KR101087617B1 - Ｅｎｉｇｍａ―Ｍｄｍ２ 상호작용 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Enigma-Mdm2 상호작용 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 암세포에서 Enigma의 발현 또는 활성 억제가 Mdm2의 불안정화와 p53의 활성화를 유도함으로써 효과적인 암세포 사멸을 유도할 수 있으며, SRF에 의하여 유도되는 Enigma가 Mdm2와 함께 암조직에서 과발현됨을 측정함으로써 항암제 치료의 예후를 평가할 수 있으며, Enigma와 Mdm2 간의 특이적 상호결합을 저해하는 인자를 선별함으로써 항암 활성 물질을 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 Enigma-Mdm2 상호작용 및 Enigma의 발현 조절은 암 예방 및 치료 방법, 및 항암제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
Enigma, Mdm2, p53.

Description

Ｅｎｉｇｍａ―Ｍｄｍ２ 상호작용 및 그 용도{Enigma―Mdm2 interaction and uses thereof}
본 발명은 Enigma-Mdm2 상호작용 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 Enigma과 Mdm2 간의 상호작용 및 Enigma 발현 조절을 이용한 암 치료 방법 및 항암제 개발에 관한 것이다.
PDLIM7 단백질 Enigma는 아미노말단에 PDZ 도메인을 가지고, 카르복실 말단에 세 개의 LIM 도메인을 가지고 있다(Bach, Mech.Dev. 91, 5-17,2000). 상기 PDZ 도메인은 베타-트로포마이신(β-tropomyosin)과 같은 액틴(actin) 결합 단백질과 상호작용한다(Guy et al., Mol.Biol.Cell. 10, 1973-1984,1999). 상기 Enigma의 LIM 도메인은 세 개의 Zinc 핑거로 구성되며 단백질 키나제 또는 인슐린 신호전달의 연결인자등과 결합한다(Barres et al., Mol. Endocrinol. 20, 2864-2875, 2006; Kuroda et al., J.Biol.Chem.,271, 31029-31032,1996; Wu et al., J.Biol.Chem., 271, 15934-15941,1994). 또한, Enigma는 갑상선 암 유발 인자인 Ret/ptc2와 결합하여 활성화시킨다(Durick et al., Mol. Cell. Biol., 18, 2298-2308,1998). 또한, Enigma는 Smad 유비퀴틴 조절 인자 1(Smad ubiquitin-regulatory factor 1)과 상호작용하여 뼈 형성을 촉진시킨다(Sangadala et al., J.Biol.Chem., 281,17212-17219,2006). 그러나, Enigma의 정확한 세포내 기능은 명확하게 보고된 바 없다.
p53은 세포의 증식의 정지 및 사멸을 조절하는 유전자들을 조절하는 인자로서 비정상적인 세포들을 제거함으로써 정상세포가 암세포화되는 것을 막아주는 중요한 인자로 알려져 있다(Michael and Oren, Cncer Biol., 13, 49-58,2003). p53 활성은 정상세포의 생존을 위하여 매우 엄격하게 조절되고 있으며, 상기 조절을 주로 담당하는 것은 Mdm2(mouse double minute 2)이다. 상기 Mdm2는 p53을 유비퀴틴화시켜 분해하는 E3 유비퀴틴 리가제로써 p53의 세포내 농도를 조절한다(Haupt et al., Nature, 387, 296-299,1997; Honda et al., FEBS Lett.,420,25-27,1997; Kubbutat et al., Nature, 387,299-302,1997). 또한, Mdm2는 p53의 전사를 조절을 받아 발현이 조절되기도 하는 자율조절 고리(autoregulatory loop)를 형성한다(Michael and Oren, Cncer Biol., 13, 49-58,2003). 상기 Mdm2는 p53을 기질로 이용할 수 있으며, Mdm2 스스로를 유비퀴틴화시켜 분해할 수도 있다(Fang et al., J. Biol.Chem., 275,8945-8951,2000; Honda and Yasuda, oncogne, 19,4173-4176,2000). 이와 같은 Mdm2의 분해작용의 방향을 결정하는 것은 세포의 증식 상태를 결정하는 중요한 요소이다(Michael and Oren, Cncer Biol., 13, 49-58,2003). Mdm2를 안정화시켜 p53의 활성을 약화시킬 수 있다고 알려진 인자들로 YY1, Gankyrin, Daxx 및 SS18-SSX1이 있다. 상기 YY1은 Mdm2와 p53에 모두 결합하여 p53의 분해를 촉진시키고, Gankyrin은 Mdm2의 효소활성을 촉진시켜 p53의 분해를 촉진시킨다(Sui et al., Cell, 117,859-872,2004; Higashitsuji et al., Cancer cell, 8,75-87,2005). 상기 Daxx는 Mdm2와 결합하여 Mdm2를 안정화시키고 p53을 억제하지만, Mdm2의 자가 유비퀴틴화 활성에는 영향을 주지 않는다(Tang et al., Nat. Cell. Biol.,8,855-862,2006). 상기 SS18-SSX1 단백질은 Mmd2의 자가 유비퀴틴화를 억제하여 p53의 활성을 억제하나, 암 세포에서만 특이적으로 발현한다(D'Arcy et al., Mol.Cacncer Res., 6,127-138,2008). Enigma 단백질은 Mdm2의 자가 유비퀴틴 분해를 억제하여 p53의 분해를 촉진시키는 점에서 여타의 인자들과 비슷하지만, Mdm2에만 결합하여 p53의 분해를 촉진시키는 점에서 보다 정확한 기전을 제시해 준다.
세포의 증식을 촉진시키는 혈청(serum) 또는 성장인자(HGF 또는 FGF)에 의하여 Mdm2의 발현이 증가되나(Feng et al., J. Biol.Cehm., 279, 35510-35517,2004), 그 기전에 대하여 의견이 명확하지 않다. Enigma는 SRF에 의하여 전사 수준에서 활성화되어 발현이 높아진다(Chai and Tarnawski, J. physiol. Pharmarcol., 53, 147-157,2002).
이에, 본 발명자들은 종래 알려진 Mdm2의 조절 인자와는 구분되는 Enigma의 기능을 알아보기 위해 연구한 결과, Enigma의 Mdm2-p53의 유비퀴틴 프로테오좀 분해의 조절 기작을 규명하고, 세포증식 조건에서 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 존재를 새 롭게 밝혔다. 아울러 암 세포에서 Enigma의 과발현의 의미가 항암제 내성을 유도한다는 것을 밝혔다. 따라서, 암 세포에서 Enigma의 발현 억제를 통해 p53를 활성화시킬 수 있고, Enigma-Mdm2 상호결합 저해 인자를 선별하여 항암제를 스크리닝할 수 있으며, 항암제 치료시에 Enigma의 발현 정도를 확인하여 항암 효과 확인에 이용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Enigma의 세포내 기능과 암 발생 및 암세포의 생존과의 관련성을 규명하고, Enigma의 발현을 저해함으로써 암세포의 사멸을 유도하는 방법을 제공하며, Enigma와 Mdm2 간의 상호결합 또는 Enigma에 의한 Mdm2와 p53의 발현조절을 이용하여 항암제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Enigma의 발현 또는 활성 억제를 통하여 Mdm2(mouse double minute 2)의 안정성을 감소시키고, p53의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Enigma의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 또는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 Enigma의 발현 또는 활성 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Enigma에 의존적인 Mdm2 또는 p53의 발현 수준을 이용한 항암제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Enigma와 Mdm2 간의 상호결합 수준을 이용한 항암제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 암세포에서의 Enigma 발현 수준을 이용한 암의 진단, 치 료 결과 확인 또는 예후를 평가하는 방법, 및 이를 위한 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 보는 바와 같이, 암세포에서 Enigma의 과발현은 Mdm2의 안정화와 p53의 억제를 초래하는데, 이는 Mdm2의 자가 유비퀴틴화의 억제와 p53 유비퀴틴화 증가로 인한 것임을 확인하였다. 따라서, Enigma의 발현을 억제함으로써 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있고, 암 환자에서 Enigma의 발현을 측정함으로써 항암 치료시의 예후를 평가할 수 있으며, Enigma와 Mdm2 간에 특이적 상호결합을 확인하여 이를 억제하는 물질을 선별함으로써 Mdm2의 안정화를 약화시키고 p53의 활성을 증가시켜 항암활성을 나타낼 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.
