CN1308451C

CN1308451C - 肿瘤坏死因子相关配基

Info

Publication number: CN1308451C
Application number: CNB971984018A
Authority: CN
Inventors: Y·奇彻波提彻; J·L·布朗宁
Original assignee: Geneva School Of Medicine, University of; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biological gene MA company; University of Geneva School of Medicine
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2007-04-04
Anticipated expiration: 2017-08-07
Also published as: AU3829497A; JP4411330B2; IL128407A0; NO990550D0; BG103169A; IL128407A; WO1998005783A1; EP1591530B8; IS2606B; NZ334107A; SK288012B6; JP4161084B2; KR20000029877A; BR9711046A; CZ297387B6; EA199900187A1; ATE307204T1; EP1591530B1; PL188102B1; DE69734397D1

Abstract

肿瘤坏死因子相关配基(TRELL)，一种肿瘤坏死因子家族(TNF)的新成员，修饰过的TRELL以及包含它们的药物组合物。

Description

肿瘤坏死因子相关配基

发明背景

本发明涉及肿瘤坏死因子相关配基或“TRELL”，一种肿瘤坏死因子家族成员的多肽。该蛋白质或其受体可用于抗癌和/或免疫调节。而且，TRELL基因转染的细胞可以用于肿瘤、自身免疫疾病和炎性疾病或者继承性遗传障碍的基因治疗。

本文描述的发明一部分为瑞士国家基金授予Irene Garcia的#31-42275.94和32-41729.94基金的工作。瑞士国家基金法#28和#29段描述了保留权。

发明背景

肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞因子是宿主防御和免疫调节的介质。该家族成员以膜锚定形式存在，通过细胞与细胞的接触局部发挥作用，或作为分泌蛋白质扩散到更远距离为目标。对应的受体家族发生上述分子存在的信号，其导致在靶组织中细胞死亡开始或细胞增殖和分化。目前，TNF家族的配基和受体至少已经了确定9个受体-配基对，包括：TNF：TNF-R；LT-α：TNF-R；LT-α/β：LT-β-R；FasL：Fas；CD40L：CD40；CD30L：CD30；CD27L：CD27；OX40L：OX40和4-1 BBL：4-1BB。编码这些配基的DNA序列，甚至在最相关的情况下也仅有约25％到约30％的同源性，而氨基酸相关性为约50％。

最初由两个不同的TNF受体的分子克隆揭示，发现该细胞因子受体家族确定的特征是胞外富含半胱氨酸结构域¹。该基因家族编码的糖蛋白质性质为具有胞外配基结合结构域的I型跨膜蛋白质，一个跨膜区和一个参与激活细胞功能的胞质区。该富含半胱氨酸配基结合区表现为紧密结合的二硫键连接的核心结构域(取决于特定家族成员)，并多次重复。大多数受体有四个结构域，虽然也可以少至三个结构域，或多至六个结构域。

TNF家族的蛋白质配基特征为：通常具有短亲水氨基酸的短N末端序列，该序列通常包含用作终止转移序列的几个赖氨酸或精氨酸残基。接下来连接一个跨膜区和一个可变长度的胞外区，其将C末端受体结合结构域与膜分开。该区有时称作“柄”。C末端受体结合结构域包括巨量蛋白质，通常但不总是，包含糖基化位点。这些基因缺少I型膜蛋白质的典型信号序列特征，而具有II型膜蛋白质的特点，其C末端位于细胞外侧，短的N末端残基在胞质中。有些情况中，例如，TNF和LT-α，在蛋白质加工过程早期柄区被切割，配基则主要以分泌型存在。然而，大多数配基以膜形式存在，介导定位信号传送。

通过TNF、LT-α和CD40L的结晶学分析对这些配基的结构作了充分描述。TNF和淋巴毒素-α(LT-α)都具有“三明治”结构，即两个反向平行的β-折叠片层，其中有“果冻卷”或希腊钥匙状拓扑结构²。Cα和β-链残基之间的rms偏差为0.61C，说明它们的分子拓扑图极其相似。CD40L、TNF和LT-α的分子研究表明它们的结构特征为倾向于组成寡聚复合物。该寡聚物结构的实质是在两个相邻亚基的接合处形成受体结合位点从而形成多价配基。TNF、CD40L和LT-α的晶体结构分析表明它们的四级结构以三聚体形式存在。不同配基间的一些保守氨基酸为支架样β-片层结构序列。似乎所有这些分子都保留这种基本的三明治结构，因为这种支架序列部分在该家族的多种成员中都保留。四级结构也可能存在，因为该亚基构象倾向于保持相似。

TNF家族的成员可以最好被描述为免疫系统的总开关，其控制细胞存活和分化。与TNF家族的其它主要膜锚定成员相反，目前仅发现TNF和LTα为分泌型细胞因子。虽然TNF的膜形式已经充分表征，其基本上具有唯一的生物作用，而分泌型TNF通常作为一般报警信号作用于距引发事件位点较远的细胞。因此TNF的分泌可以放大导致脉管系统内壁和细胞炎症状态的充分描述的变化的事件。相反，该家族的膜结合成员通过TNF型受体仅对直接接触的细胞发送信号。例如，T细胞仅对通过相关TCR相互作用引起直接接触的B细胞提供CD40介导的“帮助”。对诱导细胞死亡能力的类似的细胞-细胞接触限制应用于研究透彻的Fas系统。

诱导程序性细胞死亡的能力是TNF家族数个成员的一个重要和充分研究的特性。Fas介导的程序性细胞凋亡可能在外周和胸腺中自反应淋巴细胞的调控中发挥作用(Castro等，1996)，近期的工作也暗示TNF和CD30体系存在于T细胞和巨细胞退行发育淋巴瘤系的存活(Amakawa等，1996；Gruss等，1994；Sytwu等，1996；Zheng等，1995)。我们以及其它人以前曾表明这一细胞系的死亡应答传送程序性细胞凋亡信号的TNF、Fas或LTb受体(Abreu-Martin等，1995；Browning等，1996)。

基于其诱导细胞死亡的能力可以将TNF配基分成三组(表III)。首先，TNF、Fas配基和TRAIL可以有效地诱导许多细胞系中的细胞死亡，其受体大多数很可能有典型的死亡结构域。推测DR-3的配基(TRAMP/WSL-1)也应该属于这一类。其次，有一些触发微弱死亡信号的配基限于很少的一些细胞类型，TRELL、CD30配基和LTalb2是这一类的例子。这组配基如何在缺乏典型死亡结构域的情况下诱导细胞死亡是一个令人感兴趣的问题，提示存在一个分开的微弱死亡信号传递机制。最后，还有一些成员，不能有效传递死亡信号。作为诱导细胞分化的结果，也许所有这些基团对某些细胞类型都具有抗增殖作用，例如CD40(Funakoshi等，1994)。

TNF家族近年来增长迅速，包括至少11种不同的涉及免疫系统调节的信号传递途径。TRELL和TRAIL的表达模式表明还有很多该家族的功能变体有待揭示。近几年这方面研究受到高度重视，发现两种影响劳斯肉瘤和单纯疱疹病毒复制能力的受体，以及以前观察到TNF有抗病毒活性，痘病毒编码伪TNF受体(Brojatsch等，1996；Montgomery等，1996；Smith等，1994；Vassalli，1992)。可溶性TRELL的制备和TRELL受体的鉴定提供了阐述该目标蛋白质的生物功能的工具。

TNF是脓毒性休克和恶病质的介质³，参与造血细胞发育的调节⁴。其可能作为炎症和防御细菌、病毒和寄生虫感染的介质⁵发挥重要作用，且具有抗肿瘤活性⁶。TNF也涉及不同的自身免疫疾病⁷。几种类型的细胞可以产生TNF，包括巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞和天然杀伤细胞⁸。TNF与两个不同的受体结合，其中每个通过特异性胞内信号传递分子发挥作用，从而导致不同的TNF作用⁹。TNF既可以以膜结合型存在也可以作为可溶性分泌细胞因子存在¹⁰。

LT-α具有TNF的许多活性，即，能与TNF受体结合¹¹，但与TNF不同，其可能主要由活化的T细胞和一些β-类淋巴母细胞瘤分泌¹²。LT-α和LT-β的杂合复合物是与LT-β受体结合的膜结合复合物¹³。LT系统(LT和LT-R)可能参与外周淋巴器官的发育，因为LT-β的遗传破坏导致脾中T和B细胞解体以及淋巴结的缺乏¹⁴。LT-β系统也参与一些腺癌细胞系的细胞死亡¹⁵。

TNF家族的另一种成员Fas-L主要在活化的T细胞中表达¹⁶。它通过已知为程序性细胞死亡或程序性细胞凋亡机制诱导承载其受体的细胞死亡，包括肿瘤细胞和HIV感染的细胞¹⁷。而且，Fas或Fas-L的缺失可能导致淋巴扩增性紊乱，明确了Fas系统在免疫反应调节中的作用¹⁸。Fas系统还参与肝炎慢性感染导致的肝损伤¹⁹和HIV感染病人中的自身免疫²⁰。Fas系统还参与HIV病人的T细胞破坏²¹。该家族为另一成员TRAIL可能还参与大量不同起源的转化细胞系的死亡²²。

TNF家族的另一个成员CD40-L在T细胞表达，诱导承载CD40的B细胞的调节²³。而且，CD40-L基因的改变导致一种称为X-连锁的高IgM综合征的疾病²⁴。CD40系统也参与不同的自身免疫疾病²⁵，CD40-L已知具有抗病毒性质²⁶。虽然CD40系统参与程序性细胞凋亡的B细胞的营救²⁷，但对非免疫细胞却诱导程序性细胞凋亡²⁸。TNF家族的另外一些淋巴细胞成员还参与共刺激²⁹。

通常，TNF家族的成员对控制免疫系统和激活急性宿主防御系统具有基本的调节作用。假设目前能够操纵TNF家族的成员用于治疗，可能该家族的成员会提供控制疾病的唯一方法。该家族的一些配基可以直接诱导许多转化细胞的程序性细胞凋亡，例如，LT、TNF、Fas配基和TRAIL(Nagata，1997)。Fas及可能的TNF和CD30受体的活化可以诱导具有免疫调节功能的非转化淋巴细胞的死亡(Amakawa等，1996；Nagata，1997；Sytwu等，1996；Zheng等，1995)。通常，随着位于TNF受体胞质侧死亡结构域的聚集引发死亡。死亡结构域负责组装多种导致级联反应激活的信号转导成分(Nagata，1997)。一些受体缺乏典型的死亡结构域，例如，LTb受体和CD30(Browning等，1996；Lee等，1996)，然而，它们可以诱导细胞死亡，虽然作用非常微弱。可能这些受体主要诱导细胞分化，死亡是一些转化细胞系的异常结果，然而这一构想还不清晰，象如无CD30的鼠的研究提示胸腺中负性选择的死亡作用(Amakawa等，1996)。相反，需要通过其它途径例如CD40的信号传递以便维持细胞生存。因此，需要确定并表征TNF家族的其它成员分子，以便提供控制疾病和操纵免疫系统的其它方法。

