CN112839709A - 治疗神经退行性疾病的神经干细胞组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于干细胞的疗法，用于治疗神经退行性疾病和CNS病症，例如亨廷顿氏病。该疗法改善了运动缺陷和挽救突触改变。该细胞示出具有电生理学活性并且其改善了运动和晚期认知损害。

Description

治疗神经退行性疾病的神经干细胞组合物和方法
背景技术
目前尚无疾病修饰疗法可用于影响中枢或外周神经系统的许多神经退行性疾病。一些人已建议人类干细胞为某些神经退行性疾病提供了可能治疗策略(评阅参见，Drouin-Ouellet,2014，Golas and Sander,2016，Kirkeby et al.,2017)。
例如，亨丁顿氏病(Huntington’s disease，HD)是由被扩增的CAG重复序列(CAGrepeat)引起的常染色体显性神经退行性疾病，该CAG重复序列编码在亨丁顿氏蛋白(HTT)之内的多聚谷氨酰胺重复序列(The Huntington’s Disease Collaborative ResearchGroup,1993)。不自主运动、进行性智力下降以及精神病学障碍发生(Ross and Tabrizi,2011)，并且神经病理学主要涉及纹状体中的中型棘神经元(MSN)的变性以及皮质的萎缩(Vonsattel and DiFiglia,1998)。本领域中存在发现用于神经退行性疾病和病症(例如HD)的疗法的需求。本发明满足了这种需求并且也提供了相关的优势。
发明内容
本发明提供一种从人类胚胎干细胞(hESC)中制备人类神经元干细胞(hNSC)的方法，该方法包含以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或进一步由以下步骤组成：
a)从被培养于分化培养基中的类胚体(embryoid body，EB)的群体中分离至少一个干细胞玫瑰花结(rosette)；
b)将被分离自步骤a)的玫瑰花结的至少一个单个单元(individual cell)培养一定量的时间，并且在为生成至少一个玫瑰花结提供的条件下，直到至少一个玫瑰花结生成；
c)将来自步骤b)的玫瑰花结的单个单元分离成为单个细胞(individual cells)；以及
d)将被分离自步骤c)的至少一个单个细胞培养一定量的时间，并且在为生成hNSC的融合群体提供的条件下，直到生成hNSC的融合群体。
在一些实施方式中，从玫瑰花结中分离至少一个单个单元是手动地进行的。在另一方面，从玫瑰花结中分离至少一个单个单元/细胞是酶促地进行的。在另一方面，从步骤a)的玫瑰花结中分离至少一个单个单元是数字化地进行的，任选地使用数字二维或三维图像识别技术。在另一方面，步骤c)的至少一个单个细胞的分离是酶促地进行的。
在一些实施方式中，可以使步骤a)至c)中的一步或多步手动地进行或以高通量方式(任选地使用数字二维或三维图像识别技术)机械地进行2次或更多次。
在一些实施方式中，该方法进一步包含从ESI-017中生成类胚体。在一些实施方式中，该方法进一步包含在超低附着表面上于EB培养基中培养类胚体(EB)。在一些实施方式中，该方法进一步包含在将EB已经在鸟氨酸/层粘连蛋白包被的表面上在步骤a)上进一步培养了有效量的时间之后，用N2培养基代替EB培养基。在一些实施方式中，该方法进一步包含在EB已经在EB培养基中被培养一定量的时间(有效地产生步骤a)的至少一个EB)后，用N2培养基代替EB培养基。
在一些实施方式中，在鸟嘌呤/层粘连蛋白包被的板上的N2培养基中将在步骤c)中被分离的至少一个单个细胞培养有效量的时间，以生成hNSC的融合细胞群体。在一些实施方式中，该方法进一步包含用有效量的N2培养基培养hNSC的融合群体。在一些实施方式中，该方法进一步包含扩增细胞群体。
在一些实施方式中，该方法进一步包含对细胞进行基因修饰。在一些实施方式中，通过转基因的插入或通过CRISPR的修饰对细胞进行基因修饰。在一些实施方式中，转基因是ApiCCT1、其片段或其每一个的等效物，并且任选地其中该转基因在细胞中被过表达。
在一些方面，本发明提供一种由以下方法制备的hNSC，该方法包含以下步骤或基本上由以下步骤组成或由以下步骤组成：
a)从被培养于分化培养基中的类胚体(EB)的群体中分离至少一个干细胞玫瑰花结；
b)将被分离自步骤a)的玫瑰花结中的至少一个单个单元培养一定量的时间，并且在为生成至少一个玫瑰花结提供的条件下，直到至少一个玫瑰花结生成；
c)将来自步骤b)的玫瑰花结的单个单元分离成为单个细胞；以及
d)将被分离自步骤c)的至少一个单个细胞培养一定量的时间，并且在为生成hNSC的融合群体提供的条件下，直到生成hNSC的融合群体。
在一些实施方式中，hNSC表达BNDF。在一些实施方式中，hNSC在细胞的分化后表达BNDF。在一些实施方式中，通过转基因的插入或通过CRISPR对细胞进行基因修饰。
在一些方面，本发明提供一种根据本文所述的方法制备的细胞群体。还提供包含根据本文所述的方法制备的分离的细胞的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含载体。在一些实施方式中，载体是防腐剂和/或低温保护剂。
在一些方面，本发明提供一种将转基因递送至对象的方法或在有需要的对象中基因编辑细胞的方法，其包含施用有效量的根据本文所述的方法制备的分离的细胞。在一些实施方式中，对象是哺乳动物。在一些实施方式中，对象是人类。
在一些方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗神经退行性疾病或增强突触联系的方法，其包含施用有效量的根据本文所述的方法制备的分离的细胞。在一些实施方式中，对象是哺乳动物。在一些实施方式中，对象是人。在一些实施方式中，神经退行性疾病选自亨丁顿氏病、中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、外伤性脑损伤、脑部炎症、中风、自身免疫性疾病(例如多发性硬化、原发性或继发性进行性多发性硬化、复发缓解型多发性硬化症)、慢性脊髓损伤、贝尔氏麻痹(Bell’s palsy)、颈脊椎病、腕管综合症、脑或脊髓肿瘤、周围神经病变、格林-巴利综合症(Guillain-Barre syndrome)、脊髓性肌萎缩、弗雷德里希共济失调(Freidrich's ataxia)、肌萎缩性侧索硬化和亨丁顿氏舞蹈病。
在一些方面，本发明提供包含hESC和用于进行本文所述方法的说明书的试剂盒。
在一些方面，本发明提供了一种具有根据本文所述的方法制备并移植到动物中的hNSC的非人类动物。在一些实施方式中，动物是鼠或绵羊。
附图说明
图1A–1D：被植入R6/2小鼠中的ESI-017hNSC改善了行为并展示出分化成未成熟神经元和星形胶质细胞的证据。(A)转棒任务证明了与非转基因同窝小鼠(NT)相比R6/2小鼠中的缺陷，并且与载体处理(Veh)小鼠相比hNSC处理的R6/2小鼠在植入后的1周(黑色条)和3周(灰色条)的平均潜伏期增加。(B)爬杆测试证明，与NT相比，R6/2小鼠具有缺陷。hNSC处理的R6/2小鼠在植入后4周(灰色条)比Veh小鼠降落得更快，但在植入后2周(黑色条)则却没有。(C)握力证明了与NT相比在R6/2小鼠中的缺陷。与Veh小鼠(黑色条)相比，hNSC处理的R6/2小鼠在4周后具有更大力量(克)，但在2周后(灰色条)却没有。(D)免疫组化(IHC)。被植入R6/2小鼠的纹状体中的hNSC(人类标记物SC121)与神经元限制性祖细胞(双皮质素[DCX])和星形胶质细胞(SC121和GFAP)的标记物共定位。单因素方差分析，然后进行Tukey’s HSD检验与事后进行Scheffe′、Bonferroni和Holm多重比较计算。*p<0.05，**p<0.01(n＝15)。图示出平均值±SEM。
图2A–2F：IHC示出被植入R6/2小鼠中的ESI-017hNSC分化。(A)被植入R6/2小鼠中的hNSC(SC121)分化成神经元限制性祖细胞(双皮质素[DCX])和星形胶质细胞(SC121和GFAP)。(B)高倍放大(633)示出了分化：被植入R6/2小鼠的hNSC(人类细胞核标记物Ku80)分化成神经元限制性祖细胞(DCX)和一些星形胶质细胞(Ku80和GFAP)。(C)hNSC(Ku80)和神经元限制性祖细胞(DCX)。(D)hNSC(Ku80)和神经元限制性祖细胞(βIII-微管蛋白)；以DAPI示出小鼠细胞核。(E)hNSC(Ku80)和神经元限制性祖细胞(MAP-2)；以DAPI示出小鼠细胞核。(F)hNSC(Ku80)与已分化的有丝分裂后神经元细胞标记物(NeuN)不共定位。
图3A–3F：植入ESI-017hNSC可降低R6/2小鼠的皮质纹状体过度兴奋。(A)用SC121在纹状体和IHC中记录的生物胞素填充的(箭头)hNSC。比例尺，20mm。(B)顶部轨迹：自发放电(spontaneously firing)的hNSC的细胞贴附记录。底部轨迹：来自hNSC的sEPSC和sIPSC。记录阐明了hNSC中自发的内向和外向突触电流。(C)MSN中记录的sEPSC和sIPSC。(D)在hNSC簇(SC121)附近的生物胞素填充的MSN。比例尺，20mm。(E)在加入GABAA受体拮抗剂荷包牡丹硷(10mM)后，R6/2MSN亚群中sEPSC的记录示出“癫痫样”活性(第一条轨迹)。这些大振幅兴奋性事件通常接着是高频小振幅sEPSC。在具有hNSC植入物的小鼠中，这些事件在频率上明显地降低(第二条轨迹)。(F)在具有“癫痫样”活性的细胞中(BIC后6-8min)，与载体相比，被植入hNSC的R6/2组的事件间间隔累积概率分布向右移动，对应于高频自发事件显著降低(p<0.001，两次重复测量方差分析，然后进行Bonferroni事后分析；*p<0.05)。
图4A–4B：来自宿主的神经末梢使突触与被植入的hNSC进行联系。(A)含有突触小泡的未被标记的神经末梢(U-NT)，与下面被标记的(SC121)hNSC树突(L-DEND)形成突触样联系(箭头)。联系可以是对称的。(B)包含突触小泡的未被标记的神经末梢(U-NT)，与下面被标记的(SC121)hNSC树突(L-DEND)形成不对称突触联系(箭头)。这种不对称的联系表明了兴奋性突触联系。
图5A–5G：被植入Q140小鼠中的ESI-017hNSC改善了行为学并展现出分化成未成熟神经元和星形胶质细胞的证据。(A)在细胞注射后3个月，运动协调性(爬杆任务)中的暂时改善。WT Veh(n＝20)、Q140 Veh(n＝18)、Q140 hNSC(n＝18)。用Bonferroni事后检验的单向方差分析：*p<0.05，**p<0.01。(B–D)处理后5.5个月持续改善转轮跑步缺陷(每组n＝5)。(B)示出在处理后5.5个月的7.5个月龄的雄性WT或Q140小鼠中在2周内的平均转轮转动数/3min/晚的图。通过双因素方差分析的比较：组的效应F＝52.93，p<0.0001；在转轮中的夜晚数的效应F＝17，p<0.0001。Bonferroni事后检验：与Q140 Veh相比，*p<0.01，**p<0.001和***p<0.0001。(C)2周内的在夜间的总平均转轮转动数。用Bonferroni事后检验的双向方差分析：*p<0.01，**p<0.001。(D)在三组之间的运动学习斜率并不显著。(E和F)新物体的识别。hNSCs预防了Q140小鼠在治疗后5个月的缺陷，但在3个月时嗅探时间(E)或回合次数(F)的辨别指数却没有。WT Veh n＝18，Q140 Veh n＝18，Q140 hNSC n＝19。Bonferroni事后检验的单向方差分析：*p<0.05，**p<0.01。(G)通过将与星形胶质细胞(GFAP；b和c)或神经元限制性祖细胞(DCX；e和f)共表达的人类特异性抗体(HNA；a和d)染色，Q140小鼠中hNSC的存活和分化。比例尺，20mm。所有图均示出平均值±SEM。
图6A–6D：被植入HD小鼠中的ESI-017hNSC增加BDNF的表达。(A)ESI-017hNSC(Ku80)示出与BDNF的共定位；星形胶质细胞示出为GFAP阳性。(B)经Veh处理的小鼠没有示出BDNF或hNSC，但具有GFAP。(C)在植入后6个月的Q140或WT小鼠的纹状体中ELISA的BDNF水平。(D)在Q140小鼠中的hNSC处理降低了小胶质细胞的激活。数据表示为平均值+95％置信区间(每组n＝5)。条形代表每个直径的细胞的百分比，灰色部分代表置信区间。与WT Veh相比，在Q140 Veh中观察到显著的纹状体小胶质细胞激活。与Q140 Veh小鼠相比，Q140 hNSC小鼠示出显著降低的纹状体中的小胶质细胞激活。通过用Bonferroni事后检验的单向方差分析，*p<0.05和**p<0.01。图示出平均值±SEM。
图7A–7F：被植入R6/2小鼠中的ESI-017hNSC导致弥散性聚集体和内含体减少，并减少在Q140小鼠中的亨丁顿聚集体。(A和B)ESI-017hNSC导致R6/2小鼠中的弥散性聚集体和内含体(A中的箭头)降低。(A)具有镍的Ku80、HTT标记物EM48和用于非hNSC细胞核染色的甲酚紫的图像。使用StereoInvestigator进行的体视学评估。在53个物镜下以轮廓追踪(虚线，在左侧小图中的例子)，并在1003处计数。对于在整个纹状体的6个切片，计数每3个切片(40mm冠状切片)，其中可以在前bregma 0.5mm和bregma_0.34mm之间看到Ku80。(B)示出具有聚集体或内含体的细胞百分比(n＝4/组)，通过使用Bonferroni事后检验的单向方差分析**p<0.01。(C和D)ESI-017hNSC减少Q140小鼠中的亨丁顿聚集体。(C)HTT标记物EM48的图像(箭头表示内含体)。(D)用StereoInvestigator分析HTT染色的细胞核和聚集体，用于聚集体类型/切片的定量。数据示出为平均值±SEM(n＝5/组)。通过Bonferroni事后检验进行单向方差分析，*p<0.05。(E和F)hNSC移植调节R6/2小鼠中的不溶性蛋白质的积累。将Western印迹的纹状体裂解物分为可溶于去污剂的部分和不可溶于去污剂的部分。(E)与NT相比，R6/2富集于不溶性累积的mHTT。与veh处理的动物相比，在R6/2中的hNSC移植导致不溶性HMW积累的HTT的显著减少。与NT相比，R6/2纹状体还富集不溶性泛素缀合蛋白。与veh处理相比，在R6/2小鼠中的hNSC移植导致泛素修饰的不溶性缀合蛋白的显著减少；而与veh对照相比，在NT中无显著影响。(F)mHTT和泛素的相对蛋白表达的定量。值表示平均值±SEM。用单向方差分析，随后的Bonferroni事后检验(n＝3/处理)确定R6/2中相对不溶性累积mHTT和泛素缀合蛋白表达的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图示出平均值±SEM。
图8A–8D：通过单色流式细胞仪的ESI-017hNSC的表征。(A)ESI-017hNSC对CD24、SOX1、SOX2、Nestin和Pax6 NSC标记物染色阳性。ESI-017hNSC对多能标记物SSEA4染色阴性。在ESI-017hNSC上进行染色体核型分析，并通过凝集染色体的Giemsa染色将中期可视化。最终的染色体组型示出具有正常的46XX轮廓的高的有丝分裂指数。(B)NSC制造过程的流程图：通过形成类胚体(EB)生成hNSC，然后将生成的EB铺板到聚鸟氨酸-层粘连蛋白(Poly-O)包被的板中，随后形成神经玫瑰花结。手动地切割玫瑰花结并转移到新鲜的Poly-O板中，使其在其中附着。然后酶促地切割被扩增的神经玫瑰花结，然后将其铺板到新鲜的Poly-O板上。在此使细胞可以生长至融合，并将其酶促地传代成更大量的Poly-O板。在扩增至足够数量后，对生成的hNSC进行最终收获和冷冻保存。(C)被培养的ESI-017hNSC免疫细胞化学示出对神经外胚层干细胞标记物巢蛋白的阳性NSC染色和DAPI细胞核染色。比例尺等于30μm。(D)是玫瑰花结的图片。
图9：紧扣行为：用ESI-017hNSC(n＝15)处理的R6/2小鼠在植入后示出延迟的紧扣行为。非转基因(NT)小鼠没有展示这种表型。每天测试小鼠的该表型，并且图示出在研究过程中每个组紧扣的百分比。通过Fisher的精确概率检验确定紧扣测定的显著性。
图10A–10E：ESI-017的低放大倍数免疫组化。被植入hNSC的R6/2小鼠：被植入R6/2小鼠中的hNSC(人类标记物SC121)与用于神经元限制性祖细胞(双皮质素DCX)的标记物共定位。为了筛选hNSC，在第34、37、40、43、46和49切片(分别相当于Bregma 0.38mm、0.26mm、0.14mm、0.02mm、-0.10mm和-0.22mm)上进行IHC。S2是如图1D所示图像的再次使用，用于与其他冠状切片的比较。ESI-017hNSC植入物R6/2小鼠中的免疫组化：(A)被植入R6/2小鼠中的hNSC(人类标记物Ku80)与用DAPI示出的少突胶质细胞标记物(Olig2)小鼠细胞核不共定位。高放大倍数(63x)示出了分化：(B)hNSC(人类细胞核标记物Ku80和胞浆标记物SC121蓝色)示出与神经元限制性祖细胞(BIII-微管蛋白)的共定位(lt.蓝色)。(C)hNSC(人类细胞核标记物Ku80和胞质标记物SC121)示出与神经元限制性祖细胞(MAP-2)的共定位。(D)hNSC(人类细胞核标记物Ku80)与亨丁顿标记物(EM48)不共定位。(E)S1-6示出收集的冠状切片，从bregma1.70mm开始免疫染色，每个切片40um。
图11A–11B：被植入到纹状体中的ESI-017hNSC没有改善Q140小鼠中在旷场或爬笼试验中的缺陷。在植入前0.5个月或植入后3和5个月，在旷场中测试小鼠15分钟(A)，以及爬笼5分钟(B)。数据表示为平均值±SEM；Wt Veh(n＝18)，Q140 Veh(n＝18)和Q140 hNSC(n＝17)。与相同时间点的载体处理的Wt小鼠相比，用Bonferroni事后检验的双向方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图12A–12C：ESI-017hNSC BDNF的体外表达。ESI-017hNSC在神经干细胞培养基中培养(A)或分化(B)，然后对BDNF、人类细胞核标记物Ku80和双皮质素DCX染色。(C)比较来自被培养的ESI-017hNSC的RNA水平的qPCR示出随分化而增加的BDNF表达。作为比较，干细胞标记物巢蛋白随分化而减少，而DCX增加。
图13A–13E：(A&B)具有ESI-017hNSC的Q140小鼠纹状体中突触素水平增加。(A)用微阵列扫描仪采集图像并对荧光强度进行定量。白色比例尺等于10μm。(B)数据示出为平均值±SEM，并且所用的统计检验是用Bonferroni事后检验的单向方差分析，*p＜0.05，每组n＝5只小鼠。R6/2小鼠中的hNSC处理不会改变小胶质细胞的激活。数据表示为平均值+95％置信区间(每组n＝5)。条形表示细胞的每个直径的百分数，以及彩色部分代表置信区间。(C)与非转基因对照(NT Veh)相比，在用载体(R6/2Veh)处理的R6/2小鼠中观察到显著的纹状体小胶质细胞的激活。(D)NT+载体与NT+hNSC的比较。(E)与R6/2Veh小鼠相比，用hNSC(R6/2NSC)处理的R6/2小鼠示出在纹状体中的小胶质细胞的激活没有显著减少。
图14：R6/2小鼠中人类HTT转基因表达的实时PCR。RPLPO(大核糖体蛋白)内源性对照用于标准化cDNA样品中的基因表达差异。用Bonferroni事后检验的单因素方差分析确定未观察到显著性。
图15A-15F：在5周龄时，对R6/1小鼠进行双侧纹状体内注射表达sApiCCT1或mCherry对照的AAV。在两个分开的实验中，小鼠注射12x109个AAV2/1的基因组拷贝，并在17周龄时收获。(A)示意图。(B，C)琼脂糖凝胶电泳的定量，然后进行蛋白质印迹，示出动物中的寡聚mHTT显著降低。(D)免疫组化示出sApiCCT1(抗HA)的表达。(E)被注射sApiCCT1的小鼠通过体视学示出在可视化mHTT内含体中减少了约40％(抗EM48)。(F)被注射sApiCCT1-AAV2/1的小鼠在转棒运动任务上示出改善*p<0.05，**p>0.01。
图16A-16D：ESI-017hNSC产生ApiCCT。(A)转导后，将以sApiCCT慢病毒以MOI 0、5、10或15转导的ESI-017hNSC培养48小时，裂解并使用HA抗体进行Western印迹，然后将其切割并用用于上样对照的α-微管蛋白抗体重新探测。(B)从hNSC分泌的ApiCCT进入PC12Htt14A2.6细胞。将来自被sApiCCT慢病毒转导的ESI-017hNSC的条件培养基应用至由松甾酮的EtOH溶液诱导的14A2.6细胞以表达HTT-GFP，或应用至单独用EtOH处理的对照。在细胞裂解物中检测到ApiCCT1，支持了工程化的hNSC表达分泌形式的ApiCCT1的可行性，该ApiCCT1可以在移植后被邻近细胞吸收。使用HA抗体示出了蛋白质印迹。随着较高的MOI，在被处理过的PC12细胞裂解物中检测到较高量的ApiCCT1。(C)从hNSC中分泌的ApiCCT1不会改变PC12 Htt14A2.6细胞中的单体HTT。将来自用sApiCCT慢病毒转导的ESI-017hNSC的条件培养基应用至由松甾酮诱导的14A2.6细胞，或应用至单独用EtOH处理的对照。用被分泌的ApiCCT1处理不会导致单体mHTT-GFP转基因发生改变。使用GFP抗体示出蛋白质印迹，然后将其切割并重新探测作为上样对照的α-微管蛋白。(D)从hNSC中分泌的ApiCCT1改变了PC12 Htt14A2.6细胞中的寡聚HTT种类。来自用sApiCCT1慢病毒转导并被应用于松甾酮诱导的14A2.6细胞或单独用EtOH处理的对照的ESI-017hNSC的条件培养基会导致最高MOI处的寡聚HTT减少(红色框)。使用GFP抗体示出的代表性样品的蛋白质印迹。
