KR20110093840A

KR20110093840A - 지방세포 형성의 조절을 위한 ｐｌａｃ８ 활성 억제제의 용도

Info

Publication number: KR20110093840A
Application number: KR1020117012750A
Authority: KR
Inventors: 다이애나 홀; 마리아 지메네즈; 카린 뿌생; 베르나르트 토렌스
Original assignee: 사노피
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-05
Publication date: 2011-08-18
Also published as: AU2009312476A1; IL212667A0; WO2010052581A1; BRPI0921274A2; JP2012508224A; US20120035241A1; CN102203128A; EP2186822A1; MX2011004852A; CA2742770A1; EP2364324A1; AR074295A1

Abstract

본 발명은 지방세포 형성의 조절에 관여되는 새로운 표적인 Plac8에 관한 것이다. siRNA 방안을 이용하여, 본 발명자들은 전-지방세포 및 지방 조직에서 Plac8 활성의 감소가 지방세포 형성의 감소를 유도함을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 Plac8 활성의 조절자 (modulator)뿐만 아니라, 상기 표적의 활성의 조절자의 확인을 위한 스크리닝 시험, 및 지방세포 형성을 조절하고 따라서 비만 및 관련 질환을 치료하기 위한, 특히 제약 조성물에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

지방세포 형성의 조절을 위한 ＰＬＡＣ８ 활성 억제제의 용도{USE OF INHIBITORS OF PLAC8 ACTIVITY FOR THE MODULATION OF ADIPOGENESIS}

본 발명은 지방세포 형성의 조절에 관여되는 새로운 표적인 Plac8, 및 상기 표적의 활성의 조절자 (modulator)의 확인을 위한 스크리닝 시험에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Plac8 활성의 조절자, 및 지방세포 형성을 조절하고 따라서 비만 및 관련 질환을 치료하기 위한, 특히 제약 조성물에서의 그의 용도에 관한 것이다.

비만은 고혈압, 관상 동맥 질병, 이상지질혈증, 인슐린 저항성 및 2형 당뇨병을 포함한 많은 질환에 대한 주요 위험 인자이다. 비만 유행의 중요성 때문에, 많은 조사는 그에 의해 새로운 지방세포가 생성되는 발달 경로를 포함한 지방세포의 생물학에 집중하였다. 지방세포 형성은 미분화된 중간엽 전구체 세포가 성숙 지방세포로 되는 과정이다. 지난 십 년 동안 지방세포 분화의 분자 메카니즘을 설명하는데 상당한 진전이 이루어졌고, 이는 CCAAT/인핸서 결합 단백질 (C/EBPα, α, 및 γ) 및 핵 호르몬 수용체 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 γ (PPARγ)와 같은 몇몇 패밀리로부터 전사 인자의 순차적인 활성화를 포함한다 (Rosen, E.D. et al., 2002). PPARγ는 시험관 내에서 및 생체 내 모두에서 지방세포 형성을 위해 충분하고 필요한 것으로 나타났으므로 지방세포 형성의 "마스터 조절자 (master regulator)"로서 설명된다. 최근에, KLF 패밀리 (KLF2, 5 및 KLF15) ([Banerjee, S.S. et al., 2003]; [Gray, S.M. et al., 2002]), Ebf 패밀리 (Jimenez, M.A. et al., 2007) 및 Krox 20 (Chen, Z. et al., 2005)와 같은 새로운 전사 인자가 지방세포 형성에 참여하는 것으로 설명되었고, 이는 지방세포 형성 동안 일어나는 전사 케스케이드 (cascade)가 이전에 생각된 것보다 훨씬 더 복잡함을 제안한다. 추가로, 신호전달 분자 및/또는 수용체, 예를 들어 Wnt 패밀리의 분비형 단백질 (Kang S. et al., 2007), 소닉 헷지호그 (sonic hedgehog) 단백질, 노치 (Notch) 수용체가 또한 지방세포 형성을 일으키는 분자 사건에 관여되는 것으로 설명되었다. 세포외 및 세포내 사건이 어떻게든 결합되어 지방세포 형성을 조절한다는 것을 아는 것은 흥미롭다. 이들 모든 신호전달 경로는 긴밀하게 조절된 전사 케스케이드에 모이고, 이것은 잠재적으로 지방세포 발생을 제어하고 비만을 방지하기 위해 보다 완전히 이해될 필요가 있다.

지방 조직 내의 지방 저장은 제한적이고, 상기 용량을 초과하면 다른 조직, 특히 근육, 간, 및 내분비 췌장 내에 지질의 축적, 및 지방세포에 의한 다양한 아디포카인 (adipokine) 분비를 일으킨다. 지방 조직은 별개의 전구체로부터 기원할 수 있고 상이한 생리학적 기능 및 병리생리학적 역할을 갖는, 상이한 해부학 부위에 위치하는 몇몇 침착물로 이루어진다. 피하 지방 침착물과 반대로 내장 지방은 대사 증후군과 연관된 결함에 더욱 기여할 수 있다.

칸나비노이드 (cannabinoid) 1 수용체는 포도당 대사 및 2형 당뇨병에서 핵심 역할을 하는 모든 장기, 즉, 지방 조직, 위장관, 간, 골격근 및 췌장에서 확인되었다. 임상 용도에서 재조합의 제1 선택적 칸나비노이드 수용체 1 (CB1R) 길항제는 음식 섭취 및 체중을 감소시키고, 따라서 포도당 대사 조절을 개선하는 것으로 나타났다.

그러나, 비만 치료를 위한 신규한 치료 표적이 여전히 필요하다.

태반 8 단백질 (Plac8)은 세포질 신호전달 분자로서 알려져 있지만, 추정 신호 펩티드를 갖는 것으로 보고되었다 (Rogulski, K. et al., 2005). 최근에, Plac8 녹아웃 (knockout) 마우스가 생성되었고, 세균 감염에 대해 손상된 면역 반응을 보였다 (Ledford, J.G. et al., 2007). 면역 세포 및 다른 세포 종류에서 Plac8의 역할 및 기능은 여전히 알려져 있지 않다.

본 발명자들은 본 발명에 이르러 Plac8이 지방세포 분화에서 중요한 역할을 함을 발견하기에 이르렀다. 따라서, Plac8은 지방세포 형성의 조절을 위한 및 비만 및 관련 질환의 치료를 위한 새로운 관련 표적으로서 여겨진다. 또한, Plac8의 억제는 피하 및 내장 지방 축적의 감소를 위해 지방세포 형성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 지방세포에서의 대사 기능 및 지방세포 형성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 비만 및 관련 질환의 치료를 위한 지방세포 형성의 조절을 위한 Plac8의 활성 억제제의 용도로 이루어진다. 본 발명은 또한 상기 지방세포 형성의 조절자를 함유하는 제약 조성물 및 관련된 질환 및 상기 조절자에 대한 스크리닝 시험에 관한 것이다.