发明概述

因此，本发明涉及一种多肽，称为TRELL的肿瘤坏死因子相关配基，其基本上克服了由于本相关领域的局限和缺点造成的一种或多种问题。发明人公开了一种细胞因子TNF家族的新成员，定义了人和鼠该蛋白质的氨基酸序列，以及编码这些蛋白质的DNA序列。要求保护的本发明可以用于大量疾病和病理状况(下面将详细讨论)的新的诊断和治疗方法，以及获得关于免疫系统的信息并操纵该系统的方法。另外，要求保护的本发明涉及诱导肿瘤中的细胞死亡。

本发明其它的性质和优点将出现在下文的描述中，部分将构成描述，或可以通过本发明的实施理解。通过撰写的说明书和其权利要求以及附图指出的组合物和方法将能够认识和获得本发明的目的和其它优点。

因此，为获得这些和其它优点，按照本发明的目的，如本文体现和广泛描述的，本发明包括编码TRELL的DNA序列。鼠TRELL(m TRELL)的核苷酸序列如SEQ ID.NO.1所示，人TRELL(h TRELL)核苷酸序列如SEQ ID.NO.3所示。本发明尤其涉及编码SEQ ID.NO.2(m TRELL)或4(h TRELL)所示氨基酸序列的TRELL的DNA序列。其它实施例中，本发明涉及与编码TRELL的C末端受体结合结构域的DNA有至少50％同源性的序列，该序列与要求保护的DNA序列或其片段杂交，其编码具有SEQID.NO.4或SEQ ID.NO.2所示的序列的TRELL。

本发明的某些实施例进一步涉及编码TRELL的DNA序列，该序列有效地连接于表达控制序列。任何合适的表达控制序列都可以用于本发明，本领域技术人员可很容易选择。

本发明也构思了一种重组DNA，包括编码TRELL或其片段的序列，以及导入宿主基因组的稳定整合的TRELL序列或具有附加体成分的宿主。任何合适的宿主可以用于本发明，本领域技术人员无需过度实验即可容易地选择。

其它实施例中，本发明涉及制备基本上纯的TRELL的方法，包括培养转化宿主的步骤，TRELL基本上无通常结合的动物蛋白质。

本发明包括具有SEQ ID.NO.4或SEQ ID.NO.2所示氨基酸序列的TRELL及其片段或同源体。在多个实施例中，TRELL的氨基酸和/或DNA序列包括如同下文进一步定义的保守性的插入、缺失和替换，或包括所述序列的片段。

本发明的其它实施例涉及可溶性TRELL构建体，其可以用于直接引发TRELL介导的药理学事件。该事件在治疗癌症或操纵免疫系统以便治疗免疫疾病中具有有益的治疗作用。可溶性TRELL形式可以经基因工程操作以插入易于识别的标签，藉此有利于TRELL受体的鉴定。

本发明的另外实施例涉及使用本发明公开和要求保护的TRELL进行基因治疗的方法。

本发明药物制剂可以任选的包括药学可接受的载体、佐剂、填充剂、或其它药物组合物，可以使用本领域公知的多种剂型或给药途径施用。

应该理解，上述一般性描述和下述详细描述均为示范和说明，意在进一步说明要求保护的本发明。

所含附图用于对本发明进一步理解，插入并组成说明书的一部分，说明本发明的几个实施例，并且与说明书一起解释本发明的原理。

附图简述

图1是人和鼠TRELL氨基酸序列的比较。

图2A和2B是人TNF家族成员的氨基酸比较。

图3是在不同鼠细胞系和组织中TRELL mRNA表达的Northern分析。泳道为双份，包含下列来源的RNA(1)巯基乙酸盐诱导的腹膜巨噬细胞，(2)骨髓，(3)脾，(4)肝。

图4是不同人组织中表达的TRELL mRNA的Northern分析。

图5：重组TNF、LTα和TRELL在还原和非还原条件下的SDS-PAGE图谱。

图6：TRELL对人腺瘤细胞系HT29有细胞毒性。

A.存在人干扰素-γ时，TNF、TRELL、LTα/β和抗-Fas抑制HT29细胞系生长的能力。细胞在存在各种试剂情况下生长四天，用MTT染色评估生长状况。

B.经历细胞死亡的细胞形态。细胞预生长两天，用80U/ml干扰素-γ处理24小时，A.不继续加入，B.100ng/ml用乙醇固定，上层图用相差显微镜显示(400x放大倍率)，下层图用1μg/mlHoescht染料染色以显示细胞核。带有凝缩细胞核特征的典型细胞的程序性细胞凋亡用箭头表示。

发明详述

下面将参考本发明的优选实施例详细描述。本发明涉及编码人或鼠TRELL及其片段和同源体的DNA序列，以及这些DNA序列在用其转化过的宿主中的表达。本发明涉及这些DNA序列和由它们编码的肽的用途。另外，本发明还包括人和鼠TRELL的氨基酸序列或其片段，以及包括或来源于它们的药物组合物。

A.定义

本文所说的“同源”指被比较分子的序列之间类似。当两个被比较序列的同一位置由同样的碱基或氨基酸单体占据，例如，两个DNA分子的同一位置由腺嘌呤占据，则分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源百分率是这两个序列具有的匹配或同源位置的数目除以被比较位置的数目×100。例如，如果两个序列10个位置中有6个为匹配或同源的，则这两个序列60％同源。以举例的方式，ATTGCC和TATGGC的DNA序列有50％的同源性。通常，经排列两个序列的比较得出最大同源性。

本文所说的多肽的“纯的制剂”或“基本上纯的制剂”指从其自然存在的其它蛋白质、脂肪和核酸中分离出来的多肽。优选的，该多肽也与其它用于纯化它的物质，例如，抗体、基质等分离。

本文使用的“转化过的宿主”指包含稳定整合序列的宿主，即，TRELL序列导入其基因组，或拥有编码附加体成分的TRELL序列的宿主。

本文使用的“治疗”包括任何治疗性处理，例如使用治疗剂或物质如药。

“基本上纯的核酸”，例如，基本上纯的DNA，是一种或两种：与该核酸所来源的生物体自然发生基因组直接接触(即，其一在5’末端，其一在3’末端)的序列如编码序列的一端或两端不直接相连；或(2)基本无该核酸所来源的生物体自然发生核酸序列。该术语包括，例如，插入载体(例如，自主复制质粒或病毒)或插入原核生物或真核生物基因组DNA的重组DNA，或者作为独立于其它DNA序列的独立分子形式(例如，PCR或限制性内切核酸酶处理制备的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。基本上纯的DNA也包括编码TRELL的部分杂合基因的重组DNA。

本文的术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可以替换使用。

本文使用的“生物活性”指可以由直接或间接显示的体内或体外活性。TRELL的生物活性片段可以具有，例如，与TRELL活性位点70％氨基酸的同源性，更优选至少80％，最优选至少90％的同源性。本文中各TRELL的一致性或同源性定义为与SEQ.ID.NOS.2或4所示TRELL残基一致的候选序列的氨基酸残基的百分比。

本发明的实践将使用，除非另有说明，本领域技术范围内细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中描述³⁰。

B.本发明的DNA序列

如本文描述，本发明一方面描述了基本上纯(或重组)核酸的性质，所述核酸包括编码TRELL多肽的核苷酸序列，例如SEQ.ID.NO.1或3中描述的和/或与该核酸的等同物。本文使用的术语核酸可以包括片段和等同物，例如，编码功能相同多肽的序列。等同核苷酸序列可以包括由一个或多个核苷酸的替换、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变异体、突变体等，且包括由于基因编码的简并性而不同于编码SEQ ID NO：1或3所示TRELL的核苷酸序列的序列。本发明人测定了人1936bp的DNA序列，其包含一个编码TRELL多肽的开放阅读框，其具有如SEQ.ID.NO.4所示的248个氨基酸序列。

本文中发明人描述了人和鼠序列；本发明通常参考人序列描述，然而本领域技术人员可以理解鼠序列也包括在内。TRELL的一个显著特征是鼠和人之间该受体结合结构域为大量保守序列；仅Fas配基接近这一保守水平。鼠和人TRELL蛋白质具有TNF家族所有特征，即，II型膜蛋白质的组构和涉及蛋白质折叠成TNF的反向平行β片层结构的序列基序的保守性。

mTRELL的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；mTRELL的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。hTRELL的DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ.ID.NO.3和4所示。

本发明的序列可以用于制备一系列DNA探针，用于从大量天然和合成DNA中筛选编码TRELL或其片段或衍生物的DNA序列。本领域技术人员知晓本文使用的“TRELL”也指其生物活性衍生物、片段或同源体。

编码本发明TRELL的DNA序列可以用于制备在经其转化的多种原核生物和真核生物宿主中表达的TRELL多肽。这些TRELL多肽可以用于抗癌和免疫调节。通常，包括培养宿主的步骤，该宿主被有效地连接于表达调控序列的编码TRELL的DNA分子转化。

本发明的DNA序列和重组DNA分子可以利用大量宿主/载体组合进行表达。例如，有用的载体可以包括染色体片段、非染色体或合成DNA序列。本发明表达载体的特征为至少有一个有效地与插入载体的TRELL DNA序列连接的表达控制序列，以便调控该DNA序列的表达。

而且，每一表达载体中，可以选择多种位点插入本发明TRELL序列。这些位点通常由切开它们的限制性内切核酸酶命名，这些位点和内切核酸酶为本领域技术人员公知。当然，应该理解对本发明有用的表达载体不是必须具有插入所需DNA片段的限制性内切核酸酶位点。作为替代，载体可以通过另外的方式克隆片段。表达载体，特别是用于所选DNA片段插入的特别选择的位点，以及有效连接于其上的表达调控序列由很多因素决定。这些因素包括但不限于，待表达蛋白质的大小、所需蛋白质对宿主细胞酶蛋白质降解的敏感程度、对特定限制性内切酶敏感的位点数目、污染或待表达的蛋白质被纯化过程难以除去的宿主细胞蛋白质结合。其它应该考虑的因素包括表达特征，例如涉及载体序列的起始和终止密码子的定位，和本领域技术人员应当知晓的其它因素。载体和本要求保护的DNA序列的插入位点的选择由这些因素综合决定，不是所有的选择对期望的应用都同样有效。然而，对本领域的技术人员来说分析这些参数并根据特定的应用选择一个合适的系统是常规技术。

