KR101834841B1

KR101834841B1 - 줄기세포의 고활성 유도 방법

Info

Publication number: KR101834841B1
Application number: KR1020160068280A
Authority: KR
Inventors: 황동훈; 김병곤
Original assignee: 아주대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2018-03-06
Also published as: KR20160141677A

Abstract

본 발명은 줄기세포의 고활성 유도 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 shRNA(small-hairpin RNA)을 이용하여 PTEN/mTOR 등의 관련 신호 전달계가 억제 조절되도록 제작한 줄기세포에, 특정 물질로서 성장인자 IGF-1를 외부자극 신호(trigger)로 이용하여 줄기세포의 줄기세포능(고활성)을 향상킬 수 있는 방법으로서, 각각 단독처리시보다 이 둘의 조합으로 병용처리했을 때 줄기세포의 생존능, 이동능 및 분화능이 매우 효과적으로 개선되는 우수한 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 줄기세포능을 유지한 상태의 줄기세포를 높은 수율로 확보할 수 있으므로, 상기 줄기세포를 이용하는 신경질환의 예방 및 치료법에 응용시킬 수 있다.

Description

줄기세포의 고활성 유도 방법{Method for inducing high activity of stem cells}

본 발명은 줄기세포의 고활성 유도 방법에 관한 것이다.

성숙 포유동물은 중추신경계 손상을 받게 되면 축삭경로의 손상에 의하여 영구적 하반신 혹은 상반신 마비 및 그로 인한 여러 합병증이 초래되지만, 현재까지 유효한 치료약물, 기술, 장비는 전무한 상태이다.

다양한 줄기세포를 이용하여 손상된 척수를 재생하고자 하는 많은 연구들이 수행되었으나 이식한 줄기 세포의 생존율은 5% 미만으로 매우 낮으며, 주요 기능은 여러 가지 영양인자를 생성하고 이식 부위 주변에 면역조절을 할 뿐 실제적으로 손상된 신경계 세포를 대체하는 효과는 미미한 것으로 알려지고 있다.

최근 신경 세포의 내재적 요소인 PTEN(phosphatase and tensin homolog)/ mTOR (Mammalian target of rapamycin) 관련 신호 전달의 조절을 통하여 뇌척수 신경 회로(corticospinal tract) 신경의 축삭 재생이 활발히 일어남이 밝혀졌으나, (성숙한 신경세포에서는) 큰 효과가 없어 치료적 효용성이 없었다.

한편, RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 표적 유전자의 발현을 선택적으로 억제하는 천연의 매커니즘이다. 서열 특이적 mRNA 분해의 매개자는 보다 긴 ds RNA로부터 리보뉴클레아제 III의 절단에 의해 생산된 19~23 뉴클레오타이드의 작은 간섭 RNA이다. 세포질의 RISC(RNA-induced silencing complex)는 siRNA에 결합하고 그 siRNA 중 한 가닥에 상보적인 서열을 포함하는 mRNA의 분해를 지시한다. 포유동물에서 RNA 간섭의 적용은 치료 유전자 침묵(silencing)의 효능을 가지고 있다. siRNA의 장점에도 불구하고 siRNA는 시험관내에서 제조되어야 하고 녹다운 유전자를 통상적으로 6 내지 10일 동안 일시적 형질감염에 의해 전달되어야 한다는 점에서 임상에 적용하는데 제한을 가지고 있다. 따라서, 아데노바이러스 등에 탑재시켜 기존 비바이러스성 제제에 의한 siRNA의 전달능력을 획기적으로 개선시킨 shRNA(small-hairpin RNA) 발현 시스템이 전술된 단점을 해결할 수 있다.

