CN1300367A - 用于类风湿性关节炎诊断的方法和组合物 - Google Patents

用于类风湿性关节炎诊断的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于类风湿性关节炎之筛选、诊断、预后、和用于监测类风湿性关节炎治疗效果和药物开发的方法和组合物。描述了可以使用双向电泳分析血清或血浆来测定的类风湿性关节炎诊断特征(RADF)。本发明进一步提供了在滑液、血清或血浆中可检出的类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)、包含已分离的RPI的制剂、针对RPI的免疫特异性抗体,以及包含前述的试剂盒。

Description

用于类风湿性关节炎诊断的方法和组合物
1．导言
本发明涉及与类风湿性关节炎相关的蛋白质和蛋白质同种型(isoform)的鉴定，以及它们在筛选、诊断、预后、治疗和药物开发方面的用途。
2．发明背景
类风湿性关节炎(RA)是一种多系统性疾病，其中免疫异常特征性地导致对称性关节炎症、关节磨损和关节外并发症。这是最为常见的和致残性自身免疫关节炎，且已充分定义了遗传易感性。它大约影响1-3％的人口。随着年龄的增加发病率增加，在30-55岁之间发病率最高。类风湿因子，即针对免疫球蛋白G(IgG)Fc片段的抗体存在于75％的RA患者中。类风温因子可为IgM、IgG或IgA。据信，天然存在的类风湿因子在机体异源抗原的清除中起重要作用。在类风湿性关节炎中，各种类风湿因子由滑膜浆细胞产生，其具有形成免疫复合物、活化补体以及参与炎性反应的能力，提示其参与类风湿性关节炎的发病。RA中类风湿因子与IG半乳糖基化降低共存，是严重疾病的指征。
滑膜组织是RA中炎症的主要靶点，存在CD4+T淋巴细胞、活化的B-淋巴细胞、单核细胞及多形核淋巴细胞的慢性滑膜浸润。HLA Ⅱ型表达的增加且几乎可见于所有细胞类型，表明它们处于活性状态。慢性疾病的特征在于软骨及骨的磨损，以及滑膜过度生长。
RA诊断一直困难。不能由病史、检查及早期疾病的研究得出疾病模式。目前没有用于RA的诊断性试验，美国风湿病学学院定义了RA分类的标准(Medicine(编)Axford,J.,Blackwell Science,1996,3.18-3.22)。这些标准仅仅是观察性标志，这些标志的综合可视为RA的指征。
患有RA的成年人中75％呈IgM类风湿因子阳性。在疾病早期可能不存在这种现象。在诊断中可使用类风湿因子的水平进行预后，但其波动无助于疾病的监测。在30％患者中存在抗核抗体。
通常使用凝集试验测量IgM类风温因子。这包括胶乳试验(其中用IgG包被的颗粒凝集)以及绵羊-细胞凝集试验(SCAT或瓦-罗试验)，其中绵羊红细胞凝集。至少有70％的通过其他标准诊断为RA患者的类风湿因子胶乳凝集试验呈阳性。在其他风湿性疾病、病毒性感染、慢性炎性疾病、肿瘤或化疗中，类风湿因子也呈阳性，且明显地在4％健康个体中也呈阳性。
RA的药物治疗致力于：(1)缓解疼痛(止痛)；(2)一旦炎性事件被引发即对其加以纠正(抗炎症药)；以及(3)纠正导致炎症的免疫学事件(疾病纠正药物)。
3．发明概述
本发明提供了用于类风湿性关节炎的筛选、诊断和预后、用于监测类风湿性关节炎治疗有效性和用于药物开发的方法和组合物。
发明的第一方面提供了用于类风温性关节炎诊断的方法，包括通过双向电泳(two-dimentional electrophoresis)对样品(如：血浆、血清或滑液)进行分析，以检测至少一种类风湿性关节炎诊断特征(RADF)的水平，例如选自此处所公开的RADF组中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。
发明的第二方面提供了用于类风湿性关节炎诊断的方法，包括检测样品(如：血浆、血清或滑液)中至少一种类风湿性关节炎诊断蛋白同种型(RPI)的水平，例如选自此处所公开的RPI组中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。
发明的第三方面是提供了能够与一种RPI，例如此处公开的一种RPI，免疫特异性结合的单克隆抗体和多克隆抗体
发明的第四方面是提供了一种制品，该制品包含一种已分离的RPI，即一种不合与RPI有明显不同表观分子量或等电点的蛋白质或蛋白质同种型的RPI。
发明的第五方面提供了用于治疗或防止类风湿性关节炎的方法，包括施用能降低至少一种RADF水平(或者至少一种RPI的水平或活性)的化合物，与RA患者血清相比，所述RADF或RPI在RA患者的滑液中以增高的水平存在。优选地，施用的化合物为抗体、反义寡核苷酸、核酶或能够形成三螺旋的寡核苷酸。
发明的第六方面提供了用于治疗或防止类风湿性关节炎的方法，包括施用能增高至少一种RADF水平(或者至少一种RPI的水平或活性)的化合物，与RA患者血清相比，所述RADF或RPI在RA患者的滑液中以降低的水平存在。优选地，施用的化合物为RPI、编码RPI的核酸(如，作为一种表达载体的一部分的核酸)或能够表达且分泌一种或多种RPI的细胞。
4．附图简述
图1是由正常人血清的双向电泳得到的图像，图像显示鉴定出了14个界点特征，标记为PL1-PL16。
5．发明详述
以下详细叙述的发明包括用于受试者中类风湿性关节炎筛选、诊断、预后的方法和组合物，以及用于类风湿性关节炎治疗效果监测的方法和用于药物开发的方法以及用于治疗类风湿性关节炎的方法。优选地，受试者是哺乳动物，更优选为人，最优选地，受试者是成年人。
为了公开清楚而不以任何方式限制，本发明将以血清及滑液样品的分析为例进行描述。但是，作为一个本领域的技术人员应当理解，此处所述的鉴定和技术可以应用于其它类型的病人样品，包括体液(例如：血浆、尿液、脑脊液、关节吸出物)、组织样品或其匀浆。5.1．类风湿性关节炎诊断特征(RADF)
在本发明的一个方面中，双向电泳用于分析受试者血清以测量一个或多个类风湿性关节炎诊断特征(RADF)的丰度，可用于类风湿性关节炎的筛选和诊断、决定类风湿性关节炎患者的预后、监测类风湿性关节炎治疗的效果或者用于药物的开发。此处所用的双向电泳是指一项包括等电聚焦和随后的变性电泳在内的技术。它可以产生包含多个已分离的蛋白质的双向胶(2D-gel)。优选地，变性电泳步骤使用十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。特别优选的是美国申请第08/980,574和WO 98/23950中所描述的高度准确和自动化的方法及设备(“优选技术”)，此处完整引述作为参考。简要的说，优选的技术提供了足够的、计算机辅助的方法和设备以用于生物样品中生物分子的鉴定、选择和特征描述。根据生物分子的电泳迁移率和等电点在双向胶中分离它们，可以得到一个双向图谱(array)。由此图谱可以产生一个计算机形成的数字图形，代表双向图谱中检测的多种生物分子的特性、表观分子量、等电点和相对丰度，因而能够允许将来自多个生物样品的图形进行计算机辅助的比较，以及计算机辅助的已分离目标蛋白质的切割。此处所用的术语“类风湿关节炎诊断特征(RADF)”指的是在生物样品经双向电泳后可检出的特征(例如双向胶中的一个点)，它不同地存在于一个样品和另外的与其相关样品中，例如(1)在一个患有类风湿性关节炎的受试者血清中与在一个没有患有类风湿性关节炎的受试者血清中相比；或者(2)在一个取自患有类风湿性关节炎的受试者滑液中与在一个取自未患有类风湿性关节炎的受试者血清中相比。
如此处所用，当用于检测特征(或同种型)的方法(例如：双向电泳或免疫分析方法)显示所检测特征(或蛋白质同种型)在第一个样品中与在第二个样品中的相对丰度不同时，则此处所用的术语特征(或蛋白质同种型)相对于第二个样品而言，“不同地存在于”第一个样品中。如果所测量的特征在第一个样品中的丰度高于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“升高”的；相反的，如果所测量的特征在第一个样品中的丰度低于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“降低”的。
优选的，特征在两个样品中的相对丰度是通过两个步骤来确定的。首先，参照一个适当的背景参数将依赖于样品中所发现特征而得到的信号进行标准化，例如，参照分析样品中的总蛋白质(例如上样到胶上的总蛋白质)，参照一个稳定的特征，也就是已知的在所比较的样品中含量相似的一个特征，例如一个或多个“表达参考特征”(ERF)，例如下面公开的“表达参考特征”，或者参照来源于样品中所有蛋白质的能检测到的总信号。
其次，一个或一组样品中已标准化的特征的信号与另外一个或一组样品中同一特征的已标准化的信号相比较，用以鉴定那些相对于第二个样品(或样品组)“不同地存在于”第一个样品(或样品组)中的特征。
通过两组样品的比较之一已鉴定出此处公开的RADF。第一组RADF包括以下特征：(a)与类风湿性关节炎的受试者血清相比，在患有类风湿性关节炎的受试者滑液中不同地存在的RADF；以及(b)与无类风湿性关节炎的受试者血清相比，在未患有类风湿性关节炎的受试者滑液中并非不同地存在的RADF。无类风湿性关节炎的受试者可包括已知无疾病或病症的正常受试者，或患有非RA的关节疾病或病症的受试者，包括但不限于痛风、骨关节炎或滑膜炎(例如，创伤性滑膜炎)。第二组RADF是那些与无类风湿性关节炎的受试者血清相比，在患有类风湿性关节炎的受试者血清中不同地存在的RADF。
通过优选技术的方法和装置已鉴定了四组RADF。第一组由这样的RADF组成，所述RADF在患有RA的受试者中相对于血清而言在滑液中增加，而在未患有RA的受试者中相对于血清而言在滑液中不增加。这些RADF可以用表观分子量(MW)和等电点(pI)表述如下：
表Ⅰ在类风湿性关节炎中在滑液中相对于血清而言增加的RADF
名称 增加倍数     pI     MW(kd)
RADF-1     118.3  6.76     74,447
 RADF-2     94.7  7.42     25,049
 RADF-3     62.5  4.92     54,948
 RADF-4     26.0  5.1     53,241
 RADF-5     20.1  6.94     27,221
 RADF-6     11.0  5.14     137,225
 名称 增加倍数     pI     MW(kd)
RADF-7     9.9  5.86     26,217
 RADF-8     8.2  5.79     58,161
 RADF-9     5.0  6.17     57,613
 RADF-10     3.7  5.43     39,842
 RADF-11     3.4  5.98     52,631
 RADF-12     3.3  7.06     72,543
第二组由这样的RADF组成，所述RADF在患有RA的受试者中相对于血清而言在滑液中降低，而在未患有RA的受试者中相对于血清而言在滑液中不降低。这些RADF可以用表观分子量(MW)和等电点(pI)表述如下：
表Ⅱ在类风湿性关节炎中，在滑液中相对于血清而言降低的RADF
名称 降低倍数     pI     MW(kd)
RADF-13  37.5  4.92     53,578
 RADF-14  24.6  6.2     76,789
 RADF-15  12.6  4.56     63,737
 RADF-16  11.9  5.36     24,124
 RADF-17  10.1  5.96     158,868
 RADF-18  9.0  9.52     14,953
 RADF-19  5.3  5.1     131,608
 RADF-20  3.7  5.12     60,216
 RADF-21  2.9  4.95     32,321
 RADF-22  3.0  6.95     27,812
第三组由这样的RADF组成，与不患有RA的受试者血清相比，所述RADF在患有RA的受试者的血清中增加，这些RADF可以用表观分子量(MW)和等电点(pI)表述如下：
表Ⅲ相对于非RA血清而言在RA血清中增加的RADF
名称 增加倍数     pI     MW(kd)
RADF-13     2.7  4.92     53,578
 RADF-16     4.3  5.36     24,124
 RADF-22     2.7  6.95     27,812
 RADF-23  10.1  9.00     47,978
 RADF-24     5.5  5.31     74,447
 RADF-25     3.5  5.34     40,271
 RADF-26     3.4  4.81     40,997
 RADF-27     3.2  6.97     56,354
 RADF-28     3.1  5.41     16,807
 RADF-29     2.9  5.02     36,372
 RADF-30     2.8  4.52     17,629
 RADF-31     2.6  5.26     16,687
第四组由这样的RADF组成，与不患有RA的受试者血清相比，所述RADF在患有RA的受试者的血清中降低。这些RADF可以用表观分子量(MW)和等电点(pI)表述如下：
表Ⅳ相对于非RA血清而言在RA血清中降低的RADF
名称 降低倍数     pI     MW(kd)
RADF-32     36.5  6.61  70,511
 RADF-33     4.3  6.29  76,112
 RADF-34     3.7  5.65  37,966
 RADF-35     3.3  5.93  34,471
 RADF-36     3.1  6.09  57,613
 RADF-37     3.0  5.41  183,864
 RADF-38     2.9  5.04  81,696
 RADF-39     2.8  6.25  53,917
 RADF-40     2.6  6.37  82,423
对于在第一和第二组中任何指定的RADF来说，将患有类风湿性关节炎的受试者滑液中测量的信号与患有类风湿性关节炎的受试者血清中测量的信号加以比较，所得到的比值依赖于所用的特定分析规程和检测技术。因而，本发明构思了作为诊断领域的传统做法，对于第一和第二组中的各个RADF，每一个实验室应当根据所使用的分析规程和检测技术，建立有或者无类风湿性关节炎受试者中滑液相对于血清中每一个RADF比值的参考范围。优选的，在每批分析的试验样品中均应包括至少一对来自已知患有RA的受试者的滑液与血清样品的对照，或者至少一对来自已知未患有RA的受试者的滑液与血清样品的对照(更优选地，至少包括这两类对照对中的一个)。
 类似地，对于在第三和第四组中任何指定的RADF来说，将患有类风湿性关节炎的受试者血清中测量的信号与未患有类风湿性关节炎的受试者血清中测量的信号加以比较，所得到的比值依赖于所用的特定分析规程和检测技术。因而，本发明构思了作为诊断领域的传统做法，对于第三和第四组中的各个RADF，每一个实验室应当根据所使用的分析规程和检测技术，建立有或者无类风湿性关节炎受试者中每一个RADF比值的参考范围。优选的，在每批分析的试验样品中均应包括至少一个来自已知患有RA的受试者的血清样品阳性对照，或者至少一个来自未患有RA的受试者的血清样品阴性对照(更优选地，至少包括一个阳性对照和至少一个阴性对照)。
在一个优选实施方案中，参照一个或多个在相同双向胶中检测的一个或多个表达参考特征，将与RADF相关的信号进行标准化，本领域普通技术人员显然知道，利用优选技术通过比较不同样品可容易的确定这种ERF。用于此目的之合适的ERF包括(但不限于)下表中所列的那些：
表Ⅴ
    ERF-#     MW     pI
    ERF-1     38719     5.34
    ERF-2     13915     5.26
    ERF-3     73465     5.14
    ERF-4     40924     4.87
    ERF-5     104893     7.22
    ERF-6     37294     7.62
    ERF-7     24124     5.48
    ERF-8     53409     4.56
    ERF-9     36372     5.02
    ERF-10     26930     5.52
以举例方式，表Ⅵ显示，表Ⅰ和表Ⅱ中鉴定的RADF水平被标准化为ERF-1和ERF-3；本领域普通技术人员知晓，RADF的水平可相对于任何希望的ERF被标准化。表Ⅵ中的值是各个RADF相对于目标ERF的比值，其中正比值表明相对于ERF之RADF水平增加，负比值表明相对于ERF之RADF水平降低。如本领域技术人员所知，RADF/ERF比值可以其自身的权重用做诊断参数。
表Ⅵ在RA滑液中RADF与ERF的比值
    RADF# 标准化至ERF-1 标准化至ERF-3
    RADF-1     -22.2     -26.0
    RADF-2     -96.6     -124.6
    RADF-3     -59.4     -71.3
    RADF-13     38.1     31.8
    RADF-4     -23.0     -27.6
    RADF-14     25.2     21.9
    RADF-5     -6.4     -7.3
    RADF-15     13.2     11.1
    RADF-16     12.3     9.9
    RADF-6     -10.3     -12.2
    RADF-17     10.2     8.4
    RADF-7     -2.3     -2.8
    RADF-18     9.2     7.6
    RADF-8     -7.3     -9.2
    RADF-19     5.5     4.6
    RADF-9     -4.8     -5.6
    RADF-20     3.8     3.3
    RADF-10     -3.7     -4.4
    RADF-11     -3.5     -4.7
    RADF-12     -2.5     -3.1
    RADF-22     2.7     2.3
类似地，表Ⅶ显示，表Ⅲ和表Ⅳ中鉴定的RADF水平被标准化为ERF-1和ERF-3；本领域普通技术人员知晓，RADF的水平可相对于任何希望的ERF来表示。如本领域技术人员所知，RADF/ERF比值可以其自身的权重用做诊断参数。
表Ⅶ在RA血清中RADF与ERF的比值
    RADF# 标准化至ERF-1 标准化至ERF-3
    RADF-32     -13.4     -9.5
    RADF-23     5.6     7.3
    RADF-24     4.4     5.3
    RADF-16     3.5     4.0
    RADF-33     -1.4     -1.3
    RADF-34     -2.9     -2.5
    RADF-25     2.9     3.2
    RADF-26     2.6     2.8
    RADF-35     -4.0     -3.7
    RADF-27     2.4     2.6
    RADF-36     -3.0     -2.6
    RADF-28     -2.2     2.8
    RADF-37     -4.2     -3.5
作为熟练的技术人员应当容易理解，一个给定特征或蛋白质同种型的测量分子量和等电点，会根据双向电泳和界点匹配的每一步骤中所用的具体规程而在一定范围内变动。此处所用的术语“分子量”和“等电点”分别定义为：准确依照在下文第六节列出的实验规程(“参考实验规程”)测定的特征或蛋白质同种型的表观分子量和等电点。当按照参考实验规程，样品以双份平行或更多数目平行测定时，测得的RADF或RPI的平均等电点的偏差小于±1％；测得的RADF或RPI的平均分子量的偏差通常小于±5％。在熟练技术人员希望背离参考实验规程的地方，应当进行标准实验，用以比较使用(a)参考实验规程和(b)变化的实验规程检测到的每一个RADF或蛋白质同种型的分子量和等电点。
RADF可用于类风湿性关节炎的发现、预后、诊断或监测或是药物开发。在本发明的一个实施方案中，受试者的滑液和血清通过双向电泳分析，以定量检测选自RADF-1到RADF-12中的一个或多个RADF，其中一个RADF在受试者滑液中相对于血清的丰度增加，表明类风湿性关节炎的存在。
在本发明的另一个实施方案中，受试者的滑液和血清通过双向电泳分析，以定量检测选自RADF-13到RADF-22中的一个或多个RADF，其中一个RADF在受试者滑液中相对于血清的丰度降低，表明类风湿性关节炎的存在。
在本发明的另一个实施方案中，受试者的滑液和血清通过双向电泳分析，以定量检测选自RADF-1到RADF-22中的一个或多个RADF，其中相对于表达参考特征(ERF)的一个或多个RADF的比值，表明类风温性关节炎的存在；ERF-1和ERF-3为用于此目的之优选ERF。
在本发明的又一实施方案中，患有RA的受试者的血清通过双向电泳分析，以定量检测选自RADF-13、RADF-16以及RADF-22至RADF-31中的一个或多个RADF，其中相对于受试者或无RA受试者血清(如，对照样品或以前测定的参考范围)，在受试者血清中RADF丰度的增加，表明类风温性关节炎的存在。
在本发明的另一实施方案中，受试者的滑液通过双向电泳分析，以定量检测选自RADF-32至RADF-40中的一个或多个RADF，其中相对于受试者或无RA受试者血清(如，对照样品或以前测定的参考范围)，在受试者血清中RADF丰度的降低，表明类风湿性关节炎的存在。
在本发明的又一实施方案中，受试者的血清通过双向电泳分析，以定量检测选自RADF-13、RADF-16以及RADF-22至RADF-40中的一个或多个RADF，其中相对于ERF的一个或多个RADF比值，表明类风湿性关节炎的存在；ERF-1和ERF-3为用于此目的之优选ERF。5.2．类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)
本发明的另一方面是分析受试者血清，以定量检测一个或多个类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)，这些RPI可以用于类风湿性关节炎的筛选或诊断、决定类风湿性关节炎患者的预后、监测类风湿性关节炎治疗的效果或药物开发。此处所用的术语“类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型”包括(1)与来自无RA的受试者血清相比，不同地存在于患有类风湿性关节炎的受试者血清中的蛋白质同种型，和(2)一种蛋白质同种型，(a)其与来自RA的受试者血清相比，不同地存在于患有类风湿性关节炎的受试者滑液中，以及(b)其与来自无RA的受试者血清相比，并非不同地存在于患有类风湿性关节炎的受试者滑液中。本领域公知，单基因的蛋白质产物可能表达成变体(同种型)，这种不同是不同的翻译后修饰的结果(例如：糖基化、磷酸化或乙酰化)，以至于具有相同氨基酸序列的蛋白质可以有不同的等电点、分子量或两者皆不同；和/或，这种不同源于它们的氨基酸组成不同(例如：另外的mRNA剪接或有限的蛋白质降解的结果)。因此蛋白质同种型的不同地存在并不需要编码该目的蛋白质的基因的不同表达。
使用优选技术部分中的方法和设备，通过RADF的部分氨基酸测序，已鉴定出了四组RPI。第一组由这样的RPI组成，其在类风湿性关节炎受试者中，相对于血清而言滑液中RPI增加，但是在无类风湿性关节炎的受试者中，相对于血清而言滑液中的RPI不增加。这些RPI的分子量、等电点和部分氨基酸序列列于表Ⅷ，如下：
表Ⅷ在滑液中RP的增加
RPI RADF 同源性蛋白质 部分氨基酸序列 pI MW(kd)
RPI-1 RADF-1 转铁蛋白 DQYELLCLDNTREGYYGYTGAFRDYELLCLDGTRCQSFRINHCRSCHTGLGRSCHTAVGRAPNHAVVTRASYLDCIRWCALSHHERDSGFQMNQLRSASDLTWDNLKWCAVSEHEATKKDSGFQMNQLRMYLGYEYVTAIRMYLGYEYVTAIR 6.76 74,447
    RPI     RADF 同源性蛋白质 部分氨基酸序列     pI MW (kd)
CSTSSLLEACTFRFDEFFSEGCAPGSKKPVEEYANCHLAREDPQTFYYAVAVVKDCHIAQVPSHTVVARELDIWELLNQAQEHFGKSAGWNIPIGLLYCDLPEPR
 RPI-2  RADF-2  IgG κ轻链 SGTASVVCLLNNFYPRFSGSGSGTDFTLTISREIVLTQSPATLSLSPGER  7.42  25,049
 RPI-3  RADF-3 (α-1-抗胰蛋白酶 WERPFEVKSVLGQLGITKLSITGTYDLKSPLFMGKFLENEDRQINDYVEKKQINDYVEKLGMFNIQHCKGKWERPFEVKTDTSHHDQDHPTFNKLQHLENELTHDIITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLYHSEAFTVNFGDTEEAK  4.92  54,948
 RPI-4  RADF-4 维生素D结合蛋白 YTFELSRFEDCCQEKHLSLLTTLSNRVCSQYAAYGEKRTHLPEVFLSK  5.1     53,241
 RPI-5  RADF-6 血浆铜蓝蛋白前体 EYTDASFTNRDDEEFIESNKQSEDSTFYLGERALYLQYTDETFRLISVDTEHSNIYLQNGPDRQYTDSTFRMYYSAVDPTKGAYPLSIEPIGVRNNEGTYYSPNYNPQSR  5.14  137,225
 RPI-6  RADF-8  Igα--1&2链c区 WLQGSQELPRYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILR  5.79     58,161
 RPI-7  RADF-9  Igα-1&2链c区 WLQGSQELPR  6.17     57,613
 RPI-8  RADF-10 触珠蛋白前体 VGYVSGWGRYVMLPVADQDQCIR  5.43  39,842
 RPI-9  RADF-11  β-2-糖蛋白1前体(载脂蛋白H)  VCPFAGILENGAVRATVVYQGEREHSSLAFWKTCPKPDDLPFSTVVPLK  5.98     52,631
 RPI-10  RADF-11 新 VAA(I/L)EHFGR  5.98     52,631
 RPI-11  RADF-12 转铁蛋白 DYELLCLDGTR  7.06     72,543
第二组由这样的RPI组成，其在类风湿性关节炎受试者中，相对于血清而言滑液中RPI降低，但是在无类风湿性关节炎的受试者中，相对于血清而言滑液中的RPI不降低。这些RPI的分子量、等电点和部分氨基酸序列列于表Ⅸ，如下：
表Ⅸ
 RPI  RADF  同源性蛋白质  部分氨基酸序列  pI  Mw(kd)
 RPI-12  RADF-13  α-1-抗胰蛋白酶  DTEEEDFHVDQVTTVKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSITGTYDLKLGMFNIQHCKSVLGQLGITKFLENEDRFLENEDRRWERPFEVKGKWERPFEVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKLYHSEAFTVNFGDTEEAKK  4.92  53,578
 RPI-13  RADF-14  转铁蛋白前体  DSGFQMNQLRWCALSHHERSASDLTWDNLKEGYYGYTGAFRSCHTGLGRSCHTAVGRAPNHAVVTRDCHLAQVPSHTVVAR  6.2  76,789
 RPI-14  RADF-14  IgM链  LICQATGFSPRVSVFVPPRDGFFGNPRQIQVSWLRQVGSGVTTDQVQAEAKFTCTVTHTDLPSPLKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRGFPSVLRVQHPNGNKNVPLPVIAELPPKDVMQGTDEHVVCXYVTSAPMPEPQAPGRESDWLSOSMFTCR  6.2  76,789
 RPI-15  RADF-15  α-1-抗胰凝乳蛋白酶前体  DSLEFRADLSGITGAREOLSLLDRITLLSALVETRWEMPFDPQDTHQSRLYGSEAFATDFQDSAAAKAVLDVFEEGTEASAATAVK  4.56  63,737
 RPI-16  RADF-16  载脂蛋白A-1前体  LSPLGEEMRVQPYLDDFQKDLATVYVLKAHVDALRAELQEGARWQEEMELYRVSFLSALEEYTK  5.36  24,124
 RPI-17  RADF-16  新  DSGAD(I/L)S  5.36  24,124
 RPI-18  RADF-17  补体因子H前体   QMSKYPSGERMDGASNVTCINSRCGKDGWSAQPTCIKGNTAKCTSTGWIPAPRIDVHLVPDR  5.96  158,868
 RPI  RADF  同源性蛋白质  部分氨基酸序列  pI  MW(kd)
 EFDHNSNIRRPYFPVAVGKSLGNVIMVCRLYSTCEGGFRHGGLYHENMREIMENYNIALRTDCLSLPSFENAIPMGEK
 RPI-19  RADF-17  铜转运ATP酶  DRSASHLDHKASINSLLSDKRQIEAMGFPAFVKVFAEVLPSHKVAKCYIQVTGMTCASCVANIER  5.96  158,868
 RPI-20  PADF-17  新  NV(I/L)DAPHAR  5.96  158,868
 RPI-21  RADF-18  血红蛋白α链  VGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVK  9.52  14,953
 RPI-22  RADF-19  血浆铜蓝蛋白前体  GAYPLSIEPIGVRALYLQYTDETFRGSLHANGRYTVNQCRQYTDSTFRDNEDFQESNRQSEDSTFYLGERDLYSGLIGPLIVCRVDKDNEDFQESNRNNEGTYYSPNYNPOSR  5.1  131.608
 RPI-23  RADF-20  Igα-1&2链c区  QEPSQGTTTFAVTSILRYLTWASRSAVQGPPERWLQGSQELPRDASGATFTWTPSSGK  5.12  60,216
 RPI-24  RADF-22  补体C3C前体  HQQTVTPPKSSLSVPYVIVPLKLPYSVVRDSITTWEILAVSMSDKSEFPESWLWNVEDLKTLDPERVVPEGIRNEQVEIRAVLYNYRRHQQTVTIPPKAAVYHHFISDGVRVELLHNPAFCSLATTKSNLDEDILAEENIVSR  6.95  27,812
第三组包括这样的RPI，与在无类风湿性关节炎受试者的血清中相比，在类风湿性关节炎的受试者的血清中RPI增加。这些RPI的分子量、等电点和部分氨基酸序列列于表Ⅹ，如下：
表Ⅹ
 RPI  RADF  同源蛋白质  部分氨基酸序列  pI  MW(kd)
 RPI-25  RADF-23  Igγ链c区  EPQVYTLPPSRDTLMISRGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKFNWYVDGVEVHNAKTPEVTCVVVDVSHEDPEVK  9  47,978
 RPI-26  RADF-24  血红素结合蛋白  NFPSPVDAAFRGGYTLVSGYPKGECQAEGVLFFQGDR  5.31  74,447
 RPI-16  RADF-16  载脂蛋白A-1前体  LSPLGEEMRVQPYLDDFQKDLATVYVDVLKAHVDALRAELQEGARWQEEMELYRVSFLSALEEYTK  5.36  24,124
 RPI-17  RADF-16  新  DSGAD(I/L)S  5.36  24,124
 RPI-27  RADF-25  触珠蛋白前体  VGYVSGWGRGSFPWQAKYVMLPVADQDQCIRVTSIQDWVQKSCAAEYGVYVK  5.34  40,271
 RPI-28  RADF-26  补体C3前体  ENEGFTVTAEGKVYAYYNLEESCTRNTMILEICTRVSHSEDDCLAFK  4.81  40,997
 RPI-29  RADF-26  触珠蛋白前体  VGYSGWGR  4.81  40,997
 RPI-30  RADF-26  Znα2糖蛋白  QDSQLQKIDVHWTRSQPMGLWRWEAEPVVYVQRAREDIFMETLKAYLEEECPATLR  4.81  40,997
 RPI-31  RADF-27  Lgα-1&2  WLQGSQELPR  6.97  56,354
 RPI  RADF  同源蛋白质  部分氨基酸序列  pI  MW(kd)
 链c区
 RPI-32  RADF-27  补体因子B(BB片段)  QVPAHARISVIRPSKVASYGVKPRDISFVVTPRGDSGGPLIVHKYGLVTYATYPKLPPTTTCQQQKFLCTGGVSPYADPNTCR  6.97  56,354
 RPI-12  RADF-13  α-1-抗胰蛋白酶  DTEEEDFHVDQVTTVKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSITGYDLKLGMFNIQHCKSVLGQLGITKFLENDRFLENEDRRWERPFEVKGKWERPFEVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAK  4.92  53,578
 RPI-24  RADF-22  补体C3C前体  HQQTVTIPPKSSLSVPYVIVPLKLPYSVVRDSITTWEILAVSMSDKSEFPESWLWNVEDLKTLDPERVVPEGIRNEQVEIRAVLYNYRRHQQTVTIPPKAAVYHHFISDGVRVELLHNPAFCSLATTKSNLDEDIIAEENIVSR  6.95  27,812
第四组包括这样的RPI，与无类风湿性关节炎受试者的血清中相比，在类风湿性关节炎受试者的血清中RPI降低。这些RPI的分子量、等电点和部分氨基酸序列列于表Ⅺ，如下：
表Ⅺ
RPI RADF 同源蛋白质 部分氨基酸序列 pI MW(kd)
RPI-33 RADF-32 转铁蛋白 DSGFQMNQLR 6.61 70,511
RPI-34 RADF-33 转铁蛋白 DSGFQMNQLRCDEWSVNSVGK 6.29 76,112
RPI-35 RADF-34 C-末端胰蛋白酶解片段补体H CTSTGWIPAPRSCDNPYIPNGDYSPLREYHFGQAVRSLGNVIMVCRTGDEITYQCR 5.65 37,966
 RPI  RADF  同源蛋白质  部分氨基酸序列  pI  MW(kd)
 KGEWVALNPLRGEWVALNPLRK
 RPI-36  RADF-35  触珠蛋白相关蛋白前体  VGYVSGWGQSDNFKNYAEVGRVVLHPNYHQVDIGLIK  5.93  34,471
 RPI-37  RADF-36  Igα--1&2链c区  WLQGSQELPRQEPSQGTTTFAVTSILRYLTWASRSAVQGPPER  6.09  57,613
 RPI-38  RADF-37  补体因子H前体  EIMENYNIALRIDVHLVPDREFDHNSNIRRPYFPVAVGKSLGNVIMVCRSCDIPVFMNARTDCLSLPSFENAIPMGEK  5.41  183,864
在本发明的一个实施方案中，分析受试者滑液和血清，以定量检测选自RPI-1到RPI-11中的一个或多个RPI，其中一个或多个这类RPI在滑液中相对于血清的丰度增加，表明类风湿性关节炎的存在。在本发明的另一个实施方案中，分析受试者的滑液和血清，以定量检测选自RPI-12到RpI-24中的一个或多个RpI，其中一个或多个这类RPI在滑液中相对于血清的丰度降低，表明类风湿性关节炎的存在。
