JP5377358B2 - Enigma―Mdm2相互作用及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明(2)は、前記Enigmaの発現抑制剤が、Enigma遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉RNA(short interfering RNA)、短ヘアピンRNA(short hairpin RNA)及びRNAiからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする本発明(1)の抗癌用組成物である。
本発明(3)は、前記Enigmaの活性抑制剤が、Enigmaタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする本発明(1)の抗癌用組成物である。
本発明(4)は、前記短干渉RNAが、配列番号2あるいは3で表わされる塩基配列を有することを特徴とする本発明(2)の抗癌用組成物である。
本発明(5)は、前記癌が、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする本発明(1)の抗癌用組成物である。
本発明(6)は、Enigmaの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌補助剤である。
本発明(7)は、Enigmaの発現または活性抑制剤を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法である。
本発明(8)は、Enigmaの発現または活性抑制を通じてHdm2/Mdm2(human/mouse double minute 2)の安定性を減少させる方法である。
本発明(9)は、Enigmaの発現または活性抑制を通じてp53の活性を増加させる方法である。
本発明(10)は、
1)候補物質が存在するまたは存在しない条件下でEnigma及びMdm2を接触させる工程、
2)Enigma及びMdm2の結合水準を測定する工程、及び
3)候補物質が存在しない時と比較してEnigma及びMdm2の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程を含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明(11)は、
1)Enigma及びMdm2を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
2)細胞内Enigma及びMdm2の結合水準を測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較して細胞内Enigma及びMdm2の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明(12)は、
1)Enigma及びMdm2を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
2)EnigmaまたはMdm2の発現水準を測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較してEnigmaまたはMdm2の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明(13)は、
1)Enigma、Mdm2及びp53を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
2)p53の発現水準を測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較してp53の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明(14)は、Enigmaと反応する抗体またはEnigma遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を用いて、癌細胞でのEnigma発現水準を測定する工程を含む、癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法である。
本発明(15)は、Enigmaと反応する抗体またはEnigma遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌診断用キットである。
本発明は、Enigmaの発現または活性抑制を通じてMdm2の安定性を減少させて、p53の活性を増加させる方法を提供する。
1)RNAi