본 발명자들은 신경재생에 효과적인 세포치료제를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 줄기 세포 내에서 PTEN/mTOR 관련 신호 전달을 억제 조절했을 때 신경의 축삭이 활발히 생성되며, 추가적인 성장인자 IGF-1(Insulin like growth factor 1)이 손상된 척수 조직에 이식된 신경 줄기 세포의 생존과 세포의 이동을 증가시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포의 고활성 유도 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 줄기세포의 고활성 유도용 배지 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포능이 향상된 줄기세포를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 신경질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 신경질환 치료용 세포치료제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 줄기세포를 (a) PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog, NM_000314) 유전자 발현 수준 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 억제하는 억제제; 및 (b) 성장 인자;를 포함하는 배지에 접촉시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 고활성 유도 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 'PTEN 유전자 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준 억제'는 PTEN의 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 PTEN 의 발현을 중단 또는 감소시키거나 또는 발현된 PTEN 단백질의 활성을 제거 또는 감소시키는 것을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 'PTEN 유전자 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 억제하는 억제제'는 PTEN의 발현 또는 활성을 억제시키는 물질로서, PTEN의 발현 또는 활성 억제제로는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 화합물 및 천연 추출물 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 달리 기재하지 않는 한, 본 명세서에서 용어 'PTEN 억제제'도 동일한 의미로 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 억제제는 PTEN 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 결합하여 PTEN 유전자의 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이며, 가장 바람직하게는 shRNA이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 억제제는 PTEN 단백질에 결합하여 PTEN 단백질의 발현 수준 또는 활성을 억제하는 항체, 앱타머, 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이며, PTEN 억제제로서 작용할 수 있는 한, 임의의 화합물 또는 항체일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 화합물은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조하거나, 상업적으로 제공되는 루트를 통해 수득할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 'siRNA'는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi (RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중 사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능 하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.

본 발명에서의 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오티드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 처리된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오티드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리 뉴클레오티드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어, siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 'shRNA'는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 III의 프로모터로부터 아데노바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer 또는 Rnase III)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환 되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '안티센스'는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 PTEN 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고머이다.

본 발명에서는 상기 핵산 수준의 PTEN 발현 억제제의 구체적인 실시예로서, PTEN 유전자를 억제하는 올리고뉴클레오티드인 shRNA를 이용하였으며, 그 서열들은 하기와 같다: CAGAAACAAAAGGAGATATCAAG(서열번호 1); ATGATGTTTGAAACTATTCCAAT(서열번호 2); TAGAGTTCTTCCACAAACAGAAC(서열번호 3); ATGAAGATCAGCATTCACAAATT(서열번호 4). 상기 핵산 수준의 PTEN 억제제는 당업계에 공개된 방법에 따라 제작될 수 있으며, 보다 구체적으로 벡터 내에 상기 올리고뉴클레오티드를 삽입한 후, 대상을 형질전환시켜, 발현되는 shRNA로 PTEN의 발현을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 shRNA는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 배시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀을 이용하여 세포 내로 전달될 수 있다.

상기 기술한 바와 같이 바이러스성 벡터를 사용할 수 있으며, 레트로바이러스 벡터(rerovirus vector), 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector), 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vector), 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터(herpes simplex virus vector), 렌티바이러스 벡터(lentivirus vector)가 포함되며, 바람직하게는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명에서는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용하였다. 본 발명에서 제작된 AAV는 줄기세포에 감염 정도를 확인할 수 있는 표식/마커로서 GFP 단백질을 포함하고 있다.

또한, PTEN 억제제는 PTEN 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 활성 억제물질은 PTEN을 특이적으로 인식하는 항체이다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법의 상기 억제제에 줄기세포능을 향상시킬 수 있는 특정 물질, 즉 성장 인자를 동시 또는 순차적으로 병용 처리할 수 있다.

상기 성장인자는 상기 성장인자를 처리했을 때 상기 줄기세포의 줄기세포능을 향상시킬 수 있는 한, 당업계에 공지된 어떠한 성장인자도 이용할 수 있으며, 바람직하게는 IGF-1(Insulin Like Growth Factor-1)이다.

즉, 상기 '처리'는 PTEN의 발현 또는 활성을 억제시켜 성체 줄기세포가 신경세포의 특성을 가지도록 하기 위한 것으로 상기 억제제와 IGF-1을 동시에 처리할 수도 있고, 상기 억제제에 의해서 줄기세포 내 PTEN의 발현 또는 활성이 억제된 것이 확인된 후 상기 줄기세포에 추가적으로 IGF-1을 순차적으로 처리할 수도 있다.

본 명세서에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 신경줄기세포, 간엽줄기세포, 연골줄기세포, 조혈줄기세포 및 간줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 신경줄기세포이다.