在本发明的另一个实施方案中，分析受试者的血清，以定量检测选自RPI-12、RPI-16、RPI-17和RPI-24至RPI-32中的一个或多个RPI，其中一个或多个这类RPI在受试者血清中丰度的增加，表明类风湿性关节炎的存在。在本发明的另一个实施方案中，分析受试者的血清，以定量检测选自RPI-33到RPI-38中的一个或多个RPI，其中一个或多个这类RPI在受试者血清中丰度的降低，表明类风湿性关节炎的存在。
优选地，RPI的丰度被标准化至一种表达参考蛋白质同种型(ERPI)。使用优选技术部分的方法和装置，通过上述ERF的部分氨基酸序列测定鉴定了ERPI。这些ERPI的部分氨基酸序列以及它们与之同源的已知蛋白质示于表Ⅺb。
表Ⅺb
 ERPI-#  ERF-#  同源蛋白质  部分氨基酸序列
 ERPI-1  ERF-4  Zn-α-2-糖蛋白前体  EDIFMETLK
 ERPI-2  ERF-6  免疫球蛋白重链γ(中间体区段)  EEQYNSTYR
 ERPI-3  ERF-8  α-2-HS-糖蛋白前体  LDGKFSVVYAK
如上所示，此处所述的RPI包括以前未知的蛋白质和已知蛋白质的同种型，以前并不知道这些同种型与类风湿性关节炎有关。对于每一个RPI，本发明另外提供了包括分离的RPI或其片段的制品，以及进一步提供了能结合所述RPI或所述片段的抗体，或能与所述RPI及所述片段结合的抗体。此处所述“分离的”RPI是指这样的RPI，如双向电泳鉴定的，它不包含与RPI的那些同种型有显著不同分子量和等电点的蛋白质或蛋白质同种型。此处所述“显著不同的”等电点或分子量是指按照参考实验规程操作，在双向电泳中能够和RPI分离开的污染的蛋白质同种型之等电点或分子量。
在一个实施方案中，提供了一种分离的蛋白质，所述蛋白质包括具有在表Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ或表Ⅺ中鉴定的针对RPI氨基酸序列的肽，所述蛋白质的等电点和分子量在表Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ或表Ⅺ中鉴定出的相应RPI分子量和等电点的10％变化范围以内(优选地，是在5％变化范围以内，更优选地，是在1％变化范围以内)。
本发明的RPI可以用本领域技术人员知晓的任何方法加以分析。在一个实施方案中，RPI由于其分子量和等电点而在双向胶中得到分离，通过对胶染色而显现出来。
另外，RPI可以用分析方法测定，例如免疫分析方法，从而用于类风湿性关节炎的发现、预后、诊断或监测，或者用于药物开发。在一个实施方案中，在能够发生免疫特异性结合的条件下，将来自要检测的受试者之样品与一种抗-RPI抗体接触，然后检测或测量任何被抗体免疫特异性结合的量。优选的，抗-RPI抗体优先结合RPI，而不是同-蛋白质的其它同种型。在一个优选的实施方案中，抗-RPI抗体与RPI的亲和力和与同一蛋白质的其它同种型的亲和力相比，至少高出2倍；更优选的，至少高出5倍；最优选的，至少高出10倍。
在另一实施方案中，如下进行免疫分析鉴定：在能够发生免疫特异性结合的条件下，通过将来自例如待测受试者的样品与多种抗-RPI抗体接触，同时检测或测量任何被针对多重RPI的多种抗体免疫特异性结合的量。优选的，各个抗-RPI抗体结合不同的RPI，且任选地固定于固相支持物。例如，抗体可以以双向图谱(array)排列被固定，其中图谱中各个位置被特异性结合单一RPI的抗体占据，且其中图谱中具有特异于一个或多个RPI的抗体。优选地，各个抗-RPI抗体优先结合RPI，而不是同一蛋白质的其它同种型。在一个优选的实施方案中，抗-RPI抗体与RPI的亲和力和与同一蛋白质的其它同种型的亲和力相比，至少高出2倍；更优选的，至少高出5倍；最优选的，至少高出10倍。
在一个实施方案中，组织切片中的抗体结合可用于检测异常的RPI定位或RPI的异常水平(例如：高、中、低、缺失)。在一个特定的实施方案中，针对RPI的抗体可用于分析患者组织或血清样品中RPI的存在情况，其中异常的RPI水平可以提示类风湿性关节炎的存在。此处所用的“异常水平”是指相对于来源于身体一部分或无类风湿性关节炎受试者的类似样品中的水平或标准水平，水平的上升或下降。
可以使用的免疫分析方法包括但不限于竞争和非竞争分析系统，使用的技术例如：Western印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、夹心式免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体固定分析、免疫放射量度分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析等等，此处仅指出其中的一些。
如果可能，RPI可以用一种两步法的夹心分析进行测定。此处，RPI代表蛋白质的一种特定糖基化形式(glycoform)。第一步，可用一种抗-RPI抗体(该抗体任选地固定于固相)捕捉RPI；第二步，可用一种直接或间接标记的凝集素检测捕捉到的RPI。任何优先结合RPI而不是与下列蛋白质结合的凝集素都可以用于此目的：(a)、具有与RPI相同核心蛋白质的其它糖基化形式；或是(b)、具有共同的抗体识别的抗原决定簇的其它同种型。在一个优选的实施方案中，选用的凝集素与RPI的亲和力和与具有与RPI相同核心蛋白质的其它糖基化形式的亲和力相比，至少高出2倍，更优选的，至少高出5倍；仍然更优选的，至少高出10倍。适用于测定给定RPI的凝集素可以用本领域熟知的方法进行鉴定，例如检测列于下列参考文献第158-159页表Ⅰ列举的一个或多个凝集素：Sumar等，凝集素可作为疾病相关的糖基化形式的指示剂，摘自：GabiusH-J & GabiusS(编)，1993，凝集素与糖生物学，第158-174页。(此处全文引入作为参考文献)
如果需要，将应用编码RPI基因、相关基因和相关的核酸序列及亚序列(包括互补序列)进行杂交分析。编码RPI的核苷酸或含有大约至少8个核苷酸的亚序列(或其互补序列)可以用作杂交探针。杂交分析可用于(尤其是经过手术或治疗后复发的)类风湿性关节炎中伴随的RPI基因表达的异常改变之检测、预后、诊断，或用于监测病情和病况。特别是，这种杂交分析的进行可通过如下方法，包括：在杂交能够发生的条件下，将含有核酸的样品与核酸探针接触，所述探针能与编码RPI的DNA或RNA杂交，并检测或测定任何产生的杂交结果。
本发明也提供了包含置于一个或多个容器中的抗-RPI抗体的诊断试剂盒。此外，这样的试剂盒可任选的包含以下一种或多种内容：(1)、用于诊断、预后、治疗监测、药物开发或这些应用任一组合应用的抗-RPI抗体的使用说明；(2)、许可证书。也就是一种管理药品或生物制品生产、使用和销售的政府部门认可形式的通知，它表明了与用于人类的生产、使用或销售有关的部门的认可。(3)、标记的针对抗体的结合配基。(4)、固相，(例如：试剂纸条)，其上固定有抗-RPI抗体。如果没有提供抗体的标记结合配基，那么抗-RPI抗体本身可以用一示踪标记物标记，例如：化学发光的、酶的、荧光的或放射性的基团。
本发明也提供了一种试剂盒，包含分装于一个或多个容器中的能与编码不同RPI的RNA杂交的核酸探针。在一个特定的实施方案中，试剂盒包含分装于一个或多个容器中的一对引物(例如：每个的长度为6-30个核苷酸，更优选的，为10-20个核苷酸)，这些引物在适当的反应条件下能引发编码一种RPI的核酸(至少是其中一部分)的扩增，例如通过聚合酶链式反应(例如参见：Innis等，1990,PCR操作规程(PCRProtocol)，学院出版公司，圣地亚哥，加利福尼亚)、使用Qβ复制酶的连接酶链式反应(参见EP320,308)、环式探针反应或本领域已知的其他方法。
本发明同样提供了允许用于多个RPI或各自编码一种RPI的多个核酸检测的试剂盒。试剂盒可进一步任选的包含预先定量过的一种分离的RPI蛋白质或编码RPI的核酸，例如用作标准或对照。5.3．在临床研究中的应用
本发明的诊断方法和组合物可以有助于指导或监测临床研究，例如，测试用于类风湿性关节炎治疗的药物。在一个实施方案中，可以测试候选分子恢复类风湿性关节炎患者RADF或RPI水平趋向于非类风湿性关节炎受试者中所见水平的能力，或在治疗过的患者中保持RADF或RPI水平达到或接近非类风湿性关节炎患者或血清水平的能力。可以分析一个或多个RADF或RPI的水平。
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于临床研究筛选候选者中类风湿性关节炎个体的鉴定，随后，这些个体可以包括于或排除于研究中或单独用于治疗或分析。5.4．RPI的纯化
在某些特定方面，本发明提供了已分离的RPI，优选的，人类RPI及其片段和衍生物，其包含抗原决定簇(也就是能被抗体识别)或者说是具有功能活性的，以及编码前述的核酸。此处所用的“具有功能活性的”RPI是指那些表现出具有一个或多个与全长RPI(野生型)相关的已知的功能活性的材料，例如：与RPI底物或结合配基结合、抗原性(与抗靶抗体结合)、免疫原性等。
在一个特定实施方案中，本发明提供了一种RPI的片段，包含至少6个氨基酸、10个氨基酸、50个氨基酸或至少75个氨基酸。也提供了片段或包含片段的缺失RPI某些或全部区域的蛋白质，还提供了编码前述物质的核酸。
一旦鉴定出表达RPI基因序列的重组核酸，就可以对其基因产物进行分析。这可以通过建立于产物物理或功能性质之上的分析来完成，包括产物放射性标记后的凝胶电泳分析、免疫分析等。
一旦鉴定出RPI，它就可以用标准方法进行分离和纯化，包括层析(例如：离子交换层析、亲和层析和分子筛柱层析)、离心、溶解度差异或其它用于蛋白质纯化的标准技术。
另外，一旦鉴定出由重组核酸产生的RPI，那么RPI的整个氨基酸序列就能从重组体中包含的嵌合基因的核苷酸序列推导出来，因此，相应蛋白质可以用本领域已知的标准的化学方法进行合成(例如参见Hunkapille等，1984，自然(Nature),310:105-111)
在另一个实施方案中，天然RPI可以从天然来源用前述的标准方法纯化(例如：免疫亲和纯化)。
在一个优选的实施方案中，RPI用美国申请第08/980,574和WO98/23950中优选技术所述的方法进行分离，在此引入作为参考。进行“制备级”操作时，根据Westermeier,1993，实践中的电泳技术(VCH,Weinheim,德国)，第197-209页(此处全文引入以作参考)描述的方法，等电聚焦步骤中优选“窄范围”的“聚集胶”，其pH范围为2个pH单位或更少。这种方法上的修改允许在胶上加载更大量的目标蛋白质，因而可以增加可从胶上回收的分离RPI的量。当以此方式进行制备级操作时，优选的技术在一次操作一般可提供近100ng及可高达1000ng分离的RPI。本领域技术人员应当理解聚集胶可用于使用凝胶等电聚焦的任何分离策略。
在本发明的一个特定实施方案中，重组DNA技术或化学合成方法或天然蛋白质纯化方法得到的RPI包括(但不局限于)，那些含有RPI全部或部分氨基酸序列的成分，以及其片段、其它衍生物、和类似物、包括其同源蛋白质。5.5．针对RPI的抗体的生产
依照发明，RPI及其片段、其它衍生物或类似物可以用作免疫原，用以生产可免疫特异性结合这种免疫原的抗体。这些蛋白质、片段、衍生物或类似物可用任何传统的方法加以分离，包括本申请前一部分叙述的方法。产生的抗体包括但不局限于多克隆、单克隆、嵌合的、单链的、Fab片段以及Fab表达文库。在一特定的实施方案中，生产了针对人RPI的抗体。在另一个实施方案中，生产了针对RPI结构域的抗体。在一个特定的实施方案中，RPI的亲水片段用作免疫原，用于抗体的生产。1.1本领域已知的多种方法可用于针对RPI或其衍生物、类似物的多克隆抗体生产。在一个特定的实施方案中，可以获得针对RPI的一个表位或其亚序列的兔多克隆抗体。多种宿主动物可以通过注射天然的RPI或合成的RPI或其衍生物(例如片段)来免疫，从而生产抗体。这些宿主动物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、马、山羊等。多种佐剂可以用于增强免疫反应，这依赖于宿主动物的物种，这些佐剂包括但不局限于完全或不完全福氏佐剂、矿物胶(如氢氧化铝)、表面活性物质，例如：溶血卵磷脂、多聚醇类(pluronic polyols)、多聚阴离子类、肽类、油乳剂类、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在的有用的人类佐剂，如BCG(卡芥苗)以及小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
为了制备针对RPI序列或其类似物的单克隆抗体，可以采用任何能够用连续培养的细胞系来产生抗体分子的技术。例如：最初由Kohler和Milstein发展起来的杂交瘤技术(1975，自然，256:495-497)以及三方杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫(Immunology Today),4:72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cote等，1985，摘自：单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer therapy),Alan R.Liss公司，第77-96页)(此处以上文献引入用作参考)。在发明的另外一个实施方案中，单克隆抗体可以在PCT/US90/02545(此处引入用作参考)中描述的无菌动物中产生。根据发明，可使用人抗体或可由使用人杂交瘤获得(Cote等，1983，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),80:2026-2030)，或体外用EBV病毒转化人类B细胞获得(Cole等，1985，摘自：单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss公司，第77-96页)。实际上，根据本发明，可以使用通过将特异识别RPI的鼠抗体分子的基因与具有合适生物活性的人抗体基因剪接，形成嵌合抗体(Morrison等，1984，美国国家科学院院报，81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312:604-608；Takeda等，1985，自然，314：452-454)的技术，这种抗体也在此发明范围之内。(此处引入以上每一个文献作为参考)。
根据发明，用于生产单链抗体的技术(美国专利4946,778，此处引入用作参考)可以经调整以用于生产RPI特异性单链抗体。在本发明的另一个实施方案中，使用用于构建Fab表达文库的技术(Huse等，1989，科学(Science),246:1275-1281)以快速方便的鉴定对RPI、衍生物或类似物具有理想特异性的单克隆Fab片段。
可以使用已知的技术生产含有分子独特型的抗体片段。例如：这些片段包括但不局限于：抗体分子经胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段；还原F(ab’)2片段的二硫键后产生的Fab’片段、抗体分子经木瓜蛋白酶和还原剂处理产生的Fab片段，以及Fv片段。
在抗体的生产过程中，目标抗体的筛选可以用本领域已知的技术来完成，例如：ELISA(酶联免疫吸附分析)。例如，为了选择能够识别RPI特定结构域的抗体，我们可以分析产生的杂交瘤，其产物能够与包含这样的结构域的RPI片段结合。为了选择能够特异性结合第一个RPI同系物而不特异性结合不同的RPI同系物的抗体，我们可以在第一个RPI同系物结合呈阳性而缺乏与第二个RPI同系物结合能力的基础上来进行筛选。类似的，为了选择能够特异性结合RPI而不特异性结合同一蛋白质的不同同种型(例如，与RPI具有相同核心肽的不同糖基化形式)的抗体，我们可以在RPI结合阳性而缺乏与不同同种型(例如糖基化形式)结合能力的基础上来进行筛选。
此外，已发展了用于制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，美国国家科学院院报，81,6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312，604-608；Takeda等，1985，自然，314,452-454)，方法是通过剪接来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因。一个嵌合抗体是一个其中不同部分来自不同动物种类的分子，如那些具有来自小鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白的恒定区的分子(见，例如，Cabilly等的美国专利4,816,567；和Boss等的美国专利4,816,397，此处全文引用作为参考。)
此外，还开发了用于制备人源化抗体的技术(见，例如，Queen的美国专利5,585,089；和Winter的美国专利5,225,539，此处全文引用作为参考。)。一个免疫球蛋白轻链或重链可变区由这样的“框架区”组成，该框架区由三个称为互补性决定区(CDR)的超变区间断。框架区和CDR的范围已被详细定义(见，“目的免疫球蛋白的蛋白质序列，Kabat,E.等，美国健康与人力服务部(1983))。简言之，人源化抗体是来自非人种类的抗体分子，具有一个或多个来自非人类的CDR以及来自人免疫球蛋白分子的框架区。
此外，可使用描述的用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778；Bird,1988，科学，242,423-426；Huston，等，1988，美国国家科学院院报，85,5879-5883；Ward等，1989，自然，334,544-546)。通过一个氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成了单链抗体，产生了单链多肽。
识别特定表位的抗体片段可通过已知技术产生。例如，这类片段包括但不限于，F(ab’)2片段(其可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生)，以及Fab片段(其可通过还原F(ab’)2片段的二硫键产生)。
或者，可构建Fab表达文库(Huse等，1989，科学，246,1275-1281)，从而迅速且方便地鉴定具有期望特异性的单克隆Fab片段。抗体标记及其应用
此处描述了用于可检测性标记分子的方法，所述的分子能特异性识别RPI(或RPI的保守性变体或肽片段)之一种或多种RPI表位。此处所用的标记及检测方法可以是例如，在Harlow和Lane(Harlow和Lane，1988，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)中所述，此处完整引入作为参考。
一种方法中，RPI特异性抗体或拟肽可通过将其连接于一种酶被标记，这种标记的分子可用于酶免疫分析，如ELISA(酶联免疫吸附分析)。结合于抗体的酶将与适当的底物反应，优选地一种发色底物，反应以这样的方式进行从而产生可被例如分光光度计法、荧光光度计法或可视法检测的化学基团。可被用于可检测地标记抗体、其衍生物和类似物的酶包括但不限于，苹果酸脱氢酶、链球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱脂酶。检测可通过发色法完成，其中利用针对酶的发色底物。检测也可通过与类似制备的标准相比的可视底物酶反应程度来完成。
为用于检测方法，优选用放射性同位素，包括但不限于125I、131I或99mTc标记分子。利用放射免疫分析(RIA)或放射性探针，这种肽和抗体可通过体内分析检测。放射性同位素可通过如下方法检测，如使用γ-计数器或液闪计数器或通过放射自显影方法。也可以用荧光化合物标记抗体、其衍生物或类似物以及肽。当荧光标记的肽暴露于适当波长的光线，由于其荧光可检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸胍、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻青蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
也可以用生物素标记抗体、其衍生物或类似物以及肽。生物素标记的肽可接触一种抗生物素蛋白偶联的可检测标记，如荧光标记偶联的抗生物素蛋白。因为抗生物素蛋白与生物素有高亲和力，抗生物素蛋白偶联的可检测标记可与生物素标记的肽结合，由此检测所述肽。
也可用发射荧光的技术如152Eu或其他镧系元素可检测地标记抗体、其衍生物或类似物以及肽。利用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)这些金属螯合基团可将这些金属结合于抗体、其衍生物或类似物以及肽。
也可通过偶联于化学发光化合物可检测地标记抗体、其衍生物或类似物以及肽。化学发光标记的肽的存在可通过检测在化学反应过程中增加的发光物的量测定。特别有用的化学发光物标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
类似地，可使用生物发光化合物标记本发明的抗体、其衍生物或类似物以及肽。生物发光物是见于生物系统中的一种化学发光物，其中一种催化蛋白质增加化学发光反应的效率。本发明的生物发光蛋白质通过检测发光物的存在测定。重要的用于标记的生物发光化合物有萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
测定可特异性结合RPI的标记的抗体可用于检测多种样品中RPI的存在，包括体液(如血浆、尿、脑脊液、关节吸出物)、组织样品或其匀浆。这种标记的抗体还可用于显示在各个细胞中或其上的RPI的定位。
测定可特异性结合RPI的标记的抗体可以用诊断有效剂量施用于患者，以检测RPI的存在。诊断有效量是指足以靶定在其表面含有RPI的诊断细胞分子的量，使得采用本领域可得的方法能检测细胞。
还提供了针对RPI的结构域的抗体。
前述抗体可以用于本领域已知的与本发明RPI的定位和活性相关的方法，例如：这些蛋白质的显像、在适当生理样品中RPI水平的测定和用在诊断方法中等等。5.6．编码RPI的DNA的分离
下面将以举例的方式，不加任何限制的阐述用于RPI基因克隆的特定的实施方案。
本发明的核苷酸序列(包括DNA和RNA)以及包含编码RPI或其片段、其类似物的序列，可以用本领域已知的方法合成，例如使用传统的化学合成方法和重叠寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)扩增。这些序列同样也可用作来自任何物种的RPI基因的克隆和鉴定，例如用于筛选cDNA文库、基因组文库或表达文库。
包含本发明中RPI编码序列的核苷酸序列可用于与其它蛋白质基因的互补序列选择性形成二聚体分子。依赖于不同的应用，不同的序列同一性可以通过不同的杂交条件来实现。
为了获得高度的选择性，可以使用相对苛刻的条件来形成二聚体，例如低盐或高温条件。此处所用的“高度严格条件”是指与滤膜上结合的DNA进行的杂交是在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA、65℃；在0.1×SSC/0.1％SDS、68℃下清洗。(Ausubel F.M.等编，1989，分子生物学通用操作规程(Current Protocols in Molecular Biology)，第一卷，Green出版联合公司和John Wiley & sons公司，纽约，第2.10.3页；此处完整引入作为参考)。对于某些应用，需要不甚严格的杂交条件。此处所用的“中度严格的条件”是指在0.2×SSC/0.1％SDS、42℃条件下清洗(Ausubel等，同上)。杂交条件也可以通过增加甲酰胺的量以使杂交二聚体去稳定而变得严格。因而特定的杂交条件可以容易的操纵，一般应当根据所预期的结果来选择。例如，传统的杂交温度在50％甲酰胺存在下是：对于与RPI基因片段有95-100％同源性的探针为42℃；90-95％同源性的为37℃；70-90％同源性的为32℃。
在基因组文库的制备中可以产生DNA片段，其中有些编码RPI的一部分或全部。DNA可能用多种限制性内切酶在特定位点切开。另外，可以在锰存在下使用DNA酶将DNA打碎，或者用物理方法将DNA剪切，例如用超声波。随后DNA片段可以根据大小用标准的方法进行分离，包括但不局限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析和蔗糖梯度离心。然后DNA片段可插入到适当的载体，包括但不局限于质粒、粘粒、λ或T4噬菌体和酵母人工染色体(YAC)(参见，例如，Sambrook等，1989，分子克隆实验手册)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；GloverD.M.(编)，1985,DNA克隆实验方法(DNA Cloning：A PracticalApproach),MRL出版有限公司，牛津，英国，第Ⅰ、Ⅱ卷；Ausubel F.M.等编，1989，分子生物学通用操作规程，第一卷，Green出版联合公司和John Wiley & sons公司，纽约)。基因组文库可以通过将核酸与标记的探针进行杂交来筛选(Benton和Davis,1979，科学，196:180；Grunstein和Hogness,1975，美国国家科学院院报，72:3961)。
基因组文库可以用相应于RPI的任一肽的氨基酸序列之标记的简并性寡核苷酸探针，使用本领域熟知的最适方法进行筛选。所用的探针优选的至少10个核苷酸(更优选的，15个核苷酸，仍旧更优选的，20个核苷酸)。
如前述表Ⅷ-表Ⅺ所示，此处公开的一些RPI对应于先前已鉴定的一些蛋白质，其编码基因的序列也已公开。要筛选这样的基因，可以使用任何与这些基因和其互补序列互补的探针，优选的，探针长度为10核苷酸或更长，更优选的，15核苷酸或更长。使用国家生物技术信息中心(NCBI)的检索数据库(其网址为：http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)可以通过下述检索号获得这些RPI的基因序列，此处引入每个基因的序列以作参考。
表Ⅻ RPI相关蛋白质的基因序列
 RADF#  RPI  检索号
 RADF-1  RPI-1  T40090,T40068
 RADF-3  RPI-3  AA551927,AA260531,W97741,N99366,T70526,T40177,T40060,T40034,T39910,T39894
 RADF-4  RPI-4  T41010,T40102,T40058,T39954
 RADF-6  RPI-5  AA269874
 RADF-8  RPI-6  Z20858,AA503766,H51308,H03365
 RADF-9  RPI-7  Z20858,AA503766,H51308,H03365
 RADF-10  RPI-8  Z21022,Z19947
 RADF-11  RPI-9  T41063,T41020,T41005,T40881,T40190,T40139,T40125,T40114,T40096,T39908
 RADF-12  RPI-11  T40090,T40068
 RADF-13  RPI-12  AA551927,AA260531,W97741,N99366,T70526,T40177,T40060,T40034,T39910,T39894
 RADF-14  RPI-13  T40090,T40068
 RADF-15  RPI-15  T40940,T40002
 RADF-16  RPI-16  T73244,T71043,T71032,T40181,T40116
 RADF-18  RPI-21  N99641,N99445,N99528,Z20485,Z20465
 RADF-19  RPI-22  AA269874
 RADF-20  RPI-23  Z20858,AA503766,H51308,H03365
 RADF-22  RPI-24  T1952,H73939,Z20894,T40182,T40167,T40158
 RADF-23  RPI-25  AA614684,AA523377,AA715907,AA580429,AA630254,AA617854,AA580356
 RADF-24  RPI-26  AA268201,T64416,T62149,T40186
 RADF-25  RPI-27  Z21017,Z20888,Z19984,Z19971,T41056,T40108
 RADF-26  RPI-28  T1952,H73939,Z20894,T40182,T40167,T40158
 RADF-26  RPI-29  Z21017,Z20888,Z19984,Z19971,T41056,T40108
 RADF-26  RPI-30  T64707
 RADF-27  RPI-31  Z20858,AA503766,H51308,H0336
 RADF-32  RPI-33  T40090,T40068
 RADF-33  RPI-34  T40090,T40068
 RADF-35  RPI-36  Z21022,Z19947
 RADF-36  RPI-37  Z20858,AA503766,H51308,H03365
对于RPI-10、RPI-17和RPI-20，其各自的一组简并性探针列于下面：a)RPI-10的探针5′- A C G A C C T T T A T G T T C T A T A G C A G C A A C -3′G   T G     G     G     C     C   G G     G     GT     T                       A   A T     T     TC     C                       G     C     C     Cb)RPI-17的探针5′- A C G A G C A T G A G G A G C A T C T A T A A G A T T -3′G   T G     G     G     G     G     C   G G     GT     T           T     T           A   A TC     C           C     C           G     Cc)PRI-20的探针5′- A G A T A T A T C A G C A C C A G A A T C -3′G C T C   G G     G     G     G C T GT     A   A       T     T     TC     G           C     C     C
文库中，含有编码RPI或其片段的目的DNA插入序列之克隆可以和一个或多个简并性寡核苷酸探针(或其互补序列)杂交。这种寡核苷酸探针与基因组文库的杂交可以使用本领域已知的方法进行。例如：与前面所述的系列简并性寡核苷酸探针(或其互补序列)杂交(或与这样的系列中的任何成员或其互补序列杂交)。这种杂交可以在前面所述的高度严格或中度严格的条件下进行，或可在2×SSC,1.0％SDS,50℃的反应和清洗条件下进行。
另一方面，编码RPI部分或全部多肽的核苷酸序列或RPI衍生多肽的核苷酸序列之克隆可以通过筛选表达文库获得。例如：相关来源的DNA分离后，制备随机片段，然后连接入一个表达载体(例如：噬菌体、质粒、噬菌粒和粘粒)以致于载体进入宿主细胞后而使载体中的插入片段能被宿主表达。多种筛选分析可用于选择表达的RPI或RPI衍生多肽。在一个实施方案中，本发明的多种抗RPI抗体通过本领域已知的方法可用于鉴定目标克隆，参见，例如：Harlow和Lane,1998，抗体实验手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约，附录Ⅳ。将文库中的克隆或噬菌斑与这些抗体接触从而鉴定那些结合的克隆。
在一个实施方案中，根据Olsvick等，第二十九届ICAAC，休斯顿，得克萨斯，1989的文献(此处引入用作参考)，含有编码RPI或RPI衍生多肽的序列之克隆或噬菌斑可以用DYNA珠来鉴定。抗RPI抗体交联于甲苯磺酰化的DYNA珠M280上，这些抗体包被珠可用于吸附至表达RPI和RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑。表达RPI或RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑可通过这种与珠的结合而得到鉴定。
另外，抗RPI抗体可以非特异性地固定化于适当的支持物上，例如：硅质或硅藻土(CelsiteTM)基质。这些材料可用于吸附表达RPI蛋白或RPI衍生多肽的细菌克隆。
另一方面，PCR扩增可用于产生编码来源于基因组DNA中的部分和全部RPI的基本上纯的DNA。简并的或其它的对应于已知RPI序列的寡核苷酸引物可用作引物。
PCR可以使用Perkin-Elmer Cetus的PCR扩增仪和热稳定的DNA聚合酶以及Taq聚合酶(Gene AMPTM)来进行。可以选择合成数个不同的简并性引物用于PCR反应。也可以改变引发PCR杂交反应的杂交条件的严格程度，以适应简并性引物和DNA序列中相应序列的更高的或更低的核苷酸序列相似性。成功地扩增编码RPI的序列的一个片段后，这一片段可以进行分子克隆和测序，并用作探针分离完整的基因组克隆。进而允许鉴定基因的完整核苷酸序列，及对其表达进行分析，生产用于如下所述的用于功能研究的蛋白质产物。
RPI基因也可以通过核酸杂交后体外翻译来筛选mRNA的方法进行鉴定。在此方法中，片段用于通过杂交分离互补的mRNA。这样的DNA片段可能代表着另一物种可用的纯化的RPI DNA(例如：小鼠或人)。对分离的mRNA之分离产物的体外翻译产物进行免疫沉淀分析或功能分析(例如：体外聚集能力、受体结合能力)可以鉴定目标mRNA，因而可鉴定包含目标序列的互补DNA片段。另外，特异性mRNA可能通过从细胞分离出的多核糖体与固定化的特异性针对RPI的抗体之吸附来选择。使用选择的mRNA(来自吸附的多核糖体)作为模板，可以合成放射性标记的RPI的cDNA片段。放射性标记的mRNA或cDNA能用作探针，鉴定来自其它基因组DNA片段的RPI的DNA片段。
分离RPI基因组DNA的替代方法包括但不局限于，从一已知的序列化学合成基因序列本身，或制造针对编码RPI之mRNA的cDNA。例如：用于RPI基因cDNA克隆的RNA可以从表达RPI的细胞中分离出来。其他方法也是可能的并也在本发明的范围之内。
任何真核细胞潜在的可以作为RPI基因分子克隆的来源。编码RPI的核酸序列可以从以下材料分离：脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、犬、以及其它灵长类动物来源、昆虫、植物等等。DNA可以通过本领域已知的标准方法从克隆的DNA(例如DNA文库)获得，可以通过化学合成、cDNA克隆或基因组DNA或其片段克隆，或纯化自目标细胞。(参见，例如：Sambrook等，1989，分子克隆实验手册)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；Glover D.M.(编)，1985,DNA克隆实验方法(DNA Cloning:A Practical Approach),MRL出版有限公司，牛津，英国，第Ⅰ、Ⅱ卷)。来源于基因组DNA的克隆除了包含编码区域以外，还可能包含调节序列和内含子DNA序列。来源于cDNA的克隆可能只包含外显子序列。不管来源如何，RPI基因应当通过分子克隆插入到一个适当的载体中以便进行扩增。
已分离的和已鉴定的基因或cDNA可随后插入到一个合适的克隆载体中。本领域大量的已知的载体宿主系统可用于此目的。可能的载体包括但不局限于，质粒或修饰的病毒，但是，载体系统必须和使用的宿主细胞相适应。这样的载体包括但不局限于，噬菌体例如λ噬菌体衍生物，或质粒例如pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene)。可以通过将DNA片段连接入含互补粘性末端的克隆载体来完成这种插入过程。但是，如果克隆载体中不合用于切开DNA的互补限制性位点，那么DNA分子末端可被酶促修饰。另外，任何目的位点可以通过向DNA末端连入核苷酸序列(连接子)产生。这些连接子可包含编码限制性内切酶识别序列的特定化学合成寡核苷酸。在一个替代方法中，切开的载体和RPI基因可能通过同源多聚尾来修饰。重组分子可通过转化、转染、感染、电转化等手段引入宿主细胞，以使基因序列产生许多拷贝。
在一个特定的实施方案中，用掺-分离的RPI基因、cDNA或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞，可以产生基因的多个拷贝。因而通过培养转化体，从其中分离重组DNA分子，可以获得大量的基因，需要时，可以从分离的重组DNA中回收插入基因。
本发明提供的RPI序列包含那些编码与天然RPI中发现的氨基酸序列基本上相同的核苷酸序列，以及那些编码具有同等功能氨基酸的序列和编码其他目标衍生物或类似物的序列。5.7．编码RPI的DNA的表达