RNA干渉(RNAi)は、Enigma遺伝子に対応する二本鎖RNA(dsRNA)を細胞または有機体に導入することにより、対応するmRNAの分解が起きる転写後遺伝子サイレンシングメカニズム(post−transcriptional gene silencing mechanism)である。前記RNAi効果によって遺伝子発現が復帰される前に多重細胞分裂が持続するので、RNAiはRNAレベルで目標とするノックアウト(knockout)または「ノックダウン(knockdown)」を作る非常に強力な方法である。RNAiは、ヒトの胚芽腎臓(embryonic kidney)及びHeLa細胞を含むヒト細胞において成功的であることが確認された(Elbashir等,Nature,2001年,第411巻,p.494−498)。
siRNAは、特定mRNAの切断を通じてRNAi現象を誘導することができる短い二重鎖RNAを意味する。
Enigmaをコードする核酸に対してアンチセンスである核酸分子を阻害剤に使用することができる。「アンチセンス」核酸は、Enigmaをコードする「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的またはmRNA配列に相補的な核酸配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成することができる。前記アンチセンス核酸は、全体Enigmaコード鎖または単にそれらの一部(例:コード領域)に相補的なことがある。前記アンチセンス核酸分子は、Enigma mRNAの全体コード領域に相補的なことがあり、Enigma mRNAのコードまたは非コード領域の単に一部(例:翻訳開始部)にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドがさらに好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約5ないし50ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンス核酸は、公知の方法を用いた化合合成及び酵素結合反応を用いて構成することができる。化学合成法、例えば、文献[Tetrahedron Lett.1991年,第32巻,p.30005−30008]に記載されているように、アセトニトリル中でテトラエチルチウラムジスルファイドで硫化させるホスホアミダート化学のような方法によって非常に容易に製造することができる。前記アンチセンス核酸の生成に使用できる変形ヌクレオチドの例としては、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、5−カルボキシルメチルアミノメチル−2−チオウリジン、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルケオシン、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、2,6−ジアミノプリン、5−メチル−2−チオウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、シュードウラシル、ケオシン、2−チオシトシン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルケオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニル、5−メチル−2−チオウラシル、(acp3)w及びワイブトキソシンが挙げられる。必要によって、前記アンチセンス核酸は、発現ベクターを用いて生物学的に生成することができる。
1)ペプチドミメティクス(Peptide Mimetics)
Enigmaポリペプチドのタンパク質結合ドメインを抑制したミメティクス(例、ペプチドまたは非ペプチド性薬剤)を製作して、元来のEnigmaポリペプチドがMmd2に結合することを抑制することができる(欧州特許出願EP0412765及びEP0031080)。
1)Enigma及びMdm2を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
2)EnigmaまたはMdm2の発現水準を測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較してEnigmaまたはMdm2の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
1)Enigma、Mdm2及びp53を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
2)p53の発現水準を測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較してp53の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
1)候補物質が存在するまたは存在しない条件下でEnigma及びMdm2を接触させる工程と、
2)Enigma及びMdm2の結合水準を測定する工程、及び
