DE69836956T2

DE69836956T2 - Rezeptor 5, der eine für den zelltod verantwortliche domäne enthält

Info

Publication number: DE69836956T2
Application number: DE69836956T
Authority: DE
Inventors: Jian Rockville NI; L. Reiner Silver Spring GENTZ; Guo-Liang San Mateo YU; Y. Jeffrey Gaithersburg SU; A. Craig Laytonsville ROSEN
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1998-03-17
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2018-03-18
Also published as: JP4330180B2; EP0970213A2; JP2001520513A; AU747635B2; EP0970213B1; CA2644454A1; CN1624128A; US7803615B1; NZ508381A; AU6763598A; DK0970213T3; ES2281126T3; WO1998041629A2; PT970213E; HK1025352A1; CA2285040C; WO1998041629A3; ATE352618T1; DE69836956D1; CA2285040A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung betrifft ein neues Mitglied der Familie der Tumornekrosefaktor-Rezeptoren. Spezifischer werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die einen Rezeptor 5 codieren, der eine humane, für den Zelltod verantwortliche Domäne enthält, oder einfach "DR5". DR5-Polypeptide werden ebenfalls bereitgestellt, ebenso wie Vektoren, Wirtszellen und rekombinante Verfahren für ihre Herstellung. Die Erfindung betrifft weiterhin Durchmusterungsverfahren für die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten der DR5-Aktivität.
Stand der Technik
Zahlreiche biologische Aktivitäten, zum Beispiel die Reaktion auf gewisse Reize und natürliche biologische Prozesse werden von Faktoren wie Cytokinen kontrolliert. Viele Cytokine wirken über Rezeptoren, indem sie die Rezeptoren besetzen und eine intrazelluläre Antwort produzieren.
Zum Beispiel sind die Tumornekrosefaktoren (TNF) alpha und beta Cytokine, die über TNF-Rezeptoren wirken, indem sie zahlreiche biologische Prozesse regulieren, einschließlich des Schutzes gegen eine Infektion und der Induktion von Schock und Entzündungskrankheit. Die TNF-Moleküle gehören zur "TNF-Liganden"-Superfamilie und wirken zusammen mit ihren Rezeptoren oder Gegen-Liganden, der "TNF-Rezeptor"-Superfamilie. Bisher wurden neun Mitglieder der TNF-Liganden-Superfamilie identifiziert und zehn Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie wurden charakterisiert.
Unter den Liganden befinden sich TNF-α, Lymphotoxin-α (LT-α, auch als TNF-β bekannt), LT-β (gefunden in dem komplexen Heterotrimeren LT-α2-β), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-IBBL, OX40L und Nervenwachstumsfaktor (NGF). Die Superfamilie der TNF-Rezeptoren umfaßt den p55TNF-Rezeptor, den p75TNF-Rezeptor, das mit dem TNF-Rezeptor verwandte Protein, das FAS-Antigen oder APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-IBB, OX40, den p75-Rezeptor niedriger Affinität und den NGF-Rezeptor (Meager, A., Biologicals, 22: 291–295 (1994)).
Viele Mitglieder der TNF-Liganden-Superfamilie werden von aktivierten T-Zellen exprimiert, was nahe legt, daß sie für die T-Zell-Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen notwendig sind, die der Zellontogenese und Zellfunktionen unterliegen. (Meager, A., vorstehend).
Beträchtlichen Einblick in essentielle Funktionen von mehreren Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie wurde durch die Identifizierung und Erzeugung von Mutanten gewonnen, denen die Expression dieser Proteine fehlt. Zum Beispiel verursachen natürlicherweise vorkommende Mutationen im FAS-Antigen und seinem Liganden eine lymphoproliferative Krankheit (Watanabe-Fukunaga, R., et al., Nature 356: 314 (1992)), was vielleicht ein Versagen beim programmierten Zelltod reflektiert. Mutationen beim CD40-Liganden verursachen einen X-verknüpften Immundefizienzzustand, der durch hohe Niveaus von Immunglobulin M und niedrigen Niveaus von Immunglobulin G im Plazma charakterisiert ist, was eine fehlerhafte T-Zell-abhängige B-Zell-Aktivierung anzeigt (Allen, R. C. et al., Science 259: 990 (1993)). Gezielte Mutationen des Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors niedriger Affinität verursachen eine Störung, die durch fehlerhafte sensorische Innovation von peripheren Strukturen charakterisiert ist (Lee, K. F. et al., Cell 69: 737 (1992)).
TNF und LT-α sind in der Lage, an zwei TNF-Rezeptoren zu binden (den 55- und 75-kd TNF-Rezeptor). Eine große Zahl an biologischen Effekten, die von TNF und LT-α hervorgerufen werden, die durch ihre Rezeptoren wirken, umfassen die hämorrhagische Nekrose von transplantierten Tumoren, die Cytotoxizität, eine Rolle beim endotoxischen Schock, die Entzündung, die Immunregulation, die Proliferation und antivirale Reaktionen, ebenso wie der Schutz gegen die schädlichen Effekte von ionisierender Strahlung. TNF und LT-α sind in die Pathogenese einer großen Reihe von Krankheiten involviert, einschließlich des endotoxischen Schocks, der cerebralen Malaria, Tumore, Autoimmunkrankheiten, AIDS und Transplantat-Wirt-Abstoßung (Beutler, B. und Von Huffel, C., Science 264: 667–668 (1994)). Mutationen im p55-Rezeptor verursachen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber mikrobiellen Infektionen.
Darüber hinaus wurde über eine Domäne von etwa 80 Aminosäuren in der Nähe des C-Terminus von TNFR1 (p55) und Fas als der "Domäne des Zelltods" berichtet, die für die Übertragung von Signalen für den programmierten Zelltod verantwortlich ist (Tartaglia et al., Cell 74: 845 (1993)).
Die Apoptose oder der programmierte Zelltod ist ein physiologischer Prozeß, der für die normale Entwicklung und die Homöostase von vielzelligen Organismen essentiell ist (H. Steller, Science 267: 1445–1449 (1995)). Störungen bei der Apoptose tragen zur Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten bei, einschließlich Krebs, neudegenerativen Störungen und erworbenem Immundefizienzsyndrom (C. B. Thompson, Science 267: 1456–1462 (1995)). Kürzlich fokussierte sich viel Aufmerksamkeit auf die Signalübertragung und die biologische Funktion von zwei Zelloberflächenrezeptoren für den Zelltod, Fas/APO-1 und TNFR-1 (J. L. Cleveland et al., Cell 81: 479–482 (1995); A. Fraser et al., Cell 85: 781–784 (1996); S. Nagata et al., Science 267: 1449–56 (1995)). Beide sind Mitglieder der Familie der TNF-Rezeptoren, die unter anderem auch TNFR-2, NGFR niedriger Affinität, CD40 und CD30 umfaßt (C. A. Smith et al., Science 248: 1019–23 (1990); M. Tewari et al., in Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Carl, Hrsg. (Chapman und Hall, London, 1995). Während Familienmitglieder durch die Anwesenheit von Cystein-reichen Wiederholungen in ihren extrazellulären Domänen definiert werden, haben Fas/APO-1 und TNFR-1 auch eine gemeinsame Region intrazellulärer Homologie, die in geeigneter Weise als "Domäne für den Zelltods" bezeichnet wird, die mit dem Suizidgen reaper von Drosophila entfernt verwandt ist (P. Golstein et al., Cell 81: 185–186 (1995); K. White et al., Science 264: 677–83 (1994)). Die gemeinsame Domäne für den Zelltod legt nahe, daß beide Rezeptoren mit einem verwandten Satz an signalübertragenden Molekülen wechselwirken, die bis vor kurzem nicht identifiziert waren. Die Aktivierung von Fas/APO-1 rekrutiert das die Domäne für den Zelltod enthaltende Adaptormolekül FADD/MORT1 (A. M. Chinnaiyan et al., Cell 81: 505–12 (1995); M. P. Boldin et al., J. Biol Chem 270: 7795–9 (1995); F. C. Kischkel et al., EMBO 14: 5579–5588 (1995)), welches wiederum bindet und vermutlich FLICE/MACH1 aktiviert, ein Mitglied der ICE/CED-3-Familie an pro-Apoptose- Proteasen (M. Muzio et al., Cell 85: 817–827 (1996); M. P. Boldin et al., Cell 85: 803–815 (1996)). Während die zentrale Rolle von Fas/APO-1 das Anstoßen des Zelltods ist, kann TNFR-1 eine Reihe von verschiedenen biologischen Aktivitäten signalisieren – von denen viele von seiner Fähigkeit zur Aktivierung von NF-kB abstammen (L. A. Tartaglia et al., Immunol Today 13: 151–3 (1992)). Dem entsprechend rekrutiert TNFR-1 das multivalente Adaptormolekül TRADD, das wie FADD auch die Domäne für den Zelltod enthält (H. Hsu et al., Cell 81: 495–504 (1995); H. Hsu et al., Cell 84: 299–308 (1996)). Durch seine Assoziation mit einer Reihe von Signalmolekülen, einschließlich FADD, TRAF2 und RIP, kann TRADD sowohl Apoptose als auch die NF-kB-Aktivierung signalisieren (H. Hsu et al., Cell 84: 299–308 (1996); H. Hsu et al., Immunity 4: 387–396 (1996)).
Kürzlich wurde ein neuer Apoptose induzierender TNF-Ligand entdeckt. S. R. Wiley et al. (Immunity 3: 673–682 (1995)) nannten das Molekül "mit TNF verwandter Apoptose induzierender Ligand" oder einfach "TRAIL". Das Molekül wurde auch als "Apo-2-Ligand" oder "Apo-2L" bezeichnet. R. M. Pitt et al., J. Biol. Chem. 271: 12687–12690 (1996). Dieses Molekül wurde auch in der gleichzeitig anhängigen provisorischen U.S.-Anmeldung No. 60/013,405 offenbart, die der WO 97/33899 entspricht. Zur Vereinfachung wird das Molekül hier als TRAIL bezeichnet.
Anders als der FAS-Ligand, dessen Transkripte im Wesentlichen auf stimulierte T-Zellen beschränkt zu sein scheinen, werden signifikante Spiegel von TRAIL in vielen menschlichen Geweben nachgewiesen (z.B. Milz, Lunge, Prostata, Thymus, Eierstock, Dünndarm, Dickdarm, periphere Blutlymphocyten, Plazenta, Niere) und wird von einigen Zelllinien konstitutiv transkribiert. Es wurde gezeigt, daß TRAIL unabhängig vom FAS-Liganden wirkt (Wiley et al., vorstehend). Es wurde auch gezeigt, daß TRAIL rasch die Apoptose aktiviert, innerhalb eines Zeitrahmens, der dem des Signals für den Zelltod durch Fas/Apo-1L ähnlich ist, aber viel schneller als die durch TNF induzierte Apoptose. S. A. Marsters et al., Current Biology 6: 750–752 (1996). Das Unvermögen von TRAIL zur Bindung von TNFR-1, Fas oder das kürzlich identifizierte DR3 legt nahe, daß TRAIL mit einem einzigen Rezeptor(en) interagiert.
Es wurden bereits mehrere einmalige Rezeptoren für TRAIL identifiziert. In der gleichzeitig anhängigen provisorischen U.S.-Anmeldung No. 60/035,722, die der WO 98/32856 entspricht, wird DR4 ein neuer Rezeptor für TRAIL offenbart, der eine neue Domäne für den Zelltod enthält. Vgl. Pan et al., Science 276: 111–113 (April 1997). Von dem TR5-Rezeptor, dem Gegenstand der gleichzeitig anhängigen provisorischen U.S.-Anmeldung No. 60/035,496, die der WO 98/30693 entspricht, wurde gezeigt, daß er TRAIL bindet. In der gleichzeitig anhängigen provisorischen U.S.-Anmeldung No. 60/050,36, die der WO 98/54202 entspricht, wurde vorausgesagt, daß der TR10-Rezeptor wegen der Sequenzhomologie mit DR4 auch TRAIL binden würde.
Die Effekte der Liganden der TNF-Familie und der Rezeptoren der TNF-Familie werden in den Prozessen des Säugersystems von zahlreichen Funktionen variiert und beeinflußt, normalen und abnormalen. Deshalb besteht ein eindeutiger Bedarf an der Identifikation und Charakterisierung solcher Rezeptoren und Liganden, die die biologische Aktivität beeinflussen, im normalen und Krankheitszustand. Insbesondere besteht Bedarf an der Isolierung und Charakterisierung zusätzlicher neuer Rezeptoren, die TRAIL binden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die Nucleinsäuresequenzen umfassen, die die Aminosäuresequenz, die in 1 gezeigt wird (SEQ ID NO: 2) oder die Aminosäuresequenz, die der cDNA-Clon codiert, der am 7. März 1997 als ATCC-Hinterlegung No. 97920 hinterlegt wurde, codieren.
Die vorliegenden Erfindung stellt auch rekombinante Vektoren bereit, die die isolierten Nucleinsäuremoleküle der Erfindung umfassen, und Wirtszellen, die die rekombinanten Vektoren enthalten, ebenso Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren und Wirtszellen und ihre Verwendung für die Produktion von DR5-Polypeptiden oder –Peptiden mit rekombinanten Techniken.
Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes DR5-Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz hat, die von einem hier beschriebenen Polynucleotid codiert wird.
Hier werden auch diagnostische Tests offenbart, wie quantitative und diagnostische Tests zum Nachweis von Spiegeln an DR5-Protein. So kann zum Beispiel ein diagnostischer Test gemäß der Erfindung zum Nachweis der Überexpression von DR5 oder der löslichen Form davon im Vergleich mit Proben von normalem Kontrollgewebe zum Nachweis der Anwesenheit von Tumoren verwendet werden.
Von den Liganden der Familie der Tumornekrosefaktoren (TNF) ist bekannt, daß sie zu den am meisten pleiotropen Cytokinen gehören, die eine hohe Anzahl an zellulären Reaktionen induzieren, einschließlich der Cytotoxizität, der antiviralen Aktivität, immunregulatorischer Aktivitäten und der transkriptionalen Regulation mehrerer Gene. Die zelluläre Reaktion auf Liganden der TNF-Familie umfassen nicht nur normale physiologische Reaktionen, sondern auch Krankheiten, die mit erhöhter Apoptose oder der Inhibition der Apoptose assoziiert sind. Die Apoptose – der programmierte Zelltod – ist ein physiologischer Mechanismus, der in die Entfernung von peripheren T-Lymphocyten des Immunsystems involviert ist, und seine Deregulierung kann zu einer Anzahl von verschiedenen pathogenen Prozessen führen. Erkrankungen, die mit einem erhöhten Zellüberleben einhergehen, oder der Inhibierung der Apoptose, umfassen Krebs, Autoimmunkrankheiten, virale Infektionen, Entzündung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung, akute Transplantatabstoßung und chronische Transplantatabstoßung. Erkrankungen, die mit einer erhöhten Apoptose einhergehen, sind AIDS, neurodegenerative Krankheiten, myelodisplastische Syndrome, ischämische Verletzung, von einem Toxin induzierte Lebererkrankung, der septische Schock, die Kachexie und die Anorexie.
Somit wird die Verwendung eines Agonisten, der zur Erhöhung der von DR5 vermittelten Signalübertragung in der Lage ist, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Apoptose angestrebt, die von einem Liganden der TNF-Familie induziert wurde, was die Verabreichung einer wirksamen Menge der besagten pharmazeutischen Zusammensetzung an eine Zeile involviert, die das DR5-Polypeptid exprimiert. Vorzugsweise wird die von DR5 vermittelte Signalübertragung erhöht, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine verminderte Apoptose gezeigt wird.
Bei einem weiteren Aspekt wird die Verwendung eines Antagonisten, der zur Verminderung der von DR5 vermittelten Signalübertragung in der Lage ist, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung der Apoptose angestrebt, die von einem Liganden der TNF-Familie induziert wurde, was die Verabreichung einer wirksamen Menge der besagten pharmazeutischen Zusammensetzung an eine Zelle involviert, die das DR5-Polypeptid exprimiert. Vorzugsweise wird die von DR5 vermittelte Signalübertragung vermindert, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine erhöhte Apoptose gezeigt wird.
Ob ein Kandidat als "Agonist" oder "Antagonist", wie hier beschrieben, die Apoptose verstärken oder inhibieren kann, kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Tests für die zelluläre Reaktion auf Liganden/Rezeptoren der TNF-Familie bestimmt werden, einschließlich derer, die nachstehend detaillierter beschrieben werden. Somit wird in einem weiteren Aspekt ein Durchmusterungsverfahren für die Bestimmung beschrieben, ob ein Kandidat als Agonist oder Antagonist in der Lage ist, die zelluläre Reaktion auf Liganden der TNF-Familie zu verstärken oder zu inhibieren. Das Verfahren involviert das Inkontaktbringen von Zellen, die das DR5-Polypeptid exprimieren, mit einer Kandidatenverbindung und einem Liganden der TNF-Familie, das Testen einer zellulären Reaktion und den Vergleich der zellulären Reaktion mit einer zellulären Standardreaktion, wobei der Standard getestet wird, wenn der Kontakt in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung hergestellt wird, wobei eine erhöhte zelluläre Reaktion gegenüber dem Standard anzeigt, daß die Kandidatenverbindung ein Agonist des Liganden/Rezeptor-Signalweges ist und eine verminderte zelluläre Reaktion im Vergleich mit dem Standard anzeigt, daß die Kandidatenverbindung ein Antagonist des Liganden/Rezeptor-Signalweges ist. Mit der Erfindung kann eine Zelle, die das DR5-Polypeptid exprimiert, mit einem endogen oder exogen verabreichten Liganden der TNF-Familie in Kontakt gebracht werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Nucleotid (SEQ ID NO: 1)- und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) von DR5. Es wird vorausgesagt, daß die Aminosäuren 1–51 (unterstrichen) das Signalpeptid darstellen (Aminosäurereste von etwa –51 bis etwa –1 in SEQ ID NO: 2); die Aminosäurereste 52–184 stellen die extrazelluläre Domäne dar (Aminosäurereste von etwa 1 bis etwa 133 in SEQ ID NO: 2); die Aminosäurereste 185–208 (unterstrichen) stellen die Transmembrandomäne dar (Aminosäurereste von etwa 134 bis etwa 157 in SEQ ID NO: 2); und die Aminosäurereste 209–411 stellen die intrazelluläre Domäne dar (Aminosäurereste von etwa 158 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2), von denen die Aminosäuren 324–391 (kursiv) die Domäne für den Zelltod darstellen (Aminosäurereste von etwa 273 bis etwa 340 in SEQ ID NO: 2).
2 zeigt die Regionen der Ähnlichkeit zwischen den Aminosäuresequenzen von DR5 (HLYBX88), menschlichem Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (h TNFR1) (SEQ ID NO: 3), menschlichem Fas-Protein (SEQ ID NO: 4) und Rezeptor 3, der die Domäne für den Zelltod enthält (SEQ ID NO: 5). Der Vergleich wurde unter Verwendung des Clustal-Verfahrens mit dem Megalign-Programm gemacht, das in der DNA Star-Folge von Programmen enthalten ist.
3 zeigt eine Analyse der DR5-Aminosäuresequenz. Es werden alpha, beta, Wende- und Spiralenbereiche gezeigt; Hydrophilie und Hydrophobie; amphipathische Regionen; flexible Regionen; der antigene Index und die Oberflächenwahrscheinlichkeit. In der Graphik "Antigener Index – Jameson-Wolf" entsprechen die Aminosäurereste von etwa 62 bis etwa 110, von etwa 119 bis etwa 164, von etwa 224 bis etwa 271, und von etwa 275 bis etwa 370, wie in 1 dargestellt, den gezeigten hoch antigenen Regionen des DR5-Proteins. Diese hoch antigenen Fragmente in 1 entsprechen in SEQ ID NO: 2 jeweils den folgenden Fragmenten: Aminosäurereste von etwa 11 bis etwa 59, von etwa 68 bis etwa 113, von etwa 173 bis etwa 220 und von etwa 224 bis etwa 319.
4 zeigt die Nucleotidsequenzen (HAPBU13R und HSBBU76R) von zwei cDNA-Molekülen, die mit der Nucleotidsequenz von 1 (SEQ ID NO: 1) verwandt sind.
