführt.
Die genetische Testung, die auf DNA-Sequenz-Unterschieden beruht, kann durch den Nachweis einer Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen, mit oder ohne denaturierende Reagenzien, erreicht werden. Kleine Sequenz-Deletionen und -Insertionen können mit Hilfe von hochauflösender Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente unterschiedlicher Sequenzen können in denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, in denen die Mobilitäten unterschiedlicher DNA-Fragmente im Gel an verschiedenen Positionen entsprechend ihrem spezifischen Schmelzen oder ihren partiellen Schmelztemperaturen zurückgehalten werden (siehe z. B. Myers et al., Science, 230: 1242, 1985).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuclease-Protektionstests, wie RNase- und S1-Protektion oder das chemische Spaltungsverfahren (z. B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397–4401, 1985) offen gelegt werden. Somit kann der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren wie Hybridisierung, RNase-Protektion, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (z. B. Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus; "RFLP") und Southern-Blot von genomischer DNA erreicht werden. Zusätzlich zu den mehr geläufigen Elektrophorese- und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch mit in situ-Analysen nachgewiesen werden.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auch für die Identifizierung von Chromosomen nützlich. Die Sequenz ist spezifisch auf eine bestimmte Stelle auf einem einzelnen menschlichen Chromosom gerichtet und kann daran hybridisieren. Darüber hinaus gibt es einen aktuellen Bedarf für die Identifizierung bestimmter Stellen auf dem Chromosom. Gegenwärtig sind wenige Chromosomen-markierende Reagenzien erhältlich, die auf aktuellen Sequenzdaten beruhen (repeat-Polymorphismen; Wiederholungseinheiten-Polymorphismen). Das Kartieren von DNAs auf Chromosomen in Einklang mit der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheit assoziiert sind.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht wird die hierin offenbarte cDNA verwendet, um genomische DNA eines erfindungsgemäßen Gens zu clonieren. Das kann erreicht werden, indem eine Vielzahl gut bekannter Verfahren und Bibliotheken verwendet werden, die im Allgemeinen kommerziell erhältlich sind. Die genomische DNA wird dann für die in situ Chromosomen-Kartierung verwendet, wobei für diesen Zweck gut bekannte Verfahren verwendet werden. Üblicherweise kann in Übereinstimmung mit Routineverfahren für die Chromosomenkartierung einiges Ausprobieren erforderlich sein, um eine genomische Sonde zu identifizieren, die ein gutes in situ-Hybridisierungsignal bereitstellt.
In einigen Fällen können zusätzlich Sequenzen auf Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise 15 bis 25 bp) von der cDNA hergestellt werden. Computeranalyse der 3'-nichttranslatierten Region des Gens wird verwendet, um schnell Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon innerhalb der genomischen DNA umfassen, wobei das Amplifikations-Verfahren verkompliziert wird. Diese Primer werden dann zur PCR-Durchmusterung somatischer Zellhybride verwendet, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur diejenigen Hybride ergeben ein amplifiziertes Fragment, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht.
PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist ein schnelles Verfahren, um eine bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuordnen. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung kann mit den gleichen Oligonucleotid-Primern mit Spuren von Fragmenten spezifischer Chromosomen oder durch Zusammenschluss großer genomischer Clone auf eine ähnliche Art und Weise eine Sublokalisation erhalten werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher Weise verwendet werden können, um sie auf ihr Chromosom zu kartieren, beinhalten in situ-Hybridisierung, Vorscreening (Prä-Durchmusterung) mit markierten Durchfluss-sortierten Chromosomen und Vorauswahl durch Hybridisierung, wobei Chromosomen-spezifische cDNA-Bibliotheken erzeugt werden.
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung ("FISH") eines cDNA-Clons auf eine chromosomale Metaphase-Ausbreitung kann verwendet werden, um eine genaue chromosomale Lokalisation mit einem Schritt bereitzustellen. Dieses Verfahren kann mit cDNA durchgeführt werden, die nicht größer ist als 50 oder 60. Als Übersicht für dieses Verfahren siehe Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques. Pergamon Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz auf eine genaue chromosomale Stelle kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den Daten der genetischen Karte in Bezug gesetzt werden. Solche Daten werden zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man beschrieben, erhältlich online (über das Internet) über die Johns Hopkins University, Welch Medical Library. Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die auf die gleiche chromosomale Region kartiert wurden, wird dann durch Kopplungsanalysen (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Als nächstes ist es notwendig die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Falls eine Mutation in einigen oder allen betroffenen Individuen beobachtet wird, jedoch in keinem normalen Individuum, dann ist die Mutation wahrscheinlich der Auslöser der Erkrankung.
Bei der gegenwärtigen Auflösung physikalischer Kartierungs- und genetischer Kartierungs-Verfahren könnte eine cDNA, die genau auf einen chromosomalen Bereich lokalisiert wurde, der mit der Erkrankung assoziiert ist, eines von zwischen 50 und 500 potentiell verursachenden Genen sein. (Das setzt 1 Megabase Kartierungs-Auflösung und 1 Gen pro 20 kb voraus).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch diagnostische Tests, wie quantitative und diagnostische Tests zum Nachweis von Spiegeln eines Proteins in der vorliegenden Erfindung in Zellen und Geweben, einschließlich die Bestimmung normaler und anormaler Spiegel. Somit kann zum Beispiel ein diagnostischer Test in Übereinstimmung mit der Erfindung zum Nachweis der Überexpression von erfindungsgemäßem TNF-Protein verglichen mit normalen Kontrollgewebe-Proben verwendet werden, um die Anwesenheit von zum Beispiel Neoplasie nachzuweisen. Testverfahren, die verwendet werden können, um Spiegel eines Poteins zu bestimmen, wie ein erfindungsgemäßes Protein, in einer Probe, die von einem Wirt abstammt, sind den Fachleuten gut bekannt. Solche Testverfahren beinhalten Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western Blot-Analyse und ELISA-Tests. Unter diesen werden ELISAs häufig bevorzugt. Ein ELISA-Test umfasst anfänglich die Herstellung eines Antikörpers, der für ein erfindungsgemäßes Protein spezifisch ist, vorzugsweise ein monoclonaler Antikörper. Zusätzlich wird im Allgemeinen ein Reporter-Antikörper (Nachweis-Antikörper) hergestellt, der an den monoclonalen Antikörper bindet. Der Reporter-Antikörper wird an ein nachweisbares Reagenz angeheftet, wobei dieses radioaktiv, fluoreszierend oder enzymatisch ist, wobei es sich in diesem Beispiel um Meerrettich-Peroxidase-Enzym handelt.
