CN1624128A

CN1624128A - 包含死亡结构域的受体－5

Info

Publication number: CN1624128A
Application number: CNA2004100949179A
Authority: CN
Inventors: 倪健; R·L·根兹; 余国良; J·Y·苏; C·A·罗森
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1998-03-17
Publication date: 2005-06-08
Also published as: US7803615B1; CN1275162A; KR20000076364A; JP2001520513A; CN1184315C; AU6763598A; NZ508381A; ATE352618T1; US20020098550A1; PT970213E; CA2285040C; CA2644454A1; KR100527638B1; ES2281126T3; HK1025352A1; WO1998041629A2; CA2285040A1; EP0970213B1; DK0970213T3; DE69836956T2

Abstract

本申请涉及新的包含死亡结构域的受体－5(DR5)蛋白质，该蛋白质是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，并表现为能结合TRAIL。具体说，提供了编码人DR5蛋白质的分离的核酸分子。还提供了DR5多肽以及用于制备这种多肽的载体、宿主细胞和重组方法。本发明还涉及鉴定DR5活性激动剂和拮抗剂的筛选方法。

Description

包含死亡结构域的受体-5

发明背景

发明领域

本发明涉及受体的肿瘤坏死因子家族的一个新成员。更具体说，提供了编码包含人死亡结构域的受体-5(或简称DR5)的分离核酸分子。还提供了DR5多肽、载体、宿主细胞和制备它们的重组方法。本发明还涉及鉴定DR5活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。

相关技术

大量的生物活动(例如，对某种刺激的反应和自然的生物学过程)受到各种因子(例如细胞因子)的控制。许多细胞因子通过带动受体并产生细胞内反应从而经由受体发挥作用。

例如，肿瘤坏死因子(TNF)α和β即是通过TNF受体来调节大量生物过程，包括抵抗感染防御和感应震惊和炎症疾病的细胞因子。TNF分子属于TNF-配体超家族，并且是与它们的受体或抗配体(即TNF受体超家族)共同起作用。迄今为止，已鉴定到TNF配体超家族的9个成员和TNF受体超家族的10个成员。

在这些配体中，包括TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，又称为TNF-β)、LT-β(发现于复合异三聚体LT-α2-β中)、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-IBBL、OX40L和神经生长因子(NGF)。TNF受体超家族包括p55TNF受体、p75TNF受体、TNF受体相关蛋白质、FAS抗原或APO-1、CD40、CD27、CD30、4-IBB、OX40、低亲合力p75和NGF受体(Meager，A.，生物学22：291-295(1994))。

TNF配体超家族的许多成员是由活化的T细胞表达的，这暗示它们是T细胞与其他类型细胞进行相互作用(这是细胞癌化和功能的基础)所必需的(Meager，A.，出处同前)。

对TNF受体家族几个成员的基本功能相当多的了解是从鉴定和制备消除了这些蛋白质的表达的突变体中获得的。例如，FAS抗原及其配体的突变导致淋巴增殖性疾病(Watanabe-Fukunaga，R.等，自然356：314(1992))，这可能反映出程序化细胞死亡有缺陷。CD40配体的突变导致X-连锁的免疫缺陷状况，其特征在于胞浆中有高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G，表明T细胞依赖性的B细胞活化失效(Allen，R.C.等，科学259：990(1993))。低亲合力神经生长因子受体的定向突变导致以外围结构感觉新生失效为特征的失调(Lee，K.F.等，细胞69：737(1992))。

TNF和LT-α能与两个TNF受体(55和75kd TNF受体)结合。TNF和LT-α通过它们的受体引发的许多生物效应，包括移植肿瘤的出血性坏死、细胞毒性(在内毒素休克、发炎、免疫调节、增殖和抗病毒反应中的一种作用)以及对抗离子辐射的有害作用。TNF和LT-α参与多种疾病(包括内毒素休克、脑疟疾、肿瘤、自身免疫疾病、AIDS和移植体-宿主排斥)的发病机理(Beutler，B.和Von Huffel，C.，科学264：667-668(1994))。p55受体的突变导致对微生物感染的易感性加强。

此外，曾报道过在TNFR1(p55)和Fas的近C-末端有一个大约80个氨基酸的结构域，称为“死亡结构域”，它负责传导程序化细胞死亡信号(Tartaglia等，细胞74：845(1993))。

细胞凋亡，或程序化细胞死亡，是多细胞生物正常发育和系统平衡中必需的生理过程(H.Steller，科学267：1445-1449(1995))。细胞凋亡的紊乱构成几种人类疾病(包括癌症、神经变性性疾病和获得性免疫缺陷综合症)的发病机理(C.B.Thompson，科学267：1456-1462(1995))。最近，更多的注意力集中在两个细胞表面死亡受体(Fas/APO-1和TNFR-1)的信号传导和生物功能上(J.L.Cleveland等，细胞81：479-482(1995)；A.Fraser等，细胞85：781-784(1996)；S.Nagata等，科学267：1449-56(1995))。两者都是TNF受体家族的成员，该家族还包括TNFR-2、低亲合力NGFR、CD40和CD30等(C.A.Smith等，科学248：1019-23(1990)；M.Tewari等，《分子和细胞生物学教程》，M.Purton，Heldin，Carl编(Chapman and Hall，London，1995))。该家族的成员是根据胞外结构域中存在富含半胱氨酸的重复片段确定的，Fas/APO-1和TNFR-1还有被恰当地命名为死亡结构域的共同的胞内同源区，它与果蝇(Drosophila)自杀基因reaper有较远的相关性(P.Golstein等，细胞81：185-186(1995)；K.White等，科学264：677-83(1994))。这个共有的死亡结构域提示两个受体可能与一组至今身份不明的相互关联的信号传导分子相互作用。Fas/APO-1的活化能补充含有死亡结构域的接合体分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyan等，细胞81：505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物学化学杂志270：7795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO14：5579-5588(1995))，后者随之结合并且可能激活FLICE/MACH1(前凋亡蛋白酶ICE/CED-3家族的成员)(M.Muzio等，细胞85：817-827(1996)；M.P.Boldin等，细胞85：803-815(1996))。Fas/APO-1的中心作用是引发细胞死亡，而TNFR-1可以给一系列不同生物活动发出信号，其中许多是基于其激活NF-kB的能力(L.A.Tartaglia等，今日免疫学13：151-3(1992))。与此相应，TNFR-1能补充多价接合体分子TRADD，该分子与FADD一样含有一个死亡结构域(H.Hsu等，细胞81：495-504(1995)；H.Hsu等，细胞84：299-308(1996))。通过联合包括FADD、TRAF2和RIP在内的许多信号分子，TRADD能够给出细胞凋亡和激活NF-kB的信号(H.Hsu等，细胞84：299-308(1996)；H.Hsu等，免疫(Immunity)4：387-396(1996))。

最近，发现了一种新的诱导细胞凋亡的TNF配体。S.R.Wiley等(免疫3：673-682(1995))将该分子命名为“TNF相关的细胞凋亡诱导配体”或简称“TRAIL”。该分子又被称为“Apo-2配体”或“Apo-2L”(R.M.Pitt等，生物学化学杂志271：12687-12690(1996)。在共同未决的美国临时专利申请60/013,405中也公开了这种分子。为了方便，本文将该分子称为TRAIL。

FAS配体的转录呈现出主要局限于被活化的T细胞，与它不同，在许多人体组织(例如脾、肺、前列腺、胸腺、卵巢、小肠、结肠、外周血淋巴细胞、胎盘、肾)中都检测到显著水平的TRAIL，并且一些细胞系组成性表达TRAIL。已经证实TRAIL不依赖Fas配体而作用(Wiley等，出处同前)。还证实TRAIL在与Fas/Apo-1L引发死亡信号相似的时间范围内迅速激活细胞凋亡，但比TNF诱导的细胞凋亡快得多(S.A.Marster等，现代生物学6：750-752(1996))。TRAIL不能与TNFR-1、Fas或最近鉴定的DR3结合，这提示TRAIL可能是与一或多个独特的受体相互作用。

已经鉴定到TRAIL的几种独特的受体。共同未决的美国临时专利申请60/035,722中公开了一种新的包含死亡结构域的TRAIL受体-DR4。参见Pan等，科学276：111-113(1997年4月)。共同未决的美国临时专利申请60/035,496号表明该申请的对象-TR5受体与TRAIL结合。共同未决的美国临时专利申请60/xxxxxx号基于TR10受体与DR4的序列同源性，预测它也能结合TRAIL。

TNF家族配体和TNF家族受体具有各种作用，并影响到哺乳动物系统的生物过程中的很多正常或不正常功能。因此，十分需要鉴定和确定这些影响正常和病态下生物活性的受体和配体。具体说，需要分离和确定另外的结合TRAIL的新受体。

发明概要

本发明提供了分离的核酸分子，它们包含编码图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列或在1997年3月7日保藏的cDNA克隆(ATCCNO.97920)编码的氨基酸序列的核酸序列。

本发明还提供包括本发明所述分离的核酸分子的重组载体，和含有重组载体的宿主细胞，以及这些载体和宿主细胞的制备方法，和用它们通过重组技术制备DR5多肽或肽的方法。

本发明另外提供了具有本文所述多核苷酸所编码氨基酸序列的分离的DR5多肽。

本发明还提供了诊断方法(如定量的)和检测DR5蛋白质水平的诊断方法。因此，例如根据本发明用于检测过表达DR5或其可溶性形式相比于正常对照组织样品的过表达情况的诊断方法，可以用来检测肿瘤的存在。

已知肿瘤坏死因子(TNF)家族配体是最多效的细胞因子之一，它们诱导许多细胞应答，包括细胞毒性、抗病毒活性、免疫调节活性和对几种基因的转录调节。对TNF家族配体的细胞应答不仅包括正常生理应答，还包括与细胞凋亡增加或细胞凋亡抑制相关联的疾病。细胞凋亡-程序化细胞死亡是一种参与清除免疫系统外周T淋巴细胞的生理机制，其调节障碍能导致许多不同的发病过程。与细胞存活增加或细胞凋亡抑制相关的疾病包括癌症、自身免疫失调、病毒感染、炎症、移植体对抗宿主疾病、急性移植体排斥和慢性移植体排斥。与细胞凋亡增加相关的疾病包括AIDS、神经变性性疾病、骨髓发育不良综合症、局部缺血性损伤、毒素诱导的肝脏疾病、败血症性休克、恶病质和厌食。

因此，本发明还提供了一种用于增强TNF家族配体所诱导的细胞凋亡的方法，包括将有效量的能增强DR5介导的信号过程的激动剂给予表达DR5多肽的细胞。优选地，增强DR5介导的信号过程来治疗细胞凋亡呈现下降的疾病。

另一方面，本发明针对一种用于抑制TNF家族配体所诱导的细胞凋亡的方法，包括将有效量的能降低DR5介导的信号过程的拮抗剂给予表达DR5多肽的细胞。优选地，降低DR5介导的信号过程来治疗细胞凋亡呈现上升的疾病。

可以用本领域已知的TNF家族配体/受体细胞应答实验(包括下面将详细描述的)来确定本发明所述的某种候选“激动剂”或“拮抗剂”是否能够增强或抑制细胞凋亡。因此，另一方面，提供了一种用于确定某种候选的“激动剂”或“拮抗剂”是否能够增强或抑制对TNF家族配体的细胞应答的筛选方法。该方法包括将表达DR5多肽的细胞与候选的化合物及TNF家族配体接触，检测细胞应答，并与标准的细胞应答(标准的细胞应答是在没有候选化合物的情况下与配体进行接触时检测到的)进行比较，因此，比标准增加的细胞应答表示该候选化合物是该配体/受体信号途径的激动剂，而比标准降低的细胞应答表示该候选化合物是该配体/受体信号途径的拮抗剂。通过本发明，可以将表达DR5多肽的细胞与内源或外源给予的TNF家族配体进行接触。

附图简述

图1显示DR5的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)以及推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。推测氨基酸1-51(加下划线)组成信号肽(SEQ ID NO：2中的大约-51到-1号氨基酸残基)；氨基酸52-184组成胞外结构域(SEQ ID NO：2中的大约1到133号氨基酸残基)；氨基酸185-208(加下划线)组成跨膜结构域(SEQ ID NO：2中的大约134到157号氨基酸残基)；氨基酸209-411组成胞内结构域(SEQID NO：2中的大约158到360号氨基酸残基)，其中的氨基酸324-391号(斜体)组成死亡结构域(SEQ ID NO：2中大约273到340号氨基酸残基)。

图2显示DR5(HLYBX88)、人肿瘤坏死因子受体1(h TNFR1)(SEQ ID NO：3)、人Fas蛋白质(SEQ ID NO：4)以及含有死亡结构域的受体3(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列之间相似的区域。比较是用Clustal方法通过DNA Star程序组中包含的Megalign程序进行的。

图3显示对DR5氨基酸序列的分析。显示了α螺旋、β折叠、转角和卷曲区域；亲水性和疏水性；两亲性区域；柔性区域；抗原性指数和表面概率。在“抗原性指数-Jameson-Wolf”图中，如图1所示的氨基酸残基大约62到110、约119到164、约224到271以及约275到370对应于图示的DR5蛋白质的高抗原区域。图1中的高抗原性片段分别对应于SEQ ID NO：2中的以下片段：氨基酸残基大约11到59、大约68到113、大约173到220以及大约224到319。

图4显示与图1所示核苷酸序列(SEQ ID NO：1)相关的两种cDNA分子的核苷酸序列(HAPBU13R和HSBBU76R)。

图5A的条形图显示在MCF7人乳癌细胞中DR5过表达所诱导的细胞凋亡。图5B的条形图显示在人上皮样癌(Hela)细胞中DR5过表达所诱导的细胞凋亡。图5C的条形图显示DR5诱导的细胞凋亡被caspase抑制剂CrmA和z-VAD-fmk阻断，但显性失活的FADD未受影响。图5D是显示DR5和DR4一样不与FADD和TRADD在体内相互作用的免疫印迹。图5E的条形图显示新鉴定的类FLICE分子-FLICE2的显性失活形式有效地阻断了DR5诱导的细胞凋亡，而显性失活的FLICE在FLICE2阻断的条件下只有部分效果。还显示TNFR-1有效地阻断了细胞凋亡。

图6A是显示DR5-Fc(以及DR4和TRID)特异结合TRAIL，但不与相关的细胞毒性配体TNFα结合的免疫印迹。图6A底部一组表明结合实验中Fc融合体的加入量。图6B的条形图显示DR5-Fc阻断TRAIL诱导细胞凋亡的能力。图6B所示的数据(均值±SD)是凋亡细胞核占计数的总细胞核的百分比(n＝4)。图6C的条形图显示在TNFR1-Fc使TNFα杀伤完全消除的条件下，DR5-Fc对细胞凋亡(TNFα诱导的细胞死亡)没有影响。

优选实施方案详述

本发明提供分离的核酸分子，其中包含编码具有图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的DR5多肽或多肽片段的多核苷酸。本发明所述DR5多肽与其它已知的含有死亡结构域的TNFR家族受体(包括人TNFR-1、DR3和Fas)有序列同源性(图2)。将cDNA克隆，如HLYBX88[1997年3月7日保藏在美国典型培养物保藏中心(12301ParkLawn Drive，Rockville，Maryland20852)，保藏号97920]进行测序得到图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列。该保藏克隆包含在pSport1质粒(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中。

