CN1653080A - 淋巴管和血管的内皮细胞基因 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞中差异表达的多核苷酸和基因。这些基因可用于治疗涉及淋巴管的疾病,所述疾病例如淋巴水肿,各种炎性疾病,和通过淋巴管系统进行的癌转移。
Description
技术领域
本发明涉及在淋巴管内皮细胞中特异性表达的多核苷酸和蛋白。
背景技术
近来关于淋巴血管生长因子(lymphangiogenic growth factors)和癌症的淋巴管内生长和转移(Mandriota等,EMBO J.20:672-682(2001);Skobe,等,Nat.Med.7:192-198(2001);Stacker,等,Nat.Med.7:186-191(2001);Karpanen等,Cancer Res.61:1786-1790(2001))的联系的证据表明,淋巴管可用作肿瘤治疗的又一个靶点。癌细胞通过直接侵入周围组织,扩散到体腔,侵入血管系统(血管源性转移)在体内扩散,也通过淋巴系统扩散(淋巴转移)。局部淋巴结播散是多种常见癌症转移的第一步,并且和疾病的预后高度相关。参与从肿瘤区引流组织液的淋巴结称为哨兵淋巴结(sentinel nodes),在适当的位置上通过诊断发现这些淋巴结,并在疑有癌细胞转移的情况下,则去除它们。然而,虽然其与临床相关(relevance),对于导致通过血流或通过淋巴系统转移的机制却知之甚少。
直到最近,尽管淋巴管在医学上很重要,它们受到的重视远小于血管。淋巴管从大多数组织的组织间隙收集富含蛋白质的液体和白细胞,并将它们作为淋巴这种白色不透明的液体运输到血液循环。小淋巴管汇合成较大的淋巴管,将淋巴液通过胸导管引流到颈部的大静脉。淋巴结是沿淋巴管分布的过滤站,收集淋巴管(collecting lymphatic vessels)周围的平滑肌收缩和身体的运动(bodily movements)驱动淋巴的运动,流动的方向由静脉内的瓣膜控制,就像在静脉中一样。淋巴毛细管内覆内皮细胞,它们之间具有很多大的内皮间隙并有明显的接点。淋巴毛细管还缺乏连续的基底膜,而且没有周细胞。锚丝(Anchoring filaments)连接淋巴管内皮细胞的近腔表面和血管周围的细胞外基质,并在组织水肿时锚丝牵引内皮细胞以保持淋巴管的开放。淋巴管缺乏或堵塞通常由感染,外科手术或放疗造成,极少数情况下由遗传缺陷造成,使得蛋白富集液在组织中聚集,即淋巴水肿。淋巴系统对于肠脂肪吸收和免疫应答也很重要。细菌,病毒和其他外来物质被淋巴管吸收并运送到淋巴结,在淋巴结中,外来物质被呈递给免疫细胞,而树突细胞则在此借由淋巴来穿行。对操纵淋巴管的理解和能力进展缓慢。
淋巴管内皮细胞的发育或功能异常可导致淋巴管肿瘤或畸形,例如淋巴管瘤或淋巴管扩张。Witte等,Regulation of Angiogenesis(eds.Goldber,I.D.& Rosen,E.M.)65-112(Birk_user,Basel,Switzerland,1997)。VEGFR-3酪氨酸激酶受体在正常淋巴内皮中表达,并在多种类型的血管肿瘤中发生上调,包括卡波奇肉瘤(Kaposi’s sarcomas)。Jussila等,Cancer Res 58,1955-1604(1998);Partanen,等,Cancer 86:2406-2412(1999)。由感染,手术,放射治疗或遗传缺陷造成的淋巴管缺失或功能障碍导致淋巴水肿,其特征是富含蛋白的液体在该组织中的慢性累积,从而导致肿胀。VEGFR-3信号对淋巴管生成的重要性在家族性淋巴水肿的遗传学中得到了揭示,所述疾病的特征是皮肤淋巴管发育不全,导致外貌变丑和肢体肿胀致残。Witte,等,Regulationof Angiogenesis(eds.Goldber,I.D.& Rosen,E.M.)65-112(Birk_user,Basel,Switzerland,1997);Rockson,S.G.,Am.J.Med.110,288-295(2001)。一些患有淋巴水肿的家族成员是编码酪氨酸激酶结构域的VEGFR3外显子的错义突变杂合子,这种突变导致受体蛋白失活。Karkkainen,等,Nature Genet.25:153-159(2000);Irrthum,等,Am.J.Hum.Genet.67:295-301(2000)。
本领域需要关于控制内皮细胞多样性的转录程序的信息,以及血管生成和淋巴管生成的机制的信息。本领域还需要新的血管标志物,所述标志物可用作研究包括肿瘤转移在内的多种涉及淋巴管的疾病的有价值的靶点。
发明内容
本发明的组合物包括分离的多核苷酸,具体为淋巴管内皮细胞基因,多肽,这些多核苷酸编码的分离的多肽,重组DNA分子,克隆的基因或其简并变体,尤其是天然存在的变体例如等位基因变体,以及特异性识别一种或多种存在于所述多肽上的表位的抗体。
本发明的组合物还包括含有本发明的多核苷酸的载体(包括表达载体),经遗传改造含有这种多核苷酸的细胞,和经遗传改造表达这种多核苷酸的细胞。
在选定的实施方案中,本发明这种分离的多核苷酸包含序列表中所述的多核苷酸序列,例如SEQ ID NO:1-30之一。
本发明的多核苷酸还包括,但不限于,与SEQ ID NO:1-30的核苷酸序列的互补序列在高度严格的条件下杂交的多核苷酸;与SEQ ID NO:1-30的核苷酸序列的互补序列在中等严格的条件下杂交的多核苷酸;上述任一种多核苷酸的等位基因变体多核苷酸;编码上述任一种蛋白的种同源物(species homologue)的多核苷酸;编码包含SEQ ID NO:1-30之一编码的多肽的特定结构域或截短部分(truncation)的多肽的多核苷酸。示例性的高度严格的杂交条件是在42℃,含有50%甲酰胺,5xSSPE,5x Denhardt′s溶液,0.1%SDS和0.1mg/ml变性的鲑精DNA的溶液中杂交20小时,然后用1xSSC,0.1%SDS在65℃洗涤30分钟。
本发明的另一方面涉及LEC和BEC多肽,包括上述多核苷酸编码的多肽。在一些实施方案中,所述多肽是本发明多肽的成熟形式。特别是经纯化并分离的多肽,所述多肽包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293,和391之一的氨基酸序列;以及经纯化并分离的多肽,所述多肽包含选自以下序列的氨基酸序列:(a)SEQ ID NOs:31-34,46,48,207,676,859,和861;和(b)(a)中的氨基酸序列的包括至少10个氨基酸的胞外区片段。此外,本发明还包括上述纯化并分离的可溶性多肽,所述多肽包含SEQ ID NO:31-34,46,48,207,676,859,和861之一的氨基酸序列的胞外区片段,其中所述多肽缺乏任何跨膜区。这种多肽还缺乏任何细胞内区。本发明还涉及融合蛋白,所述蛋白包含与有含免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白片段融合的上述多肽。
相关地,本发明还提供了一种组合物,所述组合物包含上述的多肽或蛋白,以及可药用的稀释剂,载体或佐剂。本发明的多肽组合物可包含可接受的载体,如亲水的载体例如可药用的载体。还提供了包含这样一种组合物的试剂盒,以及给药受试哺乳动物所述药物组合物来调节受试动物体内的淋巴系统的方案。本发明还提供了特异性结合上述多肽的抗体,在一些实施方案中所述抗体是人源化的。本发明还提供了包含特异性结合上述多肽的抗体的抗原结合区的蛋白,其中所述蛋白与所述多肽特异性结合。
本发明还涉及制备多肽的方法,包括在适宜的培养基中,使本发明的细胞培养物生长,并纯化来自培养物或细胞提取物的蛋白。具体地,本发明涉及制备LEC多肽的方法,包括使得用本文所述的表达载体转化或转染的宿主细胞生长,其中生长的条件使所述细胞表达所述多核苷酸编码的多肽。
本发明还提供了鉴定本文的产物和组合物的方法。具体地,本发明提供了鉴定LEC核酸的方法,包括:(a)使含有候选LEC核酸的生物样品和多核苷酸或其互补体在严格的杂交条件下接触,所述多核苷酸包含:SEQ IDNO:1-30,45,47,49,51,82,93,111,188,208,212,236,242,294,和392之一的至少14个连续核苷酸的片段,所述杂交条件为:(i)42℃,在含有50%甲酰胺,5xSSPE,5x Denhardt′s溶液,0.1%SDS和0.1mg/ml变性的鲑精DNA的溶液中杂交20小时,和(ii)65℃,1xSSC,0.1%SDS中洗涤30分钟;和(b)检测候选LEC核酸和该多核苷酸的杂交,由此鉴定LEC核酸。
本发明还提供了鉴定LEC蛋白的方法,包括(a)使含有候选LEC蛋白的生物样品和选自本文所述抗体或本文所述蛋白或多肽的LEC蛋白结合配偶体在适宜二者结合的条件下接触;和(b)检测候选LEC蛋白和LEC结合配偶体之间的结合,由此鉴定LEC蛋白。
本发明还涉及鉴定LEC的方法,包括(a)使包含细胞的生物样品和LEC结合配偶体在适宜两者结合的条件下接触,其中的LEC结合配偶体包含与多肽结合的抗体或该抗体的抗原结合片段,所述多肽包含SEQ IDNO:31-34,46,48,207,676,859,和861之一;和(b)通过检测细胞和LEC结合配偶体之间的结合鉴定LEC,其中LEC结合配偶体与细胞的结合可鉴定LEC。
本发明的多核苷酸在分子生物学领域的熟练技术人员已知的多种技术中有多种应用。这些技术包括用作杂交探针,作为PCR的引物,用于染色体和基因作图,用于重组制备蛋白,和用于产生反义DNA或RNA、其化学类似物等诸如此类。例如,mRNA的表达主要限于特定的细胞或组织类型例如淋巴管内皮细胞时,本发明的多核苷酸可用作杂交探针,使用例如原位杂交法检测样品中特定细胞或组织mRNA的存在。
另一方面,本发明提供了一种包含分离的多核苷酸的组合物,所述多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293,和391之一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;以及可药用的稀释剂,载体或佐剂。在一些实施方案中,所述组合物包含编码该多肽的多核苷酸或其片段,所述多核苷酸包括SEQ ID NO:14-30,45,47,49,51,82,93,111,188,208,212,222,236,242,294,和392之一的核苷酸序列。
本发明还提供了包含表达控制序列的表达载体,所述序列与包含编码包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293,和391之一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中,所述表达载体是含所述多核苷酸的复制缺陷的腺病毒或腺伴随病毒载体。本发明另一方面涉及包含上述表达载体和可药用的稀释剂,载体或佐剂的组合物。此外,本发明提供了包含组合物的试剂盒,所述组合物包含上述多核苷酸或载体以及可药用的稀释剂,载体或佐剂,其包装内还有将该组合物给药受试哺乳动物以调节受试动物的淋巴系统的方案。
本发明还提供了由上述表达载体转化或转染的宿主细胞。
本发明的多肽可用于多种传统方法和目前用于其它蛋白的方法中。此外,本发明的多肽还可用于产生特异性结合该多肽的抗体。
本发明还提供了差异调节血管内皮细胞(BEC)或淋巴管内皮细胞(LEC)的生长和分化的方法,包括使内皮细胞和包含差异调节血或淋巴管内皮细胞的试剂的组合物接触,所述试剂选自:(a)包含BEC多肽或LEC多肽的氨基酸序列的多肽,或该多肽的活性片段;(b)包含编码(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸;(c)特异性结合(a)的多肽的抗体;(d)包含(c)的抗体的片段的多肽,其中所述片段和抗体与所述多肽结合;(e)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的反义核酸;(f)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的干扰RNA(RNAi)。所述方法包括使内皮细胞与所述组合物在活体外或活体内接触。所述组合物可包含可药用的稀释剂,佐剂或载体,而且所述接触步骤包括将所述组合物给药受试哺乳动物从而差异调节受试哺乳动物的BEC或LEC。
此外,所述方法包括鉴定患有以LEC过度增生为特征的疾病的人类受试者;给药所述人类受试者该组合物,其中的试剂差异性抑制LEC的生长和BEC的生长;可选地该方法可包括鉴定患有以LEC过度增生为特征的疾病的人类受试者;筛选受试者的LEC以便鉴定表3中的多肽的过度表达;将该组合物给药该人类受试者,其中所述试剂通过抑制筛选步骤鉴定的多肽的表达,差异抑制LEC的生长和BEC的生长。
本发明还涉及调节人类受试者的淋巴管内皮细胞的生长的方法,包括以下步骤:鉴定患有增生性淋巴疾病的人类受试者,筛查受试者鉴定表3所示LEC多肽的过低表达或过低活性,其中所述蛋白不在表1或2中;将所述组合物给药所述人类受试者,其中所述试剂包括筛选步骤所鉴定的LEC多肽(a)或该多肽的活性片段,或包括包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸(b)。
本发明的另一方面涉及使用一种试剂制备用于差异调节血管内皮细胞(BEC)或淋巴管内皮细胞(LEC)的生长或分化的药物,所述试剂选自:(a)包含BEC多肽或LEC多肽的氨基酸序列的多肽,或该多肽的活性片段;(b)包含编码多肽(a)的核苷酸序列;(c)特异性结合多肽(a)的抗体;(d)包含(c)的抗体的片段的多肽,其中所述片段和抗体与该多肽结合;(e)编码多肽(a)的人基因或mRNA的反义核酸;(f)编码多肽(a)的人基因或mRNA的干扰RNA(RNAi)。
本发明另一方面提供了调节内皮细胞生长的化合物的鉴定方法,包括以下步骤:在存在或缺失一种化合物的条件下培养内皮细胞;测定细胞内BEC或LEC基因的至少一种的表达,其中BEC或LEC基因选自编码表3和4中的多肽的基因,其中存在所述化合物相比于缺失所述化合物时至少一种BEC基因的表达改变表明该化合物是BEC生长的调节物,且其中存在所述化合物相比于缺失所述化合物时至少一种LEC基因的表达改变表明该化合物是LEC生长的调节物。所述方法可用于筛选选择性调节BEC或LEC生长或分化的化合物,其中测定步骤包括测定细胞中至少一种BEC基因和至少一种LEC基因的表达,且其中所述方法包括通过筛选差异调节至少一种BEC基因的表达相比于至少一种LEC基因的表达的化合物,筛选出可选择性调节BEC或LEC生长或分化的化合物。
此外,本发明涉及本发明上述方面的方法或用途,其中所述多肽是表3中的LEC多肽,以及差异调节LEC生长或分化相比于BEC生长或分化的试剂。在一些实施方案中,所述LEC多肽包括SEQ ID NO:81,187,207,211,221,235,241,293,和391之一的氨基酸序列;在另外的实施方案中,所述LEC多肽包括SEQ ID NO:31-34,46和48之一的氨基酸序列。在这些实施方案中,试剂可以是特异性结合上述LEC多肽的抗体,或者这种抗体的多肽片段。此外,该试剂可以是上述多肽的胞外区,或编码胞外区的多核苷酸,或者反义分子或核酸。可选地,所述多肽是表4中的BEC多肽,且该试剂差异调节BEC生长分化相比于LEC生长和分化。优选,所述多肽不在表1或2中。
本发明的方法还涉及检测样品中本发明的多核苷酸或多肽存在的方法。这种方法可例如,被用作上述疾病的预后和诊断评估的一部分,以及鉴定显示易患有所述疾病的受试者。此外,本发明还提供了在用于治疗与淋巴管内皮细胞有关的疾病的临床实验中评估药物有效性,监控病人的病情进展的方法。
本发明还提供了鉴定调节本发明的多核苷酸和/或多肽的表达的化合物。所述方法可用于例如,鉴定可缓解与上述SEQ ID NO:1-30之一的蛋白表达有关的疾病的症状的化合物。这种方法包括,但不限于,用于鉴定与本发明的多肽反应(例如结合)的化合物或其他物质的分析试验。
此外,本发明提供了测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,所述方法包括(a)测定人类受试者中与遗传性淋巴水肿基因型相关的核酸突变,而且与相应的野生型等位基因所编码的多肽的氨基酸序列相比,所述突变改变该人类受试者的至少一种等位基因编码的氨基酸序列,其中所述野生型多肽是表3中鉴定的多肽。可选地,测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括(a)测定人类受试者中与遗传性淋巴水肿基因型相关的核酸突变,而且与相应的野生型等位基因所编码的多肽的氨基酸序列相比,所述突变改变该人类受试者的至少一种等位基因编码的氨基酸序列,其中所述野生型多肽包含SEQ ID NO:31-44,46,48,52,54,207,676,859,和861之一的氨基酸序列;(b)使核酸中突变的存在或缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,其中核酸中所述突变的存在与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,且核酸中所述突变缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关。
测定患淋巴水肿的危险性的另一种方法包括以下步骤:(a)测定人类受试者的核酸的突变,所述突变改变了人类受试者的至少一种转录因子等位基因编码的氨基酸序列,并且与野生型等位基因编码的转录因子多肽的转录调节活性相比,所述突变改变了该等位基因编码的转录因子多肽的转录调节活性,其中所述野生型转录因子多肽包含SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:211,SEQ ID NO:241之一的氨基酸序列,和表5中的序列编码的转录因子;和(b)使核酸中所述突变的存在或缺失和发生遗传性淋巴水肿的危险性相关联,其中核酸中存在所述突变和患淋巴水肿危险性增加相关,而核酸中缺失所述突变和患遗传性淋巴水肿危险性不增加相关。在该方法中,所述野生型转录因子等位基因可包含表述为SEQ ID NO:54的Sox18氨基酸序列。在本方法的一些实施方案中,所述分析鉴定了改变Sox18等位基因编码的蛋白的反式激活区或DNA结合区的氨基酸序列的突变;在本方法的另一些实施方案中,与野生型SOX18对相应基因的转录活化相比,所述突变降低了SOX18反应型基因的转录活化。
本发明另一方面提供了测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括(a)测定人类受试者的核酸中的突变,其中与野生型等位基因编码的野生型粘附多肽相比,所述突变改变至少一种LEC基因的等位基因编码的氨基酸序列,并改变该LEC基因等位基因编码的粘附多肽的结合亲合力,其中所述野生型粘附多肽包含SEQ ID NO:31-34,46,207,676,859,和861之一的氨基酸序列;和(b)使核酸中存在或缺失所述突变和患遗传性淋巴水肿的危险性相关联,其中核酸中存在所述突变和出现淋巴水肿的危险性增加相关联,而核酸中缺失所述突变和患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关联。在本方法的一些实施方案中,至少一种基因相应于编码SEQ ID NO:54所述的氨基酸序列的人Sox18基因。
在测定出现本发明的遗传性淋巴水肿的方法中,所述测定可确定突变的存在,并且关联性步骤可确定病人患遗传性淋巴水肿的危险性的增加。
本发明还涉及筛选患遗传性淋巴水肿的危险性增加的人类受试者的方法,包括测定人类受试者的核酸中的突变,所述突变改变了所述核酸编码的至少一种包含表3中氨基酸序列的多肽的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中,所述多肽包SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,54,207,676,859,以及861之一的氨基酸序列,并与患遗传性淋巴水肿的危险性相关联,而且特别涉及包含SEQ ID NO:54的SOX18氨基酸序列的多肽。
本发明的另一方面涉及测定或筛选出现上述遗传性淋巴水肿的危险性的方法,其中该方法包括以下步骤的至少一步:(a)测定人类受试者的至少一种多核苷酸的至少一个密码子的核苷酸序列;(b)进行杂交试验以便测定所述人类受体的核酸具有的核苷酸序列和一种或多种对照序列相同还是不同;(c)进行多核苷酸迁移(migration)试验,确定人类受试者的核酸具有的核苷酸序列和一种或多种对照序列相同还是不同;(d)使用限制性内切酶进行消化,确定人类受试者的核酸具有的核苷酸序列和一种或多种对照序列相同还是不同。
本发明的另一方面提供了测定或筛选出现上述遗传性淋巴水肿的危险性,其中所述方法包括:进行聚合酶链反应(PCR)以便扩增包含LEC多核苷酸编码序列的核酸,并测定所扩增核酸的核苷酸序列。
本发明还提供了筛选人类受试者中的遗传性淋巴水肿基因型的方法,包括(a)提供包含来自所述受试者的核酸的生物样品,和(b)分析所述核酸中存在的突变,与编码SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,54,207,676,859,和861之一的氨基酸序列的人类基因相比,所述突变改变了人类受试者中的至少一种基因的至少一种等位基因所编码的氨基酸序列,其中当所述突变改变人受试者中编码的氨基酸序列,且这种改变与人类受试者中的淋巴水肿相关时,这种突变的存在指示了遗传性淋巴水肿基因型。在本方法的一些实施方案中,所述生物样品是细胞样品。在本方法的另一些实施方案中,所述分析包括测定所述核酸的一部分的序列。本发明的另一些实施方案中,所述人类受试者通过筛选方法被鉴定为具有遗传性淋巴水肿基因型。
本发明另一方面提供了抑制淋巴管生成的方法,包括给药受试者LEC跨膜多肽的抑制物,其中所述LEC跨膜多肽包括SEQ ID NO:31-34,46 48,207,676,859,和861之一的氨基酸序列,且其中所述抑制物选自:(a)LEC跨膜多肽的可溶性细胞外区片段;(b)与所述LEC跨膜多肽的胞外区结合的抗体;(c)包含(b)的抗体的抗原结合区的多肽;和(d)与编码该LEC跨膜多肽的核酸或其互补链互补的反义核酸。在本方法一些实施方案中,所述抑制物是包含LEC多肽的胞外区片段的多肽,其中胞外区序列选自以下序列:SEQ ID NO:31的氨基酸1-152,SEQ ID NO:32的氨基酸1-695和SEQ IDNO:33的氨基酸1-248。在本方法的一些实施方案中,所述受试者是患有肿瘤的人。
本发明还提供了调节受试哺乳动物的淋巴管生成的方法,包括:将LEC多核苷酸的反义分子给药需要调节淋巴管生成的受试哺乳动物,其量可有效抑制LEC多核苷酸编码的多肽的转录或翻译,其中所述LEC多核苷酸包含选自SEQ ID NO:14-30,45,47,49,51,208,677,860,和862之一的核苷酸序列。
本发明的方法还包括治疗上述与淋巴管内皮细胞相关的疾病的方法,包括将该化合物给药显示与所述疾病相关的症状或有患该病趋势的个体。
本发明另一方面提供了治疗遗传性淋巴水肿的方法,包括:(a)鉴定患有遗传性淋巴水肿的人类受试者,而且与包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,54,207,676,859,和861之一的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列相比,所述人类受试者具有的突变改变了所编码的至少一种多肽的氨基酸序列;和(b)将淋巴管生长因子给药所述受试者,所述淋巴管生长因子选自:VEGF-C多核苷酸,VEGF-C多肽,VEGF-D多核苷酸,和VEGF-D多肽。
本发明还提供了治疗遗传性淋巴水肿的方法,包括:鉴定患有淋巴水肿的人类受试者,所述人类受试者中编码表3所示LEC蛋白的基因的至少一种等位基因具有突变,所述突变与人类受试者中的淋巴水肿相关;且其中LEC蛋白不是VEGFR-3;以及将一种包含淋巴管生长试剂的组合物给药受试者,所述试剂选自;VEGF-C多肽,VEGF-D多肽,VEGF-C多核苷酸,和VEGF-D多核苷酸。本发明还涉及利用选自VEGF-C多肽,VEGF-D多肽,VEGF-C多核苷酸,和VEGF-D多核苷酸的淋巴管生长试剂制备用于治疗遗传性淋巴水肿的药物的用途,其中遗传性淋巴水肿由表3中鉴定的LEC基因的突变造成,且其中的基因不是VEGFR-3。
此外,本发明涉及通过给药调节靶基因产物的总体活性的化合物和其它物质治疗这种疾病或病症的方法。化合物和其它物质可在靶基因表达或靶蛋白活性的水平上起所述调节作用。这些治疗方法包括:将本发明的多肽或多核苷酸给药内皮细胞,例如LEC和/或BEC,或例如人类病人等有机体。本发明的示例性方法是给药以下治疗剂之一:能够调节本发明的至少一种多核苷酸的表达的反义多核苷酸,本发明的多肽,本发明的多核苷酸,特异性识别本发明的多肽的抗体或抗体片段,VEGF-C多核苷酸,VEGF-C多肽,VEGF-D多核苷酸,VEGF-D多肽和可溶性VEGFR-3多肽。
本发明另一方面提供了筛选内皮细胞疾病或患有该疾病的倾向性的方法,包括从人类受试者获得包含内皮细胞mRNA的生物样品;根据样品中由该基因转录的mRNA的量测定BEC或LEC基因的表达,其中BEC或LEC基因编码表3或4中鉴定的多肽。
本发明涉及抑制淋巴管内皮细胞生长的方法,所述方法包括使细胞和组合物接触,所述组合物包含至少一种与能够抑制生长的试剂偶联的抗体,其中所述试剂选自细胞毒性剂和细胞生长抑制剂,其中所述抗体特异性结合由一种多核苷酸编码的多肽,其包含SEQ ID NO:14-17,45,47,860和862之一的序列。本发明的一个具体实施方案中,所述多肽包含SEQ IDNO:31-34,46,48,859和861之一的氨基酸序列。
本发明还涉及检测淋巴管内皮细胞的方法,所述方法包括将细胞和一种组合物接触,所述组合物包含至少一种与可检测的试剂,例如荧光分子或放射标记的分子偶联的抗体。在具体的实施方案中,所述抗体特异性结合包含SEQ ID NO:14-17,45,47,860和862之一的序列的多核苷酸编码的多肽。本方法更具体的实施方案中,所述多肽包含SEQ ID NO:31-34,46,48,859和861之一的氨基酸序列。
本发明还涉及分离淋巴管内皮细胞的方法,其包括将所述细胞域固体基质接触,所述基质含有至少一种能够和细胞的细胞膜中的跨膜蛋白结合的抗体,并分离与该抗体基质特异性结合的细胞。在具体的实施方案中,所述抗体与包含SEQ ID NO:14-17,45,47,860和862之一的序列的多核苷酸编码的多肽特异性结合。本方法更具体的实施方案中,所述多肽包含SEQID NO:31-34,46,48,859和861之一的氨基酸序列。
本发明还涉及将激动剂或拮抗剂给药淋巴管内皮细胞,包括选择能够特异性结合淋巴管内皮细胞特异蛋白的抗体,肽或小分子量化合物,其中的抗体,肽或小分子量的化合物是生长因子受体,细胞因子受体,趋化因子受体,或造血因子受体的激动剂或拮抗剂,并将所述抗体,肽或小分子量的化合物和需要生长刺激或抑制的淋巴管内皮细胞接触。在具体的实施方案中,这种淋巴管内皮细胞与淋巴水肿,淋巴管瘤,淋巴管骨髓瘤(lymphangiomyeloma),淋巴管肌瘤病(lymphangiomatosis),淋巴管扩张(lymphangiectasis),淋巴管肉瘤(lymphosarcoma)和淋巴管硬化(lymphangiosclerosis)有关。
本发明还涉及将细胞毒性或细胞生长抑制性药物给予淋巴管内皮细胞,包括筛选能够特异性结合淋巴管内皮细胞特异性蛋白的抗体,肽或小分子量化合物,其中所述抗体,肽或小分子化合物与细胞毒性或细胞生长抑制性的药物结合。在具体的实施方案中,所述复合物给药可用于治疗易于转移到淋巴系统的恶性肿瘤疾病。
本发明还提供了监测药物对内皮细胞的效力或毒性的方法,包括测定给药前后受试哺乳动物内皮细胞的至少一种BEC或LEC基因的表达,其中所述至少一种BEC或LEC基因编码表3或4中所述的多肽,并且其中BEC或LEC基因的表达的改变和药物对内皮细胞的效力或毒性有关。
所述发明涉及淋巴管内皮细胞标记蛋白,所述蛋白包含SEQ IDNO:14-17之一的多核苷酸;和在严格条件下与SEQ ID NO:14-17之一杂交的多核苷酸编码的多肽。在具体的实施方案中,所述淋巴管内皮细胞标记蛋白包含SEQ ID NO:31-34之一的多肽。
本发明还涉及能够特异性结合淋巴管内皮细胞标记蛋白的抗体,所述标记蛋白包含SEQ ID NO:31-34之一的多肽。
本发明还涉及检测淋巴管内皮细胞的方法,包括使所述细胞和抗体接触,其中所述抗体具有可检测的标记。
本发明还涉及抑制淋巴管内皮细胞的至少一种生物活性的方法,包括使细胞和能够与至少一种由SEQ ID NO:14-17,45,47,860和862之一编码的多肽结合的试剂接触,其中所述多肽与没有和该试剂接触的多肽相比,活性被降低。
本发明还涉及抑制淋巴管内皮细胞生长的方法,所述方法包括将所述细胞和一种反义寡核苷酸接触,所述反义寡核苷酸能够特异性结合至少SEQ ID NOSEQ ID NO:1-30,45,47,860和862之一的多核苷酸。在具体的实施方案中,所述反义寡核苷酸主要由SEQ ID NO:1-30,45,47,860和862之一的约12到约25个连续的核苷酸组成。
根据本申请的全文内容,本发明的其它特征和变化对于本领域熟练技术人员是显而易见的,并且所有这些特征都意图作为本发明的内容。
附图说明
图1:LEC和BEC中差异表达的基因的实例。其转录子的Northern印迹和杂交。通过使用GAPDH测证明加样量相等。在微阵列分析时,从LEC中提取RNA,并在VEGF-C存在的条件下培养(LEC/+C)。验证微阵列结果时,也从没有加入VEGF-C的LEC培养物(LEC/-C)中提取RNA作为对照。
图2:BEC和LEC中表达的细胞骨架结构,钙粘着蛋白复合物和整联蛋白α9。对LEC和BEC的混合培养物进行双染,显示N-钙粘着蛋白(a),VE-钙粘着蛋白(c),β-连环蛋白(e),片珠蛋白(plakoglobin)(g),F-肌动蛋白(i)和整联蛋白α9(k),以及LEC特异的标记物podoplanin(绿;b,d,f,h,j,l)。整联蛋白α9在淋巴管内皮中表达(arrow)但不在血管内皮中表达楔形(arrowhead)。人皮肤的连续切片使用整联蛋白α9(m),VEGFR-3(n)或血管内皮抗原PAL-E(o)的抗体染色。
发明详述
淋巴管系统的一个主要作用是去除丛血毛细血管中不断渗出的过量的富含蛋白的间质液体,并将其引流回血液循环(Witte,M.H.,等,Microsc.Res.Tech.55:122-145.2001;Karpanen,T.,等,J.Exp.Med.194:F37-F42.2001;Karkkainen,M.J.,等,Trends Mol.Med.7:18-22.2001)。此外,所述淋巴系统通过淋巴结链过滤淋巴液及其抗原,提供了持续的免疫监视,并且是从肠道吸收脂类的主要途径之一。长期以来已知多种类型的癌症中,淋巴管提供了肿瘤转移的主要途径,而且局部淋巴结扩散与疾病的进展相关。遗传性淋巴水肿,手术后继发的淋巴水肿,以及丝虫病引起的淋巴管堵塞,其特征都是受损部位的功能丧失和变形肿胀,与淋巴管的不全堵塞相关。Witte,M.J.,等,Microsc.Res.Tech 55:122-145(2001)。
尽管淋巴管在医学上很重要,直到最近,人们对血管系统的这部分细胞生物学的注意仍然很少。过去四年中的研究揭示了淋巴管特异的血管内皮生长因子VEGF-C和VEGF-D的存在,所述生长因子是受体酪氨酸激酶VEGFR-3的配体,并显示了它们对于淋巴管的正常发育的重要性(见,Jeltsch,M.,等,Science 276:1423-1425(1997);Veikkola,T.,等,EMBO J.20:1223-1231(2001);M_kinen,T.,等,Nat.Med.7:199-205(2001))。这些分子也参与淋巴水肿和淋巴管转移的发展(Karpanen,T.,等,J.Exp.Med.194:F37-F42(2001);Karkkainen,M.J.,等,Trends Mol.Med.7:18-22.2001)。
生长因子血管内皮生长因子C(VEGF-C),以及编码VEGF-C,和VEGF-C变体和类似物的天然人类和非人类哺乳动物,和鸟类多核苷酸序列,在以下文章中详述:1998年2月2日提交的国际专利申请PCT/US98/01973,1998年8月6日公开的国际公开WO98/33917;Joukov等,J.Biol.Chem.,273(12):6599-6602(1998);和Joukov等,EMBO J.,16(13):3898-3911(1997),所有这些文章的全文内容包含在文中作为参考。如本文详述,人VEGF-C(SEQ ID NO:863)最初是以人类细胞中作为419个氨基酸的前蛋白-VEGF-C多肽的形式产生的。根据布达佩斯条约的规定,将编码人VEGF-C(SEQ ID NO:864)的cDNA保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209(USA),(保藏日1995年7月24日,ATCC保藏号97231)。其它物种的VEGF-C序列也有报道。见例如Genbank保藏号MMU73620(Mus musculus);和CCY15837(Coturnix coturnix),包含在文中作为参考。
前蛋白(prepro)-VEGF-C多肽经多阶段处理产生成熟的和最活泼的VEGF-C多肽,根据还原条件下的SDS-PAGE估计约为21-23 kD(SEQ IDNO:863)。这样的加工包括单肽(残基1-31)的裂解;裂解羧基末端肽(大约对应于约氨基酸228-419并具有并具有Balbiani环3蛋白(BR3P)序列的隔开的(spaced)半胱氨酸残基[Dignam等,Gene,88:133-40(1990);Paulsson等,J.Mol.Biol.,211:331-49(1990)])来产生月29kD的部分加工形式;以及裂解(明显在细胞外)氨基末端肽(大约对应于氨基酸32-103)以产生约21-23kD的完全加工形式。实验证据表明,部分加工的VEGF-C(例如,29kD的形式)能够结合VEGFR-3(Flt4受体),而只有完全加工的VEGF-C才以高亲合力结合VEGFR-2。很明显VEGF-C多肽天然地结合成非二硫化物连接的二聚体。
已证明VEGF-C的氨基酸103-227对于保持VEGF-C的功能不都是必要的。由氨基酸113-213组成(并且缺乏残基103-112和214-227)的多肽保持结合和刺激VEGF-C受体的能力,并且预期包含大约残基131到大约残基211的多肽将保持VEGF-C的生物活性。氨基酸位置156上的半胱氨酸残基显示对于VEGFR-2的结合能力很重要。然而,VEGF-CΔC156多肽(即,由于缺失或替代而缺乏该半胱氨酸的类似物)仍然是VEGFR-3的有效激活物。VEGF-C多肽的位置165上的半胱氨酸对于结合两种受体都很重要,然而缺乏位置83或137上的半胱氨酸的类似物与天然VEGF-C竞争结合两种受体并刺激两种受体。
VEGF-D在结构和功能上与VEGF-C最为接近(见美国专利6,235,713和国际专利WO 98/07832,包含在文中作为参考)。VEGF-D的多核苷酸序列见SEQ ID NO:866;编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:865。和VEGF-C一样,VEGF-D最初是作为前蛋白肽表达的,并经过了N末端和C末端的蛋白裂解加工,形成非共价连接的二聚体。VEGF-D刺激体内内皮细胞的有丝分裂反应。在胚胎形成期间,VEGF-D以一种复杂的时间和空间模式表达,且它在成人的心脏,肺和骨骼肌中持续表达。VEGF-D的生物活性片段分离物称为VEGF-DΔNΔC,在国际专利公开WO 98/07832中描述,包含在文中作为参考。VEGF-DΔNΔC由VEGF-D的氨基酸残基93-201(SEQ ID NO:26)组成,可选地与亲合标记肽FLAG_,或其他序列连接。
前蛋白-VEGF-D多肽具有推定的21个氨基酸的信号肽,并且明显通过与加工前蛋白-VEGF-C类似的方式进行蛋白裂解加工。“重组成熟”的VEGF-D缺乏残基1-92和202-354,其保持活化受体VEGFR-2和VEGFR-3的能力,并且和非共价连接的二聚体结合。因此,优选的VEGF-D多核苷酸包括编码氨基酸93-201的核苷酸序列。上述将功能保持性修饰引入VEGF-C多肽的方法也适于将功能保持性的修饰引入VEGF-D多肽。本发明的另一方面还涉及实施本发明的方法,其用VEGF-D多肽代替VEGF-C多肽。
与血管内皮细胞相比,淋巴管内皮显示特殊的形态学和分子特征。例如,淋巴毛细管比毛细血管更大,它们具有无规且塌陷的管腔,其中没有血细胞,不连续的基底层,重叠的细胞间连接复合体和将淋巴内皮细胞连接到细胞外基质的锚丝(Witte,M.H.,等,Microsc.Res.Tech.55:122-145(2001))。和毛细血管不同,没有周细胞覆盖淋巴毛细管。在分子水平上,鉴定了多种淋巴管特异性标记物,包括VEGFR-3,Prox-1转录因子,透明质酸(hyaluronan)受体LYVE-1,膜粘蛋白podoplanin,β趋化因子受体D6,细胞骨架蛋白粒桥蛋白I和II以及举是细胞甘露糖I(Wigle,J.T.& Oliver,G.,Cell 98:769-778(1999);Banerji,S.,等,J.Cell Biol.144:789-801(1999):Breitenede r-Geleff,S.,等,Am.J.Pathol.154:385-394(1999):Nibbs,R.J.,等,Am.J.Pathol.158:867-877(2001);Ebata,N.,等,Microvasc.Res.61:40-48.(2001);Irjala,H.,等,J.Exp.Med.194:1033-1041(2001))。本发明还涉及使用基因绘图(gene profiling)的方法,鉴别淋巴毛细管内皮细胞与血管内皮细胞。
“严格的杂交条件”或“严格的条件”指这样一种条件,例如寡核苷酸的核酸在该条件下与其靶序列特异性杂交。严格的条件与序列有关,并且根据环境而不同。较长的核酸比较短的核酸的杂交温度更高。通常,严格的条件被选为在特定的离子强度和PH下,比特定序列的热溶解温度(Tm)低约5℃。Tm是温度(在特定的离子强度,PH和核酸浓度条件下),在该温度下,约50%的与靶核苷酸互补的核酸与靶核苷酸以等当量杂交。术语“互补”指两个核酸分子的核苷酸之间的标准Watson-Crick碱基配对。通常,严格的条件是:pH7.0-8.3,盐浓度低于约1.0M钠离子,通常为约0.01-1.0M钠离子(或其他盐),而且对于短探针,引物和寡核苷酸(例如10-50个核苷酸)温度至少约30℃,而对于较长的探针,引物和寡核苷酸温度至少约60℃。如本领域已知,严格的条件可通过加入去稳定剂,例如甲酰胺来实现。示例性的严格条件是在含有50%甲酰胺,5xSSPE,5x Denhardt′s溶液,0.1%SDS和0.1mg/ml变性的鲑精DNA的溶液中,在42℃下杂交20小时,然后在65℃下,1xSSC,0.1%SDS中洗涤30分钟。
根据本发明,发现血管和淋巴管内皮细胞具有不同的基因表达图。这些结果提供了关于内皮细胞基因型多样性的新发现,并揭示了新的潜在的淋巴内皮分子,其中一些还提供了治疗以异常血管生成或淋巴管生成为特征的疾病的重要靶点。
已发现了编码参与炎症过程以及介导细胞-细胞和细胞-基质间相互作用的蛋白的基因的表达不同。此外,内皮细胞生物学领域还鉴定了多种以前未知的基因,它们在两种细胞系中的差异表达。所述基因的一些最初是从神经组织中克隆的,包括参与突触巨分子的吸收和突触形成以及重构的基因(neuronal pentraxins I和II(Kirkpatrick,L.L.,等,J.Biol.Chem.275:17786-17792.2000),参与突触小泡的运输的基因(NAP-22(Yamamoto,Y.,等,Neurosci.Lett.224:127-130.1997),piccolo(Fenster,S.D.,等,Neuron25:203-214(2000))以及参与轴突生长和引导的基因(Nr-CAM(Grumet,M.,Cell Tissue Res.290:423-428(1997),reelin(Rice,D.S.& Curran,T.,Annu.Rev.Neurosci.24:1005-1039(2001))。
此外,LEC还特异性表达一些目前仍未定型的基因,最初在神经组织中克隆并在其中高表达(KIAA基因(Kikuno,R.,等,Nucleic Acids Res.30:166-168.2002)。本文的基因表达profiling数据支持一下观点:控制神经细胞定位,引导轴突生长锥(axonal growth cones)到达它们的特异性靶点,以及突触形成具有相同的分子机制,通常该机制也适用于血管系统形成及BEC和LEC的确定。首先在神经系统发育中描述的一些其他信号分子也参与血管系统的发育,反之也如此(Shima和Mailhos,Curr.Opin.Genet.Dev.10:536-542(2000);Oosthuyse,等,Nat.Genet.28:131-138(2001);Sondell,等,Eur.J.Neurosci.12:4243-4254(2000))。
在LEC中,观察到在平滑肌细胞(SMCs)和周细胞中表达的一些基因的表达,例如基质Gla,它是矿质结合的细胞外基质蛋白,参与抑制血管和组织的钙化(Luo,G.,等,Nature 386:78-81(1997)),单胺氧化酶A,它是主要的单胺激素和神经递质的降解酶(Rodriguez,M.J.,等,Cell Tissue Res.304:215-220(2001)),整联蛋白α9(Palmer,E.L.,等,J.Cell Biol.123:1289-1297(1993))和载脂蛋白D(Hu,C.Y.,等,J.Neurocytol.30:209-218(2001))。LEC和SMCs之间类似的基因表达模式与淋巴毛细管周围缺乏SMC有关。LEC还独立执行一些SMC的任务。例如,淋巴流动的保持是由于LEC的内在收缩性(Witte,M.H.,等,Microsc.Res.Tech.55:122-145(2001)),与血管SMCs的收缩能力类似。
淋巴管和血管的分子鉴别在研究涉及血管和/或淋巴管的疾病以及这类疾病的靶向治疗中是重要的。目前,已鉴定了多种淋巴内皮特异的标志物,但其中一些只在部分淋巴管中表达,而另一些也在一些血管内皮或其他细胞类型中表达,而且其表达模式在病理条件下发生改变(例如,VEGFR-3(Valtola,R.,等,Am.J.Pathol.154:1381-1390.1999))。本发明的新的血管标记物的鉴定应提供对病理条件下的血管和淋巴管的更可信的分析,并最终使诊断和治疗更好。此外,抑制参与血管生成和/或淋巴管生成的调控的特定分子的功能已知能够防止肿瘤生长和转移,并且刺激血管和淋巴管的生长显示对多种病理条件有益。因此,本发明鉴定的BEC和LEC特异性分子调节物可提供治疗以异常血管生成和淋巴管生成为特征的疾病的新靶点。
一些新的LEC基因编码跨膜蛋白,它们可能是淋巴管内皮细胞特异的分子标记(表6)。这些基因和编码的蛋白可用于淋巴管疾病的靶向治疗。它们也可用于制备抗体,抗LEC特异性蛋白的抗体可用来鉴别生理和病理条件下的血管和淋巴管。抗体也可用于分离淋巴管内皮细胞。这些蛋白也可调节淋巴管生成,并为淋巴管疾病例如淋巴水肿提供新的候选基因。
淋巴管内皮细胞特异性表面分子可用作靶向抗体,肽和小分子量化合物的分子药物,它们可作为生长因子受体,细胞因子和趋化因子受体,以及造血因子受体信号,细胞粘附和细胞与胞外基质或其他细胞表面分子相互作用的激动剂或拮抗剂。这种分子也可用于将细胞毒性或抑制细胞生长的药物靶向淋巴管内皮细胞,以及用于附着电荷密集的(electron-dense),不透射线的,或者放射活性的标记物来显像与淋巴管相关的疾病过程。所述疾病包括,淋巴水肿,淋巴管瘤,淋巴管骨髓瘤,淋巴管肌瘤病,淋巴管扩张,淋巴肉瘤和淋巴管硬化.