图17A和17B：IHC示出被ApiCCT的病毒转导并将其植入R6/2小鼠的纹状体中的ESI-017hNSC表达ApiCCT。(A)被植入R6/2小鼠中的hNSC(人类细胞核抗原[HNA])分化为神经元限制性祖细胞(双皮质素[DCX])，并表达HA标记的ApiCCT(HA)。(B)高放大倍数(95x)，取自A所示的白框区域，示出分化和ApiCCT表达：被植入R6/2小鼠中的hNSC(HNA)分化成神经元限制性祖细胞(DCX)，并表达HA标记的ApiCCT(HA)。
发明详述
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是本文描述了优选的方法、设备和材料。所有的技术和专利公开通过引用方式以其整体并入本文中。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明早于这样的公开。
本整个申请中及在本申请之内，通过引文引用了技术和专利文献。对于这些参考文献中的某些，在本申请的结尾处紧接权利要求书之前可找到标识性引用。通过引用方式将所有出版物并入本发明，以更全面地描述本发明所属领域的技术水平。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域技术范围内的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见例如Sambrook andRussell eds.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition；Ausubel etal.eds.(2007)Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)系列；MacPherson et al.(1991)PCR 1:A PracticalApproach(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al.(1995)PCR 2:APractical Approach；Harlow and Lane eds.(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,5th edition；Gait ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames and Higginseds.(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic AcidHybridization；Hames and Higgins eds.(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guideto Molecular Cloning；Miller and Calos eds.(1987)Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed.(2003)GeneTransfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；Herzenberg et al.eds(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition(Cold SpringHarbor Laboratory Press(2002))；Sohail(ed.)(2004)Gene Silencing by RNAInterference:Technology and Application(CRC Press)。
所有的包括范围的数字标识(例如pH、温度、时间、浓度和分子量)都是近似值，在适当的情况下，通过0.1或1.0的增量，以(+)或(-)进行变化。应当理解，尽管并非总是明确地指出，所有数字标识之前均带有术语“约”。还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，其等效物是本领域已知的。
如说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数参照物。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用，术语“包含”旨在表示所述组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应意为排除对于所述目的而言对组合具有任何实质意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物将不会从分离和纯化方法中排除痕量污染物以及药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)。“由……组成”是指排除超过痕量的其他元素和用于施用本发明组合物的实质性方法步骤或生产组合物或达到预期结果的工艺步骤。这些过渡术语中的每一个所定义的实施方式都在本发明的范围内。
如本文相对于核酸(例如DNA或RNA)所用，术语“分离的”是指分别与存在于天然来源大分子中的其他DNA或RNA分开的分子。术语“分离的核酸”是指包括并非以片段天然存在并且不会以天然状态被发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还用于指从其他细胞蛋白分离的多肽、蛋白质和/或宿主细胞，并且意为包括纯化的和重组的多肽。在其他实施方式中，术语“分离的”是指从组分、细胞或其他中分离，其中细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常是天然相连的。例如，被分离的细胞是从不相似表型或基因型的组织或细胞中分离的细胞。对本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来区分其与天然存在的对应物。
术语“分离”旨在从其他组合物或组分与紧邻的其他组分或组分分离的过程。可以手动地分离细胞/单元(例如，手动地使用移液管或其他工具)，通过使用化学试剂酶促地分离，或通过基于细胞/单元或玫瑰花结形态的数字技术数字地分离。参见例如，cellavision.com/en/introducing-digital-cell-morphology-by-cellavision，于2018年5月22日访问。
“分化培养基”是指含有例如某些生长因子的因子的细胞培养基，该因子促进未成熟细胞分化为更成熟的表型，例如从胚胎干细胞分化为神经细胞。
如本文所用，术语“融合群体”是指与相邻细胞连续接触的细胞群体。
“超低附着表面”是指细胞或组织培养表面，在某些方面，该表面包含亲水和中性电荷的共价结合的水凝胶层。由于蛋白质和其他生物分子通过疏水或离子相互作用被动吸附到聚苯乙烯表面，所以该水凝胶表面通过这些力自然地抑制非特异性固定，因此抑制后续的细胞附着。这些表面可从许多供应商处购得，例如Millipore-Sigma、Fisher-Scientific和S-bio。用于制造细胞培养板和表面的方法是本领域已知的。
“转基因”是指已经加入到细胞、组织或生物体中的多核苷酸。转基因的一个例子是ApiCCT1。
“ApiCCT1”是指CCT1的顶端结构域和/或编码所述CCT1的顶端结构域的多核苷酸(Sontag,E.Proc Natl Acad Sci U S A.2013Feb 19；110(8):3077-82，通过引用方式并入本文)。CCT1是分子伴侣，是含有TCP1复合物(CCT)(也称为TCP1环复合物(TRiC))的伴侣蛋白的成员。该复合物由两个相同的堆叠环组成，每个环包含八个不同的蛋白质。未折叠的多肽进入复合物的中央腔，并以ATP依赖性方式折叠。该复合物折叠多种蛋白质，包括肌动蛋白和微管蛋白。在一些实施方式中，ApiCCT1的大小为20kDa。在人类中，TCP1环复合物由TCP1基因(Entrez基因6950)编码。本文中以SEQ ID NO：1-4提供TCP1 mRNA和蛋白质的序列的非限制性例子。该顶端结构域参与底物结合。(Pappenberger,G.et al.J MolBiol.2002May 17；318(5):1367-79，通过引用方式并入本文)。下面提供了ApiCCT1的序列的非限制性例子(SEQ ID NO：7)：
MVPGYALNCTVASQAMPKRIAGGNVKIACLDLNLQKARMAMGVQINIDDPEQLEQIRKREAGIVLERVKKIIDAGAQWLTIKGIDDLCLKEFVEAKlMGVRRCKKEDLRRIARATGATLVSSMSNLEGEETFESSYLGLCDEWQAKFSDDECILIKGTSKAAAAALE。
“sApiCCT1”是指ApiCCT1的分泌版本。下文提供了sApiCCT的核酸序列和氨基酸序列的非限制性例子。带下划线的序列对应于HA标签。在一些实施方式中，sApiCCT1不包含标签。
sApiCCT1 mRNA(SEQ ID NO：8)
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCTATCAGTGGCTATGCACTCAACTGTGTGGTGGGATCCCAGGGCATGCCCAAGAGAATCGTAAATGCAAAAATTGCTTGCCTTGACTTCAGCCTGCAAAAAACAAAAATGAAGCTTGGTGTACAGGTGGTCATTACAGACCCTGAAAAACTGGACCAAATTAGACAGAGAGAATCAGATATCACCAAGGAGAGAATTCAGAAGATCCTGGCAACTGGTGCCAATGTTATTCTAACCACTGGTGGAATTGATGATATGTGTCTGAAGTATTTTGTGGAGGCTGGTGCTATGGCAGTTAGAAGAGTTTTAAAAAGGGACCTTAAACGCATTGCCAAAGCTTCTGGAGCAACTATTCTGTCAACCCTGGCCAATTTGGAAGGTGAAGAAACTTTTGAAGCTGCAATGTTGGGACAGGCAGAAGAAGTGGTACAGGAGAGAATTTGTGATGATGAGCTGATCTTAATCAAAAATACTAAGGCTGCTGCGGCTGCGGGTGGACACTACCCTTACGACGTGCCTGACTACGCCTGA
sApiCCT1肽(SEQ ID NO：9)
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISGYALNCVVGSQGMPKRIVNAKIACLDFSLQKTKMKLGVQVVITDPEKLDQIRQRESDITKERIQKILATGANVILTTGGIDDMCLKYFVEAGAMAVRRVLKRDLKRIAKASGATILSTLANLEGEETFEAAMLGQAEEVVQERICDDELILIKNTKAAAAAGGHYPYDVPDYA
如本文所用，“BDNF”是指脑源性神经营养因子(BDNF)及其等效物和/或编码BDNF的多核苷酸或其等效物。BDNF作用于中枢神经系统和外周神经系统的神经元，有助于支持现有神经元的存活，并促进新神经元和突触的生长和分化。BDNF在海马、皮层和基底前脑中也很活跃，这些区域对于学习、记忆和高智商至关重要。它还在视网膜、运动神经元、肾脏、唾液和前列腺中被表达。BDNF蛋白由BDNF基因编码(Entrez基因：627；mRNA：NM_001143805、NM_001143806、NM_001143807、NM_001143808、NM_001143809、NM_001143810、NM_001143811、NM_001143812、NM_001143813、NM_001143814、NM_001143815、NM_001143816、NM_001709、NM_170731、NM_170732、NM_170733、NM_170734、NM_170735、NM_001143805)。BDNF mRNA和蛋白质序列的非限制性例子在本文中以SEQ ID NO：5-6提供。
如本文所用，术语“CRISPR”是指依赖于聚集的规则间隔的短回文重复途径的序列特异性基因操作技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调控，以及简单地将蛋白质靶向特定的基因组位置。基因编辑是指一种遗传工程，其中通过将缺失、插入或碱基置换引入多核苷酸序列改变靶多核苷酸序列的核苷酸序列。在某些方面，CRISPR介导的基因编辑利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组的途径进行编辑。基因调控是指增加或降低特定基因产物(例如蛋白质或RNA)的产生。
如本文所用，术语“gRNA”或“指导RNA”是指用于靶向特定基因来采用CRISPR技术进行校正的指导RNA序列。设计用于靶特异性的gRNA和供体治疗性多核苷酸的技术是本领域众所周知的。例如Doench,J.,et al.Nature biotechnology 2014；32(12):1262-7,Mohr,S.et al.(2016)FEBS Journal 283:3232-38、以及Graham,D.,et al.GenomeBiol.2015；16:260。gRNA包含以下组分或基本上由其组成，或者进一步由其组成：包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)的融合多核苷酸；或包含CRISPRRNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)的多核苷酸。在一些方面，gRNA是合成的(Kelley,M.et al.(2016)J of Biotechnology 233(2016)74-83)。如本文所用，gRNA的生物学等效物包括但不限于可以将Cas9或其等效物引导至特定核苷酸序列(例如细胞基因组的特定区域)的多核苷酸或靶向分子。
在细胞中CRISPR的表达可以使用常规的CRISPR/Cas系统实现，并指导细胞中靶基因特异性的RNA。合适的表达系统，例如慢病毒或腺病毒表达系统，是本领域已知的。可以理解的是，CRISPR编辑构建体可用于敲除内源性基因或敲入基因。因此，可以理解的是，可以将CRISPR系统设计用于实现这些目的之一或全部。
如本领域技术人员已知的，存在六类病毒。DNA病毒构成I类和II类。RNA病毒和逆转录病毒构成了其余类别。III类病毒具有双链RNA基因组。IV类病毒具有阳性的单链RNA基因组，基因组本身起着mRNA的作用。V类病毒具有阴性的单链RNA基因组，用作mRNA合成的模板。VI类病毒具有阳性的单链RNA基因组，但不仅在复制中而且在mRNA合成中都具有DNA中间体。逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息；但是，一旦病毒感染细胞，RNA就会逆转录为DNA形式，并整合到被感染细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式称为原病毒。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。在聚合后多核苷酸可进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则作为多核苷酸的本发明的任何实施方式既包括双链形式，也包括已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。
多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)；当多核苷酸为RNA时，对胸腺嘧啶来说是尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。可以将该字母表示形式输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用程序，例如功能基因组学和同源性搜索。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述位置可以为了比较的目的被对齐。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配或同源位置数目的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列之一共享小于40％的同一性，或小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)“序列同一性”，意为当比对时，在比较这两个序列时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Ausubel et al.eds.(2007)Current Protocols in Molecular Biology所述的那些，来确定这种比对和同源性或序列同一性百分数。优选地，将默认参数用于比对。一种比对程序是使用默认参数的BLAST。特别是，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；股＝两者；临界值＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在以下Internet地址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
等效或生物学等效的核酸、多核苷酸或寡核苷酸或肽是与参考核酸、多核苷酸、寡核苷酸或肽具有至少80％的序列同一性、或至少85％的序列同一性、或至少90％的序列同一性、或至少92％的序列同一性、或至少95％的序列同一性、或至少97％的序列同一性、或至少98％的序列同一性的核酸、多核苷酸或寡核苷酸或肽。
术语“多核苷酸的扩增”包括例如PCR、连接扩增(或连接酶链反应，LCR)和扩增方法的方法。这些方法是本领域已知的并且广泛实践的。参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202以及Innis et al.,1990(用于PCR)和Wu et al.(1989)Genomics 4:560-569(用于LCR)。一般而言，PCR程序描述了一种基因扩增的方法，该方法包括(i)引物与DNA样品(或文库)中具有特定基因的序列特异性杂交，(ii)随后的扩增，涉及多轮退火、延伸以及使用DNA聚合酶进行变性；以及(iii)在PCR产物中筛选正确大小的条带。所使用的引物是具有足够长度和适当序列以提供聚合起始的寡核苷酸，即，每个引物被专门设计为与待扩增的基因组基因座的每个链互补。
用于进行PCR的试剂和硬件是商业上可购买的。可用于扩增来自特定基因区域的序列的引物优选与靶区域或其侧翼区域中的序列互补并特异性杂交。通过扩增生成的核酸序列可以直接被测序。或者，可以在序列分析之前克隆被扩增的序列。用于酶促地扩增的基因组区段的直接克隆和序列分析的方法是本领域已知的。
“基因”是指含有至少一个开放阅读框(ORF)的多核苷酸，其在转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白质。
术语“表达”是指基因产物的产生。
如本文所用，“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或该被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。
“基因产物”或者“基因表达产物”是指当转录和翻译基因时生成的氨基酸(例如，肽或多肽)。
“在转录控制之下”是本领域已知的术语，并且表明了多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录取决于其被可操作地连接至有助于启动转录或促进转录的元件。“可操作地连接”意指以使它们可以在细胞中起作用的方式排列多核苷酸。一方面，本发明提供了可操作地连接至下游序列(例如，自杀基因、编码ApiCCT1的多核苷酸、例如sApiCCT1的其片段、或其每一个的等效物)的启动子。
当应用于多核苷酸时，术语“编码”是指如果在其天然状态，则多核苷酸被称为“编码”多肽；或者当通过本领域技术人员已知的方法操纵其时，其可以被转导和/或翻译以产生该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的补体，并且可以从其推导编码序列。
当在多核苷酸操纵的上下文中使用时，“探针”是指作为试剂提供的寡核苷酸，其通过与靶标杂交来检测可能存在于目标样品中的靶标。通常，探针包含可检测的标记或在杂交反应之前或之后通过其标记可以被附着的手段。或者，“探针”可以是能够与可能存在于目标样品中的靶标结合的生物化合物，例如多肽、抗体或其片段。
“可检测的标记”或“标记物”包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和包括酶蛋白质。可检测的标记也可以连接至本文所述的多核苷酸、多肽、抗体或组合物。
“引物”是短的多核苷酸，通常具有游离的3'-OH基团，其通过与靶标杂交并随后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合而与靶标或可能存在于目标样品中的“模板”结合。“聚合酶链反应”(“PCR”)是这样的反应，其中使用由“上游”和“下游”引物组成的“一对引物”或“一组引物”、以及聚合的催化剂(例如DNA聚合酶)、以及通常是热稳定的聚合酶制成靶多核苷酸的复制拷贝。PCR的方法是本领域已知的并且在例如MacPherson et al.(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press)中有教导。产生多核苷酸的复制拷贝的所有过程，例如PCR或基因克隆，在本文中被统称为“复制”。引物也可以用作杂交反应(例如Southern或Northern印迹分析)的探针。Sambrook and Russell(2001)，见下文。