核酸分子

除非另外指明，本文中所有通过DNA分子测序确定的核苷酸序列都是用自动DNA测序仪(例如，购自Applied Biosystems，Inc.的Model 373)确定的，所有由文中确定的DNA分子所编码的多肽的氨基酸序列是通过翻译如上确定的DNA序列推测的。因此，正如本领域已知的对于任何通过自动化方法确定的DNA序列所知的那样，任何文中确定的核苷酸序列都可能含有某些错误。自动化确定的核苷酸序列与被测序DNA分子的实际核苷酸序列通常至少大约90％相同，更通常至少大约95％到至少大约99.9％相同。可以通过其它方法(包括本领域熟知的人工DNA测序方法)更精确地确定实际的核苷酸序列。本领域内还知道，与实际序列相比，在确定出的核苷酸序列中存在单个插入或缺失将导致核苷酸序列翻译的移码，从而由确定出的核苷酸序列编码的推测氨基酸序列会从插入或缺失位点开始与被测序DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。

利用本文提供的信息(如在SEQ ID NO：1中展示的核酸序列)，可以用标准的克隆和筛选步骤(如用mRNA作为起始材料克隆cDNA的步骤)来得到本发明所述编码DR5多肽的核酸分子。举例来说，在以下组织的cDNA文库中已鉴定到本发明所述核酸分子：初级树突细胞、内皮组织、脾、慢性淋巴细胞性白血病和人胸腺基质细胞。

确定出的SEQ ID NO：1的DR5 cDNA核苷酸序列含有一个开放读码框，它编码一个大约411个氨基酸残基的蛋白质，其起始密码子在图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列的130-132位，还有一个大约51个氨基酸残基的前导序列。在TNF受体家族的已知成员中，本发明所述DR5多肽与图2所示的人TNFR1、FAS和DR3多肽有程度最高的同源性，在多个半胱氨酸富含结构域中有显著的序列同源性。DR5所显示的与其他含死亡结构域之受体的同源性有力地表明DR5也是一个含有死亡结构域、有诱导细胞凋亡能力的受体。现在证明DR5也能结合TRAIL。

如文中表明，本发明还提供了成熟形式的本发明所述DR5蛋白。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质带有信号或分泌前导序列，它们在不断延长的蛋白质链一开始穿过粗糙内质网向外运输时，即被从成熟蛋白质上切割下来。大多数哺乳动物细胞、甚至某些昆虫细胞以相同的特异性切割分泌蛋白质。但是，在某些情况中，分泌蛋白质的切割并不完全一致，这样就得到蛋白质的两种或多种成熟形式。另外，早已知道分泌蛋白质切割的特异性最终由完整蛋白质的一级结构决定，这就是说是多肽氨基酸序列的内在性质。

因此，本发明提供了编码成熟DR5多肽的核苷酸序列，所述成熟多肽具有鉴定为ATCC NO.97920的宿主中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列，如图1所示(SEQ ID NO：2)。“具有ATCC 97920宿主中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟DR5蛋白质”是指通过在哺乳动物细胞(例如如下所述的COS细胞)中表达保藏宿主中质粒所含人DNA克隆序列所编码的完整开放读码框而产生的成熟形式DR5蛋白质。正如以下表明的，ATCC NO.97920所含cDNA克隆编码的成熟DR5的氨基酸序列可能与或可能不与SEQ ID NO：2(氨基酸大约1到360号)所示推测的“成熟”DR5蛋白质不同，这取决于基于计算机分析推测出的切割位点的准确性。

有一些方法可用于预测蛋白质是否有分泌前导序列以及该前导序列的切割位点。例如，可以使用McGeoch(病毒研究3：271-280(1985))和von Heinje(核酸研究14：4683-4690(1986))的方法。这两种方法预测已知哺乳动物分泌蛋白质的切割位点的准确性在75-80％(von Heinje，出处同前)。但是，这两种方法对给定的蛋白质不是总能给出相同的预测切割位点。

在本申请案中，通过计算机程序(PSORT)分析本发明所述完整DR5多肽的预测氨基酸序列。参见K.Nakai和M.Kanehisa，基因组14：897-911(1992)。PSORT是根据氨基酸序列预测蛋白质的胞内位置的专业系统。计算机预测位置的部分内容是将McGeoch与von Heinje的方法结合起来，用PSORT程序进行的分析预测出切割位点在图1氨基酸51和52之间(SEQ ID NO：2中的-1和1位氨基酸之间)。之后，应用von Heinje的简化形式的(-1，-3)规则(von Heinje，出处同前)，进一步经目测分析完整氨基酸序列。这样预测到DR5蛋白质的前导序列由图1中加下划线的氨基酸残基大约1到51(对应于SEQ ID NO：2中的大约-51到1)组成，而预测的成熟DR5蛋白质由图1中的大约残基52到411组成(对应于SEQ ID NO：2中的大约1到360)。

正如文中表明，本发明的核酸分子可以是RNA形式(例如mRNA)，或DNA形式，包括例如通过克隆得到的或合成制备的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链的。单链DNA可以是编码链(又称为有义链)，或者可以是非编码链(也称作反义链)。

“分离的”核酸分子意指脱离其天然环境的核酸分子(DNA或RNA)。例如，为了本发明目的，包含于载体中的重组DNA分子被视为分离的。分离的DNA分子的其它例子包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中的(部分或基本)纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明所述DNA分子的体内或体外RNA转录产物。根据本发明的分离核酸分子还包括合成制备的这种分子。

本发明所述分离的核酸分子包括包含SEQ ID NO：1所示开放读码框(ORF)的DR5 DNA分子；包含成熟DR5蛋白的编码序列的DNA分子；以及包含与上述DNA分子有较大差异、但由于遗传密码的简并性而仍编码DR5蛋白质的序列的DNA分子。当然，这些遗传密码是本领域公知的。因此，制备这种简并性变体对本领域技术人员来说是常规工作。

另一方面，本发明提供了编码DR5多肽的分离的核酸分子，所述DR5多肽具有1997年3月7日保藏为ATCC NO.97920的质粒中所含有的cDNA克隆编码的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了编码成熟DR5多肽或缺少N-端甲硫氨酸的全长DR5多肽的核酸分子。本发明进一步提供了具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或上述保藏克隆中所含DR5 cDNA的核苷酸序列的分离核酸分子，或者具有上述任何一个序列的互补序列的核酸分子。这些分离分子，特别是DNA分子，可以用作通过染色体原位杂交进行基因作图的探针，以及用于检测(例如通过Northern印迹分析)DR5基因在人体组织中的表达。

本发明进一步针对本文所述分离的核酸分子的片段。具有保藏cDNA的核苷酸序列、SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其互补链的分离核酸分子的片段，意指至少约15nt的DNA片段，更优选至少20nt，还要优选的是至少大约30nt，更要优选的是至少大约40、50、100、150、200、250、300、400或500nt长的DNA片段。这些片段有许多用途，包括但不限于如本文讨论的作为诊断探针和引物。当然，根据本发明，较大的DNA片段(500-1500nt长)也有用，对应于大部分或全部保藏cDNA或SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的片段也一样有用。例如至少长20nt的片段意指包括保藏cDNA的核苷酸序列中或SEQ IDNO：1所示核苷酸序列中的20个或者更多个相连碱基的片段。

本发明优选的核酸片段包括但不限于编码下述的核酸分子：包含DR5胞外结构域(图1中的氨基酸残基大约52到184(SEQ ID NO：2中的大约1到133))的多肽；包含DR5跨膜结构域(图1中的氨基酸残基大约185到208(SEQ ID NO：2中的大约134到157))的多肽；包含DR5胞内结构域(图1中的氨基酸残基大约209到411(SEQID NO：2中的大约158到360))的多肽；以及包含DR5死亡结构域(图1中的氨基酸残基大约324到391(SEQ ID NO：2中的大约273到340))的多肽。由于这些结构域的位置已经通过计算机绘图进行了预测，普通技术人员会意识到，根据用于定义每个结构域的标准，组成这些结构域的氨基酸残基会有轻微的差异(例如大约1到15个残基)。

本发明优选的核酸片段编码缺少氨基端甲硫氨酸的编码核苷酸(SEQ ID NO：1中的核苷酸130-132)的全长DR5多肽，因为已知甲硫氨酸将被自然切割，这样的序列可能在遗传工程构建DR5表达载体中有用。本发明还包括这类多核苷酸编码的多肽。

本发明优选的核酸片段还包括编码DR5蛋白质中携表位之部分的核酸分子。具体说，本发明的这种核酸片段包括、但不限于编码下列多肽的核酸分子：包含图1中的氨基酸残基大约62到110(SEQ ID NO：2中的大约11到59))的多肽；包含图1中的氨基酸残基大约119到164(SEQ ID NO：2中的大约68到113))的多肽；包含图1中的氨基酸残基大约224到271(SEQ ID NO：2中的大约173到220))的多肽；以及包含图1中的氨基酸残基大约275到370(SEQ ID NO：2中的大约224到319))的多肽。发明人已经确定出以上多肽片段是DR5蛋白质的抗原区。用于确定DR5蛋白质中其它携表位之部分的方法在下面详细描述。

另外，本发明提供了具有与SEQ ID NO：1更大范围部分相关的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列已从以下相关克隆：HAPBU13R(SEQ ID NO：6)和HSBBU76R(SEQ ID NO：7)确定了。HAPBU13R和HSBBU76R的核苷酸序列如图4所示。

另外，本发明包括含有SEQ ID NO：1中从残基284到1362、优选从284到681中的至少大约30个核苷酸、优选至少大约50个核苷酸的任何部分的多核苷酸。

另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，它含有在严谨杂交条件下与本发明上述核酸分子(例如，包含于ATCC NO.97920中的cDNA克隆)的一段多核苷酸可杂交的多核苷酸。“严谨杂交条件”意指于42℃在溶液中保温过夜，该溶液含有：50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml变性、剪切鲑精DNA；随后于大约65℃在0.1×SSC中洗涤膜。

与多核苷酸的一部分可杂交的多核苷酸意指这样一个多核苷酸(DNA或RNA)，它与至少大约15个核苷酸(nt)、更优选至少大约20nt、更优选至少大约30nt、还要优选的是至少大约30-70或80-150nt、或者完整长度的参照多核苷酸可杂交。可如上所述用它们作诊断探针和引物，这将在下面详细讨论。

“至少(例如)20nt长的多核苷酸部分”意指来自参照多核苷酸(例如，保藏cDNA或SEQ ID NO：1所示核苷酸序列)的核苷酸序列中的20或更多个相邻核苷酸。

当然，只与polyA序列(如图1(SEQ ID NO：1)所示的DR5 cDNA 3’末端poly(A))或者互补的T(或U)残基片段可杂交的多核苷酸不包括在本发明中用于与本发明所述核酸部分杂交的多核苷酸中，因为这样的多核苷酸能与任何含有poly(A)片段或其互补物(例如实际上任何双链cDNA克隆)的核酸分子杂交。

如文中表明，本发明所述编码DR5多肽的核酸分子可以包括，但不限于成熟多肽的编码序列本身；成熟多肽的编码序列和附加序列(如编码前导序列或分泌序列的序列，例如编码前-、或原-或前原-蛋白质序列的序列)；带有或不带有上述附加编码序列的成熟多肽编码序列，它们带有附加的非编码序列，包括例如但不限于内含子和非编码5’和3’序列，例如参与转录、mRNA加工-包括例如剪切和多聚腺苷酸化信号-核糖体结合和mRNA稳定的已转录的非翻译序列；编码附加氨基酸(例如能提供附加功能)的附加编码序列。因此例如，可以将多肽与标记序列(例如有助于纯化融合多肽的肽)融合在一起。在本发明这方面的优选实施方案中，标记序列是6-组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.)等中提供的标记物，其中许多有商业产品。例如Gentz等(美国科学院学报86：821-824(1989))描述的6-组氨酸能够方便融合蛋白质的纯化。“HA”标记物是可用于纯化过程的另一种肽，它对应一种来源于流感血凝素蛋白质的表位，Wilson等在细胞37：767-778(1984)中已有描述。正如以下讨论的，其他这类融合蛋白质包括与Fc在N-或C-端融合的DR5受体。

本发明还涉及本发明所述核酸分子的变体，它们编码DR5受体的部分、类似物或衍生物。变体可以是天然的，例如天然的等位基因变体。“等位基因变体”意指在生物染色体上占据一定位点的一个基因的几种替代形式之一(基因II，Lewin，B.编，John Wiley&Sons，NewYork(1985))。非天然发生的变体可以用本领域已知的诱变技术制备。

这种变体包括那些通过涉及一或多个核苷酸的核苷酸取代、缺失或添加而制备得到的。变体可以在编码或非编码区域或两种区域中发生了改变。在编码区的改变可以产生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。其中特别优选的是不改变DR5受体或其部分的特征和活性的沉默取代、添加和缺失。在这方面，还特别优选保守性取代。

本发明另外的实施方案包括与下列核苷酸序列至少90％、更优选至少95％、96％、97％、98％或99％相同的分离的核酸分子：(a)编码具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列、但缺少氨基端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：2中大约1到360位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有ATCC NO.97920所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)编码具有ATCCNO.97920所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟DR5多肽的核苷酸序列；(f)编码具有SEQ ID NO：2中大约1到133位氨基酸序列的DR5胞外结构域、或ATCC NO.97920所含cDNA编码的DR5胞外结构域的核苷酸序列；(g)编码具有SEQ ID NO：2中大约134到157位氨基酸序列的DR5跨膜结构域、或ATCC NO.97920所含cDNA编码的DR5跨膜结构域的核苷酸序列；(h)编码具有SEQ ID NO：2中大约158到360位氨基酸序列的DR5胞内结构域、或ATCC NO.97920所含cDNA编码的DR5胞内结构域的核苷酸序列；(i)编码具有SEQ ID NO：2中大约273到340位氨基酸序列的DR5死亡结构域、或ATCC NO.97920所含cDNA编码的DR5死亡结构域的核苷酸序列；和(j)与上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)任何一个核苷酸序列互补的核苷酸序列。

“与编码DR5多肽的参照核苷酸序列有至少例如95％相同的核苷酸序列的多核苷酸”意指该多核苷酸在编码DR5多肽的参照核苷酸序列中每100个核苷酸可能有不超过5个点突变，除此之外该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列都相同。换句话说，要获得核苷酸序列与参照核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参照序列中不超过5％的核苷酸可以被缺失或用其他核苷酸取代，或者可以向参照序列中插入占参照序列核苷酸总数不超过5％的核苷酸。参照(查询)序列可以是图1(SEQ ID NO：1)所示的完整DR5核苷酸序列或本文描述的任何多核苷酸片段。

事实上，任何具体核酸分子是否与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或保藏cDNA克隆的核苷酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可以用已知的计算机程序(如Bestfit程序，WisconsinSequence Analysis Package，Version8 for Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI53711)来常规确定。Bestfit使用了Smith和Waterman的局部同源算法(local homology algorithm)(应用数学进展2：482-489(1981))来寻找两个序列间的最佳同源片段。当使用Bestfit或其他序列比对程序来确定一个具体序列与本发明参照序列是否(例如)95％相同时，当然要设置参数以便相对参照核苷酸序列的全长计算相同百分比，并且允许同源性的缺口高达参照序列内核苷酸总数的5％。