淋巴管内皮细胞表面分子也可用来靶向基因治疗,例如通过抗体包被的脂质体(含有蛋白或基因作为运载物),或通过病毒转导载体例如具有修饰的衣壳/包膜的腺病毒,腺伴随病毒或慢病毒。淋巴管内皮细胞特异性分子的处理可用于治疗与组织水肿相关的疾病过程,所述治疗通过增加液体通过淋巴管壁的运输,例如通过调节内皮细胞-细胞或细胞-基质相互作用或者通过刺激跨内皮转运。将例如细胞毒性或抑制细胞生长的化合物靶向淋巴管内皮细胞对于治疗可能通过淋巴系统转移的恶性肿瘤有价值。
淋巴管内皮细胞分子可促进淋巴管内皮细胞的体外生长以及淋巴管的体外组织改造,所述淋巴细胞和淋巴管用于其中的淋巴管被破坏的疾病,例如手术后或者多种类型的淋巴水肿。细胞表面蛋白配体可进一步用于包被各种用于细胞粘附的聚合基质,例如生物植入物。
淋巴管内皮细胞特异性分子例如表面分子是调节感染,自身免疫和感染过程的重要工具,所述过程涉及白细胞迁移和免疫识别以及次级免疫应答的刺激。这种过程包括抗原呈递细胞迁移入包括淋巴结的淋巴系统,和淋巴细胞和其他白细胞亚类的跨内皮细胞输送,以及各种类型的白细胞的回巢,存活和功能。
这些分子使得可调节从肠道吸收的包括脂肪酸/乳糜微粒的脂肪酸的代谢,和调控各种器官例如皮下组织和动脉壁的脂肪组织中脂肪的聚集。
淋巴管内皮细胞特异性分子还使得可调节从肠道吸收的包括脂肪酸/乳糜微粒的脂肪酸的代谢,和调控各种器官例如皮下组织和动脉壁的脂肪组织中脂肪的聚集。
淋巴细胞特异性跨膜蛋白据信在细胞粘附(例如淋巴管内皮细胞-淋巴管内皮细胞,淋巴管内皮细胞-平滑肌细胞,淋巴管内皮细胞-免疫系统细胞例如淋巴细胞或树突细胞之间的粘附),细胞-胞外基质接触中起作用,或者作为生长因子,细胞因子,趋化因子,或者微生物受体或离子通道。所述跨膜蛋白和细胞内分子相连,所述细胞内分子可诱导细胞生长,细胞迁移,细胞凋亡,细胞分化或细胞粘附或其他内皮细胞特异的细胞功能,例如白细胞粘附受体的表达,一氧化氮的释放,抗凝蛋白,吸收周围组织的液体和蛋白以及肠道或脂肪组织的脂肪。具有短细胞内区的TM蛋白可和其他TM蛋白的复合,作为辅助性受体起作用。
跨膜蛋白及其细胞内结合配偶分子可用作正常和疾病状态下的淋巴管内皮细胞的分子标记物,并用于鉴别生理和病理情况下的血管和淋巴管。
淋巴管特异性跨膜蛋白的抗体,以及与淋巴管特异性TM蛋白的胞外区结合的肽和小分子化合物可用于粘附电荷密集的,不透射线的或者放射活性的标记物来显像与淋巴管相关的疾病过程。这种疾病包括淋巴水肿,淋巴管瘤,淋巴管骨髓瘤,淋巴管肌瘤病,淋巴管扩张,淋巴肉瘤和淋巴管硬化。类似地,可在治疗患有淋巴管生长不足例如淋巴水肿的病人时,或者可选地在为防止淋巴管生长的治疗例如肿瘤的治疗时使淋巴管显像,从而易化本发明的治疗方法的监督。
预期LEC-特异性TM蛋白的抗体也可用于分离淋巴管内皮细胞。
淋巴管特异性跨膜蛋白的抗体,或者与淋巴管特异性TM蛋白的胞外区结合的肽或小分子化合物据信可用于将药物递送靶向淋巴管内皮细胞,例如通过将抗体,肽或小分子化合物与细胞毒性或抑制细胞生长的化合物偶联。这种偶联的化合物可用于治疗易于通过淋巴系统转移的恶性肿瘤疾病,以及缓解与任何这种疾病相关的症状的治疗剂。所述抗体,肽或小分子化合物也可和刺激淋巴管内皮细胞的分子偶联以加强刺激,所述分子例如生长因子,细胞因子和趋化因子。
此外,淋巴管特异性TM蛋白或与淋巴管特异性TM蛋白的胞外区结合的肽,或小分子化合物的抗体可用来靶向基因治疗,例如通过抗体包被的脂质体(含有蛋白,基因或其他分子作为运载体),或者通过病毒转导载体例如具有修饰的衣壳/包膜的腺病毒,腺伴随病毒或慢病毒。淋巴管内皮细胞特异性分子的处理可用于治疗与组织水肿相关的疾病过程,所述疾病是由于淋巴管的相对缺乏,或相对功能不全,可以由感染,手术,放射治疗或基因缺陷导致液体通过淋巴管壁的运输增加,例如通过调节内皮细胞-细胞或细胞-基质相互作用或者通过刺激跨内皮转运。
淋巴管内皮细胞分子可促进淋巴管内皮细胞的体外生长以及淋巴管的体外组织改造,用来治疗其中的淋巴管被破坏的疾病,例如手术后或者多种类型的淋巴水肿,以及本文所述的其他应用。细胞表面蛋白配体可进一步用来包被各种用于细胞粘附的聚合基质,例如生物植入物。
涉及白细胞迁移和免疫识别的炎症,自身免疫和感染过程,例如抗原呈递细胞迁移进入包括淋巴结的淋巴系统,和淋巴细胞和其他白细胞亚类的跨内皮细胞输送,以及各种类型的白细胞的回巢,存活和功能可通过靶向内皮细胞特异性TM蛋白被调节,该蛋白介导这些细胞粘附过程。
本文还涉及将淋巴管特异性基因的上调,例如在癌症中,用作诊断标志物,并使用淋巴管内皮细胞特异性蛋白的抗体来监控这种上调表达,例如通过组织免疫染色或通过使用可以淋巴管内皮细胞特异性mRNA在例如本文的严格杂交条件下杂交的探针。
淋巴管内皮细胞特异性转录因子预期对淋巴管内皮细胞从胚胎干细胞,内皮前体细胞,或者血管内皮细胞的分化有用。
淋巴管内皮细胞特异性转录因子预期可改善淋巴管内皮细胞在体外的生长,以及促进淋巴管的体外组织改造,所述淋巴细胞和淋巴管用于其中的淋巴管被破坏的疾病,例如手术后或者多种类型的淋巴水肿,以及本文公开的其他应用。
细胞内信号蛋白参与调解淋巴管内皮细胞的增殖,分化,凋亡,迁移或粘附的信号通路,预计所述蛋白可用作抑制这些信号事件的小分子化合物的靶点,以及依赖这种信号的细胞功能的靶点。预计信号蛋白还参与VEGFR-3信号通路,并可用于调节至少部分由VEGFR-3信号控制的细胞活性,例如淋巴管生成。
预期淋巴管内皮细胞分子还可改善淋巴管内皮细胞在体外的生长,以及促进淋巴管的体外组织改造,所述淋巴细胞和淋巴管用于其中的淋巴管被破坏的疾病,例如手术后或者多种类型的淋巴水肿,以及本文所述的其他应用。
预期淋巴管特异性转录因子也可用于调节内皮细胞中的基因表达,来诱导其它淋巴管特异性基因在例如血管内皮细胞或内皮前体细胞中的表达。
预期淋巴管特异性基因转录物可提供用于RNA干扰(RNAi)诱导的表达抑制的的靶点。RNAi技术与其可用于本发明的方法,例如有效治疗高和低增殖性内皮细胞相关疾病和病症的治疗方法,以及缓解与任何这种疾病或病症有关的症状。RNAi的方法在本领域已知,且已知的RNAi技术可用于本发明的多个方面。见Fire等,Nature 391:806-811.(1998)和Sharp,P.,Genes和Dev.13:139-141.(1999),包含在文中作为参考。优选RNAi化合物是与表达所需靶点的的部分或全部编码区对应的双链RNA分子。
多种新的LEC基因编码转录因子,所述转录因子控制细胞的命运(iroquois相关同源框基因),并且在淋巴管内皮细胞的分化中有重要作用。本文公开的转录因子可控制例如淋巴管内皮细胞的增殖所涉及的基因的转录,并且是淋巴管生长的重要分子调节物(表5)。淋巴管内皮细胞特异性转录因子对淋巴管内皮细胞从胚胎干细胞,内皮前体细胞和从血管内皮细胞中的分化有用。
淋巴内皮转录因子使得淋巴管内皮细胞的体内生长,以及促进淋巴管的体内组织改造,用在其中的淋巴管被破坏的疾病中,例如手术后或者多种类型的淋巴水肿。
本发明的多核苷酸
通常,本发明分离的多核苷酸包括LEC和BEC多核苷酸,它们显示不同的表达并在表3,4,14,15和16中被鉴定。这些多核苷酸的序列以及其可获得的已知的数据库保藏号在表16中提供。在表14和15种,这些保藏号与唯一的序列鉴定物(sequence idenfier)相关,从而可通过每种保藏物(citation)的序列鉴定物确定保藏号。多核苷酸序列可包括一个编码区并包括非编码的侧翼序列,可被本领域熟练技术人员轻易鉴定。本发明涉及的多核苷酸包含一个编码区的部分或全部,具有或不具有侧翼区,例如多腺苷酸序列,5′非编码序列,等等诸如此类。本发明的多核苷酸还包括,但不限于,与SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的核苷酸序列的互补序列在高度严格的杂交条件下杂交的多核苷酸;与SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的核苷酸序列的的互补序列在中度严格的杂交条件下杂交的多核苷酸;上述多核苷酸之一的等位基因变体;编码上述蛋白之一的种同源物的多核苷酸,编码包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50和52之一的特定结构域或截短序列的多肽的多核苷酸。这种多核苷酸在上述条件下与SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的互补序列或者SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的片段杂交,其中所述片段大于至少约10bp,并且可选地在其他实施方案中,大于约20到约50bp,或者在适当的情况下,大于约100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,或800bp。
本发明的多核苷酸还提供了上述多核苷酸的变体。通常这种变体序列与上述多核苷酸的差异不大于约20%,即,与相应的对照序列相比,类似序列中单个核苷酸替代,添加,和/或缺失的数量除以变体核苷酸序列的总数为约0.2或更小。这种序列据说与所述序列具有80%的序列相同性。这种变体序列可通常通过应用前述算法鉴定。
在一种实施方案中,本发明的变体多核苷酸序列与所述序列的差异不大于10%,即,,与相应的对照序列相比,类似序列中单个核苷酸替代,添加,和/或缺失的数量除以变体核苷酸序列的总数为约0.1或更小。这种序列据说与所述序列具有90%的序列相同性。这种变体序列可通常通过应用前述算法鉴定。
在本发明另一实施方案中,本发明的变体多核苷酸序列与所述序列的差异不大于5%,即,,与相应的对照序列相比,类似序列中单个核苷酸替代,添加,和/或缺失的数量除以变体核苷酸序列的总数为约0.05或更小。这种序列据说与所述序列具有95%的序列相同性。这种变体序列可通常通过应用前述算法鉴定。
在本发明另一实施方案中,本发明的变体多核苷酸序列与所述序列的差异不大于2%,即,,与相应的对照序列相比,类似序列中单个核苷酸替代,添加,和/或缺失的数量除以变体核苷酸序列的总数为约0.02或更小。这种序列据说与所述序列具有98%的序列相同性。这种变体序列可通常通过应用前述算法鉴定
本发明的多核苷酸可以通过已经建立的重组DNA技术(see Sambrook J等(2d Ed.;1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)和其他任何一种核苷酸序列连接。用于连接多肽的核苷酸序列包括各种载体,例如,质粒,粘粒,λ噬菌体衍生物,噬菌粒等本领域已知的载体。相应地,本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体以及含有该多核苷酸的宿主细胞。通常,载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点,便利的限制性核酸内切酶位点,以及宿主细胞的选择性标记物。本发明的载体包括表达载体,复制载体,探针生成载体,测序载体(sequencing vectors),和逆转录病毒载体。本发明的宿主细胞可以是原核或真核细胞,并可以是单细胞有机体或者多细胞有机体的一部分。本领域熟练技术人员已知大量适宜的载体和启动子,并且可购得它们用来产生本发明的重组构建体。
本发明范围内的序列不限于本文所述的具体序列,还包括其等位基因变体。等位基因变体的测定通常可通过比较SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的序列,其代表性的中间片段,或者与SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的序列具有至少99.9%的同一性同核苷酸序列和相同物种的另一分离株(isolate)的序列。此外,为了提供密码子多样性,本发明包括的核酸分子编码的氨基酸序列与本文公开的特异性开放阅读框架(ORFs)的氨基酸序列相同。换言之,在ORF的编码区,尤其涉及使用一种密码子替换另外一种编码相同氨基酸的密码子。
除非本文特别指出的,所有定义的术语都是本领域已知的,例如见美国专利6,350,447,包含在文中作为参考。
本发明还涉及根据本发明的LEC或BEC多核苷酸之一的序列的反义多核苷酸。这种反义多核苷酸与在LEC和BEC中差异表达的本发明的多核苷酸序列或其片段是基本互补的(例如,至少90%互补性),优选完全互补,所述本发明的多核苷酸见序列表,表3,4,14-16,以及本说明书的全文内容。这些多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一或其包括至少10个连续的核苷酸的片段。所述反义核苷酸包含与编码蛋白质的“有义”核酸互补的核苷酸序列(例如,与双链cDNA分子的编码序列或mRNA序列互补)。设计并最优化反义核苷酸的方法见Lima等,(J Biol Chem;272:626-38.1997)和Kurreck等,(Nucleic Acids Res.;30:1911-8.2002)。一方面,本文的反义核酸分子包括与至少约10,25,50,100,250或500个核苷酸或者整个编码序列互补的序列。本发明的反义核酸通过化学合成或酶偶联反应使用本领域已知的方法构建。
在一种实施方案中,反义核酸分子与编码本发明的多肽的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区。在另一实施方案中,该反义核酸分子与编码该多核苷酸的核苷酸序列的“让步区(conceding region)”反义。术语“让步区”指与编码区侧接的5′和3′序列,它们不被翻译成氨基酸(即,也称为5′和3′非翻译区)。
本发明的反义核酸可根据Watson和Crick或Hoogsteen碱基配对规则进行设计。所述反义核酸分子可以和本发明的多核苷酸的mRNA的整个编码区互补,但更优选仅和mRNA的编码或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。反义寡核苷酸的长度可以是例如约5,10,15,20,25,30,35,40,45,or50个核苷酸。本发明的反义核酸可使用化学合成或酶偶联反应使用本领域已知的方法构建。例如,反义核酸(例如,反义寡核苷酸)可利用化学方法,使用天然存在的核苷酸或者经不同的修饰后的核苷酸合成,所述修饰是为了增加分子的生物稳定性或者提高反义和有义核酸之间形成的双链的物理稳定性(例如,可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。
所述本发明的反义核酸分子通常给药受体或在原位生成使得它们和编码互补多核苷酸的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合,从而抑制蛋白的表达(例如通过抑制转录和/或翻译)。杂交反映了形成稳定双链的通常的核苷酸互补性,或者如果反义核苷酸分子与DNA双链结合,表明是通过双螺旋结构的大沟(groove)中的特异性相互作用。
给药本发明的反义核酸分子的途径的实例包括直接注入组织位点。可选地,可修饰反义核酸分子使其靶向选定的细胞然后系统地给药。例如,就系统给药而言,反义核酸分子可被修饰使得它们特异性结合选定的细胞表面表达的受体或抗原(例如,通过连接所述反义核酸分子和结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体)。反义治疗的其他途径可用于本发明,例如局部给药,经皮给药[见Brandin Curr.Opin.Mol.Ther.3:244-8.2001],使用纳米颗粒系统的反义给药[Lambert等,Adv.Drug.Deliv.Rev.47:99-112.2001],或给药与肽偶联的反义核苷酸[Juliano等,Curr.Opin.Mol.Ther.2:297-303.2000]。
本发明还涉及将本发明的多核苷酸用于基因治疗或用于重组表达载体中,所述载体产生可调节LEC活性的本发明的多核苷酸或多肽,并可用于例如淋巴水肿的LEC疾病的治疗。将编码本发明的多肽的功能性基因递送到适当的细胞可通过使用载体在活体外,原位或活体内实现,所述载体包括病毒载体(例如腺病毒,腺伴随病毒或逆转录病毒),或在活体外用生理DNA转移方法(例如,脂质体或化学处理)实现。见,例如,Anderson,Nature,supplement to vol.392,no.6679,25-20页(1998)。关于基因治疗技术的其他综述见Friedmann,(Science,244:1275-1281.1989);Verma,(ScientificAmerican:263:68-72,81-84.1990);和Miller,(Nature,357:455-460.1992)。将本发明的任何一种核苷酸或者编码本发明的多肽的任何一种基因导入也可通过染色体外基质(substrate)(瞬时表达)或人工染色体(稳定表达)实现。细胞也可在存在本发明的蛋白的条件下离体培养,使所述细胞增殖或在细胞中产生所需的效果或活性。在另一实施方案中,包含表达本发明的多核苷酸或多肽的载体的细胞可在活体外培养,并被给药需要治疗LEC疾病或病症的个体。
根据公开的核酸构建体,可能通过常规的重组DNA/RNA技术制备包含SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的序列的基因之一的基因产物。多种表达载体/宿主系统可用来包含并表达所述编码序列。这些表达载体/宿主系统包括,但不限于,微生物,例如重组噬菌体转化的细菌,质粒,噬菌粒或粘粒DNA表达载体;酵母表达载体转化的酵母菌;病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如,杆状病毒);病毒表达载体转染的植物细胞系统(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)或细菌表达载体转化的植物细胞系统(例如,Ti或pBR322质粒);甚至动物细胞系统。用于重组蛋白制备的哺乳动物细胞包括,但不限于,VERO细胞,HeLa细胞,中国藏书卵巢(CHO)细胞,COS细胞(例如COS-7),WI38,BHK,HepG2,3T3,RIN,MDCK,A549,PC12,K562和HEK 293细胞.
本发明的多肽
通常,本发明的分离LEC和BEC由上述本发明差异表达的LEC和BEC多核苷酸编码。LEC和BEC的序列以及其已知的数据库保藏号在表16中提供。在表14和15中,这些保藏号与唯一的序列鉴定物相关,因此可通过每篇文献的(citation)序列鉴定物进行鉴定。本发明分离的多肽包括,但不限于,包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50和52之一的氨基酸序列或者SEQID NO.:1-30,45,47,49和51之一的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽,或相应的全长或成熟蛋白。本发明还提供了SEQ ID NO.:31-44,46,48,50和52之一的氨基酸序列的生物活性或免疫活性变体,或保持生物活性的相应全长或成熟蛋白适宜的变体多肽,该多肽具有至少约65%,至少约70%,至少约75%,至少约80%,至少约85%,86%,87%,88%,89%,至少约90%,91%,92%,93%,94%,典型地至少约95%,96%,97%,更典型地至少约98%,或最典型地至少约99%的氨基酸同一性。本发明还涉及本发明的蛋白的片段,所述片段包含本发明公开的序列的至少10个连续的氨基酸,且能够显示相应的全长蛋白的生物活性。
通过公开的核苷酸序列的翻译在序列表中鉴定了蛋白质编码序列。这种蛋白的成熟形式可通过全长多核苷酸在适宜的哺乳动物细胞或者其他宿主细胞中的表达获得。成熟形式的蛋白的序列也可通过全长形式的氨基酸序列确定。本发明的蛋白如果是膜结合的,还提供可溶形式的蛋白。在这种形式中,部分或所有使得蛋白成为膜结合的蛋白的区均被缺失,使得该蛋白能够从表达它的细胞完整地分泌。
本领域已知的多种方法可用来获得本发明分离的多肽或蛋白中的任何一种。最简单的水平上,可使用可购得的肽合成仪来合成所述氨基酸序列。本发明的多肽和蛋白还可任选地从细胞中纯化,所述细胞被改变以表达所需的多肽或蛋白。如果细胞通过基因操纵而产生其通常不产生或者以低水平产生的多肽或蛋白,就称本文的细胞被改变以表达所需的多肽或蛋白。本领域熟练技术人员可轻易采用将重组或合成序列引入真核或原核细胞并在其中表达的方法,以生成可产生本发明的多肽或蛋白之一的细胞。
多肽的“片段”指分子的任何部分,例如肽核(core),或者肽核的变体,或者多肽的细胞外区。多肽的“变体”指在结构和生物活性上与整个分子,或其片段基本相似的分子。因此,如果两种分子具有类似的活性,即使两种分子之一的组成或次级,三级或四级结构与另一种分子不同,或者即使氨基酸残疾的序列不同,仍认为它们是本发明所述的变体。多肽或遗传序列的“类似物”指与分离的多肽或遗传序列在功能和结构上基本类似的蛋白或遗传序列。
应理解可对纯化的或分离的多肽进行保守的氨基酸取代,所述多肽包含SEQ ID NO.:31-44,46,48,50和52的序列之一,产生保持生物活性或免疫活性的多肽,特别是这种取代的数目较小时。“保守的氨基酸取代”指一种氨基酸被具有类似的化学性质的侧链的氨基酸取代。用来进行保守取代的类似的氨基酸包括具有酸性侧链的氨基酸(谷氨酸,天冬氨酸);具有碱性侧链的氨基酸(精氨酸,赖氨酸,组氨酸);具有极性氨基侧链的氨基酸(谷氨酰胺,天冬酰胺);具有疏水的亲脂的侧链的氨基酸(亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸,丙氨酸,甘氨酸);具有芳香基侧链的氨基酸(苯丙氨酸,色氨酸,酪氨酸);具有小侧链的氨基酸(甘氨酸,丙氨酸,丝氨酸,苏氨酸,蛋氨酸);或者具有脂肪族羟基侧链的氨基酸(丝氨酸,苏氨酸)。
微阵列
本发明的另一方面是一种组合物,所述组合物包含多种用于检测以具体细胞类型为特征的基因表达模式和检测具体细胞类型例如淋巴管内皮细胞的表达模式中的变化的多核苷酸探针。例如,本发明包含阵列,例如微阵列,所述阵列包含具有选自序列表中显示的多核苷酸序列的至少10个连续的核苷酸的多核苷酸。
本发明还涉及这样的微阵列,所述微阵列包含的多核苷酸具有选自SEQ ID NO:1-30,45,47,49和5的至少10个连续的核苷酸。本发明的微阵列包含至少3种多核苷酸,其中每种列举的多核苷酸具有选自SEQ IDNOSEQ ID NO:1-30,45,47,49和51的独特的序列。这种微阵列还具有完全相同的多核苷酸和其它多核苷酸,例如用于使用微阵列的基于杂交的分析中的对照多核苷酸。阵列,包括微阵列,具有三种以上不同的本发明的多核苷酸,例如至少5中,7种,9种,20种,50种或更多这种多核苷酸,所述阵列被认为是本发明的阵列,并具有使生物样品例如各种内皮细胞类型产生细微差的能力,或者在使用这种微阵列的过程中,提供不同的,通常更高水平的置信度,例如用于筛选特定的内皮细胞,用于筛选异常的或疾病细胞和组织,等诸如此类。
术语“微阵列”指可杂交的阵列元件的有序排列。所述阵列元件(arrayelements)的排列使得优选在固体支持物上有至少三种或更多种不同的阵列元件,更有选至少100种阵列元件,并最有选至少1000种阵列元件。优选,所述固体支持物是1cm2的基质表面,珠,纸,尼龙或其他类型的膜,滤纸,芯片,玻璃载玻片,或任何其它适宜的固相支持物。每个阵列元件的杂交信号是独立可识别的。在右选地实施方案中,所述阵列元件包括多核苷酸探针。
杂交的意思是将两种或多种核酸在适宜碱基配对的条件下接触。杂交包括部分或完全互补的核酸之间的相互作用。适宜的杂交条件对于本领域熟练技术人员是已知的。在具体的应用中,需要获得较低程度的严格条件。在这些条件下,即使反应链的序列不是完全互补的,在一个或几个位点是错配的,杂交仍可出现。通过根据本领域的知识调节条件可使反应条件的严格程度较低,例如增加盐浓度和/或降低温度。适宜的杂交条件是允许从可鉴定的表达单位例如基因的基因表达的检测的那些条件。优选的杂交条件是严格的杂交条件,例如在42℃在溶液(即,杂交溶液)中(所述溶液包含50%甲酰胺,1%SDS,1M NaCl,10%葡聚糖硫酸酯),并在洗涤液中65℃洗涤30分钟,所述洗涤溶液包含1XSSC和0.1%SDS。应理解在本领域中,相同程度的严格条件可通过改变温度和缓冲液,或盐浓度来实现,如Ausubel,等(Eds.),
Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1994),pp.6.0.3 to 6.4.10所述。杂交条件的修饰可由经验确定或根据探针的鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)碱基配对精确计算。杂交条件可如Sambrook,等,(Eds.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York(2d.Ed.;1989),9.47-9.51页所述计算。
使用本发明的探针和引物的一种方法是用于检测人细胞中的基因表达。通常,靶基因将表达RNAs,但也可筛选基因组DNA或cDNA文库。通过改变杂交条件的严格程度和靶结合位点(即探针的序列,相应于SEQ IDNO:1-30,45,47,49和51之一的一部分),杂交可产生不同程度的同源性。
所述微阵列可用于大量靶多核苷酸的大规模的遗传或基因表达分析。所述微阵列还可用于诊断疾病和监测治疗。此外,所述微阵列还可用于检测个体对疾病的易感性。此外,所述微阵列还可用来检测对感染,药物治疗的细胞反应性,等等诸如此类。
所述核算探针可以是基因组DNA or cDNA or mRNA多核苷酸或寡肽,或者任何RNA样或DNA样物质,例如肽,核酸,分支DNA,等等诸如此类。所述探针可以是有义或反义核苷酸探针。如果靶多核苷酸是双链的,所述探针可以是有义或反义链。如果靶多核苷酸是单链的,所述探针可以是互补的单链。在一种实施方案中,所述探针是cDNAs。目的DNA序列的大小可变,优选具有100-10000个核苷酸,更有选为150-3500个核苷酸。
探针可以用多种合成或酶技术制备,这是本领域已知的。所述探针可以通过使用本领域已知的化学方法(Caruthers等,Nucleic Acids Res.,Symp.Ser.,215-233,1980)合成其全部或部分。
药物配制剂和给药途径
本发明的蛋白(无论其来源,例如来自重组和非重组来源)可被给药需要治疗的病人,可以单独给药,或者与适宜的载体,稀释剂,辅剂或赋形剂以治疗或改善各种疾病的剂量混合,以药物组合物的方式给药。这种组合物可以包括(除了蛋白质和载体以外)稀释剂,滤液,盐,缓冲液,稳定剂,增溶剂,以及其它本领域已知的物质。术语“可药用的”指非毒性物质,它不干扰活性成分的生物活性的有效性。载体的性质有赖于给药途径。本发明的药物组合物还包含细胞因子,趋化因子,淋巴因子,生长因子,或其它生血因子,例如PDGF,VEGF(具体为VEGF-C或VEGF-D),VEGFR-3(包括含有细胞外区的可溶性VEGFR-3肽),M-CSF,GM-CSF,TNF,IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IFN,TNF0,TNF1,TNF2,G-CSF,Meg-CSF,血小板生成素,干细胞因子,和红细胞生成素。也涉及这些多肽的各种形式,例如分离的全蛋白质,亚基,片段(例如可溶性片段),和蛋白融合物。所述药物组合物还可含有其它试剂,该试剂可增强所述蛋白的活性,补充其活性或在治疗中的用途。这种添加因子和/或试剂可包含在所述药物组合物中,产生与本发明的蛋白协同的作用,或者用以使副作用最小化。相反,本发明的蛋白可以包含在具体的细胞因子,淋巴因子,其它生血因子,血小板生成或抗血小板因子,或者抗炎试剂的制剂中,从而使所述细胞因子,淋巴因子,其它生血因子,血小板生成或抗血小板因子,或者抗炎试剂的副作用最小化。本发明的蛋白可以在多聚体(例如异二聚体或同二聚体)或在与其自身或其它蛋白的复合物中有活性。结果,本发明的药物组合物以这种多聚物形式或复合物形式包含本发明的蛋白。
本申请的组合物的配制和给药见″Remington′s Pharmaceutical Sciences,″Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版。治疗有效剂量还指足以缓解症状的化合物的量,例如治疗,治愈预防或缓解相关医学病情的量,或者增加有益改变,治愈,防止或改善这种病情的速率的量。单独给药独立的活性成分时,所述治疗有效剂量指该单独的成分。当联合给药时,治疗有效剂量指产生治疗效果的活性成分的联合用量,可以是联合给药,序贯给药或者同时给药。
进行本发明的治疗方法或用途时,将治疗有效量的本发明的蛋白给药患有待治疗的病情或疾病的哺乳动物。可根据本发明的方法单独或联合其他治疗(例如使用细胞因子,淋巴因子或其它生血因子的治疗)给药本发明的蛋白。与一种或多种细胞因子,淋巴因子或其它生血因子联合给药时,本发明的蛋白可同时和所述细胞因子,淋巴因子,其它生血因子,溶栓因子或抗血小板因子同时给药,或者序贯给药。如果是序贯给药的,主治医师将决定联合给药本发明的蛋白和细胞因子,淋巴因子,其它生血因子,溶栓因子或抗血小板因子的适当顺序。
给药途径
适宜的给药途径可例如,包括经口,经直肠,经粘膜,或经肠道给药;肠道外递送,包括肌肉内,皮下,髓内注射,以及鞘内,直接心室内,静脉内,腹膜内,鼻腔内或眼内注射。给药用于所述药物组合物中或用于进行本发明的方法的本发明的蛋白,可通过多种常用方式进行,例如口服,吸入,局部应用或用于皮肤,皮下,腹膜内,胃肠外或静脉内注射。静脉内给药哺乳动物,例如人类病人,是优选的。可选,可将化合物以局部而非系统的方式给药,例如通过将所述化合物注射入目的作用位点。
组合物/配制剂
用于本发明的药物组合物因此可以使用一种或多种生理上可接受的载体(包扩赋形剂和辅剂)以常见的方式进行配制,所述载体可促进将该活性化合物加工成可药用的制剂。这些药物组合物可以由例如,通过普通的混合,溶解,颗粒化,制备糖衣丸,研磨,乳化,装入胶囊,截留(entrapping),或冻干法制备。适合的配制剂有赖于所选的给药途径。当治疗有效量的本发明的蛋白口服给药时,本发明的蛋白可为片剂,胶囊,粉末,溶液或酏剂的形式。如果以片剂的形式给药,本发明的药物组合物还可以含有固相载体例如凝胶或辅剂。所述片剂,胶囊,以及粉末含有约5-95%的本发明的蛋白,并有选含有约25-90%的本发明的蛋白。当以液体形式给药时,可添加液体载体例如水,汽油,动物或植物油例如花生油,矿物油,大豆油或芝麻油,或者合成油。液体形式的药物组合物还可包含生理盐水,葡聚糖,或其它糖类的溶液,或者二醇例如乙二醇,丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时,该药物组合物含有约0.5-90%重量的本发明的蛋白,并有选含有1-50%重量的本发明的蛋白。
当通过静脉内,皮肤或皮下注射给药治疗有效量的本发明的蛋白时,本发明的蛋白将是不含致热源,可胃肠外给药的水溶液形式。这种胃肠外可接受的具有适当的pH值,等张性,稳定性,等等性质的蛋白溶液的制备物,是本领域熟练技术人员已知的。优选的用于静脉内,皮肤或者皮下注射的药物组合物含有(除本发明的蛋白以外)等张的载体,例如氯化钠注射液,乳酸林格氏注射液,或者本领域已知的其它载体。本发明的药物组合物还包括稳定剂,防腐剂,缓冲液,抗氧化剂,或其它本领域熟练技术人员已知的添加剂。对于注射而言,本发明的试剂可配置成水溶液,优选是生理上相容的缓冲液,所用缓冲液例如汉克氏液(Hank’s solution),林格氏液,或者生理盐水。对于经粘膜给药,适合待透过的屏障得渗透剂被用于该制剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服给药,所述化合物可通过将活性化合物与本领域已知的可药用的载体结合而被轻易地配制。这样的载体使得本发明的化合物能够配制成片剂,丸剂,糖衣丸,胶囊,液体,凝胶,糖浆,浆,悬液等等,用于待治疗的病人口服。用于口服的药物制备物可通过与固相赋形剂结合而获得,可选地研磨产生的混合物,并且如需要,在加入适宜的辅剂后加工颗粒的混合物,以获得片剂或糖丸的核心。适宜的赋形剂是,具体为,填充物例如糖类,包括乳糖,蔗糖,甘露糖或山梨糖;纤维素制备物例如,玉米淀粉,小麦淀粉,大米淀粉,土豆淀粉,凝胶,黄芪胶,甲基纤维素,羟丙甲基纤维素,羧甲基纤维素钠,和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要,可加入分解剂,例如交联的聚乙烯吡咯烷酮,琼脂,或藻酸,或其盐例如藻酸钠。可给糖衣丸核心提供适宜的包衣。为此目的,可是用浓缩的蔗糖溶液,其可选地含有阿拉伯胶,滑石,聚乙烯吡咯烷酮,carbopol凝胶,聚乙二醇,和/或二氧化钛,漆液,以及适宜的有机溶剂或溶剂混合物。染料和色素可加入所述片剂或糖衣丸中,用来鉴别或表征活性化合物制剂的不同组合。
可口服的药物制备物包括凝胶制成的推入式(push-fit)胶囊,以及柔软的密封的凝胶和可塑剂制成的胶囊,所述可塑剂例如甘油或山梨醇。推入式胶囊可以包含活性成分,其与填充物例如乳糖,结合物例如淀粉,和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁,以及可选的稳定剂混合。在软性胶囊中,所述活性化合物可以溶解或悬浮在适宜的液体中,例如脂肪类油,液体石蜡,或者液体聚乙二醇。此外,还可加入稳定剂。所有口服给药的配制剂应是适宜这种给药的剂型。对于经颊给药,所述组合物可以采用以通常方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入给药,根据本发明所用的化合物可以来自压缩的包装或雾化器的气溶胶喷雾的形式,使用适宜的推进物方便地递送,所述推进物例如二氯二氟甲烷,三氯氟甲烷,二氯四氟乙烷,二氧化碳或者其他适宜的气体。如果是压缩的气溶胶,所述剂型单位可以通过提供活瓣递送来定量。例如用于吸入器或吹入器的凝胶的胶囊和药筒,可配制成含有化合物的粉末混合物和适宜的粉末基质例如乳糖或淀粉。所述化合物可配置成用于通过注射胃肠外给药,例如通过弹丸注射或者连续输注。用于注射的配制剂可以单位剂量形式存在于,例如安瓿,或多剂型容器中,还可含有加入的防腐剂。所述组合物可以是悬液,溶液或油性或水性载体中的乳液的形式,并且包含配制用试剂(formulatory agents)例如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药物配制剂包括水中可溶形式的活性化合物的水溶液。此外,活性化合物的悬液可制备成适宜的油性注射悬液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪族油类,例如芝麻油,或合成的脂肪酸酯类,例如乙基油酸酯或甘油三酸酯,或者脂质体。含水的注射悬浮液含有适宜的稳定剂或试剂,其可增加所述化合物的溶解性,使得可制备高浓度的溶液。可选地,所述活性成分可以是粉末形式,在使用之前,可用适宜的载体例如无菌的不含致热源的水溶解。
所述化合物也可配制成直肠用组合物的形式,例如栓剂或灌肠剂,例如含有通常的栓剂基质,例如可可油或其它甘油酯。除了前述的配制剂外,所述化合物还可配制成贮存制备物。这种长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射给药。因此,例如所述化合物可与适宜的聚合物或疏水物质(例如可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂配在一起,或者配制成基本不可溶的衍生物,例如配制成基本不可溶的盐类。
本发明的疏水化合物的药物载体是助溶系统,包含苯乙醇,非极性表面活性剂,可与水混合的有机共聚物,以及水相。所述助溶系统可以是VPD助溶系统。VPD是一种溶液,包含3%w/v的苯乙醇,8%w/v的非极性表面活性剂聚山梨醇酯80,和65%w/v的聚乙二醇300,溶于无水乙醇中。VPD助溶系统(VPD:5W)由用5%的葡聚糖水溶液按1∶1稀释的VPD组成。所述助溶系统有效地溶解疏水性化合物,并且其自身在系统给药时产生的毒性较低。通常,助溶系统的比例可在较大范围内变化,而不会破坏其溶解力和毒性。此外,助溶系统的成分也可不同;例如,其它低毒性的非极性表面活性剂可用来代替聚山梨醇酯80;聚乙二醇的比例可以变化;其它生物可相容的聚合物可替代聚乙二醇,例如聚乙烯吡咯烷酮,以及其它糖或聚糖也可替代葡聚糖。可选地,其它用于疏水性药物化合物的递送系统也可被使用。脂质体和乳剂是已知的疏水药物的递送载体的实例。也可用一些有机溶剂例如二甲基亚砜,但通常其毒性较大。此外,所述化合物可是用持续释放系统递送,例如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质。各种缓释物质已经确立并且是本领域熟练技术人员已知的。缓释胶囊可根据其化学性质在几个星期到超过100天的时间段内释放所述化合物。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性,还可使用其它蛋白稳定化的方案。
所述药物组合物还包含适宜的固相或凝胶相载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙,磷酸钙,各种糖,淀粉,纤维素衍生物,凝胶和聚合物例如聚乙二醇。本发明的许多蛋白酶抑制性化合物可作为具有可药用的抗衡离子的盐。这种可药用的碱加成盐是保持游离酸的生物效力和性质的那些盐,通过与无机或有机碱反应获得,所述无机或有机碱例如氢氧化钠,氢氧化镁,氨水,三烷基胺,二烷基胺,单烷基胺,二价氨基酸,乙酸钠,苯甲酸钾,三乙醇胺,等等诸如此类。
本发明的药物组合物可以是本发明的蛋白与蛋白或肽抗原的复合物的形式。本发明的药物组合物可以是脂质体的形式,其中本发明的蛋白是结合的,其除了可以和其它可药用的载体结合以外,还可以和两性试剂例如以聚合的微束形式,不可溶的单分子层,液体结晶,或薄层的形式存在于水溶液中的脂类。用于脂质体配制剂的适宜的脂类包括,但不限于,单甘油酯,二甘油酯,硫化物,溶血卵磷脂,磷脂,皂角苷,胆酸等。本领域熟练技术人员可以制备这样的脂质体配制剂,如美国专利4,235,871;4,501,728;4,837,028;和4,737,323中所述,每篇文献都包含在文中作为参考。
本发明的蛋白在药物组合物中的量有赖于正在治疗的疾病的病情的性质和严重性,以及病人接受过的治疗的性质。最后,主治医师决定用于治疗每个个体病人的本发明的蛋白的量。开始,主治医师将给药低剂量的本发明的蛋白,并观察病人的反应。较大剂量的本发明的蛋白会在从病人获得乐观的治疗效果时给予,并且在该时间点,所述剂量不再增加。多种用于本发明的治疗方法的药物组合物包含约0.01μg到约100mg(优选约0.1μg到约10mg,更优选about 0.1μg to about 1mg)本发明的蛋白每公斤体重。给药时,本发明所用的药物组合物是不合致热源,生理上可接受的形式。除本发明的蛋白以外的治疗上有用的试剂,可以可选地或额外地,同时或序贯地与本发明的方法中的组合物一起给药。
本发明的多核苷酸也可用于基因治疗。这种多核苷酸可在体内或活体外被引入细胞内用于在受试哺乳动物中表达。本发明的多核苷酸还可通过已知的将核酸引入细胞或有机体的方法(包括,但不限于以病毒载体裸露的DNA的形式)给药。细胞可以在存在本发明的蛋白的条件下离体培养,以进行增殖或者在这种细胞中产生所需的效果或活性。治疗的细胞可被引入体内用于治疗。
有效剂量
适合用于本发明的药物组合物包括一种组合物,它包含实现预期目的的有效量的活性成分。更具体地,治疗有效量指有效预防被治疗的受试者的病情进展或缓解其症状的量。可确定有效剂量的适宜性质包括测定LEC和/或BEC的生长刺激或抑制,细胞分化成LEC和/或BEC的速率或程度,细胞表达模式改变成或偏离LEC或BEC的特定表达模式的倾向性,等等诸如此类。测定有效量在本领域熟练技术人员的能力范围内,尤其是在本发明公开内容的启发下。对于任何用于本发明的方法中的化合物而言,所述治疗有效剂量首先可以通过细胞培养试验来估计。例如,对于抑制性方法,可将药剂给予动物模型,得到包含细胞培养测定的IC50(即检验化合物的浓度是最大抑制浓度的一半)的循环浓度范围。这样的信息可用来更准确地测定人类所用的剂量。
