CN1620466A - 胱氨酸结折迭蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型蛋白质(INSP002)，它经本发明鉴定为一种分泌性蛋白质，是胱氨酸结折迭细胞因子超家族的Dan家族成员，以及涉及该蛋白质和来自编码基因的核酸序列在诊断、预防和治疗疾病中的应用。

Description

胱氨酸结折迭蛋白质
技术领域
本发明涉及新型蛋白质(INSP002)，经本发明鉴定为一种分泌性蛋白质，它是胱氨酸结折迭细胞因子超家族的Dan家族的成员，以及涉及该蛋白质和来自编码基因的核酸序列在诊断、预防和治疗疾病中的应用。
本文所引用的出版物、专利和专利申请，均纳入其全文作为参考。
发明背景
目前，药物发现方法正蕴酿着一场根本革命，因为功能基因组学年代已经来临。术语“功能基因组学”应用于使用生物信息学工具将功能归因于感兴趣的蛋白质序列的方法。这些工具正日益显示其必要性，因为序列数据产生的速度远远高于研究实验室将功能划分给这些蛋白质序列的能力。
随着生物信息学工具的功效和准确性提高，这些工具正快速取代生物化学特性鉴定的常规技术。事实上，鉴定本发明所用的先进生物信息学工具现在能够输出可获得较高置信度的结果。
各所研究院和商业机构正在检查已有的序列数据，并且逐渐获得重大发现。然而，仍然有必要鉴定和特性分析其他基因和它们编码的多肽，作为研究和药物发现的目标。
分泌性蛋白质的背景
细胞制造和分泌胞外蛋白质的能力是许多生物过程的中心。通过分泌小泡与质膜融合，酶、生长因子、胞外基质蛋白和信号传导分子全部由细胞分泌出来。多数情况下，但不是所有情况，蛋白质被信号肽导入内质网，并进入分泌小泡。信号肽是顺式作用序列，影响多肽链从细胞质转运至膜结合室如分泌小泡。靶向分泌小泡的多肽或者分泌进入胞外基质，或者留在质膜内。留在质膜内的多肽有一或多个跨膜结构域。在细胞机能中发挥中心作用的分泌性蛋白质的例子是细胞因子、激素、胞外基质蛋白(粘附分子)、蛋白酶及生长和分化因子。
生长因子代表相对较大的一组均有在体内外诱导细胞增殖的性质的多肽。生长因子有两方面与诸如胰岛素或生长激素等典型内分泌激素不同。首先，内分泌激素通常在专有腺体内合成(例如胰岛素在胰腺内合成)，而生长因子一般在多种类型的细胞和组织内合成。其次，典型内分泌激素在合成位点释放进入体液，被血流带到它们的靶组织。在多数情形下，生长因子的特点是它们在被合成的组织内局部地发挥作用(综述参见Heath，JK.(1993)Growth Factors，Oxford University Press，Oxford，UK，pp.15-33)。
虽然生长因子之间序列相似性的水平不高，但根据结构和功能相似性可将它们分成超家族。这些超家族的例子包括：(a)造血生长因子，例如生长激素、IL-2、IL-4、G-CSF和CNTF，它们全部都具有四螺旋束结构基序；(b)β-三叶家族成员，例如IL-1β、IL-1α、FGF和角化细胞生长因子；(c)EGF-样生长因子，例如EGF和TGFα，它们全部都有免疫球蛋白样结构域；和(d)胱氨酸结生长因子折迭，包括NGF、TGFβ、PDGF和糖蛋白激素。
生长因子位于细胞外，为了发挥生物作用，它们与位于靶细胞质膜上的特异性高亲和力受体相互作用。很多不同生长因子受体的分子特性揭示，它们属于限定家族：酪氨酸激酶受体、G-蛋白相关的7次跨膜受体，和丝氨酸/苏氨酸激酶受体。酪氨酸激酶受体的特点在于具有酪氨酸激酶活性的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。丝氨酸/苏氨酸激酶生长因子受体与带有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的酪氨酸激酶受体相似。胞内结构域具有内在丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
生长因子的反调节暗示各种疾病状态，包括但不限于：肿瘤疾病(BartucciM等，(2001)Cancer Res.Sep 15；61(18)：6747-54，Dias S等，(2001)Proc NatlAcad Sci USA.Sep 11；98(19)：10857-62，Djavan B等，(2001)World J Urol.19(4)：225-33)、炎症疾病(Fiocchi C.(2001)J Clin Invest.Aug；108(4)：523-6，Hodge S等，(2001)Respirology.Sep；6(3)：205-211，Fenwick SA等，(2001)JAnat.Sep；199(Pt 3)：231-40)、神经系统疾病(Cooper JD等，(2001)Proc NatlAcad Sci USA 98(18)：10439-44，Fahnestock M等，(2001)Mol Cell Neurosci18(2)：210-20)和代谢疾病(Vickers MH等，(2001)Endocrinology.142(9)：3964-73)。
胱氨酸结折迭超家族
胱氨酸结超家族中看到的典型结构基于6个胱氨酸的存在，建立3个二硫键。其中两个二硫键建立“环状”结构，第3个二硫键贯穿其中(Sun等，1995)。通常发现胱氨酸结结构域有6个以上胱氨酸残基。附加胱氨酸残基正常情况下用于二聚作用过程中建立胱氨酸结结构域内其他二硫键或链间二硫键。
将该胱氨酸结超家族分为亚家族，包括糖蛋白激素(例如卵泡刺激素)、转化生长因子β(TGFβ)蛋白(例如骨形态生成蛋白4)、血小板分泌的生长因子样(PDGF-样)蛋白(例如血小板分泌的生长因子A)、神经生长因子(NGF)(例如脑分泌的神经营养因子)和成神经细胞瘤中差异筛选选择的基因畸变(DAN)家族(例如cerberus)。DAN亚家族包括Cerl、Cerberus、Caronte、Drm/Gremlin、PRDC、DAN、Dante和CeCanl(Massague等，Genes Dev 2000 Mar 15；14(6)：627-44；Massague & Wotton，EMBO J.2000 Apr 17；19(8)：1745-54)。
一般认为，DAN亚家族成员能够调节蛋白质TGFβ亚家族成员的作用(Pearce等，Dev Biol.1999 May 1；209(1)：98-110)。更具体地说，DAN亚家族成员在发育期间能够调节骨形态生成蛋白(BMP)的作用是可能的。
业已发现，DAN亚家族成员是骨形态生成蛋白(BMP)的拮抗剂，而骨形态生成蛋白是胱氨酸结超家族的TGFβ亚家族成员(Stanley等，Mech Dev.1998Oct；77(2)：173-84；Massague等，2000(见上)；Massague J&Wotton D，2002(见上)。BMP单体在与细胞表面受体相互作用之前，通过它们的胱氨酸结结构域结合而发生同源或异源二聚化。一般认为，DAN亚家族成员通过它们各自的胱氨酸结结构域能够与BMP结合。这防止BMP与它的天然二聚配偶子结合，结果是BMP不能再与它的细胞表面信号传导受体相互作用。特别针对DAN、Cerl和DRM进行的实验已经显示，它们抑制BMP4的作用(Pearce等，1999，(见上))。
因为结合研究的结果，使得对cerberus功能的理解加深(Piccolo S.等，Nature.1999 Feb 25；397(6721)：707-10)。首次对cerberus进行的功能研究使用了非洲爪蟾cerberus蛋白(cer)。将非洲爪蟾cerberus mRNA微量注入非洲爪蟾胚胎中，结果发现cer蛋白诱导Spemann’s组织者的前内胚层中形成异位头(ectopic head)(Bouwmeester等，Nature 1996 Aug 15；382(6592)：595-601；Bouwmeester T.，Int J Dev Biol.200，145(1 Spec No)：251-8)。由Piccolo及合作者进行的结合研究发现，非洲爪蟾的cerberus蛋白通过独立位置结合和抑制Nodal、BMP和Wnt蛋白质。更具体地说，他们发现cerberus对Xnr-1(Nodal家族成员)、BMP4(BMP家族成员)和Xwmt-8(Wnt家族成员)有高的特异亲和力和抑制作用。所以，这一研究将cerberus与DAN家族的其他成员和发育和组织分化通道联系起来。
由基因SOST编码的壳硬蛋白也是DAN亚家族的成员(Brumkow等，2001，Am.J.Hum.Genet.68：577-589)。SOST与硬化性狭窄有关，这是常染色体隐性硬化性骨发育不良。硬化性狭窄相关的表型是渐进性骨胳生长过度，可导致巨人症、面容扭曲及第7和第8根颅神经受压(Brumkow等，2001，(见上))。硬化性狭窄与SOST之间的联系通过受疾病感染的家族的纯合子性图谱来确定。Brumkow及合作者鉴定了硬化性狭窄相关的表型与其他DAN亚家族成员相关的作用相类似。由于丧失TGFβ亚家族成员的负调节因子，更具体是丧失BMP会出现产生硬化性狭窄，这一启示也使上述联系得到支持。
所以，要加深理解导致上述疾病状态和相关疾病状态的隐伏通道，以及研制治疗这些疾病的有效基因或药物疗法，鉴定分泌性蛋白质，特别是生长因子，例如胱氨酸结折迭超家族成员，尤其是DAN亚家族成员具有极为重要的意义。
发明内容
本发明基于如下发现：INSP002蛋白质起分泌性蛋白质的作用，此外，也起胱氨酸结折迭细胞因子超家族的DAN亚家族成员的作用。
本发明第一方面提供一种多肽，该多肽：
(i)包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
(ii)是其具有分泌性蛋白质的功能，优选具有胱氨酸结折迭细胞因子超家族成员的功能，更好具有DAN亚家族成员的功能，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者
(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
本发明第一方面的多肽优选：
(i)包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
(ii)是其具有分泌性蛋白质的功能，优选具有胱氨酸结折迭细胞因子超家族成员的功能，更好具有DAN亚家族成员的功能，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者
(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
本发明第一方面的另一实施例提供一种多肽，该多肽：
(i)由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成；
(ii)是其具有分泌性蛋白质的功能，优选胱氨酸结折迭细胞因子超家族成员的功能，更好是DAN亚家族成员的功能，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者
(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
下文将具有SEQ ID NO：2所示的序列的多肽称为“INSP002外显子1多肽”。将具有SEQ ID NO：4所示的序列的多肽称为“INSP002外显子2多肽”。将具有SEQ ID NO：6所示的序列的多肽称为“INSP002多肽”。INSP002外显子1多肽的首22个氨基酸是信号肽，没有信号序列的INSP002多肽序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。下文将具有SEQ ID NO：7所示的序列的多肽称为“没有信号肽的INSP002外显子1多肽”。将具有SEQ IDNO：8所示的序列的多肽称为“没有信号肽的INSP002多肽”。
本发明第一方面的另一实施例提供一种多肽，该多肽：
(i)包括或由SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列组成；
(ii)是其具有分泌性蛋白质的功能，优选胱氨酸结折迭细胞因子超家族成员的功能，更好是DAN亚家族成员的功能，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者
(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
具有SEQ ID NO：14所示的序列的多肽是INSP002多肽的变体。它与INSP002多肽相同，但与INSP002多肽相比，它在107和108位含有两个氨基酸缺失，在110位含有一个氨基酸取代。下文将具有SEQ ID NO：14所示的序列的多肽称为“变体INSP002多肽”。
本发明第一方面的多肽优选起胱氨酸结折迭细胞因子超家族成员的作用，更好是起DAN亚家族成员的作用。术语“胱氨酸结折迭细胞因子”已为本领域所熟悉，应用本领域公知的各种检测法之一，本领域技术人员很容易能够确定一个多肽是否起胱氨酸结折迭细胞因子超家族的成员的作用。
具体地说，通过测定它是否是TGFβ超家族成员的拮抗剂，尤其它是否是BMP的拮抗剂，本领域技术人员就能够确定一个多肽是否起DAN亚家族的成员的作用。为了测定多肽是否起BMP拮抗剂的作用，可以非洲爪蟾胚胎作为一个系统，因为多个BMP在非洲爪蟾胚胎中表达(Chang C.等，1999，Development 126：3347-3357，Hawley S.等，1995，Genes Dev.9：2923-2935，Hemmati-Brivanlou，A.，和G.H.Thomsen.1995，Dev.Genet.17：78-89，JonesC.M.等，1992，Development 115：639-647)。BMP-2/4类别或BMP-7类别信号在早期中胚层中过度表达会招致腹部致命，而这些信号的抑制剂(例如Noggin、Xnr3、Chordin或Follistatin)会招致背部致命。所以，利用多肽对胚胎发育的影响可确定该多肽是否是一种BMP拮抗剂。
本文所用的术语“INSP002多肽”包括包括INSP002外显子1多肽、没有信号肽的INSP002外显子1多肽、INSP002外显子2多肽、INSP002多肽或者没有信号肽的INSP002多肽的多肽，或者由INSP002外显子1多肽、没有信号肽的INSP002外显子1多肽、INSP002外显子2多肽、INSP002多肽、没有信号肽的INSP002多肽或者变体INSP002多肽组成的多肽。
本发明第二方面提供一种编码本发明第一方面的多肽的纯化核酸分子。
纯化核酸分子最好包括SEQ ID NO：1(编码INSP002外显子1多肽)、SEQID NO：3(编码INSP002外显子2多肽)、SEQ ID NO：5(编码INSP002多肽)、或者SEQ ID NO：13(编码变体INSP002多肽)所示的核酸序列，或者是这些序列之一的一个冗余等同物或片段。
本发明还提供纯化核酸分子，其由SEQ ID NO：1(编码INSP002外显子1多肽)、SEQ ID NO：3(编码INSP002外显子2多肽)、SEQ ID NO：5(编码INSP002多肽)、或者SEQ ID NO：13(编码变体INSP002多肽)所示的核酸序列组成，或者是这些序列之一的一个冗余等同物或片段。
根据本发明该方面的一实施例，纯化核酸分子不含有位于编码INSP002外显子1多肽的核酸序列和编码INSP002多肽的核酸序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5的核苷酸1至151)上游的5’非翻译区。根据此实施例，纯化核酸分子最好包括SEQ ID NO：1的核苷酸152至475或者SEQ ID NO：5的核苷酸152至721。本发明还提供一种纯化核酸分子，其由SEQ ID NO：1的核苷酸152至475或者SEQ ID NO：5的核苷酸152至721组成。编码不含有5’非翻译区的INSP002多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：5的核苷酸152至721)如SEQ ID NO：11所示，编码不含有5’非翻译区的INSP002外显子1多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：1的核苷酸152至475)如SEQ ID NO：12所示。
根据本发明该方面的另一实施例，纯化核酸分子不编码位于INSP002外显子1多肽和INSP002多肽起点的信号肽(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5的核苷酸152至217)。根据此实施例，纯化核酸分子最好包括SEQ ID NO：1的核苷酸218至475(编码没有信号肽的INSP002外显子1多肽)或者SEQ IDNO：5的核苷酸218至721(编码没有信号肽的INSP002多肽)。本发明还提供一种纯化核酸分子，其由SEQ ID NO：1的核苷酸218至475(编码没有信号肽的INSP002外显子1多肽)或者SEQ ID NO：5的核苷酸218至721(编码没有信号肽的INSP002多肽)组成。编码成熟INSP002多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)如SEQ ID NO：9所示，编码成熟INSP002外显子1多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
根据本发明该方面的另一实施例，纯化核酸分子不含有位于编码变体INSP002多肽的核酸序列(SEQ ID NO：13的核苷酸1至68)上游的5’非翻译区。根据此实施例，纯化核酸分子最好包括或由SEQ ID NO：13的核苷酸69至719组成。编码不含有5’非翻译区的变体INSP002多肽的核苷酸序列(SEQID NO：13的核苷酸69至719)如SEQ ID NO：15所示。
本发明第三方面提供一种在高度严谨条件下与本发明第二方面的核酸分子杂交的纯化核酸分子。
本发明第四方面提供一种含有本发明第二或第三方面的核酸分子的载体，例如表达载体。
本发明第五方面提供一种用本发明第四方面的载体转化的宿主细胞。
本发明第六方面提供一种配体，其特异性地结合，优选抑制本发明第一方面的多肽的胱氨酸结折迭细胞因子活性。优选地，配体抑制本发明第一方面的多肽的功能，所述多肽是胱氨酸结折迭细胞因子的DAN亚家族成员。本发明多肽的配体可以有多种形式，包括天然或修饰的基质、酶、受体、有机小分子(例如最大为2000Da，优选800Da或以下的天然或合成有机小分子)、多肽类似物、无机分子、肽、多肽、抗体、上述物质的结构或功能类似物。本发明第七方面提供一种化合物，它能有效地改变编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达，或者能调节本发明第一方面的多肽的活性。
本发明第七方面的化合物可增加(激动)或者减少(拮抗)多肽的基因表达水平或活性。重要的是，对INSP002多肽功能的鉴定允许设计能够鉴定有效地治疗和/或诊断疾病的化合物的筛选方法。
本发明第八方面提供本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物在治疗或诊断中的应用。这些分子还可用来制造治疗细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统疾病、发育障碍、代谢性疾病、感染和其他病理病征的药物。