本领域的技术人员为获得高水平的蛋白质表达可以容易地对表达控制序列进行适当的修饰，即，通过替换密码子、或选择特定生物体优先使用的特定氨基酸密码子，以便减小蛋白质水解或改变糖基化组成。同样，半胱氨酸可以改变为其它氨基酸以便简化制备、重折叠或稳定性问题。

因此，不是所有宿主/表达载体的组合在表达本发明的DNA序列中同样有效。然而，本领域技术人员可以选择一种特定的宿主/表达载体组合。应该考虑的因素包括，例如，宿主和载体的相容性，该DNA序列编码的蛋白质对宿主的毒性，回收所需蛋白质的容易程度，该DNA序列和与它们有效地连接的表达调控序列的表达特征，生物安全性，成本以及所需蛋白质的折叠、构型或其它表达后必需的修饰。

用本发明序列转化的宿主制备的TRELL及其同源体，以及按照本发明方法纯化的天然TRELL，或由本要求保护的氨基酸序列制备的天然TRELL用于多种抗癌和免疫调节的组合物和方法。它们也直接用于针对其它疾病的治疗方法中。

本发明也涉及本文公开的DNA序列在异常条件下(即基因治疗时)表达TRELL的用途。TRELL可以在适于该应用的启动子引导下在肿瘤细胞中表达。这种表达可以增强抗肿瘤免疫反应或直接影响肿瘤的存活。细胞因子例如TRELL还可以通过改变局部免疫反应影响移植器官的存活。在这种情况下，移植体自身或周围细胞应该用构造的TRELL基因修饰。

本发明的另一方面涉及到经分离的编码TRELL的核酸在“反义”治疗中的应用。本文使用的“反义”治疗指在细胞条件下可与编码TRELL的细胞mRNA和/或DNA特异地杂交的寡核苷酸或其衍生物的施用或原位产生，以便抑制所编码蛋白质的表达(即通过抑制转录和/或翻译)。这种结合通过常规的碱基对互补实现，或例如，在与DNA双螺旋结合时，通过双螺旋的主要沟的特异性相互作用实现。通常，“反义”治疗指在本领域常规使用的技术范围内，包括任何依赖寡核苷酸序列特异性结合的任何治疗。

本发明的反义构建体可以被例如，作为表达质粒而输运，其在细胞中转录时，产生与编码TRELL的细胞mRNA至少部分互补的RNA。或者，反义构建体可以是一种离体产生的寡核苷酸探针。这种寡核苷酸探针优选的是经修饰的能够抗内源核酸酶的寡核苷酸，因此能够在体内稳定存在。用作反义寡核苷酸的核酸分子的例子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基磷酸酯类似物(参见，例如，5176996；和5256775)。另外，构建反义治疗中有用的寡聚物的一般方法已有综述，例如Van DerKrol等的综述(1988)生物技术6：958-976；Stein等，(1988)癌症研究48：2659-2668，特别地插入本文作为参考。

C.TRELL及其氨基酸序列

上面讨论的本发明的肿瘤坏死因子家族相关蛋白质(TRELL)是TNF家族的成员。该蛋白质、其片段或同源体有广泛的治疗和诊断应用。

TRELL以相对于TNF家族成员的独特方式存在于许多组织中。由于TNF家族成员参与细胞死亡和存活以及细胞分化的调节，所以TRELL可能也参与多种组织中的细胞存活、分化、和修补。

虽然TRELL的精确三维结构尚不清楚，可以预测，作为TNF家族的一员，它也许具有该家族其它成员的某些共有结构特征。本文公开了鼠和人TRELL。从已知的cDNA序列推断出的鼠TRELL包括至少21个疏水氨基酸的序列，推测其作为II型膜蛋白质的膜锚定结构域发挥作用。mTRELL的氨基酸序列如SEQ ID.NO.2所示。

人TRELL包括N末端亲水胞质结构域、约27个氨基酸疏水的II型跨膜结构域和204个氨基酸的胞外结构域。hTRELL的氨基酸序列如SEQ ID.NO.4所示。

图1描绘了人和鼠TRELL的氨基酸序列。

虽然可以从cDNA克隆中的开放阅读框预测N末端区的52个氨基酸，但不能预测准确的起始甲硫氨酸。Met-36具有合理的共有Kozak序列，这使得它成为优选起始密码子。将TRELL序列与TNF家族的其它成员相比较发现相当多的结构类似性。例如，如图2A和2B所示，所有蛋白质都类似II型膜蛋白质，胞外结构域中都具有的几个序列保守区。序列上具有横线的区域表明TNF和LTα中的这些序列参与该分子β链的组构。推定的N端连接的糖基化位点带有下划线。星号表明半胱氨酸参与TNF的二硫键。保守结构域可能参与亚基间的相互作用和片层组构。

EST研究公开了一种与鼠TRELL高度同源的345个碱基的人克隆。人TRELL氨基酸序列如SEQ ID.NO.4所示。EST编码的开放阅读框不包含赋予一个序列TNF家族配基成员特征的序列基序，例如Wiley等使用的基序，用来在已知数据库中鉴定TRAIL的EST。

本发明的新型多肽与受体特异性地相互作用，该受体目前还没有被鉴定。然而，本文公开的肽和方法能够鉴定与TRELL或其片段特异性地相互作用的受体。

本发明的某些实施方案包括来源于TRELL的肽，其具有与TRELL受体结合的能力。可以用几种方法制备TRELL片段，例如，重组技术、PCR技术、蛋白质水解消化或化学合成。多肽的内部或末端片段可以通过从编码该多肽的核酸的一端或两端除去一个或多个核苷酸产生。该经诱变DNA的表达产生多肽片段。用“末端顺序降解”的内切核酸酶消化可以产生编码多种片段的DNA。编码蛋白质片段的DNA也可以通过随机剪切，限制性消化或上述方法的组合产生。

多肽片段也可以使用本领域已知的技术化学合成，例如常规Merrifield固相f-moc或t-boc化学法。例如，本发明的肽和DNA序列可以被任意地分成需要长度的片段而无片段的重叠，或分成需要长度的重叠片段。这些方法下面将详细描述。

D.可溶性TRELL的产生

该配基的可溶性形式经常可以有效地传递信号，因此可以作为模拟天然膜形式的药物使用。TRELL可能作为可溶性细胞因子自然分泌，然而，如果其不能被分泌，可以用基因工程修饰基因迫使其分泌。为制备TRELL的可溶性分泌型，可在DNA水平除去N末端跨膜区和部分柄区，用I型引导序列或II型引导序列代替，这将使得在所选的表达系统中进行有效蛋白质水解切割。熟练技术人员可以改变分泌表达构建体中保留的柄区的数量，从而优化受体的结合性质和分泌效能。例如，可以制备包含所有可能柄长度的构建体(即，N末端截短)以便蛋白质从81个氨基酸开始，到139个氨基酸结束。柄序列的最优长度可以从这种分析得到。

E.与TRELL反应的抗体的产生

本发明还包括特异地与TRELL或其受体反应的抗体。可以用标准方案(参见，例如，抗体：实验室手册，Harlow和Lane编(Cold SpringHarbor Press：1988))制备抗蛋白质/抗肽的抗血清或单克隆抗体。哺乳动物例如鼠、仓鼠或兔可以用肽的免疫原性型免疫。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括与载体偶联，或其它本领域公知的技术。

TRELL或其受体的免疫原部分可以与佐剂联合施用。可以通过检测血浆或血清中抗体的滴度监测免疫过程。可以将免疫原作为抗原使用标准ELISA和其它免疫检测法评价抗体水平。

在优选实施方案中，所述抗体对TRELL或其受体的抗原决定簇具有免疫特异性，例如SEQ ID NO：2或4所示多肽的抗原决定簇，或密切相关的人或非人哺乳动物同源体(例如，70、80或90％同源，最优选至少95％的同源)的抗原决定簇。本发明的另一优选实施方案中，抗-TRELL或抗-TRELL受体的抗体基本上不与这样一种蛋白质交叉反应，这种蛋白质例如具有同SEQ ID NO：2或4所示多肽低于80％同源性，优选低于90％同源性，最优选低于95％同源性(即，反应特异性)。至于“基本上无交叉反应”，意思是该抗体与对SEQ ID NO：2或4蛋白质的结合亲和力低于10％，优选低于5％，最优选低于1％的非同源蛋白质具有结合亲和力。

本文使用的术语抗体意在包括也能与TRELL或TRELL受体特异性地反应的抗体片段。抗体可以用常规技术分成片段，筛选具有如上述完全抗体同样用途的片段。例如，可以用胃蛋白质酶处理抗体得到F(ab’)₂片段。处理得到的F(ab’)₂片段以减少二硫键，产生Fab’片段。本发明的抗体还意在包括具有抗-TRELL或抗-TRELL受体活性的生物特异性分子和嵌合型分子。因此，无论抗TRELL和其受体的单克隆还是多克隆抗体(Ab)及抗体片段例如Fab’和F(ab’)₂均可以用于阻断TRELL和其受体的活性。

用标准重组DNA技术(Winter和Milstein，自然349：293-299(1991)，特别地插入本处作为参考)也可以得到多种形式的抗体。例如，可以构建嵌合抗体，其中来自动物抗体的抗原结合结构域与人恒定结构域相连(例如，Cabilly等，U.S.4816567，插入此处作为参考)。用于人临床治疗中时嵌合抗体可以减小动物抗体引发的观察到的免疫原反应。

另外，可以合成识别TRELL或其受体的重组“人源化抗体”。人源化抗体是主要包含人IgG序列的嵌合体，其中插入负责特异性结合抗原的区域。动物用希望的抗原免疫，分离相应的抗体，除去负责特异性抗原结合可变区序列的部分。然后将来自动物的抗原结合区克隆到抗原结合区被删除的人抗体基因的合适位置。人源化抗体降低了异源(即，种间)序列在人抗体中的应用，因此几乎不诱导接受治疗的个体的免疫反应。

通过制备包括可变结构域和从不同类免疫球蛋白质分离到的人恒定结构域(CH1、CH2、CH3)的嵌合或人源化抗体，也可以实现不同类重组抗体的构建。例如，可以通过将抗原结合位点克隆到带有人：链恒定区的载体上重组性制备抗原结合位点效价增加的抗体(Arulanandam等，实验医学杂志，177：1439-1450(1993)，插入此处作为参考)。

另外，还可以使用标准重组DNA技术通过改变抗原结合位点附近的氨基酸残基来改变重组抗体对其抗原的结合亲和力。还可以通过基于分子模型的致突变作用增加人源化抗体的抗原结合亲和力(Queen等，美国国家科学院院报，86：10029-33(1989)，插入此处作为参考)。

