JP2024042096A - 神経幹細胞組成物および神経変性障害を処置するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】神経幹細胞組成物および神経変性障害を処置するための方法の提供【解決手段】ハンチントン病等の神経変性疾患およびＣＮＳ障害の処置のための幹細胞に基づく療法が本明細書において提供される。療法は運動欠損を改善し、シナプス変化をレスキューした。細胞は電気生理学的に活性であり、運動機能障害および後期認知機能障害を改善することが示された。一部の実施形態では、方法は、細胞を遺伝子改変することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、導入遺伝子の挿入またはＣＲＩＳＰＲによる改変によって遺伝子改変される。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＡｐｉＣＣＴ１、その断片、またはそれらのそれぞれの同等物であり、必要に応じて細胞において過剰発現する。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り Ｒｅｉｄｌｉｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１８ Ｊａｎ ９；１０（１）：５８－７２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１７．１１．００５、公開日：２０１７年１２月７日

現在のところ、中枢または末梢神経系に影響を及ぼす多くの神経変性障害に利用可能な疾患修飾療法は存在しない。一部の研究は、ヒト幹細胞が一部の神経変性障害に関する見込みのある治療戦略を提供すると示唆している（概観については、Drouin-Ouellet,2014；Golas and Sander, 2016；Kirkeby et al., 2017を参照のこと）。

一例として、ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）内のポリグルタミン反復配列をコードする伸長したＣＡＧ反復配列によって引き起こされる常染色体優性神経変性疾患である（TheHuntington's Disease Collaborative Research Group,
1993）。不随意運動、進行性知能低下、および精神の障害が生じ（Rossand Tabrizi, 2011）、神経病理は、線条体における中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の変性および皮質の萎縮を主に含む（VonsattelandDiFiglia, 1998）。ＨＤ等の神経変性疾患および障害のた
めの処置を見出す必要性が当技術分野において存在する。本開示は、この必要性を満たし、関連する利点も提供する。

Ｒｏｓｓ Ｃ．Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１１）１０：８３～９８ Ｖｏｎｓａｔｔｅｌ Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９８）５７：３６９～３８４

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からヒトニューロン幹細胞（ｈＮＳＣ）を調製するための方法であって、
ａ）分化培地中で培養された胚様体（ＥＢ）の集団から少なくとも１つの幹細胞ロゼットを単離するステップ、
ｂ）ステップａ）のロゼットから単離された少なくとも１個の個々の細胞をある時間、少なくとも１つのロゼットの生成を提供する条件下で培養するステップ、
ｃ）ステップｂ）のロゼットから個々の細胞を単離して、個々の細胞にするステップ、および
ｄ）ステップｃ）からの単離された少なくとも１個の個々の細胞をある時間、ｈＮＳＣのコンフルエントな集団の生成を提供する条件下で培養するステップ
を含むか、または代替的にはこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる、方法が本明細書において提供される。

一部の実施形態では、ロゼットからの少なくとも１個の個々の細胞の単離は手動で実施される。別の態様では、ロゼットからの少なくとも１個の個々の細胞の単離は酵素により実施される。さらなる態様では、ステップａ）のロゼットからの少なくとも１個の個々の細胞の単離は、必要に応じてデジタル二または三次元画像認識技術を使用して、デジタル的に実施される。さらなる態様では、ステップｃ）の少なくとも１個の個々の細胞の単離は酵素により実施される。

一部の実施形態では、手動で、または必要に応じてデジタル二もしくは三次元画像認識技術を使用してハイスループットで機械的に実施することができるステップａ）からｃ）のうちの１つまたは複数は、２回またはそれよりも多く実施される。

一部の実施形態では、方法は、胚様体をＥＳＩ－０１７から生成することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、胚様体（ＥＢ）を、ＥＢ培地中で超低接着表面において培養することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＥＢが有効な時間培養された後、ＥＢ培地からＮ２培地に置き換えて、オルニチン／ラミニンコーティング表面においてステップａ）をさらに実行することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＥＢが、ステップａ）の少なくとも１つのＥＢを作製するのに有効な時間、ＥＢ培地中で培養された後、ＥＢ培地からＮ２培地に置き換えることをさらに含む。

一部の実施形態では、ステップｃ）において単離された少なくとも１個の個々の細胞は、Ｎ２培地のオルニチン（ornithin）／ラミニンコーティングプレートにおいて有効な時間培養されて、ｈＮＳＣのコンフルエントな細胞集団を生成する。一部の実施形態では、方法は、ｈＮＳＣのコンフルエントな集団を、有効量のＮ２培地を用いて培養することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、細胞の集団を拡大増殖させることをさらに含む。

一部の実施形態では、方法は、細胞を遺伝子改変することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、導入遺伝子の挿入またはＣＲＩＳＰＲによる改変によって遺伝子改変される。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＡｐｉＣＣＴ１、その断片、またはそれらのそれぞれの同等物であり、必要に応じて細胞において過剰発現する。

一部の態様では、
ａ）分化培地中で培養された胚様体（ＥＢ）の集団から少なくとも１つの幹細胞ロゼットを単離するステップ、
ｂ）ステップａ）のロゼットから単離された少なくとも１個の個々の細胞をある時間、少なくとも１つのロゼットの生成を提供する条件下で培養するステップ、
ｃ）ステップｂ）のロゼットから個々の細胞を単離して、個々の細胞にするステップ、および
ｄ）ステップｃ）からの単離された少なくとも１個の個々の細胞をある時間、ｈＮＳＣのコンフルエントな集団の生成を提供する条件下で培養するステップ
を含むか、または代替的にはこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなることによって調製されるｈＮＳＣが本明細書において提供される。

一部の実施形態では、ｈＮＳＣはＢＮＤＦを発現する。一部の実施形態では、ｈＮＳＣは、分化するとＢＮＤＦを発現する。一部の実施形態では、細胞は、導入遺伝子の挿入またはＣＲＩＳＰＲによって遺伝子改変されている。

一部の態様では、本明細書に記載される方法に従って調製される細胞の集団が本明細書において提供される。また、本明細書に記載される方法に従って調製される単離された細胞を含む組成物も提供される。一部の実施形態では、組成物は担体をさらに含む。一部の実施形態では、担体は保存剤および／または凍結保護剤である。

一部の態様では、導入遺伝子を被験体に送達するか、またはそれを必要とする被験体における細胞を遺伝子編集するための方法であって、本明細書に記載される方法に従って調製される有効量の単離された細胞を投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体はヒトである。

一部の態様では、それを必要とする被験体における神経変性障害を処置するかまたはシナプス結合を増強する方法であって、本明細書に記載される方法に従って調製される有効量の単離された細胞を投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体はヒトである。一部の実施形態では、神経変性障害は、ハンチントン病、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、脳炎症、脳卒中、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、一次または二次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、慢性脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害、ギラン・バレー症候群、脊髄性筋委縮症、フリードライヒ（Freidrich's）運動失調症、筋萎縮性側索硬化症、および
ハンチントン舞踏病の群から選択される。

一部の態様では、ｈＥＳＣと、本明細書に記載される方法を実施することに関する指示とを含むキットが本明細書において提供される。

一部の態様では、ｈＮＳＣが本明細書に記載される方法に従って調製され、移植される非ヒト動物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、動物はネズミ科動物（murine）またはヒツジである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からヒトニューロン幹細胞（ｈＮＳＣ）を調製するための方法であって、
ａ）分化培地中で培養された胚様体（ＥＢ）の集団から少なくとも１つの幹細胞ロゼットを単離するステップ、
ｂ）ステップａ）の前記ロゼットから単離された少なくとも１個の個々の細胞をある時間、少なくとも１つのロゼットの生成を提供する条件下で培養するステップ、
ｃ）ステップｂ）の前記ロゼットから個々の細胞を単離して、個々の細胞にするステップ、および
ｄ）ステップｃ）からの単離された少なくとも１個の前記個々の細胞をある時間、ｈＮＳＣのコンフルエントな集団の生成を提供する条件下で培養するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記ロゼットからの少なくとも１個の前記個々の細胞の前記単離が手動で実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ロゼットからの少なくとも１個の前記個々の細胞の前記単離が酵素により実施される、項目１に記載の方法。
（項目４）
ステップａ）の前記ロゼットからの少なくとも１個の前記個々の細胞の前記単離が手動で実施される、項目１に記載の方法。
（項目５）
ステップｃ）の少なくとも１個の前記個々の細胞の前記単離が酵素により実施される、項目１または４に記載の方法。
（項目６）
ステップａ）からｃ）のうちの１つまたは複数が２回またはそれよりも多く実施される、項目１に記載の方法。
（項目７）
ステップａ）からｄ）のうちの少なくとも１つが手動で実施される、項目１に記載の方法。
（項目８）
ステップａ）からｄ）のうちの少なくとも１つが機械的に実施される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ロゼットの前記単離がデジタル的に実施される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記胚様体をＥＳＩ－０１７から生成することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記胚様体（ＥＢ）を、ＥＢ培地中で超低接着表面において培養することをさらに含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＥＢが有効な時間培養された後、前記ＥＢ培地からＮ２培地に置き換えて、オルニチン／ラミニンコーティング表面においてステップａ）をさらに実行することをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＥＢが、ステップａ）の少なくとも１つのＥＢを作製するのに有効な時間、前記ＥＢ培地中で培養された後、前記ＥＢ培地からＮ２培地に置き換えることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ステップｃ）において単離された少なくとも１個の前記個々の細胞が、オルニチン／ラミニンコーティングプレートのＮ２培地中で有効な時間培養されて、ｈＮＳＣのコンフルエントな細胞集団を生成する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
ｈＮＳＣの前記コンフルエントな集団を、有効量のＮ２培地を用いて培養することをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
細胞の前記集団を拡大増殖させることをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞を遺伝子改変することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞が導入遺伝子の挿入またはＣＲＩＳＰＲによる改変によって遺伝子改変される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記導入遺伝子が、ＡｐｉＣＣＴ１、その断片、またはそれらのそれぞれの同等物であり、必要に応じて前記細胞において過剰発現する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
項目１５から１９のいずれか一項に記載の方法によって調製され、必要に応じてＢＮＤＦを発現するｈＮＳＣ。
（項目２１）
項目１０に記載の方法によって調製され、分化するとＢＮＤＦを発現するｈＮＳＣ。
（項目２２）
導入遺伝子の挿入またはＣＲＩＳＰＲによって遺伝子改変されている、項目２１に記載のｈＮＳＣ。
（項目２３）
項目１８に記載の細胞の集団。
（項目２４）
項目２０に記載の単離された細胞を含む組成物。
（項目２５）
項目２４に記載の集団および担体を含む組成物。
（項目２６）
保存剤および／または凍結保護剤をさらに含む、項目２４または２５に記載の組成物。（項目２７）
導入遺伝子を被験体に送達するか、またはそれを必要とする被験体における細胞を遺伝子編集するための方法であって、項目２０または２１に記載の有効量の細胞を投与することを含む、方法。
（項目２８）
前記被験体が哺乳動物である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記被験体がヒトである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
神経変性障害の処置またはシナプス結合の増強を必要とする被験体における神経変性障害を処置するかまたはシナプス結合を増強する方法であって、前記被験体に項目２０または２１に記載の有効量の単離された細胞を投与することを含む、方法。
（項目３１）
前記神経変性障害が、ハンチントン病、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、脳炎症、脳卒中、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、一次または二次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、慢性脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害、ギラン・バレー症候群、脊髄性筋委縮症、フリードライヒ運動失調症、筋萎縮性側索硬化症、およびハンチントン舞踏病の群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記被験体が哺乳動物である、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
前記被験体がヒトである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ｈＥＳＣと、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示とを含むキット。
（項目３５）
項目２０または２１に記載のｈＥＳＣと、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示とを含むキット。
（項目３６）
項目２０または２１に記載のｈＮＳＣが移植された非ヒト動物。
（項目３７）
ネズミ科動物またはヒツジである、項目３６に記載の非ヒト動物。

図１Ａ～１Ｄは、Ｒ６／２マウスに埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣが、行動を改善し、未成熟のニューロンおよび星状細胞への分化の証拠を呈示することを示す。（Ａ）ロータロッド課題は、非トランスジェニック同腹仔（ＮＴ）と比較したＲ６／２マウスにおける欠損を実証し、ｈＮＳＣ処置Ｒ６／２マウスでは、ビヒクル処置（Ｖｅｈ）マウスと比較して、埋め込みの１週間後（黒色のバー）および３週間後（灰色のバー）に落下までの平均潜時が増加した。（Ｂ）ポール試験は、ＮＴと比較してＲ６／２マウスが有する欠損を実証する。ｈＮＳＣ処置Ｒ６／２マウスは、埋め込みの４週間後ではＶｅｈマウスより速く下降するが（灰色のバー）、埋め込みの２週間後ではそうではなかった（黒色のバー）。（Ｃ）握力は、ＮＴと比較したＲ６／２マウスにおける欠損を実証する。ｈＮＳＣ処置Ｒ６／２マウスは、Ｖｅｈマウスと比較して４週間後により大きい強度のグラムを有するが（黒色のバー）、２週間後ではそうではなかった（灰色のバー）。（Ｄ）免疫組織化学（ＩＨＣ）。ニューロン限定前駆体細胞のマーカー（ダブルコルチン［ＤＣＸ］、ならびに星状細胞（ＳＣ１２１およびＧＦＡＰ）が同時局在するＲ６／２マウスの線条体中に埋め込まれたｈＮＳＣ（ヒトマーカーＳＣ１２１）。一元配置分散分析、それに続き、事後に実施されるシェッフェ、ボンフェローニ、およびホルムの多重比較計算を含むテューキーのＨＳＤ検定。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１（ｎ＝１５）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。 同上。 同上。 同上。

図２Ａ～２Ｆは、ＩＨＣが、Ｒ６／２マウスに埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣが分化することを示すことを示す。（Ａ）Ｒ６／２マウス中に埋め込まれたｈＮＳＣ（ＳＣ１２１）は、ニューロン限定前駆体細胞（ダブルコルチン［ＤＣＸ］）および星状細胞（ＳＣ１２１およびＧＦＡＰ）に分化する。（Ｂ）分化を示す高い倍率（６３３）：Ｒ６／２マウス中に埋め込まれたｈＮＳＣ（ヒト核マーカーＫｕ８０）は、ニューロン限定前駆体細胞（ＤＣＸ）および一部の星状細胞（Ｋｕ８０およびＧＦＡＰ）に分化する。（Ｃ）ｈＮＳＣ（Ｋｕ８０）およびニューロン限定前駆体細胞（ＤＣＸ）。（Ｄ）ｈＮＳＣ（Ｋｕ８０）およびニューロン限定前駆体細胞（βＩＩＩ－チューブリン）；ＤＡＰＩと共に示されるマウス細胞核。（Ｅ）ｈＮＳＣ（Ｋｕ８０）およびニューロン限定前駆体細胞（ＭＡＰ－２）；ＤＡＰＩと共に示されるマウス細胞核。（Ｆ）ｈＮＳＣ（Ｋｕ８０）は、分化した有糸分裂後の神経細胞マーカー（ＮｅｕＮ）と同時局在しない。

図３Ａ～３Ｆは、ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣの埋め込みが、Ｒ６／２マウスにおける皮質線条体の興奮性亢進を低減させることを示す。（Ａ）線条体およびＳＣ１２１でのＩＨＣにおいて記録されたビオシチン充填（矢印）ｈＮＳＣ。スケールバー、２０ｍｍ。（Ｂ）上のトレース：自発的発火ｈＮＳＣの細胞付着の記録。下のトレース：ｈＮＳＣからのｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣ。記録は、ｈＮＳＣにおける自発的な内部および外部へのシナプス電流を例示する。（Ｃ）ＭＳＮで記録されたｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣ。（Ｄ）ｈＮＳＣ（ＳＣ１２１）のクラスターの近くのビオシチン充填ＭＳＮ。スケールバー、２０ｍｍ。（Ｅ）Ｒ６／２ ＭＳＮの部分集団におけるｓＥＰＳＣの記録は、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリン（１０ｍＭ）の添加後に「てんかん様」の活性を示す（第１のトレース）。通例、これらの大振幅の興奮性事象の後に高頻度の小振幅ｓＥＰＳＣが続く。ｈＮＳＣ埋め込みを有するマウスにおいて、これらの事象は著しく頻度を低減した（第２のトレース）。（Ｆ）「てんかん様」の活性（ＢＩＣ後に６～８分）を有する細胞において、ｈＮＳＣを埋め込んだＲ６／２群に関して、ビヒクルと比較して、高頻度の自発的な事象の有意な減少に対応する累積的な事象間の間隔の確率分布における右方向のシフトが存在した（ｐ＜０．００１、二元配置反復測定分散分析とそれに続くボンフェローニ事後分析；^＊ｐ＜０．０５）。

図４Ａ～４Ｂは、宿主由来の神経末端は埋め込まれたｈＮＳＣとのシナプス結合を作ることを示す。（Ａ）非標識神経末端（Ｕ－ＮＴ）は、シナプス小胞を含有し、基礎となる標識された（ＳＣ１２１）ｈＮＳＣ樹状突起（Ｌ－ＤＥＮＤ）とのシナプス様の結合を作る（矢印）。接続は対称的であり得る。（Ｂ）非標識神経末端（Ｕ－ＮＴ）は、シナプス小胞を含有し、基礎となる標識された（ＳＣ１２１）ｈＮＳＣ樹状突起（Ｌ－ＤＥＮＤ）との非対称のシナプス結合（矢印）を作る。この非対称の結合は興奮性のシナプス結合を示唆する。