本发明第九方面提供一种诊断患者疾病的方法，该方法包括评估所述患者组织中编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达水平或者本发明第一方面的多肽的活性，并将所述表达水平或者活性与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。这种方法最好在体外进行。可用类似方法监测对患者疾病的治疗，其中多肽或核酸分子的表达水平或活性在一段时间内趋向于对照水平，表示该疾病获得缓解。
本发明第九方面和第十方面的障碍或疾病优选涉及胱氨酸结折迭细胞因子，更好是涉及DAN亚家族成员的异常水平。这些障碍或疾病也可以涉及胱氨酸结折迭细胞因子，更好是涉及DAN亚家族成员的配体的异常水平。例如，这些障碍或疾病可以涉及TGFβ超家族成员的异常水平。具体地说，这些障碍或疾病可以涉及BMP，例如神经病变、肾病，如糖尿病性神经病变，癌症、伤口愈合、纤维变性、骨质减少、骨质疏松、骨折和硬化性狭窄。
检测本发明第一方面的多肽的优选方法包括以下步骤：(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将本发明第六方面的一种配体，例如抗体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。
本领域的读者将懂得，本发明第九方面的方法有很多种，例如，核酸与短探针杂交法、点突变分析法、聚合酶链式反应(PCR)扩增法以及使用抗体检测异常蛋白水平的方法。类似方法的使用可以是短期或长期，以治疗患者被监测的疾病。本发明还提供一些用于这些方法中诊断疾病的试剂盒。
本发明第十方面提供本发明第一方面的多肽作为分泌性蛋白质的应用。优选地，本发明提供本发明第一方面的多肽作为胱氨酸，更好是作为胱氨酸结折迭细胞因子，特别是作为胱氨酸结折迭细胞因子的DAN亚家族成员的应用。
本发明第十一方面提供一种药物组合物，该组合物含有本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物以及药学上可接受的载体。
本发明第十二方面提供本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物在制造诊断或治疗疾病的药物中的应用。
本发明第十三方面提供一种治疗患者疾病的方法，该方法包括把本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物给予该患者。
本发明第十二方面和第十三方面的疾病优选涉及胱氨酸结折迭细胞因子，更好是涉及DAN亚家族成员的异常水平。这些疾病也可以涉及胱氨酸结折迭细胞因子，更好是涉及DAN亚家族成员的配体的异常水平。例如，这些疾病可以涉及TGFβ超家族成员的异常水平。具体地说，这些障碍或疾病可以涉及BMP，例如神经病变、肾病，如糖尿病性神经病变，癌症、伤口愈合、纤维变性、骨质减少、骨质疏松、骨折和硬化性狭窄。
当与健康受试者中编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达水平或者本发明第一方面的多肽的活性相比，病患者的该表达水平或活性较低的，给予该患者的多肽、核酸分子、配体或化合物应该是激动剂。相反，当与健康受试者中所述多肽的天然基因的表达水平或者活性相比，病患者的该表达水平或活性较高的，给予该患者的多肽、核酸分子、配体或化合物应该是拮抗剂。拮抗剂的例子包括反义核酸分子、核酶和配体，例如抗体。
本发明第十四方面提供转基因或剔除非人动物，它们被转化为表达本发明第一方面的多肽的更高水平、更低水平或缺乏。这些转基因动物是研究疾病极为有用的模型，也可用在鉴定有效治疗或诊断该疾病的化合物的筛选方案中。
以下，给出为实施本发明而可采用的标准技术和步骤的概要。应明白，本发明并不限于所述的这些具体方法、方案、细胞系、载体和试剂。还应明白，本文所用的术语目的仅在于描述具体实施例，该术语不应该被看成为限定本发明的范围。本发明的范围只由所附权利要求书的术语限定。
本说明书中核苷酸和氨基酸使用标准缩写。
除非另有指出，本发明的做法是采用分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学的常规技术，它们都已为本领域技术人员所掌握。
这些技术在有关文献中已有详细解释。例如，可参考以下特别适用的文献：Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，especially volumes 154&155；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein Purification：Principles and Practice，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.1986)。
本文所用的术语“多肽”包括含有相互间以肽键或修饰肽键连接的两个或以上氨基酸的任何肽或蛋白质，即肽同构物(isostere)。该术语指短链(肽和寡肽)和长链(蛋白质)。
本发明的多肽可以是成熟蛋白质形式，或者可以是前蛋白质(pre-，pro-orprepro-protein)，其可被前部分(pre-，pro-or prepro-portion)切割激活而产生活性成熟多肽。这些多肽中的前序列(pre-，pro-or prepro-sequence)可以是先导序列或者分泌序列或者是用来纯化成熟多肽序列的序列。
本发明第一方面的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，它一般适宜包括一或多个附加氨基酸序列，这些附加氨基酸序列可含有分泌序列或先导序列、前序列(pro-sequences)、有助纯化的序列、或者例如在重组生产中赋予蛋白质更高稳定性的序列。另一个选择或者另一方面是，成熟多肽可与另一种化合物，例如与延长该多肽半衰期的化合物(譬如聚乙二醇)融合。
多肽可含有由天然过程，例如翻译后加工，或者由本领域公知的化学修饰技术修饰的氨基酸，它们不同于20个基因编码的氨基酸。在已知的修饰中，本发明的多肽通常带有的修饰是糖基化、脂质附着、硫酸化、例如谷氨酸残基的γ-羧酸化，羟基化和ADP-核糖基化。其他可能的修饰包括乙酰化、酰化、酰胺化、黄素的共价附着、血素分子的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、GPI锚着形成、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、转移-RNA介导的蛋白质中插入氨基酸例如精氨酰化，以及遍在蛋白化。
修饰可发生于多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。事实上，天然存在的肽和合成肽一般通过共价修饰封闭肽的氨基或羧基末端，或者封闭二者，这样的修饰存在于本发明的多肽中。
发生在多肽内的修饰通常随如何制成该多肽而变化。对于重组制成的多肽，通过特定宿主细胞翻译后修饰能力以及存在于所述多肽的氨基序列中的修饰信号来确定大部分修饰的性质和程度。例如，不同类型的宿主细胞之间糖基化型式是不同的。
本发明的多肽可以任何合适的方式制成。这些多肽包括分离的天然存在的多肽(例如自细胞培养基中纯化而来)、重组产生的多肽(包括融合蛋白)、合成产生的多肽或者通过这些方法组合所产生的多肽。
本发明第一方面的功能等同多肽可以是与INSP002多肽同源的多肽。如果一个多肽的序列与另一个多肽的序列具有足够高程度的同一性或相似性，本文就用术语“同源的”来形容该两个多肽。“同一性”表示在比对序列的任何特定位置上，两个序列之间的氨基酸残基是相同的。“相似性”表示在比对序列的任何特定位置上，两个序列的氨基酸残基是相似的。同一性和相似性的程度不难计算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，Part l，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
所以，同源多肽包括INSP002多肽的天然生物变体(例如，产生多肽的物种内等位基因变体或地理变体)和突变体(例如，含有氨基酸取代、插入或缺失的突变体)。这些突变体可包括其一或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)取代的多肽，这样一个取代的氨基酸残基可以或不必是遗传密码编码的残基。典型的取代是在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间；或者在芳香族残基Phe和Tyr之间。特别优选的是这样一些变体：有多个氨基酸，即5至10个氨基酸，1至5个氨基酸，1至3个氨基酸，1至2个氨基酸，或者仅有1个氨基酸以任意组合取代、缺失或插入的变体。特别优选的是不改变该蛋白质的性质和活性的沉默取代、插入和缺失。就此而言，特别优选的还有保守性取代。这些突变体也包括其中一或多个氨基酸残基包括一取代基团的多肽。
通常，两个多肽之间的同一性大于30％，就认为它们在功能上是等同的。本发明第一方面的功能等同多肽与INSP002多肽，或其活性片段的序列同一性优选大于35％。更好的多肽分别具有大于35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95、98％、99％或以上的同一性。
本发明第一方面的功能等同多肽还可以是已用一或多种结构比对技术鉴定的多肽。例如，可以应用Inpharmatica Genome Threader技术(它构成用于产生Biopendium检索数据库的检索工具的其中一部分，参见共同待审批英国专利申请PCT/GB01/01105)来鉴定现时具有未知功能的多肽，这些多肽虽然与INSP002多肽具有较低的序列同一性，但由于与INSP002多肽序列共享较高水平的结构同源性，故可预计它们有分泌性分子活性。“较高水平的结构同源性”指用Inpharmatica Genome Threader预测两个蛋白质确定共享10％和以上的结构同源性。
本发明第一方面的多肽还包括INSP002多肽的片段、INSP002多肽的功能等同物的片段，只要那些片段保留了胱氨酸结折迭细胞因子的活性，优选DAN胱氨酸结折迭亚家族成员的活性，或者带有与INSP002多肽相同的抗原性决定簇。
本文所用的术语“片段”指氨基酸序列与INSP002多肽或它的其中一种功能等同物的部分而非全部氨基酸序列相同的多肽。这些片段应包括所述序列的至少n个保守性氨基酸，取决于特定的序列，n最好是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或以上)。小片段可形成抗原性决定簇。
这些片段可以是“独立的(free-standing)”，即不是其他氨基酸或多肽的一部分，也不与其他氨基酸或多肽融合，或者它们可包含在它们构成其中一部分或区域的较大多肽之内。当包含在较大多肽之内时，本发明的片段最好构成单个连续区域。例如，一些优选实施例涉及一个片段，其具有与该片段的氨基末端融合的前多肽区域(pre-and/or pro-polypeptide region)，和/或具有与该片段的羧基末端融合的附加区域。然而，单一个较大多肽内可含有多个片段。
本发明的多肽或其免疫原性片段(包含至少一个抗原性决定簇)可被应用来产生对这些多肽有免疫特异性的配体，例如多克隆或单克隆抗体。这些抗体可用于分离或鉴定表达本发明的多肽的克隆，或者用于亲和力层析法纯化这些多肽。抗体还可用来帮助诊断或治疗，以及其他应用，这对本发领域技术人员是显而易见的。
术语“免疫特异性”指抗体对本发明的多肽的亲和力远远大于它们对现有领域其他相关多肽的亲和力。本文所用的术语“抗体”指能够与所述抗原性决定簇结合的完整分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。所以，这些抗体与本发明第一方面的多肽结合。
术语“明显较高的亲和力”指与对已知的分泌性蛋白质的亲和力相比，对本发明的多肽的亲和力有可测量的提高。
优选地，对本发明的多肽的亲和力比已知的分泌性蛋白质，例如胱氨酸结折迭细胞因子，特别是DAN亚家族成员至少高1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
如果需要多克隆抗体，可用本发明第一方面的多肽使一种选定哺乳动物免疫，例如小鼠、兔、山羊或马。用来免疫动物的多肽可通过重组DNA技术产生，或者可通过化学方法合成。有需要的时候，可将多肽与一载体蛋白质连接。通过化学方法与多肽偶联的常用载体包括牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔血蓝蛋白。然后，用偶联的多肽来免疫动物。采集该免疫动物的血清，再按公知的程序，例如免疫亲和力层析法加以处理。
本领域技术人员可轻易地生产针对本发明第一方面的多肽的单克隆抗体。应用杂交瘤技术生产单克隆抗体的一般方法已为人所公知(例如，参见Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday 4：72(1983)；Cole等，77-96 in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
可针对各种性质，即同种型、表位、亲和力等，筛选对本发明第一方面的多肽产生的多系列单克隆抗体。单克隆抗体特别用于纯化它们所针对的各种多肽。另一方面，编码感兴趣的单克隆抗体的基因可通过例如本领域公知的PCR技术在杂交瘤中分离出来，并可在适当载体中克隆和表达。
还可使用嵌合抗体，其中非人的可变区与人稳定区连接或融合(例如，参见Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439(1987))。
可对抗体进行修饰，例如通过使它人源化，以便在某一个体内的免疫原性减弱(参见ones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用的术语“人源化抗体”指非人供体抗体的重链和/或轻链可变区内CDR氨基酸和选定的其他氨基酸已经被人抗体的等同氨基酸所取代的抗体分子。所以，人源化抗体与人抗体极为相近，但具有与该供体抗体结合的能力。
另一个选择是，抗体可以是“双特异性”抗体，即它是一种有两个不同抗原结合区的抗体，每一结合区针对不同表位。
可应用噬菌体展示技术选择基因，所述基因编码具有与本发明多肽结合的活性的抗体，多肽来自为具有相关抗体而筛选的以PCR技术扩增的人淋巴细胞V基因库，或者天然文库(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783)。这些抗体的亲和力也可通过链改组加以改善(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。
以上述技术产生的多克隆抗体或单克隆抗体有额外应用，因为它们可用作免疫测定法、放射性免疫测定法(RIA)或者酶联免疫吸附测定法(ELISA)中的试剂。这些应用可使用可分析检测到的试剂，例如放射性同位素、萤光分子或酶来标记抗体。
本发明第二和第三方面的优选核酸分子是编码SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14所示的多肽序列和功能上等同的多肽的那些分子。这些核酸分子可用于本文描述的方法和应用中。本发明的核酸分子最好含有至少n个本文所公开的序列中的连续核苷酸，取决于特定的序列，n是10或以上(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40或以上)。
本发明的核酸分子还包括上述核酸分子的补体序列(例如，用于反义或探测目的)。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或者是DNA形式，包括例如cDNA、合成DNA或基因组DNA。这样一些核酸分子可通过克隆、化学合成技术或其组合获得。例如，核酸分子可通过应用诸如固相亚磷酰胺化学合成从基因组或cDNA文库化学合成，或者从生物体中分离而制备。一般通过在体外或体内转录DNA序列产生RNA分子。
核酸分子可以是双链或单链。单链DNA可以是编码链，也称有义链，或者它可以是非编码链，也称反义链。
术语“核酸分子”还包括DNA和RNA类似物，例如含有修饰骨架的那些类似物，以及肽核酸(PNA)。本文所用的术语“PNA”指反义分子或反基因试剂，其含有长至少5个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与最好位于赖氨酸末端的氨基酸残基肽骨架连接。该末端赖氨酸使组合物具有溶解性。PNA可被聚乙二醇化，延长它们在细胞内的停留时间，在细胞内它们优先与补体单链DNA和RNA结合，并终止转录延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)Anticancer Drug Des.8：53-63)。
编码SEQ ID NO：2所示的多肽的核酸分子可与SEQ ID NO：1所示的核酸分子的编码序列(核苷酸152至475)相同，如SEQ ID NO：12所示。编码SEQ ID NO：7所示的多肽的核酸分子可与SEQ ID NO：1所示的核酸分子的编码序列(核苷酸218至475)相同，如SEQ ID NO：10所示。编码SEQ IDNO：4所示的多肽的核酸分子可与SEQ ID NO：3所示的核酸分子的编码序列相同。编码SEQ ID NO：6所示的多肽的核酸分子可与SEQ ID NO：5所示的核酸分子的编码序列(核苷酸152至721)相同，如SEQ ID NO：11所示。编码SEQ ID NO：8所示的多肽的核酸分子可与SEQ ID NO：5所示的核酸分子的编码序列(核苷酸218至721)相同，如SEQ IDNO：9所示。编码SEQID NO：14所示的多肽的核酸分子可与SEQ ID NO：13所示的核酸分子的编码序列(核苷酸69至719)相同，如SEQ ID NO：15所示。
这些分子还可以有另一个不同序列，因为遗传密码简并性，该不同序列编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8或SEQ ID NO：14所示的多肽。这些编码SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14所示的多肽的核酸分子可包括，但不限于，成熟多肽自身的编码序列；成熟多肽的编码序列加上附加编码序列，例如编码先导序列或分泌序列(如前多肽序列)的序列；成熟多肽的编码序列，加上或不加上前述附加编码序列，再加上另外一些非编码序列，包括非编码5’和3’序列，例如在转录(包括终止信号)、核糖体结合和mRNA稳定性中发挥作用的转录非翻译序列。核酸分子还包括编码附加氨基酸的附加序列，例如提供附加功能的那些氨基酸。
本发明第二和第三方面的核酸分子也可编码本发明第一方面的多肽及片段的片段或功能等同物。这样一种核酸分子可以是天然存在的变体，例如天然存在的等位基因变体，或者该分子可以是非天然存在的变体。核酸分子的非天然存在的变体可通过诱变技术制成，包括适用于核酸分子、细胞或生物体的那些技术。
就此而言，这些变体是通过核苷酸取代、缺失或插入而不同于上述核酸分子的变体。取代、缺失或插入可涉及一或多个核苷酸。变体可在编码区或非编码区或者二者内发生变化。编码区内的变化可产生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或插入。