본 발명자들은 지방세포 형성의 조절에서 Plac8의 역할을 확인하였다. 전사체 (transcriptomic) 방안을 통해, 그의 발현이 고지방 식이를 먹인 C57BI/6 마우스의 코호트 (cohort)에서 체중 증가와 상호관련된 유전자를 확인하였다. 이어서, 고지방 식이를 먹인 마우스의 리모나밴트 (rimonabant) 치료에 의해 유발된 유전자 발현의 변화를 평가하기 위해 제2 분석을 수행하였다. 지방세포 생물학에서 이전에 설명되지 않았지만, 신호전달, 세포외 매트릭스 단백질의 변형 및 유전자 전사와 같은 중요한 생물학적 과정에 관여될 수 있는 유전자가 보유되었다. 이들 유전자는 특히 그에 의해 리모나밴트가 마우스에서 지방량 (fat mass)을 감소시키는 메카니즘에 관여될 수 있으므로, 지방세포 형성을 위해 중요할 수 있다. 상기 문맥에서, Plac8은 지방세포 대사에서, 특히 새로운 신호전달 경로에서 관여되는 것으로서 확인되었다. 보다 일반적으로, 상기 유전자는 비만에서 지방세포 형성 및 지방 조직 발달의 제어에 일정 역할을 하는 것으로 보인다.

본 발명은 Plac8 활성의 조절자의 확인으로 이루어진다. 상기 조절자는 특정 소분자, 지질 및 siRNA에서 Plac8 활성을 조절할 수 있는 임의의 화합물 또는 분자일 수 있다.

Plac8 활성의 조절자는 Plac8의 활성을 조절하는 물질의 능력을 검출함으로써 확인할 수 있다. Plac8의 억제제는 Plac8의 활성을 전적으로 또는 부분적으로 감소 또는 억제할 수 있는 임의의 화합물이다. Plac8의 억제제는 세포내 구획 (compartment)에서 그의 천연 리간드와 Plac8의 상호작용을 저해하는 물질, 전사 및 번역 수준 모두에서 Plac8 발현을 감소시키는 물질, 및 Plac8이 관여되는 세포내 신호를 억제하는 물질을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

하나의 실시양태에서, Plac8 활성은 Plac8의 전사를 전적으로 또는 부분적으로 억제하는 소분자를 사용하여 감소될 수 있다. 그러한 조절자는, 리포터 유전자에 인프레임으로 (in frame) 연결되고 적합한 세포주 내에서 발현되는 Plac8의 프로모터로 이루어지는 리포팅 (reporting) 시스템으로서 당업자에게 잘 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있고; 리포터 유전자 생성물의 활성은 정량적으로 측정될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 활성화 전사 인자를 억제함으로써 리포터 유전자의 발현을 억제하는 화합물은 잠재적인 후보로서 간주될 수 있다.

그러한 리포팅 시스템에서 사용될 수 있는 리포터 유전자는 많고 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 그러한 리포터 유전자는 초록 형광 단백질 (GFP), 루시퍼라제, β-갈락토시다제 등의 발현을 허용하는 유전자일 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 측면은

a) 리포터 유전자에 연결된 Plac8 프로모터를 포함하는 리포터 구축물로 세포주를 형질감염시키고,

b) 상기 세포주를 리포터 유전자의 발현을 허용하는 조건에서 배양하고,

c) 후보 화합물을 세포 배양액에 첨가하고,

d) 억제제 화합물을 리포터 유전자 발현을 감소 또는 억제하는 능력을 갖는 화합물인 것으로서 확인하는 단계

를 포함하는, Plac8의 활성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

Plac8 전사의 조절자에 대한 상기 스크리닝 시험에 사용할 Plac8의 예측된 프로모터는 서열 23에 상응한다.

다른 실시양태에서, Plac8의 발현은 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 사용하는 RNA 간섭을 통해 조절된다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 Plac8 유전자 발현에 대항한 RNA 간섭 (RNAi)을 매개할 수 있는 작은 핵산 분자, 예를 들어 짧은 간섭 핵산 (siNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자 (상기 작은 핵산 분자들의 칵테일 (cocktail) 및 상기 작은 핵산 분자의 적합한 제형 포함)를 포함하는 이중가닥 핵산 분자에 관한 것이다.

RNAi 매개된 유전자 침묵 (silencing) 현상은 카에노랍디티스 엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 시스템에서 처음 설명되었고, 여기서 긴 이중가닥 RNA 분자의 마이크로주사가 보고되었다. RNA 매개된 유전자 불활성화의 메카니즘은 지금까지 조사된 다양한 유기체에서 근소하게 상이한 것으로 보인다. 그러나, 모든 시스템에서, RNA 매개된 유전자 침묵은 소위 RISC 복합체의 일부인 엔도뉴클레아제 Argonaute2에 의해 유도된 표적 mRNA의 전사후 분해에 기초한다. 분해의 서열 특이성은 RISC 복합체 내로 부하된 특이적 안티센스 RNA 가닥의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정된다.

siRNA 화합물을 세포 내로 도입하면, 세포의 표적 mRNA 수준이 감소하고, 따라서 상응하는 폴리펩티드 및 동시에 상응하는 효소 활성이 감소한다.

본원에서 설명된 바와 같이 Plac8에 특이적인 siRNA는 Plac8 mRNA의 번역을 감소시키기 위해서 Plac8 활성의 조절자로서 사용될 수 있다. 보다 특히, Plac8에 특이적인 siRNA는 지방세포 형성을 감소시켜 비만 및 관련 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 가닥들 중 하나가 표적 Plac8 핵산 분자 내의 소정의 Plac8 뉴클레오티드 서열에 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부를 포함하는 이중가닥 핵산 분자, 예를 들어 siRNA 분자를 특징으로 한다.

변형 또는 비변형된 RNA 분자가 사용될 수 있다. 변형의 예는 올리고뉴클레오티드의 혈청 안정성을 개선하기 위해 트리시클로-DNA를 혼입하는 것이다.

하나의 실시양태에서, 결정된 Plac8 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 Plac8 뉴클레오티드 표적 서열 (서열 1 및 서열 3)이다.

상이한 유기체 또는 상이한 대상에 걸친 게놈의 서열 변이 가능성 때문에, 넓은 치료 용도를 위한 siRNA 분자의 선택은 아마도 유전자의 보존된 구역을 포함할 것이다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 게놈의 보존된 구역 또는 상이한 표적들에 걸쳐 보존되는 구역을 표적으로 하는 siRNA 분자에 관한 것이다. 다양한 표적들의 보존된 구역을 표적화하도록 설계된 siRNA 분자는 다양한 환자 집단에서 Plac8 유전자 발현의 효율적인 억제를 가능하게 한다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 표적 Plac8 유전자의 발현을 하향조절하거나 표적 RNA의 절단을 유도하는 이중가닥의 짧은 간섭 핵산 분자를 특징으로 하고, 여기서 상기 siRNA 분자는 약 15 내지 약 28개의 염기쌍, 바람직하게는 약 19개의 염기쌍을 포함한다. 본 발명의 siRNA 또는 RNAi 억제제는 화학적으로 합성되거나, 벡터로부터 발현되거나, 효소적으로 합성될 수 있다.

특정 실시양태에서, Plac8에 특이적인 siRNA는 서열 5 또는 서열 6 또는 서열 7의 서열을 갖는 shRNA이다. 바람직한 실시양태에서, Plac8에 특이적인 siRNA는 서열 6 또는 서열 7의 서열을 갖는 shRNA이고, 보다 바람직한 실시양태에서, Plac8에 특이적인 siRNA는 서열 6의 서열을 갖는 shRNA이다.