治疗有效剂量指化合物的量导致症状缓解,或者使患有致命性疾病的病人的生存期延长。这种化合物的毒性和治疗有效性可通过标准的药学方法在细胞培养或试验动物中测定,例如用于测定LD50(使50%的数量致死的剂量)或ED50(对50%的数量治疗有效的剂量)的方法。毒性和治疗性效果的剂量比是治疗的指数,并且可表示为LD50和ED50之间的比例。显示高治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于配制较大范围的用于人类的剂量。这种化合物的剂量优选在包括ED50的循环浓度的范围内,所述范围几乎没有或没有毒性。所述剂量可在该范围内变化,根据所用剂量和给药途径而不同。准确的配制,给药途径和剂量可根据病人的病情由医师决定。见例如,Fingl等,1975,in″ThePharmacological Basis of Therapeutics″,Ch.1 p.1。
给药的组合物的剂量有赖于被治疗的受试者,该受试者的体重,病情的严重程度,给药的方式和医师的判断。
包装
如果需要,组合物可以存在于包装或含有一个或多个含活性成分的单位剂量形式的配药器中。所述包装可,例如,包含金属或塑料箔的例如泡状包装。所述包装或配药器可附有给药说明。也可制备配制在相容的药物载体中包含本发明的化合物的组合物,所述组合物置于适宜的容器中,并包含治疗所述指征说明。
此外,本发明包含利用这种组合物制备用于治疗细胞或例如人的有机体的药物,所述细胞或有机体患有LEC和/或BEC过度增生或增殖低下的疾病,例如淋巴水肿,淋巴管瘤,淋巴管骨髓瘤,淋巴管肌瘤病,淋巴管扩张,淋巴肉瘤,或淋巴管硬化,所述治疗包括将有效量或剂量的本发明的组合物给药所述细胞或有机体。适宜的组合物包括,但不限于,任何根据本发明的多核苷酸(例如反义多核苷酸),和本发明的任何多肽,特异性识别本发明的多核苷酸或多肽的抗体,对于调节本发明的多核苷酸的表达有效的小分子,等等诸如此类。还涉及本发明的组合物用于制备药物来改善与LEC或BEC相关的疾病或病症有关的症状。
抗体
抗体可用于调节本发明的多肽,这是由于可容易地产生具有相关特异性的抗体的能力,以及将抗体用于人类治疗的技术的不断改进。因此本发明涉及使用对本发明的目的多肽特异的抗体(例如单克隆和多克隆抗体,单链抗体,嵌合抗体,双功能、双特异性抗体,人源化抗体,人抗体,以及互补决定区(CDR)移植的抗体,包括含有特异性识别本发明的多肽地CDR序列)。优选的抗体是人抗体,例如在转基因动物中产生的抗体,其可根据WO93/11236,published June 20,1993,其全文包含在文中作为参考所述的方法制备和鉴定。本发明还提供了抗体片段,包括Fab,Fab,F(ab)2,和Fv。术语″对...的特异性″用于描述本发明的抗体时,指本发明的抗体的可变区识别并结合目的多肽的水平与其结合其他物质相比,可见测出有所不同,其水平较高(即,尽管可能存在局部的序列同一性,同源性或相似性,通过测定结合亲合力的差异,能够区别目的多肽和其它已知的同家族多肽)。也应理解特异性抗体也和其它蛋白反应(例如,金黄色葡萄球菌蛋白A或ELISA技术中的其它抗体),所述反应是通过抗体的可变区以外的序列,具体为该分子的恒定区。测定本发明的抗体的结合特异性的筛选法是本领域已知并常用的。这些方法的详述见Harlow等(Eds.),Antibodies A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory;Cold Spring Harbor,NY(1988),第6章。
非人抗体可以通过本领域已知的任何方法人源化。优选的“人源化”抗体具有人恒定区,而所述抗体的可变区,或至少一个互补决定区(CDR)来自非人物种。人源化非人抗体的方法是本领域已知的(见美国专利5,585,089,和5,693,762)。通常人源化抗体具有一个或多个引入其框架区的来自非人来源的氨基酸。可例如使用Jones等[Nature 321:522-525,(1986)],Riechmann等,[Nature,332:323-327,(1988)]和Verhoeyen等[Science239:1534-1536,(1988)]所述的方法进行,即通过用人抗体相应区取代至少一部分啮齿类CDR。多种用于制备改造的抗体的方法例如,在Owens和Young,J.Immunol.Meth.,168:149-165(1994)中描述。可将进一步的改变引入所述抗体的框架区来调节其亲合力或免疫源性。
本发明还提供了产生本发明的抗体的杂交瘤。本发明的抗体可用于检测和/或纯化本发明的多肽。
本发明的多肽和/或多核苷酸也可用于免疫动物以获得与所述多肽特异性反应的多克隆或单克隆抗体。这种抗体可使用整个多肽或其片段作为免疫源而获得。所述肽免疫源还包含位于羧基末端的半胱氨酸残基,并且可以和例如匙孔血蓝蛋白(KLH)的半抗原偶联。合成这种多肽的方法是本领域已知的,例如见R.P.Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2154(1963);J.L.Krstenansky,等,FEBS Lett.211:10(1987)。与本发明的蛋白结合的单克隆抗体可用于多肽的免疫检测的诊断性试剂。与所述多肽结合的中和性单克隆抗体可以是用于与所述多肽相关的疾病的治疗剂,以及用于治疗涉及该多肽的异常表达的一些形式的癌症。如果是癌细胞或白血病细胞,该多肽的中和性单克隆抗体可用于检测和防止所述多肽介导的癌细胞的转移性播散。通常,用于制备多克隆和单克隆抗体的技术以及能够产生所需抗体的杂交瘤是本领域已知的(Campbell,A.M.,Monoclonal Antibodies Technology:Laboratory Techniques in Biochemistry和Molecular Biology,Elsevier SciencePublishers,Amsterdam,The Netherl和s(1984);St.Groth等,J.Immunol.35:1-21(1990);Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975)),the trioma技术,人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,Immunology Today 4:72(1983);Cole等,in Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96页)。
任何已知产生抗体的动物(小鼠,兔子等)可用本发明的肽或多肽来免疫。免疫的方法是本领域已知的。这种方法包括所述多肽的皮下或腹膜内注射。本领域熟练技术人员认识到用于免疫的本发明ORF编码的多肽的量根据被免疫的动物,肽的抗原性,以及注射的部位不同而变化。所述蛋白用作免疫原,可被修饰或在辅剂中给药以提高所述蛋白的抗原性。提高蛋白抗原性的方法是本领域已知的,并且包括,但不限于,将所述抗原和异源性蛋白(例如球蛋白或β-半乳糖苷酶)偶联,或者通过在免疫过程中掺入辅剂。
对于单克隆抗体,来自免疫后动物的脾细胞被取出,与骨髓瘤细胞例如SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合,使其成为产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。本领域已知的方法中的任何一种可用于鉴定可产生具有所需特征的抗体的杂交瘤细胞。这些包括使用ELISA试验,Western印迹,或放射性免疫试验来检测杂交瘤(Lutz等,Exp.Cell Research.175:109-124.1988)。分泌所需抗体的杂交瘤被克隆,并使用本领域已知的方法确定其类型和亚型(Campbell,A.M.,Monoclonal Antibody Technology:Laboratory Techniques inBiochemistry和Molecular Biology,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherl和s(1984))。用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可被用来制备本发明的多肽的单链抗体。
对于多克隆抗体,含有抗体的抗血清从被免疫的动物中分离出来,并使用上述方法之一筛选具有所需特异性的抗体的存在。本发明还提供了上述抗体的可检测的标记形式。抗体的可检测标记可通过使用放射性同位素,亲合标记(例如生物素,抗生物素蛋白,等等诸如此类),酶标记(例如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,等等诸如此类),荧光标记物(例如FITC或罗丹明,等等诸如此类),顺磁性原子,等等诸如此类。获得这种标记的方法是本领域已知的,例如,见Sternberger,L.A.等,J.Histochem.Cytochem.18:315.1970;Bayer,E.A.等,Meth.Enzym.62:308(1979);Engval,E.等,Immunol.109:129.1972;和Goding,J.W.J.Immunol.Meth.13:215.(1976)。
本发明的标记的抗体可用在活体外,活体内,以及原位试验中来鉴定表达目的多肽的片段的细胞或组织。所述抗体也可直接用于治疗或其它诊断。本发明还提供了固定在固相支持物上的上述抗体。这种固相支持物的实例包括塑料例如聚碳酸酯,复合碳水化合物例如琼脂糖和琼脂糖凝胶,以及丙烯酸树脂例如聚丙烯酸和乳胶珠。将抗体偶联到这种固相支持物上的技术是本领域已知的(Weir,D.M.等,″H和book of ExperimentalImmunology″″4th Ed.,Blackwell Scientific Publications,Oxford,Engl和,Chapter 10(1986);Jacoby,W.D.等,Meth.Enzym.34 Academic Press,N.Y.(1974))。本发明的固定的抗体可用在体外,体内以及原位试验中,还用于本发明的蛋白的免疫亲合力纯化。
可机读的序列
在该实施方案的一种应用中,本发明的核苷酸序列可记载在可机读的介质上。本文的“可机读介质”指任何可被计算机阅读并直接获取的介质。这种介质包括,但不限于,磁性储存介质,例如软盘,硬盘储存介质,和磁盘;光学储存介质,例如CD-ROM;电学储存介质,例如RAM和ROM;以及这些种类的杂合介质例如磁性/光学储存介质。熟练技术人员可轻易采用任何已知的将信息记载在计算机可读的介质上的方法来获得包含本发明的核苷酸序列的产品。
多种本领域熟练技术人员可得的数据存储结构可用来产生其上记载了本发明的核苷酸序列的可机读的介质。数据存储结构的选择通常基于所选的获取存储的信息的方法。此外,多种数据处理程序和格式可用来将本发明的核苷酸序列的信息存储在可机读的介质上。序列信息可存在于文字处理文本文件中,在可购得的例如WordPerfect和Microsoft Word中格式化,或作为ASCII文件的形式,存储在数据库应用程序(database application)中,例如DB2,Sybase,Oracle,等诸如此类。本领域熟练技术人员可轻易采用任何数量的数据处理器构建的格式(例如文本文件或数据库),来获得的其上记载了本发明的核苷酸序列的计算机可读的介质。通过提供SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51的核苷酸序列或其代表性片段,或者可机读形式的与SEQID NO:1-30,45,47,49和51具有99.9%的序列同一性的核苷酸片段,本领域熟练技术人员可常规地获取用于多种目的的序列信息。计算机软件可公开获得,使得熟练技术人员可获取计算机可读介质上的序列信息。下面的实施例显示了如何在Sybase系统上使用执行BLAST(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410.1990)和BLAZE(Brutlag等,Comp.Chem.17:203-207(1993))搜索算法(search algorithms)的软件来鉴定核酸序列内的开放阅读框架(ORFs)。这种ORFs可以是编码蛋白的片段,并且可用于制备商业上重要的蛋白,例如用于发酵反应中的酶以及制备商业上有用的代谢物。
本文的“基于计算机的系统”指用于分析本发明的核苷酸序列信息的硬件工具,软件工具,以及数据存储工具。本发明的基于计算机的系统的最少硬件工具包括一个中央处理单元(CPU),输入工具,输出工具和数据存储工具。本领域熟练技术人员可轻易理解目前可得的基于计算机的系统中的任何一种都适宜用于本发明中。如上述,本发明的基于计算机的系统包含其中存储了本发明的核苷酸序列的一种数据存储工具,以及必要的硬件和软件工具用于支持和执行搜索工具(means)。
本文的“搜索工具”指一种或多种能够在基于计算机的系统上执行来比较靶序列或靶结构基序和存储在数据存储工具中的序列信息。搜索工具用来鉴定已知序列的片段或区,所述序列与具体的靶序列或靶基序匹配。各种已知的算法已被公开,并且多种可购得的用于进行搜索方法的软件被用于并且可被用于本发明的基于计算机的系统。这样的软件的实例包括,但不限于,MacPattern(EMBL),BLASTN和BLASTA(NPOLYPEPTIDEIA)。熟练技术人员可容易地理解任何一种可得的用于进行同源性搜索的算法或执行软件包可用于本发明的基于计算机的系统。本文的“靶序列”可以是6个或更多个核苷酸的核酸或2个或更多个氨基酸的氨基酸序列。熟练技术人员可容易地理解靶序列越长,靶序列在数据库中作为随机出现的序列的可能性就越小。靶序列最优选的序列长度是从约10-100个氨基酸或者从约30-300个核苷酸残基。然而,可以理解搜索商业上重要的片段,例如涉及基因表达和蛋白加工的序列片段可以较短。
本文的“靶结构基序”,或“靶基序”指任何合理选出的序列或序列的组合,其中的序列是基于靶基序的折叠形成的三位结构。本领域已知多种靶基序。蛋白靶基序包括,但不限于,酶活性位点和信号序列。核酸靶基序包括,但不限于,启动子序列,发夹结构,和可诱导的表达元件(蛋白结合序列)。
诊断性试验和试剂盒
本发明还提供了诊断性试验,以及相关的试剂盒,用于过度增殖和/或增殖低下的例如LEC或BEC的内皮细胞的病症或疾病。这些试验包括通过使用本发明的核酸探针或抗体鉴定试验样品中本发明的ORFs之一或其同源物的存在或表达。
通常,检测本发明的多核苷酸的方法包括将样品与结合多核苷酸并形成复合物的化合物接触足够长的时间以形成复合物,并检测所述复合物,使得如果检测到所述复合物,就表示在样品中检测到了本发明的多核苷酸。
这种方法也可包括将样品在严格的杂交条件下和核酸引物接触,,所述核酸引物在这样的条件下退火结合本法发明的多核苷酸,然后扩增退火的多核苷酸,使得如果多核苷酸被扩增,本发明的多核苷酸在样品中被检测出。
通常,检测本发明的多肽的方法包括样品与结合多肽并形成复合物的化合物接触足够长的时间以形成复合物,并检测所述复合物,使得如果检测到所述复合物,就表示在样品中检测到了本发明的多肽。具体而言,这种方法包括将检验样品和本发明的一种或多种抗体或者一种或多种核酸探针一起温育,并测定核酸探针或抗体与检验样品内的成分的结合。
将核酸探针或抗体与检验样品共同温育的条件各异。温育条件有赖于试验使用的模式,采用的检验方法,以及试验所用的核酸探针或抗体的类型和性质。本领域熟练技术人员可认识到任何一种常用的可得的杂交,扩增或免疫试验形式可轻易采用本发明的核酸探针或抗体。这种试验的实例见Chard,T.,An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherl和s(1986);Bullock,G.R.等,Techniques in Immunocytochemistry,Academic Press,Orlando,Fla.Vol.1(1982),Vol.2(1983),Vol.3(1985);Tijssen,P.,Practice and Theory ofimmunoassays:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1985)。本发明的检验样品包括细胞,细胞的蛋白或膜提取物,或者生物液体例如痰液,血液,血清,血浆或尿液。用于本发明的方法的检验样品可根据试验模式,检验方法的性质,以及被检测的组织,细胞或提取物而不同。制备细胞的蛋白提取物或膜提取物的方法是本领域已知的,并可被用来获得与使用的系统相容的样品。
在本发明的另一个实施方案中,提供了含有必要的反应剂以进行本发明的试验的试剂盒。在一个实施方案中,本发明提供了隔室试剂盒,来容纳紧邻的一个或多个容器,所述容器包括:(a)第一容器,它包含本发明的一种探针或抗体;和(b)一种或多种其它容器,包含一种或多种洗涤剂,能够检测结合的探针或抗体的存在的试剂。
具体而言,隔室试剂盒包括任何其中的反应剂包含在分离的容器中的试剂盒。这种容器包括小的玻璃容器,塑料容器或者塑料或纸的条状容器。这种容器使得技术人员有效地将反应剂从一个隔室转移到另一个隔室,使得样品和试剂不被交叉污染,并且每个容器中的试剂或溶液可以以定量的方式从一个隔室加入另一个隔室中。这样的容器包括能够容纳检验样品的容器,包含试验所用的一种或多种抗体的容器,包含洗涤试剂(例如磷酸盐缓冲的盐溶液,Tris缓冲液,等诸如此类)的容器,以及含有用于检测结合的抗体或探针的试剂的容器。检测试剂的类型包括标记的核酸探针,标记的二级抗体,或者可选地,如果初级抗体被标记,还包括能够和标记的抗体反应的酶或抗体结合剂。本领域熟练技术人员已知,本发明公开的探针和抗体可并入本领域已知的试剂盒形式中。
实施例
用于实施例中的方法如下:
抗体
使用抗VEGFR-3单克隆抗体(克隆2E11D11;见国际申请PCT/US02/22164,由WO 03/006104公开),PAL-E(MoNOsan),CD31(Dako),N-钙粘着蛋白,VE-钙粘着蛋白,β-连环蛋白和片珠蛋白和多克隆兔抗人podoplanin(Breiteneder-Geleff,S.,等,Am.J.Pathol.154:385-394(1999))。小鼠抗人整联蛋白9由Dr.Dean Sheppard(University of California at San Francisco,San Francisco)和Dr.Curzio Rüegg(University of Lausanne Medical School,Lausanne,Switzerland)提供。荧光染料偶联的二级抗体来自JacksonImmunoresearch。
细胞培养和转染
人羊膜上皮细胞在存在5%胎牛血清的Med199培养基中培养。人真皮微血管内皮细胞来自PromoCell(Heidelberg,Germany)。抗Podoplanin抗体,MACS胶质超顺磁MicroBeads和山羊抗兔IgG抗体偶联(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach,Germany),根据出厂说明,使用LD及MS分离柱和Midi/MiniMACS分离器(Miltenyi Biotech)进行细胞分类。分离的细胞在纤连蛋白包被的(10μg/ml,Sigma,St.Louis,MO)板上培养(M_kinen,T.,等,EMBOJ.20:4762-4773.2001)。
RNA分离,Northern印迹和微阵列分析
总RNA被分离并在Rneasy中使用DNAseI处理(Qiagen,Valencia,CA)。32P-标记的和Atlas滤纸杂交的探针(Clontech)使用2-5μg总RNA根据出厂说明制备,但探针使用Nick-25柱(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)纯化。杂交并洗涤后,该膜用Fuji BAS 100 phosphoimager分析。对于Affymetrix_分析,四种独立的BEC和LEC样品的制备和杂交使用从不同个体中分离的四组细胞提取的RNA进行。对于Affymetrix_表达分析,使用5μg总RNA使用Custom SuperScript ds-cDNA合成试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)来合成双链cDNA。随后使用Enzo BioArrayTMHighYieldTMRNA转录标记试剂盒(Affymetrix,Santa Clara,CA)制备生物素标记的cRNA,并用RNeasy柱(Qiagen,Valencia,CA)去除未结合的核苷酸。人基因组95Av2微阵(用于Prox-1试验)和9513-E微阵列(主要是非特异性(uncharacterized)的EST序列)的杂交,洗涤以及染色,是根据出厂说明进行的(Affymetrix,GeneChipExpression Analysis Technical Manual)。所述探针阵列在570nm使用AgilentGeneArray_ Scanner进行检测,并且用Affymetrix_ Microarray Suite version5.0和Data Mining Tool version 3.0分析定量扫描的读数。使用100的总放大强度(global scaling intensity)计算杂交强度。
差异表达的序列用于搜索the National Center for BiotechnologyInformation和the National Library of Medicine的GenBank数据库中的EST重叠群。使用NCBI/NLM提供的orf发现软件预测(NCBI/NLM)和开放阅读框架。SOSUI系统用于预测来自蛋白序列的跨膜螺旋和信号序列,并且使用P fam(比对和HMMs的蛋白家族数据库)预测其它蛋白结构域的构建。
免疫荧光和免疫组织化学
细胞在盖玻片上培养,使用4%的多聚甲醛固定,并用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的Triton-X100透化,并用初级抗体进行染色。对于整联蛋白9,染色的活细胞和抗体一起在冰上保持15分钟然后进行固定。细胞可进一步使用FITC或TRITC偶联的二级抗体进行染色。F-肌动蛋白使用得克萨斯红(TexasRed)偶联的鬼笔环肽(Molecular Probes,Eugene,OR)染色。使用Hoechst 33258荧光染料(Sigma)进行复染,并使用Zeiss Axioplan 2荧光显微镜观察。
手术取出的正常人皮肤包埋于Tissue-Tek_(Sakura,The Netherl和s)中,然后进行冷冻和切片。切片(6μm)在冷丙酮中固定10分钟,然后使用初级抗体进行染色,接着使用Vectastain Elite ABC试剂盒(载体Laboratories,Burlingame,CA)和3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma,St.Louis,MO)进行染色。
实施例1
鉴定差异表达的基因
血管和淋巴管内皮细胞(分别为BEC和LEC)从人皮肤微血管内皮细胞培养物中,使用微磁珠和抗淋巴管内皮细胞表面标记podoplanin(Breiteneder-Geleff,S.,等,Am.J.Pathol.154:385-394(1999);M_kinen,T.,等,EMBO J.20:4762-4773(2001))进行分离。分离的BEC和LEC群使用抗VEGFR-3抗体或podoplanin通过免疫荧光评估为大于99%。分离的细胞培养两代后,从培养物中分离RNA并将其和寡核苷酸微阵列杂交,所述微阵列含有约12000已知的基因,即预期人转录物总数的约1/3。
如预期的那样,podoplanin,粒桥蛋白I/II和巨细胞甘露糖受体(已知的淋巴管内皮细胞标记),被发现在LEC中特异。见,Breiteneder-Geleff,S.,等,Am.J.Pathol.154:385-394(1999);Ebata,N.,等,Microvasc.Res.61:40-48.(2001);和Irjala,H.,等,J.Exp.Med.194:1033-1041(2001)。由于这些结果与已知的体内和体外基因表达模式一致,对基因表达模式进行了进一步的表征。当在复制分析中选择的复制的信号与log2的比值为1.0(两倍差异)时,超过400个基因被发现在LEC和BEC中的表达有差异。表达有差异的基因的一些实例在表1中按其功能分别显示,并在表2-4中提供了差异表达的基因的完整列表。表3和4提供了差异表达的基因的完整列表,所述列表包括GenBank的保藏号和独立收获的BEC和LEC的表达水平之间的差异(信号的log2比值±s.d.)。通过对31个选出的基因的Northern印迹和免疫荧光证实了微阵列的数据(见图1)。
表3和4中列出的每种基因都通过基因保藏号鉴定,该保藏号与公开的基因组数据库例如NCBI保管的GenBank数据库中发现的基因的序列相关。这些序列包含在文中作为参考。
表1
选出的在BEC和LEC中差异表达的基因类型
血管内皮细胞 | 淋巴管内皮细胞 | |
粘附分子 | 整联蛋白α5整联蛋白β5,β4*ICAM-1*,ICAM-2N-钙粘着蛋白*selectin P,selectin E*原钙粘着蛋白(protocaherin)42*CD44*EphrinB1* | 整联蛋白α9*整联蛋白α1巨噬细胞甘露糖受体I* |
血管内皮细胞 | 淋巴管内皮细胞 | |
细胞骨架蛋白ECM蛋白ECM调节受体酪氨酸激酶和其它蛋白激酶转录因子生长因子细胞因子,趋化因子和受体 | 粘着斑蛋白claudin 7*肌动蛋白,α2抑制蛋白2胶原蛋白8A1*,6A1*,4A2/13A1*,1A2*层粘连蛋白*多能聚糖*蛋白多糖1MMP-1,MMP-10,MMP-14*uPA*,tPA*组织蛋白酶CVEGFR-1(sVEGFR-1*)STAT6*TFEC*MAD-3*HMGI-C*JUN*GATA2VEGF-C*胎盘生长因子IL-8*,IL-6*干细胞因子*单核细胞趋化蛋白1UFO/axl* | 粒桥蛋白I和II*内收蛋白γα-辅肌动蛋白-2相关LIM蛋白*基质Gla蛋白*TIMP-3VEGFR-3*LynDyrk3prox-1*MEF2C*c-maf*叉头盒M1CREM耳(ear)-3造血因子-2IL-7*SDF-1b* |
血管内皮细胞 | 淋巴管内皮细胞 | |
细胞周期氧化应激其它 | CXCR4CCRL2/CKRX*IL-4受体p27*p21gadd45硫氧还原蛋白还原酶β*Neuropilin-1HNMP-1*内皮细胞蛋白C/APC受体Rnase A,胰腺的*TGF-βLTBP-2金属硫蛋白I,II,III环加氧酶2*clusterin/载脂蛋白J神经元(neuronal)pentraxin I* | Cdk-抑制物p57KIP2*细胞周期蛋白依赖的激酶抑制物3,CIP2细胞周期蛋白E2*细胞周期蛋白B1,B2*含硒蛋白(selenoprotein)P*podoplanin*MRC OX2载脂蛋白DSemaphorin 3A*脂肪酸结合蛋白4LITAF/Pig7*IGFBP-2*piccolo*单胺氧化酶A神经元(neuronal)pentraxin II* |
总数 | 222个基因 | 187个基因 |
粗体显示的基因通过Northern印迹或免疫荧光确定,且用星号(*)标记的基因是仅在两种细胞系之一中特异性表达的基因。
表2
已知的LEC特异性基因
基因 | 保藏号 | ||
检测* | 起始EST | 可能的基因 | |
CD36=COL1/TSP受体,脂肪酸转运蛋白β1-syntrophincollectin亚家族成员12分解蛋白(disintegrin)和金属蛋白酶结构域12细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4niban蛋白 NM_022083 niban蛋白含多个PDZ区的蛋白,LNXMAGE-E1蛋白上游刺激因子1,USF1(基因组匹配)与YRPW基序1相关的分裂的毛状/增强子(hairy/enhancer-of-split relatedwith YRPW motif 1)α-2,8-聚唾液酸转移酶semaphorin 6A1鸟苷酸核苷酸结合蛋白(G prot),γ2膜整合蛋白3与小鼠糖皮质激素诱导的基因1类似 | Af(S/4,3)Af(S/4,5)Af(S/4,5)Af(S/4,3)Af(S/4,0)Af(S/3,7)Af(S/3,5)Af(S/3,2)Af(S/2,6)Af(NS/2,6)Af(S/2,5)Af(S/2,4)Af(S/2,3)Af(S/2,3)Af(S/2,0) | R20784H54254氨基酸447177R74387氨基酸147933AI733018氨基酸554814AI738919AI435112氨基酸701033R61374AI422986W21965氨基酸738022氨基酸128019AI678080 | M98399L31529NM_030781NM_003474NM_005214NM_052966NM_032622NM_030801AB017568NM_012258L41680NM_020796NM_030926XM_070471 |
基因 | 保藏号 | ||
检测* | 起始EST | 可能的基因 | |
YAP65(Yes-相关蛋白,65kDaMW)17kDa胎脑蛋白Kruppel-样因子5降钙素受体样,CGRP类型1受体成纤维细胞生长因子13,同种型1A四区(tetraspan)NET-6蛋白环指(ring finger)蛋白11 | Af(NS/2,0)Af(NS/1,9)Af(S/1,8)Af(S/1,7)Af(NS/1,7)Af(NS/1,6)Af(S/1,6) | AL048399H92988AI815057AI741128,T94540AW014749W22687AL079648 | X80507NM_022343NM_001730NM_005795,L76380NM_004114NM_014399BC020964 |
*Af=Affymetrix,S=对LEC特异,NS=非特异(也在BEC中表达),数字代表BEC和LEC之间的信号强度的log2比值值值
实施例2
参与炎症的基因的BEC-特异性表达基因
内皮细胞在炎性反应的多个步骤中起重要作用。它们募集白细胞到炎性灶,并且有专门的内皮细胞(高内皮小静脉)负责使淋巴细胞回到次级淋巴器官中。此外,内皮细胞调节白细胞的活化,反之亦然,所述内皮细胞通过白细胞分泌的分子被活化。与细胞培养中内皮细胞的活化相一致,BEC表达高水平的前感染淋巴因子和趋化因子(干细胞因子,白介素-8,单核细胞趋化蛋白1(MCP-1))和受体(UFO/axl,CXCR4,IL-4R)见表1。CXCR4及其配体,基质细胞来源的因子(SDF-1),在捕获正常淋巴细胞,单核细胞,以及造血干细胞和造血祖细胞中起重要作用;CXCR4或SDF-1的靶向活化导致心脏发生,造血作用和血管发育受损(Tachibana,等,Nature 393:591-594.1998)。SDF-1b主要是由LEC产生的,表明这一趋化因子可能参与表达CXCR-4的细胞的LEC启动的趋化作用。此外,CXCR4和SDF-1在BEC和LEC上的表达的交互模式表明这两种细胞类型使用这些分子进行旁分泌联络。
实施例3
细胞粘附,细胞-细胞相互作用和细胞骨架分子
检测到BEC和LEC之间的更明显的差异是参与细胞骨架和细胞-细胞或细胞-基质相互作用的基因的表达(见表3和4)。例如,N-钙粘着蛋白,它参与内皮细胞和SMCs以及周细胞之间的相互作用(Gerhardt,等,Dev.Dyn.218:472-479.2000),在BEC中被特异性检测到。这与淋巴毛细管不是被SMCs包围这一事实一致。在免疫染色中,N-钙粘着蛋白只在BEC中检测得到,而VE-钙粘着蛋白存在于这两种细胞类型中(图2a-d)。钙粘着蛋白的胞质区与β-连环蛋白,片珠蛋白(γ-连环蛋白)和p120ctn反应,并通过α-肌动蛋白,粘着斑蛋白,ZO-1,ZO-2和spectrin将所述胞质区和肌动蛋白骨架相连接(Provost,E.& Rimm,Curr.Op.Cell Biol.11:567-572.1999)。BEC表达非常高水平的β-连环蛋白(图2e,f)和粘着斑蛋白,而片珠蛋白主要存在于LEC上(图2g,h)。LEC和BEC的染色也显示了显著不同的肌动蛋白的结构。BEC显示多种应激纤维,所述纤维在LEC几乎完全缺失,而在LEC中观察到了肌动蛋白在真皮中的分布(图2i,j)。
整联蛋白是重要的细胞粘附介导物(Giancotti & Ruoslahti,Science285:1028-1032.1999)。它们是跨膜蛋白,由两种多肽组成,即α和β亚基。它们的胞外区结合细胞外基质蛋白,而所述胞质区结合细胞骨架和参与信号转导的蛋白。整联蛋白α5是纤连蛋白受体的亚基,主要在BEC中表达。反之,整联蛋白α1和α9,分别为层粘连蛋白和胶原蛋白的受体以及为骨桥蛋白和腱生蛋白的受体提供了亚基,它们在LEC中表达(图1a和图2k,l)。在人皮肤中,整联蛋白α9的抗体特异性染色淋巴毛细管,而血管内皮细胞是阴性的(图2m-o)。此外,已有报道,在动脉平滑肌细胞中检测到整联蛋白α9(Palmer,等,J.Cell Biol.123:1289-1297.1993)。有趣的是,整联蛋白α9已显示duiyu淋巴系统的正常发育是重要的。缺乏整联蛋白α9β1的小鼠由于乳糜胸(可能是淋巴)渗出而出现了呼吸衰竭,并在出生后6-12天死亡(Huang,等,Mol.Cell Biol.20:5208-5215.2000)。
BEC,而不是LEC,产生两种层粘连蛋白和不同类型的胶原蛋白(表4)。在共培养中,这些基底膜成分对于LEC的粘附和生长是必要的(M_kinen,T.,等,EMBO J.20:4762-4773.2001)。此外,许多参与基质降解和重塑的蛋白,包括几种基质金属蛋白酶,组织型和尿激酶纤溶酶原激活物,以及纤溶酶原激活物I主要在BEC中检测到,而while基质金属蛋白酶的组织抑制物-3(TIMP-3)主要在LEC中检测到(表3和图1)。和其它可溶的TIMPs不同,TIMP-3是细胞外基质的成分。据报道重组的TIMP-3可对生血因子应答,从而抑制内皮细胞迁移和管形成,如果是在肿瘤模型中表达,重组的TIMP-3可很可能通过抑制肿瘤的扩张,生长因子从细胞外基质的释放,或者血管生成来抑制肿瘤生长(An和-Apte,等,Biochemistry & Cell Biology 74:853-862.1996)。
其它以前已知的基因在微阵列中被鉴定为LEC-特异性转录因子or跨膜蛋白。见表5和6。
表5
鉴定的转录因子
基因 | 保藏号 | ||
检测* | 起始EST | 可能的基因 | |
与Iroquois相关的同源框2同源与小鼠odd-skipped相关1锌指TF相似来自7q35-qter的PAC克隆RP4-751H13与小鼠糖皮质激素诱导的基因1类似 | Af(S/4,2)Af(S/3,3)Af(S/2,3)Af(NS/2) | 氨基酸936528AI809953AC004877AI678080 | 不是从人(18)克隆的(19)XM_070471 |
*Af=Affymetrix,S=对LEC的特异性,NS=非特异性(也在BEC中表达),数字代表BEC和LEC之间的信号强度的log2比值值值。
表6
鉴定的跨膜蛋白
基因 | 保藏号 | ||
检测* | 起始EST | 可能的基因 | |
KIAA0626KIAA0644未知蛋白假想蛋白FLJ20898与layilin相似,未命名的蛋白产物假想蛋白FLJ23403KIAA0062间充质干细胞蛋白DSCD75 | Af(S/4,7)Af(S/3,9)Af(S/3,5)Af(NS/1,8)Af(NS/1,7)Af(NS/3,2)Af(S/1,8) | AB014526AB014544AI333655AI733570AA447940AI681538D31887AW009871 | NM_21647 (14)NM_14817 (15)XM_059074 (16)NM_024600 (862)AK055654,XM_84655(45)NM_022068 (860)XM_46677 (47)NM_16647 (17) |
*A=Affymetrix,S=对LEC的特异性,NS=非特异性(也在BEC中表达),数字代表BEC和LEC之间的信号强度的log2比值值。
此外,表10和11分别描述了鉴定的已知LEC基因及其保藏号,和差异表达的基因及其保藏号,而表12描述了在扫描中鉴定的其它未知蛋白。
实施例4
PROX-1对LEC基因的差异性调节
研究了淋巴分化程序的机制。Prox-1同源框转录因子被发现在LEC中特异性表达,并且小鼠中Prox-1的靶向破坏被报道导致淋巴管发育的阻抑(Wigle等,Cell,98:769-778.1999)。尽管prox-1基因几乎十年前就发现了,Prox-1靶基因仍没有被鉴定。为确定同源区转录因子Prox-1造成了分化的LEC和BEC基因型,分析上述鉴定的基因在原代BEC和LEC中,存在或缺乏Prox-1过度表达的条件下的表达。
腺病毒介导的原代内皮细胞中的prox-1基因转移用来在BEC细胞中诱导基因的表达。为了消除腺病毒感染造成的基因表达变化,将AdLacZ(编码β-半乳糖苷酶)引入BEC作为对照。
prox-1 cDNA通过RT-PCR使用来自人内皮细胞的RNA进行扩增,所用引物为5’-GCCATCTAGACTACTCATG氨基酸GCAGCT-3’(SEQ IDNO:61)和5’-GCGCAG氨基酸TTCGGCCCTGACCATGACAGCACA-3’(SEQ ID NO:62)。PCR产物被克隆到pAMC表达载体中,产生N-末端Myc-标记的Prox-1。所述构建体随后被亚克隆入pAdCMV中,以产生AdProx-1来制备腺病毒。AdProx-1和AdLacZ病毒株如所述方法制备(Laitinen等,Hum.Gene Ther.9:1481-148 6.1998)。腺病毒产生的Prox-1迁移的分子量为约85kDa,并且也被Prox-1 C-末端肽的抗体识别。突变的Prox-1 N625A/R627A,(密码子625处的天冬氨酸变成了丙氨酸,密码子627处的精氨酸变成了丙氨酸)是通过使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)和以下引物制备的:
5’-CTCATC氨基酸GTGGTTTAGCGCTTTCCGTAGTTTTACTAC-3’(SEQ ID NO:63)和
5’-GTAGT氨基酸氨基酸CTCACGG氨基酸GCGCT氨基酸ACCACTTGATGAG-3.(SEQ ID NO:64)。
将人皮肤微血管内皮细胞,冠状动脉内皮细胞(CAECs),隐静脉内皮细胞(SAVECs),BEC和LEC铺于板上,24小时后,以8,000细胞/cm2的密度,在不含血清的培养基中以50-100PFU/细胞,用腺病毒感染1小时。孵育期末,洗涤细胞,然后在完全培养基中培养20-24个小时。如上述进行总RNA分离和阵列杂交。
滴定试验显示,人微血管内皮细胞感染AdProx-1 or AdLacZ后导致感染24小时后,>90%的细胞中的腺病毒编码的蛋白的核表达。为了研究Prox-1诱导的基因表达中的变化,使用了人cDNA滤纸阵列,所述阵列含有约1,000已知对常见细胞代谢重要的基因,以及在调节心血管功能和血细胞生成中特别涉及的基因。AdProx-1上调28LEC基因的表达,而下调63BEC基因的表达(见下表7),可以通过10个或11个选出的基因Northern印迹确定。与在LEC和BEC中差异表达的基因相比较,Prox调节的15个基因(即,约30%)被被发现在培养的LEC和BEC之间的表达有差异,表明Prox-1是调节内皮细胞身份(identity)。
表7
Prox-1调控的LEC/BEC基因
基因 保藏号 1信号对数比 2s.d.