본 명세서에서 용어 "고활성"이란 줄기세포의 체외 배양시 줄기세포 고유의 줄기세포능이 우수한 상태를 의미한다. 즉, 고활성이 유도된 줄기세포는 손상된 신경 조직에서 대조군 그룹보다 신경 줄기 세포 및/또는 신경 세포 형성에 유의적 향상 결과를 보여주었으며, 축삭의 생장능력은 향상됨을 보여 준다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 줄기세포능은 생존율, 이동능, 분화능 및 노화 억제능으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 포함하며, 고활성이란 상기 1 종 이상이 향상된 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명에서는 (a) PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog, NM_000314) 유전자 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 억제하는 억제제; 및 (b) 성장 인자를 포함하는 줄기세포의 고활성 유도용 배지 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 추가적으로 줄기세포능을 향상시킬 수 있는 성장 인자를 동시 또는 순차적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배지"는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), a-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 4-30 중량%이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 5-15중량%이며, 가장 바람직하게는 약 10중량%이다.

본 조성물은 상술한 PTEN 억제제 및 IGF-1를 유효성분으로 포함하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에서는 본 방법에 따라 고활성을 획득하도록 제작된, 줄기세포능이 향상된 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 줄기세포는 인간 PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog, NM_000314) 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 후, 성장인자인 IGF-1 처리에 의하여 줄기세포능이 보다 향상된, PTEN에 대한 shRNA를 발현하는 인간 신경줄기세포이며, 상기 벡터는 도 1의 패널 A에 개시된 벡터 구조를 가지는 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV) 벡터를 이용하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "신경줄기세포"는 자기복제능력(self-renew)을 가지고 있으며, 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron or meironal cell), 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 등의 세포로 분화할 수 있는 다분화능력을 가진 미분화세포를 의미한다.

본 발명의 줄기세포는 초대 배양(primary cultured) 줄기세포 또는 이의 유전적으로 변형된 불사멸화된(immortalized) 줄기세포일 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환체인 줄기세포는 해당 대상의 조직으로부터 분리 및 배양된 초대 배양 줄기세포(primary cultured stem cell)일 수 있다.

예컨대, 본 발명에 따른 줄기세포가 신경줄기세포인 경우, 인간 태아 또는 성인의 뇌로부터 분리된 신경줄기세포, 인간 탯줄혈액 유래 조혈 줄기세포로부터 유도된 신경줄기세포, 인간 골수줄기세포로부터 유도된 신경줄기세포, 또는 인간 배아로부터 유도된 신경줄기세포가 형질전환에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 유전적으로 변형되어 불사멸화된 줄기세포도 형질전환에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 줄기세포가 신경줄기세포인 경우, 인간 태아의 뇌에서 분리된 신경줄기세포에 PTEN shRNA를 포함한 AAV 벡터를 도입하여 확립된 불사멸화된 인간 신경줄기세포주가 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, PTEN 억제제 및 성장인자를 처리함으로써 성체 줄기세포로부터 신경세포로의 분화를 유도할 수 있거나 또는 분화된 신경세포를 성체 줄기세포로 역분화시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 신경질환은 신경성 또는 신경퇴행성 질환을 포함하는 병리학적 또는 물리적으로 인한 신경조직의 손상으로부터 유래한 모든 신경 질환을 의미하며, 예컨대, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 헌팅턴병, 정신 분열증, 알츠하이머 병, 근 위축성 측삭 경화증, 운동 실조증, 자폐증, 라임 질환, 뇌막염, 편두통, 운동 신경 질환, 파킨슨 병, 신경 병증 통증, 신경 병성 통증, 척수 장애, 말초 및 중추 신경 장애, 자율 신경계 장애, 발작 장애, 간질, 수면 장애, 치매, 알츠하이머 병, 근이영양증, 샤르코-마리-투스 신경 병증 유형 1A 및 탈수초성 질환, 급성 뇌척수염, 부신 백질 이영양증, 아드레노미엘로신경병증, 다발성 경화증, 시신경 척수염, 시신경염, 횡단성척수염, 척수 근육 위축, 신경마비, 운동신경마비, 열성경련, 뇌성마비, 뇌종양, 루게릭병, 신경교종 등의 다양한 질환이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에서는 상기 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 신경계 질환 치료용 조성물은 세포 치료제로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '세포 치료제'는 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.

상기 '치료(treatment)'는 증상의 완화, 질환(또는 손상, 이하 동일) 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화(palliation), 일부 또는 완전한 완화(remission)를 포함한 다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 질환의 상태와 비교하여 호전된 상태를 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질환의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질환의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다. 전형적으로 치료는 손상된 신경계의 재생을 위해 본 발명의 방법에 따라 제작된 줄기세포, 신경세포로의 분화 유도용 조성물 또는 시험관내 세포 배양물을 투여하는 경우를 포함한다. 이때, 본 발명에서의 신경계는 뇌, 중추 또는 말초 신경계일 수 있다.