Um einen ELISA-Test durchzuführen wird eine Probe von einem Wirt entfernt und auf einem festen Träger inkubiert, z. B. einer Polystyrol-Platte, die die Proteine in der Probe bindet. Jede freie Proteinbindungsstelle auf der Platte wird dann durch Inkubation mit einem nicht-spezifischen Protein, wie Rinder-Serum-Albumin, bedeckt. Als nächstes wird der monoclonale Antikörper auf der Platte inkubiert, während dieser Zeit binden die monoclonalen Antikörper an jedes erfindungsgemäße Protein, das auf die Polystyrol-Platte aufgebracht ist. Nichtgebundener monoclonaler Antikörper wird mit Puffer ausgewaschen. Der Reporter-Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist, wird auf die Platte gegeben, was in der Bindung des Reporter-Antikörpers mit jedem monoclonalen Antikörper resultiert, der an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden hat. Nichtgebundener Reporter-Antikörper wird dann ausgewaschen. Die Reagenzien für die Peroxidase-Aktivität, einschließlich ein colorimetrisches Substrat, werden dann auf die Platte gegeben. Immobilisierte Peroxidase, durch die primären und sekundären Antikörper an erfindungsgemäßes Protein gekoppelt, produziert ein gefärbtes Reaktionsprodukt. Die Menge an Farbe, die sich in einem bestimmten Zeitraum entwickelt, gibt die Menge an erfindungsgemäßem Protein an, die in der Probe vorliegt. Quantitative Ergebnisse werden im Allgemeinen durch Bezugnahme auf eine Standardkurve erhalten.
Es kann ein Kompetitionstest verwendet werden, worin Antikörper, die für erfindungsgemäßes Protein spezifisch sind, an einen festen Träger gekoppelt sind und markiertes erfindungsgemäßes Protein und eine Probe, die von dem Wirt abstammt, über den festen Träger geschickt werden und die Menge an Markierung, die an den festen Träger gekoppelt nachgewiesen wird, kann mit einer Menge an erfindungsgemäßem Protein in der Probe korreliert werden.
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoge davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper dagegen herzustellen. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper, sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressions-Bibliothek. Verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können für die Herstellung solcher Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt wurden, die einer erfindungsgemäßen Sequenz entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier erhalten werden oder durch Verabreichung der Polypeptide an ein Tier, vorzugsweise kein Mensch. Der so erhaltene Antikörper wird dann die Polypeptide selbst binden. Auf diese Art und Weise kann sogar eine Sequenz verwendet werden, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, um Antikörper zu erzeugen, die die vollständigen nativen Polypeptide binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus Gewebe zu isolieren, die dieses Polypeptid exprimieren.
Für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann jedes Verfahren verwendet werden, das Antikörper bereitstellt, die durch fortlaufende Züchtung von Zelllinien produziert werden. Beispiele beinhalten das Hybridom-Verfahren (Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256: 495–497 (1975)), das Triom-Verfahren, das menschliche B-Zell-Hybridom-Verfahren (Kozbor et al., Immunology Today, 4: 72 (1983)) und das EBV-Hybridom-Verfahren, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole et al., S. 77–96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc. (1985)).
Verfahren, die für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben sind (U.S.-Patent-Nr. 4.946.778) können angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene erfindungsgemäße Polypeptid-Produkte herzustellen.
Die vorstehend beschriebenen Antikörper können verwendet werden, um Clone zu isolieren oder zu identifizieren, die das Polypeptid exprimieren oder um das erfindungsgemäße Polypeptid durch Anheftung des Antikörpers an einen soliden Träger zur Isolierung und/oder Reinigung anhand von Affinitäts-Chromatographie aufzureinigen.
Somit können die erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet werden, um Neoplasie, wie Tumorzellwachstum, zu hemmen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in bestimmten Zellen für die Tumor-Vernichtung durch Apoptose und Zytotoxizität verantwortlich sein. Die erfindungsgemäßen Polypeptide induzieren auch die Hochregulation von Adhäsionszellen, zum Beispiel LFA-1, deshalb können sie für die Wundheilung verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die verstärkte Wachstumsaktivität benötigen, zum Beispiel Restenose, da die erfindungsgemäßen Polypeptide Proliferationswirkung für Zellen von endothelialem Ursprung haben. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können deshalb auch verwendet werden, um Hämatopoese während der Endothelzell-Entwicklung zu regulieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide stimulieren auch die Aktivierung von T-Zellen und können deshalb verwendet werden, um eine Immunantwort gegen eine Vielzahl von parasitären, bakteriellen und viralen Infektionen zu stimulieren. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in dieser Hinsicht auch verwendet werden, um autoreaktive T-Zellen zu eliminieren, um Autoimmunerkrankungen zu behandeln und/oder zu verhindern. Ein Beispiel für eine Autoimmunerkrankung ist Typ I-Diabetes.
Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifikation von Molekülen, wie Rezeptor-Moleküle, die die erfindungsgemäßen Proteine binden. Gene, die Proteine codieren, die die erfindungsgemäßen Proteine binden, wie Rezeptor-Proteine, können mit zahlreichen Verfahren identifiziert werden, die den Fachleuten bekannt sind, zum Beispiel, Liganden-Schwenken (Liganden-panning) und FACS-Sortierung. Solche Verfahren sind in zahlreichen Labor-Handbüchern beschrieben, wie zum Beispiel, Coligan et al., Current Protocols in Immunology I(2): Kapitel 5 (1991).
Für diesen Zweck kann zum Beispiel Expressions-Clonierung verwendet werden. Zu diesem Zweck wird polyadenylierte RNA von einer Zelle hergestellt, die für die erfindungsgemäßen Proteine responsiv ist, von dieser RNA wird eine cDNA-Bibliothek erzeugt, die Bibliothek wird in Zusammenschlüsse (pools) aufgeteilt und die Zusammenschlüsse werden vereinzelt in Zellen transfiziert, die für die erfindungsgemäßen Proteine nicht responsiv sind. Die transfizierten Zellen werden dann markierten erfindungsgemäßen Proteinen ausgesetzt. Die erfindungsgemäßen Proteine können mit Hilfe einer Vielzahl gut bekannter Verfahren markiert sein, einschließlich der Standard-Verfahren mit Hilfe von Radio-Iodierung oder Einbeziehung einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nachfolgend der Exposition werden die Zellen fixiert und die Bindung von Cytostatin wird bestimmt. Diese Verfahren werden in geeigneter Weise auf Glas-Objektträgern durchgeführt.
Zusammenschlüsse werden nach cDNA identifiziert, die TNF-delta- oder TNF-epsilon-bindende Zellen produzierten. Unter-Zusammenschlüsse werden von diesen positiven hergestellt, in Wirtszellen transfiziert und wie vorstehend beschrieben durchmustert. Unter Verwendung eines sich wiederholenden Unter-Zusammenschließens und erneutem Durchmusterungs-Verfahren kann einer oder können mehrere einzelne Clone isoliert werden, die das mutmaßliche bindende Molekül codieren, wie ein Rezeptormolekül.
Alternativ dazu kann ein markierter Ligand mit Hilfe von Photoaffinität an einen Zellextrakt, wie eine Membran oder ein Membranextrakt gekoppelt werden, der hergestellt wurde von Zellen, die ein Molekül exprimieren, das daran bindet, wie ein Rezeptor-Molekül. Überkreuz-vernetztes Material wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt und mit einem X-Ray-Film exponiert. Der markierte Komplex, der den Liganden-Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten werden, in Peptid-Fragmente aufgetrennt werden und einer Protein-Microsequenzierung unterzogen werden. Die Aminosäuresequenz, die anhand der Microsequenzierung erhalten wurde, kann verwendet werden, um einzigartige oder degenerierte Oligonucleotid-Sonden zu entwerfen, um cDNA-Bibliotheken zu durchmustern, um Gene zu identifizieren, die das vermeintliche Rezeptor-Molekül codieren.