図５Ａ～５Ｇは、Ｑ１４０マウス中に埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣは行動を改善し、未成熟のニューロンおよび星状細胞への分化の証拠を呈示することを示す。（Ａ）細胞注射の３か月後における運動協調性（ポール課題）の一時的な改善。ＷＴ Ｖｅｈ（ｎ＝２０）、Ｑ１４０ Ｖｅｈ（ｎ＝１８）、Ｑ１４０ ｈＮＳＣ（ｎ＝１８）。ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ～Ｄ）処置の５．５か月後における走行輪（runningwheel）欠損の持続的な改善（ｎ＝５／群）。（Ｂ）処置の５．５か月後の７．５月齢の雄ＷＴまたはＱ１４０マウスにおける２週にわたる平均走行輪回転回数／３分／夜間を示すグラフ。二元配置分散分析による比較：群の作用Ｆ＝５２．９３、ｐ＜０．０００１；夜間の走行輪の作用Ｆ＝１７、ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ事後検定：Ｑ１４０ Ｖｅｈと比較して、^＊ｐ＜０．０１、^＊＊ｐ＜０．００１、および^＊＊＊ｐ＜０．０００１。（Ｃ）２週にわたる夜間の総平均走行輪回転。ボンフェローニ事後検定を含む二元配置分散分析：^＊ｐ＜０．０１、^＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）３つの群間で有意ではない運動学習の傾き。（ＥおよびＦ）新規物体認識。ｈＮＳＣは、臭い嗅ぎ行動時間（Ｅ）または行為（bout）の回数（Ｆ）の識別指標において、処置の５か月後にＱ１４０マウスにおける欠損を防止したが、３か月ではそうではなかった。ＷＴ Ｖｅｈ ｎ＝１８、Ｑ１４０ Ｖｅｈ ｎ＝１８、およびＱ１４０ ｈＮＳＣ ｎ＝１９。ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。（Ｇ）星状細胞（ＧＦＡＰ；ｂおよびｃ）またはニューロン限定前駆体細胞（ＤＣＸ；ｅおよびｆ）と共発現するヒト特異的抗体（ＨＮＡ；ａおよびｄ）を用いて染色することによるＱ１４０マウスにおけるｈＮＳＣの生存および分化。スケールバー、２０ｍｍ。全てのグラフは平均±ＳＥＭを示す。

図６Ａ～６Ｄは、ＨＤマウス中に埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣがＢＤＮＦの発現を増加させることを示す。（Ａ）ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ（Ｋｕ８０）は、ＢＤＮＦとの同時局在を示す；星状細胞はＧＦＡＰ陽性として示される。（Ｂ）Ｖｅｈ処置マウスはＢＤＮＦまたはｈＮＳＣを示さないが、ＧＦＡＰを有する。（Ｃ）埋め込みの６か月後のＱ１４０またはＷＴマウスの線条体におけるＥＬＩＳＡによるＢＤＮＦレベル。（Ｄ）Ｑ１４０マウスにおけるｈＮＳＣ処置は、ミクログリア活性化を減少させた。データは、平均＋９５％信頼区間（ｎ＝５／群）として提示される。バーは、各直径の細胞のパーセンテージを表し、灰色の部分は、信頼区間を表す。有意な線条体のミクログリア活性化が、ＷＴ Ｖｅｈと比較して、Ｑ１４０ Ｖｅｈで観察された。Ｑ１４０ ｈＮＳＣマウスは、Ｑ１４０ Ｖｅｈマウスと比較して、線条体におけるミクログリア活性化の有意な低減を示した。ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析により、^＊ｐ＜０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図７Ａ～７Ｆは、Ｒ６／２マウスに埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣが、Ｑ１４０マウスにおいて散在性凝集体および封入体における減少を引き起こし、ハンチンチン凝集体を低減させることを示す。（ＡおよびＢ）ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣは、Ｒ６／２マウスにおける散在性凝集体および封入体の減少（Ａにおける矢印）を引き起こす。（Ａ）非ｈＮＳＣ核染色のためにニッケル、ＨＴＴマーカーＥＭ４８、およびクレシルバイオレットを用いたＫｕ８０の画像。ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒを使用して実施した立体解析学的評価。５３対物レンズ下での輪郭描画（左のパネルにおいて、点線、実施例）および１００３での計数。線条体全体にわたる６つの切片に関して、３つごとの切片を計数し（４０ｍｍの冠状切片）、この場合、Ｋｕ８０は、ブレグマ０．５ｍｍとブレグマ＿０．３４ｍｍとの間に見ることができる。（Ｂ）凝集体または封入体を有する細胞のパーセンテージを描写するグラフ（ｎ＝４／群）、ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析により、^＊＊ｐ＜０．０１。（ＣおよびＤ）ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣは、Ｑ１４０マウスにおいてハンチンチン凝集体を低減させる。（Ｃ）ＨＴＴマーカーＥＭ４８の画像（矢印は封入体を示す）。（Ｄ）ＨＴＴ染色された核および凝集体を、凝集体タイプ／切片の定量に関してＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒで分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示される（ｎ＝５／群）。ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析により^＊ｐ＜０．０５。（ＥおよびＦ）ｈＮＳＣ移植は、Ｒ６／２マウスにおける不溶性タンパク質の蓄積をモジュレートする。線条体溶解産物のウエスタンブロットを、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分に分離した。（Ｅ）ＮＴと比較して不溶性の蓄積したｍＨＴＴで富化されたＲ６／２。Ｒ６／２におけるｈＮＳＣ移植は、ｖｅｈ処置動物と比較して不溶性ＨＭＷが蓄積したＨＴＴの有意な低減をもたらす。Ｒ６／２線条体は、ＮＴと比較して不溶性ユビキチンコンジュゲートタンパク質も富化される。Ｒ６／２マウスにおけるｈＮＳＣ移植は、ｖｅｈ処置と比較して、ユビキチン改変不溶性コンジュゲートタンパク質の有意な低減をもたらし、ｖｅｈ対照と比較してＮＴにおける有意な効果がない。（Ｆ）ｍＨＴＴおよびユビキチンの相対的なタンパク質発現の定量。値は、平均±ＳＥＭを表す。Ｒ６／２における相対的な不溶性の蓄積したｍＨＴＴおよびユビキチンコンジュゲートしたタンパク質発現の統計的有意性を、一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定（ｎ＝３／処置）を用いて決定した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図８Ａ～８Ｄは、単色のフローサイトメトリーによるＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣの特徴付けを示す。（Ａ）ＣＤ２４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＮｅｓｔｉｎおよびＰａｘ６ ＮＳＣマーカーについて陽性のＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ染色。多能性マーカーＳＳＥＡ４について陰性のＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ染色。ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣに対する核型分析を実施し、中期を、濃縮した染色体のギムザ染色によって可視化した。最終的な核型は、４６ ＸＸの正常なプロファイルと共に高い分裂指数を有することが示された。（Ｂ）ＮＳＣ製造プロセスの流れ図：ｈＮＳＣは、胚様体（ＥＢ）形成、続いて生成したＥＢのポリ－オルニチン－ラミニン（ポリ－Ｏ）コーティングプレートへのプレーティング、それに続く神経ロゼット形成によって生成される。ロゼットを手動で切離し、新鮮なポリ－Ｏプレートに移し、そこにそれらを付着させる。次いで拡大増殖した神経ロゼットを酵素で切離し、続いて新鮮なポリ－Ｏプレートにプレーティングする。そこで細胞をコンフルエントになるまで成長させ、より多くのポリ－Ｏプレートに酵素によって継代させる。十分な数に拡大増殖させた後、生成したｈＮＳＣの最終的な回収および凍結保存を実施する。（Ｃ）培養したＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣの免疫細胞化学は、神経外胚葉の幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎの陽性ＮＳＣ染色およびＤＡＰＩ核染色を示す。スケールバーは３０μｍに等しい。（Ｄ）はロゼットの写真である。 同上。 同上。

図９は、クラスピング（clasping）行動であり、ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣで処置したＲ６／２マウス（ｎ＝１５）は、埋め込み後、遅延型のクラスピング行動を示すことを示す。非トランスジェニック（ＮＴ）マウスはこの表現型を実証しない。マウスを表現型について毎日試験し、グラフは、研究の経過にわたりクラスピングを示す各群のパーセンテージを描写する。クラスピングアッセイの有意性を、フィッシャーの直接確率検定によって決定した。

図１０Ａ～１０Ｅは、ＥＳＩ－０１７の低倍率の免疫組織化学を示す。ｈＮＳＣ埋め込みＲ６／２マウス：Ｒ６／２マウス中に埋め込まれたｈＮＳＣ（ヒトマーカーＳＣ１２１）は、ニューロン限定前駆体細胞（ダブルコルチンＤＣＸ）のマーカーと同時局在する。ｈＮＳＣに関してスクリーニングするために、ＩＨＣは、切片番号３４、３７、４０、４３、４６、および４９（それぞれブレグマ０．３８ｍｍ、０．２６ｍｍ、０．１４ｍｍ、０．０２ｍｍ、－０．１０ｍｍ、および－０．２２ｍｍに等しい）で実施される。Ｓ２は、他の冠状切片との比較のための図１Ｄに示される画像の再使用である。Ｒ６／２マウス免疫組織化学におけるＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ埋め込み：（Ａ）Ｒ６／２マウス中に埋め込まれたｈＮＳＣ（ヒトマーカーＫｕ８０）は、ＤＡＰＩと共に示される希突起膠細胞マーカー（Ｏｌｉｇ２）マウス細胞核と同時局在しない。分化を示す高い倍率（６３×）：（Ｂ）ｈＮＳＣ（ヒト核マーカーＫｕ８０および細胞質マーカーＳＣ１２１ブルー）は、ニューロン限定前駆体細胞（ＢＩＩＩ－チューブリン）との同時局在（ｌｔ．ブルー）を示す。（Ｃ）ｈＮＳＣ（ヒト核マーカーＫｕ８０および細胞質マーカーＳＣ１２１）は、ニューロン限定前駆体細胞（ＭＡＰ－２）との同時局在を示す。（Ｄ）ｈＮＳＣ（ヒト核マーカーＫｕ８０）は、ハンチンチンマーカー（ＥＭ４８）と同時局在しない。（Ｅ）Ｓ１－６は、ブレグマ１．７０ｍｍから始まり、切片１つ当たり４０ｕｍの、収集され免疫染色された冠状切片を示す。

図１１Ａ～１１Ｂは、線条体に埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣが、Ｑ１４０マウスにおいて、オープンフィールドまたはケージよじ登り試験における欠損を改善しなかったことを示す。埋め込みの０．５か月前、または埋め込みの３および５か月後に、オープンフィールドで１５分（Ａ）、およびケージよじ登りで５分間（Ｂ）マウスを試験した。データを平均±ＳＥＭとして表す；Ｗｔ Ｖｅｈ（ｎ＝１８）、Ｑ１４０ Ｖｅｈ（ｎ＝１８）、およびＱ１４０ ｈＮＳＣ（ｎ＝１７）。ボンフェローニ事後検定を含む二元配置分散分析で、ビヒクル処置Ｗｔマウスの同じ時点と比較して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

図１２Ａ～１２Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ ＢＤＮＦ発現を示す。ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣを神経幹細胞培地中で培養した。（Ａ）または分化させ（Ｂ）、次いでＢＤＮＦヒト核マーカーＫｕ８０およびダブルコルチンＤＣＸについて染色した。（Ｃ）培養したＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣからのＲＮＡレベルを比較するｑＰＣＲは、分化に伴い増加したＢＤＮＦ発現を示す。比較すると、幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎは分化に伴い減少し、ＤＣＸは増加した。

図１３Ａ～１３Ｅは、（ＡおよびＢ）シナプトフィジンレベルは、ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣを有するＱ１４０マウスの線条体中で増加することを示す。（Ａ）マイクロアレイスキャナーで画像をとり、蛍光強度について定量した。白色のスケールバーは１０μｍに等しい。（Ｂ）データは平均±ＳＥＭとして示され、使用された統計的検定は、ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析であり、^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５匹のマウス／群。Ｒ６／２マウスにおけるｈＮＳＣ処置は、ミクログリア活性化を変化させない。データは、平均＋９５％信頼区間として表される（ｎ＝５／群）。バーは各直径の細胞パーセントを表し、色付きの部分は信頼区間を表す。（Ｃ）ビヒクルで処置したＲ６／２マウス（Ｒ６／２ Ｖｅｈ）で観察された、非トランスジェニック対照（ＮＴ Ｖｅｈ）と比較した有意な線条体のミクログリア活性化。（Ｄ）ＮＴ＋ビヒクルとＮＴ＋ｈＮＳＣとの比較。（Ｅ）ｈＮＳＣで処置したＲ６／２マウス（Ｒ６／２ ＮＳＣ）は、Ｒ６／２ Ｖｅｈマウスと比較して、線条体におけるミクログリア活性化の有意な低減を示さなかった。

図１４は、Ｒ６／２マウスにおけるヒトＨＴＴ導入遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲを示す。ＲＰＬＰＯ（大きいリボソームタンパク質）内因性対照を使用して、ｃＤＮＡ試料中の遺伝子発現の差を正規化した。ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析によって決定したところ、有意性は観察されなかった。

図１５Ａ～１５Ｆは、５週齢のＲ６／１マウスの両側の線条体内に、ｓＡｐｉＣＣＴ１またはｍＣｈｅｒｒｙ対照を発現するＡＡＶを注射したことを示す。２つの別個の実験で、マウスに１２×１０^９ゲノムコピーのＡＡＶ２／１を注射し、１７週齢で回収した。（Ａ）概略図。（Ｂ、Ｃ）アガロースゲル電気泳動とそれに続くウエスタンブロットの定量は、動物におけるオリゴマーｍＨＴＴの有意な低減を示す。（Ｄ）免疫組織化学は、ｓＡｐｉＣＣＴ１（抗ＨＡ）の発現を示す。（Ｅ）ｓＡｐｉＣＣＴ１が注射されたマウスは、立体解析学により、可視ｍＨＴＴ封入体のおよそ４０％の低減を示す（抗ＥＭ４８）。（Ｆ）ｓＡｐｉＣＣＴ１－ＡＡＶ２／１が注射されたマウスは、ロータロッド運動課題における改善を示し、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＞０．０１。

図１６Ａ～１６Ｄは、ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣがＡｐｉＣＣＴを産生することを示す。（Ａ）０、５、１０または１５のＭＯＩでｓＡｐｉＣＣＴレンチウイルスが形質導入されたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣを形質導入後４８時間培養し、溶解させ、ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットを実施し、次いでストリッピングし、ローディング対照のためにアルファ－チューブリン抗体で再度プロービングした。（Ｂ）ｈＮＳＣから分泌されたＡｐｉＣＣＴは、ＰＣ１２ Ｈｔｔ１４Ａ２．６細胞に侵入する。ｓＡｐｉＣＣＴレンチウイルスが形質導入されたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣからの条件培地を、ＨＴＴ－ＧＦＰを発現するようにＥｔＯＨ中のポナステロンにより誘導された１４Ａ２．６細胞またはＥｔＯＨ単独で処置した対照に適用した。ＡｐｉＣＣＴ１が細胞溶解物中で検出され、これは、移植後に近接する細胞によって取り込むことができる分泌された形態のＡｐｉＣＣＴ１を発現するようにｈＮＳＣを操作することが実行可能であることを裏付ける。ＨＡ抗体を使用したウエスタンブロットを示す。処置したＰＣ１２細胞溶解物において、より高いＭＯＩで、より多くの量のＡｐｉＣＣＴ１が検出される。（Ｃ）ｈＮＳＣから分泌されたＡｐｉＣＣＴ１は、ＰＣ１２ Ｈｔｔ１４Ａ２．６細胞における単量体ＨＴＴを変化させない。ｓＡｐｉＣＣＴレンチウイルスが形質導入されたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣからの条件培地を、ポナステロンによって誘導された１４Ａ２．６細胞またはＥｔＯＨ単独で処置した対照に適用した。分泌されたＡｐｉＣＣＴ１での処置は、単量体ｍＨＴＴ－ＧＦＰ導入遺伝子における変化を起こさなかった。ＧＦＰ抗体を使用してウエスタンブロットを示し、次いでストリッピングし、ローディング対照としてのアルファ－チューブリンのために再度プロービングした。（Ｄ）ｈＮＳＣから分泌されたＡｐｉＣＣＴ１は、ＰＣ１２ Ｈｔｔ１４Ａ２．６細胞においてオリゴマーＨＴＴ種を変化させる。ｓＡｐｉＣＣＴ１レンチウイルスが形質導入され、ポナステロンによって誘導された１４Ａ２．６細胞またはＥｔＯＨ単独で処置した対照に適用されたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣからの条件培地は、最大のＭＯＩでオリゴマーＨＴＴの低減を引き起こした（赤色のボックス）。ＧＦＰ抗体を使用した代表的な試料のウエスタンブロットを示す。

図１７Ａおよび１７Ｂは、ＩＨＣが、ＡｐｉＣＣＴのためのウイルスが形質導入され、Ｒ６／２マウスの線条体中に埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣはＡｐｉＣＣＴを発現することを示すことを示す。（Ａ）Ｒ６／２マウス中に埋め込まれたｈＮＳＣ（ヒト核抗原［ＨＮＡ］）は、ニューロン限定前駆体細胞（ダブルコルチン［ＤＣＸ］）に分化し、ＨＡタグ付きＡｐｉＣＣＴ（ＨＡ）を発現する。（Ｂ）分化およびＡｐｉＣＣＴ発現を示す、Ａで示される白色のボックス中の区域から撮った高倍率（９５×）：Ｒ６／２マウス中に埋め込まれたｈＮＳＣ（ＨＮＡ）は、ニューロン限定前駆体細胞（ＤＣＸ）に分化し、ＨＡタグ付きＡｐｉＣＣＴ（ＨＡ）を発現する。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料がここで記載される。本明細書で引用される全ての技術および特許刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいずれも、本発明が先行発明のためにそのような開示に先立つ権利を有しないという承認として解釈されるべきではない。

本出願全体および本出願内において、技術および特許文献は引用によって参照される。これらの参考文献のうちのいくつかに関して、同定のための引用は、本出願の末尾、特許請求の範囲の直前に見出される。全ての刊行物は、本開示が属する技術分野の水準をより完全に説明するために、参照によって本開示に組み込まれる。

本開示の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技法を用いる。例えば、Sambrookand Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3^rdedition；the series Ausubel et al. eds. (2007) CurrentProtocols in MolecularBiology；the series Methods in Enzymology (AcademicPress, Inc., N.Y.)；MacPhersonet al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRLPress at Oxford University Press)；MacPhersonet al. (1995) PCR 2: A PracticalApproach；Harlow and Lane eds. (1999)Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney(2005) Culture of Animal Cells: AManual of Basic Technique, 5^thedition；Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；Hames andHiggins eds. (1984) NucleicAcid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic AcidHybridization；Hames and Higginseds. (1984) Transcription and Translation；ImmobilizedCells and Enzymes (IRLPress (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide toMolecular Cloning；Miller andCalos eds.
(1987) Gene Transfer Vectors forMammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makridesed. (2003) GeneTransfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic
Press, London)；Herzenberget al. eds (1996) Weir's Handbook of ExperimentalImmunology；Manipulating theMouse Embryo: A Laboratory Manual, 3^rdedition (Cold Spring HarborLaboratory Press (2002))；Sohail (ed.) (2004) GeneSilencing by RNAInterference: Technology and Application (CRC Press)を参照のこと。