이하, 본 발명에서 사용되는 용어들을 정의한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 성장 또는 전이를 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정 의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 암의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Enigma의 발현 또는 활성 억제를 통하여 Mdm2(mouse double minute 2)의 안정성을 감소시키고, p53의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 Enigma의 발현에 의존적으로 Mdm2의 안정성이 조절되는 것을 확인하였고(도 2a, 도 2d 및 도 2e 참조), Mdm2는 p53을 기질로 하는 E3 리가제이므로 Mdm2의 안정화가 p53의 유비퀴틴 프로테오좀 분해를 촉진하여 p53의 세포내 기능을 억제하는 것을 확인하였으며(도 2a, 도 2b, 도 2d 및 도 2e 참조), Enigma에 의하여 Mdm2의 자가 유비퀴틴화가 억제되고 p53의 위비퀴틴화가 증가됨을 확인하였다(도 5a 내지 도 5d 참조).
또한, 본 발명자들은 Enigma에 의한 Mdm2-p53의 발현조절이 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해, 성장 촉진 인자에 의한 세포증식유도 조건에서 Enigma의 기능을 확인한 결과, Enigma는 SRF에 의하여 그 발현이 촉진되고(도 6a 내지 도 6f 참조), Mdm2를 안정화시켜 p53을 억제함으로써 세포증식에 도움을 주는 역할을 하고 있는 것으로 나타났다(도 7a 내지 도 7e 참조)
본 발명의 Enigma의 발현 또는 활성 억제는 Enigma 유전자의 전사를 억제하는 물질, 전사된 Enigma mRNA의 번역을 억제하는 물질, 또는 Enigma 단백질의 기능을 억제하는 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 전사를 억제하는 물질로는 Enigma 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있는 프로모터, 인핸서(enhancer), 프로모터에 결합되는 전사조절인자에 결합하는 단백질 또는 화합물을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 mRNA의 번역을 억제하는 물질로는 저분자 화합물, 안티센스 핵산 서열의 제조나 RNAi 테크닉을 이용한 RNA, siRNA 또는 shRNA 등을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이를 구체적으로 살펴보면 하기와 같다:
1) RNAi
RNA 간섭(RNAi)은 Enigma 유전자에 대응하는 두 가닥 사슬 RNA(dsRNA)를 세포 또는 유기체에 도입함으로써 대응하는 mRNA의 분해가 일어나는 전사 후 유전자 사일런싱 메카니즘(post-transcriptional gene silencing mechanism)이다. 상기 RNAi 효과에 의해 유전자 발현이 복귀되기 전에 다중 세포 분열이 지속되므로 RNAi는 RNA 레벨에서 목표로 하는 녹아웃(knockout) 또는 '녹다운(knockdown)'을 만드는 매우 강력한 방법이다. RNAi는 인간의 배아 신장(embryonic kidney) 및 HeLa 세포를 포함한 인간 세포에서 성공적임이 확인되었다(Elbashir et al. Nature May 24;411(6836):494-8, 2001).
유전자 사일런싱에서의 RNAi 기술은 표준 분자 생물학 방법을 이용한다. 불활성화시킬 표적 유전자의 서열에 대응하는 dsRNA는 표준 방법, 예를 들면 T7 RNA 중합효소를 이용한 주형 DNA의 양 가닥 동시 전사에 의해 생성할 수 있다. RNAi에 사용되는 dsRNA의 생성 키트는 상업적으로 판매되는 제품(예를 들면, New England Biolabs, Inc.사의 제품)을 사용할 수 있다. dsRNA 또는 dsRNA를 제조하도록 처리된 플라스미드의 트랜스펙션 방법은 종래 공지의 기술이다.
2) 안티센스 핵산 서열
Enigma를 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 핵산 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 Enigma를 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 Enigma 코딩가닥 또는 단지 그들의 일부(예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 Enigma mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있으나, Enigma mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 단지 일부(예: 번역 개시부)에만 안티센스인 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 안티 센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 약 5 내지 50 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 공지의 방법을 이용한 화합 합성 및 효소 결합 반응을 이용하여 구성할 수 있다. 화학 합성법, 예를 들어 문헌[Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008]에 기재된 바와 같이 아세토니트릴 중에서 테트라에틸티우람 디술파이드로 황화시키는 포스포아미다이트 화학과 같은 방법에 의해 매우 용이하게 제조할 수 있다. 상기 안티센스 핵산의 생성에 사용될 수 있는 변형 뉴클레오티드의 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오드우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시히드록실메틸)우라실, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 5-카복실메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노 메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 2,6-디아미노푸린, 5-메틸-2-티오우라실, 우라실-5-옥시아세트산(v), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닐, 5-메틸-2-티오우라실, (acp3)w 및 와이부톡소신일 수 있다. 필요에 따라서, 상기 안티센스 핵산은 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성할 수 있다.
상기 Enigma 단백질의 기능을 억제하는 물질로는 상기 단백질에 결합하는 펩 타이드, 항체, 화합물 또는 펩티드 미메틱스 등을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이를 구체적으로 살펴보면 하기와 같다:
1) 펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)
Enigma 폴리펩티드의 단백질 결합 도메인을 억제한 미메틱스(예, 펩티드 또는 비펩티드성 약제)를 제작하여 원래의 Enigma 폴리펩타이드가 VHL에 결합하는 것을 억제할 수 있다(유럽특허출원 EP 0412765 및 EP 0031080).
비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J Med Chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al. in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al. Biochem Biophys Res Commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.
본 발명에서는 Enigma의 발현을 억제하기 위해 Enigma-siRNA 발현벡터(siEnigma)를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, Enigma의 mRNA에 상보적인 서열이며, 바람직하게는 서열번호 2(5'-AGACCTTCTACTCCAAGAA-3')로 기재되고 H1 프로모터에 의해 발현되도록 pSuper 플라스미드 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 또한, 세포내로 전달 및 발현을 원하는 유전자를 제공하는 아데노바이러스 제작용 pShuttle 벡터에 상기 제작된 pSuper 플라스미드 벡터를 제한효소로 처리하여 H1 프로모터, Enigma-siRNA, 전사종료 서열인 다섯 개의 T 염기(T5)까지 함유하는 아데노바이러스 제작용 Enigma-siRNA 발현벡터를 제작하였다. 아울러, Enigma의 mRNA가 CMV 프로모터에 의하여 발현되도록 pCMV-Taq2b 벡터에 클로닝한 후, 세포내로 전달이 용이하도록 아데노바이러스 F-Enigma를 제작하였다(도 1a 내지 도 1c 참조).
또한, 본 발명은 Enigma의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 또는 항암 보조제를 제공한다.
상기 Enigma의 발현 억제제는 Enigma 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 RNAi로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 Enigma의 활성 억제제는 Enigma 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 위암, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 Enigma 및 Mdm2이 각 종 암조직에서 과발현되는 것을 확인하였고(도 10a 및 도 10b 참조), 암세포에서 Enigma의 과발현이 항암제 내성을 유도하는 것을 확인하였으며, Enigma의 발현을 억제하는 siEnigma를 처리하는 경우 암세포의 효과적인 사멸을 유도하는 것을 확인하였다(도 11a 내지 도 11e 참조). 따라서, Enigma의 발현 또는 활성 저해제는 암세포의 효과적인 사멸을 유도함으로써 항암 치료제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있으며, 항암제 내성을 억제함으로써 항암 보조제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 항암용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량 %로 포함한다.