本发明的核酸分子也可以采用本领域公知的方法为多种原因而进行改造，这些原因包括修饰克隆、加工、和/或基因产物(多肽)的表达。可用来改造核苷酸序列的技术还包括应用随机断裂所作的DNA改组、基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新装配。可利用定点诱变插入新的限制位点，改变糖基化模式，修改密码子偏向，产生剪接变体，引入突变等等。
编码本发明第一方面的多肽的核酸分子可与异源序列连接，以致该组合核酸分子编码融合蛋白。这样一些组合核酸分子包括在本发明第二和第三方面之内。例如，要在肽库中筛选抑制多肽活性的抑制剂，用这种组合核酸分子表达可被市售抗体识别的融合蛋白是有用的。融合蛋白还可被改造成含有位于本发明多肽的序列与异源蛋白质的序列之间的切割位点，以致该多肽可被切割，并从该异源蛋白质中纯化出来。
本发明的核酸分子还包括一些反义分子，它们与编码本发明的多肽的核酸分子部分互补，因而与编码核酸分子杂交。如本领域普通技术人员所知，这些反义分子，例如寡核苷酸，可设计成识别、特异性地结合以及防止编码本发明多肽的靶核酸的转录(例如，参见Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991))。
本文所用的术语“杂交”指两个核酸分子通过氢键相互缔合。通常，将一个分子固定于固相支持物上，而另一个分子在溶液中游离。然后，在有利氢键键合的条件下使两个分子相互接触。影响键合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相分子与固相支持物非特异性附着的试剂(Denhardt′s试剂或BLOTTO)；分子的浓度；提高分子缔合率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；杂交后洗涤条件的严谨程度(参见上述文献Sambrook等)。
应用本领域公知的杂交测定法(例如，参见上述文献Sambrook等)，可检查一个完全互补分子与靶分子杂交的抑制。遵照Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152：399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152：507-511)的教导，在不同严谨程度的条件下，使基本上同源的分子竞争并抑制完全同源的分子与靶分子的结合。
“严谨程度”指在杂交反应中与不同的分子缔合相比，有利于极度相似的分子缔合的条件。高度严谨杂交条件定义为42℃下在一溶液中培养过夜，该溶液含有50％甲酰胺、5XSSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性剪切鲑鱼精子DNA，然后，约65℃下在0.1XSSC中洗涤过滤器。低度严谨条件涉及在35℃下进行的杂交反应(参见上述文献Sambrook等)。杂交使用的优选条件是高度严谨杂交条件。
本发明该方面的优选例子是其全长至少有70％与编码INSP002多肽(SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14)的核酸分子相同的核酸分子以及基本上与这些核酸分子互补的核酸分子。本发明该方面的优选核酸分子含有一区域，该区域的全长至少有80％与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示的SEQID NO：2和SEQ ID NO：7编码序列、与SEQ ID NO：3所示的SEQ ID NO：4编码序列、与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的SEQID NO：6和SEQ ID NO：8编码序列、或者与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15所示的SEQ ID NO：14编码序列相同，或者是一个互补核酸分子。就此而言，特别优选的是其全长至少有90％，优选至少95％，更好至少98％或99％与所述核酸分子相同的核酸分子。优选的例子是编码基本上保留与INSP002多肽相同的生物功能或活性的多肽的核酸分子。
本发明还提供一种检测本发明核酸分子的方法，该方法包括以下步骤：(a)在杂交条件下将本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；以及(b)检测所形成的任何双链体。
下文另外讨论关于本发明可采用的测定法，上述的核酸分子可用作RNA、cDNA或基因组DNA的杂交探针，分离编码INSP002多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与编码该多肽的基因有高度同一性的同源或直向同源基因的cDNA和基因组克隆。
在这点上，可以使用以下技术，其中包括已为本领域技术人员所知的，为了举例说明讨论如下。DNA的测序和分析方法已为人公知，在本领域中可以得到，事实上这些方法也用于以下讨论的本发明很多实施例中。这些方法可使用酶，例如DNA聚合酶I的克列诺片段测序酶(US Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐热T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)或者这些酶的组合，以及校读外切核酸酶，例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)出售的ELONGASE扩增系统中找到的那些外切核酸酶。优选的测序方法可应用Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、PeltierThermal Cycler(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化剂以及373和377 DNA测序仪(Perkin Elmer)等仪器进行自动操作。
一种分离编码具有与INSP002多肽等同功能的多肽的核酸分子的方法是按照本领域公认的标准程序用天然或人工设计的探针探测基因组或cDNA文库(例如，参见″Current Protocols in Molecular Biology″，Ausubel等(eds)，GreenePublishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。特别有用的探针是：含有至少15个，优选至少30个，更好是至少50个邻接碱基，这些碱基对应于，或者与适当的编码基因的核酸序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15)互补。使用可分析检测到的试剂标记探针，方便鉴定。有用的试剂包括，但不限于，放射性同位素、萤光染料和能够催化待检测产物形成的酶。有了这些探针，本领域普通技术人员就能够从人、哺乳动物或其他动物来源中分离出感兴趣的基因组DNA、cDNA或RNA聚核苷酸编码蛋白质的互补拷贝，并能够在这些来源中筛选出有关序列，例如该家族、类型和/或亚型的额外成员。
多数情况下，分离的cDNA序列是不完整的，因为编码多肽的区域通常在5’端被截短。现时有一些方法可获得全长cDNA，或者将短cDNA延长。应用部分核苷酸序列和本领域公知的方法检测上游序列，例如启动子和调控元件，可将这些序列延长。例如，可采用的一种方法是基于快速扩增cDNA末端的方法(RACE；例如参见Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近，MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)对这种技术进行了改进，例如使较长cDNA的检索大大简化。另一种稍稍不同的技术称为“限制位点”PCR，它使用通用探针检索邻接一已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2：318-322)。以基于已知区域的趋异性引物，也可用反向PCR来扩增或延长序列(Triglia，T.等，(1988)NucleicAcids Res.16：8186)。捕捉PCR是可使用的另一种方法，它涉及通过PCR技术扩增邻接人和酵母人工染色体DNA中已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等，(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。可用来检索未知序列的另一种方法是Parker，J.D.等描述的方法(1991，Nucleic AcidsRes.19：3055-3060)。另外，人们可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinderTM文库来查看基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。这种方法不需筛选文库，可用于寻找内含子/外显子接合。
当筛选全长cDNA时，最好用已经按大小进行选择包含了较大cDNA的文库。优选的还有随机引物文库，因为它们含有较多含基因5’区的序列。对于寡d(T)文库不能产生全长cDNA的情形，最好使用随机引物文库。基因组文库可用来将序列延伸进入5’非转录调控区。
在本发明一实施例中，本发明的核酸分子可用来进行染色体定位。在这一技术中，核酸分子特异性靶向，并能与单个人染色体的特定位置杂交。对本发明染色体的相关序列作图谱，是确认那些序列与基因相关性疾病相互关系的重要步骤。一旦将序列与准确染色体位置在图谱反映出来，就可以将染色体上序列的物理位置与基因图谱数据关联起来。这些数据例如可以在人类孟德尔遗传学数据库中找到(Johns Hopkins大学韦尔奇医学库在线提供)。然后，通过连锁分析(物理相邻基因的共同继承)确定业已映像在同一个染色体区的基因与疾病之间的关系。这为研究人员用定位克隆或其他基因发现技术检索疾病基因提供了有价值的信息。一旦通过遗传连锁分析粗略地把疾病或综合征限制在一特定基因组区，映像在该区域的任何序列代表相关或调控基因，可作进一步研究。核酸分子还可用来检测由于正常、载体或染病个体之间移位、反转等造成染色体位置的差异。
本发明的核酸分子对于组织定位也是有价值的。这些技术通过检测编码多肽的mRNA可以确定该多肽在组织中的表达模式。这些技术包括原位杂交技术和核苷酸扩增技术，例如PCR。从研究中获得的结果可知道生物体中多肽的正常功能。另外，mRNA的正常表达模式与突变基因编码的mRNA的正常表达模式之间的比较研究为理解突变多肽在疾病中的作用提供了有价值的认知。不适当表达可以是时间、空间或量化。
可采取基因沉默方法使编码本发明多肽的基因内源表达下调。一种方法是RNA干扰(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)，可用来使序列特异性翻译后基因沉默。短dsRNA寡核苷酸在体外合成，并导入细胞中。这些dsRNA寡核苷酸的序列特异性结合引发靶mRNA降解，从而减少或消除蛋白质表达。
评估上述基因沉默方法的功效可用TaqMan方法在RNA水平上测量多肽的表达(例如，Western印迹)。
本发明的载体包含本发明的核酸分子，可以是克隆或表达载体。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，它们可用本发明的载体转化、转染或转导。
本发明的多肽的制备可以重组形式在宿主细胞所含的载体内表达它们的编码核酸分子。这些表达方法已为本领域技术人员公知，很多方法已由上述的Sambrook和Fernandez与Hoeffier的书(1998，eds.″Gene expressionsystems，Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)详细叙述。
一般而言，可使用适合维持、繁殖或表达核酸分子在一所需宿主内产生多肽的任何系统或载体。应用各种公知的常规技术，例如上述Sambrook中描述的技术，可将适当的核苷酸序列插入一表达系统中。通常，可使编码基因受控于调控元件，例如启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)，任选地是操纵子，以便将编码所希望的多肽的DNA序列转录至转化宿主细胞的RNA内。
例如，适当的表达系统的例子包括染色体系统、附加体系统和病毒衍生系统，包括例如衍生自以下物质的载体：细菌质粒、噬菌体、转位子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒，例如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆转录病毒，或者其组合，例如从质粒和噬菌体遗传因子所产生的载体，包括粘粒和噬菌粒。人的人工染色体(HACs)也可用来输送在质粒中所含有和表达的较大DNA片段。
特别适合的表达系统包括微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达系统转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或者用细胞表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。无细胞翻译系统也可用来产生本发明的多肽。
参照许多标准实验手册，例如Davis等(Basic Methods in MolecularBiology(1986))和上述Sambrook等中描述的方法，可将编码本发明的多肽的核酸分子导入宿主细胞内。特别适合的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、微量注射、阳离子质粒介导的转染、电穿孔、转导、划痕加载、弹导导入或感染(参见上述Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman & Leinwald，1998)。在真核细胞中，表达系统可以是暂时的(例如附加体)或者永久的(染色体整合)，取决于该系统的需要。
编码核酸分子可以包括或不包括编码调控序列，例如信号肽或先导序列的序列，有需要的时候，例如将翻译的多肽分泌到内质网腔、胞质间隙或胞外环境中。这些信号可以与该多肽内源，或者它们可以是异源信号。先导序列可在翻译后加工中被细菌宿主除去。
除了调控序列之外，希望可以加入能调节相对于宿主细胞生长的多肽表达的调节序列。调节序列的例子是可引起基因的表达对化学和物理刺激，包括调节化合物的存在，或者对各种温度或代谢条件的应答增大或减少的序列。调节序列是载体的那些非翻译区，例如增强子、启动子以及5’和3’非翻译区。它们与宿主细胞蛋白质相互作用，进行转录和翻译。这些调节序列的强度和特异性可以是不同的。取决于所用的载体系统和宿主，可使用任何数量的适当转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如在细菌系统内克隆时，可使用诱导型启动子，例如Bluescript噬菌粒的杂交lacZ启动子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportlTM质粒(Gibco BRL)等等。在昆虫细胞内可用杆状病毒多角体蛋白启动子。由植物细胞基因组(例如，热激、RUBISCO和贮藏蛋白基因)或者植物病毒(例如，病毒启动子或先导序列)衍生而来的启动子或增强子可克隆到载体中。哺乳动物细胞系统优选使用哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有序列的多个拷贝的细胞系，可使用基于SV40或EBV的载体和一适当选择性标记物。
构建一个表达载体，以致于使特定核酸编码序列位于该带有适当调节序列的载体内，所述编码序列相对于调节序列的定位和方向使得该编码序列在该调节序列的“控制”下转录，即在调控序列下与DNA分子结合的RNA聚合酶转录该编码序列。在一些情况下，有需要将序列修饰成它可以适当方向附着于调控序列，即维持读框。
调控序列和其他调节序列可在插入载体之前先连接到核酸编码序列。另一个选择是，直接将编码序列克隆到已经含有调控序列和适当限制位点的表达载体中。
对于长时间高得率地生产重组多肽，最好有稳定的表达。例如，稳定地表达感兴趣的多肽的细胞系可以用含有病毒来源复制的表达载体和/或同一个或不同载体上的内源性表达元件和选择性基因转化。导入载体之后，允许细胞先在富集培养基中生长1-2天，再转移到选择培养基中。选择性标记物的目的是针对选择带来抗性，它的存在可以使成功表达导入序列的细胞生长和恢复。稳定转化的细胞的抗性克隆可应用适合细胞类型的组织培养技术进行增殖。
本领域技术人员已知哺乳动物细胞系可用作表达宿主，而哺乳动物细胞系包括美国典型菌种保藏中心(ATCC)的许多无限增殖化细胞系，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK 293细胞、Bowes黑色素瘤细胞和人肝细胞癌(例如Hep G2)细胞以及其他许多细胞系。
杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的物质在市场上以试剂盒形式提供，可以购自inter alia、Invitrogen、San Diego CA(“MaxBac”试剂盒)。这些技术对本领域技术人员而言是众所周知的，在Summers和Smith的文章(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))中也有所描述。特别适合该系统使用的宿主细胞包括昆虫细胞，例如果蝇S2细胞和草地夜蛾Sf9细胞。
本领域已经知道很多植物细胞培养基和全植物遗传表达系统。合适的植物细胞遗传表达系统的例子包括美国专利US 5,693,506；US 5,659,122；和US 5,608,143中描述的系统。植物细胞培养基的遗传表达的另外一些例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。
具体地说，可使用原生质体被分离和培养得到全再生植物的所有植物，以致回收到的全植物含有转移基因。特别是所有植物可从培养细胞或组织中再生，包括但不限于甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果和其他树木、豆类和蔬菜的所有主要种属。
特别优选的细菌宿主细胞的例子包括链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌细胞。
特别适合真菌表达的宿主细胞的例子包括酵母细胞(例如酿酒酵母)和曲霉菌细胞。
本领域已经知道许多选择系统，它们都可用来回收转化细胞系。例如，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M.等，(1977)Cell 11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，I.等，(1980)Cell 22：817-23)基因可分别用在tk-或aprt±细胞中。
另外，选择的基础可以是抗代谢物、抗生素或除草剂抗性；例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler，M.等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；npt赋予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等，(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)，als或pat分别赋予绿黄隆和草丁膦乙酰转移酶抗性。此外，还描述了其他选择性基因，它们的例子为本领域技术人员所知。