3)候補物質の不存在時と比較して、Enigma及びMdm2の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
1)Enigma及びMdm2を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
2)細胞内Enigma及びMdm2の結合水準を測定する工程、及び
3)候補物質を処理していない対照群と比較して、細胞内Enigma及びMdm2の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
本発明者等は、韓国生命工学研究院から提供を受けたEnigma cDNA(配列番号:1)を含むベクターを鋳型にして、一般的なPCR方法で得られた切片をpCMV taq2B(Stratagene,米国)にクローニングして、Enigmaを過発現するベクターを製作した。また、Enigmaの発現を特異的に阻害する5’−AAAGACCTTCTACTCCAAGAA−3’(配列番号:2)のヌクレオチド切片をpSuperプラスミドベクターにHind III/Bgl II部位にクローニングを行った(図2)。また、細胞内への導入を容易にするためにsiEnigmaを含むアデノウイルス(図3)と、Flag−Enigmaを含むアデノウイルス(図2)は、韓国特許登録第627377号(Hepatology,2006年,第43巻,p.1042−1052)及び第877824号(米国特許出願第12/093093号(2008年5月8日);Nat Med,2006年,第12巻,p.809−816)に提示された方法を基に下記のように製作した。
Enigmaによる26Sプロテオゾーム依存的タンパク質分解に及ぼす影響を次のような方法で確認した。Flag−Enigma発現ベクターを濃度別(+:2μg、++:5μg)でHLK3細胞株(全北医大、韓国)に導入して、12時間MG132(10μM)を処理したまたは処理していない細胞を集めてウエスタンブロット方法でタンパク質の発現様相を確認した。その結果、Mdm2の発現程度は、Enigmaの発現に依存的に高く、一方、p53及びその下位分子p21は減少した(図4のa)。
Enigmaによるp53の減少がp53活性の減少と関連するかどうかを確認するために、p53によって調節される標的遺伝子のプロモーターの活性変化を調査した。p53RE−Luc、Bax−Luc、p21−Lucのレポーター遺伝子(0.5μg)をそれぞれFlag−Enigma(+:2μg、++:5μg)と濃度別にHLK3細胞株あるいはp53+/+またはp53−/−の大腸癌細胞株(HCT116、ATCC)に導入して、12時間MG132(10μM)を処理するかまたは処理せずに、細胞を集めてレポーター分析(Promega,米国)を実施した。その結果、p53によって調節される下位分子の転写活性は、Enigmaの発現に濃度依存的に阻害されることが示された(図4のb)。
EnigmaによるMdm2及びp53の発現変化が、mRNA水準で発生したのかどうか検証するためにノーザンブロットを実施した。Flag−Enigma発現ベクターを濃度別(+:2μg、++:5μg)でHLK3細胞株に導入して、48時間後、総RNAを分離(RNeasy kit,Qiagen)して、それぞれのプローブ(P1/P2Mdm2,p53,p21)でノーザンブロット方法を実施した。その結果、Enigmaの発現量と関係なくP1−Mdm2、p53、p21のmRNA量は一定であり、p53によって調節されるP2−Mdm2のmRNAの量は、Enigmaの発現に依存的に減少した(図4のc)。この結果は、EnigmaがMdm2−p53を転写後の工程で調節するということを提示している。
Enigmaによるp53及びp21の発現抑制が、Mdm2依存的なのかどうかを確認するために、Mdm2−/−p53−/−MEF及びMdm2+/+p53−/−MEF細胞株(G.Lozano,M.D.ANDERSON CANCER CENTER)を用いた。前記それぞれの細胞株に、p53を発現するアデノウイルスベクター(Ad−p53)を導入した16時間後、Ad−F−Enimga(50MOI)、Ad−Lacz(50MOI)、Ad−siEnigma(100MOI)、Ad−siControl(100MOI)を再び導入して32時間後に細胞を集めてウエスタンブロット方法でそれぞれのタンパク質の発現変化を確認した。その結果、Mdm2の発現に依存的にp53及びp21の発現が減少した(図4のd)。
Enigmaによるp21の発現抑制が、p53を経由したものかどうかをp53+/+、p53−/−細胞株を使用して確認した。p53+/+またはp53−/−細胞株に、Flag−Enigma、siEnigmaを導入して48時間後に細胞を集めてウエスタンブロット方法で確認した。その結果、p21の変化は、p53の変化に起因したものであることが示され、Enigmaによる直接的な影響はないことが示された(図4のe)。