본 발명의 항암용 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 항암용 조성물은, 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또 는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 Enigma의 발현 또는 활성 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 Enigma에 의존적인 Mdm2 또는 p53의 발현 수준을 이용한 항 암제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 Enigma의 발현에 의존적으로 Mdm2이 안정화되어 발현이 증가하고 상기 Mdm2을 매개로 p53의 발현이 감소하기 때문에, 상기 Enigma 또는 Mdm2의 발현을 감소시키거나 p53의 발현 수준을 증가시키는 물질을 선별함으로써 항암 활성을 가지는 물질을 스크리닝할 수 있다.
구체적으로, 상기 스크리닝 방법은
1) 후보물질을 Enigma 및 Mdm2를 발현하는 세포에 처리하는 단계;
2) Enigma 또는 Mdm2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 Enigma 또는 Mdm2의 발현 수준을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 스크리닝 방법은
1) 후보물질을 Enigma, Mdm2 및 p53를 발현하는 세포에 처리하는 단계; 및
2) p53의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 p53의 발현 수준을 증가시킨 후보물질을 선별하는 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 후보물질은 핵산, 단백질, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 발현 수준은 유전자의 전사 활성 수준을 측정 하거나 발현된 단백질량을 측정할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 전사활성 수준은 루시퍼라제 분석법(Luciferase Assay)을 이용하는 것이 바람직하고, 단백질량은 웨스턴블랏(Western blot) 분석법을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 Enigma와 Mdm2 간의 상호결합 수준을 이용한 항암용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명자들은 Enigma와 Mdm2가 직접 상호결합하고, p53과는 Mdm2를 통하여 간접적으로 결합하고 있다는 사실을 확인하였다(도 2a 내지 도 2c 참조). 또한, Enigma의 LIM3 부위와 Mdm2의 401-491(RING 도메인 부위)에 결합하는 것을 확인하였다(도 2d 내지 도 2g 참조). 따라서, Enigma와 Mdm2 간의 상호결합을 저해하는 물질은 Mdm2의 안정화를 약화시키고 p53을 활성화시켜 항암 활성을 가지는 물질이 될 수 있음을 알 수 있다.
상기 스크리닝 방법은
1) 후보물질이 존재 또는 부존재하는 조건하에서 Enigma 및 Mdm2를 접촉시키는 단계;
2) Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
3) 후보물질의 부존재시에 비해 Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 스크리닝 방법은
1) Enigma 및 Mdm2를 발현하는 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계;
2) 세포내 Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
3) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 세포내 Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 후보물질은 핵산, 단백질, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 결합은 면역침강(immunoprecipitation) 방법에 의해 측정될 수 있다. 면역침강은 예를 들면, 문헌에 있는 방법에 의해 수행될 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988). SDS-PAGE는 면역침강된 단백질들의 분석에 일반적으로 사용되고, 결합된 단백질은 적합한 농도의 겔(gel)을 이용하여 단백질의 분자량에 의해 분석될 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 세포들을 이용하는 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 이용될 수 있다("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); 참고문헌 Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992; Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994).
상기 스크리닝 방법에 있어서, 표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 이용한 바이오센서(biosensor)는 본 발명에서 결합된 물질들을 탐지 또는 정량하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 상기 바이오센서가 사용될 때, 상기 결합에 의한 상호작용은 표면 플라즈몬 공명 시그날(signal)로서 실시간 관찰될 수 있다.
또한, 본 발명은 Enigma와 반응하는 항체 또는 Enigma 유전자에 상보적인 핵산 중 어느 하나 이상을 이용하여 암세포에서의 Enigma 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단, 치료 결과 확인 또는 예후를 평가하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Enigma와 반응하는 항체 또는 Enigma 유전자에 상보적인 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 암세포에서 Enigma의 과발현을 확인한 결과, SRF, Enigma 및 Mdm2가 사람의 간암 세포와 위암세포에서 과발현되어 있음을 확인하였고(도 9a 및 도 9b 참조), 암세포에서 Enigma의 발현 수준에 의존적으로 암세포의 성장 및 항암제 내성이 유도되는 것을 확인하였다(도 10a 내지 도 12e 참조). 따라서 Enigma의 발현 수준을 측정함으로써, 항암 치료시에 약물의 암세포에 대한 사멸 정도를 확인할 수 있으며, 항암 치료의 예후를 평가하는 방법으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 암 진단 방법에 있어서, 정상 이상으로 상승된 Enigma의 발현 검출은 환자가 암에 걸렸음을 의미한다. 또한, 암으로 치료를 받았거나 받고 있는 개체의 진단시료에서 Enigma의 정상적인 발현 검출은 암 치료가 성공적임을 의미하고, 상기 진단시료에서 정상 이상으로 상승된 Enigma의 검출은 치료를 계속해야 한다는 것을 의미한다. 아울러, 암에 걸린 개체의 진단시료에서 Enigma의 정상적인 발현 검출은 예후가 좋다는 것을 의미하고, 상기 진단시료에서 정상 이상으로 상승된 Enigma의 검출은 예후가 좋지 않다는 것을 의미한다.
본 발명의 암 진단용 키트는, Enigma와 반응하는 하나 이상의 물질 및 반응 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, Enigma와 반응하는 하나 이상의 물질은 Enigma의 RNA 또는 DNA에 상보적인 RNA 또는 DNA, 및 Enigma 단백질에 결합하는 항체일 수 있고 반응 생성물 검출용 시약은 핵산 또는 단백질 표지 및 발색시약일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는것은 아니다.
<실시예 1> Enigma에 의한 MDM2의 안정화와 이에 따른 p53의 분해
본 발명자들은 한국생명공학연구원으로부터 제공받은 Enigma cDNA(서열번호: 1)를 함유하는 벡터를 주형으로 하여 PCR 방법으로 얻어진 절편을 pCMV taq2B (Stratagene,USA)에 클로닝하여 Enigma를 과발현하는 벡터를 제작하였다. PCR 조 건은 하기와 같다: DNA 중합효소(pfu polymerase(Vent), New England Bioscience, USA)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 94℃에서 4분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 5분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 또한, Enigma의 발현을 특이적으로 저해하는 5'-AAAGACCTTCTACTCCAAGAA-3'(서열번호: 2)의 뉴클레오타이드 절편을 pSuper 플라스미드 벡터에 Hind III/Bgl II 부위에 클로닝를 제작하였다(도 1b). 또한, 세포내로 용이한 도입을 위하여 siEnigma를 함유하는 아데노바이러스(도 1c)와 Flag-Enigma를 포함하는 아데노바이러스(도 1b)는 하기의 방법으로 제작하였다.
아데노바이러스 제작용 pShuttle(BD Bioscience, USA) 벡터에 상기에서 제작된 pSuper Enigma-siRNA 플라스미드를 Xba I/Hind III로 처리하여 H1 프로모터에서 T5 전사종료 서열을 함유하는 DNA 절편을 클로닝함으로써 제작하였다(pShuttle/Enigma-siRNA). F-enigma를 발현하는 아데노바이러스 제작을 위하여 상기 제작된 pCMV taq2B-Enigma로부터 Enigma 부위만을 NotI/XhoI으로 절단하고 이를 pCMV shuttle 벡터에 클로닝함으로써 제작하였다. 아데노바이러스 유전자를 포함하고 있는 pAdEasy-1과 pShuttle/Enigma-siRNA 및 pCMVshuttle-F-Enigma간의 재조합은 E. coli BJ5183 균주에 동시에 형질도입 함으로써 수행되었다. 대장균에서 상동재조합에 의해 얻어진 재조합 아데노바이러스 유전체 함유 플라스미드는 카나마이신 선택배지에서 자란 E. coli 콜로니로부터 DNA를 분리하여 제한 효소 분석을 통해 확인하였다.
