KR20180028094A

KR20180028094A - 유도신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180028094A
Application number: KR1020160115193A
Authority: KR
Inventors: 한동욱; 현정근; 홍진영; 이승찬
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2018-03-16

Abstract

본 발명은 유도신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 신경줄기세포는 체세포에 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 유전자를 도입하여 리프로그래밍함으로써 수득하며, 뉴런, 희돌기교세포 및 성상세포로의 분화능을 갖는다. 본 발명의 조성물은 축삭 재생을 유도하고, 면역 반응 및 세포사멸을 억제하며, 신경재생을 촉진하고, 운동기능을 회복시키는 효과를 나타내며, 궁극적으로 다양한 신경계 질환 및 손상에 대하여 개선 및 치료 효능을 발휘한다.

Description

유도신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 조성물{Composition for Improving or Treating Spinal Cord Injury Comprising Induced Neural Stem Cells}

본 발명은 유도신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 이라는 4가지의 외래 유전자를 일반 체세포에 도입하여 체내 모든 세포로 분화(differentiation)가 가능한 전능성 배아줄기세포의 상태와 유사한 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)로의 역분화(reprogramming) 연구가 활발히 진행되고 있다. 뿐만 아니라 신경세포, 심근세포, 간세포 및 신경줄기세포, 심근전구세포, 간 줄기세포 등, 특정 체세포 및 체세포 줄기세포 특이적인 전사인자의 도입을 통해 특정 세포로의 교차분화를 유도하는 다양한 연구가 보고되었다. 또한 이러한 교차분화 기전을 이해하고 그 과정을 촉진시키기 위해 교차분화 과정을 억제, 촉진할 수 있는 다양한 요소들을 발굴하고 그 작용기전을 규명하는 연구가 진행되어 왔으며, 이에 따라 후생유전학적 조절인자(epigenetic modifier), 염색질 리모델링 복합체(chromatin remodeling complex), 미세환경(microenvironment), 추가전사인자(additional transcription factors), 유전적 배경(genetic background) 등이 유도만능줄기세포로의 교차분화 과정에 영향을 미칠 수 있다는 연구결과들이 보고되었다. 그러나 체세포 및 체세포 줄기세포로의 교차분화 과정에 영향을 미치는 조절인자에 관한 연구는 유도만능줄기세포로의 역분화 과정의 조절인자 연구에 비해 매우 미비한 실정이다.

2012년 본 연구진은 생쥐의 체세포에 네 가지 전사인자 조합인 BSKM (Brn4/Pou3f4, Sox2, Klf4, c-Myc)을 도입하여 유도신경줄기세포를 생산하는 교차분화 기술을 개발하였으며, 2014년 신경줄기세포 특이적 표면 단백질인 SSEA1을 이용하여 양질의 클로널 유도신경줄기세포주를 확립하는 기술을 보고하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 척수 손상 등 신경계 손상을 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 체세포에 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 유전자를 도입하여 리프로그래밍함으로써 수득한 유도신경줄기세포가 안전하고 유효하게 신경계 질환 및 손상을 치료할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 신경줄기세포는 체세포에 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 유전자를 도입하여 리프로그래밍함으로써 수득한 신경줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 척수 손상 등 신경계 손상을 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 체세포에 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 유전자를 도입하여 리프로그래밍함으로써 수득한 유도신경줄기세포가 안전하고 유효하게 신경계 질환 및 손상을 치료할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 조성물에 포함되는 신경줄기세포는 섬유아세포에 신경줄기세포 특이적인 전사인자(Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)를 도입하여 신경줄기세포로 직접 리프로그래밍함으로써 생산한다. 직접 리프로그래밍을 통해 생산된 유도신경줄기세포(induced neural stem cells; iNSCs)는 뇌 조직에서 유래의 신경줄기세포와 형태학적 특성, 자기재생능, 후생학적 상태, 분화능력, 체내/체외기능성 면에서 거의 일치한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 체세포에 도입되어 신경줄기세포 생산에 이용하는 전사 유전자인 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc은 각각 서열목록 제1서열 내지 제4서열에 기재된 염기서열로 이루어진다.

본 발명의 신경줄기세포는 뉴런(neuron), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 및 성상세포(astrocyte)로 분화될 수 있는 능력을 나타낸다.