본 발명에 따른 siRNA를 사용하면, 상응하는 야생형 세포의 mRNA 수준의 5% 내지 20%, 바람직하게는 5% 내지 15%, 보다 바람직하게는 5% 내지 10%로 mRNA 수준을 감소시킨다. 야생형 세포는 siRNA 화합물을 코딩하는 핵산의 도입 전의 세포이고, 여기서 표적화된 mRNA는 siRNA 화합물에 의해 분해되지 않는다.

Plac8의 활성 억제제는 분자의 성질 및 예상되는 효과에 따라 국소 또는 전신으로 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. siRNA는 당업계에서 사용되는 프로토콜에 따라 이중 가닥 분자의 경우에 표적화된 조직에서 직접 국소 투여되거나, 또는 shRNA의 경우에 벡터를 통해 투여될 수 있다.

하나의 실시양태에서, RNAi는 shRNA 분자를 사용하여 달성된다. shRNA 구축물은 스템-루프 (stem-loop) RNA를 코딩한다. 세포 내로 도입된 후에, 상기 스템-루프 RNA는 그의 서열이 원래의 RNA 분자의 스템에 상응하는 이중가닥 RNA 화합물로 프로세싱된다. 상기 이중가닥 RNA는 비제한적으로 문헌 ([Sahber et al. (1987)], [Bhattacharyya et al., (1990)]) 또는 US 5,795,715에 기재된 시험관내 및 생체내 방법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다.

생체내 투여를 위해, shRNA는 플라스미드 내로 도입될 수 있다. 플라스미드-유래된 shRNA는 리포터 유전자 또는 선택 마커와의 조합에 대한 선택권, 및 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 통한 전달을 제공하는 잇점을 제시한다. shRNA의 벡터 내로, 이어서 세포 내로의 도입은 shRNA의 연속적인 발현을 보장한다. 벡터는 대체로 딸세포로 전달되어, 유전자 침묵의 유전을 허용한다.

본 발명은 또한 본 발명의 shRNA 발현을 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 이들 벡터는 예를 들어 정맥내 경로, 근육내 경로, 피하 조직 또는 통상적인 용례에 따라 선택된 다른 표적화된 조직 내로의 직접 주사를 비롯한 상이한 적합한 경로에 의해 투여될 수 있는, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터이다.

siRNA의 투여 경로는 국소의 직접 전달로부터 전신 정맥내 투여까지 달라진다. 국소 전달의 잇점은 분자가 표적 조직 내로 또는 그 부근에 주사되기 때문에, 효능을 위해 요구되는 siRNA의 용량이 실질적으로 적다는 것이다. 또한, 국소 투여는 siRNA의 집중 전달을 허용한다. 그러한 직접 전달을 위해, 네이키드 (naked) siRNA가 사용될 수 있다. "네이키드 siRNA"는 염수 또는 다른 간단한 부형제, 예를 들어 5% 덱스트로스 내에서 siRNA (비변형된 또는 변형된)의 전달을 나타낸다. 그러한 분자는 그의 제형화 및 투여가 용이하기 때문에 매력적인 치료 방안이다. 또한, 네이키드 DNA는 지질, 특히 리포좀 내로 제형화될 수 있다.

siRNA의 전신 적용은 종종 덜 침습성이고, 보다 중요하게는 외부로부터 충분히 접근가능한 조직에 제한되지 않는다. 전신 전달을 위해, siRNA는 콜레스테롤 접합체, 리포좀 또는 중합체-기반 나노입자와 함께 제형화될 수 있다. 리포좀은 증가된 약동학 특성 및/또는 감소된 독성 프로필을 제공하기 위해 전통적으로 사용된다. 이들은 유의하고 반복적인 성공적 생체내 전달을 허용한다. 현재, 특히 간세포에 대한 siRNA의 전신 전달을 위한 지질-기반 제형의 사용이 RNAi 치료제의 개발을 위한 가장 유망한 가까운 장래의 기회 중 하나를 제시할 것으로 보인다. 중합체, 예를 들어 동적 폴리접합체 (예를 들어, 간세포 표적화를 위해 N-아세틸글루코사민에 결합된) 및 시클로덱스트린-기반 나노입자를 사용한 제형화는 표적화된 전달 및 엔도좀 회피 (escape) 메카니즘 모두를 허용한다. 아텔로콜라겐 및 키토산과 같은 다른 중합체는 피하 종양 이종이식편 및 뼈 전이에 대한 치료 효과를 허용한다.

siRNA는 또한 표적화 전달을 돕기 위해 설계된 분자 엔티티 (entity)와 직접 접합될 수 있다. siRNA 이중체의 성질을 고려하여, 불활성 또는 센스 스트랜드의 존재는 접합을 위한 이상적인 부위로 향한다. 접합체의 예는 친지성 접합체, 예를 들어 콜레스테롤, 또는 앱타머 (aptamer)-기반 접합체이다.

또한, siRNA 이중체의 음대전된 인산염 백본 (backbone)과 복합체를 형성하기 위해 양이온성 펩티드 및 단백질이 사용된다.

이들 상이한 전달 방안은 Plac8 siRNA를 관련 조직, 특히 지방 조직 내로 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 상기 표적화를 위해, siRNA는 예를 들어 지질 수송체, 수용체, 인슐린 수용체 또는 당업계에 공지된 임의의 분자와 상호작용하는 리간드와 같이, 전-지방세포 및 지방세포와 상호작용하는 상이한 분자에 접합될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 Plac8의 조절자를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다. 이들 제약 조성물은 유효 용량의 본 발명에 따른 적어도 하나의 조절자, 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 상기 부형제는 당업자에게 공지된 통상적인 부형제 사이에서 제약 형태 및 목적하는 투여 경로에 따라 선택된다.

본 발명은 또한 지방세포 형성의 조절 방법으로 이루어진다. 상기 방법은 비만 또는 관련 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 미용 목적으로 지방 축적을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

Plac8 활성의 조절자는 특히 비만 관련 질환, 특히 2형 당뇨병, 이상지질혈증, 상승된 혈압, 인슐린 저항성, 심혈관 질환 및 보다 일반적으로 대사 증후군의 치료 및 예방에서 지방세포 형성을 조절하기 위해 치료제에서 유용하다.

본 발명은 그의 다른 측면에 따라, 유효 용량의 본 발명에 따른 Plac8의 조절자를 환자에게 생체내 투여하는 것을 포함하는, 상기 병리학의 치료 방법에 관한 것이다.

적절한 단위 투여형은 경구 형태, 예를 들어 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 분말, 과립 및 경구 용액 또는 현탁액, 설하, 구강, 기관내, 눈 안, 코 안 형태, 흡입, 국소 (topical), 경피, 피하, 근육내 또는 정맥내 형태, 직장 형태 및 임플란트를 포함한다. 국소 적용을 위해, 본 발명의 화합물은 크림, 겔, 연고 또는 로션으로서 사용될 수 있다.