재조합 아데노바이러스 유전체 함유 플라스미드에서 아데노바이러스 입자 제작은 하기와 같이 수행하였다. 재조합 아데노바이러스 유전체 함유 플라스미드를 Pac I으로 절단하여 아데노바이러스의 복제원점인 말단 반복서열(terminal repeat, TR)들이 양쪽 끝에 존재하도록 선형화하고 60-mm 배양접시에서 70-80%의 밀도로 자란 HEK293 세포에 칼슘 포스페이트 방법으로 도입하였다. 재조합 아데노바이러스 유전체 함유 플라스미드가 도입되어 아데노바이러스 입자가 만들어지는 세포는 2-3일 후 주위 세포보다 커졌고, 4-5일 후에 전체 세포의 약 50%가 뭉치거나 배지위로 떠올라 이를 배지와 함께 수거하여 바이러스 입자가 포함되는 일차 세포 추출액을 확보하였다. 세포 수거액을 동결-해빙(freezing-thawing) 방법을 통하여 세포 속 바이러스 입자까지 배지로 탈출하도록 하고, 이 상층액을 다시 100-mm 배양접시에 60-70% 정도로 준비된 세포에 재감염 시켜 바이러스의 존재 유무 및 재감염의 가능성을 확인하였다. 아데노바이러스 감염 후 증식에 의해 세포가 죽게 되면, 다시 수거하여 다량의 293 세포주 (ATCC)에 재감염시킴으로써 아데노바이러스 입자를 증폭하고 플라크 형성법을 이용하여 바이러스의 수를 결정하였다.
<1-1> Enigma에 의한 MDM2 안정화 검증
Enigma에 의한 프로테오좀 의존적 단백질분해(proteolysis)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 확인하였다. Flag-Enigma 발현 벡터를 농도별(+: 2μg, ++: 5μg)로 HLK3 세포주(전북의대, 한국)에 도입하고, 12시간 전에 MG132(10 μM)를 처리하거나 처리하지 않은 군을 수거하여 웨스턴블랏 방법으로 단 백질의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, Mdm2의 발현 정도는 Enigma의 발현에 의존적으로 높았으며, 반면에 p53 및 그 하위 분자 p21은 감소하였다(도 2 a).
<1-2> Enigma에 의한 p53의 발현억제와 전사활성 억제 검증
Enigma에 의한 p53의 발현 저해가 p53의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, p53 및 표적 유전자의 프로모터로 전사활성의 변화를 확인하였다. p53RE-Luc, Bax-Luc, p21-Luc의 리포터 유전자(0.5 μg)를 각각 Flag-Enigma(+: 2 μg, ++: 5 μg)와 농도별로 HLK3 세포주에 도입하고, 12 시간 전에 MG132(10 μM)를 처리하거나 처리하지 않은 군을 수거하여 리포터분석 방법(reporter assay)(Promega USA)을 실시하였다. 그 결과, p53 및 그 하위 분자의 전사활성은 Enigma의 발현에 농도 의존적으로 저해되는 것으로 나타났다(도 2b).
<1-3> Enigma에 의한 관련 분자들의 mRNA의 변화 검증
Enigma에 의한 Mdm2 및 p53의 발현변화가 mRNA 수준에서 발생하였는지 검증하기 위하여 노던블랏을 실시하였다. Flag-Enigma 발현 벡터를 농도별(+: 2μg, ++: 5μg)로 HLK3 세포주에 도입하고, 48시간 후 총(total) RNA를 분리(RNeasy kit, Qiagen)하여 각각의 프로브(probe)(p1/p2 Mdm2, p53, p21)로 노던블랏 방법을 실시하였다. 그 결과, Enigma의 발현량과 상관없이 p1-Mdm2, p53, p21의 mRNA 량은 일정하였으며, p53에 의하여 조절되는 p1-Mdm2의 mRNA의 양은 Enigma의 발현에 의존적으로 감소하였다(도 2c).
<1-4> Enigma에 의한 Mdm2 의존적 p53 억제
Enigma에 의한 p53 및 p21의 발현억제가 Mdm2 의존적인지 확인하기 위하여 Mdm2 -/- p53 -/- MEF 및 Mdm2 +/+ p53 -/- MEF 세포주(G. Lozano, M. D. ANDERSON CANCER CENTER)를 사용하였다. 상기 각각의 세포주에 p53을 발현하는 아데노바이러스벡터(Ad-p53)를 도입한 16시간 후, Ad-F-Enimga(50 MOI), Ad-Lacz(50 MOI), Ad-siEnigma(100 MOI), Ad-siControl(100 MOI)를 다시 도입하고 32시간 후에 세포를 수거하여 웨스턴블랏 방법으로 각각의 단백질의 발현변화를 확인하였다. 그 결과, Mdm2의 발현에 의존적으로 p53 및 p21의 발현이 감소하였다(도 2d).
<1-5> Enigma에 의한 p53 하위 분자의 억제
Enigma에 의한 p21의 발현억제가 p53을 경유한 것인지 그렇지 않은 것인지 p53 +/+ , p53 -/- 세포주를 사용하여 확인하였다. p53 +/+ 또는 p53 -/- 세포주에 Flag-Enigma, siEnigma를 도입하고 48시간 후에 세포를 수거하여 웨스턴블랏 방법으로 확인하였다. 그 결과, p21의 변화는 p53의 변화에 기인한 것으로 나타내었으며, Enigma에 의한 직접적인 영향은 없는 것으로 나타났다(도 2e).
<실시예 2> Enigma와 Mdm2간의 상호작용 검증
본 발명자들은 Enigma와 Mdm2 간의 상호작용을 검증하기 위하여, Enigma의 돌연변이체(F-PDZ, F-PDZ-LIM1, F-PDZ-LIM2, F-LIM)를 pCMV taq2B에 PCR 클로닝법으로 제작하고 Mdm2의 돌연변이체(GST-1-100, GST-101-491, GST-201-491, GST-301-491)를 pEBG에 PCR 클로닝 법으로 제작하였다. 시험관내(In vitro)에서 상호 결합을 확인하기 위하여 GST-Mdm 단백질을 대장균(E.coli)에서 GST-resin으로 분리 정제하였으며, Flag-Enigma와 p53은 포유류(mammalian) 세포주에 해당 벡터를 도입한 후 세포에서 면역침강(Immunoprecipitation; IP) 법으로 분리 정제하였다.
<2-1> 배양세포에서 Enigma와 Mdm2간의 결합에 p53의 역할 검증
p53 +/+ 또는 p53 -/- 의 대장암 세포주(HCT 116, ATCC)와 Mdm2 -/- p53 -/- MEF 및 Mdm2 +/+ p53 -/- MEF 세포주(G. Lozano, M. D. ANDERSON CANCER CENTER)에서 Enigma와 Mdm2-p53간의 상호결합을 IP 법으로 확인하였다. 그 결과, Enigma와 Mdm2 간의 상호작용은 p53과 상관없이 존재하였으며, Mdm2와 p53이 함께 존재하는 경우는 Enigma-Mdm2-p53의 결합체를 형성하는 것으로 나타났다(도 3a 및 도 3b).
<2-2> 시험관내( In vitro )에서 Enigma와 Mdm2의 상호작용 검증
각각의 단백질(1 μg GST-Mdm2, 0.5 μg F-Enigma, 0.5 μg p53) 간의 상호작용을 시험관에 직접 확인하기 위하여 시험관내 결합분석(in vitro binding assay)을 실시하였다. 각각의 단백질을 섞어 결합을 유도한 후, GST-pull down 및 IP 방법으로 단백질간의 결합여부를 확인하였다. 그 결과, Enigma는 Mdm2와 직접 결합하였으나, p53과는 Mdm2를 매개하여 결합하였다(도 3c).