5A ist ein Balkendiagramm, das zeigt, daß die Überexpression von DR5 Apoptose in humanen MCF7-Brustkrebszellen induzierte. 5B ist ein Balkendiagramm, das zeigt, daß die Überexpression von DR5 Apoptose in humanem epitheloidem Karzinom (Hela) induzierte. 5C ist ein Balkendiagramm, das zeigt, daß die von DR5 induzierte Apoptose von den Caspase-Inhibitoren CrmA und z-VAD-fmk blockiert wurde, des dominant negative FADD aber ohne Effekt war. 5D ist ein Immunblot, der zeigt, daß in vivo DR5, wie DR4, nicht mit FADD und TRADD interagierte. 5E ist ein Balkendiagramm, das zeigt, daß eine dominant negative Version eines neu identifizierten FLICE-ähnlichen Moleküls, FLICE2 (Vincenz, C. et al., J. Biol. Chem. 272: 6578 (1997)), die von DR5 induzierte Apoptose effizient blockierte, während das dominant negative FLICE unter Bedingungen, die es blockierte, nur einen partiellen Effekt hatte. Es zeigt auch, daß TNFR-1 die Apoptose effektiv blockierte.
6A ist ein Immunblot, der zeigt, daß DR5-Fc (ebenso wie DR4 und TRID) spezifisch TRAIL banden, aber nicht den verwandten cytotoxischen Liganden TNFα. Die untere Graphik von 6A zeigt den Input, den Fc-Fusionen bei dem Bindungstest darstellen. 6B ist ein Balkendiagramm, das zeigt, daß DR5-Fc die Fähigkeit von TRAIL zur Induktion der Apoptose blockierte. Die in 6B gezeigten Daten (±SD) sind der Prozentsatz an apoptotischen Kernen unter den insgesamt gezählten Kernen (n = 4). 6C ist ein Balkendiagramm, das zeigt, daß DR5-Fc keinen Effekt auf die Apoptose hatte, den von TNFα induzierten Zelltod unter Bedingungen, bei denen TNFR1-Fc das Abtöten durch TNFα vollständig aufhob.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die ein Polynucleotid umfassen, das ein DR5-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz hat, die in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigt ist, oder ein Fragment des Polypeptids. Das DR5-Polypeptid der vorliegenden Erfindung zeigt eine Sequenzhomologie mit anderen bekannten Rezeptoren der TNFR-Familie, die eine Domäne für den Zelltod enthalten, einschließlich humanem TNFR-L, DR3 und Fas (2). Die in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigte Nucleotidsequenz wurde durch Sequenzierung von cDNA-Clonen wie HLYBX88 erhalten, der am 7. März 1997 bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt wurde und der die Zugangsnummer 97920 erhielt. Der hinterlegte Clon ist in dem pSport 1-Plasmid (Life Technologies, Gaithersburg, MD) enthalten.
Nucleinsäuremoleküle
Außer anders angegeben wurden alle Nucleotidsequenzen, die durch Sequenzierung bestimmt wurden, unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenziergeräts (wie dem Modell 373 von Applied Biosystems, Inc.) bestimmt, und alle Aminosäuresequenzen der Polypeptide, die von hier bestimmten DNA-Molekülen codiert wurden, wurden durch die Translation der wie vorstehend bestimmten DNA-Sequenz bestimmt. Deshalb kann, wie im Stand der Technik für jede DNA-Sequenz bekannt ist, die auf diesem automatischen Weg bestimmt wurde, jede hier bestimmte Nucleotidsequenz einige Fehler enthalten. Nucleotidsequenzen, die automatisch bestimmt werden, sind typischerweise mindestens zu 90% identisch, mehr typischerweise mindestens zu 95% bis zu mindestens zu 99,9% identisch mit der tatsächlichen Nucleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls. Die tatsächliche Sequenz kann präziser auf anderen Wegen bestimmt werden, einschließlich manueller DNA-Sequenzierungsverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Wie im Stand der Technik auch bekannt ist, wird eine einzige Insertion oder Deletion in einer bestimmten Nucleotidsequenz im Vergleich mit der tatsächlichen Sequenz eine Rahmenverschiebung bei der Translation der Nucleotidsequenz verursachen, so daß die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die die bestimmte Nucleotidsequenz codiert, vollständig unterschiedlich sein wird zu der Aminosäuresequenz, die tatsächlich von dem sequenzierten DNA-Molekül codiert wird, beginnend mit dem Punkt einer solchen Insertion oder Deletion.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Information, wie der in der SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz, kann ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, das ein DR5-Polypeptid codiert, unter Verwendung von Standard-Clonierungsverfahren und –Durchmusterungsverfahren erhalten werden, wie diejenigen für die Clonierung von cDNAs unter Verwendung von mRNA als Ausgangsmaterial. Beispielhaft für die Erfindung wurde das Nucleinsäuremolekül der Erfindung in cDNA-Banken von den folgenden Geweben identifiziert: primäre dendritische Zellen, Endothelgewebe, Milz, chronischer lymphozytischer Leukämie und humanen Thymusstromazellen.
Die bestimmte Nucleotidsequenz der DR5-cDNA von SEQ ID NO: 1 enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein von etwa 411 Aminosäureresten codiert, dessen Initiationscodon an Position 130–132 der in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigten Nucleotidsequenz ist, mit einer Leader-Sequenz von etwa 51 Aminosäureresten. Von den bekannten Mitgliedern der Familie der TNF-Rezeptoren zeigt das DR5-Polypeptid der Erfindung das höchste Maß an Homologie mit humanen TNFR1-, FAS- und DR3-Polypeptiden, die in 2 gezeigt sind, einschließlich signifikanter Sequenzhomologie über mehrere Cystein-reiche Domänen. Die Homologie, die DR5 mit anderen Rezeptoren zeigt, die eine Domäne für den Zelltod enthalten, legt stark nahe, daß auch DR5 ein Rezeptor ist, der eine Domäne für den Zelltod enthält, mit der Fähigkeit zur Induktion der Apoptose. Von DR5 wurde auch gezeigt, daß es TRAIL bindet.
Wie angezeigt, stellt die vorliegende Erfindung auch die reife Form/reifen Formen der DR5-Proteins der vorliegenden Erfindung bereit. Gemäß der Signalhypothese haben Proteine, die von Säugerzellen sezerniert werden, eine Signal- oder sekretorische Leadersequenz, die von dem reifen Protein abgespalten wird, nachdem der Export der wachsenden Proteinkette durch das rohe endoplasmatische Retikulum initiiert wurde. Die meisten Säugerzellen und sogar Insektenzellen spalten sezernierte Proteine mit derselben Spezifität. In einigen Fällen ist jedoch die Spaltung eines sezernierten Proteins nicht vollkommen einheitlich, was in zwei oder mehr reifen Arten des Proteins resultiert. Des weiteren ist seit langem bekannt, daß die Spaltspezifität eines sezernierten Proteins letztlich durch die Primärstruktur des vollständigen Proteins bestimmt wird, das heißt, sie ist inhärent in der Aminosäuresequenz des Polypeptids.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz bereit, die das reife DR5-Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die der cDNA-Clon codiert, der in dem Wirt enthalten ist, der als ATCC-Hinterlegung No. 97920 identifiziert ist, und wie gezeigt in 1 (SEQ ID NO: 2). Mit dem reifen DR5-Protein, das die Aminosäuresequenz hat, die die cDNA-Clone codieren, die in dem Wirt enthalten sind, der als ATCC-Hinterlegung No. 97920 identifiziert ist, ist die reife Form/sind die reifen Formen des DR5-Proteins gemeint, das durch Expression des vollständigen offenen Leserahmens in einer Säugerzelle (z.B. COS-Zellen, wie nachstehend beschrieben) produziert wird, der von der humanen DNA-Sequenz des Clons codiert wird, der in dem Vektor in dem hinterlegten Wirt enthalten ist. Wie nachstehend angezeigt, kann das reife DR5, das die Aminosäuresequenz hat, die der cDNA-Clon codiert, der in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten ist, sich von dem "reifen" DR5-Protein unterscheiden, das in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, (Aminosäuren von etwa 1 bis etwa 360), oder auch nicht, in Abhängigkeit von der Genauigkeit der vorhergesagten Spaltstelle, basierend auf der Computer-Analyse.
Verfahren für die Vorhersage, ob ein Protein einen sekretorischen Leader hat ebenso wie die Spaltstelle für die Leadersequenz, stehen zur Verfügung. Zum Beispiel kann das Verfahren von McGeoch (Virus Res. 3: 271–286 (1985)) und von von Heinje (Nucleic Acids Res. 14: 4683–4690 (1986)) verwendet werden. Die Genauigkeit der Vorhersage der Spaltstellen von bekannten sekretorischen Proteinen der Säuger bei jedem dieser Verfahren ist im Bereich von 75–80%. Von Heinje, vorstehend. Die beiden Verfahren produzieren jedoch nicht immer denselben/dieselben vorhergesagten Spaltpunkt(e) für ein vorgegebenes Protein.
Im vorliegenden Fall wurde die vorhergesagte Aminosäuresequenz des vollständigen DR5-Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit einem Computerprogramm ("PSORT") analysiert. Vgl. K. Nakai und M. Kanehisa, Genomics 14: 897–911 (1992). PSORT ist ein Expertensystem für die Vorhersage der zellulären Lage eines Proteins aufgrund seiner Aminosäuresequenz. Als ein Teil der Computervorhersage der Lage werden die Verfahren von McGeoch von von Heinje eingebaut. Die Analyse mit dem PSORT-Programm sagte die Spaltstellen zwischen den Aminosäuren 51 und 52 in 1 (–1 und 1 in SEQ ID NO: 2) voraus. Danach wurden die vollständigen Aminosäuresequenzen durch visuelle Inspektion unter Anwendung einer einfachen Form der (–1, –3)-Regel von von Heinje, vorstehend, weiter analysiert. Damit wird vorausgesagt, daß die Leadersequenz für das DR5-Protein aus den Aminosäureresten von etwa 1 bis etwa 51 besteht, unterstrichen in 1 (entsprechend von etwa –51 bis etwa 1 in SEQ ID NO: 2), während das vorhergesagte reife DR5-Protein aus den Resten von etwa 52 bis etwa 411 in 1 besteht (entsprechend von etwa 1 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2).
Wie angegeben können die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung in der Form von RNA sein, wie mRNA, oder in der Form von DNA, einschließlich zum Beispiel cDNA und genomische DNA, die durch Clonierung erhalten oder synthetisch produziert wurde. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Einzelsträngige DNA kann der codierende Strang sein, auch bekannt als der Sense-Strang, oder sie kann der nicht codierende Strang sein, auch bekannt als der Antisense-Strang.
Mit "isoliertem/isolierten" Nucleinsäuremolekül(en) ist ein Nucleinsäuremolekül gemeint, DNA oder RNA, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Zum Beispiel werden rekombinante DNA-Moleküle, die in einem Vektor enthalten sind, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert betrachtet. Weitere Beispiele für isolierte DNA-Moleküle umfassen rekombinante DNA-Moleküle, die in heterolgen Wirtszellen enthalten sind oder gereinigte (partiell oder im Wesentlichen) DNA-Moleküle in Lösung. Isolierte RNA-Moleküle umfassen in vivo- oder in vitro-RNA-Transkripte von DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung. Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin solche Moleküle, die synthetisch produziert wurden.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen DR5-DNA-Moleküle, die einen offenen Leserahmen (ORF) umfassen, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1; DNA-Moleküle, die die codierende Sequenz für das reife DR5-Protein umfassen; und DNA-Moleküle, die eine Sequenz umfassen, die wesentlich unterschiedlich ist zu den vorstehend beschriebenen, die aber wegen der Degeneration des genetischen Codes noch ein DR5-Protein codieren. Natürlich ist der genetische Code im Stand der Technik gut bekannt. Somit wäre es für den Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet Routine, solche degenerierten Varianten herzustellen.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die das DR5-Polypeptid codieren, das eine Aminosäuresequenz hat, die von dem cDNA-Clon in dem Plasmid codiert wird, das als ATCC-Hinterlegung No. 97920 am 7. März 1997 hinterlegt wurde. Bei einer weiteren Ausführungsform werden Nucleinsäuremoleküle bereit gestellt, die das reife DR5-Protein codieren oder das DR5-Polypeptid voller Länge, dem das N-terminale Methionin fehlt. Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das die Nucleotidsequenz hat, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, oder die Nucleotidsequenz der DR5-cDNA, die in dem vorstehend beschriebenen hinterlegten Clon enthalten ist, oder ein Nucleinsäuremolekül, das eine Sequenz hat, die zu einer der vorstehenden Sequenzen komplementär ist. Solche isolierten Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, sind als Sonden für die Kartierung mittels in situ-Hybridisierung mit Chromosomen von Nutzen, und für den Nachweis der Expression des DR5-Gens in humanem Gewebe, zum Beispiel mit der Northern Blot-Analyse.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf Fragmente der hier beschriebenen isolierten Nucleinsäuremoleküle gerichtet. Mit einem Fragment eines isolierten DNA-Moleküls, das die Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA hat, die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz, oder der dazu komplementäre Strang, sind DNA-Fragmente mit einer Länge von mindestens 15 nt gemeint, und mehr bevorzugt von mindestens 20 nt, noch mehr bevorzugt von mindestens 30 nt, und noch mehr bevorzugt von mindestens 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 oder 500 nt. Diese Fragmente haben viele Verwendungen, die diagnostische Sonden und Primer umfassen, wie hier diskutiert, sind aber nicht darauf beschränkt. Natürlich sind auch größere DNA-Fragmente mit einer Länge von 500–1500 nt gemäß der vorliegenden Erfindung von Nutzen, wie es Fragmente sind, die dem Großteil der, wenn nicht der gesamten, Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA entsprechen, oder wie gezeigt in SEQ ID NO: 1. Mit einem Fragment mit einer Länge von mindestens 20 nt sind zum Beispiel Fragmente gemeint, die 20 oder mehr aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz der hinterlegten DNA enthalten oder der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz.
Bevorzugte Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Nucleinsäuremoleküle, die codieren: ein Polypeptid, das die extrazelluläre Domäne von DR5 umfaßt (Aminosäurereste von etwa 52 bis etwa 184 in 1 (von etwa 1 bis etwa 133 in SEQ ID NO: 2)); ein Polypeptid, das die Transmembrandomäne von DR5 umfaßt (Aminosäurereste von etwa 185 bis etwa 208 in 1 (von etwa 134 bis etwa 157 in SEQ ID NO: 2)); ein Polypeptid, das die intrazelluläre Domäne von DR5 umfaßt (Aminosäurereste von etwa 209 bis etwa 411 in 1 (von etwa 158 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2)); und ein Polypeptid, das die Domäne für den Zelltod von DR5 umfaßt (Aminosäurereste von etwa 324 bis etwa 391 in 1 (von etwa 273 bis etwa 340 in SEQ ID NO: 2)). Da die Lage dieser Domänen durch Computergraphik vorhergesagt wurde, würde der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet anerkennen, daß die Aminosäurereste, die diese Domänen bilden, leicht variieren können (z.B. durch etwa 1 bis 15 Reste), in Abhängigkeit von den Kriterien, die für die Definition jeder Domäne verwendet wurden.
Bevorzugte Nucleinsäurefragmente der Erfindung codieren ein DR5-Polypeptid voller Länge, dem die Nucleotide fehlen, die das Amino-terminale Methionin codieren (Nucleotide 130–132 in SEQ ID NO: 1), da bekannt ist, daß das Methionin natürlicherweise abgespalten wird und solche Sequenzen können bei der gentechnischen Herstellung von DR5-Expressionsvektoren von Nutzen sein. Polypeptide, die solche Polynucleotide codieren, werden von der Erfindung auch erfaßt.
Bevorzugte Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin Nucleinsäuremoleküle, die ein Epitop tragende Teile des DR5-Proteins codieren. Insbesondere umfassen solche Nucleinsäurefragmente, sind aber nicht beschränkt auf, Nucleinsäuremoleküle, die codieren: ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 62 bis etwa 110 in 1 umfaßt (etwa 11 bis etwa 59 in SEQ ID NO: 2); ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 119 bis etwa 164 in 1 umfaßt (etwa 68 bis etwa 113 in SEQ ID NO: 2); ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 224 bis etwa 271 in 1 umfaßt (etwa 173 bis etwa 220 in SEQ ID NO: 2); und ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 275 bis etwa 370 in 1 umfaßt (etwa 224 bis etwa 319 in SEQ ID NO: 2). Die Erfinder haben bestimmt, daß die vorstehenden Polypeptidfragmente antigene Regionen des DR5-Proteins sind. Verfahren für die Bestimmung solcher, ein Epitop tragender Teile des DR5-Proteins werden im Detail nachstehend beschrieben.
Außerdem werden hier Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die Nucleotidsequenzen haben, die verwandt sind mit längeren Teilen von SEQ ID NO: 1 und die aus den folgenden verwandten cDNA-Clonen bestimmt wurden: HAPBU13R (SEQ ID NO: 6) und HSBBU76R (SEQ ID NO: 7). Die Nucleotidsequenzen von HAPBU13R und HSBBU76R sind in 4 gezeigt.
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Polynucleotid, das irgendeinen Teil von mindestens 30 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens 50 Nucleotiden, von SEQ ID NO: 1 von Rest 284 bis 1.362, vorzugsweise von 284 bis 681, umfaßt.
Ebenfalls wird hier ein isoliertes Nucleinsäuremolekül offenbart, das ein Polynucleotid umfaßt, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Teil des Polynucleotids in einem Nucleinsäuremolekül der vorstehend beschriebenen Erfindung hybridisiert, zum Beispiel die cDNA-Clone, die in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten sind. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" ist die Inkubation übernacht bei 42°C in einer Lösung gemeint, die umfaßt: 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt's Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C.
Mit einem Polynucleotid, das mit einem "Teil" eines Polynucleotids hybridisiert, ist ein Polynucleotid (DNA oder RNA) gemeint, das mit mindestens 15 Nucleotiden (nt) hybridisiert, und mehr bevorzugt mit mindestens 20 nt, noch mehr bevorzugt mit mindestens 30 nt und noch mehr bevorzugt mit 30–70 oder 80–150 nt, oder der gesamten Länge des Referenzpolynucleotids. Diese sind als diagnostische Sonden und Primer von Nutzen, wie vorstehend diskutiert und detaillierter nachstehend.
Mit einem Teil eines Polynucleotids von "mindestens 20 nt Länge" sind zum Beispiel 20 oder mehr aufeinanderfolgende Nucleotide von der Nucleotidsequenz des Referenzpolynucleotids gemeint (d.h. die hinterlegte cDNA oder die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz).
Natürlich wäre ein Polynucleotid, das nur mit einer Poly A-Sequenz (wie dem 3'-terminalen poly(A)-Schwanz der in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigten DR5-cDNA) oder mit einer komplementären Strecke von T (oder U)-Resten hybridisiert, nicht in einem Polynucleotid der Erfindung eingeschlossen, das verwendet wird, um mit einem Teil der Nucleinsäure der Erfindung zu hybridisieren, da ein solches Polynucleotid mit jedem Nucleinsäuremolekül hybridisieren würde, das einen poly(A)-Schwanz oder das Komplementäre dazu enthält (d.h. praktisch jeder doppelsträngige cDNA-Clon).
Wie gesagt können die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, die ein DR5-Polypeptid codieren, die codierende Sequenz für das reife Polypeptid selbst umfassen; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und zusätzlich Sequenzen, wie solche, die eine Leader- oder sekretorische Sequenz umfassen, wie eine prä- oder pro- oder präpro-Proteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid, mit oder ohne die vorstehend erwähnten zusätzlichen codierenden Sequenzen, zusammen mit zusätzlichen nicht codierenden Sequenzen, einschließlich zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Introns und nicht codierende 5'- und 3'-Sequenzen, wie die transkribierten, nicht translatierten Sequenzen, die bei der Transkription eine Rolle spielen, bei der mRNA-Prozessierung – einschließlich Splice- und Polyadenylierungssignale, zum Beispiel – der Ribosomenbindung und der Stabilität der mRNA; zusätzliche codierende Sequenzen, die zusätzliche Aminosäuren codieren, wie diejenigen, die zusätzliche Funktionalitäten bereitstellen. So kann zum Beispiel das Polypeptid mit einer Markersequenz fusioniert werden, wie einem Peptid, welches die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. Bei gewissen bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein hexa-Histidinpeptid, wie die Markierung, die in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt wird, unter anderem, von denen viele im Handel erhältlich sind. Wie zum Beispiel bei Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821–824 beschrieben, stellt das hexa-Histidin eine einfache Reinigung des Fusionproteins bereit. Die "HA"-Markierung ist ein anderes Peptid, das für die Reinigung von Nutzen ist, das einem Epitop entspricht, das von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein abgeleitet ist, das von Wilson et al., Cell 37: 767–778 (1984) beschrieben wurde. Wie nachstehend diskutiert umfassen andere solche Fusionproteine den DR5-Rezeptor, der am N- oder C-Terminus mit Fc fusioniert ist.
Zusätzlich werden hier Varianten der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung beschrieben, die Teile, Analoga oder Derivate des DR5-Rezeptors codieren. Varianten können natürlicherweise vorkommen, wie eine natürliche allelische Variante. Mit einer "allelischen Variante" ist eine von mehreren alternativen Formen eines Gens gemeint, das einen bestimmten Locus auf einem Chromosom eines Organismus einnimmt. Genes II, Lewin, B., Hrsg., John Wiley & Sons, New York (1985). Nicht natürlicherweise vorkommende Varianten können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Mutagenesetechniken produziert werden.