Erfindungsgemäße Polypeptide können auch verwendet werden, um TNF-delta- oder TNF-epsilon-Bindungsfähigkeit von TNF-delta- oder TNF-epsilon-Bindemolekülen, wie Rezeptor-Moleküle, in Zellen oder zellfreien Präparationen festzustellen. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen bereit, um diejenigen zu identifizieren, die die Wirkung von TNF-delta oder TNF-epsilon auf Zellen verstärken oder blockieren, wie deren Interaktion mit TNF-delta- oder TNF-epsilon-Bindemolekülen, wie Rezeptor-Molekülen. Ein Agonist ist eine Verbindung, die die natürlichen biologischen Funktionen von erfindungsgemäßen Polypeptiden erhöht oder die auf eine Art und Weise funktioniert, die der der erfindungsgemäßen Polypeptide ähnlich ist, während Antagonisten solche Funktionen erniedrigen oder ausschalten.
Zum Beispiel ein zelluläres Kompartiment, wie eine Membran oder eine Präparation davon, wie eine Membran-Präparation, kann von einer Zelle hergestellt werden, die ein Molekül exprimiert, das TNF-delta oder TNF-epsilon bindet, wie ein Molekül eines Signal-Transduktionswegs oder eines regulatorischen Signalwegs, der durch TNF-delta oder TNF-epsilon moduliert wird. Die Präparation wird in Abwesenheit oder in Anwesenheit von einem Kandidaten-Molekül mit markiertem TNF-delta oder TNF-epsilon inkubiert, das ein TNF-delta oder TNF-epsilon Agonist oder Antagonist sein kann. Die Fähigkeit des Kandidaten-Moleküls das bindende Molekül zu binden wird in der erniedrigten Bindung des markierten Liganden reflektiert. Moleküle, die kostenlos binden, d. h. ohne die Wirkungen von TNF-delta oder TNF-epsilon auf die Bindung des TNF-delta- oder TNF-epsilon-bindenden Moleküls zu induzieren, sind höchst wahrscheinlich gute Antagonisten. Moleküle, die gut binden und Wirkungen auslösen, die die gleichen sind oder nah verwandt sind mit TNF-delta oder TNF-epsilon, sind Agonisten.
TNF-delta- oder TNF-epsilon-ähnliche Wirkungen potentieller Agonisten und Antagonisten können gemessen werden, zum Beispiel durch Bestimmung der Aktivität eines second messenger-Systems, nachfolgend der Interaktion des Kandidaten-Moleküls mit einer Zelle oder einer geeigneten Zellpräparation und Vergleich der Wirkung mit der von TNF-delta oder TNF-epsilon oder mit Molekülen, die die gleichen Wirkungen wie TNF-delta oder TNF-epsilon auslösen. Second messenger-Systeme, die in dieser Hinsicht zweckmäßig sind, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf AMP Guanylatcyclase, Ionenkanal- oder Phosphoinositid-Hydrolysesecond messenger-Systeme.
Ein anderes Beispiel eines Tests für TNF-delta- oder TNF-epsilon-Antagonisten ist ein kompetitiver Test, der TNF-delta oder TNF-epsilon und einen potentiellen Antagonisten mit Membran-gebundenem TNF-delta oder TNF-epsilon Rezeptor-Molekülen oder rekombinanten TNF-delta- oder TNF-epsilon-Rezeptor-Molekülen unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Hemmungstest kombiniert. TNF-delta oder TNF-epsilon können markiert sein, wie mit Radioaktivität, sodass die Anzahl von TNF-delta- oder TNF-epsilon-Molekülen, die an ein Rezeptor-Molekül gebunden sind, genau bestimmt werden kann, um die Wirksamkeit des potentiellen Antagonisten zu beurteilen.
Potentielle Antagonisten beinhalten kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid binden und dabei dessen Aktivität hemmen oder abschalten. Potentielle Antagonisten können auch kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid, wie ein nah verwandtes Protein oder Antikörper sein, der an die gleiche Stelle eines bindenden Moleküls, wie ein Rezeptor-Molekül, bindet, ohne TNF-delta- oder TNF-epsilon-induzierte Aktivitäten zu induzieren, wobei die Wirkung eines erfindungsgemäßen Polypeptids verhindert wird, indem ausgeschlossen wird, dass dieses an seinen Rezeptor bindet.
Ein anderer potentieller Antagonist ist eine lösliche Form des TNF-delta- oder TNF-epsilon-Rezeptors, die an TNF-delta oder TNF-epsilon bindet und dieses daran hindert mit den Membran-gebundenen TNF-delta- oder TNF-epsilon-Rezeptoren zu interagieren. Auf diese Art und Weise werden die Rezeptoren nicht durch ihren Liganden stimuliert.
Potentielle Antagonisten beinhalten ein kleines Molekül, das die Bindungsstelle des Polypeptids bindet und besetzt, wobei die Bindung an zelluläre bindende Moleküle, wie an Rezeptor-Moleküle, verhindert wird, sodass die normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für kleine Moleküle beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kleine organische Moleküle, Peptide oder Nicht-Peptid-Antagonisten.
Andere potentielle Antagonisten beinhalten Antisense-Moleküle. Die Antisense-Technologie kann verwendet werden, um mit Hilfe von Antisense-DNA oder -RNA oder durch dreifach Helix-Bildung Genexpression zu kontrollieren. Antisense-Verfahren sind diskutiert, zum Beispiel in Okano, J. Neurochem., 56: 560, 1991; Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRP Press, Boca Raton, FL (1988). Dreifach Helix-Bildung ist zum Beispiel diskutiert in Lee et al., Nucleic Acids Research, 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991). Die Verfahren basieren auf der Bindung eines Polynucleotids an eine komplementäre DNA oder RNA. Zum Beispiel der 5'-codierende Bereich eines Polynucleotids, das das reife erfindungsgemäße Polypeptid codiert, kann verwendet werden, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird entworfen, um für eine Region des Gens komplementär zu sein, die bei der Transkription beteiligt ist, wobei die Transkription und die Herstellung von TNF-delta oder TNF- epsilon verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in TNF-delta- oder TNF-epsilon-Polypeptid. Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen verabreicht werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids zu unterdrücken.
Die Antagonisten können in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verwendet werden, z. B. wie hierin nachfolgend beschrieben.
Die Antagonisten können zum Beispiel verwendet werden, um Kachexie (Auszehrung, Abmagerung) zu behandeln, was ein fettabbauender Defekt ist, der aus einer systemischen Defizienz an Lipoprotein-Lipase resultiert, der durch TNF-delta oder TNF-epsilon unterdrückt wird. Die Antagonisten können auch verwendet werden, um cerebrale Malaria zu behandeln, bei der erfindungsgemäße Polypeptide eine pathogene Rolle zu spielen scheinen. Die Antagonisten können auch verwendet werden, um durch Hemmung TNF-delta oder TNF-epsilon induzierter Produktion inflammatorischer Zytokine, wie IL1 in den Synovialiszellen, rheumatoide Arthritis zu behandeln. Zur Behandlung von Arthritis werden die erfindungsgemäßen Polypeptide vorzugsweise intra-artikulär injiziert (in das Gelenk injiziert).