本発明者等は、EnigmaとMdm2間の相互作用を検証するために、Enigmaの突然変異体(F−PDZ、F−PDZ−LIM1、F−EniΔLIM3、F−LIM)をpCMV taq2Bに一般的なPCRクローニング法で製作し、Mdm2の突然変異体(GST−1−100、GST−101−491、GST−201−491、GST−301−491)をpEBGにPCRクローニング法で製作した。インビトロで相互結合を確認するために、His−Mdm2、Enigma、GST−p53、EniΔLIM3タンパク質を大腸菌でそれぞれ分離精製した。
p53+/+またはp53−/−の大腸癌細胞株(HCT116)とMdm2−/−p53−/−MEF及びMdm2+/+p53−/−MEF細胞株(G.Lozano,M.D.ANDERSON CANCER CENTER)で、EnigmaとMdm2−p53間の相互結合をIP法で確認した。その結果、EnigmaとMdm2間の相互作用は、p53と関係なく存在し、Mdm2とp53が一緒に存在する場合は、Enigma−Mdm2−p53の結合体を形成することが示された(図5のa及びb)。
大腸菌で分離精製したそれぞれのタンパク質(1μg His−Mdm2、0.5μg Enigma、1μg GST−p53)間の相互作用をインビトロで直接確認するためにインビトロ結合分析(in vitro binding assay)を実施した。それぞれのタンパク質を混ぜて結合を誘導した後、GST pull−down及びIP方法でタンパク質間の結合有無を確認した。その結果、Enigmaは、Mdm2と直接結合したが、p53とはMdm2を媒介して結合した(図5のc)。
EnigmaとMdm2の製作されたそれぞれの突然変異体を使用して、二分子間の結合部位を決定した。まず、それぞれのMdm2突然変異体(5μg)をFlag−Enigmaが常に発現されるように考案された293細胞株に導入して、以後、GST pull−downしてFlag抗体にウエスタンブロットして結合有無を確認した(図5のd)。同時に、それぞれのEnigma突然変異体(5μg)とGST−Mdm2発現ベクター(5μg)を293T細胞株(ATCC)にカルシウムホスファート方法で導入させて、24時間後に細胞を集めてFlag抗体でIPを遂行して、GST抗体でウエスタンブロットして結合有無を確認した(図5のe)。EnigmaLIM3が除去された、細菌で発現させたEniΔLIM3とMdm2は、互いに結合しなかったし(図5のc)、Mdm2の301−491部位とEnigmaのLIM3部位が結合部位であることが示された。LIM3部位のみを含んだGST−LIM3突然変異体とMdm2間の結合を細胞株導入後、GST pull−downとMdm2抗体でウエスタンブロットで確認して、EnigmaのLIM3部位がMdm2の401−491に結合するということを確認することができた(図5のf)。したがって、知られたMdm2−p53間の相互結合に基づいて、Enigmaの“C”末端とMdm2の“C”末端が直接結合し、かつMdm2の“N”末端とp53の“N”末端が結合している結合構造が分かった(図5のg)。
Enigmaと類似の分子構造を有したENH(Enigma homolog)を対象に、Mdm2と結合有無を確認した。Flag−ENH、Flag−Enigma及びGST−Mdm2発現ベクターを293T細胞株にカルシウムホスファート方法で導入して、48時間後に細胞を集めてGST pull−downと、Flag抗体でウエスタンブロットを遂行した。その結果、Mdm2とENH間の結合は、存在しなかった(図6のa)。同時に、F−ENH発現ベクターをHLK3細胞株に濃度別(2、5μg)で導入した後、Mdm2及びp53の発現変化を確認した。その結果、ENHは、Mdm2とp53の発現量に影響を与えなかった(図6のb)。したがって、EnigmaとMdm2間の結合及びこれによるMdm2の発現増加が、特異的相互作用であることが分かった。
本発明者等は、EnigmaがMdm2と直接結合してMdm2を安定化させて、Mdm2によるp53の分解を促進させる機序を解明するために、Mdm2の自己ユビキチン化とp53ユビキチン化にEnigmaが及ぼす影響を細胞内及びインビトロで検証した。
HLK3細胞株に、Flag−Enigma(5、10μg)、siEnigma(10、15μg)を濃度別で導入し、集める12時間前にMG132を処理した。また、異なる293T細胞株には、His−Ub(5μg)とF−Enigma(5、10μg)を導入して集める12時間前にMG132を処理した。準備した細胞破砕溶液で細胞タンパク質抽出液を作ってそれぞれの抗体としてIPを実施して、Ubが結合したMdm2とp53の増減をUb抗体とHis抗体としてウエスタンブロットして確認した。その結果、細胞内でEnigmaが過発現されるほどMdm2のユビキチン化は減少し、p53のユビキチン化は増加し、Enigmaの発現が抑制されるほどMdm2のユビキチン化は増加し、p53のユビキチン化は減少した(図7のa及びb)。