Solche Varianten umfassen diejenigen, die durch Nucleotidsubstitutionen, -deletionen oder -additionen produziert werden, die ein oder mehrer Nucleotide umfassen können. Die Varianten können in codierenden oder nicht codierenden Regionen verändert werden, oder beides. Veränderungen in den codierenden Regionen können konservative oder nicht konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen produzieren. Speziell bevorzugt unter diesen sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten des DR5-Rezeptors oder von Teilen davon nicht verändern. Speziell bevorzugt sind in diesem Hinblick konservative Substitutionen.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen isolierte Nucleinsäuremoleküle, die mindestens zu 95% identisch sind, und mehr bevorzugt mindestens zu 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind mit (a) einer Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 hat; (b) einer Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 hat, dem aber das aminoterminale Methionin fehlt; (c) einer Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz an den Positionen etwa 1 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2 hat; (d) einer Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz hat, die der cDNA-Clon codiert, der in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten ist; (e) einer Nucleotidsequenz, die das reife DR5-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz hat, die der cDNA-Clon codiert, der in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten ist; (f) einer Nucleotidsequenz, die die extrazelluläre Domäne von DR5 codiert, die die Aminosäuresequenz an den Positionen etwa 1 bis etwa 133 in SEQ ID NO: 2 hat, oder die extrazelluläre Domäne von DR5, die die cDNA codiert, die in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten ist; (g) einer Nucleotidsequenz, die die Transmembrandomäne von DR5 codiert, die die Aminosäuresequenz an den Positionen etwa 134 bis etwa 157 in SEQ ID NO: 2 hat, oder die Transmembrandomäne von DR5, die die cDNA codiert, die in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten ist; (h) einer Nucleotidsequenz, die die intrazelluläre Domäne von DR5 codiert, die die Aminosäuresequenz an den Positionen etwa 158 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2 hat, oder die intrazelluläre Domäne von DR5, die die cDNA codiert, die in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten ist; (i) einer Nucleotidsequenz, die die Domäne für den Zelltod von DR5 codiert, die die Aminosäuresequenz an den Positionen etwa 273 bis etwa 340 in SEQ ID NO: 2 hat, oder die Domäne für den Zelltod von DR5, die die cDNA codiert, die in der ATCC-Hinterlegung No. 97920 enthalten ist; (j) einer Nucleotidsequenz, die komplementär ist zu einer der Nucleotidsequenzen in (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) oder (i) vorstehend.
Mit einem Polynucleotid, das eine zum Beispiel mindestens zu 95% "identische" Nucleotidsequenz mit einem Referenznucleotid hat, das ein DR5-Polypeptid codiert, ist gemeint, daß die Nucleotidsequenz des Polynucleotids identisch ist mit der Referenzsequenz, außer daß die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro 100 Nucleotide der Referenznucleotidsequenz einschließen kann, die das DR5-Polypeptid codiert. Mit anderen Worten, um ein Polynucleotid zu erhalten, das eine Nucleotidsequenz hat, die zu mindestens 95% identisch ist mit einer Referenznucleotidsequenz, können bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder durch ein anderes Nucleotid substituiert sein, oder eine Zahl von Nucleotiden bis zu 5% der gesamten Nucleotide in der Referenzsequenz können in die Referenzsequenz insertiert sein. Die Referenzsequenz (query) kann die gesamte DR5-Nucleotidsequenz sein, die in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigt ist, oder jedes hier beschriebene Polynucleotidfragment.
Praktischerweise kann in herkömmlicher Weise unter Verwendung von bekannten Computerprogrammen wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden, ob irgendein spezielles Nucleinsäuremolekül zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit zum Beispiel der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, oder mit der Nucleotidsequenz des hinterlegten cDNA-Clons. Bestfit verwendet den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482–489 (1981), um das beste Segment an Homologie zwischen zwei Sequenzen zu finden. Wenn Bestfit oder jedes andere Sequenzvergleichsprogramm verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine spezielle Sequenz zum Beispiel zu 95% identisch mit einer Referenzsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist, werden die Parameter natürlich so festgelegt, daß der Prozentsatz an Identität über die gesamte Länge der Referenznucleotidsequenz berechnet wird und daß Lücken in der Homologie von bis zu 5% der Gesamtzahl an Nucleotiden in der Referenzsequenz erlaubt sind.
Bei einer speziellen Ausführungsform wird die Identität zwischen einer Referenzsequenz (query) (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung) und einer fraglichen Sequenz, auch als globaler Sequenzvergleich bezeichnet, unter Verwendung des FASTDB-Computerprogramms bestimmt, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Corp. App. Biosci. 6: 237–245 (1990)) beruht. Bevorzugte Parameter, die beim FASTDB-Vergleich von DNA-Sequenzen zur Kalkulation des Prozentsatzes an Identität verwendet werden, sind: Matrix = Unitary, k-tuple = 4, Mismatch Penalty = 1, Joining Penalty = 30, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty 0,05, Window Size = 500 oder die Länge der fraglichen Nucleotidsequenz, was immer kürzer ist. Wenn gemäß dieser Ausführungsform die fragliche Sequenz wegen 5'- oder 3'-Deletionen, nicht wegen interner Deletionen, kürzer als die query-Sequenz ist, wird an den Ergebnissen eine manuelle Korrektur vorgenommen, um der Tatsache gerecht zu werden, daß das FASTDB-Programm bei der Berechnung des Prozentsatzes an Identität 5'- und 3'-Verkürzungen der fraglichen Sequenz nicht Rechnung trägt. Für fragliche Sequenzen, die relativ zur query-Sequenz an den 5'- oder 3'-Enden verkürzt sind, wird der Prozentsatz an Identität durch Berechnung der Anzahl an Basen der query-Sequenz, die 5' und 3' der fraglichen Sequenz sind, korrigiert, die nicht passen/aneinanderliegen, als Prozentsatz der gesamten Basen der query-Sequenz. Eine Bestimmung, ob ein Nucleotid paßt/aneinanderliegt, wird durch die Resultate des FASTDB-Sequenzvergleichs bestimmt. Dieser Prozentsatz wird dann vom Prozentsatz an Identität abgezogen, der mit dem vorstehenden FASTDB-Programm unter Verwendung der spezifischen Parameter berechnet wurde, um zu einem endgültigen Ergebnis für den Prozentsatz an Identität zu kommen. Dieses korrigierte Ergebnis ist es, was für die Zwecke dieser Ausführungsform verwendet wird. Nur Basen außerhalb der 5'- und 3'-Basen der fraglichen Sequenz, wie gezeigt vom FASTDB-Sequenzvergleich, die nicht zur query-Sequenz passen/aneinanderliegen, werden zum Zwecke der manuellen Anpassung des Ergebnis für den Prozentsatz an Identität berechnet. Zum Beispiel wird eine fragliche Sequenz von 90 Basen mit einer query-Sequenz von 100 Basen verglichen, um den Prozentsatz an Identität zu bestimmen. Die Deletionen treten am 5'-Ende der fraglichen Sequenz auf und deshalb zeigt der FASTDB-Sequenzvergleich kein Passen/Aneinanderliegen der ersten 10 Basen am 5'-Ende. Die 10 ungepaarten Basen stellen 10% der Sequenz dar (Zahl der Basen an den 5'- und 3'-Enden/Gesamtzahl von Basen in der query-Sequenz), somit werden 10% von dem Ergebnis für den Prozentsatz an Identität abgezogen, der mit dem FASTDB-Programm berechnet wurde. Wenn die verbleibenden 90 Basen perfekt zueinander passen würden, wäre der endgültige Prozentsatz an Identität 90%. Bei einem anderen Beispiel wird eine fragliche Sequenz von 90 Basen mit einer query-Sequenz von 100 Basen verglichen. Dieses mal sind die Deletionen interne Deletionen, so daß am 5'- oder 3'-Ende der fraglichen Sequenz keine Basen sind, die mit der query nicht passen/aneinanderliegen. In diesem Fall wird der von FASTDB berechnete Prozentsatz an Identität nicht manuell korrigiert. Noch einmal, es werden nur Basen 5' und 3' der fraglichen Sequenz, die mit der query-Sequenz nicht passen/aneinanderliegen, korrigiert. Für die Zwecke dieser Ausführungsform werden keine anderen Korrekturen vorgenommen.
Die vorliegenden Anmeldung ist auf Nucleinsäuremoleküle gerichtet, die zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind mit der Nucleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNAs oder Fragmenten davon, unabhängig davon, ob sie ein Polypeptid codieren, das DR5-Aktivität hat. Dies ist so, weil, selbst wenn ein spezielles Nucleinsäuremolekül nicht ein Polypeptid codiert, das DR5-Aktivität hat, der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet dennoch wüßte, wie er die Nucleinsäuremoleküle verwenden müßte, zum Beispiel als Hybridisierungssonden oder als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Verwendungen der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, die nicht ein Polypeptid mit DR5-Aktivität codieren, umfassen inter alia: (1) die Isolierung des DR5-Gens oder seiner allelischen Varianten in einer cDNA-Bank; (2) die in situ-Hybridisierung (d.h. "FISH") zum chromosomalen Spreizen in der Metaphase, um die genaue chromosomale Lage des DR5-Gens zu liefern, wie beschrieben in Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); und (3) die Northern Blot-Analyse zum Nachweis der DR5-mRNA-Expression in spezifischen Geweben.
Bevorzugt werden jedoch Nucleinsäuremoleküle, die Sequenzen haben, die zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind mit der Nucleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNAs oder Fragmenten davon, die in der Tat ein Polypeptid codieren, das DR5-Proteinaktivität hat. Mit "Polypeptid, das DR5-Aktivität hat" sind Polypeptide gemeint, die eine ähnliche, aber nicht notwendigerweise identische Aktivität zu einer Aktivität des DR5-Proteins der Erfindung zeigen (entweder das Protein voller Länge oder vorzugsweise das reife Protein) wie in einem speziellen biologischen Test gemessen. Zum Beispiel kann die DR5-Proteinaktivität unter Verwendung des Tests für den Zelltod im Wesentlichen wie zuvor beschrieben gemessen werden (A. M. Chinnaiyan, et al., Cell 81: 505–12 (1995); M. P. Boldin, et al., J. Biol. Chem. 270: 7795–8 (1995); F. C. Kischkel, et al., EMBO 14: 5579–5588 (1995); A. M. Chinnaiyan, et al., J. Biol. Chem. 271: 4961–4965 (1996)) und wie nachstehend in Beispiel 5 dargestellt. In MCF7-Zellen werden Plasmide, die DR5 voller Länge oder ein Kandidatengen für den Zelltod, das einen Rezeptor enthält, co-transfiziert mit dem pLantern-Reporterkonstrukt, das grünes fluoreszierendes Protein codiert. Kerne von Zellen, die mit DR5 transfiziert sind, werden eine apoptopische Morphologie zeigen, wie gezeigt mit der DAPI-Färbung. Ähnlich wie TNFR-1 und Fas/APO-1 (M. Muzio, et al., Cell 85: 817–827 (1996); M. P. Boldin, et al., Cell 85: 803–815 (1996); M. Tewari, et al., J. Biol. Chem. 270: 3255–60 (1995)), wird die von DR5 induzierte Apoptose durch die Inhibitoren von ICE-ähnlichen Proteasen CrmA und z-VAD-fmk bevorzugt geblockt.
Wegen der Degeneration des genetischen Codes wird der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet natürlich sofort erkennen, daß eine große Zahl an Nucleinsäuremolekülen, die eine Sequenz haben, die zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNA, der Nucleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, oder Fragmenten davon, ein Polypeptid codieren, das "DR5-Proteinaktivität hat". Da in der Tat degenerierte Varianten dieser Nucleotidsequenzen alle dasselbe Polypeptid codieren, wird dies in vielen Fällen dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet auch ohne Durchführung des vorstehend beschriebenen Vergleichstest klar sein. Weiterhin wird im Stand der Technik anerkannt, daß solche Nucleinsäuremoleküle, die keine degenerierten Varianten sind, eine vernünftige Anzahl ein Polypeptid codieren, das DR5-Proteinaktivität hat. Dies deshalb, weil der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet sich vollständig klar über Nucleinsäuresubstitutionen ist, die entweder weniger wahrscheinlich oder unwahrscheinlich signifikant die Proteinfunktion berühren (d.h. Ersatz einer aliphatischen Aminosäure durch eine zweite aliphatischen Aminosäure).
Zum Beispiel wird eine Anleitung bezüglich der Herstellung von phänotypisch stillen Aminosäuresubstitutionen von Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306–1310 (1990), wo die Autoren ausführen, daß Proteine überraschend tolerant gegenüber Aminosäuresubstitutionen sind.
Polynucleotidtests
Ebenfalls hier beschrieben wird die Verwendung der DR5-Polynucleotide zum Nachweis von komplementären Polynucleotiden wie zum Beispiel als ein diagnostisches Reagens. Der Nachweis einer mutierten Form von DR5, die mit Dysfunktion einhergeht, wird ein diagnostisches Werkzeug bereitstellen, das zu einer Diagnose einer Krankheiten oder Veranlagung für eine Krankheit beiträgt oder sie definiert, die das Resultat der Unterexpression, der Überexpression oder geänderten Expression von DR5 oder einer löslichen Form davon ist, wie zum Beispiel Tumore oder Autoimmunerkrankungen.
Individuen, die Mutationen im DR5-Gen haben, können mittels einer Reihe von Techniken auf der Ebene der DNA nachgewiesen werden. Nucleinsäuren für die Diagnose können aus den Zellen eines Patienten erhalten werden, wie aus dem Blut, Urin, Speichel, Gewebematerial und Autopsiematerial. Die genomische DNA kann direkt für den Nachweis verwendet werden oder sie kann vor der Analyse unter Verwendung der PCR enzymatisch amplifiziert werden. (Saiki et al., Nature 324: 163–166 (1986)). Auf dieselbe Weise kann auch RNA oder cDNA verwendet werden. Als ein Beispiel können PCR-Primer, die zu der Nucleinsäure komplementär sind, die DR5 codiert, verwendet werden, um DR5-Expression und Mutationen zu identifizieren. Zum Beispiel können Deletionen und Inserierungen durch eine Veränderung in der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit dem normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung von amplifizierter DNA mit radioaktiv markierter DR5-RNA oder alternativ radioaktiv markierten DR5-Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Perfekt passende Sequenzen können von ungepaarten Duplexen durch RNase A-Verdau oder Unterschieden bei den Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Sequenzunterschiede zwischen einem Referenzgen und Genen, die Mutationen haben, können auch mittels direkter DNA-Sequenzierung offenbart werden. Außerdem können clonierte DNA-Segmente als Sonden zum Nachweis von spezifischen DNA-Segmenten verwendet werden. Die Empfindlichkeit solcher Verfahren kann durch geeignete Verwendung der PCR oder anderer Amplifikationsverfahren stark erhöht werden. Zum Beispiel wird ein Sequenzierprimer mit doppelsträngigem PCR-Produkt verwendet oder ein einzelsträngiges Matrizenmolekül, das mittels modifizierter PCR erzeugt wurde. Die Sequenzbestimmung wird mit herkömmlichen Verfahren mit radioaktiv markiertem Nucleotid oder durch automatische Sequenzierverfahren mit Fluoreszenzmarkierung durchgeführt.
Die genetische Testung, basierend auf DNA-Sequenzunterschieden, kann durch den Nachweis der Veränderung der elektrophoretischen Beweglichkeit von DNA-Fragmenten in Gelen erreicht werden, mit oder ohne denaturierenden Mitteln.
Kleine Sequenzdeletionen und Insertionen können mit hochauflösender Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente von verschiedenen Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, in denen die Beweglichkeiten von verschiedenen DNA-Fragmente in dem Gel gemäß ihrem spezifischen Schmelzen oder ihrer partiellen Schmelztemperaturen verlangsamt werden (vgl. z.B. Myers et al., Science 230: 1242 (1985)).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch mit dem Nuclease-Schutztest, wie dem RNase- und S1-Schutz, oder dem chemischen Spaltverfahren (vgl. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397–4401 (1985)) offenbart werden.
Somit kann der Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen mit Verfahren erreicht werden, die umfassen, aber nicht beschränkt sind auf die Hybridisierung, den RNase-Schutz, die chemische Spaltung, die direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (d.h. Restriktionsfragmente-Längenpolymorphismus ("RFLP") und Southern Blotting von genomischer DNA).
Zusätzlich zu eher herkömmlicher Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch in situ-Analyse nachgewiesen werden.
Vektoren und Wirtszellen
Die vorliegenden Erfindung betrifft auch Vektoren, die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung enthalten, Wirtszellen, die mit den Vektoren der Erfindung gentechnisch verändert wurden, und die Produktion von Polypeptiden der Erfindung mit rekombinanten Techniken.
Wirtszellen können gentechnisch so verändert werden, daß sie die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten und die Polypeptide der vorliegenden Erfindung exprimieren. Die Polynucleotide können allein eingebracht werden oder mit anderen Polynucleotiden. Solche anderen Polynucleotide können unabhängig eingebracht werden, gemeinsam eingebracht werden oder mit den Polynucleotiden der Erfindung verbunden eingebracht werden.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann der Vektor zum Beispiel ein Plasmidvektor sein, ein einzelsträngiger oder doppelsträngiger Phagenvektor, ein einzelsträngiger oder doppelsträngiger viraler RNA- oder DNA-Vektor. Solche Vektoren können mit wohl bekannten Techniken für die Einbringung von DNA oder RNA in Zellen als Polynucleotide in die Zellen eingebracht werden, vorzugsweise DNA. Virale Vektoren können zur Replikation in der Lage oder defekt bezüglich der Replikation sein. Im letzteren Fall wird die Virusvermehrung im allgemeinen nur in komplementierenden Wirtszellen stattfinden.
Bei den Vektoren sind in gewissen Fällen diejenigen für die Expression der Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Im allgemeinen umfassen solche Vektoren cis-agierende Kontrollregionen, die für die Expression in einem Wirt effektiv sind, operativ verknüpft mit dem zu exprimierenden Polynucleotid. Geeignete trans-agierende Faktoren werden entweder von dem Wirt bereitgestellt, durch einen ergänzenden Vektor bereitgestellt oder nach Einbringung in den Wirt von dem Vektor selbst bereitgestellt.
Eine große Vielzahl an Expressionsvektoren kann für die Expression des Polypeptids der Erfindung verwendet werden. Solche Vektoren umfassen chromosomale, episomale und von Viren abgeleitete Vektoren, d.h. von bakteriellen Plasmiden abgeleitete Vektoren, von Bakteriophagen, von Hefe-Episomen, von chromosomalen Elementen der Hefe, von Viren wie Baculoviren, Papova-Viren wie SV40, Vaccinia-Viren, Adenoviren, Geflügelpest-Viren, Pseudotollwut-Viren und Retroviren, und Vektoren, die von Kombinationen davon abgeleitet sind, wie diejenigen, die von genetischen Elementen von Plasmiden und Bakteriophagen abgeleitet sind, wie Cosmide und Phagemide, sie alle können für die Expression gemäß dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Im allgemeinen kann in dieser Hinsicht jeder Vektor verwendet werden, der geeignet ist, Polynucleotide für die Expression eines Polypeptids in einem Wirt zu erhalten, zu vermehren oder zu exprimieren.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist operativ verknüpft mit einer geeigneten Kontrollsequenz/geeigneten Kontrollsequenzen, einschließlich zum Beispiel einem Promotor für die Steuerung der Transkription der mRNA. Beispiele für solche Promotoren umfassen den Phagen-Promotor lambda PL, die E. coli-Promotoren lac, trp und tac, die frühen und späten SV40-Promotoren und Promotoren von retroviralen LTRs, um nur einige der wohl bekannten Promotoren zu nennen. Im allgemeinen werden Expressionskonstrukte Stellen für die Transkription, Initiation und Termination enthalten, und in der transkribierten Regionen eine Ribosomenbindungsstelle für die Translation. Der codierende Bereich der reifen Transkripte, der von den Konstrukten exprimiert wird, wird am Anfang ein die Translation initiierendes AUG enthalten und ein Terminationscodon (UAA, UGA oder UAG), in geeigneter Weise am Ende des zu translatierenden Polypeptids gelegen.
Zusätzlich können die Konstrukte Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren und hervorrufen. Im allgemeinen werden solche Regionen über die Kontrolle der Transkription arbeiten, wie mittels Repressorbindungsstellen und Enhancer, unter anderem.