“杂交”是指其中一种或多种多核苷酸反应形成复合物的反应，其中该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键而稳定。氢键可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式出现。该复合物可包含形成双链体结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，单条自杂交链，或这些的任何组合。杂交反应可形成更广泛过程中的步骤，例如PCR反应的启动或通过核酶对多核苷酸的酶促切割。
杂交反应可以在不同的“严格性”条件下进行。通常，低严格性杂交反应是在10xSSC中约40℃下或等离子强度/温度的溶液中进行的。中严格性杂交通常在6x SSC中约50℃下进行，以及高严格性杂交反应通常在1x SSC中约60℃下进行。严格杂交条件的其他例子包括：低严格性的约25℃至约37℃的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及从约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中等杂交条件的例子包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格性条件的例子包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。通常，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。应当理解，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。杂交反应也可以在本领域技术人员已知的“生理条件”下进行。生理状况的非限制性例子是通常在细胞中发现的温度、离子强度、pH和Mg2+的浓度。
当在两个单链多核苷酸之间以反平行构型发生杂交时，该反应被称为“退火”，并且那些多核苷酸被描述为“互补的”。如果在第一多核苷酸链中的一条和第二多核苷酸链中的一条之间可发生杂交，则双链多核苷酸与另一多核苷酸可以是“互补”或“同源”。根据普遍接受的碱基配对规则，“互补性”或“同源性”(一个多核苷酸与另一个互补的程度)可根据预期彼此形成氢键的相对链中的碱基比例来定量。
术语“繁殖”或“扩增”是指使细胞或细胞群体生长。术语“生长”还指在支持培养基、营养物、生长因子、支持细胞或获得所需数量的细胞或细胞类型所需的任何化学或生物化合物存在下的细胞增殖。
术语“培养”是指细胞或生物在各种培养基上或之中的体外繁殖。应当理解，在培养物中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同(即，在形态、基因或表型上)。
如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，从而当将载体置于细胞内时可以例如通过转化过程来复制载体。载体可以是病毒的或非病毒的。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒、被修饰的杆状病毒、丘疹病毒或其他被修饰的天然存在病毒。用于递送核酸的非病毒载体的例子包括裸露的DNA、单独的或与阳离子聚合物结合的与阳离子脂质复合的DNA、阴离子和阳离子脂质体、DNA-蛋白质复合物和颗粒(包含与阳离子聚合物(例如异质聚赖氨酸、定长寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的DNA，在某些情况下被包含在脂质体中)、以及包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物的用途。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含待体内、离体或体外递送至宿主细胞的多核苷酸。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体等。α病毒载体(例如基于Semliki Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体)也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，Schlesinger andDubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439以及Ying,et al.(1999)Nat.Med.5(7):823-827。
在慢病毒载体介导基因转移的方面，载体构建体是指包含慢病毒基因组或其一部分和治疗基因的多核苷酸。如本文所用，“慢病毒介导的基因转移”或“慢病毒转导”带有相同的含义，并指借助于病毒进入细胞并整合其基因组到宿主细胞基因组而将基因或核酸序列稳定地转移到宿主细胞中的过程。病毒可以通过其正常的感染机制进入宿主细胞，也可以对其进行修饰，从而其与不同的宿主细胞表面受体或配体结合以进入细胞。逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息。但是，一旦病毒感染细胞，RNA就会逆转录成DNA形式，并整合到被感染细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式称为原病毒。如本文所用，慢病毒载体是指能够通过病毒的或类病毒的进入机制将外源核酸引入细胞的病毒颗粒。“慢病毒载体”是本领域已知的逆转录病毒载体的类型，与其他逆转录病毒载体相比，在转导非分裂细胞方面具有某些优势。参见，Trono D.(2002)Lentiviral vectors,New York:Spring-Verlag BerlinHeidelberg。
本发明的慢病毒载体是基于或衍生自核型病毒(含有MLV的逆转录病毒的亚组)和慢病毒(含有HIV的逆转录病毒的亚组)。例子包括ASLV、SNV和RSV，所有这些都已分为用于慢病毒载体颗粒生产系统的包装和载体成分。根据本发明的慢病毒载体颗粒可以基于遗传或其他方式(例如通过包装细胞系统的特定选择)的改变形式的特定逆转录病毒。
根据本发明的载体颗粒是“基于”特定的逆转录病毒，意为指该载体衍生自该特定的逆转录病毒。载体颗粒的基因组包含来自该逆转录病毒的成分作为骨架。载体颗粒含有与RNA基因组相容的必需载体成分，包括逆转录和整合系统。通常，这些将包括源自特定逆转录病毒的gag和pol蛋白。因此，尽管载体颗粒的大部分结构成分可能已经通过遗传方式或其他方式进行了改变以提供所需的有用特性，但它们通常将源自该逆转录病毒。但是，某些结构成分(尤其是env蛋白)可能源自不同病毒。可以通过在载体颗粒生产系统中使用不同的env基因以给予载体颗粒不同的特异性，来改变被感染或转导的载体宿主范围和细胞类型。
术语“启动子”是指开启特定基因的转录的DNA区域。启动子包括核心启动子，其是正确开启转录所需的最小部分的启动子，并且还可以包括调节元件，例如转录因子结合位点。调节元件可以促进转录或抑制转录。启动子中的调节元件可以是转录激活子或转录阻遏子的结合位点。启动子可以是组成型或诱导型的。组成型启动子是指始终活跃和/或不断指导基因转录高于基础转录水平的启动子。此类的非限制性例子包括磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子、SSFV、CMV、MNDU3、SV40、Ef1a、UBC和CAGG。诱导型启动子是能够被加入到细胞中或在细胞中表达的分子或因子诱导的启动子。在不存在诱导的情况下，诱导型启动子可能仍会产生基础水平的转录，但是诱导通常会导致蛋白质的显著增加。启动子也可以是组织特异性的。组织特异性启动子允许在具有适当转录因子以激活该启动子的特定细胞群体中产生蛋白质。
增强子是增加靶序列表达的调节元件。“启动子/增强子”是含有能够提供启动子和增强子功能的序列的多核苷酸。例如，逆转录病毒的长末端重复序列包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源的”增强子/启动子是与基因组中给定基因天然连接的增强子/启动子。“外源”或“异源”增强子/启动子是通过基因操作(即分子生物学技术)方式与基因并列放置的增强子/启动子，从而该基因的转录由所连接的增强子/启动子指导。
如本文所用，“干细胞”定义为具有在培养物中无限期分裂并产生特化细胞的能力的细胞。此时为了方便起见，将干细胞分为体细胞(成人)或胚胎细胞。体细胞干细胞是在分化的组织中发现的未分化细胞，可以自我更新(克隆)并(在一定的限制下)分化以产生其起源的组织的所有特化细胞类型。胚胎干细胞是来自胚胎的原始(未分化)细胞，具有成为多种特化细胞类型的潜力。胚胎干细胞是已经在体外条件下培养的细胞，其允许数月至数年增殖而不会分化。克隆是指与起源细胞(在这种情况下，是干细胞)在遗传上相同的细胞的品系。
“干细胞玫瑰花结”指干细胞簇，其在放大下表现为一簇花瓣。参见例如图8D。
细胞群体指超过一个表型和/或基因型相同(克隆)或不同的细胞的集合。基本同质的细胞群体是具有如通过预选标记物所测得的至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％相同的表型的细胞群体。
如本文所用，“胚胎干细胞”是指源自受精后但在妊娠结束之前形成的组织的干细胞，该组织包括胚胎前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，其在妊娠期间的时间被采取，通常但不一定在妊娠约10-12周之前。最常见的是，胚胎干细胞是源自早期胚胎或胚泡的多能细胞。胚胎干细胞可直接从合适的组织中获得，包括但不限于人类组织，或从已建立的胚胎细胞系中获得。“类胚胎干细胞”是指具有胚胎干细胞的一个或多个但并非全部特征的细胞。
神经干细胞是可以从包括人类的哺乳动物的成年中枢神经系统中分离出来的细胞。它们已示出生产神经元，迁移并发出轴突和树突状投射，并整合到先前存在的神经元回路中，并有助于正常的脑功能。在Miller(2006)The Promise of Stem Cells for NeuralRepair,Brain Res.Vol.1091(1):258-264；Pluchino et al.(2005)Neural Stem Cellsand Their Use as Therapeutic Tool in Neurological Disorders,Brain Res.BrainRes.Rev.,Vol.48(2):211-219；和Goh,et al.(2003)Adult Neural Stem Cells andRepair of the Adult Central Nervous System,J.Hematother.Stem Cell Res.,Vol.12(6):671-679中可以找到该领域的研究综述。
“分化”描述了非特化细胞获得例如心脏、肝脏或肌肉细胞等特化细胞特征的过程。“定向分化”是指操纵干细胞培养条件以诱导分化成特定细胞类型。“去分化”定义了可以还原到在细胞谱系内较不定向位置的细胞。如本文所用，术语“分化的或已分化的”定义了在细胞谱系内占据更加定向(“分化的”)位置的细胞。如本文所用，“分化为中胚层(或外胚层或内胚层)谱系的细胞”定义了分别成为被定向至特定的中胚层、外胚层或内胚层谱系的细胞。分化为中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞的例子包括但不限于成脂、生肌、成软骨、心源性、生皮、造血、血管原(hematopoetic)、肌原性、肾源性、生尿性、成骨性、心包性的细胞或基质。
如本文所用，术语“分化的或已分化的”定义了在细胞谱系内占据更定向的(“已分化的”)位置的细胞。“去分化”定义了可以还原到在细胞谱系内较不定向位置的细胞。诱导多能干细胞是去分化细胞的例子。
如本文所用，细胞的“谱系”定义了细胞的遗传，即其祖先和后代。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传方案中。
“多谱系干细胞”或“多能干细胞”是指自我复制以及复制来自不同发育谱系的至少两个已进一步分化的后代细胞的干细胞。这些谱系可以来自同一胚层(即中胚层、外胚层或内胚层)，也可以来自不同胚芽层。从多谱系干细胞分化而来的具有不同发育谱系的两个子代细胞的例子是肌原性细胞和成脂细胞(两者都是中胚层起源的，但是会产生不同的组织)。另一个例子是(外胚层来源的)神经源细胞和(中胚层来源的)成脂细胞。
“前体”或“祖细胞”旨在意为具有分化为特定类型细胞的能力的细胞。祖细胞可以是干细胞。祖细胞也可能比干细胞更具特异性。祖细胞可以是单能的或多能的。与成体干细胞相比，祖细胞可能处于细胞分化的后期。祖细胞的例子包括但不限于祖神经细胞。
“孤雌生殖干细胞”是指自卵的孤雌生殖活化产生的干细胞。产生孤雌生殖干细胞的方法是本领域已知的。参见，例如Cibelli et al.(2002)Science 295(5556):819以及Vrana et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(Suppl.1)11911-6。
如本文所用，“多能细胞”定义了可以产生至少两个不同的(基因型和/或表型)被进一步分化的子代细胞的较低分化的细胞。在另一方面，“多能细胞”包括诱导多能干细胞(iPSC)，其是从非多能细胞(通常是成年体细胞)人工衍生的干细胞，其历史上已经通过诱导一种或多种干细胞特异性基因的表达而产生。此类干细胞特异性基因包括但不限于：八聚体转录因子家族，即Oct-3/4、Oct-3/4、Oct-3/4、Oct-3/4、Oct-3/4、Oct-3/4；Sox基因家族，即Sox1、Sox2、Sox3、Sox 15和Sox 18；Klf基因家族，即Klf1、Klf2、Klf4和Klf5；Myc基因家族，即c-myc和L-myc；Nanog基因家族，即OCT4、NANOG和REX1；或LIN28。在Takahashi etal.(2007)Cell advance online publication 20November 2007；Takahashi&Yamanaka(2006)Cell 126:663–76；Okita et al.(2007)Nature 448:260-262；Yu et al.(2007)Science advance online publication 20November 2007；和Nakagawa et al.(2007)Nat.Biotechnol.Advance online publication 30November 2007中描述了iPSC的例子。
“类胚体或EB”是培养过程中形成的胚胎干细胞的三维(3D)聚集体，其可促进后续分化。当在悬浮培养中生长时，EB细胞形成被内脏内胚层外层包围的小型细胞聚集体。在生长和分化后，EB会发展成具有充满液体腔和外胚层样细胞的内层的囊状类胚体。
“组合物”旨在意为活性多肽、多核苷酸或抗体与惰性(例如可检测标记)或活性(例如基因递送载体)的另一种化合物或组合物的组合。
“药物组合物”旨在包括活性多肽、多核苷酸或抗体与惰性或活性载体(例如固体支持物)的组合，从而使该组合物适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包含任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂(例如油/水或水/油乳剂)以及各种类型的润湿剂。该组合物还可包含稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的例子，参见Martin(1975)Remington’sPharm.Sci.,15th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton)。
“对象”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，并且是指脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于鼠类、大鼠、兔、猿、牛、羊、猪、犬，猫、农场动物、运动动物、宠物、马和灵长类动物，特别是人类。除了可用于人类治疗之外，本发明还可用于兽医学治疗易患神经退行性疾病的伴侣哺乳动物、外来动物和家养动物，包括哺乳动物、啮齿类动物等。在一个实施方式中，哺乳动物包括马、狗和猫。在本发明的另一个实施方式中，所述人类是十八岁以下的青少年或婴儿。
“宿主细胞”不仅指特定的对象细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能会在后代中发生，因此此类后代事实上可能与亲本细胞不同，但仍包含在本文所用术语的范围内。
“治疗”疾病包括：(1)预防疾病，即使该疾病的临床症状不在可能易患该疾病但尚未经历或表现出该疾病的症状的患者中发展；(2)抑制疾病，即阻止或减轻疾病的发展或其临床症状；或(3)缓解疾病，即引起疾病或其临床症状的消退。
与术语“治疗”相关的术语“患有”是指已被诊断出具有或易患感染或易发生疾病的患者或个体。由于活动性或潜伏性感染，患者也可能被称为“有患病风险”。该患者尚未发展特征性疾病病理。
“有效量”是足以影响有益或期望结果的量。有效量可以以一次或多次给药、应用或剂量被施用。这样的递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间段、治疗剂的生物利用度、给药途径等。然而，应当理解的是，用于特定对象的本发明的特定剂量水平的治疗性药剂取决于多种因素，包括：所用特定化合物的活性，对象的年龄、体重、性别和饮食，给药时间，排泄速率，药物组合以及所治疗的特定疾病的严重程度和给药形式。通常可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。通常，最初来自体外和/或体内测试的剂量效应关系可以为患者给药的适当剂量提供有用的指导。通常，人们期望施用一定量的化合物以有效地达到与体外被发现有效的浓度相当的血清水平。这些参数的确定完全在本领域技术范围内。这些考虑因素以及有效的制剂和给药方法是本领域中已知的，并在标准教科书中进行了描述。与该定义一致，如本文所用，术语“治疗有效量”是足以抑制RNA病毒离体、体外或体内复制的量。
术语“给药”应包括但不限于：通过口服、肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内，ICV、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)给药，通过吸入气雾剂、阴道、直肠、舌下、尿道(例如尿道栓剂)、颅内给药，或局部给药途径(例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等)，可以单独或一起制成含有常规无毒适用于每种给药途径的药学上可接受的载体、佐剂、辅料和载体的合适剂量单位制剂。本发明不受给药途径、制剂或给药方案的限制。
亨丁顿氏病(HD)是遗传性疾病，会导致大脑中神经细胞的进行性衰竭(退化)。亨丁顿氏病对人的功能能力具有广泛的影响，包括运动和认知功能的丧失以及精神病。治疗或改善HD症状的目的在于改善患者的精神、认知或运动功能，或减少这种遗传性疾病的不良影响。疾病的症状和病程是本领域技术人员已知的，请参见mayoclinic.org/diseases-conditions/huntingtons-disease/symptoms-causes/syc-20356117，于2018年5月21日访问。
中枢神经系统(CNS)疾病或病症旨在影响一组神经病症，其会影响大脑或脊髓的功能结构，并可能导致大脑或脊髓中的一个或多个部分退化。非限制性例子包括HD、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、外伤性脑损伤、中风、自身免疫性疾病(例如多发性硬化、原发性或继发性进行性多发性硬化、复发缓解型多发性硬化症)、脑部炎症、贝尔氏麻痹、颈脊椎病、腕管综合症、脑或脊髓肿瘤、周围神经病变、格林-巴利综合征、脊髓性肌萎缩、弗雷德里希共济失调、肌萎缩性侧索硬化症和亨丁顿氏舞蹈病。治疗或改善CNS损伤的症状旨在改善患者的神经功能，减少遗传性或后天性疾病、损伤或失调的不良影响。该疾病的症状和病程是本领域技术人员已知的，请参见Hopkinsmedicine.org/healthlibrary/conditions/nervous_system_disorders/overview_of_nervous_sys tem_disorders_85,P00799，于2018年5月21日访问。
“神经退行性疾病或病症”是以神经系统的神经元变性(尤其是CNS中的神经元)为特征的疾病或表型。
“增强突触联系”旨在促进神经元或神经元受体之间的连接。
突触是两个神经细胞之间的连接，由微小的间隙组成，通过神经递质的扩散刺激传递穿过该间隙。
用于实施本发明的方式
本发明提供从人类胚胎干细胞(hESC)中制备人类神经元干细胞(hNSC)的方法，该方法包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或进一步由以下步骤组成：
a)从被培养于分化培养基中的类胚体(EB)的群体中分离至少一个干细胞玫瑰花结；
b)将被分离自步骤a)的玫瑰花环状结构的至少一个单个单元培养一定量的时间，并且在为生成至少一个玫瑰花结提供的条件下，直到至少一个玫瑰花结生成；
c)将来自步骤b)的玫瑰花结的单个单元分离成为单个细胞；以及
d)将被分离自步骤c)的至少一个单个细胞培养一定量的时间，并且在为生成hNSC的融合群体提供的条件下，直到生成hNSC的融合群体。
在一方面，从玫瑰花结中分离至少一个单个单元是手动进行的。在另一方面，从玫瑰花结中分离至少一个单个单元/细胞是酶促地进行的。在进一步的方面，通过以下方式中的一种或多种进行来自步骤a)的玫瑰花结的至少一个单个单元的分离：手动、酶促和/或数字化。在另一方面，步骤c)的至少一个单个细胞的分离是酶促地进行的。数字化地识别三维或二维图像的方法和技术在本领域中是已知的，参见例如美国专利号7,689,043、美国专利号6,907,140和美国专利号5,020,112。