Enigmaの結合によるMdm2の自己ユビキチン化の変化を検証するために、インビトロユビキチン化分析を実施した。His−Mdm2タンパク質(0.5μg)、His−Mdm2(C464A)(0.5μg)、Enigmaタンパク質(0.5、1μg)、F−EniΔLIM3(1μg)に、ユビキチン反応混合物(E1、E2、His−Ub、ATP含む)を入れて反応させた後、IP/IB方法を用いてMdm2の自己ユビキチン化変化と結合タンパク質の有無を確認した。その結果、Mdm2と結合するF−EnigmaによってMdm2の自己ユビキチン化が抑制され、Enigmaは、Mdm2RINGフィンガー領域の464−システインがアラニンに置換されたMdm2(C464A)変異体には影響を与えなかった(図7のc)。併せて、F−EnigmaによるMdm2依存的p53のユビキチン化は、増加した(図7のd)。したがって、EnigmaがMdm2のユビキチン化の方向を決定する因子であることが分かった。
PCAF(p300−CBP関連因子)は、Mdm2のユビキチン化を誘導する(Nat Cell Biol,2007年,第9巻,p.331−338)。細菌から分離精製した図8に提示したタンパク質を用いて、インビトロユビキチン実験を行なった時、EnigmaはPCAFによるMdm2ユビキチン化に影響を与えなかった(図8のa)。この現象は、Mdm2−/−p53−/−MEF細胞株でも検証された(図8のb)。この結果は、EnigmaがMdm2自己ユビキチン化を特異的に阻害してp53ユビキチン化を促進することを提示する。
p53は、細胞増殖抑制機能があって、Enigmaが細胞内でMdm2の安定化を誘導してp53減少を起こすので、細胞増殖が起きる条件でEnigmaプロモーターが活性化するのか、活性化するのならどのような機序になるかを調査した。
Enigmaのプロモーターに血清応答因子(SRF)が結合する血清応答部位(serum response element;SRE)が存在することを発見して、プロモーター配列中、SREを含むまたは含まない断片をルシフェラーゼを有しているpGL2/3ベクターに挿入してEnigma−Luc(pGL2)、SRE−Luc、ΔSRE−Luc(pGL3)レポーターベクターをそれぞれ製作した(図9のa)。前記、Enigma−LucをHLK3細胞株に導入(0.5μg)し、0.1%FBSを含むDMEMにて24時間培養した後、5%及び20%FBSを添加して再び6時間培養した後、細胞を集めてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、血清の濃度に依存的にEnigma−Lucの活性度が増加した(図9のb)。
Enigma発現のSRF依存性を検証するために製作したSRE−Luc(0.5μg)、ΔSRE−Luc(0.5μg)をHLK3細胞株に導入して、0.1%FBSを含むDMEMにて24時間培養後、5%及び20%FBS、FGF(20、40ng/ml)、またはHGF(20、40ng/ml)を添加して再び6時間培養した後、細胞を集めてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、SREが存在するレポーターでのみ処理した成長因子の濃度に依存的に活性度が増加した(図9のc及びd)。
EnigmaプロモーターのSRE部位[5’−CTATATAAGG−3’(配列番号:4)]に、SRFが特異的に結合するのかどうかを検証するために、EMSAと細胞内ChIP分析を実施した。EMSA分析を行なうために、血清を処理したまたは処理していないHLK3の核タンパク質分画を製造した後、放射線(32P−ATP)で標識されたSRE(5’−CTATATAAGG X3)ヌクレオチドと反応させた後、抗−SRF抗体と再び反応させて6%のアクリルアミドゲルでその結合有無を確認した。その結果、EnigmaのSRE部位にSRFが特異的に結合することが示された(図9のe)。
細胞増殖あるいは生存を促進させる条件で、Mdm2の増加が報告されたことがある(Growth factors,2005年,第23巻,p.183−192)。前記現象が、Enigmaによって起因することかどうかを調べるため、SRFによるEnigmaの活性化がMdm2を安定化させて、p53を抑制するかどうかを細胞及びマウスの肝(liver)で検証した。
p53+/+またはp53−/−の大腸癌細胞株を血清を除去した条件で培養した後、10%の血清を含んだ培地で時間別に再び培養して各タンパク質の変化をウエスタンブロットで、転写水準(mRNA)の変化は各条件で分離した総RNAを用いたRT−PCRで確認した。その結果、血清の刺激によって、SRFが転写段階から増加してタンパク質量も増加し、SRFによって転写活性化したEnigmaのタンパク質量も増加することが示された。Enigmaの増加は転写体の変化なしにMdm2タンパク質の安定化を誘導し、p53タンパク質の分解として示された。SRF−Enigma−Mdm2一連の増加は、p53に非依存的だった(図10のa及びb)。