Vektoren für die Vermehrung und Expression werden im allgemeinen selektierbare Marker enthalten. Solche Marker können auch für die Amplifikation geeignet sein oder der Vektor kann für diesen Zweck weiter Marker enthalten. In diesem Hinblick enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markergene, um einen phänotypischen Stamm für die Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen. Diese Marker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für die eukaryontische Zellkultur und Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgene für die Züchtung von E. coli und anderen Bakterien.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz enthält, wie woanders hier beschrieben, ebenso wie einen geeigneten Promotor und andere geeignete Kontrollsequenzen, kann unter Verwendung einer Vielzahl von wohl bekannten Techniken, die für die Expression des gewünschten Polypeptids dort geeignet sind, in einen geeigneten Wirt eingebracht werden. Repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten umfassen Bakterienzellen, wie E. coli-, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen, Pilzzellen wie Hefezellen, Insektenzellen wie Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; tierische Zellen wie CHO-, COS- und Bowes Melanoma-Zellen; und Pflanzenzellen. Geeignete Kulturmedien und Bedingungen für die vorstehend beschriebenen Wirtszellen sind im Stand der Technik bekannt.
Unter den Vektoren, die für die Verwendung in Bakterien bevorzugt sind, sind pQE70, pQE60 und pQE-9, verfügbar von Qiagen; pBS-Vektoren, Pagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, verfügbar von Stratagen; und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, verfügbar von Pharmacia. Unter den bevorzugten eukaryontischen Vektoren sind pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, verfügbar von Stratagen; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, verfügbar von Pharmacia. Diese Vektoren sind nur zu Illustrationszwecken von den vielen, kommerziell verfügbaren und dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannten Vektoren aufgelistet.
Die Auswahl von geeigneten Vektoren und Promotoren für die Expression in einer Wirtszelle ist ein wohl bekanntes Verfahren, und die erforderlichen Techniken für die Konstruktion von Expressionsvektoren, das Einbringen des Vektors in die Wirtszelle und die Expression in dem Wirt sind Routineverfahren im Stand der Technik.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen und diskutierten Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle sein, wie eine Säugerzelle, oder eine niedrigere eukaryontische Zelle sein, wie eine Hefezelle, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein, wie eine Bakterienzelle. Es kann ein Wirtsstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingefügten Gensequenz moduliert oder der das Genprodukt in der spezifisch gewünschten Art modifiziert und prozessiert. Die Expression gewisser Promotoren kann in der Gegenwart gewisser Induktoren erhöht werden: somit kann die Expression des gentechnisch hergestellten Polypeptids kontrolliert werden. Darüber hinaus haben verschiedene Wirtszellen Charakteristika und spezifische Mechanismen für die translationale und post-translationale Prozessierung und Modifikation (z.B. Phosphorylierung, Spaltung) von Proteinen. Geeignete Zelllinien können ausgesucht werden, um die gewünschten Modifikationen und gewünschte Prozessierung des fremdem exprimierten Proteins sicherzustellen.
Die Einbringung des Konstrukts in die Wirtszelle kann mittels der Calciumphosphat-Transfektion, der durch DEAE-Dextran vermittelten Transfektion, der durch kationische Lipide vermittelten Transfektion, der Elektroporation, der Transduktion, der Infektion oder anderer Verfahren erreicht werden. Solche Verfahren sind in vielen Standardlaborhandbüchern beschrieben, wie Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986).
Das Polypeptid kann in einer modifizierten Form exprimiert werden, wie ein Fusionsprotein (das das Polypeptid über eine Peptidbindung verknüpft mit einer heterologen Proteinsequenz (eines verschiedenen Proteins) umfaßt), und kann nicht nur sekretorische Signale enthalten, sondern auch zusätzliche heterologe funktionelle Regionen. Solch ein Fusionsprotein kann durch Ligierung der Polynucleotide der Erfindung und der gewünschten Nucleinsäuresequenz, die die gewünschte Aminosäuresequenz codiert, miteinander im richtigen Leserahmen mit im Stand der Technik bekannten Verfahren und Expression des Fusionsproteins mit im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann ein solches Fusionsprotein mit Verfahren der Proteinsynthese hergestellt werden, z.B. unter Verwendung eines Peptidsynthesegeräts. So kann zum Beispiel eine Region von zusätzlichen Aminosäuren, insbesondere geladenen Aminosäuren, zum N-Terminus des Polypeptids hinzugefügt werden, um die Stabilität und Persistenz in der Wirtszelle während der Reinigung oder während der anschließenden Handhabung und Lagerung zu verbessern. Zusätzlich kann zu dem Polypeptid auch eine Region hinzugefügt werden, um die Reinigung zu erleichtern. Solche Regionen können vor der endgültigen Herstellung des Polypeptids entfernt werden. Das Hinzufügen von Peptidgruppen zu Polypeptiden, um die Sekretion oder das Ausscheiden zu ermöglichen, um die Stabilität zu verbessern und die Reinigung zu erleichtern, unter anderem, sind vertraut und im Stand der Technik Routineverfahren. Ein bevorzugtes Fusionsprotein umfaßt eine heterologe Region von Immunglobulin, die für die Solubilisierung von Proteinen von Nutzen ist. Zum Beispiel offenbart die EP-A-0 464 533 (kanadisches Gegenstück 2045869) Fusionsproteine, die verschiedene Anteile der konstanten Region von Immunglobulinmolekülen zusammen mit anderen menschlichen Proteinen oder einem Teil davon umfassen. In vielen Fällen ist der Fc-Teil in einem Fusionsprotein durchaus von Vorteil bei der Verwendung in der Therapie und Diagnose und resultiert dabei zum Beispiel in verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften (EP-A 0232 262). Andererseits wäre es für einige Verwendungen wünschenswert, in der Lage zu sein, den Fc-Teil nach der Expression, dem Nachweis und der Reinigung des Fusionsproteins auf die beschriebene vorteilhafte Weise zu deletieren. Dies ist der Fall, wenn sich der Fc-Teil als Hindernis bei der Verwendung in der Therapie und Diagnose herausstellt, wenn zum Beispiel das Fusionsprotein als ein Antigen für die Immunisierung verwendet werden soll. Bei der Entdeckung von Wirkstoffen wurden zum Beispiel menschliche Proteine wie der hIL-5-Rezeptor zum Zwecke des High-Troughput-Screenings mit Fc-Teilen fusioniert, um Antagonisten von hIL-5 zu identifizieren. Vgl. D. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, 8: 52–58 (1995) und K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 270: 9459–9471 (1995).
Die DR5-Polypeptide können mit Standardverfahren aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt werden, die umfassen, aber nicht beschränkt sind auf die Ammoniumsulfat- oder Ethanolausfällung, die Säurextraktion, die anionische oder kationische Ionenaustauscherchromatographie, die Phosphocellulose-Chromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, die Affinitätschromatographie, die Hydroxylapatit-Chromatographie und die Lektin-Chromatographie. Am meisten bevorzugt wird die Hochleistungs-Flüssigchromatographie ("HPLC") für die Reinigung verwendet. Wohl bekannte Techniken für die Rückfaltung von Proteinen können zur Erzeugung der aktiven Konformation verwendet werden, wenn das Polypeptid während der Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen auf natürliche Weise gereinigte Produkte, Produkte von chemischen Syntheseverfahren und Produkte, die mit rekombinanten Techniken von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt produziert wurden, einschließlich zum Beispiel Bakterienzellen, Hefezellen, Zellen höherer Pflanzen, Insektenzellen und Säugerzellen. In Abhängigkeit von dem bei der rekombinanten Produktion verwendeten Wirt, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert sein oder sie können nicht glycosyliert sein. Zusätzlich können die Polypeptide der Erfindung auch einen anfänglichen modifizierten Methioninrest umfassen, in einigen Fällen als ein Ergebnis eines vom Wirt vermittelten Prozesses.
Die DR5-Polynucleotide und Polypeptide können gemäß der vorliegenden Erfindung für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, insbesondere denjenigen, die die chemischen und biologischen Eigenschaften von DR5 verwenden. Darunter sind Anwendungen bei der Behandlung von Tumoren, der Resistenz gegen Parasiten, Bakterien und Viren, zur Induktion der Proliferation von T-Zellen, Endothelzellen und gewissen hämatopoietischen Zellen, der Behandlung von Restenose, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, zur Regulation von anti-viralen Reaktionen und zur Verhinderung gewisser Autoimmunerkrankungen nach Stimulierung von DR5 mit einem Agonisten. Zusätzliche Anwendungen betreffen die Diagnose und die Behandlung von Störungen von Zellen, Geweben und Organismen. Diese Aspekte der Erfindung werden nachstehend weiter diskutiert.
DR5-Polypeptide und Fragmente
Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes DR5-Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz hat, wie sie die hinterlegte cDNA codiert, oder die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, oder ein Polypeptid oder Peptid, das einen Teil der vorstehenden Polypeptide umfaßt.
Es ist im Stand der Technik bekannt, daß einiges der Aminosäuresequenz von DR5 ohne signifikanten Effekt auf die Struktur oder Funktion des Proteins variiert werden kann. Wenn solche Unterschiede in der Sequenz in Betracht gezogen werden, sollte man daran denken, daß es kritische Gebiete in dem Protein sind, die die Aktivität bestimmen. Solche Gebiete werden üblicherweise Reste umfassen, die die Ligandenbindungsstelle oder die Domäne für den Zelltod bilden, oder die Tertiärstrukturen bilden, die diese Domänen betreffen.
Somit umfaßt die Erfindung weiterhin Variationen des DR5-Proteins, die eine substantielle DR5-Proteinaktivität zeigen oder die Regionen von DR5 einschließen, wie die nachstehend diskutierten Proteinteile. Solche Mutanten umfassen Deletionen, Inserierungen, Inversionen, Wiederholungen und Typsubstitutionen. Wie vorstehend angedeutet kann eine Anleitung hinsichtlich der Frage, welche Aminosäureaustäusche wahrscheinlich phänotypisch still sind, in Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306–1310 (1990) gefunden werden.
Somit kann das Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids von SEQ ID NO: 2 oder des von der hinterlegten cDNA codierten sein (i) eines, bei dem mindestens einer oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservativen oder einen nicht konservativen Aminosäurerest (vorzugsweise einen konservativen Aminosäurerest(e), und mehr bevorzugt mindestens einen, aber weniger als zehn konservative Aminosäurereste) substituiert sind, und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann vom genetischen Code codiert sein oder nicht, oder (ii) eines, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe umfassen, oder (iii) eines, bei dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie einer Verbindung zur Erhöhung der Halbwertszeit des Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) eines, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie ein Fusionsregionpeptid mit IgG Fc oder einer Leader- oder sekretorischen Sequenz oder einer Sequenz, die für die Reinigung des reifen Polypeptids oder einer Proproteinsequenz verwendet wird. Solche Fragmente, Derivate und Analoga werden nach den Lehren hier als im Können des Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet liegend betrachtet.
Von besonderem Interesse sind Substitutionen von geladenen Aminosäuren durch andere geladene Aminosäuren und durch neutrale oder negativ geladene Aminosäuren. Das letztere resultiert in Proteinen mit reduzierter positiver Ladung, um die Charakteristika des DR5-Proteins zu verbessern. Das Verhindern der Aggregation ist sehr erwünscht. Die Aggregation von Proteinen resultiert nicht nur in einem Verlust von Aktivität, sondern kann auch bei der Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen problematisch sein, weil sie immunogen sein können. (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2: 331–340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838–845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307–377 (1993)).
Der Ersatz von Aminosäuren kann auch die Selektivität der Bindung an Zelloberflächenrezeptoren verändern. Ostade et al., Nature 361: 266–268 (1993) beschreibt gewisse Mutationen, die in der selektiven Bindung von TNF-alpha an nur einen der bekannten Typen von TNR-Rezeptoren resultieren. Somit kann der DR5-Rezeptor der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere Nucleinsäuresubstitutionen, Deletionen oder Additionen umfassen, entweder von natürlichen Mutationen oder menschlicher Manipulation.
Wie angezeigt, sind die Veränderungen vorzugsweise kleinerer Natur, wie konservative Nucleinsäuresubstitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinflussen (vgl. Tabelle 1).
TABELLE 1. Konservative Nucleinsäuresubstitutionen
Die Aminosäuren in dem DR5-Protein der vorliegenden Erfindung, die für die Funktion essentiell sind, können mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren wie der stellengerichteten Mutagenese oder der Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085 (1989)) identifiziert werden. Das letztere Verfahren führt einzelne Alaninmutationen an jedem Rest in dem Molekül ein. Die resultierenden mutanten Moleküle werden dann auf ihre biologisch Aktivität wie der Rezeptorbindung in vitro oder der proliferativen Aktivität in vitro getestet. Stellen, die kritisch sind für die Bindung Ligand-Rezeptor können auch durch die Strukturanalyse wie der Kristallisation, der kernmagnetischen Resonanz oder der Photoaffinitätsmarkierung bestimmt werden (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904 (1992) und de Vos et al., Science 255: 306–312 (1992)).
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in isolierter Form bereit gestellt. Mit "isoliertes Polypeptid" ist ein Polypeptid gemeint, das aus einer natürlichen Umgebung entfernt wurde. Somit wird ein Polypeptid, das in einer rekombinanten Wirtszelle produziert oder enthalten ist, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert angesehen. Auch als ein "isoliertes Polypeptid" betrachtet werden Polypeptide, die aus einer rekombinanten Wirtszelle partiell oder substantiell gereinigt wurden. Zum Beispiel kann eine rekombinant produzierte Version des DR5-Polypeptids mit dem Einschrittverfahren substantiell gereinigt werden, das in Smith und Johnson, Gene 67: 31–40 (1988) beschrieben ist.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen auch das Polypeptid, das durch die hinterlegte cDNA codiert wird, einschließlich des Leaders; das reife Polypeptid, das durch die hinterlegte cDNA codiert wird, minus Leader, (d.h. das reife Protein); ein Polypeptid, das die Aminosäuren etwa –51 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2 umfaßt; ein Polypeptid, das die Aminosäuren etwa – 50 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2 umfaßt; ein Polypeptid, das die Aminosäuren etwa 1 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2 umfaßt; ein Polypeptid, das die extrazelluläre Domäne umfaßt; ein Polypeptid, das die Transmembrandomäne umfaßt; ein Polypeptid, das die intrazelluläre Domäne umfaßt; ein Polypeptid, das die extrazelluläre und intrazelluläre Domäne umfasst, wobei die gesamte oder ein Teil der Transmembrandomäne deletiert ist; und ein Polypeptid, das die Domäne für den Zelltod umfaßt, ebenso wie Polypeptide, die mindestens zu 90% oder 95% identisch sind, noch mehr bevorzugt mindestens zu 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind mit den vorstehend beschriebenen Polypeptiden, und umfassen auch Teile von solchen Polypeptiden mit mindestens 30 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren.
Mit einem Polypeptid, das eine zum Beispiel mindestens zu 95% "identische" Aminosäuresequenz mit dem DR5-Polypeptid hat, ist gemeint, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids identisch ist mit der Referenzsequenz, außer daß die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureveränderungen pro je 100 Aminosäuren der Referenzaminosäure des DR5-Polypeptids umfassen kann. Mit anderen Worten, um ein Polypeptid zu erhalten, das eine Aminosäuresequenz hat, die zu mindestens 95% identisch ist mit einer Referenzaminosäuresequenz, können bis zu 5% der Aminosäurereste in der Referenzsequenz deletiert oder durch eine andere Aminosäure substituiert sein, oder eine Zahl von Aminosäuren bis zu 5% der gesamten Aminosäurereste in der Referenzsequenz können in die Referenzsequenz insertiert sein. Diese Veränderungen der Referenzsequenz können an amino- oder carboxyterminalen Positionen der Referenzaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen auftreten, sie können entweder einzeln oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen zwischen den Resten in die Referenzsequenz eingestreut.
Praktischerweise kann in herkömmlicher Weise unter Verwendung von bekannten Computerprogrammen wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden, ob irgendein spezielles Polypeptid zu mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit zum Beispiel der Aminosäuresequenz ist, die in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigt ist, mit der Aminosäuresequenz, die die hinterlegten cDNA-Clone codieren, oder Fragmenten davon. Wenn Bestfit oder jedes andere Sequenzvergleichsprogramm verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine spezielle Sequenz zum Beispiel zu 95% identisch mit einer Referenzsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist, werden die Parameter natürlich so festgelegt, daß der Prozentsatz an Identität über die gesamte Länge der Referenzaminosäuresequenz berechnet wird und daß Lücken in der Homologie von bis zu 5% der Gesamtzahl an Aminosäurereste in der Referenzsequenz erlaubt sind.
Bei einer spezifischen Ausführungsform wird die Identität zwischen einer Referenz (query)-sequenz (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung) und der fragliche Sequenz, auch bezeichnet als eine globale Sequenzaneinanderlegung, unter Verwendung des FASTDB-Computerprogramms bestimmt, basierend auf dem Algorithmus von Brutlag et al., (Corp. App. Biosci. 6: 237–245 (1990)). Bevorzugte Parameter, die beim Aminosäureaneinanderlegen mit verwendet werden, sind: Matrix = PAM 0, k-tuple = 2, Mismatch Penalty = 1, Joining Penalty = 20, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1, Window Size = Sequenzlänge, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty 0,05, Window Size = 500 oder die Länge der fraglichen Aminosäuresequenz, was immer kürzer ist. Wenn gemäß dieser Ausführungsform die fragliche Sequenz wegen C- oder N-terminalen Deletionen, nicht wegen interner Deletionen, kürzer als die query-Sequenz ist, wird an den Ergebnissen eine manuelle Korrektur vorgenommen, um der Tatsache gerecht zu werden, daß das FASTDB-Programm bei der Berechnung des Prozentsatzes an Identität C- und N-terminalen-Verkürzungen der fraglichen Sequenz nicht Rechnung trägt. Für fragliche Sequenzen, die relativ zur query-Sequenz an den C- oder N-Termini verkürzt sind, wird der Prozentsatz an Identität durch Berechnung der Anzahl an Resten der query-Sequenz korrigiert, die N- und C-terminal der fraglichen Sequenz sind und die nicht mit einem fraglichen Rest passen/aneinanderliegen, als ein Prozentsatz der gesamten Basen der query-Sequenz. Eine Bestimmung, ob ein Rest paßt/aneinanderliegt, wird durch die Resultate des FASTDB-Sequenzvergleichs bestimmt. Dieser Prozentsatz wird dann vom Prozentsatz an Identität abgezogen, der mit dem vorstehenden FASTDB-Programm unter Verwendung der spezifischen Parameter berechnet wurde, um zu einem endgültigen Ergebnis für den Prozentsatz an Identität zu kommen. Dieses endgültige Ergebnis des Prozentsatzes an Identität ist es, was für die Zwecke dieser Ausführungsform verwendet wird. Nur Reste der N- und C-Termini der fraglichen Sequenz, die nicht zur query-Sequenz passen/aneinanderliegen, werden zum Zwecke der manuellen Anpassung des Ergebnis für den Prozentsatz an Identität berechnet. Das heißt nur query-Restpositionen außerhalb der am weitesten außen liegenden N- und C-terminalen Reste der fraglichen Sequenz. Zum Beispiel wird eine fragliche Sequenz mit 90 Aminosäureresten verglichen mit einer fraglichen query-Sequenz mit 100 Aminosäureresten, um den Prozentsatz an Identität zu bestimmen. Die Deletionen treten am N-Terminus der fraglichen Sequenz auf und daher zeigt der FASTB-Vergleich kein Passen/Aneinanderliegen bei den ersten 10 Resten des N-Terminus. Die 10 ungepaarten Reste stellen 10% der Sequenz dar (Zahl der Reste an den N- und C-Termini nicht passend/Gesamtzahl der Reste in der query-Sequenz), somit werden 10% von dem Ergebnis für den Prozentsatz an Identität abgezogen, der mit dem FASTDB-Programm berechnet wurde. Wenn die verbleibenden 90 Reste perfekt zueinander passen würden, wäre der endgültige Prozentsatz an Identität 90%. Bei einem anderen Beispiel wird eine fragliche Sequenz von 90 Resten mit einer query-Sequenz von 100 Resten verglichen. Dieses mal sind die Deletionen interne Deletionen, so daß an den N- und C-Termini der fraglichen Sequenz keine Reste sind, die mit der query nicht passen/aneinanderliegen. In diesem Fall wird der von FASTDB berechnete Prozentsatz an Identität nicht manuell korrigiert. Noch einmal, es werden nur Restepositionen außerhalb der N- und C-terminalen Enden der fraglichen Sequenz, wie beim Aneinanderlegen mit FASTE gezeigt, die mit der query-Sequenz nicht passen/aneinanderliegen, manuell korrigiert. Für die Zwecke dieser Ausführungsform werden keine anderen Korrekturen vorgenommen.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung könnte unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, als Molekulargewichtsmarker auf SDS-PAGE-Gelen oder auf Molekularsieb-Gelfiltrationssäulen verwendet werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, daß das DR5-Polypeptid ein Protein mit 411 Resten ist, das drei hauptsächliche Strukturdomänen zeigt. Zuerst wurde die Ligandenbindungsdomäne innerhalb der Reste von etwa 52 bis etwa 184 in 1 (Aminosäurereste von etwa 1 bis etwa 133 in SEQ ID NO: 2) identifiziert. Als zweites wurde die Transmembrandomäne innerhalb der Reste von etwa 185 bis etwa 208 in 1 (Aminosäurereste von etwa 134 bis etwa 157 in SEQ ID NO: 2) identifiziert. Als drittes wurde die intrazelluläre Domäne innerhalb der Reste von etwa 209 bis etwa 411 in 1 (Aminosäurereste von etwa 158 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2) identifiziert. Wichtig ist, daß die intrazelluläre Domäne eine Domäne für den Zelltod von etwa 324 bis etwa 391 (Aminosäurereste von etwa 273 bis etwa 340 in SEQ ID NO: 2) umfaßt. Weitere bevorzugte Fragmente des in 1 gezeigten Polypeptids umfassen das reife Protein von den Resten etwa 52 bis etwa 411 (Aminosäurereste von etwa 1 bis etwa 360 in SEQ ID NO: 2) und lösliche Polypeptide, die die gesamten oder einen Teil der extrazellulären und intrazellulären Domänen umfassen, denen aber die Transmembrandomäne fehlt.