AdProx-1诱导的LEC特异性(28种基因)
细胞周期蛋白E2 AF091433 NM_57735 4.95 1.17
富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白2 U57646 NM_001321 4.58 0.36
Cdk-抑制物p57KIP2 U22398 NM_000076 3.77 0.68
亲代表达的10 AB028974 NM_015068 3.54 0.95
血栓烷A2受体 D38081 NM_001060 2.32 0.13
B-myb X13293 NM_002466 2.11 0.28
视网膜母细胞瘤相关蛋白HEC AF017790 NM_06101 1.86 0.13
胆固醇25羟化酶 AF059214 NM_003956 1.86 0.56
G蛋白偶联的受体,家族C,组5,成员B AC004131 1.83 0.32
胸腺嘧啶激酶1 M15205 NM_003258 1.80 0.39
CREM(cAMP反应性因子调节物) S68134 NM_001881 1.78 0.30
α-辅肌动蛋白-2-相关LIM蛋白 AF002282 NM_014476 1.77 0.42
基因 保藏号 1信号对数比 2s.d.
粒桥蛋白(DPI,DPII) AL031058 1.74 1.03
MCM6微型染色体保持缺陷的6(minichromosome maintenance D84557 NM_005915 1.72 0.06
deficient 6)
红细胞膜蛋白带4.9(dematin) U28389 NM_001978 1.71 0.25
GTP环化水解酶 1 U19523 NM_000161 1.61 0.04
KlAA0186基因产物 D80008 NM_021067 1.47 0.11
细胞分裂周期2蛋白 X05360 NM_001786 1.35 0.43
来自克隆643的假想蛋白 AF091087 NM_020467 1.25 0.22
泛素载体蛋白E2-C U73379 NM_007019 1.23 0.12
有丝分裂检验点(checkpoint)激酶Mad3L AF053306 NM_001211 1.22 0.47
V-Erba相关Ear-3蛋白 HG3510-HT3704 1.20 0.20
糖原磷酸化酶(PYGL) AF046798 1.16 0.54
fms-相关的酪氨酸激酶4,VEGFR-3 X69878 NM_002020 1.10 0.00
含BTB(POZ)区3(BTB(POZ)domain containing 3) AB023169 NM_014962 1.10 0.08
SMC4染色体结构保持4样1(structural maintenance of AB019987 NM_005496 1.09 0.59
chromosomes 4-like 1)(酵母)
高活动性组的蛋白2(high-mobility group protein 2) X62534 NM_02129 1.07 0.04
基因 保藏号 1信号对数比 2s.d.
α拓扑异构酶 L47276 1.04 0.49
基因 保藏号 1信号对数比 2s.d.
AdProx-1抑制的BEC特异性(63种基因)
neuropilin-1 AF016050 NM_03873 -3.99 0.42
ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物2,RAC2 M64595 NM_002872 -3.87 0.47
含三部分基序的22(tripartite mortif-containing 22) X82200 NM_006074 -3.56 0.28
小的可诱导细胞因子A2(单核细胞趋化蛋白 1) M26683 NM_002982 -3.56 0.03
锌指蛋白238 AJ223321 NM_006352 -3.08 0.13
uPA X02419 -3.05 0.02
转录因子EC D43945 NM_12252 -3.04 0.08
RNase A,胰腺的 D26129 NM_002933 -2.72 0.02
维生素A反应性;细胞骨架调控的 AF070523 NM_006407 -2.51 0.6
白介素6 X04430 NM_000600 -2.42 0.63
Rho GDP解离抑制物(GDI)β X69549 NM_001175 -2.42 0.03
基质金属蛋白酶14 X83535 NM_004995 -2.37 0.08
E3泛素接合酶SMURF2 氨基酸 NM_22739 -2.22 0.06
630312
死亡受体6 AF068868 NM_014452 -2.16 0.61
蛋白C受体,内皮(EPCR) L35545 NM_006404 -2.09 0.14
基因 保藏号 1信号对数比 2s.d.
造血和神经膜蛋白(HNMP-1) U87947 NM_001425 -2.08 0.63
KIAA0836 AB020643 -2.07 0.44
硫酸软骨素蛋白多糖2(多能聚糖) X15998 NM_004385 -1.99 0.65
G蛋白信号4调节物 AI267373 NM_05613 -1.93 0.54
磷酸果糖激酶,肌肉 U24183 NM_000289 -1.93 0.11
IGF-IImRNA-结合蛋白 3 U97188 NM_006547 -1.9 0.23
神经元细胞粘附分子Nr-CAM/hBRAVO AB002341 NM_005010 -1.89 0.13
细胞表面糖蛋白CD44 L05424 -1.84 0.12
纤溶酶原激活物-1 J03764 NM_000602 -1.83 0.33
AF1Q蛋白 U16954 NM_006818 -1.79 0.23
人克隆24674mRNA序列 AF070578 -1.76 0.01
烟酰胺N甲基转移酶 U08021 NM_006169 -1.74 0.49
乳酸脱氢酶B X13794 -1.73 0.08
KIAA0537基因产物 AB011109 NM_14840 -1.73 0.08
LIM区(domain)蛋白 X93510 NM_003687 -1.67 0.11
淋巴细胞抗原75,DEC-205 AF011333 NM_002349 -1.61 0.08
自然杀伤细胞转录物4 AA631972 NM_004221 -1.59 0.05
磷脂酶A2 M72393 -1.58 0.41
R-ras M14949 -1.56 0.1
腺苷酸环化酶相关蛋白2 N90755 NM_006366 -1.55 0.08
leupaxin AF062075 NM_04811 -1.53 0.3
信号转导物和转录激活物6(STAT6) AF067575 -1.51 0.45
LYL-1 M22637 -1.51 0.14
selectin P M25322 NM_003005 -1.47 0.37
蛋白激酶,不依赖cAMP,催化的,β M34181 NM_002731 -1.43 0.49
TRAM样蛋白 D31762 NM_12288 -1.42 0.43
鸟苷酸结合蛋白2,干扰素可诱导的 M55543 NM_04120 -1.41 0.51
基因 保藏号 1信号对数比 2s.d.
细胞间粘附分子2 X15606 NM_000873 -1.38 0.13
蛋白多糖1,分泌性颗粒 X17042 NM_02727 -1.35 0.47
原肌球蛋白1(α) Z24727 NM_000366 -1.32 0.1
成纤维细胞活化蛋白,α亚基 U09278 NM_004460 -1.25 0.12
假想蛋白DKFZp564D0462 AL033377 -1.25 0.23
有丝分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶3 U09578 NM_04635 -1.2 0.35
β淀粉样蛋白(A4)前体蛋白结合的 U62325 -1.2 0.18
AXL受体酪氨酸激酶 M76125 NM_001699 -1.19 0.3
整联蛋白α5 X06256 NM_002205 -1.18 0.02
月元病毒蛋白(PrP) U29185 -1.18 0.07
TRAF家族成员相关的NFKB激活物(TRAF family U59863 NM_04180 -1.17 0.13
member-associated NFKB activator)
膜联蛋白VI Y00097 NM_01155 -1.16 0.12
钴胺传递蛋白II L02648 NM_00355 -1.16 0.12
含寿司重复(sushi-repeat)的蛋白,X染色体 U61374 NM_006307 -1.13 0.09
骨形态发生蛋白6 M60315 NM_01718 -1.13 0.39
假想蛋白,来自克隆23549和23762 U90908 NM_021226 -1.1 0.6
视网膜cDNA随机引物亚文库,EST W28438 -1.09 0.36
TU3A蛋白 AF035283 -1.06 0.29
角蛋白7 AJ238246 NM_005556 -1.05 0.53
潜在的转化型生长因子结合蛋白2 Z37976 NM_00428 -1.04 0.13
N-钙粘着蛋白 M34064 NM_001792 -1.02 0.12
cDNA DKFZp564J0323(来自克隆DKFZp564J0323) AL049957 -1.01 0.22
1所述改变表达为log2的比值。
2表达水平改变的标准偏差。
还研究了重组Prox-1在BEC中(通常是缺失的)表达的能力,所述表达可修饰这些细胞对淋巴管内皮细胞的基因型的转录过程。通过寡核苷酸微阵列分析可确定,对照AdLacZ,不显著改变BEC或LEC特异的转录。反之,AdProx-1增强许多LEC特异的mRNA的表达,例如VEGFR-3,p57Kip2,粒桥蛋白I/II和α-肌动蛋白相关的LIM蛋白(见表8)。令人吃惊的是,Prox-1还抑制在BEC中特定表达的基因的表达的大约40%,所述基因例如转录因子STAT6,theUFO/axl受体酪氨酸激酶,neuropilin-1(NRP-1),单核细胞化学吸引剂蛋白-1(MCP-1)和整联蛋白α5(见表7和表8)。这些基因表达的结果与淋巴管的体内研究一致。例如,在淋巴内皮中发现了VEGFR-3和粒桥蛋白I/II(Ebata等,Microvasc.Res.61:40-48.2001;Kaipainen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:3566-70.1995),并且发现在BEC中由Prox-1表达的VEGF辅受体(co-receptor)NRP-1,在小鼠皮肤中的血管表达,而不在其淋巴管中表达。
表8
Prox-1调控的LEC和BEC特异性基因的实例
LEC-特异性,上调 | BEC-特异性,下调 | |
粘附分子细胞骨架蛋白ECM蛋白 | 粒桥蛋白I和IIα-肌动蛋白-2相关的LIM蛋白 | 整联蛋白α5ICAM-2CD44Nr-CAMP-selectinleupaxin多能聚糖蛋白多糖1 |
ECM蛋白 | 多能聚糖蛋白多糖1 |
LEC-特异性,上调的 | BEC-特异性,下调的 | |
ECM调节受体酪氨酸激酶转录因子细胞因子,趋化因子和受体细胞周期控制其它 | VEGFR-3CREMear-3p57Kip2细胞周期蛋白E2胆固醇25羟化酶血栓烷A2受体 | MMP-14uPAPAI-IUFO/axlSTAT6TFECIL-6MCP-1Neuropilin-1内皮细胞蛋白C受体 |
总数 | 28个基因(LEC-特异性基因的19%) | 63个基因(BEC-特异性基因的38%) |
粗体所示的基因通过Northern印迹或RT-PCR确定。
为确定基因表达中的Prox-1诱导的改变是否细胞类型特异的,分析了其他内皮细胞类型(即冠状动脉内皮细胞(CAECs)和隐静脉奶皮细胞(SAVECs))和非内皮细胞类型(即羊膜内皮细胞(AEC))中,AdProx-1 or AdLacZ感染后基因表达的改变。在所有这些细胞类型中,AdProx-1强烈地上调细胞周期蛋白E1和E2,组蛋白H2B,和PCNA。然而,AdProx-1只在CAECs和SAVECs中诱导VEGFR-3的表达,而不在AECs中诱导该基因的表达。
这些结果和Prox-1胚胎中缺乏淋巴管分化一致。有趣的是,Prox-1在原代内皮细胞中的表达导致VEGFR-3受体酪氨酸激酶的上调,该激酶在孕中期后对淋巴内皮特异,并且对正确的淋巴管生长和功能是必要的(Karkkainen和Petrova,原癌基因19:5598-5605.2000)。例如,人和小鼠中VEGFR-3的活化突变导致淋巴管发育不全和淋巴水肿(Jeltsch等,Science 276:1423-1425.1997;Karkkainen等,Nat.Genet.,25:153-159.2000;Karkkainen等,Trends Mol.Med.7:18-22.2001)。上述结果表明Prox-1对VEGF-3的表达的上调是淋巴管内皮细胞身份的确定中的重要途径之一,还表明成人血管内皮细胞中不同细胞的基因型是可塑的,并且对转录重编(transcriptionalreprogramming)敏感,这对于本发明影响内皮细胞的治疗方法是有用的。
实施例5
使用ADPROX-1转染的细胞进行离体细胞刺激和淋巴水肿的基因治疗
Prox-1调节特异性参与LEC发育的基因的能力为治疗显示LEC疾病的个体或由LEC基因表达水平增加或降低造成的病情提供了方法。Prox-1上调可用于促进LEC发育,治疗以例如淋巴管发育较宽为特征的淋巴管系统发育不良为特征的LEC疾病,例如淋巴水肿。本领域已知,细胞的离体转染和随后将这些细胞转移到病人体内是有效的上调转移的特定基因的体内水平的方法,并可缓解由于这些基因的表达较低导致的疾病。(Gelse等,Arthritis Rheum.48:430-41.2003;Huard等,基因Ther.9:1617-26.2002;Kim等,Mol.Ther.6:591-600 2002)。
为产生治疗LEC发育疾病的疗法,将内皮细胞,例如CAEC,SVEC,LEC或BEC从患有LEC疾病(例如淋巴水肿)的个体中分离出来,并随后将这些细胞置于适当的培养基中(见上文)以促进细胞的生长和存活力。随后如所述使用上述的AdProx-1载体感染这些细胞,来启动非LEC在体外的LEC分化,以及促进培养基中LEC的生长。这些转染后的细胞随后以有效促进LEC在体内的扩增的数量被转入患病的病人。在优选的实施方案中,受操作的细胞是自体细胞。这些细胞通过一种或多种通常包括注射的给药途径来递送。这些细胞被地送到LEC疾病或病症例如淋巴水肿的局部位点或者被系统地递送。
将Prox-1感染的细胞引入患有淋巴水肿的病人提供了补充性的LEC,所述LEC可以并入淋巴系统网络中来促进淋巴管发育和完成淋巴清除来缓解淋巴水肿的症状。还涉及一种方法,包括将AdProx-1转染到内皮细胞内,并给药转染的细胞,这种方法对于治疗任何以LEC数目或活性为特征的疾病是有效的,所述疾病例如淋巴水肿,淋巴管瘤,淋巴管骨髓瘤,淋巴管肌瘤病,淋巴管扩张,淋巴肉瘤,和淋巴管硬化。此外,这种方法还可用来缓解与这种疾病相关的症状(例如,淋巴水肿中由淋巴导致的肿胀)。
实施例6
LEC-特异性基因的表征
使用LEC和BEC基因之间的扣除文库(subtraction library)进一步分析LEC-特异性基因。为构建所述文库,如上述分离总RNA,并且使用SMARTPCR cDNA合成试剂盒(BD Biosciences Clontech)预扩增5μg of总RNA。使用RsaI消化后,PCR-选择的cDNA subtraction以两个方向进行,导致差异表达的序列的选择性扩增,并且制备了subtracted LEC和BEC cDNA文库(BD Biosciences Clontech)。使用1(tester):30(driver)的比例以两个方向进行扣除杂交,并使用PCR扩增扣除后的cDNA库。50ng纯化的PCR扩增产物被克隆入pAtlas载体(基于PUC的载体)用来构建扣除文库,尽管本领域已知一些其他载体也可用来构建。
扣除的LEC特异性文库的示差筛选如PCR-Select DifferentialScreening Kit User Manual(BD Biosciences Clontech)所述进行。LEC-特异性扣除文库经平板培养,并挑出单个的细菌克隆使其生长。DNA提取后,用PCR扩增插入物并进行测序。等分量的PCR扩增插入物也在尼龙膜上进行排列并用来和32P标记的cDNA探针杂交。扣除的LEC特异性(tester)和扣除的BEC特异性(driver)cDNA探针的杂交结果用于差异表达分析。
BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool)用来比较核苷酸,蛋白和EST序列数据库的序列。对于未知的序列,搜索EST重叠群,并使用ORF finder预测开放阅读框架。蛋白结构域构型用Pfam(Protein families database of alignments和HMMs)和Smart(SimpleModular Architecture Research Tool)分析。
在LEC和BEC中差异表达的克隆的核苷酸序列如上述方式分析。首次筛选中多种EST或未知的基因片段被进一步研究来确定其与已知基因序列的相似性,来确定任何开放阅读框架以及功能性结构域的类似性。这些结果见表9。
表9
克隆命名和(SEQ ID NO) | EST | 人基因组保藏号# | KIAA名称#和(SEQ ID NO) | 预期的基因功能 |
LE000100001_A06(SEQ ID NO:61)LE0000100050_A01(SEQ ID NO:59)LE0000100055_H05LE000100017_C02(SEQ ID NO:55)LE0000100049_E10LE0000100054_F09LE0000100056_F07SEQ ID NOs:LE0000100053_A06SEQ ID NO:56LE0000100055_G10LE0000100046_C12SEQ ID NOs:57-58 | AB014526AB014544AI333655AI681538氨基酸447940XM_046677XM_047672AI761647D14657 | NM_021647NM_014817XM_059074NM_016647XM_084655D31887XM_047672NM_015147NM_014736 | KIAA0626SEQ ID NO:14KIAA0644SEQ ID NO:15无KIAA,称为hLyrpSEQ ID NO:16SEQ ID NO:17SEQ ID NO:45KIAA0062SEQ ID NO:47KIAA1673SEQ ID NO:26KIAA0582SEQ ID NO:49KIAA0101SEQ ID NO:51 | Ig结构域基序,很可能的细胞粘附功能富含亮氨酸的基序,细胞粘附活性富含亮氨酸的重复序列,细胞粘附蛋白与间克质干细胞蛋白类似与layilin类似,很可能的细胞粘附功能锌转运物基序,金属离子转运RNA-结合区,与RNA结合蛋白类似 |
发现多种LEC-特异性基因与KIAA基因序列相对应,KIAA是大的核苷酸EST克隆,编码未知的人蛋白。(Kazusa DNA ResearchInstitute,1532-3,Yana Kisarazu,Chiba,292-0812,Japan)。这些LEC特异性基因在多种可得的数据库中进一步分析,以确定物种同源物的存在和这些同源物的相似性百分比,以及揭示显示与保守的蛋白结构域的相似性的氨基酸序列。
LEC克隆序列的分析使用National Institutes of Health提供的U.S.National Center for Biotechnology Information保存的Homolo基因数据库,来确定物种同源物和直向同源物以及其与新分离的人LEC特异性基因的相似性百分比。这些序列的分析使用的的资源是curated和计算后的基因同源物,如由Uni基因代表或基因组序列的注释表示,通常比较EST和来自UniGene的mRNA序列,以及从注释的基因组序列中提取的转录物。(Zhang,等,J.Comp.Biol.7:203-14.2000)。一种有机体中的核苷酸序列与另一种有机体中的核苷酸序列的最佳匹配基于这两个序列之间相似性的程度,其最小比对为100个碱基对。这两个序列之间的相似性通过比对值确定。序列对的比对是被比对的两个序列的部分的相似性得分的总和。
HomoloGene分析表明相应于KIAA0626,KIAA0644,和KIAA0062的人LEC基因,与EST和以下未知的基因序列同源:小鼠(所有),大鼠(KIAA0062,KIAA0644),牛(KIAA0062),猪(KIAA0626,KIAA0644)和非洲爪蟾属(KIAA0644)。所述克隆显示与被鉴定为Homolo基因的同源物的基因大约80%(±3%)的相似性,KIAA0644显示与猪EST序列BE233028.1高达86%的同源性,以及与X.laevis基因较低的72%的相似性。
使用Pfam比较分析LEC基因发现,相应于KIAA0626(SEQ IDNO:14),KIAA0644(SEQ ID NO:15),hLyrp(SEQ ID NO:16),XM_084655(SEQ ID NO:45)和KIAA0062(SEQ ID NO:47)的核苷酸序列显示以编码的跨膜结构域为特征的核苷酸序列,说明相应的多肽(其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:31,32,33,46和48)在细胞的表面表达。KIAA1673,KIAA0582和KIAA0101不显示明显的跨膜区并且据预期是胞质的或核蛋白。Northern印迹测定的组织表达显示,KIAA0101在肾,胸腺,结肠和小肠中表达,而KIAA0582在心脏,骨骼肌,和卵巢中强烈表达,在肾和胎盘中表达较低,而在脑,肺,胸腺,小肠和前列腺中表达更低。
KIAA0626转录子的Northern印迹分析表明,KIAA0626在LEC中特异性表达,并且见于心,骨骼肌和肾。原位分析表明KIAA0626在11天的小鼠胚胎(E11)中的肌节间组织和血管周围的周细胞中,以及卵黄囊血管,内皮细胞以及周围的周细胞中表达。KIAA0626(SEQID NO:14)的多核苷酸序列编码409个氨基酸(409氨基酸)的蛋白(SEQ ID NO:31),所述蛋白具有一个信号序列(氨基酸1-29),一个Ig超家族结构域(大约氨基酸61-127),一个短跨膜区(大约氨基酸153-175),和一个从大约氨基酸176-409的长234个氨基酸的胞质区。预计Ig结构域可支持所述蛋白与其配体的结合,而长胞质结构域表明KIAA0626可能参与LEC的细胞内信号。
通过Northern印迹分析测定,KIAA0644(SEQ ID NO:15)主要在心和脑组织中。E10小鼠胚胎的原位分析表明KIAA0644在整个胚胎中表达。KIAA0644多核苷酸编码811个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:32),显示共有13个富含亮氨酸的区。富含亮氨酸的区包含一个短的序列基序,约20-28个氨基酸,该区在蛋白中起细胞粘附和受体分子的作用。富含亮氨酸的区,下文称为LRRNT和LRRCT,通常侧接富含半胱氨酸的区。所述KIAA0644蛋白含有一个富含亮氨酸的N末端区(LRRNT:氨基酸26-54),11个内部富含亮氨酸的区(LRR1:氨基酸84-107,LRR2:氨基酸108-131,LRR3:氨基酸132-155,LRR4:氨基酸156-179,LRR5:氨基酸180-203,LRR6:氨基酸204-223,LRR7:氨基酸230-253,LRR8:氨基酸254-277,LRR9:氨基酸278-301,LRR10:氨基酸302-325,和LRR11:氨基酸326-349)以及一个C末端富含亮氨酸的区(LRRCT),从大约氨基酸359-404。该KIAA0644跨膜区跨大约亮氨酸696-718,其胞质内区大约95个氨基酸,从氨基酸719-811。KIAA0644基因的富含亮氨酸的区使得该基因参与以细胞粘附或配体结合为特征的蛋白-蛋白相互作用。
hLyrp(SEQ ID NO:16)mRNA可在骨骼肌中检测到,并且与E11和小鼠胚胎卵黄囊中的Prox-1染色相比,其可通过与淋巴管原位杂交定位。与KIAA0644相似,hLyrp蛋白(SEQ ID NO:33)含有一系列富含亮氨酸的区,从富含亮氨酸的N末端区(LRRNT:氨基酸27-55)延伸经过5个内部的富含亮氨酸的区(LRR1:氨基酸57-80,LRR2:氨基酸81-104,LRR3:氨基酸105-128,LRR4:氨基酸129-153,LRR5:氨基酸154-176),以C末端的富含亮氨酸的区(LRRCT)为终点,从大约氨基酸186-240。hLyrp多肽还含有一个跨膜区,从氨基酸249-272,其具有短的22个氨基酸的胞质区。多个连续的富含亮氨酸的区存在于hLyrp多肽中表明,该多肽的作用是细胞粘附分子和/或细胞表面受体。
使用在LEC中特异性表达的全长mRNA序列分离表3所示的多个附加序列。这些序列的结构域预测表明,KIAA0711(SEQ ID NO:81和82)含有一个BPB/POZ结构域,所述结构域长达约氨基酸171-269,该结构域预期在蛋白-蛋白相互作用中起作用。POZ区出现在转录辅助因子例如锌指蛋白中,所述转录因子介导转录抑制并且与组蛋白脱乙酰基酶复合物的组分相互作用。KIAA0711还具有三个Kelch同上,跨氨基酸386-437,439-480,和484-525,并且Kelch基序与β折叠结构的形成有关。此外,KIAA0711 mRNA在多种组织中表达。KIAA0711 mRNA从最高表达水平到最低表达水平见于脑和肾,肝,脾;肺,卵巢,胰腺和心;平滑肌和睾丸。由于这种表达模式从一次RT-PCR ELISA中获得,所述表达模式在循环RT-PCR中可能有变化。相应地,所述表达模式适合筛选以定性的量在组织中特异性表达的基因。如果需要更精确的定量表达模式,应采用在统计学上更加可信的方法(例如,多重RT-PCR ELISA测定,DNA芯片分析,RNA印迹分析,等等)。
对应于cDNA DKFZp5640222(SEQ ID NO:93)的结构域图谱表明,存在N末端信号肽(氨基酸1-23),两个内部同上结构域和一个可在蛋白例如myocilin,pancortin,和latrophilin中检测到的olfactomedin区(氨基酸361-616)。Myocilin中的OLF区与青光眼相关。
KIAA1233(SEQ ID NO:111)的结构域图谱表明KIAA序列含有六个血小板反应蛋白I型同上,该序列见于细胞外基质蛋白并通常参与细胞-细胞相互作用,并更特异性参与补体途径,抑制血管生成,以及参与凋亡。KIAA1233 mRNA从最高表达水平到最低表达水平,其见于脊髓;心,大脑,肺,肾,胰腺,各种脑组织(杏仁核,胼胝体,尾状核,海马,黑质,丘脑和下丘脑核团)和胎肝;胎脑;脾;和睾丸。
KIAA0846(SEQ ID NO:188)蛋白含有鸟苷酸交换因子中的基序,并因此可能使细胞内蛋白,可能是信号蛋白。KIAA0846还显示两个EF手基序(EF-h和基序s),见于信号蛋白(例如钙调蛋白,S100B)(所述蛋白经过依赖钙的构像改变)和缓冲/转运蛋白。KIAA0846 mRNA从最高的表达水平到最低的表达水平见于肾;心,脑和肺;肝,脾和卵巢;胰腺,平滑肌和睾丸。
蛋白FLJ13110(SEQ ID NO:207和208)包含TB2/DP1,HVA22超家族蛋白结构域和两个短的跨膜区(SEQ ID NO:207的氨基酸4-22和43-65)。HVA22家族包括来自多种真核细胞的成员,包括TB2/DP1(在严重的家族性腺瘤样息肉病中缺失)蛋白,其在严重的家族性腺瘤样息肉病,常染色体显性的肿瘤性遗传疾病中缺失。
LEC-特异性基因筛选还鉴定了蛋白KIAA0937(SEQ ID NO:211和212)。KIAA0937含有WWE结构域(从SEQ ID NO:211的大约氨基酸30-112,和113-189),该结构域是根据其三个保守的残基命名的,并被预期介导泛素质和ADP核糖偶联系统中的特异性的蛋白-蛋白相互作用。KIAA0937预期含有锌指结构域(SEQ ID NO:211的氨基酸443-501),并预期其是细胞内转录因子。KIAA0937 mRNA从最高的表达水平到最低的表达水平见于,脊髓;下丘脑核团和大脑脑干;广泛意义上的脑(包括杏仁核,胼胝体和胎脑)和卵巢;胎肝;心,肺,肾,脾和脑的部分(尾状核和海马);睾丸和胰腺;以及平滑肌。
KIAA0952(SEQ ID NO:241和242)含有Broad-Complex,Tramtrack和Bric-a-brac结构域,也称为POZ(痘苗病毒和锌指)结构域。这些结构域已知是多种C2H2型转录因子的N末端以及Shaw类型钾通道的蛋白-蛋白相互作用结构域。这些结构域已知的结构显示紧密地互相缠绕的二体,该二体是通过N末端多肽链和螺旋结构之间的相互作用形成的。
命名为KIAA0429(SEQ ID NO:391和392)的蛋白与转移抑制蛋白相似,并含有大约从氨基酸467-484的肌动蛋白-结合WH2区,和从氨基酸348-466的富含脯氨酸的区。
蛋白FLJ23403(氨基酸序列,SEQ ID NO:859;多核苷酸序列,SEQ ID NO:860)显示于未知的小鼠蛋白(GenBank Acc.No.XM 129000)大约85%的同源性,并含有一系列四个跨膜区,即氨基酸44-66,86-108,115-137和452-474。
其它LEC-特异性,上调的基因包括以前未鉴定的蛋白KIAA0186(SEQ ID NO:221和222),KIAA0513(SEQ ID NO:235和236)和命名为FLJ13910(SEQ ID NO:293和294)的蛋白。
淋巴管内皮细胞特异性分子的操作预期可用于治疗LEC疾病的与组织水肿相关的病症。为不受理论限制,这种分子的操作预期可调节内皮细胞-细胞或细胞-基质蛋白的相互作用,或者通过改变通过淋巴关闭的液体运输的状态类影响跨内皮细胞运输。此外,这种分子还提供了递送治疗性化合物例如生长因子,有丝分裂原等等诸如此类的靶点,以及递送本领域已知的细胞抑制剂或细胞毒剂的靶点。这些治疗性化合物通过将治疗剂与例如LEC表面标志物的结合配偶体(例如抗体)相连靶向这种细胞。本文鉴定的跨膜蛋白,具体为富含亮基酸蛋白,还提供了调节细胞粘附事件整体到淋巴清除的靶点。
实施例7
检测LEC和淋巴相关病症的微阵列分析
本发明鉴定的LEC-特异性基因可用于体内检测LEC和样品中检测淋巴管系统的范围。该LEC-特异性基因也预期可用于诊断淋巴水肿和其它LEC相关的病症。
本发明的另一方面是一种组合物,包含多个多核苷酸探针,用于检测以特定细胞类型为特征的基因表达模式和用于检测特定细胞类型例如淋巴管内皮细胞的基因表达模式的改变。本文术语“多核苷酸探针”指SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的核酸序列或其片段,或者编码SEQ ID NO:31-44,46,48,和50之一的氨基酸序列的核酸序列或其片段。优选,所述片段的长度为至少10个核苷酸;更优选,该片段长度至少为20个核苷酸。这样一种组合物可用于诊断和治疗任何一种病情或疾病,所述疾病涉及或可疑淋巴管内皮细胞功能不良或无功能。在一个实施方案中,本发明提供了一种包含多个多核苷酸探针的组合物,其中至少一部分多核苷酸探针各包含一段独特的序列,所述序列选自SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一。优选,所述组合物包含至少3个多核苷酸子集,每种多核苷酸都具有不同的序列,所述序列选自SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一。优选的组合物还有包含至少5,至少7,至少9,至少15,至少20,或至少25个不同的多核苷酸的组合物,所述多核苷酸具有SEQID NO:1-30,45,47,49和51之一的序列。
所述组合物尤其可用作微阵列中的一套可杂交的阵列元件,用来监控多个靶多核苷酸的表达。所述微阵列包括底物和可杂交的阵列元件。所述微阵列可用于,例如由于异常淋巴管内皮细胞活性造成的疾病的诊断和预后,所述疾病例如淋巴水肿,淋巴管瘤,淋巴管骨髓瘤,淋巴管肌瘤病,淋巴管扩张,淋巴肉瘤,和淋巴管硬化。组合物还可用于鉴定一种以上细胞类型并用于一种以上的疾病,病症或病情的诊断和预后。此外,可从产生信号的那些探针和不产生信号的那些探针获得有用的信息。
包含SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的多核苷酸可用于诊断SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51编码的基因之一的异常表达相关的病情或疾病。例如,包含SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的序列的多核苷酸可用于杂交或体液或组织(例如从活检中获得)的PCR分析,来检测患有淋巴水肿或另一种淋巴相关的疾病的病人的异常基因表达。此外,包含编码SEQ ID NO:31-44,46,48 or 50之一的氨基酸序列的序列的多核苷酸可用于诊断和具有那些氨基酸序列之一的多台的异常表达相关的病情或疾病。包含至少10个核苷酸的片段可用于这些诊断方法中。
表达模式可以使用本发明包含SEQ ID NO:1-30,45,47,49和51之一的组合物产生。由所述微阵列产生的表达模式可用来检测疾病涉及的基因的表达的改变
实施例8
BEC和LEC中的转录因子
在LEC中差异表达的转录因子包括锌指因子c-maf和MADS家族转录因子MEF2C(图1)。MEF2C的靶向诱变导致胚胎在E9.5-10死亡,这是由于初始脉管系统重构缺陷和心内膜异常(Bi,等,Dev.Biol.211:255-267.1999)。据报道MEF2C可结合转录因子Sox18并加强其在内皮细胞中的活性(Hosking,等,Biochem.Biophys.Res.Commun.287:493-500.2001)。在Sox18中具有破坏MEF2C复合物的纯合子突变的幼鼠在一些遗传背景下出现乳糜性腹水(Pennisi,D.,等,Nat.基因t.24:434-437.2000),表明这两种蛋白可能都参与淋巴管形成的调节。与这一假设一致,MEF2C-/-胚胎的PCR-RT分析显示VEGFR-3的表达降低(Bi,等,Dev.Biol.见上文)。
STAT6转录因子由IL-4激活,并且在BEC中特异性表达。与这一观察一致,本文的结果显示IL-4受体优选在BEC中表达,一些IL-4靶趋化因子和受体例如MCP-1和CXCR4也如此。VEGF刺激和活化VEGFR-2也已知导致STAT6在内皮细胞中磷酸化和活化(Bartoli,等,J.Biol.Chem.275:33189-33192.2000)。因此STAT6在LEC中缺乏表明VEGFR-2的下游信号途径在BEC和LEC中不同。其他转录因子的表达模式见表5。
实施例9
SOX18和遗传性淋巴水肿
转录因子MEF2C的表达在LEC中上调。Sox18(SEQ ID NO:53,以及编码SOX18的SEQ ID NO:54),据报道与小鼠中的MEF2C反应,并且也显示在淋巴管内皮细胞发育中可能起作用。为了研究Sox18在淋巴水肿中的作用,研究了人Sox18突变体和人遗传性淋巴水肿之间的相互关系。
SOX蛋白,SRY转录因子家族的类似物,是遍在的转录因子,它含有推定的高活动性基团(high-motility group)(HMG)DNA结合区。(Wegner,M.,Nucl.Acids Res.27:1409-20.1999)。SOX蛋白在七聚的SOX共有结合序列[5′-(A/T)(A/T)C氨基酸(A/T)G-3′](Pennisi等,Mol.Cell Bio.20:9331-36.2000)结合其靶DNA,并且在双螺旋的小沟而非大沟处结合DNA,这导致该把基因的转录调节。SOX蛋白还可能参与将其它DNA结合蛋白募集到DNA蛋白复合物,从而支持转录调节(Wegner,见上文)。SOX18和SOX7以及SOX17具有同源性,它们都是F组Sox基因。
SOX18参与血管发育并且局限于发育的心血管系统和生血活性位点。在Sox18中具有Ragged(Ra)突变的小鼠纯合子出现乳糜性腹水和水肿(Pennisi等,Nat.基因t.24:434-37.2000),这和淋巴水肿的Chy小鼠模型相似(Lyon等,Mouse News Lett.71:26.1984)。Ra小鼠中的突变被确定为移码突变,导致反式激活区的截短(Pennisi等,Nat.基因t.24:434-37.2000)。Sox18无效小鼠却显示毛囊发育中的仅一个微小的基因型变化,并且没有显示人和水肿或无规律的血管发育的迹象(Downes和Koopman,Trends Cardio.Med.11:318-24.2001)。该基因型可能由于F组Sox成员即SOX7和SOX17过多造成。这些蛋白可以在缺乏SOX18时替代其功能,但不能克服Sox18显性的阴性突变体例如Ra突变。因此,敲除整个F组家族可能产生与Ragged小鼠类似的淋巴水肿基因型。
小鼠和人SOX18是同源的蛋白,包含一个大约80个氨基酸的DNA结合HMG-盒子(97%的同源性),一个在小鼠中大约为93个氨基酸的反式激活区(90%的同源性),以及一个C末端区(92%的同源性)(Downes和Koopman,见上文)。人SOX18 HMG-盒子可定位于核苷酸395-598,对应氨基酸84-151。小鼠HMG盒子由核苷酸320-532编码,对应氨基酸78-148。目前还没有关于人反式激活区的描述,但本领域熟练技术人员可轻易使用在小鼠SOX18的氨基酸252-346发现的同源小鼠序列(Hosking等,基因262:239-47.2001)获得人反式激活区。尽管人SOX18蛋白显示于小鼠SOX18在初级结构水平上相似,人Sox18突变体与疾病或病情例如遗传性淋巴水肿没有已知的联系。
人Sox18被定位于染色体20q.13.3(Stanojcic等,Biochem.Biophys.Acta.1492:237-41.2000)。阐明与遗传性淋巴水肿相关的在该染色体上或其附近的位点上的可遗传的突变可用于确定该疾病的遗传基础,筛选具有出现遗传性或其他形式的淋巴水肿的倾向性的病人,以及作为克服遗传突变的靶向治疗方案的基础。
为了确定Sox18和淋巴水肿之间的关系,鉴定患有遗传性淋巴水肿的家族来进行连锁和位置候选基因分析(linkage and positionalcandidate gene analyses)。家族成员如果显示一条或两条腿的不对称的或明显的肿胀,或者被诊断为淋巴水肿,或者有个人或家族的四肢肿胀或不对称的报道,则该家族的成员被认为受到遗传性淋巴水肿的影响。
从这样的家族中获得生物样品,来进行遗传分析。使用Miller等的方法(Nucleic Acids Res.16:1215.1998),从EDTA抗凝的全血中分离DNA,并使用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra Systems,Minneapolis,MN)从cytobrush样品中分离DNA。用于基因组筛选的标记物的分析通过本领域已知的方法进行。见Browman等,Am.J.Hum.Genetic.,63:861-869(1998);也见the NHLBI MammalianGenotyping Service。
为了探索Sox18在淋巴水肿中可能的角色,通过直接测定Sox18基因的部分的序列来筛选淋巴水肿家族的先证者中的变异。所述测序法使用根据Sox18 cDNA序列(SEQ ID NO:53)产生的扩增引物,以及相关的Sox基因的基因组结构的信息(内含子-外显子数据,鉴定的结构域基序)。可变位置(单核苷酸多形性)和独特序列引物用于扩增侧接每个位于用于分析的结构域中的可变位点的序列。
正常和受淋巴水肿影响的个体的Sox18的基因组DNA被测序,并且通过未受影响的个体对比,得到了在淋巴水肿病人的Sox18基因中检测到的突变的图谱。通常在淋巴水肿的病人中检测到的突变,例如保守的或非保守的核苷酸改变,缺失,或插入,表明特定核苷酸中的突变导致出现淋巴水肿的倾向性。受影响的个体的基因组DNA的分析将Sox18中的基因组序列中的突变和淋巴水肿联系起来。
为证实Sox18突变和淋巴水肿的出现之间的相互关系,进行了遗传关系的研究,如美国专利申请US2003026759和PCT/US99/06133(每篇参考文件都包含在文中作为参考)中描述的鉴定遗传多态性的方法。
两点连锁(Two-point linkage)分析使用常染色体显性模型进行,所述模型预期在杂合状态中为80%的外显率,在纯合状态下为99%的外显率,和1%的拟表型率。该疾病等位基因的频率被定为1/10,000,微卫星标记等位基因的频率是通过计数建立者等位基因(founder alleles)来计算的,还加入了非传送的等位基因的计数。多点分析是通过使用University of Southampton School of Medicine提供的distances from the Location Database进行的。多点和两点分析可通过使用VITESSE(vl.1)程序易化(O′Connell,和Weeks,Nature基因t.,11:402-408.1995)。
用于基因组扫描的标记物的分析可通过本领域已知的方法进行。(见Browman等,Am.J.Hum.基因tic.,63:861-869(1998);也见the NHLBI Mammalian Genotyping Service和the Center for Moleculargenetics提供的数据库(Marshfield,WI))。本领域熟练技术人员可轻易选出染色体20(尤其是20q13.3)中鉴定的遗传连锁标志物,Sox18就位于其中(Stanojcic等,见上文)。
连锁模拟可使用SLINK(Weeks等,Am.J.Hum.基因t.47:A204.1990)进行,并且可使用MSIM(Ott,J.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,86:4175-4178.1989)分析连锁,来估计两点连锁分析在被评估的家族中的潜力。使用可得的个体模型,标志物基因型被模拟成连锁的(linked)(θ=0)和非连锁的(unlinked)(θ=0.5)模型。进行模拟使得检测连锁的力量大于Z(θ)2.0的LOD分数阈值的90%,并且假阳性率低于5%。
与遗传性淋巴水肿相关的突变被预期位于SOX18蛋白的功能结构域内。例如,HMG-盒子结构域或者反式激活结构域。示例性的结构域包括导致非保守型替代的错义突变,导致Sox18编码区移码的核苷酸缺失或插入,框架内缺失或插入例如影响功能结构域的那些,或者影响Sox18表达水平的控制序列的改变。
一旦鉴定了Sox18淋巴水肿相关的突变,含有分离的突变的Sox18等位基因的Sox18突变子表达载体就在例如,293T或内皮细胞中表达。Sox18突变体DNA也可以被整合入用于哺乳动物二杂合子系统中的质粒中(例如pGAL4),来测定SOX18与其结合配偶体例如MEF2C(Hosking等,Biochem.Biophys.Res.Comm.287:493-500.2001)的相互作用,或者用来筛选SOX18结合配偶体。例如,pGAL4Sox18载体将Sox18基因连接到酵母Gal4 DNA结合结构域,并且转录激活子被连接到分离的载体中的SOX18结合配偶体。将这些载体共引入宿主细胞中将导致由SOX18与该结合配偶体或候选的结合配偶体的相互作用造成的可监测的报道基因的表达。pCMV-BD和pCMV-AD载体分别含有GAL4 DNA结合结构域和NF-κB转录结构域,可用于该方法中(BD Biosciences Clontech)来构建和表达基因融合物,并且使用萤光素酶报道系统检测SOX18的结合活性。
在这样一个双因子杂合子分析(dihybrid assay)中,含有通过反式激活区影响SOX18结合的突变的Sox18淋巴水肿-相关的突变体将降低萤光素酶报道活性的量,表明Sox18淋巴水肿相关的突变将通过其通过反式激活区结合其结合配偶体的能力的缺陷导致淋巴水肿。
还通过一些技术评估了Sox18等位基因中HMG-box DNA结合区中的突变。在单杂合子实验中评估DNA结合,在该实验中DNA序列与SOX18连接,例如5′-(A/T)(A/T)C氨基酸(A/T)G-3′及其变换,被置于与双杂合子是严重的靶质粒相似的启动子/报道基因构建体之前(即上游或5’端)。报道基因试验随后检测了SOX18蛋白及其推定DNA结合序列之间的结合。DNA结合也使用凝胶?实验(gelshift assay)进行,即将纯化的SOX18蛋白和含有SOX18 DNA结合序列的32P末端标记的DNA片段一同温育。反应产物随后在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行分析,来测定DNA结合的或游离的SOX18的移动性。SOX18多肽对推定的结合位点的特异性是通过使用含有SOX18的结合位点的DNA片段或者寡肽,或者其他无关的DNA序列进行竞争试验确定的。
此外,应用了用于检测DNA/蛋白结合的基于荧光的试验。SOX18 DNA结合是通过检测与DNA或蛋白结合的单个荧光团的荧光测定的。在这些试验中,蛋白结合是通过DNA-蛋白复合体形成时荧光强度或极性的改变测定的。可选地,两种各含有半个该蛋白结合位点地DNA片段产生了。这两个双链DNA片段具有包含部分蛋白结合位点的互补的单链突出端。一个DNA片段用荧光供体标记,而另一个用受体标记,其荧光只能在荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer)(FRET)是检测到。发生蛋白结合时,两个DNA片段的突出端退火并使得荧光供体和受体接近,导致荧光能量的转移,从而使得受体的荧光可被检测。见Heyduk,等,Nat.Biotechnol.20:171-6.2002。
人Sox18基因组合出现淋巴水肿的危险性的关系提供了另一种诊断和/或治疗受到遗传性淋巴水肿影响的个体的方法。阐明与淋巴水肿相关的Sox18突变使得可以确定SOX18蛋白的活性被突变干扰,即DNA结合或蛋白结合,并提供了治疗患有淋巴水肿的病人的指导。
此外,还涉及使用淋巴管生长因子例如VEGF-C和/或VEGF-D治疗患有Sox18-诱导的淋巴水肿的病人,来治疗受损害的淋巴管发育。例如,使用VEGF-C和/或VEGF-D治疗VEGFR-3缺陷的动物克服了VEGFR-3不能起信号作用的缺陷,从而促进了淋巴管生成并缓解了淋巴水肿的症状。Sox18-诱导的淋巴水肿病人用治疗有效量的VEGF-C和/或VEGF-D治疗。在另一个实施方案中,将VEGF-C和/或VEGF-D和其他设计为缓解淋巴水肿症状的治疗联合治疗给药上述病人。
实施例10
VEGF-C和VEGF-D敲除小鼠显示的异常血管发育可以通过给药外源性VEGF-C和/或VEGF-D多肽克服。为确定Sox18转录调节是否能够由于其与VEGFR-3启动子的可能的相互作用,以及对VEGFR-3的转录影响而克服这一缺陷,VEGF-C or VEGF-D敲除小鼠通过和从细胞特异的启动子(例如K-14角蛋白启动子)过度表达Sox18的小鼠进行杂种繁殖,进行遗传杂交。Sox18活性对淋巴水肿的效果通过入实施例10所述测定淋巴水肿和血管发育进行评估。
基因敲出小鼠的存活和VEGF-C和/或VEGF-D敲除/Sox18-过度表达小鼠中淋巴管发育的检测表明Sox18诱导VEGFR-3信号并在淋巴管生成中起关键作用。