F.类似物的产生：改变的DNA和肽序列的制备

TRELL类似物与自然发生的TRELL的差异可以在氨基酸序列上，或不涉及序列，或两者兼具。非序列修饰包括TRELL的体内或体外化学衍生化。非序列修饰包括但不限于，乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化或糖基化改变。

优选类似物包括TRELL或其生物活性片段，它们的序列与SEQ ID NOS.2和4给出的序列不同处在于：一个或多个保守性氨基酸替换，一个或多个不破坏TRELL活性的非保守性氨基酸替换、缺失或插入。保守性替换典型地包括一个氨基酸被另一个性质相似的氨基酸替换，例如，下列范围内的替换：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸及苯丙氨酸，酪氨酸。

表I：保守性氨基酸替换

氨基酸	代码	替换氨基酸
氨基酸	代码	替换氨基酸	丙氨酸	A	D-Ala，Gly，β-Ala，L-Cys，D-Cys
精氨酸	R	D-Arg，Lys，D-Lys，homo-Arg，D-homo-Arg，Met，Ile，D-Met，D-Ile，Orn，D-Orn	丙氨酸	A	D-Ala，Gly，β-Ala，L-Cys，D-Cys
精氨酸	R		天冬酰胺	N	D-Asn，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
天冬氨酸	D	D-Asp，D-Asn，Asn，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln	天冬酰胺	N	D-Asn，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
天冬氨酸	D	D-Asp，D-Asn，Asn，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln	半胱氨酸	C	D-cys，S-Me-Cys，Met，D-Met，Thr，D-Thr
谷氨酰胺	Q	D-Gln，Asn，D-Asn，Glu，D-Glu，Asp，D-Asp	半胱氨酸	C	D-cys，S-Me-Cys，Met，D-Met，Thr，D-Thr
谷氨酰胺	Q	D-Gln，Asn，D-Asn，Glu，D-Glu，Asp，D-Asp	谷氨酸	E	D-Glu，D-Asp，Asp，Asn，D-Asn，Gln，D-Gln
甘氨酸	G	Ala，D-Ala，Pro，D-Pro，-Ala，Acp	谷氨酸	E	D-Glu，D-Asp，Asp，Asn，D-Asn，Gln，D-Gln
甘氨酸	G	Ala，D-Ala，Pro，D-Pro，-Ala，Acp	异亮氨酸	I	D-Ile，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-Met
亮氨酸	L	D-Leu，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-Met	异亮氨酸	I	D-Ile，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-Met
亮氨酸	L	D-Leu，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-Met	赖氨酸	K	D-Lys，Arg，D-Arg，Homo-Arg，D-Homo-Arg，Met，D-Met，Ile，D-Ile，Orn，D-Orn
蛋氨酸	M	D-Met，S-Me-Cys，Ile，D-Ile，Leu，D-Leu，Val，D-Val	赖氨酸	K
蛋氨酸	M	D-Met，S-Me-Cys，Ile，D-Ile，Leu，D-Leu，Val，D-Val	苯丙氨酸	F	D-Phe，Tyr，D-Thr，L-Dopa，His，D-His，Trp，反式-3，4，或5-苯脯氨酸，顺式-3，4，或5-苯脯氨酸
脯氨酸	P	D-Pro，L-1-thoazolidine-4-羧酸，D-或L-1-唑烷-4-羧酸	苯丙氨酸	F
脯氨酸	P	D-Pro，L-1-thoazolidine-4-羧酸，D-或L-1-唑烷-4-羧酸	丝氨酸	S	D-Ser，Thr，D-Thr，异-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，L-Cys，D-Cys
苏氨酸	T	D-Thr，Ser，D-Ser，异-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，Val，D-Val	丝氨酸	S	D-Ser，Thr，D-Thr，异-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，L-Cys，D-Cys
苏氨酸	T	D-Thr，Ser，D-Ser，异-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，Val，D-Val	酪氨酸	Y	D-Tyr，Phe，D-Phe，L-Dopa，His，D-His
颉氨酸	V	D-Val，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Met，D-Met	酪氨酸	Y	D-Tyr，Phe，D-Phe，L-Dopa，His，D-His

有用的致突变方法包括PCR诱变和饱和诱变，下面将详细描述。也可以通过合成简并性寡核苷酸序列制备随机变化的氨基酸序列文库。

-PCR诱变

PCR诱变中，可降低Taq多聚酶的忠实度以将随机突变引入克隆的DNA片段(Leung等，1989，技术1：11-15)。这是导入随机突变非常有效和相对快速的方法。可以用多聚酶链反应(PCR)在降低Taq DNA多聚酶合成DNA的忠实度的条件下(例如，dGTP/dATP的比率为5且PCR反应中添加Mn²⁺)扩增将被诱变的DNA区。扩增的DNA片段可以插入合适的克隆载体以提供随机突变文库。

-饱和诱变

饱和诱变允许快速将大量单碱基替换导入到克隆的DNA片段上(Mayers等，1985，科学229：242)。该技术包括突变的产生，例如通过化学处理或体外单链DNA的辐照，和互补DNA链的合成。通过调节处理的程度来调节突变频率，基本上可以获得所有可能的碱基替换。因为该方法不涉及遗传选择，同时可以获得中性替换以及通过改变功能的DNA随机诱变制备的蛋白质。

-简并的寡核苷酸

可以从大量简并性的寡核苷酸序列获得同源体文库。可以用DNA自动合成仪化学合成简并性序列，然后将合成的基因连接进合适的表达载体。简并性寡核苷酸的合成是本领域已知技术³¹，该技术已被应用于其它蛋白质的直接合成³²。

非随机或直接的诱变技术可以用于提供特异序列或在特定区中的突变。这些技术可以用于产生变异体，包括缺失、插入、或替换一种蛋白质的已知氨基酸序列残基。突变的位点可以单独被修饰或连续被修饰，例如，通过(1)首先用保守氨基酸替换，然后根据获得的结果进行更根本的选择，(2)删除目标残基，或(3)靠近定位位点处插入同类或不同类的残基，或(1)-(3)选项的组合。

-丙氨酸扫描诱变

丙氨酸扫描诱变是确定希望蛋白质的某个残基或区域具有优选的诱变位置或结构域的有效方法，Cunningham和Wells(科学244：1081-1085，1989)插入此处作为特别参考。丙氨酸扫描中，确定一个残基或目标残基群(例如，带电的残基例如，Arg、Asp、His、Lys、和Glu)，然后用电中性氨基酸或负电荷氨基酸替换(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)。氨基酸的替换会影响氨基酸与胞内或胞外周围的水溶液性环境的相互作用。这些表明对替换敏感的结构域可再通过在替换位点导入另一个或其它变异体而精确定义。因此，虽然导入氨基酸序列变异的位点可以预先确定，但突变本身的性质不必预定。例如，为优化给定位点的突变方法，可以在目标密码子或区域使用丙氨酸搜索或随机诱变，然后筛选表达希望蛋白质亚基的变异体以得到所需活性的优化组合。

-寡核苷酸介导的诱变

寡核苷酸介导的诱变是制备DNA的替换、缺失、和插入变异体的有效方法，参见，例如，Adelman等(DNA 2：183，1983)插入此处作为参考。简单地说，通过杂交编码DNA模板突变的寡核苷酸可改变所需的DNA，其中模板是包含所需蛋白质的未改变的或天然的DNA序列的质粒或噬菌体的单链形式。杂交后，使用DNA聚合酶来合成模板的完全互补链，以插入寡核苷酸引物，编码所需蛋白质DNA的所选择的改变。通常使用长度至少为25个核苷酸的寡核苷酸。优选的寡核苷酸含有12-15个核苷酸，并与编码突变的核苷酸的模板中的任一侧完全互补。这保证寡核苷酸将与单链DNA模板分子正确杂交。使用本领域已知技术可以容易地合成寡核苷酸，例如Crea等描述的(美国国家科学院院报，75：5765(1978))，插入此处作为参考。

-盒式诱变

制备变异体另一种方法盒式诱变是基于Wells等(基因，34：315(1985))描述的技术，插入此处作为参考。起始材料可以是包含待突变蛋白质亚基DNA的质粒(或其它载体)。鉴定待突变蛋白质亚基DNA中的密码子。鉴定的突变区的每侧都必须有唯一的限制性内切核酸酶位点。如果不存在该限制性位点，也许应使用上述寡核苷酸介导的诱变方法在所需蛋白质亚基DNA的合适位置变中导入以产生这种位点。限制性位点导入质粒后，在这些位点切割质粒成线性。用标准方法合成限制性位点之间包含所需突变的编码DNA序列的双链寡核苷酸。这两个双链单独合成，然后用标准技术杂交到一起。这种双链寡核苷酸即称为盒。这种盒设计为具有与线性化质粒末端相互补的3’和5’末端。以至它可以直接连接到该质粒中。该质粒于是包含突变的所需蛋白质亚基DNA序列。

-组合诱变

组合诱变也可以用于合成突变体。例如，一组同源体或其它相关蛋白质的氨基酸序列被排列成行，优选的尽可能提高到最高同源性。可以选择所有出现在排列序列给定位置的氨基酸用来产生一系列简并性的组合序列。核酸水平的组合诱变产生变异体的多样化文库，并被多样化基因文库编码。例如，合成的寡核苷酸混合物可以被酶连接到基因序列，以至潜在序列的简并性序列可以作为单独的肽，或者作为包含简并性序列的较大的融合蛋白质表达。

筛选产生的突变基因产物的各种方法为本领域已知。筛选大基因文库的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体上，用得到的载体文库转化合适的细胞，在所需活性的检测(例如在本文中，结合TRELL或其受体)促使编码被检测产物基因的载体相对容易地分离的条件下表达该基因。下述每种技术均适应筛选所产生的大量序列(例如，随机诱变技术)的大通量分析的要求。

本发明还能减少所述TRELL多肽或其受体的蛋白质结合结构域产生类似物，例如肽或非肽。这些肽类似物能够破坏TRELL和其受体的结合。可以鉴定TRELL中参与受体多肽或下游胞内蛋白质的分子识别的关键残基，并用于制备TRELL或其受体衍生的肽类似物，其能够竞争性或非竞争性抑制TRELL与受体的结合(参见，例如，“与成视网膜细胞瘤基因蛋白质结合的人乳头瘤病毒蛋白质的肽抑制物”欧洲专利申请EP-412762A和EP-B31080A)，特别地插入此处作为参考。

G.药物组合物

通过制备纯的和重组的TRELL，本发明提供了一种分析方法，该方法可以用于筛选作为正常细胞功能的激动剂或拮抗剂(本文中为TRELL或其受体)的药物候选者。一个实施方案中，此分析方法评价了一种化合物调节TRELL和其受体结合的能力。多种分析形式都将有效，并且根据本发明本领域技术人员将理解这些形式。