範囲を含む全ての数値指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、適宜、０．１または１．０単位で（＋）または（－）に変動する近似値である。常に明示的に述べられるわけではないが、全ての数値指定が「約」という用語によって先行されることは理解されるべきである。常に明示的に述べられるわけではないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的なものに過ぎず、そのような試薬の同等物は当技術分野で公知であることもまた理解されるべきである。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、文脈上別段の指示が明確にない限り、複数の指示対象が含まれる。例えば「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語には、その混合物を含め、複数の細胞が含まれる。

本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物および方法が、記載された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、述べられた目的のための組合せに対して何らかの本質的な意義を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量夾雑物、ならびに薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水、保存剤等を除外しない。「からなる」は、微量よりも多い他の構成成分の要素、および本発明の組成物を投与するための実質的な方法ステップまたは組成物を製造するかもしくは所期の結果を達成するためのプロセスステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。

「単離された」という用語は、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸に関して使用される場合、それぞれ高分子の天然源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離した分子を指す。「単離された核酸」という用語には、断片として天然には存在せず、天然状態において見出すことができない核酸断片が含まれるものとする。「単離された」という用語はまた、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されるポリペプチド、タンパク質、および／または宿主細胞を指すためにも使用され、精製ポリペプチドと組換えポリペプチドとの両方を包含するものとする。他の実施形態では、「単離された」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片が、天然では通常会合している細胞およびその他の構成要素から分離されたことを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離している細胞である。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、その天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。

「単離すること」という用語は、組成物または成分を、極めて近くにあるかまたはそれと付随している他のものから分離するプロセスを表す。細胞は、手動で（例えばピペットもしくは他の道具を使用して手で）、化学的作用物質の使用によって酵素により、または細胞もしくはロゼット形態学に基づいたデジタル技法の使用によってデジタル的に単離することができる。例えば、cellavision.com/en/introducing-digital-cell-morphology-by-cellavision（アクセス日２０１８年５月２２日）を参照のこと。

「分化培地」とは、未熟細胞のより成熟した表現型への分化、例えば胚性幹細胞から神経系細胞への分化を促進する、ある特定の増殖因子等の因子を含有する細胞培養培地を表す。

本明細書で使用される場合、「コンフルエントな集団」という用語は、隣接細胞と切れ目なく接触している細胞の集団を表す。

「超低接着表面」とは、一部の態様では、親水性であり電荷中立の共有結合したヒドロゲル層を含有する細胞または組織培養表面を表す。タンパク質および他の生体分子は、疎水性またはイオン性相互作用のいずれかを介してポリスチレン表面に受動的に吸着するため、このヒドロゲル表面は、これらの力を介した非特異的な固定を天然に阻害し、したがってその後の細胞接着を阻害する。これらの表面は、多様な販売業者、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、Ｆｉｓｈｅｒ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、およびＳ－ｂｉｏから市販されている。細胞培養プレートおよび表面を製造することに関する方法は当技術分野で公知である。

「導入遺伝子」とは、細胞、組織、または生物に付加されたポリヌクレオチドを表す。導入遺伝子の一例はＡｐｉＣＣＴ１である。

「ＡｐｉＣＣＴ１」とは、ＣＣＴ１の頂端ドメイン、および／またはＣＣＴ１の前記頂端ドメインをコードするポリヌクレオチドを指す（参照によって本明細書に組み込まれる、Sontag,E. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Feb 19;110(8):3077-82）。ＣＣＴ１と
は、ＴＣＰ１環複合体（ＴＲｉＣ）としても公知のＴＣＰ１含有シャペロニン複合体（ＣＣＴ）のメンバーである分子シャペロンである。この複合体は、それぞれが８つの異なるタンパク質を含有する２つの同一の積み重なった環からなる。折り畳まれていないポリペプチドは、複合体の中心の空洞に入り、ＡＴＰ依存的に折り畳まれる。複合体は、アクチンおよびチューブリンを含む様々なタンパク質を折り畳む。一部の実施形態では、ＡｐｉＣＣＴ１は２０ｋＤａのサイズである。ヒトでは、ＴＣＰ１環複合体はＴＣＰ１遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子６９５０）によってコードされる。ＴＣＰ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列の非限定的な例は、本明細書において配列番号１～４として提供される。頂端ドメインは基質結合に関与する。（参照によって本明細書に組み込まれる、Pappenberger,G.et al. J Mol Biol. 2002 May 17;318(5):1367-79）。ＡｐｉＣＣＴ１の配列の非限
定的な例は以下に提供される（配列番号７）：

「ｓＡｐｉＣＣＴ１」とは、分泌型のＡｐｉＣＣＴ１を指す。ｓＡｐｉＣＣＴの核酸配列およびアミノ酸配列の非限定的な例は、以下に提供される。下線を付けた配列はＨＡタグに対応する。一部の実施形態では、ｓＡｐｉＣＣＴ１はタグを含まない。
ｓＡｐｉＣＣＴ１ ｍＲＮＡ（配列番号８）
ｓＡｐｉＣＣＴ１ペプチド（配列番号９）

本明細書で使用される場合、「ＢＤＮＦ」とは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびその同等物、ならびに／またはＢＤＮＦもしくはその同等物をコードするポリヌクレオチドを表す。ＢＤＮＦは、中枢神経系および末梢神経系のニューロンに作用し、現存するニューロンの生存を支持すること、ならびに新たなニューロンおよびシナプスの成長および分化を促すことに役立つ。ＢＤＮＦはまた、海馬、皮質、および前脳基底部－学習、記憶、および高次思考に不可欠な区域－において活性である。網膜、運動ニューロン、腎臓、唾液、および前立腺においても発現する。ＢＤＮＦタンパク質は、ＢＤＮＦ遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：６２７、ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００１１４３８０５、ＮＭ＿００１１４３８０６、ＮＭ＿００１１４３８０７、ＮＭ＿００１１４３８０８、ＮＭ＿００１１４３８０９、ＮＭ＿００１１４３８１０、ＮＭ＿００１１４３８１１、ＮＭ＿００１１４３８１２、ＮＭ＿００１１４３８１３、ＮＭ＿００１１４３８１４、ＮＭ＿００１１４３８１５、ＮＭ＿００１１４３８１６、ＮＭ＿００１７０９、ＮＭ＿１７０７３１、ＮＭ＿１７０７３２、ＮＭ＿１７０７３３、ＮＭ＿１７０７３４、ＮＭ＿１７０７３５）によってコードされる。ＢＤＮＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質配列の非限定的な例は、本明細書において配列番号５～６として提供される。

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文反復配列経路に依存する配列特異的遺伝子操作の技法を指す。ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子編集および／または遺伝子調節を実施するため、ならびに単にタンパク質を特異的ゲノム位置にターゲティングするために使用することができる。遺伝子編集とは、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列への欠失、挿入、または塩基置換の導入によって変更される遺伝子工学の種類を指す。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えの経路を利用して、編集を実施する。遺伝子調節とは、タンパク質またはＲＮＡ等の特異的遺伝子産物の産生を増加または減少させることを指す。

「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ技法を用いた修正のための特異的な遺伝子を標的とするために使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性のためにｇＲＮＡおよびドナー治療ポリヌクレオチドを設計する技法は当技術分野で周知である。例えば、Doench,J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7、Mohr, S.et al. (2016) FEBSJournal 283: 3232-38、およびGraham, D., et al. Genome Biol.2015; 16: 260。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む融合ポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むポリヌクレオチドを含むか、または代替的にはこれから本質的になるか、またはさらにはこれからなる。一部の態様では、ｇＲＮＡは合成である（Kelley,M.et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83）。本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡの生物学的同等物としては、これらに限定さ
れないが、Ｃａｓ９またはその同等物を細胞のゲノムの特異的領域等の特異的ヌクレオチド配列に導くことができるポリヌクレオチドまたはターゲティング分子が挙げられる。

細胞におけるＣＲＩＳＰＲの発現は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および細胞における標的遺伝子に特異的なガイドＲＮＡを使用して達成することができる。好適な発現系、例えばレンチウイルスまたはアデノウイルス発現系は当技術分野で公知である。ＣＲＩＳＰＲ編集構築物は内在性遺伝子をノックアウトすることと遺伝子をノックインすることとの両方に有用であり得るということがさらに理解される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ系はこれらの目的のうちの一方または両方を実現するために設計することができることが理解される。

当業者に公知であるように、ウイルスに関して６つのクラスが存在する。ＤＮＡウイルスはクラスＩおよびＩＩを構成する。ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスは残りのクラスをなす。クラスＩＩＩウイルスは二本鎖ＲＮＡゲノムを有する。クラスＩＶウイルスは一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有し、このゲノム自体はｍＲＮＡとして作用する。クラスＶウイルスはｍＲＮＡ合成のための鋳型として使用される一本鎖マイナス鎖ＲＮＡゲノムを有する。クラスＶＩウイルスは一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有するが、複製だけでなくｍＲＮＡ合成においてもＤＮＡ中間体を含む。レトロウイルスは遺伝情報をＲＮＡの形態で保有するが、レトロウイルスが細胞に感染すると、そのＲＮＡは感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ形態に逆転写される。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかである任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実施し得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、もしくはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等の改変ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後、例えば標識成分とのコンジュゲートによってさらに改変することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子との両方も指す。別段の指定も要求もない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態をなすことが公知であるかまたは予測される２本の相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。

ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の４種類のヌクレオチド塩基の個別の配列から構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央演算処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力され、機能ゲノミクスおよび相同性検索等のバイオインフォマティクス適用のために使用することができる。

「相同性」、または「同一性」、または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としてアラインメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列のある位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められている場合、分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致または相同位置の数の関数である。「関連性のない」または「非相同」配列は、本発明の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、または代替的には２５％未満の同一性を共有する。

ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が別の配列とある特定のパーセンテージ（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の「配列同一性」を有するとは、アラインメントした場合に、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が２つの配列を比較して同じであることを意味する。このアラインメント、およびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばAusubelet al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているソフトウェアプ
ログラムを使用して決定することができる。好ましくは、初期パラメーターがアラインメントのために使用される。１つのアラインメントプログラムは、初期パラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下の初期パラメーター：遺伝暗号＝標準、フィルター＝無し、鎖＝２、カットオフ＝６０、期待値＝１０、行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、表示＝５０配列、ソーティング＝高スコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットアドレス：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTにおいて見出すことができる。

等価または生物学的に等価な核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、またはペプチドは、参照核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、または代替的には少なくとも８５％の配列同一性、または代替的には少なくとも９０％の配列同一性、または代替的には少なくとも９２％の配列同一性、または代替的には少なくとも９５％の配列同一性、または代替的には少なくとも９７％の配列同一性、または代替的には少なくとも９８％の配列同一性を有するものである。

「ポリヌクレオチドの増幅」という用語には、ＰＣＲ、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）、および増幅方法等の方法が含まれる。これらの方法は当技術分野で公知であり、広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにInniset al., 1990（ＰＣＲに関して）、およびWu et al. (1989) Genomics 4:560-569（ＬＣＲに関して）を参照のこと。全般に、ＰＣ
Ｒ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（またはライブラリー）内の個別の遺伝子に対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを使用する複数ラウンドのアニーリング、伸長、および変性を伴うその後の増幅、ならびに（ｉｉｉ）正しいサイズのバンドに関してＰＣＲ産物をスクリーニングすることで構成される遺伝子増幅の方法を記載する。使用されるプライマーは、重合の開始をもたらすのに十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドである、すなわち、各プライマーは、増幅されるゲノム遺伝子座の各鎖に相補的となるように特異的に設計される。

ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは市販されている。特定の遺伝子領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは標的領域またはその隣り合う領域の配列に相補的であり、特異的にハイブリダイズする。増幅によって生成される核酸配列は、直接配列決定されてもよい。あるいは、増幅された配列は、クローニングされた後に配列分析されてもよい。酵素により増幅されたゲノムセグメントの直接クローニングおよび配列分析のための方法は、当技術分野で公知である。

「遺伝子」とは、転写および翻訳された後の特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。

「発現する」という用語は、遺伝子産物の産生を指す。

本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。

「遺伝子産物」または代替的には「遺伝子発現産物」とは、遺伝子が転写および翻訳される際に生成されるアミノ酸（例えばペプチドまたはポリペプチド）を指す。

「転写制御下」とは、当技術分野で十分に理解されている用語であり、通例はＤＮＡ配列であるポリヌクレオチド配列の転写が、転写の開始に寄与するかまたは転写を促進するエレメントに配列が作動的に連結することに依存することを示す。「作動的に連結する」とは、ポリヌクレオチドが、細胞において機能することが可能となるように配置されることを表す。一態様では、本発明は、下流の配列、例えば、自殺遺伝子、ＡｐｉＣＣＴ１をコードするポリヌクレオチド、ｓＡｐｉＣＣＴ１等のその断片、またはそれらのそれぞれの同等物に作動的に連結するプロモーターを提供する。

「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、本来の状態において、または当業者に周知の方法によって操作された際に、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生することができるという場合にポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補鎖であり、コード配列はそこから導出することができる。

「プローブ」とは、ポリヌクレオチド操作の文脈において使用される場合、目的の試料に潜在的に存在する標的を、標的とハイブリダイズすることによって検出するための試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを指す。通例、プローブは、検出可能な標識、またはハイブリダイゼーション反応の前もしくは後のいずれかに標識が接着することを可能にする手段を含み得る。あるいは、「プローブ」は、目的の試料に潜在的に存在する標的に結合することができる生体化合物、例えば、ポリペプチド、抗体、またはそれらの断片であってもよい。

「検出可能な標識」または「マーカー」としては、これらに限定されないが、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、染料、および酵素を含むタンパク質が挙げられる。検出可能な標識はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または組成物に接着することができる。

「プライマー」とは、全般的に、目的の試料に潜在的に存在する標的または「鋳型」に、標的とハイブリダイズすることによって結合し、その後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、遊離３’－ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、「上流」プライマーおよび「下流」プライマーからなる「１対のプライマー」または「１組のプライマー」と、重合の触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、および典型的には熱安定性ポリメラーゼ酵素とを使用して、標的ポリヌクレオチドから複製コピーが作られる反応である。ＰＣＲのための方法は、当技術分野で周知であり、例えばMacPhersonet al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press atOxford University Press)において教示されている。ＰＣＲまたは遺伝子クローニング等の、ポリヌクレオチドの複製コピーを作製する全てのプロセスは、本明細書ではまとめて「複製」と称される。プライマーはまた、サザンまたはノーザンブロット分析等のハイブリダイゼーション反応におけるプローブとして使用することもできる。下記のSambrookandRussell (2001)。

「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、または他の任意の配列特異的な方法によって生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本もしくはそれよりも多い鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスにおけるステップ、例えばＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成してもよい。

ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施することができる。全般に、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、１０×ＳＳＣ中約４０℃で、または等価なイオン強度／温度の溶液中で実行される。中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、典型的には６×ＳＳＣ中約５０℃で実施され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、全般的に１×ＳＳＣ中約６０℃で実施される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の追加の例としては、低ストリンジェンシーの、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度、約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約０％～約２５％のホルムアミド濃度、および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中等度ハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度、約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度、約３０％～約５０％のホルムアミド濃度、および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度、約５５％～約７５％のホルムアミド濃度、および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。全般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、１、２、またはそれよりも多い洗浄ステップを含めて５分～２４時間であり、洗浄インキュベーション時間は約１、２、または１５分である。ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用するＳＳＣの同等物が用いられ得ることは理解される。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者に周知である「生理的条件」下において実施することもできる。生理的条件の非限定的な例は、細胞において通常見出される温度、イオン強度、ｐＨ、およびＭｇ^２＋の濃度である。

ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間において逆平行構成で行われる場合、その反応は「アニーリング」と称され、それらのポリヌクレオチドは「相補的」と記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖の一方と第２のポリヌクレオチドとの間で行われ得る場合、別のポリヌクレオチドに「相補的」または「相同」であり得る。「相補性」または「相同性」（あるポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に認められている塩基対形成則に従って互いに水素結合を形成すると予期される対向する鎖の塩基の割合の点から定量可能である。

「増大させる」または「拡大増殖させる」という用語は、細胞または細胞の集団を成長させることを意味する。「成長する」という用語もまた、維持培地、栄養素、増殖因子、支持細胞、または所望の数の細胞もしくは細胞型を取得するのに必要な任意の化学化合物もしくは生体化合物の存在下における細胞の増殖を指す。

「培養すること」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生物のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増大を指す。培養において成長した細胞の子孫が親細胞と完全には同一でない場合がある（すなわち、形態的に、遺伝子的に、または表現型的に）ことは理解される。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、例えば形質転換のプロセスによって細胞内に置かれる場合にベクターが複製され得るように完全なレプリコンを含む非染色体核酸を指す。ベクターはウイルス性であっても非ウイルス性であってもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス（bacculoviruses）、改変バキュロウイルス、パポウイルス（papovirus）、ま
たはその他の改変された天然に存在するウイルスが挙げられる。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターとしては、裸のＤＮＡ；単独またはカチオン性ポリマーと組み合わせたカチオン性脂質と複合体化したＤＮＡ；アニオン性およびカチオン性リポソーム；不均質なポリリシン、定められた長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーと縮合したＤＮＡを含み、場合によってはリポソームに含有されるＤＮＡ－タンパク質複合体および粒子；ならびにウイルスおよびポリリシン－ＤＮＡを含む三元複合体の使用が挙げられる。

「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかにおいて宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換え作製されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が挙げられる。セムリキ森林ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクター等のアルファウイルスベクターもまた、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。Schlesingerand Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439、およびYing,et al. (1999)Nat.
Med. 5(7):823-827を参照のこと。