编码RPI或具有活性功能类似物、片段或其它衍生物的核苷酸序列可以插入一个适当的表达载体，即含有插入蛋白质编码序列的转录和翻译的必需元件的载体。这些必需转录和翻译信号可以由天然RPI基因提供，或者由RPI基因侧翼区域提供。表达编码蛋白质序列可以选择多种宿主载体的表达系统。这些系统包括但不局限于，用病毒感染哺乳动物细胞的系统(如，痘病毒、腺病毒等等)；病毒感染的昆虫细胞表达系统(如杆状病毒)；微生物如带有酵母载体的酵母、噬菌体转化的细菌、DNA、质粒DNA或粘粒DNA。载体的表达元件的特异性和强度各不相同。依赖于所使用的宿主载体系统，可以使用若干适当的转录和翻译元件中的任何一个。在一个特定的实施方案中，表达了人的RPI基因或编码人RPI功能活性区的序列。在另外一个实施方案中，表达了包含RPI结构域的目标片段。
前面所述的用于将DNA片段插入到载体的任何方法可以用于构建含有嵌合基因的表达载体，这一嵌合基因包含适当的转录和翻译调节信号和蛋白质编码序列。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组体(遗传重组)。编码RPI或肽片段的核酸序列的表达可能受到第二核酸序列的调节，因此RPI或肽在用重组的DNA分子转化的宿主细胞中表达。例如，RPI基因的表达可以由本领域已知的任何启动子或增强子元件调节。可以用于调节RPI基因表达的启动子包括但不局限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，自然，290:304-310)，包含与鲁斯氏肉瘤病毒3’长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人，1980，细胞，22:787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，美国国家科学院院报，78:1441-1445)，金属硫蛋白基因调节序列(Brinster等人，1982，自然，296:39-42)；原核表达载体，例如β-半乳糖苷酶启动子(Villa Kmaroff等人，1978，美国国家科学院院报，75:3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报，86:21-25)；亦参见“重组细菌中的有用蛋白质”，科学美国人(Scientific American)1980，242:74-94)；植物表达载体，包括胭脂碱合成酶启动子区域(HerrerraEstrella等人，自然，303:209-213)；花椰菜花叶病毒35S的RNA启动子(Gardner等人，1981，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，9:2871)，光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrerra Estrella等人，1984，自然，310:115-120)；来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如：Gal4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子以及下述动物的转录调控区域，它们表现出组织特异性并已应用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区；(Swift等人，1984，细胞(Cell)，38:639-646；Omitz等人，1986，冷泉港症状定量生物学(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.)，50:399-09；MacDonald，1987，肝病学(Hepatology)，7:425-515)；在胰腺β-细胞中有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan,1985，自然，315:15-122)，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl等人，1984，细胞，38:647-658；Adames等人，1985，自然，318:533-538；Alexander等人，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),7:1436-1444)，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder等人，1986，细胞，45:485-495)，在肝脏中有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert等人，1987，基因与进展(Genes and Devel.)，1:268-276)，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因调控区(Krumlauf等人，1985，分子细胞生物学，5:1639-1648；Hammer等人，1987，科学，235:53-58)；在肝脏中有活性的α-1抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等人，1987，基因与进展，1:161-171)，在脊髓细胞中有活性的β-球蛋白基因调控区(Mogram等人，1985，自然，315:338-340；Kollias等人，1986，细胞，46:89-94)；在脑少突细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因调控区(Readhead等人，1987，细胞，48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因的调控区(Sani,1985，自然，314:283-286)以及在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因调控区(Mason等人，1986，科学，234:1372-1378)。
在一个特定的实施方案中，所用的载体包含与RPI编码核酸有效连接的启动子、一个和多个复制起点、以及任选地包含一个或多个选择标志(例如抗生素抗性基因)。
在一个特定的实施方案中，通过将RPI编码基因亚克隆入三个pGEX载体(谷胱甘肽S-转移酶表达载体；Smith和Johnson,1988，基因(Gene)，7:31-40)的每一个载体的EcoRI限制性位点中，构建表达构建体，这可以允许从正确阅读框架的亚克隆来表达RPI产物。
包含RPI基因插入物的表达载体可以通过三种通用方法验证：(a)核酸杂交，(b)有或无“标志”基因功能，以及(c)插入序列的表达。第一种方法中，我们可以利用核酸杂交检测表达载体中RPI基因插入物的存在，所用的探针包含与插入的RPI基因同源的序列。第二种方法中，可以利用载体中RPI基因插入造成某一特定“标志”基因功能的存在或缺失，对重组载体/宿主系统进行鉴定和筛选(例如：胸苷激酶活性，抗生素抗性，转化表型，杆状病毒包涵体形成等等。)。例如：如果RPI基因插入点位于载体的标志基因序列内，那么通过标志基因功能缺失可判定重组子中包含RPI基因插入序列。第三种方法中，可以通过检测重组体表达的RPI基因产物来验证重组表达载体。例如此分析可在RPI基因产物在体外分析系统中的物理或功能特性(例如与抗RPI抗体结合)的基础上进行。
一旦鉴定并且分离出某一特定重组DNA分子，就可利用本领域已知的多种方法进行扩增。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，就可对重组表达载体进行扩增和大量制备。如前所述，可用的表达载体包括但不局限于如下的载体或其衍生物：人类或动物病毒如痘病毒和腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(如λ)；质粒和粘粒DNA载体等等。
另外，可以选择调节插入序列表达，或以特定的理想方式修饰、加工基因产物的宿主细胞株。从某些启动子开始的表达在某些诱导剂存在下可以提高，因而可以控制遗传工程化的RPI的表达。进一步讲，不同的宿主细胞具有不同的特征性、特异性的用于翻译和翻译后加工和修饰的机制(例如：蛋白质的糖基化和磷酸化)。可以选择合适的细胞系或宿主系统来保证表达的外源蛋白质进行所希望的加工与修饰。例如：在细菌系统中的表达可用于生产非糖基化的核心蛋白质产物。在酵母中的表达可产生糖基化产物；在哺乳动物细胞中的表达可以用于保证外源蛋白质的“天然”糖基化。此外，不同的载体/宿主表达系统可能影响加工反应的程度。
为了长期高产量生产重组蛋白质，应当优选稳定的表达。例如可以构建能稳定表达不同表达能力或途径的基因蛋白质的细胞系。不是使用含有病毒复制起始位点的表达载体，宿主细胞可以用由适当表达调控元件控制的DNA(例如：启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等)以及选择标志进行转化。引入外源DNA后，工程化细胞可在加富培养基中生长1-2天，然后转移至一种选择性培养基中。重组质粒中的选择标志可产生对选择压力的抗性，因而可使细胞稳定的将质粒整合入宿主染色体，而生长形成菌落，菌落进而可以进行克隆和增殖成细胞系。这种方法在形成表达不同的表达的或途径基因蛋白质的工程细胞系方面具有许多优点。这种工程化细胞系在筛选和评价那些能影响不同表达能力的或途径基因蛋白质内源活性的化合物上特别有用。
许多选择系统可以使用，包括但不局限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，细胞，11:223)，次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,1962，美国国家科学院院报，48:2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，细胞，22:817)基因可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用。抗代谢物抗性也可以用作选择下列基因的基础：dhfr，赋予氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，1980，美国国家科学院院报，77:3567；O’Hore等人，1981，美国国家科学院院报，78:1527)；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligun和Berg,1981，美国国家科学院院报，78:2072)；neo，赋予对氨基糖苷G418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物学杂志(J.Mol.Boil.),150:1)以及hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，基因，30:147)。
在另一个实施方案中，RPI、片段、类似物或衍生物可表达为一个融合的、嵌合的蛋白质产物(包含通过肽键与外源蛋白质序列(不同的蛋白质)相连的蛋白质、片段、类似物、衍生物)。可通过将诸个编码目标氨基酸序列的适当核酸序列用本领域已知的方法以正确的编码框架相互连接起来，得到这种嵌合产物，然后用本领域公知的方法对嵌合产物进行表达。另外，这种嵌合产物可以用蛋白质合成技术生产，例如使用多肽合成仪。
cDNA和基因组序列都能进行克隆和表达。5.8 RPI的治疗用途
本发明通过施用治疗性化合物，提供对多种疾病和紊乱的治疗或预防。所述化合物包括但不限于，RPI及其类似物和衍生物(包括片段)(如，如此处所述)；其抗体(如此处所述)；编码RPI、其类似物、或衍生物的核酸(如此处所述)；RPI基因反义核酸，以及RPI基因的激动剂和拮抗剂。如此处所述，本发明的一个重要特征在于参与类风湿性关节炎的RPI基因的鉴定。可通过施用一种治疗性化合物治疗或防止关节炎，所述化合物可促进在RA患者的滑液中相对于血清而言下降的RPI的功能或表达。也可通过施用治疗性化合物治疗或防止关节炎，所述化合物可减低在RA患者的滑液中相对于血清而言增加的RPI的功能或表达。
总之，施用与患者相同种的来源或种间反应性(对于抗体的情况)的产物是优选的。由此，在一个优选实施方案中，将人RPI、其衍生物或类似物，或者核酸、或针对人RPI的抗体施用于人类患者用于治疗或预防。5.8.1类风湿性关节炎的治疗和预防
通过施用促进(即：增加或提供)一种或多种RPI(或一种或多种RADF水平)的水平或功能的化合物，从而治疗或预防类风湿性关节炎，所述RPI或RADF在患有RA的受试者的滑液中相对于血清而言降低了。这类化合物的例子包括但不限于RPI及其衍生物、或有功能活性的片段，特别是有如体外分析或动物模型中所示的活性；以及编码RPI或其有功能活性衍生物的核酸或其片段(如用于基因治疗)。其他可用的化合物如RPI的激动剂的鉴定可利用体外分析。
也可通过施用一种化合物治疗或防止关节炎，所述化合物抑制(即：降低)一种或多种RPI的水平或功能(或一种或多种RADF的水平)，从而治疗或预防类风湿性关节炎，所述RPI或RADF在患有RA的患者滑液中相对于血清而言显示增加的丰度。这类化合物的例子包括但不限于RPI反义寡核苷酸、核酶或针对RPI的抗体。其他可用的化合物如RPI的拮抗剂的鉴定可利用体外分析。
在特定实施方案中，与RA患者血清相比，当鉴定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相对于正常或期望值而言缺失或降低时，可治疗性(包括预防性)施用促进一种或多种RPI(或一种或多种RADF水平)的水平或功能的化合物。在另一实施方案中，与RA患者血清相比，当鉴定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相对于正常或期望值而言增加时，可治疗性(包括预防性)施用抑制一种或多种RPI(或RADF水平)的水平或功能的化合物。由于这类化合物的施用导致的RPI功能或水平(或RADF水平)的改变可方便的检测，如通过获得患者组织样品(如，从活检组织)并体外分析其RNA或蛋白质水平，或表达RPI RNA或蛋白质的活性。优选的技术也可采用，以检测施用化合物之前以及之后的RPI或RADF的水平。可如此利用多种本领域周知的标准方法，包括但不限于激酶分析、免疫分析，以检测和/或显示RPI(如，Western杂交、免疫沉淀随后是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫组化等)和/或杂交分析，以通过检测和/或显示编码RPI的mRNA(如，Northern分析、点杂交、原位杂交等)来检测RPI表达。
本发明化合物包括但不限于任何化合物，如可将RA患者的RPI或RADF图形向正常水平恢复的小有机分子、蛋白质、肽、抗体、核酸等，前提是这类化合物不是非甾体抗炎剂(NSAID)(如，强的松、布洛芬、非诺布芬、酮洛芬、氟布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、阿斯匹林、水杨酰水杨酸、diflunisal、萘普生、炎痛喜、替诺昔康、保泰松、羟布宗)、金盐、D-青霉胺、抗疟疾药，如羟氯喹或柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氨甲蝶呤、类皮质酮、抗CD4单克隆抗体或抗CDw52抗体。5.8.2基因治疗
在一个特定实施方案中，通过基因治疗方法施用包含编码RPI或其功能衍生物的核酸序列，以促进RPI功能。基因治疗是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的蛋白质，该蛋白质通过促进RPI功能介导治疗作用。
任何本领域可得的基因治疗方法均可根据本发明使用。示范性方法如下述。
关于基因治疗方法的一般性综述，见Goldspiel等，1993，临床药理(Clinical Pharmacy)12:488-508；Wu和Wu,1991，生物治疗(Biotherapy)3:87-95；Tolstoshev,1993，药物毒理年鉴(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32:573-596；Mulligan,1993，科学(Science)260:926-932；Morgan和Anderson,1993，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)62:191-217；1993,5,TIBTECH 11(5):155-215)。本领域周知的可用的重组DNA技术的方法如Ausubel等，(编)，分子生物学现代方法，John Wiley & Sons,NY；和Kriegler,1990，基因转移和表达，实验室手册，Stockton出版社，NY。
在优选的方面，化合物包含编码RPI蛋白质的核酸，所述核酸是在合适宿主中表达RPI或其片段或其嵌合蛋白质之表达载体的一部分。特别是，这类核酸具有与RPI编码区有效连接的启动子，所述启动子为组成型或诱导型的，以及任选的是组织特异性的。在另一实施方案中，使用核酸分子，其中RPI编码序列及任何其他期望序列的侧翼为促进在基因组希望的位点同源重组的区域，由此提供RPI核酸的染色体内表达。(Koller和Smithies,1989，美国国家科学院院报，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)。
核酸向患者的递送可以直接的方式，其中患者直接接触核酸或携带核酸的载体；或可以是间接的方式，其中，细胞首先体外用核酸转化，然后移植入患者。这两种途径分别已知为体内或离体基因治疗。
在一个特定实施方案中，体内直接施用核酸，其中核酸表达产生编码的产物。这可通过多种本领域已知的方法中任一种完成，如：通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分，且通过如下方法施用进行感染使其成为细胞内的，例如，通过缺陷型或减毒逆转录病毒载体或其它病毒载体(见，美国专利4,980,286)；或裸DNA直接注射，或使用微颗粒轰击(如，基因枪；Biolistic,Dupont)；或用脂类、细胞表面受体或转染剂包被，包封于脂质体、微颗粒或微胶囊；或通过将其以与已知能进入核的肽键连的形式施用；通过将其以与经历受体介导的胞饮作用的配体键连的形式施用(见，如Wu和Wu，生物化学杂志，262:4429-4432)(其可用于靶定于特异性表达受体的细胞类型)等等。在另一实施方案中，可形成核酸配体复合物，其中，配体包括一种融合性病毒肽以破坏核内体，使得核酸免受溶酶体降解。在另一实施方案中，通过靶定一个特定受体，可体内靶定核酸用于细胞特异性摄入和表达(见，如，PCT公开文本WO92/06180，1992年，4月16日，(Wu等)；WO92/22635,1992年12月23日，(Wilson等)；WO92/20316 1992年11月26,(Findeis等)；W093/14188 1993年，7月22,(CIarke等),WO93/20221 1993年10月14，(Young))。或者，可通过同源重组将核酸细胞内导入并掺入宿主细胞DNA用于表达(Koller和Smithies,1989，美国国家科学院院报，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342:435-438)。
在一特定实施方案中，使用一种含有编码RPI的核酸的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(见Miller等，1993，酶学方法(Meth.Enzymol.)217:581-599)。这些逆转录病毒载体已经过修饰，删除了对于包装病毒基因组及整合入宿主细胞DNA而言非必需的逆转录病毒序列。待用于基因治疗的编码RPI之核酸被克隆入载体，这有助于基因向患者的递送。更具体地关于逆转录病毒载体的报道参见Boesen等，1994，生物治疗6:291-302，其中描述了使用逆转录病毒载体将mdr I基因向造血干细胞递送，以使干细胞更加耐受化疗。其它阐明逆转录病毒载体在基因治疗中的使用的文献有：Clowes等，1994，临床研究杂志(临床研究杂志)93:644-651；Kiem等，1994，血液(Blood)83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993，人类基因治疗(Human Gene Therapy)4:129-141；以及Grossman和Wilson,1993，遗传学与发育的当代观点(Curr.Opin.in Genetics and Devel.)3:110-114)。
腺病毒是可用于基因治疗的其它病毒载体。对于将基因递送至呼吸上皮细胞腺病毒是特别有吸引力的载体。腺病毒天然感染呼吸性上皮细胞，并由此产生温和性疾病。基于腺病毒的递送系统之其它靶点是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有可感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson,1993，遗传学与发育的当代观点，3：499-503提供了基于腺病毒基因治疗的观点。Bout等，1994，人类基因治疗5：3-10证实，腺病毒载体用于将基因转移入恒河猴的呼吸性上皮细胞。其它在基因治疗中使用腺病毒的例子见于Rosenfeld等，1991，科学252:431-434；Rosenfeld等，1992，细胞68:143-155；Mastrangeli等，1993，临床研究杂志91:225-234；PCT公开文本WO94/12649；和Wang等，1995，基因治疗2:775-783。
腺伴随病毒(AAV)以被建议用于基因治疗(Walsh等，1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；美国专利5,436,146)。
基因治疗的另一途径涉及通过如下方法将基因转移入组织培养的细胞，包括电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染，或病毒感染。通常，转移方法包括将一种选择性标记转移入细胞。然后将细胞置于选择性条件下，以分离那些已摄入并表达转移入的基因的细胞。然后，将那些细胞递送至患者。
在这个实施方案中，将核酸导入细胞，然后体内施用所得的重组细胞。这种导入可通过本领域已知的任何一种方法进行，包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒载体或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。本领域已知多种用于将异源基因导入细胞的技术(见，入，Loeffler和Behr,1993，酶学方法，217:599-618；Cohen等，1993，酶学方法，618-644；Cline,1985，药物治疗(Pharmac.Ther.)29:69-92)且可依本发明使用，只要受体细胞的必要发育及生理功能不被破坏。技术应使核酸向细胞稳定地转移，使得核酸被细胞表达，且优选地可被其细胞后代遗传和表达。
通过本领域已知的多种方法所得重组细胞可被递送至患者。在一个优选实施方案中，例如皮下注射上皮细胞。在另一实施方案中，可作为皮肤移植物将重组皮肤细胞移植至患者。优选地通过静脉内施用重组血细胞(如，造血干细胞或先祖细胞)。构思施用的细胞量取决于期望的作用、患者的状况等，可由本领域普通技术人员决定。
可导入核酸用于基因治疗的细胞包括任何希望的可得的细胞类型，包括但不限于，上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维母细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或先祖细胞，特别是造血于细胞或先祖细胞，如获自脊髓、脐带血、外周血、胎肝等。
在一个优选实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。
在一个实施方案中，重组细胞用于基因治疗，将编码RPI的核酸导入细胞，使得其能被细胞或其后代表达，然后将重组细胞体内施用用以治疗。在一特定实施方案中，采用造血干细胞及先祖细胞。任何能被分离和体外维持的干细胞和/或先祖细胞可有效地根据本发明的实施方案施用(见，如PCT公开文本WO 94/08598,1994年4月28日；Stemple和Anderson,1992，细胞，71:973-985；Rheinwald,1980，细胞生物学方法(Meth.Cell Bio.)21A:229；以及Pittelkow和cott,1986,Mayo ClinicProc.,61:771)。
在一特定实施方案中，用于基因治疗的待导入的核酸包含与编码区有效连接的诱导型启动子，使得可通过适当的转录诱导物的存在与否控制核酸的表达。5.8.3 RPI的抑制以治疗类风湿性关节炎1.1.1
在本发明的实施方案中，通过施用拮抗(抑制)RPI水平和/或RPI功能的化合物治疗或预防RA，其中所述RPI与患有RA的患者血清中相比，在滑液中的水平升高。可采用的化合物包括但不限于抗RPI抗体(及含有其结合区的片段和衍生物)、RPI反义或核酶核酸、和用于通过同源重组“敲除”内源性RPI功能的编码无功能RPI的核酸(见，如，Capecchi,1989，科学，244:1288-1292)。在一特定实施方案中，作为RPI拮抗剂，采用含有RPI基因的部分之核酸，其中的核苷酸编码侧翼(5′和3′)为不同基因序列的RPI，以促进通过同源重组的RPI失活作用。(也参见Koller和Smithies,1989，美国国家科学院院报86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)。可通过已知的方便的体外检测鉴定抑制RPI功能的其它化合物，如基于其抑制RPI与其它蛋白质结合的能力、或抑制任何已知RPI功能的能力，优选地在体外检测，或在细胞培养物中检测，尽管也可利用遗传检测。也可采用优选技术，用于检测在化合物施用之前和之后的RPI水平。优选地，利用适当地体外或体内检测以测定特定化合物的作用，以及是否化合物的施用显示受影响的组织的治疗。
在特定实施方案中，与患有RA的患者的血清相比，当滑液中检测的RPI水平或RPI功能的增加(如，高于正常水平或希望的水平)时，治疗性施用(包括预防性)抑制RPI功能的化合物。可通过如下方法方便的检测RPI水平或功能的增加，例如，通过定量蛋白质和/或RNA、通过获得患者滑液及血清样品，以及体外检测其RNA或蛋白质水平、编码RPI的表达的RNA之结构和/或活性、或RPI本身。可如此采用本领域的许多标准方法，包括但不限于检测和/或显示RPI的激酶检测、免疫检测(如，Western印迹、免疫沉淀随后是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫组化等)和/或杂交检测，以通过分别检测和/或显示检测编码RPI的mRNA(如，Northern印迹、点杂交、原位杂交等)检测RPI的表达等等。5.8.4 RPI的反义调控1.1.1
在特定实施方案中，通过采用RPI反义核酸抑制RPI功能。本发明提供了治疗或预防用途的核酸，包括至少与基因或编码RPI的cDNA或其部分反义的6个核苷酸。如此处所用，RPI的“反义”核酸是指依照一些序列互补性可与编码RPI的RNA(优选地mRNA)的部分杂交的核酸。反义核酸可与编码RPI之mRNA的编码区和/或非编码区互补。这种反义核酸具有如可抑制RPI功能的化合物的用途，且可用于治疗或防止类风湿性关节炎。
本发明的反义核酸可以是单链或双链的寡核苷酸、RNA或DNA或其修饰或衍生的部分，其可被直接施用于细胞，或者其可通过外源性导入序列在细胞内产生。
本发明还提供含有在药学可接受载体中的有效量的本发明之RPI反义核酸的药物组合物，如下述。
在另一实施方案中，本发明涉及用于在原核或真核细胞中抑制RPI核酸序列表达的方法，包括向细胞提供含有本发明RPI反义核酸的有效量的组合物。
RPI反义核酸及其用途如下述。RPI反义核酸
RPI反义核酸是至少6个核苷酸，且优选为寡核苷酸(从6个至约50个寡核苷酸)。在一特定方面，寡核苷酸至少为10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少100个核苷酸、或至少200核苷酸。寡核苷酸可为DNA或RNA、或其嵌合混合物、或衍生物或修饰变体、单链或双链。寡核苷酸可以在碱基部分、糖基部分或磷酸骨架上被修饰。寡核苷酸可包含其它附加的基团如肽，或促进跨越细胞膜转运的试剂(见，如，Letsinger等，1989，美国国家科学院院报86:6553-6556；Lemaitre等，1987，美国国家科学院院报，84:648-652；PCT公开文本WO 88/09810，公开日12月15日，1988)或促进跨越血脑屏障的试剂(见如，PCT公开文本WO89/10134，公开于4月25日，1988)、杂交引发的切割剂(参见如，Krol等，1988，生物技艺，6:958-976)或嵌入剂(参见如，Zon,1988，药物研究(Pharrn.Res.)5:539-549)。
在本发明的优选方面，提供了RPI反义寡核苷酸，优选为单链DNA。寡核苷酸可通过用本领域周知的取代基在其结构上的任何位置加以修饰。
RPI反义寡核苷酸可包括至少一种选自以下的修饰的碱基，包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosyl queosine、肌苷、N-6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-6腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosyl queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N-6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W和2,6二氨基嘌呤。
在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一种修饰的糖基部分，如选自阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖的糖基。
在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一种修饰的磷酸骨架，其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲乙二缩醛或其类似物。
在另一实施方案中，寡核苷酸是α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸与互补RNA形成特定的双链杂合体，其中与通常的β单位相反，各链彼此相互平行。(Gautier等，1987，核酸研究(Nucl.Acids Res.),15:6625-6641)。
寡核苷酸可与其它分子偶联，如肽、杂交引发的交联剂、转运剂、杂交引发的切割剂等。
可通过本领域周知的标准方法合成本发明的寡核苷酸，如通过使用自动DNA合成仪(如可从Biosearch、Applied Biosystems，等购得的)。例如，可通过Stein等，(1988，核酸研究16:3209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可通过采用受控孔的玻璃聚合物支持物制备甲基磷酸酯寡核苷酸(Sarin等，1988，美国国家科学院院报85:7448-7451)等。
在一个特定实施方案中，通过外源序列的转录于细胞内产生本发明的RPI反义核酸。例如，可体内导入载体使得其被细胞摄入，在细胞内载体或其部分被转录，产生本发明的反义核酸(RNA)。这类载体含有编码RPI反义核酸的序列。这类载体可为游离的或整合入染色体，只要其可被转录产生目标反义RNA。这类载体可通过本领域标准的重组DNA技术构建。载体可为质粒、病毒或其它本领域用于在哺乳动物细胞中复制和表达的材料。编码RPI反义核酸的序列之表达可由本领域周知的在哺乳动物(优选为人)细胞中起作用的启动子控制。这类启动子可为诱导型或组成型。这类启动子包括但不限于：SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon,1981，自然290:304-310)、包含于劳氏肉瘤病毒3’长末端重复的启动子(Yamamoto等，1980，细胞，22:787-797)，疱疹胸腺嘧啶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院院报，78:1441-1445)，金属硫蛋白基因调控序列(Brinster等，1982，自然，296:39-42)等。
本发明的反义核酸包括与RPI基因(优选人RPI基因)的RNA转录物的至少一部分互补的序列。尽管绝对互补是优选的，但不是必需的。一个“与至少RNA的一部分互补”的序列在此是指一个具有足够互补性、能够与RNA杂交形成稳定双螺旋的序列；对于双链RPI反义核酸，可如此测试双链DNA的一个单链，或可检测三链形成。杂交的能力取决于互补性的程度以及反义核酸的长度。通常，杂交的核酸越长，可能含有的与编码RPI的RNA的错配碱基越多，但仍形成稳定双螺旋(或三螺旋，有时如此)。本领域技术人员能通过采用标准步骤测定杂交复合物的熔点以确定错配的可接受的程度。5.8.5 RPI反义核酸的治疗用途
当患有类风湿性关节炎的患者滑液中目标RPI过量表达时，可施用RPI反义核酸治疗(或防止)类风湿性关节炎。在优选实施方案中，采用单链DNA反义RPI寡核苷酸。
表达或过量表达编码RPI的RNA的细胞类型可通过多种本领域周知的方法鉴定。这些细胞类型包括但不限于，白细胞(如，中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞)和驻留细胞(如滑膜细胞)。这类方法包括但不限于，与RPI特异性核酸杂交(如，通过Northern杂交、点杂交、原位杂交)、观察待体外翻译RPI的细胞翻译RNA的能力、免疫检测等。在优选的方面，可在治疗前通过例如免疫细胞化学或原位杂交的方法检测患者原代组织的RPI表达。
本发明的药物组合物包含药学可接受载体中的有效量的RPI反义核酸，其可施用于患有类风湿性关节炎的患者。
在治疗RA中有效的RPI反义核酸的量可通过标准临床技术确定。如可能，在试验及用于人类之前，希望体外测定待治疗的肿瘤类型的反义细胞毒性，随后在有用的动物模型系统中测试。
在一个特定实施方案中，通过脂质体、微颗粒或微胶囊施用含有RPI反义核酸的药物组合物。在多个本发明的实施方案中，可采用这类组合物实现RPI反义核酸的缓释。在一特定实施方案中，可希望利用脂质体通过抗体靶定特定的可鉴别的肿瘤抗原(Leonetti等，1990，美国国家科学院院报，87:2448-2451；Renneisen等，1990，生物化学杂志，265:16337-16342)。5.8.6抑制性核酶及三股螺旋途径
在另一实施方案中，可通过与周知的降低RPI基因表达的水平之基因“敲除”、核酶和/或三股螺旋方法一起使用RPI基因序列，从而降低RPI基因的表达水平和/或RPI基因产物的活性，缓解RA症状。在表现出可调节RPI基因的活性、表达或合成的能力之化合物(包括缓解RA症状的能力的化合物)中包括核酶和三股螺旋分子。可设计这类分子用于降低或抑制(如希望，不损害)突变靶基因活性。用于制备和使用这类分子的技术为本领域周知。
设计催化性切割RPI基因mRNA转录物的核酶分子可用于防止靶基因mRNA的转录，因此防止RPI基因产物的表达。(参见如，PCT国际公开文本WO90/11364，公开于10月4日，1990；Sarver等，1990，科学，247:1222-1225)。
核酶是能催化RNA特异性切割的酶性RNA分子(综述见Rossi,1994，当代生物学(Current Biology)4,469-471)。核酶作用的机理包括核酶分子与互补性靶RNA的序列特异性杂交，随后是内切核酸切割事件。核酶分子的组成必须包括一个或多个与靶基因mRNA互补的序列，且必须包括周知的负责mRNA切割的催化序列。对于这样的序列，参见如，美国专利5,093,246，此处引入作为参考。
当在特异性识别序列位点切割mRNA的核酶可被用于破坏编码RPI的mRNA时，优选使用锤头核酶。锤头核酶通过切割这种位点的mRNA，该位点由与靶mRNA形成互补性碱基对的侧翼区标明。仅仅需要的是靶mRNA具有如下两个碱基序列：5’-UG-3’。锤头核酶的构建和制备为本领域周知，完整的描述见Myers,1995，分子生物学和生物技术：简明手册，VCH Publishers,New York，(尤其见图4,833页)和见于Haseloff与Gerlach,1988，自然，334,585-591，此处完整引入作为参考。
优选地，设计核酶使得切割识别位点位于编码RPI的mRNA之5’端，即：增加效率并最小化非功能性mRNA转录物的胞内积累。