对化合物和天然提取物文库进行测试的药物筛选程序中，期望高通量分析，以便在给定时间内最大化被检测化合物的数量。无细胞体系中进行的分析，例如来源于纯化或半纯化蛋白质的无细胞体系，通常优选的作为“初步”筛选，那可以使得检测快速进行并且相对容易地检测出由所测化合物介导的靶分子的改变。而且，所测化合物的细胞毒性和/或生物利用度的影响在体外系统通常可以忽略，此分析主要集中于药物对靶分子的作用，这可以通过药物与其它蛋白质结合亲和力的改变或靶分子酶性质的变化来证明。

本发明的药物组合物可以包括治疗有效量的TRELL或TRELL-受体，或其片段或类似物，以及任选地包括药学可接受的载体。因此，本发明提供治疗癌症的方法，和刺激或某些情况下抑制免疫系统的方法，或通过施用药学有效量的本发明化合物或其药学可接受的盐或衍生物进行治疗的方法。应该理解本发明的组合物和方法可以在多种治疗中与其它治疗组合使用。

可以配制用于多种给药途径的组合物，包括系统给药、局部给药或定位给药。对于系统给药，优选注射，包括肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下注射，本发明组合物可以配制为液体溶液，优选于生理可接受的缓冲液中，例如Hank’s溶液或Ringer’s溶液。另外，组合物可以配制为固体形式，任选地使用前重溶解或悬浮。本发明也包括冻干型。

组合物可以口服给药、粘膜给药或透皮给药。对于粘膜给药或透皮给药，制剂中使用渗透屏障的合适渗透剂。这种渗透剂本领域已知，包括，例如对于粘膜给药，胆盐、梭链孢酸衍生物和去垢剂。粘膜给药可以通过鼻腔喷雾或使用栓剂实现。对于口服给药，组合物设计为传统的口服给药形式，例如胶囊、片剂和滋补剂。对于局部给药，本发明的组合物设计为本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。

优选的本发明的组合物为单位剂量给药形式，每天使用一次或多次。一次或整个治疗过程使用的活性化合物的量依赖于很多因素。例如，患者的年龄和大小，需要治疗的疾病的严重程度和进程，给药方式和形式，以及治疗医师的判断。然而，有效量应该在约0.005到约5mg/kg/天的范围内，优选约0.05到0.5mg/kg/天。本领域技术人员将认识到更高和更低的剂量也可以使用。

按照本发明的基因构建体也可以用作部分基因治疗方案，以输运编码TRELL多肽激动剂或拮抗剂的核酸。

TRELL表达构建体可以在任何生物有效载体(例如，任何可以将TRELL基因有效地传送进体内细胞的制剂或组合物)中被施用。方法包括将基因插入可以直接转染细胞的病毒载体，或在帮助下(例如，脂质体或胞内载体)传送质粒DNA，以及基因构建体的直接注射。优选病毒载体转移方法。

基因治疗构建体的药物制剂可基本上由可接受的稀释剂中的基因输运系统组成，或包括缓释基质以及嵌入其中的基因输运载体。或者，当重组细胞能够制备完整的基因输运系统时，例如，逆转录病毒载体，药物制剂可以包含一种或多种产生该基因输运系统的细胞。

除了用于治疗外，本发明的寡聚物可以用作诊断剂以检测与它们特异性结合的目标DNA、RNA或氨基酸序列存在与否。其它方面，本要求保护的发明可以用于评价一种化学物质与TRELL多肽或其片段相互作用(例如，结合或物理性结合)的能力。该方法包括将该化学物质与TRELL多肽接触，评价该物质与TRELL相互作用的能力。另外，本发明的TRELL可以用于评价自然发生的TRELL配基或受体，以及评价与TRELL受体偶联或结合的化学物质。

某些方面，本要求保护的发明描述了用于评价一种化学物质调节TRELL与其受体之间相互作用能力的方法。该方法包括在TRELL和其受体对能够相互作用的条件下混合TRELL受体和TRELL，添加待评价的化学物质，检测复合物的形成或分解。这些调节剂可以在体外被进一步评价，例如，在无细胞系统中检测其活性，然后，任选地对细胞和动物施用该化合物，评价其作用。

H.实施例

1.TRELL cDNA的分离

a)鼠TRELL的克隆

通过PCR从鼠腹膜巨噬细胞cDNA文库中分离编码mTRELL的cDNA。氨基酸序列和跨膜区的位置是典型的膜蛋白质。mTRELL的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

通过腹膜灌洗从Balb/c鼠获得巨噬细胞，裂解一小时内附着于塑料的细胞，提取RNA。合成一种来源于鼠促红细胞生成素序列的反义寡核苷酸引物5’GTTCCAGGCCAGCCTGGG3’。C.B.Shoemaker和L.D.Mistock，“鼠促红细胞生成素基因：克隆、表达和人基因同源体”，分子细胞生物学，6：849(1986)，特别插入此处作为参考。按照制造商的推荐，该引物用于与BRL-设计的锚定引物相关的5’RACE方案(来自BRL的5’RACE系统)。从来自一小时内附着的腹膜巨噬细胞获得的RNA制备第一条cDNA链。在Pekin Elmer DNA热循环仪中用来自Perkin Elmer的Taq DNA聚合酶进行扩增。94℃变性5分钟后，进行循环，条件如下：94℃30秒，55℃30秒，72℃3分钟，循环35次。另外在72℃进行延伸，然后反应控制在4℃。琼脂糖凝胶分析显示PCR实验得到两个扩增片段，即650bp和500bp。这两个片段从凝胶切出，插入pBS-T载体并测序。这两种插入体是不同的。它们每一末端都有同样的用作PCR合成引物的促红细胞生成素基因的特异寡核苷酸。用³²P标记的随机引物片段进行的Northern杂交表明它们与两种不同的RNA杂交，500bp片段与巨噬细胞的1.4kb RNA杂交。在Northern杂交中使用两个方向的³²P-标记的核酸探针，以确定cDNA的方向。

从确定的方向和序列，得到两个1.4kb mRNA的内部引物。它们分别用于3’和5’RACE-PCR。3’RACE实验得到一种750bp的片段，它被插入pBS-T载体并测序。它对应于1.4kb RNA的3’末端，因为该序列拥有poly-A前面的poly-A附加信号AATAAA。5’RACE没有发现任何带。用ClontechMarathon cDNA扩增试剂盒以制备一小时附着的巨噬细胞cDNA文库。用来自已确定的cDNA序列的有义和反义寡核苷酸引物及试剂盒的通用引物通过PCR分离到一种1040bp的PCR片段。于是分离到比最初1040bp的片段更大尺寸的片段。这种经测序的新片段5’序列添加了60bp(SEQ.ID.NO：1)。

从巯基乙酸盐诱导的附着1小时后的鼠腹腔巨噬细胞提取RNA。用³²P-标记的mTRELL cDNA进行杂交。图3显示TRELL mRNA在鼠腹腔巨噬细胞和鼠其它组织中表达的Northern分析。

前21个氨基酸显示为疏水、跨膜结构域。在可得的数据库中无论核苷酸水平或氨基酸水平上均无相同序列。使用PROSITE程序及225个氨基酸确定该序列属于TNF家族的蛋白质。该蛋白质也具有与描述的该家族LT-α和其它成员不同的结构域(J.Browning等，“淋巴毒素-α，一种与细胞表面淋巴毒素形成异源复合物的TNF家族的新成员”，细胞，72，847(1993)；C.F.Ware等，“淋巴毒素系统的配基和受体”，细胞裂解方法，G.M.Griffiths和J.Tschopp(编)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，p175-218(1995)，均特别地插入本文作为参考)。该序列是唯一的。在核苷酸或氨基酸水平上，观察到TNF家族的不同成员或任何序列之间具有较差的相同性或相似性。EST数据库中搜索到1个人序列与该鼠序列高度同源。，Soares(Washington大学)制备的乳腺cDNA文库中的克隆154742，5’(GenBank，保藏号R55379)是具有345个碱基对的序列，与鼠TRELL具有89％同源性。可得的数据库中未发现与mTRELL的可得5’DNA匹配的人序列。

b)人TRELL的克隆

i)寡核苷酸探针和PCR引物的制备

与鼠TRELL同源的人EST R55379序列用作合成寡核苷酸引物的基础。合成两个20mer寡核苷酸的有义链：

LTB-065 5＝-CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA(R55379的NT 70-89)

LTB-066 5＝-TGA TGA GGG GAA GGC TGT CT(R55379的NT14-33)

和一个20mer寡核苷酸的反义链：

LTB-067 5＝-AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA(R55379的NT251-270)

ii)mRNA的鉴定和用于克隆hTRELL的cDNA文库。

从Clontech公司购买到人肝(cat#6510-1)、脾(cat#6542-1)和淋巴结(cat#6594-1)的PolyA+mRNA。人细胞系THP-1、U937和II-23的PolyA+mRNA由Biogen，Cambridge，MA制备。λgt10的人扁桃体cDNA文库和来自扁桃体文库的DNA同样由Biogen制备。

在六个RNA样品上进行RT-PCR。每一cDNA反应包含1μgPolyA+mRNA，50mM Tris pH 8.3，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT，250μM dNTP，50ng随机六聚体(50ng/μl)和400单位Superscript II逆转录酶(Gibco BRL cat#6542-1)，终体积为40μl。反应在20EC保温20分钟，42EC 50分钟，99EC 5分钟。对于PCR，采用每个cDNA反应的五分之一或cDNA文库的100-1000ng DNA。每个样品进行两个PCR反应，其一加入LTB-065和LTB-067引物对，如果样品中存在转录物则产生201bp的PCR产物，其二加入LTB-066和LTB-067引物对，如果样品中存在转录物则产生257bp的产物。在10mM Tris pH 8.3，50mM KCl，1.5mMMgCl₂，0.01％明胶，10％DMSO，100μM dNTP，两种引物各30pmole和5单位Amplitaq(Perkin Elmer cat#N801-0060)条件下，在Perkin ElmerCetus DNA热循环仪(Model#480)中进行PCR反应。使用的循环条件为95EC 1分钟，60EC 1分钟，72EC 1分钟，循环35次。