在一个实施方式中，使步骤a)至c)中的一步或多步进行两次或更多次，这可以使用手动地或以高通量方式机械地中的一个或两个进行。在另一方面，玫瑰花结的分离是数字化地进行的。数字地识别三维或二维图像的方法和技术在本领域中是已知的，参见例如美国专利号7,689,043、美国专利号6,907,140和美国专利号5,020,112。
在一方面，类胚体是由可从BioTime获得的ESI-017细胞系产生的(参见esibio.com/esi-017-human-embryonic-stem-cell-line-46-xx/,上次访问于2018年6月6日)。
在本发明的一方面，该方法进一步包含在EB培养基中的超低附着表面上培养类胚体(EB)。在另一方面，该方法进一步包含在将EB在鸟氨酸/层粘连蛋白包被的表面上在步骤a)上进一步培养了有效量的时间之后，用N2培养基代替EB培养基。或者，该方法进一步包含在将EB在EB培养基中培养一定量的时间(有效地产生步骤a)的至少一个EB)之后，用N2培养基代替EB培养基。
可通过使在步骤c)中被分离的至少一个单个细胞在鸟嘌呤/层粘连蛋白包被的板上的N2培养基中培养有效量的时间以生成hNSC的融合细胞群体，来进一步修饰该方法。如本领域技术人员已知的，融合细胞群体是其中大量的细胞与该群体中的其他细胞接触的细胞群体。通过用有效量的N2培养基培养hNSC的融合群体，可以进一步修饰此方法。
本发明还提供通过如本文所述的方法制备的细胞或细胞群体。这些神经元细胞和已分化的细胞产生BDNF或过表达BDNF。
细胞群体可以例如通过插入转基因或通过CRISPR而被扩增和/或基因修饰。一方面，转基因是ApiCCT1、其片段(例如sApiCCT)或其每一个的等效物。细胞和/或转基因可以任选地被可检测地标记。可以使用已知的常规重组技术，通过将转基因插入载体中来插入转基因，该转基因在调控元件(例如启动子和任选地增强子元件)的控制下。含有转基因的细胞和/或载体可以被可检测标记。如下详述，将转基因sApiCCT插入hNSC的特定细胞群体中，以在其被植入作为治疗剂时为其提供进一步的保护。也可以将sApiCCT转基因插入hESC或其他干细胞衍生物中，包括但不限于，其他胚胎细胞系、胎儿来源的细胞系、间充质来源的细胞系、神经元来源的细胞系以及已分化的细胞类型。
进一步提供这些细胞的群体以及包含这些细胞的非人类动物。该群体可以是基本上同质的、基本上异质的或克隆的。该群体可以被可检测地标记。该群体可以与载体(例如药学上可接受的载体)组合。
进一步提供包含被分离的细胞以及例如载体的组合物。在另一方面，该组合物还包含防腐剂和/或低温储存剂。防冻剂的非限制性例子包括商业上可购买的DMSO、甘油，参见例如streck.com/collection/streck-cell-preservative/，最新访问于2018年5月22日。
该细胞可用于治疗方法。在一方面，提供通过施用有效量的如本文所述的细胞、群体或组合物中的一种或多种将转基因递送至对象的方法或在有需要的对象中基因编辑细胞的方法。在另一方面，通过向对象施用有效量的一种或多种细胞、群体或组合物，提供了在有需要的对象中治疗神经变性疾病或增强突触联系的方法。在另一方面，提供了在有需要的对象中治疗神经退行性疾病或增强突触联系或治疗CNS损伤的方法，所述方法包含向该对象施用有效量的一种或多种细胞、群体或组合物。可以使用任何适当的给药方法，本文提供了其非限制性例子。
神经退行性疾病的非限制性例子选自亨丁顿氏病、中风、CNS损伤、慢性脊髓损伤、脊髓损伤、动脉瘤、手术、动静脉畸形(AVM)、辐射、脊髓性肌萎缩、弗雷德里希共济失调、肌萎缩性疾病侧索硬化症(ALS)、肌肉硬化症、原发性或继发性进行性多发性硬化症、复发缓解型多发性硬化症、血管性痴呆、癫痫发作、脑血管痉挛、阿尔茨海默氏病、急性或创伤性脑损伤、脑部炎症，以及由于例如心肺骤停或接近溺死导致的脑缺氧或导致对CNS组织的急性物理损伤的任何其他CNS损伤和其组合。
在某些实施方式中，CNS损伤是由中风引起的损伤。“中风”意为因为在对大脑的血液供应或氧气的分布，所以导致对中枢神经系统的物理损坏的任何病症。这可能是因为局部缺血(血液供应不足或氧气不足)或因为出血，该局部缺血由血栓形成或栓塞引起。
试剂盒
还提供试剂盒。在一方面，该试剂盒包含hESC和以进行如本文所述方法的说明书。在另一方面，该试剂盒包含使用如本文所述的方法制备的神经元细胞和使用说明书。该试剂盒可进一步包含组合物和试剂，以实施试剂盒所提供的说明。
在一些实施方式中，本文所述的试剂可以被组装成药物的或诊断的或研究的试剂盒，以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的使用。在一方面，该试剂盒包含hESC和进行如本文所述的方法的说明书。在另一方面，该试剂盒包含使用如本文所述的方法制备的神经元细胞和使用说明书。该试剂盒可进一步包含组合物和试剂，以实施该试剂盒所提供的说明。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包含使用说明书。具体地，这样的试剂盒可包括本文所述的一种或多种试剂，以及描述这些试剂的预期应用和正确使用的说明书。例如，在一个实施方式中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并应用于对象的说明书。在某些实施方式中，试剂盒中的试剂为适合于特定应用和试剂的施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可能含有成适当浓度或数量的组分，用于进行各种实验。
试剂盒可以被设计来促进本文所述方法的使用，并且可以采取许多形式。试剂盒的组合物中的每一个，如果可适用，可以以液体形式(例如以溶液)或以固体形式(例如干粉)提供。在某些情况下，某些组合物可能是可组成的或可加工的(例如，成活性形式)，例如通过加入合适的溶剂或其他物质(例如水或细胞培养基)，其可能与试剂盒一起提供或没有与试剂盒一起提供。在一些实施方式中，可以在保存溶液(例如，冷冻保存溶液)中提供组合物。保存溶液的非限制性例子包括DMSO、低聚甲醛和
Figure BDA0002911354990000251
(Stem CellTechnologies,Vancouver,Canada)。在一些实施方式中，保存溶液含有一定量的金属蛋白酶抑制剂。
如本文所使用的，“说明书”可以定义说明书和/或推广的组成部分，并且通常涉及在所要求保护的方法或组合物的包装上或与之相关的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，从而用户将清楚地认识到该说明书与试剂盒相关联，例如视听(例如，录像带、DVD等)、互联网和/或基于网络的沟通等。在某些实施方式中，书面说明书采用的是规范药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书还可以反映用于动物施用的制造、使用、或销售的机构的批准。
在一些实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中含有本文所述的组分中的任何一种或多种。因此，在一些实施方式中，试剂盒可包括容纳本文所述的试剂的容器。该试剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。所述试剂可以被无菌制备、包装在注射器中并冷藏运输。或者，可以将其容纳在小瓶或其他容器中用于存储。第二容器可具有被无菌制备的其他试剂。或者，该试剂盒可以包括在注射器、小瓶、管或其他容器中预混合并运输的活性试剂。该试剂盒可具有所需来施用该试剂施用至对象的组份中的一种或多种，例如注射器、局部施用装置或IV针管和袋。
如本文所述的疗法可以与适当的诊断技术结合以识别和选择用该疗法的患者。例如，可以提供识别肌肉萎缩基因中的突变的基因测试。因此，具有突变的患者可以被识别为适合于治疗。
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
试验步骤
表1.生成ESI-017hNSC–材料
Figure BDA0002911354990000261
表2.N2培养基配方
Figure BDA0002911354990000262
表3.低温保存培养基配方
Figure BDA0002911354990000263
表4.额外的试剂
Figure BDA0002911354990000264
Figure BDA0002911354990000271
表5.溶液的制备
制备
1.将储存的聚-L-鸟氨酸1:3稀释在PBS中-/-(1份聚-L至2份PBS)
2.稀释层粘连蛋白，每1ml PBS 10ul储存的层粘连蛋白-/-(10ug/ml)
3.将100ug小瓶bFGF稀释在10ml水中＝10ug/ml或者10ng/ul
从ESC生成NSC的步骤
对用于类胚体(EB)形成的ESC进行传代
在第1天，使用P1000吸头从ESC培养物中手动地清除已分化的集落。然后从ESC培养物中将ESC培养基改为2mL/孔EB培养基。使用P1000吸头，以来回的移动(首先水平穿过孔，然后垂直穿过)刮掉ESC集落。用10mL血清移液管将每个孔的被刮取的集落转移至超低附着6孔板的一个孔中。使用EB培养基，用P1000微量移液器清洁ESC板的孔，并将洗涤液加入到超低附着6孔板的各个孔中，使最终体积为3mL/孔。将EB板移动至37℃和5％CO2的培养箱中。整个第2天，将EB平板在37℃和5％CO2下孵育。在第3天，进行EB培养基的半量更换。将漂浮的集落轻轻地旋流至其孔的中心。使用P1000微量移液器，从每个孔中取出1ml的培养基并丢弃。将1.5mL新鲜EB培养基轻轻地加回到每个孔中。然后将板放回培养箱。在第4天，不进行任何动作。在37℃和5％CO2中孵育的同时继续搅拌。在第5天，将源自ESC的EB铺板到层粘连蛋白包被的板上。在室温，将6孔板中适当数量的孔用以1：3稀释在PBS中的聚L-鸟氨酸包被1小时。根据表2制备N2培养基(制备后一周N2培养基良好)。1小时后，将聚-L-鸟氨酸溶液移除并丢弃。用PBS洗涤孔两次。孔用以1：100稀释于PBS中的层粘连蛋白在室温下包被1小时。使用10mL血清移液管将EB的悬浮液从每个孔转移到其自己的15mL锥形管中。在室温下使EB可以在悬浮液中沉积15分钟。对于包被的6孔板的孔，抽吸并丢弃层粘连蛋白。将1mLN2培养基加入到每个孔中。从每个15mL锥形管中吸出EB培养基。使用10mL血清移液管将EB轻轻重悬于2mL的N2培养基中。将EB加入到含有1mL的N2培养基的被包被孔中，总体积为3mL。将板轻轻地来回摇动以分散EB，并将其放入培养箱中。在第6天到第14天，进行被铺板的EB的玫瑰花结的形成以及分离(Ros1，第1轮)。在接下来的4-6天中检查细胞，以检查玫瑰花结的形成。根据形成的质量，可以随时采摘玫瑰花结。如果尚未形成玫瑰花结，则每隔一天更换N2培养基，直到玫瑰花结出现为止。为了采摘玫瑰花结，在室温下用以1：3稀释在PBS中的聚-L-鸟氨酸将12孔板包被1小时。1小时后，将聚-L-鸟氨酸溶液除移除并丢弃。用PBS洗涤孔3次。然后将孔用以1：100稀释在PBS中的层粘连蛋白在室温下包被1小时。如果需要，根据表2制备一瓶N2培养基。1小时后，去除层粘连蛋白，并向每个孔中加入1mL N2培养基以保持湿润，并保存在培养箱中以切割玫瑰花结。在第10-12天左右，可以看到从先前铺板的EB中形成的玫瑰花结。在解剖显微镜下，通过使用被连接到1mL注射器的18计量注射针描勾画玫瑰花结，将玫瑰花结进行解剖。然后使用p200微量移液器将混合物转移到层粘连蛋白包被的板的N2培养基中。转移后，将混合物在培养箱中保存过夜，并标记为Ros1。在培养箱中保存期间，每隔一天更换培养基。在第15到18天，将该玫瑰花结分散成单细胞。在将Ros1分离(第1轮)后的第两到第三天，将最干净的玫瑰花结分散成单细胞。从每个所需的孔中吸出N2培养基，并向每个孔中都加入0.5mL含EDTA的0.05％胰蛋白酶。将混合物在37℃和5％CO2下孵育90秒。90秒后，加入0.5mL DTI。使用1000μL微量移液器，使玫瑰花结在孔中分散，然后将每个孔的体积加入到其自己的15mL锥形管中。在整个传代中每个孔或“克隆”都保持分离。锥形管以1000RPM快速离心5分钟。加入上清液并丢弃。将每个团块重悬于1mL新鲜N2培养基中。将每个1mL悬浮液铺在聚L/层粘连蛋白包被的12孔板上的其自身的孔，并将该板标记为(第0代NSC)。将板放回培养箱并监测培养物，用新鲜的N2培养基每隔一天更换培养基。当细胞达到约85％融合时，使用与上述相同的步骤，但使用1mL 0.05％胰蛋白酶和1mLDTI，将每个“克隆”传递至6孔板的其自身的孔，用3mL N2培养基每隔一天更换培养基。将细胞维持并以106个细胞/孔的比率继续传代，或着手细胞的低温保存(下文讨论)。
NSC的低温保存
根据表3制备冷冻保存培养基或冷冻培养基，确保在使用前始终将冷冻培养基冷却至4℃。从培养箱中取回NSC板，并将其置于生物安全柜内。吸出旧的培养基并将其丢弃到废弃物容器中。向每个孔中加入1mL的0.05％胰蛋白酶，并在37℃下孵育90秒。90秒后，向每个孔加入1mL DTI以使胰蛋白酶失活。使用1000μL移液器吸头，上下吸取混合物，以将细胞从每个孔的表面洗掉，然后将混合物转移到15mL锥形管中。将15mL锥形管以1000RPM快速离心3分钟。将锥形管放回生物安全柜，并吸出上清液。将细胞重悬于5mL新鲜N2培养基中，并使用0.4％台盼蓝和血细胞计数器进行细胞计数。在台式离心机中将细胞以1000rpm离心3分钟。将适当体积的4℃冷冻培养基加入到细胞中，以使细胞浓度为3.0x10 6个细胞/mL。使用10mL血清移液管将1mL的在冷冻培养基中的细胞悬浮液加入到每个冷冻小管。一小瓶的没有细胞的冷冻培养基被制成用于冷冻探针。将小瓶盖紧并立即转移到预冷的控制速率冷冻机-冷冻架(freezer-freezing rack)中。将探针插入仅包含冷冻培养基的小瓶中，然后放入该架子中。将小瓶从控制速率冰箱转移到-80℃预冷的完整标记的冷冻箱中，然后立即转移到LN2储存器中。
小鼠
所有程序均依照《NIH实验动物的护理和使用指南》以及通过在UCI和UCLA、AAALAC认可机构的动物护理和使用委员会机构批准的动物研究方案。R6/2小鼠及其NT同窝小鼠(非转基因携带者C57B16/CBA)获得自在UCI(品系6494，
Figure BDA0002911354990000291
CAG重复序列)或UCLA(品系2810，
Figure BDA0002911354990000292
CAG重复序列)维持的繁殖集落。纯合Q140小鼠或WT(C57B16)同窝小鼠来自在UCLA处的繁殖集落，在此进行操作。将所有小鼠均按12/12小时光照/黑暗时间表饲养，自由采食食物和水。将小鼠分组以混合处理组饲养，以及仅单独饲养用于转轮跑步的小鼠。已证实R6/2小鼠(Laragen，Los Angeles,CA)的CAG重复序列长度，而Q140小鼠的频率分布没有显著差异(Hickey et al.,2012b)。对于HD模型，对结果中的差异的评估是基于先前的经验和已发表的结果(Hickey et al.,2005；Hockly et al.,2003)，并应用功效分析(G Power[psycho.uni-duesseldorf.de/abteilungen/aap/gpower3/])对于申请人行为学最低n＝10，生化分析最低n＝4。
hNSC的分离
hNSC的使用是由UCI、UCLA和UC Davis的人类干细胞研究监督委员会(hSCRO)批准的，并且细胞来源于Biotime ESI-017hESC。将hESC集落转移至具有Noggin的EB培养基，过渡至NP培养基，并将玫瑰花结切割出，分散，并用hNSC培养基铺板以生成hNSC(图8B)。手动地将玫瑰花结切割出并铺到生长因子降低的Matrigel包被的板中的NSC培养基中，然后使用Accutase进行分散并铺到有NSC培养基的聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的平板上。
移植手术
使用立体定向仪进行hNSCs或veh的双侧纹状体内注射，以及相对于bregma的坐标为：前后位，0.00；中外侧，±2.00；背腹侧，-3.25。麻醉小鼠，将其置于立体定向框架中，并使用5μL汉密尔顿微注射器(33gauge)，以0.5μL/min注射速度对其注射100,000个hNSC/侧(2μL/注射)或veh(2μL Hank平衡盐溶液，其具有20ng/mL人类表皮生长因子[STEMCELLTechnologies,#78003]和人类成纤维细胞生长因子[STEMCELL,#78006])。密封伤口，将小鼠恢复到有加热垫的笼子中。在手术的前一天，向所有小鼠施用免疫抑制剂，并在整个过程中继续使用。
行为学评估
R6/2
以半随机方式分配小鼠，并在6至9周之间进行行为测试。研究人对于用于测试和数据收集的基因型和处理采用盲法。为了最小化实验者的可变性，每个测试都由单一的研究人员实施。如Ochaba et al.(2016)先前所述，在R6/2小鼠中进行行为学任务。
Q140
除了转轮跑步之外，都使用雄性和雌性，其中因为发情周期会影响跑步活动所以在转轮跑步中仅使用雄性。基因型或处理对实验者是未知的。除了在黑暗时间段实施的转轮跑步外，所有测试均在明亮时间段进行。如Hickey et al.(2008)先前所述，在Q140小鼠中进行行为学任务。
R6/2脑切片中的电生理学
使用R6/2(品系2810，150±10CAG重复序列)和NT同窝小鼠，表现出与用于行为实验的品系6494相似的表型(Cummings et al.,2012)。步骤如Andre et al.(2011)所述，并有如本文详述的修改。
免疫组化和电子显微镜学
麻醉被植入hNSC 5周的雄性R6/2小鼠(n＝3)，并用EM固定剂(0.1M磷酸盐缓冲液[pH 7.4]中的2.5％戊二醛、0.5％多聚甲醛和0.1％苦味酸)灌注。然后在4℃下将大脑收集到EM固定剂中过夜，并在PBS中洗涤，直到通过使用振动切片机(Leica Microsystems)以60毫米穿过含有hNSC的纹状体连续切片(相当于自bregma+1.4至+0.14mm)(Franklin andPaxinos,2007)。使用二氨基联苯胺(DAB)(Sigma,St Louis,MO)和hNSC抗体(Stem121,1:100；StemCells)预包埋纹状体的IHC和用于EM的组织处理如先前所述(Spinelli et al.,2014；Walker et al.,2012)，并且将纹状体切片平包埋在两片ACLAR(ElectronMicroscopy Sciences,Hatfield,PA)之间在60℃的烤箱中过夜放置过夜以聚合树脂。将含有hNSC的区域从被包埋的切片中显微切割，然后将其超粘至蜡块(block)上用于薄切片。
使用数码相机(AMT,Danvers,MA)，以346,200的最终放大倍数，在DAB标记的结构(即hNSC标记的细胞，树突)的JEOL 1400透射电子显微镜(JEOL,Peabody,MA)上拍摄照片。由于DAB标记仅限于薄切片的前边缘，因此仅拍摄示出DAB标记的区域。R6/2小鼠中的生物化学、分子学和免疫组化分析。
通过过量戊巴比妥将小鼠安乐死，并用0.01M PBS灌注。从左半球切出纹状体和皮层，然后急速冷冻用于使用制造商((Life Technologies,Grand Island,NY)的步骤在TRIzol中分离RNA和蛋白质，或如下所述进行均质化。将另一半固定在4％多聚甲醛中，冷冻保护于30％的蔗糖中，并在用于IHC的滑动振动切片机上以40μm进行切割。将切片漂洗3次，并置于封闭缓冲液中1小时(PBS、0.02％Triton X-100、5％山羊血清)，并放置一抗在4℃封闭过夜(ON)。漂洗切片，在Alexa Fluor二抗中孵育1小时，然后使用Fluoromount G(Southern Biotechnology)载片(mounted)。一抗在补充实验步骤中列出。
可溶性/不溶性的分级分离
如先前所述(Ochaba et al.,2016)，处理纹状体组织。抗体：抗HTT(Millipore,#MAB5492；RRID:AB_347723)和抗泛素(Santa Cruz Biotechnology,#sc-8017；RRID:AB_628423)。使用来自NIH程序ImageJ和光密度测定法应用程序的软件对条带进行定量。
共聚焦显微镜和定量
使用lambda-strobing模式通过Bio-Rad Radiance 2100共聚焦系统对切片进行成像。图像表示单个共焦z切片或z堆栈。使用StereoInvestigator软件(MicroBrightField,Williston,VT)进行所有无偏见的立体评估。使用光学分馏器探针来估计平均的细胞、弥散性聚集体和包含体的数量。
RNA分离和实时qPCR
将纹状体在TRIzol(Invitrogen)中均质化，然后在RNEasy Mini试剂盒(Qiagen)中均质化。每个样品的RIN值>9(Agilent Bioanalyzer)。用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)，RT使用oligo(dT)引物和1mg总RNA。如Vashishtha et al.(2013)所述，进行qPCR。
Q140小鼠中的生物化学、分子学和免疫组化分析
处理后六个月，通过颈脱位法(n＝7冷冻)或多聚甲醛灌注(n＝5IHC)使Q140雄性安乐死。
IHC
用0.1M PBS和4％多聚甲醛灌注小鼠。将脑移除，在4％多聚甲醛中固定过夜后，低温保护在30％蔗糖中，冷冻，并在低温恒温器上切成40μm的冠状切片(Leica CM，1850)。在室温下将切片封闭1小时，然后使用一抗ON。几次洗涤后，将切片在Alexa Fluor二抗中孵育，并用DAPI复染。分别如Menalled et al.(2003)和Watson et al.(2012)所述，进行定量HTT聚集体和小胶质细胞的IHC。
HTT-染色的细胞核和聚集体