本发明的核酶还包括RNA内切核酸酶(以下称为Cech型核酶)，诸如天然存在于嗜热四膜虫(Tetrahymena therrnophila)(称为IVS，或L-19 IVS RNA)以及已被Thomas Cech及其同事充分描述了的那些(Zaug，等，1984，科学，224,574-578；Zaug和Cech,1986，科学，231,470-475；Zaug，等，1986，自然，324,429-433；公开的国际专利申请WO88/04300(University Patents Inc.；Been和Cech，1986，细胞，47，207-216)。Cech型核酶具有8碱基对活性位点，其与靶RNA序列杂交，其后发生靶RNA的切割。本发明涵盖了那些靶定在编码RPI基因中存在的8碱基对活性位点序列的Cech型核酶。
至于在反义方法中，核酶可由修饰的寡核苷酸(例如，用于增加稳定性、靶定等)组成，且应被递送至体内表达RPI的细胞中。优选的递送方法包括使用编码在强组成型pol Ⅲ或pol Ⅱ启动子控制下的核酶之DNA构建体，使得转染的细胞可产生足够量的核酶，以破坏编码RPI的内源RNA并抑制翻译。因为核酶如同反义分子一样是催化性的，为达到效率需要较低地细胞内浓度。
可通过使用靶定同源重组灭活或“敲除”RPI基因或其启动子，降低内源性RPI表达(如，参见Smithies，等，1985，自然，317:230-234；Thomas和Capecchi，1987，细胞，51:503-512；Thompson等，1989，细胞，5：313-321；此处全文引入作为参考)。例如，可使用一种突变、非功能性RPI基因(或完整的不相关DNA序列)，其侧翼为与内源RPI基因同源的DNA(可为编码RPI的基因之编码区或调控区)，带有或不带有选择性标记和/或隐性选择性标记，用这样的序列转染体内表达靶基因的细胞。通过靶定同源重组将DNA构建体插入，造成靶基因的灭活。这种方法特别适合于农业领域，其中对ES(胚发生干)细胞的修饰可用于产生具有失活靶基因的动物子代(如见，Thomas和Capecchi,1987以及Thompson,1989，出处同上)。然而，这种方法可经修改以适用于人类，只要重组DNA构建体直接施用或利用病毒载体体内靶定于需要的位点。
另外，可通过靶定互补于RPI基因调控区(即，RPI基因启动子和/或增强子)的脱氧核糖核苷酸序列降低内源性RPI基因表达，以形成在体内靶细胞中防止RPI基因转录的三股螺旋结构(一般参见，Helene,1991，抗肿瘤药物研究(Anticancer Drug Res.),6(6),569-584；Helene,等，1992，纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.),660,27-36；以及Maher,1992，生物检测(Bioassays),14(12),807-815)。
待用于三股螺旋形成以抑制转录的核酸分子应为单链，且由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成必须经设计以促进通过Hoogsteen碱基配对法则的三股螺旋形成，这一般需要将存在于双螺旋一个链上的嘌呤或嘧啶之相当大的延伸。核苷酸序列可是基于嘧啶的，这样会在所得三股螺旋的三个结合链之间形成TAT和CGC*三联体。富含嘧啶的分子提供了同与之处于平行方向的双螺旋单链上之富含嘌呤区互补的碱基。此外，可选择富含嘌呤的核酸分子，例如，含有G残基的延伸。这些分子与富含GC对的DNA双螺旋形成三股螺旋，其中嘌呤残基的大部分位于靶双螺旋的单链，导致在三螺旋的三个链之间的GGC三联体。
另外，通过产生所谓“改变角度(switchback)”的核酸分子，可增加能被靶定三螺旋形成的潜在序列。改变角度的分子可以交替的5′-3′和3′-5′方式合成，使得其与双螺旋的第一链破基配对，然后与另一链配对，消除了对于待存在于双螺旋的一个链上之嘌呤或嘧啶的相当大延伸片段的必要性。
在其中此处所述的反义、核酶和/或三股螺旋分子用于抑制突变基因表达的情况中，可能这些技术非常有效降低或抑制由正常RPI基因等位基因产生的mRNA的转录(三螺旋)和/或翻译(反义、核酶)，这就增加了这种可能性，其中存在的正常RPI基因产物可能低于正常表型所需的浓度。在这种情况下，为保证维持基本正常的RPI基因活性水平，因此可通过基因治疗方法，将编码并表达显示正常RPI基因活性的RPI基因多肽导入细胞，采用不含有易于受到反义、核酶或三螺旋处理攻击的序列。此外，当RPI基因编码胞外蛋白质时，可优选与正常RPI基因蛋白质一起施用，以维持靶基因活性的必要水平。
可通过上述本领域关于DNA和RNA分子合成的任一方法制备本发明的反义RNA和DNA、核酶及三螺旋分子。这包括本领域周知的化学合成寡脱氧核糖核苷酸以及寡核糖核苷技术，诸如固相氨基磷酸(phosphoramidite)化学合成。此外RNA分子可通过体外和体内的编码反义RNA分子之DNA序列转录来产生。这类DNA序列可被掺入多种整合了适当RNA聚合酶启动子(如T7或SP6聚合酶启动子)的载体。此外，可组成型地或诱导型地(取决于采用的启动子)合成反义RNA的反义cDNA构建体，可被稳定地导入细胞系。5.9治疗或预防实用性的证实
本发明化合物在用于人类之前，优选地体外测试，然后体内用于希望的治疗或预防活性。例如，可使用体外检测测定是否有施用特定化合物的显示，包括体外细胞培养检测，其中，患者组织样品在培养液中生长，并接触或者以其它方法施用化合物，然后观察这类化合物对组织细胞的作用。
可测试待测化合物之恢复患有RA的患者中RADF或RPI水平，使之趋向于未患有RA的受试者中所见的水平的能力，或者检测在RA的试验动物模型中产生类似改变的能力(如，大鼠中非特异性关节炎)。能恢复所述水平的化合物可用做先导药物，用于进一步的药物发现，或治疗性使用。可通过优选技术、免疫分析、凝胶电泳及随后的显现、或任何其它本领域技术人员知晓的方法检测RADF和RPI的表达。这类分析可用于筛选侯选药物或用于临床监测或药物开发，其中RADF或RPI的丰度可用做临床疾病的代用标记。
在多种特定实施方案中，可用参与患者疾病的各种细胞类型之代表性细胞进行体外检测，以测定是否该化合物对这种细胞类型具有希望的作用。
在于人中测试之前可在适当的动物模型系统中检测用于治疗的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。对于体内检测，在施用于人之前，可采用任一本领域知晓的动物模型系统。5.10治疗/预防性施用和组合物
本发明提供了通过向受试者施用有效量的本发明化合物治疗(和预防)的方法。在一优选方面，本发明的化合物是基本上纯的(即，基本上不合有限制其作用或产生不希望地副作用的物质)。受试者优选为动物，包括但不限于如牛、猪、马、鸡、猫、狗等，优选为哺乳动物，最优选为人。在一特定实施方案中，非人哺乳动物是受试者。
当化合物含有如上述核酸时可采用用于施用的制剂和方法。其它合适的制剂和施用路线可选自下述。
已知多种递送系统且可用于施用本发明的化合物，如脂质体包封、微颗粒、微胶囊、能表达化合物的重组细胞、受体介导的细胞内吞(参见如，Wu和Wu,1987，生物化学杂志，262:4429-4432)，构建作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸等等。导入的方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、脑膜外和口内途径。可通过任一方便途径施用化合物，例如通过输注或大剂量注射、通过上皮或黏膜衬的吸收(如，口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)，以及可通过与其它生物活性剂一起施用。施用可为系统性或局部地。此外，通过任一适当的途径将本发明的药物组合物导入中枢神经系统是有利的，包括心室内或鞘内注射；心室内注射可借助例如结合至储液槽的心室内导管，如Ommaya储液槽。也可采用肺部施用，如通过利用吸入器或喷雾器，以及带有气溶胶剂的制剂。
在一特定实施方案中，可希望将本发明的药物组合物局部施用于需要治疗的部位。这可通过例如(不是以限制的方式)手术中的局部输注、局部涂用(例如与手术后的创口包扎一起)、注射、利用导管、利用栓剂或利用植入物的方法，所述植入物为多孔的或非多孔的、或胶凝材料，包括膜，如sialastic膜，或纤维。在一个实施方案中，可通过在恶性肿瘤或瘤性或前瘤性组织的位点(或原发位点)直接注射进行施用。
在另一实施方案中，化合物可以如下形式递送：在囊泡中，特别是在脂质体(见Langer，科学，249:1527-1533(1990)；Treat等，脂质体在感染性疾病与癌症治疗中，Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss，纽约，PP.353-365(1989)；Lopez-Berestein，出处同上，pp.317-327；通常见出处同上)。
在另一实施方案中，可在受控释放系统中递送化合物。在一个实施方案中，可采用泵(见Langer，出处同上；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等，外科(Surgery)88:507(1980)；Saudek等，新英格兰医学杂志，321：574(1989))。在另一实施方案中，可采用聚合物材料(见，受控释放的医疗应用,Langer和Wise(编),CRC Press.,BocaRaton,Florida(1974)；受控药物生物利用度，药品设计与性能，Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macrornol.Chem.23:61(1983)；还参见Levy等，科学，228:190(1985)；During等，神经科学年鉴(Ann.Neurol.)25:351(1989)；Howard等，神经外科学杂志(J.Neurosurg.)71:105(1989))。在另一实施方案中，可将受控释放系统置于治疗靶点(即：脑)附近，这样只需要系统性给药剂量的一部分。(参见如，Goodson，受控释放的医疗应用，出处同前，vol.2,pp.115-138(1984))。
其它受控释放系统在Langer(科学，249:1527-1533(1990))的综述中讨论。
在另一实施方案中，当本发明化合物为编码蛋白质的核酸时，可体内施用核酸促进其编码的蛋白质表达，这可通过将核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分，且通过如下方法施用使其成为细胞内的，例如，逆转录病毒载体或其它病毒载体(见，美国专利4,980,286)；直接注射，或使用微颗粒轰击(如，基因枪；Biolistic,Dupont)；或用脂类、细胞表面受体或转染剂包被，或通过将其以与已知能进入核的同型盒样肽键连的形式施用(见如，Joliot等，1991，美国国家科学院院报，88:1864-1868)等。或者，可通过同源重组将核酸细胞内导入并掺入宿主细胞DNA用于表达。
本发明还提供了药物组合物。这类组合物包括治疗有效量的化合物，以及药学可接受的载体。在一特定实施方案中，术语“药学可接受的”是指由联邦政府或州政府管理部门批准或列在美国药典或其它普遍承认的用于动物(尤其是人)的药典中。术语“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或治疗时一起使用的溶媒载体。这类药学载体可为无菌液体，如水或油类，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物为静脉内施用时水为优选的载体。生理盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用做液体载体，特别是用于注射溶液。适合的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、脱脂牛奶、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。如需要。组合物可还含有少量保湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以为溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。组合物也可被制为如栓剂，带有传统的结合剂和载体如三甘油三酯。口服制剂可包括标准载体，如口服级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子描述于雷明顿制药科学(＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂，)E.W.Martin。这类组合物含有治疗有效量的化合物(优选以纯化的形式)，还含有合适量的载体，以提供用于恰当施用于患者的形式。制剂应与施用模式相适应。
在一优选实施方案中，依照常规方法制备组合物，以作为适于静脉内施用于人类的药物组合物。一般，用于静脉内施用的组合物为无菌等渗水性缓冲液。如需要，组合物也可含有助溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以在注射部位缓解疼痛。通常，以单位剂量的单独或混合在一起的形式提供各个组分，例如，以在密封容器(如安瓿或标明活性剂的量的量筒)中的冻干粉或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注给药时，可将其分散于含有无菌药用级水或盐水的输液瓶中。当组合物通过注射给药时，可提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿，使得在给药前组分可被混合。
本发明化合物可被配制为中性或盐形式。药学可接受的盐包括与游离氨基形成的那些，如衍生于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与游离羟基形成的那些，如衍生于钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基醇、组氨酸、脯氨酸等。
在治疗RA中有效的本发明化合物的量可通过标准临床技术测定。此外，可任选地利用体外检测以帮助确定最优剂量范围。在制剂中采用的精确剂量取决于给药途径以及疾病或紊乱的严重程度，且应当根据执业医师的判断和各个患者的情况决定。但是，用于静脉内给药的适当剂量范围一般在每千克体重约20-500微克活性化合物。用于鼻内给药的适当剂量范围一般在每千克体重0.01pg至1mg。有效的剂量也可从来自体外或动物模型测试系统的剂量效应曲线外推得知。
一般栓剂含有范围在0.5％-10％(重量)的活性成分；口服制剂优选含有10％-95％的活性成分。
本发明还提供了含有填充有一种或多种本发明的药物组合物的成分之一个或多个容器的药物包装或试剂盒。任选地，与这类容器结合的还有以管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府部门颁布的许可通告，该通告反映出就用于人类施用而言得到管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府部门准许。
6.实施例患有类风湿性关节炎病人血清及滑液中的蛋白质
使用下面的参考实验规程，患有类风湿性关节炎(RA)的患者和未患有RA的患者(即痛风、骨关节炎、外伤性滑膜炎患者)之血清和滑液中的蛋白质，用等电聚焦和随后的SDS-PAGE进行分离，每个样品重复一次。6.1.样品制备
一收到血清样品即进行蛋白质分析(使用Pierce BCA Cat#23225)。将相当于总蛋白为300μg的血清按体积分为若干等份，每一份加入相同体积的10％(W/V)SDS(Fluka 71729)、2.3％(W/V)二硫苏糖醇(BDH443852A)。样品在95℃加热5分钟，然后冷却至20℃，然后向样品中加入125μl下述缓冲液：
8M尿素(BDH 452043w)
4％CHAPS(Sigma C3023)
65mM二硫苏糖醇(DTT)
2％(V/V)Resolytes 3.5-10(BDH 443382×)
此混合液涡旋混合后，在15℃、13000转/分钟条件下离心5分钟，上清液用等电聚焦分析。6.2．等电聚焦在临床研究中的应用
本发明的诊断方法和组合物可以有助于指导或监测临床研究，例如，测试用于类风湿性关节炎治疗的药物。在一个实施方案中，可以测试候选分子恢复类风湿性关节炎患者RADF或RPI水平趋向于非类风湿性关节炎受试者中所见水平的能力，或在治疗过的患者中保持RADF或RPI水平达到或接近非类风湿性关节炎患者或血清水平的能力。可以分析一个或多个RADF或RPI的水平。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于临床研究筛选候选者中类风湿性关节炎个体的鉴定，随后，这些个体可以包括于或排除于研究中或单独用于治疗或分析。RPI的纯化
在某些特定方面，本发明提供了已分离的RPI，优选的，人类RPI及其片段和衍生物，其包含抗原决定簇(也就是能被抗体识别)或者说是具有功能活性的，以及编码前述的核酸。此处所用的“具有功能活性的”RPI是指那些表现出具有一个或多个与全长RPI(野生型)相关的已知的功能活性的材料，例如：与RPI底物或结合配基结合、抗原性(与抗靶抗体结合)、免疫原性等。在一个特定实施方案中，本发明提供了一种RPI的片段，包含至少6个氨基酸、10个氨基酸、50个氨基酸或至少75个氨基酸。也提供了片段或包含片段的缺失RPI某些或全部区域的蛋白质，还提供了编码前述物质的核酸。一旦鉴定出表达RPI基因序列的重组核酸，就可以对其基因产物进行分析。这可以通过建立于产物物理或功能性质之上的分析来完成，包括产物放射性标记后的凝胶电泳分析、免疫分析等。一旦鉴定出RPI，它就可以用标准方法进行分离和纯化，包括层析(例如：离子交换层析、亲和层析和分子筛柱层析)、离心、溶解度差异或其它用于蛋白质纯化的标准技术。另外，一旦鉴定出由重组核酸产生的RPI，那么RPI的整个氨基酸序列就能从重组体中包含的嵌合基因的核苷酸序列推导出来，因此，相应蛋白质可以用本领域已知的标准的化学方法进行合成(例如参见Hunkapille等，1984，自然(Nature),310：105-111)在另一个实施方案中，天然RPI可以从天然来源用前述的标准方法纯化(例如：免疫亲和纯化)。在一个优选的实施方案中，RPI用美国申请第08/980,574和W098/23950优选技术中所述的方法进行分离，在此引入作为参考。进行“制备级”操作时，根据Westermeier,1993，实践中的电泳技术(VCH,Weinheim，德国)，第197-209页(此处全文引入以作参考)描述的方法，等电聚焦步骤中优选“窄范围”的“聚集胶”，其pH范围为2个pH单位或更少。这种方法上的修改允许在胶上加载更大量的目标蛋白质，因而可以增加可从胶上回收的分离RPI的量。当以此方式进行制备级操作时，优选的技术在一次操作一般可提供近100ng及可高达1000ng分离的RPI。本领域技术人员应当理解聚集胶可用于使用凝胶等电聚焦的任何分离策略。在本发明的一个特定实施方案中，重组DNA技术或化学合成方法或天然蛋白质纯化方法得到的RPI包括(但不局限于)，那些含有RPI全部或部分氨基酸序列的成分，以及其片段、其它衍生物、和类似物、包括其同源蛋白质。针对RPI的抗体的生产
依照发明，RPI及其片段、其它衍生物或类似物可以用作免疫原，用以生产可免疫特异性结合这种免疫原的抗体。这些蛋白质、片段、衍生物或类似物可用任何传统的方法加以分离，包括本申请前一部分叙述的方法。产生的抗体包括但不局限于多克隆、单克隆、嵌合的、单链的、Fab片段以及Fab表达文库。在一特定的实施方案中，生产了针对人RPI的抗体。在另一个实施方案中，生产了针对RPI结构域的抗体。在一个特定的实施方案中，RPI的亲水片段用作免疫原，用于抗体的生产。本领域已知的多种方法可用于针对RPI或其衍生物、类似物的多克隆抗体生产。在一个特定的实施方案中，可以获得针对RPI的一个表位或其亚序列的兔多克隆抗体。多种宿主动物可以通过注射天然的RPI或合成的RPI或其衍生物(例如片段)来免疫，从而生产抗体。这些宿主动物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、马、山羊等。多种佐剂可以用于增强免疫反应，这依赖于宿主动物的物种，这些佐剂包括但不局限于完全或不完全福氏佐剂、矿物胶(如氢氧化铝)、表面活性物质，例如：溶血卵磷脂、多聚醇类(pluronic polyols)、多聚阴离子类、肽类、油乳剂类、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在的有用的人类佐剂，如BCG(卡芥苗)以及小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。为了制备针对RPI序列或其类似物的单克隆抗体，可以采用任何能够用连续培养的细胞系来产生抗体分子的技术。例如：最初由Kohler和Milstein发展起来的杂交瘤技术(1975，自然，256:495-497)以及三方杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫(Immunology Today)，4:72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cote等，1985，摘自：单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancertherapy),Alan R.Liss公司，第77-96页)(此处以上文献引入用作参考)。在发明的另外一个实施方案中，单克隆抗体可以在PCT/US90/02545(此处引入用作参考)中描述的无菌动物中产生。根据发明，可使用人抗体或可由使用人杂交瘤获得(Cote等，1983，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),80:2026-2030)，或体外用EBV病毒转化人类B细胞获得(Cole等，1985，摘自：单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss公司，第77-96页)。实际上，根据本发明，可以使用通过将特异识别RPI的鼠抗体分子的基因与具有合适生物活性的人抗体基因剪接，形成嵌合抗体(Morrison等，1984，美国国家科学院院报，81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312:604-608；Takeda等，1985，自然，314:452-454)的技术，这种抗体也在此发明范围之内。(此处引入以上每一个文献作为参考)。根据发明，用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778，此处引入用作参考)可以经调整以用于生产RPI特异性单链抗体。在本发明的另一个实施方案中，使用用于构建Fab表达文库的技术(Huse等，1989，科学(Science),246:1275-1281)以快速方便的鉴定对RPI、衍生物或类似物具有理想特异性的单克隆Fab片段。可以使用已知的技术生产含有分子独特型的抗体片段。例如：这些片段包括但不局限于：抗体分子经胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段；还原F(ab’)2片段的二硫键后产生的Fab’片段、抗体分子经木瓜蛋白酶和还原剂处理产生的Fab片段，以及Fv片段。在抗体的生产过程中，目标抗体的筛选可以用本领域已知的技术来完成，例如：ELISA(酶联免疫吸附分析)。例如，为了选择能够识别RPI特定结构域的抗体，我们可以分析产生的杂交瘤，其产物能够与包含这样的结构域的RPI片段结合。为了选择能够特异性结合第一个RPI同系物而不特异性结合不同的RPI同系物的抗体，我们可以在第一个RPI同系物结合呈阳性而缺乏与第二个RPI同系物结合能力的基础上来进行筛选。类似的，为了选择能够特异性结合RPI而不特异性结合同一蛋白质的不同同种型(例如，与RPI具有相同核心肽的不同糖基化形式glycoform)的抗体，我们可以在RPI结合阳性而缺乏与不同同种型(例如糖基化形式)结合能力的基础上来进行筛选。
还提供了针对RPI的结构域的抗体。前述抗体可以用于本领域已知的与本发明RPI的定位和活性相关的方法，例如：这些蛋白质的显像、在适当生理样品中RPI水平的测定和用在诊断方法中等等。编码RPI的DNA的分离
下面将以举例的方式，不加任何限制的阐述用于RPI基因克隆的特定的实施方案。本发明的核苷酸序列(包括DNA和RNA)以及包含编码RPI或其片段、其类似物的序列，可以用本领域已知的方法合成，例如使用传统的化学合成方法和重叠寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)扩增。这些序列同样也可用作来自任何物种的RPI基因的克隆和鉴定，例如用于筛选cDNA文库、基因组文库或表达文库。
包含本发明中RPI编码序列的核苷酸序列可用于与其它蛋白质基因的互补序列选择性形成二聚体分子。依赖于不同的应用，不同的序列同源性可以通过不同的杂交条件来实现。为了获得高度的选择性，可以使用相对苛刻的条件来形成二聚体，例如低盐或高温条件。此处所用的“高度严格条件”是指与滤膜上结合的DNA进行的杂交是在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA、65℃；在0.1×SSC/0.1％SDS、68℃下清洗。(Ausubel F.M.等编，1989，分子生物学通用操作规程(Current Protocolsin Molecular Biology)，第一卷，Green出版联合公司和John Wiley&sons公司，纽约，第2.10.3页；此处完整引入作为参考)。对于某些应用，需要不甚严格的杂交条件。此处所用的“中度严格的条件”是指在0.2×SSC/0.1％SDS、42℃条件下清洗(Ausubel等，同上)。杂交条件也可以通过增加甲酰胺的量以使杂交二聚体去稳定而变得严格。因而特定的杂交条件可以容易的操纵，一般应当根据所预期的结果来选择。例如，传统的杂交温度在50％甲酰胺存在下是：对于与RPI基因片段有95-100％同源性的探针为42℃；90-95％同源性的为37℃；70-90％同源性的为32℃。在基因组文库的制备中可以产生DNA片段，其中有些编码RPI的一部分或全部。DNA可能用多种限制性内切酶在特定位点切开。另外，可以在锰存在下使用DNA酶将DNA打碎，或者用物理方法将DNA剪切，例如用超声波。随后DNA片段可以根据大小用标准的方法进行分离，包括但不局限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析和蔗糖梯度离心。然后DNA片段可插入到适当的载体，包括但不局限于质粒、粘粒、λ或T4噬菌体和酵母人工染色体(YAC)(参见，例如，Sambrook等，1989，分子克隆实验手册)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；GloverD.M.(编)，1985,DNA克隆实验方法(DNA Cloning:A PracticalApproach),MRL出版有限公司，牛津，英国，第Ⅰ、Ⅱ卷；Ausubel F.M.等编，1989，分子生物学通用操作规程，第一卷，Green出版联合公司和John Wiley&sons公司，纽约)。基因组文库可以通过将核酸与标记的探针进行杂交来筛选(Benton和Davis,1979，科学，196:180；Grunstein和Hogness,1975，美国国家科学院院报，72:3961)。
基因组文库可以用相应于RPI的任一肽的氨基酸序列之标记的简并性寡核苷酸探针，使用本领域熟知的最适方法进行筛选。所用的探针优选的至少10个核苷酸，更优选的，15个核苷酸，仍旧更优选的，20个核苷酸。
如前述表Ⅷ-表Ⅺ所示，此处公开的一些RPI对应于先前已鉴定的一些蛋白质，其编码基因的序列也已公开。要筛选这样的基因，可以使用任何与这些基因和其互补序列互补的探针，优选的，探针长度为10核苷酸或更长，更优选的，15核苷酸或更长。使用国家生物技术信息中心(NCBI)的检索数据库(其网址为：http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)可以通过下述检索号获得这些RPI的基因序列，此处引入每个基因的序列以作参考。RPI相关蛋白质的基因序列：RADF#RPI检索号
RADF-1 RPI-1 T40090,T40068RADF-3 RPI-3 AA551927,AA260531,W97741,N99366,T70526,T40177,T40060,T40034,T39910,T39894RADF-4 RPI-4 T41010,T40102,T40058,T39954RADF-6 RPI-5 AA269874RADF-8 RPI-6 Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-9 RPI-7 Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-10 RPI-8 Z21022,Z19947RADF-11 RPI-9T41063, T41020,T41005,T40881,T40190,T40139,T40125,T40114,T40096,T39908RADF-12 RPI-11T40090,T40068RADF-13
RPI-12AA551927,AA260531,W97741,N99366,T70526,T40177,T40060,T40034,T39910,T39894RADF-14 RPI-13T40090,T40068RADF-15 RPI-15T40940,T40002RADF-16 RPI-16T73244,T71043,T71032,T40181,T40116RADF-18 RPI-21N99641,N99445,N99528,Z20485,Z20465RADF-19 RPI-22AA269874RADF-20 RPI-23Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-22 RPI-24T1952,H73939,Z20894,T40182,T40167,T40158RADF-23 RPI-25AA614684,AA523377,AA715907,AA580429,AA630254,AA617854,AA580356RADF-24 RPI-26AA268201,T64416,T62149,T40186RADF-25 RPI-27Z21017,Z20888,Z19984,Z19971,T41056,T40108RADF-26 RPI-28T1952,H73939,Z20894,T40182,T40167,T40158RADF-26 RPI-29Z21017,Z20888,Z19984,Z19971,T41056, T40108RADF-26 RPI-30T64707RADF-27 RPI-31Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-32 RPI-33T40090,T40068RADF-33 RPI-34T40090,T40068RADF-35 RPI-36221022,Z19947RADF-36 RPI-37Z20858,AA503766,H51308, H03365对于每个RPI-10、RPI-17和RPI-20，提供了如下简并性探针：
(a)RPI-10的探针5’-A C G A C C T TT A T G T T C T A T A G C A G C A A C-3′  G    T G    GG     C     C   G G     G     G    T    T
  A   A T     T     T   C     C                       G
C     C      C(b)RPI-17的探针 5’-A C G A G C A T GA G G A G C A T C T A T A A G A T T-3′  G    T G    GG     G     G     C   G G     G          T     T        T
T           A   A-T                 C     C        CC           G     C    (C)RPI-20的探针5’-A G A T A T A T C A G C A C C A G A A T C-3′     G C T C    GG     G     G     G C T G             T    A    A       TT     T                   C   G            C    C       C
文库中，含有编码RPI或其片段的目的DNA插入序列之克隆可以和一个或多个简并性寡核苷酸探针(或其互补序列)杂交。这种寡核苷酸探针与基因组文库的杂交可以使用本领域已知的方法进行。例如：与前面所述的系列简并性寡核苷酸探针(或其互补序列)杂交(或与这样的系列中的任何成员或其互补序列杂交)。这种杂交可以在前面所述的高度严格或中度严格的条件下进行，或可在2×SSC,1.0％SDS,50℃的反应和清洗条件下进行。另一方面，编码RPI部分或全部多肽的核苷酸序列或RPI衍生多肽的核苷酸序列之克隆可以通过筛选表达文库获得。例如：相关来源的DNA分离后，制备随机片段，然后连接入一个表达载体(例如：噬菌体、质粒、噬菌粒和粘粒)以致于载体进入宿主细胞后而使载体中的插入片段能被宿主表达。多种筛选分析可用于选择表达的RPI或RPI衍生多肽。在一个实施方案中，本发明的多种抗RPI抗体通过本领域已知的方法可用于鉴定目标克隆，参见，例如：Harlow和Lane,1998，抗体实验手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约，附录Ⅳ。将文库中的克隆或噬菌斑与这些抗体接触从而鉴定的结合的克隆。在一个实施方案中，根据Olsvick等，第二十九届ICAAC，休斯顿，得克萨斯，1989的文献(此处引入用作参考)，含有编码RPI或RPI衍生多肽的序列之克隆或噬菌斑可以用DYNA珠来鉴定。抗RPI抗体交联于甲苯磺酰化的DYNA珠M280上，这些抗体包被珠可用于吸附至表达RPI和RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑。表达RPI或RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑可通过这种与珠的结合而得到鉴定。另外，抗RPI抗体可以非特异性的固定化于适当的支持物上，例如：硅质或硅藻土(CelsiteTM)基质。这些材料可用于吸附如前述表达RPI或RPI衍生多肽的细菌克隆。另一方面，PCR扩增可用于产生编码来源于基因组DNA中的部分和全部RPI的基本上纯的DNA。简并的或其它的对应于已知RPI序列的寡核苷酸引物可用作引物。
PCR可以使用Perkin-Elmer Cetus的PCR扩增仪和热稳定的DNA聚合酶，以下Taq聚合酶(Gene AMPTM)来进行。可以选择合成数个不同的简并性引物用于PCR反应。也可以改变引发PCR杂交反应的杂交条件的严格程度，以适应简并性引物和DNA序列中相应序列的更高的或更低的核苷酸序列相似性。成功地扩增编码RPI的序列的一个片段后，这一片段可以进行分子克隆和测序，并用作探针分离完整的基因组克隆。进而允许鉴定基因的完整核苷酸序列，及对其表达进行分析，生产用于如下所述的用于功能研究的蛋白质产物。RPI基因也可以通过核酸杂交后体外翻译来筛选mRNA的方法进行鉴定。在此方法中，片段用于通过杂交分离互补的mRNA。这样的DNA片段可能代表着另一物种可用的纯化的RPI DNA(例如：小鼠或人)。对分离的mRNA之分离产物的体外翻译产物进行免疫沉淀分析或功能分析(例如：体外聚集能力、受体结合能力)可以鉴定目标mRNA，因而可鉴定包含目标序列的互补DNA片段。另外，特异性mRNA可能通过从细胞分离出的多核糖体与固定化的特异性针对RPI的抗体之吸附来选择。使用选择的mRNA(来自吸附的多核糖体)作为模板可以合成放射性标记的RPI的cDNA片段。放射性标记的mRNA或cDNA能用作探针，鉴定来自其它基因组DNA片段的RPI的DNA片段。分离RPI基因组DNA的替代方法包括但不局限于，从一已知的序列化学合成基因序列本身，或制造针对编码RPI之mRNA的cDNA。例如：用于RPI基因cDNA克隆的RNA可以从表达RPI的细胞中分离出来。其他方法也是可能的并也在本发明的范围之内。