통상적인 실무에 따라, 각각의 환자에 적합한 투여량은 투여 경로, 환자의 체중 및 반응에 따라 의사가 결정한다.

Plac8 억제제는 또한 수치스러운 지방 축적을 감소시키기 위해 미용 용도에 유용하다. 미용 용도를 위해, Plac8의 억제제는 국소 사용에 적합한 제형 내에 포함될 수 있다. Plac8의 억제제는 이전에 설명된 소분자 또는 siRNA일 수 있다.

본 발명은 이제 다음 실시예를 참조로 설명되고, 이들 실시예는 단지 예시적이고 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

도 1: 중요한 지방 조직 조절 유전자의 선택. 벤 다이아그램 (Venn diagram)은 다음 기준에 기초한 유전자의 선택을 예시한다. A) 피하 (SCAT 또는 Sq) 및 내장 (VAT)에서 고지방 급식에 의한 유사한 조절. 151개의 유전자가 선택되었다 (SCAT에 대해 48개 및 VAT에 대해 88개). B) 이들 151개의 유전자 중에서, 리모나밴트 치료에 의해 조절된 유전자의 선택 (SCAT에 대해 14개 및 VAT에 대해 54개). 이렇게 하여 고지방 급식 및 리모나밴트에 의해 두 조직 모두에서 조절된 34개 유전자를 선택하였다. 이들 유전자 중에서, 16개는 L, M 및 H군의 체중과 상호관련된 발현 수준을 갖고 (비만-연관), 18개는 각각의 하위군에서 동일한 수준으로 HFD에 의해 조절된다 (비만-연관되지 않은).
도 2: 다양한 조직 및 세포 종류에서 Plac8 발현. A) 다양한 마우스 조직: 비장, 근육 (비복근), 심장, 폐, 신장, 간, 갈색 지방 조직 (BAT), 피하 (SCAT) 및 내장 (VAT) 지방 조직 내의 mRNA 발현을 보여주는 Plac8에 대한 노던 블로팅 (Northern Blotting). 대조군으로서, 막을 메틸렌 블루로 염색한다. Plac8 mRNA의 크기를 우측에 제시한다. B 내지 E: RT-PCR에 의해 측정된 Plac8의 mRNA 수준. B) 야생형 및 Ob/Ob 마우스 (n=5)의 SCAT 및 VAT에서 (* p<0.05), 데이타를 평균±sd로서 제시하고, 1로 설정된 대조군 SCAT에 비해 증가 배수로서 표현한다. C) 마우스 (n=5, 각각의 추출을 위해 모은 마우스, 실험은 3회 반복하고, 대표적인 실험을 보여준다)의 기질 혈관 분획 (SVF) 및 단리된 지방세포에서. 데이타는 SCAT SVF 발현에 비해 증가 배수로서 표현한다. D) 인간 전체 조직 SCAT 및 VAT, 단리된 지방세포, 단리된 전-지방세포 및 시험관 내에서 분화된 지방세포에서. 데이타는 1로 임의로 설정한 전체 조직 SCAT 발현에 대비한 수준으로서 표현한다. E) DMI 처리일 2일 전 및 제7일까지 DMI 처리 후 3T3-L1 세포에서. N=2-3 세트의 세포. 데이타는 제0일 발현에 대비한 수준으로서 나타낸다.
도 3: shRNA 에 의한 Plac8 발현 및 활성의 녹다운 ( knockdown ). A) 293T 세포 내로 shRNA 형질감염. Plac8에 대한 shRNA 서열을 함유하는 pSIREN 레트로바이러스 플라스미드를 pCMVSPORT 발현 플라스미드와 함께 동시-형질감염시켰다. shRNA 구축물에 대한 대조군으로서, 개똥벌레 루시퍼라제 단백질에 대한 shRNA (shRNA 루시퍼라제)를 사용하였다. Plac8에 대해 3개의 shRNA를 시험하였다. B) 3T3-L1 세포에 루시퍼라제 (shLuc) 또는 Plac8 (shPlac8)에 대한 shRNA를 함유하는 레트로바이러스를 형질도입하였다. mRNA 수준을 분화 전에 RT-PCR에 의해 측정하였다. C) 제9일에 분화된 3T3-L1의 오일-레드-O 사진. D) 제9일에 C)에서와 동일한 세포에서 RT-PCR에 의해 측정된 aP2 (분화의 마커) mRNA 발현. 결과는 평균±sd로서 표현한다 (^* _,P<0.05, ^**, P<0.01; ^***, P<0.005, n=3).
도 4: 3 T3 - L1 세포주에서 Plac8 cDNA 의 과다발현. A) Plac8에 대한 뮤린 cDNA를 발현하는 레트로바이러스, 또는 대조군으로서 빈 레트로바이러스를 형질도입시킨 3T3-L1. 제0일에 RT-PCR에 의해 측정된 Plac8 mRNA 발현. B) Plac8에 대한 cDNA를 함유하는 구축물 또는 빈 구축물 레트로바이러스 (대조군)를 형질도입시킨 제4일 및 제9일에 분화된 3T3-L1의 접시의 오일-레드-O 사진. C) 제9일에 동일한 세포에서 RT-PCR에 의해 측정된 PPAR감마2 (분화의 마커) mRNA 발현. 결과를 평균±sd로서 표현한다 (^*, P<0.05, ^**, P<0.01, n=3).

물질 및 방법

동물 처리

C57BL/6J 마우스 (비만 경향 (Collins et al. 2004))에게 6개월 동안 고지방 식이 (HFD)를 먹였다. 6개월의 HFD 후에, 마우스는 다양한 정도의 당 불내성 (glucose intolerance) (당 내성 시험에 의해 측정됨)을 가지는 산발적인 체중을 보였다. HFD 마우스를 동일한 수준의 당 불내성을 갖지만 낮은 (L), 중간 (M) 또는 높은 (H) 체중을 보이는 3개의 군으로 분리하고, 그들의 체중을 표준화하기 위해 이들 및 정상 사료 (NC)를 먹인 마우스를 1개월 동안 비히클 또는 리모나밴트 (10 mg.kg^-1.일^-1)로 치료하였다.

RNA 제조, 표지 및 cDNA 마이크로어레이 상에서의 혼성화 .