从肝、脾、淋巴结、THP-1和扁桃体获得正确尺寸的产物，但从U937或II-23mRNA没有获得。纯化了来自肝的201bp的PCR产物用作筛选cDNA文库的探针。

iii)cDNA文库的筛选

通过PCR确定了包含TRELL的扁桃体文库后，λgt10人扁桃体cDNA文库的一百万平板形成单位(PFU)在密度为1×10⁵PFU/Nunc^TM的平板上铺板。在20×20cm的Schleicher和Scheull BA-S 85 Optitran^TM滤膜上制做重复的印模。用随机引物对201bp的PCR产物进行P³²标记(Feinberg和Vogelstein，生物化学分析137：266-267，1984，特别地插入本文作为参考)。滤膜在含10％硫酸葡聚糖，100μg/ml tRNA和6×10⁵CPM/ml探针的400ml平板筛选缓冲液(50mM Tris pH 7.5，1M NaCl，0.1％焦磷酸钠，0.2％PVP和0.2％Ficoll)中65EC下杂交过夜。它们在65℃用平板筛选缓冲液洗两次，用2XSSC、0.1％SDS洗两次，然后在-70℃与胶片接触强化筛选40小时。

双份阳性的样品从主平板集中到添加明胶的SM(100mM NaCl、10mMMgSO₄、50mM Tris pH 7.5)上。噬菌斑纯化了12个阳性样品。12个纯化的侯选样品中的λminiprep DNA用Not1消化，1％的琼脂糖凝胶上电泳，Southern印迹且与201bp探针杂交。选择出与上述探针杂交的具有最大程度插入的克隆(约2kb)用于大规模DNA纯化和DNA测序。这些克隆的插入部分被亚克隆到pBluescript SK+(Strategene#212205)的Not1位点。从λDNA和质粒DNA获得DNA序列。具有2006bp cDNA插入序列的克隆F1a似乎具有编码区5’端的内含子，但不包含完全开放阅读框。克隆A2a，也称为PB133，包含1936bp cDNA的插入序列。该克隆包含543bp的5’非翻译区，852bp开放阅读框和3’非翻译区，但不含多聚腺苷酸化信号或polyA尾。

编码hTRELL cDNA克隆A2a开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID.NO.3所示。得到的284个氨基酸的序列如SEQ ID.NO.4所示。36位的第二个蛋氨酸很可能是翻译起始位点，因为该位点非常符合Kozak定义的起始位点的要求。

利用鉴定过的序列，确定了编码TRELL的cDNA序列。从上述的DNA序列(即，SEQ.ID.NO.3)，我们推得TRELL的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.4)。显然，按照目前蛋白质工程领域的状况，技术人员可以在这些氨基酸序列中进行有目的的改变、插入或缺失，获得具有与我们描述的分子基本上同样的生物活性或免疫活性的分子变异体。

iv)人TRELL表达的Northern分析

人cDNA克隆2a的440bp PpuM1/BstX1片段用随机引物³²P标记，用以探查包含多种人组织RNA的商品化Northern印迹。Norhtern分析表明hTRELL片段与长度约为1.4kb到1.6kb的单链mRNA杂交。人TRELL在免疫系统的大多数器官中表达，即，脾、外周血液淋巴细胞(pbl)、淋巴结、阑尾，但在胸腺、胎肝(祖代淋巴细胞源)和骨髓表达相对较低(图4)。因此，次级免疫系统的器官主要表达TRELL。卵巢、前列腺、小肠、结肠、心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰也检测到表达。睾丸、肝、肾和胸腺中表达相对较低。该模式表明与TRAIL配基的广泛表达高度类似，除了TRAIL在心脏和脑中表达较弱之外。

c)与TRELL配基结合的受体的分离

TNF家族的配基可以用于鉴定和克隆受体。通过对TRELL序列的描述，技术人员可以将构成受体结合序列的TRELL配基5’端胞外结构域与表记或标签序列融合，然后添加一种先导序列，其将使得该配基在一些表达系统分泌。Browning等(1996)(JBC 217，8618-8626)描述了该技术的一个实施方案，其中LT-β配基以这种形式分泌。VCAM先导序列与短myc肽标签偶联后再与LT-β的胞外结构域偶联。VCAM序列用于迫使正常膜结合LT-β分子分泌。分泌蛋白质保留了不破坏与受体结合的能力的N末端的myc标签。这种分泌蛋白质可以在短暂转染的Cos细胞或类似系统，例如，EBNA衍生的载体、昆虫细胞/杆状病毒、毕氏酵母(picchia)等中表达。未纯化的细胞上清液可以用做添加标签的配基的来源。

表达受体的细胞可以通过将它们与添加标签的配基接触而鉴定。带有结合配基的细胞在FACS实验中通过用抗myc肽抗体(9E10)标记myc标签，随后用藻红素(或类似标记物)标记抗鼠免疫球蛋白质得以鉴定。可以容易地鉴定FACS阳性细胞，其可以作为编码受体的RNA源。然后经过标准技术从这些RNA制备表达文库且分入克隆库。克隆库可以被转染到合适的宿主细胞中，用显微检查确定添加标签的配基与受体阳性转染细胞的结合，随后用酶标记的抗鼠Ig试剂(即，半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或荧光素酶标记抗体标记结合的myc肽标签。一旦确定了阳性库，减小库体积直到鉴定出编码cDNA的受体。该方法可以选择更易于产生受体的鼠或者人TRELL进行操作。

2.细胞和试剂

所有细胞来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)，除了WEHI 164克隆13来自Kawashima博士(日内瓦生物医学研究所，日内瓦，瑞士)。HT29亚克隆(HT29-14)前面描述过(Browning等，1996)，TNF敏感ME180亚克隆来自Carl Ware博士。II-23T细胞杂交瘤也曾描述过(Browning等，1991)。Balb/c鼠腹膜内注射1.5ml硫羟基乙酸盐肉汤(Difco Lab.，MI)，三天后处死。腹膜腔取出的细胞在DMEM(GibcoLab)上以10⁶细胞/ml培养1小时。从平板上清洗掉非粘附细胞，基本上完全是巨噬细胞的粘附细胞在Tri-试剂(分子研究中心公司)中裂解，进行RNA提取。

以前曾描述过重组人TNF、LTa、LTa1/b2、上述蛋白质的抗体和其受体-Ig融合蛋白质(Browning等，1995)。抗-CD40L抗体5C8也曾描述过。如前所述，通过CFA中淋巴结内注射纯的重组hTRELL制备多克隆抗-hTRELL血清(Browning和Ribolini，1989)。2个月后，观察到抗-hTRELL反应，用蛋白质A-琼脂糖纯化免疫球蛋白质。

鼠TRELL克隆

自鼠促红细胞生成素序列获得的反义寡核苷酸引物5’GTTCCAGGCCAGCCTGGG3’用于5’RACE方案依制造商推荐(来自BRL的5’RACE系统)，与BRL-设计的锚引物相关。首先，从来自1小时粘附的腹膜巨噬细胞提取的RNA制备第一链cDNA。在Perkin Elmer DNA热循环仪中用Taq DNA聚合酶进行扩增。94℃变性5分钟后，循环条件如下：94℃30秒，55℃30秒，72℃3分钟，循环35次，随后72℃末端额外延伸。PCR实验的琼脂糖凝胶分析显示2个扩增片段650bp和500bp。这两个片段从凝胶切出，插入pBS-T载体并测序。用随机引物³²P标记片段的Northern杂交表明500bp片段与巨噬细胞中的1.4kb的RNA杂交。为了确定cDNA的方向，Northern杂交中使用了两个方向的³²P标记的核酸探针。从确定的方向和序列，我们得到1.4kb mRNA的两个内部引物：5’TCAGGTGCACTTTGATGAGG 3’和5’CTGTCAGCTCCTCCTGAG 3’，其分别用于3’和5’RACE-PCR。3’RACE实验显示插入pBS-T载体的750bp片段并测序。它对应1.4kb RNA的3’端，因为序列在poly A之前具有polyA附加信号。5’RACE没有显示任何带。Clontech Marathon cDNA扩增试剂盒用于从1小时粘附的巨噬细胞制备cDNA文库。用来自确定的cDNA序列(5’AGCAGGAGCCTTCTCAGGAG3’和5’GATCCAGGGAGGAGCT TGTCC3’)的有义寡核苷酸和反义寡核苷酸引物和该试剂盒的通用引物分离用于PCR的1040bp PCR片段。由此分离到比原1040bp片段5’端长60bp的片段。

人TRELL克隆

EST数据库的检索显示一个人克隆与上述鼠序列显著同源。克隆154742(Genbank保藏号：R55379)具有345bp序列，与鼠cDNA 89％同源。来自EST的两种引物(5’CCCTGCGCTGCCTGGAGGAA3’和5’AGACCAGGGCCCCTCAGTGA3’)被用于通过RT-PCR在不同组织和文库中筛选hTRELL转录物。从肝、脾、淋巴结、THP-1和扁桃体获得合适尺寸的产物，但从U937mRNA没有获得。克隆201bp的产物，用于筛选λgt10人扁桃体cDNA库。10⁶平板形成单位以10⁵PFU/平板铺板。在20×20cm硝酸纤维素滤膜上制备重复印模，与随机引物法制备的探针杂交。滤膜在含10％硫酸葡聚糖、100mg/ml tRNA和6×10⁵cpm/ml探针的平板筛选缓冲液(50mM Tris pH7.5，1M NaCl，0.1％焦磷酸钠，0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％Ficoll)中65℃杂交过夜。65℃用平板筛选缓冲液清洗两次，2XSSC、0.1％SDS清洗两次。从阳性克隆制备λminiprepDNA，选择具有最大插入序列的克隆用于大规模DNA纯化和DNA测序。插入序列亚克隆λpBlueScript SK+的Not1位点。发现人EST编码部分。

RNA分析

hTRELL cDNA的0.45kb PpuM1/BstX1片段或1.25NarI/NotI片段用随机引物法标记，用于探查人和鼠组织Northern印迹(从Clontech购买)。鼠组织和细胞用TRI-试剂提取RNA。Northern分析基本上用已描述的方法(Chicheportiche和Vassalli，1994)，使用4μg总RNA和³²P标记的随机引物mTRELL cDNA。

染色体测定

以单染色体细胞杂交体来源的DNA为模板(HGMP资源中心，Hinxton，Cambridge，英国)，用选择的引物(5’AGTCGTCCCAGGCTGCCGGCT3’和5’CCTGAAGTGGGGTCTTCTGGA3’)通过PCR在与鼠序列不同源的3’非翻译区扩增一个340bp的片段。扩增条件如下：94℃30秒，65℃90秒，72℃90秒，循环40次。用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶进行检测。

