JP6194517B2 - 神経分化促進剤 - Google Patents
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- C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
Description
[1]p38阻害剤を含む、神経幹細胞の神経分化促進剤。
[2]神経幹細胞がグリア新生型である、[1]記載の剤。
[3]神経幹細胞が神経新生型である、[1]記載の剤。
[4]p38阻害剤が、p38をコードするDNA又はmRNAに生理学的条件下でハイブリダイズし、それによってその転写及び/又は翻訳を阻害する核酸、当該核酸の発現ベクター、又は低分子p38阻害剤である、[1]〜[3]のいずれかに記載の剤。
[5]核酸が、p38を標的とするsiRNA、miRNA又はその前駆体、或いはアンチセンス核酸である、[4]記載の剤。
[6]核酸が、miR-17、miR-106a、miR-106b、又はそれらのmiRNAの前駆体である、[5]記載の剤。
[7]p38阻害剤が、SB203580である、[4]記載の剤。
[8]神経幹細胞をp38阻害剤存在下で培養することを含む、神経幹細胞の神経分化促進方法。
[9]神経幹細胞がグリア新生型である、[8]記載の方法。
[10]神経幹細胞が神経新生型である、[8]記載の方法。
[11]p38阻害剤が、p38をコードするDNA又はmRNAに生理学的条件下でハイブリダイズし、それによってその転写及び/又は翻訳を阻害する核酸、当該核酸の発現ベクター、又は低分子p38阻害剤である、[8]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]核酸が、p38を標的とするsiRNA、miRNA又はその前駆体、或いはアンチセンス核酸である、[11]記載の方法。
[13]核酸が、miR-17、miR-106a、miR-106b、又はそれらのmiRNAの前駆体である、[12]記載の方法。
[14]p38阻害剤が、SB203580である、[11]に記載の方法。
[15]グリア新生型神経幹細胞をp38阻害剤存在下で培養することを含む、グリア新生型神経幹細胞の神経新生型神経幹細胞への変換方法。
[16]哺乳動物に対して、有効量のp38阻害剤を投与することを含む、当該哺乳動物における神経幹細胞の神経分化の促進方法。
[17]p38阻害剤を含む、神経幹細胞の神経分化を促進することが必要とされる障害の予防又は治療剤。
[18]哺乳動物に対して、有効量のp38阻害剤を投与することを含む、当該哺乳動物における神経幹細胞の神経分化を促進することが必要とされる障害の予防又は治療方法。
[19]神経幹細胞の神経分化を促進することが必要とされる障害の予防又は治療において使用するための、p38阻害剤。
[20]神経幹細胞の神経分化を促進することが必要とされる障害の予防又は治療剤の製造のための、p38阻害剤の使用。
[ヒトp38]
アミノ酸配列:アクセッション番号 NP_001306(バージョンNP_001306.1)(配列番号2)
ヌクレオチド配列(cDNA配列):アクセッション番号 NM_001315(バージョンNM_001315.2)(配列番号1)
[マウスp38]
アミノ酸配列:アクセッション番号 NP_001161980(バージョンNP_001161980.1)(配列番号4)
ヌクレオチド配列(cDNA配列):アクセッション番号 NM_001168508(バージョンNM_001168508.1)(配列番号3)
(A)p38をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は18塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むRNA、及び
(B)p38をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と対象動物(好ましくはヒト又はマウス)の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る18塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることによりp38の転写及び/又は翻訳を抑制するRNAを挙げることができる。
(A)p38をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は12塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
(B)p38をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と治療対象動物(好ましくはヒト)の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る12塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態でp38ポリペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸等を挙げることが出来る。
細胞培養及びニューロスフェア分化アッセイ