任何真核细胞潜在的可以作为RPI基因分子克隆的来源。编码RPI的核酸序列可以从以下材料分离：脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、犬、以及其它灵长类动物来源、昆虫、植物等等。DNA可以通过本领域已知的标准方法从克隆的DNA(例如DNA文库)获得，可以通过化学合成、cDNA克隆或基因组DNA或其片段克隆，或纯化自目标细胞。(参见，例如：Sambrook等，1989，分子克隆实验手册)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；Glover D.M.(编)，1985,DNA克隆实验方法(DNA Cloning:A Practical Approach),MRL出版有限公司，牛津，英国，第Ⅰ、Ⅱ卷)。来源于基因组DNA的克隆除了包含编码区域以外，还可能包含调节序列和内含子DNA序列。来源于cDNA的克隆可能只包含外显子序列。不管来源如何，RPI基因应当通过分子克隆插入到一个适当的载体中以便进行扩增。已分离的和已鉴定的基因或cDNA可随后插入到一个合适的克隆载体中。本领域大量的已知的载体宿主系统可用于此目的。可能的载体包括但不局限于，质粒或修饰的病毒，但是，载体系统必须和使用的宿主细胞相适应。这样的载体包括但不局限于，噬菌体例如λ噬菌体衍生物，或质粒例如pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene)。可以通过将DNA片段连接入含互补粘性末端的克隆载体来完成这种插入过程。但是，如果克隆载体中不含用于切开DNA的互补限制性位点，那么DNA分子末端可被酶促修饰。另外，任何目的位点可以通过向DNA末端连入核苷酸序列(连接子)产生。这些连接子可包含编码限制性内切酶识别序列的特定化学合成寡核苷酸。在一个替代方法中，切开的载体和RPI基因可能通过同源多聚尾来修饰。重组分子可通过转化、转染、感染、电转化等手段引入宿主细胞，以使基因序列产生许多拷贝。在一个特定的实施方案中，用掺入分离的RPI基因、cDNA或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞，可以产生基因的多个拷贝。因而通过培养转化体，从其中分离重组DNA分子，可以获得大量的基因，需要时，可以从分离的重组DNA中回收插入基因。本发明提供的RPI序列包含那些编码与天然RPI中发现的氨基酸序列基本上相同的核苷酸序列，以及那些编码具有同等功能氨基酸的序列和编码其他目标衍生物或类似物的序列。
编码RPI的DNA的表达
编码RPI或具有活性功能类似物、片段或其它衍生物的核苷酸序列可以插入一个适当的表达载体，即含有插入蛋白质编码序列的转录和翻译的必需元件的载体。这些必需转录和翻译信号可以由天然RPI基因提供，或者由RPI基因两侧区域提供。表达编码蛋白质序列可以选择多种宿主载体的表达系统。这些系统包括但不局限于，用病毒感染哺乳动物细胞的系统(如，痘病毒、腺病毒等等)；病毒感染的昆虫细胞表达系统(如杆状病毒)；微生物如带有酵母载体的酵母、噬菌体转化的细菌、DNA、质粒DNA或粘粒DNA。载体的表达元件的特异性和强度各不相同。依赖于所使用的宿主载体系统，可以使用若干适当的转录和翻译元件中的任何一个。在一个特定的实施方案中，表达了人的RPI基因或编码人RPI功能活性区的序列。在另外一个实施方案中，表达了包含RPI结构域的目标片段。前面所述的用于将DNA片段插入到载体的任何方法可以用于构建含有嵌合基因的表达载体，这一嵌合基因包含适当的转录和翻译调节信号和蛋白质编码序列。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组体(遗传重组)。编码RPI或肽片段的核酸序列的表达可能受到第二核酸序列的调节，因此RPI或肽在用重组的DNA分子转化的宿主细胞中表达。例如，RPI基因的表达可以由本领域已知的任何启动子或增强子元件调节。可以用于调节RPI基因表达的启动子包括但不局限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon,1981，自然，290:304-310)，包含与鲁斯氏肉瘤病毒3’长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人，1980，细胞，22:787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，美国国家科学院院报，78:1441-1445)，金属硫蛋白基因调节序列(Brinster等人，1982，自然，296:39-42)；原核表达载体，例如β-半乳糖苷酶启动子(Vlla Kmaroff等人，1978，美国国家科学院院报，75:3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报，86:21-25)；亦参见“重组细菌中的有用蛋白质”，科学美国人(Scientific American)1980,242:74-94)；植物表达载体，包括胭脂碱合成酶启动子区域(Herrerra Estrella等人，自然，303:209-213)；花椰菜花叶病毒35S的RNA启动子(Gardner等人，1981，核酸研究(Nucl.Acids Res.),9:2871)，光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrerra Estrella等人，1984，自然，310:115-120)；来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如：Gal4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子以及下述动物的转录调控区域，它们表现出组织特异性并已应用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区；(Swift等人，1984，细胞(Cell),38:639-646；Ornitz等人，1986，冷泉港症状定量生物学(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bio1.),50:399-409；MacDonald，1987，肝病学(Hepatology),7:425-515)；在胰腺β-细胞中有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan,1985，自然，315:115-122)，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl等人，1984，细胞，38:647-658；Adames等人，1985，自然，318:533-538；Alexander等人，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),7:1436-1444)，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder等人，1986，细胞，45:485-495)，在肝脏中有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert等人，1987，基因与进展(Genes and Devel.),1:268-276)，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因调控区(Krumlauf等人，1985，分子细胞生物学，5:1639-1648；Hammer等人，1987，科学，235:53-58)；在肝脏中有活性的α-1抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等人，1987，基因与进展，1:161-171)，在脊髓细胞中有活性的β-球蛋白基因调控区(Mogram等人，1985，自然，315:338-340；Kollias等人，1986，细胞，46:89-94)；在脑少突细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因调控区(Readhead等人，1987，细胞，48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因的调控区(Sani,1985，自然，314:283-286)以及在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因调控区(Mason等人，1986，科学，234:1372-1378)。在一个特定的实施方案中，所用的载体包含与RPI编码核酸有效连接的启动子、一个和多个复制起点、以及任选地包含一个或多个选择标志(例如抗生素抗性基因)。在一个特定的实施方案中，通过将RPI编码基因亚克隆入三个pGEX载体(谷胱甘肽S-转移酶表达载体；Smith和Johnson,1988，基因(Gene),7:31-40)的每一个载体的EcoRⅠ限制性位点中，构建表达构建体，这可以允许从正确阅读框架的亚克隆来表达RPI产物。包含RPI基因插入物的表达载体可以通过三种通用方法验证：(a)核酸杂交，(b)有或无“标志”基因功能，以及(c)插入序列的表达。第一种方法中，我们可以利用核酸杂交检测表达载体中RPI基因插入物的存在，所用的探针包含与插入的RPI基因同源的序列。第二种方法中，可以利用载体中RPI基因插入造成某一特定“标志”基因功能的存在或缺失，对重组载体/宿主系统进行鉴定和筛选(例如：胸苷激酶活性，抗生素抗性，转化表型，杆状病毒包涵体形成等等。)。例如：如果RPI基因插入点位于载体的标志基因序列内，那么通过标志基因功能缺失可判定重组子中包含RPI基因插入序列。第三种方法中，可以通过检测重组体表达的RPI基因产物来验证重组表达载体。例如此分析可在RPI基因产物在体外分析系统中的物理或功能特性(例如与抗RPI抗体结合)的基础上进行。一旦鉴定并且分离出某一特定重组DNA分子，就可利用本领域已知的多种方法进行扩增。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，就可对重组表达载体进行扩增和大量制备。如前所述，可用的表达载体包括但不局限于如下的载体或其衍生物：人类或动物病毒如痘病毒和腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(如λ)；质粒和粘粒DNA载体等等。另外，可以选择调节插入序列表达，或以特定的理想方式修饰、加工基因产物的宿主细胞株。从一定启动子开始的表达在某些诱导剂存在下可以提高，因而可以控制遗传工程化的RPI的表达。进一步讲，不同的宿主细胞具有不同的特征性、特异性的用于翻译和翻译后加工和修饰机制(例如：蛋白质的糖基化和磷酸化)。可以选择合适的细胞系或宿主系统来保证表达的外源蛋白质进行所希望的加工与修饰。例如：在细菌系统中的表达可用于生产非糖基化的核心蛋白质产物。在酵母中的表达可产生糖基化产物；在哺乳动物细胞中的表达可以用于保证外源蛋白质的“天然”糖基化。此外，不同的载体/宿主表达系统可能影响加工反应的程度。为了长期高产量生产重组蛋白质，应当优选稳定的表达。例如可以构建能稳定表达不同表达能力或途径的基因蛋白质的细胞系。不是使用含有病毒复制起始位点的表达载体，宿主细胞可以用由适当表达调控元件控制的DNA(例如：启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等)以及选择标志进行转化。引入外源DNA后，工程化细胞可在加富培养基中生长1-2天，然后转移至一种选择性培养基中。重组质粒中的选择标志可产生对选择压力的抗性，因而可使细胞稳定的将质粒整合入宿主染色体，而生长形成菌落，菌落进而可以进行克隆和增殖成细胞系。这种方法在形成表达不同地表达的或途径基因蛋白质的工程细胞系方面具有许多优点。这种工程化细胞系在筛选和评价那些能影响不同表达能力的或途径基因蛋白质内源活性的化合物上特别有用。许多选择系统可以使用，包括但不局限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，细胞，11：223)，次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,1962，美国国家科学院院报，48:2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，细胞，22:817)基因可以分别在tl-、hgprt-或aprt-细胞中使用。抗代谢物抗性也可以用作选择下列基因的基础：ddfr，赋予氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，1980，美国国家科学院院报，77:3567；O’Hore等人，1981，美国国家科学院院报，78:1527)；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligun和Berg,1981，美国国家科学院院报，78:2072)；neo，赋予对氨基糖苷G418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物学杂志(J.Mo1.Boil.),150:1)以及hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，基因，30:147)。
在另一个实施方案中，RPI、片段、类似物或衍生物可表达为一个融合的、嵌合的蛋白质产物(包含通过肽键与外源蛋白质序列(不同的蛋白质)相连的蛋白质、片段、类似物、衍生物)。可通过将诸个编码目标氨基酸序列的适当核酸序列用本领域已知的方法以正确的编码框架相互连接起来，得到这种嵌合产物，然后用本领域公知的方法对嵌合产物进行表达。另外，这种嵌合产物可以用蛋白质合成技术生产，例如使用多肽合成仪。cDNA和基因组序列都能进行克隆和表达。
RPI的治疗用途
本发明通过施用治疗性化合物，提供对多种疾病和紊乱的治疗或预防。所述化合物包括但不限于，RPI及其类似物和衍生物(包括片段)(如，如此处所述)；其抗体(如此处所述)；编码RPI、其类似物、或衍生物的核酸(如此处所述)；RPI基因反义核酸，以及RPI基因的激动剂和拮抗剂。如此处所述，本发明的一个重要特征在于参与类风湿性关节炎的RPI基因的鉴定。可通过施用一种治疗性化合物治疗或防止关节炎，所述化合物可促进在RA患者的滑液中相对于血清而言下降的RPI的功能或表达。也可通过施用治疗性化合物治疗或防止关节炎，所述化合物可减低在RA患者的滑液中相对于血清而言增加的RPI的功能或表达。总之，施用与患者相同种的来源或种间反应性(对于抗体的情况)的产物是优选的。由此，在一个优选实施方案种，将人RPI、其衍生物或类似物，或者核酸、或针对人RPI的抗体施用于人类患者用于治疗或预防。类风湿性关节炎的治疗和预防
通过施用促进(即：增加或提供)一种或多种RPI(或一种或多种RADF水平)的水平或功能的化合物从而治疗或预防类风湿性关节炎，所述RPI或RADF在患有RA的受试者的滑液中相对于血清而言降低了。这类化合物的例子包括但不限于RPI及其衍生物、或有功能活性的片段，特别是有如体外分析或动物模型中所示的活性；以及编码RPI或其有功能活性衍生物的核酸或其片段(如用于基因治疗)。其他可用的化合物如RPI的激动剂的鉴定可利用体外分析。也可通过施用一种化合物治疗或防止关节炎，所述化合物抑制(即：降低)一种或多种RPI的水平或功能(或一种或多种RADF的水平)，从而治疗或预防类风湿性关节炎，所述RPI或RADF在患有RA的患者滑液中相对于血清而言显示增加的丰度。这类化合物的例子包括但不限于RPI反义寡核苷酸、核酶或针对RPI的抗体。其他可用的化合物如RPI的拮抗剂的鉴定可利用体外分析。在特定实施方案中，与RA患者血清相比，当鉴定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相对于正常或期望值而言缺失或降低时，可治疗性(包括预防性)施用促进一种或多种RPI(或一种或多种RADF水平)的水平或功能的化合物。在另一实施方案中，与RA患者血清相比，当鉴定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相对于正常或期望值而言增加时，可治疗性(包括预防性)施用抑制一种或多种RPI(或RADF水平)的水平或功能的化合物。由于这类化合物的施用导致的RPI功能或水平(或RADF水平)的改变可方便的检测，如通过获得患者组织样品(如，从活检组织)并体外分析其RNA或蛋白质水平，或表达RPI RNA或蛋白质的活性。优选的技术也可采用，以检测施用化合物之前以及之后的RPI或RADF的水平。可如此利用多种本领域周知的标准方法，包括但不限于激酶分析、免疫分析，以检测和/或显示RPI(如，Western杂交、免疫沉淀随后是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫组化等)和/或杂交分析，以通过检测和/或显示编码RPI的mRNA(如，Northern分析、点杂交、原位杂交等)来检测RPI表达。本发明化合物包括但不限于任何化合物，如可将RA患者的RPI或RADF图形向正常水平恢复的小有机分子、蛋白质、肽、抗体、核酸等，前提是这类化合物不是非甾体抗炎剂(NSAID)(如，强的松、布洛芬、非诺布芬、酮洛芬、氟布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、阿斯匹林、水杨酰水杨酸、diflunisal、萘普生、炎痛喜、替诺昔康、保泰松、羟布宗)、金盐、D-青霉胺、抗疟疾药，如羟氯喹或柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氨甲蝶呤、类皮质酮、抗CD4单克隆抗体或抗CDw52抗体。基因治疗
在一个特定实施方案中，通过基因治疗方法施用包含编码RPI或其功能衍生物的核酸序列，以促进RPI功能。基因治疗是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的蛋白质，该蛋白质通过促进RPI功能介导治疗作用。本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的蛋白质，该蛋白质通过促进RPI功能介导治疗作用。任何本领域周知的基因治疗可根据本发明使用。示范性例子如下。关于基因治疗方法的一般性综述，见Goldspiel等，1993，临床药理(Clinical Pharmacy)12:488-508；Wu和Wu,1991，生物治疗(Biotherapy)3:87-95；Tolstoshev,1993，药物毒理年鉴(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32:573-596；Mulligan,1993，科学(Science)260:926-932；Morgan和Anderson,1993，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)62:191-217；1993,5,TIBTECH 11(5):155-215)。本领域周知的可用的重组DNA技术的方法如Ausubel等，(编)，分子生物学现代方法，John Wiley & Sons,NY；和Kriegler,1990，基因转移和表达，实验室手册，Stockton出版社，NY。在优选的方面，化合物包含编码RPI蛋白质的核酸，所述核酸是在合适宿主中表达RPI或其片段或其嵌合蛋白质之表达载体的一部分。特别是，这类核酸具有与RPI编码区有效连接的启动子，所述启动子为组成型或诱导型的，以及任选的是组织特异性的。在另一实施方案中，使用核酸分子，其中RPI编码序列合任何其他期望序列的侧翼为促进在基因组希望的位点同源重组的区域，由此提供RPI核酸的染色体内表达。(Koller和Smithies,1989，美国国家科学院院报，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)。核酸向患者的递送可以直接的方式，其中患者直接接触核酸或携带核酸的载体；或可以是间接的方式，其中，细胞首先体外用核酸转化，然后移植入患者。这两种途径分别已知为体内或离体基因治疗。在一个特定实施方案中，体内直接施用核酸，其中核酸表达产生编码的产物。这可通过多种本领域已知的方法中任一种完成，如：通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分，且通过如下方法施用进行感染使其成为细胞内的，例如，通过缺陷型或减毒逆转录病毒载体或其它病毒载体(见，美国专利4,980,286)；或裸DNA直接注射，或使用微颗粒轰击(如，基因枪；Biolistic,Dupont)；或用脂类、细胞表面受体或转染剂包被，包封于脂质体、微颗粒或微胶囊；或通过将其以与已知能进入核的肽键连的形式施用；通过将其以与经历受体介导的胞饮作用的配体键连的形式施用(见，如Wu和Wu，生物化学杂志，262:4429-4432)(其可用于靶定于特异性表达受体的细胞类型)等等。在另一实施方案中，可形成核酸配体复合物，其中，配体包括一种融合性病毒肽以破坏核内体，使得核酸免受溶酶体降解。在另一实施方案中，通过靶定一个特定受体，可体内靶定核酸用于细胞特异性摄入和表达(见，如，PCT公开文本WO92/06180，1992年，4月16日，(Wu等)；WO92/22635,1992年12月23日，(Wilson等)；WO92/20316 1992年11月26,(Findeis等)；WO93/14188 1993年，7月22,(Clarke等),WO93/20221 1993年10月14,(Young))。或者，可通过同源重组将核酸细胞内导入并掺入宿主细胞DNA用于表达(Koller和Smithies,1989，美国国家科学院院报，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342:435-438)。在一特定实施方案中，使用一种含有编码RPI的核酸的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(见Miller等，1993，酶学方法(Meth.Enzymol.)217:581-599)。这些逆转录病毒载体已经过修饰，删除了对于包装病毒基因组及整合入宿主细胞DNA而言非必需的逆转录病毒序列。待用于基因治疗的编码RPI之核酸被克隆入载体，这有助于基因向患者的递送。更具体地关于逆转录病毒载体的报道参见Boesen等，1994，生物治疗6:291-302，其中描述了使用逆转录病毒载体将mdrI基因向造血干细胞递送，以使干细胞更加耐受化疗。其它阐明逆转录病毒载体在基因治疗中的使用的文献有：Clowes等，1994，临床研究杂志(临床研究杂志)93:644-651；Kiem等，1994，血液(Blood)83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,人类基因治疗(Human Gene Therapy)4:129-141；以及Grossman和Wilson,1993，遗传学与发育的当代观点(Curr.Opin.in Genetics andDevel.)3:110-114)。腺病毒是可用于基因治疗的其它病毒载体。对于将基因递送至呼吸上皮细胞腺病毒是特别有吸引力的载体。腺病毒天然感染呼吸性上皮细胞，并由此产生温和性疾病。基于腺病毒的递送系统之其它靶点是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有可感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson,1993，遗传学与发育的当代观点，3:499-503提供了基于腺病毒基因治疗的观点。Bout等，1994，人类基因治疗5:3-10证实，腺病毒载体用于将基因转移入恒河猴的呼吸性上皮细胞。其它在基因治疗中使用腺病毒的例子见于Rosenfeld等，1991，科学252:431-434；Rosenfeld等，1992，细胞68:143-155；Mastrangeli等，1993，临床研究杂志91:225-234；PCT公开文本W094/12649；和Wang等，1995，基因治疗2:775-783。腺伴随病毒(AAV)以被建议用于基因治疗(Walsh等，1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300；美国专利5,436,146)。基因治疗的另一途径涉及通过如下方法将基因转移入组织培养的细胞，包括电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染，或病毒感染。通常，转移方法包括将一种选择性标记转移入细胞。然后将细胞置于选择性条件下，以分离那些已摄入并表达转移入的基因的细胞。然后，将那些细胞递送至患者。在这个实施方案中，将核酸导入细胞，然后体内施用所得的重组细胞。这种导入可通过本领域已知的任何一种方法进行，包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒载体或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。本领域已知多种用于将异源基因导入细胞的技术(见如，Loeffler和Behr,1993，酶学方法，217:599-618；Cohen等，1993，酶学方法，618-644；Cline,1985，药物治疗(Pharmac.Ther.)29:69-92)且可依本发明使用，只要受体细胞的必要发育及生理功能不被破坏。技术应使核酸向细胞稳定地转移，使得核酸被细胞表达，且优选地可被其细胞后代遗传和表达。通过本领域已知的多种方法所得重组细胞可被递送至患者。在一个优选实施方案中，例如皮下注射上皮细胞。在另一实施方案中，可作为皮肤移植物将重组皮肤细胞移植至患者。优选地通过静脉内施用重组血细胞(如，造血干细胞或先祖细胞)。构思施用的细胞量取决于期望的作用、患者的状况等，可由本领域普通技术人员决定。可导入核酸用于基因治疗的细胞包括任何希望的可得的细胞类型，包括但不限于，上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维母细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或先祖细胞，特别是造血干细胞或先祖细胞，如获自脊髓、脐带血、外周血、胎肝等。在一个优选实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。在一个实施方案中，重组细胞用于基因治疗，将编码RPI的核酸导入细胞，使得其能被细胞或其后代表达，然后将重组细胞体内施用用以治疗。在一特定实施方案中，采用造血干细胞及先祖细胞。任何能被分离和体外维持的干细胞和/或先祖细胞可有效地根据本发明的实施方案施用(见，如PCT公开文本WO 94/08598,1994年4月28日；Stemple和Anderson,1992，细胞，71:973-985；Rheinwald,1980，细胞生物学方法(Meth.Cell Bio.)21A:229；以及Pittelkow和cott,1986,Mayo Clinic Proc.,61:771)。在一特定实施方案中，用于基因治疗的待导入的核酸包含与编码区有效连接的诱导型启动子，使得可通过适当的转录诱导物的存在与否控制核酸的表达。RPI的抑制以治疗类风湿性关节炎
在本发明的实施方案中，通过施用拮抗(抑制)RPI水平和/或RPI功能的化合物治疗或预防RA，其中所述RPI与患有RA的患者血清中相比，在滑液中的水平升高。可采用的化合物包括但不限于抗RPI抗体(及含有其结合区的片段和衍生物)、RPI反义或核酶核酸、和用于通过同源重组“敲除”内源性RPI功能的编码无功能RPI的核酸(见，如，Capecchi,1989，科学，244:1288-1292)。在一特定实施方案中，作为RPI拮抗剂，采用含有RPI基因的部分只核酸，其中的核苷酸编码侧翼(5′和3′)为不同基因序列的RPI，以促进通过同源重组的RPI失活作用。(也参见Koller和Smithies,1989，美国国家科学院院报86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)。可通过已知的方便的体外检测鉴定抑制RPI功能的其它化合物，如基于其抑制RPI与其它蛋白质结合的能力、或抑制任何已知RPI功能的能力，优选地在体外检测，或在细胞培养物中检测，尽管也可利用遗传检测。也可采用优选技术，用于检测在化合物施用之前和之后的RPI水平。优选地，利用适当地体外或体内检测以测定特定化合物的作用，以及是否化合物的施用显示受影响的组织的治疗。在特定实施方案中，与患有RA的患者的血清相比，当滑液中检测的RPI水平或RPI功能的增加(如，高于正常水平或希望的水平)时，治疗性施用(包括预防性)抑制RPI功能的化合物。可通过如下方法方便的检测RPI水平或功能的增加，例如，通过定量蛋白质和/或RNA、通过获得患者滑液及血清样品以及体外检测其RNA或蛋白质水平、编码RPI的表达的RNA之结构和/或活性、或RPI本身。可如此采用本领域的许多标准方法，包括但不限于检测和/或显示RPI的激酶检测、免疫检测(如，Western印迹、免疫沉淀随后是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫组化等)和/或杂交检测，以通过分别检测和/或显示检测编码RPI的mRNA(如，Northern印迹、点杂交、原位杂交等)检测RPI的表达等等。RPI的反义调控
在特定实施方案中，通过采用RPI反义核酸抑制RPI功能。本发明提供了治疗或预防用途的核酸，包括至少与基因或编码RPI的cDNA或其部分反义的6个核苷酸。如此处所用，RPI的“反义”核酸是指依照一些序列互补性可与编码RPI的RNA(优选地mRNA)的部分杂交的核酸。反义核酸可与编码RPI之mRNA的编码区和/或非编码区互补。这种反义核酸具有如可抑制RPI功能的化合物的用途，且可用于治疗或防止类风湿性关节炎。本发明的反义核酸可以是单链或双链的寡核苷酸、RNA或DNA或其修饰或衍生的部分，其可被直接施用于细胞，或者其可通过外源性导入序列在细胞内产生。本发明还提供含有在药学可接受的载体中的有效量的本发明之RPI反义核酸的药物组合物，如下述。在另一实施方案中，本发明涉及用于在原核或真核细胞中抑制RPI核酸序列表达的方法，包括向细胞提供含有本发明RPI反义核酸的有效量的组合物。RPI反义核酸及其用途如下详述。RPI反义核酸
RPI反义核酸是至少6个核苷酸，且优选为寡核苷酸(从6个至约50个寡核苷酸)。在一特定方面，寡核苷酸至少为10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少100个核苷酸、或至少200核苷酸。寡核苷酸可为DNA或RNA、或其嵌合混合物、或衍生物或修饰变体、单链或双链。寡核苷酸可以在碱基部分、糖基部分或磷酸骨架上被修饰。寡核苷酸可包含其它附加的基团如肽，或促进跨越细胞膜转运的试剂(见，如，Letsinger等，1989，美国国家科学院院报86:6553-6556；Lemaitre等，1987，美国国家科学院院报，84:648-652；PCT公开文本WO 88/09810，公开日12月15日，1988)或促进跨越血脑屏障的试剂(见如，PCT公开文本WO89/10134，公开于4月25日，1988)、杂交引发的切割剂(参见如，Krol等，1988，生物技艺，6:958-976)或嵌入剂(参见如，Zon,1988，药物研究(Pharm.Res.)5:539-549)。在本发明的优选方面，提供了RPI反义寡核苷酸，优选为单链DNA。寡核苷酸可通过用本领域周知的取代基在其结构上的任何位置加以修饰。RPI反义寡核苷酸可包括至少一种选自以下的修饰的碱基，包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosyl queosine、肌苷、N-6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-6腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N-6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W和2,6二氨基嘌呤。在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一种修饰的糖基部分，如选自阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖的糖基。在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一种修饰的磷酸骨架，其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲乙二缩醛或其类似物。在另一实施方案中，寡核苷酸是α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸与互补RNA形成特定的双链杂合体，其中与通常的β单位相反，各链彼此相互平行。(Gautier等，1987，核酸研究(Nucl.Acids Res.),15:6625-6641)。寡核苷酸可与其它分子偶联，如肽、杂交引发的交联剂、转运剂、杂交引发的切割剂等。可通过本领域周知的标准方法合成本发明的寡核苷酸，如通过施用自动DNA合成仪(如可从Biosearch、Applied Biosystems，等购得的)。例如，可通过Stein等，(1988，核酸研究16:3209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可通过采用受控孔的玻璃聚合物支持物制备甲基磷酸酯寡核苷酸(Sarin等，1988，美国国家科学院院报85:7448-7451)等。在一个特定实施方案中，通过外源序列的转录于细胞内产生本发明的RPI反义核酸。例如，可体内导入载体使得其被细胞摄入，在细胞内载体或其部分被转录，产生本发明的反义核酸(RNA)。这类载体含有编码RPI反义核酸的序列。这类载体可为游离的或整合入染色体，只要其可被转录产生目标反义RNA。这类载体可通过本领域标准的重组DNA技术构建。载体可为质粒、病毒或其它本领域用于在哺乳动物细胞中复制和表达的材料。编码RPI反义核酸的序列之表达可由本领域周知的在哺乳动物(优选为人)细胞中起作用的启动子控制。这类启动子可为诱导型或组成型。这类启动子包括但不限于：SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon,1981，自然290:304-310)、包含于劳氏肉瘤病毒3’长末端重复的启动子(Yamamoto等，1980，细胞，22:787-797)，疱疹胸腺嘧啶启动子(Wagner等，1981,美国国家科学院院报，78:1441-1445)，金属硫蛋白基因调控序列(Brinster等，1982，自然，296:39-42)等。本发明的反义核酸包括与RPI基因(优选人RPI基因)的RNA转录物的至少一部分互补的序列。尽管绝对互补是优选的，但不是必需的。一个“与至少RNA的一部分互补”的序列在此是指一个具有足够互补性、能够与RNA杂交形成稳定双螺旋的序列；对于双链RPI反义核酸，可如此测试双链DNA的一个单链，或可检测三链形成。杂交的能力取决于互补性程度以及反义核酸的长度。通常，杂交的核酸越长，可能含有的与编码RPI的RNA的错配碱基越多，但仍形成稳定双螺旋(或三螺旋，有时如此)。本领域技术人员能通过采用标准步骤测定杂交复合物的熔点以确定错配的可接受的程度。RPI反义核酸的治疗用途
当患有类风湿性关节炎的患者滑液中目标RPI过量表达时，可施用RPI反义核酸治疗(或防止)类风湿性关节炎。在优选实施方案中，采用单链DNA反义RPI寡核苷酸。表达或过量表达编码RPI的RNA的细胞类型可通过多种本领域周知的方法鉴定。这些细胞类型包括但不限于，白细胞(如，中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞)和驻留细胞(如滑膜细胞)。这类方法包括但不限于，与RPI特异性核酸杂交(如，通过Northern杂交、点杂交、原位杂交)、观察待体外翻译RPI的细胞翻译RNA的能力、免疫检测等。在优选的方面，可在治疗前通过例如免疫细胞化学或原位杂交的方法检测患者原代组织的RPI表达。本发明的药物组合物包含药学可接受载体中的有效量的RPI反义核酸，其可施用于患有类风湿性关节炎的患者。在治疗RA中有效的RPI反义核酸的量可通过标准临床技术确定。如可能，在试验及用于人类之前，希望体外测定待治疗的肿瘤类型的反义细胞毒性，随后在有用的动物模型系统中测试。在一个特定实施方案中，通过脂质体、微颗粒或微胶囊施用含有RPI反义核酸的药物组合物。在多个本发明的实施方案中，可采用这类组合物实现RPI反义核酸的缓释。在一特定实施方案中，可希望利用脂质体通过抗体靶定特定的可鉴别的肿瘤抗原(Leonetti等，1990，美国国家科学院院报，87:2448-2451；Renneisen等，1990，生物化学杂志，265:16337-16342)。抑制性核酶及三股螺旋途径