본 발명에서 척수 손상은 사고나 질병에 의해 척추가 손상이 되면서 척추 내에 존재하는 중추신경인 척수가 함께 손상되거나 질병에 의해 척수가 손상되는 것을 의미하며, 척수 손상에 의해 뇌와 신체 사이에 신경전달이 제대로 전달되지 못해 운동, 감각 등의 마비를 초래하게 된다. 이러한 척수 손상의 치료 목적은 이차적인 척수 손상을 최대한 줄이고 신경학적 기능을 최대한 회복시키는데 있다.

본 발명의 신경줄기세포를 척수 손상 모델에 이식한 경우, 축삭 재생(axonal regeneration)을 유도하고, 면역 반응 및 세포사멸을 억제하며, 신경재생을 촉진하고, 운동기능을 회복시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 신경학적 기능 회복에 우수한 효과를 나타내므로 다양한 신경계 질환 및 손상에 대하여 개선 및 치료 효능을 발휘한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 달성되는 신경재생 촉진 효과는 GDNF, HGF, NT3, NT4, NGF, Map2, ChAT, Pax6, Nestin, Olig2 및 GFAP로 구성된 군으로부터 선택되는 신경영양성 인자(neurotrophic factor) 분비에 의해 유도된다.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 신경계 질환 및 손상은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알쯔하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 또는 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 신경계 질환 및 손상에 대한 세포치료제로서 이용 가능하다.

본 발명에서 사용된 용어 ‘세포치료제’는 분리, 배양 및 특수한 방법을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.

상기에서 ‘치료(treatment)’는 증상의 완화, 질환(또는 손상, 이하 동일) 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화(palliation), (일부 또는 완전한) 완화(remission)를 포함한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 질환의 상태와 비교하여 호전된 상태를 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다. 전형적으로 치료는 손상된 신경계의 재생을 위해 본 발명의 신경줄기세포를 투여하는 경우를 포함한다. 이 때, 본 발명에서의 신경계는 뇌, 중추 또는 말초 신경계일 수 있다.

본 발명의 신경줄기세포는 인간 내로의 투여를 위해 약제학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 ‘약제학적으로 허용되는’이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 의약제형의 일반적인 원리에 대해서는 하기의 문헌을 참고할 수 있다: Cell Therapy; Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn amp; W. Sheridan 편저, Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister amp; P. Law, Churchill Livingstone, 2000. 본 발명의 약제학적 조성물은 원하는 목적, 예를 들면 손상된 신경계의 재생을 위해 표기된 지시에 따라 적당한 용기 내에 포장될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 원하는 조직 부위로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여되어, 손상된 신경계가 재생되거나 기능적으로 회복되도록 한다. 예컨대, 본 발명의 신경줄기세포를 손상된 신경 부위로 직접 이식한다. 이식은 단세포 현탁액 또는 ㎕ 당 1×10⁵-1.5×10⁵ 세포 밀도의 작은 집합체를 이용하여 수행한다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 유도신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 유도신경줄기세포는 체세포에 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 유전자를 도입하여 리프로그래밍함으로써 수득하며, 뉴런, 희돌기교세포 및 성상세포로의 분화능을 갖는다.

(ⅲ) 본 발명의 조성물은 축삭 재생을 유도하고, 면역 반응 및 세포사멸을 억제하며, 신경재생을 촉진하고, 운동기능을 회복시키는 효과를 나타내며, 궁극적으로 다양한 신경계 질환 및 손상에 대하여 개선 및 치료 효능을 발휘한다.