<2-3> Enigma와 Mdm2 간의 결합부위 결정
Enigma와 Mdm2의 제작된 각각의 돌연변이체를 사용하여 두 분자 간의 결합부위를 결정하였다. 먼저, 각각의 Mdm2 돌연변이체(5 μg)를 Flag-Enigma가 항상 발현되도록 고안된 293 세포주에 도입하고, 이후 GST-pull down하여 Flag 항체로 웨스턴블랏하여 결합여부를 확인하였다. 아울러 각각의 Enigma 돌연변이체(5 μg)와 GST-Mdm2 발현벡터(5 μg)를 293T 세포주(ATCC)에 칼슘포스페이트 방법으로 도입시키고 24시간 후에 세포를 수거하여 Flag 항체로 IP하고 GST로 웨스턴 블랏하여 결합여부를 확인하였다. 그 결과, Mdm2의 301-491부위와 Enigma의 LIM(1-3)부위가 결합부위인 것으로 나타났으며, LIM3 부위만을 함유한 GST-LIM3 돌연변이체와 Mdm2간의 결합을 세포주 도입 후 GST-pull down하고 Mdm2로 웨스턴하여 확인하여 Enigma의 LIM3 부위가 Mdm2의 301-491에 결합한다는 것을 확인할 수 있었다(도 3d, 도 3e, 도 3f). 따라서 알려진 Mdm2-p53 간의 상호결합에 근거하여, Enigma의 "C" 말단과 Mdm2의 "C" 말단이 직접결합하고, Mdm2의 "N" 말단과 p53의 "N" 말단의 결합 구조를 알 수 있었다(도 3g).
<2-4> Enigma-Mdm2 결합의 특이성 검증
Enigma와 유사한 분자구조를 가진 ENH(Enigma homolog)를 대상으로 Mdm2와 결합여부를 확인하였다. Flag-ENH, Flag-Enigma 및 GST-Mdm2 발현벡터를 293T 세 포주에 칼슘포스페이트 방법으로 도입하고, 48시간 후 세포를 수거하여 GST-pull down하고, Flag 항체로 웨스턴블랏을 수행하였다. 그 결과, Mdm2와 ENH 간의 결합은 존재하지 않았다(도 4a). 아울러, F-ENH 발현벡터를 HLK3 세포주에 농도별(2, 5 μg)로 도입한 후, Mdm2 및 p53의 발현변화를 확인하였다. 그 결과, ENH는 Mdm2와 p53의 별현량에 영향을 주지 않았다(도 4b). 따라서 Enigma와 Mdm2 간의 결합 및 이에 따른 Mdm2의 발현증가가 특이적 상호작용임을 알 수 있었다.
<실시예 3> Enigma가 Mdm2의 자가 유비퀴틴화(self-ubiquitination)와 p53의 유비퀴틴화(ubiquitination)에 미치는 영향 검증
본 발명자들은 Enigma가 Mdm2와 직접 결합하여 Mdm2를 안정화시키고, Mdm2에 의한 p53의 분해를 촉진시키는 기전을 설명하기 위하여, Mdm2의 자가 유비퀴틴화와 p53 유비퀴틴화에 Enigma가 미치는 영향을 시험관내(in vitro)에서 검증하였다.
<3-1> 세포내에서 Mdm2와 p53의 유비퀴틴화에 Enigma가 미치는 영향
HLK3 세포주(전북의대, 한국)에 Flag-Enigma(5, 10 μg)와 siEnigma(10, 15 μg)를 농도별로 도입시키고 수거 12시간 전에 MG132를 처리하였다. 또 다른 293T 세포주에는 His-Ub(5 μg)와 F-Enigma(5, 10 μg)를 도입시키고 수거 12시간 전에 MG132를 처리하였다. 준비된 세포파쇄용액으로 각각의 항체로써 IP를 실시하고 Ub가 결합한 Mdm2와 p53의 증감을 Ub 항체와 His 항체로써 웨스턴블랏하여 확인하였다. 그 결과, Enigma가 과발현될수록 Mdm2의 유비퀴틴화는 감소하였고 p53의 유비 퀴틴화는 증가하였으며, Enigma의 발현이 억제될수록 Mdm2의 유비퀴틴화는 증가하였고 p53의 유비퀴틴화는 감소하였다(도 5a, 도 5b)
<3-2> Enigma에 의한 Mdm2의 자가 유비퀴틴화 저해와 p53의 유비퀴틴화 검증
Enigma의 결합에 의한 Mdm2의 자가 유비퀴틴화의 변화를 검증하기 위하여 시험관내 유비퀴틴화 분석(in vitro ubiquitination assay)을 실시하였다. GST-Mdm2 단백질(0.5 μg), F-Enigma 단백질(0.5, 1 μg), F-PDZ 단백질(0.5 μg), F-LIM 단백질(0.5 μg)에 유비퀴틴 반응 혼합물(Ubiquitin reaction mixture)(E1, E2, His-Ub, ATP 포함)를 넣고 반응시킨 후, 풀다운 분석(pull down assay)과 IP 방법을 사용하여 Mdm2의 자가 유비퀴틴화 변화와 결합단백질의 여부를 확인하였다. 그 결과, Mdm2와 결합하는 F-Enigma와 F-LIM에 의하여 Mdm2의 자가 유비퀴틴화가 억제 되었다(도 5c). 아울러 F-Enigma에 의한 Mdm2 의존적 p53의 유비퀴틴화는 증가하였다(도 5d). 따라서 Enigma가 Mdm2의 유비퀴틴화의 방향을 결정하여 주는 인자임을 알 수 있었다.
<실시예 4> 혈청반응인자(serum response factor; SRF)에 의한 Enigma의 전사조절 검증
본 발명자들은 혈청반응인자(SRF)가 Enigma의 프로모터 부위에 결합하여 Enigma 프로모터를 활성화시키는 기전을 설명하기 위하여, 혈청반응부위(serum response element; SRE)를 이용하여 Enigma의 전사 활성에 미치는 영향을 시험관 내(in vitro)에서 검증하였다.
<4-1> SRF에 의한 Enigma promoter의 조절검증
Enigma의 프로모터를 분석한 결과, 혈청반응부위(SRE)가 존재하는 것을 발견하였으며, 프로모터 서열중 SRE를 포함하거나 포함하지 않은 단편을 루시퍼라제를 가지고 있는 pGL2/3 벡터에 삽입하여 Enigma-Luc(pGL2), SRE-Luc, ΔSRE-Luc(pGL3) 리포터 벡터를 각각 제작하였다(도 6a). 상기 Enigma-Luc를 HLK3 세포주에 도입(0.5 μg)하고 0.1% FBS를 포함하는 DMEM에 24시간 동안 배양한 후, 5% 및 20% FBS를 첨가하여 다시 6시간 동안 배양한 다음, 세포를 수거하여 루시퍼라제활성을 측정하였다. 그 결과, 혈청의 농도에 의존적으로 Enigma-Luc의 활성도 증가하였다(도 6b).
<4-2> SRE 의존적 Enigma 프로모터의 활성화 검증
Enigma 발현의 SRF 의존성을 검증하기 위하여 제작한 SRE-Luc(0.5 μg), ΔSRE-Luc(0.5 μg)를 HLK3 세포주에 도입하고 0.1% FBS를 포함하는 DMEM에 24시간 동안 배양후 5% 및 20% FBS, FGF(20, 40 ng/ml), 또는 HGF (20, 40 ng/ml)를 첨가하여 다시 6시간 동안 배양한 다음, 세포를 수거하여 루시퍼라제활성을 측정하였다. 그 결과, SRE가 존재하는 리포터에서만 처리한 성장인자(growth factor)의 농도에 의존적으로 활성도 증가하였다(도 6c, 도 6d).