使用StereoInvestigator 5.00软件(Microbrightfield,Colchester,VT)(Hickey et al.,2012a)对切片进行分析。对于被绘制的纹状体轮廓，该软件设置200x 200μm的网格，并带有20x 20μm的计数框，其用于量化每个切片的每种类型的聚集体。
在Q140小鼠的纹状体中的IBA-1-阳性细胞的定量
使用Leica DM-LB显微镜实施分析，该显微镜使用所述用于反映激活的小胶质细胞直径(Watson et al.,2012)的StereoInvestigator软件(MicroBrightField)。对于以5倍放大倍数绘制的纹状体轮廓，该软件放置了200x 200μm的网格，在左上角具有20x 20μm的计数框，从而可以进行无偏见的采样和定量。
Q140小鼠的生物化学分析
按照生产商的说明书，使用Biosensis BDNF快速试剂盒(Biosensis BEK-2211,SA,Australia)进行用于ELISA的冷冻纹状体处理。
统计分析
R6/2小鼠的结果来自单一同生群，但除了电生理和EM数据外，它们来自不同的亚群；所有都使用同一批细胞。使用在研究之前的分析，确定数字具有足够强度(如上所述)。如使用严格分析所述，获取统计学显著性。所有发现都是可重复的。上面的图例中进一步详述了多种统计方法。显著性水平：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。在R6/2小鼠中，数据表示为平均值±SEM；行为学任务的统计测试使用单向ANOVA，随后是Tukey的Heff检测及事后Scheffe′、Bonferroni和Holm的多重比较。数据符合所用统计检验的假设，并且p值小于0.05被认为是有效的。将所有小鼠随机分配，并以随机方式用不知道基因型和治疗的个体进行任务。通过单因素方差分析，然后进行Bonferroni的多重比较检验，进行光密度测定结果的统计学比较。学生t检验用于来自EM48立体研究的聚集数量比较。紧扣中的显著性由费舍尔确切概率确定。对行为和事后数据进行显著性差异(p<0.05)，使用用Bonferroni事后检验的单向方差分析，使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software,SanDiego,CA)对Q140小鼠进行统计学分析。图中使用双向方差分析，然后进行Bonferroni事后检验，该图代表转轮/3分钟测试中的平均转数；并且使用自定义MATLAB函数的自主统计用于IBA-1分析。图上的所有误差线均代表SEM。
hNSC的分离。每日(D)培养如下。D1：使用胶原酶IV酶促地“分散”ESC集落，直到集落边缘开始升高。从孔中手动地刮取集落，转移至低附着平板，并在EB培养基(减去bFGF的ESC培养基)中培养过夜。D2：对EB培养基补充500ng/ml头蛋白(Noggin)和10μM SB431542，再培养2天。D4：更换培养基。D5：在相同培养基中，将EB铺到低生长因子的基质胶包被的6孔板上。D6：更换培养基，使用NP培养基以驱动NPC的分化。每两天更换培养基，直到第十二天。D12-14：在解剖显微镜下目视分离玫瑰花结，用18号针手动地切割，并铺到低生长因子的基质胶包被的6孔板中的NSC培养基中。2-3天后，使用Accutase将玫瑰花结分散，并铺到具有NSC培养基和Y27632化合物的聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的平板上。ESI-017hNSC细胞遗传学分析发现细胞核型稳定，没有观察到异常，并对CD271(Brilliant Violet 510--BDHorizon货号563451)、CD24(Brilliant Violet 711--BD Horizon货号563401)、Pax6(PE--BD Pharmingen货号561552)、Nestin(Alexa Fluor 647--BD Pharmingen货号560341)、SOX1(PerCP CY5.5--BD Pharmingen货号561549)、SOX2(V450--BD Horizon货号561610)、CD44(APC-H7--BD Pharmingen货号560532)、CD184(PE-CY7--Biolegend货号306514)或SSEA4(lexa Fluor 700--Invitrogen货号SSEA429)进行单色流式细胞术。
移植手术。使用立体定位仪进行hNSC或载体的双侧纹状体内注射，以及相对于Bregma AP的以下坐标：0.00ML：+/-2.00以及DV-3.25。将小鼠置于立体定位框架中，每侧注射100,000个hNSC(2μl/注射)或作为对照处理的载体(2μl有20ng/ml hEGF和hFGF的HBSS)，使用5μl Hamilton微注射器(33号)，注射速度为0.5μl/min。R6/2小鼠用异氟烷麻醉，Q140小鼠用戊巴比妥钠(60mg/kg在无菌0.9％盐水中的戊巴比妥，i.p.)麻醉。对于所有老鼠；为了维持麻醉的手术平面，通过鼻锥对小鼠施用异氟烷(1-2％于100％氧气中，0.5L/min)，在整个手术过程中给与氧气，并在电子控制的加热垫上保持15度的温度，使用直肠探针温度计(Physitemp)进行监测。通过可视化大脑区域内的针道，对所有动物确认了将注射物准确放置到靶标区域。用骨蜡在颅骨上密封伤口，并用皮骨结(dermabond)或缝合线封闭。手术后将小鼠放在单个笼子中的加热垫上，直到它们从麻醉中恢复。在对被植入hNSC和载体的R6/2和非转基因小鼠的手术前一天开始以10mg/kg的浓度腹腔给药每日单剂量的免疫抑制剂CSA。为了进一步免疫抑制小鼠，以10mg/kg给予i.p.每周一次的CD4抗体(BioXcell,Lebanon,NH)的额外剂量方案。Q140小鼠或Wt同窝小鼠接收CSA(2mg/kg/天)的免疫抑制，CSA通过皮下渗透微型泵(Alzet#1004)给药，该泵每月更换一次以确保整个研究过程中CSA的持续递送。移除和更换微型泵的手术如下。用异氟烷麻醉小鼠(在100％氧气中，3％用于诱导，而1.75％用于维持麻醉)。在对切口部位消毒后，通过背面的小切口移除微型泵，并在缝合切口之前植入新的微型泵。
R6/2：以半随机方式将小鼠分配到各组。根据任务，在6、7、8或9周龄时进行下面列出的行为学测试。每天将小鼠称重，随着处理未观察到显著差异。在实验测试和数据收集期间，研究人员对哪些小鼠被移植了hNSC采用盲法。为了最小化实验者的变异性，每个行为学测试都由单个研究人员实施。从使用卵巢移植的雌性小鼠(Jackson labs)在UCI处繁殖集落中获得小鼠。
使用转棒仪来测量前肢和后肢的运动协调和平衡，并使用300s的加速测定法在连续3天内测试小鼠。在6周龄和8周龄每隔一周两次进行转棒测试。对于爬杆测试，将小鼠的头朝下放置在杆上，然后将头先下降到杆的长度。测量了从放置起点下降的16个总时间。在7周龄和9周龄每两周两次进行爬杆测试。IITC生命科学仪器用于通过数字力传感器测量前臂抓力，该单位以1克为增量给出读数。在7和9周龄时每隔一周测量两次抓地力。
Q140：攀爬测试和爬杆测试。为了在攀爬期间评估运动协调性和自发性活动，将小鼠放置在铁丝网柱笼的底部并对自发性活动录像。对于爬杆测试，将每只小鼠面朝上放置在杆的顶部，并且对做出完全转身到向下位置计时，以及对从杆降落到其各自家笼中计时。
R6/2小鼠中的电生理学
简而言之，将小鼠麻醉，以基于高蔗糖的切片溶液进行心脏灌注，然后将冠状切片(300μm)转移到含有ACSF的培养室中。使用带有差分干涉对比光学器件的红外发光仪将MSN和NSC可视化。所有记录均在注射部位内或注射部位周围进行(被记录的MSN在150-200um之间与移植物相邻)。将生物胞素加入到膜片吸管(patch pipette)用于细胞可视化。在标准ACSF中的全细胞配置中记录自发性突触后电流。以无间隙模式记录膜电流。将细胞电压钳制在+10mV，并在ACSF中记录自发性抑制性突触后电流(sIPSC)。在ACSF中以-70mV(基线)记录了自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)，并且在存在GABAA受体阻滞剂bicucullinemethobromide(Tocris,M inneapolis,MN)的情况下，来分离谷氨酸能兴奋性事件。使用MiniAnalysis软件(6.0版，Synaptosoft,Fort Lee,NJ)分析自发性突触电流。记录后，将切片固定，然后在4℃转移至30％的蔗糖中，直到进行IHC处理。为了识别生物胞素填充的记录细胞和hNSC，将固定的切片洗涤，透化并封闭4小时，然后与SC121(1：1000，StemCells，Inc.)一起孵育。洗涤后，将切片在山羊抗小鼠Alexa-488(1：1000，Life Technologies，Carlsbad，CA货号：A-11001)中孵育，并且将链霉亲和素与Alexa-594(1：1000，LifeTechnologies货号：S11227)缀合。洗涤切片，安装载片并用Zeiss LSM510共聚焦显微镜将细胞可视化。
R6/2小鼠中的生物化学、分子免疫组化分析
共聚焦显微镜和定量。用使用lambda-strobing模式的Bio-Rad Radiance 2100共聚焦系统对切片成像。图像表示单个共聚焦Z切片或Z堆栈。使用StereoInvestigator软件(MicroBrightField,Williston,VT)进行所有无偏差的立体评估。使用光学分馏器探针来估计平均细胞数、弥散聚集体数和内含体数。保护区设置为测得厚度的3％，最小光学解剖器高度为14μm。轮廓跟踪以5x目标进行，计数以100x目标进行。对于每个切片，在距干细胞膜片边缘约70μm处进行追踪。在整个纹状体的6个切片每第3个切片(40μm冠状切片)中进行计数，其中在Bregma 0.5mm和Bregma-0.34mm之间可以看到Ku80标记的细胞。所有计数都是在仅一个脑半球中使用50x50μm计数框架和250x250μm采样网格进行的。每个“单独”小鼠的CE值在0.03至0.06之间。首先使用具有镍的ABC试剂盒和DAB底物试剂盒(VectorLaboratories)对切片进行Ku80染色，然后仅使用ABC和DAB试剂盒对EM48染色。将切片用甲酚紫染色以进行非干细胞核染色。使用相同的立体学参数来对被植入载体的小鼠的聚集体和细胞进行计数。使用对被植入的R6/2脑切片中的Ku80阳性细胞的这种立体评估，ESI-017NSC植入物的存活数示出雄性小鼠(n＝3)中平均63,975个细胞以及雌性小鼠(n＝3)中平均18,673个细胞，相当于最初被移植细胞的64％(雄性)和18.6％(雌性)。小鼠(n＝6，3只雄性和3只雌性)中平均共有41,323个细胞，相当于最初被移植细胞的～41％。雄性和雌性在被植入细胞数量上的差异可能是由于在5周时植入较小雌性的技术困难。
用于IHC的一抗；GFAP(Abcam ab4674)、NeuN(Millipore MAB377)、SC121(STEM121人类特异性胞浆标记物，Clontech AB-121-U-050)、Ku80(Abcam,Cambridge,UnitedKingdom ab80592)、Doublecortin(Millipore AB2253)、Olig2(R&D Systems AF2418)、BIII微管蛋白(Abcam ab107216)、MAP-2、、(Abcam ab5392)、BDNF(Icosagen，329-100)和EM48(Millipore MAB5374)。
RNA分离和实时定量PCR。使脑组织在TRIzol(Invitrogen)中匀浆化，并使用RNEasy Mini试剂盒(QIAGEN)分离总RNA。将DNase处理并入RNEasy程序中，以移除残留的DNA。每个样品的RIN值>9(Agilent Bioanalyzer)。使用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)，使用寡(dT)引物和1μg总RNA进行逆转录。如先前所述(Vashishtha,Ng etal.2013)进行定量PCR(qPCR)，对ddCT值进行定量并针对RPLPO进行分析。用于扩增R6/2-Htt转基因的引物是：oIMR1594：5′-CCCCTCAGGTTCTGCTTTTA-3′，oIMR1596：5′-TGGAAGGACTTGAGGGACTC-3′；RPLPO正向：5'-TGGTCATCCAGCAGGTGTTCGA-3'，RPLPO反向：5'-ACAGACACTGGCAACATTGCGG-3'。使用的其他引物是：巢蛋白，F5'TCAAGATGTCCCTCAGCCTGGA3'R 5'AAGCTGAGGGAAGTCTTGGAGC3'；BDNF F5'TATGCGCCGAAGCAAGTCTCCA3'R 5'CATCCAAGGACAGAGGCAGGTA3'；以及DCX，As 5'GTAAAGCCAACCCTGTGTCG3'S 5'TCCGCTCCAAAATCTGACTC3'。
Q140小鼠中的免疫组化分析
用于IHC的一抗：HNA(Millipore MAB1281)、DCX(abcam ab18723)、GFAP(DakoZ033401)或突触素(Millipore 04-1019)。用于HTT聚集体定量的IHC使用如(Menalled etal.,2003)所述的单克隆抗体EM48(Millipore MAB5374)，并且小胶质细胞使用如(Watsonet al.,2012)所述的兔抗Iba-1(Wako 019-19741)。对于细胞计数，在6个冠状切片的整个纹状体区域中计数HNA+细胞。定量了2100个HNA标记的细胞19，并用神经元标记物(DCX,Abcam ab18723)或神经胶质标记物(GFAP,Dako Z033401)双重标记那些细胞的比例。最终数量被表示为每组5只小鼠的平均值±SEM。
当被移植到R6/2小鼠中时ESI-017hNSC会修饰行为、存活和分化
为了评估hNSC移植在HD转基因模型中的功效，申请人使用了外显子-1HTT R6/2小鼠(rv120 CAG重复序列)(Cummings et al.,2012)，这些小鼠展示了快速进展性运动和代谢缺陷以及早期死亡(rv12–14周)(Mangiarini et al.,1996)，并可以提供临床前研究中治疗范例的初步评估(Hickey and Chesselet,2003；Hockly et al.,2003)。ESI-017hNSC改善了行为学。
在图8A和8B中描述了GMP级hNSC品系的制造过程和质量控制图。流式细胞术表明对hNSC增殖和多能性标志物进行了适当的染色(图8A)。免疫细胞化学证实了神经外胚层干细胞标记物巢蛋白的染色(图8C)。以冷冻等分试样(UC Davis)的形式获取ESI-017hNSC，复苏并在不传代的情况下使用与GMP设施相同的培养基试剂培养，然后给药。通过纹状体内立体定向递送每半球100,000个hNSC，对五周龄的小鼠进行给药。包括雄性(M)和雌性(F)R6/2，以及非转基因(NT)年龄匹配的同窝小鼠和载体对照(veh)(n＝8只R6/2hNSC M、6只R6/2hNSC F、7只NT hNSC M、7只NT hNSC F、7只R6/2veh M、6只R6/2veh F、8只NT veh M和6只NT veh F)。对所有小鼠施用免疫抑制。进行行为学分析，并在行为学测试后立即在9周龄时将小鼠实施安乐死。
如前所述(Mangiarini et al.,1996)，Veh处理的小鼠发展出与HD相关的行为。简而言之，在5周龄时，R6/2小鼠的行为与NT小鼠的行为难以区别。到8周时，神经系学异常包括进行性典型的后肢理毛运动(hind limb grooming movement)、紧扣(clasping)和不规则步态。当通过尾巴被举起时，正常小鼠将张开后肢和前肢，如果老鼠将四肢紧抓住其腹部，则其被认为“紧扣”。在所有hNSC治疗的小鼠中观察到R6/2紧扣的发作延迟；在植入后3周veh处理的小鼠紧扣。在这个时间点hNSC处理的小鼠没有紧扣，在安乐死(植入后4周)时，只有50％的hNSC处理的小鼠紧扣(图9)。进行了两个运动测定。转棒(Rotarod)测试在加速的旋转棒上行走的能力。在转棒表现上，hNSC处理的R6/2小鼠示出超过veh处理的R6/2小鼠的统计学上的显著改善(植入后1周改善30％，p<0.01；植入后3周改善19％，p<0.05)(图1A)。爬杆测试(pole test)比较在垂直杆上下落时的时间；与NT小鼠相比，R6/2小鼠的下降潜伏期更长。在植入后4周，在R6/2治疗组之间观察到统计学上显著的改善(p＝0.02)(改善25％，图1B)。抓力仪也用于评估神经肌肉功能和运动协调，植入后4周，hNSC处理产生了显著改善(p＝0.02，改善16％，图1C)。
ESI-017hNSC存活率、迁移和分化
植入后4周对将小鼠安乐死并收集大脑，其中一半固定后用于组织学，另一半快速冷冻用于生物化学。hNSC主要聚集在针头轨迹周围，并保留在纹状体中(图1D)；一些在皮层中，少量迁移到在皮层和纹状体区域之间的微环境(niche)(脑胼胝体/白质束)(图10)。使用人类标记物SC121(胞质)或Ku80(细胞核)，主要用早期神经元标记物双皮质素(DCX)将细胞染色(SC121，图2A合并为黄色；Ku80，图2B和2C)。一些细胞可能分化为星形胶质细胞表型(神经胶质纤维酸性蛋白[GFAP])(图2B)。在植入位点周围还存在非人GFAP阳性免疫染色(图2A和2B)，其潜在地代表了小鼠神经胶质细胞瘢痕。用βIII-微管蛋白(图2D和10B)和微管相关蛋白2(MAP-2)(图2E和10C)证实了hNSC向神经元限制性祖细胞的分化，但缺乏与NeuN的共定位(图2F)表明没有有丝分裂后神经元。使用在一个半球中的Ku80阳性细胞的体视学评估，hNSC植入物的存活数示出平均为41,323个细胞(n＝6，雄性3只，雌性3只)，大约相当于最初被移植的100,000个的41％。
植入ESI-017hNSC可预防R6/2小鼠中的皮质纹状体超兴奋性
申请人接下来评估了电生理活性。在第5周，对雄性和雌性小鼠在纹状体植入100,000个hNSC(n＝18)或veh(n＝16)。植入后4-6周申请人记录在急性脑切片中的hNSC(图3A和3B)。hNSC示出未成熟细胞的基本神经元特性，其膜电容显著小于宿主MSN(hNSC 22.0±1.8pF，n＝31与MSN 71.3±3.5pF，n＝44相比；p<0.001，Student's t检验)，并且显著更高的膜输入电阻(hNSC 2804.8±203.0MU与MSN 163.8±15.1MU相比；p<0.001，Student's t检验)。hNSC示出自发兴奋性突触后电流和自发抑制性突触后电流(sEPSC和sIPSC)，表明它们从宿主组织或其他植入的hNSC中接收到突触输入。然而，与MSN相比，频率要低得多。一些hNSC还自发生产动作电位，表明它们可能影响宿主神经元和邻近的hNSC(图3B)。
与NT小鼠相比，在来自有症状R6/2的MSN中发生电生理改变，包括固有膜性质中的变化和降低的兴奋性突触活性(Cepeda et al.,2003,2007)。hNSC植入并未显著地改变R6/2小鼠中的膜特性、平均sEPSC频率(1.1±0.1Hz对1.4±0.2Hz)或MSN的平均SIPSC频率。R6/2小鼠还展现出皮质锥体细胞兴奋性的增加以及发生癫痫放电和癫痫发作的倾向(Cummings et al.,2009)。通过出现大幅度的EPSC和高频率的爆发，尤其明显的是在与sEPSC频率中的增加一致的GABAA受体的阻断延长之后，在纹状体MSN中示出皮质超兴奋性(Cepeda et al.,2003；Cummings et al.,2009)。与veh小鼠(28.6％，16/56)相比，在hNSC植入的小鼠(20.5％，9/44)中，较小比例(无统计学显著性)的MSN展现出皮质兴奋性增加。然而，在该种群之内sEPSC频率的增加在被植入hNSC的R6/2小鼠中并未发生。事件间间隔时间图的累积概率分布向右移动(p<0.001)，表明当GABAA受体被阻滞时hNSC可以减少从皮质到纹状体的过度兴奋输入(图3E和3F)。
宿主组织与R6/2小鼠中被植入的ESI-017hNSC进行潜在的突触联系
申请人利用免疫组化(IHC)和电子显微镜(EM)来检查来自宿主的神经末梢是否与hNSC进行突触联系。申请人发现源自宿主的未标记的神经末梢的例子，其与被植入的和免疫标记的hNSC进行潜在的对称突触联系(图4A)。神经末梢内的少量突触小泡非常靠近突触前膜，表明潜在的小泡释放区域(hNSC的DAB标记遮盖了联系)。另外，申请人发现源自宿主的未标记的神经末梢进行明显不对称的联系(图4B)，表明是兴奋性突触联系。总体而言，申请人发现源自宿主的未标记神经末梢中有44.5％(n＝71)与被标记的hNSC进行非对称联系，而48.3％(n＝69)与标记的hNSC进行对称联系。在源自与被标记hNSC并列的宿主的剩余的7.2％(n＝11)的未标记神经末梢中，不能确定其联系的确切性质(不对称与对称)。
ESI-017hNSC在Q140基因敲入小鼠中挽救行为学、存活和分化
接下来，申请人确定了hNSC是否也可以改善进展缓慢的全长HD小鼠模型的缺陷。Q140小鼠表达被修饰的小鼠/人类外显子1，该外显子具有被插入到小鼠亨丁顿基因中的140个重复序列(Menalled et al.,2003)。纯合子小鼠在运动测试中表现出早期异常，该异常为在1.5个月龄的攀爬缺陷以及认知缺陷(Hickey et al.,2008；Simmons et al.,2009)，以及4个月左右的可见的HTT聚集(Menalled et al.,2003)。在1年时检测到纹状体萎缩，在22个月时纹状体细胞损失35％(Hickey et al.,2008)。以每半球100,000个hNSC对每组的24只2个月龄的纯合雄性和雌性小鼠进行给药，双侧立体定向递送至纹状体(n＝12/性别)，并对年龄相匹配的Q140(n＝12/性别)和野生型(WT)(n＝12/性别)对照小鼠注射载体。所有小鼠均被免疫抑制。行为测试在1.5月龄时开始(细胞移植前)，并且将小鼠在移植后6个月、8个月时安乐死。除了转轮跑步之外，在所有老鼠上进行行为学测试，因为发情周期会影响跑步活动故只使用雄性(Hickey et al.,2008)。在Q140小鼠中观察到旷场中的自发活动的早期缺陷以及在爬笼测试中自发运动的降低；然而，hNSC处理并不能挽救表现(图11)。