SRF−Enigma−Mdm2経路が、HGFによっても調節されるかどうかを調査した。SRF、Enigmaの特異的関連性を示すために、siEnigma、siSRF各10μgをHLK3細胞株に導入して、血清を制限条件で培養した後、細胞を集める4時間前にHGF(40、60ng/ml)をそれぞれ処理した後、それぞれのタンパク質の変化をウエスタンブロットで確認した。その結果、SRF−Enigma−Mdm2の増加とp53の減少を確認することができた(図10のc)。また、F−SRFをHLK3細胞株に濃度別(5、10μg)で直接導入して、EnigmaとMdm2の変化を観察した。その結果、Enigmaの発現は、SRFによって直接的に影響を受けることが示された(図10のd)。
細胞成長因子によるSRFの活性化に、MAPキナーゼが係わっていることが知られているので(J Physiol Pharmacol,2002年,第53巻,p.147−157)、SRF−Enigma−Mdm2の経路の調節にもMAPキナーゼが係わっていると仮定して、MAPキナーゼ特異的阻害剤であるPD98059を用いて検証した。Mdm2+/+p53−/−MEF細胞株にAd−p53またはAd−LacZを導入した後、HGFを処理時にPD98059を一緒に処理した。その結果、PD98059は、HGFによるSRF−Enigma−Mdm2経路の活性化を抑制した(図10のe)。
Ad−p53あるいはAd−LacZウイルス(5×108pfu)それぞれをマウス(Balb/c、Female、Taconic)の尾静脈に注射して24時間経過後、HGF(100μg/kg)をマウスの尾静脈に再び注射して時間別に肝を摘出して、SRF−Enigma−Mdm2−p53の変化をウエスタンブロットで確認した。その結果、HGFは、肝細胞のSRFを転写活性化させてタンパク質発現を誘導し、SRFによってEnigmaは、転写体水準で誘導されてタンパク質量が増えた。Enigmaの増加によってMdm2のタンパク質量が増加し、同時にp53はタンパク質量を減少させた(図10のf及びg)。
本発明者等は、ヒトの癌組織(胃癌:忠南医大、韓国;肝癌:全北医大及び啓明医大、韓国)でもSRFによるEnigmaの誘導がMdm2の安定化をもたらしてp53の減少を誘導することができるのかどうかを調べるため、肝癌、胃癌組織と該当する正常組織を組織溶解緩衝液(Intron、韓国)で破砕してウエスタンブロットで調査した。その結果、12例の肝癌及び胃癌組織で、SRF−Enigma−Mdm2の発現が高かったが、p53発現が検出されなかった(図13のa、「*」参照)。また、ヒトの各種癌組織が植えられている組織アレイ(www.tissuearray.com)で、Enigma−Mdm2の発現を蛍光抗体法を用いて観察した。その結果、胃癌及び大腸癌組織の細胞質の頂端部位(apical region)でEnigma−Mdm2が一緒に過発現して示された(図13のb)。この結果は、速く増殖している癌細胞でSRF−Enigam−Mdm2が活性化していて、p53が弱化していることを暗示している。
本発明者等は、Enigmaが細胞の自殺を誘導するp53を減少させて細胞の生存能を増加させ、抗癌剤耐性を誘発するかどうかを調査した。
p53+/+またはp53−/−のHCT116大腸癌細胞株に、Flag−Enigma(5μg)またはsiEnigma(10μg)を導入して、アドリアマイシン(ADR 20μg/ml)を処理して細胞生存に及ぼすEnigma効果が、p53依存的なのかどうかを細胞計数法とクリスタルバイオレット染色法で確認した。その結果、野生型のp53を有した細胞でのみEnigmaの発現が高い場合に、アドリアマイシンに対する細胞生存能が増加し、Enigmaの発現が抑制される場合に、細胞生存能が減少した(図14のa及びb)。また、p53が発現されないH1299、H358、PC3、及びHep3B細胞株では、Enigmaの発現を減少させた時に、p53+/+HCT116大腸癌細胞株と比較して、細胞生存能に影響が大きくなかった(図15)。Enigmaによる細胞の生存に及ぼす効果が、細胞自殺調節効果なのかどうかをTUNEL検証法及び細胞周期を分析して検証した。その結果、野生型p53を有した細胞株で、Enigmaの発現抑制による細胞自殺が効果的に示された(図14のd)。したがって、アドリアマイシン処理時にEnigmaによる細胞生存能の増加効果は、p53を媒介にして細胞自殺誘導を抑制することによるものであることが分かった。
本発明者等は、Enigmaの発現に依存的にp53による細胞自殺が調節されることを確認して、実際に肝癌細胞株HLK3で作ったマウス腫瘍モデルで、EnigmaによるADR抵抗性が誘導されるのかどうかを調査した。