Die Antagonisten können auch verwendet werden, um die Transplantat-Abstoßung zu verhindern, indem sie die Stimulation des Immunsystems in Anwesenheit eines Transplantats verhindern.
Die Antagonisten können auch verwendet werden, um den Knochenabbau zu hemmen und deshalb, um Osteoporose zu behandeln und/oder zu verhindern.
Die Antagonisten können auch als anti-inflammatorische Mittel verwendet werden und um endotoxischen Schock zu behandeln. Dieser kritische Zustand resultiert aus einer überhöhten Antwort auf bakterielle Infektion und Infektionen anderer Art.
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die das vorstehend diskutierte Polynucleotid oder die Polypeptide oder die Agonisten oder Antagonisten umfassen. Somit können die erfindungsgemäßen Polypeptide in Kombination mit einem nicht sterilen oder sterilen Träger oder Trägern verwendet werden, zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen, wie ein pharmazeutisch verträglicher Träger für die Verabreichung an ein Subjekt (eine Testperson). Solche Zusammensetzungen umfassen zum Beispiel einen Medienzusatz oder eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Bindemittel. Solche Träger können beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, physiologische Kochsalzlösung, gepufferte physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte an die Art der Verabreichung angepasst sein.
Die Erfindung betrifft weiter pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren Bestandteilen der vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gefüllt sind. Zugehörig zu (einem) solchen Behälter(n) kann eine Mitteilung in Form einer Vorschrift durch eine Regierungsbehörde sein, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten regelt, was die Genehmigung durch die Behörde zur Herstellung, Verwendung oder den Verkauf des Produkts für die Verabreichung an Menschen genehmigt.
Polypeptide und andere erfindungsgemäße Zusammensetzungen können alleine oder in Verbindung mit anderen Zusammensetzungen, wie therapeutische Zusammensetzungen, verwendet werden.
Die Arzneimittel können auf jede beliebige wirkungsvolle, herkömmliche Art und Weise verabreicht werden, einschließlich zum Beispiel Verabreichung durch topische, orale, anale, vaginale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale oder intradermal Wege, unter anderem. Die Arzneimittel werden im Allgemeinen in einer Menge verabreicht, die für die Behandlung oder Prophylaxe einer spezifischen Indikation oder spezifischer Indikationen wirkungsvoll ist. Im Allgemeinen werden die Arzneimittel in einer Menge von mindestens etwa 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht. In den meisten Fällen werden sie in einer Menge verabreicht, die nicht oberhalb von etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag liegt. Vorzugsweise beträgt in den meisten Fällen die Dosis von etwa 10 μg/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich. Dies soll so verstanden werden, dass die optimale Dosis mit Hilfe von Standard-Verfahren für jede Behandlungsmodalität und Indikation bestimmt wird, wobei die Indikation, deren Schwere, der Verabreichungsweg, verkomplizierende Zustände und ähnliches, berücksichtigt werden.
Die Polynucleotide, Polypeptide, Agonisten und Antagonisten, bei denen es sich um erfindungsgemäße Polypeptide handelt, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, indem solche Polypeptide in vivo exprimiert werden, in Behandlungsmodalitäten, die häufig als "Gentherapie" bezeichnet werden.
So können zum Beispiel Zellen von einem Patienten mit einem Polynucleotid, wie eine DNA oder RNA, das ein Polypeptid codiert, ex vivo gentechnisch verändert werden und die gentechnisch veränderten Zellen können dann einem Patienten bereitgestellt werden, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll. Es können zum Beispiel Zellen ex vivo durch die Verwendung eines retroviralen Plasmid-Vektors, der RNA enthält, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, gentechnisch verändert werden. Solche Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt und deren Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird durch die hierin vorliegenden Lehren offensichtlich.
In ähnlicher Weise können Zellen in vivo zur Expression eines Polypeptids in vivo durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gentechnisch manipuliert werden. Ein erfindungsgemäßes Polynucleotid kann zum Beispiel zur Expression in einem replikationsdefizienten retroviralen Vektor gentechnisch manipuliert werden, wie vorstehend diskutiert. Das retrovirale Expressionskonstrukt kann dann isoliert werden und in eine Verpackungszelle eingebracht werden, die mit einem retroviralen Plasmidvektor transduziert wurde, der RNA enthält, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, sodass die Verpackungszelle jetzt infektiöse Viruspartikel produziert, die das interessierende Gen enthalten. Diese Produzenten-Zellen können einem Patienten zur Expression des Polypeptids in vivo verabreicht werden, um Zellen in vivo gentechnisch zu verändern. Diese und andere Verfahren zur Verabreichung eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit Hilfe eines solchen Verfahrens sollten den Fachleuten aufgrund der Lehren der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein.
Retroviren, von denen die retroviralen Plasmid-Vektoren abstammen, die hierin vorstehend erwähnt wurden, können beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Moloney Murine Leukemia Virus, Milz-Mikrose-Virus, Retroviren, wie Rous Sarcoma Virus, Harvey Sarcoma Virus, Vogel-Leukose-Virus, Gibbon-Affen-Leukämie-Virus, menschliches Immundefizienz- Virus, Adenovirus, myeloproliferatives Sarcoma-Virus und Mamma-Tumor-Virus. In einer Ausführungsform stammt der retrovirale Plasmid-Vektor vom Moloney Murine Leukemia Virus ab.
Solche Vektoren beinhalten in angebrachter Weise einen oder mehrere Promotoren zur Expression des Polypeptids. Geeignete Promotoren, die zum Einsatz gelangen, können beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, den retroviralen LTR; den SV40-Promotor; und den menschlichen Cytomegalie-Virus (CMV)-Promotor, der in Miller et al., Biotechniques, 7: 980–990 (1989) beschrieben ist, oder irgendeinen anderen Promotor (z. B. zelluläre Promotoren, wie eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die Histon-, RNA-Polymerase III- und β-Aktin-Promotoren). Andere virale Promotoren, die zum Einsatz kommen können, beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, adenovirale Promotoren, Thymidinkinase-(TK)-Promotoren und B19-Parvovirus-Promotoren. Die Auswahl eines geeigneten Promotors wird dem Fachmann aus den hierin enthaltenen Lehren offensichtlich sein.
Die Nucleinsäuresequenz, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, wird unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors platziert. Geeignete Promotoren, die zum Einsatz kommen können, beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, adenovirale Promotoren, wie der hauptsächliche späte adenovirale Promotor; oder heterologe Promotoren, wie der Cytomegalie-Virus (CMV)-Promotor; der Respiratorisches-Syncytium-Virus (RSV)-Promotor; induzierbare Promotoren, wie der MMT-Promotor, der Metallothionein-Promotor; Hitzeschock-Promotoren; der Albumin-Promotor; der ApoAI-Promotor; menschliche Globin-Promotoren; virale Thymidinkinase-Promotoren, wie der Herpes simplex-Thymidinkinase-Promotor; retrovirale LTRs (einschließlich die modifizierten retroviralen LTRs, die hierin vorstehend beschrieben sind); der β-Aktin-Promotor; und menschliche Wachstumshormon-Promotoren. Der Promotor kann auch der native Promotor sein, der das Gen kontrolliert, das das Polypeptid codiert.