在爬杆测试中，与WT对照相比veh处理的Q140小鼠转身时间更长(p＝0.004)；相反，hNSC处理的Q140小鼠显著优于对照Q140小鼠(p＝0.04)，并且不再与WT显著不同，表明移植后3个月的有益作用(图5A)。如Hickey et al.(2008)所报道，5.5月龄的雄性Q140小鼠在跑步速度上有极大的缺陷(每3分钟转动)，持续2周是显著的(图5B)。在hNSC处理的Q140小鼠在处理后观察到转轮跑步的持久性改善，与veh处理的小鼠相比示出平均转轮跑步活活动性的进行性增加(图5B和5C)。申请人得出的结论是，hNSC给药改善了在Q140小鼠中观察到的某些运动缺陷。
新物体识别(NOR)是依赖皮质的认知测试，其需要学习和记忆(识别)，并利用小鼠对研究新物体超过熟悉的物体的癖好。如Simmons et al.(2009)报道，在植入后3个月和5个月内，与veh注射的WT小鼠相比，Veh注射的Q140小鼠展现出NOR中的显著的损伤(分别为p＝0.003和p＝0.03)。在Q140小鼠中的hNSC的纹状体移植在植入后5个月时挽救了认知障碍(p＝0.03)，但是更早则没有(图5E和5F)。
在治疗后6个月，将veh和hNSC移植的Q140雄性小鼠的亚组(每组n＝5)安乐死以进行IHC分析。由人类细胞核特异性抗体(HNA)识别的hNSC移植后6个月存在，且大多数局限于纹状体中的注射轨道中(图5G a，b)。在六个冠状切片的整个纹状体区域中计数HNA阳性细胞数，并计算了用DCX或GFAP双重标记的细胞(来自每组5只小鼠的平均数据±SEM)。100,000个hNSC中约25％存活，其中大多数(84％±2％)是GFAP阳性(图5Gb，c)，较小部分(16％±2％)是DCX阳性(图5Ge，f)。
ESI-017hNSC移植增加HD小鼠中的BDNF水平
增加水平的神经营养生长因子和随后增加的突触连接性涉及NSC移植后观察到的行为学改善有关(Blurton-Jones et al.,2009)。此外，对于多种HD小鼠模型和人类HD大脑，BDNF的降低已被证明(Zuccato et al.,2011)。因此，我们评估BDNF水平作为神经营养作用的标记物。在R6/2hNSC小鼠中，IHC和共聚焦显微镜术表明BDNF与DCX阳性hNSC共同定位，表明已分化的细胞产生BDNF(图6A)。实际上，仅在变成DCX阳性后，体外生长并且已分化的hNSC才产生BDNF。在Q140 hNSC小鼠中，通过ELISA对雄性小鼠亚组(n＝6/组)中的BDNF进行定量。与WT相比，在Q140小鼠中纹状体BDNF降低，但是与veh相比，在hNSC处理中观察到BDNF水平显著增加，将其恢复至WT水平(图6C)。
鉴于神经营养信号传导可以增强突触活性，如前所述(Richter et al.,2017)，通过IHC和使用微阵列扫描仪的定量，我们检查了所有被灌注的Q140动物(n＝5/组)纹状体中突触标记物突触素的水平。hNSC处理的Q140小鼠与veh处理的Q140小鼠的比较，揭示了hNSC小鼠中突触素的显著增加(图13A，定量在图13B中)。
这些结果表明，通过增加神经营养作用(包括BDNF)，被移植的hNSC可部分地改善突触连接性。
ESI-017hNSC在Q140小鼠中的处理降低了小胶质细胞的激活
用电离的钙结合衔接分子1(Iba-1)抗体对来自Q140小鼠(n＝5/组)的纹状体切片进行染色，该抗体可识别静息和反应性小胶质细胞。小胶质细胞(Microglial soma)的大小与激活状态细胞的形态有关(Watson et al.,2012)，并且在Q140小鼠纹状体中观察到Iba1阳性细胞直径的显著增加(强小胶质细胞应答)。由hNSC显著地降低了该应答(图6D)。hNSC植入的R6/2小鼠中的类似分析没有示出纹状体中的显著变化(图13)，并且可能是由于相对局部的作用或中等水平的被激活的小胶质细胞引起的。
ESI-017hNSC移植减少了mHTT的积累和聚集体
HD病理学的特点是存在HTT内含体，其可反映被改变的蛋白质稳态。因此，我们在来自R6/2和Q140小鼠的大脑切片进行了无偏差的体视学评估。对于R6/2小鼠，首先用镍增强的DAB(黑色)对切片进行Ku80染色，然后使用不含镍的DAB对HTT(EM48)进行染色，然后对非hNSC细胞核用甲酚紫复染色。图7A示出了在hNSC植入物附近进行体视学的区域；远离该植入物的区域在突变型HTT(mHTT)积累或聚集体中未示出显著差异。结果表明，与veh相比，被植入hNSC的R6/2小鼠在注射部位附近具有降低的弥漫性染色和降低的内含体数量(图7A和7B)。
在Q140小鼠的纹状体中也观察到聚集体数量明显降低(图7C)。治疗后6个月，与用veh处理的小鼠相比，hNSC处理的Q140小鼠具有较少被弥漫性染色的细胞核(p＝0.0102)，以及较少神经纤维网聚集体(p＝0.0239)，但细胞核内含体和微聚集体均没有减少(分别为p＝0.0753和p＝0.372)(图7D)。该结果表明hNSC递送调节了HD相关的病理。在R6/2(图10D)或Q140小鼠中，在被移植细胞中或其附近没有观察到内含体的获得。hNSC移植降低mHTT和泛素化蛋白的致病性积累
申请人接下来调查了hNSC处理对高分子量(HMW)mHTT种类和R6/2大脑中积累的泛素修饰蛋白的影响。这些不溶性蛋白质的减少对应于R6/2小鼠中的改善的行为学结果(Ochaba et al.,2016)。对有和没有hNSC移植的NT和R6/2纹状体去污剂不溶性级分的评估，表明R6/2纹状体中被累积的mHTT水平显著地增加，而与用veh处理的小鼠(图7E和7F)相比，R6/2纹状体中用hNSC的处理使不溶性HTT积累降低了约70％，这不应归于被改变的mHTT转基因mRNA表达(图14)。与NT小鼠相比，在R6/2纹状体中显著地增加被积累的泛素缀合蛋白质，并且与veh处理的小鼠相比，hNSC处理降低了R6/2小鼠纹状体中的不溶性泛素缀合蛋白质(图7E和7F)。在被处理的NT小鼠中未检测到显著差异。
CCT/TRiC(TCP1环状复合物)分子伴侣是寡聚分子伴侣，其可结合并折叠新翻译的多肽。CCT/TRiC表达可预防在多个HD模型系统中的截短的mHTT聚集体(Tam,S.,et al.,Thechaperonin TRiC controls polyglutamine aggregation and toxicity throughsubunit-specific interactions.Nature Cell Biol,2006.8(10):p.1155-1162)。一个亚基CCT1的过度表达足以抑制体外和细胞内的聚集，并减少mHTT介导的细胞毒性(Tam,S.,etal.,The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotesthe conformational switch to aggregation.2009.16(12):p.1279-1285)。令人惊讶的是，20kDa酵母CCT1的顶端结构域(ApiCCT1)足以在体外抑制重组mHTT的聚集。申请人的数据示出，重组ApiCCT1 ApiCCT1r可减少细胞中的HD表型(Sontag,E.M.,et al.,Exogenousdelivery of chaperonin subunit fragment ApiCCT1modulates mutant Huntingtincellular phenotypes.Proc Natl Acad Sci U S A,2013.110(8):p.3077-82)并且挽救HD小鼠原代神经元的共培养物中的BDNF运输缺陷(Zhao,X.,et al.,TRiC subunits enhanceBDNF axonal transport and rescue striatal atrophy in Huntington'sdisease.Proc Natl Acad Sci U S A,2016)。重要的是，这种外源性应用的ApiCCT1r被吸收到培养细胞和原代神经元的细胞溶质中以发挥作用(Sontag et al,Zhao et al)，这表明如果可以将该蛋白递送至疾病组织，则ApiCCT1可能被细胞吸收并具有有益的效果。即使在2周后，也可检测到ApiCCT1到R6/1纹状体中的单次直接注射，并且高分子量和聚集的HTT水平降低。在更近期的初步数据中，病毒介导的sApiCCT1的递送或分泌ApiCCT1的小鼠NSC的递送在HD小鼠体内提供了改善。这些数据表明，连续ApiCCT1的递送可能具有神经保护作用。
病毒介导的ApiCCT1的递送在体内是有效的。
为了评估体内sApiCCT1的持续传递，在一项小型预备研究中测试了AAV2/1介导的sApiCCT1递送用于R6/1小鼠中的mHTT积累的影响，sApiCCT1表达具有～115重复序列的人类mHTT的外显子1，并且展示出与R6/2相比较慢的疾病进展过程[24](在图15A中构建体)。由于R6/2小鼠中的表型迅速发作以及AAV2/1达到完整表达的2-3周，所以在疾病进展过程中更早地递送病毒对于实现病理表型的最大校正可能是必不可少的。因此，在5周龄时向R6/1小鼠进行了双侧纹状体内注射(表达sApiCCT1或mCherry对照的AAV2/1 12x109个基因组拷贝)，并在17周龄时收获组织。被注射sApiCCT1的动物示出寡聚mHTT降低约40％(图15B&C)。通过体视学的分析还揭示可见内含体减少约40％(图15E)，尽管这种影响在统计学上不显著，大概是由于样本量不足。这些动物在16周龄时展现出在扣紧行为中的显著改善；该测定法指示运动障碍(数据未显示)。使用更大的样本量(每种情况约～20个)重复进行该研究。注射AAV2/1-sApiCCT1的动物在10、12和14周时示出在转棒任务中的显著改善，该任务测量运动协调和平衡(图15F；10和12周数据未显示)。这些动物在扣紧行为中还示出与先前的研究一致(数据未显示)改善。综上所述，这些研究表明，连续递送sApiCCT1足以改善HD小鼠的行为学结果并减少mHTT病理学。
病毒转导的hNSC产生被分泌的ApiCCT1，其进入Htt14A2.6 PC12细胞并影响寡聚mHTT种类
申请人进行了小型的预备研究，以测试ESI-017hNSC的sApiCCT慢病毒转导，以确定合适的转导效价，并检查ApiCCT的产生以及对突变型HTT聚集的影响。简而言之，将ESI-017hNSC培养在6孔板中，然后用sApiCCT慢病毒以0、5、10和15的感染复数(MOI)转导。将细胞培养48小时，收集培养基并收集细胞用于蛋白质分析。图16A示出HA标记的ApiCCT的Western分析，并表明转导的ESI-017hNSC正在产生ApiCCT，并且产量随着病毒MOI的增加而增加。从被转导的hNSC中收集的培养基被加入到Htt14A2.6PC12细胞培养基中，以确定被转导和分泌的ApiCCT可以进入相邻细胞，如先前所述(Sontag PNAS,2013)。在诱导剂松甾酮的存在下，这些细胞在48小时内表达截短形式的被扩增的重复HTT外显子1蛋白(103Qs)，该蛋白在C末端融合至增强的绿色荧光蛋白(GFP)。诱导和条件培养基应用后48小时，洗涤，收获细胞并进行Western分析。结果表明，来自被处理的14A2.6细胞的细胞裂解物含有适当分子量的HA标记的蛋白，其为ApiCCT(图16B)。为了评估ApiCCT的条件培养基递送是否对特定的突变型Huntingtin(mHTT)聚集种类有影响，申请人首先评估了单体可溶性HTT片段的水平是否改变。通过使用针对GFP的抗体的Western分析，检查了来自相同实验的HTT单体水平(图16C)。ApiCCT1似乎不会改变mHTT单体水平的表达，表明ApiCCT不会改变单体突变型HTT(mHTT)的稳态水平，并且也似乎不影响被诱导的mHTT的基因表达。不溶性HTT聚集体和mHTT低聚物是HD的特点。尤其是，寡聚mHTT种类可能代表了受影响神经元中的毒性来源。因此，申请人测量了mHTT寡聚物以确定ApiCCT1的递送是否影响如先前所证明随着直接递送纯化的ApiCCT1蛋白的这些形式的积累。使用SDS琼脂糖凝胶电泳(AGE)来解析寡聚种类，因为这种方法似乎优先解析mHTT的可溶性纤维状寡聚体。将来自细胞裂解物的等量蛋白质上样到SDS-AGE凝胶上。使用ImageJ获得光密度测量结果，ApiCCT1仅在最高MOI时引起mHTT低聚物水平的降低(＞10％)(图16D)。但然而在MOI 10和15时都减少了涂片长度(smear length)。这些数据表明，hNSC分泌的ApiCCT1能够减少邻近细胞中寡聚mHTT的形成，从而再现了我们已公开的纯化ApiCCT1的结果。这些结果验证了可用于慢病毒转导hNSC的GMP生产中采用的方法，并确立了hNSC递送的潜力。在植入小鼠后病毒转导的hNSC产生被分泌的ApiCCT1
如上所述，在UCI培养ESI-017hNSC。用慢病毒以MOI 15转导hNSC 48小时，然后如上所述将其移植到五周龄的小鼠中。包括雄性和雌性R6/2和非转基因年龄匹配的同窝小鼠和载体对照。对所有小鼠施用免疫抑制。在9周龄时将小鼠实施安乐死并收集大脑，其中一半固定后用于组织学，另一半快速冷冻用于生物化学。如对hNSC所述，hNSC-ApiCCT植入的细胞具有相似的IHC(图17)。使用人类细胞核抗原标记物(HNA)，主要用早期神经元标记物双皮质素(DCX，蓝色)染色细胞(图17A合并为粉红色)。一些细胞表达HA标记的ApiCCT(图17B)。
讨论
基于干细胞的移植策略基于其通过再生和修复机制调节病理的能力，是神经退行性疾病的有前景的方法。在HD模型中，小鼠衍生的NSC示出有前景的结果，而基于hNSC的方法则取得了不同的成功，在毒素模型中具有强大的功效，而在基因HD小鼠中神经保护作用有限(El-Akabawy et al.,2012；Golas and Sander,2016)。在此我们描述了GMP级hNSC的移植，该移植提供了靶向mHTT蛋白的积累的缺陷和疾病修饰活性的强力挽救。ESI-017hNSC在R6/2小鼠中是电生理活性的，但对纹状体MSN膜特性或自发突触活性没有显著影响。然而在MSN的亚组中，没有出现通常在用荷包牡丹硷对GABAA受体的长期阻断后sEPSC频率增加，表明移植物有助于降低皮质过度兴奋性。申请人尚未确定这种作用的潜在机理，但是移植物内部的电刺激在邻近细胞中诱导了IPSC，表明它们是抑制性的。超微结构数据表明，宿主可能与hNSC以相等数量进行对称(抑制)和非对称(兴奋)突触联系。我们的假设是，这种效应源自于被植入的细胞，并且在R6/2小鼠中它们主要沿神经元谱系分化。但是，在包括Q140小鼠在内的其他实验中，存在潜在的神经胶质效应，表明尚未了解其改善的动因。考虑到这些小鼠直到疾病的非常晚期才发生神经元丧失，纹状体特异性移植似乎通过神经保护作用(通过营养因子(例如BDNF))以及通过预防mHTT种类的异常积累而起作用。然而在被移植细胞中电生理活性以及在人类和内源性小鼠细胞之间的接触的发现，其可以促进改善的电生理结果，这表明也可能有再生作用的机会。
与其他祖细胞类型相比，移植NSC的基本原理是基于它们沿多种谱系分化的能力。在R6/2小鼠中，细胞展现出早期星形细胞或神经元分化的证据；大多数与神经元限制性祖细胞标记物(DCX、βIII-微管蛋白和MAP-2)共同标记。由于hNSC通常需要几个月才能最终分化，因此我们预期在4周的时间点仅观察到被移植细胞的部分分化。有趣的是，在体外植入之前，很少有ESI-017hNSC是DCX阳性的。R6/2小鼠的细胞命运结果与我们在Q140长期HD模型中以及在帕金森氏病和阿尔茨海默氏病(AD)模型使用hNSC的其他研究中的发现相反，在后者中，更多的细胞正在变成星形胶质细胞(Goldberg et al.,2017)，尽管后者源自于胎儿NSC，而胎儿NSC倾向于胶质化。这些数据表明，根据疾病的微环境，可能会有不同的反应，免疫抑制范型可能会影响说明或者发育线索，以及人类与小鼠细胞特异性时机会影响结果。
HD小鼠和人类HD对象中BDNF水平降低(Strand et al.,2007；Zuccato et al.,2011)，以及HD小鼠中许多有效的处理方法均示出BDNF随之增加(Ross and Tabrizi,2011)。与通过干细胞移植支持营养因子的想法一致；表达GDNF的小鼠NSC的离体递送可维持运动功能并预防HD小鼠中的神经元丢失(Ebert et al.,2010)，并且在小鼠NSC移植到AD小鼠(Blurton-Jones et al.,2009)或路易小体痴呆模型(Goldberg et al.,2015)中之后，需要BDNF来改善认知能力。BDNF必须通过传入途径(包括在HD中被改变的皮质纹状体途径)被运输到纹状体(Laforet et al.,2001)。通过向纹状体提供营养支持是可能，皮质纹状体通路保留足够以表示皮质中BDNF的产生，或者源自干细胞的BDNF从纹状体逆行转运回皮质纹状体的神经元胞体，导致移植后改善电生理学活动。
被植入的hNSC的一种作用机制可能是通过减少异常的mHTT积累和聚集，可能是通过预防其形成或诱导选择性清除机制(例如Chen et al.,2013)。我们最近描述了特定HMW不溶物mHTT种类的减少与R6/2小鼠的行为改善和几种分子读数的标准化有关的发现(Ochaba et al.,2016)。合理的是，mHTT和泛素化HMW不溶性种类的致病性积累的减少可以预防在HD小鼠中观察到的神经元功能异常。
重要的是要注意，与观察到的结果相反，在人类HD对象中的胎儿细胞移植研究中可以获取聚集体(Cicchetti et al.,2014)，在任一小鼠模型中的移植过程没有观察到获得的HD表型(例如内含体)的证据(图10)。缺乏明显的蛋白质传播或获得性病理可能是hNSC的营养信号传导增加的结果或起因于mHTT种类减少的结果，而mHTT种类的减少可能会促进蛋白质传播进入被移植细胞。或者，细胞可能需要花费数年的时间才能获得在小鼠研究中并未体现出来的病理学。
总而言之，我们示出移植到HD小鼠中的hNSC可以存活、分化为神经细胞群体，可以保护或修复受损的组织并延缓疾病的进展，减少病理学和增加保护性分子的产生，并可能与周围组织形成接触，这表明了用于HD的前瞻性治疗策略。鉴于An et al.(2012)的结果，其示出被基因校正的患者来源的NSC可以形成人类神经元和DARPP-32阳性细胞，并且此处报道了结果，将来使用经过校正的患者细胞的自体移植的应用也可能是可行的。
等效物
应当理解的是，尽管已经结合以上实施方式描述了本发明，但是前述描述和实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。对于本发明所属领域的技术人员而言，本发明范围内的其他方面、优点和修改将是显而易见的。
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序列表:
NM_030752.2和智人t-复合物1(TCP1)，转录变体1，mRNA
(SEQ ID NO.:1)
GTCCTGTTTCTCTCCCTGTTGTCCCTGCCTCTTTTTCCTTCCCGCCGTGCCCCGCGGCCGGGCCGGGGCAGCCGGGAAGCGGGTGGGGTGGTGTGTTACCCAGTAGCTCCTGGGACATCGCTCGGGTACGCTCCACGCCGTCGCAGCCACTGCTGTGGTCGCCGGTCGGCCGAGGGGCCGCGATACTGGTTGCCCGCGGTGTAAGCAGAATTCGACGTGTATCGCTGCCGTCAAGATGGAGGGGCCTTTGTCCGTGTTCGGTGACCGCAGCACTGGGGAAACGATCCGCTCCCAAAACGTTATGGCTGCAGCTTCGATTGCCAATATTGTAAAAAGTTCTCTTGGTCCAGTTGGCTTGGATAAAATGTTGGTGGATGATATTGGTGATGTAACCATTACTAACGATGGTGCAACCATCCTGAAGTTACTGGAGGTAGAACATCCTGCAGCTAAAGTTCTTTGTGAGCTGGCTGATCTGCAAGACAAAGAAGTTGGAGATGGAACTACTTCAGTGGTTATTATTGCAGCAGAACTCCTAAAAAATGCAGATGAATTAGTCAAACAGAAAATTCATCCCACATCAGTTATTAGTGGCTATCGACTTGCTTGCAAGGAAGCAGTGCGTTATATCAATGAAAACCTAATTGTTAACACAGATGAACTGGGAAGAGATTGCCTGATTAATGCTGCTAAGACATCCATGTCTTCCAAAATCATTGGAATAAATGGTGATTTCTTTGCTAACATGGTAGTAGATGCTGTACTTGCTATTAAATACACAGACATAAGAGGCCAGCCACGCTATCCAGTCAACTCTGTTAATATTTTGAAAGCCCATGGGAGAAGTCAAATGGAGAGTATGCTCATCAGTGGCTATGCACTCAACTGTGTGGTGGGATCCCAGGGCATGCCCAAGAGAATCGTAAATGCAAAAATTGCTTGCCTTGACTTCAGCCTGCAAAAAACAAAAATGAAGCTTGGTGTACAGGTGGTCATTACAGACCCTGAAAAACTGGACCAAATTAGACAGAGAGAATCAGATATCACCAAGGAGAGAATTCAGAAGATCCTGGCAACTGGTGCCAATGTTATTCTAACCACTGGTGGAATTGATGATATGTGTCTGAAGTATTTTGTGGAGGCTGGTGCTATGGCAGTTAGAAGAGTTTTAAAAAGGGACCTTAAACGCATTGCCAAAGCTTCTGGAGCAACTATTCTGTCAACCCTGGCCAATTTGGAAGGTGAAGAAACTTTTGAAGCTGCAATGTTGGGACAGGCAGAAGAAGTGGTACAGGAGAGAATTTGTGATGATGAGCTGATCTTAATCAAAAATACTAAGGCTCGTACGTCTGCATCGATTATCTTACGTGGGGCAAATGATTTCATGTGTGATGAGATGGAGCGCTCTTTACATGATGCACTTTGTGTAGTGAAGAGAGTTTTGGAGTCAAAATCTGTGGTTCCCGGTGGGGGTGCTGTAGAAGCAGCCCTTTCCATATACCTTGAAAACTATGCAACCAGCATGGGGTCTCGGGAACAGCTTGCGATTGCAGAGTTTGCAAGATCACTTCTTGTTATTCCCAATACACTAGCAGTTAATGCTGCCCAGGACTCCACAGATCTGGTTGCAAAATTAAGAGCTTTTCATAATGAGGCCCAGGTTAACCCAGAACGTAAAAATCTAAAATGGATTGGTCTTGATTTGAGCAATGGTAAACCTCGAGACAACAAACAAGCAGGGGTGTTTGAACCAACCATAGTTAAAGTTAAGAGTTTGAAATTTGCAACAGAAGCTGCAATCACCATTCTTCGAATTGATGATCTTATTAAATTACATCCAGAAAGTAAAGATGATAAACATGGAAGTTATGAAGATGCTGTTCACTCTGGAGCCCTTAATGATTGATCTGATGTTCCTTTTATTTATAACAATGTTAAATGCAATTGTCTTGTACCTTGAGTTGAGTATTACACATTAAAGTAAAGTACAAGCTGTAAACTTGGGTTTTTGTGATGTAGGAAATGGTTTCCATCTGTACTTTGGTCCTCTGATTTCACATATTGCAACCTAGTACTTTATTAGTTTAAAAAGAAATTGAGGTTGTTCAAAGTTTAAGCAATTCATTCTCTCTGAACACACATTGCTATTCCCATCCCACCCCCAATGCACAGGGCTGCAACACCACGACTTCTGCCCATTCTCTCCAGTGTGTGTAACAGGGTCACAAGAATTCGACAGCCAGATGCTCCAAGAGGGTGGCCCAAGGCTATAGCCCCTCCTTCAATATTGACCTAACGGGGGAGAAAAGATTTAGATTGTTTATTCTTCTGTGGACACAGTTTAAAATCTTAAACTTGTCTTTTTCCTCTTAATGTATCAGCATGCTACCCTTTCAAACTCAAATTTTCATTTTAACTGCTTAGGAATAAATTTACACCTTTGTGAAAATTCAAAAAAAAAAA