F−Enigma(5μg)またはsiEnigma(10μg)をHLK細胞株に導入して、アドリアマイシン(ADR 20μg/ml)を処理するかまたは処理せずに、細胞計数法で細胞の生存を調査した。その結果、Enigmaの発現が高い場合には、抗癌剤による細胞自殺が抑制され、Enigmaの発現が抑制される場合には、ADRがない場合にも細胞自殺が効果的に誘導された(図16のa及び図17)。ADR処理時に、Enigma−Mdm2−p53経路の変化を確認するために、上記と同一条件でADR(2μg/ml)を処理してウエスタンブロットを実施した。その結果、Enigmaの発現に依存的にMdm2−p53の発現が変化した(図16のb)。
エトポシド(ETC)とnutlin3a(Sigma,米国)は、機序は異なるがp53を活性化させて癌細胞の自殺を誘導する抗癌剤であり(Science,2004年,第303巻,p.844−8484)、これらに対してもEnigmaが癌細胞に対して抵抗性を示すようにできるのかどうかを検証した。F−Enigma(5μg)が導入されたHLK3細胞に、ETCとnutlin3aをそれぞれ処理して細胞計数法で生存した細胞数を確認した。その結果、Enigmaが過発現されるとETCとnutlin3aに対しても抵抗性が誘導されることを確認した(図16のc)。また、F−Enigmaの発現時に、ETCとnutlin3a処理によるMdm2−p53の発現様相をウエスタンブロットで確認した。その結果、F−Enigmaの過発現によるMdm2の増加とp53の減少を確認することができた(図16のd)。
EnigmaによるADR抵抗性誘導が、生体内でも起きるのかどうかを検証するために、ヌードマウス(Balb/c nu,Female,SLC,日本)に腫瘍モデルを製作して用いた。そのために、Ad−F−Enigma(100 MOI)、Ad−LacZ(100 MOI)、Ad−siEnigma(200 MOI)、Ad−siControl(200 MOI)を、まず、HLK細胞に感染させた後、前記マウス(n=5/実験群)の皮下に注射した。14日後、ADR(4mg/kg)を尾静脈内に注射して、以後28日間腫瘍塊の大きさを観察した。その結果、F−Enigmaが発現される癌細胞は、ADRを処理しない対照群と類似に増殖しながらADRに抵抗性を示し、Enigma発現が抑制される群は、癌細胞の増殖が最も多く抑制された(図16のe及びf)。腫瘍塊を成す細胞中のMdm2−p53の発現変化を確認するために、上記の条件で前記マウスに腫瘍塊を作って、ADRで処理して3日後に腫瘍塊をマウスから分離して細胞破砕液を得た後、ウエスタンブロットで各タンパク質の発現様相を確認した。その結果、抗癌剤耐性がある場合、Enigma−Mdm2が多く、p53が減少していた(図16のg)。
Claims (5)
- 1)候補物質が存在するまたは存在しない条件下でEnigma及びMdm2を接触させる工程、
2)Enigma及びMdm2の結合水準を測定する工程、及び
3)候補物質が存在しない時と比較してEnigma及びMdm2の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程を含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。 - 1)Enigma及びMdm2を発現する細胞と候補物質を生体外(ex vivo)で接触させる工程と、
2)細胞内Enigma及びMdm2の結合水準を生体外(ex vivo)で測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較して細胞内Enigma及びMdm2の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。 - 1)Enigma及びMdm2を発現する細胞に候補物質を生体外(ex vivo)で処理する工程と、
2)EnigmaまたはMdm2の発現水準を生体外(ex vivo)で測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較してEnigmaまたはMdm2の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。 - 1)Enigma、Mdm2及びp53を発現する細胞に候補物質を生体外(ex vivo)で処理する工程と、
2)p53の発現水準を生体外(ex vivo)で測定する工程、及び
3)候補物質を処理しない対照群と比較してp53の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。 - Enigmaと反応する抗体またはEnigma遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌患者において抗癌剤耐性発生の有無を検出するための癌診断用キット。
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