遺伝子移入がレンチウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物とは、レンチウイルスゲノムまたはその部分と治療遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「レンチウイルス媒介遺伝子移入」または「レンチウイルス形質導入」は、同じ意味を有し、ウイルスが細胞に侵入してそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むために、遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定的に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、通常の感染機構を介して宿主細胞に侵入することも、異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合して細胞に侵入するように改変されることもできる。レトロウイルスは遺伝情報をＲＮＡの形態で保有するが、レトロウイルスが細胞に感染すると、そのＲＮＡは感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ形態に逆転写される。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。本明細書で使用される場合、レンチウイルスベクターとは、ウイルスまたはウイルス様侵入機構を介して外因性核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。「レンチウイルスベクター」は、他のレトロウイルスベクターと比べて非分裂細胞に形質導入することにおいてある特定の利点を有する、当技術分野で周知のレトロウイルスベクターの１種である。TronoD. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag BerlinHeidelbergを参照のこと。

本発明のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス（ＭＬＶを含有するレトロウイルスのサブグループ）およびレンチウイルス（ＨＩＶを含有するレトロウイルスのサブグループ）に基づいているかまたは由来している。例としては、ＡＳＬＶ、ＳＮＶ、およびＲＳＶが挙げられ、これらの全てはレンチウイルスベクター粒子産生系のためのパッケージング成分およびベクター成分に分けられている。本発明のレンチウイルスベクター粒子は、遺伝子的にまたは他の方法によって（例えばパッケージング細胞系の特異的選択によって）変更された形態の特定のレトロウイルスに基づいていてもよい。

本発明のベクター粒子が特定のレトロウイルス「に基づいている」とは、ベクターがその特定のレトロウイルスに由来していることを意味する。ベクター粒子のゲノムは、そのレトロウイルスからの成分を骨格として含む。ベクター粒子は、逆転写および組込み系を含む、ＲＮＡゲノムと適合性の必須のベクター成分を含有する。通例、必須のベクター成分としては、特定のレトロウイルスに由来するｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を挙げることができる。したがって、ベクター粒子の構造成分のうちの大部分は、通常ではそのレトロウイルスに由来すると考えられるが、所望の有用な特性を実現するように遺伝子的にまたは他の方法によって変更されてもよい。しかしながら、ある特定の構造成分、特にｅｎｖタンパク質は、異なるウイルスを起源としてもよい。感染または形質導入されるベクター宿主範囲および細胞型は、ベクター粒子産生系において異なるｅｎｖ遺伝子を使用してベクター粒子に異なる特異性を与えることによって変更することができる。

「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。プロモーターには、転写を適切に開始するために必要とされるプロモーターの最小部分であるコアプロモーターが含まれ、また転写因子結合部位等の調節エレメントも含まれることがある。調節エレメントは、転写を促進しても転写を阻害してもよい。プロモーターにおける調節エレメントは、転写活性化因子または転写抑制因子の結合部位であり得る。プロモーターは構成的または誘導性であり得る。構成的プロモーターとは、常に活性である、および／または基底レベルの転写を超える遺伝子の転写を絶えず指向するプロモーターを指す。そのようなプロモーターの非限定的な例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター；ＳＳＦＶ、ＣＭＶ、ＭＮＤＵ３、ＳＶ４０、Ｅｆ１ａ、ＵＢＣ、およびＣＡＧＧが挙げられる。誘導性プロモーターとは、細胞に付加されるかまたは細胞において発現する分子または因子によって誘導されることができるプロモーターである。誘導性プロモーターは、誘導の非存在下においても依然として基底レベルの転写を引き起こすことができるが、誘導は、典型的には非存在下におけるよりも有意に多いタンパク質の産生をもたらす。プロモーターはまた、組織特異的でもあり得る。組織特異的プロモーターは、プロモーターを活性化させるのに適切な転写因子を有するある特定の細胞の集団におけるタンパク質の産生を可能にする。

エンハンサーとは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーター機能とエンハンサー機能との両方を実現することができる配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーター機能とエンハンサー機能との両方を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内在性」であっても「外因性」であっても「異種」であってもよい。「内在性」エンハンサー／プロモーターとは、ゲノムの所与の遺伝子と天然に連結するエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターとは、遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作（すなわち分子生物学的技法）によってその遺伝子の近位に置かれるエンハンサー／プロモーターである。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、培養において無期限に分裂して特殊化した細胞を生じる能力を有する細胞を定義する。この時、説明の便宜上、幹細胞は体性（成体）または胚性として分類される。体性幹細胞とは、自己増殖し（クローナル）、（ある特定の限定を伴って）分化して、自身が起源とする組織の特殊化した細胞型の全てを生み出すことができる、分化した組織に見出される未分化細胞である。胚性幹細胞とは、多種多様な特殊化した細胞型になる可能性を有する、胚由来の原始（未分化）細胞である。胚性幹細胞は、数か月から数年の間、分化を伴わない増殖を可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で培養された細胞である。クローンとは、起源となる細胞、この場合は幹細胞と遺伝子的に同一である細胞の株である。

「幹細胞ロゼット」とは、拡大増殖下で一群の花弁のように見える幹細胞のクラスターを表す。例えば図８Ｄを参照のこと。

細胞の集団とは、表現型および／または遺伝子型の点で同一（クローナル）であるかまたは非同一である２個以上の細胞の集合を表す。実質的に同種の細胞の集団とは、予め選択したマーカーによって測定した場合に、少なくとも７０％、または代替的には少なくとも７５％、または代替的には少なくとも８０％、または代替的には少なくとも８５％、または代替的には少なくとも９０％、または代替的には少なくとも９５％、または代替的には少なくとも９８％同一の表現型を有する集団である。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」とは、必然ではないが典型的には妊娠およそ１０～１２週よりも前の妊娠中の任意の時間に得られた前期胚組織(pre-embryonictissue)（例えば胚盤胞等）、胚組織、または胎児組織を含む、受精後かつ妊娠末期前に形成された組織に由来する幹細胞を指す。大半の場合、胚性幹細胞は、初期胚または胚盤胞に由来する多能性細胞である。胚性幹細胞は、ヒト組織を含むがこれに限定されない好適な組織、または樹立した胚性細胞株から直接取得することができる。「胚性様幹細胞」とは、胚性幹細胞の特質を、全てではないが、１つまたは複数共有する細胞を指す。

神経幹細胞とは、ヒトを含む哺乳動物の成体中枢神経系から単離することができる細胞である。これらは、ニューロンを生成し、遊走して軸索突起および樹状突起を伸ばし、既存の神経回路に組み込まれ、正常な脳機能に寄与することが示されている。この分野の研究の概観は、Miller(2006) The Promise of Stem Cells for Neural Repair, BrainRes.
Vol. 1091(1):258-264；Pluchino et al. (2005) Neural Stem Cells and TheirUse asTherapeutic Tool in Neurological Disorders, Brain Res. Brain Res. Rev.,Vol.48(2):211-219；およびGoh, et al. (2003) Adult Neural Stem Cells and Repair oftheAdult Central Nervous System, J. Hematother. Stem Cell Res., Vol.12(6):671-679に見
出される。

「分化」とは、特殊化していない細胞が心臓、肝臓、または筋細胞等の特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスを示す。「指向性分化」とは、分化を特定の細胞型に誘導するための、幹細胞培養条件の操作を指す。「脱分化した」は、細胞の系譜において、より関わりのない位置に戻る細胞を定義する。本明細書で使用される場合、「分化するまたは分化した」という用語は、細胞の系譜において、より関わりのある（「分化した」）位置につく細胞を定義する。本明細書で使用される場合、「中胚葉（または外胚葉または内胚葉）系譜に分化する細胞」は、それぞれ個別の中胚葉、外胚葉、または内胚葉系譜に関わるようになる細胞を定義する。中胚葉系譜に分化するかまたは個別の中胚葉細胞を生じる細胞の例としては、これらに限定されないが、脂肪生成性、平滑筋原性、軟骨形成性、心原性、皮膚形成性、造血性、血管形成性、筋原性、腎形成性、泌尿生殖器形成性、骨原性、心膜形成性、または間質性である細胞が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「分化するまたは分化した」という用語は、細胞の系譜において、より関わりのある（「分化した」）位置につく細胞を定義する。「脱分化した」は、細胞の系譜において、より関わりのない位置に戻る細胞を定義する。人工多能性幹細胞は脱分化した細胞の例である。

本明細書で使用される場合、細胞の「系譜」は、細胞の遺伝、すなわち細胞の先祖および子孫を定義する。細胞の系譜は、細胞を発生および分化の遺伝体系内に位置付ける。

「多系列幹細胞」または「複能性幹細胞」とは、自己再生し、別個の発生系譜からさらに分化した少なくとも２種類の子孫細胞を再生する幹細胞を指す。系譜は、同じ胚葉（すなわち、中胚葉、外胚葉、または内胚葉）由来であっても、異なる胚葉由来であってもよい。多系列幹細胞の分化からの別個の発生系譜を有する２種類の子孫細胞の一例は、筋原性細胞および脂肪生成細胞である（両者は中胚葉起源であるが、異なる組織を生じる）。別の例は、神経原性細胞（外胚葉起源）および脂肪生成細胞（中胚葉起源）である。

「前駆体」または「前駆細胞」とは、特異的な型の細胞に分化する潜在能力を有する細胞を意味することを意図する。前駆細胞は幹細胞であってもよい。前駆細胞はまた、幹細胞より特異的であってもよい。前駆細胞は、単能性であっても複能性であってもよい。成体幹細胞と比べて、前駆細胞は細胞分化の後期であってもよい。前駆細胞の一例としては、限定されないが、前駆神経細胞が挙げられる。

「単為発生幹細胞」とは、卵子の単為発生的活性化から生じる幹細胞を指す。単為発生幹細胞を創製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Cibelli etal. (2002) Science 295(5556):819およびVrana et al. (2003)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 100(Suppl. 1)11911-6を参照のこと。

本明細書で使用される場合、「多能性細胞」は、少なくとも２種類の別個の（遺伝子型的におよび／または表現型的に）さらに分化した子孫細胞を生じることができる、より分化していない細胞を定義する。別の態様では、「多能性細胞」としては、非多能性細胞、典型的には成体体性細胞から人工的に誘導された幹細胞であって、これまで１つまたは複数の幹細胞特異的遺伝子の発現を誘導することによって作製されている人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。そのような幹細胞特異的遺伝子としては、これらに限定されないが、オクタマー転写因子、すなわちＯｃｔ－３／４のファミリー；Ｓｏｘ遺伝子、すなわち、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８のファミリー；Ｋｌｆ遺伝子、すなわち、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５のファミリー；Ｍｙｃ遺伝子、すなわち、ｃ－ｍｙｃおよびＬ－ｍｙｃのファミリー；Ｎａｎｏｇ遺伝子、すなわち、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＲＥＸ１のファミリー；またはＬＩＮ２８が挙げられる。ｉＰＳＣの例は、Takahashiet al. (2007) Cell advance online publication 20 November2007；Takahashi &Yamanaka (2006) Cell 126:663-76；Okita et al.
(2007) Nature448:260-262；Yu et al. (2007) Science advance online publication 20November2007；およびNakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. Advance onlinepublication 30November 2007に記載されている。

「胚様体またはＥＢ」とは、その後の分化を容易にする、培養中に形成される胚性幹細胞の三次元（３Ｄ）凝集体である。浮遊培養において成長する場合、ＥＢ細胞は、臓側内胚葉の外層によって囲まれる細胞の小さな凝集体を形成する。成長および分化すると、ＥＢは、流体で満たされた空洞と外胚葉様細胞の内層とを有する嚢胞性胚様体に発達する。

「組成物」とは、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体と、不活性な別の化合物もしくは組成物（例えば検出可能な標識）、または活性な別の化合物もしくは組成物（例えば遺伝子送達ビヒクル）との組合せを意味することが意図される。

「医薬組成物」には、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体と、組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおける診断的または治療的使用に好適なものにする固体支持体等の不活性または活性な担体との組合せが含まれることが意図される。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝食塩溶液、水、および油／水型または水／油型エマルション等のエマルション、ならびに様々な種類の湿潤剤のうちのいずれかを包含する。組成物はまた、安定剤および保存剤も含むことができる。担体、安定剤、およびアジュバントの例に関しては、Martin(1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co.,Easton)を参照のこと。

「被験体」、「個体」、または「患者」とは、本明細書において交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、これらに限定されないが、ネズミ科動物、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ科動物、ネコ科動物、家畜動物、スポーツ動物、愛玩動物、ウマ科動物、および霊長類、特にヒトが挙げられる。ヒト処置に有用であることに加えて、本発明は、神経変性疾患にかかりやすい伴侶哺乳動物、エキゾチック動物、ならびに哺乳動物およびげっ歯類等を含む飼育動物の獣医学的処置にも有用である。一実施形態では、哺乳動物としては、ウマ、イヌ、およびネコが挙げられる。本発明の別の実施形態では、ヒトは１８歳の年齢未満の青年または乳児である。

「宿主細胞」とは、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。世代を継続する際、変異または環境の影響のいずれかに起因してある特定の改変が生じる場合があるため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲に含まれる。

疾患を「処置すること」または疾患の「処置」には、（１）疾患を予防すること、すなわち、疾患にかかりやすくなっている可能性はあるが、まだ疾患の症状を経験しても表してもいない患者において、疾患の臨床症状を発生させないこと、（２）疾患を抑制すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の発生を阻止もしくは減少させること、または（３）疾患を緩和すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の後退を引き起こすことが含まれる。

「罹患すること」という用語は、「処置」という用語に関連する場合、感染症または感染症に伴う疾患であると診断されたかまたはそれにかかりやすくなっている患者または個体を指す。患者は、活動性または潜在性感染症のために疾患に「罹患するリスクがある」と言われる場合もある。この患者は、特徴的な疾患病態をまだ発生させていない。

「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬量において投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用されるべき時間期間、治療剤のバイオアベイラビリティ、投与経路等を含むいくつかの変数に依存している。しかしながら、任意の特定の被験体のための本発明の治療剤の具体的な用量レベルが、用いられる具体的な化合物の活性、被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事、投与の時間、排泄の速度、薬物組合せ、ならびに処置されている特定の障害の重症度、ならびに投与の形態を含む多様な要因に依存することは理解される。処置投薬量は全般的に、安全性および有効性を最適化するように用量設定され得る。典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ試験からの投薬量－効果関係は、患者投与に適した用量に関する有用な手引きを初期に提供することができる。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効果的であることが見出された濃度に見合う血清レベルを達成するのに有効な化合物の量を投与することが所望されると考えられる。これらのパラメーターの決定は十分に当技術分野の技術の範囲内である。これらの検討事項、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野で周知であり、標準的な教科書に記載されている。この定義と矛盾せずに本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＮＡウイルス複製を阻害するのに十分な量である。

投与という用語には、限定されないが、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、槽内注射もしくは注入、皮下注射、または埋め込み）、経鼻噴霧吸入、膣、直腸、舌下、尿道（例えば尿道坐剤）、頭蓋内、あるいは局所投与経路（例えば、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、エアロゾル剤等）による投与が含まれるものとし、これは、各投与経路に適切な従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、およびビヒクルを含有する好適な投薬単位製剤において、単独でまたは一緒に処方することができる。本発明は、投与経路によっても、製剤によっても、投薬スケジュールによっても限定されない。

ハンチントン病（ＨＤ）とは、脳における神経細胞の進行性破壊（変性）を引き起こす遺伝性疾患である。ハンチントン病は、運動および認知機能の喪失、ならびに精神障害を含め、人の機能的能力に対する幅広い影響を有する。ＨＤの症状を処置するまたは好転させることは、患者の精神、認知、もしくは運動機能を改善するか、またはこの遺伝性障害の有害効果を軽減することを意図する。疾患の症状および経過は当業者に公知であり、mayoclinic.org/diseases-conditions/huntingtons-disease/symptoms-causes/syc-20356117（アクセス日２０１８年５月２１日）を参照されたい。

中枢神経系（ＣＮＳ）疾患または障害とは、脳または脊髄の機能の構造に影響を及ぼし、脳または脊髄の１つまたは複数の部分の変性を生じ得る神経障害群を表す。非限定的な例としては、ＨＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、脳卒中、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、一次または二次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、脳炎症、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害、ギラン・バレー症候群、脊髄性筋委縮症、フリードライヒ運動失調症、筋萎縮性側索硬化症、およびハンチントン舞踏病が挙げられる。ＣＮＳ損傷の症状を処置するまたは好転させることは、患者の神経機能を改善するか、あるいは遺伝性もしくは後天性疾患、損傷、または障害の有害効果を軽減することを意図する。疾患の症状および経過は当業者に公知であり、hopkinsmedicine.org/healthlibrary/conditions/nervous_system_disorders/overview_of_nervous_system_disorders_85,P00799（アクセス日２０１８年５月２１日）を参照されたい。

「神経変性疾患または障害」とは、神経系、とりわけＣＮＳにおけるニューロンの変性によって特徴付けられる疾患または表現型である。

「シナプス結合を増強すること」とは、ニューロン間またはニューロンの受容体間における結合を促進することを意図する。

シナプスとは、インパルスが神経伝達物質の拡散によって通過する微小な間隙からなる、２個の神経細胞の間の接合部である。

本開示を実行するための形態
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からヒトニューロン幹細胞（ｈＮＳＣ）を調製するための方法であって、
ａ）分化培地中で培養された胚様体（ＥＢ）の集団から少なくとも１つの幹細胞ロゼットを単離するステップ、
ｂ）ステップａ）のロゼットから単離された少なくとも１個の個々の細胞をある時間、少なくとも１つのロゼットの生成を提供する条件下で培養するステップ、
ｃ）ステップｂ）のロゼットから個々の細胞を単離して、個々の細胞にするステップ、および
ｄ）ステップｃ）からの単離された少なくとも１個の個々の細胞をある時間、ｈＮＳＣのコンフルエントな集団の生成を提供する条件下で培養するステップ
を含むか、または代替的にはこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる、方法が本明細書において提供される。

一態様では、ロゼットからの少なくとも１個の個々の細胞の単離は手動で実施される。別の態様では、ロゼットからの少なくとも１個の個々の細胞の単離は酵素により実施される。さらなる態様では、ステップａ）のロゼットからの少なくとも１個の個々の細胞の単離は、手動、酵素、および／またはデジタルのうちの１つまたは複数によって実施される。さらなる態様では、ステップｃ）の少なくとも１個の個々の細胞の単離は酵素により実施される。三または二次元画像をデジタル的に同定するための方法および技法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第７，６８９，０４３号、同第６，９０７，１４０号、および同第５，０２０，１１２号を参照されたい。