VEGF-C过度表达小鼠(K-14-VEGF-C Tg)显示广泛的淋巴管系统网络,并易于发生肿瘤转移,还显示上调的VEGFR-3表达和淋巴水肿症状(美国专利6,361,946)。为确定Sox18是否通过VEGFR-3调节VEGF-C信号,使K-14-VEGF-C Tg小鼠与表达天然突变的Sox18(Ragged突变)的动物或者实验室设计的突变体杂交,产生K-14-VEGF-C Tg/Sox18-/-小鼠,所述突变体是使用定点诱变和本领域已知的技术在SOX蛋白的DNA结合或反式激活区中产生突变构建的。
与K-14-VEGF-C Tg单突变动物相比,K-14-VEGF-C Tg/Sox18-/-双突变动物显示降低的淋巴管生成,降低的肿瘤转移范围,和降低的VEGFR-3水平,表明Sox18分子通过VEGFR-3干扰VEGF-C信号,而且Sox18突变体中VEGFR-3信号的抑制下调了活化的VEGFR-3的淋巴管生成作用。
可选地,K-14-VEGF-C Tg小鼠与过度表达的Sox18等位基因的转基因小鼠(见上文)杂交,并测定Sox18上调的作用。与K-14-VEGF-C Tg单突变动物相比,K-14-VEGF-C Tg/Sox18过度表达的双突变动物显示的淋巴管生成,降低的肿瘤转移范围,和降低的VEGFR-3水平,表明Sox18转录调节抑制VEGFR-3信号,并且很可能是淋巴管生成的负向调节中的因子。
表明Sox18是淋巴管生成的负向调节物的结果提供了一种治疗由广泛的淋巴管系统介导的疾病的方法,例如肿瘤生长或淋巴管肉瘤中的淋巴管生成,所述方法通过给药提供过量的SOX18转录因子的载体,来防止淋巴管生成信号的诱导。
实施例11
SOx18在淋巴管发育中的作用
淋巴管内皮细胞显示独特的由例如VEGFR-3和Prox-1的多种LEC特异性基因高度调节的发育模式。Sox18是DNA结合蛋白和转录因子,预期参与这些LEC特异性基因的调节,与LEC细胞的命运相关。多条证据表明Sox18参与VEGFR-3转录调节,SOX18与小鼠中的转录因子MEF2C结合,Sox18突变体和MEF2C缺陷的小鼠显示于VEGFR-3突变小鼠相似的淋巴水肿症状,而且VEGFR-3启动子含有MEF2C结合位点(Iljin等,FASEB J.15:1028-36.2001)。这些观察支持SOX18在淋巴管发育中的作用。
为分析SOX18影响LEC特异性生长因子的能力,通过加入AdProx-1载体,诱导血管内皮细胞发育成LEC。Sox18 mRNA和蛋白水平在加入所述Prox-1载体前后测定。Sox-18在加入Prox-1载体之后的上调预期和淋巴管内皮细胞的发育相关,表明Sox-18是LEC分化中的因子。可选地,Sox18的DNA结合和反式激活活性被定点诱变破坏,从而产生显性阴性或失活的SOX-18蛋白。含有Sox-18破坏的等位基因的质粒和AdProx-1载体一起被共转染到BEC中,来评估存在无功能Sox-18基因时LEC的发育。LEC特异性标志物例如LYVE-1和podoplanin的检测也用于这些试验中来测定Sox18调节淋巴管发育的能力。此外,突变体Sox-18还和编码LEC特异性蛋白(例如,VEGFR-3,Prox-1,LYVE-1)的载体共转染到293T细胞中,并评估了突变的Sox18调节所述基因的活性的能力。例如,存在或缺乏Sox18的条件下,VEGF-C刺激的VEGFR-3共转染的293T细胞中的信号使用磷酸化试验评估。
淋巴管系统的发育也可以在Sox-18突变小鼠中评估,所述小鼠包括Ra小鼠,Sox18裸鼠,和具有本文所述的与易患淋巴水肿相关的突变的Sox18转基因小鼠。显示淋巴水肿症状的转基因Sox-18小鼠,经改造表达与人突变同源的小鼠基因突变,或者被改造表达含有淋巴水肿特异性突变的Sox-18基因。分析了这些动物中淋巴管系统的发育,如美国专利6,361,946(也见Kaipainen等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),92:3566-70.1995)所述,使用本领域已知的技术,例如原位杂交来检测VEGF-C和/或VEGFR-3 mRNA的表达,检测活体内的a VEGF-C和/或VEGFR-3蛋白的抗体,以及使用Evan’s蓝染料检测来测定LEC发育的程度,并显示活体内有效的琳巴引流。
显性失活的Sox-18突变体转染体中的VEGFR-3信号表明,Sox18表达对VEGFR-3介导的活性有损伤效应。本发明涉及克服这种类型的突变的治疗,包括给药例如人类病人的哺乳动物一种包含SOX18抑制物的组合物,例如显性失活的基因或显性失活的Sox18配体,所述组合物影响SOX18干扰VEGFR-3信号的能力。可选地,如果Sox18活化促进VEGFR-3活性,则表明淋巴水肿的治疗包含促进SOX18转录活性的组合物,例如在活体外给予过度表达Sox18的细胞。
实施例12
SOX18介导的淋巴水肿治疗
本发明的另一方面提供是使用Sox18制备以细胞为基础的治疗组合物,具体是以LEC细胞为基础的组合物。在一个实施方案中,所述细胞是自体细胞,即接受淋巴管系统疾病或病症的治疗的有机体(例如人类病人)的细胞。本发明涉及通过例如同源重组的重组技术增加Sox18的内源性表达,例如通过修饰表达控制区,即启动子。可选地,所述细胞被分离的Sox18即异源性Sxo18转化或转染所述细胞,来进行活体内或者活体外的同源Sox18表达。
例如,SOX18与转录因子MEF2C相互作用,形成的复合物与VEGFR-3启动子结合,从而诱导VEGFR-3转录并影响VEGFR-3蛋白表达和信号水平。预期逆转录病毒或腺病毒载体驱使SOX18基因插入表达LEC的VEGFR-3,从而上调VEGFR-3介导的信号。
这些Sox18表达细胞随后用作治疗性组合物,治疗患有LEC疾病或病症例如遗传性淋巴水肿或外伤诱导的淋巴水肿的病人。这些细胞用于治疗任何与VEGFR-3的表达相关的疾病或病症,例如淋巴管瘤,淋巴管骨髓瘤,淋巴管肌瘤病,淋巴管扩张,淋巴肉瘤,和淋巴管硬化.
此外,将SOX18多肽或多肽片段给药患有淋巴水肿的病人来缓解淋巴水肿的症状。给药的含有DNA结合区或反式激活区的全长SOX18多肽或SOX18的片段,将结合其体内的关联结合配偶体并促进VEGFR-3信号,或者将启动淋巴管生成过程的下游事件,从而回避淋巴水肿相关的VEGFR-3信号或者VEGF-C配体结合的缺陷。
在相关的方面,如果SOX18表达通过降低的转录因子结合或者DNA结合抑制VEGFR-3信号,预期SOX18的抑制将导致VEGFR-3的补偿性上调,减轻与VEGFR-3表达过低相关的有害症状。在Sox18负向调节VEGFR-3活性的情形下,给予对Sox18基因特异的反义治疗将抑制SOX18的活性,从而使VEGFR-3介导信号和淋巴管生长。但由于F组SOX蛋白(SOX7/17/18)的潜在功能性冗余(potentialfunctional redundancy),可能需要通过以至所有F组蛋白的DNA结合活性的机制使所有三种蛋白失活。这一过程是通过例如靶向在所有所述蛋白中高度同源的DNA结合区来实现的。认为重组,表达突变的DNA结合区的SOX7/17/18蛋白作为药物组合物(含有所有三种突变肽)给药时,将抑制SOX18对VEGFR-3的下调,并诱导或促进VEGFR-3信号的活性。从上文可见,尽管本发明的具体实施例是为举例而描述,可进行各种修饰而不偏离本发明的精神和范围。
本发明所有上述美国专利申请公开出版物,美国专利申请,外国专利,外国专利申请和非专利出版物的全文内容都包含在本文中作为参考。
表3
淋巴内皮细胞(187种基因)
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
肺I型细胞膜相关蛋白,podoplanin肺I型细胞膜相关蛋白,podoplanin细胞视黄醇结合蛋白巨噬细胞甘露糖受体(MRC1)转录因子C-MAF转录因子C-MAF含硒蛋白(selenoprotein)PKLA0466,免疫球蛋白超家族,成员3II型膜蛋白,与HIV gp120-结合的C-型凝集素类似,CD209抗原样KIAA0626 | AF030428AI660929M11433M93221AF055376AF055376Z11793AB007935AB015629AB014526 | NM_006474NM_006474NM_002899NM_005360NM_005360NM_005410NM_001542NM_014257NM_021647 | 41870_at41871_at38634_at36908_at41504_s_at41505_ r_at34363_at38086_at39270_at33241_at | AAAAPAAAAA | PPPPPPPPPP | 7.46.17.37.15.13.95.04.94.94.7 | 0.9250.1500.2550.6820.5220.5880.3312.0280.8460.212 | ++ |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
KIAA0711整联蛋白α9整联蛋白α9松弛素H2KIAA0644Cdk-抑制物p57KIP2(KIP2)Cdk-抑制物p57KIP2(KIP2)瞬时受体电压通道(transientreceptor potential channel)TRPC6cDNA DKFZp564O222(来自克隆DKFZp564O222)枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)样蛋白(PACE4),配对的碱性氨基酸裂解系统4G-蛋白信号16调节物, | AB018254D25303D25303X00948AB014544U22398U22398AJ006276AL050002M80482U70426 | NM_014867NM_002207NM_002207NM_005059NM_014817NM_000076NM_000076NM_004621NM_002570NM_002928 | 36453_at1508_at35948_at31732_at34214_at1787_at39545_at36365_at38312_at32001_s_at41779_at | AAAAAAAAAPA | PPPPPPPPPPP | 4.64.33.64.13.93.83.03.83.63.63.6 | 0.0550.7121.0860.4320.8032.0200.1500.9880.8760.3340.673 | ++++++ | ++ | 3.31.4 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
A28-RGS14p二氢嘧啶酶相关蛋白1,脑衰蛋白反应介导物蛋白1粒桥蛋白(DPI,DPII)pendrin,溶质载体(solute carrier)家族,成员4reelin(RELN)整联蛋白,α1整联蛋白,α1胆固醇25羟化酶抑制素β-B亚单位前体KIAA1233前-B细胞刺激因子类似物(SDF1b)V-Erba相关Ear-3蛋白 | D78012AL031058AF030880U79716X68742X68742AF059214M31682AL109724L36033HG3510-HT37 | NM_001313NM_004415NM_000441NM_005045NM_003956NM_002193NM_000609 | 40272_at36133_at36376_at37530_s_at120_at37484_at32363_at38545_at38856_at33834_at1147_at | AAAPPMAPAAP | PPPPPPPPPPP | 3.53.53.33.33.32.43.33.23.13.02.9 | 1.1920.4261.1560.1420.0800.3450.1370.0561.5400.8600.398 | ++RT-PCR | + | 1.01.53.01.7 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
单克隆抗体MRC OX-2鉴定的抗原载脂蛋白DTIMP3,基质金属蛋白酶的组织抑制物TIMP3乙醛脱氢酶1prospero-相关的同源框1(prox 1)基质Gla蛋白神经元pentraxin II(NPTX2)histatin 2(HIS2)内收蛋白(adducin)样蛋白的ADDLmRNA,内收蛋白3(γ)内收蛋白3(γ) | 04X05323J02611U14394U14394K03000U44060AI953789U29195M26665D67031U37122 | NM_001647NM_000362NM_000362NM_000689NM_002763NM_000900NM_000200NM_016824NM_016824 | 37716_at36681_at1035_g_at1034_at37015_at31918_at36683_at35663_at41148_at33102_at33103_s_at | PMAPPAAAAPM | PPPPPPPPPPP | 2.92.92.81.92.82.82.62.62.62.62.4 | 0.2830.1500.5280.2240.2750.2990.2501.2671.0090 2770.397 | ++++++++ | + | 1.0(5,6)2.9 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
转录增强因子2,多肽C(肌细胞增强因子2C)MADS框转录增强因子2,(肌细胞增强因子2C)MADS框转录增强因子2,多肽C(肌细胞增强因子2C)葡萄糖磷酸变位酶5细胞周期蛋白E2白介素7(IL7)白介素7cDNA DKFZp586L0120(来自克隆DKFZp586L0120)过氧化物酶体增生活化的受体(peroxisome proliferative activatedreceptor),γ,PPARG | L08895S57212L40933AF102778M29053J04156AL050154L40904 | NM_002397NM_002397NM_002397NM_021965NM_004702NM_000880NM_005037 | 37710_at37712_g_at37711_at33694_at35249_at33966_at1159_at38351_at37104_at | AAAAAAAPA | PPPPPPPPP | 2.51.91.42.52.52.41.92.42.4 | 0.5400.1970.4420.4310.9060.1910.9210.1350.502 | +++ | 5.8 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
脂肪酸结合蛋白4蛋白激酶Cζ46kDa柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)蛋白来自7q35-qter的PAC克隆RP4-751H13,锌指样胸腺嘧啶激酶1,可溶胸腺嘧啶激酶1Pig7(PIG7),LPS诱导的TNF-α因子LPS诱导的TNF-α因子脂肪酶A,溶酶体酸,胆固醇酯酶泛素特异性蛋白酶13(异肽酶T-13) | 氨基酸128249Z15108Y07593AC004877M15205K02581AF010312AL120815X76488U75362 | NM_001442NM_002744NM_001338NM_003258NM_003258NM_004862NM_004862NM_000235NM_003940 | 38430_at362_at37534_at39837_s_at910_at41400_at37024_at37025_at38745_at40701_at | PPPAPMAPPA | PPPPPPPPPP | 2.42.42.32.32.31.72.31.32.32.2 | 0.1320.0080.1370.7140.2050.1930.2330.3270.2810.334 | 2.22.11.44.63.8 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(胆汁糖蛋白)CEACAM1cDNA DKFZp586D0918(来自克隆DKFZp586D0918)KIAA0598,B细胞RAG相关蛋白RAMP2(受体(降钙素)活性修饰的蛋白2)胆固醇酯转移蛋白前体上皮膜蛋白2MHC II型淋巴细胞抗原(HLA-DP)β链MHC II型淋巴细胞抗原(HLA-DP)β链β-抑制蛋白(抑制蛋白)2有丝分裂检验点激酶Bub1 | X16354AL049370AB011170AJ001015M30185U52100M83664M83664AF106941AF053305 | NM_001712NM_014863NM_005854NM_000078NM_001424NM_002121NM_002121NM_004313NM_004336 | 988_at41856_at35350_at38177_at40741_at39631_at38095_i_at38096_f_at33283_at41081_at | PPPPAPAAAA | PPPPPPPPPP | 2.22.12.12.12.12.02.01.22.02.0 | 0.0480.3850.1540.3610.1910.1411.3680.0340.2730.195 | 1.0 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
(BUB1)KIAA0229,与人锚蛋白1(S08275)相似Sprouty 1同源物(FGF信号的拮抗物)Rap1的鸟苷酸核苷酸交换因子;M-Ras-调节的GEF,KIAA0277translin红细胞膜蛋白带4.9(dematin)KIAA0846蛋白神经胶质成熟因子,γ胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)平滑肌肌球蛋白重链同种型Smemb | D86982AF041037X78627U28389AB020653W07033X16302S67247 | NM_012294NM_004622NM_001978NM_015376NM_004877NM_000597 | 40971_at38767_at38062_at36177_at37192_at34748_at35261_at40422_at32838_at | PPPAPAPAA | PPPPPPPPP | 2.02.02.02.02.02.01.91.91.9 | 0.1950.2090.4970.1400.2650.4570.0831.1570.179 | 1.62.11.91.0 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
TTG-2(具有LIM基序的富含半胱氨酸的蛋白),LIM区only 2(rhombotin样1)细胞周期蛋白B2KIAA0353KIAA0559,piccolo(突触前细胞基质蛋白)G蛋白偶联的受体,家族C,组5,成员BG蛋白偶联的受体,家族C,组5,成员BCREM(环AMP-反应性元件调节物β同种型)CREM(环AMP-反应性元件调节物β同种型) | X61118AL080146AB002351AB011131AC004131AI801872S68134S68134 | NM_005574NM_004701NM_016235NM_016235NM_001881NM_001881 | 32184_at32263_at39544_at37780_at40240_at40239_g_at32066_g_at32065_at | PAPAPPPP | PPPPPPPP | 1.91.91.91.91.91.41.91.8 | 0.2210.2760.1580.3300.0470.3030.0980.241 | 1.01.82.11.72.0 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
CREM(环AMP-反应性元件调节物β同种型)假想蛋白FLJ13110肌醇(myo)-1(或4)-单磷酸酶2KIAA0937蛋白有丝分裂纺锤体卷曲螺旋(coiled-coil)相关蛋白富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白2(CSRP2)拓扑异构酶(DNA)IIα(170kD)DNA拓扑异构酶II蛋白磷酸酶抑制物2(PPP1R2)KIAA0186双重特异性酪氨酸(Y)-磷酸化调 | S68271AL080222AF014398AB023154AF063308U57646AI375913J04088U68111D80008Y12735 | NM_001881NM_022912NM_014214NM_006461NM_001321NM_001067NM_001067NM_021067NM_003582 | 32067_at36096_at36496_at35369_at32120_at41401_at40145_at1592_at33180_at39677_at39931_at | PAAPAAPPPAP | PPPPPPPPPPP | 1.51.91.81.81.81.81.81.21.81.81.8 | 0.1820.3870.5900.1850.2570.4310.2390.1620.3190.2690.146 | 2.03.24.31.01.4 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
节激酶3(Dyrk3)驱动蛋白样纺锤蛋白HKSP(HKSP)亨廷顿(Huntingtin)相关蛋白反应蛋白(duo)diubiquitinbikunin,丝氨酸蛋白酶抑制物,Kunitz型,2细胞色素P-450-1(TCDD-可诱导的)细胞色素P(1)-450KIAA0513蛋白磷酸酶抑制物2(PPP1R2)RAMP3(受体(降钙素)活性修饰蛋白3) | U37426U94190AL031983U78095K03191X02612U68111AJ001016 | NM_004523NM_003947NM_006398NM_021102NM_000499NM_000499NM_014732NM_005856 | 40726_at40655_at39959_at34348_at36767_at1025_g_at38735_at812_at35152_at | MPAAAPAPP | PPPPPPPPP | 1.81.81.81.81.71.11.71.71.7 | 0.4390.5290.8410.3980.1650.1250.2970.1850.228 | 1.42.01.7 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
B-mybKIAA0952干扰素刺激的基因(20kD),HEM45GS3955GS3955GRB2相关的接合体(adaptor)蛋白(Grap)KIAA1071蛋白具有多重剪接(multiple splicing)的RNA结合蛋白基因,RBP-MS/类型5具有多重剪接的RNA结合蛋白基因,RBP-MS/类型5RBP-MS/类型4,具有多重剪接 | X13293AB023169U88964D87119D87119U52518AB028994D84111D84111D84110 | NM_002466NM_014962NM_002201NM_021643NM_021643NM_006613NM_006867NM_006867NM_006867 | 1854_at37755_at33304_at717_at40113_at805_at38286_at34162_at34163_g_at1276_g_at | MPAPPAAPPP | PPPPPPPPPP | 1.71.71.71.71.31.71.71.71.61.5 | 0.4550.2540.1780.1070.0980.1470.6250.3470.1470.263 | 2.31.01.61.3 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
的RNA结合蛋白基因RBP-MS/类型4,具有多重剪接的RNA结合蛋白基因RBP-MS/类型3,具有多重剪接的RNA结合蛋白基因α-辅肌动蛋白-2相关的LIM蛋白semaphorin-III(Hsema-I),semaphorin 3A含IQ基序的GTPase活化蛋白2抑制蛋白,B2视网膜母细胞瘤相关蛋白HECLIM区结合蛋白(LDB1)双重特异性磷酸酶5人cDNA3’,mRNA序列 | D84110D84109AF002282L26081U51903HG2059-HT2114AF017790AF052389U15932AI557322 | NM_006867NM_006867NM_014476NM_006080NM_006633NM_006101NM_001290NM_004419 | 38049_g_at38047_at39690_at33461_at1647_at957_at40041_at36065_at529_at39611_at | PPAAMPPPPP | PPPPPPPPPP | 1.31.21.71.61.61.61.61.61.61.6 | 0.2680.2250.7280.4450.3950.3420.1530.1530.2070.081 | 1.52.01.9 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
单胺氧化酶A(MAOA)单胺氧化酶ANECDIN相关蛋白调节(regulatory)溶质载体蛋白,家族1,成员1TTK蛋白激酶fms相关的酪氨酸激酶4,VEGFR-3TSC403,与溶酶体相关的膜糖蛋白类似HMG-2人克隆24416 mRNA序列降钙素受体样KIAA0582蛋白 | M68840氨基酸420624U35139X82877M86699X69878AB013924X62534AF052159L76380AI761647 | NM_000240NM_000240NM_002487NM_006511NM_003318NM_002020NM_014398NM_005795NM_015147 | 41772_at41771_g_at36073_at31695_g_at572_at403_s_at37168_at38065_at35342_at34995_at40191_s_at | PPPAPAPPPPM | PPPPPPPPPPP | 1.61.41.61.61.61.51.51.51.51.51.5 | 0.1480.2300.2450.9160.1960.4030.1640.1050.2530.5090.558 | + | + | 1.11.11.41.4 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
cDNA DKFZp434B102(来自克隆DKFZp434B102)cDNA DKFZp586G1922(来自克隆DKFZp586G1922)乙酰-CoA合酶3脂肪酸辅酶A接合酶,长链3STAT诱导的STAT抑制物-2同源异型蛋白Hox5.4假想蛋白FLJ13910,cDNADKFZp586M141(来自克隆DKFZp586M141)cDNA DKFZp586N012(来自克隆DKFZp586N012)UbcH10,泛素载体蛋白E2-C | AL080192AL080110D89053氨基酸977580AF037989HG3502-HT3696AL050139AL049471U73379 | NM_004457NM_004457NM_022780NM_007019 | 38630_at39600_at33880_at33881_at38994_at696_at36580_at41690_at1651_at | APPPAPPPP | PPPPPPPPP | 1.51.51.51.01.51.51.51.41.4 | 0.7190.1600.2640.1200.3910.1810.2280.3200.022 | 1.71.1 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
细胞周期蛋白依赖的激酶抑制物3,蛋白酪氨酸磷酸酶(CIP2)糖原磷酸化酶(PYGL)造血因子-2造血因子-2叉头盒(forkhead box)M1可能的异戊二烯化的蛋白酪氨酸磷酸化酶hPRL-3RAB31,Rab亚家族的Low MrGTP结合蛋白RAB31,RAS原癌基因家族成员肌球蛋白VILAGrb2-相关结合物-1,与IRS-1相关的停靠(docking)蛋白 | L25876AF046798AF004327AF004327U74612AF041434U59877AI189226U39226U43885 | NM_005192NM_001147NM_001147NM_021953NM_007079NM_006868NM_006868NM_000260NM_002039 | 1599_at37215_at1951_at37461_at34715_at36008_at33371_s_at33372_at33197_at1249_at | PPPPMAPPPA | PPPPPPPPPP | 1.41.41.41.21.41.41.41.21.41.4 | 0.4310.4230.1750.1340.3670.0940.2990.4440.0380.073 | ++ | 1.51.21.42.31.2 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
核纤层蛋白B1微型染色体保持缺陷的(mis5,S.pombe)6 HsMcm6细胞周期蛋白B1细胞周期蛋白B1RTP,N-myc下游调节的α2,3-唾液酸转移酶ADP-核糖基化因子样蛋白4中心粒蛋白F(350/400kD,分裂激素)亲代表达的10,KIAA1051微管蛋白,α1(睾丸特异性)KIAA0101KLAA0128,septin 2蛋白磷酸酶2,调节性亚基B | L37747D84557M25753M25753D87953AB022918U73960U30872AB028974X06956D14657D50918Z69030 | NM_005915NM_006096NM_006100NM_005738NM_016343NM_015068NM_014736NM_002719 | 37985_at40117_at1945_at34736_at36933_at39298_at33796_at37302_at39696_at36591_at38116_at38826_at40785_g_a | PPPPPPPAPMPPP | PPPPPPPPPPPPP | 1.41.41.41.31.41.41.41.41.41.41.41.41.4 | 0.6430.1700.3980.1600.1310.1500.2810.2450.3000.3000.4090.3810.453 | 1.84.21.81.8 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
(B56),γ脱氧胞苷激酶整联蛋白β3结合蛋白(β3-内联蛋白)TAL1(SCL)中断位点KIAA0666cAMP-特异性磷酸二酯酶8A,PDE8A1有丝分裂检验点激酶Mad3L(MAD3L),BUB1B核糖体S6激酶HPTPε(蛋白酪氨酸磷酸酶ε)Lyn酪氨酸激酶,v-yes-1Yamaguchi肉瘤病毒相关的原癌基因同源物 | M60527U37139M74558AB014566AF056490AF053306X85106X54134M79321 | NM_000788NM_014288NM_003035NM_001211NM_021135NM_006504NM_002350 | t886_at38501_s_at32767_at33753_at37676_at35699_at32892_at32916_at2024_s_at | APMPPPPPP | PPPPPPPPP | 1.31.31.31.31.31.31.31.31.3 | 0.4550.1710.1500.3560.2220.2160.1450.1000.054 | + | 1.61.0 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
lyn酪氨酸激酶,v-yes-1Yamaguchi肉瘤病毒相关的原癌基因同源物lyn酪氨酸激酶brachyury变体A(TBX1),T-盒(box)1转录因子单克隆抗体Ki-67的抗原的mki67amRNA(长链型)蛋白酪氨酸磷酸酶受体pi(PTPRP)cbl-b细胞周期蛋白A2核苷磷酸化酶TNF-相关的凋亡诱导配体TRAIL磷酸二酯酶4B,cAMP-特异性 | M16038M16038AF012130X65550U81561U26710X51688X00737U37518L20971 | NM_002350NM_002350NM_005992NM_002417NM_002847NM_004351NM_001237NM_000270NM_003810NM_002600 | 1402_at32616_at32285_g_at418_at36160_s_at514_at1943_at430_at1715_at33705_at | PPPAPAPPPP | PPPPPPPPPP | 1.31.21.31.31.31.31.31.31.31.3 | 0.3820.0660.3520.3570.1930.4820.2770.2720.3160.275 | ++ | 1.5 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
巢蛋白(议定菌素)HYA22蛋白磷脂酸磷酸酶2A型KIAA0512.ALEX2血栓烷A2受体三叶(trefoil)因子3(小肠)G-2和S期表达的1(G-2和S期表达的1)ADP-核糖基转移酶(NAD+;多(ADP-核糖)聚合酶)-样2丝氨酸/苏氨酸激酶12微管蛋白,A1,同种型44核纤层蛋白B受体 | M30269D88153AF014402AB011084D38081AI985964AL031588AJ236876AF015254HG2259-HT2348L25931 | NM_002508NM_005808NM_003711NM_014782NM_001060NM_003226NM_016426NM_005484NM_004217NM_002296 | 35366_at40196_at34797_at36057_at336_at37897_s_at41660_at34756_g_at33266_at330_s_at288_s_at | PPPPMPAMPPP | PPPPPPPPPPP | 1.31.31.31.21.21.21.21.21.21.21.2 | 0.0500.1500.1910.2680.3850.1830.4240.3620.1260.0960.141 | 1.32.43.11.11.1 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
KIAA0429转录因子4多配体聚糖3(N-多配体聚糖),KIAA0468RECK蛋白前体推定的前列腺癌肿瘤抑制物蛋白磷酸酶1,调节性(抑制物)亚基PDZ和LIM区1(elfin)假想蛋白来自克隆643p53-调节的DDA3KIAA0062中链乙酰辅酶A脱氢酶间隙连接蛋白,α1,43kD(连接 | AB007889M74719AB007937氨基酸099265U42349AB020630U90878AF091087氨基酸926959D31887M91432M65188 | NM_014751NM_003199NM_014654NM_021111NM_006765NM_020992NM_020467NM_000165 | 37363_at36605_at32092_at35236_g_at36852_at41577_at36937_s_at34176_at37347_at38797_at37532_at2018_at | PPPPPPPPPPPP | PPPPPPPPPPPP | 1.21.21.21.21.11.11.11.11.11.11.11.1 | 0.1500.0500.2060.1730.0820.0820.0960.0960.0580.0580.3080.329 | 2.51.11.01.11.1 |
保藏号 | 缺失1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
蛋白(connexin)43)MyoD家族抑制物核酸内切/外切酶Mre11(MRE11A)核受体超家族2,F组,1号成员(nuclear receptor subfamily 2,groupF,成员1) | U78313AF073362X16155 | NM_005586NM_005591NM_005654 | 38156_at32869_at39294_at | PPA | PPP | 1.11.11.0 | 0.3810.6420.446 |
1一种测定,表明转录子是否被检测到(存在,P),未检测到(缺失,A),或勉强检测到(勉强,M;如果一次试验中为P,另一次为A也用M表示)。
2两种独立采集的BEC和LEC(=共4组比较)的转录子的表达水平的变化。以log2比值表示所述变化。
3所述表达水平(四组比较)变化的标准偏差。
NB=Northern印记,IF=免疫荧光
表4
血管内皮细胞(222基因)
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
p27 mRNA,干扰素α-诱导的蛋白27核糖核酸酶A(RNase A),胰腺的造血性神经膜蛋白(hematopoietic neural membraneprotein)(HNMP-1)N-钙粘着蛋白N-钙粘着蛋白白介素8(IL8)白介素8,β-血小板球蛋白样蛋白前体 | X67325D26129U87947M34064M34064M28130M17017 | NM_005532NM_002933NM_001425NM_001792NM_001792NM_000584NM_000584 | 425_at37402_at39182_at2054_g_at2053_at1369_s_at35372_r_at | PPPPPPP | AAAAPAP | 8.37.25.95.73.75.32.8 | 0.6200.2080.3811.3450.5141.4770.406 | ++ | ++ | 1.52.71.61.1 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
酪氨酸激酶受体(axl)酪氨酸激酶,受体Axl,Alt.Splice2细胞表面糖蛋白CD44(CD44)细胞粘附分子(CD44)透明质酸受体(CD44)血管内皮生长因子相关蛋白VRP,VEGF-C血管内皮生长因子C胶原蛋白XIII型,α1(=COL4A2)胶原蛋白XIII型,α-1胶原蛋白α-2,I型胶原蛋白α-2,I型 | M76125HG162-HT3165L05424M59040L05424U43142X94216M33653M59217K01079K01079 | NM_001699NM_000610NM_005429NM_005429NM_005203NM_005203 | 38433_at1278_at1126_s_at2036_s_at40493_at159_at1934_s_at38952_s_at38951_at32306_g_at32305_at | PPPPPPPPPPP | AAAAPAAAAAA | 5.14.74.91.91.94.64.44.53.64.52.8 | 1.1120.9371.5270.4020.1360.8501.3420.2131.6832.1611.464 | ++++ | 1.01.11.92.62.02.71.1 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
胶原蛋白,I型,α2蛋白多糖1磷酸脂肪酶A2,组IVA,钙依赖的磷脂结合蛋白(PLA2)碳水化合物(硫酸角蛋白Gal-6)磺基转移酶原肌球蛋白2(β),原纤维细胞原肌球蛋白硫酸软骨素蛋白多糖2(多能聚糖)硫酸软骨素蛋白多糖2(多能聚糖)潜在的转化长因子r-β结合蛋白(LTBP-2)白介素6(干扰素,β2) | V00503X17042M72393AB003791M12125X15998X15998Z37976X04430 | NM_000089NM_002727NM_003654NM_003289NM_004385NM_004385NM_000428NM_000600 | 32307_s_at32227_at35938_at41 395_at32314_g_at38111_at38112_g_at37906_at38299_at | PPPPPPPPP | APAPAAAPA | 2.44.34.34.24.24.12.04.14.0 | 1.3940.3852.3980.2321.8451.7461.2190.3810.776 | 1.01.91.51.12.0 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)骨形态发生蛋白2B,BMP-4sarcolectin,角蛋白7神经元细胞粘附分子,KIAA0343神经元细胞粘附分子,hBRAVO/Nr-CAM前体基质金属蛋白酶1(基质胶原酶),皮肤胶原酶干细胞因子,KIT配体uPA纤溶酶原激活物-1纤溶酶原激活物1selectin P,CD62,颗粒膜蛋白-140(GMP-140)前体 | U43842M22490AJ238246AB002341U55258M13509M59964X02419J03764M14083M25322 | NM_001202NM_001202NM_005556NM_005010NM_005010NM_002421NM_000899NM_002658NM_000602NM_000602NM_003005 | 40333_at1114_at41294_at37286_at37288_g_at38428_at597_at37310_at672_at38125_at40366_at | PPPPPPPPPPP | AAPAAPAAPPP | 4.02.63.93.91.53.93.93.83.72.93.6 | 0.8831.1460.6311.6420.3090.5210.5540.2820.1610.1181.869 | ++ | 1.83.01.61.91.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
latrophilin-2肌动蛋白,α2成纤维细胞活化蛋白,αG蛋白信号10的调节物20IGF-II mRNA-结合蛋白3视网膜cDNA随机引物亚文库,EST脑酸可溶性蛋白1,神经元组织富集的酸性蛋白(NAP-22)抑制蛋白2抑制蛋白2Na,K-ATPaseβ-1亚基Claudin-7正常牙龈(normal gingiva) | AJ131581X13839U09278AF060877U97188W28438AF039656AL096719L10678U16799AJ011497U51712 | NM_012302NM_001613NM_004460NM_003702NM_006547NM_006317NM_002628NM_002628NM_001677NM_001307 | 34174_s_at32755_at39945_at41086_at37558_at36497_at32607_at38839_at38840_s_at37669_s_at38482_at39698_at | PPPPPPPPPPPP | APAAPAAPPAAA | 3.63.63.63.53.53.53.43.43.13.43.43.4 | 0.0981.0670.7890.6150.5280.4140.1040.1110.0760.2490.7980.391 | 1.11.22.11.61.61.61.1 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
分解蛋白(disintegrin)和金属蛋白酶(metalloproteinase)结构域23α1(VIII)胶原蛋白的COL8A1mRNA信号转导物和转录激活物6(STAT6)转录因子IL-4 Stat,STAT6脂皮质蛋白-III,膜联蛋白A3细胞内粘附分子1(CD54),主要组(major group)鼻病毒受体前体溶质载体家族1(神经/上皮高亲合力谷氨酸转运子,系统Xag)溶质载体家族1(神经/上皮高亲合力谷氨酸转运子,系统Xag) | AB009672X57527AF067575U16031M20560M24283U08989AI928365 | NM_003812NM_001850NM_003153NM_005139NM_000201NM_004170NM_004170 | 40350_at37459_at41222_at845_at31792_at32640_at38268_at38267_at | PPPPPPPP | AAPAPAAA | 3.43.33.32.13.33.23.22.6 | 0.6000.8190.3380.4930.2650.1840.6870.524 | ++++ | ++ | 1.71.81.61.11.31.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
p53诱导的蛋白二氢嘧啶脱氢酶,DPYD自然杀伤细胞转录物4PFTAIRE蛋白激酶1,KIAA0834RGP4,G蛋白信号调节物4G蛋白信号调节物4原癌基因Aml1-Evi-1,融合活化的原癌基因Aml1-Evi-1,融合活化的腺苷酸环化酶相关蛋白2clusterin(补体裂解抑制物,SP-40,40,硫酸糖蛋白2,载脂蛋白J)ADP核糖基化因子样7 | L47738U20938氨基酸631972AB020641U27768AI267373HG4058-HT4328HG4058-HT4328N90755M25915AB016811 | NM_000110NM_004221NM_012395NM_005613NM_005613NM_006366NM_001831NM_005737 | 37579_at38220_at39119_s_at36502_at34272_at34273_at1882_g_at1881_at33405_at36780_at39829_at | PPPPPPPPPPP | AAPAAAMAAPA | 3.23.23.13.13.02.62.92.02.82.82.7 | 0.2490.3060.0820.8410.3960.4730.5900.3740.5960.1610.531 | 1.01.61.51.51.51.5 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