特征 位置/限定词
来源 1..2463
/生物体＝"智人"
/mol_类型＝"mRNA"
/db_xref＝"分类单元:9606"
/染色体＝"6"
/图谱＝"6q25.3"
基因 1..2463
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/注释＝"t-复合物1"
/db_xref＝"基因ID:6950"
/db_xref＝"HGNC:HGNC:11655"
/db_xref＝"MIM:186980"
外显子 1..299
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
misc_特征 104..106
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/注释＝"上游框内终止密码子"
CDS 236..1906
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/注释＝"异构体a由转录变体1编码；
T-复合蛋白1,α亚单元；无尾复合多肽1；
T-复合蛋白1α亚单元；
t-复合物1蛋白"
/密码子_起始＝1
/产物＝"T-复合蛋白1α亚单元异构体a"
/蛋白质_id＝"NP_110379.2"
/db_xref＝"CCDS:CCDS5269.1"
/db_xref＝"基因ID:6950"
/db_xref＝"HGNC:HGNC:11655"
/db_xref＝"MIM:186980"
/翻译＝(SEQ ID NO.:2)
"MEGPLSVFGDRSTGETIRSQNVMAAASIANIVKSSLGPVGLDKMLVDDIGDVTITNDGATILKLLEVEHPAAKVLCELADLQDKEVGDGTTSVVIIAAELLKNADELVKQKIHPTSVISGYRLACKEAVRYINENLIVNTDELGRDCLINAAKTSMSSKIIGINGDFFANMVVDAVLAIKYTDIRGQPRYPVNSVNILKAHGRSQMESMLISGYALNCVVGSQGMPKRIVNAKIACLDFSLQKTKMKLGVQVVITDPEKLDQIRQRESDITKERIQKILATGANVILTTGGIDDMCLKYFVEAGAMAVRRVLKRDLKRIAKASGATILSTLANLEGEETFEAAMLGQAEEVVQERICDDELILIKNTKARTSASIILRGANDFMCDEMERSLHDALCVVKRVLESKSVVPGGGAVEAALSIYLENYATSMGSREQLAIAEFARSLLVIPNTLAVNAAQDSTDLVAKLRAFHNEAQVNPERKNLKWIGLDLSNGKPRDNKQAGVFEPTIVKVKSLKFATEAAITILRIDDLIKLHPESKDDKHGSYEDAVHSGALND"
misc_特征 236..238
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"N-乙酰蛋氨酸。{ECO:0000244|PubMed:19413330,
ECO:0000244|PubMed:22223895,ECO:0000244|PubMed:22814378,
ECO:0000269|PubMed:12665801}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；乙酰化位点"
misc_特征 251..253
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"磷酸丝氨酸。{ECO:0000244|PubMed:23186163}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；
磷酸化位点"
misc_特征 776..778
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"磷酸丝氨酸。{ECO:0000244|PubMed:19690332}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；
磷酸化位点"
misc_特征 830..832
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"N6-乙酰赖氨酸.{ECO:0000244|PubMed:19608861}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；
乙酰化位点"
misc_特征 1433..1435
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"N6-乙酰赖氨酸.{ECO:0000244|PubMed:19608861}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；
乙酰化位点"
misc_特征 1706..1708
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"磷酸丝氨酸.{ECO:0000244|PubMed:23186163}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；
磷酸化位点"
misc_feature 1715..1717
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"N6-乙酰赖氨酸.{ECO:0000250|UniProtKB:P11983}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；
乙酰化位点"
misc_特征 1865..1867
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"磷酸丝氨酸.{ECO:0000244|PubMed:18669648,
ECO:0000244|PubMed:19690332,ECO:0000244|PubMed:20068231,
ECO:0000244|PubMed:21406692,ECO:0000244|PubMed:23186163,
ECO:0000244|PubMed:24275569}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；磷酸化位点"
misc_特征 1886..1888
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"磷酸丝氨酸.{ECO:0000244|PubMed:20068231,
ECO:0000244|PubMed:21406692,ECO:0000244|PubMed:23186163}；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P17987.1)传播；
磷酸化位点"
外显子 300..385
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 386..514
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 515..612
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 613..723
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 724..905
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 906..1032
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 1033..1208
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
STS 1073..1300
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_名称＝"GDB:451649"
/db_xref＝"UniSTS:157336"
外显子 1209..1332
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 1333..1525
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
STS 1493..1674
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_name＝"G06897"
/db_xref＝"UniSTS:35313"
外显子 1526..1689
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 1690..2453
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
STS 1857..1964
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_名称＝"SHGC-36020"
/db_xref＝"UniSTS:22807"
调控位点 1975..1980
/调控_分类＝"多聚A_信号_序列"
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
多聚A_位点 1999
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
STS 2009..2140
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_名称＝"D6S1840"
/db_xref＝"UniSTS:58762"
调控位点 2426..2431
/调控_分类＝"多聚A_信号_序列"
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
多聚A_位点 2452
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
NM_001008897.1智人t-复合物1(TCP1)，转录变体2，mRNA
(SEQ ID NO:.3)
GTCCTGTTTCTCTCCCTGTTGTCCCTGCCTCTTTTTCCTTCCCGCCGTGCCCCGCGGCCGGGCCGGGGCAGCCGGGAAGCGGGTGGGGTGGTGTGTTACCCAGTAGCTCCTGGGACATCGCTCGGGTACGCTCCACGCCGTCGCAGCCACTGCTGTGGTCGCCGGTCGGCCGAGGGGCCGCGATACTGGTTGCCCGCGGTGTAAGCAGAATTCGACGTGTATCGCTGCCGTCAAGATGGAGGGGCCTTTGTCCGTGTTCGGTGACCGCAGCACTGGGGAAACGATCCGCTCCCAAAACGGATGTAACCATTACTAACGATGGTGCAACCATCCTGAAGTTACTGGAGGTAGAACATCCTGCAGCTAAAGTTCTTTGTGAGCTGGCTGATCTGCAAGACAAAGAAGTTGGAGATGGAACTACTTCAGTGGTTATTATTGCAGCAGAACTCCTAAAAAATGCAGATGAATTAGTCAAACAGAAAATTCATCCCACATCAGTTATTAGTGGCTATCGACTTGCTTGCAAGGAAGCAGTGCGTTATATCAATGAAAACCTAATTGTTAACACAGATGAACTGGGAAGAGATTGCCTGATTAATGCTGCTAAGACATCCATGTCTTCCAAAATCATTGGAATAAATGGTGATTTCTTTGCTAACATGGTAGTAGATGCTGTACTTGCTATTAAATACACAGACATAAGAGGCCAGCCACGCTATCCAGTCAACTCTGTTAATATTTTGAAAGCCCATGGGAGAAGTCAAATGGAGAGTATGCTCATCAGTGGCTATGCACTCAACTGTGTGGTGGGATCCCAGGGCATGCCCAAGAGAATCGTAAATGCAAAAATTGCTTGCCTTGACTTCAGCCTGCAAAAAACAAAAATGAAGCTTGGTGTACAGGTGGTCATTACAGACCCTGAAAAACTGGACCAAATTAGACAGAGAGAATCAGATATCACCAAGGAGAGAATTCAGAAGATCCTGGCAACTGGTGCCAATGTTATTCTAACCACTGGTGGAATTGATGATATGTGTCTGAAGTATTTTGTGGAGGCTGGTGCTATGGCAGTTAGAAGAGTTTTAAAAAGGGACCTTAAACGCATTGCCAAAGCTTCTGGAGCAACTATTCTGTCAACCCTGGCCAATTTGGAAGGTGAAGAAACTTTTGAAGCTGCAATGTTGGGACAGGCAGAAGAAGTGGTACAGGAGAGAATTTGTGATGATGAGCTGATCTTAATCAAAAATACTAAGGCTCGTACGTCTGCATCGATTATCTTACGTGGGGCAAATGATTTCATGTGTGATGAGATGGAGCGCTCTTTACATGATGCACTTTGTGTAGTGAAGAGAGTTTTGGAGTCAAAATCTGTGGTTCCCGGTGGGGGTGCTGTAGAAGCAGCCCTTTCCATATACCTTGAAAACTATGCAACCAGCATGGGGTCTCGGGAACAGCTTGCGATTGCAGAGTTTGCAAGATCACTTCTTGTTATTCCCAATACACTAGCAGTTAATGCTGCCCAGGACTCCACAGATCTGGTTGCAAAATTAAGAGCTTTTCATAATGAGGCCCAGGTTAACCCAGAACGTAAAAATCTAAAATGGATTGGTCTTGATTTGAGCAATGGTAAACCTCGAGACAACAAACAAGCAGGGGTGTTTGAACCAACCATAGTTAAAGTTAAGAGTTTGAAATTTGCAACAGAAGCTGCAATCACCATTCTTCGAATTGATGATCTTATTAAATTACATCCAGAAAGTAAAGATGATAAACATGGAAGTTATGAAGATGCTGTTCACTCTGGAGCCCTTAATGATTGATCTGATGTTCCTTTTATTTATAACAATGTTAAATGCAATTGTCTTGTACCTTGAGTTGAGTATTACACATTAAAGTAAAGTACAAGCTGTAAACTTGGGTTTTTGTGATGTAGGAAATGGTTTCCATCTGTACTTTGGTCCTCTGATTTCACATATTGCAACCTAGTACTTTATTAGTTTAAAAAGAAATTGAGGTTGTTCAAAGTTTAAGCAATTCATTCTCTCTGAACACACATTGCTATTCCCATCCCACCCCCAATGCACAGGGCTGCAACACCACGACTTCTGCCCATTCTCTCCAGTGTGTGTAACAGGGTCACAAGAATTCGACAGCCAGATGCTCCAAGAGGGTGGCCCAAGGCTATAGCCCCTCCTTCAATATTGACCTAACGGGGGAGAAAAGATTTAGATTGTTTATTCTTCTGTGGACACAGTTTAAAATCTTAAACTTGTCTTTTTCCTCTTAATGTATCAGCATGCTACCCTTTCAAACTCAAATTTTCATTTTAACTGCTTAGGAATAAATTTACACCTTTGTGAAAATTCAAAAAAAAAAA
特征 位置/限定词
来源 1..2377
/生物体＝"智人"
/mol_类型＝"mRNA"
/db_xref＝"分类单元:9606"
/染色体＝"6"
/图谱＝"6q25.3"
基因 1..2377
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/注释＝"t-复合物1"
/db_xref＝"基因ID:6950"
/db_xref＝"HGNC:HGNC:11655"
/db_xref＝"MIM:186980"
外显子 1..299
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 300..428
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 429..526
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 527..637
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
CDS 615..1820
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/注释＝"异构体b由转录变体2编码；
T-复合蛋白1,α亚单元；无尾复合多肽1；
T-复合蛋白1亚单元α；
t-复合物1蛋白"
/密码子_起始＝1
/产物＝"T-复合蛋白1亚单元α异构体b"
/蛋白质_id＝"NP_001008897.1"
/db_xref＝"CCDS:CCDS43522.1"
/db_xref＝"基因ID:6950"
/db_xref＝"HGNC:HGNC:11655"
/db_xref＝"MIM:186980"
/翻译＝(SEQ ID NO:.4)
"MSSKIIGINGDFFANMVVDAVLAIKYTDIRGQPRYPVNSVNILKAHGRSQMESMLISGYALNCVVGSQGMPKRIVNAKIACLDFSLQKTKMKLGVQVVITDPEKLDQIRQRESDITKERIQKILATGANVILTTGGIDDMCLKYFVEAGAMAVRRVLKRDLKRIAKASGATILSTLANLEGEETFEAAMLGQAEEVVQERICDDELILIKNTKARTSASIILRGANDFMCDEMERSLHDALCVVKRVLESKSVVPGGGAVEAALSIYLENYATSMGSREQLAIAEFARSLLVIPNTLAVNAAQDSTDLVAKLRAFHNEAQVNPERKNLKWIGLDLSNGKPRDNKQAGVFEPTIVKVKSLKFATEAAITILRIDDLIKLHPESKDDKHGSYEDAVHSGALND"
外显子 638..819
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 820..946
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 947..1122
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
STS 987..1214