군당 5마리의 상이한 마우스로부터의 RNA를 peqGOLD Trifast™ (peqlab) 및 클로로포름-이소아밀알콜 (24:1) 추출을 이용하여 내장 및 피하 지방 조직으로부터 추출하였다. RNA를 이소프로판올로 침전시키고, RNeasy 컬럼 (퀴아젠 (Qiagen)) 위로 통과시켜 정제하였다. RNA 품질은 증폭 전후에 바이오애널라이저 (Bioanalyzer) 2100 (애길런트 (Agilent))를 사용하여 검토하였다. RNA를 역전사하고, RNA를 MessageAmp™ 키트 (앰비온 (Ambion))를 사용하여 증폭시켰다. 마우스 범용 참조물 (Mouse Universal Reference; 클론테크 (Clontech))을 유사하게 증폭시키고, 두 지방 조직 및 참조 RNA를 공개된 프로토콜 (De Fourmestraux et al., 2004)에 따라 Cy5 및 Cy3으로 간접 기술에 의해 표지하였다. 표지된 RNA를 로잔 대학교의 DNA 어레이 시설 (DNA Array Facility of the University of Lausanne))에서 제조된 17664개의 cDNA를 함유하는 마이크로어레이에 혼성화하였다. 스캐닝, 영상, 및 품질 제어 분석을 이전에 공개된 바와 같이 수행하였다 (de Fourmestraux et al., J. Biol. Chem. 2004 279:50743-53). 데이타를 log₂ 강도 비 (Cy5/Cy3)로서 표현하고, 프린트 팁 (print tip) 국소 가중 선 회귀 (로웨스 (Lowess)) 방법을 이용하여 표준화하고, 스폿 (spot) 품질 및 불완전 주석 (incomplete annotation)에 기반하여 여과하였다. 모든 분석은 컴프리헨시브 알 아키브 네트워크 (Comprehensive R Archive Network)(cran.us.r-project.org/)에서 이용가능한 통계 연산을 위한 R 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

세포 배양

3T3-L1 세포를 5% CO₂에서 10% FBS (깁코 (Gibco))를 함유하는 DMEM (깁코) 내에서 배양하였다. 레트로바이러스 감염 후에 (아래 참조), 세포를 10% FBS 함유 DMEM 내에서 100-mm 또는 60-mm 접시 내에서 융합 (confluence)까지 성장시켰다. 일단 융합에 도달하면, 세포를 덱사메타손 (1μM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 및 이소부틸메틸잔틴 (0.5 μM)를 함유하는 분화 배지 (DMI)에 노출시켰다. 2일 후에, 세포를 7일에 수거할 때까지 인슐린 (5 ㎍/ml)을 함유하는 배지 내에 유지하였다.

오일- 레드 -O 염색

분화의 7 내지 10일 후에, 세포를 PBS 내에서 1회 세척하고, 포름알데히드 (Formalde-fresh; 피셔 (Fisher))로 15분 동안 고정시켰다. 염색 용액은 0.5 g 오일-레드-O를 100 ml의 이소프로판올에 용해시켜 제조하고; 상기 용액 60 ml을 40 ml의 증류수와 혼합하였다. 실온에서 1시간 후에, 염색 용액을 여과하고, 접시에 4시간 동안 첨가하였다. 이어서, 염색 용액을 제거하고, 세포를 증류수로 2회 세척하였다.

shRNA 구축물

shRNA는 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (클론테크)를 사용하여 구축하였다. Plac8에 대한 표적 서열은 화이트헤드 (Whitehead) siRNA 알고리즘 (http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) 및 siRNA 디자이너 소프트웨어 (클론테크; http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/)에 질의함으로써 설계하고; 두 알고리즘에 의해 나타내어지는 적어도 2개의 서열을 EcoRI 및 BamH1 제한 부위를 사용하여 pSIREN 벡터 (클론테크) 내로 서브클로닝하였다. Plac8에 대한 3개의 표적 서열, 즉 서열 5 (shPlac8-1), 서열 6 (shPlac8-2) 및 서열 7 (shPlac8-3)을 선택하고; 음성 대조군으로서, 서열 8의 서열을 갖는 루시퍼라제에 대한 siRNA 서열 (shLuc)을 사용하였다.

shRNA 구축물의 형질감염

shRNA의 특이성은 문헌 [Jordan, M., et al. (2004)]에 기재된 인산칼슘 방법을 이용하여, Plac8 cDNA (서열 21)를 함유하는 발현 벡터, 및 루시퍼라제 (대조 shLUC) 또는 Plac8 (shPlac8)에 대한 shRNA를 발현하는 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen 벡터로 동시-형질감염시킨 293T HEK 세포에서 시험하였다. RT-PCR 분석은 형질감염 24h 후에 세포 RNA-추출물에 대해 수행하였다.

레트로바이러스 구축물의 생성 및 레트로바이러스 감염

레트로바이러스를 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (pSIREN 클론테크) 또는 pMSCV 푸로마이신 플라스미드 (pMSCV, 클론테크) 내에 구축하였다. 바이러스 구축물을 문헌 [Jordan, M., et al. (2004)]에 기재된 인산칼슘 방법을 이용하여, gag-pol 및 VSV-G 단백질을 코딩하는 구축물과 함께 293 HEK 패키징 (packaging) 세포 내로 형질감염시켰다. 상등액을 48h 후에 3 ㎛의 트리코스타틴 (Trichostatin) A (시그마 (Sigma))의 존재 하에 수거하고, 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 급속 냉동하고 -80℃에서 저장하였다. 바이러스 상등액을 폴리브렌 (4 ㎍/ml)의 존재 하에 6시간 동안 세포에 첨가하고, 다음 15시간 동안 신선한 배지로 2배 희석하였다.

과다발현 구축물

GFP 마커를 발현하는 변형된 pMSCV 푸로마이신 레트로바이러스 플라스미드 (클론테크)를 사용하여, 세포 내로 Plac8의 cDNA를 과다발현시켰다. cDNA (서열 21)를 pMSCV의 다중클로닝 부위로부터 hpaI 제한 부위 내로 블런트 상태 (blunted)로 삽입하였다. 생성되는 콜로니를 올바른 배향에 대해 시험하고, 효소 소화에 의해 선택하였다. 올바른 클론을 선택하고 증폭시키고, 3T3-L1 세포의 레트로바이러스 감염을 위해 사용하였다.

지방 조직으로부터 지방세포 및 기질 혈관 분획 ( SVF )의 단리

8주령 수컷 C57BL/6J 마우스 (n=6-8)를 CO₂ 흡입에 의해 안락사시키고, 부고환 (내장) 및 피하 지방 조직을 수집하고, 10 mg/ml 지방산-결여 BSA (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미국 미시건주 세인트 루이스))를 함유하는 DMEM 배지에 넣었다. 조직을 미세한 조각으로 간 다음, 진탕 수조 (80Hz) 내에서 1시간 동안 0.12 단위/mL 콜라게나제 타입 I (시그마) 내에서 37℃에서 소화시켰다. 이어서, 샘플을 멸균 250㎛ 나일론 메시 (Scrynel NY250HC, Milian)를 통해 여과하여, 소화되지 않은 단편을 제거하였다. 생성되는 현탁액을 1100 RPM에서 10 min 동안 원심분리하여, 지방세포로부터 SVF를 분리하였다. 지방세포를 제거하고, DMEM 버퍼로 세척하였다. 이어서, 이들을 peqGOLD TriFast 시약 (액손랩 (Axonlab))에 현탁하고, RNA를 제조자의 지시에 따라 단리하였다. SVF 분획을 적혈구 용해 버퍼 (0.154 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA) 내에서 2 min 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 1100 RPM에서 10 min 동안 원심분리하고, RNA 단리를 위해 500 ㎕의 peqGOLD TriFast 시약 (액손랩) 내에 재현탁하였다.