H因子(补体)样1RNA解旋酶相关的蛋白,金属硫蛋白-If活化的反式肌动蛋白g因子(50kDa)Staf50环加氧酶-2(hCox-2)GRO1原癌基因,黑素瘤生长刺激活性(MGSA)NRGN,neurogranin小鼠dkk-1同源物胃肠道肿瘤相关抗原GA733-1,肿瘤相关的钙信号转导物2层粘连蛋白transgelin,22kDa平滑肌蛋白(SM22) | M65292H68340X82200U04636X54489X99076AB020315J04152Z15008M95787 | NM_002113NM_007372NM_006074NM_000963NM_001511NM_006176NM_002353NM_005562NM_003186 | 32249_at41446_f_at36825_at1069_at408_at33925_at35977_at291_s_at35280_at36931_at | PPPPPMPPPP | APAAAAAPAA | 2.72.72.72.62.62.62.52.52.52.5 | 0.5890.2960.7301.2810.3691.2370.3980.1390.8240.980 | 6.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
编码单核细胞分泌蛋白的JE基因锌指蛋白238,RP58组织蛋白酶C组织型凝血酶原激活物(t-PA)寿司重复蛋白膜联蛋白A6EphrinB1EphrinB1TFEC同种型(转录因子EC)小的可诱导细胞因子A2,(单核细胞趋化蛋白1)小的可诱导细胞因子A2(单核细胞趋化蛋白1)内皮细胞蛋白C/APC受体 | M28225AJ223321X87212M15518AF060567D00510U09303U09303D43945M26683M26683L35545 | NM_006352NM_001814NM_000930NM_014467NM_001155NM_004429NM_004429NM_012252NM_002982NM_002982NM_006404 | 34375_at35824_at133_at33452_at37805_at39082_at39721_at188_at34470_at875_g_at874_at647_at | PPPPPPPPPPPP | PAPAAAAAAPAP | 2.42.42.42.42.42.42.41.22.42.31.22.3 | 0.1860.4980.2440.4790.6700.1810.9460.4890.0280.2830.3850.259 | 3.63.21.23.13.52.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
(EPCR)转谷氨酶(transglutaminase)2(TGase)转谷氨酶(transglutaminase)(TGase)人金属硫蛋白-If转化生长因子β诱导的(BIGH3)神经元特异性(γ)烯醇酶的ENO2基因FAT肿瘤抑制物(果蝇(Drosophila))同源物恶性细胞表达增强的基因/肿瘤进展增强的基因恶性细胞表达增强的基因/肿瘤进展增强的基因 | M55153M55153M10943M77349X51956X87241S82470S82470 | NM_004613NM_004613NM_000358NM_005245NM_024298NM_024298 | 231_at38404_at31622_f_at1385_at40193_at40454_at181_g_at180_at | PPPPPPPP | MPMAAAPA | 2.31.62.32.32.32.32.21.7 | 0.4130.0930.2300.9510.1211.20404690.420 | 1.6 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
cDNA DKFZp566G0746(来自克隆DKFZp566G0746)赖氨酰氧化酶样2ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物2(rho家族,小GTP结合蛋白Rac2)内皮白细胞粘附分子1(ELAM-1),selectin E层粘连蛋白,α5,KIAA0533胎盘生长因子(PlGF)来自染色体的ALL1融合基因1q,AF1q溶基质素-2,MMP-10金属硫蛋白-I-A胶原蛋白VIα-1 | AL050078U89942M64595M24736AB011105X54936U16954X07820K01383X15880 | NM_002318NM_002872NM_000450NM_002632NM_006818NM_002425 | 39324_at33127_at32737_at265_s_at41610_at793_at36941_at1006_at31623_f_at38722_at | PPPPPPPPPP | APPAPPPPPA | 2.22.22.22.22.22 22.22.12.12.1 | 1.2810.2740.1430.4480.1460.3010.5920.1590.2380.898 | + | 3.51.01.0 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
mad蛋白同源物(hMAD-3)mad蛋白同源物(hMAD-3)mad蛋白同源物(hMAD-3)膜整合蛋白2A白介素1受体样1高度活动性组(非组蛋白染色体)蛋白同种型I-C(HMGI-C)表皮生长因子r受体激酶底物(Eps8)乳酸脱氢酶B未知产物的mRNA假想蛋白DKFZp564D0462赖氨酰羟化酶同种型2(PLOD2)follistatin样3,follistatin相关蛋白 | U68019U68019U68019AL021786D12763X92518U12535X13794D29810AL033377U84573U76702 | NM_005902NM_005902NM_005902NM_003856NM_004447NM_002300NM_000935NM_005860 | 1433_g_at38944_at1454_at40775_at40322_at35200_at1467_at33819_at40227_at36014_at34795_at33900_at | PPPPPPPPPPPP | AAAPAAAPAAPA | 2.11.82.02.12.12.02.02.02.02.02.02.0 | 0.2690.3670.3040.5700.7180.1770.7100.0291.1700.1370.1570.075 | 1.11.41.01.61.12.6 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
(FLRG)人克隆24674 mRNA序列L-艾杜糖醇-2脱氢酶神经元pentraxin 1来自克隆23549和23762的假想蛋白UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶锌指蛋白185(LIM区)四个半LIM结构域2,心蛋白(FHL-2)有丝分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶3,MAPKAP激酶(3pK)金属硫蛋白1E(功能型)TU3A蛋白 | AF070578L29254U61849U90908AB011004Y09538U29332U09578R92331AF035283 | NM_002522NM_021226NM_003115NM_007150NM_001450NM_004635NM_007177 | 36758_at38763_at37921_at34010_at41242_at32139_at38422_s_at1637_at36130_f_at38044_at | PPPPPPPPPP | AAAAPAPAPA | 2.01.91.91.91.91.81.81.81.81.8 | 0.6120.1400.7440.8700.3420.0620.2290.4540.1310.298 | 1.82.51.61.41.8 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
金属硫蛋白1H鸟氨酸结合蛋白同种型II(GBP-2)可溶性血管内皮细胞生长因子r受体1(sVEGFR-1)R-RasR-ras肌氨酸转运物(SLC6A8),可溶性载体家族6,成员8myb1(小鸡)同源物靶点,血红素加氧酶1(HO-1)前胶原-赖氨酸,2-氧化戊二酸5-双加氧酶,赖氨酰羟化酶(PLOD)KIAA0836 | R93527M55543U01134M14949M14949U36341Z82244L06419AB020643 | NM_005951NM_004120NM_002019NM_005629NM_005488NM_000302 | 39594_f_at32700_at1 964_g_at38338_at1879_at40926_at33802_at36184_at33296_at | PPPPPPPPP | PPMPPAPPP | 1.81.81.81.81.21.81.81.81.8 | 034150.3040.3840.1190.3300.3050.1490.3100.203 | + | 1.11 51.8 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NBIF | 信号对数比 | ||||||
cDNA DKFZp434C171(来自克隆DKFZp434C171)白介素4受体的IL-4-R mRNA趋化因子(C-C基序)受体样2(CCRL2),趋化因子受体X(CKRX)磷酸脂肪酶C,β3(磷脂酰肌醇特异性)LIM区蛋白蛋白激酶(cAMP-依赖的,催化的)抑制物βrho GDP解离抑制物2KIAA0975,咪唑受体候选物(candidate)脊髓灰质炎病毒受体 | AL080169X52425AF014958Z16411X93510M34181X69549AB023192X64116 | NM_000418NM_003965NM_000932NM_003687NM_002731NM_001175NM_007184NM_006505 | 34183_at404_at1445_at364_s_at32610_at36215_at1984_s_at33916_at32698_at | PPPPPPPPP | APAAPAPAP | 1.81.71.71.71.71.71.71.71.7 | 0.6060.2440.3860.0980.0670.3150.1630.3430.173 | 1.21.81.91.02.4 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
脊髓灰质炎病毒受体即刻早期反应(immediate earlyresponse)3金属硫蛋白2A原肌球蛋白1(α)原肌球蛋白1(α)原肌球蛋白1(α)TRAM样蛋白E3泛素接合酶SMURF2含EGF的fibulin样细胞外基质蛋白1G蛋白偶联的56c-jun第一(proto)原癌基因(JUN)G蛋白信号调节物10,RGS10 | X64116S81914A1547258M19267Z24727M19267D31762氨基酸630312U03877AJ011001J04111AF045229 | NM_006505NM_003897NM_005953NM_000366NM_000366NM_000366NM_012288NM_022739NM_004105NM_005682NM_002228NM_002925 | 32699_s_at1237_at39081_at36791_g_at36792_at36790_at40051_at33354_at32551_at35769_at32583_at33121_g_a | PPPPPPPPPPPP | PPAPPPpPPPAA | 1.31.71.71.61.41 21.61.61.61.61.61.6 | 0.1020.1710.2470.1840.0940.2130.2440.2440.1520.0750.3770.064 | 1.01.31.12.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
β淀粉样蛋白(A4)前体蛋白结合的,家族B,成员2(Fe65样)ras相关的rho蛋白蛋白酶体(prosome,macropain)26S亚基,非-ATPase,10KIAA0537溶酶体相关的膜蛋白-2磷脂转移蛋白N-豆蔻酰转移酶2磷酸果糖激酶(PFKM)整联蛋白,β4leupaxin内皮素转化酶1野生型p53活化的片段 | U62325M12174AL031177AB011109X77196L26232AF043325U24183X53587AF062075Z35307U03106 | NM_004040NM_002814NM_014840NM_002294NM_006227NM_004808NM_000289NM_000213NM_004481NM_001397NM_000389 | t40148_at1826_at37957_at33787_at38403_at40081_at41656_at36196_at406_at36062_at41726_at2031_s_at | PPPPPPPPPPPP | PPAPPPPPAAPP | 1.61.61.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5 | 0.3120.2810.2650.1350.4320.0460.0380.3740.1950.2310.1800.399 | 1.31.41.82.01.3 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
-1(WAF1),细胞周期蛋白依赖的激酶抑制物1A(p21,Cip1)ICAM-2,LFA-1的细胞粘附配体ICAM-2,LFA-1的细胞粘附配体细胞间粘附分子2(ICAM-2)真核细胞翻译起始因子2B,eIF-2Bβ亚单位鸟苷磷酸化酶整联蛋白,β5N-磺基葡糖胺磺基水解酶(磺酰胺酶)synaptojanin 2金属硫蛋白1L巨噬细胞加帽蛋白,凝溶胶蛋白 | X15606X15606M32334AF035280X90858X53002U30894AF039945氨基酸224832M94345 | NM_000873NM_000873NM_014239NM_003364NM_002213NM_000199NM_002450NM_001747 | 38453_at38454_g_at590_at40515_at37351_at39754_at35626_at36532_at39120_at38391_at | PPPPPPPPPP | PPPPMPPAAP | 1.51.51.41.51.51.51.51.51.41.4 | 0.0240.1530.1520.1080.0640.0680.0770.1640.6640.281 | 1.52.01.51.1 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
样HSPC022蛋白人克隆137308 mRNA,部分cds原钙粘着蛋白42,PC42,原钙粘着蛋白1(钙粘着蛋白样1)caspase样凋亡调节性蛋白2(CLARP2)caspase样凋亡调节性蛋白2(CLARP2)主要穹隆(major vault)蛋白,lrp范可尼贫血(Fanconi anemia),互补组G月元病毒蛋白(PrP)干扰素刺激的蛋白,15kDa丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制 | W68830AW006742L11370AF005775AF005775X79882AC004472U29185氨基酸203213L40377 | NM_014029NM_002587NM_003879NM_003879NM_005115NM_004629NM_000311NM_005101NM_002640 | 32736_at38207_at37562_at1867_at1868_g_at38064_at33842_at36159_s_at38432_at36312_at | PPPPPPPPPP | PAAPPPAPAA | 1.41.41.41.41.21.41.41.41.41.3 | 0.0620.4420.1660.3630.3250.2520.2330.3420.2440.360 | 2.71.52.21.01.12.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
物,分化枝B(卵清蛋白),细胞质抗蛋白酶2(CAP2)双糖链蛋白聚糖趋化因子(C-X-C基序),受体4(fusin)泛素羧基末端酯酶L1(泛素硫酯酶)KIAA0469TNF(配体)超家族,成员4(tax-转炉活化的糖蛋白1,34kD)KIAA1053NAD(P)H-醌氧化还原酶含寿司重复的蛋白整联蛋白,α5enigma(LIM区蛋白) | J04599L06797X04741AB007938AL022310AB028976M81600U61374X06256L35240 | NM_001711NM_003467NM_004181NM_014851NM_003326NM_006307NM_002205NM_005451 | 38126_at649_s_at36990_at37230_at32319_at40855_at38066_at31855_at39753_at39530_at | PPPPPPPPPP | PPPPAPPPPP | 1.31.31.31.31.31.31.31.31.31.3 | 0.1010.1770.1170.1240.3490.2420.0580.6100.1790.396 | + | + | 1.61.81.21.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
核苷外切三磷酸二磷酸水解酶1(ectonucleoside triphosphatediphosphohydrolase 1)转化生长因子r-β(tgf-β),骨形态发生蛋白6转化生长因子r-β(tgf-β),骨形态发生蛋白6烟酰胺N甲基转移酶,NNMTcDNA DKFZp564J0323(来自克隆DKFZp564J0323)硫氧还原蛋白还原酶βf-盒和富含氨基酸重复的蛋白2转钴蛋白II(TCN2)乙醛脱氢酶2,线粒体的GTP结合蛋白ragB | AJ133133M60315M60315U08021AL049957AB019694AL049953L02648X05409X90530 | NM_001776NM_001718NM_001718NM_006169NM_006440NM_000355NM_000690NM_006064 | 32826_at39279_at1733_at37032_at39170_at41711_at36525_at37922_at32747_at39989_at | PPPPPPPPPP | APPPPAAAPM | 1.31.31.01.21.21.21.21.21.21.2 | 0.4120.2060 3080.0830.2640.2060.3000.3420.1170.602 | 1.52.11.21.21.2 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
淋巴细胞抗原75GM2激活物蛋白3型肌醇1,4,5-三磷酸受体(ITPR3)KIAA0284金属硫蛋白I-BBTG2腺苷酸激酶1肿瘤坏死因子受体超家族,成员12,WSL-LR,WSL-S1和WSL-S2蛋白氨基肽酶N/CD13生长抑制和DNA损伤诱导的蛋白(gadd45)KIAA0638蛋白 | AF011333X62078U01062AI828210M13485U72649J04809Y09392M22324M60974AB014538 | NM_002349NM_002224NM_006763NM_000476NM_003790NM_001150NM_001924 | 38160_at35820_at182_at38592_s_at609_f_at36634_at36997_at41189_at39385_at1911_s_at37375_at | PPPPPPPPPPP | APPPPPAPPPP | 1.21.21.21.21.21.21.21.21.21.21.2 | 0.1320.1010.0520.0780.2660 2100.2460.3500.3980.1770.680 | 1.71.51.51.9 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
粘着斑蛋白前胶原蛋白-脯氨酸,2-氧化戊二酸(oxoglutarate)4-双加氧酶(dioxygenase)(脯氨酸4-羟化酶),α多肽IImsg1相关的基因1(mrg1),Cbp/p300-相互作用的反式激活物微粒体谷胱甘肽S-转移酶3维生素A反应性;细胞骨架相关的17-kDa蛋白,干扰素刺激的蛋白,15kDa基质金属蛋白酶14(插入膜的)4F2细胞表面抗原,溶质载体家 | M33308U90441U65093AF026977AF070523M13755X83535J02939 | NM_003373NM_004199NM_006079NM_004528NM_006407NM_005101NM_004995NM_002394 | 36601_at34390_at33113_at39018_at39091_at1107_s_at34747_at38029_at | PPPPPPPP | PPPPPPAP | 1.21.11.11.11.11.11.11.1 | 0.0780.3470.1640.1910.2160.1190.4870.143 | + | 1.21.12.92.4 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
族3,成员2金属硫蛋白-III蛋白激酶(cAMP-依赖的,催化的)抑制物α蛋白激酶(cAMP-依赖的,催化的)抑制物αreticulocalbin 1,EF-手钙(handcalcium)结合区lipin 1,KIAA0188蛋白酶,丝氨酸,23hect结构域和RLD 2GATA结合蛋白(GATA2)agrin前体均衡(equilibrative)核苷转运物1(hENT1) | M93311S76965S76965D42073D80010AF015287AF041080M68891AF016903U81375 | NM_005954NM_006823NM_006823NM_002901NM_007173NM_004667NM_002050NM_004955 | 870_f_at36202_at546_at40556_at38098_at40078_at40877_s_at37194_at33454_at33901_at | PPPPPPPPPP | PPPPPPPPPP | 1.11.11.01.11.11.01.01.01.01.0 | 0.3340.0460.3670.0350.0800.0990.1040.3250.2720.352 | 1.11.41.31.0 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
coronin,肌动蛋白结合蛋白2B,KIAA0925f盒(和WD-40结构域蛋白3非综合症(nonsyndromic)听力障碍蛋白(DFNA5)肌动蛋白丝结合的蛋白TNFR相关的死亡受体-6(DR6)血清/糖皮质激素调节的激酶DNase XDNase X脂肪酸去饱和酶3LYL-1ATP结合盒,亚家族C(CFTR/MRP),成员1 | AB023142U07000AF073308D25248AF068868Y10032X90392X90392AC004770M22637X78338 | NM_012165NM_004403NM_021638NM_014452NM_005627NM_006730NM_006730NM_021727NM_004996 | 34772_at537_f_at41872_at37578_at35402_at973_at37214_g_at37213_at34224_at39971_at34016_s_at | PPPPPPPPPPP | AMPPAAPPPpA | 1.01.01.01.01.01.01.01 01.01.01.0 | 0.4590.2120.5350.2180.2350.1740.5070.3760.2940 3130.258 | 1.01.71.42.3 |
保藏号 | 检测1Affymetrix BEC LECID | 基因表达分析信号对数s.d.3比2 | 确认NB IF | 信号对数比 | ||||||
跨膜蛋白(CD59)fms相关的酪氨酸激酶1,VEGFR-1 | M84349S77812 | NM_002019 | 39351_at1545_g_at | PP | PP | 1.01.0 | 0.1410.535 | + | 1.11.9 |
1一种测定方法,表明转录子是否被检测到(存在,P),未检测到(缺失,A),或勉强检测到(勉强,M;如果一次试验中为P,另一次为A也用M表示)。
2两种独立采集的BEC和LEC(=共4组比较)的转录子的表达水平的变化。以log2比值表示所述变化。
3所述表达水平(四组比较)变化的标准偏差。
NB=Northern印记,IF=免疫荧光
表10
已知的LEC-特异性基因
基因 | 保藏号 | ||
检测* | 起始EST | 可能的基因 | |
CD36=COL1/TSP受体,脂肪酸转运蛋白β1-syntrophincollectin亚家族成员12分解蛋白和金属蛋白酶结构域12细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4niban蛋白NM_022083 niban蛋白含多个PDZ区的蛋白,LNXMAGE-E1蛋白上游刺激因子1,USF1(基因组匹配)与YRPW基序1相关的毛状/分裂增强子α-2,8-聚唾液酸转移酶semaphorin 6A1鸟苷酸核苷酸结合蛋白(G prot),γ2膜整合蛋白3与小鼠糖皮质激素诱导的基因1类似YAP65(65kDa MW的Yes相关蛋白)17kDa胎脑蛋白Kruppel-样因子5降钙素受体样,CGRP type 1受体 | Af(S/4,3 )Af(S/4,5)Af(S/4,5)Af(S/4,3)Af(S/4,0)Af(S/3,7)Af(S/3,5)Af(S/3,2)Af(S/2,6)Af(NS/2,6)Af(S/2,5)Af(S/2,4)Af(S/2,3)Af(S/2,3)Af(S/2,0)Af(NS/2,0)Af(NS/1,9)Af(S/1,8)Af(S/1,7) | R20784H54254氨基酸447177R74387氨基酸147933AI733018氨基酸554814AI738919AI435112氨基酸701033R61374AI422986W21965氨基酸738022氨基酸128019AI678080AL048399H92988AI815057AI741128, | M98399L31529NM_030781NM_003474NM_005214NM_052966NM_032622NM_030801AB017568NM_012258L41680NM_020796NM_030926XM_070471X80507NM_022343NM_001730NM_005795,L76380 |
基因 | 保藏号 | ||
检测* | 起始EST | 可能的基因 | |
成纤维细胞生长因子13,同种型1A四区(tetraspan) NET-6蛋白环指蛋白11 | Af(NS/1,7)Af(NS/1,6)Af(S/1,6) | T94540AW014749W22687AL079648 | NM_004114NM_014399BC020964 |
*Af=Affymetrix,S=对LEC的特异性,NS=非特异性(也在BEC中表达),数字代表BEC和LEC之间的信号强度的log2比值。
表11
根据保藏号鉴定的差异表达的基因
基因 | 检测* | 起始EST | SEQ ID NO: |
ESTESTESTESTESTESTESTESTESTESTESTESTESTESTESTEST | Af(S/4,9)Af(S/3,7)Af(S/3,2)Af(S/2,9)Af(S/2,8)Af(NS/2,6)Af(S/2,3)Af(S/2,2)Af(S/2,1)Af(NS/2,0)Af(S/1,9)Af(NS/1,9)Af(S/1,8)Af(S/1,7)Af(S/1,6)Af(S/1,6) | AL079386N21555AL119027H05299AA973128AI128820AW044647AI333058AI536067AA156409AI770080AA456099AI692645AL119265AI478114AI817448 | 12345678910111213 |
*Af=Affymetrix,S=对LEC的特异性,NS=非特异性(也在BEC中表达),数字代表BEC和LEC之间的信号强度的log2比值。
表12
其它鉴定的蛋白
基因 | 保藏号 | ||
检测* | 起始EST | 可能的基因 | |
KIAA1392,假想蛋白DKFZp762K222与葡萄糖磷酸变位酶5相似与跨膜受体Unc5H1类似假想蛋白MGC21854KIAA1877与未命名的蛋白产物相似未知蛋白KIAA1058(+从ests起缺失N-末端)与KIAA1673相似与溶酶体氨基酸转运子1相似与KIAA1673蛋白相似的人蛋白KIAA0493假想蛋白MGC2780跨膜蛋白2新的人染色体1基因作图 | Af(S/5,3)Af(S/4,5)Af(S/4,5)Af(S/3,7)Af(S/3,4)Af(NS/3,1)Af(S/2,9)Af(S/2,6)Af(S/2,3)Af(S/2,3)Af(S/2,3)Af(S/2,3)Af(S/2,3)Af(NS/2,3)Af(S/2,2) | N50545AL046941R56359AI659418AW004016氨基酸036952氨基酸846091氨基酸007697AI948598AI692279AI948598氨基酸532655AI734962NM_013390氨基酸651889 | XM_048721 (20)XM_047649 (21)XM_030300 (22)NM_52862 (23)XM_85235XM_38314 (24)AB028981 (25)XM_059607 (26)XM_058449 (27)XM_59607AB007962 (28)NM_25266 (29)57094_atHS455J72(30) |
*Af=Affymetrix,S=对LEC的特异性,NS=非特异性(也在BEC中表达),数字代表BEC和LEC之间的信号强度的log2比值。
在表5,6和12中,括号里的数字表示序列表里的SEQ ID NO:。下表13将这些序列与多肽序列SEQ ID NO:31-44和46(开放阅读框架,ORF’s)。
表13
对应于LEC-特异性多核苷酸的多肽
保藏号 | 多核苷酸 | 多肽 |
NM_021647 | SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:31 |
NM_014817 | SEQ ID NO:15 | SEQ ID NO:32 |
XM_059074 | SEQ ID NO:16 | SEQ ID NO:33 |
NM_016647 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:34 |
XM_048721 | SEQ ID NO:20 | SEQ ID NO:35 |
XM_047649 | SEQ ID NO:21 | SEQ ID NO:36 |
XM_030300 | SEQ ID NO:22 | SEQ ID NO:37 |
NM_052862 | SEQ ID NO:23 | SEQ ID NO:38 |
XM_039314 | SEQ ID NO:24 | SEQ ID NO:39 |
AB028981 | SEQ ID NO:25 | SEQ ID NO:40 |
XM_059607 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:41 |
XM_058449 | SEQ ID NO:27 | SEQ ID NO:42 |
NM_25266 | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:43 |
AL137762/HS455J72 | SEQ ID NO:30 | SEQ ID NO:44 |
XM_084655 | SEQ ID NO:45 | SEQ ID NO:46 |
表14
表3中序列的序列鉴定物
保藏号 | 氨基酸SEQID NO: | 核苷酸SEQID NO: | ||
肺I型细胞膜相关蛋白,podoplanin | AF030428 | NM_006474 | SEQ ID NO:65 | SEQ ID NO:66 |
肺I型细胞膜相关蛋白,podoplanin | AI660929 | NM_006474 | 同上 | |
细胞视黄醇结合蛋白 | M11433 | NM_002899 | SEQ ID NO:67 | SEQ ID NO:68 |
巨噬细胞甘露糖受体(MRC1) | M93221 | SEQ ID NO:69 | SEQ ID NO:70 | |
转录因子C-MAF | AF055376 | NM_005360 | SEQ ID NO:71 | SEQ ID NO:72 |
转录因子C-MAF | AF055376 | NM_005360 | 同上 | |
含硒蛋白P | Z11793 | NM_005410 | SEQ ID NO:73 | SEQ ID NO:74 |
KIAA0466,免疫球蛋白超家族,成员3 | AB007935 | NM_001542 | SEQ ID NO:75 | SEQ ID NO:76 |
II型膜蛋白,与HIV gp120-结合C-型凝集素类似,CD209抗原样 | AB015629 | NM_014257 | SEQ ID NO:77 | SEQ ID NO:78 |
KIAA0626 | AB014526 | NM_021647 | SEQ ID NO:79 | SEQ ID NO:80 |
KIAA0711 | AB018254 | NM_014867 | SEQ ID NO:81 | SEQ ID NO:82 |
整联蛋白α9 | D25303 | NM_002207 | SEQ ID NO:83 | SEQ ID NO:84 |
整联蛋白α9 | D25303 | NM_002207 | 同上 |
松弛素H2 | X00948 | NM_005059 | SEQ ID NO:85 | SEQ ID NO:86 |
KIAA0644 | AB014544 | NM_014817 | SEQ ID NO:87 | SEQ ID NO:88 |
Cdk-抑制物p57KIP2(KIP2) | U22398 | NM_000076 | SEQ ID NO:89 | SEQ ID NO:90 |
Cdk-抑制物p57KIP2(KIP2) | U22398 | NM_000076 | 同上 | |
暂时受体电压通道TRPC6 | AJ006276 | NM_004621 | SEQ ID NO:91 | SEQ ID NO:92 |
cDNA DKFZp564O222(来自克隆DKFZp564O222) | AL050002 | SEQ ID NO:93 | ||
M80482 | NM_002570 | SEQ ID NO:94 | SEQ ID NO:95 | |
G-蛋白信号16调节物,A28-RGS14p | U70426 | NM_002928 | SEQ ID NO:96 | SEQ ID NO:97 |
二氢嘧啶酶相关蛋白-1,脑袁蛋白反应介导物蛋白1 | D78012 | NM_001313 | SEQ ID NO:98 | SEQ ID NO:99 |
粒桥蛋白(DPI,DPII) | AL031058 | NM_004415 | SEQ ID NO:100 | SEQ ID NO:101 |
pendrin,溶质载体家族,成员4 | AF030880 | NM_000441 | SEQ ID NO:102 | SEQ ID NO:103 |
reelin(RELN) | U79716 | NM_005045 | SEQ ID NO:104 | SEQ ID NO:105 |
整联蛋白,α1 | X68742 | SEQ ID NO:106 | ||
整联蛋白,α1 | X68742 | 同上 | ||
胆固醇25羟化酶 | AF059214 | NM_003956 | SEQ ID NO:107 | SEQ ID NO:108 |
抑制素β-B亚单位前体 | M31682 | NM_002193 | SEQ ID NO:109 | SEQ ID NO:110 |
KIAA1233 | AL109724 | SEQ ID NO:111 | ||
前-B细胞刺激因子类似物(SDF1b) | L36033 | NM_000609 | SEQ ID NO:112 | SEQ ID NO:113 |
V-Erba相关Ear-3蛋白 | HG3510-HT3704 | SEQ ID NO:114 | ||
单克隆抗体MRC OX-2鉴定的抗原 | X05323 | SEQ ID NO:115 | SEQ ID NO:116 | |
载脂蛋白D | J02611 | NM_001647 | SEQ ID NO:117 | SEQ ID NO:118 |
TIMP3,基质金属蛋白酶的组织抑制物 | U14394 | NM_000362 | SEQ ID NO:119 | SEQ ID NO:120 |
TIMP3 | U14394 | NM_000362 | 同上 | |
乙醛脱氢酶1 | K03000 | NM_000689 | SEQ ID NO:121 | SEQ ID NO:122 |
prospero相关同源框1(prox 1) | U44060 | NM_002763 | SEQ ID NO:123 | SEQ ID NO:124 |
基质Gla蛋白 | AI953789 | NM_000900 | SEQ ID NO:125 | SEQ ID NO:126 |
神经元pentraxin II(NPTX2) | U29195 | SEQ ID NO:127 | SEQ ID NO:128 | |
histatin 2(HIS2) | M26665 | NM_000200 | SEQ ID NO:129 | SEQ ID NO:130 |
ADDL mRNA for内收蛋白样蛋白,内收蛋白3(γ) | D67031 | NM_016824 | SEQ ID NO:131 | SEQ ID NO:132 |
内收蛋白3(γ) | U37122 | NM_016824 | 同上 | |
MADS框转录增强因子2,多肽C(肌细胞增强因子2C) | L08895 | NM_02397 | SEQ ID NO:133 | SEQ ID NO:134 |
MADS框转录增强因子2,(肌细胞增强因子2C) | NM_002397 | 同上 |
MADS框转录增强因子2,多肽C(肌细胞增强因子2C) | S57212 | NM_002397 | 同上 | |
葡萄糖磷酸变位酶5 | L40933 | NM_021965 | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:136 |
细胞周期蛋白E2 | AF102778 | NM_004702 | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:138 |
白介素7(IL7) | M29053 | SEQ ID NO:139 | SEQ ID NO:140 | |
白介素7 | J04156 | NM_000880 | 同上 | |
cDNA DKFZp586L0120(来自克隆DKFZp586L0120) | AL050154 | SEQ ID NO:141 | ||
过氧化物酶体增生活化的受体,γ,PPARG | L40904 | NM_005037 | SEQ ID NO:142 | SEQ ID NO:143 |
脂肪酸结合蛋白4 | 氨基酸128249 | NM_001442 | SEQ ID NO:144 | SEQ ID NO:145 |
蛋白激酶Cζ | Z15108 | NM_002744 | SEQ ID NO:146 | SEQ ID NO:147 |
46kDa柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)蛋白 | Y07593 | NM_001338 | SEQ ID NO:148 | SEQ ID NO:149 |
来自7q35-qter的PAC克隆RP4-751H13,锌指样 | AC004877 | SEQ ID NO:150 | SEQ ID NO:151 | |
胸腺嘧啶激酶1,可溶 | M15205 | NM_003258 | SEQ ID NO:152 | SEQ ID NO:153 |
胸腺嘧啶激酶1 | K02581 | NM_003258 | 同上 | |
Pig7(PIG7),LPS诱导的TNF-α因子 | AF010312 | NM_004862 | SEQ ID NO:154 | SEQ ID NO:155 |
LPS诱导的TNF-α因子 | AL120815 | NM_004862 | 同上 | |
脂肪酶A,溶酶体酸,胆固醇酯酶 | X76488 | NM_000235 | SEQ ID NO:156 | SEQ ID NO:157 |
泛素特异性蛋白13(异肽酶T-13) | U75362 | NM_003940 | SEQ ID NO:158 | SEQ ID NO:159 |
癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(胆汁糖蛋白)CEACAM1 | X16354 | NM_001712 | SEQ ID NO:160 | SEQ ID NO:161 |
cDNA DKFZp586D0918(来自克隆DKFZp586D0918) | AL049370 | SEQ ID NO:162 | ||
KIAA0598,B细胞RAG相关蛋白 | AB011170 | NM_014863 | SEQ ID NO:163 | SEQ ID NO:164 |
RAMP2(受体(降钙素)活性修饰蛋白2) | AJ001015 | NM_005854 | SEQ ID NO:165 | SEQ ID NO:166 |
胆固醇酯转移蛋白前体 | M30185 | NM_000078 | SEQ ID NO:167 | SEQ ID NO:168 |
上皮膜蛋白2 | U52100 | NM_001424 | SEQ ID NO:169 | SEQ ID NO:170 |
MHC II型淋巴细胞抗原(HLA-DP)β链 | M83664 | NM_002121 | SEQ ID NO:171 | SEQ ID NO:172 |
MHC II型淋巴细胞抗原(HLA-DP)β链 | M83664 | NM_002121 | 同上 | |
β-抑制蛋白(抑制蛋白)2 | AF106941 | NM_004313 | SEQ ID NO:173 | SEQ ID NO:174 |
有丝分裂检验点激酶Bub1(BUB1) | AF053305 | NM_004336 | SEQ ID NO:175 | SEQ ID NO:176 |
KIAA0229,与人锚蛋白1(S08275)相似 | D86982 | SEQ ID NO:177 | SEQ ID NO:178 | |
Sprouty 1类似物(FGF信号的拮抗物) | AF041037 | SEQ ID NO:179 | SEQ ID NO:180 | |
Rap1的鸟苷酸核苷酸交换因子;M-Ras-调节的GEF,KIAA0277 | NM_012294 | SEQ ID NO:181 | SEQ ID NO:182 | |
translin | X78627 | NM_004622 | SEQ ID NO:183 | SEQ ID NO:184 |
红细胞膜蛋白带4.9(dematin) | U28389 | NM_001978 | SEQ ID NO:185 | SEQ ID NO:186 |
KIAA0846蛋白 | AB020653 | NM_015376 | SEQ ID NO:187 | SEQ ID NO:188 |
神经胶质成熟因子,γ | W07033 | NM_004877 | SEQ ID NO:189 | SEQ ID NO:190 |
胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2) | X16302 | NM_000597 | SEQ ID NO:191 | SEQ IDNO:192 |
平滑肌肌球蛋白重链同种型Smemb | S67247 | SEQ ID NO:193 | SEQ ID NO:194 | |
TTG-2(具有LIM基序的富含半胱氨酸的蛋白),LIM区only 2(rhombotin样1) | X61118 | NM_005574 | SEQ ID NO:195 | SEQ ID NO:196 |
细胞周期蛋白B2 | AL080146 | NM_004701 | SEQ ID NO:197 | SEQ ID NO:198 |
KIAA0353 | AB002351 | SEQ ID NO:199 | SEQ ID NO:200 | |
KIAA0559,piccolo(突触前细胞基质蛋白) | AB011131 | SEQ ID NO:201 | SEQ ID NO:202 | |
G蛋白偶联的受体,家族C,组5,成员B | AC004131 | NM_016235 | SEQ ID NO:203 | SEQ ID NO:204 |
G蛋白偶联的受体,家族C,组5,成员B | AI801872 | NM_016235 | 同上 | 同上 |
CREM(环AMP-反应性元件调节物β同种型) | S68134 | NM_001881 | SEQ ID NO:205 | SEQ ID NO:206 |
CREM(环AMP-反应性元件调节物β同种型) | S68134 | NM_001881 | 同上 | 同上 |
CREM(环AMP-反应性元件调节物β同种型) | S68271 | NM_001881 | 同上 | 同上 |
假想蛋白FLJ13110 | AL080222 | NM_022912 | SEQ ID NO:207 | SEQ ID NO:208 |
肌醇(myo)-1(或4)-单磷酸酶2 | AF014398 | NM_014214 | SEQ ID NO:209 | SEQ ID NO:210 |
KIAA0937蛋白 | AB023154 | SEQ ID NO:211 | SEQ ID NO:212 | |
有丝分裂纺锤体卷曲螺旋相关蛋白 | AF063308 | NM_006461 | SEQ ID NO:213 | SEQ ID NO:214 |
富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白2(CSRP2) | U57646 | NM_001321 | SEQ ID NO:215 | SEQ ID NO:216 |