重组hTRELL蛋白质的表达

可溶性表达构建体包含VCAM先导序列，myc肽标签和与描述过的淋巴毒素-b(ref)类似的hTRELL的胞外结构域，用与描述过的LTb(Browning等，1996)类似的方法制备。分离到下列DNA片段：编码VCAM先导的Not1/平端片段和一对编码描述过的myc标签(5’平端，3’PpuM1位点)的寡核苷酸片段，TRELL的0.45kb PpuM1/BstX1片段和TRELL的0.65kb BstX1/Not1片段。这四个片段连接到Not1/磷酸酶pBluescript载体上。上述载体的Not1插入序列转移到pFasBac1载体上(GibcoBRL)，用于产生重组杆状病毒。可溶性TRELL通过10MOI感染HiFive TM昆虫细胞制备，两天后收获培养基。下列各项加入培养基中：终浓度为25mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，1mM AEBSF(Pierce)和1mg/ml抑胃酶肽。过滤培养基，并在Amicon 10kDa截留分子量滤膜上超滤浓缩10倍。含培养基的浓缩TRELL直接上样到SP Sepharose Fast Flow柱上，用含0.4M NaCl的25mM HEPES缓冲液(pH7.0)冲洗。用0.6M NaCl的同样缓冲液将TRELL洗脱。纯化的TRELL大小分析在——。

分泌的分析

使用EBNA基因和组氨酸标签被除去的pEBVHis ABC(Invitrogen)经修饰的版本的载体CH269构建基于EBNA表达的载体。P.Pescamento博士和A.Goldfeld提供位于pFastBac载体中的0.7kb的hTNF片段。SnaBI/XhoI插入序列连接到CH269的PvUII/XhoI位点。包含1-12切割位点缺失的基因组TNF插入序列由G.Kollias博士馈赠，其由A.Goldfeld插入CH269载体。E.Garber博士提供hTRELL克隆A2A的1.8kb NotI插入序列和含hCD40L cDNA的0.98kb NotI片段，含hLTa(Browning等，1995)的1.46kb NotI插入序列连接到CH269的NotI位点。具有修饰过的起始位点(Browning等，1995)的含hLTb编码区的0.81kb HindIII插入序列连接到CH269的HindIII位点。利用脂质转染胺试剂用多种CH269载体和GFP载体转染EBNA-293细胞，取出含5mM EDTA的PBS用于FACS分析，或者2天后将细胞经代谢标记研究。这两种方法都使用了下列抗体：hTRELL兔多克隆Ig片段，hTNF单克隆抗体104c，hLTa单克隆抗体AG9，LTa1/b2单克隆抗体B9和CD40L单克隆抗体5C8。在含10％FBS和50μg/ml热聚集人IgG的RPMI培养基中加入5μg/ml抗体进行FACS分析。藻红素标记的抗鼠或兔IgG(Jackson免疫研究)用于检测抗体结合。GFP转染的细胞GATED存活。转染后2天的细胞用PBS清洗并转移到含200μCi/ml TranSlabel(ICN)的无蛋氨酸/半胱氨酸的MEM中，用于免疫沉淀。小时后收获上清液，用Browning(1995)等描述的方法进行免疫沉淀。

细胞毒性分析

用以前描述的方法(Browning和Ribolini，1989)进行细胞生长检测。HT29-14细胞以200,000细胞/孔的密度在12孔板中生长2天用于镜检。加入人TRELL、TNF、淋巴毒素-a1b2(Browning等，1996)、或抗-fas(CH11，Kamaya)以及80单位/ml的人干扰素-γ。细胞因子或抗fas处理26小时后，除去培养基以及一些从塑料上剥脱的死亡细胞。存留的细胞用80％的乙醇固定，在含1mg/ml Hoescht染料的PBS中清洗。2分钟后，除去染料，细胞在PBS中清洗，用荧光显微镜检查。

表II：人TRELL的结合位点和对多种细胞系的细胞毒作用

细胞系	种类	TRELL结合	细胞毒作用^a
细胞系	种类	TRELL结合	细胞毒作用^a	造血细胞系
JurkatSKW 6.4NamalwaK562THP-1	T淋巴瘤EBV B细胞Burkitt淋巴瘤原髓细胞单细胞白血病	--+++	-----	造血细胞系
JurkatSKW 6.4NamalwaK562THP-1	T淋巴瘤EBV B细胞Burkitt淋巴瘤原髓细胞单细胞白血病	--+++	-----	非造血细胞系
HT29ME-180HelaMCF-7293Cos	结肠腺癌子宫颈癌子宫颈癌乳腺癌胚胎肾细胞肾成纤维细胞	+++	++^b--d+/-ndnd	非造血细胞系

a：有和无人干扰素-γ时3-5天的增殖分析。

b：仅在加入干扰素-γ时观察到细胞毒性。

c：ND，未测定。

d：形态变化。

表III：多种TNF家族成员按照细胞毒性分组

组	受体活性
组	受体活性	许多细胞类型中细胞凋亡强效诱导剂仅对有限细胞类型的弱诱导剂不能诱导细胞死亡，某些情况下抗增殖	TNF、Fas、TRAIL-R^a、DR-3LTb-R、TRELL-R^a、CD30CD27、CD40、OX-40

a：这些受体还未曾鉴定。

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序列表

(1)一般信息

(i)申请人：Chicheportiche，Yves

Browning，Jeffrey L.

(ii)发明名称：肿瘤坏死因子相关配基

(iii)序列数目：4

(iv)联系地址：

(A)地址：BIOGEN，INC

(B)街道：14 Cambridge Center

(C)城市：Cambridge

(D)州：MA

(E)国家：美国

(F)邮政编码(ZIP)：02142

(v)计算机可读信息：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：未分配

(B)递交日：1997年5月7日

(C)分类：

(viii)代理人/代理机构信息：

(A)姓名：FLYNN，KERRY A

(B)登记号：36,693

(C)文献/卷号：A003 PCT

(ix)通讯信息：

(A)电话：(617)679-3583

(B)传真：(617)679-2838

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1168个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：非

(iv)反义：非

(vi)初始来源：

(A)生物：TNF家族相关蛋白质

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：2..676

(xi)SEQ ID NO：1的序列描述

G GTG CTG AGC CTG GGC CTG GCG CTG GCC TGC CTT GGC CTC CTG CTG 46

Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu

1 5 10 15

GTC GTG GTC AGC CTG GGG AGC TGG GCA ACG CTG TCT GCC CAG GAG CCT 94

Val Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro

20 25 30

TCT CAG GAG GAG CTG ACA GCA GAG GAC CGC CGG GAG CCC CCT GAA CTG 142

Ser Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu

35 40 45

AAT CCC CAG ACA GAG GAA AGC CAG GAT GTG GTA CCT TTC TTG GAA CAA 190

Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp Val Val Pro Phe Leu Glu Gln

50 55 60

CTA GTC CGG CCT CGA AGA AGT GCT CCT AAA GGC CGG AAG GCG CGG CCT 238

Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro

65 70 75

CGC CGA GCT ATT GCA GCC CAT TAT GAG GTT CAT CCT CGG CCA GGA CAG 286

Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln

80 85 90 95

GAT GGA GCA CAA GCA GGT GTG GAT GGG ACA GTG AGT GGC TGG GAA GAG 334

Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu

100 105 110

ACC AAA ATC AAC AGC TCC AGC CCT CTG CGC TAC GAC CGC CAG ATT GGG 382

Thr Lys Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Ile Gly

115 120 125

GAA TTT ACA GTC ATC AGG GCT GGG CTC TAC TAC CTG TAC TGT CAG GTG 430

Glu Phe Thr Val Ile Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val

130 135 140

CAC TTT GAT GAG GGA AAG GCT GTC TAC CTG AAG CTG GAC TTG CTG GTG 478

His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val

145 150 155

AAC GGT GTG CTG GCC CTG CGC TGC CTG GAA GAA TTC TCA GCC ACA GCA 526

Asn Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala

160 165 170 175

GCA AGC TCT CCT GGG CCC CAG CTC CGT TTG TGC CAG GTG TCT GGG CTG 574

Ala Ser ser Pro Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu

180 185 190

TTG CCG CTG CGG CCA GGG TCT TCC CTT CGG ATC CGC ACC CTC CCC TGG 622

Leu Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp

195 200 205

GCT CAT CTT AAG GCT GCC CCC TTC CTA ACC TAC TTT GGA CTC TTT CAA 670

Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln

210 215 220

GTT CAC TGAGGGGCCT TGCTCTCCCA GATTCCTTAA ACTTTCCCTG GCTCCAGGAG 726

Val His

225

CATCACCACA CCTCCCTACC CCACCCCCAC TCCTCCACCC CCTCGCTGCT CCTTGGTCCA 786

GTCCTGTCTC TCCTCAAAGG CAGCCAGAGC TTGTTCACAT GTTTCCATTC CACAGACGTA 846

TCCTTGCTCT TCTTAACATC CCATCCCACC ACAACTATCC ACCTCACTAG CTCCCAAAGC 906

CCCTACTTAT CCCTGACTCC CCCACCCACT CACCCGACCA CGTGTTTATT GACTTTGTGC 966

ACCAGGCACT GAGATGGGCT GGACCTGGTG GCAGGAAGCC AGAGAACCTG GGACTAGGCC 1026

AGAAGTTCCC AACTGTGAGG GGGAAGAGCT GGGGACAAGC TCCTCCCTGG ATCCCTGTGG 1086

ATTTTGAAAA GATACTATTT TTATTATTAT TGTGACAAAA TGTTAAATGG ATATTAAAGA 1146

GAATAAATCA TGATTTCTCT TC 1168

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：225个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)SEQ ID NO：2的序列描述

Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ser

20 25 30

Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn

35 40 45

Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp Val Val Pro Phe Leu Glu Gln Leu

50 55 60

Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg

65 70 75 80

Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp

85 90 95

Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Thr

100 105 110

Lys Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Ile Gly Glu

115 120 125

Phe Thr Val Ile Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His

130 135 140

Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asn

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Pro Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu

180 185 190

Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala

195 200 205

His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val

210 215 220

His

225

(2)SEQ ID NO：3信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1373个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：非