RNA 추출 및 실시간 PCR

총 RNA를, 제조자의 지시 (액손랩)에 따라 peqGOLD TriFast 시약을 사용하여 배양된 세포로부터 단리하였다. 랜덤 프라이머 및 Superscript II (인비트로겐 (Invitrogen))을 사용하여 0.5 ㎍의 총 RNA로부터 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR은 Power SYBR Green Mix (어플라이드 바이오시스템 (Applied Biosystem))를 사용하여 수행하였다. 마우스 유전자에 대해 다음 프라이머를 사용하였다: 서열 9 (Plac8-전방향), 서열 10 (Plac8-역방향), 서열 11 (PPAR감마2-F), 서열 12 (PPPAR감마2-R), 서열 13 (Ap2-F), 서열 14 (Ap2-R), 서열 15 (시클로필린 (Cyclophilin) A-F) 서열 16 (시클로필린 A-R). 인간 유전자에 대해 다음 프라이머를 사용하였다: 서열 17 (hPlac8-F), 서열 18 (hPlac8-R), 서열 19 (h시클로필린 A-F) 및 서열 20 (h시클로필린 A-R).

노던 블로트

다양한 마우스 조직으로부터 총 RNA를, 제조자의 지시 (액손랩)에 따라 peqGOLD TriFast 시약을 사용하여 단리하였다. 총 RNA (8 ㎍)을 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔 상에서 분리하고, 나일론 막에 밤새 형질감염시켰다. RNA 양 부하를 제어하기 위해, 후속적인 혼성화 전에 막을 메틸렌 블루로 염색하였다. Plac8 신호의 검출을 위해, 전장 cDNA 마우스 플라스미드 (오픈 바이오시스템 (Open Biosystem))로부터의 프로브를 사용하였다. [α-³²P]dCTP (아머샴 (Amersham))을 사용한 랜덤 프라이밍 (random priming)에 의해 프로브를 표지하였다. 혼성화 및 세척은 제조자의 지시 (스트라타젠 (Stratagene))에 따라 Quickhib 방법을 이용하여 수행하였다. 블로트를 신호 강도에 따라 1일 또는 수일 동안 -80℃에서 하이퍼필름 (Hyperfilm) ECL (아머샴)에 노출시켰다.

결과

실시예 1: 마이크로어레이 결과

다음 3개의 기준을 만족시키는 유전자를 확인하기 위해 마이크로어레이 데이타의 생물정보학 분석을 수행하였다: (i) 고지방 급식에 의해 조절됨, (ii) 내장 및 피하 지방 모두에서 고지방 급식에 의해 유사한 조절된 발현, 및 (iii) 리모나밴트 치료에 의한 그들의 발현의 유사한 정상화 (도 1). 사용된 cDNA 마이크로어레이 상에 존재하는 약 17000개의 유전자 표적 중에서, 34개의 유전자가 이들 기준을 만족시켰고, 이를 표 1에 제시하였다. 현저하게, 이들 유전자 중 10개 - Cav1, Fgf1, Fndc3b, Kif5b, Mest, Npr3, Pik3ca, Sparc, Vldlr, 및 Wwtr1 -는 지방 조직 발달 및 기능의 중요한 조절자인 것으로 이전에 알려져 있었다. 이들 유전자 중 일부는 체중 증가와 상호관련된 발현 수준을 가졌고 (표 1에서 회색으로 제시함), 이는 비만 동안 지방 조직의 과다형성 및/또는 비대에서 잠재적인 역할을 제안한다. 이들 결과는 비만의 치료 처치를 위한 가능한 신규한 표적을 확인하기 위해 사용된 방안을 입증한다.

가장 중요하게는, 표 1에 언급된 유전자 중 많은 것은 지방 조직 발달 또는 생물학의 문맥에서 연구되지 않았다. 이들 유전자는 다음 기능 클래스에 속한다: 세포외 매트릭스/세포 상호작용, 세포골격, 세포내 신호전달, 효소, 및 전사 인자/보조-인자. 이들은 아마도 조직 재형성, 특히 지방세포 발달에 관여한다. 이들 유전자 중 하나인 Plac8 유전자 및 지방세포 생물학에서 그의 역할을 본원에 제시하고, 이는 본 발명의 한 측면을 구성한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같은 Plac8의 마우스 및 인간 서열은 각각 서열 1 및 서열 3에 상응한다.

실시예 2: 선택된 유전자의 조직 및 세포 발현

지방세포 발달에서 Plac8의 역할을 보다 잘 이해하기 위해, 그의 발현 패턴을 먼저 특성 결정하였다. 다양한 마우스 조직에서, 단리된 전-지방세포 및 지방세포에서, 마우스 비만 모델 (Ob/Ob 마우스)의 내장 지방 조직 (VAT) 및 피하 지방 조직 (SCAT)에서 및 인간 지방 조직에서 mRNA 수준을 노던-블로트 및 RT-PCR에 의해 측정하였다.

노던-블로팅에 의해, Plac8 (도 2A에서 화살표로 표시된 1 kb 신호)은 사료-식이 C57BL/6J 마우스의 SCAT 및 비장에서 동일한 높은 수준으로, 및 VAT, SCAT, 근육, 심장, 폐 및 근육에서 보다 낮은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 2A). 이어서, Plac8의 발현 패턴을 마이크로어레이 연구에 의해 관찰하였다. Ob/Ob 마우스의 백색 지방 조직에서, Plac8 수준은 야생형 마우스 내의 수준에 비해 감소한다 (도 2B). 값을 1로 임의로 설정한 SCAT에서 대조값에 비해 증가 배수로서 표현한다.

지방 조직은 성숙 지방세포뿐만 아니라, 전구체 세포, 예를 들어 전-지방세포 및 혈관, 대식세포 및 섬유모세포를 또한 포함하는 복잡한 조직이다. 콜라게나제 I 소화 기술에 기초하여, 기질 혈관 분획 (SVF) (전-지방세포, 내피세포 및 대식세포 포함)을 단리된 지방세포 분획으로부터 분리하였다. Plac8은 전-지방세포를 함유하는 기질 혈관 분획에서 주로 발현되는 것으로 밝혀졌다 (도 2C). 이들 결과는 Plac8이 전-지방세포에서 보다 많이 발현되고, 따라서 분화 또는 증식 과정에 관여하는 것으로 보임을 나타낸다.

다음 단계는 Plac8 유전자가 종들 사이에서 보존되는지 결정하는 것이다. 상기 문제를 다루기 위해, 인간 지방 조직 샘플에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 전-지방세포 및 지방세포를 SCAT 또는 VAT로부터 단리하였다. 단리된 전-지방세포를 제7일까지 시험관 내에서 분화하도록 유도하였다. 결과는 Plac8이 인간 지방에서 실제로 발현됨을 보여주었다 (도 2D). 이들은 이들 유전자가 인간 지방 조직 내에 존재함을 나타낸다. 이들 결과를 함께 살펴보면, Plac8이 가능하게는 비만에서 지방세포 형성 또는 지방 조직 팽대를 위해 요구되는 지방세포 발달을 위한 관련 후보 유전자임을 제안한다.