在另一实施方案中，可通过与周知的降低RPI基因表达的水平之基因“敲除”、核酶和/或三股螺旋方法一起使用RPI基因序列，从而降低RPI基因的表达水平和/或RPI基因产物的活性，缓解RA症状。在表现出可调节RpI基因的活性、表达或合成的能力之化合物中(包括缓解RA症状的能力的化合物)包括有核酶和三股螺旋分子。可设计这类分子用于降低或抑制(如希望，不损害)突变靶基因活性。用于制备和使用这类分子的技术为本领域周知。设计催化性切割RPI基因mRNA转录物的核酶分子可用于防止靶基因mRNA的转录，因此防止RPI基因产物的表达。(参见如，PCT国际公开文本WO90/11364，公开于10月4日，1990；Sarver等，1990，科学，247:1222-1225)。核酶是能催化RNA特异性切割的酶性RNA分子(综述见Rossi,1994，当代生物学(CurrentBiology)4,469-471)。核酶作用的机理包括核酶分子与互补性靶RNA的序列特异性杂交，随后是内切核酸切割事件。核酶分子的组成必须包括一个或多个与靶基因mRNA互补的序列，且必须包括周知的负责mRNA切割的催化序列。对于这样的序列，参见如，美国专利5,093，246，此处引入作为参考。当在特异性识别序列位点切割mRNA的核酶可被用于破坏编码RPI的mRNA时，优选使用锤头核酶。锤头核酶通过切割这种位点的mRNA，该位点由与靶mRNA形成互补性碱基对的侧翼区标明。仅仅需要的是靶mRNA具有如下两个碱基序列：5’-UG-3’。锤头核酶的构建和制备为本领域周知，完整的描述见Myers，1995，分子生物学和生物技术：简明手册，VCH Publishers,New York，(尤其见图4,833页)和见于Haseloff与Gerlach,1988，自然，334,585-591，此处完整引入作为参考。优选地，设计核酶使得切割识别位点位于编码RPI的mRNA之5’端，即：增加效率并最小化非功能性mRNA转录物的胞内积累。本发明的核酶还包括RNA内切核酸酶(以下称为Cech型核酶)，诸如天然存在于嗜热四膜虫(称为IVS，或L-19 IVS RNA)以及已被Thomas Cech及其同事充分描述了的那些(Zaug,等，1984，科学，224，574-578；Zaug和Cech,1986，科学，231,470-475；Zaug，等，1986，自然，324,429-433；公开的国际专利申请WO88/04300(University PatentsInc.；Been和Cech,1986，细胞，47,207-216)。Cech型核酶具有8碱基对活性位点，其与靶RNA序列杂交，其后发生靶RNA的切割。本发明涵盖了那些靶定在编码RPI基因中存在的8碱基对活性位点序列的Cech型核酶。至于在反义方法中，核酶可由修饰的寡核苷酸(例如，用于增加稳定性、靶定等)组成，且应被递送至体内表达RPI的细胞中。优选的递送方法包括使用编码在强组成型pol Ⅲ或pol Ⅱ启动子控制下的核酶之DNA构建体，使得转染的细胞可产生足够量的核酶，以破坏编码RPI的内源RNA并抑制翻译。因为核酶如同反义分子一样是催化性的，为达到效率需要较低地细胞内浓度。可通过使用靶定同源重组灭活或“敲除”RPI基因或其启动子，降低内源性RPI表达(如，参见Smithies,等，1985，自然，317:230-234；Thomas和Capecchi,1987，细胞，51:503-512；Thompson等，1989，细胞，5:313-321；此处全文引入作为参考)。例如，可使用一种突变、非功能性RPI基因(或完整的不相关DNA序列)，其侧翼为与内源RPI基因同源的DNA(可为编码RPI的基因之编码区或调控区)，带有或不带有选择性标记和/或隐性选择性标记，用这样的序列转染体内表达靶基因的细胞。通过靶定同源重组将DNA构建体插入，造成靶基因的灭活。这种方法特别适合于农业领域，其中对ES(胚发生干)细胞的修饰可用于产生具有失活靶基因的动物子代(如见，Thomas和Capecchi,1987以及Thompson,1989，出处同上)。然而，这种方法可经修改以适用于人类，只要重组DNA构建体直接施用或利用病毒载体体内靶定于需要的位点。另外，可通过靶定互补于RPI基因调控区(即，RPI基因启动子和/或增强子)的脱氧核糖核苷酸序列降低内源性RPI基因表达，以形成在体内靶细胞中防止RPI基因转录的三股螺旋结构(一般参见，Helene,1991，抗肿瘤药物研究(Anticancer DrugRes.),6(6),569-584；Helene，等，1992，纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.),660,27-36；以及Maher，1992，生物检测(Bioassays),14(12)，807-815)。待用于三股螺旋形成以抑制转录的核酸分子应为单链，且由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成必须经设计以促进通过Hoogsteen碱基配对法则的三股螺旋形成，这一般需要将存在于双螺旋一个链上的嘌呤或嘧啶之相当大的延伸。核苷酸序列可是基于嘧啶的，这样会在所得三股螺旋的三个结合链之间形成TAT和CGC*三联体。富含嘧啶的分子提供了同与之处于平行方向的双螺旋单链上之富含嘌呤区互补的碱基。此外，可选择富含嘌呤的核酸分子，例如，含有G残基的延伸。这些分子与富含GC对的DNA双螺旋形成三股螺旋，其中嘌呤残基的大部分位于靶双螺旋的单链，导致在三螺旋的三个链之间的GGC三联体。另外，通过产生所谓“改变角度”的核酸分子，可增加能被靶定三螺旋形成的潜在序列。改变角度的分子可以交替的5′-3′和3′-5′方式合成，使得其与双螺旋的第一链碱基配对，然后与另一链配对，消除了对于待存在于双螺旋的一个链上之嘌呤或嘧啶的相当大延伸片段的必要性。在其中此处所述的反义、核酶和/或三股螺旋分子用于抑制突变基因表达的情况中，可能这些技术非常有效降低或抑制由正常RPI基因等位基因产生的mRNA的转录(三螺旋)和/或翻译(反义、核酶)，这就增加了这种可能性，其中存在的正常RPI基因产物可能低于正常表型所需的浓度。在这种情况下，为保证维持基本正常的RPI基因活性水平，因此可通过基因治疗方法，将编码并表达显示正常RPI基因活性的RPI基因多肽导入细胞，采用不含有易于受到反义、核酶或三螺旋处理攻击的序列。此外，当RPI基因编码胞外蛋白质时，可优选与正常RPI基因蛋白质一起施用，以维持靶基因活性的必要水平。可通过上述本领域关于DNA和RNA分子合成的任一方法制备本发明的反义RNA和DNA、核酶及三螺旋分子。这包括本领域周知的化学合成寡脱氧核糖核苷酸以及寡核糖核苷技术，诸如固相氨基磷酸化学合成。此外RNA分子可通过体外和体内的编码反义RNA分子之DNA序列转录来产生。这类DNA序列可被掺入多种整合了适当RNA聚合酶启动子(如T7或SP6聚合酶启动子)的载体。此外，可组成型地或诱导型地(取决于采用的启动子)合成反义RNA的反义cDNA构建体可被稳定地导入细胞系。治疗或预防实用性的证实
本发明化合物在用于人类之前，优选地体外测试，然后体内用于希望的治疗或预防活性。例如，可使用体外检测测定是否有施用特定化合物的显示，包括体外细胞培养检测，其中，患者组织样品在培养液中生长，并接触或者以其它方法施用化合物，然后观察这类化合物对组织细胞的作用。可测试待测化合物之恢复患有RA的患者中RADF或RPI水平，使之趋向于未患有RA的受试者中所见的水平的能力，或者检测在RA的试验动物模型中产生类似改变的能力(如，大鼠中非特异性关节炎)。能恢复所述水平的化合物可用做先导药物，用于进一步的药物发现，或治疗性使用。可通过优选技术、免疫分析、凝胶电泳随后是显现、或任何其它本领域技术人员知晓的方法检测RADF和RPI的表达。这类分析可用于筛选侯选药物或用于临床监测或药物开发，其中RADF或RPI的丰度可用做临床疾病的代用标记。在多种特定实施方案中，可用参与患者疾病各种细胞类型的代表性细胞进行体外检测，以测定是否该化合物对这种细胞类型具有希望的作用。在于人中测试之前可在适当的动物模型系统中检测用于治疗的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。对于体内检测，在施用于人之前，可采用任一本领域知晓的动物模型系统。治疗/预防性施用和组合物
本发明提供了通过向受试者施用有效量的本发明化合物治疗(和预防)的方法。在一优选方面，本发明的化合物是基本上纯的(即，基本上不含有限制其作用或产生不希望地副作用的物质)。受试者优选为动物，包括但不限于如牛、猪、马、鸡、猫、狗等，优选为哺乳动物，最优选为人。在一特定实施方案中，非人哺乳动物是受试者。当化合物含有如上述核酸时可采用用于施用的制剂和方法。其它合适的制剂和施用路线可选自下述。已知多种递送系统且可用于施用本发明的化合物，如脂质体包封、微颗粒、微胶囊、能表达化合物的重组细胞、受体介导的细胞内吞(参见如，Wu和Wu，1987，生物化学杂志，262:4429-4432)，构建作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸等等。导入的方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、静脉内、鼻内、脑膜外和口内途径。可通过任一方便途径施用化合物，例如通过输注或大剂量注射、通过上皮或黏膜衬的吸收(如，口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)，以及可通过与其它生物活性剂一起施用。施用可为系统性或局部地。此外，通过任一适当的途径将本发明的药物组合物导入中枢神经系统是有利地，包括心室内或鞘内注射；心室内注射可借助例如结合至储液槽的心室内导管，如Ommaya储液槽。也可采用肺部施用，如通过利用吸入器或喷雾器，以及带有气溶胶剂的制剂。在一特定实施方案中，可希望将本发明的药物组合物局部施用于需要治疗的部位。这可通过例如(不是以限制的方式)手术中的局部输注、局部涂用(例如与手术后的创口包扎一起)、注射、利用导管、利用栓剂或利用植入物的方法，所述植入物为多孔的或非多孔的、或胶凝材料，包括膜，如sialastic膜，或纤维。在一个实施方案中，可通过在恶性肿瘤或瘤性或前瘤性组织的位点(或原发位点)直接注射来施用。在另一实施方案中，化合物可以如下形式递送：在囊泡中，特别是在脂质体(见Langer，科学，249:1527-1533(1990)；Treat等，脂质体在感染性疾病与癌症治疗中，Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss，纽约，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，出处同上，pp.317-327；通常见出处同上)。在另一实施方案中，可在受控释放系统中递送化合物。在一个实施方案中，可采用泵(见Langer，出处同上；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等，外科(Surgery)88:507(1980)；Saudek等，新英格兰医学杂志，321:574(1989))。在另一实施方案中，可采用聚合物材料(见，受控释放的医疗应用，Langer和Wise(编)，CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；受控药物生物利用度，药品设计与性能，Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macrornol.Chem.23:61(1983)；还参见Levy等，科学，228:190(1985)；During等，神经科学年鉴(Ann.Neurol.)25:351(1989)；Howard等，神经外科学杂志(J.Neurosurg.)71:105(1989))。在另一实施方案中，可将受控释放系统置于治疗靶点(即：脑)附近，这样只需要系统性给药剂量的一部分。(参见如，Goodson，受控释放的医疗应用，出处同前，vol.2,pp.115-138(1984))。其它受控释放系统在Langer(科学，249:1527-1533(1990))的综述中讨论。在另一实施方案中，当本发明化合物为编码蛋白质的核酸时，可体内施用核酸促进其编码的蛋白质表达，这可通过将核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分，且通过如下方法施用使其成为细胞内的，例如，逆转录病毒载体或其它病毒载体(见，美国专利4,980,286)；直接注射，或使用微颗粒轰击(如，基因枪；Biolistic,Dupont)；或用脂类、细胞表面受体或转染剂包被，或通过将其以与已知能进入核的同型盒样肽键连的形式施用(见如，Joliot等，1991，美国国家科学院院报，88:1864-1868)等。或者，可通过同源重组将核酸细胞内导入并掺入宿主细胞DNA用于表达。本发明还提供了药物组合物。这类组合物包括治疗有效量的化合物，以及药学可接受的载体。在一特定实施方案中，术语“药学可接受的”是指由联邦政府或州政府管理部门批准或列在美国药典或其它普遍承认的用于动物(尤其是人)的药典中。术语“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或治疗时一起使用的溶媒载体。这类药学载体可为无菌液体，如水或油类，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物为静脉内施用时水为优选的载体。生理盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用做液体载体，特别是用于注射溶液。适合的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、脱脂牛奶、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。如需要。组合物可还含有少量保温剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以为溶液、悬浮液乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。组合物也可被制为如栓剂，带有传统的结合剂和载体如三甘油三酯。口服制剂可包括标准载体，如口服级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子描述于雷明顿制药科学(＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂，)E.W.Martin。这类组合物含有治疗有效量的化合物，优选以纯化的形式，以及合适量的载体，以提供用于恰当施用于患者的形式。制剂应与施用模式相适应。在一优选实施方案中，依照常规方法制备组合物，以作为适于静脉内施用于人类的药物组合物。一般，用于静脉内施用的组合物为无菌等渗水性缓冲液。如需要，组合物也可含有助溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以在注射部位缓解疼痛。通常，以单位剂量的单独或混合在一起的形式提供各个组分，例如，以在密封容器(如安瓿或标明活性剂的量的量筒)中的冻干粉或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注给药时，可将其分散于含有无菌药用级水或盐水的输液瓶中。当组合物通过注射给药时，可提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿，使得在给药前组分可被混合。本发明化合物可被配制为中性或盐形式。药学可接受的盐包括与游离氨基形成的那些，如衍生于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与游离羟基形成的那些，如衍生于钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基醇、组氨酸、脯氨酸等。在治疗RA中有效的本发明化合物的量可通过标准临床技术测定。此外，可任选地利用体外检测以帮助确定最优剂量范围。在制剂中采用的精确剂量取决于给药途径以及疾病或紊乱的严重程度，且应当根据执业医师的判断和各个患者的情况决定。但是，用于静脉内给药的适当剂量范围一般在每千克体重约20-500微克活性化合物。用于鼻内给药的适当剂量范围一般在每千克体重0.01pg至1mg。有效的剂量也可从来自体外或动物模型测试系统的剂量效应曲线外推得知。一般栓剂含有范围在0.5％-10％(重量)的活性成分；口服制剂优选含有10％-95％的活性成分。本发明还提供了含有填充有一种或多种本发明的药物组合物的成分之一个或多个容器的药物包装或试剂盒。任选地，与这类容器结合的还有以管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府部门颁布的许可证，该许可证反映出就人类施用而言得到管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府部门准许。实施例患有类风湿性关节炎病人血清和滑液中的蛋白质
使用下面的参考实验规程，患有类风湿性关节炎(RA)的患者和未患有RA的患者(即痛风、骨关节炎、外伤性滑膜炎患者)之血清和滑液中的蛋白质，用等电聚焦和随后的SDS-PAGE进行分离，每个样品重复一次。样品制备
一收到血清样品即进行蛋白质分析(使用Pierce BCA Cat#23225)。将相当于总蛋白为300μg的血清按体积分为若干等份，每一份加入相同体积的10％(W/V)SDS(Fluka 71729)、2.3％(W/V)二硫苏糖醇(BDH443852A)。样品在95℃加热5分钟，然后冷却至20℃，然后向样品中加入125μl下述缓冲液：8M尿素(BDH 452043w)、4％CHAPS(SigmaC3023)、65mM二硫苏糖醇(DTT)、2％(V/V)Resolytes 3.5-10(BDH443382×)。此混合液旋涡混合后，在15℃、13000转/分钟条件下离心5分钟，上清液用等电聚焦分析。等电聚焦
等电聚焦(IEF)是使用Immobiline_Drystrip试剂盒(PharmaciaBioTech)，遵照产品的使用手册所述的方法进行的，参见Immobiline_Drystrip试剂盒的说明书，Pharmacia,#18-1038-63，版本AB(此处完整引入用作参考)。固定化的pH梯度(IPG)条(18cm,pH3-10非线性条带，Pharmacia Cat,#17-1235-01)在含有8M尿素、2％(W/V)CHAPS、10mM DTT、2％(V/V)Resolytes 3.5-10的溶液(Immobiline_Drystrip试剂盒的使用手册所述)中20℃再水化过夜。进行IEF时，将500μl上清液(上述方法制备)上样至条带，且将杯状上样单元置于条带的碱性端。上样胶用矿物油(Pharmacia 17-3335-01))覆盖，根据下述条件使用Pharmacia EPS3500XL电源(Cat 19-3500-01)立即向条带提供电压：
起始电压：300V2小时
线性梯度：300V-3500V3小时
稳定在3500V19小时
对于所有的方法，电流限制为12个条带10mA，功率的限制为5W。温度始终保持在20℃。6.3．胶的平衡与SDS-PAGE
在最后的19小时步骤后，立即将条带切下来，并在组成为下述的第一溶液中20℃浸泡10分钟：6M尿素、2％(W/V)DTT、2％(W/V)SDS、30％(V/V)甘油(Fluka,49767)、0.05M Tris/HCl,pH 6.8(Sigma,Cat:T-1503)。条带从第一溶液中移出，然后在组成为下述的第二溶液中20℃浸泡10分钟：6M尿素、2％(W/V)碘乙酰胺(Sigma,I-6125)、2％(W/V)SDS、30％(V/V)甘油(Fuka,49767)、0.05M Tris/HCl,pH6.8。从第二溶液中将条带移出，然后将条带加到支持胶上面，依据Hochstrasser等人，1988，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，173:412-423(此处完整引入用作参考)所述的方法进行SDS-PAGE，并作下述修改。6.4．支持胶的制备
凝胶在两块如下尺寸大小的玻璃平板间形成：后板23cm宽，24cm长，前板23cm宽，24cm长，在中央有一19cm长2cm深的刻痕。为了提高SDS-PAGE凝胶的共价联结，后板用0.4％的γ-异丁烯酰基-氧丙基三甲氧硅烷的乙醇溶液(BindSilaneTM(Pharmacia Cat#17-1330-01)处理。前板用RepelsilaneTM(Pharmacia Cat#17-1332-01)处理，以减少凝胶的粘附。多余的试剂用水清洗除去，将平板晾干。在此时，将一粘性条形码贴于后板上一适当的位置(不至于与凝胶基质接触)作为区分凝胶和平板衬层的标志。
已干的平板装入容量为13个凝胶夹槽的装胶盒上，每一夹槽的上下平板用2.5cm宽、1mm后的垫片隔开，夹槽相互之间用醋酸纸隔开，以利于凝胶聚合后夹槽的分离。然后按照Hochstrasser等人前述文献所用方法制备模具。
使用Angelique梯度凝胶灌注系统(大规模生物学)，灌注9％-16％的线性聚丙烯酰胺凝胶梯度，直至前板刻痕下方2cm处。所用储备液如下：丙烯酰胺(40％水溶液)(Serva,Cat#10677)，交联剂为PDA(BioRad161-0202)，浓度为总起始单体总量的2.6％(W/V)。凝胶缓冲液为0.375MTris/HCl,pH8.8，聚合催化剂为0.05％(V/V)TEMED(BioRad 161-0801)，引发剂为0.1％(W/V)的APS(BioRad 161-0700)。凝胶中不含SDS，不使用层积胶。灌制好的凝胶可以在20℃过夜聚合，然后在密闭的聚乙烯袋中在6ml凝胶缓冲液中4℃保存，并在4周内使用。6.5.SDS-PAGE
在电泳缓冲液(0.025M Tris、0.198M甘氨酸(Fluka 50050)、1％(W/V)SDS，加入少量的溴酚蓝)中配制0.5％(w/v)的琼脂糖(FlukaCat 05075)溶液。琼脂糖混悬液在搅拌的情况下加热到70℃，直至琼脂糖溶解。在双向支持胶的上方灌入琼脂糖溶液，然后将平衡条带放入琼脂糖中，用平面刀将凝胶轻轻敲打直到与双向胶刚好接触。按照Amess等人，1985，电泳(Electrophoresis),16:1255-1267)(此处完整引入用作参考文献)所述方法将凝胶放入双向电泳槽中。电泳槽中充有上述电泳缓冲液，液面刚好高于包含聚丙烯酰胺凝胶的双向胶的顶端，这样可以使活性凝胶区域得到充分的冷却。将电泳缓冲液加入到由凝胶形成的顶部缓冲液池，然后使用Consort E-833电源立即向凝胶加上电压。凝胶在20mA/凝胶的条件下电泳1小时。功率限制设定为：每一个含6个凝胶的电泳槽150W；电压限制设定为：600V。1小时后，凝胶在同上的功率和电压限制下，40mA/凝胶的条件下电泳，直至溴酚蓝线距凝胶底端0.5cm处。在整个电泳过程中缓冲液温度应保持在10℃。6.6．染色
电泳完成后，立即将凝胶从电泳槽中移出进行固定。仔细地将凝胶盒上方的顶端平板取出，使凝胶粘在底端平板上。把粘有凝胶的平板放入染色器皿中，每个这样的器皿可以放12个凝胶。将凝胶完全浸泡于固定溶液中：40％(V/V)乙醇(BDH 28719)、10％(V/V)乙酸(BDH 100016X)、50％(V/V)水(MilliQ-Miliipore)，固定过程中使固定液始终绕凝胶流动。固定过夜后，从固定器皿中去除固定液，将凝胶浸泡于7.5％(V/V)乙酸、0.05％(W/V)SDS、92.5％(V/V)水中预染(prime)30分钟。沥干预染溶液后，将凝胶完全浸泡于染色溶液中4小时。荧光染料溶液是根据Sypro Red(分子探针，Eugene公司，俄勒岗)的使用说明将其稀释，然后用0.4μm滤膜在抽真空条件下将其滤过制备的。6.7．凝胶成像
电泳完成后，立即将凝胶从电泳槽中移出进行固定。仔细地将凝胶盒上方的顶端平板取出，使凝胶粘在底端平板上。把粘有凝胶的平板放入染色器皿中，每个这样的器皿可以放12个凝胶。将凝胶完全浸泡于固定溶液中：40％(V/V)乙醇(BDH 28719)、10％(V/V)乙酸(BDH 100016X)、50％(V/V)水(MilliQ-Miliipore)，固定过程中使固定液始终绕凝胶流动。固定过夜后，从固定器皿中去除固定液，将凝胶浸泡于7.5％(V/V)乙酸、0.05％(W/V)SDS、92.5％(V/V)水中预染30分钟。沥干预染溶液后，将凝胶完全浸泡于染色溶液中4小时。荧光染料溶液是根据Sypro Red(分子探针，Eugene公司，俄勒岗)的使用说明将其稀释，然后用0.4μm滤膜在抽真空条件下将其滤过制备的。
使用Storm扫描仪(分子动力学，Sunnyvale，加利福尼亚)按照其使用说明(见Storm用户手册，1995,4.0版本，零件号：149-355，此处完整引入用作参考)对经荧光染色的凝胶进行成像，可以得到一个计算机可读的结果，方法作了如下的修改：凝胶从染液取出后，轻轻用水清洗，然后于Storm扫描仪上成像，成像条件：PMT设置1000V红色荧光模式，分辨率为200μm。既然凝胶刚性的结合于玻璃板上，因而在成像过程中凝胶就可以和扫描仪床体接触。为了避免凝胶和扫描仪床体之间不一致的接触造成的干扰，可以在凝胶下面加水膜，并小心不要产生气泡。而且，凝胶应当放于由两个荧光按钮形成的框架中，这两个按钮与凝胶一起成像，可以提供用于鉴定在凝胶中发现的其它特征的X、Y参照坐标。在机械手切胶器上提供有一个匹配框架，可以用于对凝胶进行正确的排列比较。成像完成后，将凝胶密封于含有少量染色溶液的聚乙烯袋中，4℃保存。6.8．数据的数字化分析
使用美国申请第08/980574，5.4、5.5节(此处引入用作参考)所述方法对数据进行处理。下面进行更详细地描述。6.8.1检测结果的计算机分析
扫描仪的结果首先使用MELANIEⅡ2D PAGE分析软件(版本2.2,1997，伯乐实验室，大力神，加利福尼亚，Cat.#170-7566)进行处理，以自动发现参考点：M1和M2；自动修剪图像(也就是去除凝胶边界以外的扫描区产生的图像，例如参考图框)；根据污染去除人为假象；发现特征并对其进行定量；以GIF文件格式产生图像文件。使用以下参数检测特征：
平滑度=2
调和量算子阈：50
部分阈：1
饱和度=100
峰态峭度=0
最小周长=106.9 pI和MW的测定
图像要进行评定以判断是否可以舍弃，舍弃标准是图像存在明显的异常、或有过高或过低的上样量或总体图像强度、或分辨率很低、或平行样品十分不同。如果平行样品中有一个图像需要舍弃，那么另一个也必须舍弃，不管其图像质量如何。舍弃的样品要安排进行重新分析。
使用界点鉴定来测定在凝胶中发现的特征的等电点和分子量。这些方法包括在任何给定的生物样品中都预计可见的特定蛋白质的鉴定。由于这些共同蛋白质在不同的样品中表现出相同的等电点和分子量，因而它们可以用作标准；这一方法同样适用于任何可能的凝胶变化或异常。
由正常血清凝胶的数据集，我们可以人为选出一个凝胶作为第一原版胶。然后通过比较此第一原版胶中发现的特征与在先正常人血清双向电泳鉴定出的特征的差异，可以对界点特征进行鉴定(参见：Bjellqvist等人，1993，电泳，14:1357-1365，此处完整引入用作参考)。
在第一原版胶中鉴定出十四个界点特征，标记为PL1-PL12和PL15-PL16。这些界点特征鉴定显示于图1，其pI和/或MW值列于表Ⅻ。
表Ⅻ用于本研究的界点特征
名称     pI     MW(kd)     名称     pI     MW(kd)
PL1 无 186,073  PL8     6.47     47,195
 PL2     6.20     100,000  PL9     5.29     43,541
 PL3     4.73     93,708  PL10     5.22     23,000
 PL4     5.13     73,465  PL11     4.47     25,183
 PL5     4.97     52,739  PL12     5.52     13,800
 PL6     4.10     无 PL15     7.80     36,962
 PL7     4.80     40,997  PL16     8.58     无
在数据集中的每一个凝胶中鉴定尽可能多的这些界点。
根据最靠近的两条已经分配pI值的界点，使用内插法/外推法(使用MELANIE Ⅱ软件)为原版胶中所有特征分配一个pI值；根据最靠近的两条已经分配MW值的界点，使用内插法/外推法(使用MELANIE Ⅱ软件)为原版胶中所有特征分配一个MW值。还用已知为其分子簇序号(MCI)的独有性数字标记这些特征。
第二原版胶选择RA血清胶和RA滑液胶。使用MELANE Ⅱ软件提供的运算法则(MELANIE Ⅱ 2D PAGE(版本2.2)使用说明(Melanie集团，日内瓦，瑞士)中A节第8-10页，对这些凝胶中的特征与原版胶中的共同特征进行配对。能够配对的特征就可以与相应的MCI联系起来，因而可以获得相关pI和MW值。这些第二原版胶中不能配对的特征可以通过使用Melanie Ⅱ软件参考界点的pI和MW，由线性内插/外推法为其分配pI和MW。然后为这些特征产生一个MCI中的额外的独特入口值。6.9.1图形的构建
数据集中所有的凝胶现在都和第一和第二原版胶相匹配，配对的特征都在分子簇索引(MCI)中与相应的入口值联系起来。
通过界点将多份胶排列比较，进行匹配过程以找到平行凝胶中成对的相同点。它可以提高分析的准确度，以保证随后的pI和MW测量的准确，因为配对的斑点显示分离的重复性，同时可以去除人为假象。
测定每一个蛋白质斑点的强度并保存。每一个蛋白质斑点被分配一个鉴定码并与原版胶中的斑点匹配。
产生了对于代表一个血清或滑液的样品的每一个平行组的分析这一方面的最终结果。对于每一个鉴定斑点的数字化图形包含：1)唯一的一个给定鉴定码；2)X,Y坐标；3)等电点；4)分子量；5)信号值；6)每一个前述测定的标准偏差；以及7)与该斑点匹配的原版胶上斑点的MCI的指针。借助实验室信息管理系统(LIMS)，这种图形可以回溯到产生该图的实际储存的凝胶上，因此，由计算机分析凝胶图形数据库所鉴定的蛋白质是可以检索的。同时，LIMS可以允许将图形回溯到原始样品或患者。6.9.2样品间的交叉匹配
一旦形成了图形，分析就指向目标蛋白质的选择。图形中的每一个有意义的特征都被赋予一个索引，“分子簇索引(MCI)”，它能够鉴定所有凝胶中的特征，并且可作为前述特征的(1)-(7)参数的指针。对于每一种样品类型(也就是类风湿性关节炎血清和滑液)，可以由原版胶产生一个分子簇表。相同类型的所有其它样品的凝胶都可以和相关的第一和第二原版胶进行匹配。然后，每一个样品的数字化图形通过增加(已匹配的特征)分配给在原版胶中的特征相应的MCI来加以注释。6.9.3图形的差别分析
在每一个样品组中(血清或滑液)，分析图形以鉴定和选择在至少50％以上的图形中存在的那些特征。然后将这些选择的特征组成一个类风湿性关节炎滑液特征组和一个血清特征组。然后比较每一个特征组中的匹配特征，来鉴定在血清和滑液间平均强度至少有2倍差异的那些特征。然后在未患有RA的患者滑液与血清样品中检测相同特征。与在RA滑液样品中相比在RA血清中不同地存在的特征，但是与非RA滑液样品相比在非RA血清中不是不同地存在的特征被鉴定为类风湿性关节炎诊断特征(RADF)。6.10所选蛋白质的回收与分析
RADF中的蛋白质可以被机械手切割，并被加工形成胰蛋白酶切肽。这些肽的部分氨基酸序列可以通过质谱分析使用从头测序加以测定。6.11结果
这些初始实验鉴定出相对于RA患者血清，在滑液中降低的10个特征和增加的12个特征。相对于RA患者的血清而言，这些RADF的每一个仅仅在滑液中不同地存在，但是相对于非RA受试者血清，在其滑液中不是不同地存在的。
这些RADF中不同存在的RPI的部分氨基酸序列已检测。公用数据库的计算机检索发现，21个这类部分测序的蛋白质为本领域周知，5个在任何检测的公共数据库中没有描述。表Ⅷ显示几个RPI为同一蛋白质的同种型。例如：RPI-1和RPI-11是转铁蛋白的同种型。这些同种型据信来源于翻译后加工过程(例如：糖基化、磷酸化、乙酰化和最小蛋白质水解)。7．实施例来自患有或未患有RA的患者的血清的蛋白质
通过等电聚焦及随后的SDS-PAGE分离并比较来自患有及未患有RA的患者血清的蛋白质。
如实施例6所述进行分析，除了在实施例7中的比较是在患有RA的患者与未患有RA的患者之间进行。7.1结果
这些初始实验鉴定出相对于非RA患者血清，在RA患者血清中降低的9个特征和增加的12个特征。这些RADF的详细情况见表Ⅲ和Ⅳ。这些RADF的每一个相对于非RA患者的血清在RA血清中不同地存在。
这些RADF中不同存在的RPI的部分氨基酸序列已检测。公用数据库的计算机检索发现，17个这类部分测序的蛋白质为本领域周知，4个在任何检测的公共数据库中没有描述。表Ⅺ显示几个RPI为同一蛋白质的同种型。例如：RPI-44和RPI-45是转铁蛋白的同种型。这些同种型据信来源于翻译后加工过程(例如：糖基化、磷酸化、乙酰化和最小蛋白质水解)。
此外，表Ⅷ-Ⅺ显示，RPI-2、RPI-6、RPI-7、RPI-14、RPI-23、RPI-25、RPI-31和RPI-37代表免疫球蛋白的同种型；RPI-2尤其代表IgG轻链的同种型。换言之，优选技术已用于鉴定可特异性与RA结合并可能反映与该疾病相关的寡克隆体液免疫反应的免疫球蛋白同种型的确定亚型。这类免疫球蛋白同种型(及其片段、针对它的抗体等)可用于诊断、预后、治疗性监测及药物开发。
本发明不局限于特定的列举的实施方案，这些实施方案意在将发明的单一方面表述清楚。实际上，根据前面描述，对本发明进行除此处所列出的内容以外的修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改都落在所附带的权利要求书的范围内。
此处所引用的出版物都以完整形式引入用作参考。
        序列表<110>Oxford GlycoSciences (UK) Ltd
Parekh, Rajesh B
Patel,Thakorbhai P