Die Erfindung stellt weiterhin DR5-Polypeptide bereit, die der hinterlegte cDNA-Clon codiert, einschließlich des Leaders und DR5-Polypeptidfragmenten, die ausgesucht sind aus dem reifen Protein, der extrazellulären Domäne, der Transmembrandomäne, der intrazellulären Domäne, der Domäne für den Zelltod und allen Kombinationen davon.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Peptid oder ein Polypeptid bereit, das einen ein Epitop tragenden Bereich des hier beschriebenen Polypeptids umfasst. Das Epitop dieses Polypeptidteils ist ein immunogenes oder antigenes Epitop des Polypeptids der Erfindung. Ein "immunogenes Epitop" ist als ein Teil eines Proteins definiert, der eine Antikörperreaktion hervorruft, wenn das gesamte Protein das Immunogen ist. Andererseits ist eine Region eines Proteinmoleküls, an die ein Antikörper binden kann, als ein "antigenes Epitop" definiert. Die Anzahl an immunogenen Epitopen eines Proteins ist im allgemeinen weniger als die Anzahl an antigenen Epitopen. Vgl. zum Beispiel Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998–4002 (1983).
Hinsichtlich der Selektion von Peptiden oder Polypeptiden, die ein antigenes Epitop tragen (d.h. die eine Region eines Proteinmoleküls enthalten, an die ein Antikörper binden kann), ist es im Stand der Technik wohl bekannt, daß relativ kurze synthetische Peptide, die einen Teil einer Proteinsequenz nachbilden, üblicherweise zum Hervorrufen eines Antiserums in der Lage sind, das mit dem teilweise nachgebildeten Protein reagiert. Vgl. zum Beispiel Sutcliffe, J. G., Shinnick, T. M., Green, N. und Learner, R. A. "Antibodies That React With Predetermined Sites an Proteins", Science 219: 660–666 (1983). Peptide, die zum Hervorrufen von Protein-reaktiven Seren in der Lage sind, sind häufig dargestellt in der Primärsequenz eines Proteins, können mit einem Satz einfacher chemischer Regeln charakterisiert werden und sind weder auf die immundominanten Regionen von intakten Proteinen beschränkt (d.h. immunogene Epitope) noch auf die Amino- oder Carboxylenden.
Antigenes Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Erfindung sind deshalb zur Erzeugung von Antikörpern von Nutzen, einschließlich monoclonaler Antikörper, die spezifisch an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Vgl. zum Beispiel Wilson et al., Cell 37: 767–778 (1984), Seite 777. Antigenes Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Erfindung enthalten vorzugsweise eine Sequenz von mindestens sieben, mehr bevorzugt mindestens neun und am meisten bevorzugt zwischen mindestens etwa 15 bis etwa 30 Aminosäuren, die innerhalb der Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung enthalten sind.
Nicht beschränkende Beispiele von antigenen Polypeptiden oder Peptiden, die zur Erzeugung von DR5-spezifischen Antikörpern verwendet werden können, umfassen: ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 62 bis etwa 110 in 1 (etwa 11 bis etwa 59 in SEQ ID NO: 2) umfaßt; ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 119 bis etwa 164 in 1 (etwa 68 bis etwa 113 in SEQ ID NO: 2) umfaßt; ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 224 bis etwa 271 in 1 (etwa 173 bis etwa 220 in SEQ ID NO: 2) umfaßt; und ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 275 bis etwa 370 in 1 (etwa 224 bis etwa 319 in SEQ ID NO: 2) umfaßt. Wie vorstehend angezeigt, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestimmt, daß die vorstehenden Polypeptidfragmente antigene Regionen des DR5-Proteins sind.
Die Epitop-tragenden Peptide und Polypeptide der Erfindung können mit jedem herkömmlichen Mittel produziert werden. Hougthen, R. A., "General Method for the Rapid Solid-Phase Sythesis of Large Numbers of Peptides: Specificity of Antigen-Antibody Interaction at the Level of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135 (1985). Dieses "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)"-Verfahren ist weiterhin beschrieben in dem U.S.-Patent No. 4,631,211 für Hougthen et al. (1986).
Wie der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet erkennen wird, können die DR5-Polypeptide der vorliegenden Erfindung und die vorstehend beschriebenen Epitop-tragenden Fragmente davon mit Teilen der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgG) kombiniert werden, was in chimären Polypeptiden resultiert. Diese Fusionsproteine erleichtern die Reinigung und zeigen in vivo eine erhöhte Halbwertszeit. Dies wurde z.B. für chimäre Proteine gezeigt, die aus den ersten zwei Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Region der schweren oder leichten Kette von Säuger-Immunglobulinen bestanden (EPA 394,287; Traunecker et al., Nature 331: 84–86 (1988)). Fusionsproteine, die wegen des IgG-Teils eine Disulfid-verknüpfte dimere Struktur haben, können auch bei der Bindung und Neutralisation anderer Moleküle effizienter sein als das monomere DR5-Protein oder Proteinfragment allein (Fountoulakis et al., J. Biochem 270: 3958–3964 (1995)).
Polypeptidtests
Diagnostische Tests, wie quantitative und diagnostische Tests für den Nachweis der Spiegel an DR5-Protein, oder seiner löslichen Form, in Zellen und Geweben, einschließlich der Bestimmung von normalen und abnormalen Spiegeln, werden hier offenbart. Somit kann zum Beispiel ein diagnostischer Test gemäß der Erfindung für den Nachweis einer Überexpression von DR5, oder seiner löslichen Form, im Vergleich mit normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden, um zum Beispiel die Anwesenheit von Tumoren nachzuweisen. Testverfahren, die zur Bestimmung von Spiegeln von Proteinen, wie dem DR5-Protein der vorliegenden Erfindung oder seiner löslichen Form in einer Probe verwendet werden können, die von einem Wirt abgeleitet ist, sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Solche Testverfahren umfassen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, die Western-Blot-Analyse und ELISA-Tests.
Das Testen auf Spiegel von DR5-Protein in einer biologischen Probe kann unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgen. Mit "biologischer Probe" ist jede biologische Probe gemeint, die man von einem Individuum gewonnen hat, einer Zelllinie, Gewebekultur oder anderen Quelle, die das DR5-Rezeptorprotein oder mRNA enthalten. Bevorzugt für das Testen auf Spiegel von DR5-Protein in einer biologischen Probe sind Techniken auf der Basis von Antikörpern. Zum Beispiel kann die Expression von DR5-Protein in Geweben mit klassischen immunhistologischen Verfahren untersucht werden (Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976–985 (1985); Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087–3096 (1987)). Andere Verfahren auf der Basis von Antikörpern, die für den Nachweis der Expression des DR5-Proteingens von Nutzen sind, umfassen Immuntests, wie den enzymgebundenen Immunsorptionstest (ELISA) und den Radioimmuntest (RIA).
Im Stand der Technik sind geeignete Markierungen bekannt und umfassen Enzymmarkierungen, wie Glucoseoxidase, Radioisotope wie Iod (¹²⁵I, ¹²¹I), Kohlenstoff (¹⁴C), Schwefel (³⁵S), Tritium (³H), Indium (¹¹²In) und Technetium (^99mTC) und fluoreszierende Markierungen wie Fluorescein und Rhodamin, und Biotin.
Therapeutika
Es ist bekannt, daß die Liganden der Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie unter den am meisten pleiotropen Cytokinen sind, die eine große Zahl an zellulären Antworten induzieren, einschließlich der Cytotoxizität, der antiviralen Aktivität, immunregulatorischen Aktivitäten und der transkriptionalen Regulation mehrerer Gene (Goeddel, D. V. et al., "Tumor Necrosis Factors; Gene Structure ans Biological Activities," Symp. Quant. Biol. 51: 597–609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler, B., und Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57: 505–518 (1988); Old, L. J., Sci. Am. 258: 59–75 (1988); Fiers, W., FERS Lett. 285: 199–224 (1991). Die Liganden der TNF-Familie induzieren so verschiedene zelluläre Antworten durch Bindung an die Rezeptoren der (TNF)-Familie, einschließlich des DR5 der vorliegenden Erfindung. Zellen, die das DR5-Polypeptid exprimieren und von denen man glaubt, daß sie eine potente zelluläre Antwort auf DR5-Liganden haben, umfassen primäre dendritische Zellen, Endothelgewebe, die Milz, chronische lymphocytische Leukämie und menschliche Thymusstromazellen. Mit "einer zellulären Reaktion auf Liganden der TNF-Familie" ist jede genotypische, phänotypische und/oder morphologische Veränderung einer Zelle, Zelllinie, eines Gewebes, einer Gewebekultur oder eines Patienten gemeint, die von einem Liganden der TNF-Familie verursacht wird. Wie angegeben umfassen solche zellulären Antworten nicht nur normale physiologische Antworten auf Liganden der TNF-Familie, sondern auch Krankheiten, die mit einer erhöhten Apoptose oder der Inhibierung der Apoptose einhergehen. Die Apoptose (der programmierte Zelltod) ist ein physiologischer Mechanismus, der in die Deletion von peripheren T-Lymphocyten des Immunsystems involviert ist, und seine Dysregulierung kann zu einer Reihe von verschiedenen pathologischen Prozessen führen (Ameisen, J. C., AIDS 8: 1197–1213 (1994); Krammer, P. H. et al., Curr. Opin. Immunol. 6: 279–289 (1994)).
Krankheiten, die mit einem erhöhten Überleben von Zellen assoziiert sind, oder der Inhibierung der Apoptose, umfassen Krebs (wie Follikellymphome, Karzinome mit p53-Mutationen, und hormonabhängige Tumore wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Kaposi's Sarkom und Eierstockkrebs); Autoimmunkrankheiten (wie systemischer Lupus erythematosus und mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehende Glomerulonephritis, rheumatoide Arthritis) und virale Infektionen (wie Herpesvirus, Pockenvirus und Adenoviren), Entzündung; Transplantat-Wirt-Abstoßung, akute Transplantatabstoßung und chronische Transplantatabstoßung. Krankheiten, die mit erhöhter Apoptose einhergehen, umfassen AIDS; neurodegenerative Störungen (wie die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit, die amyotrophe Lateralsklerose, die Retinitis pigmentosa, die cerebellare Degeneration); myelodisplastische Syndrome (wie die aplastische Anämie), eine ischemische Verletzung (wie die von Herzinfarkt, Schlaganfall und Reperfusionsverletzung verursachte), die von Toxin induzierte Leberkrankheit (wie die von Alkohol verursachte), den septischen Schock, die Kachexie und Anorexie.
Somit ist eine Verwendung eines DR5-Liganden, eines Analogon oder eines Agonisten, die in der Lage sind, die von DR5 vermittelte Signalübertragung zu erhöhen, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Erhöhung der Apoptose vorgesehen, die von einem Liganden der TNF-Familie induziert wird, was die Verabreichung einer effektiven Menge des Arzneimittels an eine Zelle beinhaltet, die das DR5-Polypeptid exprimiert. Vorzugsweise wird die von DR5 vermittelte Signalübertragung erhöht, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine verminderte Apoptose oder eine verminderte Expression von Cytokin- und Adhäsionsmolekülen gezeigt wird. Ein Agonist kann lösliche Formen von DR5 umfassen und monoclonale Antikörper, die gegen das DR5-Polypeptid gerichtet sind.
Bei einem weiteren Aspekt ist eine Verwendung eines Antagonisten, der in der Lage ist, die von DR5 vermittelte Signalübertragung zu vermindern, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Inhibierung der Apoptose vorgesehen, die von einem Liganden der TNF-Familie induziert wird, was die Verabreichung einer effektiven Menge des Arzneimittels an eine Zelle beinhaltet, die das DR5-Polypeptid exprimiert. Vorzugsweise wird die von DR5 vermittelte Signalübertragung vermindert, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine erhöhte Apoptose oder NFkB-Expression gezeigt wird. Ein Antagonist kann lösliche Formen von DR5 umfassen und monoclonale Antikörper, die gegen das DR5-Polypeptid gerichtet sind.
Mit "Agonist" sind natürlicherweise vorkommende und synthetische Verbindungen gemeint, die in der Lage sind, die Apoptose zu verstärken oder potenzieren. Mit "Antagonist" sind natürlicherweise vorkommende und synthetische Verbindungen gemeint, die in der Lage sind, die Apoptose zu inhibieren. Ob ein Kandidat wie hier beschrieben als "Agonist" oder "Antagonist" die Apoptose verstärken oder inhibieren kann, kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Tests der zellulären Reaktion auf Liganden/Rezeptoren der TNF-Familie bestimmt werden, einschließlich der hier nachstehend detaillierter beschriebenen.
Ein solches Durchmusterungsverfahren umfaßt die Verwendung von Melanophagen enthaltenden Zellen, die transfiziert werden, um den Rezeptor der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Ein solches Durchmusterungsverfahren ist beschrieben in der PCT WO 92/01810, offengelegt am 6. Februar 1992. Ein solcher Test kann zum Beispiel für die Durchmusterung auf eine Verbindung verwendet werden, die die Aktivierung des Rezeptorpolypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert (oder verstärkt), indem die Melanophagen enthaltenden Zellen, die den Rezeptor codieren, mit einem Liganden der TNF-Familie und dem Kandidaten für einen Antagonisten (oder Agonisten) in Kontakt gebracht werden. Die Inhibierung oder Verstärkung des Signals, das von dem Liganden erzeugt wird, zeigt an, daß die Verbindung ein Antagonist oder Agonist des Liganden/Rezeptor-Signalübertragungsweges ist.
Andere Durchmusterungstechniken umfassen die Verwendung von Zellen, die den Rezeptor exprimieren (zum Beispiel transfizierte CHO-Zellen), in einem System, das Veränderungen beim extrazellulären pH-Wert mißt, die von der Rezeptoraktivierung verursacht werden. Zum Beispiel können Verbindungen mit einer Zelle in Kontakt gebracht werden, die das Rezeptorpolypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert und eine zweite Botenstoffreaktion, z.B. Veränderungen bei der Signalübertragung oder dem pH-Wert, kann gemessen werden, um zu bestimmen, ob die potentielle Verbindung den Rezeptor aktiviert oder inhibiert.
Eine andere solche Durchmusterungstechnik umfaßt das Einbringen von RNA, die den Rezeptor codiert in Xenopus-Oozyten, um den Rezeptor transient zu exprimieren. Die Rezeptor-Oozyten können dann mit dem Rezeptorliganden und einer Verbindung, die getestet werden soll, in Kontakt gebracht werden, gefolgt vom Nachweis der Inhibierung oder Aktivierung eines Calciumsignals im Falle des Testens auf Verbindungen, von denen man annimmt, daß sie die Aktivierung des Rezeptors inhibieren.
Eine andere Durchmusterungstechnik umfaßt die Expression eines Konstrukts in Zellen, wobei der Rezeptor mit einer Phospholipase C oder D verknüpft ist. Solche Zellen umfassen Endothelzellen, glatte Muskelzellen, embryonale Nierenzellen, usw. Die Durchmusterung kann wie hier vorstehend beschrieben durch den Nachweis der Aktivierung des Rezeptors oder der Inhibition der Aktivierung des Rezeptors durch das Phospholipasesignal durchgeführt werden.
Ein anderes Verfahren umfaßt die Durchmusterung auf Verbindungen (Antagonisten), die die Aktivierung des Rezeptorpolypeptids der vorliegenden Erfindung inhibieren, indem man die Inhibition der Bindung von markierten Liganden an Zellen bestimmt, die an ihrer Oberfläche den Rezeptor haben. Ein solches Verfahren umfaßt die Transfektion einer eukaryontischen Zelle mit einer DNA, die den Rezeptor codiert, so daß die Zelle auf ihrer Oberfläche den Rezeptor exprimiert, und das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Verbindung in der Gegenwart einer markierten Form eines bekannten Liganden. Der Ligand kann z.B. durch Radioaktivität markiert sein. Die Menge des an die Rezeptoren gebundenen markierten Liganden wird gemessen, z.B. durch Messung der Radioaktivität des Rezeptors. Wenn die Verbindung an den Rezeptor bindet, bestimmt durch die Reduktion des markierten Liganden, die an den Rezeptor bindet, wird die Bindung des markierten Liganden an den Rezeptor inhibiert.
Weitere Durchmusterungstests für Agonisten und Antagonisten der vorliegenden Erfindung sind beschrieben in Tartaglia, L. A. und Goeddel, D. V., J. Biol Chem. 267: 4304–4307 (1992).
Somit wird bei einem weiteren Aspekt ein Durchmusterungverfahren für die Bestimmung beschrieben, ob ein Kandidat für einen Agonisten oder Antagonisten in der Lage ist, die zelluläre Reaktion auf einen Liganden der TNF-Familie zu erhöhen oder zu inhibieren. Das Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen von Zellen, die das DR5-Polypeptid exprimieren mit einer Kandidatenverbindung und einem Liganden der TNF-Familie, das Testen der zellulären Reaktion und dem Vergleich der zellulären Reaktion mit einer zelluläre Standardreaktion, wobei der Standard getestet wird, wenn der Kontakt mit dem Liganden in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung hergestellt wird, wobei eine erhöhte zelluläre Reaktion gegenüber dem Standard zeigt, daß die Kandidatenverbindung ein Agonist des Liganden/Rezeptor-Signalwegs ist und eine verminderte zelluläre Reaktion gegenüber dem Standard zeigt, daß die Kandidatenverbindung ein Antagonist des Liganden/Rezeptor-Signalwegs ist. Mit dem "Testen einer zellulären Reaktion" ist die qualitative oder quantitative Messung einer zellulären Reaktion auf eine Kandidatenverbindung und/oder einen Liganden der TNF-Familie gemeint (d.h. die Bestimmung oder Abschätzung einer Erhöhung oder Verminderung der T-Zell-Proliferation oder eine Markierung mit tritiumhaltigen Thymidin). Mit der Erfindung kann eine Zelle, die das DR5-Polypeptid exprimiert, entweder mit einem endogenen oder exogen zugegebenen Liganden der TNF-Familie in Kontakt gebracht werden.
Die Agonisten, wie sie hier beschrieben werden, umfassen natürlicherweise vorkommende und synthetische Verbindungen, wie zum Beispiel Peptidfragmente von Liganden der TNF-Familie, transformierender Wachstumsfaktor, Neurotransmitter (wie Glutamat, Dopamin, N-Methyl-D-aspartat), Tumorsuppressoren (p53), cytolytische T-Zellen und Antimetabolite. Bevorzugte Agonisten umfassen chemotherapeutische Wirkstoffe wie zum Beispiel Cisplatin, Doxorubicin, Bleomycin, Cytosinarabinosid, Stickstoffsenfgas, Methotrexat und Vincristin. Andere umfassen Ethanol- und Amyloidpeptid. (Science 267: 1457–1458 (1995)). Weitere bevorzugte Agonisten umfassen polyclonale und monoclonale Antikörper, die gegen das DR5-Polypeptid gebildet werden, oder ein Fragment davon. Solche Agonisten-Antikörper, die gegen einen Rezeptor der TNF-Familie gebildet werden, sind beschrieben bei Tartaglia, L. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292–9296 (1991); und Tartaglia, L. A. und Goeddel, D. V. J. Biol Chem. 267(7): 4304–4307 (1992). Vgl. auch PCT-Anmeldung WO 94/09137.