虽然标记基因表达的存在或不存在提示感兴趣的基因也是存在的，但它的存在和表达有待确认。例如，如果在一标记基因序列中插入相关的基因，不存在标记基因功能可以确定含有适当序列的转化细胞。另一个选择是，在单个启动子控制下将标记基因与编码本发明的多肽的序列串联放置。标记基因应答诱导或选择的表达通常也表示串联基因的表达。
另外，含有编码本发明的多肽的核酸序列，并表达所述多肽的宿主细胞可通过本领域技术人员公知的各种程序进行鉴定。这些程序包括但不限于：DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物分析，例如，萤光激活细胞分类术(FACS)或免疫测定技术(例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射性免疫测定法(RIA))，包括用来检测和/或定量分析核酸或蛋白质的膜、溶液或晶片技术(参见Hampton，R.等，(1990)Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
本领域技术人员公知的各种各样标记和连接技术可用在不同的核酸和氨基酸测定法中。产生标记杂交的装置或者检测与编码本发明的多肽的核酸分子有关的序列的PCR探针包括，寡标记、镍翻译、末端标记或使用标记聚核苷酸的PCR扩增。另外，也可将编码本发明的多肽的序列克隆到载体内，以产生mRNA探针。这些载体是本领域公知的，可通过商业途径获得，加入诸如T7、T3或SP6等适当RNA聚合酶和标记核苷酸可在体外合成RNA探针。这些步骤使用市场上供应的各种试剂盒(Pharmacia & Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))进行。
易于检测的合适报导分子或标记包括放射性核、酶和萤光、化学发光或发色试剂和物质、协同因子、抑制剂、磁性粒子等等。
本发明的核酸分子还可用来制造转基因动物，特别是啮齿动物。这些转基因动物构成本发明的另一方面。这可通过局部修饰体细胞，或者通过种系治疗引入遗传修饰来实现。这些转基因动物特别适用于制作动物模型，分析作为本发明多肽的调节剂的药物分子。
从重组细胞培养基中回收和纯化多肽的方法是公知的，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阳离子或阴离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水基相互作用层析法、亲和力层析法、羟磷灰石层析法和血凝素层析法。高效液相层析法特别适用于纯化。当分离和/或纯化期间多肽发生变性时，可应用蛋白质再折迭的公知技术来再产生活性构造。
也可利用特异性载体结构来帮助蛋白质纯化，有需要的时候，将编码本发明的多肽的序列与编码有利于可溶性蛋白质纯化的多肽结构域的核酸序列连接。有利于纯化的结构域的例子包括金属螯合肽，例如允许在固定金属上纯化的肌氨酸-色氨酸组件，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及用在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中的结构域。为了方便纯化，可以采用可切割的接头序列的内含物，例如在纯化结构域与本发明的多肽之间的对XA因子或肠激酶有特异性的序列。一种这样的表达载体为融合蛋白的表达提供准备，所述融合蛋白含有本发明的多肽，与硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前面的多个肌氨酸残基融合。肌氨酸残基有利于固定金属离子亲和力层析法(IMAC)的纯化，参见Porath，J.等的描述(Prot.Exp.Purif.3：263-281，(1992))，而硫氧还蛋白或肠激酶切割位点为从融合蛋白纯化多肽提供了一种手段。Kroll，D.J.等对含有融合蛋白的载体进行了讨论(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)。
如果多肽的表达是用在筛选测定中，通常最好是在它表达的宿主细胞表面上产生该多肽。在此情况下，宿主细胞可在用于筛选测定之前，例如用萤光激活细胞分类术(FACS)或免疫测定技术之前收获。如果多肽分泌到培养基中，可回收该培养基以便回收和纯化表达多肽。如果多肽是在细胞内产生，则回收多肽之前必须先溶解细胞。
本发明的多肽可用来筛选各种药物筛选技术使用的化合物库。这些化合物可以激活(激动)或抑制(拮抗)本发明多肽的基因的表达水平或活性，构成本发明的另一方面。优选的化合物是能有效地改变编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达，或者调节本发明第一方面的多肽的活性。
激动剂或拮抗剂化合物可从，例如，细胞制剂、无细胞制剂、化学库或天然混合产物中分离出来。这些激动剂或拮抗剂可以是天然的或者是经修饰的物质、配体、酶、受体或者结构或功能类似物。关于这些筛选技术的综述，可参见Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5(1991)。
最有可能成为良好拮抗剂的化合物是与本发明的多肽结合但在结合后又不会诱导该多肽生物作用的分子。潜在的拮抗剂包括有机小分子、肽、多肽和抗体，它们与本发明的多肽结合，由此抑制或消除它的活性。以这种方式，多肽与正常细胞结合分子的结合可被抑制，从而抑制该多肽的正常生物活性。
用在此筛选技术中的本发明的多肽可以在溶液中游离，附着于固相支持物上，留在细胞表面或位于细胞内。一般而言，这些筛选程序可涉及使用表达与测试化合物接触的多肽的适当细胞或细胞膜，观察结合、或功能反应的刺激或抑制。再将与测试化合物接触的细胞和不接触测试化合物的对照细胞的功能反应作比较。借助适当检测系统，这种测定方法可以评估测试化合物是否导致多肽激活产生一个信号。一般情况下，在已知激动剂的存在下分析激活的抑制剂，在测试化合物存在下观察激活对激动剂的影响。
一种鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂化合物的优选方法包括：
(a)在允许与多肽结合的条件下，将在其表面上表达本发明第一方面的多肽的细胞与待筛选化合物接触，所述的多肽与能够在化合物与该多肽结合之后提供可检测信号的第二成分缔合。
(b)通过测定化合物与多肽相互作用所产生的信号水平来确定该化合物是否结合和激活或抑制该多肽。
另一种鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂化合物的优选方法包括：
(a)在允许与多肽结合的条件下，将在其表面上表达本发明第一方面的多肽的细胞与待筛选化合物接触，所述的多肽与能够在化合物与该多肽结合之后提供可检测信号的第二成分缔合。
(b)通过对化合物与多肽相互作用所产生的信号水平与在该化合物不存在下的信号水平作比较来确定该化合物是否结合和激活或抑制该多肽。
在另一优选实施例中，上述的通用方法还包括在多肽的标记或无标记配体存在下对激动剂或拮抗剂进行鉴定。
在另一实施例中，鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂的方法包括：
在允许结合多肽的条件和候选化合物存在下，测定配体与其表面上带有本发明的多肽的细胞、或者与含有这样一种多肽的细胞膜结合的抑制，并测定与该多肽结合的配体数量。能够引起配体结合减少的化合物就认为是激动剂或拮抗剂。配体最好是带标记的。
更具体地说，筛选多肽拮抗剂或激动剂化合物的方法包括以下步骤：
(a)使标记的配体与在细胞表面上表达本发明的多肽的全细胞，或者含有本发明的多肽的细胞膜培养，
(b)测定与全细胞或细胞膜结合的标记配体数量，
(c)在步骤(a)的标记配体和全细胞或者细胞膜的混合物中加入候选化合物，使该混合物达到平衡；
(d)测定步骤(c)之后与全细胞或细胞膜结合的标记配体数量；以及
(e)比较步骤(b)和(d)中结合的标记配体之差值，将引起步骤(d)的结合减少的化合物看成激动剂或拮抗剂。
在上述测定法中，发现多肽以剂量依赖方式调节各个生理和病理过程。所以，本发明的多肽的“功能等同物”包括在上述测定法中显示剂量依赖方式的任何相同的调节活性的多肽。虽然剂量依赖活性的程度不必与本发明的多肽完全一样，但“功能等同物”在给定的活性测定法中最好基本上具有与本发明的多肽相类似的剂量依赖关系。上述一些实施例可应用简单结合测定法，其中测试化合物与带有多肽的表面的附着用直接或间接与该测试化合物结合的标记检测，或者可应用涉及与标记竞争物竞争的测定法检测。另一个实施例采用竞争药物筛选测定法，其中能够结合多肽的中和抗体与测试化合物特异性地竞争结合。以此方式可用抗体检测对多肽有特异性结合亲和力的任何测试化合物的存在。
测定法也可设计成检测加入的测试化合物对细胞内编码多肽的mRNA产生的作用。例如，ELISA可构建成通过本领域公知的标准方法以单克隆抗体或多克隆抗体测量多肽的分泌或细胞相关水平，这可用来检索抑制或增强在适当操纵的细胞或组织中产生多肽的化合物。然后，测定多肽与测试化合物之间的结合复合物的形成。
本发明包括的测定法是在过表达或切除检测中涉及使用本发明的基因和多肽的方法。这些测定法涉及细胞内这些基因/多肽水平的操纵，以及该操纵事件对被操纵细胞生理的影响的评估。例如，这些实验揭示与特定基因/多肽有关联的信号传导和代谢通道的详细信息，产生关于与待研究多肽相互作用的多肽同一性的信息，并提供调节相关基因和蛋白质的方法的思路。
可采用另一种药物筛选技术，它高通量筛选对感兴趣的多肽具有适当结合亲和力的化合物(参见国际专利申请WO84/03564)。在这一方法中，在固相基质上合成大量不同的小测试化合物，它们再与本发明的多肽反应，洗涤。一种固定多肽的方法是用非中和抗体。以本领域公知的方法可检测结合多肽。纯化的多肽也可直接铺在板上，用于上述药物筛选技术中。
通过本领域公知的标准受体结合技术，例如配体结合和交联测定法，本发明的多肽可用来鉴定膜结合或可溶性受体，在配体结合和交联测定法中，多肽用放射性同位素标记，以化学方法修饰，或者与有利于它的检测或纯化的肽序列融合，并与推定受体来源(例如，细胞组合物、细胞膜、细胞上清液、组织抽提物或体液)一起培育。结合的效率可用生物物理技术，如表面胞质基因共振和光谱测定。结合测定法用于纯化和克隆受体，但也可鉴定多肽的激动剂和拮抗剂，这些激动剂和拮抗剂与其受体竞争结合多肽。进行筛选测定的标准方法已为本领域所熟悉。
本发明还包括一种筛选试剂盒，它可用在鉴定上述的激动剂、拮抗剂、配体、受体、基质、酶的方法中。
本发明包括激动剂、拮抗剂、配体、受体、基质和酶以及通过上述方法发现的能调节本发明的多肽的活性或抗原性的其他化合物。
本发明还提供一些药物组合物，其含有本发明的多肽、核酸、配体或化合物，以及合适的药物载体。这些组合物适合用作治疗或诊断试剂、疫苗、或其他免疫原性组合物，下文将作详细说明。
根据本文的术语，当组合物中以X+Y的总重量计时至少85％是X，认为含有多肽、核酸、配体或化合物[X]的组合物“基本上不含”杂质[本文以Y表示]。优选X占组合物中X+Y总重量的至少约90％，更好至少约95％、98％或者甚至99％(重量)。
药物组合物最好含有治疗有效量的本发明的多肽、核酸分子、配体或化合物。本文所用的术语“治疗有效量”指需要治疗、缓解、或预防目标疾病或病征，或者具有可检测的治疗或预防作用的治疗药剂的用量。任何一种化合物的有效治疗剂量最初可在例如肿瘤细胞的细胞培养测定法、或者动物模型通常是小鼠、兔、狗、或猪模型中估计。动物模型还可用来确定适当的浓度范围和给药途径。有了这些信息，就可以确定给予人的有用给药剂量和途径。
人受试者的准确有效剂量取决于疾病状态的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应灵敏度，以及治疗耐受性/反应。该用量可以常规实验测定，由医生判断。通常，有效剂量从0.01毫克/千克至50毫克/千克，优选从0.05毫克/千克至10毫克/千克。组合物可单独给予患者，或者与其他药剂、药物或激素结合给予。
一种药物组合物还可含有药学上可接受的载体，作为治疗试剂给予。这些载体包括抗体和其他多肽、基因和其他治疗试剂，例如脂质体，只要该载体本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，而且载体的给予不会产生过高毒性。合适的载体可以是大的代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。
还可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)对药学上可接受的载体作了详尽讨论。
治疗组合物中药学上可接受的载体也可含有水、盐水、甘油和乙醇等液体。另外，这些组合物还可含有辅助物质，例如，湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。这些载体能将药物组合物配制成供患者摄取的片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等等。
一旦配成以后，本发明的组合物可直接给予受试者。接受治疗的受试者可以是动物；特别是人受试者。
本发明使用的药物组合物可以任何途径给予，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、脊髓内、鞘内、心室内、透皮或经皮(例如参见WO98/20734)、皮下、腹腔内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。本发明的药物组合物也可用基因枪或无针注射器给予。一般将治疗组合物制成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制成适合注射前溶解或悬浮于液体介质中的固体形式。
通过注射可将组合物直接输送到皮下、腹腔内、静脉内或肌内，或者送到组织间质空间。组合物也可施加在病变部位。剂量治疗可分单剂或多剂。
如果本发明的多肽的活性在一特定疾病状态中是过度的，有多种方法可采用。其中一种方法包括把上述抑制剂化合物(拮抗剂)与药学上可接受的载体一起给予受试者，抑制剂化合物的量为通过例如阻断配体、基质、酶、受体的结合，或者抑制第二信号而抑制多肽的功能，从而缓解异常状况的有效量。这些拮抗剂优选是抗体。这些抗体最好是嵌合抗体和/或人源化抗体，如前所述，可使它们的免疫原性减至最低。
另一种方法是给予保留了对上述配体、基质、酶、受体有结合亲和力的多肽的可溶形式。通常，多肽以保留相关部分的片段的形式给予。
在一替换方法中，应用表达封闭技术，例如用内部产生或另外给予的反义核酸分子(如上所述)，抑制编码多肽的基因表达。设计编码多肽的基因的调控区、5’区或调节区(信号序列、启动子、增强子和内含子)的互补序列或反义核酸分子(DNA、RNA或PNA)，可获得对基因表达的修饰。类似地，用“三螺旋体”碱基成对方法可实现抑制。三螺旋体成对是有用的，这是因为它能引起抑制双螺旋体充分打开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力。应用三螺旋DNA的治疗取得最新进展，在文献中已有描述(Gee，J.E.等，(1994)In：Huber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，NY)。互补序列或反义分子还可设计成防止转录子与核糖体结合，从而封闭mRNA的翻译。这些寡核苷酸可给予，或在体内表达中原位产生。
另外，使用对它的编码mRNA序列有特异性的核糖体，可防止表达本发明的多肽。核糖体是具有催化活性的天然或合成RNA(例如，参见Usman，N等，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可设计合成核糖体，在选定位置上特异性切割mRNA，从而防止mRNA翻译为功能多肽。核糖体通常在RNA分子中找到，可用天然的磷酸核糖骨架和天然碱基合成。另一个选择是，核糖体可用非天然骨架，例如2’-氧-甲基RNA合成，保护核糖核酸酶免于降解，还可含有经修饰的碱基。
可对RNA分子进行修饰，以增加胞内稳定性和延长半衰期。可能的修饰包括但不限于，在分子的5’和/或3’末端加入侧翼序列或在分子的骨架内使用硫代磷酸或2’-氧-甲基而不用磷酸二酯酶连锁。这一概念对于产生PNA是固有的，可延伸至所有这些分子中，方法是包含非常规碱基，例如肌苷、核苷(queosine)和高修饰鸟苷(butosine)以及乙酰基-、甲基-、硫代-、及类似修饰形式的腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷，它们不易被内源性内切核酸酶识别。
有一些方法治疗与本发明的多肽表达不足够或其活性相关的异常征状。其中一种方法包括把治疗有效量的能激活该多肽的化合物，即上述激动剂给予患者，缓解异常征状。另外，也可以给予治疗量的多肽与适当药物载体，以恢复多肽的相关生理平衡。
基因疗法可用来在受试者体内通过相关细胞内源性产生多肽。基因疗法以修正治疗基因置换缺陷基因，永久治疗多肽的不适当产生。
本发明的基因疗法可发生于体内或体外。体外基因疗法需要分离和纯化患者的细胞，导入治疗基因，以及将经基因改造的细胞再引入患者体内。与之相反，体内基因疗法不需要分离和纯化患者的细胞。
治疗基因往往被“包装”以方便给予患者。基因输送赋形剂可以是非病毒，例如脂质体，或者复制缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992))所述的腺病毒，或者Muzyczka，N.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美国专利US5,252,479所述的腺伴随病毒(AVV)载体。例如，可对编码本发明的多肽的核酸分子进行改造，以在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达。然后分离这种表达构造体，导入用含有编码多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞内，使该包装细胞现在能产生含有感兴趣的基因的感染病毒粒子。将这些生产细胞给予患者，以体内改造细胞和体内表达多肽(参见“Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches”(纳入作为文献参考)，Human MolecularGenetics(1996)，T Strachan和AP Read，BIOS Scientific Publishers Ltd)。
另一种方法是给予“裸露DNA”，其中治疗基因直接注入血流或肌肉组织。
对于本发明的多肽或核酸分子是引起疾病的试剂的情形，本发明提出它们可用在疫苗中，产生针对疾病引发剂的抗体。在上述多肽或核酸分子被上调的情形下，疫苗的研制可涉及产生抗这些试剂的抗体或T细胞(描述见WO00/29428)。
本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或者是治疗性的(即治疗感染后疾病)。这些疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白质或核酸，通常与前述药学上可接受的载体结合，包括本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的任何载体。这些载体还可用作免疫刺激剂(“辅助剂”)。此外，抗原或免疫原可与细菌类毒素例如来自白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌和其他致病原的类毒素偶联。