실시예 3: 3 T3 - L1 분화 동안 선택된 유전자의 발현

이어서, 지방세포 형성 동안 Plac8 유전자의 발현을 평가하였다. 이를 위해, 3T3-L1 (지방생성 세포주)의 상세한 분화 시간-경과 동안 mRNA 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다 (도 2E). 실험은 초기 단계 (DMI 처리 1 내지 3시간 후)에 Plac8이 현저하게 증가함을 보여주었다. 공지의 지방생성 전사 인자, 예를 들어 CEBPβ 및 γ (Rosen E.D. et al., 202), Krox20 (Chen, Z. et al., 2005) 및 Ebf (Jiminez, M.A et al., 2007)가 유사한 발현을 보이고, 이것은 지방세포 형성의 초기 단계에서 상기 유전자의 관련성을 시사하기 때문에 상기 패턴은 흥미롭다.

실시예 4: 3 T3 - L1 세포에서 Plac8 의 shRNA 녹다운은 지방세포 형성을 감소시킨다

기능 상실 (loss-of-function) 연구를 위해, 클론테크로부터의 레트로바이러스 벡터 내로 서브클로닝된 Plac8에 특이적인 shRNA를 사용하였다 (RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen 또는 pSIREN). 상기 플라스미드는 GFP 마커를 함유하고, 이는 3T3-L1 세포에서 감염 효율을 제어하도록 허용한다. Plac8에 대해 3개의 상이한 shRNA를 pSIREN 플라스미드 내로 클로닝하고, 이를 293T HEK 세포에서 먼저 시험하였다. 상기 실험은 Plac8 발현을 억제하는 Plac8에 특이적인 shRNA의 능력을 입증하였다. 흥미롭게도, shPlac8-2 및 shPlac8-3을 사용하여 각각 75% 및 40%의 녹다운이 획득되었고 (도 3A), 따라서, 이들은 둘 모두 3T3-L1 세포 내로 형질도입을 위해 사용된다.

이어서, 3T3-L1 세포를 6시간 동안 Plac8 (shPlac8) 또는 루시퍼라제 (shLuc)를 향해 생성된 shRNA를 발현하는 레트로바이러스 벡터로 감염시켰다. GFP 마커를 사용하여, 3T3-L1 세포에서 90% 감염을 관찰하였다. 제0일에, shPlac8-2 및 shPlac8-3 (도 3B)로 감염된 세포에서 Plac8에 대한 50% 녹다운이 얻어진 반면, shLuc 대조군에서는 억제가 보이지 않았다. 이어서, 세포를 융합에 도달시키고, 1주 후에 DMI로 분화시켰다. 분화의 7 내지 10일 후에, 지질 함량의 양을 결정하기 위해 세포를 오일-레드-O 염색으로 염색하였다. shLuc로 형질감염된 대조 세포에 비해 shPlac8로 형질감염된 세포에서 지질 염색 및 지방세포 형성의 마커의 감소에 의해 나타나는 바와 같이, Plac8의 녹다운은 지방세포 형성을 감소시킨다 (도 3C 및 3D).

실시예 5: 3 T3 - L1 세포주에서 Plac8 의 과다발현은 지방세포 형성을 증가시킨다.

기능 획득 (gain-of-function) 연구를 위해, Plac8의 뮤린 서열의 cDNA를 pMSCV 레트로바이러스 플라스미드 (클론테크) 내로 서브클로닝하였다. 3T3-L1 세포의 감염 후에, Plac8의 RNA 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다. 제0일에, 분화에 앞서, 빈 플라스미드로 감염된 대조군 세포 (L1 대조군)에 비해 Plac8을 과다발현하는 3T3-L1 세포 (L1 Plac8)에서 Plac8의 3.5배 유도를 얻었다 (도 4A). 세포를 융합에 도달시키고, DMI로 분화시켰다. 제4일 및 제9일에, 세포를 지질 함량에 대해 오일-레드-O로 염색하였다. 도 4B에 보이는 바와 같이, Plac8의 과다발현은 3T3-L1의 지방생성 가능성을 증가시킨다. 분화의 마커 (PPARg2)를 또한 RT-PCR에 의해 측정하였고, 결과는 상기 마커가 제9일에 Plac8을 과다발현하는 3T3-L1에서 대조군 세포에 비해 54% 증가하였음을 보여주었다 (도 4C).