Der retrovirale Plasmid-Vektor wird verwendet, um Verpackungs-Zelllinien zu transduzieren, um Produzenten-Zelllinien zu erzeugen. Beispiele für Verpackungszellen, die transfiziert werden können, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, die PE501, PA317, Y-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCRIP, GP+E-86, GP+envAml2 und DAN-Zelllinien, wie in Miller A., Human Gene Therapy, 1: 5–14 (1990) beschrieben. Der Vektor kann mit jedem beliebigen Mittel, das im Stand der Technik bekannt ist, in die Verpackungszellen transduziert werden. Solche Mittel beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und CaPO₄-Präzipitation. Als eine Alternative kann der retrovirale Plasmid-Vektor in ein Liposom eingekapselt sein oder an ein Lipid gekoppelt sein und dann einem Wirt verabreicht werden.
Die Produzenten-Zelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektor-Partikel, die die Nucleinsäuresequenz(en) beinhalten, die die Polypeptide codiert. Solche retroviralen Vektor-Partikel können dann verwendet werden, um eukaryontische Zellen zu transduzieren, entweder in vitro oder in vivo. Die transduzierten eukaryontischen Zellen werden die Nucleinsäure-Sequenz(en) exprimieren, die das Polypeptid codieren. Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, embryonale Stammzellen, embryonale Karzinomzellen, sowie hämapoietische Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und bronchiale Epithelzellen.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben. Die Beispiele werden ausschließlich bereitgestellt, um die Erfindung durch Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen zu veranschaulichen. Diese erläuternden Beispiele, während sie bestimmte spezifische Aspekte der Erfindung veranschaulichen, stellen nicht die Eingrenzungen dar oder umschreiben den Schutzumfang der offenbarten Erfindung.
Alle Beispiele werden unter Verwendung von Standard-Verfahren durchgeführt, die den Fachleuten gut bekannt und Routine für diese sind, mit Ausnahme, wo dies ausführlich andersartig beschrieben ist. Routine-Molekularbiologie-Verfahren der nachfolgenden Beispiele können durchgeführt werden, wie in Standard-Labor-Handbüchern beschrieben, wie Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg.; Cold Spring Harabor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), hierin als "Sambrook" bezeichnet.
Alle Teile oder Mengen, die in den nachfolgenden Beispielen dargestellt sind, beziehen sich auf Gewicht, falls dies nicht andersartig spezifiziert ist. Falls nicht andersartig bezeichnet, wurde die Größenauftrennung von Fragmenten in den nachfolgenden Beispielen unter Verwendung von Standard-Verfahren der Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese ("PAGE") durchgeführt, wie in Sambrook und zahlreichen anderen Bezugnahmen, wie zum Beispiel Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980), beschrieben. Falls nicht anders beschrieben, wurden die Ligierungen unter Verwendung von Standard-Puffern, Inkubationstemperaturen und Zeiten durchgeführt, mit ungefähr äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente und ungefähr 10 Einheiten T4-DNA Ligase ("Ligase") pro 0,5 μg DNA.
Beipiel 1
Expression und Aufreinigung der löslichen Form von menschlichem TNF-delta und TNF-epsilon unter Verwendung von
Bakterien
Die DNA-Sequenz, die menschliches TNF-delta oder TNF-epsilon in dem hinterlegten Polynucleotid codiert, wurde unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die spezifisch sind für das carboxyterminale Aminosäureende der Sequenz von menschlichem TNF-delta- oder TNF-epsilon-Protein und den Vektorsequenzen in 3'-Richtung zu dem Gen. Zusätzliche Nucleotide, die Restriktionsschnittstellen enthalten, um das Clonieren zu erleichtern, wurden an die 5'- bzw. 3'-Sequenzen hinzugefügt.
Der 5'-Oligonucleotid-Primer hatte die Sequenz 5'-GCG GGA TCC CAG AGC CTC ACC ACA G-3', die die unterstrichene Restriktionsschnittstelle enthält, gefolgt von 16 Nucleotiden der codierenden Sequenz, die in den Figuren dargestellt ist, beginnend mit der 115ten Base des ATG-Codons.
Der 3'-Primer besitzt die Sequenz 5'-CGC AAG CTT ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC-3', enthält die unterstrichene HindIII-Restriktionsschnittstelle, gefolgt von 20 Nucelotiden, die komplementär zu den letzten 13 Nucleotiden der codierenden Sequenz sind, die in den 1 und 2 dargestellt ist, einschließlich des Stop-Codons.
Die Restriktionsschnittstellen waren passend für Restriktionsenzym-Schnittstellen in den bakteriellen Expressions-Vektoren pQE-9, die in diesen Beispielen zur bakteriellen Expression verwendet wurden. (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). pQE-9 codiert Ampicillin-Antibiotika-Resistenz ("Amp^r") und enthält einen bakteriellen Replikationsursprung ("ori"), einen IPTG-induzierbaren Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle ("RBS"), ein 6-His-tag und Restriktionsenzym-Schnittstellen.
Die amplifizierte menschliche TNF-delta DNA und der Vektor pQE-9 wurden beide mit BamHI und HindIII gespalten und die gespaltenen DNAs wurden dann miteinander ligiert. Die Inserierung der TNF-delta DNA in den gespaltenen pQE-9-Vektor platzierte die codierende Region von TNF-delta stromabwärts von und funktionell verknüpft mit dem IPTG-induzierbaren Promotor des Vektors und im Leseraster mit einem iniziierenden AUG, das in geeigneter Weise zur Translation von TNF-delta positioniert worden war.
Das Ligierungsgemisch wurde in kompetente E. coli-Zellen transformiert, wobei Standard-Verfahren verwendet wurden. Solche Verfahren sind beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). E. coli-Stamm M15/rep4, der zahlreiche Kopien des Plasmids pREP4 enthält, das den lac-Repressor exprimiert und Kanamycin-Resistenz ("Kan^r") vermittelt, wurde bei der Durchführung des hier beschriebenen veranschaulichenden Beispiel verwendet. Dieser Stamm, bei dem es sich um nur einen von zahlreichen handelt, die für die Expression von TNF-delta geeignet sind, ist kommerziell von Qiagen erhältlich. Transformanten wurden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, in Anwesenheit von Ampicillin auf LB-Platten zu wachsen. Plasmid-DNA wurde von resistenten Kolonien isoliert und die Identität der clonierten DNA wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt.