在一个具体实施方案中，用基于Brutlag等人的算法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))确定参照(查询)序列(本发明所述序列)与目标序列之间的相同程度(又称为全序列比对)。优选用于计算相同性百分比的FASTDB DNA序列比对中的参数为：矩阵＝一元，k-tuple＝4，错配罚分＝1，相连罚分＝30，序列随机化分段长度＝0，Cutoff分＝1，间隙罚分＝5，间隙大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或者等于序列的长度(对于更短的目标核苷酸序列)。根据本实施方案，如果目标序列由于5’或3’缺失、而非内部缺失而比查询序列短，考虑到计算相同性百分比时FASTDB程序不能解释目标序列5’或3’截短这一事实，就要对结果进行人工修正。对于相对查询序列而在5’或3’末端被截短的目标序列，通过计算位于目标序列5’或3’的查询序列中没有匹配/比对的碱基数目占查询序列总碱基数的百分比来进行修正。用FASTDB序列比对的结果确定核苷酸是否匹配/比对。随后，从通过使用特定参数的上述FASTDB程序计算出的相同百分比中减去该百分比，得到最终的相同百分比评分。修正后的分数用于本实施方案的目的。人为调整相同百分比评分时，只计算FASTDB比对显示位于目标序列5’和3’碱基之外的不与查询序列匹配/比对的碱基。例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列比对来确定相同百分比。缺失发生在目标序列的5’端，因此FASTDB比对显示5’端前10个碱基没有匹配/比对。10个未配对的碱基代表序列的10％(5’和3’末端没有匹配的碱基数/查询序列中的总碱基数)，因此从通过FASTDB程序计算的相同百分比判分中减去10％。如果剩下的90个碱基很好地匹配了，则最终的相同百分比就是90％。在另一个实施例中，将一个90个碱基的目标序列与一个100个碱基的查询序列进行了比较。这次的缺失是内部缺失，因此目标序列的5’和3’没有不与查询序列匹配/比对的碱基。这种情况中，通过FASTDB计算的相同百分比未做人工修正。同样，只有目标序列5’和3’的不与查询序列匹配/比对的碱基要做人工修正。为了该实施方案，未做其他人工修正。

本申请针对与SEQ ID NO：1所示的核酸序列、保藏cDNA的核酸序列或它们的片段至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸分子，而不考虑它们是否编码有DR5活性的多肽。这是因为即使一个具体的核酸分子不编码有DR5活性的多肽，本领域的技术人员也知道如何利用这个核酸分子，例如作为杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物。本发明所述不编码有DR5活性之多肽的核酸分子的用途包括(还有其他用途)：(1)在cDNA文库中分离DR5基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体涂片原位杂交(例如“FISH”)以便给出DR5基因的准确的染色体位置(如Verma等在《人类染色体：基本技术指南》，Pergamon Press，New York(1988)中所描述)，和(3)用于检测DR5mRNA在特定组织中的表达的Northern印迹分析。

但是，优选具有与SEQ ID NO：1所示的核酸序列、保藏cDNA的核酸序列或它们的片段至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列、并且确实编码有DR5活性的多肽的核酸分子。“有DR5活性的多肽”意指在特定生物检测中测量到具备与本发明所述DR5蛋白质(全长蛋白质，或者优选成熟蛋白质)活性相似的、但不必相同的活性的多肽。例如，可以基本按照以前描述的细胞死亡实验(A.M.Chinnaiyan等，细胞81：505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物学化学杂志270：7795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO14：5579-5588(1995)；A.M.Chinnaiyan等，生物学化学杂志271：4961-4965(1996))来测量DR5蛋白质的活性(如以下实施例5中阐述)。在MCF7细胞中，将编码全长DR5或候选含有死亡结构域的受体的质粒与编码绿色荧光蛋白的pLantern受体构建体进行共转染。通过DAPI染色评价，被DR5转染的细胞的细胞核会显示出细胞凋亡的形态。与TNFR-1和Fas/APO-1(M.Muzie等，细胞85：817-827(1996)；M.P.Boldin等，细胞85：803-815(1996)；M.Tewari等，生物学化学杂志270：3255-60(1995))相似，DR5诱导的细胞凋亡优先被类ICE蛋白酶的抑制剂CrmA和z-VAD-fmk阻断。

当然，由于遗传密码的简并性，本领域的普通技术人员立即会认识到，与SEQ ID NO：1所示的核酸序列、保藏cDNA的核酸序列或它们的片段具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的许多核酸分子能编码“有DR5蛋白质活性”的多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变体都编码相同的多肽，因此在许多情况下，即使不进行前面描述的比较检测，对本领域的技术人员也是显而易见的。本领域的技术人员还会认识到，对于非简并性变体的核酸分子，有相当数量也编码有DR5蛋白质活性的多肽。这是因为技术人员充分意识到有些氨基酸取代不太可能或不可能显著影响蛋白质功能(例如，用另一个脂肪族氨基酸代替一个氨基酸)。

例如，在Bowie，J.U.等的“破解蛋白质序列中的信息：对氨基酸取代的耐受性”(科学247：1306-1310(1990))一文中提供了关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指南，在文中作者表明蛋白质惊人地耐受氨基酸取代。

多核苷酸检测

本发明还涉及利用DR5多核苷酸检测互补多核苷酸的用途，例如作为诊断试剂。检测与功能障碍相关联的突变形式DR5能提供一种诊断工具，它能增加或确定对DR5或其可溶性形式低表达或过表达或表达改变所致疾病(例如，肿瘤或自身免疫疾病)的诊断或对这类疾病的易感性。

可以通过多种技术在DNA水平上检测携带DR5基因内突变的个体。用于诊断的核酸可以得自患者的细胞，例如来自血液、尿、唾液、组织活检标本和解剖材料。可以直接或通过在分析前用PCR进行酶法扩增将基因组DNA用于检测(Saiki等，自然324：163-166(1986))。还可以同样的方式使用RNA或cDNA。作为一个例子，可以用与编码DR5的核酸互补的PCR引物来鉴定和分析DR5的表达和突变。例如，通过扩增产物相比于正常基因型的大小变化可检测出缺失和插入。通过将扩增的DNA与放射标记的DR5 RNA或者放射标记的DR5反义DNA序列杂交，可以鉴定点突变。通过RNase A消化或溶解温度的差异可以将匹配良好的序列与未匹配的双链区分开。

还可以通过直接DNA测序揭示参照基因和带有突变的基因之间的序列差异。另外，可以将克隆的DNA片段做为探针来检测特异性DNA片段。适当地使用PCR或另一种扩增方法可以大大增加这类方法的灵敏度。例如，将测序引物与双链PCR产物或修饰PCR产生的单链模板分子一起使用。通过使用放射标记核苷酸的常规步骤或使用荧光标记物的自动测序步骤来确定序列。

通过检测DNA片段在有或没有变性剂的凝胶中电泳迁移率的改变可以实现基于DNA序列差异的基因检测。小的序列缺失和插入可以通过高分辨率凝胶电泳目测。在变性甲酰胺梯度凝胶中，不同DNA片段的迁移将根据它们的特异溶解温度或部分溶解温度被阻滞在凝胶的不同位置，可以以此区分不同序列的DNA片段(参见，例如Myers等，科学230：1242(1985))。

通过核酸酶保护实验，例如RNase和S1保护法，或化学裂解方法(例如Cotton等，美国科学院学报85：4397-4401(1985))，可以揭示具体位置的序列变化。

因此，可以通过包括、但不限于杂交、RNase保护法、化学裂解、直接DNA测序或使用限制酶[例如，限制性酶切片段长度多态性(“RFLP”)和基因组DNA的Southern印迹]等方法来检测特异DNA序列。

除了更常规的凝胶电泳和DNA测序，通过原位杂交分析也可以检测突变。

载体和宿主细胞

本发明还涉及包括本发明所述DNA分子的载体、用本发明所述载体基因工程化得到的宿主细胞以及通过重组技术制备本发明所述多肽。

可以通过基因工程操作使宿主细胞带有核酸分子并表达本发明所述多肽。多核苷酸可以被单独或与其它多核苷酸一起导入。这类其它多核苷酸可以被独立导入、共导入或与本发明多核苷酸联接导入。

按照本发明的这一方面，载体可以是例如质粒载体、单或双链噬菌体载体、单或双链RNA或DNA病毒载体。可以通过已知的DNA和RNA向细胞中导入的技术，将这些载体以多核苷酸(优选DNA)的形式导入细胞。病毒载体可以是可复制型或复制缺陷型的。在后一种情况中，病毒增殖通常只发生在互补型的宿主细胞中。

在某些方面优选的载体是用于表达本发明所述多核苷酸和多肽的载体。通常，这些载体包含与待表达多核苷酸操纵性地连接、对于在宿主中的表达有效的顺式作用调控区。合适的反式因子可以由宿主、互补载体提供，或载体本身在导入宿主时提供。

很多种表达载体可被用于表达本发明多肽。这些载体包括染色体型、附加型载体和病毒衍生的载体，例如来源于细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体，以及来源于它们的组合体的载体，如来源于质粒和噬菌体遗传元件的载体(如粘粒和噬菌粒)，它们均可用于本发明这一方面的表达。通常，任何适合维持、增殖或表达多核苷酸从而在宿主中表达多肽的质粒都可以用于这方面的表达。

将表达载体中的DNA序列操纵性连接上合适的表达调控序列，包括例如指导mRNA转录的启动子。这种启动子的代表包括噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子(仅举已知质粒中的几种)。一般来说，表达构建体中应含有转录、起始和终止位点，并且在转录区中有用于翻译的核糖体结合位点。由该构建体表达的成熟转录物的编码区应包括开头的翻译起始AUG和适当置于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。

另外，构建体可以含有调节和引起表达的调控区。通常，这些区域通过调控转录来起作用，例如阻遏蛋白结合位点和增强子等。

用于增殖和表达的载体通常包括选择性标记。这些标记也适用于扩增，或者载体可以含有附加标记以便达到这一目的。在这方面，优选表达载体含有一或多个选择性标记基因，以提供表型特征，便于挑选被转化的宿主细胞。这些标记包括，但不限于用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，和用于培养大肠杆菌和其它细菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因。

可以用多种已知技术，将含有文中其它地方描述的适当DNA序列以及适当启动子和其它适当调控序列的载体导入适合用来表达所需多肽的适当宿主中。适当宿主的代表性例子包括细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞)；真菌细胞(如酵母细胞)；昆虫细胞(如果蝇S2和灰翅夜蛾属Sf9细胞)；动物细胞(如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞)和植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域已知的。

在细菌中使用的优选载体是Qiagen有售的pQE70、pQE60和pQE-9；Stratagene有售的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；和Pharmacia有售的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体是Stratagene有售的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；和Pharmacia有售的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。仅列举这些载体代表许多市场销售和本领域技术人员熟知的载体。

挑选用于在宿主细胞中进行表达的适当载体和启动子是熟知的操作，用于表达载体构建、将载体导入宿主并在宿主中进行表达的必要技术也是本领域的常规技能。

本发明还涉及上面讨论的含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或者宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。可以选择能够调节插入基因序列的表达，或能以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。可以用特定的诱导物来提高从特定启动子开始的表达，因此可以调控基因工程化多肽的表达。另外，不同宿主细胞有特征性和特异性的翻译和翻译后蛋白质加工和修饰机制(例如，磷酸化、切割)。可以选择适当的细胞系以保证按需要修饰和加工所表达的外源蛋白质。

可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质体介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法实现构建体向宿主细胞的导入。这些方法在许多标准实验指南(如Davis等，1986)分子生物学基本方法)中有描述。

可以将多肽表达为修饰形式，如融合蛋白[包含通过肽键与(不同蛋白质的)异源蛋白质序列连接的多肽]，还可以包括分泌信号和附加的异源功能区。可以用本领域已知的方法，通过将本发明所述多核苷酸与编码预期氨基酸序列的所需核酸序列在合适的读码框中连接在一起，并用本领域已知方法表达融合蛋白产物来制备这种融合蛋白。可选择地，通过蛋白质合成技术，例如用肽合成仪，可以制备这种融合蛋白质。因此，例如，可以在多肽的N-末端加上附加氨基酸区，特别是带电荷氨基酸，以提高它们在宿主细胞中、在纯化或随后的操作和保存期间的稳定性和持续性。另外，可以给多肽加上一个区域以便协助纯化。这些区域可以在多肽的最后制备之前去除。给多肽加上肽部分使其分泌或排泄、提高稳定性和协助纯化都是本领域中熟悉和常规的技术。优选的融合蛋白质包含可用于增强蛋白质溶解性的来自免疫球蛋白的异源区域。例如，EP-A-0 464 533(加拿大对应号2045869)公开过包含免疫球蛋白分子恒定区各部分和另一种人蛋白质或其部分的融合蛋白质。许多情况中，融合蛋白质的Fc部分用于治疗和诊断十分有利，能够产生例如改善的药物动力学特性(EP-A 0232 262)。另一方面，对于某些用途，希望在以描述的有益方式表达、检测和纯化融合蛋白质后能删除Fc部分。当Fc部分防碍在治疗和诊断中的使用，例如在将融合蛋白质用作免疫抗原时，即是如此。在开发药物时，例如，已将人蛋白质(如hIL5-受体)与Fc部分融合在一起，以用于鉴定hIL5的拮抗剂的高容量筛选检测中。参见，D.Bennett等，分子识别杂志8：52-58(1995)和K.Johanson等，生物学化学杂志270：9459-9471(1995)。

可以通过包括，但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲合层析、羟磷灰石层析和凝集素层析等的标准方法，将DR5多肽从重组细胞培养物中回收和纯化出来。最优选采用高效液相层析(“HPLC”)进行纯化。当多肽在分离和/或纯化期间被变性时，可以采用用于蛋白质重新折叠的公知技术来恢复其活性构象。

本发明所述多肽包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物以及通过重组技术从原核或真核宿主(包括例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)制备到的产物。根据重组制备过程中采用的宿主，本发明所述多肽可以是糖基化或非糖基化。另外，本发明所述多肽还可以包括起始的被修饰甲硫氨酸残基，在某些情况中这是宿主介导过程的结果。

可以根据本发明，将DR5多核苷酸和多肽用于多种应用，特别是那些利用DR5的化学和生物学特性的应用。其中有治疗肿瘤，抗寄生虫、细菌和病毒，诱导T细胞、内皮细胞和某些造血细胞增殖，治疗再狭窄，移植体抗宿主疾病，调节抗病毒反应，以及用激动剂刺激DR5后，预防某些自身免疫疾病。另外的应用涉及诊断和治疗细胞、组织和生物体紊乱。以下进一步讨论本发明的这些方面。

DR5多肽和片段

本发明还提供了具有保藏cDNA编码的氨基酸序列或SEQ ID NO：2中的氨基酸序列的分离DR5多肽、或包含以上多肽的一部分的多肽或肽。

本领域技术人员会意识到，可以改变DR5的某些氨基酸序列而不显著影响该蛋白质的结构和功能。如果在序列中设计这样的差异，应记住蛋白质中有决定活性的关键区域。这些区域通常包含构成配体结合位点或死亡结构域、或者形成影响这些结构域的三级结构的残基。

因此，本发明还包括显示出实质性的DR5蛋白质活性或包括DR5的区域(如以下讨论的蛋白质部分)的DR5蛋白质变体。这些突变包括缺失、插入、翻转、重复和类型取代。正如上面说明的，可以在Bowie，J.U.等，科学247：1306-1310(1990)文中找到有关可能是表现型沉默的氨基酸变化的指导。