Townsend, Robert R<120>用于类风湿性关节炎诊断的方法和组合物<130>PWC/P20924WO<140>PCT/GB99/00763<141>1999-03-15<150>GB 9805477.8<151>1998-03-13<160>227<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg1               5                  10<210>2<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg1               5                  10<210>3<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg1               5                  10<210>4<211>5<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Cys Gln Ser Phe Arg1               5<210>5<211>5<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Ile Asn His Cys Arg1               5<210>6<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg1               5<210>7<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg1               5<210>8<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg1               5<210>9<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Ala Ser Tyr Leu Asp Cys Ile Arg1               5<210>10<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg1               5<210>11<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg1               5                  10<210>12<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys1               5                  10<210>13<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala Thr Lys1               5                  10<210>14<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>14Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg1               5                 10<210>15<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg1               5                  10<210>16<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>16Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg1               5                  10<210>17<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>17Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys1               5                  10<210>18<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>18Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg1               5                  10<210>19<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys1               5                  10<210>20<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>20Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg1               5                  10                  15<210>21<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>21Glu Leu Asp Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His Phe Gly1               5                  10                  15Lys<210>22<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>22Ser Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro1               5                  10                  15Glu Pro Arg<210>23<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>23Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg1               5                  10                  15<210>24<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>24Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg1               5                  10                 15<210>25<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>25Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1               5                  10                  15Glu Arg<210>26<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>26Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys1               5<210>27<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>27Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys1               5                  10<210>28<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>28Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys1               5                  10<210>29<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>29Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys1               5<210>30<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg1               5<210>31<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>31Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys1               5<210>32<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>32Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys1               5<210>33<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>33Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys1               5                  10<210>34<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>34Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys1               5                  10<210>35<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>35Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys1               5                  10                  15<210>36<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>36Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys1              5                   10                  15<210>37<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>37Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro1               5                  10                  15Leu Lys<210>38<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>38Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu1               5                  10                  15Ala Lys<210>39<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3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a Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys1                5                 10<210>80<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>80Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg1               5                  10<210>81<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>81Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg1               5<210>82<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>82Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg1               5<210>83<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>83Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg1               5<210>84<211>15<212>PRT<213>omo sapiens<400>84Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg1               5                   10                 15<210>85<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>85Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg1               5                  10<210>86<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>86Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg1               5<210>87<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>87Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg1               5<210>88<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>88Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg1               5<210>89<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>89Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys1               5                  10                  15<210>90<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>90Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro ser Pro Leu Lys1               5                  10                  15<210>91<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>91Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg1               5                  10                  15<210>92<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>92Glu Gln Leu Asn Leu Arg1               5<210>93<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>93Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg1               5<210>94<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>94Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys1               5<210>95<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>95Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys1               5                  10<210>96<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>96Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys1               5                  10<210>97<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>97Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg1               5                  10                  15<210>98<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>98Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg1               5                  10<210>99<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>99Asp Ser Leu Glu Phe Arg1               5<210>100<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>100Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr Gly Ala Arg1               5                  10<210>101<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>101Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg1               5<210>102<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>102Ile Thr Leu Leu Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg1               5                   10<210>103<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>103Trp Glu Met Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg1               5                  10<210>104<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>104Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln Asp Ser Ala Ala1               5                  10                  15Ala Lys<210>105<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>105Ala Val Leu Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr1               5                  10                  15Ala Val Lys<210>106<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>106Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg1               5<210>107<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>107Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys1               5                  10<210>108<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>108Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys1               5                  10<210>109<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>109Ala His Val Asp Ala Leu Arg1               5<210>110<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>110Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg1               5<210>111<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>111Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg1               5<210>112<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>112Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys1               5                  10<210>113<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>113Asp Ser Gly Ala Asp Leu Ser1               5<210>114<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>114Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser1               5<210>115<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>115Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg1               5                  10<210>116<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>116Met Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg1               5                  10<210>117<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>117Cys Gly Lys Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys1               5                  10<210>118<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>118Gly Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg1               5                  10                  15<210>119<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>119Ile Asp Val His Leu Val Pro Asp Arg1               5<210>120<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>120Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg1               5<210>121<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>121Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys1               5                  10<210>122<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>122Ser Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg1               5                  10<210>123<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>123Leu Tyr Ser Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg1               5                  10<210>124<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>124His Gly Gly Leu Tyr His Glu Asn Met Arg1               5                  10<210>125<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>125Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg1               5                  10<210>126<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>126Thr Asp Cys Leu Ser Leu Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly1               5                  10                  15Glu Lys<210>127<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>127Asp Arg Ser Ala Ser His Leu Asp His Lys1               5                  10<210>128<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>128Ala Ser Ile Asn Ser Leu Leu Ser Asp Lys Arg1               5                  10<210>129<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>129Gln Ile Glu Ala Met Gly Phe Pro Ala Phe Val Lys1               5                  10<210>130<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>130Val Phe Ala Glu Val Leu Pro Ser His Lys Val Ala Lys1               5                  10<210>131<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>131Cys Tyr Ile Gln Val Thr Gly Met Thr Cys Ala Ser Cys Val Ala Asn1               5                  10                  15Ile Glu Arg<210>132<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>132Asn Val Leu Asp Ala Pro His Ala Arg1               5<210>133<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>133Asn Val Ile Asp Ala Pro His Ala Arg1               5<210>134<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>134Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg1               5                  10                  15<210>135<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>135Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys1               5<210>136<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>136Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys1               5                  10                  15<210>137<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>137Gly Ala Tyr Pro Leu Ser Ile Glu Pro Ile Gly Val Arg1               5                  10<210>138<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>138Ala Leu Tyr Leu Gln Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Arg1               5                  10<210>139<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>139Gly Ser Leu His Ala Asn Gly Arg1               5<210>140<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>140Tyr Thr Val Asn Gln Cys Arg1               5<210>141<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>141Gln Tyr Thr Asp Ser Thr Phe Arg1               5<210>142<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>142Asp Asn Glu Asp Phe Gln Glu Ser Asn Arg1               5                  10<210>143<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>143Gln Ser Glu Asp Ser Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Arg1               5                  10<210>144<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>144Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Ile Val Cys Arg1               5                  10<210>145<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>145Val Asp Lys Asp Asn Glu Asp Phe Gln Glu Ser Asn Arg1               5                  10<210>146<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>146Asn Asn Glu Gly Thr Tyr Tyr Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Gln Ser Arg1               5                  10                  15<210>147<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>147Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu1               5                  10                  15Arg<210>148<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>148Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg1               5<210>149<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>149Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg1               5<210>150<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>150Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg1               5                  10<210>151<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>151Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys1               5                  10                  15<210>152<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>152His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys1               5                  10<210>153<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>153Ser Ser Leu Ser Val Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys1               5                  10<210>154<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>154Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg1              5<210>5<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>155Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys1               5                  10                  15<210>156<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>156Ser Glu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys1               5                  10                  15<210>157<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>157Thr Leu Asp Pro Glu Arg1               5<210>158<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>158Val Val Pro Glu