因为多肽可以在胃内分解，所以含有多肽的疫苗最好肠胃外给予(例如皮下、肌内、静脉内、或皮内注射)。适合肠胃外给予的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与接受者的血液等渗的溶解物，以及无菌水悬浮液或非水悬浮液，其可包括悬浮剂或增稠剂。
本发明的疫苗制剂可制成单剂或多剂容器。例如，密封安瓿和小瓶可储存于冻干条件下，只要在使用之前加入无菌液体载体。剂量取决于疫苗的比活性，通过常规实施可轻易测定。
如国际专利申请WO 98/55607所述，与本发明的多肽结合的抗体的基因传送也会受影响。快速注射技术(例如访问www.powderject.com)可用来配制疫苗。
国际专利申请WO 00/29428描述了很多适当的接种疫苗方法和疫苗传送系统。
本发明还涉及本发明的核酸分子作为诊断试剂的应用。检测以本发明的核酸分子为特点，并与功能障碍相关的基因的突变形式提供一种诊断工具，它可加入或限定因为基因的表达不足、过度表达或者空间或时间表达发生改变而引起的疾病或疾病易感性的诊断。通过各种技术可在DNA水平上检测携带基因突变的个体。
用于诊断的核酸分子可从受试者的细胞中获得，例如从血液、尿、唾液、组织活体或尸体材料中获得。基因组DNA可直接用作检测，或者在分析前用PCR、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或者其他扩增技术酶解扩增(参见Saiki等，Nature，324，163-166(1986)；Bej等，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。
在一实施例中，本发明该方面提供一种诊断患者疾病的方法，该方法包括评估编码本发明的多肽的天然基因的表达水平，并将所述表达水平与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。这种方法包括以下步骤：
(a)在允许本发明的核酸分子和核酸探针形成杂交复合物的严谨条件下，将患者的组织样品与探针接触；
(b)在与步骤(a)相同的条件下，将对照样品与所述探针接触；
(c)以及检测所述样品中是否存在杂交复合物。
其中，检测到患者样品中杂交复合物的水平与对照样品中杂交复合物不同，表示患病。
本发明另一方面包括一种诊断方法，其包括以下步骤：
(a)从待测试疾病的患者中获得组织样品；
(b)从所述组织样品中分离本发明的核酸分子；
(c)通过检测与疾病相关的核酸分子是否存在突变，诊断患者疾病。
为了帮助上述方法检测核酸分子，可包括扩增步骤，例如利用PCR技术。
将扩增产物大小的变化与正常基因型比较，可检测到缺失或插入。将扩增DNA与本发明的标记RNA，或者与本发明的标记反义DNA序列杂交，可以鉴定点突变。以核糖核酸酶消化或评估熔点温度的差异，发现完全匹配的序列与错配的双链体截然不同。患者是否存在突变可这样检测：将DNA与在严谨条件下和该DNA杂交的核酸探针接触，形成杂交双链分子，该杂交双链分子在对应于与疾病相关的突变的任何部分具有核酸探针链的未杂交部分；检测探针链的未杂交部分是否存在即表示该DNA链的对应部分存在或不存在与疾病相关的突变。这样的诊断特别适用于产前，甚至新生儿测试。
参考基因与“突变体”基因之间的点突变和其他序列差异可通过公知技术鉴定，例如，直接DNA测序或单链构象多态性(参见Orita等，Genomics，5，874-879(1989))。例如，测序引物可与改良PCR产生的双链PCR产物或单链模板分子一起使用。以使用放射性标记核苷酸的常规程序或者通过使用萤光标记的自动测序程序，进行序列测定。克隆DNA节段也可用作检测特异性DNA片段的探针。当与PCR结合时该方法的灵敏度大大提高。另外，点突变和其他序列变异，例如多态性，可参照上述方法检测，例如使用等位基因特异性寡核苷酸对不同于单个核苷酸的序列进行PCR扩增。
在变性试剂存在或不存在下改变DNA片段的凝胶电泳迁移率，或直接对DNA测序都可以检测到DNA序列的差异(例如Myers等，Science(1985)230：1242))。特定位置的序列变化可通过核酸酶保护测定法揭示，例如RNase和S1保护，或者化学切割方法发现(Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)85：4397-4401)。
除了常规凝胶电泳和DNA序列测定之外，微小缺失、非整倍性、易位、倒位等突变也可用原位分析加以检测(例如，参见Keller等，DNA Probes，2ndEd.，Stockton Press，New York，N.Y.，USA(1993))，换言之，可分析细胞内DNA或RNA序列的突变，无需分离或固定在膜上。萤光原位杂交(FISH)是目前最常用的方法，就FISH的综述已有很多报导(例如，参见Trachuck等，Science，250，559-562(1990)，and Trask et al.，Trends，Genet.，7，149-154(1991))。
本发明另一实施例中，构建包括本发明核酸分子的寡核苷酸探针阵列，对遗传变体、突变和多态性进行有效筛选。阵列技术方法是公知的，获得广泛应用，可用来解释分子遗传方面的各种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(例如，参见M.Chee等，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在一实施例中，按照PCT申请WO95/11995(Chee等)；Lockhart，D.J.等((1996)Nat.Biotech.14：1675-1680))；以及Schena，M.等 ((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619))描述的方法制作和使用阵列。寡核苷酸对的范围从2至1,000,000以上。应用光引导化学法在基质的指定区域上合成低聚物。基质可以是纸、尼龙或其他种类的膜、过滤器、晶片、玻璃载片或其他任何合适的固相支持物。另外，参照PCT申请WO95/251116(Baldeschweiler等)中描述的方法，使用化学偶联程序和喷墨应用装置可在基质表面上合成寡核苷酸。另一方面，利用真空系统、热学、紫外线、机械或化学结合程序，以类似斑点(或狭线)印迹的“栅格”阵列将cDNA片段或寡核苷酸设置和连接于基质表面上。阵列，例如上述的那些阵列，可用人手或现有设备(斑点印迹或狭线印迹装置)、材料(任何合适的固相支持物)和机器(包括自动仪器)制作，它们可含有8、24、96、384、1536或6144个寡核苷酸，或者2至1,000,000以上之间的任何数目，该数目能够使阵列有效地应用于市场上买到的仪器中。
除了上述讨论的方法之外，通过包括测定受试者样品中多肽或mRNA水平异常增加或减少的方法可以诊断疾病。采用本领域公知的任何方法可以在RNA水平上测定表达减少或增加，以便对聚核苷酸作定量分析，例如核酸扩增，如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹和其他杂交方法。
可用来确定从宿主获得的样品中本发明的多肽水平的测定技术已为本领域技术人员所知，在上文提到的一些文献中已有讨论(包括放射性免疫测定法、竞争结合测定法、Western印迹分析和ELISA试验)。本发明该方面提供一种诊断方法，其包括以下步骤：(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将上述一种配体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。
测定多肽水平的方案，例如ELISA、RIA和FACS还可为诊断多肽表达的变化或异常水平提供基础。在适合形成复合物的条件下将正常哺乳动物受试者，优选是人的体液或细胞抽提物与针对多肽的抗体结合，确立多肽表达的正常或标准值。标准复合物形成的数量可用各种方法定量测定，例如光度计装置。
特异性结合本发明的多肽的抗体可用来诊断以多肽表达为特点的征状或疾病，或者用在测定法中监测以本发明的多肽、核酸分子、配体和其他化合物治疗的患者。用于诊断目的的抗体可以用上述关于治疗所述的相同方法制成。对多肽的诊断分析包括利用抗体和标记检测人体液或者细胞或组织抽提物的多肽的方法。使用的多肽可以修饰或不作修饰，将它们与报导分子共价或非共价结合加上标记。可以应用本领域已知的各种各样报导分子，其中一些已在上文作了描述。
将在受试者活体组织获得的对照样品和患病样品中表达的多肽数量与标准值作比较。标准值与受试者值之间的偏差建立诊断疾病的参数。可用诊断分析区分多肽不存在、存在和过度表达，并监测治疗干预期间多肽水平的调节。这些分析也可用来评估动物研究、临床试验或个体患者的监测治疗中特定治疗方案的疗效。
本发明的一种诊断试剂盒可包括：
(a)本发明的核酸分子；
(b)本发明的多肽；或者
(c)本发明的配体。
本发明一方面提供一种诊断试剂盒，该试剂盒可包括第一容器，其含有在严谨条件下与本发明的核酸分子杂交的核酸探针；第二容器，其含有用来扩增该核酸分子的引物；以及该探针和引物的使用说明书，方便诊断疾病。这种试剂盒还可包括装有消化未杂交RNA的试剂的第三容器。
本发明另一方面也提供一种诊断试剂盒，该试剂盒可包括核酸分子阵列，其中至少一个核酸分子是本发明的核酸分子。
为了检测本发明的多肽，一种诊断试剂盒可包括一或多种与本发明的多肽结合的抗体；一种用来检测该抗体与多肽之间结合反应的试剂。
这些试剂盒都可用于诊断疾病或疾病易感性，特别是细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统疾病、发育障碍、代谢性疾病、感染和其他病理病征。这些疾病或障碍优选涉及胱氨酸结折迭细胞因子，更好是涉及DAN亚家族成员的异常水平。这些疾病或障碍也可以涉及胱氨酸结折迭细胞因子，更好是涉及DAN亚家族成员的配体的异常水平。例如，这些疾病或障碍可以涉及TGFβ超家族成员的异常水平。具体地说，这些障碍或疾病可以涉及BMP，例如神经病变、肾病，如糖尿病性神经病变，癌症、伤口愈合、纤维变性、骨质减少、骨质疏松、骨折和硬化性狭窄。
以下，将通过举例说明，特别是结合INSP002多肽对本发明的各个方面和实施例进行描述。
应明白，在不脱离本发明的范围的情况下可以作出改型。
附图说明
图1：用组合的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4多肽序列通过BLAST在NCBI非冗余数据库中击中的结果。
图2：在组合的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO：4多肽序列与最接近相关序列智人cerberus相关性1蛋白质之间通过BLAST所产生的比对。
图3：2002年11月26日就INSP002经BLAST在NCBI-nr与NCBI-nt数据库中获得的上部4个击中。
图4：INSP002与AK095926.1的比对。
图5：INSP002与IMAGE：4558384的比对。
图6：INSP002核苷酸序列与翻译。
图7：INSP002部分克隆序列与翻译。
图8：部分PCRII-TOPO-INSP002的图谱。
图9：INSP002预测序列(上部)与部分克隆序列(下部)的比对，其中图9a是核苷酸序列比对，图9b是蛋白质序列比对。
图10：Image：4558384的cDNA插入片段的核苷酸序列和翻译。
图11：INSP002预测序列(上部)与IMAGE：4558384(BC025333.1(下部)的序列比对，其中图11a是核苷酸序列，图11b是蛋白质序列。
图12：通过PCR技术在Image：4558384中产生的INSP002V的核苷酸序列和翻译。
图13：pCR4blunt-TOPO-INSP002V的图谱。
图14：INSP002预测序列(上部)与INSP002V变体序列(下部)之间的比对，其中图14a是核苷酸序列，图14b是蛋白质序列。
图15：表达质粒pEAK12d的图谱。
图16：Gateway载体pDONR201的图谱。
图17：pEAK12d-INSP002-V-6HIS的图谱。
图18：从心脏克隆的全长INSP002的序列。
图19：编码从心脏克隆的全长INSP002的质粒pCR4-bluntTOPO-INSP002FL的图谱。
具体实施方式
实施例1 INSP002蛋白质与序列数据库的蛋白质的比对
结合SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4产生的多肽序列表示INSP002的连续外显子的翻译，该序列可用作针对NCBI非冗余序列数据库的BLAST查询序列。上部10对匹配包括标注为cerberus或cerberus相关蛋白质的序列，这些蛋白质是胱氨酸结家族成员，它们全部与查询序列比对的E值都很高(2E-10至3E-06)(图1)。图2所示为INSP002查询序列与智人cerberus相关性1蛋白质序列之间的序列比对(Feng等，2001)。
结合SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4产生的多肽序列表示INSP002的连续外显子的翻译，将该序列输入SignalP V2.0.b2(Nielsen等，1997 Protein Eng1：1-6)。程序预计多肽序列有一信号肽。发现该信号肽最可能的切割位点在结合SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4产生的INSP002多肽序列的残基22和23之间。
编码多肽SEQ ID NO：2外显子1的核苷酸序列SEQ ID NO：1包括5’非翻译区(5’UTR)和蛋白质编码序列(CDS)。CDS起点是核苷酸152。
实施例2用BLAST重复检索
以结合SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4产生的SEQ ID NO：6多肽序列，在2002年11月26日对NCBI-nr和NCBI-nt数据库进行BLAST检索。图3所示为检索确定的上部四个击中。
检索发现，INSP002多肽与从心脏克隆并在2002年7月16日保藏的假定的蛋白质FLJ38607氨基酸水平以及对应核苷酸序列AK095926相同。图4所示为INSP002查询序列与AK095926 cDNA克隆衍生的蛋白质的比对。
AK095926的存在从实验上证实了对INSP002所预测的外显子1和外显子2剪接接点。
  450    .    :   .   :    .   :   .   :   .    :
  451 GATGTGTAAGGCTGTGCCCTTCGTTCAG       GTGTTCTCCCGGC
      ||||||||||||||||||||||||||||>>>...>>>|||||||||||||
10225 GATGTGTAAGGCTGTGCCCTTCGTTCAGGTG...CAGGTGTTCTCCCGGC
      外显子1                     外显子2
  500    .    :   .   :    .   :   .    :   .   :
  492 CCGGCTGCTCAGCCATACGCCTCCGAAATCATCTGTGCTTTGGTCATTGC
      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
13670 CCGGCTGCTCAGCCATACGCCTCCGAAATCATCTGTGCTTTGGTCATTGC
检索还发现，部分INSP002与2002年3月8日保藏的IMAGE克隆4558384(BC025333.1)相同。图5所示为部分INSP002查询序列与IMAGE克隆4558384的比对。
实施例3 INSP002的cDNA的部分克隆
(i)cDNA文库
人cDNA文库(在噬菌体λ载体中)购自Stratagene或Clontech，或者在Serono Pharmaceutical Research Institute按照生产商(Stratagene)的方案在ZAP或λGT10载体中制成。噬菌体λDNA按照生产商(Promega，Corporation，Madison WI.)的指示用Wizard Lambda Preps DNA纯化系统在小规模的感染大肠杆菌宿主菌培养基中制备。所用的文库和宿主菌清单列于表I中。
(ii)对噬菌体文库DNA的虚拟cDNA进行PCR扩增
应用基因特异性克隆引物(INSP002-CP1和INSP002-CP2，图6和表II)，获得编码INSP002的部分cDNA(图6)，作为159bp的PCR扩增产物(图7)。用MJ Research DNA Engine在50微升终体积中进行PCR扩增，该终体积含有1X AmpliTaqTM缓冲液、200μM dNTPs、克隆引物各50pmole、2.5个单位AmpliTaqTM(Perkin Elmer)和噬菌体文库DNA各100ng，程序如下：94℃，1分钟；94℃循环40次，1分钟，x℃，以及y分钟，72℃(其中x是最低温度-5℃，y＝1分钟/kb产物)；然后，72℃循环1次，7分钟，4℃持续循环。
在1X TAE缓冲液(Invitrogen)中的0.8％琼脂糖凝胶上看到扩增产物，用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)从凝胶纯化得到以预定分子量迁移的PCR产物。PCR产物在50微升无菌水中洗脱出来，或者直接亚克隆或者储存于-20℃。
(iii)用于PCR的基因特异性克隆引物
设计长度为18至25个碱基的PCR引物对，以便运用引物设计软件(Scientific & Educational Software，PO Box 72045，Durham，NC 27722-2045，USA)扩增虚拟cDNA的全长序列。将PCR引物优化至温度接近55±10℃，GC含量为40-60％。选择对靶序列INSP002有高度选择性的引物(对其他模板几乎没有不是非特异性引发)。
(iv)PCR产物的亚克隆
用购自Invitrogen Corporation的TOPT TA克隆试剂盒(cat.No.分别是K4600-01和K4575-01)，在生产商指定的条件下将PCR产物亚克隆到拓朴异构酶I修饰克隆载体(pCR II TOPO)中。简言之，从人胎肾文库(文库12)扩增中取4微升凝胶纯化的PCR产物，室温下与1微升TOPO载体和1微升盐溶液培养15分钟。再按以下方法将反应混合物转化到大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen)中：50微升One Shot TOP10细胞等分试样在冰上解冻，加入20微升TOPO反应物。该混合物冰上培育15分钟，再在42℃培育热激刚好30秒。将样品送回冰上，加入250微升温热SOC培养基(室温)。样品在37℃摇动培育(220rpm)1小时。然后，将转化混合物铺在含有氨比西林(100μg/ml)的L-broth(LB)板上，37℃培育过夜。通过集落PCR技术鉴定含有cDNA插入片段的氨比西林抗性集落。
(v)集落PCR
用无菌牙签将集落接种在50微升无菌水中。然后，按照上述方法，将10微升接种物等分试样在20微升总反应体积中进行PCR扩增，但引物对用SP6和T7。循环条件如下：94℃，2分钟；94℃循环30次，30秒，47℃，30秒，以及72℃1分钟；72℃循环1次，7分钟。作进一步分析之前将样品保持在4℃(持续循环)。