(iv)反义：非

(vi)初始来源：

(A)生物：TNF家族相关蛋白质

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..852

(xi)SEQ ID NO：3的序列描述

ATG TCA TTG TTA GAC TTT GAA ATT TCC GCC CGC CGG CTC CCC CTC CCC 48

Met Ser Leu Leu Asp Phe Glu Ile Ser Ala Arg Arg Leu Pro Leu Pro

1 5 10 15

CGA TCC CTC GGG TCC CGG GAT GGG GGG GCG GTG AGG CAG GCA CAG CCC 96

Arg Ser Leu Gly Ser Arg Asp Gly Gly Ala Val Arg Gln Ala Gln Pro

20 25 30

CCC GCC CCC ATG GCC GCC CGT CGG AGC CAG AGG CGG AGG GGG CGC CGG 144

Pro Ala Pro Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg

35 40 45

GGG GAG CCG GGC ACC GCC CTG CTG GTC CCG CTC GCG CTG GGC CTG GGC 192

Gly Glu Pro Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly

50 55 60

CTG GCG CTG GCC TGC CTC GGC CTC CTG CTG GCC GTG GTC AGT TTG GGG 240

Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly

65 70 75 80

AGC CGG GCA TCG CTG TCC GCC CAG GAG CCT GCC CAG GAG GAG CTG GTG 288

Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val

85 90 95

GCA GAG GAG GAC CAG GAC CCG TCG GAA CTG AAT CCC CAG ACA GAA GAA 336

Ala Glu Glu Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu

100 105 110

AGC CAG GAT CCT GCG CCT TTC CTG AAC CGA CTA GTT CGG CCT CGC AGA 384

Ser Gln Asp Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg

115 120 125

AGT GCA CCT AAA GGC CGG AAA ACA CGG GCT CGA AGA GCG ATC GCA GCC 432

Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala

130 135 140

CAT TAT GAA GTT CAT CCA CGA CCT GGA CAG GAC GGA GCG CAG GCA GGT 480

His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly

145 150 155 160

GTG GAC GGG ACA GTG AGT GGC TGG GAG GAA GCC AGA ATC AAC AGC TCC 528

Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser

165 170 175

AGC CCT CTG CGC TAC AAC CGC CAG ATC GGG GAG TTT ATA GTC ACC CGG 576

Ser Pro Leu Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg

180 185 190

GCT GGG CTC TAC TAC CTG TAC TGT CAG GTG CAC TTT GAT GAG GGG AAG 624

Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys

195 200 205

GCT GTC TAC CTG AAG CTG GAC TTG CTG GTG GAT GGT GTG CTG GCC CTG 672

Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu

210 215 220

CGC TGC CTG GAG GAA TTC TCA GCC ACT GCG GCC AGT TCC CTC GGG CCC 720

Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro

225 230 235 240

CAG CTC CGC CTC TGC CAG GTG TCT GGG CTG TTG GCC CTG CGG CCA GGG 768

Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly

245 250 255

TCC TCC CTG CGG ATC CGC ACC CTC CCC TGG GCC CAT CTC AAG GCT GCC 816

Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala

260 265 270

CCC TTC CTC ACC TAC TTC GGA CTC TTC CAG GTT CAC TGAGGGGCCC 862

Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His

275 280

TGGTCTCCCC ACAGTCGTCC CAGGCTGCCG GCTCCCCTCG ACAGCTCTCT GGGCACCCGG 922

TCCCCTCTGC CCCACCCTCA GCCGCTCTTT GCTCCAGACC TGCCCCTCCC TCTAGAGGCT 982

GCCTGGGCCT GTTCACGTGT TTTCCATCCC ACATAAATAC AGTATTCCCA CTCTTATCTT 1042

ACAACTCCCC CACCGCCCAC TCTCCACCTC ACTAGCTCCC CAATCCCTGA CCCTTTGAGG 1102

CCCCCAGTGA TCTCGACTCC CCCCTGGCCA CAGACCCCCA GGGCATTGTG TTCACTGTAC 1162

TCTGTGGGCA AGGATGGGTC CAGAAGACCC CACTTCAGGC ACTAAGAGGG GCTGGACCTG 1222

GCGGCAGGAA GCCAAAGAGA CTGGGCCTAG GCCAGGAGTT CCCAAATGTG AGGGGCGAGA 1282

AACAAGACAA GCTCCTCCCT TGAGAATTCC CTGTGGATTT TTAAAACAGA TATTATTTTT 1342

ATTATTATTG TGACAAAATG TTGATAAATGG 1373

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：片段

(iii)假设：非

(iv)反义：非

(xi)SEQ ID NO：4的序列描述

Met Ser Leu Leu Asp Phe Glu Ile Ser Ala Arg Arg Leu Pro Leu Pro

1 5 10 15

Arg Ser Leu Gly Ser Arg Asp Gly Gly Ala Val Arg Gln Ala Gln Pro

20 25 30

Pro Ala Pro Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg

35 40 45

Gly Glu Pro Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly

50 55 60

Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly

65 70 75 80

Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val

85 90 95

Ala Glu Glu Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu

100 105 110

Ser Gln Asp Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg

115 120 125

Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala

130 135 140

His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly

145 150 155 160

Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser

165 170 175

Ser Pro Leu Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg

180 185 190

Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys

195 200 205

Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu

210 215 220

Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro

225 230 235 240

Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly

245 250 255

Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala

260 265 270

Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His

275 280

Claims

1.一种分离的核酸，其编码由SEQ ID NO：2所组成的或SEQ IDNO：4的氨基酸36-284所组成的多肽。

2.一种分离的核酸，其编码具有如下氨基末端的多肽，所述氨基末端开始于SEQ ID NO：2的氨基酸22至80中的任意一个且羧基末端位于SEQ ID NO：2之氨基酸225，或所述氨基末端开始于SEQ ID NO：4的氨基酸81至139中的任意一个且羧基末端位于SEQ ID NO：4的氨基酸284，其中所述多肽具有在HT-29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡的能力。

3.一种分离的核酸，其含有编码多肽的序列，其中所述核酸在高严谨条件下与编码序列的互补物杂交，其中所述高严谨条件包括用2×SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤的步骤，其中所述多肽具有在HT-29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡的能力，且其中所述编码序列选自：

a)SEQ ID NO：1

b)SEQ ID NO：1的核苷酸65-676；

c)SEQ ID NO：3的核苷酸106-852；和

d)SEQ ID NO：3的核苷酸241-852。

4.一种分离的核酸，其编码多肽，其中所述核酸在高严谨条件下与SEQ ID NO：3杂交，其中所述高严谨条件包括用2×SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤的步骤，且其中所述核酸编码由SEQ ID NO：2所组成的或SEQ ID NO：4之氨基酸36-284所组成的多肽。

5.一种分离的核酸，其包含编码含有与下列多肽至少90％相同的氨基酸序列的多肽之序列：

a)由SEQ ID NO：2组成的多肽；

b)具有氨基末端开始于SEQ ID NO：2之氨基酸22-80中的任意一个且羧基末端在SEQ ID NO：2之氨基酸225的多肽；

c)由SEQ ID NO：4之氨基酸36-284组成的多肽；

d)具有氨基末端开始于SEQ ID NO：4之氨基酸81-139中的任意一个且羧基末端在SEQ ID NO：4之氨基酸284的多肽；

其中所述多肽具有在HT-29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡的能力。

6.权利要求5的核酸，其中所述多肽含有与下列多肽至少95％相同的氨基酸序列：

a)由SEQ ID NO：2组成的多肽；

c)由SEQ ID NO：4之氨基酸36-284组成的多肽；

7.权利要求1-5中任一项的核酸，其中所述多肽能在HT29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡。

8.权利要求1-5中任一项的核酸，其与表达控制序列有效连接。

9.用权利要求1-5中任一项的核酸转化的宿主细胞。

10.权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

11.权利要求10的宿主细胞，其中哺乳动物细胞为人细胞。

12.一种产生分离的多肽的方法，包括步骤：

a)培养权利要求9的转化的宿主细胞；和

b)从所述宿主细胞中分离多肽。

13.一种在动物细胞培养物中表达分离的多肽的方法，包括步骤：

a)向细胞培养物中导入含有权利要求1-8中任一项核酸的载体，且

b)使所述细胞培养物在其中核酸在该细胞培养物中表达的条件下生活。

14.权利要求13的方法，其中所述动物细胞培养物是昆虫细胞培养物或哺乳动物细胞培养物。

15.权利要求13的方法，其中所述载体为病毒或质粒。

16.一种分离的多肽，其由权利要求1-7中任一项的核酸序列编码。

17.一种由SEQ ID NO：4之氨基酸36-284组成的分离的多肽。

18.一种分离的多肽，其具有开始于SEQ ID NO：4之氨基酸81-139中任意一个的氨基端和SEQ ID NO：4之氨基酸284的羧基端。

19.一种由SEQ ID NO：2组成的分离的多肽。

20.一种分离的多肽，其具有开始于SEQ ID NO：2之氨基酸22-80中任意一个的氨基端和SEQ ID NO：2之氨基酸225的羧基端。

21.权利要求16的多肽，其中所述多肽能在HT29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡。

22.一种由权利要求12-15中任一项的方法获得的分离的多肽。

23.一种抗体或其抗原结合部分，其能与权利要求16-22中任意一项的多肽特异性反应。

24.权利要求23的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自

a)一种单克隆抗体；

b)一种多克隆抗体；和

c)其抗体片段。

25.权利要求23的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自：

a)嵌合抗体；

b)人源化抗体；和

c)重组抗体。

26.权利要求24的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体片段选自：

a)Fab′片段；和

b)F(ab′)₂片段。

27.一种产生可与权利要求16-22中任一项多肽特异性反应的抗体或其抗原结合部分或其抗原性片段的方法，包括用所述多肽或其抗原性片段免疫动物，和从所述动物分离所述抗体或抗原结合部分的步骤。

28.一种含有权利要求1-8中任一项的核酸之组合物。

29.权利要求28的组合物，其为诊断性组合物。

30.一种含有权利要求16-22中任一项的多肽之组合物。

31.权利要求30的组合物，其为诊断性组合物。

32.一种含有权利要求23-26中任一项的抗体或其抗原结合部分的组合物。

33.权利要求32的组合物，其为诊断性组合物。

34.权利要求28、30或32中任一项的组合物，其为药物组合物，还含有任选的药学可接受载体、佐剂或填充剂。

35.权利要求1-8中任一项的核酸序列或权利要求16-22中任一项的多肽用于制备用于如下方面的药物组合物的用途：

a)防止或降低自身免疫病的严重性；

b)防止或降低对组织移植的免疫应答；

c)刺激免疫系统；

d)抑制免疫系统；或

e)癌症治疗。

36.一种编码含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之氨基酸36-284的多肽的分离的核酸，其中所述多肽具有在HT-29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡的能力。

37.一种编码多肽的分离的核酸，其中所述多肽含有开始于SEQID NO：2之氨基酸22-80中任意一个的氨基末端和SEQ ID NO：2之氨基酸225的羧基末端，或开始于SEQ ID NO：4之氨基酸81-139中任意一个的氨基末端和SEQ ID NO：4之氨基酸284的羧基末端，其中所述多肽具有在HT-29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡的能力。

38.一种分离的多肽，其含有SEQ ID NO：4之氨基酸36-284，其中所述多肽具有在HT-29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡的能力。

39.一种分离的多肽，其含有SEQ ID NO：4的片段，所述片段具有SEQ ID NO：4之氨基酸81-139中任意一个的氨基末端和SEQ IDNO：4之氨基酸284的羧基末端，其中所述多肽具有在HT-29结肠癌细胞中诱导程序性细胞死亡的能力。

40.一种由权利要求36或权利要求37的核酸序列编码的分离的多肽。