拓扑异构酶(DNA)IIα(170kD) | AI375913 | NM_001067 | SEQ ID NO:217 | SEQ ID NO:218 |
DNA拓扑异构酶II | J04088 | NM_001067 | 同上 | 同上 |
蛋白磷酸酶抑制物2(PPP1R2) | U68111 | SEQ ID NO:219 | SEQ ID NO:220 | |
KIAA0186 | D80008 | NM_021067 | SEQ ID NO:221 | SEQ ID NO:222 |
双重特异性酪氨酸(Y)-磷酸化调节激酶3(Dyrk3) | Y12735 | NM_003582 | SEQ ID NO:223 | SEQ ID NO:224 |
驱动蛋白样纺锤蛋白HKSP(HKSP) | U37426 | NM_004523 | SEQ ID NO:225 | SEQ ID NO:226 |
亨廷顿相关蛋白反应蛋白(duo) | U94190 | NM_003947 | SEQ ID NO:227 | SEQ ID NO:228 |
diubiquitin | AL031983 | NM_006398 | SEQ ID NO:229 | SEQ ID NO:230 |
bikunin,丝氨酸蛋白酶抑制物,Kunitz型,2 | U78095 | NM_021102 | SEQ ID NO:231 | SEQ ID NO:232 |
细胞色素P-450-1(TCDD-可诱导的) | K03191 | NM_000499 | SEQ ID NO:233 | SEQ ID NO:234 |
细胞色素P(1)-450 | X02612 | NM_000499 | 同上 | 同上 |
KIAA0513 | NM_014732 | SEQ ID NO:235 | SEQ ID NO:236 |
蛋白磷酸酶抑制物2(PPP1R2) | U68111 | 同上 | ||
RAMP3(受体(降钙素)活性修饰蛋白3) | AJ001016 | NM_005856 | SEQ ID NO:237 | SEQ ID NO:238 |
B-mvb | X13293 | NM_002466 | SEQ ID NO:239 | SEQ ID NO:240 |
KIAA0952 | AB023169 | NM_014962 | SEQ ID NO:241 | SEQ ID NO:242 |
干扰素刺激的基因(20kD),HEM45 | U88964 | NM_002201 | SEQ ID NO:243 | SEQ ID NO:244 |
GS3955 | D87119 | NM_021643 | SEQ ID NO:245 | SEQ ID NO:246 |
GS3955 | D87119 | NM_021643 | 同上 | 同上 |
GRB2相关的接合体蛋白(Grap) | U52518 | NM_006613 | SEQ ID NO:247 | SEQ ID NO:248 |
KIAA1071蛋白 | AB028994 | SEQ ID NO:249 | SEQ ID NO:250 | |
具有多重剪接的RNA结合蛋白基因,RBP-MS/类型5 | D84111 | NM_006867 | SEQ ID NO:251 | SEQ ID NO:252 |
具有多重剪接的RNA结合蛋白基因,RBP-MS/类型5 | D84111 | NM_006867 | 同上 | 同上 |
RBP-MS/类型4,具有多重剪接的RNA结合蛋白基因 | D84110 | NM_006867 | 同上 | |
RBP-MS/类型4,具有多重剪接的RNA结合蛋白基因 | D84110 | NM_006867 | 同上 | 同上 |
RBP-MS/类型3,具有多重剪接的RNA结合蛋白基因 | D84109 | NM_006867 | 同上 | 同上 |
α-辅肌动蛋白-2相关的LIM蛋白 | AF002282 | NM_014476 | SEQ ID NO:253 | SEQ ID NO:254 |
semaphorin-III(Hsema-I),semaphorin 3A | L26081 | NM_006080 | SEQ ID NO:255 | SEQ ID NO:256 |
含IQ基序的GTPase活化蛋白2 | U51903 | NM_006633 | SEQ ID NO:257 | SEQ ID NO:258 |
抑制蛋白,β2 | HG2059-HT2114 | 同上 | ||
视网膜母细胞瘤相关蛋白HEC | AF017790 | NM_006101 | SEQ ID NO:259 | SEQ ID NO:260 |
LIM区结合蛋白(LDB1) | AF052389 | NM_001290 | SEQ ID NO:261 | SEQ ID NO:262 |
双重特异性磷酸酶5 | U15932 | NM_004419 | SEQ ID NO:263 | SEQ ID NO:264 |
人cDNA 3’,mRNA序列 | AI557322 | SEQ ID NO:265 | ||
单胺氧化酶A(MAOA) | M68840 | NM_000240 | SEQ ID NO:266 | SEQ ID NO:267 |
单胺氧化酶A | 氨基酸420624 | NM_000240 | 同上 | |
NECDIN相关蛋白 | U35139 | NM_002487 | SEQ ID NO:268 | SEQ ID NO:269 |
调节(调节性)溶质载体蛋白,家族1,成员1 | X82877 | NM_006511 | SEQ ID NO:270 | SEQ ID NO:271 |
TTK蛋白激酶 | M86699 | NM_003318 | SEQ ID NO:272 | SEQ ID NO:273 |
fms相关的酪氨酸激酶4,VEGFR-3 | X69878 | NM_002020 | SEQ ID NO:274 | SEQ ID NO:275 |
TSC403,与溶酶体相关的膜糖蛋白类似 | AB013924 | NM_014398 | SEQ ID NO:276 | SEQ ID NO:277 |
HMG-2 | X62534 | SEQ ID NO:278 | SEQ ID NO:279 | |
人克隆24416mRNA序列 | AF052159 | SEQ ID NO:280空序列 | SEQ ID NO:281 | |
降钙素受体样 | L76380 | NM_005795 | SEQ ID NO:282 | SEQ ID NO:283 |
KIAA0582蛋白 | AI761647 | NM_015147 | SEQ ID NO:284 | SEQ ID NO:285 |
cDNA DKFZp434B102(来自克隆DKFZp434B102) | AL080192 | SEQ ID NO:286 | ||
cDNA DKFZp586G1922(来自克隆DKFZp586G1922) | AL080110 | SEQ ID NO:287 | ||
乙酰-CoA合酶3 | D89053 | NM_004457 | SEQ ID NO:288 | SEQ ID NO:289 |
脂肪酸辅酶A接合酶,长链3 | AA977580 | NM_004457 | 同上 | |
STAT诱导的STAT抑制物-2 | AF037989 | SEQ ID NO:290 | SEQ ID NO:291 | |
同源异型蛋白Hox5.4 | HG3502-HT3696 | SEQ ID NO:292 | ||
假想蛋白FLJ13910,cDNADKFZp586M141(来自克隆DKFZp586M141) | AL050139 | NM_022780 | SEQ ID NO:293 | SEQ ID NO:294 |
cDNA DKFZp586N012(来自克隆DKFZp586N012) | AL049471 | SEQ ID NO:295 | ||
UbcH10,泛素载体蛋白E2-C | U73379 | NM_007019 | SEQ ID NO:296 | SEQ ID NO:297 |
细胞周期蛋白依赖的激酶抑制物3,蛋白酪氨酸磷酸酶(CIP2) | L25876 | NM_005192 | SEQ ID NO:298 | SEQ ID NO:299 |
糖原磷酸化酶(PYGL) | AF046798 | SEQ ID NO:300 | SEQ ID NO:301 | |
造血因子-2 | AF004327 | NM_001147 | SEQ ID NO:302 | SEQ ID NO:303 |
造血因子-2 | AF004327 | NM_001147 | 同上 | 同上 |
叉头盒M1 | U74612 | NM_021953 | SEQ ID NO:304 | SEQ ID NO:305 |
可能的异戊二烯化的蛋白酪氨酸磷酸化酶hPRL-3 | AF041434 | NM_007079 | SEQ ID NO:306 | SEQ ID NO:307 |
RAB31,Rab亚家族的Low MrGTP结合蛋白 | U59877 | NM_006868 | SEQ ID NO:308 | SEQ ID NO:309 |
RAB31,RAS原癌基因家族成员 | AI189226 | NM_006868 | ||
肌球蛋白VIIA | U39226 | NM_000260 | SEQ ID NO:310 | SEQ ID NO:311 |
Grb2-相关结合物-1,与IRS-1相关的停靠蛋白 | U43885 | NM_002039 | SEQ ID NO:312 | SEQ ID NO:313 |
核纤层蛋白B1 | L37747 | SEQ ID NO:314 | SEQ ID NO:315 | |
微型染色体保持缺陷的(mis5,S.pombe)6 HsMcm6 | D84557 | NM_005915 | SEQ ID NO:316 | SEQ ID NO:317 |
细胞周期蛋白B1 | M25753 | SEQ ID NO:318 | ||
细胞周期蛋白B1 | M25753 | 同上 | 同上 | |
RTP,N-myc下游调节的 | D87953 | NM_006096 | SEQ ID NO:319 | SEQ ID NO:320 |
α2,3-唾液酸转移酶 | AB022918 | NM_006100 | SEQ ID NO:321 | SEQ ID NO:322 |
ADP-核糖基化因子样蛋白4 | U73960 | NM_005738 | SEQ ID NO:323 | SEQ ID NO:324 |
中心粒蛋白F(350/400kD,分裂激素) | U30872 | NM_016343 | SEQ ID NO:325 | SEQ ID NO:326 |
亲代表达的10,KIAA1051 | AB028974 | NM_015068 | SEQ ID NO:327 | SEQ ID NO:328 |
微管蛋白,α1(睾丸特异性) | X06956 | SEQ ID NO:329 | SEQ ID NO:330 |
KIAA0101 | D14657 | NM_014736 | SEQ ID NO:331 | SEQ ID NO:332 |
KIAA0128,septin2 | D50918 | SEQ ID NO:333 | SEQ ID NO:334 | |
蛋白磷酸酶2,调节性亚基B(B56),γ | Z69030 | NM_002719 | SEQ ID NO:335 | SEQ ID NO:336 |
脱氧胞苷激酶 | M60527 | NM_000788 | SEQ ID NO:337 | SEQ ID NO:338 |
整联蛋白β3结合蛋白(β3-内联蛋白) | U37139 | NM_014288 | SEQ ID NO:339 | SEQ ID NO:340 |
TAL1(SCL)中断位点 | M74558 | NM_003035 | SEQ ID NO:341 | SEQ ID NO:342 |
KIAA0666 | AB014566 | SEQ ID NO:343 | SEQ ID NO:344 | |
cAMP-特异性磷酸二酯酶8A,PDE8A1 | AF056490 | SEQ ID NO:345 | SEQ ID NO:346 | |
有丝分裂检验点激酶Mad3L(MAD3L),BUB1B | AF053306 | NM_001211 | SEQ ID NO:347 | SEQ ID NO:348 |
核糖体S6激酶 | X85106 | NM_021135 | SEQ ID NO:349 | SEQ ID NO:350 |
HPTPε(蛋白酪氨酸磷酸酶ε) | X54134 | NM_006504 | SEQ ID NO:351 | SEQ ID NO:352 |
Lyn酪氨酸激酶,v-yes-1Yamaguchi肉瘤病毒相关的原癌基因同源物 | M79321 | NM_002350 | SEQ ID NO:353 | SEQ ID NO:354 |
lyn酪氨酸激酶,v-yes-1Yamaguchi肉瘤病毒相关的原癌基因同源物 | M16038 | NM_002350 | 同上 | |
lyn酪氨酸激酶 | M16038 | NM_002350 | 同上 |
brachyury变体A(TBX1),T-box1转录因子r | AF012130 | NM_005992 | SEQ ID NO:355 | SEQ ID NO:356 |
单克隆抗体Ki-67的抗原的mki67a mRNA(长链型) | X65550 | NM_002417 | SEQ ID NO:357 | SEQ ID NO:358 |
蛋白酪氨酸磷酸酶受体pi(PTPRP) | U81561 | NM_002847 | SEQ ID NO:359 | SEQ ID NO:360 |
cbl-b | U26710 | NM_004351 | SEQ ID NO:361 | SEQ ID NO:362 |
细胞周期蛋白A2 | X51688 | NM_001237 | SEQ ID NO:363 | SEQ ID NO:364 |
核苷磷酸化酶 | X00737 | NM_000270 | SEQ ID NO:365 | SEQ ID NO:366 |
TNF-相关的凋亡诱导配体TRAIL | U37518 | NM_003810 | SEQ ID NO:367 | SEQ ID NO:368 |
磷酸二酯酶4B,cAMP-特异性 | L20971 | NM_002600 | SEQ ID NO:369 | SEQ ID NO:370 |
巢蛋白(议定菌素) | M30269 | NM_002508 | SEQ ID NO:371 | SEQ ID NO:372 |
HYA22蛋白 | D88153 | NM_005808 | SEQ ID NO:373 | SEQ ID NO:374 |
磷脂酸磷酸酶2A型 | AF014402 | NM_003711 | SEQ ID NO:375 | SEQ ID NO:376 |
KIAA0512,ALEX2 | AB011084 | NM_014782 | SEQ ID NO:377 | SEQ ID NO:378 |
血栓烷A2受体 | D38081 | NM_001060 | SEQ ID NO:379 | SEQ ID NO:380 |
三叶草因子(trefoil factor)3(小肠) | AI985964 | NM_003226 | SEQ ID NO:381 | SEQ ID NO:382 |
G-2和S-期表达的1 | AL031588 | NM_016426 | SEQ ID NO:383 | SEQ ID NO:384 |
ADP-核糖基转移酶(NAD+;多(ADP-核糖)聚合酶)-样2 | AJ236876 | NM_005484 | SEQ ID NO:385 | SEQ ID NO:386 |
丝氨酸/苏氨酸激酶12 | AF015254 | NM_004217 | SEQ ID NO:387 | SEQ ID NO:388 |
微管蛋白,A1,同种型44 | HG2259-HT2348 | 同上 | ||
核纤层蛋白B受体 | L25931 | NM_002296 | SEQ ID NO:389 | SEQ ID NO:390 |
KIAA0429 | AB007889 | NM_014751 | SEQ ID NO:391 | SEQ ID NO:392 |
转录因子4 | M74719 | NM_003199 | SEQ ID NO:393 | SEQ ID NO:394 |
多配体聚糖3(N-多配体聚糖),KIAA0468 | AB007937 | NM_014654 | SEQ ID NO:395 | SEQ ID NO:396 |
RECK蛋白前体 | 氨基酸099265 | NM_021111 | SEQ ID NO:397 | SEQ ID NO:398 |
推定的前列腺癌肿瘤抑制物 | U42349 | NM_006765 | SEQ ID NO:399 | SEQ ID NO:400 |
蛋白磷酸酶1,调节性(抑制物)亚基 | AB020630 | SEQ ID NO:401 | SEQ ID NO:402 | |
PDZ和LIM区1(elfin) | U90878 | NM_020992 | SEQ ID NO:403 | SEQ ID NO:404 |
假想蛋白来自克隆643 | AF091087 | NM_020467 | SEQ ID NO:405 | SEQ ID NO:406 |
p53-调节的DDA3 | 氨基酸926959 | SEQ ID NO:407 | ||
KIAA0062 | D31887 | SEQ ID NO:408 | SEQ ID NO:409 | |
中链乙酰辅酶A脱氢酶 | M91432 | SEQ ID NO:410 | SEQ ID NO:411 |
间隙连接蛋白,α1,43kD(连接蛋白(connexin)43) | M65188 | NM_000165 | SEQ ID NO:412 | SEQ ID NO:413 |
MyoD家族抑制物 | U78313 | NM_005586 | SEQ ID NO:414 | SEQ ID NO:415 |
核酸内切/外切酶Mre11(MRE11A) | AF073362 | NM_005591 | SEQ ID NO:416 | SEQ ID NO:417 |
核受体超家族2,F组,1号成员 | X16155 | NM_005654 | SEQ ID NO:418 | SEQ ID NO:419 |
表15
表4中的序列的序列鉴定物
保藏号 | 氨基酸SEQ IDNO: | 核苷酸SEQID NO: | ||
p27mRNA,干扰素α-诱导的蛋白27 | X67325 | NM_005532 | 420 | 421 |
核糖核酸酶A(RNase A),胰腺 | D26129 | NM_002933 | 422 | 423 |
造血性神经膜蛋白(hematopoietic neuralmembrane protein)(HNMP-1) | U87947 | NM_001425 | 424 | 425 |
N-钙粘着蛋白 | M34064 | NM_001792 | 426 | 427 |
N-钙粘着蛋白 | M34064 | NM_001792 | 同上 | |
白介素8(IL8) | M28130 | NM_000584 | 428 | 429 |
白介素8,β血小板球蛋白样蛋白前体 | M17017 | NM_000584 | 同上,SEQ IDNO:430,空 | 同上,SEQID NO:431,空 |
酪氨酸激酶受体(axl) | M76125 | NM_001699 | 432 | 433 |
HG162-HT3165 | 同上 | |||
细胞表面糖蛋白CD44(CD44) | L05424 | 434 | 435 |
细胞粘附分子(CD44) | M59040 | NM_000610 | 同上 | |
透明质酸盐受体(CD44) | L05424 | 同上 | ||
血管内皮生长因子related蛋白VRP,VEGF-C | U43142 | NM_005429 | 436 | 437 |
血管内皮生长因子C | X94216 | NM_005429 | 同上 | |
XIII型胶原蛋白,α1(=COL4A2) | M33653 | NM_005203 | 438 | 439 |
XIII型胶原蛋白,α-1 | M59217 | NM_005203 | 同上 | |
胶原蛋白α-2I型 | K01079 | 440 | ||
胶原蛋白α-2I型 | K01079 | 同上 | ||
胶原蛋白,I型α2 | V00503 | NM_000089 | 同上 | |
蛋白多糖1 | X17042 | NM_002727 | 441 | 442 |
磷酸脂肪酶A2,IVA组,钙依赖的磷脂结合蛋白(PLA2) | M72393 | 443 | 444 | |
碳水化合物(硫酸角蛋白Gal-6)磺基转移酶 | AB003791 | NM_003654 | 445 | 446 |
原肌球蛋白2(β),成纤维细胞原肌球蛋白 | M12125 | NM_003289 | 447 | 448 |
硫酸软骨素蛋白多糖2(多能聚糖) | X15998 | NM_004385 | 449 | 450 |
硫酸软骨素蛋白多糖2(多能聚糖) | X15998 | NM_004385 | 同上 | |
潜在的转化长因子r-β结合蛋白(LTBP-2) | Z37976 | NM_000428 | 451 | 452 |
白介素6(干扰素,β2) | X04430 | NM_000600 | 453 | 454 |
骨形态发生蛋白-4(hBMP-4) | U43842 | NM_001202 | 455 | 456 |
骨形态发生蛋白2B,BMP-4 | M22490 | NM_001202 | 同上 | |
sarcolectin,角蛋白7 | AJ238246 | NM_005556 | 457 | 458 |
神经元细胞粘附分子, | AB002341 | NM_005010 | 459 | 460 |
KIAA0343 | ||||
神经元细胞粘附分子,hBR4VO/Nr-CAM前体 | U55258 | NM_005010 | 同上 | |
基质金属蛋白酶1(基质胶原酶),皮肤胶原酶 | M13509 | NM_002421 | 461 | 462 |
干细胞因子,KIT配体 | M59964 | NM_000899 | 463 | 464 |
uPA | X02419 | NM_002658 | 465 | 466 |
纤溶酶原激活物1 | J03764 | NM_000602 | 467 | 468 |
纤溶酶原激活物1 | M14083 | NM_000602 | 同上 | |
selectin P,CD62,颗粒膜蛋白-140(GMP-140)前体 | M25322 | NM_003005 | 469 | 470 |
latrophilin-2 | AJ131581 | NM_012302 | 471 | 472 |
肌动蛋白,α2 | X13839 | NM_001613 | 473 | 474 |
成纤维细胞活化蛋白,α | U09278 | NM_004460 | 475 | 476 |
G蛋白信号10的调节物20 | AF060877 | NM_003702 | 477 | 478 |
IGF-II mRNA-结合蛋白3 | U97188 | NM_006547 | 479 | 480 |
视网膜cDNA随机引物亚文库,EST | W28438 | 481 | ||
脑酸溶性蛋白1,神经组织富集的酸性蛋白(NAP-22) | AF039656 | NM_006317 | 482 | 483 |
抑制蛋白2 | AL096719 | NM_002628 | 484 | 485 |
抑制蛋白2 | L10678 | NM_002628 | 同上 | |
Na,K-ATPaseβ-1亚基 | U16799 | NM_001677 | 486 | 487 |
Claudin-7 | AJ011497 | NM_001307 | 488 | 489 |
正常齿龈 | U51712 | 490 | ||
分解蛋白和金属蛋白结构域23 | AB009672 | NM_003812 | 491 | 492 |
α1(VIII)胶原蛋白的COL8A1 mRNA | X57527 | NM_001850 | 493 | 494 |
信号转导物和转录激活物6(STAT6) | AF067575 | 495 | 496 | |
转录因子IL-4 Stat,STAT6 | U16031 | NM_003153 | 同上 | |
脂皮质蛋白-III,膜联蛋白A3 | M20560 | NM_005139 | 497 | 498 |
细胞内粘附分子1(CD54),主要组(major group)鼻病毒受体前体 | M24283 | NM_000201 | 499 | 500 |
溶质载体家族1(神经/上皮高亲合力谷氨酸转运子,系统Xag) | U08989 | NM_004170 | 501 | 502 |
溶质载体家族1(神经/上皮高亲合力谷氨酸转运子,系统Xag) | AI928365 | NM_004170 | 同上 | |
p53诱导的蛋白 | L47738 | 503 | 504 | |
二氢嘧啶脱氢酶,DPYD | U20938 | NM_000110 | 505 | 506 |
自然杀伤细胞转录物4 | 氨基酸631972 | NM_004221 | 507 | 508 |
PFTAIRE蛋白激酶1,KIAA0834 | AB020641 | NM_012395 | 509 | 510 |
RGP4,G蛋白信号10的调节物4 | U27768 | NM_005613 | 511 | 512 |
G蛋白信号的调节物4 | A1267373 | NM_005613 | 同上 | |
原癌基因Aml1-Evi-1,融合活化的(Fusion Activated) | HG4058-HT4328 | 513 | 514 | |
原癌基因Aml1-Evi-1,融合活化的 | HG4058-HT4328 | 同上 | ||
腺苷酸环化酶相关蛋白2 | N90755 | NM_006366 | 515 | 516 |
clusterin(补体裂解抑制物,SP-40,40,硫酸糖蛋白2,载脂蛋白J) | M25915 | NM_001831 | 517 | 518 |
ADP核糖基化因子样7 | AB016811 | NM_005737 | 519 | 520 |
H因子(补体)样1 | M65292 | NM_002113 | 521 | 522 |
RNA解旋酶相关的蛋白,金属硫蛋白-If | H68340 | NM_007372 | 523 | 524 |
活化的反式肌动蛋白g因子(50kDa)Staf50 | X82200 | NM_006074 | 525 | 526 |
环加氧酶-2(hCox-2) | U04636 | NM_000963 | 527 | 528 |
GRO1原癌基因,黑素瘤生长刺激活性(MGSA) | X54489 | NM_001511 | 529 | 530 |
NRGN,neurogranin | X99076 | NM_006176 | 531 | 532 |
小鼠dkk-1同源物 | AB020315 | 533 | 534 | |
胃肠道肿瘤相关抗原GA733-1,肿瘤相关的钙信号转导物2 | J04152 | NM_002353 | 535 | 536 |
层粘连蛋白 | Z15008 | NM_005562 | 537 | 538 |
transgelin,22kDa平滑肌蛋白(SM22) | M95787 | NM_003186 | 539 | 540 |
编码单核细胞分泌蛋白的JE基因 | M28225 | 541 | 542 | |
锌指蛋白238,RP58 | AJ223321 | NM_006352 | 543 | 544 |
组织蛋白酶C | X87212 | NM_001814 | 545 | 546 |
组织型凝血酶原激活物(t-PA) | M15518 | NM_000930 | 547 | 548 |
寿司重复蛋白 | AF060567 | NM_014467 | 549 | 550 |
膜联蛋白A6 | D00510 | NM_001155 | 551 | 552 |
EphrinB1 | U09303 | NM_004429 | 553 | 554 |
EphrinB1 | U09303 | NM_004429 | 同上 | |
TFEC同种型(转录因子EC) | D43945 | NM_012252 | 555 | 556 |
小的可诱导细胞因子A2,(单核细胞趋化蛋白1) | M26683 | NM_002982 | 557 | 558 |
小的可诱导细胞因子A2(单核 | M26683 | NM_002982 | 同上 |
细胞趋化蛋白1) | ||||
内皮细胞蛋白C/APC受体(EPCR) | L35545 | NM_006404 | 559 | 560 |
转谷氨酶(transglutaminase)2(TGase) | M55153 | NM_004613 | 561 | 562 |
转谷氨酶(TGase) | M55153 | NM_004613 | 同上 | |
人金属硫蛋白-If | M10943 | 563 | 564 | |
转化生长因子β-诱导的(BIGH3) | M77349 | NM_000358 | 565 | 566 |
神经元特异性(γ)烯醇酶的ENO2基因 | X51956 | 567 | 568 | |
FAT肿瘤抑制物(果蝇(Drosophila))同源物 | X87241 | NM_005245 | 569 | 570 |
恶性细胞表达增强的基因/肿瘤进展-增强的基因 | S82470 | NM_024298 | 571 | 572 |
恶性细胞表达增强的基因/肿瘤进展-增强的基因 | S82470 | NM_024298 | 同上,SEQ 1DNO:573,空 | 同上,SEQID NO:574,空 |
cDNA DKFZp566G0746(来自克隆DKFZp566G0746) | AL050078 | 575 | ||
赖氨酰氧化酶样2 | U89942 | NM_002318 | 576 | 577 |
ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物2(rho家族,小GTP结合蛋白Rac2) | M64595 | NM_002872 | 578 | 579 |
内皮白细胞粘附分子1(ELAM-1),selectin E | M24736 | NM_000450 | 580 | 581 |
层粘连蛋白,α5,KIAA0533 | AB011105 | 582 | 583 | |
胎盘生长因子(PIGF) | X54936 | NM_002632 | 584 | 585 |
染色体的ALL1融合基因1q,AF1q | U16954 | NM_006818 | 586 | 587 |
溶基质素-2,MMP-10 | X07820 | NM_002425 | 588 | 589 |
金属硫蛋白-I-A | K01383 | 590 | 591 | |
胶原蛋白VIα-1 | X15880 | 592 | 593 | |
mad蛋白同源物(hMAD-3) | U68019 | NM_005902 | 594 | 595 |
mad蛋白同源物(hMAD-3) | U68019 | NM_005902 | 同上 | |
mad蛋白同源物(hMAD-3) | U68019 | NM_005902 | 同上 | |
膜整合蛋白2A | AL021786 | 596 | ||
白介素1受体样1 | D12763 | NM_003856 | 597 | 598 |
高度活动性组(非组蛋白染色体)蛋白同种型I-C(HMGI-C) | X92518 | 599 | 600 | |
表皮生长因子r受体激酶底物(Eps8) | U12535 | NM_004447 | 601 | 602 |
乳酸脱氢酶B | X13794 | NM_002300 | 603 | 604 |
未知产物的mRNA | D29810 | 605 | 606 | |
假想蛋白DKFZp564D0462 | AL033377 | 607 | ||
赖氨酰羟化酶同种型2(PLOD2) | U84573 | NM_000935 | 608 | 609 |
Follistatin样3,follistatin相关蛋白(FLRG) | U76702 | NM_005860 | 610 | 611 |
人克隆24674 mRNA序列 | AF070578 | 612 | ||
L-艾杜糖醇-2脱氢酶 | L29254 | 613 | 614 | |
神经元pentraxin 1 | U61849 | NM_002522 | 615 | 616 |
来自克隆23549和23762的假想蛋白 | U90908 | NM_021226 | 617 | 618 |
UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶 | AB011004 | NM_003115 | 619 | 620 |
锌指蛋白185(LIM结构域) | Y09538 | NM_007150 | 621 | 622 |
四个半LIM结构域2,心蛋白(FHL-2) | U29332 | NM_001450 | 623 | 624 |
有丝分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶3,MAPKAP激酶(3pK) | U09578 | NM_004635 | 625 | 626 |
金属硫蛋白1E(功能性) | R92331 | 627 | ||
TU3A蛋白 | AF03 5283 | NM_007177 | 628 | 629 |
金属硫蛋白1H | R93527 | NM_005951 | 630 | 631 |
鸟氨酸结合蛋白 同种型II(GBP-2) | M55543 | NM_004120 | 632 | 633 |
可溶血管内皮细胞生长因子r受体1(sVEGFR-1) | U01134 | NM_002019 | 634 | 635 |
R-Ras | M14949 | 636 | 637 | |
R-ras | M14949 | 638 | 639 | |
肌氨酸转运物(SLC6A8),可溶性载体家族6,成员8 | U36341 | NM_005629 | 同上,SEQ IDNO:638,空 | 同上,SEQIDNO:639,空 |
myb1(小鸡)同源物靶点,血红素加氧酶1(HO-1) | Z82244 | NM_005488 | 642 | 643 |
前胶原-赖氨酸,2-氧化戊二酸5-双加氧酶,赖氨酰羟化酶(PLOD) | L06419 | NM_000302 | 644 | 645 |
KIAA0836 | AB020643 | 646 | 647 | |
cDNA DKFZp434C171(来自克隆DKFZp434C171) | AL080169 | 648 | 649 | |
白介素4受体的IL-4-RmRNA | X52425 | NM_000418 | 650 | 651 |
趋化因子(C-C基序)受体样2(CCRL2),趋化因子受体X(CKRX) | AF014958 | NM_003965 | 652 | 653 |
磷酸脂肪酶C,β3(磷脂酰肌醇-特异性) | Z16411 | NM_000932 | 654 | 655 |
LIM区蛋白 | X93510 | NM_003687 | 656 | 657 |
蛋白激酶(cAMP-依赖的,催化的)抑制物β | M34181 | NM_002731 | 658 | 659 |
rho GDP-解离抑制物2 | X69549 | NM_001175 | 660 | 661 |
KIAA0975,咪唑受体候选物(c和idate) | AB023192 | NM_007184 | 662 | 663 |
脊髓灰质炎病毒受体 | X64116 | NM_006505 | 664 | 665 |
脊髓灰质炎病毒受体 | X64116 | NM_006505 | 同上 | |
即刻早期反应3 | S81914 | NM_003897 | 666 | 667 |
金属硫蛋白2A | AI547258 | NM_005953 | 668 | 669 |
原肌球蛋白1(α) | M19267 | NM_000366 | 670 | 671 |
原肌球蛋白1(α) | Z24727 | NM_000366 | 同上 | |
原肌球蛋白1(α) | M19267 | NM_000366 | 同上 | |
TRAM样蛋白 | D31762 | NM_012288 | 672 | 673 |
E3泛素接合酶SMURF2 | 氨基酸630312 | NM_022739 | 674 | 675 |
含EGF的fibulin样细胞外基质蛋白1 | U03877 | NM_004105 | 676 | 677 |
G蛋白偶联的56 | AJ011001 | NM_005682 | 678 | 679 |
c-jun第一原癌基因(JUN) | J04111 | NM_002228 | 680 | 681 |
G蛋白信号调节物10,RGS10 | AF045229 | NM_002925 | 682 | 683 |
β淀粉样蛋白(A4)前体蛋白结合的,家族B,成员2(Fe65-样) | U62325 | 684 | 685 | |
ras-相关的rho蛋白 | M12174 | NM_004040 | 686 | 687 |
蛋白酶体(前体,macropain)26S亚基,非-ATPase,10 | AL031177 | NM_002814 | 688 | 689 |
KIAA0537 | AB011109 | NM_014840 | 690 | 691 |
溶酶体相关的膜蛋白-2 | X77196 | NM_002294 | 692 | 693 |
磷脂转移蛋白 | L26232 | NM_006227 | 694 | 695 |
N-豆蔻酰转移酶2 | AF043325 | NM_004808 | 696 | 697 |
磷酸果糖激酶(PFKM) | U24183 | NM_000289 | 698 | 699 |
整联蛋白,β4 | X53587 | NM_000213 | 700 | 701 |
leupaxin | AF062075 | NM_004811 | 702 | 703 |
内皮素转化酶1 | Z35307 | NM_001397 | 704 | 705 |
野生型p53活化的片段-1(WAF1),细胞周期蛋白依赖的激酶抑制物1A(p21,Cip1) | U03106 | NM_000389 | 706 | 707 |
ICAM-2,LFA-1的细胞粘附配体 | X15606 | NM_000873 | 708 | 709 |
ICAM-2,LFA-1的细胞粘附配体 | X15606 | NM_000873 | 同上 | |
细胞内粘附分子2(ICAM-2) | M32334 | 710 | 711 | |
真核细胞翻译起始因子2B,eIF-2Bβ亚基 | AF035280 | NM_014239 | 712 | 713 |
鸟苷磷酸化酶 | X90858 | NM_003364 | 714 | 715 |
整联蛋白,β5 | X53002 | NM_002213 | 716 | 717 |
N-磺基葡糖胺磺基水解酶(磺酰胺酶) | U30894 | NM_000199 | 718 | 719 |
synaptojanin 2 | AF039945 | 720 | 721 | |
金属硫蛋白1L | 氨基酸224832 | NM_002450 | 722 | 723 |
巨噬细胞加帽(capping)蛋白,凝溶胶蛋白样 | M94345 | NM_001747 | 724 | 725 |
HSPC022蛋白 | W68830 | NM_014029 | 726 | 727 |
人克隆137308 mRNA,部分cds | AW006742 | 728 | ||
原钙粘着蛋白42,PC42,原钙粘着蛋白1(钙粘着蛋白样1) | L11370 | NM_002587 | 729 | 730 |
caspase样凋亡调节性蛋白2(CLARP2) | AF005775 | NM_003879 | 731 | 732 |
caspase样凋亡调节性蛋白2(CLARP2) | AF005775 | NM_003879 | 同上 | |
主要穹隆(major vault)蛋白,lrp | X79882 | NM_005115 | 733 | 734 |
范可尼贫血(Fanconi anemia),互补组G | AC004472 | NM_004629 | 735 | 736 |
月元病毒蛋白(PrP) | U29185 | NM_000311 | 737 | 738 |
干扰素刺激的蛋白,15kDa | 氨基酸203213 | NM_005101 | 739 | 740 |
丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制物,分化枝B(卵清蛋白),细胞质抗蛋白酶2(CAP2) | L40377 | NM_002640 | 741 | 742 |
双糖链蛋白聚糖 | J04599 | NM_001711 | 743 | 744 |
趋化因子(C-X-C基序),受体4(fusin) | L06797 | NM_003467 | 745 | 746 |
泛素羧基末端酯酶L1(泛素硫酯酶) | X04741 | NM_004181 | 747 | 748 |
KIAA0469 | AB007938 | NM_014851 | 749 | 750 |
TNF(配体)超家族,成员4(tax-转炉活化的糖蛋白1,34kD) | AL022310 | NM_003326 | 751 | 752 |
KIAA1053 | AB028976 | 753 | 754 | |
NAD(P)H-醌氧化还原酶 | M81600 | 755 | 756 | |
含寿司重复的蛋白 | U61374 | NM_006307 | 757 | 758 |
整联蛋白,α5 | X06256 | NM_002205 | 759 | 760 |
enigma(LIM区蛋白) | L35240 | NM_005451 | 761 | 762 |
核苷外切三磷酸二磷酸水解酶1(ectonucleoside triphosphatediphosphohydrolase 1) | AJ133133 | NM_001776 | 763 | 764 |
转化生长因子r-β(tgf-β),骨形态发生蛋白6 | M60315 | NM_001718 | 765 | 766 |
转化生长因子r-β(tgf-β),骨形态发生蛋白6 | M60315 | NM_001718 | 同上 |
烟酰胺N甲基转移酶,NNMT | U08021 | NM_006169 | 767 | 768 |
cDNA DKFZp564J0323(来自克隆DKFZp564J0323) | AL049957 | 769 | ||
硫氧还原蛋白还原酶β | AB019694 | NM_006440 | 770 | 771 |
f-盒和富含氨基酸repeat蛋白2 | AL049953 | 772 | 773 | |
钴胺传递蛋白II(TCN2) | L02648 | NM_000355 | 774 | 775 |
乙醛脱氢酶2,线粒体的 | X05409 | NM_000690 | 776 | 777 |
GTP-结合蛋白ragB | X90530 | NM_006064 | 778 | 779 |
淋巴细胞抗原75 | AF011333 | NM_002349 | 780 | 781 |
GM2活化物蛋白 | X62078 | 782 | 783 | |
3型肌醇1,4,5-三磷酸受体(ITPR3) | U01062 | NM_002224 | 784 | 785 |
KIAA0284 | AI828210 | 786 | ||
金属硫蛋白I-B | M13485 | 787 | 788 | |
BTG2 | U72649 | NM_006763 | 789 | 790 |
腺苷酸激酶1 | J04809 | NM_000476 | 791 | 792 |
肿瘤坏死因子受体超家族,成员12,WSL-LR,WSL-S1和WSL-S2蛋白 | Y09392 | NM_003790 | 793 | 794 |
氨基肽酶N/CD13 | M22324 | NM_001150 | 795 | 796 |
生长抑制和DNA损伤诱导的蛋白(gadd45) | M60974 | NM_001924 | 797 | 798 |
KIAA0638蛋白 | AB014538 | 799 | 800 | |
粘着斑蛋白 | M33308 | NM_003373 | 801 | 802 |
前胶原蛋白-脯氨酸,2-氧化戊二酸4-双加氧酶(脯氨酸4-羟化酶),α多肽II | U90441 | NM_004199 | 803 | 804 |
msg1-相关基因1(mrg1),与 | U65093 | NM_006079 | 805 | 806 |
Cbp/p300相互作用的反式激活物 | ||||
微粒体谷胱甘肽S-转移酶3 | AF026977 | NM_004528 | 807 | 808 |
维生素A反应性;细胞骨架相关的 | AF070523 | NM_006407 | 809 | 810 |
17-kDa蛋白,干扰素刺激的蛋白,15kDa | M13755 | NM_005101 | 811 | 812 |
基质金属蛋白酶14(插入膜的) | X83535 | NM_004995 | 813 | 814 |
4F2细胞表面抗原,可溶性载体家族3,成员2 | J02939 | NM_002394 | 815 | 816 |
金属硫蛋白-III | M93311 | NM_005954 | 817 | 818 |
蛋白激酶(cAMP-依赖的,催化的)抑制物α | S76965 | NM_006823 | 819 | 820 |
蛋白激酶(cAMP-依赖的,催化的)抑制物α | S76965 | NM_006823 | 同上 | |
reticulocalbin 1,EF-h和钙结合区 | D42073 | NM_002901 | 821 | 822 |
lipin 1,KIAA0188 | D80010 | 823 | 824 | |
蛋白酶,丝氨酸,23 | AF015287 | NM_007173 | 825 | 826 |
hect结构域和RLD 2 | AF041080 | NM_004667 | 827 | 828 |
GATA-结合蛋白(GATA2) | M68891 | NM_002050 | 829 | 830 |
agrin前体 | AF016903 | 831 | 832 | |
均衡核苷转运物1(均衡核苷转运物1)(hENT1) | U81375 | NM_004955 | 833 | 834 |