在1X TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上分析PCR反应产物。使产生预期PCR产物大小(由于多个克隆位点(MCS)而得到159bp cDNA+187bp)的集落生长过夜，生长条件：温度为37℃，5毫升含有氨比西林(100μg/ml)的L-broth(LB)板，37℃220rpm摇动。
(vi)质粒DNA的制备和测序
按照生产商的指示，用Qiaprep Turbo 9600自动化系统(Qiagen)或WizardPlus SV Minipreps试剂盒(Promega cat.no.1460)在5毫升培养基中制备小量制备质粒DNA。将质粒DNA在100微升无菌水中洗脱。用Eppendorf BO光度计测定DNA浓度。按照生产商的指示，用BigDyeTerminator系统(AppliedBiosystems cat.no.4390246)以T7和SP6为引物对质粒DNA(200-500ng)进行DNA测序。测序反应用Dye-Ex柱(Qiagen)或者Montage SEQ 968净化板(Millipore cat.no.LSKS09624)纯化，再用Applied Biosystems 3700测序仪分析。
(vii)含有INSP002的cDNA文库的鉴定
在皮层、结肠、胎肺和胎肾cDNA文库(文库8、9、11和12)中鉴定用INSP002-CP1和INSP002-CP2获得并以正确大小(159bp)迁移的PCR产物。图7所示为pCRII-TOPO载体中克隆的PCR产物的序列，图8所示为质粒(质粒ID13422)的图谱。克隆的部分cDNA是INSP002外显子2的一部分，可参见图9a所示的预测INSP002核苷酸序列和克隆的部分核苷酸序列的比对，以及图9b所示的预测INSP002蛋白质序列和克隆的部分核苷酸序列的比对。
实施例4从Image：4558384中产生INSP002全编码序列
眼癌的Image克隆4558384(在质粒pOTB7中)购自Resgen(InvitrogenCorporation)。将4558384大肠杆菌穿刺并分散在含有氨比西林(100μg/ml)的LB板上，37℃生长过夜。使单氨比西林抗性克隆接种在5毫升含氨比西林(100μg/ml)的LB中，37℃ 220rpm摇动培育一晚。制备小量制备质粒DNA，参照实施例3(vi)所述，用SP6、T7、M13F、INSP002-CP1和INSP002-CP2引物测序。
插入片段的序列见图10。Image 4558384 cDNA与INSP002的核苷酸和推定氨基酸序列的比对见图11。Image 4558384 cDNA似乎是INSP002的剪接变体。它含有一个87bp插入片段，与INSP002预测序列相比，引入了一个移码和未成熟终止密码子。另外，3’未翻译序列还含有表示cDNA的基因组DNA污染的Alu复制。Image 4558384的外显子2和4等同于INSP002预测序列的外显子1和2。然而，Image 455838在INSP002预测序列的外显子1和2之间插入了一个附加外显子。该附加外显子编码防止胱氨酸结结构域翻译的未成熟终止密码子。Image 4558384的剪接边界如下：
  500    .    :   .   :   .   :    .   :   .    :
  492 GGCTGTGCCCTTCGTTCAG       ACACGGGAGTCTCGCTATGTTG
      |||||||||||||||||||>>>...>>>||||||||||||||||||||||
10234 GGCTGTGCCCTTCGTTCAGGTG...TAGACACGGGAGTCTCGCTATGTTG
     外显子2                   外显子3
  550    .    :   .   :    .   :   .    :   .   :
  533 CCCAAGCTAGTCTTGAGCTTCTGGCCTCAAGCAATCCTCCCACCTCAGCC
      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10741 CCCAAGCTAGTCTTGAGCTTCTGGCCTCAAGCAATCCTCCCACCTCAGCC
  600    .    :   .   :    .   :   .    :   .   :
                                                  外显子4
设计PCR策略，除去基因组DNA以产生编码INSP002全编码序列(ORF)的全长cDNA。设计PCR引物扩增位于Image克隆的87bp插入片段侧翼的INSP002的5’端(上游)和3’端(下游)。上游序列的反向引物和下游序列的正向引物在它们的3’和5’端分别含有互补序列，产生重迭端，这样，可以将每次反应的PCR产物一起混合和退火，从而可以用嵌套上游正向引物和嵌套下游反向引物在第三次PCR反应中扩增全长cDNA。
第一次PCR反应扩增所含的INSP002 5’端(87bp插入片段的上游)，50微升终体积含有：0.5μl 10X Platinum Pfx缓冲液、1.5μl dNTPs(10mM)、1μl硫酸镁(50mM)、1.5μl INSP002V-5’-F(10μM，正向引物)、1.5μlINSP002V-5’-R(10μM，反向引物)、0.75μl Platinum Pfx和135ng IMAGE：4558384质粒cDNA。扩增条件是：94℃循环1次2分钟，94℃循环30次15秒，68℃1分钟；68℃循环1次7分钟。在同样条件下进行第二次PCR反应，扩增INSP002 3’端(87bp插入片段的下游)，但引物为：正向：INSP002V-3’-F，反向：INSP002V-3’-R。
在1X TAE缓冲液(Invitrogen)中的0.8％琼脂糖凝胶上看到扩增产物，用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)从凝胶纯化得到以预定分子量(第一次和第二次PCR分别是520bp和448bp)迁移的PCR产物。PCR产物在50微升无菌水中洗脱，用Eppendorf BO光度计测定DNA浓度。各取50ng纯化PCR产物作为嵌套式PCR的模板，反应在50微升体积中进行，含有：0.5μl 10X Platinum Pfx缓冲液、1.5μl dNTPs(10mM)、1μl 1硫酸镁(50mM)、1.5μl INSP002V-5’nest-F(10μM，嵌套正向引物)、1.5μl INSP002V-3’nest-F(10μM，嵌套反向引物)。反应混合物在95℃加热3分钟，加入0.75μl Platinum Pfx聚合酶。扩增条件如下：94℃循环1次2分钟，94℃循环30次15秒，61℃30秒和68℃1分钟；68℃循环1次7分钟。用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)从凝胶纯化得到以预定分子量719bp迁移的PCR产物，在50微升无菌水中洗脱。参照1.4节所述，取4μl纯化PCR产物与pCR4 blunt TOPO载体连接。参照1.5节所述，通过集落PCR测试插入片段的氨比西林抗性集落，引物用T3和T7。获得预定PCR产物大小(由于多克隆位点而得到719bp+106bp)的集落在5毫升含氨比西林(100μg/ml)的LB中生长，37℃ 220rpm摇动培育一晚。从5毫升培养基中制备小量制备质粒DNA，参照1.6节所述，用T3和T7引物测序。其中一个所得克隆的序列和对应的质粒图谱(pCR4 bluntTOPO-INSP002V)分别示于图12和图13中。克隆序列的翻译显示，相对于预测的INSP002序列，INSP002V含有2个氨基酸缺失(V107和Q108)和一个氨基酸取代(F110L)。图14所示为INSP002预测和INSP002V的核苷酸和氨基酸序列的比对。
当与INSP002预测序列相比时，外显子1和2之间的剪接接点使用6bp上游供体位点。这导致2个氨基酸(ValGlu)缺失。使用的剪接受体与INSP002预测序列所用的相同，但受体之后发生2个测序误差。这导致1个氨基酸取代(Phe->Leu)。
实施例5在HEK293/EBNA细胞中表达INSP002V的质粒的构建
通过DNA测序鉴定一个pCR4 blunt-TOPO克隆含有INSP002V全编码序列(ORF，可读框)(图13)，再运用GatewayTM克隆方法(Invitrogen)以该克隆将插入片段亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pEAK12d(图15)中。
(i)构建Gateway相容的与符合读框的6HIS标记序列融合的IPAAA44548ORF
Gateway克隆方法的第一阶段涉及二步PCR反应，该反应产生在5’末端有attB1重组位点和Kozak序列，在3’末端有用编码符合读框的6组氨酸(6HIS)标记、终止密码子和attB2重组位点(Gateway相容的cDNA)的INSP002VORF。第一次PCR反应(在50微升终体积中)含有：25ng pCR4 blunt-TOPO-INSP002V(质粒13075，图13)、1.5μl dNTPs(10mM)、5μl 10X Pfx聚合酶缓冲液、1.0μl硫酸镁(50mM)、基因特异性引物各0.5μl(100μM)(INSP002V-EX1和INSP002V EX2)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。在95℃首次变性步骤进行PCR反应2分钟，然后94℃循环12次15秒，以及68℃30秒。按照生产商的指示，用Wizard PCR prep DNA纯化系统(Promega)直接在反应混合物中纯化PCR产物。第二次PCR反应(在50微升终体积中)含有：10μl纯化PCR产物、1.5μl dNTPs(10mM)、1.0μl硫酸镁(50mM)、5μl 10X Pfx聚合酶缓冲液、Gateway转化引物各0.5μl(100μM)(正向引物：GCP，反向引物：GCP)和0.5μl of Platinum Pfx DNA聚合酶。第二次PCR反应的条件是：95℃1分钟；94℃循环4次15秒；45℃30秒以及68℃3.5分钟；94℃循环25次15秒；55℃30秒和68℃3.5分钟。参照上述方法纯化PCR产物。
(ii)Gateway相容的INSP002V ORF亚克隆到Gateway入门载体pDONR201和表达载体pEAK12d
Gateway克隆方法的第二阶段按如下方法将Gateway修饰的PCR产物亚克隆到Gateway入门载体pDONR201(Invitrogen，图16)：将5μl纯化的PCR产物与1.5μl pDONR201载体(0.1μg/μl)、2μl BP缓冲液和1.5μl BP克隆酶混合物在室温培育1小时。加入蛋白酶K(2μg)终止反应，37℃培育多10分钟。取该反应的一等分试样(2μl)，用Biorad Gene Pulser电穿孔仪通过电穿孔转化到大肠杆菌DH10B细胞中。将转化物铺在LB-卡那霉素板上。用WizardPlus SV Minipreps试剂盒(Promega cat.no.1460)在1-4个所得集落中制备小量制备质粒DNA，在重组反应中使用1.5μl该质粒洗脱液，该反应的终体积为10毫升，含有1.5μl pEAK12d载体(图9)(0.1μg/μl)、2μl LR缓冲液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)。混合物室温培育1小时，加入蛋白酶K(2μg)终止培育，再在37℃培育10分钟。取该反应的一等分试样(1μl)，通过电穿孔技术转化到大肠杆菌DH10B细胞中。
参照上述方法，进行集落PCR鉴定含有正确插入片段的克隆，但PCR的引物用pEAK12d(正向引物：pEAK12d F，反向引物：pEAK12d R)。用QiaprepTurbo 9600自动化系统(Qiagen)或人手以Wizard Plus SV Minipreps试剂盒(Promega)在含有正确插入片段的克隆中分离出小量制备质粒DNA，并用正向引物pEAK12d F和反向引物pEAK12d R确认序列。
从500毫升序列已被确认的克隆培养基中制备用氯化铯梯度纯化的质粒pEAK12d-INSP002V-6HIS(质粒ID号：13227，图17)的大量制备DNA(Sambrook J.等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，重悬于1μg/μl无菌水中，-20℃储存。
(iii)表达质粒pEAK12d的构建
载体pEAK12d是哺乳动物细胞表达载体pEAK12的Gateway克隆系统相容译本(购自Edge Biosystems)，其中感兴趣的cDNA在人EF1α启动子的控制下表达。pEAK12d按以下方法产生：
用限制酶HindIII和NotI消化pEAK12，用克列诺(New England Biolabs)平端，并用牛小肠碱性磷酸盐(Roche)脱磷酸。在脱磷酸作用之后，使载体与含有ccdB基因旁侧的AttR重组位点和氯霉素抗性的平端Gateway读框盒C(Gateway载体转化系统，Invitrogen cat no.11828-019)连接，再转化到大肠杆菌DB3.1细胞(可使含ccdB基因的载体增殖)中。用Wizard Plus SV Minipreps试剂盒(Promega)使小量制备DNA与几个所得集落分离，以AseI/EcoRI消化鉴定集落，得到670bp片段，这表示读框盒以正确方向插入。得到的质粒命名为pEAK12d(图15)。
实施例6 INSP002-SV-6HIS-V1(质粒号：13227)在哺乳动物细胞中的表达和纯化
表达埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎肾293细胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)保持在无Ex-cell VPRO血清的培养基悬浮液中(种子储备，维持培养基，JRH)。转染前16至20小时(第1天)，将细胞接种在2x T225烧瓶中(每个烧瓶50毫升，接种在含有2％FBS移种培养基(JRH)的DMEM/F12(1∶1)中，密度为2×105个细胞/毫升)。第二天(转染第0天)，用JetPEITM试剂进行转染(2μl/μg质粒DNA，PolyPlus-transfection转染试剂)。每个烧瓶中，113μg质粒(No.13227)与2.3μg GFP(萤光报导基因)共转染。再将转染混合物加入2x T225烧瓶中，37℃(5％CO2)培育6天。为了提高获得更多物质的可能性，我们在另外2个烧瓶中重复这一程序，总共得到200毫升。在第1和第6天定性萤光检验确认为阳性转染(Axiovert 10 Zeiss)。
在第6天(收获天)，将四个烧瓶中的上清液(200ml)合并，离心(4℃，400g)，并置于带有独特鉴定器的器皿内。
保留一等分试样(500μl)对6His标记蛋白作QC(内部生物加工QC)。
纯化方法
含有C端带6His标记的重组蛋白质的200毫升培养基样品用冷冻缓冲液A(50mM磷酸二氢钠；600mM氯化钠；8.7％(重量/体积)甘油，pH 7.5)稀释至终体积400毫升。样品经0.22μm无菌过滤器(Millipore，500毫升过滤装置)过滤，4℃储存于无菌方形培养瓶中(Nalgene)。
4℃下用连接到样品自动装载器(Labomatic)的VISION工作站(AppliedBiosystems)进行纯化。纯化程序由两个连续步骤组成：在装有镍离子的Poros20MC(Applied Biosystems)柱(4.6×50mm，0.83ml)上进行金属亲和力层析，再在Sephadex G-25培养(Amersham Pharmacia)柱(1.0×10cm)上进行凝胶过滤。
第一个层析步骤的金属亲和柱用30柱体积的EDTA溶液(100mMEDTA；1M NaCl；pH 8.0)再生，用15柱体积的100mM硫酸镍溶液洗涤重新装载镍离子，用10柱体积的缓冲液A和7柱体积的缓冲液B(50mM磷酸二氢钠；600mM氯化钠；8.7％(重量/体积)400mM甘油；咪唑，pH 7.5)洗涤，最后用15柱体积含15mM咪唑的缓冲液A平衡。200毫升样品用Labomatic的样品装载器转移到200毫升定量环，然后以10ml/min的速率装到镍金属亲和柱上。一旦要将400毫升样品装在柱上，重复转移和装载离子的步骤。装载离子的步骤结束后，柱再用12柱体积的缓冲液A和28柱体积含20mM咪唑的缓冲液A洗涤。在20mM咪唑洗涤期间，附着比较松散的污染蛋白质从柱中洗脱出来。重组的His标记蛋白质最后用10柱体积的缓冲液B洗脱，流速为2ml/min，洗脱出来的蛋白质收集得到1.6毫升馏分。
第二层析步骤的Sephadex G-25凝胶过滤柱用2毫升缓冲液D(1.137M氯化钠；2.7mM氯化钾；1.5mM磷酸二氢钾；8mM磷酸二氢钠；pH 7.2)再生，然后用4柱体积的缓冲液C(137mM氯化钠；2.7mM氯化钾；1.5mM磷酸二氢钾；8mM磷酸二氢钠；20％(重量/体积)甘油；pH 7.4)平衡。从镍柱洗脱出来的峰值馏分自动通过装在Sephadex G-25柱并连接到VISION的整合型样品装载器，蛋白质用缓冲液C洗脱，流速为2ml/min。去盐后样品回收得到2.2毫升馏分。该馏分经过0.22μm无菌离心过滤器(Millipore)过滤，冻存于-80℃。取样品的一等分试样以使用抗His抗体的SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝胶；Novex)的Western印迹进行分析。
在电穿孔之后，在4℃、290mA、1小时内将蛋白质从凝胶电转移到硝基纤维素膜上。室温下用5％在缓冲液E(137mM氯化钠；2.7mM氯化钾；1.5mM磷酸二氢钾；8mM磷酸二氢钠；0.1％Tween 20，pH 7.4)中的奶粉封闭纤维素膜1小时，再于4℃在2.5％在缓冲液E中的奶粉中与2种兔多克隆抗His抗体(G-18和H-15，各0.2μg/ml；Santa Cruz)混合物培养过夜。室温再培养1小时之后，膜用缓冲液E(3×10分钟)洗涤，再与结合HRP的第二抗兔抗体(DAKO，HRP 0399)室温培养2小时，第二抗体用含2.5％奶粉的缓冲液E稀释至1/3000。用缓冲液E(3×10分钟)洗涤之后，膜用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia)显影1分钟。然后，将膜与超膜(Hyperfilm)(AmershamPharmacia)接触，使超膜显影，对Western印迹影像作目测分析。
实施例7从心脏克隆全长INSP002
按如下方法从心脏cDNA克隆INSP002的全长编码序列
(i)心脏cDNA模板的产生
人心脏总RNA购自Clontech。用Agilent 2100生物分析仪分析RNA的质量和浓度。