マウスESC(EB3)培養、EB形成、ニューロスフェア形成及びニューロスフェアの分化は、既述の通りに行った(Nat. Neurosci. 11, 1014-1023 (2008))。ヒトNSCsを、上皮増殖因子(EGF)無しで、既述の通りに増殖させ(J. Neurosci. Res. 69, 869-879 (2002);J. Neurosci. Res. 87, 307-317 (2009))、マウスニューロスフェアのために用いるものと同様の手順で、マイトジェン不在下で14日間に亘り基質被覆カバースリップ上で分化させた。
レンチウイルス粒子を、着目する遺伝子のレンチウイルス発現コンストラクトを、ウイルス複製のために必要な2つのレンチウイルスコンストラクト(pCMV-VSV-G-RSV-Rev 及びpCAG-HIVgp)と共に293Tヒト胚性腎細胞へ一過性にトランスフェクトすることにより産生した。トランスフェクションは、製造者の指示書に従って、GeneJuice (Novagen)を用いて行った。ウイルス粒子は、超遠心分離により回収し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。高力価のウイルス懸濁液を使用し、約5の感染多重度という効率的なNSCの感染を得た。
試験は、ICR系のマウスを用いて行った。動物ケア及び処置の全ての事柄は、慶応大学医学部の実験動物委員会のガイドラインに従って行った。レンチウイルス粒子のE10.5 ICRマウス脳への子宮内微注入は、インビボ超音波リアルタイムスキャナー(Vevo660; VisualSonics)によりガイドされた。
免疫細胞化学及び免疫組織化学は、βIII-チュブリン、NeuN(神経細胞マーカー)、グリア繊維性酸性タンパク質(GFAP、アストロサイトマーカー)、及びヘムアグルチニン(HA)に対する抗体を用いて、既述の通り行った(Nat. Neurosci. 11, 1014-1023 (2008))。
iTRAQ法を用いた定量的プロテオミクス解析を、miR-LacZ及びmiR-17類を過剰発現したp0及びp2ニューロスフェアについて製造者の指示書に従って、AB SCIEX TripleTOF 5600 System (AB SCIEX) を用いて、行った。
各統計学的解析について、少なくとも3回の独立した試験を実施した。統計学的有意差は、両側t検定により決定した。試験を通じて、P<0.05を有意差ありとした。
Coup-tf類の下流で作用する遺伝子の同定
本発明者らは、本試験を、Coup-tf類の下流の候補遺伝子を同定することから始めた。Coup-tf類の直接的なDNA結合部位を、クロマチン免疫沈降シークエンシング(ChIP-seq)を用いて検討し、全般的遺伝子発現及びマイクロRNA発現プロファイルを、マイクロアレイ解析により、コントロールとCoup-tf類ノックダウンマウスニューロスフェアとの間で比較した(Nat. Neurosci. 11, 1014-1023 (2008))。得られたデータに基づき、候補遺伝子を獲得し、この候補遺伝子の過剰発現及びノックダウンのためのレンチウイルスライブラリーを構築した。次に、本発明者らは、既述(Nat. Neurosci. 11, 1014-1023 (2008))のように、ニューロスフェア培養系を用いて候補遺伝子の機能的スクリーニングを行った。そして最終的に、Coup-tf類の下流のエフェクターとしてmiR-17-92マイクロRNA遺伝子クラスターを同定した。
miR-17類がCoup-tf類の下流エフェクターであることを確実にするため、本発明者らは、次にいわゆる「タフデコイ(TuD)」RNAとよばれる、特定の標的マイクロRNAを強力かつ安定的に抑制するRNAデコイ(Nucleic Acids Res 37, e43 (2009))を用いた試験を実施した。miR-17特異的TuD、miR-17*特異的TuD(それぞれ、TuD-miR-17 及び TuD-miR-17*)、又はコントロールTuD-miR-LacZを発現するレンチウイルスベクターを構築した。
インビボにおけるmiR-17類の機能的役割を調べるための最初のステップとして、本発明者らは発生中のCNSにおけるその発現パターンを検討した。マイクロアレイデータによると、miR-17及びmiR-106bの発現レベルは、p0ニューロスフェアよりも、p2ニューロスフェアにおいて、それぞれ、0.18倍及び0.28倍低かった。これらのデータから予想されたように、miR-17及びmiR-106bのインビボ発現パターンは、胎生11.5日(E11.5)及び生後0日(P0)において互いに類似しており、E11.5においては前者についてより強いシグナルが観察された。双方のマイクロRNAのレベルは、発生の進行と共に減少した(図7)。次に、子宮内マウス胎児脳室へのレンチウイルス注入により発生中のマウス脳におけるmiR-17の過剰発現の効果を調べることにより、miR-17類のインビボにおける役割を解析した。インビトロにおける結果と一致して、E10.5においてmiR-17を過剰発現するレンチウイルスに感染したほとんどの細胞(97.6%)は、P30までに大脳皮質において神経細胞になるよう運命付けられたが、コントロールmiR-LacZ発現レンチウイルスに感染した細胞のわずか62.2%だけが神経細胞になった(図8)。従って、miR-17の過剰発現はまた、細胞自律的にインビボにおけるグリア分化をも阻害した。