coronin,肌动蛋白结合蛋白2B,KIAA0925 | AB023142 | 835 | 836 | |
f-盒和WD-40结构域蛋白3 | U07000 | NM_012165 | 837 | 838 |
非综合症性听力障碍蛋白(DFNA5) | AF073308 | NM_004403 | 839 | 840 |
肌动蛋白丝结合蛋白 | D25248 | NM_021638 | 841 | 842 |
TNFR-相关的死亡受体-6(DR6) | AF068868 | NM_014452 | 843 | 844 |
血清/糖皮质激素调节的激酶 | Y10032 | NM_005627 | 845 | 846 |
DNase X | X90392 | NM_006730 | 847 | 848 |
DNase X | X90392 | NM_006730 | 同上 | |
脂肪酸去饱和酶3 | AC004770 | NM_021727 | 849 | 850 |
LYL-1 | M22637 | 851 | 852 | |
ATP-结合盒,亚家族C(CFTR/MRP),成员1 | X78338 | NM_004996 | 853 | 854 |
跨膜蛋白(CD59) | M84349 | 855 | 856 | |
fms-相关的酪氨酸激酶1,VEGFR-1 | S77812 | 857 | 858 | |
假想蛋白FLJ23403 | AI681538 | NM_022068 | 859 | 860 |
假想蛋白FLJ20898 | AI733570 | NM_024600 | 861 | 862 |
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
(于2003年10月15日(15.10.03)被国际局接受;修改了原始权利要求7,10,15,18,54,55,76和77;加入了新权利要求94-99;余下的权利要求未改变(7页))。
1.差异调节血管内皮细胞(BEC)或淋巴管内皮细胞(LEC)的生长或分化的方法,包括使内皮细胞和一种组合物接触,所述组合物包含差异调节血管和淋巴管内皮细胞的制剂,所述制剂选自以下物质:
(a)包含BEC多肽或LEC多肽的氨基酸序列的多肽,或者所述多肽的活性片段;
(b)包含编码(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸;
(c)特异性结合(a)的多肽的抗体;
(d)包含(c)的抗体的片段的多肽,其中所述片段和抗体与该多肽结合;
(e)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的反义核酸;
(f)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的干扰RNA(RNAi)。
2.权利要求1的方法,其中所述内皮细胞与所述组合物在活体外接触。
3.权利要求1方法,其中所述组合物包含可药用的稀释剂,佐剂或载体,且所述接触步骤包括将所述组合物给药受试哺乳动物,以差异调节受试哺乳动物的BEC或LEC。
4.权利要求3方法,包括:
鉴定患有以LEC的过度增生为特征的病症的人类受试者;和
将所述组合物给药该人类受试者,其中所述制剂差异抑制LEC的生长和BEC的生长。
5.权利要求3方法,包括:
鉴定患有以LEC的过度增生为特征的病症的人类受试者;
筛选受试者的LEC,以鉴定表3中的多肽的过度表达;和
将所述组合物给药该人类受试者,其中所述制剂通过抑制筛选步骤所鉴定的多肽的表达,差异抑制LEC的生长和BEC的生长。
6.根据权利要求3的调节人类受试者的淋巴管内皮细胞的生长的方法,包括以下步骤:
鉴定患有增生性淋巴疾病的人类受试者;
筛选受试者以鉴定表3中所述的LEC多肽的低表达或低活性,其中所述蛋白不在表1或2中;
将所述组合物给药人类受试者,其中所述制剂包含筛选步骤鉴定的LEC多肽(a)或者所述多肽的活性片段,或者包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸(b)。
7.一种制剂在制备差异调节血管内皮细胞(BEC)或淋巴管内皮细胞(LEC)的生长或分化的药物中的用途,所述制剂选自:
(a)包含BEC多肽或LEC多肽的氨基酸序列的多肽,或者所述多肽的活性片段;
(b)包含编码(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸;
(c)特异性结合(a)的多肽的抗体;
(d)包含(c)的抗体的片段的多肽,其中所述片段和抗体与该多肽结合;
(e)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的反义核酸;和
(f)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的干扰RNA(RNAi)。
8.权利要求1-7之一的方法或用途,其中所述多肽是选自表3的LEC多肽,而且所述制剂差异调节LEC和BEC的生长或分化。
9.权利要求1-7的方法或用途,其中所述多肽是选自表4的BEC多肽,而且所述制剂差异调节BEC和LEC的生长或分化。
10.权利要求8的方法或用途,其中所述多肽不在表1或2中。
11.权利要求8的方法或用途,其中所述LEC多肽包含选自SEQ ID NO:81,187,207,211,221,235,241,293或391的氨基酸序列。
12.权利要求8的方法或用途,其中所述LEC多肽包含选自SEQ ID NO:31-34,46或48的氨基酸序列。
13.权利要求12的方法和用途,其中所述制剂包含(c)的抗体或(d)的多肽。
14.权利要求的方法12,其中所述制剂包含(a)的多肽的细胞外区片段,或者编码所述细胞外区片段的多核苷酸。
15.权利要求1-7之一的方法或用途,其中所述制剂包含反义分子。
16.治疗遗传性淋巴水肿的方法,包括:
鉴定患有淋巴水肿的人类受试者,该受试者的编码表3中鉴定的LEC蛋白的基因的至少一个等位基因中具有突变,其中所述突变和人类受试者中的淋巴水肿相关,并且所述LEC蛋白不是VEGFR-3;且
给药所述受试者一种组合物,所述组合物包含选自VEGF-C多肽,VEGF-D多肽,VEGF-C多核苷酸,或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生长制剂。
17.选自VEGF-C多肽,VEGF-D多肽,VEGF-C多核苷酸,或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生长制剂在制备药物中的用途,所述药物用于治疗表3中鉴定的LEC基因突变造成的遗传性淋巴水肿,且所述基因不是VEGFR-3。
18.筛选内皮细胞疾病或患该疾病的倾向性的方法,包括:
从人类受试者获得含有内皮细胞mRNA样品;
根据样品中从所述基因转录的mRNA的量测定BEC或LEC基因的表达,其中所述BEC或LEC基因编码表3或4中鉴定的多肽。
19.监测药物对内皮细胞的效力或毒性的方法,包括以下步骤:
将药物给药受试动物前后,测定受试哺乳动物内皮细胞中至少一种BEC或LEC基因的表达,其中至少一种BEC或LEC基因编码表3中所述的多肽,并且其中BEC或LEC基因的表达的改变与药物对内皮细胞的效力或毒性相关。
20.鉴定调节内皮细胞的生长的化合物的方法,包括:
在存在或缺乏化合物的条件下培养内皮细胞;
测定细胞中至少一种BEC或LEC基因的表达,其中的BEC或LEC基因选自编码表3和4中的多肽的基因;与缺乏该化合物的情况相比,存在该化合物时至少一种BEC基因的表达改变表明该化合物是BEC生长的调节物;且与缺乏该化合物的情况相比,存在该化合物时至少一种LEC基因的表达改变表明该化合物是LEC生长的调节物。
21.权利要求20的筛选选择性调节BEC或LEC的生长或分化的化合物的方法,
其中所述测定步骤包含测定细胞内至少一种BEC基因和至少一种LEC基因的表达,和
所述方法包含通过筛选差异调节至少一种BEC基因的表达和至少一种LEC基因的表达的化合物,筛选选择性地调节BEC或LEC的生长或分化的化合物。
22.一种组合物,包含:
一种分离的多核苷酸,包含编码含有选自Q ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293或391的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和
可药用的稀释剂,载体或佐剂。
23.权利要求22的组合物,包含含有选自Q ID NO:14-30,45,47,49,51,82,93,111,188,208,212,222,236,242,294或392的核苷酸序列的多核苷酸,或编码所述多肽的所述多核苷酸的片段。
24.一种表达载体,包含与一种多核苷酸可操作地连接的表达控制序列,所述多核苷酸包含编码含有选自SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293或391的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
25.权利要求24的表达载体,是含有该多核苷酸的复制缺陷的腺病毒或腺伴随病毒载体。
26.一种组合物,包含权利要求24或25的表达载体以及可药用的稀释剂,载体或佐剂。
27.一种试剂盒,包含权利要求22,23或26之一的组合物,所述组合物与将其给药受试哺乳动物来调节该受试动物的淋巴系统的说明包装在一起。
28.使用权利要求24的表达载体转化或转染的宿主细胞。
29.制备LEC多肽的方法,包括在细胞表达该多核苷酸编码的多肽的条件下,使权利要求28的宿主细胞生长。
30.纯化并分离的多肽,包含选自选自Q ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293或391的氨基酸序列。
31.纯化并分离的多肽,其包含的氨基酸序列选自以下序列:
(a)SEQ ID NO:31-34,46,48,207,676,859或861;以及
(b)(a)的氨基酸序列的至少10个氨基酸的细胞外区片段。
32.权利要求31的纯化并分离的可溶性多肽,包含选自ID NO:31-34,46,48,207,676,859或861的氨基酸序列的胞外区片段,其中所述多肽缺乏任何跨膜区。
33.权利要求32的多肽,所述多肽缺乏任何细胞内区。
34.一种融合蛋白,包含权利要求32或33的多肽,所述多肽与包含免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白片段融合。
35.一种组合物,包含权利要求30-34之一的多肽或蛋白,以及可药用的稀释剂,载体或佐剂。
36.一种试剂盒,包含权利要求35的组合物,以及将所述药物组合物给药受试哺乳动物以调节所述受试动物的淋巴系统的说明。
37.一种抗体,其与权利要求30-34之一的多肽特异性结合。
38.权利要求37的抗体,其是一种人化的抗体。
39.一种蛋白质,包含与权利要求30-34之一的多肽特异性结合的抗体的抗原结合区,其中所述蛋白与该多肽特异性结合。
40.鉴定LEC核酸的方法,包括:
(a)使含有候选LEC核酸的生物样品与一种多核苷酸或其互补序列在严格的杂交条件下接触,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1-30,45,47,49,51,82,93,111,188,208,212,236,242,294或392的序列的至少14个连续核苷酸的片段,所述严格的杂交条件是:
(i)42℃,在含有50%甲酰胺,5xSSPE,5x Denhardt′s溶液,0.1%SDS和0.1mg/ml变性的鲑精DNA的溶液中杂交20小时,和
(ii)5℃,在1xSSC,0.1%SDS中洗涤30分钟;和
(b)检测所述候选LEC核酸和所述多核苷酸的杂交,由此鉴定LEC核酸。
41.鉴定LEC蛋白的方法,包括:
(a)使含有候选LEC蛋白的生物样品与权利要求37的抗体或权利要求39的蛋白之一的LEC蛋白结合配偶体在适合二者结合的条件下接触;和
(b)检测所述候选LEC蛋白和所述LEC结合配偶体之间的结合,从而鉴定LEC。
42.鉴定LEC的方法,包括:
(a)使含有细胞的生物样品和LEC结合配偶体在适宜两者结合的条件下接触,其中所述LEC结合配偶体包含与一种多肽结合的抗体,所述多肽含有SEQ ID NO:31-34,46,48,207,676,859或861的序列,或包含所述抗体的抗原结合片段;和
(b)通过检测细胞和所述LEC结合配偶体之间的结合鉴定LEC,其中LEC结合配偶体与细胞的结合鉴定LEC。
43.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸突变,所述突变与遗传性淋巴水肿基因型相关,并且与相应的野生型等位基因编码的多肽的氨基酸序列相比,所述突变改变人类受试者的至少一种等位基因编码的氨基酸序列,其中所述野生型多肽是表3中鉴定的多肽。
44.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸中的突变,所述突变与遗传性淋巴水肿基因型相关,并且与相应的野生型等位基因编码的多肽的氨基酸序列相比,所述突变改变人类受试者的至少一种等位基因编码的氨基酸序列,其中所述野生型多肽包含选自SEQ ID NO:31-44,46,48,52,54,207,676,859或861的氨基酸序列;
(b)使核酸中的所述突变的存在或缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,其中核酸中存在所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性增加相关,并且核酸中缺乏所述的突变与患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关。
45.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸的突变,其中与野生型等位基因编码的转录因子多肽的转录调节活性相比,所述突变改变了该人类受试者的至少一种转录因子的等位基因编码的氨基酸序列,还改变该等位基因编码的转录因子多肽的转录调节活性,
其中所述野生型转录因子多肽包含SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:211,或SEQ ID NO:241的氨基酸序列,以及表5中的序列编码的转录因子;和
(b)使核酸中所述突变的存在或缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,其中核酸中存在所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性增加相关,并且核酸中缺乏所述的突变与患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关。
46.权利要求45的方法,其中所述野生型转录因子等位基因包含表示为SEQ ID NO:54的Sox18氨基酸序列。
47.权利要求46的方法,其中与所述测定鉴定了改变反式激活或Sox18等位基因编码的蛋白的DNA结合区氨基酸序列的突变。
48.权利要求46的方法,其中与野生型SOX18对所述基因的转录活化相比,所述突变减少SOX18应答型基因的转录活化。
49.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸的突变,其中与野生型等位基因编码的粘附多肽的结合亲合力相比,所述突变改变了该人类受试者的至少一种转录因子的等位基因编码的氨基酸序列,还改变了该LEC等位基因编码的粘附多肽的结合亲合力,
其中所述野生型粘附多肽包含SEQ ID NO:31-34,46,207,676,859和861之一的氨基酸序列;和
(b)使核酸中所述突变的存在或缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,其中核酸中存在所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性增加相关,并且核酸中缺乏所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关。
50.权利要求43-49之一的方法,其中所述测定鉴定了突变的存在,并且所述相关步骤鉴定了所述病人患遗传性淋巴水肿的危险性增加。
51.筛选人类受试者患遗传性淋巴水肿的危险性增加的方法,包括测定人类受试者的核酸突变,所述突变改变了该核酸编码的至少一种多肽的氨基酸序列,所述多肽包含表3的氨基酸序列。
52.权利要求51的方法,其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,和54,207,676,859或861的氨基酸序列,并且与患遗传性淋巴水肿的危险性相关。
53.权利要求52的方法,其中所述多肽包含以SEQ ID NO:54表示的SOX18氨基酸序列。
54.权利要求43-49,51,52和53之一的方法,其中所述方法包括以下步骤中的至少一步:
(a)测定人类受试者的至少一种多核苷酸的至少一种密码子的核苷酸序列;
(b)进行杂交试验以测定来自人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同;
(c)进行多核苷酸迁移试验来测定来自人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同;和
(d)进行限制性核酸内切酶消化试验确定人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同。
55.权利要求43-49,51,52和53之一的方法,其中所述方法包括:进行聚合酶链反应(PCR)来扩增包含所述LEC多核苷酸的编码序列的核酸,并测定所扩增的核酸的核苷酸序列。
56.筛选人类受试者的遗传性淋巴水肿基因型,包括:
(a)提供包括来自所述人类受试者的核酸的生物样品;和
(b)分析所述核酸中突变的存在,与编码SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,54,207,676,859,和861之一的氨基酸序列的人类基因相比,所述突变改变了人类受试者中至少一种基因的至少一种等位基因所编码的氨基酸序列,其中人类受试者中存在的突变改变上述氨基酸序列的方式与人类受试者的淋巴水肿相关可鉴定遗传性淋巴水肿。
57.权利要求56的方法,其中所述生物样品是细胞样品。
58.权利要求56的方法,其中所述分析包括测定所述核酸的部分序列。
59.权利要求56的方法,其中所述人类受试者具有由筛选法所鉴定的遗传性淋巴水肿基因型。
60.权利要求49的方法,其中至少一种基因对应于编码SEQ ID NO:54的氨基酸序列的人Sox18基因。
61.抑制淋巴管生成的方法,包括:
给药受试者LEC跨膜多肽的抑制物,
其中所述LEC跨膜多肽包含选自SEQ ID NO:31-34,46 48,207,676,859或861的氨基酸序列,而且
其中所述抑制物选自:
(a)LEC跨膜多肽的可溶性细胞外区片段;
(b)与LEC跨膜多肽胞外区结合的抗体;
(c)一种多肽,包含(b)的抗体的抗原结合区;和
(d)一种反义核酸,与编码LEC跨膜多肽和其互补物的核酸互补。
62.权利要求61的方法,其中所述抑制物是包含LEC多肽的胞外区片段的多肽,其中所述胞外区的序列选自SEQ ID NO:31的氨基酸1-152,SEQ ID NO:32的氨基酸1-695或SEQ ID NO:33的氨基酸1-248。
63.权利要求61或62的方法,其中所述受试者是患有肿瘤的人。
64.调节哺乳动物受试者的淋巴管生成的方法,包括:将LEC多核苷酸的反义分子以有效抑制LEC多核苷酸编码的多肽的转录或翻译的量,给药需要调节淋巴管生成的受试哺乳动物,其中所述LEC多核苷酸包含选自SEQ ID NO:14-30,45,47,49,51,208,677,860或862的核苷酸序列。
65.治疗遗传性淋巴水肿的方法,包括:
(a)鉴定患有遗传性淋巴水肿的人类受试者,与包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,54,207,676,859,和861之一的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列相比,该人类受试者具有的突变改变了其至少一种多肽的氨基酸序列;并且
(b)将VEGF-C多核苷酸,VEGF-C多肽,VEGF-D多核苷酸或VEGF-D多肽的淋巴管生长因子给药所述受试者。
66.调节内皮细胞或者内皮前体细胞的生长的方法,包括将内皮细胞或内皮前体细胞与包含调节细胞内的prox-1转录调控的试剂接触,其中所述试剂选自:
(a)prox-1多肽;
(b)编码prox-1多肽的多核苷酸;或
(c)prox-1的反义分子。
67.权利要求66的方法,其中所述细胞包括培养的内皮细胞或内皮前体细胞,而且接触是离体进行的。
68.权利要求67的方法,其中所述接触包括将所述试剂加入培养基中。
69.权利要求66-68之一的方法,其中所述细胞包括内皮前体细胞。
70.权利要求66-69之一的方法,其中所述细胞在接触步骤之后被引入受试哺乳动物中。
71.权利要求70的方法,其中所述受试者是人。
72.权利要求71的方法,其中的人类受试者患有LEC疾病。
73.提高人类受试者中的LEC的功能的方法,包括:
从人类受试者中分离内皮细胞或内皮前体细胞;
用包含编码prox-1多肽的核苷酸序列的表达载体转化或转染所述内皮细胞,以促进LEC的分化或生长;和
转化或转染步骤后,将LEC细胞给予人类受试者。
74.权利要求73的方法,其中所述分离和给药步骤中的人类受试者相同。
75.权利要求73或74的方法,其中所述人类受试者患有淋巴水肿。
76.权利要求73-74之一的方法,其中所述载体和转化或转染方法被选用于prox-1的瞬时表达。
77.权利要求73-74之一的方法,其中所述表达载体是复制缺陷的腺病毒载体。
78.分离的多肽,其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸61-127具有至少95%的同一性。
79.权利要求78的多肽,其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸30-152具有至少95%的同一性。
80.一种可溶性多肽,包含SEQ ID NO:31中的氨基酸序列的片段,其中所述片段缺乏SEQ ID NO:31的跨膜和细胞内氨基酸。
81.一种分离的多肽,包含SEQ ID NO:32的至少一个富含亮氨酸的区。
82.权利要求81的分离的多肽,其中所述多肽缺乏SEQ ID NO:32的跨膜氨基酸。
83.一种分离的多肽,包含SEQ ID NO:33的至少一个富含亮氨酸的区。
84.权利要求81的分离的多肽,其中所述多肽缺乏SEQ ID NO:33的跨膜氨基酸。
85.一种分离的多肽,其包含的氨基酸序列与包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的多肽的片段具有至少95%的同一性,
其中所述片段包含至少一个血小板反应蛋白I型同上序列。
86.权利要求85的分离的多肽,其中所述片段包括SEQ ID NO:111的六个血小板反应蛋白I型重复序列。
87.一种分离的多肽,其包含的氨基酸序列与包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的多肽的片段具有至少95%的同一性,
其中所述片段包括至少一个免疫球蛋白C-2型结构域。
88.权利要求85的分离的多肽,其中所述片段包含SEQ ID NO:111的三个免疫球蛋白C-2类型结构域序列。
89.一种融合蛋白,包含权利要求78-88之一的多肽和一种异源性多肽。
90.一种抗体,其特异性地与权利要求78-88之一的多肽结合。
91.一种多核苷酸,其包含编码权利要求78-89之一的多肽的核苷酸序列。
92.包含权利要求91的多核苷酸的表达载体,其可操作地连接于表达控制序列。
93.权利要求92的表达载体,其是复制缺陷的腺病毒载体。
94.权利要求9的方法,其中所述多肽不在表1或2中。
95.权利要求1-7之一的方法,其中所述试剂包含一个反义分子,且其中的多肽不在表1或2中。
96.权利要求43-49之一的方法,其中所述测定鉴定了所述突变的存在,并且所述相关步骤鉴定了所述患者患遗传性淋巴水肿的增加的危险性,而且其中所述方法包含至少以下步骤之一:
(a)测定该人类受试者的至少一种多核苷酸的至少一种密码子的核苷酸序列;
(b)进行杂交试验来确定该人类受试者的核酸的核苷酸序列于一种或多种对照序列相同还是不同;
(c)进行多核苷酸迁移试验来测定来自人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同;和
(d)进行限制性核酸内切酶消化试验确定人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同。
97.权利要求43-39之一的方法,其中所述测定鉴定了所述突变的存在,而且该相关步骤鉴定了所述病人出现淋巴水肿的危险性增加,所述方法包括以下步骤:进行聚合酶链反应(PCR)来扩增包含所述LEC多核苷酸的编码序列的核酸,并测定该扩增的核酸的核苷酸序列。
98.权利要求73-74之一的方法,其中所述人类受试者患有淋巴水肿,而且其中所选载体以及转化或转染方法用于prox-1的瞬时表达。
99.权利要求73-74之一的方法,其中所述人类受试者患有淋巴水肿,而且所述载体包含复制缺陷的腺病毒载体。
Claims (93)
1.差异调节血管内皮细胞(BEC)或淋巴管内皮细胞(LEC)的生长或分化的方法,包括使内皮细胞和一种组合物接触,所述组合物包含差异调节血管和淋巴管内皮细胞的制剂,所述制剂选自以下物质:
(a)包含BEC多肽或LEC多肽的氨基酸序列的多肽,或者所述多肽的活性片段;
(b)包含编码(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸;
(c)特异性结合(a)的多肽的抗体;
(d)包含(c)的抗体的片段的多肽,其中所述片段和抗体与该多肽结合;
(e)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的反义核酸;
(f)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的干扰RNA(RNAi)。
2.权利要求1的方法,其中所述内皮细胞与所述组合物在活体外接触。
3.权利要求1方法,其中所述组合物包含可药用的稀释剂,佐剂或载体,且所述接触步骤包括将所述组合物给药受试哺乳动物,以差异调节受试哺乳动物的BEC或LEC。
4.权利要求3方法,包括:
鉴定患有以LEC的过度增生为特征的病症的人类受试者;和
将所述组合物给药该人类受试者,其中所述制剂差异抑制LEC的生长和BEC的生长。
5.权利要求3方法,包括:
鉴定患有以LEC的过度增生为特征的病症的人类受试者;
筛选受试者的LEC,以鉴定表3中的多肽的过度表达;和
将所述组合物给药该人类受试者,其中所述制剂通过抑制筛选步骤所鉴定的多肽的表达,差异抑制LEC的生长和BEC的生长。
6.根据权利要求3的调节人类受试者的淋巴管内皮细胞的生长的方法,包括以下步骤:
鉴定患有增生性淋巴疾病的人类受试者;
筛选受试者以鉴定表3中所述的LEC多肽的低表达或低活性,其中所述蛋白不在表1或2中;
将所述组合物给药人类受试者,其中所述制剂包含筛选步骤鉴定的LEC多肽(a)或者所述多肽的活性片段,或者包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸(b)。
7.一种制剂在制备差异调节血管内皮细胞(BEC)或淋巴管内皮细胞(LEC)的生长或分化的药物中的用途,所述制剂选自:
(a)包含BEC多肽或LEC多肽的氨基酸序列的多肽,或者所述多肽的活性片段;
(b)包含编码(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸;
(c)特异性结合(a)的多肽的抗体;
(d)包含(c)的抗体的片段的多肽,其中所述片段和抗体与该多肽结合;
(e)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的反义核酸;
(f)编码(a)的多肽的人基因或mRNA的干扰RNA(RNAi)。
8.权利要求1-7之一的方法或用途,其中所述多肽是选自表3的LEC多肽,而且所述制剂差异调节LEC和BEC的生长或分化。
9.权利要求1-7的方法或用途,其中所述多肽是选自表4的BEC多肽,而且所述制剂差异调节BEC和LEC的生长或分化。
10.权利要求8或9的方法或用途,其中所述多肽不在表1或2中。
11.权利要求8的方法或用途,其中所述LEC多肽包含选自SEQ ID NO:81,187,207,211,221,235,241,293或391的氨基酸序列。
12.权利要求8的方法或用途,其中所述LEC多肽包含选自SEQ ID NO:31-34,46,或48的氨基酸序列。
13.权利要求12的方法和用途,其中所述制剂包含(c)的抗体或(d)的多肽。
14.权利要求的方法12,其中所述制剂包含(a)的多肽的细胞外区片段,或者编码所述细胞外区片段的多核苷酸。
15.权利要求1-10之一的方法,其中所述制剂包含反义分子。
16.治疗遗传性淋巴水肿的方法,包括:
鉴定患有淋巴水肿的人类受试者,该受试者的编码表3中鉴定的LEC蛋白的基因的至少一个等位基因中具有突变,其中所述突变和人类受试者中的淋巴水肿相关,并且所述LEC蛋白不是VEGFR-3;且
给药所述受试者一种组合物,所述组合物包含选自VEGF-C多肽,VEGF-D多肽,VEGF-C多核苷酸,或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生长制剂。
17.选自VEGF-C多肽,VEGF-D多肽,VEGF-C多核苷酸,或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生长制剂在制备药物中的用途,所述药物用于治疗表3中鉴定的LEC基因突变造成的遗传性淋巴水肿,且所述基因不是VEGFR-3。
18.筛选内皮细胞疾病或患该疾病的倾向性的方法,包括:
从人类受试者获得含有内皮细胞mRNA样品;
根据样品中从所述基因转录的mRNA的量测定BEC或LEC基因的表达,其中所述BEC或LEC基因编码表3或4中鉴定的多肽。
19.监测药物对内皮细胞的效力或毒性的方法,包括以下步骤:
将药物给药受试动物前后,测定受试哺乳动物内皮细胞中至少一种BEC或LEC基因的表达,其中至少一种BEC或LEC基因编码表3中所述的多肽,并且其中BEC或LEC基因的表达的改变与药物对内皮细胞的效力或毒性相关。
20.鉴定调节内皮细胞的生长的化合物的方法,包括:
在存在或缺乏化合物的条件下培养内皮细胞;
测定细胞中至少一种BEC或LEC基因的表达,其中的BEC或LEC基因选自编码表3和4中的多肽的基因;与缺乏该化合物的情况相比,存在该化合物时至少一种BEC基因的表达改变表明该化合物是BEC生长的调节物;且与缺乏该化合物的情况相比,存在该化合物时至少一种LEC基因的表达改变表明该化合物是LEC生长的调节物。
21.权利要求20的筛选选择性调节BEC或LEC的生长或分化的化合物的方法,
其中所述测定步骤包含测定细胞内至少一种BEC基因和至少一种LEC基因的表达,和
所述方法包含通过筛选差异调节至少一种BEC基因的表达和至少一种LEC基因的表达的化合物,筛选选择性地调节BEC或LEC的生长或分化的化合物。
22.一种组合物,包含:
一种分离的多核苷酸,包含编码含有选自SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293,或391的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列;和
可药用的稀释剂,载体或佐剂。
23.权利要求22的组合物,包含含有选自SEQ ID NO:14-30,45,47,49,51,82,93,111,188,208,212,222,236,242,294,或392的核苷酸序列的多核苷酸,或编码所述多肽的所述多核苷酸的片段。
24.一种表达载体,包含与一种多核苷酸可操作地连接的表达控制序列,所述多核苷酸包含编码含有选自SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293或391的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
25.权利要求24的表达载体,是含有该多核苷酸的复制缺陷的腺病毒或腺伴随病毒载体。
26.一种组合物,包含权利要求24或25的表达载体以及可药用的稀释剂,载体或佐剂。
27.一种试剂盒,包含权利要求22,23或26之一的组合物,所述组合物与将其给药受试哺乳动物来调节该受试动物的淋巴系统的说明包装在一起。
28.使用权利要求24的表达载体转化或转染的宿主细胞。
29.制备LEC多肽的方法,包括在细胞表达该多核苷酸编码的多肽的条件下,使权利要求28的宿主细胞生长。
30.纯化并分离的多肽,包含选自SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,81,187,207,211,221,235,241,293或391的氨基酸序列。
31.纯化并分离的多肽,其包含的氨基酸序列选自以下序列:
(a)SEQ ID NO:31-34,46,48,207,676,859或861;以及
(b)(a)的氨基酸序列的至少10个氨基酸的细胞外区片段。
32.权利要求31的纯化并分离的可溶性多肽,包含选自SEQ ID NO:31-34,46,48,207,676,859或861的氨基酸序列的胞外区片段,其中所述多肽缺乏任何跨膜区。
33.权利要求32的多肽,所述多肽缺乏任何细胞内区。
34.一种融合蛋白,包含权利要求32或33的多肽,所述多肽与包含免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白片段融合。
35.一种组合物,包含权利要求30-34之一的多肽或蛋白,以及可药用的稀释剂,载体或佐剂。
36.一种试剂盒,包含权利要求35的组合物,以及将所述药物组合物给药受试哺乳动物以调节所述受试动物的淋巴系统的说明。
37.一种抗体,其与权利要求30-34之一的多肽特异性结合。
38.权利要求37的抗体,其是一种人化的抗体。
39.一种蛋白质,包含与权利要求30-34之一的多肽特异性结合的抗体的抗原结合区,其中所述蛋白与该多肽特异性结合。
40.鉴定LEC核酸的方法,包括:
(a)使含有候选LEC核酸的生物样品与一种多核苷酸或其互补序列在严格的杂交条件下接触,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1-30,45,47,49,51,82,93,111,188,208,212,236,242,294或392的序列的至少14个连续核苷酸的片段,所述严格的杂交条件是:
(i)42℃,在含有50%甲酰胺,5xSSPE,5x Denhardt′s溶液,0.1%SDS和0.1mg/ml变性的鲑精DNA的溶液中杂交20小时,和
(ii)5℃,在1xSSC,0.1%SDS中洗涤30分钟;和
(b)检测所述候选LEC核酸和所述多核苷酸的杂交,由此鉴定LEC核酸。
41.鉴定LEC蛋白的方法,包括:
(a)使含有候选LEC蛋白的生物样品与权利要求37的抗体或权利要求39的蛋白之一的LEC蛋白结合配偶体在适合二者结合的条件下接触;和
(b)检测所述候选LEC蛋白和所述LEC结合配偶体之间的结合,从而鉴定LEC。
42.鉴定LEC的方法,包括:
(a)使含有细胞的生物样品和LEC结合配偶体在适宜两者结合的条件下接触,其中所述LEC结合配偶体包含与一种多肽结合的抗体,所述多肽含有SEQ ID NO:31-34,46,48,207,676,859或861的序列,或包含所述抗体的抗原结合片段;和
(b)通过检测细胞和所述LEC结合配偶体之间的结合鉴定LEC,其中LEC结合配偶体与细胞的结合鉴定LEC。
43.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸突变,所述突变与遗传性淋巴水肿基因型相关,并且与相应的野生型等位基因编码的多肽的氨基酸序列相比,所述突变改变人类受试者的至少一种等位基因编码的氨基酸序列,其中所述野生型多肽是表3中鉴定的多肽。
44.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸中的突变,所述突变与遗传性淋巴水肿基因型相关,并且与相应的野生型等位基因编码的多肽的氨基酸序列相比,所述突变改变人类受试者的至少一种等位基因编码的氨基酸序列,其中所述野生型多肽包含选自SEQ ID NO:31-44,46,48,52,54,207,676,859或861的氨基酸序列;
(b)使核酸中的所述突变的存在或缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,其中核酸中存在所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性增加相关,并且核酸中缺乏所述的突变与患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关。
45.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸的突变,其中与野生型等位基因编码的转录因子多肽的转录调节活性相比,所述突变改变了该人类受试者的至少一种转录因子的等位基因编码的氨基酸序列,还改变该等位基因编码的转录因子多肽的转录调节活性,
其中所述野生型转录因子多肽包含SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:211,或SEQ ID NO:241的氨基酸序列,以及表5中的序列编码的转录因子;和
(b)使核酸中所述突变的存在或缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,其中其中核酸中存在所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性增加相关,并且核酸中缺乏所述的突变与患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关。
46.权利要求45的方法,其中所述野生型转录因子等位基因包含表示为SEQ ID NO:54的Sox18氨基酸序列。
47.权利要求46的方法,其中与所述测定鉴定了改变反式激活或Sox18等位基因编码的蛋白的DNA结合区氨基酸序列的突变。
48.权利要求46的方法,其中与野生型SOX18对所述基因的转录活化相比,所述突变减少SOX18应答型基因的转录活化。
49.测定患遗传性淋巴水肿的危险性的方法,包括:
(a)检测人类受试者的核酸的突变,其中与野生型等位基因编码的粘附多肽的结合亲合力相比,所述突变改变了该人类受试者的至少一种转录因子的等位基因编码的氨基酸序列,还改变了该LEC等位基因编码的粘附多肽的结合亲合力,
其中所述野生型粘附多肽包含选自SEQ ID NO:31-34,46,207,676,859或861的氨基酸序列;和
(b)使核酸中所述突变的存在或缺失与患遗传性淋巴水肿的危险性相关,其中核酸中存在所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性增加相关,并且核酸中缺乏所述突变与患遗传性淋巴水肿的危险性不增加相关。
50.权利要求43-49之一的方法,其中所述测定鉴定了突变的存在,并且所述相关步骤鉴定了所述病人患遗传性淋巴水肿的危险性增加。
51.筛选人类受试者患遗传性淋巴水肿的危险性增加的方法,包括测定人类受试者的核酸突变,所述突变改变了该核酸编码的至少一种多肽的氨基酸序列,所述多肽包含表3的氨基酸序列。
52.权利要求51的方法,其中所述多肽包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,和54,207,676,859,和861之一的氨基酸序列,并且与患遗传性淋巴水肿的危险性相关。
53.权利要求52的方法,其中所述多肽包含以SEQ ID NO:54表示的SOX18氨基酸序列。
54.权利要求43-53之一的方法,其中所述方法包括以下步骤中的至少一步:
(a)测定人类受试者的至少一种多核苷酸的至少一种密码子的核苷酸序列;
(b)进行杂交试验以测定来自人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同;
(c)进行多核苷酸迁移试验来测定来自人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同;和
(d)进行限制性核酸内切酶消化试验确定人类受试者的核酸具有的核苷酸序列与一种或多种对照序列相同还是不同。
55.权利要求43-53之一的方法,其中所述方法包括:进行聚合酶链反应(PCR)来扩增包含所述LEC多核苷酸的编码序列的核酸,并测定所扩增的核酸的核苷酸序列。
56.筛选人类受试者的遗传性淋巴水肿基因型的方法,包括:
(a)提供包括来自所述人类受试者的核酸的生物样品;和
(b)分析所述核酸中突变的存在,与编码选自SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,54,207,676,859或861的氨基酸序列的人类基因相比,所述突变改变了人类受试者中至少一种基因的至少一种等位基因所编码的氨基酸序列,其中人类受试者中存在的突变改变上述氨基酸序列的方式与人类受试者的淋巴水肿相关可鉴定遗传性淋巴水肿。
57.权利要求56的方法,其中所述生物样品是细胞样品。
58.权利要求56的方法,其中所述分析包括测定所述核酸的部分序列。
59.权利要求56的方法,其中所述人类受试者具有由筛选法所鉴定的遗传性淋巴水肿基因型。
60.权利要求49的方法,其中至少一种基因对应于编码SEQ ID NO:54的氨基酸序列的人Sox18基因。
61.抑制淋巴管生成的方法,包括:
给药受试者LEC跨膜多肽的抑制物,
其中所述LEC跨膜多肽包含选自SEQ ID NO:31-34,46 48,207,676,859或861的氨基酸序列,而且
其中所述抑制物选自:
(a)LEC跨膜多肽的可溶性细胞外区片段;
(b)与LEC跨膜多肽胞外区结合的抗体;
(c)一种多肽,包含(b)的抗体的抗原结合区;和
(d)一种反义核酸,与编码LEC跨膜多肽和其互补物的核酸互补。
62.权利要求61的方法,其中所述抑制物是包含LEC多肽的胞外区片段的多肽,其中所述胞外区的序列选自SEQ ID NO:31的氨基酸1-152,SEQ ID NO:32的氨基酸1-695或SEQ ID NO:33的氨基酸1-248。
63.权利要求61或62的方法,其中所述受试者是患有肿瘤的人。
64.调节哺乳动物受试者的淋巴管生成的方法,包括:将LEC多核苷酸的反义分子以有效抑制LEC多核苷酸编码的多肽的转录或翻译的量,给药需要调节淋巴管生成的受试哺乳动物,其中所述LEC多核苷酸包含选自SEQ ID NO:14-30,45,47,49,51,208,677,860或862的核苷酸序列。
65.治疗遗传性淋巴水肿的方法,包括:
(a)鉴定患有遗传性淋巴水肿的人类受试者,与包含SEQ ID NO:31-44,46,48,50,52,54,207,676,859,和861之一的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列相比,该人类受试者具有的突变改变了其至少一种多肽的氨基酸序列;并且
(b)将VEGF-C多核苷酸,VEGF-C多肽,VEGF-D多核苷酸或VEGF-D多肽的淋巴管生长因子给药所述受试者。
66.调节内皮细胞或者内皮前体细胞的生长的方法,包括将内皮细胞或内皮前体细胞与包含调节细胞内的prox-1转录调控的试剂接触,其中所述试剂选自:
(a)prox-1多肽;
(b)编码prox-1多肽的多核苷酸;或
(c)prox-1的反义分子。
67.权利要求66的方法,其中所述细胞包括培养的内皮细胞或内皮前体细胞,而且接触是离体进行的。
68.权利要求67的方法,其中所述接触包括将所述试剂加入培养基中。
69.权利要求66-68之一的方法,其中所述细胞包括内皮前体细胞。
70.权利要求66-69之一的方法,其中所述细胞在接触步骤之后被引入受试哺乳动物中。
71.权利要求70的方法,其中所述受试者是人。
72.权利要求71的方法,其中的人类受试者患有LEC疾病。
73.提高人类受试者中的LEC的功能的方法,包括:
从人类受试者中分离内皮细胞或内皮前体细胞;
用包含编码prox-1多肽的核苷酸序列的表达载体转化或转染所述内皮细胞,以促进LEC的分化或生长;和
转化或转染步骤后,将LEC细胞给予人类受试者。
74.权利要求73的方法,其中所述分离和给药步骤中的人类受试者相同。
75.权利要求73或74的方法,其中所述人类受试者患有淋巴水肿。
76.权利要求73-75之一的方法,其中所述载体和转化或转染方法被选用于prox-1的瞬时表达。
77.权利要求73-75之一的方法,其中所述表达载体是复制缺陷的腺病毒载体。
78.分离的多肽,其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸61-127具有至少95%的同一性。
79.权利要求78的多肽,其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸30-152具有至少95%的同一性。
80.一种可溶性多肽,包含SEQ ID NO:31中的氨基酸序列的片段,其中所述片段缺乏SEQ ID NO:31的跨膜和细胞内氨基酸。
81.一种分离的多肽,包含SEQ ID NO:32的至少一个富含亮氨酸的区。
82.权利要求81的分离的多肽,其中所述多肽缺乏SEQ ID NO:32的跨膜氨基酸。
83.一种分离的多肽,包含SEQ ID NO:33的至少一个富含亮氨酸的区。
84.权利要求81的分离的多肽,其中所述多肽缺乏SEQ ID NO:33的跨膜氨基酸。
85.一种分离的多肽,其包含的氨基酸序列与包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的多肽的片段具有至少95%的同一性,
其中所述片段包含至少一个血小板反应蛋白I型同上序列。
86.权利要求85的分离的多肽,其中所述片段包括SEQ ID NO:111的六个血小板反应蛋白I型重复序列。
87.一种分离的多肽,其包含的氨基酸序列与包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的多肽的片段具有至少95%的同一性,
其中所述片段包括至少一个免疫球蛋白C-2型结构域。
88.权利要求85的分离的多肽,其中所述片段包含SEQ ID NO:111的三个免疫球蛋白C-2类型结构域序列。
89.一种融合蛋白,包含权利要求78-88之一的多肽和一种异源性多肽。
90.一种抗体,其特异性地与权利要求78-88之一的多肽结合。
91.一种多核苷酸,其包含编码权利要求78-89之一的多肽的核苷酸序列。
92.包含权利要求91的多核苷酸的表达载体,其可操作地连接于表达控制序列。
93.权利要求92的表达载体,其是复制缺陷的腺病毒载体。
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