Die Antagonisten, wie sie hier beschrieben werden, umfassen natürlicherweise vorkommende und synthetische Verbindungen, wie zum Beispiel den CD40-Liganden, neutrale Aminosäuren, Zink, Östrogen, Androgene, virale Gene (wie Adenovirus EIB, Baculovirus p35 und IAP, Kuhpockenvirus crmA, Epstein-Barr-Virus BHRF1, LMP-1, Afrikanisches Schweinefieber-Virus LMW5-HL und Herpesvirus yl 34,5), Calpaininhibitoren, Cysteinproteaseinhibitoren und Tumorpromotoren (wie PMA, Phenobarbital und alpha-Hexachlorcyclohexan).
Andere potentielle Antagonisten umfassen Antisensemoleküle. Die Antisensetechnologie kann zur Kontrolle der Genexpression durch Antisense-DNA, oder RNA oder Tripelhelixbildung verwendet werden. Antisense-Techniken sind zum Beispiel diskutiert in Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Die Tripelhelixbildung wird zum Beispiel diskutiert in Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science 251: 1360 (1991). Die Verfahren basieren auf der Bindung eines Polynucleotids an eine komplementäre DNA oder RNA.
Zum Beispiel kann der 5' codierende Teil eines Polynucleotids, das das reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet werden, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, daß es zu einer Region des Gens komplementär ist, die in die Transkription involviert ist, wodurch die Transkription und die Produktion des Rezeptors verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo mit der mRNA und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das Rezeptorpolypeptid.
Die DR5-Antisense-Nucleinsäure kann intrazellulär durch Transkription von einer exogenen Sequenz produziert werden. Zum Beispiel wird ein Vektor oder ein Teil davon transkribiert und produziert dabei eine Antisensenucleinsäure (RNA) der Erfindung. Ein solcher Vektor würde eine Sequenz enthalten, die die DR5-Antisense-Nucleinsäure codiert. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder chromosomal integriert werden, so lange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA zu produzieren. Solche Vektoren können mittels rekombinanter DNA-Technolgieverfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Die Vektoren können ein Plasmid, viral oder andere im Stand der Technik sein, die für die Replikation und Expression in Wirbeltierzellen verwendet werden. Die Expression der Sequenz, die DR5 codiert, oder ihrer Fragmente, kann mittels jedes Promotors erfolgen, von dem im Stand der Technik bekannt ist, daß er in Wirbeltierzellen, vorzugsweise in menschlichen Zellen arbeitet. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Solche Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Region des frühen Promotors von SV40 (Bernoist und Chambon, Nature 29: 304–310 (1981), den Promotor, der in dem langen 3'-terminalen Repeat des Rous-Sarkomvirus (Yamamoto et al., Cell 22: 787–797 (1980) enthalten ist, den Herpes-Thymidinpromotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445 (1981), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster, et al., Nature 296: 39–42 (1982)), usw.
Die Antisense-Nucleinsäuren umfassen eine Sequenz, die komplementär ist zu mindestens einem Teil eines RNA-Transkripts eines DR5-Gens. Es ist jedoch keine absolute Komplementarität erforderlich, obwohl bevorzugt. Eine Sequenz "komplementär zu mindestens einem Teil einer RNA", auf die hier Bezug genommen wird, bedeutet eine Sequenz, die ausreichend Komplementarität hat, um in der Lage zu sein, unter Bildung eines stabilen Duplex mit der RNA zu hybridisieren; im Falle von doppelsträngigen DR5-Antisense-Nucleinsäure kann so ein einziger Strang der Duplex-DNA getestet werden, oder die Triplexbildung kann getestet werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung wird vom Ausmaß der Komplementarität und der Länge der Antisense-Nucleinsäure abhängen. Im allgemeinen gilt, daß je größer die hybridisierende Nucleinsäure ist, desto mehr nicht gepaarte Basen mit der DR5-RNA kann sie enthalten und dennoch einen stabilen Duplex (oder fallweise Triplex) bilden. Der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet kann unter Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunktes des hybridisierten Komplexes ein tolerierbares Maß an Fehlpaarung sicherstellen.
Potentielle Antagonisten umfassen auch katalytische RNA oder ein Ribozym (vgl. z.B. die Internationale PCT-Veröffentlichung WO 90/11364, offengelegt am 4. Oktober 1990; Sarver et al., Science 247: 1222–1225 (1990). Während Ribozyme, die mRNA an stellenspezifischen Erkennungsstellen spalten, verwendet werden können, um die DR5-mRNAs zu zerstören, wird die Verwendung von Hammerkopf-Ribozymen bevorzugt. Hammerkopf-Ribozyme spalten mRNAs an Stellen, die von den flankierenden Regionen diktiert werden, die mit der Ziel-mRNA komplementäre Basenpaare bilden. Das einzige Erfordernis ist, daß die Ziel-mRNA die folgende Sequenz von zwei Basen hat: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Produktion von Hammerkopf-Ribozymen ist im Stand der Technik wohl bekannt und vollständiger beschrieben in Haselhoff und Gerlach, Nature 334: 585–591 (1988). Es gibt zahlreiche potentielle Spaltstellen für Hammerkopf-Ribozym in der Nucleotidsequenz von DR5 (1). Vorzugsweise wird das Ribozym so entworfen, daß die Spaltungserkennungsstelle in der Nähe des 5'-Endes der DR5-mRNA liegt; d.h. um die Effizienz zu erhöhen und die intrazelluläre Anhäufung von nicht-funktionellen mRNA-Transkripten zu minimieren. DNA-Konstrukte, die das Ribozym codieren, können auf dieselbe Weise in die Zelle eingebracht werden, wie sie vorstehend für die Einbringung von Antisense codierender DNA beschrieben wurde. Da Ribozyme, anders als Antisense-Moleküle, katalytisch sind, ist für die Effizienz eine niedrigere intrazelluläre Konzentration erforderlich.
Weitere Antagonisten umfassen lösliche Formen von DR5, d.h. DR5-Fragmente, die die Ligandenbindungsdomäne von der extrazellulären Region des Rezeptors voller Länge umfassen. Solche löslichen Formen des Rezeptors, die natürlicherweise vorkommen oder synthetisch sein können, sind antagonistisch hinsichtlich der von DR5 vermittelten Signalgebung, indem sie mit dem DR5 auf der Zelloberfläche um die Bindung der Liganden der TNF-Familie konkurrieren. Somit sind lösliche Formen des Rezeptors, die die Ligandenbindungsdomäne umfassen, neue Cytokine, die in der Lage sind, Apoptose zu inhibieren, die Liganden der TNF-Familie induzieren. Diese können als Monomere exprimiert werden, werden aber vorzugsweise als Dimere oder Trimere exprimiert, da von diesen gezeigt wurde, daß sie monomeren Formen von Rezeptor als Antagonisten überlegen sind, z.B. Fusionen der IgGFc-Familie von TNF-Rezeptoren. Andere solche Cytokine sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Fas B (eine lösliche Form des Fas-Rezeptors der Maus), der physiologisch beschränkend auf die vom Fas-Liganden induzierte Apoptose wirkt (Hughes, D. P. und Crispe, I. N., J. Exp. Med. 182: 1395–1401 (1995)).
Der Ausdruck "Antikörper" (Ab) oder "monoclonaler Antikörper" (mAB), wie hier verwendet, ist so gemeint, daß er intakte Moleküle umfaßt ebenso wie Fragmente davon (wie zum Beispiel Fab- und F(ab')₂-Fragmente), die in der Lage sind, ein Antigen zu binden. Fab-, Fab'- und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie verschwinden schneller aus dem Kreislauf und können weniger nichtspezifische Bindung des intakten Antikörpers haben (Wahl et al., J Nucl. Med. 24: 316–325 (1983)).
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können mit jedem einer Vielzahl von Standardverfahren unter Verwendung des DR5-Antigens der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Wie angegeben umfassen solche DR5-Immunogene das DR5-Polypeptid voller Länge (das die Leadersequenz enthalten kann oder nicht) und die DR5-Polypeptidfragmente wie die Ligandenbindungsdomäne, die Transmembrandomäne, die intrazelluläre Domäne und die Domäne für den Zelltod.
Die Antikörper der Erfindung können bei im Stand der Technik bekannten Verfahren hinsichtlich der Lokalisierung und Aktivität der Polypeptidsequenzen der Erfindung verwendet werden, z.B. bei der Bildgebung dieser Polypeptide, bei der Messung ihrer Spiegel in geeigneten physiologischen Proben, usw. Die Antikörper finden auch Verwendung in Immuntests und in Therapeutika als Agonisten und Antagonisten von DR5.
Proteine und andere Verbindungen, die die DR5-Domänen binden, sind auch Kandidaten für Agonisten und Antagonisten. Solche bindenden Verbindungen können unter Verwendung des Zwei-Hybrid-Sytems der Hefe "eingefangen" werden (Fields und Song, Nature 340: 245–246 (1989)). Eine modifizierte Version des Zwei-Hybrid-Sytems der Hefe wurde beschrieben von Roger Brem und seinen Kollegen (Gyuris, J. et al., Cell 75: 791–803 (1993); Zervos, A. S. et al., Cell 72: 223–232 (1993)). Vorzugsweise wird das Zwei-Hybrid-System der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, um Verbindungen einzufangen, die an die Ligandenbindungsdomäne von DR5 oder die intrazelluläre Domäne von DR5 binden. Solche Verbindungen sind gute Kandidaten für als Agonisten und Antagonisten der vorliegenden Erfindung.
Mit einem "Liganden der TNF-Familie" sind natürlicherweise vorkommende, rekombinante und synthetische Liganden gemeint, die in der Lage sind, an ein Mitglied der Familie der TNF-Rezeptoren zu binden und den Liganden/Rezeptor-Signalweg zu induzieren. Mitglieder der Familie der TNF-Liganden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DR5-Liganden, TRAIL, TNF-α, Lymphotoxin-α, (LT-α, auch bekannt als TNF-β), LT-β (gefunden in dem komplexen Heterotrimeren LT-α2-β), FasL, CD40, CD27, CD30, 4-IBB, OX40 und Nervenwachstumsfaktor (NGF). Ein Beispiel eines Tests, der durchgeführt werden kann, um die Fähigkeit von DR5 und seinen Derivaten (einschließlich Fragmenten) und Analoga zur Bindung von TRAIL ist nachstehend in Beispiel 6 beschrieben.
Repräsentative therapeutische Anwendungen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend detaillierter besprochen. Der Zustand der Immundefizienz, der AIDS definiert, ist Folge einer Abnahme der Zahl und Funktion der CD4⁺-T-Lymphocyten. Kürzliche Berichte schätzen den täglichen Verlust an CD4⁺-T-Zellen auf zwischen 3,5 × 10⁷ Zellen und 2 × 10⁹ Zellen (Wei X. et al., Nature 373: 117–122 (1995)). Man glaubt, daß ein Grund für die Abnahme der CD4⁺-T-Zellen im Verlauf der HIV-Infektion die durch HIV induzierte Apoptose ist. In der Tat wurde der von HIV induzierte apoptotische Zelltod nicht nur in vitro gezeigt, sondern, noch wichtiger, in infizierten Individuen (Ameisen, J. C., AIDS 8: 1197–1213 (1994); Finkel, T. H. und Bands, N. K., Curr. Opin. Immunol. 6: 605–615 (1995); Muro-Cacho, C. A. et al., J. Immunol. 154: 5555–5566 (1995)). Darüber hinaus ist die Apoptose und die Abnahme der CD4⁺-Lymphocyten eng korreliert in verschiedenen Tiermodellen für AIDS (Brunner, T., et al., Nature 373: 441–444 (1995), Gougeon, M. L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553–563 (1993)) und Apoptose wird bei den Tiermodellen nicht beobachtet, wo die virale Replikation nicht in AIDS resultiert (Gougeon, M. L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553–563 (1993)). Weitere Daten zeigen, daß uninfizierte, aber „primed" oder aktivierte T-Lymphocyten von mit HIV infizierten Individuen Apoptose erleiden, wenn sie dem Liganden der TNF-Familie FasL begegnen. Unter Verwendung von Monocytenzelllinien, die nach der HIV-Infektion den Tod als Resultat haben, wurde gezeigt, daß die Infektion von U937-Zellen mit HIV in der de novo-Expression von FasL resultiert und daß FasL die HIV-induzierte Apoptose vermittelt (Badley, A. D. et al., J. Virol. 70: 199–206 (1996)). Des weiteren war der Ligand der TNF-Familie bei nicht infizierten Makrophagen nachweisbar und seine Expression wurde nach der HIV-Infektion hochreguliert, was in der selektive Abtötung von nicht infizierten CD4-T-Lymphocyten resultierte (Badley, A. D. et al., J. Virol. 70: 199–206 (1996)). Somit wird die Verwendung eines Antagonisten für die Reduktion der selektiven Abtötung von CD4-T-Lymphocyten für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von HIV⁺-Individuen geplant. Die Arten der Verabreichung und Dosierungen werden nachstehend im Detail diskutiert.
Bei der Abstoßung eines allogenen Transplantats wurde das Immunsystem des Empfängertieres nicht zuvor auf die Reaktion vorbereitet, weil das Immunsystem größtenteils nur Antigenen aus seiner Umwelt ausgesetzt ist. Gewebe von anderen Mitgliedern der eigenen Art wurden nicht in derselben Weise präsentiert wie zum Beispiel Viren oder Bakterien präsentiert wurden. Im Falle der Abstoßung eines allogenen Transplantats werden immunsuppressive Behandlungsschemata geplant, um das Immunsystem daran zu hindern, das Effektorstadium zu erreichen. Das Immunprofil bei der Abstoßung eines Fremdtransplantats kann jedoch dem bei Wiederauftreten einer Krankheit eher gleichen als dem bei Abstoßung eines Transplantats der eigenen Art. Im Falle des Wiederauftretens einer Krankheit wurde das Immunsystem bereits aktiviert, wie durch die Zerstörung der nativen Inselzellen bewiesen wird. Deshalb ist beim Wiederauftreten einer Krankheit das Immunsystem bereits im Effektorstadium. Die Agonisten der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, die Immunantwort auf allogene Transplantate und Fremdtransplantate zu unterdrücken, weil Lymphocyten, die aktiviert wurden und zu Effektorzellen differenzierten, das DR5-Polypeptid exprimieren werden und daher Verbindungen zugänglich sind, die die Apoptose verstärken. Somit wird eine Verwendung für die Erzeugung von immunprivilegierten Geweben geplant.
Die DR5-Antagonisten können bei der Behandlung von Entzündungskrankheiten wie rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Psoriasis, Septicemia und entzündlicher Darmerkrankung von Nutzen sein.
Zusätzlich können wegen der Expression von DR5 bei Lymphoblasten lösliche DR5-Agonisten bei der Behandlung dieser Art von Krebs verwendet werden. Weiterhin können lösliches DR5 oder neutralisierende mABs zur Behandlung verschiedener chronischer und akuter Formen von Entzündung verwendet werden, wie rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Psoriasis, Septicemia und entzündlicher Darmerkrankung.
Verabreichungswege
Die hier beschriebenen Agonisten oder Antagonisten können in vitro, ex vivo oder in vivo an Zellen verabreicht werden, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimieren. Mit Verabreichung einer "effektiven Menge" eines Agonisten oder Antagonisten ist eine Menge der Verbindung gemeint, die ausreicht, eine zelluläre Reaktion auf einen Liganden der TNF-Familie einschließlich Polypeptiden zu verstärken oder zu inhibieren. Insbesondere ist mit Verabreichung einer "effektiven Menge" eines Agonisten oder Antagonisten eine Menge der Verbindung gemeint, die effektiv ist bei der Verstärkung oder Inhibierung der von DR5 vermittelten Apoptose. Wenn natürlich eine Verstärkung der Apoptose erwünscht ist, kann ein Agonist gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit Liganden der TNF-Familie verabreicht werden. Der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wird erkennen, daß effektive Mengen eines Agonisten oder Antagonisten empirisch bestimmt werden können und in reiner Form angewendet werden können oder als pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester oder in einer Proform des Wirkstoffs. Der Agonist oder Antagonist kann in Zusammensetzungen in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Exzipienten (d.h. Trägern) verabreicht werden.
Man wird verstehen, daß bei Verabreichung an einen menschlichen Patienten die gesamte tägliche Verwendung der Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch den behandelnden Arzt im Rahmen des fundierten medizinischen Urteils entschieden wird. Das spezifische therapeutisch effektive Dosierungsniveau für jeden einzelnen Patienten wird von Faktoren abhängen, die auf dem medizinischen Fachgebiet wohl bekannt sind.
Als ein genereller Vorschlag wird die gesamte pharmazeutisch effektive Menge an DR5-Polypeptid, die parenteral verabreicht wird, pro Dosis im Bereich von etwa 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag des Körpergewichts des Patienten sein, obwohl dies, wie vorstehend angemerkt, der therapeutischen Entscheidung unterliegt. Mehr bevorzugt ist diese Dosis mindestens 0,01 mg/kg/Tag und am meisten bevorzugt für Menschen zwischen etwa 0,01 und 1 mg/kg/Tag für das Hormon. Bei kontinuierlicher Zugabe werden die DR5-Agonisten oder -Antagonisten typischerweise mit einer Dosierungsrate von etwa 1 μg/kg/Stunde bis etwa 50 μg/kg/Stunde entweder mittels 1–4 Injektionen pro Tag oder mittels kontinuierlicher subkutaner Infusion zum Beispiel unter Verwendung einer Minipumpe verabreicht. Eine intravenöse Beutel-Lösung kann auch verwendet werden.
Die Dosierung kann in einer patientenspezifischen Weise auch so angelegt sein, daß eine zuvor festgelegte Konzentration eines Agonisten oder Antagonisten im Blut bereitgestellt wird, wie bestimmt mittels der RIA-Technik. Die Dosierung beim Patienten kann so eingestellt werden, daß reguläre, anhaltende Durchgangsblutspiegel, wie mit RIA gemessen, im Bereich von 50 bis 1000 ng/ml erreicht werden, vorzugsweise 150 bis 500 ng/ml.
Arzneimittel, die den Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, werden bereitgestellt. Zusätzlich werden pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die einen Agonisten oder Antagonisten umfassen (einschließlich DR5-Nucleotide und Polypeptide) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten, die oral, rektal, parenteral, intrazystemisch, intravaginal, intraperitoneal, topisch (als Puder, Salben, Drops, oder transdermales Pflaster) buccal oder als ein oraler oder nasaler Spray verabreicht werden können. Es ist wichtig, daß durch co-Verabreichung eines Agonisten und eines Liganden der TNF-Familie klinische Nebenwirkungen unter Verwendung von niedrigeren Dosen von Ligand und Agonist reduziert werden können. Man wird verstehen, daß der Agonist vor, nach oder simultan mit dem Liganden der TNF-Familie "co-verabreicht" werden kann, in Abhängigkeit von den Erfordernissen einer speziellen therapeutischen Anwendung. Mit "pharmazeutisch verträglichem Träger" ist ein nicht-toxisches festes, halbfestes oder flüssiges Füllmittel, ein Verdünnungsmittel, ein Verkapselungsmaterial oder ein Formulierungshilfsmittel jeder Art gemeint. Bei einer spezifischen Ausführungsform bedeutet "pharmazeutisch verträglich" zugelassen durch eine Regulierungsbehörde der Bundes- oder Staatsregierung oder gelistet in der U.S. Pharmacopeia oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmacopeia für die Verwendung in Tieren und insbesondere Menschen. Nicht beschränkende Beispiele von geeigneten pharmazeutischen Trägern gemäß dieser Ausführungsform werden bereitgestellt in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin und umfassen sterile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle, einschließlich solcher wie Petroleum und tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, wie Erdnußöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn das Arzneimittel intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wäßrige Dextrose- und Glycerinlösungen können als flüssige Träger verwendet werden, insbesondere für injizierbare Lösungen.
Der Ausdruck "parenteral", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Verabreichungswege, die die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane und intraartikuläre Injektion und Infusion umfassen.
Die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung für die parenterale Injektion können pharmazeutisch verträgliche sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen umfassen, ebenso wie sterile Pulver für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen kurz vor der Verwendung.
Zusätzlich zu löslichen DR5-Polypeptiden können auch DR5-Polypeptide verwendet werden, die die Transmembranregion enthalten, wenn sie durch Einschluß von Detergentien wie CHAPS oder NP-40 mit Puffer solubilisiert wurden.
Chromosomentests
Die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung sind auch wertvoll bei der Chromosomenidentifikation. Die Sequenz ist spezifisch gerichtet zu einer speziellen Lage auf einem einzelnen menschlichen Chromosom und kann damit hybridisieren. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheit assoziiert sind.
Bei gewissen bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht werden die hier offenbarte cDNA und/oder Polynucleotide zur Clonierung der genomischen DNA eines DR5-Gens verwendet. Dies kann unter Verwendung einer Vielzahl wohl bekannter Techniken und Bibliotheken erreicht werden, die im allgemeinen kommerziell verfügbar sind. Die genomische DNA wird dann bei der Chromosomenkartierung in situ unter Verwendung von für diesen Zweck wohl bekannten Techniken verwendet.