因此，SEQ ID NO：2的多肽或保藏cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的至少一或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基，更优选至少1个但少于10个保守氨基酸残基)取代，这些取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的，或者(ii)其中的1或多个氨基酸残基包括取代基团，或者(iii)其中的成熟多肽与另外一种化合物融合在一起，如提高多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加氨基酸与成熟多肽融合在一起，如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化成熟多肽或前蛋白序列的序列。本领域技术人员应意识到，参照本文的教导，这些片段、衍生物或类似物包括在本发明范围内。

我们特别感兴趣的是用另一个带电荷、中性或负电荷的氨基酸取代带电荷氨基酸。后者形成的蛋白质所带正电荷减少，从而可改善DR5蛋白质的特性。十分希望能防止聚集。蛋白质的聚集不仅导致失活，而且因为它们是免疫原性的，还会在制备药物组合物时带来问题(Pinckard等，临床与实验免疫学(Clin Exp.Immunol.)2：331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845(1987)；Cleland等，治疗性药物载体系体评述(Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystems)10：307-377(1993))。

氨基酸取代还可以改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等(自然361：266-268(1993))描述了某些导致TNF-α选择性结合两种已知类型的TNF受体之一的突变。因此，本发明所述DR5受体可以包括来自自然突变或人工的1或多个氨基酸的取代、缺失或添加。

正如文中表明，优选影响较小的变化，如不会显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见表1)。

表1保守氨基酸取代

芳香族氨基酸苯丙氨酸

酪氨酸

色氨酸

疏水性氨基酸亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

极性氨基酸谷氨酰胺

天冬酰胺

碱性氨基酸精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性氨基酸天冬氨酸

谷氨酸

小氨基酸丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

甘氨酸

可以通过本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989))来鉴定本发明所述DR5蛋白质中为功能所必需的氨基酸。后一种操作在分子的每个残基处导入单个丙氨酸突变。然后检测制得的突变分子的生物活性，如受体结合活性或者体外、体内增殖活性。通过结构分析，如结晶、核磁共振或光亲合标记(Smith等，分子生物学杂志224：899-904(1992)和de Vos等，科学255：306-312(1992))，也可以确定配体-受体结合的关键位点。

优选以分离的形式提供本发明所述多肽。“分离的多肽”意指从其天然环境中取出的多肽。因此，本发明中，在重组宿主细胞中制备和/或包含着的多肽也视作分离的。“分离的多肽”还指已从重组宿主细胞中(部分或基本)纯化的多肽。例如，可以通过Smith和Johnson(基因67：31-40(1988))描述的一步法将重组制备的DR5多肽基本上地纯化。

本发明所述多肽还包括保藏cDNA编码的包括前导序列的多肽；保藏cDNA编码的没有前导序列的成熟多肽(即成熟蛋白质)；包含SEQID NO：2中大约氨基酸-51到360的多肽；包含SEQ ID NO：2中大约氨基酸-50到360的多肽；包含SEQ ID NO：2中大约氨基酸1到360的多肽；包含胞外结构域的多肽；包含跨膜结构域的多肽；包含胞内结构域的多肽；包含胞外和胞内结构域以及有全部或部分跨膜结构域缺失的多肽；和包含死亡结构域的多肽；还有与以上描述的多肽至少80％相同、优选至少90％或95％相同，更优选至少96％、97％、98％、99％相同的多肽；并且包括这些多肽中至少30个氨基酸、优选至少50个氨基酸的部分。

具有与DR5多肽的参照氨基酸序列至少95％“相同”的氨基酸序列的多肽意指所述多肽在DR5多肽的参照氨基酸序列中每100个氨基酸中可以有不超过5个氨基酸改变，除此之外，该多肽的氨基酸序列与参照序列都相同。换句话说，要获得具有与参照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参照序列中不超过5％的氨基酸残基可以被缺失或用其它氨基酸取代，或者可以向参照序列中插入占参照序列氨基酸残基总数不超过5％的氨基酸残基。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端，或者两个末端之间的任何位置，可以单个地或者以1或多个相连簇的形式分布在参照序列残基中。

事实上，任何具体多肽与例如图1(SEQ ID NO：2)所示的氨基酸序列、保藏cDNA克隆编码的氨基酸序列或其片段是否至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可以用已知的计算机程序(如Bestfit程序，Wisconsin Sequence Analysis Package，Version8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI53711)来确定。当使用Bestfit或其它序列比对程序来确定一个具体序列与本发明参照序列是否(例如)95％相同时，当然要设置参数以便相对参照氨基酸序列的全长计算相同百分比，并且允许有同源性的缺口占参照序列氨基酸总数的不超过5％。

在一个具体实施方案中，用FASTDB计算机程序基于Brutlag等人的算法(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))确定参照(查询)序列(本发明所述序列)与目标序列之间的相同程度。优选用于FASTDB氨基酸序列比对的参数：矩阵＝PAM 0，k-tuple＝2，错配罚分＝1，相连罚分＝20，序列随机化分段长度＝0，Cutoff分＝1，间隙罚分＝5，间隙大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或者等于序列的长度(对于更短的目的氨基酸序列)。根据本实施方案，如果目标序列由于N或C末端缺失而非内部缺失而比查询序列短，则考虑到计算全序列相同百分比时FASTDB程序不能解释目标序列N-或C-末端截短这一事实，就要对结果进行人工修正。对于在N-或C-末端被截短的目标序列，要通过计算查询序列中位于目标序列N-或C-末端、没有与相应目的残基匹配/比对的残基数，占查询序列总残基数的百分比来修正相同百分比。用FASTDB序列比对的结果确定残基是否匹配/比对。随后从通过上述FASTDB程序使用特定参数计算出的相同百分比中减去该百分比，即得到最终的相同百分比评分。本实施方案中使用修正后的分数。人工调整相同百分比分数时，只计算位于目标序列N-或C-末端、不与查询序列匹配/比对的残基。也就是说，只查询位于目标序列N-或C-末端最远端残基外的残基位置。例如，将90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的查询序列比对来确定相同百分比。缺失发生在目标序列的N-端，因此FASTDB比对显示N-端前10个残基没有匹配/比对。10个未配对的残基代表序列的10％(N-或C-末端没有匹配的残基数/查询序列中的总残基数)，因此从通过FASTDB程序计算出的相同百分比判分中减去10％。如果剩下的90个碱基很好地匹配了，最终的相同百分比就是90％。在另一个例子中，将一个90个残基的目标序列与一个100个残基的查询序列进行了比较。这次的缺失是内部缺失，因此目标序列的N-或C-末端没有不与查询序列匹配/比对的残基。这种情况中，不对通过FASTDB计算的相同百分比做人工修正。重申一次，只针对FASTDB比对中位于目标序列的N-或C-末端、不与查询序列匹配/比对的残基做人工修正。用于该实施方案的，未做其他人工修正。

可以用本领域技术人员熟知的方法将本发明所述多肽做为SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱的分子量标记物。

本发明人发现，DR5多肽是呈现3个主要结构域的411个残基的蛋白质。首先，鉴定到配体结合结构域位于图1中的大约52到184位残基间(SEQ ID NO：2中的氨基酸残基大约1到133)。其次，鉴定到跨膜结构域位于图1中的大约185到208位残基间(SEQ ID NO：2中的氨基酸残基大约134到157)。第三，鉴定到胞内结构域位于图1中的大约209到411位残基间(SEQ ID NO：2中的氨基酸残基大约158到360)。重要的是，胞内结构域包括位于残基大约324到391(SEQ ID NO：2中的氨基酸残基大约273到340)的死亡结构域。图1所示多肽的更优选片段包括残基大约52到411(SEQ ID NO：2中的氨基酸残基大约1到360)的成熟蛋白质，和包含全部或部分胞外和胞内结构域但缺乏跨膜结构域的可溶性多肽。

本发明还提供了保藏cDNA克隆编码的、包括前导序列的DR5多肽，和选自成熟蛋白质、胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域、死亡结构域以及它们的各种组合的DR5多肽片段。

另一方面，本发明提供了包含本文所述多肽携表位之部分的肽或多肽。这个多肽部分的表位是本发明所述多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”定义为当完整的蛋白质是免疫原时，蛋白质中引起抗体应答的部分。另一方面，蛋白质分子中能够被抗体结合到上面的区域被定义为“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位的数量通常少于抗原性表位数。参见，例如Geysen等，美国科学院学报81：3998-4002(1983)。

对于选择带有抗原性表位的肽或多肽(即含有抗体能与之结合的蛋白质分子区域的肽或多肽)，本领域都知道模拟部分蛋白质序列的较短的合成肽通常能导致产生抗血清，该抗血清能与被部分模拟的蛋白质反应。参见，例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.，“与蛋白质上预定位点反应的抗体”科学219：660-666(1983)。通常蛋白质一级序列中即显示出能激发蛋白质反应性血清的肽，可以通过一组简单的化学规则来鉴定，并且既不被限定在完整蛋白质的免疫显性区域(即免疫原性表位)也不被限定在氨基或羧基末端。

本发明所述带有抗原性表位的肽和多肽可用于制备与本发明所述多肽特异结合的抗体(包括单克隆抗体)。参见，例如Wilson等，细胞37：767-778(1984)，于777页。优选本发明所述带有抗原性表位的肽和多肽序列含有本发明所述多肽的氨基酸序列中包含的至少7个氨基酸、更优选至少9个、最优选至少大约15-30个氨基酸的序列。

可用于制备DR5特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制性例子包括：包含图1中氨基酸残基大约62到110(SEQ ID NO：2中的大约11到59)的多肽；包含图1中氨基酸残基大约119到164(SEQ ID NO：2中的大约68到113)的多肽；包含图1中氨基酸残基大约224到271(SEQ ID NO：2中的大约173到220)的多肽；包含图1中氨基酸残基大约275到370(SEQ ID NO：2中的大约224到319)的多肽。正如以上表明的，发明人确定出上述多肽片段是DR5蛋白质的抗原性区域。

可以通过常规手段制备本发明所述带有表位的肽和多肽。(Hougthen，R.A.，“快速固相合成大量肽的一般方法：单个氨基酸水平上的抗原-抗体相互作用特异性”，美国科学院学报82：5131-5135(1985))。这个“同时多重肽合成(SMPS)”过程在美国专利4631211中有比Hougthen等(1986)更详细的描述。

本领域的技术人员都能理解，本发明所述DR5多肽及其上述带有表位的片段可以与免疫球蛋白(IgG)恒定区的某些部分组合在一起，产生嵌合多肽。这些融合蛋白质能协助纯化，并且体内半衰期延长。例如，由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各个结构域组成的嵌合蛋白质已表明了这一点(EPA394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白质也会比单聚体DR5蛋白质或单独的蛋白质片段更有效地结合或中和其它分子(Fountoulakis等，生物化学杂志270：3958-3964(1995))。

多肽检测

本发明还涉及诊断方法，如用于检测细胞和组织中DR5蛋白质或其可溶性形式水平(包括确定正常和异常水平)的定量和诊断方法。因此，例如根据本发明的用于检测DR5或其可溶性形式过表达的诊断方法，并与正常的对照组织样品进行比较，可以用来检测例如肿瘤的存在。可用于确定来源于某宿主的样品中蛋白质(如本发明的DR5蛋白)水平的检测技术为本领域技术人员熟知。这些检测方法包括放射免疫实验、竞争结合实验、Western印迹实验和ELISA实验。

可以用本领域已知的任何方法检测生物样品中的DR5蛋白质水平。“生物样品”意指任何从个体、细胞系、组织培养物或者其它含有DR5受体蛋白质或mRNA的来源得到的生物样品。优选用于检测生物样品中DR5蛋白质水平的技术是基于抗体的技术。例如，可以用经典的免疫组织学方法(Jalkanen等，细胞生物学杂志101：976-985(1985)；Jalkanen等，细胞生物学杂志105：3087-3096(1987))研究DR5蛋白质在组织中的表达。可用于检测DR5蛋白质基因表达的基于抗体的其它方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫实验(RIA)。

合适的标记是本领域已知的，包括酶标记物(如葡萄糖氧化酶)、放射性同位素(如碘125I、121I；碳14C；硫35S；氚3H；铟112In；锝99mTc)以及荧光标记物(如荧光素和若丹明)和生物素。

治疗方法

已知肿瘤坏死因子(TNF)家族配体是最多效的细胞因子之一，能诱导许多细胞应答，包括细胞毒性、抗病毒活性、免疫调节活性和几种基因的转录调节(Goeddel，D.V.等，“肿瘤坏死因子：基因结构和生物学活性”，Symp.Quant.Biol.51：597-609(1986)，Cold SpringHarbor；Beutler，B.，和Cerami，A.生物化学年刊57：505-518(1988)；Old，L.J.，科学美国人258：59-75(1988)；Fiers，W.，FEBS快报285：199-224(1991))。TNF家族配体通过与TNF家族受体(包括本发明所述DR5)结合而诱导这些不同的细胞应答。表达DR5多肽并且我们相信能对DR5配体作出有力细胞应答的细胞包括初级树突细胞、内皮组织、脾、慢性淋巴细胞性白血病和人胸腺基质细胞。“对TNF家族配体的细胞应答”意指任何由TNF家族配体诱导的细胞、细胞系、组织、组织培养物或患者的基因型、表型和/或形态变化。如文中表明，这些细胞应答既包括对TNF家族配体的正常生理反应，也包括与细胞凋亡增加或抑制相关联的疾病。细胞凋亡(程序化细胞死亡)是一种参与清除免疫系统外周T淋巴细胞的生理机制，其调节障碍能导致许多种不同发病过程(Ameisen，J.C.，AIDS8：1197-1213(1994)；Krammer，P.H.等，免疫学新论(Curr.Opin.Immunol.)6：279-289(1994))。

与细胞存活增加或细胞凋亡抑制相关联的疾病包括癌症(如滤泡淋巴瘤，p53突变的癌，以及激素依赖性肿瘤如乳癌、前列腺癌、Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫疾病(如系统性红斑狼疮和免疫相关的肾小球肾炎类风湿性关节炎)；和病毒感染(如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)；炎症；移植体抗宿主病、急性移植体排斥和慢性移植体排斥。与细胞凋亡增强相关联的疾病包括AIDS；神经变性性疾病(如Alzheimer’s病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、大脑变性)；骨髓发育不良综合症(如再生障碍性贫血)、局部缺血性损伤(如心肌梗塞、中风和再充血损伤导致的损伤)、毒素诱导的肝脏疾病(如酒精引起的疾病)、败血性休克、恶病质和厌食。

因此，本发明的一个方面针对一种用于增强TNF家族配体所诱导的细胞凋亡的方法，包括将有效量的DR5配体、类似物或能增强DR5介导的信号过程的激动剂给予表达DR5多肽的细胞。优选，增强DR5介导的信号过程来治疗细胞凋亡或细胞因子和粘连分子表达呈现下降的疾病。激动剂可以包括可溶形式的DR5和抗DR5多肽的单克隆抗体。

另一方面，本发明针对一种用于抑制TNF家族配体所诱导的细胞凋亡的方法，包括将有效量的能降低DR5介导的信号过程的拮抗剂给予表达DR5多肽的细胞。优选，降低DR5介导的信号过程来治疗细胞凋亡或NFkB表达呈现上升的疾病。拮抗剂可以包括可溶形式的DR5和抗DR5多肽的单克隆抗体。

“激动剂”意指能增加或加强细胞凋亡的天然和合成化合物。“拮抗剂”意指能抑制细胞凋亡的天然和合成化合物。本发明的某种候选“激动剂”和“拮抗剂”是否能够增强或抑制细胞凋亡可以用本领域已知的TNF家族配体/受体细胞应答检测(包括下面将详细描述的)来确定。