通常、1つのマイクロRNAは複数の標的mRNAの分解及び/又は翻訳を制御する(Biogerontology 11, 501-506 (2010))。NSCのコンピテンスの変化の基礎をなす分子メカニズムを更に同定するため、本発明者らは、miR-17類の標的mRNAの同定を試みた。この目的を達成するために、本発明者らはiTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation)法を用いたプロテオミクス解析を実施し、p2ニューロスフェアにおいて、miR-17の過剰発現により抑制されるタンパク質を同定した(17)。次に、特定のマイクロRNAのシード配列に相補的なmRNA中の配列を検索する、本発明者ら独自の所内のコンピュータープログラム“HIMAJA”を用いて、候補遺伝子をスキャンした。40遺伝子の最初のリストを得た。そして、最終的に、以下の通り、p38(mitogen-activated protein kinase 14、又はMapk14としても知られる)をコードするmRNAを、NSCのコンピテンス遷移の制御におけるmiR-17の直接的な標的として同定した。
最後に、本発明者らは、miR-17類の過剰発現が、段階が進行したNSCにおいて神経分化能を回復できるか、調べた。これに取り組むため、本発明者らは、通常であればニューロスフェアが排他的にグリア細胞へと分化するp3段階の開始時に、ニューロスフェアにおいて、レンチウイルス感染によりmiR-17を過剰発現させた。本発明者らの以前の報告は、Coup-tf類のノックダウンにより、見かけ上は未だ可塑性を失っていないp3 NSCの限られた集団でのみ神経分化能が回復することを示した(Nat. Neurosci. 11, 1014-1023 (2008))。しかしながら、驚くべきことに、コントロールp3ニューロスフェア中の大部分の細胞はアストロサイトへ分化したのに対し、miR-17の過剰発現によって神経分化能が顕著に回復した(図13)。加えて、GfapプロモーターのDNAメチル化状態も、miR-17をp0段階から継続的に発現上昇させたニューロスフェアにおいて以前観察されたように(図4)、有意な変化は見られなかった(図14)。
p38のインビボにおける役割を調べるため、子宮内レンチウイルス微注入により、機能獲得型試験及び機能喪失型試験を行った。インビトロの結果と一致して、p38を過剰発現すると、早発性のGFAPタンパク質発現が、E17.5の大脳皮質において観察された。p38過剰発現レンチウイルスの子宮内注入により、脳室下帯(SVZ)において低レベルのGFAPタンパク質発現を有する細胞クラスターが生じた。対照的に、eGFPを過剰発現した対照細胞は細胞クラスターを形成せず、GFAPを発現しなかった(図19)。p38特異的shRNAを発現するレンチウイルスを用いたp38ノックダウン試験の結果、E17.5において、アシルCoA合成酵素バブルガムファミリー1(Acsbg1)を発現するVZ及びSVZ細胞の数が減少した(図20)。Acsbg1は、灰白質アストロサイトマーカーであって、大脳皮質におけるGFAP陽性成熟アストロサイト及びGFAP陰性未熟アストロサイトの検出に有用である (J Neurosci 28, 264-278 (2008))。これらの観察結果は、p38がグリア新生の開始に決定的な役割を果たしていることを示唆する。以上をまとめると、上記結果は、miR-17/106-p38軸が、発生中の神経幹/前駆細胞における、神経新生型からグリア新生型への移行の主要なレギュレーターであり、この軸を操作することにより、神経幹/前駆細胞の複能性の双方向性の制御が可能となる。
本出願は日本で出願された特願2012−103875(出願日:2012年4月27日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (7)
- (1) miR-17、miR-106a及びmiR-106bからなる群から選択されるmiRNA;
(2) (1)のmiRNAの前駆体;或いは
(3) (1)のmiRNA又は(2)の前駆体を発現し得る発現ベクター
を含む、神経幹細胞の神経分化促進剤。 - 神経幹細胞がグリア新生型である、請求項1記載の剤。
- 神経幹細胞が神経新生型である、請求項1記載の剤。
- 神経幹細胞を、
(1) miR-17、miR-106a及びmiR-106bからなる群から選択されるmiRNA;
(2) (1)のmiRNAの前駆体;或いは
(3) (1)のmiRNA又は(2)の前駆体を発現し得る発現ベクター
存在下で培養することを含む、神経幹細胞の神経分化促進方法。 - 神経幹細胞がグリア新生型である、請求項4記載の方法。
- 神経幹細胞が神経新生型である、請求項4記載の方法。
- (1) miR-17、miR-106a及びmiR-106bからなる群から選択されるmiRNA;
(2) (1)のmiRNAの前駆体;或いは
(3) (1)のmiRNA又は(2)の前駆体を発現し得る発現ベクター
を含む、神経幹細胞の神経分化を促進することが必要とされる障害の予防又は治療剤。
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