Clone, die die gewünschten Konstrukte enthalten, wurden über Nacht in Flüssigkultur in LB-Medien gezüchtet ("O/N"), die sowohl mit Ampicillin (100 μg/ml) als auch Kanamycin (25 μg/ml) angereichert waren. Die O/N-Kultur wurde verwendet, um eine große Kultur in einer Verdünnung von etwa 1 : 100 bis 1 : 250 zu überimpfen. Die Zellen wurden bis auf eine optische Dichte von zwischen 0,4 und 0,6 bei 600 nm ("OD₆₀₀") gezüchtet. Dann wurde Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid ("IPTG") bis auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben, um die Transkription des lac-Repressor-sensitiven Promotors zu induzieren, indem der lacI-Repressor inaktiviert wurde. Nachfolgend wurden die Zellen 3–4 Stunden weiter inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und mit Hilfe von Standard-Verfahren aufgebrochen. Von den aufgebrochenen Zellen wurden Einschlusskörper aufgereinigt, wobei Routine-Sammelverfahren verwendet wurden und das Protein wurde in 8 M Harnstoff aus den Einschlusskörpern solubilisiert. Die 8 M Harnstofflösung, die die solubilisierten Proteine enthielt, wurde in 2 × Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung ("PBS") über eine PD-10-Säule geschickt, wobei der Harnstoff entfernt wurde, der Puffer ausgetauscht wurde und das Protein zurückgefaltet wurde. Das Protein wurde mit einem weiteren Chromatographieschritt aufgereinigt, um Endotoxin zu entfernen. Dann wurde es steril filtriert. Die steril filtrierte Protein-Präparation wurde in einer Konzentration von 95 μg/ml in 2 × PBS aufbewahrt. Die Analyse der Präparation von TNF-delta mit Hilfe von Standard-Verfahren der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ließ erkennen, dass die Präparation etwa 80% Monomer enthielt, das das erwartete Molekulargewicht von ungefähr 20,8 kDa besitzt.
Das Protein wurde durch Chromatographie über eine Nickel-Gelat-Säule aufgereinigt, unter Bedingungen, die die Bindung des Typs Protein erlauben, der das 6-His-tag besitzt. Das Protein wird in 6-molarem Guanidinium HCl pH 5,0 von der Säule eluiert und renaturiert.
Beispiel 2
Clonierung und Expression von löslichem menschlicher TNF-delta und TNF-epsilon in einem Baculovirus-Expressions-System
Die cDNA-Sequenz, die das menschliche TNF-delta- oder TNF-epsilon-Protein von vollständiger Länge codiert, die aus dem hinterlegten Clon stammt, wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen:
Der 5'-Primer hat die Sequenz 5'-GCG GGA TCC CCA GAG CCT CAC CAC AG-3', die die unterstrichene BamHI-Restriktionsenzym-Schnittstelle enthält, gefolgt von 16 Basen der Sequenz von TNF-delta oder TNF-epsilon aus den 1 und 2. Inseriert in einen Expressions-Vektor, wie nachfolgend beschrieben, stellt das 5'-Ende des amplifizierten Fragments, das menschliches TNF-delta oder TNF-epsilon codiert, ein wirkungsvolles Signalpeptid bereit. Ein wirkungsvolles Signal zur Initiation der Translation in eukaryontischen Zellen, wie von Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947–950 (1987) beschrieben, ist in geeigneter Weise in dem Vektor-Bereich des Konstrukts lokalisiert.
Der 3'-Primer besitzt die Sequenz 5'-CGC TCT AGA ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC-3', der die unterstrichene XbaI-Restriktionsschnittstelle enthält, gefolgt von Nucleotiden, die zu den letzten 13 Nucleotiden der codierenden Sequenz, die in den 1 und 2 dargestellt ist, einschließlich des Stop-Codons, komplementär sind.
Das amplifizierte Fragment wird aus einem 1% Agarosegel isoliert, wobei ein kommerziell erhältlicher Kit verwendet wird ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Das Fragment wird dann mit BamHI und Asp718 gespalten und erneut in einem 1% Agarosegel aufgereinigt. Dieses Fragment wird hierin als F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2GP wird verwendet, um das TNF-delta- oder TNF-epsilon-Protein in dem Baculovirus-Expressions-System zu exprimieren, wobei Standard-Verfahren verwendet wurden, wie diejenigen, die in Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987) beschrieben sind. Dieser Expressions-Vektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des Autographa californica nucleären Polyhedrose-Virus (AcMNPV), gefolgt von herkömmlichen Restriktionsschnittstellen. Das Signalpeptid von AcMNPV gp67, einschließlich des N-terminalen Methionin, ist unmittelbar stromaufwärts der BamHI-Schnittstelle lokalisiert. Die Polyadenylierungsstelle des Affenvirus 40 ("SV40") wird für eine wirkungsvolle Polyadenylierung verwendet. Für eine einfache Selektion von rekombinantem Virus wird das β-Galactosidasegen von E. coli in der gleichen Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor inseriert und von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens nachgefolgt. Die Polyhedrin-Sequenzen werden für die Zell-vermittelte homologe Rekombination mit viraler Wildtyp-DNA auf beiden Seiten von viralen Sequenzen flankiert, um ein lebensfähiges Virus zu erzeugen, das das clonierte Polynucleotid exprimiert.
Viele andere Baculovirus-Vektoren, die bereitstehen, wie pAc373, pVL941 und pAcIM1, könnten anstelle von pA2-GP verwendet werden, wobei die Fachleute einschätzen können, dass die Konstruktion in angemessener Weise platzierte Signale für die Transkription, Translation, den Transport und ähnliches bereitstellt, wie ein im Leserahmen liegendes AUG und ein Signalpeptid, je nach Bedarf. Solche Vektoren sind unter anderem in Lückow et al., Virology, 170: 31–39 beschrieben.
Das Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI gespalten und dann unter Verwendung von Phosphatase aus dem Dünndarm des Kalbes dephosphoryliert, wobei Routine-Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Die DNA wird dann aus einem 1%-Agarosegel isoliert, wobei ein kommerziell erhältlicher Kit verwendet wird ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Dieser Vektor wird hierin als "V2" bezeichnet.
Das Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 werden mit T4-DNA-Ligase zusammen ligiert. E. coli HB101-Zellen werden mit dem Ligierungsmix transformiert und auf Kulturschalen ausgebreitet. Bakterien, die das Plasmid mit dem menschlichen TNF-delta- oder TNF-epsilon-Gen enthalten, werden durch Spaltung der DNA aus einzelnen Kolonien identifiziert, wobei BamHI und XbaI verwendet werden und dann das Spaltprodukt durch Gelelektrophorese analysiert wird. Die Sequenz des clonierten Fragments wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Dieses Plasmid wird hierin als pBacTNF-delta bezeichnet.
5 μg des Plasmids pBacTNF-delta werden mit 1,0 μg kommerziell erhältlicher linearisierter Baculovirus-DNA ("BaculoGold^TM Baculovirus-DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) co-transfiziert, wobei das Lipofektions-Verfahren verwendet wird, das von Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987) beschrieben wurde. 1 μg BaculoGold^TM-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBacTNF-delta werden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte vermischt, die 50 μl Serum-freies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthält. Danach werden 10 μl Lipofektin + 90 μl Grace-Medium zugegeben, vermischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Transfektionsgemisch tropfenweise zu Sf9-Insektenzellen ((ATCC CRL 1711) zugegeben, die in einer 35 mm Gewebekulturschale mit 1 ml Grace-Medium oder Serum ausgesät sind. Die Platte wird vor- und zurückgeschwenkt, um die neu hinzugefügte Lösung zu mischen. Die Platte wird dann 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wird die Transfektionslösung von der Platte entfernt und 1 ml Grace-Insektenmedium, das mit 10% fötalem Kälberserum angereichert ist, wird zugegeben. Die Platte wird in einen Inkubator zurückgestellt und die Züchtung wird vier Tage lang bei 27°C fortgeführt.