一种筛选步骤包括使用被转染从而表达本发明所述受体的黑素细胞。PCT WO92/01810(1992年2月6日公开)中描述了这样一种筛选技术。通过将编码受体的黑素细胞与TNF家族配体和候选的拮抗剂(或激动剂)进行接触，这个方法可以应用于例如筛选抑制(或增强)本发明所述受体多肽活化的化合物。配体产生的信号的抑制或增强表明该化合物是配体/受体信号途径的拮抗剂或激动剂。

其他的筛选技术包括在一个能测量受体活化导致的胞外pH改变的系统中使用表达受体的细胞(例如，转染的CHO细胞)。例如，将一种表达本发明所述受体多肽的细胞与化合物进行接触，测量第二信使应答(例如信号传导或pH改变)，来确定化合物是否激活或抑制受体。

另一种筛选技术包括将编码受体的RNA导入爪蟾卵母细胞从而瞬时表达受体。然后使受体卵母细胞与受体的配体和待筛选的化合物接触，随后检测钙离子信号的抑制或激活(在筛选认为能抑制受体活化的化合物的情况中)。

另一种筛选技术包括在细胞中表达一个构建体，该构建体中受体被连接上了磷脂酶C或D。这些细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、胚肾细胞等。可以按如上描述通过检测受体从磷脂酶信号的激活或者受体的激活被抑制来进行筛选。

另一个方法包括通过确定标记配体与表面有受体的细胞之间的结合被抑制来筛选能抑制本发明所述受体多肽的活化的化合物(拮抗剂)。这个方法包括用编码受体的DNA转染真核细胞，以便细胞在其表面表达该受体，并将化合物在有标记形式的已知配体的情况下与细胞接触。可以例如利用放射性标记配体，测量与受体结合的标记配体的量(例如通过测量受体的放射活性)。如果确定出结合受体的标记配体减少，表明化合物结合了受体，则标记配体与受体的结合即被抑制了。

Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.(生物学化学杂志267：4304-4307(1992))描述过其他用于筛选本发明所述激动剂和拮抗剂的方法。

因此，进一步提供了一种用于确定候选激动剂或拮抗剂是否能增强或抑制对TNF家族配体的细胞应答的筛选方法。该方法包括将表达DR5多肽的细胞与候选的化合物及TNF家族配体接触，检测细胞应答，并与标准的细胞应答(标准的细胞应答是在没有候选化合物时与配体进行接触检测到的)进行比较，因此比标准增加的细胞应答表示该候选化合物是配体/受体信号途径的激动剂，而比标准降低的细胞应答表示该候选化合物是配体/受体信号途径的拮抗剂。“检测细胞应答”意指定性或定量测量对候选化合物和/或TNF家族配体的细胞应答(例如，确定或估计T细胞增殖或者氚胸苷标记的增加或减少)。通过本发明，可以将表达DR5多肽的细胞与内源或外源给予的TNF家族配体进行接触。

根据本发明的激动剂包括天然和合成化合物如，例如TNF家族配体肽片段、转化生长因子、神经递质(如谷氨酸、多巴胺、N-甲基-D-天冬氨酸)、肿瘤抑制因子(p53)、溶细胞性T细胞和抗代谢物。优选的激动剂包括化疗药物，例如，顺铂、阿霉素、博来霉素、阿糖胞苷、氮芥、氨甲蝶呤和长春花新碱。其他包括乙醇和-淀粉样肽(科学267：1457-1458(1995))。另外优选的激动剂包括抗DR5多肽或其片段的多克隆和单克隆抗体。Tartaglia，L.A.(美国科学院学报88：9292-9296(1991))以及Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.(生物学化学杂志267(7)：4304-4307(1992))公开过这种针对TNF家族受体的激动剂抗体。还可参见PCT申请WO94/09137。

根据本发明的拮抗剂包括天然和合成化合物，例如，CD40配体、中性氨基酸、锌、雌激素、雄激素、病毒基因(如腺病毒E1B、杆状病毒p53和IAP、牛痘病毒crmA，非洲淋巴瘤病毒BHRF1、LMP-1、非洲猪热病病毒LMW5-HL和疱疹病毒yl34.5)，钙蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和肿瘤促进因子(如PMA、苯巴比妥和α-六氯环己烷)。

其他的潜在拮抗剂包括反义分子。可以利用反义技术通过反义DNA或RNA或通过形成三螺旋来控制基因表达。例如Okano(神经化学杂志56：560(1991))；“用寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制子”(CRC Press，Boca Raton，FL(1988))讨论过反义技术。例如Lee等(核酸研究6：3073(1979))；Cooney等(科学241：456(1988))；和Dervan等(科学251：1360(1991))讨论过三螺旋形成。这些方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。

例如，可以利用编码本发明所述成熟多肽的多核苷酸的5’编码区设计大约10到40个碱基对长的反义RNA寡核苷酸。设计DNA寡核苷酸，使它与参与转录的基因区域互补，从而阻止受体的转录和产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，并阻断mRNA分子翻译成受体多肽。

在一个实施方案中，通过从外源序列转录而在细胞内产生本发明所述DR5反义核酸。例如，转录载体或载体部分从而产生本发明所述反义核酸(RNA)。这种载体应当含有编码DR5反义核酸的序列。该载体可以保持附加体形式或整合至染色体中，只需它能转录产生期望的反义RNA即可。可以通过本领域标准的重组DNA技术方法构建该载体。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其它用于在脊椎动物细胞中复制和表达的载体。可以通过本领域已知的任何启动子在脊椎动物(优选人)细胞中表达编码DR5的序列或其片段。这些启动子可以是诱导型或组成型的。启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，自然29：304-310(1981))、Rous肉瘤病毒3’长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等，细胞22：787-797(1980))、疱疹胸苷启动子(Wagner等，美国科学院学报78：1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，自然296：39-42(1982))等。

本发明所述反义核酸包含与DR5基因RNA转录产物的至少一部分互补的序列。绝对的互补虽然是优选的，但不是必要的。在本文中，“与RNA至少一部分互补”意味着序列有足够的互补性，能与RNA杂交形成稳定的双螺旋；就双链DR5反义核酸而言，可以检验双螺旋DNA的单链，或分析三螺旋形成。杂交能力取决于互补程度和反义核酸的长度两个因素。通常，杂交核酸越大，则可以含有更多的与DR5 RNA错配的碱基，而仍形成稳定的双螺旋(或者某些情况中是三螺旋)。本领域技术人员可以通过利用标准步骤确定杂交复合体的熔点来确定错配的容忍度。

根据本发明的潜在拮抗剂还包括催化性RNA，或者核酶(参见，例如PCT国际申请WO90/11364，1990年10月4日公开；Sarver等，科学247：1222-1225(1990))。虽然可以用能在位点特异性识别序列处切割mRNA的核酶来破坏DR5 mRNA，但优选使用锤头核酶。锤头核酶切割mRNA的位置由与目的mRNA形成互补碱基对的侧翼区确定。唯一的要求是目标mRNA有以下的双碱基序列：5’-UG-3’。构建和制备锤头核酶是本领域熟知的，Haseloff和Gerlach(自然334：585-591(1988))有过更完全的描述。在DR5的核苷酸序列中有大量潜在的锤头核酶切割位点(图1)。优选地，设计核酶以使切割识别位点靠近DR5 mRNA 5’端；即提高效率并减少非功能性mRNA转录产物在胞内积累。编码核酶的DNA构建体可以采取与上述反义编码DNA相同的方式导入细胞。与反义分子不同，核酶是催化性的，因此它只要求较低的胞内浓度。

根据本发明，另外的拮抗剂包括可溶形式的DR5，即包括来自全长受体中胞外区域的配体结合结构域的DR5片段。该可溶形式的受体可以是天然或合成的，它们通过与细胞表面的DR5竞争结合TNF家族配体来拮抗DR5介导的信号传导。因此，包括配体结合结构域的可溶形式受体是能抑制TNF家族配体诱导的细胞凋亡的新型细胞因子。可以将它们表达为单体，但是优选表达为二聚体或三聚体，因为二聚体或三聚体作为拮抗剂要优于单体的可溶形式受体，例如IgGFc-TNF受体家族融合体。其他这类细胞因子是本领域已知的，包括能够生理性地限制由Fas配体诱导的细胞凋亡的FasB(可溶形式的小鼠Fas受体)(Hughes，D.P.和Crispe，I.N.实验医学杂志182：1395-1401(1995))。

文中使用的术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(mAb)意味着包括能与抗原结合的完整分子和其片段(例如Fab和F(ab’)₂片段)。Fab、Fab’和F(ab’)₂片段缺少完整抗体的Fc片段，从血液循环中清除更迅速，并且非特异性组织结合可能比完整抗体少(Wahl等，核酸医学杂志(J.Nucl.Med.)24：316-325(1983))。

可以使用本发明所述DR5免疫原，通过任何标准方法来制备本发明的抗体。正如文中表明，这些DR5免疫原包括全长的DR5多肽(可以包括或不包括前导序列)和DR5多肽片段(如配体结合结构域、跨膜结构域、胞内结构域和死亡结构域)。

本发明所述抗体可以用于本领域已知的涉及本发明所述多肽序列的定位和活性的方法中，例如用于这些多肽的显像，测量它们在适当生理样品中的水平等。抗体还可以用于免疫分析，并作为DR5的激动剂和拮抗剂用于治疗方法。

根据本发明，能与DR5结构域结合的蛋白质和其它化合物也是候选的激动剂和拮抗剂。可以用酵母双杂交系统(Fields和Song，自然340：245-246(1989))“捕获”这些结合化合物。Roger Brent和他的同事描述过一种改进的酵母双杂交系统(Gyuris，J.等，细胞75：791-803(1993)；Zervos，A.S.等，细胞72：223-232(1993))。优选地，根据本发明使用酵母双杂交系统，以捕获与DR5配体结合结构域或DR5胞内结构域结合的化合物。这些化合物是很好的候选的本发明所述激动剂和拮抗剂。

“TNF家族配体”意指天然的、重组的和合成的配体，这些配体能与TNF受体家族成员结合并且诱导配体/受体信号途径。TNF配体家族成员包括，但不限于DR5配体、TRAIL、TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，又称为TNF-β)、LT-β(在复异三聚体LT-α₂-β中发现的)、FasL、CD40、CD27、CD30、4-IBB、OX40和神经生长因子(NGF)。以下实施例6中描述了一种方法，可以通过它来确定DR5和其衍生物(包括它的片段)、类似物与TRAIL结合的能力。

下面将详细讨论本发明的代表性的医疗应用。界定AIDS病的免疫缺陷症状是CD4⁺T-淋巴细胞数目减少和功能降低的次级表现。最近的报导估计CD4⁺T-淋巴细胞的每日损失量为3.5×10⁷到2×10⁹个细胞(Wei X.等，自然373：117-122(1995))。大家相信，CD4⁺T细胞在感染HIV情况下损耗的一个原因是HIV诱导的细胞凋亡。的确，HIV诱导的凋亡性细胞死亡不仅在体外，更重要的是在被感染个体中已得到了证明(Ameisen，J.C.，AIDS8：1197-1213(1994)；Finkel，T.H.和Banda，N.K.，免疫学新观点6：605-615(1995)；Muro-Cacho，C.A.等，免疫学杂志154：5555-5566(1995))。另外，细胞凋亡和CD4⁺T-淋巴细胞损耗在不同的AIDS动物模型中均密切相关(Brunner，T.等，自然373：441-444(1995)；Gougeon，M.L.等，AIDS病研究及人类逆转录病毒(AIDS Res.Hum.Retrowiruses)9：553-563(1993))，而在病毒复制没有导致AIDS的动物模型中观察不到细胞凋亡(Gougeon，M.L.等，AIDS病研究及人类逆转录病毒9：553-563(1993))。进一步的资料表明，在遇到TNF家族配体FasL后，来自感染HIV的个体的未被感染但已致敏或活化的T-淋巴细胞要经受细胞凋亡。使用被HIV感染后最终死亡的单核细胞系，已证明，用HIV感染U937细胞会导致FasL重新表达并且FasL会介导HIV诱导的细胞凋亡(Badley，A.D.等，病毒学杂志70：199-206(1996))。而且在未被感染的巨噬细胞中能检测到TNF家族配体，该配体的表达在HIV感染后被正调节，导致选择性杀伤未被感染的CD4 T-淋巴细胞(Badley，A.D.等，病毒学杂志70：199-206(1996))。因此，根据本发明，提供了一种用于治疗HIV⁺个体的方法，包括给予本发明所述拮抗剂来减少对CD4 T-淋巴细胞的选择性杀伤。以下将详细讨论给药方式和剂量。

在同种异体移植排斥中，受纳动物的免疫系统最初未被致敏而发生应答，因此，就多数情况而言，免疫系统仅被环境抗原致敏。来自相同种类其他成员的组织不是以例如与呈递病毒和细菌相同的方式呈递的。在同种异体移植排斥的情况中，将免疫抑制疗法设计成防止免疫系统达到效应子阶段。而异种移植排斥的免疫状况可能与疾病复发而非同种异体移植排斥更相似。在疾病复发的情况中，天然岛细胞的破坏证明免疫系统已经被激活。因此，疾病复发时，免疫系统已经达到效应子阶段。本发明的激动剂能抑制对同种异体移植和异种移植的免疫应答，这是因为被激活并分化成效应子的淋巴细胞会表达DR5多肽，因此对能增强细胞凋亡的化合物是易感的。因此，本发明进一步提供了一种用于产生免疫特免组织的方法。

可以将DR5拮抗剂用于治疗炎症疾病，如风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、败血病和肠炎。

另外，由于淋巴母细胞能表达DR5，因此可以用可溶性DR5激动剂或拮抗剂mAB治疗这类癌症。并且，可以用可溶性DR5或中和性mAB治疗各种慢性和急性炎症，如风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、败血病和肠炎。

给药方式

可以将文中描述的激动剂或拮抗剂在体外、离体或在体内给予表达本发明所述受体的细胞。给药“有效量”的激动剂或拮抗剂意指所给化合物(包括多肽)的量能有效地增强或抑制对TNF家族配体的细胞应答。具体说，给药“有效量”的激动剂或拮抗剂意指用量能有效地增强或抑制DR5介导的细胞凋亡。当然，在希望增强细胞凋亡的情况中，可以将本发明的激动剂与TNF家族配体共同给药。每个普通技术人员都能理解，可以根据经验确定激动剂或拮抗剂的有效量，并且可以纯品形式或药学上可接受的盐、酯或前体药物形式应用。可以将激动剂或拮抗剂与一或多种药学上可接受赋形剂(即载体)结合起来以组合物形式给药。

应当理解，当对人类患者给药时，应由主治医生在有效的医疗判断范围内确定本发明所述化合物和组合物的每日总用量。对任何具体患者的具体治疗有效剂量水平取决于本领域熟知的因素。

虽然前面强调过应服从治疗学判断，但作为一般性的建议，肠胃外给药的DR5多肽的总医疗有效量每次剂量应在大约1μg/kg患者体重/天到10mg/kg/天。更优选，激素剂量为至少0.01mg/kg/天，最优选对于人类在大约0.01-1mg/kg/天。如果持续给药，通常以大约1μg/kg/小时到50μg/kg/小时的给药速率给予DR5激动剂或拮抗剂，这是通过每天注射1-4次或(例如用微泵)连续皮下输注达到的。还可以采用静脉内袋装溶液。