도 1은 생산된 유도신경줄기세포와 뇌조직 유래 신경줄기세포의 유사성을 분석한 결과이다.
(a) 및 (b) 면역형광법을 이용한 신경줄기세포 표지 단백질 발현 확인. 신경줄기세포의 표지단백질인 Sox2, Nestin(a), SSEA1,Olig2(b)의 발현을 면역형광법을 통해 확인함. (c) RT-PCR기법을 이용하여 신경줄기세포 표지 유전자 발현을 확인함. (d) 유도신경줄기세포의 전체적인 전사인자조사. Microarray기법을 통해 유도된 신경줄기세포의 전체 유전자 발현 양상을 조사하였음. (e) 유도신경줄기세포 후생유전학적 상태조사. Nestin 및 Col1a1 유전자의 프로모터 지역의 메틸레이션 상태 분석하였음. (f) 유도신경줄기세포의 체외 분화능 조사. 신경교세포 계통으로의 분화능 조사하였음. (g) 핵형분석을 통한 유도신경줄기세포의 정상핵형 확인함.
도 2는 유도신경줄기세포 이식 후 12주째 질환모델내에서의 변화를 확인한 결과이다.
(a) 척수손상모델 랫트에 유도신경줄기세포이식 후 12주째에 마우스 특이적인 항체 M2를 이용하여 모델 내에 생착결과를 확인함. (b) 이식한 유도신경줄기세포가 하위단계의 세포로 분화여부를 확인함. Neuron은 Tuj1와 NeuN, astrocytes는 GFAP, Oligodendrocytes는 O4로 각각 확인함. (c) 하위단계의 세포로의 분화를 도 2b 를 바탕으로 정량적으로 산술한 표임. (d) 이식한 유도신경줄기세포가 neuron의 아류형인 GAGBAergic neurons, glutamatergic neurons, cholinergic neurons으로의 화능을 각각 GAD65/67, VGLUT1/2, ChAT로 확인함. (e) neuron의 아류형으로의 분화능을 도 2d 를 바탕으로 정량적으로 산술한 표임. (f) 체내에 존재하는 neuron과 이식한 유도신경줄기세포에서 유래한 neuron의 시냅스 형성을 M2, Tuj1, Synapsin1을 통해 확인함. (g) 유도신경줄기세포를 이식한 랫트에서 상처부분의 병변과 cavity의 크기가 줄어든 것을 확인한 결과임.
도 3은 유도신경줄기세포가 이식된 척수 손상 질환모델에서 축삭 재생(axonal regeneration)을 확인한 결과이다.
LFB 염색법을 통해 주입된 유도신경줄기세포의 착색부위 확인 (a) 및 정량분석 (b)을 실시한 결과임. NF positive한 지역을 조직염색을 통해 확인(d) 및 정량적으로 분석(c)한 결과임. GAP43 positive한 지역을 조직염색을 통해 확인(f) 및 정량적으로 분석(e)한 결과임. 5HT positive한 지역을 조직염색을 통해 확인(i) 및 정량적으로 분석(g)한 결과임. 면역조직염색법을 통해 VEGF positive한 부위를 측정 및 정량적으로 분석(h)한 결과임.
도 4는 유도신경줄기세포가 이식된 척수 손상 질환모델에서 행동 변화를 분석한 결과이다.
(a) 유도신경줄기세포를 이식한 랫트에서 운동회복능력을 나타내는 BBB 스코어가 증가하는 것을 12주째 확인한 결과임. (b) 유도신경줄기세포를 이식한 랫트에서 사다리를 왕복하며 운동능력을 측정하는 래더(ladder) 스코어를 확인한 결과 운동능력이 좋아지는 것을 확인한 결과임. (c) 배뇨근의 기능을 평가하는 요역동학검사(urodynamic study)를 통해 세포이식 후 12주째에 랫트의 방광 부피가 정상적으로 돌아오는 것을 정량적으로 산술한 결과임. (d) 세포이식 후 12주째에 랫트의 운동유발전위(Motor evoked potentail)를 전극을 통해 확인해본 결과 다소 증가된 것을 확인함.
도 5는 유도신경줄기세포가 이식된 척수 손상 질환모델에서 면역반응 및 세포사멸을 측정한 결과이다.
(a) 이식한 유도신경줄기세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 면역 마커를 확인해본 결과, 유전자 발현이 감소하는 것을 확인한 결과임. (b) 이식한 유도신경줄기세포 주변의 체내에 존재하는 세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 면역 마커를 확인해본 결과, 주변 세포의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인한 결과임. (c) 대조군과 비교하여 유도신경줄기세포를 이식한 질병모델에서 ED-1을 발현하는 면역세포 monocytes와 macrophages의 양의 감소를 확인한 결과임. (d) ED-1을 발현하는 세포의 양을 도 5c 를 바탕으로 정량적으로 산술한 표임. (e) ED-1을 발현하는 세포의 양과 운동회복능력을 나타내는 BBB 스코어의 음의 상관관계를 확인한 결과임. (f) 이식한 유도신경줄기세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 세포사멸 마커를 확인해본 결과, 유전자 발현이 감소하는 것을 확인한 결과임. (g) 이식한 유도신경줄기세포 주변의 체내에 존재하는 세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 세포사멸 마커를 확인해본 결과, 주변 세포의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인한 결과임. (h) 대조군과 비교하여 유도신경줄기세포를 이식한 질병모델에서 세포사멸 마커인 caspase3를 발현하는 세포의 양이 감소하는 것을 확인한 결과임.
도 6은 유도신경줄기세포가 이식된 척수 손상 질환모델에서 다양한 신경영양성 인자(neurotropic factor)의 분비를 측정한 결과이다.
(a) 이식한 유도신경줄기세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 신경 성장인자를 확인해본 결과, 유전자 발현이 증가하는 것을 확인한 결과임. (b) 이식한 유도신경줄기세포 주변의 체내에 존재하는 세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 신경 선장인자를 확인해본 결과, 주변 세포의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인한 결과임. (c) 이식한 유도신경줄기세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 신경 마커를 확인해본 결과, 분화 관련 유전자 발현은 증가하고 신경줄기세포 관련 유전자는 감소하는 것을 확인함. (d) 이식한 유도신경줄기세포 주변의 체내에 존재하는 세포를 이식 5일, 4주, 12주째에 각각 분리하여 신경 마커를 확인해본 결과, 주변 세포의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인한 결과임.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