Gly Ile Arg1               5<210>159<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>159Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg1               5<210>160<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>160Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg1               5<210>161<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>161Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys1               5                  10<210>162<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>162Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg1                   5              10<210>163<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>163Val Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys1               5                  10                  15<210>164<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>164Ser Asn Leu Asp Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg1               5                  10                  15<210>165<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>165Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg1                   5              10<210>166<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>166Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg1               5<210>167<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>167Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1               5                  10<210>168<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>168Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys1               5                  10<210>69<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>169Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys1               5                  10<210>170<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>170Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro1               5                  10                  15Glu Val Lys<210>171<211>11<212>PRT<213>omo sapiens<400>171Asn Phe Pro Ser Pro Val Asp Ala Ala Phe Arg1               5                  10<210>172<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>172Gly Gly Tyr Thr Leu Val Ser Gly Tyr Pro Lys1               5                  10<210>173<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>173Gly Glu Cys Gln Ala Glu Gly Val Leu Phe Phe Gln Gly Asp Arg1               5                  10                  15<210>174<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>174Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg1               5<210>175<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>175Gly Ser Phe Pro Trp Gln Ala Lys1               5<210>176<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>176Tyr Val Met Leu Pro Val Ala Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg1               5                  10<210>177<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>177Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln Lys1               5                  10<210>178<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>178Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys1               5                  10<210>179<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>179Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys1               5                  10<210>180<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>180Val Tyr Ala Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg1               5                  10<210>181<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>181Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile Cys Thr Arg1               5                  10<210>182<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>182Val Ser His Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe Lys1               5                  10<210>183<211>9<212>RT<213>Homo sapiens<400>183Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg1               5<210>184<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>184Gln Asp Ser Gln Leu Gln Lys1               5<210>185<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>185Ile Asp Val His Trp Thr Arg1               5<210>186<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>186Ser Gln Pro Met Gly Leu Trp Arg1               5<210>187<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>187Trp Glu Ala Glu Pro Val Tyr Val Gln Arg1               5                  10<210>188<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>188Ala Arg Glu Asp Ile Phe Met Glu Thr Leu Lys1               5                  10<210>189<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>189Ala Tyr Leu Glu Glu Glu Cys Pro Ala Thr Leu Arg1               5                  10<210>190<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>190Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg1               5                  10<210>191<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>191Gln Val Pro Ala His Ala Arg1               5<210>192<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>192Ile Ser Val Ile Arg Pro Ser Lys1               5<210>193<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>193Val Ala Set Tyr Gly Val Lys Pro Arg1               5<210>194<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>194Asp Ile Ser Glu Val Val Thr Pro Arg1               5<210>195<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>195Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Val His Lys1               5                  10<210>196<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>196Tyr Gly Leu Val Thr Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys1               5                  10<210>197<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>197Leu Pro Pro Thr Thr Thr Cys Gln Gln Gln Lys1               5                  10<210>198<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>198Phe Leu Cys Thr Gly Gly Val Ser Pro Tyr Ala Asp Pro Asn Thr Cys1                   5              10                  15Arg<210>199<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>199Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg1               5                  10<210>200<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>200Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys1               5                  10<210>201<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>201Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg1               5                  10<210>202<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>202Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg1               5                  10                  15<210>203<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>203Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg1               5<210>204<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>204Ser Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg1               5                  10<210>205<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>205Thr Gly Asp Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg1               5                  10<210>206<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>206Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg1               5                  10<210>207<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>207Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys1               5                  10<210>208<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>208Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Gln Ser Asp Asn Phe Lys1               5                  10<210>209<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>209Asn Tyr Ala Glu Val Gly Arg1               5<210>210<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>210Val Val Leu His Pro Asn Tyr His Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys1               5                  10                  15<210>211<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>211Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg1               5                  10<210>212<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>212Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu1               5                  10                  15Arg<210>213<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>213Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg1               5<210>214<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>214Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg1               5<210>215<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>215Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg1               5                  10<210>216<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>216Ile Asp Val His Leu Val Pro Asp Arg1               5<210>217<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>217Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg1               5<210>218<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>218Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys1               5                  10<210>219<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>219Set Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg1               5                  10<210>220<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>220Ser Cys Asp Ile Pro Val Phe Met Asn Ala Arg1               5                  10<210>221<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>221Thr Asp Cys Leu Ser Leu Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly1               5                  10                  15Glu Lys<210>222<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>222Glu Asp Ile Phe Met Glu Thr Leu Lys1               5<210>223<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>223Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg1              5<210>224<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>224Leu Asp Gly Lys Phe Ser Val Val Tyr Ala Lys1               5                  10<210>225<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1,4,16,19,22,25)<223>n是a或g或c或t<220><223>人工序列描述：探针<400>225nckncckttr tgytcnadng cngcnac                     27<210>226<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1,4,10,13,19,22)<223>n是a或g或c或t<220><223>人工序列描述：探针<400>226nckngcrtgn ggngcrtcna dnagrtt                                  27<210>227<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1,4,10,13,16)<223>n是a或g或c或t<220><223>人工序列描述：探针<400>227nswnadrtcn gcnccnswrt c                                           21

Claims (47)

1．一种用于受试者中类风湿性关节炎的筛选、诊断或预后的方法，或者用于监测向受试者施用的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果的方法，包括：
(a)用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，以产生特征的双向图谱；
(b)对于其相对丰度与类风湿性关节炎的存在与否相关的至少一个所选特征，将所选特征中的每一个特征在样品中的丰度与在一个或多个无类风湿性关节炎的受试者血清或血浆中所选特征的丰度相比较，
其中，样品中所选一个或多个特征的相对丰度表明受试者中存在或不存在类风湿性关节炎。
2．一种用于受试者中类风湿性关节炎的筛选、诊断或预后的方法，或者用于监测向受试者施用的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果的方法，包括：
(a)用双向电泳分析受试者滑液样品，以产生特征的双向图谱；
(b)用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，以产生特征的双向图谱；
(c)对于其相对丰度与类风湿性关节炎的存在与否相关的至少一个所选特征，将所选特征中的每一个特征在滑液样品中的丰度与在血清或血浆样品中所选特征的丰度相比较，
其中，滑液样品中所选一个或多个特征的相对丰度与血清或血浆样品相比，表明受试者中存在或不存在类风湿性关节炎。
3．一种用于受试者中类风湿性关节炎的筛选、诊断或预后的方法，或者用于监测向受试者施用的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果的方法，包括：
(a)用双向电泳分析受试者滑液、血清或血浆样品，以产生特征的双向图谱；
(b)对于其强度与类风湿性关节炎的存在与否相关的至少一个所选特征，将所选特征中的每一个特征在样品中的强度与在受试者滑液、血清或血浆中的一个或多个所选表达参考特征(ERF)的强度相比较，
其中，相对于所述一个或多个ERF之样品中所选一个或多个特征的强度表明受试者中存在或不存在类风湿性关节炎。
4．一种用于受试者中类风湿性关节炎的筛选、诊断或预后的方法，或者用于监测向受试者施用的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果的方法，包括：
(a)用双向电泳分析受试者滑液、血清或血浆样品，以根据等电点和电泳迁移率分离多种蛋白质；和
(b)定量检测至少一种下列类风湿性关节炎诊断特征(RADF)：RADF-1,RADF-2,RADF-3,RADF-4,RADF-5,RADF-6,RADF-7,RADF-8,RADF-9,RADF-10,RADF-11,RADF-12,RADF-13,RADF-14,RADF-15,RADF-16,RADF-17,RADF-18,RADF-19,RADF-20,RADF-21,RADF-22,RADF-23,RADF-24,RADF-25,RADF-26,RADF-27,RADF-28,RADF-29,RADF-30,RADF-31,RADF-32,RADF-33,RADF-34,RADF-35,RADF-36,RADF-37,RADF-38,RADF-39和RADF-40。
5．权利要求1、2、3或4的方法，其中(a)步骤包括等电聚焦后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
6．一种用于受试者中类风温性关节炎的筛选、诊断或预后的方法，或用于监测向受试者施用的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果的方法，包括：
(a)在受试者滑液、血清或血浆样品中，定量检测至少一种下列类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)：RPI-1,RPI-2,RPI-3,RPI-4,RPI-5,RPI-6,RPI-8,RPI-9,RPI-10,RPI-11,RPI-12,RPI-13,RPI-14,RPI-15,RPI-16,RPI-17,RPI-18,RPI-19,RPI-20,RPI-21或RPI-22,RADF-23,RADF-24,RADF-25,RADF-26,RADF-27,RADF-28,RADF-29,RADF-30,RADF-31,RADF-32,RADF-33,RADF-34,RADF-35,RADF-36,RADF-37和RADF-38。
7．权利要求6的方法，其中定量检测的步骤包括检测至少一个样品等份，所述检测步骤包括：
(a)将针对预选RPI的免疫特异性抗体与样品等份接触；且
(b)检测是否样品等份中至少一种成分与抗体之间发生结合。
8．权利要求7的方法，其中抗体为单克隆抗体。
9．权利要求7的方法，其中定量检测步骤包括用多重抗体检测多个样品等份。
10．权利要求9的方法，其中抗体为单克隆抗体。
11．一种包括下列已分离的类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)之一的制品：RPI-1,RPI-2,RPI-3,RPI-4,RPI-5,RPI-6,RPI-8,RPI-9,RPI-10,RPI-11,RPI-12,RPI-13,RPI-14,RPI-15,RPI-16,RPI-17,RPI-18,RPI-19,RPI-20,RPI-21或RPI-22,RPI-23,RPI-24,RPI-25,RPI-26,RPI-27,RPI-28,RPI-29,RPI-30,RPI-31,RPI-32,RPI-33,RPI-34,RPI-35,RPI-36,RPI-37或RPI-38。
12．一种包含权利要求11的制品的试剂盒。
14．一种包含多种权利要求11的制品的试剂盒。
15．一种包含已分离的人类蛋白质的制品，所述蛋白质包含具有VAAIEHFGR或VAALEHFGR序列之一的肽。
16．权利要求15的制品，其中蛋白质的等电点(pI)约为5.98，表观分子量(MW)约为52,631。
17．权利要求16的制品，其中pI在5.98的10％变动范围以内，分子量在52,631的10％变动范围以内。
18．权利要求17的制品，其中pI在5.98的5％变动范围以内，MW在52,631的5％变动范围以内。
19．权利要求18的制品，其中pI在5.98的1％变动范围以内，MW在52,631的1％变动范围以内。
20．一种包含已分离的人类蛋白质的制品，所述蛋白质包含带有下列序列中的一个的肽：DSGADIS或DSGADLS。
21．权利要求20的制品，其中蛋白质的等电点(pI)约为5.36，表观分子量(MW)约为24,124。
22．权利要求21的制品，其中pI在5.36的10％变动范围以内，MW在24,124的10％变动范围以内。
23．权利要求22的制品，其中pI在5.36的5％变动范围以内，MW在24,124的5％变动范围以内。
24．权利要求23的制品，其中pI在5.36的1％变动范围以内，MW在24,124的1％变动范围以内。
25．一种包含已分离的人类蛋白质的制品，所述蛋白质包含带有下列序列中的一个的肽：NVIDAPIHAR或NVLDAPHAR。
26．权利要求25的制品，其中蛋白质的等电点(pI)约为5.96，表观分子量(MW)约为158,868。
27．权利要求26的制品，其中pI在5.96的10％变动范围以内，MW在158,868的10％变动范围以内。
28．权利要求27的制品，其中pI在5.96的5％变动范围以内，MW在158,868的5％变动范围以内。
29．权利要求28的制品，其中pI在5.96的1％变动范围以内，MW在158,868的1％变动范围以内。
30．一种能够免疫特异性结合下列类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)中的一种的抗体：RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9、RPI-10、RPI-11、RPI-12、RPI-13、RPI-14、PPI-15、RPI-16、RPI-17、RPI-18、RPI-19、RPI-20、RPI-21或RPI-22,PPI-23,RPI-24,RPI-25,RPI-26,RPI-27,RPI-28,RPI-29,RPI-30,RPI-31,RPI-32,RPI-33,RPI-34,RPI-35,RPI-36,RPI-37和RPI-38。
31．一种包含权利要求30的抗体的试剂盒。
32．一种包含多种权利要求30的抗体的试剂盒。
33．一种药物组合物，包含治疗有效量的一种或多种下列分离的类风温性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)：RPI-12、RPI-13、RPI-14、PPI-15、RPI-16、RPI-17、RPI-18、RPI-19、RPI-20、RPI-21、RPI-22、RPI-23和RPI-24。
34．一种药物组合物，包含治疗有效量的可免疫特异性结合一种下列分离的类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(PPI)的抗体：RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9、RPI-10、或RPI-11。
35．一种药物组合物，包含治疗有效量的一种抗体的片段或衍生物以及药学可接受的载体，其中抗体可免疫特异性结合一种下列分离的类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)：RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9、RPI-10、或RPI-11，所述片段或衍生物含有抗体的结合结构域。
36．一种治疗或预防类风湿性关节炎的方法，包括向需要这类治疗或预防的受试者施用治疗有效量的编码一种下列类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)的核酸：RPI-12、RPI-13、RPI-14、RPI-15、RPI-16、RPI-18、RPI-19、RPI-21、RPI-22、RPI-23或RPI-24。
37．一种治疗或预防类风湿性关节炎的方法，包括向需要这类治疗或预防的受试者施用治疗有效量的抑制一种或多种下列类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型(RPI)的核酸：RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9或RPI-11。
38．权利要求37的方法，其中核酸是RPI反义核酸或核酶。
39．权利要求4定义的一个或多个RADF在受试者类风湿性关节炎之筛选、诊断或预后中的用途，或在监测施用于受试者的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果中的用途。
40．权利要求6定义的一个或多个RPI在受试者类风湿性关节炎之筛选、诊断或预后中的用途，或在监测施用于受试者的抗类风湿性关节炎药物或治疗效果中的用途。
41．权利要求6定义的至少一种免疫特异性针对RPI的抗体在受试者类风湿性关节炎之筛选、诊断或预后中的用途，或在监测施用于受试者的抗类风湿性关节炎药物或治疗效果中的用途。
42．权利要求41的用途，其中至少一种抗体是单克隆抗体。
43．权利要求15-29中任一项定义的蛋白质在受试者类风湿性关节炎之筛选、诊断或预后中的用途，或在监测施用于受试者的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果中的用途。
44．权利要求33中定义的至少一种RPI在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。
45．权利要求34中定义的至少一种抗体在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。
46．权利要求35中定义的一种抗体之片段或衍生物在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。
47．权利要求36中定义的核酸在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。
48．权利要求37中定义的核酸在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。
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