还可以患者特异的方式安排服药，以便使激动剂或拮抗剂在血液中达到预定的浓度(如通过RIA技术确定)。因此可以调节患者服药方式来得到规则的持续波谷血液水平(如通过RIA测量到的)，数量级在50到1000ng/ml，优选150到500ng/ml。

提供了包含激动剂或拮抗剂(包括本发明所述DR5多核苷酸和多肽)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物，它们可以经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、表面(以药粉、药膏、滴液或经皮贴片)、颊给药，或以口或鼻喷雾剂的形式给药。通过将激动剂和TNF家族配体共同给药，重要的是这样能够通过使用较低剂量的配体和激动剂而减少临床副作用。应当理解，根据具体医疗应用的紧急程度，可以在TNF家族配体之前、之后或同时将激动剂“共同给药”。“药学上可接受的载体”意味着无毒的固态、半固态或液态的填充剂、稀释剂、成胶囊材料或任何类型的制剂辅助材料。在一个具体实施方案中，“药学上可接受的”意味着联邦或州政府的管理局批准了，或者美国药典或其他普遍认可的药典中列出了可用于动物、更优选用于人。“Remington’s药物科学”(E.W.Martin)提供了根据该实施方案的合适药物载体的非限定性例子，包括无菌液体(如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等)。当药物组合物经静脉内给药时，水是优选的载体。盐溶液和右旋糖水和甘油溶液可用作液态载体，对可注射溶液更是如此。

文中所用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注等给药方式。

本发明所述用于肠胃外注射的药物组合物可以包含药学上可接受的无菌水或非水溶液、分散液、悬液或乳浊液，以及可以在使用前重配成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。

除了可溶性DR5多肽之外，当含有跨膜区的DR5多肽用缓冲液及去污剂(如CHAPS或NP-40)适当地溶解时，也可以使用。

染色体分析

本发明所述核酸分子在染色体鉴定中也有应用价值。这些序列特异地导靶到单个人染色体上的特定位置并与之杂交。根据本发明将DNA在染色体上作图是在这些序列与基因相关疾病之间建立联系的首要步骤。

在这方面的某些优选实施方案中，用文中公开的cDNA和/或多核苷酸克隆DR5基因的基因组DNA。可以用多种熟知技术，和文库(通常市场有售)实现这一点。然后采用针对该目的的熟知技术用基因组DNA做原位染色体图谱分析。

另外，可以利用由cDNA制备得到的PCR引物(优选15-25bp)，将序列定位到染色体上。利用计算机分析该基因的3’非翻译区，可以迅速地挑选出那些不跨越基因组DNA中一个以上外显子的引物(这会使扩增过程复杂化)。然后用这些引物，对含有各人染色体的体细胞杂合体进行PCR筛选。

利用cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(“FISH”)，一步就可以提供精确的染色体位置。这项技术可以使用50或60bp那么短的cDNA。关于这项技术的综述，参见Verma等，人类染色体：基础技术指南，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列已被定位在精确的染色体位置上，就可以将序列在染色体上的物理位置与基因图谱资料联系起来。这些资料可见于例如，V.McKusick，“人类中的孟德尔遗传”(通过Johns HopkinsUniversity，Welch Medical Library联机提供)。然后通过连锁分析(物理位置上临近的基因的共遗传)，鉴定出定位在相同染色体区域的基因和疾病之间的关系。

接下来，需要确定染病和未染病个体间cDNA或基因组序列间的差异。如果在某些或全部染病个体中观察到一个突变，而在任何正常个体中都没有观察到，那么该突变可能是致病原因。

以上概括地描述了本发明，参考以下实施例会更容易理解发明，提供这些实施例是用来阐述而非限定发明。

实施例1

在大肠杆菌中的表达和纯化

用DR5蛋白质氨基端序列和基因3’方向的载体序列的特异PCR寡核苷酸引物，扩增保藏cDNA克隆(ATCC编号97920)中编码成熟DR5蛋白质的DNA序列。分别在5’和3’序列加上含有协助克隆的限制位点的附加核苷酸。

用以下引物在大肠杆菌中表达DR5胞外结构域：5’引物的序列是5’-CGC CCATGGAGTCT GCTCTGATCAC-3’(SEQ ID NO：8)并含有加下划线的NcoI位点；3’引物的序列是5’-CGC AAGCTTTTAGCCTGATTCTTTGTGGAC-3’(SEQ ID NO：9)并含有加下划线的HindIII位点。

上述限制位点对细菌表达载体pQE60(Qiagen，Inc.9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)(本实施例中用它进行细菌表达)的限制酶位点而言是很方便的。pQE60编码氨苄青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有细菌复制原点(“ori”)、IPTG诱导型启动子和核糖体结合位点(“RBS”)。

用NcoI和HindIII消化扩增后的DR5 DNA和载体pQE60，然后将消化过的DNA连接起来。将DR5蛋白质DNA插入限制性酶切过的pQE60载体，使得DR5蛋白质编码区置于载体中IPTG诱导型启动子下游并与它可操纵性连接，同时与适当安置以便进行DR5蛋白质翻译的起始AUG读框一致。

采用标准操作，将连接体系转化到感受态大肠杆菌细胞中。这些步骤在Sambrook等的分子克隆：实验指南(第二版；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))中有描述。用含有多拷贝质粒pREP4(该质粒表达lac抑制子，并赋予卡那霉素抗性“Kanr”)的大肠杆菌菌株M15/rep4进行文中描述的说明性实施例。这个菌株只是许多适用于表达DR5蛋白质的菌株之一，可从Qiagen(同前)买到。

利用它们在有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上的生长能力鉴定出转化子。从抗性克隆中分离出质粒DNA，通过限制酶切分析、PCR和DNA测序证实鉴定到的克隆DNA。

使含有预期构建体的克隆在补充有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜生长(“O/N”)。用O/N培养物以大约1∶100到1∶250的稀释度放大接种。使细胞生长至600nm的光密度(“OD600”)达到0.4到0.6，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)至终浓度为1mM，以通过使lacI阻遏物失活来诱导从lac阻遏物敏感型启动子开始转录。然后将细胞继续培养3到4小时。

然后经离心收获细胞，并用标准方法破碎。用常规的收集技术从破碎的细胞中纯化包涵体，并将蛋白质从包涵体中溶解到8M脲中。含有被溶解蛋白质的8M脲溶液流过在2×磷酸盐缓冲液(“PBS”)的PD-10柱子，从而除去脲、更换缓冲液并使蛋白质重新折叠。再通过层析步骤除去内毒素使蛋白质纯化。然后，将蛋白质无菌过滤。无菌过滤过的蛋白质制品以95μ/ml浓度保存在2×PBS中。

实施例2

在哺乳动物细胞中表达

典型的哺乳动物表达载体含有启动子元件(介导起始转录mRNA)、蛋白质编码序列和转录终止以及转录产物腺苷酸化所需信号。附加元件包括增强子、Kozak序列和旁侧是RNA剪切的供体和受体位点的间插序列。用来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复(LTRs)和来自巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可以实现高效转录。但是，也可以使用细胞信号(例如人肌动蛋白启动子)。适用于实现本发明的表达载体包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)等载体。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1、Cos7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

可选择地，在含有整合到染色体中的基因的稳定细胞系中可表达感兴趣的基因。与选择性标记(如dhfr、gpt、新霉素和潮霉素)共转染就可以鉴定和分离被转染的细胞。

还可以使被转染基因扩增来大量表达它所编码的蛋白质。二氢叶酸还原酶(DHFR)标记可用于培育携带有几百甚至几千个拷贝感兴趣基因的细胞系。另一个有用的选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志227：277-279(1991)；Bebbington等，生物/技术10：169-175(1992))。利用这些标记，在选择性培养基上培养哺乳动物细胞，并挑选出抗性最高的细胞。这些细胞系含有扩增的整合在染色体中的基因。经常用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来生产蛋白质。

表达载体pC1和pC4含有Rous肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学5：438-447(1985年3月))加上CMV-增强子片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。多克隆位点(例如具有限制酶切位点BamHI、XbaI和Asp718)可以协助克隆感兴趣基因。载体可另外含有3’内含子、大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化信号和终止信号。

在CHO细胞中克隆和表达

用载体pC4表达DR5多肽。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生质粒。该质粒含有处于SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。通过在补充有化疗试剂氨甲蝶呤(MTX)的选择培养基(alpha minus MEM，Life Technologies)上培养细胞，可以挑选出转染了所述质粒的缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢或其他细胞。许多文章(参见例如Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，和Schimke，R.T.，生物学化学杂志253：1357-1370(1978)；Hamlin，J.L.和Ma，C.，生物化学与生物物理学学报(Biochem.et Biophys.Acta)1097：107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术9：64-68(1991))中显示抗氨甲蝶呤(MTX)的细胞中DHFR基因发生了扩增。DHFR基因扩增的结果是，生长在MTX浓度渐增的培养基中的细胞通过过度产生目的酶(DHFR)而逐渐发展出对药物的抗性。如果给DHFR基因连接上第二个基因，这个基因通常会共扩增和过表达。本领域已经知道，可以用这个方法培育携带1000个以上拷贝的扩增基因的细胞系。随后，当除去氨甲蝶呤时，就能获得含有扩增基因整合到宿主细胞的一或多个染色体中的细胞系。

为了表达感兴趣的基因，质粒pC4含有Rous肉瘤病毒长末端重复(LTR)的强启动子(Cullen等，分子和细胞生物学5：438-447(1985年3月))，以及分离自人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因的增强子的一个片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。启动子的下游是允许基因进行整合的以下单一限制酶切位点：BamHI、XbaI和Asp718。在这些克隆位点之后，质粒含有大鼠前胰岛素原基因的3’内含子和多聚腺苷酸化位点。也可以用其他高效启动子作表达，例如人β-肌动蛋白启动子、SV40早或晚期启动子或来自其他逆转录病毒(例如HIV和HTLVI)的长末端重复。可以用Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似的系统在哺乳动物细胞中以受调控的方式表达DR5多肽(Gossen，M.，&Bujard，H.，美国科学院学报89：5547-5551(1992))。还可以将其他信号，例如来自人生长激素或球蛋白基因的信号，用于mRNA的多聚腺苷酸化。

如果共转染一个选择标记(如gpt、G418或潮霉素)，还可以挑选出携带整合到染色体中的感兴趣基因的稳定细胞系。开始时以使用一个以上的选择标记为好，例如G418加上氨甲蝶呤。

用限制酶BamHI消化质粒pC4，然后用小牛肠磷酸酯酶通过本领域已知步骤使之去磷酸化。然后从1％的琼脂糖凝胶上分离载体。

用对应于基因期望部分5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码完整多肽的DNA序列。含有BamHI位点(加下划线部分)、Kozak序列和AUG起始密码子的5’引物序列如下：5’-CGC GGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3’(SEQ ID NO：10)；3’引物含有加下划线的Asp718位点，序列如下：5’-CGC GGTACCTTAGGACATGGCAGAGTC-3’(SEQ ID NO：11)。

用内切核酸酶BamHI和Asp718消化扩增后的片段，然后在1％的琼脂糖凝胶上纯化。用T4 DNA连接酶将分离到的片段和去磷酸化的载体连接在一起。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1 Blue细胞，利用例如限制酶切分析鉴定出含有已插入质粒pC4中的片段的细菌。

用缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞进行转染。采用脂质体转染方法(Felgner等，出处同前)，用0.5μg的质粒pSVneo与5μg表达质粒一起共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择标记-来自Tn5的neo基因(该基因编码的酶赋予对一组抗生素(包括G418)的抗性)。将细胞接种在补充有1mg/ml G418的alpha minus MEM中。两天后，将细胞胰蛋白酶解，并在补充有10、25或50ng/ml氨甲蝶呤加上1mg/ml G418的alpha minus MEM中接种在杂交瘤克隆平板(Greiner，Germany)中。大约10到14天后，将单克隆进行胰蛋白酶解，然后接种在使用不同浓度(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)氨甲蝶呤的6孔培养板上或10ml烧瓶中。将在最高浓度氨甲蝶呤上生长的克隆转移到新的含有更高浓度(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)氨甲蝶呤的6孔培养板上。重复相同的步骤，直至获得在100-200μM浓度生长的克隆。通过例如SDS-PAGE和Western印迹或反相HPLC分析，分析期望的基因产物的表达情况。

在COS细胞中克隆和表达

通过将编码DR5蛋白质的可溶性胞外结构域的cDNA克隆到表达载体pcDNAI/Amp或pcDNAIII(可从Invitrogen，Inc.购买)中，制备得到表达质粒pDR5-HA。表达载体pcDNAI/amp含有：(1)能在大肠杆菌和其他原核细胞中有效增殖的大肠杆菌复制原点；(2)用于挑选含有质粒的原核细胞的氨苄青霉素抗性基因；(3)用于在真核细胞中增殖的SV40复制原点；(4)CMV启动子、多接头、SV40和多聚腺苷酸化信号，它们以一定方式排列，这样，借助于多接头中的限制性位点，可以将cDNA方便地置于CMV启动子表达调控下，并与SV40内含子和多聚腺苷酸化信号操纵性连接。将编码DR5多肽胞外结构域的DNA片段和读框一致地融合在它的3’末端的HA标记克隆到载体的多接头区，以便由CMV启动子指导重组蛋白质的表达。HA标记对应一种来源于流感血凝素蛋白质的表位(Wilson等，细胞37：767(1984))。将HA标记与目的蛋白质融合就能用识别HA表位的抗体容易地检测和纯化重组蛋白质。

质粒构建策略如下。用含有方便的限制位点的引物扩增保藏克隆中的DR5 cDNA，方法与前面所述用于构建在大肠杆菌中表达DR5的载体的方法大致相同。为了协助检测、纯化和鉴定被表达的DR5，引物之一含有上述血凝素标记(“HA标记”)。

合适的引物包括本实施例中使用的以下引物。含有加下划线的BamHI位点的5’引物有如下序列：5’-CGC GGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3′(SEQ ID NO：10)含有加下划线的Asp718限制序列的3’引物有如下序列：5’-CGC GGTACCTrAGCCTGATTCTTTTGGAC-3′(SEQ ID NO：12).