본 세포치료제는 상술한 줄기세포를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명은 shRNA(small-hairpin RNA)을 이용하여 PTEN/mTOR 등의 관련 신호 전달계가 억제 조절되도록 제작한 줄기세포에, 특정 물질로서 성장인자 IGF-1를 외부자극 신호(trigger)로 이용하여 줄기세포의 줄기세포능(고활성)을 향상킬 수 있는 방법으로서, 각각 단독처리시보다 이 둘의 조합으로 병용처리했을 때 줄기세포의 생존능, 이동능 및 분화능이 매우 효과적으로 개선되는 우수한 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 줄기세포능을 유지한 상태의 줄기세포를 높은 수율로 확보할 수 있으므로, 상기 줄기세포를 이용하는 신경질환의 예방 및 치료법에 응용시킬 수 있다.

도 1은 PTEN shRNA의 벡터 맵을 보여준다.
도 2는 환경 조건에 의한 신경줄기세포에서의 PTEN 발현 변화를 확인한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 3은 실험에 의한 신경줄기세포에서의 PTEN 발현 변화를 확인한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 신경줄기세포가 축삭 성장에 미치는 영향을 보여준다.
도 5는 본 발명의 신경줄기세포의 신경재생능을 보여준다.
도 6은 본 발명의 신경줄기세포의 이동능을 보여준다.
도 7은 손상된 척수 조직에 본 발명의 신경줄기세포를 이식했을 때 결과를 보여준다.
도 8은 손상된 척수 조직에 본 발명의 신경줄기세포를 이식 후 IGF-1을 추가 처리했을 때 결과를 보여준다.
도 9는 줄기세포의 이동 능력에 미치는 IGF-1의 영향을 보여준다
도 10은 신경줄기세포 사멸 환경에서 본 발명의 PTEN 발현 억제 및 IGF-1 병용 처리가 미치는 영향을 보여준다.
도 11은 신경줄기세포 유래 축삭 성장에 본 발명의 PTEN 발현 억제 및 IGF-1 병용 처리가 미치는 영향을 보여준다.
도 12는 생체 척수손상 모델에서 본 발명의 PTEN 발현 억제 및 IGF-1 병용 처리가 미치는 영향을 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 신경줄기세포의 PTEN / mTOR 조절

본 발명자들은 ΔPTEN shRNA를 발현하는 AAV (adeno associated virus)를 줄기세포에 감염시켜 세포 내 PTEN의 기능을 억제시켰다(도 1).

또한, PTEN 유전자가 flox되어있는 생쥐(PTENflox/flox)에서 신경줄기세포를 배양하고, 배양된 신경줄기세포에서 AAV를 이용 Cre-recombinase를 발현하여 PTEN 유전자를 제거하였다.

WESTEN blot 실험법을 통하여 줄기세포내에 PTEN/mTOR의 단백질 양을 정량함으로써 PTEN의 발현 억제 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 태아 14일의 신경줄기세포를 3세대까지 안정적으로 배양한 후 neural induction media (GIBCO)에서 1주, 3주 동안 배양하면서 분화를 유도하거나, 줄기세포 배지에 독성 성분인 ROS, RNS 분비 물질인 H₂O₂, SIN1을 48시간 처리하여 척수 손상 환경을 시험관 내에서 재현하는 실험을 하였을 때, 신경줄기세포 자체적으로도 PTEN을 발현하고 있으며, 분화 조건이나 조직 손상 환경에 노출되었을 경우 PTEN 및 mTOR 관련 신호 전달계의 발현이 변화하는 것을 관찰할 수 있으며, 이는 줄기세포내에서 PTEN이 외부 환경에 유동적으로 반응하고 있음을 보여준다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 인간 MCF7 세포 또는 인간 MSC를 ?PTEN shRNA-AAV로 감염시켰을 경우 효과적으로 PTEN의 발현을 억제시킴을 확인하였다.

또한, 유전적 기법을 활용한 PTEN fl/fl 마우스를 이용하여 PTEN fl/fl 마우스 유래 줄기세포에 CRE-AAV를 감염시켰을 경우에도 역시 PTEN의 발현이 억제되는 것을 확인함으로써, 본 발명의 ΔPTEN shRNA-AAV에 의한 줄기 세포내 PTEN 조절을 검증하였다.