Nach vier Tagen wird der Überstand gesammelt und ein Plaque-Test wird durchgeführt, wie von Summers und Smith beschrieben, worauf bereits vorstehend Bezug genommen wurde. Ein Agarosegel mit "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) wird verwendet, um die einfache Identifizierung und Isolierung von gal-exprimierenden Clonen zu gewährleisten, die blau gefärbte Plaques erzeugen. (Eine detaillierte Beschreibung eines "Plaque-Tests" von diesem Typ kann auch in der Bedienungsanleitung für Insektenzellkultur und Baculovirologie, Seite 9–10 gefunden werden, die von Life Technologies Inc., Gaithersburg verteilt wird.)
Vier Tage nach serieller Verdünnung wird das Virus zu den Zellen gegeben. Nach geeigneter Inkubation werden blau gefärbte Plaques mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette gepickt (aufgesammelt). Der Agar, der rekombinante Viren enthält, wird dann in einem Eppendorf-Gefäß resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthält. Durch eine kurze Zentrifugation wird der Agar entfernt und der Überstand, der das rekombinante Baculovirus enthält, wird verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren, die in 35 mm Kulturschalen ausgesät sind. Vier Tage später werden die Überstände dieser Kulturschalen geerntet und dann bei 4°C aufbewahrt. Ein Clon, der in geeigneter Weise inseriertes TNF-delta oder TNF-epsilon enthält, wird durch DNA oder TNF-epsilon-Analyse, einschließlich Restriktionskartierung und Sequenzierung, identifiziert. Dieser wird hierin als V-TNF-delta bezeichnet.
Sf9-Zellen werden in Grace-Medium gezüchtet, das mit 10% Hitze-inaktiviertem FBS angereichert ist. Die Zellen werden mit dem rekombinanten Baculovirus V-TNF-delta in einer Infektions-Multiplizität (multiplicity of infection; "MOI") von etwa 2 (etwa 1 bis etwa 3) infiziert. Sechs Stunden später wird das Medium entfernt und mit SF900 II-Medium minus Methionin und Cystein (erhältlich von Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später werden 5 μCi ³⁵S-Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (erhältlich von Amersham) zugegeben. Die Zellen werden 16 Stunden lang weiter inkubiert und werden dann durch Zentrifugation geerntet, lysiert und die markierten Proteine werden durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 3
Gewebeverteilung der TNF-delta-Expression
Eine Northern Blot-Analyse wurde durchgeführt, um die Expressionsspiegel von TNF-delta in menschlichen Geweben zu überprüfen, wobei Verfahren verwendet wurden, die unter anderem beschrieben sind von Sambrook et al., worauf vorstehend Bezug genommen wurde. Gesamt-zelluläre-RNA-Proben werden mit RNAzol^TM B-System (Biotex Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033) isoliert.
Etwa 10 μg Gesamt-RNA wurde aus Gewebeproben isoliert. Die RNA wurde durch Elektrophorese in einem 1% Agarosegel unter stark denaturierenden Bedingungen nach der Größe aufgetrennt. Die RNA wurde von dem Gel auf einen Nylonfilter geblottet und der Filter wird dann für die Hybridisierung mit einer nachweisbaren markierten Polynucleotid-Sonde vorbereitet.
Als eine Sonde, um mRNA nachzuweisen, die TNF-delta codiert, wurde der Antisense-Strang der codierenden Region des cDNA-Inserts in dem hinterlegten Clon zu einer hohen spezifischen Aktivität markiert. Die cDNA wurde mit Hilfe von Primer-Extension markiert, wobei der Prime-It-Kit verwendet wurde, der von Stratagene erhältlich ist. Die Reaktion wurde unter Verwendung von 50 ng cDNA dem Standard-Reaktionsprotokoll folgend durchgeführt, wie es von dem Anbieter empfohlen wird. Das markierte Polynucleotid wurde von den anderen markierten Reaktionsbestandteilen durch Säulenchromatographie aufgereinigt, wobei eine Select-G-50- Säule verwendet wurde, die von 5-Prime-3-Prime, Inc. of 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303 erhalten wurde.
Die markierte Probe wurde in einer Konzentration von 1.000.000 cpm/ml in einem kleinen Volumen 7% SDS, 0,5 M NaPO₄, pH 7,4 bei 65°C über Nacht mit dem Filter hybridisiert.
Danach wurde die Sondenlösung abgeschüttet und der Filter zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Der Filter wird dann getrocknet und über Nacht mit einer Verstärkerfolie bei –70°C mit einem Film exponiert.
Die Autoradiographie zeigt, dass die mRNA für TNF-delta in allen 16 Geweben nachgewiesen wurde, mit der höchsten Expression im Herz, gefolgt von Plazenta und Niere.
Beispiel 4
Gentherapeutische Expression von menschlichem TNF-delta oder TNF-epsilon
Durch Hautbiopsie werden Fibroblasten von einer Versuchsperson erhalten. Das resultierende Gewebe wird in Gewebekultur-Medium gegeben und in kleine Stücke aufgeteilt. Kleine Brocken des Gewebes werden auf eine feuchte Oberfläche in eine Gewebekulturflasche gegeben, wobei ungefähr 10 Stück in jede Flasche gegeben werden. Die Flasche wird umgedreht, fest verschlossen und über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Flasche umgedreht – die Gewebebrocken bleiben am Boden der Flasche befestigt – und frisches Medium wird zugegeben (z. B. Ham's F12-Medium mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin). Das Gewebe wird dann ungefähr eine Woche bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium zugegeben und nachfolgend jeweils nach einigen Tagen gewechselt. Nach weiteren zwei Wochen in Kultur entsteht ein Monolayer aus Fibroblasten. Der Monolayer wird trypsiniert und in größere Flaschen verteilt.
Ein Vektor zur Gentherapie wird zur Clonierung eines zu exprimierenden Fragments mit Restriktionsenzymen gespalten. Der gespaltene Vektor wird mit Phosphatase vom Dünndarm des Kalbes behandelt, um eine Selbstligierung zu verhindern. Der dephosphorylierte lineare Vektor wird in einem Agarosegel fraktioniert (aufgetrennt) und aufgereinigt.
cDNA, die in der Lage ist, aktives TNF-delta oder TNF-epsilon zu exprimieren, wird isoliert. Die Enden des Fragments werden, falls notwendig, zur Clonierung in den Vektor modifiziert. Zum Beispiel können 5'-Überhänge mit DNA-Polymerase behandelt werden, um glatte Enden zu erzeugen. 3'-überhängige Enden können unter Verwendung von S1-Nuclease entfernt werden. Linker können mit T4-DNA-Ligase an glatte Enden ligiert werden.