用BamHI和Asp718消化PCR扩增的DNA片段和载体(pcDNAI/Amp)，然后连接。将连接体系转化到大肠杆菌菌株SURE(购自Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey PinesRoad，La Jolla，CA92037)中，然后将转化培养物铺氨苄青霉素平板，温育平板使氨苄青霉素抗性克隆生长。从抗性克隆中分离质粒DNA，通过限制酶切分析或其他手段检查是否存在编码DR5多肽胞外结构域的片段。

为了表达重组DR5，用上述表达载体，采用DEAE-DEXTRAN(例如，Sambrook等，分子克隆：实验指南；Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York(1988))转染COS细胞。在载体表达DR5的条件下培养细胞。

采用例如Harlow等描述的方法(抗体：实验指南，第二版；ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1988))，通过放射标记和免疫沉淀检测DR5-HA融合蛋白质的表达。为了达到这个目的，转染后过两天，将细胞在含有35S-半胱氨酸的培养基中培养8小时使之被标记。如上面引用的Wil son等描述的方法收集细胞和培养基，洗涤细胞并用含有去污剂的RIPA缓冲液(150mMNaCl，、1％NP-40、0.1％SDS、0.5％DOC、50mM TRIS，pH7.5)裂解。用HA特异性的单克隆抗体从细胞裂解物和培养基中沉淀出蛋白质。通过SDS-PAGE和放射自显影分析沉淀下来的蛋白质。在细胞裂解物中可以看到预期大小的表达产物，而在阴性对照中没有。

本实施例中用于表达的引物组与本实施例中用于CHO表达的pC4、用于COS表达的pcDNAI/Amp和在下一个实施例中用于杆状病毒表达的pA2相容。因此，例如，可以将扩增用于CHO表达的完整DR5编码片段连接到用于COS表达的pcDNAI/Amp中或者连接到用于杆状病毒表达的pA2中。

实施例3

在杆状病毒表达系统中克隆和表达DR5的可溶性胞外结构域

在本说明性实施例中，采用标准方法(如Summer等在“杆状病毒载体和昆虫细胞培养步骤方法指南，Texas AgriculturalExperimental Station Bulletin No.1555(1987)”中描述的方法)，利用质粒穿梭载体pA2，将编码完整蛋白质的克隆DNA(包括其自然联接的信号序列)插入杆状病毒中，来表达DR5蛋白质。该表达载体含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(ACMNPV)的强多角体启动子，其后跟有方便的限制位点。为了容易挑选重组病毒，质粒含有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，该基因处于一个同向的弱果蝇启动子控制下，其后跟有多角体基因的多聚腺苷酸化信号。插入基因两侧有病毒序列，以用于与野生型病毒DNA进行细胞介导的同源重组，从而产生表达克隆多核苷酸的活性病毒。本领域技术人员容易理解，只要构建体有合乎要求并适当地定位的转录、翻译、分泌等信号(如符合读框的AUG和信号肽)，则可以用许多其他杆状病毒载体，如pAc373、pVL941和pAcIM1代替pA2。例如Luckow等在病毒学170：31-39(1989)中描述过这些载体。

用与该基因5’和3’序列相对应的PCR寡核苷酸引物，扩增保藏克隆(ATCC No.97920)中编码DR5蛋白质可溶性胞外结构域的cDNA序列。DR5 5’引物有如下序列：5’-CGC GGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3’(SEQ ID NO：10)，含有加下划线的BamHI限制酶位点。按照以下描述插入表达载体后，编码DR5的扩增片段的5’末端提供有效的切割信号肽。能在真核细胞中有效地起始翻译的信号适当地位于构建体的载体部分。

DR5 3’引物有如下序列：5′-CGC GGTACCTTAGCCT GATTCFTTGTGGAC-3’(SEQ ID NO：12)，其中含有加下划线的Asp718限制序列，该序列后面是与图1的DR5核苷酸序列互补的核苷酸，再后是终止密码子。

用商品试剂盒(“Geneclean，”BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶上分离扩增片段。然后用BamHI和Asp7 18消化片段，再在1％的琼脂糖凝胶上纯化。该片段命名为“F1”。

用限制酶BamHI和Asp718消化质粒，还可以选择性地采用本领域已知的常规步骤用小牛肠磷酸酯酶将其去磷酸化。然后用商品试剂盒(“Geneclean，”BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶上分离DNA。文中将载体DNA称为“V1”。

用T4 DNA连接酶将片段F1和去磷酸化的质粒V1连接在一起。用连接体系转化大肠杆菌HB101细胞或其他合适的大肠杆菌宿主(如XL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA))，并铺培养基平板。用PCR方法鉴定出包含带有人DR5的质粒的细菌，在本方法中一个引物是用于扩增基因，第二个引物来自载体内部，这样只有含有DR5基因片段的细菌克隆显示出DNA的扩增。通过DNA测序证实克隆片段的序列。文中将该质粒命名为pBac DR5。

采用Felgner等描述的脂质体转染方法(美国科学院学报84：7413-7417(1987))，将1.0μg的商品线性杆状病毒DNA(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)与5μg质粒pBac DR5一起共转染。在含有50μl无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微量平板的一个无菌孔内混合1μg BaculoGoldTM杆状病毒DNA和5μg质粒pBacDR5。随后，加入10μl Lipofectin及90μl Grace’s培养基，混匀并于室温保温15分钟。然后将转染体系滴加给接种在35mm组织培养板(有1ml无血清Grace’s培养基)中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)上。将平板来回晃动以便混匀新加入的溶液。然后将平板于27℃保温5小时。5小时后，从平板中吸去转染溶液，并加入1ml补充了10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养液。将平板放回培养箱，于27℃继续培养4天。

4天后，收集上清液，如前面引用的Summer和Smith所描述的方法进行噬斑实验。使用有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg，MD)以便容易鉴定和分离到表达gal的克隆(产生兰染噬斑)。(关于这类噬斑实验的详细描述还可以在Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD派送的昆虫细胞培养和杆状病毒学使用说明9-10页中找到)。适当地培养后，用微型取液器(如Eppendorf)的吸头挑出染兰噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂重悬于含200μl Grace’s培养液的微量离心管中，并用该含有重组杆状病毒的悬液感染接种在35mm培养皿中的Sf9细胞。四天后，收获这些培养皿的上清液，然后保存于4℃。重组病毒称为V-DR5。

为了证实DR5基因的表达，让Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’s培养液中生长。用感染复数(“MOI”)约为2(大约1到3)的重组杆状病毒V-DR5感染细胞。6小时后，吸去培养液，换入无甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培养基(可以购自Life TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)。如果希望蛋白质被放射标记，则42小时后，加入5μCi³⁵S-甲硫氨酸和5μCi³⁵S-半胱氨酸(可以从Amersham购买)。再将细胞培养16小时，然后离心收集。通过SDS-PAGE、随后作自显影(如果蛋白质被放射标记)分析上清液中的蛋白质及胞内蛋白质。可以通过对纯化蛋白质的氨基端氨基酸序列进行微量测序确定成熟蛋白质的氨基端序列，进而确定切割点和分泌信号肽的长度。

实施例4

DR5基因表达的组织分布

用上面引用的Sambrook等描述的方法，作Northern印迹来检验DR5基因在人组织中的表达。利用rediprime^TM DNA标记系统(Amersham Life Science)，按照生产商的说明，用32P标记含有DR5蛋白质的完整核苷酸序列的cDNA探针。标记后，参照生产商的使用说明(编号PT1200-1)，用CHROMA SPIN-100TM柱子(ClontechLaboratories，Inc.)纯化探针。然后用纯化过的标记探针来检验人体各组织中的DR5 mRNA。

使用ExpressHyb^TM杂交溶液(Clontech)，用标记过的探针按照生产商的使用说明(PT1190-1)检验从Clontech(Palo Alto，CA)获得的含有不同人组织(H)或人免疫系统组织(IM)的多组织Northern(MTN)印迹。杂交并洗涤后，固定印迹，于-70℃曝光过夜。按照标准步骤冲洗底片。在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、睾丸、子宫、小肠、结肠、外周血白细胞(PBL)、淋巴结、骨髓和胎儿的肝脏中都检测到了DR5的表达。

还通过Northern印迹在以下癌症细胞系中测试DR5的表达情况：HL60(早幼粒细胞白血病)、Hela细胞S3、K562(慢性骨髓性白血病)、MOLT4(成淋巴细胞白血病)、Raji(伯基特淋巴瘤)、SW480(结肠直肠腺癌)、A549(肺癌)和G361(黑素瘤)，在所有被测细胞系中都检测到了DR5的表达。

实施例5

DR5在哺乳动物细胞中诱导的细胞凋亡

在哺乳动物细胞中过表达Fas/APO-1和TNFR-1可以模拟受体激活过程(M.Muzio等，细胞85：817-827(1996)；M.P.Boldin等，细胞85：803-815(1996))。因此，利用这个系统研究DR5在诱导细胞凋亡中的功能。本实施例证明，在MCF7人乳腺癌细胞和人上皮样癌(Hela)细胞中过表达DR5都能诱导细胞凋亡。

实验设计

细胞死亡分析基本按照以前的描述(A.M.Chinnaiyan等，细胞81：505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物学化学杂志270：7795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO14：5579-5588(1995)；A.M.Chinnaiyan等，生物学化学杂志271：4961-4965(1996))进行。简要地说，将载体、DR5、DR5Δ(52-411)或TNFR-1与β-半乳糖苷酶报告构建体一起共转染MCF-7人乳腺癌克隆细胞系和Hela细胞。

按照生产商的指导，用脂质体转染步骤(GIBCO-BRL)转染MCF7和Hela细胞。采用CaPO₄沉淀法转染293细胞。转染后过24小时，按以前描述的方法(A.M.Chinnaiyan等，细胞81：505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物学化学杂志270：7795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO14：5579-5588(1995))将细胞固定，并用X-Gal染色，显微镜检。图5中显示的数据(平均值±SD)代表圆形凋亡细胞百分比作为总β-半乳糖苷酶阳性细胞的函数(n＝3)。在MCF7(图5A)和Hela细胞(图5B)中DR5过表达都诱导细胞凋亡。

还用DR5表达构建体在有z-VAD-fmk(20μl)(Enzyme SystemsProducts，Dublin，CA)的情况下转染MCF7细胞，或者与三倍过量的CrmA(M.Tewari等，生物学化学杂志270：3255-60(1995))或FADD-DN表达构建体共转染，或用载体单独转染。图5C显示的数据表明，caspase抑制剂减弱了DR5诱导的细胞凋亡，但显性阴性FADD不能减弱。

正如图5D所描述的，DR5在体内不与FADD或TRADD相结合。采用磷酸钙沉淀法，用提到的表达构建体共转染293细胞。转染后(在40小时)，制备细胞裂解液，并用Flag M2抗体亲合胶(IBI，Kodak)使它免疫沉淀，用FADD的多克隆抗体或偶联了辣根过氧化酶(HRP)的myc抗体通过免疫印迹检测是否存在FADD或myc标记的TRADD(myc-TRADD)(Baker，S.J.等，原癌基因12：1(1996)；Chinnaiyan，A.M.等，科学274：990(1996))。

如图5E所描述，FLICE2-DN能阻断DR5诱导的细胞凋亡。用DR5或TNFR-1表达构建体和4倍过量的CrmA、FLICE-DN、FLICE 2-DN或仅用载体，在有β-半乳糖苷酶报告构建体存在下共转染293细胞。25-30小时后，将细胞染色并检验。

结果

过表达DR5，在MCF7人乳腺癌细胞(图5A)和人上皮样癌(Hela)细胞(图5B)中都诱导了细胞凋亡。多数被转染的细胞显示出正在凋亡的细胞特有的形态变化(Earnshaw，W.C.，现代生物学7：337(1995))：逐渐变圆、凝聚并与培养皿脱离。缺失死亡结构域就消除了杀伤能力。与DR4相同，DR5诱导的细胞凋亡也被caspase抑制剂-CrmA和z-VAD-fmk阻断，但显性阴性FADD对它没有影响(图5C)。与此相符，DR5在体内不与FADD和TRADD相互作用(图5D)。新鉴定的类FLICE分子的显性阴性形式FLICE2(Vincenz，C.等，生物学化学杂志272：6578(1997))，能有效地阻断DR5诱导的细胞凋亡，而显性阴性FLICE在它能有效阻断TNFR-1诱导的细胞凋亡的条件下，只有部分效果(图5E)。总之，这些证据提示DR5引发一个细胞凋亡的程序，其中包括FLICE2和下游caspase的活化，而与FADD无关。

实施例6

DR5的胞外结构域结合细胞毒性配体-TRAIL并阻断TRAIL诱导的细胞凋亡

正如上面讨论过，TRAIL/Apo2L是一种细胞毒性配体，它属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族，可诱导许多转化细胞系发生迅速的细胞死亡，却不诱导正常组织，尽管含有死亡结构域的受体DR4在这两种类型细胞中都有表达。本实施例表明本发明所述受体DR5也结合TRAIL。

由于DR5和DR4中富含半胱氨酸的胞外配体结合结构域方面的相似性，发明人推论DR5也应与TRAIL结合。为了证实这一点，将DR5的可溶性胞外配体结合结构域与人免疫球蛋白(IgG)的Fc部分融合在一起进行表达。

如图6A所示，DR5-Fc特异结合TRAIL，而不结合相关的细胞毒性配体TNFα。在该实验中，制备了Fc-DR5、DR4、TRID或TNFR1的胞外结构域以及它们的相应配体，并如Pan等(科学276：111(1997))所述进行结合检测。用蛋白G-Sepharose沉淀各个Fc融合体，并用抗Flag(Babco)或抗myc-HRP(BMB)通过免疫印迹检测共沉淀的可溶性配体。图6A底端的一组显示结合检测中Fc-融合体的加入量。

另外，DR5-Fc能阻断TRAIL诱导细胞凋亡的能力(图6B)。在有等量的Fc-融合体或只有Fc时，用可溶性TRAIL(200ng/ml)处理MCF7细胞。6小时后，按照Pan等描述的方法固定细胞(出处同前)并检验。图6B显示的数据(均值±SD)是凋亡细胞核在计数的总细胞核中的百分比(n＝4)。

最后，在TNFR1-Fc能完全消除TNFα的杀伤能力的条件下，DR5-Fc对凋亡(TNFα诱导的细胞死亡)没有影响。在有等量的Fc-融合体或Fc自身时，用TNFα(40ng/ml；Genentech，Inc.)处理MCF7细胞。11-15小时后，将细胞核染色并检验。

新鉴定出DR5是TRAIL的受体，这进一步增加了TRAIL引发的信号传导的生物学复杂性。

很显然，可以用前面说明书和实施例以外的方式实现本发明。

根据以上的教导，对本发明的许多改进和变化仍在以下权利要求的范围内。

此处所有专利、专利申请和出版物全文引作参考文献。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)姓名：Ni，Jian

Gentz，Reiner

Yu，Guo-Liang

Su，Jeffrey

Rosen，Craig A.

(ii)发明名称：包含死亡结构域的受体5

(iii)序列数：12

(iv)通讯地址：

(A)收件人：Human Genome Sciences，Inc.