실시예 2: 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포에 의한 축삭 (Axon) 성장

본 발명자들은 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포에 의한 축삭의 성장을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 신경줄기세포에, 대조군으로서 GFP (green fluorescence protein)가 발현되는 AAV로 감염시키거나; 실험군으로서 GFP와 PTEN을 억제시키는 ?PTEN-shRNA가 동시에 발현되는 AAV를 감염시켰을 경우, 두 그룹 모두 감염된 줄기세포에서 녹색의 GFP 발현이 선명하게 관찰되었다.

또한, 분화 조건에서 3일 동안 배양 후에 신경 세포의 특이 마커인 Tuj1을 함께 염색하여 관찰한 결과, 대조군의 신경줄기세포는 미분화 상태의 녹색을 유지하거나 신경 세포로 분화하였더라도 축삭(Axon)의 길이가 짧은 반면, PTEN을 억제한 실험군은 신경세포로 분화하여 많은 세포들이 merge된 노란색을 나타냈으며 축삭의 길이 또한 대조군에 비하여 상대적으로 길게 자란 것이 관찰되었다.

따라서, 줄기세포에서 PTEN을 억제하는 전략은 신경 재생의 좋은 전략이 될 수 있음을 제시한다.

실시예 3: 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포에 의한 신경재생능 확인

본 발명자들은 본 발명의 신경줄기세포의 신경재생능을 확인하였다.

PTEN 조절에 따른 줄기세포의 신경재생능력 검증을 하기 위하여, 생체 내에서 신경 재생에 주요 방해 물질로 알려져 있는 CSPG가 코팅된 플레이트 위에서 PTEN fl/fl 마우스-유래 신경줄기세포를 3 일 동안 배양하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군과 CRE-AAV를 처리한 그룹으로 나누어 축삭의 길이(흰색 화살표)를 비교했을 때, PTEN의 발현이 억제된 PTENfl/flCRE 그룹에서 축삭의 성장이 매우 활발히 일어났음을 관찰하였다.

실시예 4: 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포가 손상된 척수 조직에 미치는 영향

본 발명자들은 본 발명의 신경줄기세포 이식시 효과를 확인하였다.

8 주령 마우스의 10번 흉추에 좌상 척수 손상을 가한 후, 7 일 후에 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포를 손상된 척수 조직 내에 이식하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군의 신경줄기세포들은 이식된 부위에 그대로 모여 있는 반면(상단 패널; GFP-NSCs), PTEN 발현이 억제된 신경줄기세포들은 신경 축삭 생성(흰색 화살표)이 활발히 일어나면서 척수 조직 내로 이동하는 모습이 관찰되었다(하단 패널; GFP-PTENshRNA-NSCs).

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 손상된 척수 조직 내에 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포 이식 후 7 개월 동안 관찰한 결과, 두 그룹 모두에서 종양 발생 등의 특이적인 현상은 나타나지 않았으며, 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포를 이식한 그룹의 실험군(GFP-PTENshRNA-NSCs)의 경우 보행능력의 향상이 관찰되었다. 또한, 조직 내에 이식된 줄기세포는 대조군 또는 이식 후 5주 시기와 비교하였을 때, 축삭의 재생 길이가 현저하게 성장하였음을 알 수 있었다(흰색 화살표).

이러한 결과는 PTEN/mTOR 신호전달 조절이 줄기세포의 신경재생 능력을 촉진시킬 수 있음을 반영하며, 척수 손상과 같은 중추신경 질환 치료제로서의 가능성을 시사한다.

실시예 5: 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포 및 IGF -1 병용 처리 시 상승 효과

본 발명자들은 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포에 성장인자인 IGF-1를 함께 병용 처리시 미치는 영향을 확인하였다.

5-1. 신경줄기세포에 IGF -1 처리 시 효과

본 발명자들은 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포가 아닌 정상(naive) 신경줄기세포에 성장인자인 IGF-1를 처리했을 때 영향을 확인하고자 하였다.

손상된 척수 조직에 정상 신경줄기세포를 이식한 후 성장인자인 IGF-1를 처리하고 2 주 후에 관찰하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔(hydrogel)에 GFP가 발현되는 신경줄기세포를 이식하였을 경우보다 IGF-1을 추가로 첨가한 환경에서 이식된 줄기세포의 생존율이 더욱 향상되었음을 확인하였다.

이러한 결과는 IGF-1이 이식한 줄기세포의 생존에 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다.