Gleiche Mengen des linearen Moloney murine leukemia virus-Rückgrats und des TNF-delta- oder TNF-epsilon-Fragments werden miteinander vermischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um E. coli zu transformieren und die Bakterien werden dann auf Agar ausplattiert, der Kanamycin enthält. Der Kanamycin-Phänotyp und Restriktionsanalyse versichern, dass der Vektor das richtig inserierte Gen besitzt.
Verpackungszellen werden in Gewebeflaschen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin auf konfluente Dichte gezüchtet. Der Vektor, der das TNF-delta- oder TNF-epsilon-Gen enthält, wird mit Hilfe von Standard-Verfahren in die Verpackungszellen eingebracht. Infektiöse Viruspartikel, die das TNF-delta- oder TNF-epsilon-Gen enthalten, werden von den Verpackungszellen aufgesammelt, die jetzt Produzenten-Zellen genannt werden.
Frisches Medium wird zu den Produzenten-Zellen zugegeben und nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird das Medium von den Platten der konfluenten Produzenten-Zellen geerntet.
Das Medium, das die infektiösen Viruspartikel enthält, wird durch einen Millipore-Filter gefiltert, um abgelöste Produzenten-Zellen zu entfernen. Das gefilterte Medium wird dann verwendet, um Fibroblasten-Zellen zu infizieren. Das Medium wird von einer sub-konfluenten Platte von Fibroblasten entfernt und schnell durch das filtrierte Medium ersetzt. Polybren (Aldrich) kann in dem Medium eingeschlossen werden, um die Transduktion zu vereinfachen. Nach einer angemessenen Inkubation wird das Medium entfernt und mit frischem Medium ersetzt. Falls der Virustiter hoch ist, dann werden nahezu alle Fibroblasten infiziert, und es ist keine Selektion erforderlich. Falls der Titer niedrig ist, ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektionierbaren Marker besitzt, wie neo oder his, um transduzierte Zellen zur Vermehrung auszuwählen.
Gentechnisch veränderte Fibroblasten können dann in Ratten injiziert werden, entweder alleine oder nachdem sie auf Mikroträger-Kügelchen (microcarrier beads), wie Cytodex 3-Kügelchen, bis zur Konfluenz gezüchtet wurden. Die injizierten Fibroblasten produzieren TNF-delta- oder TNF-epsilon-Produkt und die biologischen Wirkungen des Proteins werden an den Wirt übertragen.

Claims

Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotiden, die mindestens die reife Form des Polypeptids codieren, das die abgeleitete Aminosäuresequenz wie in 1 oder 2 dargestellt hat; (b) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz wie in 1 oder 2 dargestellt, die mindestens die reife Form des Polypeptids codieren; (c) Polynucleotiden, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz mindestens der reifen Form des Polypeptids codieren, das von der cDNA, die in ATCC 97377 oder ATCC 97457 enthalten ist, codiert wird; (d) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz der cDNA, die in ATCC 97377 oder ATCC 97457 enthalten ist, die mindestens die reife Form des Polypeptids codieren; (e) Polynucleotiden, die eine Aminosäuresequenz codieren, die von einem Polynucleotid aus (a) bis (d) codiert wird, wobei 1 bis 5 oder 5 bis 10 Aminosäuren in beliebiger Kombination substituiert, entfernt oder hinzugefügt werden; (f) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das ein Fragment eines Polypeptids mit einer Länge von mindestens 30 oder mindestens 50 Aminosäuren umfasst, das von einem Polynucleotid aus (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment in der Lage ist, eine Immunantwort zu stimulieren; (g) Polynucleotiden wie in (f) definiert, die funktionell mit einer heterologen regulatorischen Sequenz verbunden sind; (h) Polynucleotiden, die mindestens zu 70% mit einem Polynucleotid aus (a) bis (d) identisch sind und die ein Polypeptid codieren, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu stimulieren; und (i) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das mindestens zu 70% mit einem Polypeptid identisch ist, das von einem Polynucleotid aus (a) bis (d) codiert wird; oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das eine DNA oder RNA ist.
DNA nach Anspruch 2, die eine genomische DNA ist.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das mit einem heterologen Polynucleotid fusioniert ist.
Vektor, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Vektor nach Anspruch 5, wobei das Polynucleotid mit Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden ist, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen gestatten.
Wirtszelle, die mit dem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 genetisch verändert wurde.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu stimulieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 7 und Gewinnen des von dem Polynucleotid codierten Polypeptids aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, ein Polypeptid zu exprimieren, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu stimulieren, wobei das Verfahren die genetische Veränderung von Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die von einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, oder das durch das Verfahren nach Anspruch 8 erhältlich ist.
Antikörper, der spezifisch für das Polypeptid nach Anspruch 10 ist.
Nucleinsäuremolekül, das spezifisch mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert.
Antagonist/Inhibitor des Polypeptids nach Anspruch 10, wobei der Antagonist/Inhibitor ein Antikörper nach Anspruch 11 ist und in der Lage ist, die Aktivität des Polypeptids nach Anspruch 10 zu hemmen oder auszuschalten, oder ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, das in der Lage ist, das Polynucleotid oder die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zu binden und dadurch dessen Expression zu hemmen.
Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Polypeptid nach Anspruch 10 oder eine DNA, die das Polypeptid codiert und in der Lage ist, es in vivo zu exprimieren, oder den Antagonist/Inhibitor nach Anspruch 13 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder den Antikörper nach Anspruch 11.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 10 oder des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Neoplasie, zur Wundheilung, zur Behandlung von Restenose, zur Regulierung der Hämatopoiese in der Entwicklung von Endothelzellen, zur Stimulierung einer Immunantwort gegen parasitäre, bakterielle oder virale Infektionen, oder zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Autoimmunerkrankungen.
Verwendung des Antagonisten/Inhibitors nach Anspruch 13 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Cachexie, Gehirnmalaria, rheumatoider Arthritis, zur Vorbeugung der Transplantat-Wirt-Abstoßung, zur Hemmung von Knochenresorption, zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Osteoporose, oder zur Behandlung von endotoxischem Schock.
Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder der Neigung zu einer Krankheit, die mit einer Unterexpression des Polypeptids nach Anspruch 10 in Zusammenhang steht, umfassend die Bestimmung einer Mutation in einer Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert.
Diagnostisches Verfahren, umfassend das Analysieren auf das Vorliegen eines Polypeptids nach Anspruch 10 in einer Probe, die einem Wirt entnommen wurde.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die das Polypeptid nach Anspruch 10 binden und seine Aktivierung hemmen, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Zelle, die an ihrer Oberfläche einen Rezeptor für das Polypeptid exprimiert, wobei der Rezeptor mit einem zweiten Bestandteil assoziiert ist, der in der Lage ist, nach Binden einer Verbindung an den Rezeptor ein nachweisbares Signal zu liefern, mit einem analytisch nachweisbaren TNF-delta-Polypeptid und einer Verbindung unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor gestatten; und (b) Festellen, ob die Verbindung an den Rezeptor bindet und diesen hemmt, indem die Abwesenheit eines Signals nachgewiesen wird, das durch die Wechselwirkung von TNF-delta mit dem Rezeptor erzeugt wird.