一実施形態では、手動的方法、またはハイスループットでの機械的方法のうちの一方または両方を使用して実施することができるステップａ）からｃ）のうちの１つまたは複数は、２回またはそれよりも多く実施される。さらなる態様では、ロゼットの単離はデジタル的に実施される。三または二次元画像をデジタル的に同定するための方法および技法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第７，６８９，０４３号、同第６，９０７，１４０号、および同第５，０２０，１１２号を参照されたい。

一態様では、胚様体は、ＢｉｏＴｉｍｅ（esibio.com/esi-017-human-embryonic-stem-cell-line-46-xx/［最終アクセス日２０１８年６月６日］を参照のこと）から入手可能な細胞株ＥＳＩ－０１７から生成する。

本開示の一態様では、方法は、胚様体（ＥＢ）を、ＥＢ培地中で超低接着表面において培養することをさらに含む。別の態様では、方法は、ＥＢが有効な時間培養された後、ＥＢ培地からＮ２培地に置き換えて、オルニチン／ラミニンコーティング表面においてステップａ）をさらに実行することをさらに含む。あるいは、方法は、ＥＢが、ステップａ）の少なくとも１つのＥＢを作製するのに有効な時間、ＥＢ培地中で培養された後、ＥＢ培地からＮ２培地に置き換えることをさらに含む。

方法は、ステップｃ）において単離された少なくとも１個の個々の細胞が、Ｎ２培地のオルニチン／ラミニンコーティングプレートにおいて有効な時間培養されて、ｈＮＳＣのコンフルエントな細胞集団を生成することによってさらに改変することができる。当業者に公知であるように、コンフルエントな細胞集団とは、相当の数の細胞が集団において他の細胞と接触している細胞集団である。この方法は、ｈＮＳＣのコンフルエントな集団を、有効量のＮ２培地を用いて培養することによってさらに改変することができる。

本明細書に記載される方法によって調製される細胞または細胞の集団もまた本明細書において提供される。ニューロン細胞および分化した細胞は、ＢＤＮＦを産生するかまたはＢＤＮＦを過剰発現する。

集団の細胞は、拡大増殖させることができる、および／または例えば導入遺伝子の挿入もしくはＣＲＩＳＰＲによって遺伝子改変することができる。一態様では、導入遺伝子は、ＡｐｉＣＣＴ１、ｓＡｐｉＣＣＴ等のその断片、またはそれらのそれぞれの同等物である。細胞および／または導入遺伝子は、必要に応じて検出可能に標識することができる。導入遺伝子は、周知かつ従来の組換え技法を使用して、導入遺伝子をベクターに挿入することによって挿入することができ、導入遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーター、および必要に応じてエンハンサーエレメントの制御下にある。細胞および／または導入遺伝子を含有するベクターは、検出可能に標識することができる。以下に詳述するように、導入遺伝子ｓＡｐｉＣＣＴは、ｈＮＳＣの特異的細胞集団に挿入されて、治療薬として埋め込まれた場合にｈＮＳＣまたは組織にさらなる保護を提供する。ｓＡｐｉＣＣＴ導入遺伝子はまた、ｈＥＳＣ、または他の胚性細胞株、胎児由来細胞株、間葉系由来細胞株、ニューロン由来細胞株を含むがこれらに限定されない他の幹細胞誘導体、および分化した細胞型に挿入することもできる。

これらの細胞の集団、およびこれらの細胞を含む非ヒト動物がさらに提供される。集団は、実質的に均質であっても、実質的に不均質であっても、クローン性であってもよい。集団は検出可能に標識することができる。集団は担体、例えば薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。

例えば担体を有する、単離された細胞を含む組成物がさらに提供される。さらなる態様では、組成物は保存剤および／または凍結保護剤をさらに含む。凍結保護剤の非限定的な例としては、ＤＭＳＯ、グリセロールが挙げられ、これらは市販されており、例えばstreck.com/collection/streck-cell-preservative/（最終アクセス日２０１８年５月２２日
）を参照されたい。

細胞は治療方法に有用である。一態様では、本明細書に記載される有効量の細胞、集団、または組成物のうちの１つまたは複数を投与することによって、導入遺伝子を被験体に送達するか、またはそれを必要とする被験体における細胞を遺伝子編集するための方法が提供される。別の態様では、被験体に有効量の細胞、集団、または組成物のうちの１つまたは複数を投与することによって、それを必要とする被験体における神経変性障害を処置するかまたはシナプス結合を増強する方法が提供される。別の態様では、それを必要とする被験体における神経変性障害を処置するか、またはシナプス結合を増強するか、またはＣＮＳ損傷を処置する方法であって、被験体に有効量の細胞、集団、または組成物のうちの１つまたは複数を投与することを含む、方法が提供される。いかなる適切な投与方法も使用することができ、そのような方法の非限定的な例は本明細書において提供される。

神経変性障害の非限定的な例は、ハンチントン病、脳卒中、ＣＮＳ損傷、慢性脊髄損傷、脊髄損傷、動脈瘤、手術、動静脈奇形（ＡＶＭ）、放射線、脊髄性筋委縮症、フリードライヒ運動失調症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋肉硬化症、一次または二次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、血管性認知症、てんかん発作、脳血管攣縮、アルツハイマー病、急性または外傷性脳損傷、脳炎症、および例えば、心肺停止もしくは溺水、またはＣＮＳ組織に対して急性物理的傷害をもたらす他の任意のＣＮＳ損傷の結果としての脳の低酸素症、ならびにそれらの組合せの群から選択される。

ある特定の実施形態では、ＣＮＳ損傷は脳卒中によって引き起こされた損傷である。「脳卒中」とは、脳への血液供給または酸素における障害に起因する中枢神経系に対する物理的傷害をもたらす任意の状態を意味する。これは、血栓症もしくは塞栓症によって引き起こされるかまたは出血に起因する虚血（血液供給または酸素の不足）を原因とする可能性がある。

キット
キットもまた提供される。一態様では、キットは、ｈＥＳＣと、本明細書に記載される方法を実施するための指示とを含む。さらなる態様では、キットは、本明細書に記載される方法を使用して調製されるニューロン細胞と、使用のための指示とを含む。キットは、キットと共に提供される指示を実行するための組成物および試薬をさらに含むことができる。

本明細書に記載される薬剤は、一部の実施形態では、薬学的、または診断用、または研究用キットに組み立てられ、治療、診断、または研究適用における薬剤の使用を容易にしてもよい。一態様では、キットは、ｈＥＳＣと、本明細書に記載される方法を実施するための指示とを含む。さらなる態様では、キットは、本明細書に記載される方法を使用して調製されるニューロン細胞と、使用のための指示とを含む。キットは、キットと共に提供される指示を実行するための組成物および試薬をさらに含むことができる。

一部の実施形態では、キットは使用のための指示をさらに含む。具体的には、そのようなキットは、本明細書に記載される１種または複数種の薬剤を、これらの薬剤の所期の適用および適した使用を記載する指示と共に含み得る。一例として、一実施形態では、キットは、キットの１種もしくは複数種の成分を混合して、ならびに／または試料を単離および混合して被験体に適用するための指示を含み得る。ある特定の実施形態では、キットにおける薬剤は、特定の適用および薬剤の投与の方法に好適な医薬製剤および投薬量である。研究目的のキットは、様々な実験を実行するのに適切な濃度または分量の成分を含有し得る。

キットは、本明細書に記載される方法の使用を容易にするように設計されてもよく、多くの形態を取ることができる。キットの組成物のそれぞれは、適用可能な場合、液体形態（例えば溶液）、または固体形態（例えば乾燥粉末）において提供されてもよい。ある特定の場合では、一部の組成物は、例えば、キットと共に提供されていてもされていなくてもよい好適な溶媒または他の化学種（例えば水または細胞培養培地）の添加によって構成可能であるか、またはそうでなければ加工可能（例えば活性形態に）であり得る。一部の実施形態では、組成物は保存溶液（例えば凍結保存溶液）において提供されてもよい。保存溶液の非限定的な例としては、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）が挙げられる。一部の実施形態では、保存溶液は、一定の量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含有する。

本明細書で使用される場合、「指示」は、説明および／または進捗の構成部分を定義することができ、典型的には特許請求される方法または組成物の包装上のまたは包装に付随した書面による指示を包含する。指示には、説明がキットと関連していると使用者が明確に認識し得る任意の形、例えば、視聴覚装置（例えばビデオテープ、ＤＶＤ等）、インターネット、および／またはウェブ上でのコミュニケーション等で提供される任意の口頭による説明または電子的な指示も含むことができる。一部の実施形態では、書面による指示は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態のものであり、動物投与のための製造、使用、または販売に関する機関による承認を反映することもできる。

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される成分のうちのいずれか１つまたは複数を、１つまたは複数の容器に含有する。したがって、一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される薬剤を収容する容器を含んでもよい。薬剤は、液体、ゲル、または固体（粉末）の形態であり得る。薬剤は、滅菌調製され、シリンジに包装され、冷却輸送され得る。あるいは、薬剤は、保管のためにバイアルまたは他の容器に収容され得る。第２の容器は、滅菌調製された他の薬剤を有し得る。あるいは、キットは、予め混合され、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器において輸送される活性剤を含んでもよい。キットは、シリンジ、局所的適用デバイス、またはＩＶ針管およびバッグ等の、薬剤を被験体に投与するために必要とされる構成部分のうちの１つまたは複数または全てを有してもよい。

本明細書に記載される療法は、療法のための患者を同定および選択するのに適切な診断技法と組み合わせることができる。例えば、筋ジストロフィー遺伝子における変異を同定するための遺伝子検査が提供され得る。したがって、変異を有する患者は療法に好適であると同定され得る。

以下の実施例は、例示することが意図されており、本開示を限定することは意図されていない。

実験手順
ＥＳＣからのＮＳＣの生成のための手順
胚様体（ＥＢ）形成のためのＥＳＣの継代。
１日目に、分化したコロニーを、Ｐ１０００チップを使用してＥＳＣ培養物から手動で取り除いた。次いで、ＥＳＣ培地をＥＳＣ培養物から２ｍＬ／ウェルのＥＢ培地に交換した。Ｐ１０００チップを使用して、ＥＳＣコロニーを、初めはウェルに対して水平方向、次いで垂直方向の前後運動により掻き取った。各ウェルの掻爬したコロニーを、１０ｍＬ血清学的ピペットを用いて超低接着６ウェルプレートの１つのウェルに移した。ＥＳＣプレートのウェルを、Ｐ１０００マイクロピペッターを用いてＥＢ培地を使用して洗い、洗浄液を超低接着６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加して、３ｍＬ／ウェルの最終容量を得た。ＥＢプレートを、３７℃および５％ＣＯ_２のインキュベーターに動かした。ＥＢプレートを、２日目の期間中３７℃および５％ＣＯ_２でインキュベートした。３日目に、半量ＥＢ培地交換を実施した。浮いているコロニーを穏やかに旋回させてウェルの中心に寄せた。Ｐ１０００マイクロピペットを使用して、１ｍｌの培地を各ウェルから除去し、廃棄した。１．５ｍＬの新鮮ＥＢ培地を穏やかに各ウェルに添加した。次いで、プレートをインキュベーターに戻した。４日目は何も行わなかった。撹拌を、３７℃および５％ＣＯ_２でインキュベートしながら継続した。５日目に、ＥＳＣに由来するＥＢを、ラミニンコーティングプレートにプレーティングした。６ウェルプレートにおける適切な数のウェルに、ＰＢＳ中１：３に希釈したポリ－Ｌ－オルニチンを、室温で１時間コーティングした。Ｎ２培地を表２に従って調製した（Ｎ２培地は調製後１週間良好である）。１時間後、ポリ－Ｌ－オルニチン溶液を除去し、廃棄した。ウェルを、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。ウェルに、ＰＢＳ中１：１００に希釈したラミニンを室温で１時間コーティングした。ＥＢの懸濁物を、１０ｍＬ血清学的ピペットを使用して各ウェルからそれぞれの１５ｍＬコニカルチューブに移した。ＥＢを、室温で１５分間、懸濁物から沈降させた。コーティングした６ウェルプレートのウェルに関して、ラミニンを吸引し、廃棄した。１ｍＬのＮ２培地を各ウェルに添加した。ＥＢ培地を各１５ｍＬコニカルチューブから吸引した。ＥＢを、１０ｍＬ血清学的ピペットを使用して、２ｍＬのＮ２培地に穏やかに再懸濁した。ＥＢを、１ｍＬのＮ２培地を含有するコーティングしたウェルに、３ｍＬの総容量となるように添加した。プレートを前後に穏やかに揺すってＥＢを分布させ、インキュベーターに入れた。６日目～１４日目に、プレーティングしたＥＢのロゼット形成および単離（Ｒｏｓ１、ラウンド１）を実施した。細胞をその後の４～６日にわたって検査して、ロゼットの形成を点検した。ロゼットは、形成の質に応じて任意の時間に採取した。ロゼット形成がまだ存在しない場合は、ロゼットが現れるまでＮ２培地を１日おきに交換した。ロゼットを採取するために、１２ウェルプレートに、ＰＢＳ中１：３に希釈したポリ－Ｌ－オルニチンを、室温で１時間コーティングした。１時間後、ポリ－Ｌ－オルニチン溶液を除去し、廃棄した。ウェルを、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。次いで、ウェルに、ＰＢＳ中１：１００に希釈したラミニンを、室温で１時間コーティングした。必要な場合、１瓶のＮ２培地を表２に従って調製した。１時間後、ラミニンを除去し、１ｍＬのＮ２培地を各ウェルに添加して湿潤を保ち、ロゼットの切離のためにインキュベーターに保管した。１０～１２日目前後に、以前にプレーティングしたＥＢから形成されたロゼットが見られる。解剖顕微鏡下において、ロゼットを、１ｍＬシリンジに取り付けた１８ゲージ針を使用してロゼットの輪郭を描画することによって切離した。次いで、混合物を、ｐ２００マイクロピペットを使用して、Ｎ２培地のラミニンコーティングプレートに移した。移した後、混合物をインキュベーターに一晩保管し、Ｒｏｓ１としてラベリングした。培地を、インキュベーターでの保管中、１日おきに交換した。１５日目～１８日目に、ロゼットを単一細胞に解離した。Ｒｏｓ１の（ラウンド１）を単離した２～３日後、最も不純物の少ないロゼットを単一細胞に解離した。Ｎ２培地を所望の各ウェルから吸引し、０．５ｍＬのＥＤＴＡ中０．０５％トリプシンを各ウェルに添加した。混合物を、３７℃および５％ＣＯ_２で９０秒間インキュベートした。９０秒後、０．５ｍＬのＤＴＩを添加した。１０００μＬマイクロピペットを使用して、ロゼットをウェルにおいて解離し、各ウェルの容量をそれぞれの１５ｍＬコニカルチューブに添加した。各ウェル、または「クローン」は、全ての継代を通して分離されたままであった。コニカルチューブを１０００ＲＰＭで５分間遠心沈降した。上清を添加し、廃棄した。各ペレットを、１ｍＬの新鮮Ｎ２培地に再懸濁した。１ｍＬの各懸濁物を、ポリ－Ｌ／ラミニンコーティング１２ウェルプレートのそれぞれのウェルにプレーティングし、プレートを（ＮＳＣ継代０）としてラベリングした。プレートをインキュベーターに戻して培養をモニタリングし、培地を１日おきに新鮮Ｎ２培地と交換した。細胞が約８５％コンフルエントに達した時、各「クローン」を、１ｍＬの０．０５％トリプシンおよび１ｍＬのＤＴＩを用い、培地を１日おきに３ｍＬのＮ２培地と交換したことを除いて上記と同じ手順を使用して、６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移動させた。細胞を維持し、継代を１０^６細胞／ウェルの比率で継続するか、または細胞の凍結保存（以下に論じられる）を行った。

ＮＳＣの凍結保存。
凍結保存培地または凍結培地を表３に従って調製し、凍結培地が使用前の全時間において確実に４℃で冷却されるようにした。ＮＳＣプレートをインキュベーターから取り出し、生物学的安全キャビネット内に入れた。古い培養培地を完全に吸引し、廃棄物容器に廃棄した。１ｍＬの０．０５％トリプシンを各ウェルに添加し、３７℃で９０秒間インキュベートした。９０秒後、１ｍＬのＤＴＩを各ウェルに添加して、トリプシンを不活性化させた。１０００μＬピペットチップを使用して、混合物をピペッティングして各ウェルの表面の細胞を洗い流し、次いで混合物を１５ｍＬコニカルチューブに移した。１５ｍＬコニカルチューブを１０００ＲＰＭで３分間遠心沈降した。コニカルチューブを生物学的安全キャビネットに戻し、上清を完全に吸引した。細胞を５ｍＬの新鮮Ｎ２培養培地に再懸濁し、細胞計数を、０．４％トリパンブルーおよび血球計数器を使用して実施した。細胞を、卓上遠心分離機において１０００ｒｐｍで３分間遠心沈降した。適切な容量の４℃凍結培地を、細胞濃度が３．０×１０^６細胞／ｍＬとなるように細胞に添加した。凍結培地における１ｍＬの細胞懸濁物を、１０ｍＬ血清学的ピペットを使用して、各凍結バイアルに添加した。細胞を含まない凍結培地のバイアルを１つ、凍結プローブのために作製した。バイアルのキャップを固く締め、予め冷却した速度制御フリーザー－凍結ラックに直ちに移した。プローブを、凍結培地のみを含有するバイアルに挿入し、ラックに入れた。バイアルを、速度制御フリーザーから予め－８０℃に冷却され完全にラベリングされた凍結ボックスに移し、直ちにＬＮ２保管庫に移した。