유도신경줄기세포 유도 및 세포주 구축

기존에 알려진 방법(Han et al., Cell Stem Cell 2011, Kim et al. Nature Protocol 2014)과 같이 5 x 10⁴개의 C3H 유래 생쥐섬유아세포에 신경줄기세포 특이적인 전사인자인 BSKM(Brn4, Sox2, Klf4, c-Myc)을 바이러스를 이용하여 도입한 후, 48시간이 지난 시점에서 신경줄기세포 특이적인 배양액으로 세포를 배양하였다. 신경줄기세포 특이적인 배양액 DMEM/F-12 + N2 or B27 supplements (Invitrogen), 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF (both from Invitrogen), PSG (Invitrogen), 바이러스 도입 4-5주 후, 초기 유도신경줄기세포 군집이 확인되었고, 이를 젤라틴 코팅 디쉬에서 계대배양 및 유지하여 세포주를 구축하였다.

면역염색법

4% PFA를 20분 동안 처리하여 세포를 고정시킨 후, PBS로 3번 워싱을 하였다. 그 다음 블로킹 용액을 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 처리 후, SOX2, SSEA1, Olig2, GFAP, Tuj1과 같은 신경줄기세포 및 분화 하위단계세포 특이적인 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 처리하였다. 16시간 처리 후, PBS로 3번 워싱을 해준 다음 형광을 나타내는 2차 항체를 상온에서 2시간 처리하였다.

유전자 발현 양상 분석

mRNA는 세포로부터 RNeasy mini kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였으며 1 μg 의 RNA를 역전사 효소(Applied biosystem)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 RT-PCR과 qPCR을 통해 각각 유전자 발현 양상을 분석하였다.

마이크로어레이

섬유아세포, 유도신경줄기세포, 뇌조직 유래 신경줄기세포의 RNA를 RNeasy mini kit를 이용하여 추출하였다. 100 ng의 RNA를 T7-oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 정제과정, 분열과정을 거친 후 각각의 샘플을 16시간 동안 Mouse genome 430 PM Array strip (Affymetrix)에 하이브리다이제이션 시켰다. 16시간이 지난 후, 어레이 스트립의 염색과정 및 이미징 과정을 진행하였다. Partex Express Affymetix Edition을 이용하여 최초의 결과값을 추출하였다. 총 45,141개의 유전자 중 섬유아세포와 뇌조직 유래 신경줄기세포의 발현양이 4배 이상 차이나는 1,881개의 유전자를 선별하였고 이를 토대로 MeV software 이용하여 Heat map을 작성하였다.

DNA 메틸레이션 분석

지노믹 DNA를 추출한 후 EpiTect bisulfite kit (Qiagen)를 이용하여 아황산수소나트륨(sodium bisulfite)을 처리하였다. 이후 PCR을 통해 해당 DNA를 증폭 및 클로닝하여 각 세포타입의 메틸화 양상을 분석하였다.