Zusätzlich können Sequenzen durch Herstellung von PCR-Primern (vorzugsweise 15–25 bp) von der cDNA auf Chromosomen kartiert werden. Die Computeranalyse der 3' nicht translatierten Region des Gens wird verwendet, um schnell Primer zu selektieren, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, um somit den Amplifikationsprozeß zu verkomplizieren. Diese Primer werden dann für die PCR-Durchmusterung von somatischen Zellhybriden verwendet, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten.
Die Fluoreszenzhybridisierung in situ ("FISH") eines cDNA-Clons mit einer Chromosomenspreizung in der Metaphase kann zur Bereitstellung einer präzisen chromosomalen Lage in einem Schritt verwendet werden. Diese Technik kann mit cDNA so kurz wie 50 oder 60 bp verwendet werden. Für einen Überblick über diese Technik vgl. Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Nachdem eine Sequenz mit einer präzisen chromosomalen Lage kartiert wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den genetischen Kartierungsdaten korreliert werden. Solche Daten werden zum Beispiel gefunden bei V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, an line verfügbar von der John Hopkins University, Welch Medical Library. Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die auf derselben chromosomalen Region kartiert wurden, werden dann durch die Verknüpfungsanalyse (co-Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Als nächstes ist es notwendig, die Unterschiede in den cDNA- oder genomischen Sequenzen zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn bei einigen oder allen betroffenen Individuen eine Mutation beobachtet wird, aber bei keinen normalen Individuen, dann ist die Mutation wahrscheinlich der Grund der Krankheit.
Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird selbige durch die folgenden Beispiele einfacher zu verstehen sein, die zur Illustration bereitgestellt werden und nicht einschränkend gedacht sind.
Beispiel 1
Expression und Reinigung in E. coli
Die DNA-Sequenz, die das reife DR5-Protein in dem hinterlegten DNA-Clon (ATCC No. 97920) codiert, wird unter Verwendung der PCR-Oligonucleotidprimer amplifiziert, die spezifisch sind zu den Sequenzen am Aminoterminus des DR5-Proteins und zu Vektorsequenzen 3' zu dem Gen. Zusätzliche Nucleotide, die zur Erleichterung der Clonierung Restriktionsstellen enthalten, werden jeweils zu den 5'- und 3'-Sequenzen hinzugefügt.
Die folgenden Primer werden für die Expression der extrazellulären Domäne von DR5 in E. coli verwendet: Der 5'-Primer hat die Sequenz
5'-CGCCCATGGAGTCT GCTCTGATCAC-3' (SEQ ID NO: 8) und enthält die unterstrichene NcoI-Stelle; und der 3'-Primer hat die Sequenz
5'-CGCAAGCTTTTAGCCTGATTC TTTGTGGAC-3' (SEQ ID NO: 9) und enthält die unterstrichene HindIII-Stelle.
Die Restriktionsstellen sind geeignet für Restriktionsenzymstellen in dem bakteriellen Expressionsvektor pQE60, der in diesem Beispiel für die bakterielle Expression verwendet wird. (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE60 codiert Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin ("Amp^r") und enthält einen bakteriellen Replikationsursprung ("orf"), einen durch IPTG induzierbaren Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle ("RBS").
Die amplifizierte DR5-DNA und der Vektor pQE60 werden beide mit NcoI und HindIII verdaut und die verdauten DNAs werden miteinander ligiert. Insertionen der DR5-Protein-DNA in das mit Restriktionsenzymen verdauten pQE60 platziert die DR5-Protein codierende Region stromabwärts von dem durch IPTG induzierbaren Promotor des Vektors und operativ damit verknüpft und im Rahmen mit einem initiierenden AUG in geeigneter Position für die Translation des DR5-Proteins.
Das Ligierungsgemisch wird unter Verwendung von Standardverfahren in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Solche Verfahren sind beschrieben bei Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laborstory Manual, 2te Ausg.; Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). Der E. coli-Stamm M15/rep4, der vielfache Kopien des Plasmids pREP4 enthält, das den lac-Repressor exprimiert und Resistenz gegen Kanamycin ("Kan^r") verleiht, wird bei der Durchführung des hier beschriebenen illustrativen Beispiels verwendet. Dieser Stamm, der nur einer der vielen ist, die für die Expression des DR5-Proteins geeignet sind, ist kommerziell von Qiagen, vorstehend, verfügbar.
Die Transformanten werden mittels ihrer Fähigkeit zum Wachsen auf LB-Platten in der Anwesenheit von Ampicillin und Kanamycin identifiziert. Aus resistenten Kolonien wird die Plasmid-DNA isoliert und die Identität der clonierten DNA durch Restriktionsanalyse, PCR und DNA-Sequenzierung bestätigt.
Clone, die die gewünschten Konstrukte enthalten, werden übernacht ("O/N") in Flüssigkultur in LG-Medien gezüchtet, die mit Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (25 μg/ml) ergänzt sind. Die O/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur mit einer Verdünnung von etwa 1:100 bis 1:250 zu inokulieren. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm ("OD600") von zwischen 0,4 bis 0,6 wachsen gelassen. Dann wird Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid ("IPTG") mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, um die Transkription von lac-Repressor-sensitiven Promotoren zu induzieren, indem man den lacI-Repressor inaktiviert. Die Zellen werden anschließen weitere 3 bis 4 Stunden inkubiert.
Die Zellen werden dann durch Zentrifugation gewonnen und mit Standardverfahren aufgebrochen. Die Einschlußkörper werden unter Verwendung von Routinesammelverfahren aus den aufgebrochenen Zellen gereinigt und das Protein wird aus den Einschlußkörpern in 8 M Harnstoff solubilisiert. Die 8 M Harnstofflösung, die das solubilisierte Protein enthält, wird über eine PD-10-Säule in 2× phosphatgepufferter Salzlösung ("PBS") gegeben, wobei der Harnstoff entfernt, der Puffer ausgetauscht und das Protein umgefaltet wird. Das Protein wird mit einem weiteren Chromatographieschritt gereinigt, um das Endotoxin zu entfernen. Dann wird es sterilfiltriert. Die sterilfiltrierte Proteinpräparation wird in 2 × PBS mit einer Konzentration von 95 μ/ml gelagert.
Beispiel 2
Expression in Säugerzellen
Ein typischer Säugerexpressionsvektor enthält das Promotorelement, das die Initiation der Transkription von mRNA vermittelt, die Protein codierende Sequenz und Signale, die für die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des Transkripts erforderlich sind. Zusätzliche Elemente umfassen Verstärker, Kozak-Sequenzen und intervenierende Sequenzen, die flankiert sind von Donor- und Akzeptorstellen für das RNA-Splicing. Eine hoch effiziente Transkription kann mit den frühen und späten Promotoren von SV40, den langen terminalen Repeats (LTRs) von Retroviren, z.B. RSV, HTLVI und HIVI und dem frühen Promotor des Cytomegalovirus (CMV) erreicht werden. Es können jedoch auch zelluläre Signale verwendet werden (z.B. der humane Aktinpromotor). Geeignete Expressionsvektoren für die Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel Vektoren wie pSVL und pMSG (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), und pBC12MI (ATCC67109). Säugerwirtszellen die verwendet werden könnten, umfassen humane Hela 293, H9- und Jurkat-Zellen, NIH3T3- und C127-Zellen der Maus, Cos 1, Cos 7 und CV1, QC1- 3-Zellen der Wachtel, L-Zellen der Maus und Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO).
Alternativ können die Gene von Interesse in stabilen Zelllinien exprimiert werden, die das Gen in einem Chromosom integriert enthalten. Die co-Transfektion mit einem selektierbaren Marker wie dhfr, gpt, Neomycin, Hygromycin erlaubt die Identifikation und Isolierung der transfizierten Zellen.
Das transfizierte Gen kann auch amplifiziert werden, um große Mengen des codierten Proteins zu exprimieren. Der Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Marker ist bei der Entwicklung von Zelllinien von Nutzen, die mehrer hundert oder sogar mehrere tausend Kopien des Gens von Interesse tragen. Ein anderer nützlicher Selektionsmarker ist das Enzym Glutamin-Synthase (GS) (Murphy et al., Biochem. J. 227: 277–279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10: 169–175 (1992)). Unter Verwendung dieser Marker werden die Säugerzellen in selektivem Medium gezüchtet und die Zellen mit der höchsten Resistenz selektiert. Diese Zelllinien enthalten das amplifizierte Gen/die amplifizierten Gene in das Chromosom integriert. Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) werden oft für die Produktion von Proteinen verwendet.
Die Expressionsvektoren pCI und PC4 enthalten den starken Promotor (LTR) vom Rous Sarkomvirus (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 5: 438–447 (März 1985)), plus einem Fragment des CMV-Verstärkers (Boshart et al., Cell 41: 521–530 (1985)). Viele Clonierungsstellen, z.B. für die Restriktionsenzymspaltstellen BamHI, Xbal und Asp718 erleichtern die Clonierung des Gens von Interesse. Die Vektoren enthalten außerdem das 3'-Intron, das Polyadenylierungs- und Terminationssignal des Präproinsulingens der Ratte.
Clonierung und Expression in CHO-Zellen
Der Vektor pC4 wird für die Expression des DR5-Polypeptids verwendet. Das Plasmid pC4 ist ein Derivat des Plasmids pSV2-dhfr (ATCC Hinterlegungs-NO. 37146). Das Plasmid enthält das DHFR-Gen der Maus unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors. Eierstockzellen des chinesischen Hamsters oder andere Zellen, denen die Dihydrofolataktivität fehlt, die mit diesen Plasmiden transfiziert werden, können durch Züchten der Zellen in einem selektive Medium (alpha minus MEM, Life Technologies), das mit dem chemotherapeutischen Mittel Methotrexat (MTX) ergänzt ist, selektiert werden. Die Amplifikation der DHFR-Gene in Zellen, die gegen Methotrexat (MTX) resistent sind, wurde gut dokumentiert (vgl. z.B. Alt, F. W., Kellems, R. M., Bertino, J. R. und Schimke, R. T., J. Biol. Chem. 253: 1357–1370 (1978); Hamlin, J. L. und Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107–143 (1990); Page, M. J. und Sydenham, M. A. 1991, Biotechnology 9: 64–68 (1991)). Zellen, die in wachsenden Konzentrationen an MTX gezüchtet werden, entwickeln Resistenz gegenüber dem Wirkstoff durch Überproduktion des Zielenzyms DHFR als Resultat der Amplifikation des DHFR-Gens. Wenn mit dem DHFR-Gen ein zweites Gen verknüpft ist, wird es üblicherweise co-amplifiziert und überexprimiert. Es ist im Stand der Technik bekannt, daß dieser Weg verwendet werden kann, um Zelllinien zu entwickeln, die mehr als 1000 Kopien des amplifizierten Gens/der amplifizierten Gene tragen. Wenn anschließend das Methotrexat entzogen wird, werden Zelllinien erhalten, die das amplifizierte Gen integriert in einem oder mehreren Chromosom(en) der Wirtszelle enthalten.
Das Plasmid pC4 enthält für die Expression des Gens von Interesse den starken Promotor der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous Sarkomvirus (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology Biology 5: 438–447 (März 1985), plus ein Fragment, das aus dem Verstärker des unmittelbaren frühen Gens des humanen Cytomegalovirus (CMV) isoliert ist (Boshart et al., Cell 41: 521–530 (1985)). Stromabwärts von dem Promotor sind die folgenden einzelnen Restriktionsenzym-Spaltstellen, die die Integration der Gene erlauben: BamHI, XbaI und Asp718. Hinter diesen Clonierungsstellen enthält das Plasmid das 3'-Intron und die Polyadenylierungsstelle des Präproinsulingens der Ratte. Andere hoch effiziente Promotoren können ebenfalls für die Expression verwendet werden, z.B. der humane β-Aktin-Promotor, der frühe oder späte SV40-Promotor oder die langen terminalen Wiederholungen von anderen Retroviren, z.B. HIV und HTLVI. Clontech's Tet-Off- und Tet-On-Genexpressionssystem und ähnliche Systeme können verwendet werden, um das DR5-Polypeptid in Säugerzellen auf regulierte Weise zu exprimieren (Gossen, M. & Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551 (1992). Für die Polyadenylierung der mRNA können auch andere Signale, z.B. von humanen Wachstumshormon- oder Globingenen, verwendet werden.
Stabile Zelllinien, die das Gen von Interesse stabil in die Chromosomen integriert tragen, können auch nach co-Transfektion mit einem selektierbaren Marker wie gpt, G418 oder Hygromycin selektiert werden. Es ist von Vorteil, zu Beginn mehr als einen selektierbare Marker zu verwenden, z.B. G418 plus Methotrexat.
Das Plasmid pC4 wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und dann unter Verwendung von Kalbsdarmphosphatase mit Verfahren desphosphoryliert, die im Stand der Technik bekannt sind. Der Vektor wird dann aus einem 1%-igen Agarosegel isoliert.
Die DNA-Sequenz, die das vollständige Polypeptid codiert, wird unter Verwendung von Primern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Enden des gewünschten Teils des Gens entsprechen. Der 5'-Primer, der die unterstrichene BamHI-Stelle enthält, eine Kozak-Sequenz und ein AUG-Startcodon, hat die folgende Sequenz: 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO: 10). Der 3'-Primer, der die unterstrichene Asp718-Stelle enthält, hat die folgende Sequenz: 5'-CGCGGTACCTTAGGACATGGCAGAGTC-3' (SEQ ID NO: 11).
Das amplifizierte Fragment wird mit der Endonuclease BamHI und Asp718 verdaut und dann erneut auf einem 1%-igen Agarosegel gereinigt. Das isolierte Fragment und der desphosphorylierte Vektor werden dann mit T4 DNA-Ligase ligiert. Dann werden E. coli HB101- oder XL-1 Blue-Zellen transformiert und unter Verwendung von zum Beispiel einer Restriktionsenzymanalyse Bakterien identifiziert, die das Fragment in das Plasmid inseriert enthalten.
Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, denen ein aktives DHFR-Gen fehlt, werden für die Transfektion verwendet. Fünf μg des Expressionsplasmids pC4 werden unter Verwendung des Lipofectin-Verfahrens (Felgner et al., vorstehend) mit 0,5 μg des Plasmids pSVneo co-transfiziert. Das Plasmid pSVneo enthält einen dominanten selektierbaren Marker, das neo-Gen von Tn5, das ein Enzym codiert, das Resistenz gegen eine Gruppe von Antibiotika verleiht, einschließlich G418. Die Zellen werden in alpha minus MEM ausgesät, das mit 1 mg G418/ml ergänzt ist. Nach 2 Tagen werden die Zellen mit Trypsin behandelt und auf Hybridomclonierungsplatten (Greiner, Deutschland) in alpha minus MEM ausgesät, das mit 10, 25 oder 50 ng Methotrexat/ml plus 1 mg G418/ml ergänzt ist. Nach etwa 10–14 Tagen werden einzelne Clone mit Trypsin behandelt und dann unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von Methotrexat (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) in Petrischalen mit 6 Mulden oder Flaschen von 10 ml ausgesät. Clone, die bei den höchsten Konzentrationen an Methotrexat wachsen, werden dann auf neue Platten mit 6 Mulden übertragen, die noch einmal höhere Konzentrationen an Methotrexat (1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM) enthalten. Dasselbe Verfahren wird wiederholt, bis Clone erhalten werden, die bei Konzentrationen von 100–200 μM wachsen. Die Expression des gewünschten Genprodukts wird zum Beispiel mit SDS-PAGE und Western Blot oder Analyse mit Umkehrphasen-HPLC analysiert.
Clonierung und Expression in COS-Zellen.
Das Expressionsplasmid pDR5-HA wird durch Clonierung einer cDNA, die die lösliche extrazelluläre Domäne des DR5-Proteins codiert, in den Expressionsvektor pcDNAI/Amp oder pcDNAIII (die von Invitrogen erhalten werden können) hergstellt. Der Expressionsvektor pcDNAI/amp enthält: (1) einen Repliktionsursprung von E. coli, der für die Vermehrung in E. coli und in anderen prokaryontischen Zellen wirksam ist; (2) ein Ampicillin-Resistenzgen für die Selektion von das Plasmid enthaltenden prokaryontischen Zellen; (3) einen Repliktionsursprung von SV40 für die Vermehrung in eukaryontischen Zellen; (4) einen CMV-Promotor, einen Polylinker, ein SV40- und ein Poladenylierungssignal, die so angeordnet sind, daß eine cDNA mittels der Restriktionsstellen in dem Polylinker einfach unter die Kontrolle des CMV-Promotors gestellt werden kann und operativ mit dem SV40-Intron und dem Poladenylierungssignal verknüpft werden kann. Ein DNA-Fragment, das die extrazelluläre Domäne des DR5-Proteins codiert, und eine HA-Markierung, die im Rahmen an ihr 3'-Ende fusioniert ist, werden in die Polylinkerregion des Vektors cloniert, so daß die Expression des rekombinanten Proteins von dem CMV-Promotor gesteuert wird. Die HA-Markierung entspricht einem Epitop, das von dem von Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) beschriebenen Influenza-Hämagglutininprotein abgeleitet ist. Die Fusion der HA-Markierung mit dem Zielprotein erlaubt den einfachen Nachweis und die einfache Gewinnung des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Strategie für die Plasmidkonstruktion ist wie folgt. Die DR5-cDNA des hinterlegten Clons wird unter Verwendung von Primern amplifiziert, die geeignete Restriktionsstellen enthalten, ähnlich wie vorstehend für die Konstruktion von Vektoren für die Expression von DR5 in E. coli beschrieben. Um den Nachweis, die Reinigung und die Charakterisierung des exprimierten DR5 zu erleichtern, enthält einer der Primer eine Hämagglutininmarkierung ("HA-Markierung"), wie vorstehend beschrieben.
Geeignete Primer umfassen die folgenden, die bei diesem Beispiel verwendet werden. Der 5'-Primer, der die unterstrichene BamHI-Stelle enthält, hat die folgende Sequenz: 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO: 10). Der 3'-Primer, der die unterstrichene Asp718-Stelle enthält, hat die folgende Sequenz: 5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTTGGAC-3' (SEQ ID NO: 12).
Das mit PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp werden mit BamHI und Asp718 verdaut und dann ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E. coli-Stamm SURF (verfügbar bei Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torreg Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert und die transformierte Kultur wird auf Ampicillinmediumplatten ausplattiert, die dann inkubiert werden, um das Wachstum von Ampicillin-resistenten Kolonien zuzulassen. Von den resistenten Kolonien wird Plasmid-DNA isoliert und mit Restriktionsanalyse oder anderen Mitteln auf die Anwesenheit des Fragments untersucht, das die extrzelluläre Domäne des DR5-Polypeptids codiert.
Für die Expression von rekombinantem DR5 werden COS-Zellen unter Verwendung von DEAE-DEXTRAN mit einem wie vorstehend beschriebenen Expressionsvektor transfiziert, wie zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laborstory Manual, Cold Spring Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Die Zellen werden unter Bedingungen für die Expression von DR5 durch den Vektor inkubiert.
Die Expression des DR5-HA-Fusionsproteins wird unter Verwendung von Verfahren, die zum Beispiel in Harlow et al., Antibodies: a Laborstory Manual, Cold Spring Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988) durch Radiomarkierung und Immunfällung nachgewiesen. Zu diesem Zweck werden die Zellen zwei Tage nach der Transfektion 8 Stunden in einem Medium inkubiert, das ³⁵S-Cystein enthält. Die Zellen und das Medium werden gesammelt und die Zellen gewaschen und dann mit Detergentien enthaltendem RIPA-Puffer lysiert: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7,5, wie beschrieben von Wilson et al., vorstehend zitiert. Die Proteine werden unter Verwendung von HA-spezifischen monoclonalen Antikörpern aus dem Zelllysat und aus dem Kulturmedium ausgefällt. Die ausgefällten Proteine werden dann mit SDS- PAGE uns Autoradiographie analysiert. Ein Expressionsprodukt der erwarteten Größe wird in dem Zelllysat gesehen, das nicht in den negativen Kontrollen gesehen wird.
Die Primersätze, die in diesem Beispiel verwendet werden, sind kompatibel mit pC4, das für die Expression in CHO in diesem Beispiel verwendet wird, mit pcDNAI/Amp für die Expression in COS in diesem Beispiel und mit pA2, das für die Baculovirus-Expression in dem folgenden Beispiel verwendet wird. Somit könnte zum Beispiel das vollständige, DR5 codierende Fragment, wie es für die Expression in CHO amplifiziert wurde, auch in pcDNAI/Amp für die Expression in COS oder pA2 für die Baculovirus-Expression ligiert werden.