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_名称＝"GDB:451649"
/db_xref＝"UniSTS:157336"
外显子 1123..1246
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 1247..1439
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
STS 1407..1588
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_名称＝"G06897"
/db_xref＝"UniSTS:35313"
外显子 1440..1603
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
外显子 1604..2367
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
STS 1771..1878
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_名称＝"SHGC-36020"
/db_xref＝"UniSTS:22807"
调控位点 1889..1894
/调控_分类＝"多聚A_信号序列"
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
多聚A_位点 1913
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
STS 1923..2054
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
/标准_名称＝"D6S1840"
/db_xref＝"UniSTS:58762"
调控位点 2340..2345
/调控_分类＝"多聚A_信号序列"
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
多聚A_位点 2366
/基因＝"TCP1"
/基因_异名＝"CCT-α；CCT1；CCTa；D6S230E；
TCP-1-α"
NM_001143805.1智人脑源性神经营养因子(BDNF)，转录变体7，mRNA
(SEQ ID NO:5)
AATATCAAGTATCACTTAATTAGAGATTTTTAAGCCTTTTCCTCCTGCTGTGCCGGGTGTGTAATCCGGGCGATAGGAGTCCATTCAGCACCTTGGACAGAGCCAACGGATTTGTCCGAGGTGGCGGTACCCCCAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAGTGGATTTATGTTGTATAGATTAGATTATATTGAGACAAAAATTATCTATTTGTATATATACATAACAGGGTAAATTATTCAGTTAAGAAAAAAATAATTTTATGAACTGCATGTATAAATGAAGTTTATACAGTACAGTGGTTCTACAATCTATTTATTGGACATGTCCATGACCAGAAGGGAAACAGTCATTTGCGCACAACTTAAAAAGTCTGCATTACATTCCTTGATAATGTTGTGGTTTGTTGCCGTTGCCAAGAACTGAAAACATAAAAAGTTAAAAAAAATAATAAATTGCATGCTGCTTTAATTGTGAATTGATAATAAACTGTCCTCTTTCAGAAAACAGAAAAAAACACACACACACACAACAAAAATTTGAACCAAAACATTCCGTTTACATTTTAGACAGTAAGTATCTTCGTTCTTGTTAGTACTATATCTGTTTTACTGCTTTTAACTTCTGATAGCGTTGGAATTAAAACAATGTCAAGGTGCTGTTGTCATTGCTTTACTGGCTTAGGGGATGGGGGATGGGGGGTATATTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTTTTTTCGTTTGTTTGTTTTGTTTTTTAGTTCCCACAGGGAGTAGAGATGGGGAAAGAATTCCTACAATATATATTCTGGCTGATAAAAGATACATTTGTATGTTGTGAAGATGTTTGCAATATCGATCAGATGACTAGAAAGTGAATAAAAATTAAGGCAACTGAACAAAAAAATGCTCACACTCCACATCCCGTGATGCACCTCCCAGGCCCCGCTCATTCTTTGGGCGTTGGTCAGAGTAAGCTGCTTTTGACGGAAGGACCTATGTTTGCTCAGAACACATTCTTTCCCCCCCTCCCCCTCTGGTCTCCTCTTTGTTTTGTTTTAAGGAAGAAAAATCAGTTGCGCGTTCTGAAATATTTTACCACTGCTGTGAACAAGTGAACACATTGTGTCACATCATGACACTCGTATAAGCATGGAGAACAGTGATTTTTTTTTAGAACAGAAAACAACAAAAAATAACCCCAAAATGAAGATTATTTTTTATGAGGAGTGAACATTTGGGTAAATCATGGCTAAGCTTAAAAAAAACTCATGGTGAGGCTTAACAATGTCTTGTAAGCAAAAGGTAGAGCCCTGTATCAACCCAGAAACACCTAGATCAGAACAGGAATCCACATTGCCAGTGACATGAGACTGAACAGCCAAATGGAGGCTATGTGGAGTTGGCATTGCATTTACCGGCAGTGCGGGAGGAATTTCTGAGTGGCCATCCCAAGGTCTAGGTGGAGGTGGGGCATGGTATTTGAGACATTCCAAAACGAAGGCCTCTGAAGGACCCTTCAGAGGTGGCTCTGGAATGACATGTGTCAAGCTGCTTGGACCTCGTGCTTTAAGTGCCTACATTATCTAACTGTGCTCAAGAGGTTCTCGACTGGAGGACCACACTCAAGCCGACTTATGCCCACCATCCCACCTCTGGATAATTTTGCATAAAATTGGATTAGCCTGGAGCAGGTTGGGAGCCAAATGTGGCATTTGTGATCATGAGATTGATGCAATGAGATAGAAGATGTTTGCTACCTGAACACTTATTGCTTTGAAACTAGACTTGAGGAAACCAGGGTTTATCTTTTGAGAACTTTTGGTAAGGGAAAAGGGAACAGGAAAAGAAACCCCAAACTCAGGCCGAATGATCAAGGGGACCCATAGGAAATCTTGTCCAGAGACAAGACTTCGGGAAGGTGTCTGGACATTCAGAACACCAAGACTTGAAGGTGCCTTGCTCAATGGAAGAGGCCAGGACAGAGCTGACAAAATTTTGCTCCCCAGTGAAGGCCACAGCAACCTTCTGCCCATCCTGTCTGTTCATGGAGAGGGTCCCTGCCTCACCTCTGCCATTTTGGGTTAGGAGAAGTCAAGTTGGGAGCCTGAAATAGTGGTTCTTGGAAAAATGGATCCCCAGTGAAAACTAGAGCTCTAAGCCCATTCAGCCCATTTCACACCTGAAAATGTTAGTGATCACCACTTGGACCAGCATCCTTAAGTATCAGAAAGCCCCAAGCAATTGCTGCATCTTAGTAGGGTGAGGGATAAGCAAAAGAGGATGTTCACCATAACCCAGGAATGAAGATACCATCAGCAAAGAATTTCAATTTGTTCAGTCTTTCATTTAGAGCTAGTCTTTCACAGTACCATCTGAATACCTCTTTGAAAGAAGGAAGACTTTACGTAGTGTAGATTTGTTTTGTGTTGTTTGAAAATATTATCTTTGTAATTATTTTTAATATGTAAGGAATGCTTGGAATATCTGCTATATGTCAACTTTATGCAGCTTCCTTTTGAGGGACAAATTTAAAACAAACAACCCCCCATCACAAACTTAAAGGATTGCAAGGGCCAGATCTGTTAAGTGGTTTCATAGGAGACACATCCAGCAATTGTGTGGTCAGTGGCTCTTTTACCCAATAAGATACATCACAGTCACATGCTTGATGGTTTATGTTGACCTAAGATTTATTTTGTTAAAATCTCTCTCTGTTGTGTTCGTTCTTGTTCTGTTTTGTTTTGTTTTTTAAAGTCTTGCTGTGGTCTCTTTGTGGCAGAAGTGTTTCATGCATGGCAGCAGGCCTGTTGCTTTTTTATGGCGATTCCCATTGAAAATGTAAGTAAATGTCTGTGGCCTTGTTCTCTCTATGGTAAAGATATTATTCACCATGTAAAACAAAAAACAATATTTATTGTATTTTAGTATATTTATATAATTATGTTATTGAAAAAAATTGGCATTAAAACTTAACCGCATCAGAACCTATTGTAAATACAAGTTCTATTTAAGTGTACTAATTAACATATAATATATGTTTTAAATATAGAATTTTTAATGTTTTTAAATATATTTTCAAAGTACATAAAA
特征 位置/限定词
来源 1..3827
/生物体＝"智人"
/mol_类型＝"mRNA"
/db_xref＝"分类单元:9606"
/染色体＝"11"
/图谱＝"11p14.1"
基因 1..3827
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"脑源性神经营养因子"
/db_xref＝"基因ID:627"
/db_xref＝"HGNC:HGNC:1033"
/db_xref＝"MIM:113505"
外显子 1..136
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
misc_特征 11
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"替代性转录起始位点"
misc_特征 12
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"替代性转录起始位点"
misc_特征 18
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"替代性转录起始位点"
misc_特征 27
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"替代性转录起始位点"
misc_特征 34
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"替代性转录起始位点"
misc_特征 74..76
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"上游框内终止密码子"
外显子 137..3827
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/推断＝"比对:Splign:2.1.0"
CDS 158..901
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/注释＝"异构体a前原蛋白由转录变体7编码；
神经营养因子；阿立纽林"
/密码子_起始＝1
/产物＝"脑源性神经营养因子异构体a前原蛋白"
/蛋白质_id＝"NP_001137277.1"
/db_xref＝"CCDS:CCDS7866.1"
/db_xref＝"基因ID:627"
/db_xref＝"HGNC:HGNC:1033"
/db_xref＝"MIM:113505"
/翻译＝(SEQ ID NO.:6)
"MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR"
sig_peptide 158..211
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/推断＝"坐标:从头预测方法:SignalP:4.0"
misc_特征 326..331
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节"
/注释＝"通过S1P裂解；
从UniProtKB/Swiss-Prot(P23560.1)传播；裂解位点"
mat_peptide 542..898
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/产物＝"脑源性神经营养因子"
/实验＝"实验证据,不记录其他细节
"
/注释＝"从UniProtKB/Swiss-Prot(P23560.1)传播"
STS 163..771
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/标准_名称＝"BDNF"
/db_xref＝"UniSTS:266531"
STS 514..796
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/标准_名称＝"BDNF-1"
/db_xref＝"UniSTS:253960"
STS 578..1460
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/标准_名称＝"BDNF_2411"
/db_xref＝"UniSTS:280459"
STS 1062..1163
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
/标准_名称＝"D11S4429"
/db_xref＝"UniSTS:43225"
多聚A_位点 3827
/基因＝"BDNF"
/基因_异名＝"ANON2；BULN2"
ApiCCT1(SEQ ID NO:7):
MVPGYALNCTVASQAMPKRIAGGNVKIACLDLNLQKARMAMGVQINIDDPEQLEQIRKREAGIVLERVKKIIDAGAQWLTIKGIDDLCLKEFVEAKlMGVRRCKKEDLRRIARATGATLVSSMSNLEGEETFESSYLGLCDEWQAKFSDDECILIKGTSKAAAAALE.
sApiCCT1 mRNA(SEQ ID NO:8)
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCTATCAGTGGCTATGCACTCAACTGTGTGGTGGGATCCCAGGGCATGCCCAAGAGAATCGTAAATGCAAAAATTGCTTGCCTTGACTTCAGCCTGCAAAAAACAAAAATGAAGCTTGGTGTACAGGTGGTCATTACAGACCCTGAAAAACTGGACCAAATTAGACAGAGAGAATCAGATATCACCAAGGAGAGAATTCAGAAGATCCTGGCAACTGGTGCCAATGTTATTCTAACCACTGGTGGAATTGATGATATGTGTCTGAAGTATTTTGTGGAGGCTGGTGCTATGGCAGTTAGAAGAGTTTTAAAAAGGGACCTTAAACGCATTGCCAAAGCTTCTGGAGCAACTATTCTGTCAACCCTGGCCAATTTGGAAGGTGAAGAAACTTTTGAAGCTGCAATGTTGGGACAGGCAGAAGAAGTGGTACAGGAGAGAATTTGTGATGATGAGCTGATCTTAATCAAAAATACTAAGGCTGCTGCGGCTGCGGGTGGACACTACCCTTACGACGTGCCTGACTACGCCTGA
sApiCCT1(SEQ ID NO:9)
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISGYALNCVVGSQGMPKRIVNAKIACLDFSLQKTKMKLGVQVVITDPEKLDQIRQRESDITKERIQKILATGANVILTTGGIDDMCLKYFVEAGAMAVRRVLKRDLKRIAKASGATILSTLANLEGEETFEAAMLGQAEEVVQERICDDELILIKNTKAAAAAGGHYPYDVPDYA

Claims (37)

1.一种从人类胚胎干细胞（hESC）中制备人类神经元干细胞（hNSC），所述方法包含以下步骤：
a）从被培养于分化培养基中的类胚体（EB）的群体中分离至少一个干细胞玫瑰花结；
b）将被分离自步骤a）的玫瑰花结的至少一个单个单元培养一定量的时间，并且在为生成至少一个玫瑰花结提供的条件下，直到至少一个玫瑰花结生成；
c）将来自步骤b）的玫瑰花结的单个单元分离成为单个细胞；以及
d）将被分离自步骤c）的至少一个单个细胞培养一定量的时间，并且在为生成hNSC的融合群体提供的条件下，直到生成hNSC的融合群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中从所述玫瑰花结中分离所述至少一个单个单元是手动进行的。
3.如权利要求1所述的方法，其中从所述玫瑰花结中分离所述至少一个单个单元是酶促地进行的。
4.如权利要求1所述的方法，其中从步骤a）的玫瑰花结中分离所述至少一个单个单元是手动地进行的。
5.如权利要求1或4所述的方法，其中步骤c）的至少一个单个细胞的分离是酶促地进行的。
6.如权利要求1所述的方法，其中使步骤a）到c）中的一步或多步进行2次或更多次。
7.如权利要求1所述的方法，其中使步骤a）到d）中的至少一步手动地进行。
8.如权利要求1所述的方法，其中使步骤a）到d）中的至少一步机械地进行。
9.如权利要求1所述的方法，其中使所述玫瑰花结的分离数字化地进行。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包含从ESI-017中生成类胚体。
11.根据权利要求9或10所述的方法，进一步包含在超低附着表面上于EB培养基中培养类胚体（EB）。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包含在EB已经在鸟氨酸/层粘连蛋白包被的表面上在步骤a）上进一步被培养了有效量的时间后，用N2培养基替换EB培养基。
13.如权利要求12所述的方法，进一步包含在EB已经于EB培养基中被培养一定量的时间后，用N2培养基替换EB培养基，该一定量的时间有效地产生步骤a）的至少一个EB。
14.如权利要求1所述的方法，其中在鸟嘌呤/层粘连蛋白包被的板上的N2培养基中，将在步骤c）中被分离的至少一个单个细胞培养有效量的时间，以生成hNSC的融合细胞群体。
15.如权利要求14所述的方法，进一步包含用有效量的N2培养基培养所述hNSC的融合群体。
16.如权利要求15所述的方法，进一步包含扩增细胞群体。
17.如权利要求1所述的方法，进一步包含对细胞进行基因修饰。
18.如权利要求17所述的方法，其中通过转基因的插入或通过CRISPR的修饰对细胞进行基因修饰。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述转基因是ApiCCT1、其片段或其每一个的等效物，并且任选地其中所述转基因在细胞中被过表达。
20.一种由权利要求15至19中任一项所述的方法制备的hNSC，并且任选地其中细胞表达BNDF。
21.一种由权利要求10所述的方法制备的hNSC，其中所述hNSC在细胞分化后表达BNDF。
22.如权利要求21所述的hNSC，其中通过转基因的插入或通过CRISPR对细胞进行基因修饰。
23.一种权利要求18所述的细胞的群体。
24.一种包含权利要求20所述的分离的细胞的组合物。
25.一种包含权利要求24所述的群体和载体的组合物。
26.如权利要求24或25所述的组合物，进一步包含防腐剂和/或低温保护剂。
27.一种将转基因递送至对象或在有需要的对象中基因编辑细胞的方法，其包含施用有效量的权利要求20或21中任一项的细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述对象是人类。
30.一种在有需要的对象中治疗神经退行性疾病或增强突触联系的方法，其包含向所述对象施用有效量的权利要求20或21的分离的细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自亨丁顿氏病、中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、外伤性脑损伤、脑部炎症、中风、自身免疫性疾病（例如多发性硬化、原发性或继发性进行性多发性硬化、复发缓解型多发性硬化症）、慢性脊髓损伤、贝尔氏麻痹、颈脊椎病、腕管综合症、脑或脊髓肿瘤、周围神经病变、格林-巴利综合症、脊髓性肌萎缩、弗雷德里希共济失调、肌萎缩性侧索硬化和亨丁顿氏舞蹈病。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述对象是人类。
34.一种试剂盒，其包含hESC和用于进行权利要求1-17中任一项所述方法的说明书。
35.一种试剂盒，其包含权利要求20或21所述的hESC和进行权利要求1-17中任一项所述方法的说明书。
36.一种非人类动物，其具有被移植到该动物中的权利要求20或21所述的hESC。
37.如权利要求36所述的非人类动物，其中所述动物是鼠或绵羊。
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