对于cDNA的合成，12μl反应混合物含有：1μl oligo(dT)15引物(500μg/ml，Promega cat.no.C 1101)、2μg总RNA、1μl dNTPs(10mM)。混合物在65℃加热5分钟，然后置于冰上冷冻。加入下列试剂：4μl 5X first strandbuffer、2μl DTT(0.1M)、1μl RNAseOut重组核糖核酸酶抑制剂(40单位/微升，Promega，cat.no.N 2511)，加入1μl(200单位)Superscript II(Invitrogen cat.no.18064-014)之前在42℃培育2分钟。该混合物在42℃培育50分钟，再在70℃加热15分钟。为了去掉RNA模板，加入1μl(2单位)大肠杆菌核糖核酸酶H(Invitrogen cat.no.18021-014)，反应混合物再在37℃培育20分钟。用无菌水将终反应混合物稀释至200微升，-80℃储存。
(ii)通过PCR技术克隆INSP002的全长编码序列
在50微升PCR反应混合物中通过PCR技术从人心脏cDNA中克隆INSP002的全长编码序列，所述反应混合物含有5μl心脏cDNA、5μl 10X Pfx缓冲液、1.5μl dNTPs(10mM)、1μl硫酸镁(50mM)、1.5μl基因特异性正向引物INSP002-FL-F(10μM)、1.5μl基因特异性反向引物INSP002-FL-R(10μM)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。循环条件是：94℃循环4次4分钟；94℃循环35次15秒；55℃30秒；68℃1分钟；68℃循环1次10分钟，然后4℃保持循环。
在1X TAE缓冲液(Invitrogen)中的0.8％琼脂糖凝胶上看到扩增产物，用Qiagen MinElute凝胶抽提试剂盒(Qiagen)从凝胶纯化得到以预定分子量(589bp)迁移的PCR产物。PCR产物在50微升10mM Tris-HCl pH 8.5中洗脱，参照上述方法(1.4节)，亚克隆到pCR4 blunt TOPO载体中。含有正确大小插入片段(由于多克隆位点而得到589bp+106bp)的集落在5毫升含氨比西林(100μg/ml)的L-Broth(LB)中生长，37℃220rpm摇动培育一晚。按照生产商的指示，用Qiaprep Turbo 9600自动化系统(Qiagen)或Wizard Plus SVMinipreps试剂盒(Promega cat.no.1460)从5毫升培养基中制备小量制备质粒DNA，参照1.6节所述，用T3和T7引物(表III)对200-500ng小量制备DNA测序。图18所示为克隆序列。图19所示为获得的质粒pCR4-blunt TOPO-INSP002FL(质粒号：13514)的图谱。
                                    表I人cDNA文库
  文库 组织/细胞来源     载体     宿主菌   供应商   Cat.no.
    1 人胎儿脑     Zap II     XL1-Blue MRF′   Stratagene   936206
    2 人卵巢     GT10     LE392   Clontech   HL1098a
    3 人垂体     GT10     LE392   Clontech   HL1097a
    4 人胎盘     GT11     LE392   Clontech   HL1075b
    5 人睾丸     GT11     LE392   Clontech   HL1010b
    6 Human sustanta nigra     GT10     LE392   in house
    7 人胎儿脑     GT10     LE392   in house
    8 人脑皮质     GT10     LE392   in house
    9 人结肠     GT10     LE392   Clontech   HL1034a
    10 人胎儿脑     GT10     LE392   Clontech   HL1065a
    11 人胎儿肺     GT10     LE392   Clontech   HL1072a
    12 人胎儿肾     GT10     LE392   Clontech   HL1071a
    13 人胎儿肝脏     GT10     LE392   Clontech   HL1064a
    14 人骨髓     GT10     LE392   Clontech   HL1058a
    15 人外周血单核细胞     GT10     LE392   Clontech   HL1050a
    16 人胎盘     GT10     LE392   in house
    17 人SHSYSY     GT10     LE392   in house
    18 人U373细胞系     GT10     LE392   in house
    19 人CFPoc-1细胞系     UniZap     XL1-Blue MRF′   Stratagene   936206
    20 人视网膜     GT10     LE392   Clontech   HL1132a
    21 人膀胱     GT10     LE392   in house
    22 人血小板     UniZap     XL1-Blue MRF′   in house
    23 人成神经细胞瘤Kan+TS     GT10     LE392   in house
    24 人支气管平滑肌     GT10     LE392   in house
    25 人支气管平滑肌     GT10     LE392   in house
    26 人胸腺     GT10     LE392   Clontech   HL1127a
    27 人脾5′延伸     GT11     LE392   Clontech   HL1134b
    28 人外周血单核细胞     GT10     LE392   Clontech   HL1050a
    29 人睾丸     GT10     LE392   Clontech   HL1065a
    30 人胎儿脑     GT10     LE392   Clontech   HL1065a
    31 Human substancia Nigra     GT10     LE392   Clontech   HL1093a
    32 人胎盘#11     GT11     LE392   Clontech   HL1075b
    33 人胎儿脑     GT10     LE392   Clontech   custom
    34 人胎盘#59     GT10     LE392   Clontech   HL5014a
    35 人垂体     GT10     LE392   Clontech   HL1097a
    36 人胰腺#63 Uni Zap XR XL1-Blue MRF′   Stratagene   937208
    37 人胎盘#19 GT11 LE392   Clontech   HL1008
    38 人肝5′延伸 GT11 LE392   Clontech   HL1115b
    39 人子宫 Zap-CMV XR XL1-Blue MRF′   Stratagene   980207
    40 人肾大插入cDNA文库 TriplEx2 XL1-Blue   Clontech   HL5507u
                   表II INSP002克隆引物
引物 序列(5’-3’)
INSP002-CP1 CTC AGC CAT ACG CCT CCG AA
INSP002-CP2 GCT GAG CTG CCA GTG AGA CA
INSP002V-5’-F(正向) ACC TGG AAG GAA GCG ACT GCA CTG A
INSP002V-5’-R(反向) GCA GCC GGG CCG GGA GAG AAC GAA GGG CAC AGC CTT A
INSP002V-3’-F(正向) AGG CTG TGC CCT TCG TTC TCT CCC GGC CCG GCT GCT C
INSP002V-3’-R(反向) ACT CCA GGA CGG GCA CTG TGT CTA C
INSPO02V-5’nest-F(嵌套正向) GTC GAC TGC TAG TGA CCT TGA G
INSPO02V-3’nest-R(嵌套反向) ACA TCA TCC AGG TCC ACG TCT T
                        表III INSP002亚克隆和测序的引物
 引物 序列(5’-3’)
 SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG
 T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG
 T3 ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA
 M13F TGT AAA ACG ACG GCC AGT
 pEAK12-F(正向) GCC AGC TTG GCA CTT GAT GT
 pEAK12-R(反向) GAT GGA GGT GGA CGT GTC AG
 INSP002V-EX1 AA GCA GGC TTC  GCC ACC ATG CTC CTT GGC CAG CTA TC
 INSP002V-EX2 GTG ATG GTG ATG GTG TGC TTT TGG GCT GCA GTG AC
 GCP(正向) G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTC  GCC ACC
 GCP(反向) GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TCA ATG GTG ATG GTGATG GTG
     表IV克隆全长INSP002的PCR引物
引物 序列(5’-3’)
INSP002-FL-F GAT GCT CCT TGG CCA GCT AT
INSP002-FL-R CCA TCC ACG ATG CTC AGT TC
下划线序列＝Kozak序列
粗体＝终止密码子
斜线序列＝His标记
                                  序列表
注意：对于外显子-外显子连接编码的氨基酸，它们将被指为more 5’外显子。SEQ ID N0：1(INSP002-核苷酸序列外显子1)
  1 AAATGCCTCC CAGGCTATCC AGGAGGGGCC AAGAGATTAA AAGCAGGTTC
 51 AGAAGGCTCA GATGCCACTC ACCAGACAGC AGGGTCGACT GCTAGTGACC
101 TTGAGCCCAG TCCGGACAGA CAGACAGGCA GACAGACGCA CGGACAAGCA
151 GATGCTCCTT GGCCAGCTAT CCACTCTTCT GTGCCTGCTT AGCGGGGCCC
201 TGCCTACAGG CTCAGGGAGG CCTGAACCCC AGTCTCCTCG ACCTCAGTCC
251 TGGGCTGCAG CCAATCAGAC CTGGGCTCTG GGCCCAGGGG CCCTGCCCCC
301 ACTGGTGCCA GCTTCTGCCC TTGGGAGCTG GAAGGCCTTC TTGGGCCTGC
351 AGAAAGCCAG GCAGCTGGGG ATGGGCAGGC TGCAGCGTGG GCAAGACGAG
401 GTGGCTGCTG TGACTCTGCC GCTGAACCCT CAGGAAGTGA TCCAGGGGAT
451 GTGTAAGGCT GTGCCCTTCG TTCAG
SEQ ID NO：2(INSP002-蛋白质序列外显子1)
  1 MLLGQLSTLL CLLSGALPTG SGRPEPQSPR PQSWAAANQT WALGPGALPP
 51 LVPASALGSW KAFLGLQKAR QLGMGRLQRG QDEVAAVTLP LNPQEVIQGM
101 CKAVPFVQ
SEQ ID NO：3(INSP002-核苷酸序列外显子2)
  1 GTGTTCTCCC GGCCCGGCTG CTCAGCCATA CGCCTCCGAA ATCATCTGTG
 51 CTTTGGTCAT TGCTCCTCTC TCTACATCCC TGGCTCGGAC CCCACCCCAC
101 TAGTCCTGTG CAACAGCTGT ATGCCTGCTC GCAAGCGTTG GGCACCCGTG
151 GTCCTGTGGT GTCTCACTGG CAGCTCAGCC TCCCGTCGAC GGGTGAAGAT
201 ATCCACCATG CTGATCGAGG GGTGTCACTG CAGCCCAAAA GCATGA
SEQ ID NO：4(INSP002-蛋白质序列外显子2)
 1 VFSRPGCSAI RLRNHLCFGH CSSLYIPGSD PTPLVLCNSC MPARKRWAPV
51 VLWCLTGSSA SRRRVKISTM LIEGCHCSPK A
SEQ ID NO：5(INSP002-核苷酸序列)
  1 AAATGCCTCC CAGGCTATCC AGGAGGGGCC AAGAGATTAA AAGCAGGTTC
 51 AGAAGGCTCA GATGCCACTC ACCAGACAGC AGGGTCGACT GCTAGTGACC
101 TTGAGCCCAG TCCGGACAGA CAGACAGGCA GACAGACGCA CGGACAAGCA
151 GATGCTCCTT GGCCAGCTAT CCACTCTTCT GTGCCTGCTT AGCGGGGCCC
201 TGCCTACAGG CTCAGGGAGG CCTGAACCCC AGTCTCCTCG ACCTCAGTCC
251 TGGGCTGCAG CCAATCAGAC CTGGGCTCTG GGCCCAGGGG CCCTGCCCCC
301 ACTGGTGCCA GCTTCTGCCC TTGGGAGCTG GAAGGCCTTC TTGGGCCTGC
351 AGAAAGCCAG GCAGCTGGGG ATGGGCAGGC TGCAGCGTGG GCAAGACGAG
401 GTGGCTGCTG TGACTCTGCC GCTGAACCCT CAGGAAGTGA TCCAGGGGAT
451 GTGTAAGGCT GTGCCCTTCG TTCAGGTGTT CTCCCGGCCC GGCTGCTCAG
501 CCATACGCCT CCGAAATCAT CTGTGCTTTG GTCATTGCTC CTCTCTCTAC
551 ATCCCTGGCT CGGACCCCAC CCCACTAGTC CTGTGCAACA GCTGTATGCC
601 TGCTCGCAAG CGTTGGGCAC CCGTGGTCCT GTGGTGTCTC ACTGGCAGCT
651 CAGCCTCCCG TCGACGGGTG AAGATATCCA CCATGCTGAT CGAGGGGTGT
701 CACTGCAGCC CAAAAGCATG A
SEQ ID NO：6(INSP002-蛋白质序列)
  1 MLLGQLSTLL CLLSGALPTG SGRPEPQSPR PQSWAAANQT WALGPGALPP
 51 LVPASALGSW KAFLGLQKAR QLGMGRLQRG QDEVAAVTLP LNPQEVIQGM
101 CKAVPFVQVF SRPGCSAIRL RNHLCFGHCS SLYIPGSDPT PLVLCNSCMP
151 ARKRWAPVVL WCLTGSSASR RRVKISTMLI EGCHCSPKA
SEQ ID NO：7(INSP002-没有信号肽的蛋白质序列外显子1)
 1 RPEPQSPRPQ SWAAANQTWA LGPGALPPLV PASALGSWKA FLGLQKARQL
51 GMGRLQRGQD EVAAVTLPLN PQEVIQGMCK AVPFVQ
SEQ ID NO：8(INSP002-没有信号肽的蛋白质序列)
  1 RPEPQSPRPQ SWAAANQTWA LGPGALPPLV PASALGSWKA FLGLQKARQL
 51 GMGRLQRGQD EVAAVTLPLN PQEVIQGMCK AVPFVQVFSR PGCSAIRLRN
101 HLCFGHCSSL YIPGSDPTPL VLCNSCMPAR KRWAPVVLWC LTGSSASRRR
151 VKISTMLIEG CHCSPKA
SEQ ID NO：9(编码没有信号肽的INSP002蛋白质序列的核苷酸序列-成熟INSP002多肽)
  1 AGGCCTGAAC CCCAGTCTCC TCGACCTCAG TCCTGGGCTG CAGCCAATCA GACCTGGGCT
 61 CTGGGCCCAG GGGCCCTGCC CCCACTGGTG CCAGCTTCTG CCCTTGGGAG CTGGAAGGCC
121 TTCTTGGGCC TGCAGAAAGC CAGGCAGCTG GGGATGGGCA GGCTGCAGCG TGGGCAAGAC
181 GAGGTGGCTG CTGTGACTCT GCCGCTGAAC CCTCAGGAAG TGATCCAGGG GATGTGTAAG
241 GCTGTGCCCT TCGTTCAGGT GTTCTCCCGG CCCGGCTGCT CAGCCATACG CCTCCGAAAT
301 CATCTGTGCT TTGGTCATTG CTCCTCTCTC TACATCCCTG GCTCGGACCC CACCCCACTA
361 GTCCTGTGCA ACAGCTGTAT GCCTGCTCGC AAGCGTTGGG CACCCGTGGT CCTGTGGTGT
421 CTCACTGGCA GCTCAGCCTC CCGTCGACGG GTGAAGATAT CCACCATGCT GATCGAGGGG
461 TGTCACTGCA GCCCAAAAGC ATGA
SEQ ID NO：10(编码没有信号肽的INSP002外显子1蛋白质序列的核苷酸序列-成熟INSP002外显子1多肽)
  1 AGGCCTGAAC CCCAGTCTCC TCGACCTCAG TCCTGGGCTG CAGCCAATCA GACCTGGGCT
 61 CTGGGCCCAG GGGCCCTGCC CCCACTGGTG CCAGCTTCTG CCCTTGGGAG CTGGAAGGCC
121 TTCTTGGGCC TGCAGAAAGC CAGGCAGCTG GGGATGGGCA GGCTGCAGCG TGGGCAAGAC
181 GAGGTGGCTG CTGTGACTCT GCCGCTGAAC CCTCAGGAAG TGATCCAGGG GATGTGTAAG
241 GCTGTGCCCT TCGTTCAG
SEQ ID NO：11(编码没有5’非翻译区的INSP002蛋白质的核苷酸序列)
  1 ATGCTCCTT GGCCAGCTAT CCACTCTTCT GTGCCTGCTT AGCGGGGCCCT
 51 GCCTACAGG CTCAGGGAGG CCTGAACCCC AGTCTCCTCG ACCTCAGTCCT
101 GGGCTGCAG CCAATCAGAC CTGGGCTCTG GGCCCAGGGG CCCTGCCCCCA