Beispiel 3
Clonierung und Expression der löslichen extrazellulären Domäne von DR5 in einem Baculovirus-Expressionssytem
Bei diesem illustrativen Beispiel wird der Plasmid-Shuttlevektor pA2 verwendet, um die clonierte DNA, die das vollständige Protein codiert, einschließlich ihrer natürlicherweise assoziierten Signalsequenz, unter Verwendung von Standardverfahren wie denjenigen, die in Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987) beschrieben sind, in einen Baculovirus zu inserieren, um das DR5-Protein zu exprimieren. Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedron-Promotor von Autograph californica nuclear polyhedrosis-Virus (ACMNPV), gefolgt von geeigneten Restriktionsstellen. Für die einfache Selektion von rekombinantem Virus enthält das Plasmid das beta-Galactodidasegen von E. coli unter der Kontrolle eines schwachen Promotors von Drosophila in derselben Orientierung, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedringens. Die inserierten Gene werden auf beiden Seiten von viralen Sequenzen für die Zell-vermittelte homologe Rekombination mit viraler Wildtyp-DNA flankiert, um lebensfähiges Virus zu erzeugen, das das clonierte Polynucleotid exprimiert. Anstelle von pA2 können viele andere Baculovirus-Vektoren verwendet werden, wie pAc373, pVL941 und pAcIM1, mit der Maßgabe, wie der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet leicht sehen wird, daß die Konstruktion geeignet liegende Signale für die Transkription, Translation, Sekretion und dergleichen bereitstellt, wie ein AUG im Rahmen und ein Signalpeptid, wie erforderlich. Solche Vektoren sind zum Beispiel in Luckow et al., Virology 170: 31–39 (1989) beschrieben.
Die cDNA-Sequenz, die die lösliche extrazelluläre Domäne des DR5-Proteins codiert, in dem hinterlegten Clan (ATCC No. 97920) wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen.
Der 5'-Primer für DR5 hat die Sequenz 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO: 10) und enthält die unterstrichene BamHI-Restriktionsenzymstelle. In einen Expressionsvektor inseriert, wie nachstehend beschrieben, stellt das 5'-Ende des amplifizierten Fragments, das DR5 codiert, ein effizientes Spaltsignalpeptid bereit. Ein effizientes Signal für die Initiation der Translation in eukaryontischen Zellen, wie beschrieben von Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947–950 (1987) ist in geeigneter Weise im Vektorteil des Konstrukts gelegen.
Der 3'-Primer für DR5 hat die Sequenz: 5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTGTGGAC-3' (SEQ ID NO: 12), die die unterstrichene Asp718-Stelle enthält, gefolgt von Nucleotiden, die komplementär sind zu der DR5-Nucleotidsequenz in 1, gefolgt vom Stop-Codon.
Das amplifizierte Fragment wird unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Kits ("Geneclean," BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) aus einem 1%-igen Agarosegel isoliert. Das Fragment wird dann mit BamHI und Asp718 verdaut und erneut auf einem 1%-igen Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird als "F1" bezeichnet.
Das Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Asp718 verdaut und kann gegebenenfalls unter Verwendung von Kalbsdarmphosphatase und unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren dephosphoryliert werden. Die DNA wird dann unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Kits ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) aus einem 1%-igen Agarosegel isoliert. Die Vektor-DNA wird hier als "V1" bezeichnet.
Das Fragment F1 und das dephosphorylierte Plasmid V1 werden mit T4 DNA-Ligase miteinander ligiert. E. coli-Zellen HB101 oder andere geeignete E. coli-Wirte wie XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)-Zellen werden mit dem Ligierungsgemisch transformiert und auf Kulturplatten ausgestrichen. Unter Verwendung des PCR-Verfahrens werden Bakterien identifiziert, die das Plasmid mit dem humanen DR5 enthalten, wobei einer der Primer, der für die Amplifikation des Gens verwendet wird und der zweite Primer innerhalb des Vektors liegen, so daß nur diejenigen bakteriellen Kolonien eine Amplifikation der DNA zeigen werden, die das DR5-Genfragment enthalten. Die Sequenz des clonierten Fragments wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Dieses Plasmid wird hier als pBac DR5 bezeichnet.
5 μg des Plasmids pBac DR5 werden unter Verwendung des von Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417 (1987) beschriebenen Lipofectin-Verfahrens mit 1,0 μg einer kommerziell verfügbaren linearisierten Baculovirus-DNA ("BaculoGold^TM Baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) co-transfiziert. 1 μg von BaculoGold^TM Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBac DR5 werden in einer sterilen Mulde einer Mikrotiterplatte gemischt, die 50 μl serumfreies Grace's-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthält. Danach werden 10 μl Lipofectin plus 90 μl Grace's-Medium zugegeben, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Transfektionsgemisch tropfenweise zu Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) zugegebenen, die auf einer Gewebeplatte von 35 mm mit 1 ml Grace's-Medium ohne Serum ausgesät waren. Die Platte wird hin und her geschüttelt, um mit der neu zugegebenen Lösung zu mischen. Die Platte wird dann 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wird die Transfektionslösung von der Platte entfernt und 1 ml Grace's-Insektenmedium zugegeben, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war. Die Platte wird in einen Inkubator zurückgestellt und die Züchtung wird vier Tage bei 27°C fortgesetzt.
Nach vier Tagen wird der Überstand gewonnen und es wird ein Plaquetest durchgeführt, wie beschrieben von Summers und Smith, vorstehend zitiert. Es wird ein Agarosegel mit "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) verwendet, um die leichte Identifikation und Isolierung von gal exprimierenden Clonen zu erlauben, die blau gefärbte Plaques erzeugen. (Eine ausführliche Beschreibung eines "Plaquetests" dieser Art kann auch in dem Anwenderhandbuch für Insektenzellenkultur und Baculo-Virologie gefunden werden, der von Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, Seiten 9–10 verteilt wird). Nach Inkubation in geeigneter Weise werden blau gefärbte Plaques mit der Spitze eines Mikropipettengeräts (z.B. Eppendorf) gesammelt. Das Agar, das die rekombinanten Viren enthält, wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace's-Medium enthält und die Suspension, die den rekombinanten Baculovirus enthält, wird verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren, die in Schalen von 35 mm ausgesät sind. Vier Tage später werden die Überstände dieser Kulturschalen geerntet und dann bei 4°C aufbewahrt. Der rekombinante Virus wird V-DR5 genannt.
Um die Expression des DR5-Gens zu verifizieren, werden Sf9-Zellen in Grace's-Medium gezüchtet, das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS ergänzt ist. Die Zellen werden mit dem rekombinanten Baculovirus V-DR5 mit einem Vielfachen der Infektion ("MOI") von etwa 2 (etwa 1 bis etwa 3) infiziert. Sechs Stunden später wird das Medium entfernt und durch SF900 II-Medium minus Methionin und Cystein (verfügbar bei Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) ersetzt. Wenn radiomarkierte Proteine gewünscht werden, werden 42 Stunden später 5 μCi ³⁵S-Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (verfügbar bei Amersham) zugegeben. Die Zellen werden weitere 16 Stunden inkubiert und dann mittels Zentrifugation gewonnen. Die Proteine und der Überstand ebenso wie die intrazellulären Proteine werden mittels SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Autoradiographie (wenn radiomarkiert). Die Mikrosequenzierung der Aminosäuresequenz des Aminoendes von gereinigtem Protein kann verwendet werden, um die Amino-terminale Sequenz des reifen Proteins zu bestimmen und damit den Spaltpunkt und die Länge des sekretorischen Signalpeptids.
Beispiel 4
Gewebeverteilung der DR5-Expression
Es wurde eine Northern Blot-Analyse durchgeführt, um die DR5-Genexpression in menschlichem Gewebe unter Verwendung von Verfahren, wie sie unter anderem bei Sambrook et al., vorstehend zitiert, beschrieben sind, zu überprüfen. Eine cDNA-Sonde, die die gesamte Nucleotidsequenz des DR5-Proteins (SEQ ID NO: 1) enthält, wurde unter Verwendung des rediprime^TM DNA-Markierungssystems (Amersham Life Science) gemäß den Vorschriften des Herstellers mit ³²P markiert. Nach der Markierung wurde die Sonde unter Verwendung einer CHROMA SPIN-100^TM-Säule (Clontech Laborstories, Inc.) gemäß dem Protokoll Nummer PT1200-1 des Herstellers gereinigt. Die gereinigte markierte Sonde wurde dann zur Untersuchung verschiedener menschlicher Gewebe auf DR5-mRNA verwendet.
Multiple Tissue Northern (MTN)-Blots, die verschiedene menschliche Gewebe (H) oder menschliche Gewebe des Immunsystems (IM) enthielten, wurden von Clontech (Palo Alto, CA) erhalten und unter Verwendung der ExpressHyb^TM-Hybridisierungslösung (Clontech) gemäß dem Protokoll Nummer PT1190-1 des Herstellers mit der mit der markierten Sonde untersucht. Nach der Hybridisierung und Waschen wurden die Blots fixiert und bei –70°C übernacht ein Film belichtet. Die Filme wurden dann gemäß Standardverfahren entwickelt. Die Expression von DR5 wurde im Herz, dem Gehirn, der Placenta, Lunge, Leber, dem Skelettmuskel, der Niere, dem Pankreas, der Milz, dem Thymus, der Prostata, den Hoden, dem Uterus, dem Dünndarm, dem Dickdarm, den peripheren Blutleukozyten (PBLs), den Lymphknoten, dem Knochenmark und der fötalen Leber nachgewiesen.
Die Expression von DR5 wurden auch mittels Northern Blot in den folgenden Krebszelllinien getestet, HL60 (promyelocytische Leukämie), Hela-Zelle S3, K562 (chronische myelogene Leukämie), MOLT4 (Lymphoblasten-Leukämie), Raji (Burkitt's Lymphom), SW480 (colorektales Adenokarzinom), A549 (Lungenkarzinom) und G361 (Melanom), und wurde in allen getesteten Zelllinien nachgewiesen.
Beispiel 5
Von DR5 induzierte Apoptose in Säugerzellen
Die Überexpression von Fas/APO-1 und TNFR-1 in Säugerzellen imitiert die Rezeptoraktivierung (M. Muzio et al., Cell 85: 817–827 (1996); M. P. Boldin et al., Cell 85: 803–815 (1996)). Daher wurde dieses System verwendet, um die funktionelle Rolle von DR5 bei der Induktion der Apoptose zu untersuchen. Dieses Beispiel zeigt, daß die Überexpression von DR5 Apoptose in humanen Brustkarzinomzellen und in humanen epitheloiden Karzinom (Hela)-Zellen induzierte.
Experimenteller Aufbau
Der Zelltodtest wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt (A. M. Chinnaiyan, et al., Cell 81: 505–12 (1995); M. P. Boldin, et al., J. Biol. Chem 270: 7795–8 (1995); F. C. Kischkel, et al., EMBO 14: 5579–5588 (1995); A. M. Chinnaiyan, et al., J. Biol. Chem 271: 4961–4965 (1996)). Kurz gesagt wurden clonale humane Brustkarzinomzelllinien MCF-7 und Hela-Zellen mit Vektor, DR5, DR5Δ (52–411) oder TNFR-1 zusammen mit einem beta-Galactosidase-Reporterkonstrukt co-transfiziert.
MCF7- und Hela-Zellen wurden unter Verwendung des Lipofectamin-Verfahrens (GIBCO-BRL) gemäß den Vorschriften des Herstellers transfiziert. 293 Zellen wurden unter Verwendung der Ausfällung mit CaPO₄ transfiziert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und wie vorstehend beschrieben mit X-Gal gefärbt (A. M. Chinnaiyan, et al., Cell 81: 505–12 (1995); M. P. Boldin, et al., J. Biol. Chem 270: 7795–8 (1995); F. C. Kischkel, et al., EMBO 14: 5579–5588 (1995)) und mikroskopisch überprüft. Die Daten (±SD), in 5 dargestellt, stellen den Prozentsatz an runden apoptopischen Zellen als Funktion der gesamten beta-Galactosidase-positiven Zellen (n = 3) dar. Die Überexpression von DR5 induzierte Apoptose in MCF7 (5A)- und Hela (5B)-Zellen.
Die MCF7-Zellen wurden auch mit einem DR5-Expressionskonstrukt in der Gegenwart von z-VAD-fmk (20 μl) (Enzyme Systems Products, Dublin, CA) transfiziert oder mit einem dreifachen Überschuß von CrmA (M. Tewari et al., J. Biol. Chem 270: 3255–60 (1995)) co-transfiziert, oder einem FADD-DN-Expressionskonstrukt, oder Vektor allein. Die in 5 präsentierten Daten zeigen, daß die von DR5 induzierte Apoptose von Caspase-Inhibitoren abgeschwächt wurde, nicht aber durch dominant negatives FADD.
Wie in 5D dargestellt, assoziierte DR5 in vivo nicht mit FADD oder TRADD. Unter Verwendung der Calciumphosphat-Fällung wurden 293 Zellen mit den angegebenen Expressionskonstrukten co-transfiziert. Nach der Transfektion (nach 40 Stunden) wurden Zelllysate hergestellt und mit Flag M2-Antikörper-Affinitätsgel (IBI, Kodak) immunpräzipitiert, und die Anwesenheit von FADD oder myc-markiertem TRADD (myc-TRADD) wurde durch Immunblotting mit einem polyclonalen Antikörper gegen FADD nachgewiesen oder mit einem mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Antikörper gegen myc (BMB) (Baker, S. J. et al., Oncogene 12: 1 (1996); Chinnaiyan, A. M. et al., Science 274: 990 (1996)).
Wie in 5E dargestellt, blockiert FLICE 2-DN die von DR5 induzierte Apoptose. 293 Zellen wurden mit einem DR5- oder TNFR-Expressionskonstrukt und einem vierfachen Überschuß von CrmA, FLICE-DN, FLICE 2-DN oder Vektor allein in der Gegenwart eines beta-Galactosidase-Reporterkonstrukt co-transfiziert. Die Zellen wurden gefärbt und 25–30 Stunden später untersucht.
Resultate
Die Überexpression von DR5 induzierte Apoptose in humanen Brustkarzinomzellen MCF-7 (5A) und in humanen epitheloiden Karzinom (Hela)-Zellen (5B). Die meisten der transfizierten Zellen zeigten morphologische Veränderungen, die für Zellen charakteristisch sind, die Apoptose erleiden (Earnshaw, W. C., Curr. Biol. 7: 337 (1996)), indem sie gerundet werden, kondensiert und sich von dem Gefäß ablösen. Die Deletion der Domäne für den Zelltod beseitigt die Fähigkeit zum Abtöten. Wie bei DR4 wurde die von DR5 induzierte Apoptose durch die Caspase-Inhibitoren CrmA und z-VAD-fmk blockiert, das dominant negative FADD war jedoch ohne Effekt (5C). Konsistent damit ging DR5 in vivo mit FADD und TRADD keine Wechselwirkung ein (5D). Eine dominant negative Version des kürzlich identifizierten FLICE-ähnlichen Moleküls FLICE2 (Vincenz, C. et al., J. Biol. Chem. 272: 6578 (1997)) blockierte die von DR5 induzierte Apoptose effizient, während das dominant negative FLICE unter Bedingungen, bei denen es blockiert, nur einen partiellen Effekt hatte. TNFR-1 induzierte die Apoptose effektiv (5E). Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, daß sich DR5 ein apoptopisches Programm beschäftigt, das die Aktivierung von FLICE2 und Caspasen stromabwärts involviert, aber unabhängig von FADD ist.
Beispiel 6
Die extrazelluläre Domäne von DR5 bindet an cytotoxischen Liganden – TRAIL und blockiert die von TRAIL induzierte Apoptose
Wie vorstehend diskutiert, ist TRAIL/Apo2L ein cytotoxischer Ligand, der zur Familie der Liganden für Tumornekrosefaktor (TNF) gehört und schnellen Zelltod für viele transformierte Zelllinien induziert, aber nicht normales Gewebe, trotz seines eine Domäne für den Zelltod enthaltenden Rezeptors DR4, der bei beiden Zellarten exprimiert wird. Dieses Beispiel zeigt, daß der vorliegende Rezeptor DR5 ebenfalls TRAIL bindet.
Mit der gegebenen Ähnlichkeit der extrazellulären Liganden bindenden Cystein-reichen Domänen von DR5 und DR4 haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung theoretisiert, daß auch DR5 TRAIL binden würde. Um dies zu bestätigen wurden die löslichen extrazellulären Liganden bindenden Domänen von DR5 als Fusionen mit dem Fc-Teil des humanen Immunglobulins (IgG) exprimiert.
Wie in 6A gezeigt, band DR5-Fc spezifisch TRAIL, aber nicht der verwandte cytotoxische Ligand TNFα. Bei diesem Experiment wurden die Fc-extrazellulären Domänen von DR5, DR4, TRID oder TNFR1 und die entsprechenden Liganden hergestellt und Bindungstests durchgeführt, wie beschrieben in Pan et al., Science 276: 111 (1997). Die jeweiligen Fc-Fusionen wurden mit Protein G-Sepharose ausgefällt und die mit ausgefällten löslichen Liganden wurden mit Immunblotting mit anti-Flag (Babco) oder anti-myc-HRP (BMB) nachgewiesen, Der untere Teil von 6A zeigt die eingegebenen Fc-Fusionen, die in den Bindungstests anwesend sind.
Zusätzlich blockierte DR5-Fc die Fähigkeit von TRAIL zur Induktion der Apoptose (6B). MCF7-Zellen wurden mit löslichem TRAIL (200 ng/ml) in der Gegenwart von gleichen Mengen an Fc-Fusionen und Fc allein behandelt. Sechs Stunden später wurden die Zellen fixiert und, wie von Pan et al. vorstehend beschrieben, untersucht. Die in 6B gezeigten Daten (Mittelwert ±SD) sind der Prozentsatz von apoptopischen Kernen von allen gezählten Kernen (n = 4).
Letztlich hatte DR5-Fc keinen Effekt auf die Apoptose, den von TNFα induzierten Zelltod unter Bedingungen, bei denen TNFR1-Fc vollständig das Abtöten von TNFα aufhob (6C). MCF7-Zellen wurden mit TNFα (40 ng/ml; Genentech, Inc.) in der Gegenwart von gleichen Mengen an Fc-Fusionen und Fc allein behandelt. Die Kerne wurden 11–15 Stunden später untersucht.
Die neue Identifikation von DR5 als Rezeptor für TRAIL fügt weitere Komplexität zur Biologie der von TRAIL initiierten Signalübertragung hinzu.
Es wird klar sein, daß die vorliegenden Erfindung anders ausgeführt werden kann als in den vorstehenden Beschreibungen und Beispielen speziell beschrieben.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren –51 bis 360 in SEQ ID NO: 2 umfasst; b) einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 1 bis 360 in SEQ ID NO: 2 umfasst; c) einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 1 bis 133 in SEQ ID NO: 2 umfasst; und d) einer ersten Nucleotidsequenz, die zu mindestens 95% identisch ist zu einer zweiten Nucleotidsequenz wie sie in einem von (a) bis (c) definiert ist, wobei die erste Nucleotidsequenz ein Polypeptid codiert, das Apoptose induziert; oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids.
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz ferner eine Nucleotidsequenz umfasst, die einen Fc-Teil eines Immunoglobulinmoleküls codiert.
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2, das DNA oder RNA ist.
Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Vektors, das das Einfügen eines Nucleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in einen Vektor umfasst.
Vektor, der das Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Wirtszelle, das das Einführen eines Nucleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder des Vektors gemäß Anspruch 5 in eine Wirtszelle umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die den Vektor gemäß Anspruch 5 umfasst.
Verfahren zum Herstellen eines isolierten Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die durch das Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, das das Züchten der rekombinanten Wirtszelle gemäß Anspruch 7, unter solchen Bedingungen, dass das Polypeptid exprimiert wird, und das Gewinnen des Polypeptids umfasst.
Isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch das Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird.
Isolierter Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid gemäß Anspruch 9 bindet, wobei das Polypeptid aus einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) der Aminosäuresequenz bestehend aus den Aminosäuren –51 bis 360 in SEQ ID NO: 2; b) der Aminosäuresequenz bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 360 in SEQ ID NO: 2; c) der Aminosäuresequenz bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 133 in SEQ ID NO: 2; und d) einer Aminosäuresequenz, die codiert wird durch eine erste Nucleotidsequenz, die mindestens zu 95% identisch ist zu einer zweiten Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert wie sie in einem von (a) bis (c) definiert ist, wobei ein Polypeptid, das aus dieser codierten Aminosäuresequenz besteht, Apoptose induziert.
Antikörper gemäß Anspruch 10, wobei der Antikörper fähig ist Apoptose zu fördern.
Arzneimittel, das den Antikörper gemäß Anspruch 10 oder 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.