マウス
全ての手順は、ＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針、ならびにＡＡＡＬＡＣ認定施設であるＵＣＩおよびＵＣＬＡの動物実験委員会によって承認された動物研究プロトコールに従った。Ｒ６／２マウスおよびそのＮＴ同腹仔（導入遺伝子非保有Ｃ５７Ｂｌ６／ＣＢＡ）を、ＵＣＩにおいて維持された繁殖コロニー（系統６４９４、約１２０±５のＣＡＧ反復配列）、またはＵＣＬＡにおいて維持された繁殖コロニー（系統２８１０、約１５０±５のＣＡＧ反復配列）から取得した。ホモ接合型Ｑ１４０マウスまたはＷＴ（Ｃ５７Ｂｌ６）同腹仔はＵＣＬＡの繁殖コロニー由来であり、ＵＣＬＡにおいて手順を実施した。全てのマウスを１２／１２時間の明／暗スケジュールにおいて、食餌および水を自由摂取させて収容した。マウスは、混合処置群として群飼し、走行輪に関してのみ単独で収容した。ＣＡＧ反復配列長をＲ６／２マウス（Ｌａｒａｇｅｎ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）に関して確認し、Ｑ１４０マウスに関して、度数分布は有意には異ならない（Hickeyet al., 2012b）。転帰における差の評価は、ＨＤモデルに関する以前の経験および公開結果（Hickey etal., 2005；Hockly etal., 2003）に基づいており、検出力分析
を適用すること（Ｇ Ｐｏｗｅｒ［psycho.uni-duesseldorf.de/abteilungen/aap/gpower3/］）により、本出願人らは、行動に関してはｎ＝１０、生化学的分析に関してはｎ＝４という最小のｎを得た。

ｈＮＳＣ単離
ｈＮＳＣの使用は、ＵＣＩ、ＵＣＬＡ、およびＵＣ Ｄａｖｉｓのヒト幹細胞研究監視委員会（ｈＳＣＲＯ）によって承認され、細胞はＢｉｏｔｉｍｅのＥＳＩ－０１７ ｈＥＳＣに由来した。ｈＥＳＣコロニーを、ノギンを含むＥＢ培地に移し、ＮＰ培地に移行し、ロゼットを切り離し、解離し、ｈＮＳＣ培地と共に播種して、ｈＮＳＣを生成した（図８Ｂ）。ロゼットを手動で切り離し、増殖因子低減マトリゲルコーティングプレートのＮＳＣ培地にプレーティングし、次いでアキュターゼを使用して解離し、ＮＳＣ培地を含むポリオルニチン／ラミニンコーティングプレートにプレーティングした。

移植手術
ｈＮＳＣまたはｖｅｈの両側線条体内注射を、定位固定装置、およびブレグマを基準とした座標：前後、０．００；内外、±２．００；背腹、－３．２５を使用して実施した。マウスを麻酔し、定位固定フレームに置き、１００，０００ｈＮＳＣ／側（２μＬ／注射）またはｖｅｈ（２０ｎｇ／ｍＬのヒト表皮増殖因子［ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃７８００３］およびヒト線維芽細胞増殖因子［ＳＴＥＭＣＥＬＬ、＃７８００６］を含む２μＬのハンクス平衡塩溶液）のいずれかを、５μＬハミルトンマイクロシリンジ（３３ゲージ）および０．５μＬ／分の注射速度を使用して注射した。創傷を封止し、マウスを、加温パッドを備えるケージにおいて回復させた。免疫抑制薬を手術前日に全てのマウスに投与し、手術中にわたって継続した。

行動評価
Ｒ６／２
マウスを半無作為に割り当て、行動の試験を６～９週の間に実施した。研究者は、試験およびデータ収集の間、遺伝子型および処置について盲検化されていた。実験者による変動性を最小限にするため、１名の調査者が各試験を行った。Ｒ６／２マウスにおける行動課題は、Ochabaet al. (2016)によって以前に記載されたように実施した。

Ｑ１４０
走行輪を除き雄および雌を使用し、走行輪に関しては、発情周期が走行活動に影響を与えるため、雄のみ使用した。遺伝子型または処置は実験者に知られていなかった。全ての試験は、暗期中に行った走行輪を除いて、明期中に行った。Ｑ１４０マウスにおける行動課題は、Hickeyet al. (2008)によって以前に記載されたように実施した。

Ｒ６／２脳スライスにおける電気生理学
行動実験のために使用した６４９４系統の表現型に類似した表現型を発現するＲ６／２（系統２８１０、１５０±１０のＣＡＧ反復配列）およびＮＴ同腹仔を使用した（Cummingset al., 2012）。手順は、Andre et al. (2011)によって記載されているものに本明細書に詳述される変更を加えたものであった。

免疫組織化学および電子顕微鏡法
ｈＮＳＣを５週間埋め込んだ雄Ｒ６／２マウス（ｎ＝３）を麻酔し、ＥＭ固定液（０．１Ｍリン酸緩衝液［ｐＨ７．４］中２．５％グルタルアルデヒド、０．５％パラホルムアルデヒド、および０．１％ピクリン酸）を灌流した。次いで、脳を採取してＥＭ固定液に４℃で一晩置き、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｈＮＳＣを含有する線条体（ブレグマから＋１．４～＋０．１４ｍｍに相当する）（Franklinand Paxinos, 2007）の６０ｍｍの切片を連続的に作製するまでＰＢＳ中で洗浄した。ＥＭのために処理した、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびｈＮＳＣ抗体（Ｓｔｅｍ１２１、１：１００、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）を使用した線条体組織の予め包埋したＩＨＣは以前に記載された通りであり（Spinelliet al.,2014；Walker et al., 2012）、線条体スライスを、２枚のＡＣＬＡＲ（Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）の間に６０℃のオーブンにおいて一晩平らに包埋して、樹脂を重合した。ｈＮＳＣを含有する区域を包埋したスライスから顕微解剖し、薄切片作製のためにブロックに瞬間接着剤で接着した。

ＪＥＯＬ１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）における３４６，２００の最終倍率のＤＡＢ標識構造（すなわちｈＮＳＣ標識細胞、樹状突起）の写真を、デジタルカメラ（ＡＭＴ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用して撮影した。ＤＡＢ標識は薄切片作製した組織の先端に限定されるため、ＤＡＢ標識を示す区域のみを写真撮影した。

Ｒ６／２マウスにおける生化学的、分子的、および免疫組織学的分析
マウスをペントバルビタール過剰投与によって安楽死させ、０．０１Ｍ ＰＢＳを灌流した。線条体および皮質を左半球から切り離し、ＲＮＡに関して急速凍結し、タンパク質を、ＴＲＩｚｏｌにおいて製造業者の手順（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して単離するか、または以下に記載するように均質化した。他の半分は、４％パラホルムアルデヒドにおいて後固定し、３０％スクロースにおいて凍結保護し、ＩＨＣのために滑走式ビブラトームにおいて４０μｍで切断した。切片を３回濯ぎ、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５％ヤギ血清）に１時間入れ、一次抗体を４℃で一晩（ＯＮ）ブロック液に入れた。切片を濯ぎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ二次抗体中で１時間インキュベートし、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して封入した。一次抗体を補足的な実験手順に列挙する。

可溶／不溶分画
線条体組織を以前に記載されたように処理した（Ochaba et al., 2016）。抗体：抗Ｈ
ＴＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＡＢ５４９２；ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３４７７２３）および抗ユビキチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃ｓｃ－８０１７；ＲＲＩＤ：ＡＢ＿６２８４２３）。バンドの定量を、ＮＩＨプログラムからのソフトウェアＩｍａｇｅＪおよびデンシトメトリーアプリケーションを使用して実施した。

共焦点顕微鏡法および定量
切片を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００共焦点システムを用いて、ラムダストロービングモードを使用して撮像した。画像は、単一共焦点ｚスライスまたはｚスタックのいずれかを表す。全ての不偏立体解析学的評価は、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ、Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ、ＶＴ）を使用して実施した。光学分画プローブを使用して、平均の細胞数、散在性凝集体数、および封入体数を推定した。

ＲＮＡ単離およびリアルタイムｑＰＣＲ
線条体をＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、続いてＲＮＥａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）において均質化した。ＲＩＮ値は各試料に関して９超であった（Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー）。ＲＴは、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよび１ｍｇの総ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に使用した。ｑＰＣＲはVashishthaet al. (2013)によって記載されているように実施した。

Ｑ１４０マウスにおける生化学的、分子的、および免疫組織学的分析
Ｑ１４０雄を処置の６か月後に頸椎脱臼（ｎ＝７、凍結）またはパラホルムアルデヒド灌流（ｎ＝５、ＩＨＣ）によって安楽死させた。

ＩＨＣ
マウスに０．１Ｍ ＰＢＳおよび４％パラホルムアルデヒドを灌流した。脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドにおいて一晩後固定し、３０％スクロースにおいて凍結保護し、凍結し、冠状切片をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ、１８５０）において４０μｍで切断した。切片を室温で１時間ブロッキングし、次いで一次抗体をＯＮで使用した。数回の洗浄後、切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ二次抗体中にインキュベートし、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。ＨＴＴ凝集体およびミクログリアの定量のためのＩＨＣを、それぞれMenalledet al. (2003)およびWatson et al. (2012)によって記載されているように実施した。

ＨＴＴ染色した核および凝集体
切片を、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ５．００ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｃｈｅｓｔｅｒ、ＶＴ）を用いて分析した（Hickeyet al., 2012a）。描かれる線条体の輪郭のために、ソフトウェアにより、切片ごとの各種の凝集体の定量のために使用される２０×２０μｍの計数枠を含む２００×２００μｍの格子を重ねた。

Ｑ１４０マウスの線条体におけるＩＢＡ－１陽性細胞の定量
分析を、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ）を備えるＬｅｉｃａ ＤＭ－ＬＢ顕微鏡を使用して、活性化を反映するミクログリアの直径に関して、記載されているように行った（Watsonet al.. 2012）。５
倍の倍率で描かれる線条体の輪郭のために、ソフトウェアにより、２０×２０μｍの計数枠を含む２００×２００μｍの格子を左上隅に重ね、不偏サンプリングおよび定量を可能にした。

Ｑ１４０マウスに関する生化学的分析
ＥＬＩＳＡのための凍結線条体処理を、Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ ＢＤＮＦ Ｒａｐｉｄキット（Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ ＢＥＫ－２２１１、ＳＡ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。

統計分析
Ｒ６／２マウスに関する結果は、異なるサブセットからのものであった電気生理学およびＥＭデータを除き、単一コホートからのものであり、全て同じバッチの細胞を使用した。十分な検出力を有する数を、研究前に分析を使用して決定した（上に記載）。統計的有意性は、厳密な分析を使用して、記載されたように達成した。全ての所見は再現可能である。複数の統計的方法は、上の図面の説明においてさらに詳述されている。有意水準：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｒ６／２マウスにおいて、データは平均±ＳＥＭとして表され、行動課題のための統計的検定は、一元配置分散分析と、それに続くシェッフェ、ボンフェローニ、およびホルムの事後多重比較を含むテューキーのＨＳＤ検定とを使用した。データは、使用した統計的検定の仮定を満たし、０．０５未満のｐ値を有意と考えた。全てのマウスを無作為に割り当て、課題を、遺伝子型および処置について盲検化された個体を用いて無作為に実施した。デンシトメトリー結果の統計的比較を、一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定とによって実施した。スチューデントのｔ検定を、ＥＭ４８立体解析学的研究からの凝集体数比較のために使用した。クラスピングにおける有意性を、フィッシャーの正確確率によって決定した。Ｑ１４０マウスに関する統計分析は、行動データおよび死後のデータにおける有意差（ｐ＜０．０５）に関してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し、一元配置分散分析とボンフェローニ事後検定とを使用して行った。二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定とを、走行輪／３分試験における平均回転数を表すグラフにおいて使用し、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）関数を使用するブートストラップ統計量をＩＢＡ－１分析のために使用した。グラフにおける全てのエラーバーはＳＥＭを表す。

ｈＮＳＣ単離。毎日の（Ｄ）培養は以下の通りであった。Ｄ１：ＥＳＣコロニーを、コロニー端が盛り上がり始めるまで、コラゲナーゼＩＶを使用して酵素により「ほぐした」。コロニーをウェルから手動で掻爬し、低接着プレートに移し、ＥＢ培地（ｂＦＧＦを含まないＥＳＣ培地）において一晩培養した。Ｄ２：ＥＢ培養培地に５００ｎｇ／ｍｌのノギンと１０μＭ ＳＢ４３１５４２とを補充し、さらに２日間培養した。Ｄ４：培地交換。Ｄ５：ＥＢを増殖因子低減マトリゲルコーティング６ウェルプレートの同じ培地にプレーティングした。Ｄ６：培地を交換し、ＮＰ培地を使用してＮＰＣ分化を駆動した。培地は１２日目まで２日ごとに交換する。Ｄ１２～１４：ロゼットを解剖スコープ下において視覚的に単離し、１８ゲージ針を使用して手動で切り離し、増殖因子低減マトリゲルコーティング６ウェルプレートのＮＳＣ培地へプレーティングした。２～３日後、ロゼットを、アキュターゼを使用して解離し、ＮＳＣ培地とＹ２７６３２化合物とを含むポリオルニチン／ラミニンコーティングプレートにプレーティングした。ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ細胞遺伝学的分析は、細胞が核型の点で安定であり異常が観察されなかったことを見出し、単色フローサイトメトリーをＣＤ２７１（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０－－ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎカタログ番号５６３４５１）、ＣＤ２４（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ７１１－－ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎカタログ番号５６３４０１）、Ｐａｘ６（ＰＥ－－ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５６１５５２）、Ｎｅｓｔｉｎ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７－－ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５６０３４１）、ＳＯＸ１（ＰｅｒＣＰ ＣＹ５．５－－ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５６１５４９）、ＳＯＸ２（Ｖ４５０－－ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎカタログ番号５６１６１０）、ＣＤ４４（ＡＰＣ－Ｈ７－－ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５６０５３２）、ＣＤ１８４（ＰＥ－ＣＹ７－－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０６５１４）、またはＳＳＥＡ４（ｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００－－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＳＳＥＡ４２９）に関して実施した。

移植手術。ｈＮＳＣまたはビヒクルの両側線条体内注射を、定位固定装置、およびブレグマを基準とした以下の座標、ＡＰ：０．００、ＭＬ：＋／－２．００、およびＤＶ －３．２５を使用して実施した。マウスを定位固定フレームに置き、片側当たり１００，０００個のｈＮＳＣ（２μｌ／注射）、または対照処置としてのビヒクル（２０ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦおよびｈＦＧＦを含む２μｌのＨＢＳＳ）のいずれかを、５μｌハミルトンマイクロシリンジ（３３ゲージ）および０．５μｌ／分の注射速度を使用して注射した。Ｒ６／２マウスを、イソフルランを用いて麻酔し、Ｑ１４０マウスを、ペントバルビタールナトリウム（滅菌０．９％生理食塩水中６０ｍｇ／ｋｇのＮｅｍｂｕｔａｌ、ｉ．ｐ．）を用いて麻酔した。全てのマウスに関して、麻酔の手術面を維持するために、マウスにノーズコーンを介してイソフルラン（１００％酸素中１～２％、０．５Ｌ／分）を投与し、酸素を手術中にわたって投与し、マウスの１５体温を電子制御加温パッド上において維持し、直腸プローブ体温計（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）を使用してモニタリングした。注射の標的化領域への正確な配置を、全ての動物に関して、脳切片内の針経路の可視化によって確認した。創傷を、骨蝋を頭蓋骨に使用して封止し、Ｄｅｒｍａｂｏｎｄまたは縫合糸を用いて閉鎖した。マウスを、手術後、麻酔から回復するまで個々のケージの加温パッド上に置いた。単回１日用量の免疫抑制薬ＣＳＡを、ｈＮＳＣおよびビヒクル埋め込みＲ６／２および非トランスジェニックマウスに手術前日から始めて１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、ｉ．ｐ．投与した。マウスをさらに免疫抑制するために、ｉ．ｐ．の１週用量のＣＤ４抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）の追加のレジメンを１０ｍｇ／ｋｇで投与した。Ｑ１４０マウスまたはＷｔ同腹仔は、研究全体にわたるＣＳＡの継続的送達を確実にするために毎月交換された皮下浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ＃１００４）によって投与されたＣＳＡ（２ｍｇ／ｋｇ／日）による免疫抑制を受けた。ミニポンプを除去および取り替えるための手術は以下の通りであった。マウスを、イソフルランを用いて麻酔した（１００％酸素中、麻酔の誘導に関しては３％、維持に関しては１．７５％）。切開部位を滅菌した後、ミニポンプを背中の小さな切開部から除去し、新たなミニポンプを埋め込んだ後に切開部を縫合した。

Ｒ６／２：マウスを複数の群に半無作為に割り当てた。以下に列挙する行動の試験を、課題に応じて６、７、８、または９週齢に実施した。マウスの体重を毎日測定し、処置に関する有意差は観察されなかった。研究者は、実験の試験およびデータ収集中、どのマウスがｈＮＳＣ移植されたかについて盲検化されていた。実験者による変動性を最小限にするため、１名の調査者が各行動の試験を行った。マウスは、卵巣移植雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）を使用するＵＣＩの繁殖コロニーから取得した。

ロータロッド装置を使用して、前および後肢運動協調性ならびに平衡性を測定し、マウスを、３００秒間の加速アッセイを使用して連続する３日にわたって試験した。ロータロッド試験は、１週おきに２回、６および８週齢時に実施した。ポール試験に関して、マウスは、ポールの上に頭を下向きにして置かれ、次いで逆さまにポールの長さを下まで降りた。配置の出発点から下降する１６の総時間を測定した。ポール試験は、１週おきに２回、７および９週齢時に実施した。ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ機器を使用して、デジタル式力変換器を介して前肢の握る力を測定し、この器具は１グラム単位で読み取り値を表示する。握力は、１週おきに２回、７および９週齢時に測定した。

Ｑ１４０：よじ登り試験およびポール試験。よじ登り中の運動協調性および自発的活動を評価するために、マウスを円筒形ワイヤーケージの底部に置き、自発的活動をビデオテープに録画した。ポール試験に関して、各マウスをポールの頂上に顔を上にして位置付け、全身を反転させて下向きの姿勢になるまでの時間を計測し、ポールを下まで降りてそれぞれのホームケージに入るまでの時間を計測した。