참고문헌

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Asp Met Asn Glu Cys Cys Leu Cys Gly Thr Ser Val Ala 55 60 65 atg agg act ctc tac agg acc cga tat ggc atc cct gga tct att tgt 356 Met Arg Thr Leu Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Ile Pro Gly Ser Ile Cys 70 75 80 85 gat gac tat atg gca act ctt tgc tgt cct cat tgt act ctt tgc caa 404 Asp Asp Tyr Met Ala Thr Leu Cys Cys Pro His Cys Thr Leu Cys Gln 90 95 100 atc aag aga gat atc aac aga agg aga gcc atg cgt act ttc taa 449 Ile Lys Arg Asp Ile Asn Arg Arg Arg Ala Met Arg Thr Phe 105 110 115 aaactgatgg tgaaaagctc ttaccgaagc aacaaaattc agcagacacc tcttcagctt 509 gagttcttca ccatcttttg caactgaaat atgatggata tgcttaagta caactgatgg 569 catgaaaaaa atcaaatttt tgatttatta taaatgaatg ttgtccctga acttagctaa 629 atggtgcaac ttagtttctc cttgctttca tattatcgaa tttcctggct tataaacttt 689 ttaaattaca tttgaaatat aaaccaaatg aaatatttta actgataaaa aaaaaaaaaa 749 aaaataaaaa a 760 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gln Ala Gln Ala Pro Val Val Val Val Thr Gln Pro Gly Val Gly 1 5 10 15 Pro Gly Pro Ala Pro Gln Asn Ser Asn Trp Gln Thr Gly Met Cys Asp 20 25 30 Cys Phe Ser Asp Cys Gly Val Cys Leu Cys Gly Thr Phe Cys Phe Pro 35 40 45 Cys Leu Gly Cys Gln Val Ala Ala Asp Met Asn Glu Cys Cys Leu Cys 50 55 60 Gly Thr Ser Val Ala Met Arg Thr Leu Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Ile 65 70 75 80 Pro Gly Ser Ile Cys Asp Asp Tyr Met Ala Thr Leu Cys Cys Pro His 85 90 95 Cys Thr Leu Cys Gln Ile Lys Arg Asp Ile Asn Arg Arg Arg Ala Met 100 105 110 Arg Thr Phe 115 <210> 5 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> scRNA <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(66) <223> shPlac8-1 <400> 5 gatccgtcgt gactcaacct ggattttcaa gagaaatcca ggttgagtca cgatttttta 60 cgcgtg 66 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> scRNA <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(66) <223> shPlac8-2 <400> 6 gatccgctga catgaatgag tgttgttcaa gagacaacac tcattcatgt cagtttttta 60 cgcgtg 66 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> scRNA <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(65) <223> shPlac8-3 <400> 7 gatccacggc attcctggat ctatttcaag agaatagatc caggaatgcc gtttttttac 60 gcgtg 65 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> scRNA <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(63) <223> shLuc <400> 8 gatccgtgcg ttgctagtac caattcaaga gattggtact agcaacgcac ttttttacgc 60 gtg 63 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mPlac8-F <400> 9 aaggagctgg atggcaagag 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mPlac8-R <400> 10 ctgaaggagt gtgtgctgag ttg 23 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mPPARgamma2-F <400> 11 cagcgactgc ggagtctgt 19 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mPPARgamma2-R <400> 12 acccaaggca cgggaaa 17 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mAp2-F <400> 13 gcccaccaac ttcggaatc 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mAp2-R <400> 14 tgcgagtggt cttccatcac 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mCyclophilinA-F <400> 15 ccgcagacga caggaaggt 19 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mCyclophilinA-R <400> 16 agggccccgc catct 15 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hPlac8-F <400> 17 ttttgacttg cgggcatttt 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hPlac8-R <400> 18 ggacgctctc ctgagctaca ga 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hCyclophilinA-F <400> 19 ttcatctgca ctgccaagac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hCyclophilinA-R <400> 20 tcgagttgtc cacagtcagc 20 <210> 21 <211> 637 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 21 atg gct cag gca cca aca gtt atc gtg act caa cct gga ttc gtt cgt 48 Met Ala Gln Ala Pro Thr Val Ile Val Thr Gln Pro Gly Phe Val Arg 1 5 10 15 gct ccc caa aat tcc aac tgg cag acc agc ctg tgt gat tgc ttc agt 96 Ala Pro Gln Asn Ser Asn Trp Gln Thr Ser Leu Cys Asp Cys Phe Ser 20 25 30 gac tgc gga gtc tgc ctc tgt ggg acc ttt tgt ttc act tgt ctt gga 144 Asp Cys Gly Val Cys Leu Cys Gly Thr Phe Cys Phe Thr Cys Leu Gly 35 40 45 tgt caa gtg gca gct gac atg aat gag tgt tgt ctg tgt gga aca acg 192 Cys Gln Val Ala Ala Asp Met Asn Glu Cys Cys Leu Cys Gly Thr Thr 50 55 60 gtg gcc atg agg act ctc tac cga acc cga tac ggc att cct gga tct 240 Val Ala Met Arg Thr Leu Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 att tgt gat gac tac atg gtc aca ctc ttc tgt cct gtt tgc tct gtg 288 Ile Cys Asp Asp Tyr Met Val Thr Leu Phe Cys Pro Val Cys Ser Val 85 90 95 tgc caa ctc aag aga gac att aac agg agg aga gcc atg aac gct ttc 336 Cys Gln Leu Lys Arg Asp Ile Asn Arg Arg Arg Ala Met Asn Ala Phe 100 105 110 taaggagctg gatggcaaga gctctggctg aagaagctca actcagcaca cactccttca 396 gcctgagatt tttcaaatct ttggcaactg agatgggatg gatccattta attagagaac 456 ggtgaaatct ttctagttgg gctttttgat ttattttaaa tggatattgc tctttgactt 516 ggtttcttct tgctcccata tcatcaaata ttggagccta taattttttt accttacatt 576 ttaggtagaa accaaataaa agattttgct aagaagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 636 a 637 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Met Ala Gln Ala Pro Thr Val Ile Val Thr Gln Pro Gly Phe Val Arg 1 5 10 15 Ala Pro Gln Asn Ser Asn Trp Gln Thr Ser Leu Cys Asp Cys Phe Ser 20 25 30 Asp Cys Gly Val Cys Leu Cys Gly Thr Phe Cys Phe Thr Cys Leu Gly 35 40 45 Cys Gln Val Ala Ala Asp Met Asn Glu Cys Cys Leu Cys Gly Thr Thr 50 55 60 Val Ala Met Arg Thr Leu Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ile Cys Asp Asp Tyr Met Val Thr Leu Phe Cys Pro Val Cys Ser Val 85 90 95 Cys Gln Leu Lys Arg Asp Ile Asn Arg Arg Arg Ala Met Asn Ala Phe 100 105 110 <210> 23 <211> 1000 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> promoter <222> (1)..(1000) <400> 23 catacataca tacatacata catacatact gatacagagg ctcataactg taatcccaga 60 actcctacga gagactgggt ggggggtgga ggcaggagaa ttgcttggaa gctcacagct 120 gtgcagcaca gtgggaacaa gagacaaggc agcttcaaca ggaggagaga agagacttcc 180 caaagctgtc ctcctgtccc ctgacctcca catgcctgct gtgatcctca gatgctgaca 240 tgtatgttca gacacacacc acagagagat ggggtgggag aaggtgatgg tgatgacaac 300 tacgacagat aaaaaataaa ataataaaaa tcacgcctaa cataaagcat aacataacat 360 aactaacata aagtgttcag tctgttacag aaaccaaagc aatatagcaa tattggggga 420 cagaggtagg tcaataatag agctctcacc taaaatgcac tggccctggg ttcagtccct 480 aatgcctcag ggaggaaaag aaaggggggg ggggaggaag aaaagacgga ggagaaagat 540 ctgatcagaa gcccggcatg gtggtgcatg tctttaatcc cagccacagg aggcagaggc 600 agatgggtct ctgagagttt gagaccatcc tacaaactga gctctgggat agccagaact 660 ctagagagac acactcaagg acagtctgag cgggcctgga actccaggtc cccaagtgcc 720 ttctggtttc ttaggttaaa agaggaaaat aaggtgtgag actcggagag ctttgtcagg 780 caggtagcta atcaggggaa ccacaccctc tcctttccac cgagacctta gaggttagcc 840 cttggaattg taaggaggaa aaccctattt ggtaagagat ggcttttggt gcctggatta 900 ccacagccaa tcagagcaca ggacattgct ctttgtactc cagcccaccc ctaccccacc 960 ctccacgggg ttgatacctc ctcctttcct cggagtctct 1000

Claims

지방세포 형성의 조절을 위한 Plac8의 활성 억제제.
제1항에 있어서, 지방세포 형성을 감소시키는 억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 비만 및 관련 질환의 치료를 위한 억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 내장 및/또는 피하 지방 축적의 감소를 위한 억제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 소분자인 억제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 작은 간섭 RNA인 억제제.
제7항에 있어서, siRNA가 서열 5 또는 서열 6 또는 서열 7에 상응하는 서열을 갖는 shRNA인 억제제.
지방세포 형성 조절용 의약의 제조를 위한 Plac8의 활성 억제제의 용도.
서열 6 또는 서열 7의 서열을 갖는 핵산.
Plac8 전사 억제를 위해 특이적인 siRNA인 핵산.
a) 리포터 유전자에 연결된 Plac8 프로모터를 포함하는 리포터 구축물로 세포주를 형질감염시키고,
b) 상기 세포주를 리포터 유전자의 발현을 허용하는 조건에서 배양하고,
c) 후보 화합물을 세포 배양액에 첨가하고,
d) 억제제 화합물을 리포터 유전자 발현을 감소 또는 억제하는 능력을 갖는 화합물인 것으로서 확인하는 단계
를 포함하는, Plac8의 활성 억제제를 스크리닝하는 방법.
Plac8의 활성 억제제 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
제12항에 있어서, 비만 및 관련 질병을 치료하기 위한 조성물.
제12항에 있어서, 내장 및/또는 피하 지방 축적의 감소를 위한 조성물.
지방세포 형성의 조절을 필요로 하는 환자에게 지방세포 형성을 조절하기 위해 Plac8의 억제제를 투여하는 것으로 이루어지는, 지방세포 형성의 조절 방법.