또한, 본 발명자들은 줄기세포의 이동 능력에 IGF-1이 영향을 줄 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 보이든 챔버(boyden chamer) 배양 방법을 이용하여 세포 이동 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 배양 2 주 후, IGF-1 수용체(receptor)(IGF1R)의 두 copy를 모두 가지고 있는 야생형(wild type, WT) 신경줄기세포(도 9a; IGF1R homo NSCs)에 비하여, IGF-1 수용체(receptor)(IGF1R)의 one copy가 제거된 이형(hetero type, +/-) 신경줄기세포(도 9b; IGF1R hetero NSCs)는, 이동성이 50% 가까이 감소된 것을 확인하였다.

또한, 챔버 하단에 IGF-1 20 ng/ml을 동일 시간인 2 주 동안 첨가하여 세포의 이동을 자극하였을 경우 더 많은 IGF1 수용체 WT 신경 줄기세포(도 9c; IGF1R homo NSCs+IGF1)가 세포 배양 하단면으로 이동한 것을 볼 수 있었다.

또한, IGF1 수용체 (+/-) 줄기세포(도 9d; IGF1R hetero NSCs+IGF1)의 경우 역시 IGF1 의존성 이동 줄기세포 증가가 WT에 비하여 적음을 알 수 있었다.

따라서, IGF-1은 신경 줄기세포의 성장 및 생존 능력 향상 뿐만 아니라 세포 이동에도 영향을 주고 있음을 알 수 있다.

5-2. 신경줄기세포 사멸 환경에서 PTEN 발현억제 및 IGF -1 병용 처리시 효과

본 발명자들은, 신경줄기세포 사멸 환경에서 본 발명의 PTEN 발현-억제 및 IGF-1 병용 처리가 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

척수 손상 조직에 이식된 신경줄기세포 사멸의 주요 원인으로 알려진 활성산소종(ROS, reactive oxygen species) 및 활성질소종(RNS, reactive nitrogen species)에 의한 신경줄기세포 사멸 환경을 시험관내에서 재현하기 위하여, H₂O₂ 및 SIN1(3-morpholinosydnonimine)을 각각 신경줄기세포에 72 시간동안 처리하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 정상 신경줄기세포 배양 대조군에 비하여 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포의 생존율은 각각 21.86%, 15.05%까지 감소하였다. 또한, IGF1을 20ng/ml 농도로 함께 처리하였을 경우, 대조군 정상 신경줄기세포의 생존율은 각각 43.06% 및 23.66%까지 회복되었다.

반면, 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포는, 각 독성 물질에 대한 생존율이 58.7%, 75%까지 향상되었으며, IGF1과 함께 병용 처리한 경우 80% 이상까지 회복되는 것을 확인하였다.

따라서, 신경줄기세포에서 PTEN 발현 억제가 세포의 독성 저항성을 향상시킬 뿐만 아니라, IGF1를 병용 처리하는 경우 본 발명의 PTEN 발현-억제 신경줄기세포의 생존율을 증가시키는 상승효과(synergistic effects)를 초래한다는 것을 확인하였다.

5-3. 신경줄기세포 유래 축삭 성장에 미치는 PTEN 발현억제 및 IGF -1 병용 처리시 효과

본 발명자들은 신경줄기세포 유래 축삭 성장에 본 발명의 PTEN 발현억제 및 IGF-1 병용 처리가 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

흰 랫트(rat) 태아 척수 유래 신경줄기 세포에 GFP-AAV2, GFP_shPTEN-AAV2를 감염시켜 각각의 신경줄기세포를 준비하고, 생체 내에서 신경 재생에 주요 방해 물질로 알려져 있는 CSPG가 코팅된 플레이트 위에서 신경 세포로 분화시킨 지 3 일 후에 각 그룹 신경줄기세포의 축삭 길이를 측정하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군인 GFP NSC의 경우 축삭 생장이 시작은 되었으나, 아직 충분한 축삭의 성장이 관찰되지 않고, ?PTEN NSC의 경우 많은 세포에서 신경 축삭 성장이 일어나고 있었으며, 일부 세포에서 300 ㎛이상 성장한 축삭도 관찰되었다.

반면, 분화과정 동안 IGF1 20 ng/ml을 함께 처리하여 배양한 ?PTEN NSC+IGF1 그룹의 경우, 대부분의 세포에서 신경 축삭이 관찰되고, 400 ㎛이상 되는 축삭도 관찰 되는 등 다른 대조군 그룹에 비해, 신경 분화 속도 및 축삭 성장 길이가 현저하게 향상되었다.