151 CTGGTGCCA GCTTCTGCCC TTGGGAGCTG GAAGGCCTTC TTGGGCCTGCA
201 GAAAGCCAG GCAGCTGGGG ATGGGCAGGC TGCAGCGTGG GCAAGACGAGG
251 TGGCTGCTG TGACTCTGCC GCTGAACCCT CAGGAAGTGA TCCAGGGGATG
301 TGTAAGGCT GTGCCCTTCG TTCAGGTGTT CTCCCGGCCC GGCTGCTCAGC
351 CATACGCCT CCGAAATCAT CTGTGCTTTG GTCATTGCTC CTCTCTCTACA
401 TCCCTGGCT CGGACCCCAC CCCACTAGTC CTGTGCAACA GCTGTATGCCT
451 GCTCGCAAG CGTTGGGCAC CCGTGGTCCT GTGGTGTCTC ACTGGCAGCTC
501 AGCCTCCCG TCGACGGGTG AAGATATCCA CCATGCTGAT CGAGGGGTGTC
551 ACTGCAGCC CAAAAGCATG A
SEQ ID NO：12(编码没有5’非翻译区的INSP002外显子1蛋白质的核苷酸序列)
  1 ATGCTCCTT GGCCAGCTAT CCACTCTTCT GTGCCTGCTT AGCGGGGCCCT
 51 GCCTACAGG CTCAGGGAGG CCTGAACCCC AGTCTCCTCG ACCTCAGTCCT
101 GGGCTGCAG CCAATCAGAC CTGGGCTCTG GGCCCAGGGG CCCTGCCCCCA
151 CTGGTGCCA GCTTCTGCCC TTGGGAGCTG GAAGGCCTTC TTGGGCCTGCA
201 GAAAGCCAG GCAGCTGGGG ATGGGCAGGC TGCAGCGTGG GCAAGACGAGG
251 TGGCTGCTG TGACTCTGCC GCTGAACCCT CAGGAAGTGA TCCAGGGGATG
301 TGTAAGGCT GTGCCCTTCG TTCAG
SEQ ID NO：13(编码变体INSP002多肽的核苷酸序列)
  1 GTCGACTGCT AGTGACCTTG AGCCCAGTCC GGACAGACAG ACAGGCAGAC AGACGCACGG
 61 ACAAGCAGAT GCTCCTTGGC CAGCTATCCA CTCTTCTGTG CCTGCTTAGC GGGGCCCTGC
121 CTACAGGCTC AGGGAGGCCT GAACCCCAGT CTCCTCGACC TCAGTCCTGG GCTGCAGCCA
181 ATCAGACCTG GGCTCTGGGC CCAGGGGCCC TGCCCCCACT GGTGCCAGCT TCTGCCCTTG
241 GGAGCTGGAA GGCCTTCTTG GGCCTGCAGA AAGCCAGGCA GCTGGGGATG GGCAGGCTGC
301 AGCGTGGGCA AGACGAGGTG GCTGCTGTGA CTCTGCCGCT GAACCCTCAG GAAGTGATCC
361 AGGGGATGTG TAAGGCTGTG CCCTTCGTTC TCTCCCGGCC CGGCTGCTCA GCCATACGCC
421 TCCGAAATCA TCTGTGCTTT GGTCATTGCT CCTCTCTCTA CATCCCTGGC TCGGACCCCA
481 CCCCACTAGT CCTGTGCAAC AGCTGTATGC CTGCTCGCAA GCGTTGGGCA CCCGTGGTCC
541 TGTGGTGTCT CACTGGCAGC TCAGCCTCCC GTCGACGGGT GAAGATATCC ACCATGCTGA
601 TCGAGGGGTG TCACTGCAGC CCAAAAGCAT GAACTGAGCA TCTGGATGGG TGCACGGAGA
661 CACGCACCTT GGAGAAATGA GGGGAGATGG ACCAAGAAAG ACGTGGACCT GGATGATGT
SEQ ID NO：14(变体INSP002多肽)
  1 MLLGQLSTLL CLLSGALPTG SGRPEPQSPR PQSWAAANQT WALGPGALPP LVPASALGSW
 61 KAFLGLQKAR QLGMGRLQRG QDEVAAVTLP LNPQEVIQGM CKAVPFVLSR PGCSAIRLRN
121 HLCFGHCSSL YIPGSDPTPL VLCNSCMPAR KRWAPVVLWC LTGSSASRRR VKISTMLIEG
161 CHCSPKA
SEQ ID NO：15(编码没有5’非翻译区的变体INSP002多肽的核苷酸序列)
  1 ATGCTCCTTG GCCAGCTATC CACTCTTCTG TGCCTGCTTA GCGGGGCCCT GCCTACAGGC
 61 TCAGGGAGGC CTGAACCCCA GTCTCCTCGA CCTCAGTCCT GGGCTGCAGC CAATCAGACC
121 TGGGCTCTGG GCCCAGGGGC CCTGCCCCCA CTGGTGCCAG CTTCTGCCCT TGGGAGCTGG
181 AAGGCCTTCT TGGGCCTGCA GAAAGCCAGG CAGCTGGGGA TGGGCAGGCT GCAGCGTGGG
241 CAAGACGAGG TGGCTGCTGT GACTCTGCCG CTGAACCCTC AGGAAGTGAT CCAGGGGATG
301 TGTAAGGCTG TGCCCTTCGT TCTCTCCCGG CCCGGCTGCT CAGCCATACG CCTCCGAAAT
361 CATCTGTGCT TTGGTCATTG CTCCTCTCTC TACATCCCTG GCTCGGACCC CACCCCACTA
421 GTCCTGTGCA ACAGCTGTAT GCCTGCTCGC AAGCGTTGGG CACCCGTGGT CCTGTGGTGT
481 CTCACTGGCA GCTCAGCCTC CCGTCGACGG GTGAAGATAT CCACCATGCT GATCGAGGGG
541 TGTCACTGCA GCCCAAAAGC A

Claims (47)

1.一种多肽，其特征在于：所述多肽
(i)包括SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
(ii)是其具有分泌性蛋白质的功能，优选具有胱氨酸结折迭细胞因子超家族成员的功能，更好具有DAN亚家族成员的功能，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者
(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽
(i)由SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成；
(ii)是其具有分泌性蛋白质的功能，优选具有胱氨酸结折迭细胞因子超家族成员的功能，更好具有DAN亚家族成员的功能，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者
(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
3.一种属于权利要求1或2(iii)的功能等同物的多肽，其特征在于：所述多肽与SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列同源，并且具有胱氨酸结折迭细胞因子的活性，更好是具有DAN亚家族成员的活性。
4.一种属于权利要求1至3中任何一项所述的片段或功能等同物的多肽，其特征在于：所述多肽与SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或者与其活性片段的同一性大于35％，更好是大于40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％或以上。
5.一种属于权利要求1至4中任何一项所述的功能等同物的多肽，其特征在于：所述多肽与具有SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽有明显的结构同源性。
6.一种属于权利要求1、2或4中任何一项所述的片段的多肽，其特征在于：所述多肽具有与权利要求1至3中任何一项所述的(i)的多肽相同的抗原决定簇，由SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的7或以上个氨基酸残基组成。
7.一种编码上述权利要求中任何一项所述的多肽的纯化核酸分子。
8.如权利要求7所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包括SEQID NO：5所示的核酸序列或者是其冗余等同物或片段。
9.如权利要求7所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由SEQ IDNO：5所示的核酸序列组成，或者是其冗余等同物或片段。
10.如权利要求7所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包括SEQID NO：5所示的核酸序列的核苷酸152至721(SEQ ID NO：11)。
11.如权利要求7所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由SEQ IDNO：5所示的核酸序列的核苷酸152至721(SEQ ID NO：11)组成。
12.如权利要求7所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包括SEQID NO：5所示的核酸序列的核苷酸218至721(SEQ ID NO：9)。
13.如权利要求7所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由SEQ IDNO：5所示的核酸序列的核苷酸218至721(SEQ ID NO：9)组成。
14.一种在高度严谨条件下与权利要求8至13中任何一项所述的核酸分子杂交的纯化核酸分子。
15.一种含有权利要求8至14中任何一项所述的核酸分子的载体。
16.一种用权利要求15所述的载体转化的宿主细胞。
17.一种配体，其特征在于：所述配体特异性地结合权利要求1至6中任何一项所述的多肽，最好抑制所述多肽的胱氨酸结折迭细胞因子的活性，更好是DAN亚家族的活性。
18.如权利要求17中所述的配体，其特征在于：所述配体是一种抗体。
19.一种增加或降低权利要求1至6中任何一项所述的多肽的表达水平或活性的化合物。
20.如权利要求19所述的化合物，其特征在于：所述化合物与权利要求1至6中任何一项所述的多肽结合，并且不会诱导该多肽的任何生物作用。
21.如权利要求20所述的化合物，其特征在于：所述化合物是天然或修饰的基质、配体、酶、受体或者结构或功能类似物。
22.如权利要求1至6中任何一项所述的多肽、权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、权利要求16或17所述的配体、或者权利要求19至21中任何一项所述的化合物，用于治疗或诊所疾病。
23.一种诊断患者疾病的方法，其特征在于：所述方法包括评估所述患者组织中编码权利要求1至6中任何一项所述的多肽的天然基因的表达水平或者评估权利要求1至6中任何一项所述的多肽的活性，并将所述表达水平或者活性与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于：所述方法在体外进行。
25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将权利要求17或18所述的配体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。
26.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(a)在允许权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子和核酸探针之间形成杂交复合物的严谨条件下，将患者的组织样品与该探针接触；
(b)在步骤(a)使用的相同条件下，将对照样品与所述探针接触；以及
(c)检测所述样品中是否存在杂交复合物，其中，检测到患者样品中杂交复合物的水平与对照样品中杂交复合物水平不同，表示患病。
27.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(a)在允许权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子和核酸引物之间形成杂交复合物的严谨条件下，将患者组织的核酸样品与该引物接触；
(b)在步骤(a)使用的相同条件下，将对照样品与所述引物接触；
(c)扩增样品中的核酸；以及
(d)检测患者和对照样品中扩增核酸的水平；其中，检测到患者样品的扩增核酸水平与对照样品的扩增核酸水平明显不同，表示患病。
28.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)从有待测试疾病的患者中获得组织样品；
(b)从所述组织样品中分离权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子；以及
(c)通过检测表示患病的核酸分子中与疾病相关的突变是否存在，诊断患者疾病。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述方法还包括扩增核酸分子以形成扩增产物，以及检测该扩增产物中是否存在突变。
30.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述患者是否是否存在突变是这样检测的：将所述核酸分子与在严谨条件下和所述核酸分子杂交的探针接触，形成杂交双链分子，该杂交双链分子在对应于与疾病相关的突变的任何部分具有核酸探针链的未杂交部分；以及检测探针链的未杂交部分是否存在，表示与疾病相关的突变存在或不存。
31.如权利要求23至30中任何一项所述的方法，其特征在于：所述疾病是细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统疾病、发育障碍、代谢性疾病、感染或其他病理病征。
32.如权利要求1至6中任何一项所述的多肽作为分泌性蛋白质的应用。
33.如权利要求1至6中任何一项所述的多肽作为胱氨酸，优选作为胱氨酸结折迭细胞因子，更好是作为胱氨酸结折迭细胞因子的DAN亚家族成员的应用。
34.一种药物组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1至6中任何一项所述的多肽、权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、权利要求17或18所述的配体、或者权利要求19至21中任何一项所述的化合物。
35.一种疫苗组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1至6中任何一项所述的多肽或权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子。
36.如权利要求1至6中任何一项所述的多肽、权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、权利要求17或18所述的配体、权利要求19至21中任何一项所述的化合物、或者权利要求34所述的药物组合物在制备治疗以下疾病的药物中的应用：细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统疾病、发育障碍、代谢性疾病、感染和其他病理病征。
37.一种治疗患者疾病的方法，其特征在于：所述方法包括把权利要求1至6中任何一项所述的多肽、权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、权利要求17或18所述的配体、或者权利要求19至21中任何一项所述的化合物、或者权利要求34所述的药物组合物给予该患者。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于：当与健康受试者中多肽的天然基因的表达水平或者活性相比，病患者的该表达水平或活性是较低的，给予该患者的多肽、核酸分子、载体、配体、化合物或组合物是激动剂。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于：当与健康受试者中多肽的天然基因的表达水平或者活性相比，病患者的该表达水平或活性是较高的，给予该患者的多肽、核酸分子、载体、配体、化合物或组合物是拮抗剂。
40.一种监测治疗患者疾病的方法，其特征在于：所述方法包括在一段时间内监测患者组织中权利要求1至6中任何一项所述的多肽的表达水平或活性、或权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子的表达水平，若在该时间内所述表达水平或活性趋向于对照水平，表示该疾病获得缓解。
41.一种鉴定有效地治疗和/或诊断疾病的化合物的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1至6中任何一项所述的多肽、或者权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子与怀疑对所述多肽或核酸分子有结合亲和力的一或多种化合物接触，选择能特异性地结合所述核酸分子或多肽的化合物。
42.一种诊断疾病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括第一容器，它含有在严谨条件下与权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子杂交的核酸探针；第二容器，它含有用来扩增该核酸分子的引物；以及该探针和引物的使用说明书，方便诊断疾病。
43.如权利要求42所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括装有消化未杂交RNA的试剂的第三容器。
44.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核酸分子阵列，其中至少一个核酸分子是权利要求7至14中任何一项所述的核酸分子。
45.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括一或多种与权利要求1至6中任何一项所述的多肽结合的抗体；一种用来检测所述抗体与所述多肽之间结合反应的试剂。
46.一种转基因或基因剔除非人动物，其特征在于：所述动物被转化为表达权利要求1至6中任何一项所述的多肽的更高水平、更低水平或缺乏。
47.一种筛选有效治疗疾病的化合物的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求46所述的非人转基因动物与候选化合物接触，并测定该化合物对动物疾病的影响。
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