<4-3> Enigma 프로모터와 SRF의 결합특이성 검증
Enigma 프로모터의 SRE 부위[5'-CTATATAAGG-3'(서열번호: 3)]에 SRF가 특이적으로 결합하는지 여부를 시험관내 EMSA와 세포내 ChIP 분석을 실시하였다. EMSA 분석을 수행하기 위하여 혈청을 처리하거나 처리하지 않은 HLK3의 핵단백질 분획을 제조한 후, 방사선(32P-ATP)으로 표지된 SRE(5'-CTATATAAGG X3) 뉴클레오타이드와 반응시킨 다음, 항-SRF 항체와 다시 반응시켜 6%의 아크릴아마이드젤에서 그 결합여부를 확인하였다. 그 결과, Enigma의 SRE 부위와 SRF가 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다(도 6e).
또한, 배양 세포내에서 Enigma 프로모터에 SRF가 결합하는지 확인하기 위하여 실시한 ChIP 분석을 위하여, 혈청을 처리하거나 처리하지 않은 HLK3을 1% 포르말린으로 고정시킨 후, 세포를 수거하고 초음파로 파쇄하였다. SRF-DNA의 결합체를 항-SRF 항체로써 IP하여 얻은 후 결합하고 있는 DNA가 Enigma 프로모터의 SRE 부위인지 특징적인 프라이머(primer)로 PCR하여 확인하였다. 그 결과, 배양세포에서도 Enigma 프로모터의 SRE 부위에 SRF가 결합하고 있는 것으로 나타났다(도 6f).
<실시예 5> 혈청과 HGF에 의한 SRF-Enigma-Mdm2-p53 경로 조절
본 발명자들은 세포증식 및 생존을 촉진시키는 조건에서 Mdm2의 증가가 보고된 바 있다. 상기 현상이 Enigma에 의하여 기인하는 것인지 알아보기 위해서, SRF에 의한 Enigma의 활성화가 Mdm2를 안정화시키고, p53을 억제하는지를 검증하였다.
<5-1> 혈청에 의한 SRF, Enigma, Mdm2, p53의 조절 검증
p53 +/+ 또는 p53 -/- 의 대장암 세포주를 혈청을 제한 조건에서 배양한 후, 10%의 혈청을 함유한 배지에서 시간별로 다시 배양하여 각 단백질의 변화를 웨스턴블랏으로, 전사수준(mRNA)의 변화는 각 조건에서 분리한 총 RNA를 사용한 RT-PCR로 확인하였다. 그 결과, 혈청의 자극에 의하여 SRF가 전사단계에서부터 증가하여 단백질양도 증가하였으며, SRF에 의하여 전사 활성화된 Enigma의 단백질양도 증가하는 것으로 나타났다. Enigma의 증가는 전사체의 변화없이 Mdm2 단백질의 안정화를 유도하였으며, p53 단백질의 분해로 나타났다. SRF-Enigma-Mdm2 일련의 증가는 p53에 비의존적이었다(도 7a, 도 7b).
p53 +/+ 또는 p53 -/- 의 대장암 세포주를 10%의 혈청을 함유한 배지에서 배양한 후, 혈청을 제한 조건에서 각 시간별로 배양하였을 때의 각 분자의 변화를 웨스턴 블랏과 RT-PCR 방법으로 확인하였다. 그 결과, 성장이 제한되는 조건에서 SRF, Enigma의 전사 수준, 단백질 수준은 모두 억제 되었고, Mdm2의 단백질 수준은 감소하였으며, p53의 단백질 수준은 증가하였다(도 8a, 도 8b).
<5-2> HGF에 의한 SRF, Enigma, Mdm2, p53의 조절 검증
SRF-Enigma-Mdm2 경로가 다른 세포성장인자들에 의해서도 조절되는지를 HGF를 사용하여 확인하였다. SRF, Enigma의 특이적 관련성을 보이기 위하여 siEnigma, siSRF 각 10 μg을 HLK3 세포주에 도입하고, 혈청을 제한 조건에서 배양한 후, 세포 수거 4시간 전에 HGF(40, 60 ng/ml)를 각각 처리한 다음, 각각의 단백질의 변화를 웨스턴블랏으로 확인하였다. 그 결과, SRF-Enigma-Mdm2의 증가와 p53의 감소를 확인할 수 있었다(도 7c). 또한, F-SRF를 HLK3 세포주에 농도별(5, 10 μg)로 직접 도입시켜 Enigma와 Mdm2의 변화를 관찰하였다. 그 결과, Enigma의 발현은 SRF에 의하여 직접적으로 영향을 받는 것으로 나타났다(도 7d).
<5-3> SRF-Enigma-Mdm2 경로에 MAP 키나아제(kinase) 관련성 검증
성장인자(Growth factor)에 의한 SRF의 활성화에 MAP 키나아제가 관련되어 있음이 알려져 있으므로, SRF-Enigma-Mdm2의 경로의 조절에도 MAP 키나아제가 관련되어 있을 것으로 가정하고, MAP 키나아제 특이적 저해제인 PD98059를 사용하여 검증하였다. Mdm2 +/+ , p53 -/- MEF 세포주에 Ad-p53 또는 Ad-Lac을 도입시킨 후, HGF를 처리할 때 PD98059를 함께 처리하였다. 그 결과, PD98059는 HGF에 의한 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 활성화를 억제하였다(도 7e). 정상세포에서 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 존재 여부를 확인하기 위하여, MRC5(사람 정상 섬유세포), MEF(마우스 태아 섬유세포)를 사용하여 혈청에 의한 반응을 확인하였다. MRC5의 경우에는 siSRF(10, 15 μg)를 도입하거나, PD98059가 존재하는 경우 혈청에 의한 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 활성화가 억제되었으며, MEF의 경우도 PD98059에 의하여 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 활성화가 억제되었다(도 9a, 도 9c). 따라서 SRF, Enigma는 전사활성에 따른 단백질양의 증가가 있었으나, Mdm2(p1-Mdm2) 및 p53의 경우는 전사체 수준의 변화는 없었다. 다만, p2-Mdm2의 전사수준은 p53의 발현양에 의존적으로 변화하였다(도 9b, 도 9d).
<5-4> SRF-Enigma-Mdm2 경로의 생체내( in vivo ) 검증
HGF(100 μg/kg)를 마우스(Balb/c, Female, Taconic)의 꼬리 정맥에 주사하고 시간별로 간을 적출하여 SRF-Enigma-Mdm2-p53의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 그 결과, HGF는 간세포의 SRF를 전사활성화시켜 단백질 발현을 유도하고, SRF에 의하여 Enigma는 전사체 수준에서 유도되어 단백질양이 늘어났다. Enigma의 증가에 따라 Mdm2의 단백질양도 증가하였으나, p53은 단백질양은 검출이 거의 되지 않았다(도 7f, 도 7g).
Enigma의 직접적인 발현양 변화에 따른 Mdm2-p53의 변화를 관찰하기 위하여, 마우스의 꼬리 정맥에 Ad-F-Enigma, Ad-LacZ, PBS를 주사하고 48시간 후에 간을 적출하여 웨스턴 블랏하여 각각의 단백질양을 확인하였다. 또한, Mdm2의 단백질양의 감소를 관찰하기 위하여, Ad-siEnigma, Ad-siControl 및 PBS를 꼬리 정맥에 주사한 후 간 적출 8시간 전에 HGF를 꼬리 정맥에 주사하였다. 그 결과, Enigma의 발현이 높으면 Mdm2도 안정화 되었으며, Enigma의 발현이 억제되면 HGF에 의한 Mdm2의 안정화가 저해되었다(도 7h).