Ｒ６／２マウスにおける電気生理学
簡潔に述べると、マウスを麻酔し、高スクロースに基づくスライス溶液を経心的に灌流し、次いで冠状スライス（３００μｍ）を、ＡＣＳＦを含有するインキュベートチャンバに移した。ＭＳＮおよびＮＳＣを、微分干渉コントラスト光学を用いて赤外照明を使用して可視化した。全ての記録を、注射部位中または周辺において実施した（記録されたＭＳＮは１５０～２００ｕｍの間の移植片に隣接していた）。ビオシチンを、細胞可視化のためにパッチピペットに添加した。自発性シナプス後電流を、標準的なＡＣＳＦ中の全細胞構成において記録した。膜電流をギャップフリーモードで記録した。細胞を＋１０ｍＶで電位固定し、自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）をＡＣＳＦにおいて記録した。自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）を、ＧＡＢＡＡ受容体遮断薬のビククリンメトブロミド（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の存在下、－７０ｍＶ（ベースライン）でＡＣＳＦにおいて記録して、グルタミン酸作動性興奮性事象を分離した。自発性シナプス電流を、ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン６．０、Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ、Ｆｏｒｔ Ｌｅｅ、ＮＪ）を使用して分析した。記録後、スライスを固定し、次いでＩＨＣ処理まで４℃の３０％スクロースに移した。ビオシチンで満たされた記録細胞およびｈＮＳＣを同定するために、固定されたスライスを洗浄し、透過処理し、４時間ブロッキングし、その後ＳＣ１２１（１：１０００、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）と共にインキュベーションを行った。洗浄後、スライスを、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ－４８８（１：１０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号：Ａ－１１００１）、およびＡｌｅｘａ－５９４（１：１０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：Ｓ１１２２７）とコンジュゲートしたストレプトアビジン中にインキュベートした。スライスを洗浄し、封入し、細胞を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を用いて可視化した。

Ｒ６／２マウスにおける生化学的、分子的、および免疫組織学的分析。
共焦点顕微鏡法および定量。切片を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００共焦点システムを用いて、ラムダストロービングモードを使用して撮像した。画像は、単一共焦点ＺスライスまたはＺスタックのいずれかを表す。全ての不偏立体解析学的評価は、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ、Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ、ＶＴ）を使用して実施した。光学分画プローブを使用して、平均の細胞数、散在性凝集体数、および封入体数を推定した。ガードゾーンを、最小１４μｍの光学的解像高さ（opticaldissector height）を含む測定した厚さの３％に設定した。輪郭描画は５倍の対物レンズで行い、計数は１００倍の対物レンズで実施した。各切片に関して、描画は、幹細胞パッチの端からおよそ７０μｍ離れて行った。計数は、Ｋｕ８０標識細胞がブレグマ０．５ｍｍとブレグマ－０．３４ｍｍとの間に見られる線条体全体にわたる６つの切片に関して、３つごとの切片（４０μｍの冠状切片）において行った。全ての計数は、一方の脳半球のみにおいて、５０×５０μｍの計数枠および２５０×２５０μｍのサンプリング格子を使用して実施した。個々のマウスそれぞれのＣＥ値は０．０３～０．０６の間の範囲であった。切片を、初めにＫｕ８０に関して、ＡＢＣキットおよびＤＡＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をニッケルと共に使用して、次いでＥＭ４８に関して、ＡＢＣおよびＤＡＢキットのみを使用して染色した。切片を、クレシルバイオレットを非幹細胞核染色のために用いて染色した。同一の立体解析学的パラメーターを使用して、ビヒクルを埋め込んだマウスにおける凝集体および細胞を計数した。埋め込みＲ６／２脳切片におけるＫｕ８０陽性細胞のこの立体解析学的評価を使用した場合、ＥＳＩ－０１７ ＮＳＣ埋め込み生存数は、平均で雄マウス（ｎ＝３）において６３，９７５個の細胞、および雌マウス（ｎ＝３）において１８，６７３個の細胞を示し、これは最初に移植した細胞の６４％（雄）および１８．６％（雌）に相当した。全体では、マウス（ｎ＝６、３匹の雄および３匹の雌）において平均で４１，３２３個の細胞が存在し、これは最初に移植した細胞の約４１％に相当する。埋め込んだ細胞の数における雄と雌との差は、５週においてより小さい雌に埋め込む技術的な困難に起因する場合がある。

ＩＨＣのために使用した一次抗体；ＧＦＡＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ４６７４）、ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ３７７）、ＳＣ１２１（ヒト特異的細胞質マーカーのＳＴＥＭ１２１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＡＢ－１２１－Ｕ－０５０）、Ｋｕ８０（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ａｂ８０５９２）、ダブルコルチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＢ２２５３）、Ｏｌｉｇ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ２４１８）、ＢＩＩＩチューブリン（Ａｂｃａｍ ａｂ１０７２１６）、ＭＡＰ－２、（Ａｂｃａｍ ａｂ５３９２）、ＢＤＮＦ（Ｉｃｏｓａｇｅｎ、３２９－１００）、およびＥＭ４８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ５３７４）。

ＲＮＡ単離およびリアルタイム定量ＰＣＲ。脳組織をＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において均質化し、総ＲＮＡを、ＲＮＥａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。ＤＮアーゼ処理をＲＮＥａｓｙ手順に組み込み、残留ＤＮＡを除去した。ＲＩＮ値は各試料に関して９超であった（Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー）。逆転写は、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよび１μｇの総ＲＮＡを使用し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は以前に記載されたように実施し（Vashishtha,Ng et al. 2013）、ｄｄＣＴ値をＲＰＬＰＯに対して定量化および分析した。Ｒ６／２－Ｈｔｔ導入遺伝子を増幅するために使用したプライマーは、
であった。使用した他のプライマーは、
であった。

Ｑ１４０マウスにおける免疫組織学的分析
ＩＨＣのために使用した一次抗体：ＨＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ１２８１）、ＤＣＸ（ａｂｃａｍ ａｂ１８７２３）、ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ Ｚ０３３４０１）、またはシナプトフィジン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０４－１０１９）。ＨＴＴ凝集体の定量のためのＩＨＣは、記載されているモノクローナル抗体ＥＭ４８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ５３７４）を使用し（Menalledet al., 2003）、ミクログリアの定量のためのＩＨＣ
は、記載されているウサギ抗Ｉｂａ－１（Ｗａｋｏ ０１９－１９７４１）を使用した（Watsonet al., 2012）。細胞計数に関しては、ＨＮＡ＋細胞を、６つの冠状切片の線条体区域全体にわたって計数した。２１００個のＨＮＡ標識細胞を１９定量し、ニューロンマーカー（ＤＣＸ、Ａｂｃａｍ ａｂ１８７２３）またはグリアマーカー（ＧＦＡＰ、Ｄａｋｏ Ｚ０３３４０１）で二重標識された細胞の割合を定量した。最終的な数を、１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭとして表した。

ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣは、Ｒ６／２マウスに移植された場合、行動を改変し、生存し、分化する
ＨＤのトランスジェニックモデルにおけるｈＮＳＣ移植の有効性を評価するために、本出願人らは、急速に進行する運動および代謝欠損、ならびに早期死亡（ｒｖ１２～１４週）を表す（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）エクソン１ ＨＴＴ Ｒ６／２マウス（ｒｖ１２０のＣＡＧ反復配列）（Cummingset al., 2012）を使用し、前
臨床研究における処置の方法論（Hickey and Chesselet,2003；Hockly et al., 2003）の初期評価を提供し得る。ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣは行動を改善する

ＧＭＰグレードのｈＮＳＣ株に関する製造プロセスおよび品質管理の図を図８Ａおよび８Ｂに記載する。フローサイトメトリーは、ｈＮＳＣ増殖および多能性マーカーに適切な染色を示した（図８Ａ）。免疫細胞化学は、神経外胚葉幹細胞マーカーのＮｅｓｔｉｎに関する染色を確認した（図８Ｃ）。ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣを凍結アリコート（ＵＣ Ｄａｖｉｓ）として入手し、解凍し、ＧＭＰ施設と同じ培地試薬を使用して継代せずに培養した後に投薬した。５週齢のマウスに、半球１つ当たり１００，０００個のｈＮＳＣの線条体内定位固定送達によって投薬した。雄（Ｍ）および雌（Ｆ）Ｒ６／２および非トランスジェニック（ＮＴ）同齢同腹仔、ならびにビヒクル対照（ｖｅｈ）を含めた（ｎ＝８のＲ６／２ ｈＮＳＣ Ｍ、６のＲ６／２ ｈＮＳＣ Ｆ、７のＮＴ ｈＮＳＣ Ｍ、７のＮＴ ｈＮＳＣ Ｆ、７のＲ６／２ ｖｅｈ Ｍ、６のＲ６／２ ｖｅｈ Ｆ、８のＮＴ ｖｅｈ Ｍ、および６のＮＴ ｖｅｈ Ｆ）。免疫抑制を全てのマウスに投与した。行動分析を実施し、マウスを９週齢時に、行動試験の直後に安楽死させた。

ｖｅｈ処置マウスは、以前に記載されたようにＨＤ関連行動を発生した（Mangiariniet
al., 1996）。簡潔に述べると、Ｒ６／２マウスの行動は、５週齢時にＮＴマウスの行動と区別不能であった。８週まで、神経学的異常には、進行性常同的後肢毛づくろい動作、クラスピング、および不規則歩行が含まれた。尾部を持ち上げた際、正常なマウスは後肢と前肢との両方を広げるが、マウスが肢を握りしめて腹部に付けている場合、マウスは「クラスピングしている」と考える。Ｒ６／２クラスピングの発症の遅延は、全てのｈＮＳＣ処置マウスにおいて観察され、ｖｅｈ処置マウスは埋め込みの３週間後までにクラスピングした。ｈＮＳＣ処置マウスはこの時点ではクラスピングせず、安楽死時（埋め込みの４週間後）において５０％のｈＮＳＣ処置マウスのみがクラスピングした（図９）。２種類の歩行運動アッセイを実施した。ロータロッドは、加速する回転ロッド上で歩行する能力を試験する。ｈＮＳＣ処置Ｒ６／２マウスは、ｖｅｈ処置Ｒ６／２マウスと比較してロータロッド成績の統計的に有意な改善を示した（埋め込みの１週間後において３０％の改善、ｐ＜０．０１；および埋め込みの３週間後において１９％、ｐ＜０．０５）（図１Ａ）。ポール試験は、垂直な梁を降りている間の時間を比較し、Ｒ６／２マウスは、ＮＴマウスと比較してより長い、下降までの潜時を有する。Ｒ６／２処置群間の統計的に有意な（ｐ＝０．０２）改善は埋め込みの４週間後に観察された（２５％の改善、図１Ｂ）。また、握力測定装置を使用して、神経筋機能および運動協調性も評価し、ｈＮＳＣ処置は、埋め込みの４週間後に有意な改善をもたらした（ｐ＝０．０２、１６％の改善、図１Ｃ）。

ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣの生存、遊走、および分化
マウスを埋め込みの４週間後に安楽死させ、脳を採取し、その半分を組織学のために後固定し、半分を生化学のために急速凍結した。ｈＮＳＣは、主に針の跡（needletrack）の周りにクラスター化し、線条体中に留まっていたが（図１Ｄ）、一部は皮質中にあり、数個は皮質領域と線条体領域との間の微小環境（脳梁／白質路）に遊走した（図１０）。ヒトマーカーのＳＣ１２１（細胞質）またはＫｕ８０（核）を使用して、細胞を、主に初期ニューロンマーカーのダブルコルチン（ＤＣＸ）を用いて染色した（ＳＣ１２１、図２Ａの混ぜ合わさった黄色；Ｋｕ８０、図２Ｂおよび２Ｃ）。一部の細胞は星状細胞表現型（グリア線維性酸性タンパク質［ＧＦＡＰ］）に分化する可能性があった（図２Ｂ）。埋め込み部位の周りにはマウスグリア細胞瘢痕を潜在的に表す非ヒトＧＦＡＰ陽性免疫染色も存在する（図２Ａおよび２Ｂ）。ｈＮＳＣのニューロン限定前駆体細胞への分化は、βＩＩＩ－チューブリン（図２Ｄおよび１０Ｂ）ならびに微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ－２）（図２Ｅおよび１０Ｃ）を用いて確認されたが、ＮｅｕＮとの同時局在の欠如（図２Ｆ）は、有糸分裂後ニューロンが存在しないことを示唆する。一方の半球におけるＫｕ８０陽性細胞の立体解析学的評価を使用した場合、ｈＮＳＣ埋め込み生存数は、平均で４１，３２３個の細胞を示し（ｎ＝６、３匹の雄および３匹の雌）、これは最初に移植した１００，０００個のうちの約４１％に相当した。

ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣの埋め込みはＲ６／２マウスにおける皮質線条体の興奮性亢進を予防する
本出願人らは次に電気生理学的活性を評価した。雄および雌マウスの線条体に１００，０００個のｈＮＳＣ（ｎ＝１８）またはｖｅｈ（ｎ＝１６）を５週で埋め込んだ。本出願人らは、埋め込みの４～６週間後の急性脳スライスにおけるｈＮＳＣから記録した（図３Ａおよび３Ｂ）。ｈＮＳＣは、未熟細胞に特徴的である基本的なニューロン特性、すなわち、宿主ＭＳＮよりも有意に小さい膜キャパシタンス（ｈＮＳＣ ２２．０±１．８ｐＦ、ｎ＝３１対ＭＳＮ ７１．３±３．５ｐＦ、ｎ＝４４；ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）、および有意に高い膜入力抵抗（ｈＮＳＣ ２８０４．８±２０３．０ＭＵ対ＭＳＮ １６３．８±１５．１ＭＵ；ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）を表す。ｈＮＳＣは、自発性興奮性シナプス後電流および自発性抑制性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣ）を示し、ｈＮＳＣが宿主組織または他の埋め込まれたｈＮＳＣからシナプス入力を受け取ったことを示す。しかしながら、ＭＳＮと比較して、周波数ははるかに低かった。一部のｈＮＳＣはまた活動電位を自発的に生成し、それが宿主ニューロンおよび近接しているｈＮＳＣに影響を及ぼし得ることを示唆した（図３Ｂ）。

電気生理学的変化は、ＮＴマウスと比較して症候性のＲ６／２からのＭＳＮにおいて生じ、内因性膜特性および低下した興奮性シナプス活性の変化を含む（Cepedaet al., 2003, 2007）。ｈＮＳＣ埋め込みは、Ｒ６／２マウスにおけるＭＳＮの膜特性も、平均ｓＥ
ＰＳＣ周波数（１．１±０．１Ｈｚ対１．４±０．２Ｈｚ）も、平均ＳＩＰＳＣ周波数も有意には変化させなかった。Ｒ６／２マウスはまた、皮質錐体細胞興奮性の増加、ならびにてんかん放電および発作を発生する性向を表す（Cummingsetal., 2009）。皮質の興奮性亢進は、ｓＥＰＳＣの周波数の増加と同時発生するＧＡＢＡＡ受容体の広範囲にわたる遮断の後に特に明白である、大きい振幅のＥＰＳＣおよび高周波数バーストの出現によって、線条体のＭＳＮにおいて示される（Cepedaetal., 2003、Cummings et al., 2009）
。ｈＮＳＣ埋め込みマウス（２０．５％、９／４４）において、ｖｅｈマウス（２８．６％、１６／５６）と比較して小さい割合（統計的に有意ではない）のＭＳＮが皮質線条体の増加した興奮性を呈した。しかしながら、この集団内のｓＥＰＳＣ周波数の増加は、ｈＮＳＣを埋め込んだＲ６／２マウスでは生じなかった。事象間間隔プロットの累計確率分布における右側シフトが生じ（ｐ＜０．００１）、ＧＡＢＡＡ受容体が遮断される場合、ｈＮＳＣは皮質から線条体への興奮性亢進入力を減少させることができることを示した（図３Ｅおよび３Ｆ）。

宿主組織はＲ６／２マウスにおいて、埋め込まれたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣとの潜在的なシナプス結合を作る
本出願人らは、免疫組織化学（ＩＨＣ）および電子顕微鏡法（ＥＭ）を利用して、宿主由来の神経末端がｈＮＳＣとのシナプス結合を作るか否かを検討した。本出願人らは、宿主を起源とする未標識神経末端が、埋め込まれて免疫標識されたｈＮＳＣと潜在的な対称性シナプス結合を作る例を見出した（図４Ａ）。神経末端内の数個のシナプス小胞はシナプス前膜に極めて接近しており、小胞放出の潜在的な区域を示す（ｈＮＳＣのＤＡＢ標識は結合を不明瞭にしている）。加えて、本出願人らは、宿主を起源とする未標識神経末端が明確に非対称な結合を作り（図４Ｂ）、興奮性シナプス結合を示唆していることを見出した。全体として、本出願人らは、宿主を起源とする未標識神経末端のうち、４４．５％（ｎ＝７１）が標識ｈＮＳＣと非対称性結合を作り、４８．３％（ｎ＝６９）が対称性結合を作っていたことを見出した。標識ｈＮＳＣと並置された宿主を起源とする未標識神経末端の残りの７．２％（ｎ＝１１）に関しては、その結合の正確な性質（非対称性か対称性か）を決定することができなかった。

ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣはＱ１４０ノックインマウスにおいて行動をレスキューし、生存し、分化する
本出願人らは次にｈＮＳＣがまた緩徐進行性全長ＨＤマウスモデルにおける欠損を改善し得るか否かを決定した。Ｑ１４０マウスは、１４０の反復配列がマウスハンチンチン遺伝子に挿入された改変マウス／ヒトエクソン１を発現する（Menalledet al., 2003）。
ホモ接合型マウスは、１．５か月齢時によじ登り欠損、ならびに４か月前後において認知欠損（Hickeyet al., 2008；Simmons et al.,2009）およびＨＴＴの可視凝集体（Menalled et al., 2003）を含む、運動試験における早期異常を呈する。線条体萎縮は１年で検
出され、２２か月では３５％の線条体細胞が喪失する（Hickeyet al., 2008）。１群当たり２４匹の２か月齢のホモ接合型雄および雌マウスに、定位固定して線条体に両側送達される、半球１つ当たり１００，０００個のｈＮＳＣを投薬し（ｎ＝１２／性別）、対照同齢Ｑ１４０（ｎ＝１２／性別）および野生型（ＷＴ）（ｎ＝１２／性別）マウスにｖｅｈを注射した。全てのマウスを免疫抑制した。行動試験は１．５か月齢時（細胞移植前）に開始し、マウスを移植の６か月後の８か月で安楽死させた。行動の試験は走行輪を除き全てのマウスに関して実施し、走行輪に関しては、発情周期が走行活動に影響を与えるため、雄のみ使用した（Hickeyetal., 2008）。オープンフィールドでの歩行運動活性における早期欠損、およびケージよじ登り試験における自発運動活性の低減がＱ１４０マウスにおいて観察されたが、ｈＮＳＣ処置は成績をレスキューしなかった（図１１）。