세포이식

1 x 10⁶개의 유도신경줄기세포와 뇌조직유래 신경줄기세포를 5 μl의 배양배지에 희석 후 Hamilton syringe를 이용하여 Rat의 척추손상 부위에 이식하였다. 세포가 포함되어있지 않은 같은 용량의 PBS는 실험의 대조군으로 사용되었다. 세포이식시 면역세포의 급격한 활성화를 억제하기 위해 면역억제제인 Cyclosporin A를 10 mg/kg 농도로 투여하였다. 세부적으로는 이식전 3일부터 이식후 2주 동안 연속적으로 Cipol Inj^TM을 투여하였고, 그 이후에는 Cipol Soln^TM을 투여하였다.

실험결과

신경줄기세포 특이적인 전사인자 BSKM을 도입하여 생산된 유도신경줄기세포는 형태와 유전자의 발현, 후생유전적 측면, 뉴런과 성상세포로의 분화능에서 정상적이었으며, 뇌조직 유래 신경줄기세포와 그 특징이 매우 유사하였다(도 1).

타박상 부상(Contusion injury)을 통해 척수손상을 유도한 척수손상모델 랫트에 1x10⁵의 유도신경줄기세포를 이식하였으며 그 양상을 12주에 걸쳐서 관찰하였다. 그 결과 이식된 유도신경줄기세포 12주 후에도 살아남았으며 질환 모델내에서 뉴런, 성상세포, 희돌기교세포의 모든 신경세포로 분화가 가능하였고 질환모델인 랫트의 신경세포와 유도신경줄기세포 유래 신경세포간에 시냅스 형성이 일어남을 확인하였다(도 2).

그 후 질환 모델내에서의 실제 치료능을 검증하기 위해 다양한 분석방법을 이용하여 유도신경줄기세포가 이식된 질환모델에서 축삭 재생이 일어났음을 확인하였다(도 3).

나아가 행동분석을 통하여 유도신경줄기세포를 이식받은 질환 모델의 경우 BBB 스코어상 운동기능이 회복되었음을 확인하였고 배뇨능력도 어느 정도 향상되어 질환모델 동물의 기능성이 유의차 있게 회복되었음을 관찰하였다(도 4).

qPCR을 이용하여 유전자 발현 양상을 확인해 본 결과, 이식한 유도신경줄기세포를 통해 면역반응과 세포사멸이 억제되었고 다양한 신경영양성 인자들을 분비하여 신경재생을 촉진함을 관찰하였다. 또한 이식된 유도신경줄기세포가 숙주세포(host cell)의 재생을 유발하는 것을 확인하였다(도 5, 도 6).