<실시예 6> 사람의 암환자 조직에서 SRF-Enigma-Mdm2의 발현 검증
본 발명자들은 사람의 암조직(위암: 충남의대, 한국; 간암: 전북의대 및 계명의대, 한국)에서도 SRF에 의한 Enigma의 유도가 Mdm2의 안정화를 초래할 수 있는지 알아보기 위해서, 간암 조직 총 27예 중 9예와 위암 조직 총 18예 중 12예를 조직 용해 완충용액(tissue lysis buffer)(Intron, Korea)에서 파쇄하고 웨스턴블랏으로 확인하였다. 그 결과, 간암 조직에서는 7예에서 SRF-Enigma-Mdm2가 발현이 높았으며, 위암조직에서는 9예에서 SRF-Enigma-Mdm2의 과발현이 확인되었다(도 10a). 또한, 사람의 각종 암 조직이 심겨있는 조직 어레이(tissue array)(www.tissue array.com)에서 Enigma-Mdm2의 발현을 형광항체법을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 위암 및 대장암 조직의 점정 부위(apical region)에서 Enigma-Mdm2가 함께 과발현되어 나타났다(도 10b).
<실시예 7> Enigma에 의한 항암제 내성 유도 검증
본 발명자들은 암세포의 자살을 유도하는 p53의 억제를 유발하는 Enigma가 암세포의 항암제 내성을 유발하는지를 확인하였다.
<7-1> Enigma의 발현 억제에 의한 세포자살 유도
p53 +/+ 또는 p53 -/- 의 대장암 세포주(HCT 116, ATCC)에 Enigma의 발현을 조절할 수 있는 Flag-Enigma(5 μg) 또는 siEnigma(10 μg)를 도입하고, 아드리아마이신(adriamycin)(ADR 20 μg/ml)을 처리하여 세포계수법과 크리스탈 바이올렛 염색 법으로 확인하였다. 그 결과, 야생형의 p53을 가진 세포에서만 Enigma의 발현이 높은 경우에는 항암제에 의한 세포자살이 억제 되었으며, Enigma의 발현이 억제되는 경우에는 세포자살이 효과적으로 유도되었다(도 11a, 도 11b). 또한, 세포자살의 대표적 마커인 DNA 단편(fragmentation)의 변화를 통하여 Enigma에 의한 세포자살 조절 효과를 검증하였다. 그 결과, 야생형 p53을 가진 세포주에서 Enigma의 발현억제에 의한 세포자살이 효과적으로 나타났다(도 11d). 따라서 Enigma의 발현억제가 p53을 매개로 하여 세포자살을 유도하였음을 알 수 있었다.
아울러, 아드리아마이신(Adriamycin; ADR)(Sigma, USA) 처리시에 Enigma-Mdm2-p53 경로의 변화를 확인하기 위하여, 상기와 동일한 조건에서 ADR(2 μg/ml)을 처리하여 웨스턴블랏을 실시하였다. 그 결과, p53의 존재와 무관하게 ADR에 의한 Mdm2의 발현억제는 Enigma의 과발현에 의하여 저해되었으며, Enigma 발현에 의존적으로 Mdm2-p53의 발현도 증가 또는 감소하였다(도 11c). 따라서, Enigma는 암세포가 아드리아마이신(Adriamycin)에 대한 저항성을 가지게 하는 것을 알 수 있었다.
<7-2> Enigma에 의한 에토포사이드(etoposide)와 Nutlin3a에 대한 저항성 증가 검증
에토포사이드(Etoposide; ETC)(Sigma, USA)와 nutlin3a(Sigma, USA)는 기전은 다르지만 p53을 활성화시켜 암세포의 자살을 유도하는 항암제이며, 이들에 대해서도 Enigma가 암세포로 하여금 저항성을 나타나게 할수 있는지 검증하였다. Flag-Enigma(5 μg)가 도입된 HLK3 세포에 ETC와 nutlin3a를 각각 처리하고 세포계수법으로 생존한 세포수를 확인하였다. 그 결과, Enigma가 과발현되면 ETC와 nutlin3a에 대하여도 저항성이 유도되는 것을 확인하였다(도 11e). 또한, F-Enigma의 발현시에 ETC와 nutlin3a 처리에 따른 Mdm2-p53의 발현양상을 웨스턴블랏으로 확인하였다. 그 결과, Flag-Enigma의 과발현에 의한 Mdm2의 증가와 p53의 감소를 확인할 수 있었다 (도 11f).
<실시예 8> 마우스 이종이식(Mouse Xenograft) 모델에서 Enigma에 의한 암세포의 ADR 저항성 유도검증
본 발명자들은 Enigma의 발현에 의존적으로 p53에 의한 세포자살이 조절되는 것을 확인하고 실제 간암 세포주 HLK3로 만든 종양에서 Enigma에 의한 ADR 저항성이 유도되는지 확인하였다.
<8-1> HLK3 간암세포주에서 Enigma에 의한 ADR에 저항성 유도 검증
Enigma의 발현을 조절할 수 있는 Flag-Enigma(5 μg) 또는 siEnigma(10 μg)를 도입하고, 아드리아마이신(adriamycin)(ADR 20 μg/ml)을 처리하여 세포계수법으로 세포의 생존을 확인하였다. 그 결과, Enigma의 발현이 높은 경우에는 항암제에 의한 세포자살이 억제되었으며, Enigma의 발현이 억제되는 경우에는 세포자살이 효과적으로 유도되었다(도 12a). ADR 처리시에 Enigma-Mdm2-p53-p21 경로의 변화를 확인하기 위하여 위와 동일한 조건에서 ADR(2 μg/ml)을 처리하여 웨스턴블랏을 실시하였다. 그 결과, Enigma의 발현에 의존적으로 Mdm2-p53의 발현이 변화하였다(도 12b).
<8-2> 마우스 이종이식 모델에서 Enigma에 의한 ADR 저항성 검증
Enigma에 의한 ADR 저항성 유도가 생체내에서도 일어나는지 검증하기 위하여 HLK3 세포주로써 누드 마우스(nude mouse)(Balb/c nu)에 종양모델을 제작하여 확인하였다(Balb/c nu, Female, SLC, Japan). 이를 위하여 Ad-F-Enigma(100 MOI), Ad-LacZ(100 MOI), Ad-siEnigma(200 MOI), Ad-siControl(200 MOI)를 먼저 세포에 감염시키 후, 상기 마우스의 피하에 주사(n=5)하였다. 14일 후 ADR(4mg/kg)를 꼬리 정맥내로 주사하고 이후 28간 종괴의 크기를 관찰하였다. 그 결과, Flag-Enigma가 발현되는 종괴는 성장이 ADR를 처리하지 않은 군과 유사하게 유지되어 ADR에 저항성을 보였으며, Enigma 발현이 억제되는 군은 종괴의 성장이 가장 많이 억제되었다(도 12c, 도 12d). 종괴를 이루는 세포 속의 Mdm2-p53의 발현 변화를 확인하기 위하여 위의 조건으로 상기 마우스에 종괴를 만들고 ADRd,f 처리하고 3일 후 종괴를 마우스로부터 분리하여 세포파쇄액을 얻은 후, 웨스턴블랏으로 각 단백질의 발현양상을 확인하였다. 그 결과, Enigma에 의한 Mdm2-p53 발현 조절을 확인할 수 있었다(도 12e).
본 발명은 Enigma의 Mdm2-p53의 유비퀴틴 프로테오좀 분해의 조절 기작 연 구, 및 암세포에서의 SRF-Enigma-Mdm2-p53 경로를 통한 작용 기작 연구 등에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, Enigma의 발현 조절을 통해 항암제 개발, Enigma 발현 또는 Enigma-Mdm2 상호결합을 이용한 항암제 스크리닝 방법 개발, 및 Enigma 발현을 이용한 항암제 치료의 예후를 평가하는 방법 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 siEnigma를 포함하는 벡터를 나타내는 모식도이다.
도 1b는 F-Enigma를 발현하는 아데노바이러스를 제작하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 1c는 si-Enigma를 항뮤하는 아데노바이러스를 제작하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2a는 Enigma가 과발현 되었을 때 Mdm2가 안정화되고 p53이 분해되는 것이 유비퀴틴 프로테오좀 분해 경로임을 나타내는 웨스턴블랏 사진이다.