(B)街道：9410 Key West Avenue

(C)城市：Rockville

(D)州：MD

(E)国家：US

(F)邮政编码：20850

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(vi)目前的申请资料：

(A)申请号：US

(B)申请日：

(C)分类号：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 60/054,021

(B)申请日：29-JUL-1997

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 60/040,846

(B)申请日：17-MAR-1997

(viii)代理人/代理资料：

(A)姓名：Hoover，Kenley

(B)登记号：40,302

(C)资料/文档号：PF366

(ix)通讯资料：

(A)电话：3013098504

(B)传真：3013098439

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1600个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/关键词：sig-peptide(信号肽)

(B)位置：130...283

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：130...1362

(ix)特征：

(A)名称/关键词：mat-peptide(成熟肽)

(B)位置：284...1362

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

CACGCGTCCG CGGGCGCGGC CGGAGAACCC CGCAATCTTT GCGCCCACAA AATACACCGA 60

CGATGCCCGA TCTACTTTAA GGGCTGAAAC CCACGGGCCT GAGAGACTAT AAGAGCGTTC 120

CCTACCGCC ATG GAA CAA CGG GGA CAG AAC GCC CCG GCC GCT TCG GGG 168

Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly

-51 -50 -45 -40

GCC CGG AAA AGG CAC GGC CCA GGA CCC AGG GAG GCG CGG GGA GCC AGG 216

Ala Arg Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg

-35 -30 -25

CCT GGG CCC CGG GTC CCC AAG ACC CTT GTG CTC GTT GTC GCC GCG GTC 264

Pro Gly Pro Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val

-20 -15 -10

CTG CTG TTG GTC TCA GCT GAG TCT GCT CTG ATC ACC CAA CAA GAC CTA 312

Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu

-5 1 5 10

GCT CCC CAG CAG AGA GCG GCC CCA CAA CAA AAG AGG TCC AGC CCC TCA 360

Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser

15 20 25

GAG GGA TTG TGT CCA CCT GGA CAC CAT ATC TCA GAA GAC GGT AGA GAT 408

Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp

30 35 40

TGC ATC TCC TGC AAA TAT GGA CAG GAC TAT AGC ACT CAC TGG AAT GAC 456

Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp

45 50 55

CTC CTT TTC TGC TTG CGC TGC ACC AGG TGT GAT TCA GGT GAA GTG GAG 504

Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu

60 65 70

CTA AGT CCC TGC ACC ACG ACC AGA AAC ACA GTG TGT CAG TGC GAA GAA 552

Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu

75 80 85 90

GGC ACC TTC CGG GAA GAA GAT TCT CCT GAG ATG TGC CGG AAG TGC CGC 600

Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg

95 100 105

ACA GGG TGT CCC AGA GGG ATG GTC AAG GTC GGT GAT TGT ACA CCC TGG 648

Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp

110 115 120

AGT GAC ATC GAA TGT GTC CAC AAA GAA TCA GGC ATC ATC ATA GGA GTC 696

Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val

125 130 135

ACA GTT GCA GCC GTA GTC TTG ATT GTG GCT GTG TTT GTT TGC AAG TCT 744

Thr Val Ala Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser

140 145 150

TTA CTG TGG AAG AAA GTC CTT CCT TAC CTG AAA GGC ATC TGC TCA GGT 792

Leu Leu Trp Lys Lys Val Leu Pro Tyr Lau Lys Gly Ile Cys Ser Gly

155 160 165 170

GGT GGT GGG GAC CCT GAG CGT GTG GAC AGA AGC TCA CAA CGA CCT GGG 840

Gly Gly Gly Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly

175 180 185

GCT GAG GAC AAT GTC CTC AAT GAG ATC GTG AGT ATC TTG CAG CCC ACC 888

Ala Glu Asp Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr

190 195 200

CAG GTC CCT GAG CAG GAA ATG GAA GTC CAG GAG CCA GCA GAG CCA ACA 936

Gln Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr

205 210 215

GGT GTC AAC ATG TTG TCC CCC GGG GAG TCA GAG CAT CTG CTG GAA CCG 984

Gly Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro

220 225 230

GCA GAA GCT GAA AGG TCT CAG AGG AGG AGG CTG CTG GTT CCA GCA AAT 1032

Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn

235 240 245 250

GAA GGT GAT CCC ACT GAG ACT CTG AGA CAG TGC TTC GAT GAC TTT GCA 1080

Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala

255 260 265

GAC TTG GTG CCC TTT GAC TCC TGG GAG CCG CTC ATG AGG AAG TTG GGC 1128

Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly

270 275 280

CTC ATG GAC AAT GAG ATA AAG GTG GCT AAA GCT GAG GCA GCG GGC CAC 1176

Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His

285 290 295

AGG GAC ACC TTG TAC ACG ATG CTG ATA AAG TGG GTC AAC AAA ACC GGG 1224

Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly

300 305 310

CGA GAT GCC TCT GTC CAC ACC CTG CTG GAT GCC TTG GAG ACG CTG GGA 1272

Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly

315 320 325 330

GAG AGA CTT GCC AAG CAG AAG ATT GAG GAC CAC TTG TTG AGC TCT GGA 1320

Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly

335 340 345

AAG TTC ATG TAT CTA GAA GGT AAT GCA GAC TCT GCC ATG TCC 1362

Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser

350 355 360

TAAGTGTGAT TCTCTTCAGG AAGTGAGACC TTCCCTGGTT TACCTTTTTT CTGGAAAAAG 1422

CCCAACTGGA CTCCAGTCAG TAGGAAAGTG CCACAATTGT CACATGACCG GTACTGGAAG 1482

AAACTCTCCC ATCCAACATC ACCCAGTGGA TGGAACATCC TGTAACTTTT CACTGCACTT 1542

GGCATTATTT TTATAAGCTG AATGTGATAA TAAGGACACT ATGGAAAAAA AAAAAAAA 1600

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：411个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys

-51 -50 -45 -40

Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro

-35 -30 -25 -20

Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu

-15 -10 -5

Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln

1 5 10

Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu

15 20 25

Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser

30 35 40 45

Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe

50 55 60

Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro

65 70 75

Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe

80 85 90

Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys

95 100 105

Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile

110 115 120 125

Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala

130 135 140

Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp

145 150 155

Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly

160 165 170

Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp

175 180 185

Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro

190 195 200 205

Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn

210 215 220

Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala

225 230 235

Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp

240 245 250

Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val

255 260 265

Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp

270 275 280 285

Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr

290 295 300

Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala

305 310 315

Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu

320 325 330

Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met

335 340 345

Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser

350 355 360

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：455个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro

20 25 30

His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys

35 40 45

Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys

50 55 60

Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp

65 70 75 80

Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu

85 90 95

Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val

100 105 110

Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg

115 120 125

Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe

130 135 140

Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu

145 150 155 160

Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu

165 170 175

Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr

180 185 190

Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser

195 200 205

Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu

210 215 220

Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys

225 230 235 240

Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu

245 250 255

Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser

260 265 270

Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val

275 280 285

Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys

290 295 300

Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly

305 310 315 320

Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn

325 330 335

Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp

340 345 350

Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro

355 360 365

Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu

370 375 380

Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln

385 390 395 400

Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala

405 410 415

Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly

420 425 430

Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro

435 440 445

Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg

450 455

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：335个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp

165 170 175

Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg

180 185 190

Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly

195 200 205

Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu

210 215 220

Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met

225 230 235 240

Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu

245 250 255

Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu

260 265 270

Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys

275 280 285

Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys

290 295 300

Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser

305 310 315 320

Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val

325 330 335

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：417个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg

20 25 30

Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys

35 40 45

Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro

50 55 60

Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala

65 70 75 80

Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp

85 90 95

Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp

100 105 110

Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser

115 120 125

Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys

130 135 140

Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr

145 150 155 160

Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys

165 170 175

Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala

180 185 190

Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala

195 200 205

Gly Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr

210 215 220

Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly

225 230 235 240

Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp

245 250 255

Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys

260 265 270

Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr

275 280 285

Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro

290 295 300

Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser

305 310 315 320

Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr

325 330 335

Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg

340 345 350

Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val Glu Val Glu Ile

355 360 365

Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln

370 375 380

Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Arg Met

385 390 395 400

Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly

405 410 415

Pro

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：507个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

AATTCGGCAC AGCTCTTCAG GAAGTCAGAC CTTCCCTGGT TTACCTTTTT TCTGGAAAAA 60

GCCCAACTGG GACTCCAGTC AGTAGGAAAG TGCCACAATT GTCACATGAC CGGTACTGGA 120

AGAAACTCTC CCATCCAACA TCACCCAGTG GNATGGGAAC ACTGATGAAC TTTTCACTGC 180

ACTTGGCATT ATTTTTGTNA AGCTGAATGT GATAATAAGG GCACTGATGG AAATGTCTGG 240

ATCATTCCGG TTGTGCGTAC TTTGAGATTT GNGTTTGGGG ATGTNCATTG TGTTTGACAG 300

CACTTTTTTN ATCCCTAATG TNAAATGCNT NATTTGATTG TGANTTGGGG GTNAACATTG 360

GTNAAGGNTN CCCNTNTGAC ACAGTAGNTG GTNCCCGACT TANAATNGNN GAANANGATG 420

NATNANGAAC CTTTTTTTGG GTGGGGGGGT NNCGGGGCAG TNNAANGNNG NCTCCCCAGG 480

TTTGGNGTNG CAATNGNGGA ANNNTGG 507

(2)SEQ ID NO：7的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：226个碱基对

(B)类型：核酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TTTTTTTTGT AGATGGATCT TACAATGTAG CCCAAATAAA TAAATAAAGC ATTTACATTA 60

GGATAAAAAA GTGCTGTGAA AACAATGACA TCCCAAACCA AATCTCAAAG TACGCACAAA 120

CGGAATGATC CAGACATTTC CATAGGTCCT TATTATCACA TTCAGCTTAT AAAATAATGC 180

CAAGTGCAGT GAAAAGTTAC AGGATGTTCC ATCCACTGGG TGGATT 226

(2)SEQ ID NO：8的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

CGCCCATGGA GTCTGCTCTG ATCAC 25

(2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

CGCAAGCTTT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC 30

(2)SEQ ID NO：10的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

CGCGGATCCG CCATCATGGA ACAACGGGGA CAGAAC 36

(2)SEQ ID NO：11的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

CGCGGTACCT TAGGACATGG CAGAGTC 27

(2)SEQ ID NO：12的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

CGCGGTACCT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC 30

Claims

1.一种分离的核酸分子，它包含具有与选自以下的序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸：

(a)编码包含SEQ ID NO：2中大约-51到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；

(b)编码包含SEQ ID NO：2中大约-50到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；

(c)编码包含SEQ ID NO：2中大约1到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；

(d)编码具有ATCC No.97920中所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

(e)编码具有ATCC No.97920中所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟DR5多肽的核苷酸序列；

(f)编码DR5胞外结构域的核苷酸序列；

(g)编码DR5跨膜结构域的核苷酸序列；

(h)编码DR5胞内结构域的核苷酸序列；

(i)编码DR5死亡结构域的核苷酸序列；和

(j)与上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)中的任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。

3.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码具SEQ IDNO：2中氨基酸序列的DR5多肽的核苷酸序列。

4.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1中的核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2中的氨基酸序列的成熟DR5多肽。

5.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有ATCC NO.97920中包含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。

6.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码DR5多肽的核苷酸序列，该DR5多肽具有ATCC NO.97920包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。

7.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码成熟DR5的核苷酸序列，该成熟DR5多肽具有ATCC NO.97920所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列。

8.一种分离的核酸分子，它包含一段多核苷酸序列，该多核苷酸序列与具有和权利要求1中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸序列在严谨杂交条件下可杂交，其中所述发生杂交的多核苷酸在严谨杂交条件下不与具有仅由腺嘌呤核苷酸或者胸腺嘧啶核苷酸组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。

9.一种分离的核酸分子，它包含编码DR5多肽中带有表位之部分的氨基酸序列的多核苷酸，该DR5多肽具有权利要求1中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)的氨基酸序列。

10.权利要求9的分离的核酸分子，它编码DR5多肽中携表位之部分，所述部分选自：包含SEQ ID NO：2中大约11到59位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中大约68到113位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中大约173到220位氨基酸残基的多肽；和包含SEQ ID NO：2中大约224到319位氨基酸残基的多肽。

11.权利要求1的分离的核酸分子，该核酸分子编码DR5胞外结构域。

12.权利要求1的分离的核酸分子，该核酸分子编码DR5跨膜结构域。

13.权利要求1的分离的核酸分子，该核酸分子编码DR5胞内结构域。

14.一种重组载体的制备方法，包括将权利要求1的分离的核酸分子插入载体。

15.由权利要求14所述方法制备的重组载体。

16.重组宿主细胞的制备方法，包括将权利要求1的分离的核酸分子导入宿主细胞内。

17.由权利要求16所述方法制备的重组宿主细胞。

18制备DR5多肽的重组方法，包括在能使所述多肽表达的条件下培养权利要求17的重组宿主细胞，并纯化该多肽。

19.一种分离的DR5多肽，它包含与选自下面的序列至少95％相同的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2中氨基酸大约-51到360位；

(b)SEQ ID NO：2中氨基酸大约-50到360位；

(c)SEQ ID NO：2中氨基酸大约1到360位；

(d)具有ATCC NO.97920所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的DR5多肽的氨基酸序列；

(e)具有ATCC No.97920所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟DR5多肽的氨基酸序列；

(f)DR5胞外结构域的氨基酸序列；

(g)DR5跨膜结构域的氨基酸序列；

(h)DR5胞内结构域的氨基酸序列；

(i)DR5死亡结构域的氨基酸序列；

(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中任何一个多肽的带有表位之部分的氨基酸序列。

20.一种分离的多肽，该多肽包含DR5蛋白质的携表位之部分，其中所述部分选自：包含SEQ ID NO：2中氨基酸残基大约11到59位的多肽；包含SEQ ID NO：2中氨基酸残基大约68到113位的多肽；包含SEQ ID NO：2中氨基酸残基大约173到220位的多肽；包含SEQID NO：2中氨基酸残基大约224到319的多肽。

21.一种可与权利要求19所述DR5多肽特异性结合的分离的抗体。

22.一种分离的核酸分子，该核酸分子包含一段多核苷酸，该多核苷酸具有的一段序列与选自以下的序列至少95％相同：

(a)克隆HAPBU13R的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)

(b)克隆HSBBU76R的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)

(c)SEQ ID NO：1所示序列的一部分的核苷酸序列，该部分包含核苷酸284到1362中的至少50个连续核苷酸；和

(d)与上述(a)、(b)或(c)中的任何一个核苷酸序列互补的核苷酸序列。

23.一种分离的核酸分子，该核酸分子包含编码DR5多肽的多核苷酸，其中所述多肽除了有至少一个保守氨基酸取代外，基本上具有选自以下的序列：

(f)编码DR5胞外结构域的核苷酸序列；

(g)编码DR5跨膜结构域的核苷酸序列；

(h)编码DR5胞内结构域的核苷酸序列；

(i)编码DR5受体的胞外和胞内结构域并且全部或部分跨膜结构域被缺失的核苷酸序列；

(j)编码DR5死亡结构域的核苷酸序列；和

(k)与上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。

24.一种分离的DR5多肽，所述多肽除了含有至少一个保守性氨基酸取代外，基本上具有选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO：2中氨基酸大约-51到360位；

(b)SEQ ID NO：2中氨基酸大约-50到360位；

(c)SEQ ID NO：2中氨基酸大约1到360位；

(d)具有ATCC NO.97920中所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的DR5多肽的氨基酸序列；

(e)具有ATCC NO.97920中所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟DR5多肽的氨基酸序列；

(f)DR5受体胞外结构域的氨基酸序列；

(g)DR5受体跨膜结构域的氨基酸序列；

(h)DR5受体胞内结构域的氨基酸序列；

(i)DR5受体胞外和胞内结构域并且全部或部分跨膜结构域被缺失的氨基酸序列；

(j)DR5受体死亡结构域的氨基酸序列；和

(k)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中任何一个多肽的携表位之部分的氨基酸序列。

25.包含权利要求19所述多肽和药学上可接受载体的药物组合物。

26.包含权利要求21所述抗体和药学上可接受载体的药物组合物。

27.包含权利要求24所述多肽和药学上可接受载体的药物组合物。

28.包含权利要求19所述多肽与一种异源多肽融合在一起的融合蛋白质。

29.权利要求8的分离的核酸，其中所述核酸编码能被DR5多肽的抗体结合的蛋白质，该DR5多肽具有SEQ ID NO：2中的氨基酸序列。

30.重组载体的制备方法，包括将权利要求8的分离的核酸分子插入载体中。

31.由权利要求30所述方法制备的重组载体。

32.重组宿主细胞的制备方法，包括将权利要求8的分离的核酸分子导入宿主细胞中。

33.由权利要求32所述方法制备的重组宿主细胞。

34.制备多肽的重组方法，包括在能使所述多肽表达的条件下培养权利要求33所述重组宿主细胞，和回收所述多肽。