결론

본 발명을 통해 연구진은 유도신경줄기세포를 질환모델에 이식한 후, 유도신경줄기세포가 직접적인 치료능을 보이는 것뿐만 아니라 질환 모델내에 존재하는 숙주세포의 재생까지 유발하는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명은 직접 리프로그래밍된 유도신경줄기세포의 치료능을 입증한 첫 번째 사례로 줄기세포의 임상적용에 있어서 큰 의의가 있다고 사료된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Composition for Improving or Treating Spinal Cord Injury Comprising Induced Neural Stem Cells <130> PN160308 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1086 <212> DNA <213> Brn4 <400> 1 atggccacag ctgcctcgaa tccctacagc attctcagtt ccagctccct tgtccatgcg 60 gactccgcgg gcatgcagca gggaagtcct ttccgcaatc ctcagaaact tctccaaagt 120 gactacttgc agggagttcc cagcaatggg catcccctcg ggcatcactg ggtgaccagt 180 cttagcgacg ggggcccgtg gtcctccaca ttggccacca gccccctgga ccagcaagac 240 gtgaagccgg gacgcgaaga tctgcaactg ggcgcaatca tccatcaccg ctcgccgcac 300 gtagcccacc actcgccgca cactaaccat ccgaacgcct ggggagcgag ccctgctcca 360 aactcgtcca tcacgtccag cggccaaccc ctcaatgtgt actcgcagcc aggcttcacc 420 gtgagcggta tgctggagca cgggggactc actccaccac cagctgctgc ctccacacag 480 agcctgcatc cagtgctccg ggagcctcca gaccatggtg agctgggctc gcaccactgc 540 caggaccact ctgatgaaga gactccaacc tctgatgagt tggaacagtt cgccaaacaa 600 ttcaaacaaa gaagaatcaa gttgggcttc acgcaagccg acgtggggct ggcactgggc 660 acactgtatg gcaacgtgtt ctcgcagact accatctgca ggttcgaggc cttacaactg 720 agcttcaaga acatgtgcaa gctgaaaccg ctattaaata agtggctgga ggaggctgat 780 tcatccacag gaagcccgac cagcattgac aagatcgctg ctcaaggccg caaacgcaag 840 aagcgaacct ccatcgaggt gagtgtcaag ggcgtactgg aaacacattt cctcaagtgt 900 cccaagcctg cagcgcagga gatctcctcg ctggcagaca gtctccagtt ggagaaagaa 960 gtggtgcgtg tctggttctg taatagaaga caaaaagaaa aaagaatgac tccgccaggg 1020 gatcagcagc cacacgaggt ttattcgcac acggtgaaaa cagacgcgtc ctgccacgat 1080 ctctga 1086 <210> 2 <211> 960 <212> DNA <213> Sox2 <400> 2 atgtataaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaagc ttcggggggc 60 ggcggcggag gaggcaacgc cacggcggcg gcgaccggcg gcaaccagaa gaacagcccg 120 gaccgcgtca agaggcccat gaacgccttc atggtatggt cccgggggca gcggcgtaag 180 atggcccagg agaaccccaa gatgcacaac tcggagatca gcaagcgcct gggcgcggag 240 tggaaacttt tgtccgagac cgagaagcgg ccgttcatcg acgaggccaa gcggctgcgc 300 gctctgcaca tgaaggagca cccggattat aaataccggc cgcggcggaa aaccaagacg 360 ctcatgaaga aggataagta cacgcttccc ggaggcttgc tggcccccgg cgggaacagc 420 atggcgagcg gggttggggt gggcgccggc ctgggtgcgg gcgtgaacca gcgcatggac 480 agctacgcgc acatgaacgg ctggagcaac ggcagctaca gcatgatgca ggagcagctg 540 ggctacccgc agcacccggg cctcaacgct cacggcgcgg cacagatgca accgatgcac 600 cgctacgacg tcagcgccct gcagtacaac tccatgacca gctcgcagac ctacatgaac 660 ggctcgccca cctacagcat gtcctactcg cagcagggca cccccggtat ggcgctgggc 720 tccatgggct ctgtggtcaa gtccgaggcc agctccagcc cccccgtggt tacctcttcc 780 tcccactcca gggcgccctg ccaggccggg gacctccggg acatgatcag catgtacctc 840 cccggcgccg aggtgccgga gcccgctgcg cccagtagac tgcacatggc ccagcactac 900 cagagcggcc cggtgcccgg cacggccatt aacggcacac tgcccctgtc gcacatgtga 960 960 <210> 3 <211> 1452 <212> DNA <213> Klf4 <400> 3 atgaggcagc cacctggcga gtctgacatg gctgtcagcg acgctctgct cccgtccttc 60 tccacgttcg cgtccggccc ggcgggaagg gagaagacac tgcgtccagc aggtgccccg 120 actaaccgtt ggcgtgagga actctctcac atgaagcgac ttcccccact tcccggccgc 180 ccctacgacc tggcggcgac ggtggccaca gacctggaga gtggcggagc tggtgcagct 240 tgcagcagta acaacccggc cctcctagcc cggagggaga ccgaggagtt caacgacctc 300 ctggacctag actttatcct ttccaactcg ctaacccacc aggaatcggt ggccgccacc 360 gtgaccacct cggcgtcagc ttcatcctcg tcttccccgg cgagcagcgg ccctgccagc 420 gcgccctcca cctgcagctt cagctatccg atccgggccg ggggtgaccc gggcgtggct 480 gccagcaaca caggtggagg gctcctctac agccgagaat ctgcgccacc tcccacggcc 540 cccttcaacc tggcggacat caatgacgtg agcccctcgg gcggcttcgt ggctgagctc 600 ctgcggccgg agttggaccc agtatacatt ccgccacagc agcctcagcc