이러한 실험 결과는 IGF1이 ?PTEN NSC의 신경 분화 속도를 향상시키고 축삭 성장을 촉진시킨다는 것을 시사한다.

5-4. 생체 척수손상 모델에 이식된 신경줄기세포의 생존율 및 이동능에 미치는 PTEN 발현 억제 및 IGF -1 병용 처리시 효과

본 발명자들은 생체 척수손상 모델에 신경줄기세포를 이식한 후 이의 생존율 및 이동능에 본 발명의 PTEN 발현 억제 및 IGF-1 병용 처리가 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

랫트 태아 유래 신경줄기세포를 GFP-AAV2, GFP_shPTEN-AAV2로 감염시켜 각각의 신경줄기세포를 준비하고, GFP NSC, ?PTEN NSC, ?PTEN NSC+IGF1 그룹을 나누고, 생체 척수손상 모델의 손상된 랫트 척수 조직에 해당 세포들의 이식을 실시하였다. 특히, IGF1 20ng/ml을 세포 배양시 24시간 동안 처리한 후 생체 척수손상 모델에 세포 이식을 실시한 ?PTEN NSC+IGF1 실험군의 경우, 세포 이식시에도 같은 농도의 IGF1을 함께 처리하였다.

각 그룹의 신경줄기세포를 이식하고 일주일 후, 이식된 신경줄기세포의 생존율 및 이동능을 관찰하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군인 GFP NSC에 비하여 ?PTEN NSC의 생존율이 향상되었으며, 특히, PTEN 발현 억제 및 IGF1 병용 처리한 ΔPTEN NSC+IGF-1의 경우 가장 탁월한 줄기세포의 생존율이 관찰되었다.

또한, 척수 조직 내에서 이식된 신경줄기세포를 확인하기 위한 　GFP (green fluorescence protein)　항체 및 손상된 척수 부위를 구분하기 위한 성상세포(astrocyte)-특이 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)를 이용하여 형광염색한 결과, 대조군들에 비해, PTEN 발현억제 및 IGF-1 병용 처리한 ΔPTEN NSC+IGF-1의 신경줄기세포는 이식된 중심 부위에서 더욱 활발하게 이동하는 양상이 관찰되었다.

결론적으로, 본 발명에 따라 PTEN 발현이 억제된 신경줄기세포에 IGF-1을 병용처리하였을 때, 세포독성 환경에서 신경줄기세포 생존률이 향상되었고, 신경줄기세포 유래 신경세포 축삭의 성장이 상승적으로 촉진되었으며, 이식된 줄기세포의 이동능 역시 증가하였다.

따라서, 본 발명의 신경줄기세포에서의 PTEN 억제 및 IGF-1 병용 처리는 신경 재생의 좋은 전략이 될 수 있음을 제시한다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method for inducing high activity of stem cells <130> AU1-63p-1 <150> KR 10-2015-0077454 <151> 2015-06-01 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN shRNA <400> 1 cagaaacaaa aggagatatc aag 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN shRNA <400> 2 atgatgtttg aaactattcc aat 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN shRNA <400> 3 tagagttctt ccacaaacag aac 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN shRNA <400> 4 atgaagatca gcattcacaa att 23

Claims

신경 줄기 세포를 (a) PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog, NM_000314) 유전자 발현 수준 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 억제하는 억제제; 및 (b) 성장 인자로서 IGF-1(Insulin Like Growth Factor-1);를 포함하는 배지에 접촉시키는 단계를 포함하는, 신경 줄기 세포의 축삭 성장능 및 이동능 향상 유도 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제는 PTEN 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 결합하여 PTEN 유전자의 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제는 PTEN 단백질에 결합하여 PTEN 단백질의 발현 수준 또는 활성을 억제하는 항체, 앱타머, 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 1에 표시된 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2에 표시된 뉴클레오티드 서열, 서열번호 3에 표시된 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 4에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 shRNA는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 배시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀을 이용하여 세포 내 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
(a) PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog, NM_000314) 유전자 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 억제하는 억제제; 및 (b) 성장 인자로서 IGF-1(Insulin Like Growth Factor-1)를 포함하는, 신경 줄기 세포의 축삭 성장능 및 이동능 향상 유도용 배지 조성물.
삭제
삭제
삭제