도 2b는 Enigma에 의한 p53의 발현억제가 p53의 전사활성을 억제하는 것을 리포터 분석 방법으로 확인한 그림이다.
도 2c는 Enigma 과발현시에 Mdm2, p53, p21의 mRNA 수준의 변화를 노던블랏으로 확인한 사진이다.
도 2d 및 도 2e는 Enigma에 의한 Mdm2의 조절은 p53에 비의존적이고, Enigma에 의한 p53과 하위 p21의 조절은 Mdm2에 의존적인 것을 나타내는 웨스턴블랏 사진이다.
도 3a 및 도 3b는 배양세포에서 Enigma와 Mdm2 간의 결합이 p53에 비의존적으로 일어나는 것을 보여주는 웨스턴블랏 사진이다.
도 3c 시험관에서 Enigma와 Mdm2간의 결합이 p53이 비의존적으로 일어나는 것을 보여주는 웨스턴블랏 사진이다.
도 3d는 Enigma가 결합하는 Mdm2의 부위가 400-491임을 나타내주는 모식도와 웨스턴블랏 사진이다.
도 3e 및 f는 Mdm2가 결합하는 Enigma의 부위가 LIM3임을 나타내주는 모식도와 웨스턴 블랏 사진이다.
도 3g는 Enigma-Mdm2-p53 간의 상호결합을 보여주는 모식도이다.
도 4a는 ENH(Enigma homolog)가 Mdm2와 결합하지 않는 것을 보여주는 웨스턴블랏 사진이다.
도 4b는 ENH는 Mdm2-p53의 발현에 영향을 주지 않는다는 것을 보여주는 웨스턴 블랏 사진이다.
도 5a 및 도 5b는 Enigma의 과발현에 의하여서 Mdm2의 자가 유비퀴틴화가 저해되고, p53의 유비퀴틴화가 증가하고, Enigma의 발현을 억제하였을 때, 현상이 역전되는 것을 나타내는 웨스턴블랏 사진이다.
도 5c는 Enigma의 LIM 도메인이 Mdm2와 결하여 Mdm2의 자가 유비퀴틴화를 억제하는 것으로 보여주는 웨스턴블랏 사진이다.
도 5d는 Enigma에 의하여 Mdm2가 p53을 유비퀴틴화 하는 것이 증가되는 것으로 보여주는 웨스턴 사진이다
도 6a는 Enigma의 프로모터 부위의 SRE 존재와 SRE 제거 돌연변이체를 나타내주는 모식도이다.
도 6b는 Enigma의 프로모터가 혈청(serum)에 의하여 활성화 되는 것을 리포터 분석으로 나타내는 그림이다.
도 6c 및 도 6d는 Enigma의 프로모터에서 SRE 부위가 혈청 및 HGF에 의한 활 성화에 중요부위인 것을 나타내는 그림이다.
도 6e 및 도 6f는 Enigma 프로모터의 SRE 부위에 SRF가 특이적으로 결합한다는 것을 나타내주는 EMSA와 ChIP 분석 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 혈청에 의하여 SRF와 Enigma의 전사활성화가 유도되어 단백질 수준이 증가하고, 이에 따라 Mdm2의 단백질양이 증가하고 p53이 억제 되는 것을 나타낸 웨스턴 블랏 사진과 RT-PCR 사진이다.
도 7c 및 도 7d는 HGF에 의하여 유도되는 Mdm2의 안정화가 SRF와 Enigma에 의존적인 것을 나타내주는 웨스턴 블랏사진이다.
도 7e는 HGF에 의한 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 활성화가 MAP kinase 에 의존적임을 암시해주는 웨스턴블랏 사진이다.
도 7f 내지 도 7h는 HGF에 의한 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 활성화가 실제 마우스의 간에도 존재한다는 것을 나타내주는 웨스턴블랏과 RT-PCR 사진이다.
도 8a 및 도 8b는 혈청이 제한되는 조건에서 SRF-Enigma-Mdm2 경로의 억제를 보여주는 웨스턴블랏과 RT-PCR 사진이다.
도 9a와 b는 사람의 정상 섬유세포에서도 SRF-Enigma-Mdm2 경로가 존재하며 MAP kinase에 의존적인 사실을 나타내주는 웨스턴블랏과 RT-PCR 사진이다.
도 9c와 d는 마우스 태아의 정상 섬유세포에서 SRF-Enigma-Mdm2 경로가 존재하며 MAP kinase에 의존적인 사실을 나타내주는 웨스턴블랏과 RT-PCR 사진이다.
도 10a는 사람의 간암조직과 위암조직에서 SRF-Enigma-Mdm2가 과발현되어 있다는 것으로 나타내 주는 웨스턴블랏 사진이다.
도 10b는 사람의 위암, 대장암 조직에서 Enigma-Mdm2가 함께 과발현되어 있음을 나타내는 형광항체염색 사진이다.
도 11a 및 도 11b는 p53 야생형의 대장암 세포주에서 Enigma에 의하여 아드리아마이신(adriamycin; ADR) 내성이 유발되고, Enigma의 발현을 억제하면 암세포의 항암제 감수성이 높아짐을 보여주는 세포계수법과 크리스탈 바이올렛 염색 사진이다.
도 11c는 ADR 처리시에 Enigma의 발현양에 따른 Mdm2-p53의 발현변화를 나타내는 웨스턴블랏 사진이다.
도 11d는 ADR 처리시에 Enigma 발현을 억제하는 siEnigma에 의한 효과적인 세포사멸을 나타내는 DNA 절편분석법 사진이다.
도 11e 및 도 11f는 ADR 외에 에토포사이드(Etoposide) 또는 nutlin3a와 같은 p53을 활성화시키는 항암제 처리시에도 Enigma는 Mdm2-p53을 조절하여 세포의 자살을 방해하는 것으로 나타내는 세포계수법과 웨스턴블랏 사진이다.
도 12a 및 도 12b는 간암세포주 HLK3 세포주에서 Enigma에 의하여 아드리아마이신(ADR) 내성이 유발되고, Enigma의 발현을 억제하면 암세포의 항암제 감수성이 높아짐을 보여주는 세포계수법과 웨스턴블랏 사진이다.
도 12c 및 도 12d는 실제 마우스 종양모델에서 Enigma가 과발현되면 ADR에 대하여 저항성이 생기고, Enigma의 발현이 억제되면 종양의 성장이 효과적으로 억제되는 것으로 보여주는 그래프와 종괴의 사진이다.
도 12e는 마우스 종괴 내의 Enigma-Mdm2-p53의 발현 변화를 나타내주는 웨스 턴블랏 사진이다.
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Claims (18)

  1. 삭제
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  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. Enigma 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 RNAi로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 Enigma 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 Enigma 발현 억제제는 서열번호 2로 기재되는 작은 간섭 RNA인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 6항에 있어서, 상기 암은 위암, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  10. Enigma 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 RNAi로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 Enigma 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 1) 후보물질이 존재 또는 부존재하는 조건하에서 Enigma 및 Mdm2를 접촉시키는 단계;
    2) Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 후보물질의 부존재시에 비해 Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 후보물질의 스크리닝 방법.
  14. 1) Enigma 및 Mdm2를 발현하는 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계;
    2) 세포내 Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 세포내 Enigma 및 Mdm2의 결합 수준을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 후보물질의 스크리닝 방법.
  15. 1) 후보물질을 Enigma 및 Mdm2를 발현하는 세포에 처리하는 단계;
    2) Enigma 또는 Mdm2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 Enigma 또는 Mdm2의 발현 수준을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 후보물질의 스크리닝 방법.
  16. 1) 후보물질을 Enigma, Mdm2 및 p53를 발현하는 세포에 처리하는 단계; 및
    2) p53의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 p53의 발현 수준을 증가시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 후보물질의 스크리닝 방법.
  17. 삭제
  18. Enigma와 반응하는 항체 또는 Enigma 유전자에 상보적인 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트.
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