gccaggtggc 660 gggctgatgg gcaagtttgt gctgaaggcg tctctgacca cccctggcag cgagtacagc 720 agcccttcgg tcatcagtgt tagcaaagga agcccagacg gcagccaccc cgtggtagtg 780 gcgccctaca gcggtggccc gccgcgcatg tgccccaaga ttaagcaaga ggcggtcccg 840 tcctgcacgg tcagccggtc cctagaggcc catttgagcg ctggacccca gctcagcaac 900 ggccaccggc ccaacacaca cgacttcccc ctggggcggc agctccccac caggactacc 960 cctacactga gtcccgagga actgctgaac agcagggact gtcaccctgg cctgcctctt 1020 cccccaggat tccatcccca tccggggccc aactaccctc ctttcctgcc agaccagatg 1080 cagtcacaag tcccctctct ccattatcaa gagctcatgc caccgggttc ctgcctgcca 1140 gaggagccca agccaaagag gggaagaagg tcgtggcccc ggaaaagaac agccacccac 1200 acttgtgact atgcaggctg tggcaaaacc tataccaaga gttctcatct caaggcacac 1260 ctgcgaactc acacaggcga gaaaccttac cactgtgact gggacggctg tgggtggaaa 1320 ttcgcccgct ccgatgaact gaccaggcac taccgcaaac acacagggca ccggcccttt 1380 cagtgccaga agtgtgacag ggccttttcc aggtcggacc accttgcctt acacatgaag 1440 aggcactttt aa 1452 <210> 4 <211> 1365 <212> DNA <213> c-Myc <400> 4 ctggatttcc tttgggcgtt ggaaaccccg cagacagcca cgacgatgcc cctcaacgtg 60 aacttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactccg tacagcccta tttcatctgc 120 gacgaggaag agaatttcta tcaccagcaa cagcagagcg agctgcagcc gcccgcgccc 180 agtgaggata tctggaagaa attcgagctg cttcccaccc cgcccctgtc cccgagccgc 240 cgctccgggc tctgctctcc atcctatgtt gcggtcgcta cgtccttctc cccaagggaa 300 gacgatgacg gcggcggtgg caacttctcc accgccgatc agctggagat gatgaccgag 360 ttacttggag gagacatggt gaaccagagc ttcatctgcg atcctgacga cgagaccttc 420 atcaagaaca tcatcatcca ggactgtatg tggagcggtt tctcagccgc tgccaagctg 480 gtctcggaga agctggcctc ctaccaggct gcgcgcaaag acagcaccag cctgagcccc 540 gcccgcgggc acagcgtctg ctccacctcc agcctgtacc tgcaggacct caccgccgcc 600 gcgtccgagt gcattgaccc ctcagtggtc tttccctacc cgctcaacga cagcagctcg 660 cccaaatcct gtacctcgtc cgattccacg gccttctctc cttcctcgga ctcgctgctg 720 tcctccgagt cctccccacg ggccagccct gagcccctag tgctgcatga ggagacaccg 780 cccaccacca gcagcgactc tgaagaagag caagaagatg aggaagaaat tgatgtggtg 840 tctgtggaga agaggcaaac ccctgccaag aggtcggagt cgggctcatc tccatcccga 900 ggccacagca aacctccgca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccactcac 960 cagcacaact acgccgcacc cccctccaca aggaaggact atccagctgc caagagggcc 1020 aagttggaca gtggcagggt cctgaagcag atcagcaaca accgcaagtg ctccagcccc 1080 aggtcctcag acacggagga aaacgacaag aggcggacac acaacgtctt ggaacgtcag 1140 aggaggaacg agctgaagcg cagctttttt gccctgcgtg accagatccc tgaattggaa 1200 aacaacgaaa aggcccccaa ggtagtgatc ctcaaaaaag ccaccgccta catcctgtcc 1260 attcaagcag acgagcacaa gctcacctct gaaaaggact tattgaggaa acgacgagaa 1320 cagttgaaac acaaactcga acagcttcga aactctggtg cataa 1365

Claims

신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물로서 상기 신경줄기세포는 체세포에 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 유전자를 도입하여 리프로그래밍함으로써 수득한 신경줄기세포인 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 Brn4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 유전자는 각각 서열목록 제1서열 내지 제4서열에 기재된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경계 질환 및 손상은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알쯔하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)으로 이루어진 군에서 선택된 질환 및 손상인 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 축삭 재생(axonal regeneration)을 유도하는 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 면역 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 척수 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 신경재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 신경재생은 신경영양성 인자(neurotrophic factor) 분비에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 신경영양성 인자는 GDNF, HGF, NT3, NT4, NGF, Map2, ChAT, Pax6, Nestin, Olig2 및 GFAP로 구성된 군으로부터 선택되는 신경영양성 인자인 것을 특징으로 하는 신경계 질환 및 손상에 대한 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.