ポール試験において、ｖｅｈ処置Ｑ１４０マウスは、ＷＴ対照と比較して反転するのにより長い時間がかかり（ｐ＝０．００４）、対照的に、ｈＮＳＣ処置Ｑ１４０マウスは、対照Ｑ１４０マウスよりも有意に良好であり（ｐ＝０．０４）、もはやＷＴと有意には異ならず、移植の３か月後に有益な効果を示した（図５Ａ）。Hickeyet al. (2008)によって報告されているように、５．５か月齢の雄Ｑ１４０マウスは、２週間で有意な走行速度（３分当たりの回転回数）の重大な欠損を有した（図５Ｂ）。走行輪欠損の持続的改善は、ｈＮＳＣ処置Ｑ１４０マウスに関して、処置後に観察され、ｖｅｈ処置マウスと比較して平均走行輪活動の進行性増加を示した（図５Ｂおよび５Ｃ）。本出願人らは、ｈＮＳＣ投与はＱ１４０マウスにおいて観察された運動欠損の一部を改善すると結論した。

新規物体認識（ＮＯＲ）とは、学習と記憶（認識）との両方を必要とし、馴染みのある物体よりも新規な物体を調査するというマウスの傾向を活用する皮質依存的な認知試験である。ｖｅｈ注射Ｑ１４０マウスは、Simmonset al. (2009)によって報告されているよ
うに、埋め込みの３および５か月後においてｖｅｈ注射ＷＴマウスと比較してＮＯＲにおける有意な機能障害を呈した（それぞれｐ＝０．００３およびｐ＝０．０３）。Ｑ１４０マウスにおけるｈＮＳＣの線条体移植は、埋め込みの５か月後に認知機能障害をレスキューしたが（ｐ＝０．０３）、それ以前ではレスキューしなかった（図５Ｅおよび５Ｆ）。

ｖｅｈおよびｈＮＳＣ移植Ｑ１４０雄マウスのサブセット（各群に関してｎ＝５）をＩＨＣ分析のために処置の６か月後に安楽死させた。ヒト核特異的抗体（ＨＮＡ）で同定されるｈＮＳＣは移植の６か月後に存在し、大半が線条体中の注射経路（図５Ｇａ、ｂ）に確認された。ＨＮＡ陽性細胞の数を６つの冠状切片における線条体区域全体にわたって計数し、ＤＣＸまたはＧＦＡＰを用いて二重標識された細胞を算出した（１群当たり５匹のマウスからの平均データ±ＳＥＭ）。１００，０００個のｈＮＳＣのうちのおよそ２５％が生存し、大半（８４％±２％）はＧＦＡＰ陽性であり（図５Ｇｂ、ｃ）、より少ない割合（１６％±２％）がＤＣＸ陽性である（図５Ｇｅ、ｆ）。

ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ移植はＨＤマウスにおけるＢＤＮＦレベルを増加させる
増加したレベルの神経栄養増殖因子、およびその後の増加したシナプス結合性は、ＮＳＣの移植後に観察される行動の好転に関与している（Blurton-Joneset al., 2009）。さらに、低下したＢＤＮＦは、ＨＤの複数のマウスモデルおよびヒトＨＤ脳において実証されている（Zuccatoet al., 2011）。したがって、本発明者らは、ＢＤＮＦレベルを神経
栄養効果に関するマーカーとして評価した。Ｒ６／２ ｈＮＳＣマウスにおいて、ＩＨＣおよび共焦点顕微鏡法はＢＤＮＦのＤＣＸ陽性ｈＮＳＣとの同時局在を示し、分化した細胞がＢＤＮＦを産生することを示唆した（図６Ａ）。実際、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて成長し、分化したｈＮＳＣは、ＤＣＸ陽性となった後にのみＢＤＮＦを産生する。Ｑ１４０
ｈＮＳＣマウスにおいて、ＢＤＮＦを雄マウスのサブセット（ｎ＝６／群）においてＥＬＩＳＡによって定量した。線条体ＢＤＮＦは、Ｑ１４０マウスではＷＴと比較して減少したが、ｈＮＳＣ処置ではｖｅｈと比較してＢＤＮＦレベルの有意な増加が観察され、ＢＤＮＦレベルをＷＴレベルまで回復させた（図６Ｃ）。

神経栄養シグナル伝達がシナプス活性を増強することができることを考慮して、本発明者らは、全ての灌流Ｑ１４０動物（ｎ＝５／群）の線条体における、シナプスマーカーであるシナプトフィジンのレベルを、マイクロアレイスキャナーを以前に記載されているように使用して（Richteret al., 2017）、ＩＨＣおよび定量によって調べた。ｈＮＳＣ処置Ｑ１４０マウスのｖｅｈ処置Ｑ１４０マウスとの比較は、ｈＮＳＣマウスにおけるシナプトフィジンの有意な増加を明らかにした（図１３Ａ、図１３Ｂにおいて定量）。

これらの結果は、生着したｈＮＳＣがＢＤＮＦを含む増加した神経栄養効果によってシナプス結合性を部分的に改善し得ることを示唆する。

Ｑ１４０マウスにおけるＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ処置はミクログリアの活性化を減少させた
Ｑ１４０マウス（ｎ＝５／群）からの線条体切片を、休止ミクログリアと反応性ミクログリアとの両方を同定するイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）抗体を用いて染色した。ミクログリア細胞体のサイズは、活性化状態細胞形態と相関し（Watsonet al., 2012）、Ｉｂａ１陽性細胞の直径の有意な増加（強力なミクログリア応答）
がＱ１４０マウスの線条体において観察された。この応答はｈＮＳＣによって有意に低下した（図６Ｄ）。ｈＮＳＣ埋め込みＲ６／２マウスにおける同様の分析は、線条体の有意な変化を示さず（図１３）、比較的局在化した効果、または活性化したミクログリアの中等度のレベルに起因すると考えられる。

ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣ移植はｍＨＴＴ蓄積および凝集体を減少させる
ＨＤ病態の特色は、変化したタンパク質恒常性を反映し得るＨＴＴ封入体の存在である。したがって、本発明者らは、Ｒ６／２およびＱ１４０マウスからの脳切片に関して不偏立体解析学的評価を実施した。Ｒ６／２マウスに関して、切片を、初めにＫｕ８０に関して、ニッケル増強ＤＡＢ（黒色）を用いて、次いでＨＴＴ（ＥＭ４８）に関して、ニッケルを伴わないＤＡＢを使用して、次いで非ｈＮＳＣ核染色のためにクレシルバイオレット対比染色を用いて染色した。図７Ａは、ｈＮＳＣ埋め込みに隣接する立体解析学を実施した区域を示し、埋め込みから離れた区域は変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）蓄積においても凝集体においても有意差を示さなかった。結果は、ｈＮＳＣを埋め込んだＲ６／２マウスが、ｖｅｈと比較して、注射部位付近において減少した散在性染色の数および減少した封入体の数を有することを示す（図７Ａおよび７Ｂ）。

凝集体数の明確な減少もまたＱ１４０マウスの線条体において観察された（図７Ｃ）。処置の６か月後において、ｈＮＳＣ処置Ｑ１４０マウスは、ｖｅｈ処置マウスと比較してより少ない散在した染色された核（ｐ＝０．０１０２）、およびより少ない神経網凝集体（ｐ＝０．０２３９）を有したが、核封入体の減少も微小凝集体の減少も有しなかった（それぞれｐ＝０．０７５３およびｐ＝０．３７２）（図７Ｄ）。この結果は、ｈＮＳＣ送達がＨＤ関連病態をモジュレートしたことを示唆する。封入体の獲得は、Ｒ６／２（図１０Ｄ）またはＱ１４０マウスのいずれにおいても、移植した細胞中にも移植した細胞付近にも観察されなかった。

ｈＮＳＣ移植はｍＨＴＴおよびユビキチン化タンパク質の病原性蓄積を低減させる
本出願人らは次に、Ｒ６／２脳に蓄積する高分子量（ＨＭＷ）ｍＨＴＴ種およびユビキチン修飾タンパク質に対するｈＮＳＣ処置の影響を検討した。これらの不溶性タンパク質の低下は、Ｒ６／２マウスにおける改善した行動の転帰に対応する（Ochabaet al., 2016）。ｈＮＳＣ移植を伴うおよび伴わないＮＴおよびＲ６／２線条体の界面活性剤不溶性
画分の評価は、蓄積したｍＨＴＴレベルがＲ６／２線条体において有意に増加したこと、およびｈＮＳＣを用いた処置がＲ６／２線条体においてｖｅｈ処置マウスと比較して不溶性ＨＴＴ蓄積を約７０％低減させたことを示し（図７Ｅおよび７Ｆ）、これらは変化したｍＨＴＴ導入遺伝子ｍＲＮＡ発現に起因しなかった（図１４）。蓄積したユビキチンコンジュゲートタンパク質もまたＲ６／２線条体においてＮＴマウスと比較して有意に増加し、ｈＮＳＣ処置はＲ６／２マウス線条体においてｖｅｈ処置マウスと比較して不溶性ユビキチンコンジュゲートタンパク質を減少させた（図７Ｅおよび７Ｆ）。有意差は処置ＮＴマウスでは検出されなかった。

ＣＣＴ／ＴＲｉＣ（ＴＣＰ１環複合体）シャペロニンとは、新たに翻訳されたポリペプチドと結合し、それを折り畳むオリゴマーシャペロンである。ＣＣＴ／ＴＲｉＣ発現は、複数のＨＤモデル系において切断されたｍＨＴＴの凝集を予防する（Tam,S., et al., The chaperonin TRiC controls polyglutamineaggregation and toxicitythrough subunit-specific interactions. Nature CellBiol, 2006. 8(10): p.1155-1162）。１つのサ
ブユニットＣＣＴ１の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞における凝集を阻害するのに十分であり、ｍＨＴＴ媒介細胞毒性を軽減する（Tam,S., et al.,The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element thatpromotes theconformational switch to aggregation. 2009. 16(12): p. 1279-1285）。驚くべきことに、酵母ＣＣＴ１の２０ｋＤａの頂端ドメイン（ＡｐｉＣＣＴ１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換えｍＨＴＴの凝集を阻害するのに十分である。本出願人らのデータは、組換えＡｐｉＣＣＴ１、すなわちＡｐｉＣＣＴ１ｒが、細胞におけるＨＤ表現型を減少させることができ（Sontag,E.M.,et al., Exogenous delivery of chaperonin subunit fragment ApiCCT1modulatesmutant Huntingtin cellular phenotypes. Proc Natl Acad Sci U S A,2013. 110(8):p. 3077-82）、ＨＤマウス初代ニューロンの共培養におけるＢＤＮＦ輸送欠損をレスキューすることができる（Zhao, X.,et al., TRiCsubunits enhance BDNF axonal transport and
rescue striatal atrophyin Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016
）ことを示す。重要なことに、この外因的に適用されるＡｐｉＣＣＴ１ｒは、培養細胞および初代ニューロンの細胞質ゾルに取り込まれて効果を発揮し（Sontagetal、Zhao et al）、タンパク質を疾患組織に送達することができる場合、ＡｐｉＣＣＴ１が細胞によっ
て取り込まれて有益な効果を有し得ることを示唆する。ＡｐｉＣＣＴ１のＲ６／１線条体への単回直接注射は、２週間後でさえ検出され、高分子量ＨＴＴおよび凝集したＨＴＴのレベルを低下させた。より近年の予備データでは、ｓＡｐｉＣＣＴ１のウイルス媒介送達、またはＡｐｉＣＣＴ１を分泌するマウスＮＳＣの送達は、ＨＤマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける改善を提供する。これらのデータは、ＡｐｉＣＣＴ１の継続的送達が神経保護的であり得ることを示唆する。

ＡｐｉＣＣＴ１のウイルス媒介送達はｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効である。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける継続的なｓＡｐｉＣＣＴ１送達を評価するために、ｓＡｐｉＣＣＴ１のＡＡＶ２／１媒介送達を、約１１５の反復配列を有するヒトｍＨＴＴのエクソン１を発現し、Ｒ６／２よりも緩徐な疾患進行経過を表すＲ６／１マウスにおけるｍＨＴＴ蓄積に対する効果に関して、小規模なパイロット研究において試験した［２４］（図１５Ａにおける構築物）。Ｒ６／２マウスにおける表現型の急速な発症、およびＡＡＶ２／１が完全な発現を達成する２～３週間という期間のため、疾患進行のより早期におけるウイルスの送達は、病理学的表現型の最大限の修正を達成するために必須であり得る。したがって、Ｒ６／１マウスへの両側線条体内注射（１２×１０^９のゲノムコピーの、ｓＡｐｉＣＣＴ１またはｍＣｈｅｒｒｙ対照を発現するＡＡＶ２／１）を５週齢に実施し、組織を１７週齢に収穫した。ｓＡｐｉＣＣＴ１を注射した動物は、オリゴマーｍＨＴＴのおよそ４０％の減少を示した（図１５ＢおよびＣ）。立体解析学による分析もまた、可視封入体のおよそ４０％の減少を明らかにしたが（図１５Ｅ）、この効果は、おそらくは検出力不足の試料サイズのために、統計的に有意ではなかった。これらの動物は、１６週齢にクラスピング行動の有意な改善を表し、このアッセイは運動機能障害の指標である（データは示していない）。本研究をより大きな試料サイズ（各条件において約２０匹）を用いて繰り返した。ＡＡＶ２／１－ｓＡｐｉＣＣＴ１を注射した動物は、１０、１２、および１４週において、運動協調性および平衡性を測定するロータロッド課題の有意な改善を示した（図１５Ｆ；１０および１２週のデータは示していない）。これらの動物はまた、以前の研究と矛盾しないクラスピング行動の改善も示した（データは示していない）。総合すると、これらの研究は、ｓＡｐｉＣＣＴ１の継続的送達がＨＤマウスにおける行動の転帰を改善してｍＨＴＴ病態を抑制するのに十分であることを示唆する。

ウイルス形質導入ｈＮＳＣはＨｔｔ１４Ａ２．６ ＰＣ１２細胞に侵入してオリゴマーｍＨＴＴ種に影響する分泌性ＡｐｉＣＣＴ１を産生する
本出願人らは、小規模のパイロット研究を実施して、ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣへのｓＡｐｉＣＣＴレンチウイルス形質導入を試験し、形質導入に適切な力価を決定し、ＡｐｉＣＣＴの産生と変異体ＨＴＴ凝集に対する効果とを検討した。簡潔に述べると、ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣを６ウェルプレートにおいて培養し、次いでこれに０、５、１０、および１５の感染多重度（ＭＯＩ）でｓＡｐｉＣＣＴレンチウイルスを形質導入した。細胞を４８時間培養し、培地を回収し、細胞をタンパク質分析のために収穫した。図１６Ａは、ＨＡタグ付きＡｐｉＣＣＴのウエスタン分析を示し、形質導入されたＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣがＡｐｉＣＣＴを産生していること、およびウイルスＭＯＩが増加するにつれて産生が増加することを示す。形質導入されたｈＮＳＣから回収した培地をＨｔｔ１４Ａ２．６ ＰＣ１２細胞培地に添加して、形質導入した分泌性ＡｐｉＣＣＴが、以前に記載されたように（SontagPNAS, 2013）、近接している細胞に侵入し得ることを決定した。誘導
因子であるポナステロンの存在下において、これらの細胞は、増強型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＣ末端で融合した切断型の伸長反復配列ＨＴＴエクソン１タンパク質（１０３Ｑ）を４８時間以内に発現する。誘導および条件培地の適用の４８時間後、細胞を洗浄し、収穫して、ウエスタン分析を実施した。結果は、処理した１４Ａ２．６細胞からの細胞溶解物がＡｐｉＣＣＴであるために適切な分子量のＨＡタグ付きタンパク質を含有することを示す（図１６Ｂ）。ＡｐｉＣＣＴの条件培地送達が特異的な変異体ハンチンチン（ｍＨＴＴ）凝集種に対して効果を有していたかを評価するために、本出願人らは初めに単量体可溶性ＨＴＴ断片のレベルが変化したかを評価した。同じ実験からのＨＴＴ単量体レベルを、ＧＦＰに対する抗体を使用するウエスタン分析によって調べた（図１６Ｃ）。ＡｐｉＣＣＴ１は単量体レベルのｍＨＴＴの発現を変化させないようであり、これは、ＡｐｉＣＣＴが定常状態レベルの単量体変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）を変化させず、誘導されたｍＨＴＴの遺伝子発現に影響を与えないようであることを示唆する。不溶性ＨＴＴ凝集体およびｍＨＴＴオリゴマーはＨＤの特色である。特に、オリゴマーｍＨＴＴ種は、影響を受けるニューロンにおける毒性の供給源となり得る。したがって、本出願人らは、ｍＨＴＴオリゴマーを測定して、ＡｐｉＣＣＴ１の送達が、精製ＡｐｉＣＣＴ１タンパク質の直接送達に関して以前に実証されたように、これらの形態の蓄積に影響を与えるか否かを決定した。ＳＤＳアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）手法はｍＨＴＴの可溶性線維性オリゴマーを優先的に分離すると考えられるため、ＡＧＥを使用して、オリゴマー種を分離した。細胞溶解物からの等量のタンパク質をＳＤＳ－ＡＧＥゲルにロードした。ＩｍａｇｅＪを使用してデンシトメトリーの測定値を取得し、ＡｐｉＣＣＴ１は最も高いＭＯＩでのみｍＨＴＴオリゴマーのレベルの低減（１０％超）を引き起こした（図１６Ｄ）。しかしながら、スメア長は１０と１５との両方のＭＯＩで減少した。これらのデータは、ｈＮＳＣからのＡｐｉＣＣＴ１分泌が近接している細胞におけるオリゴマーｍＨＴＴの形成を抑制することができることを示し、精製ＡｐｉＣＣＴ１に関する本発明者らの公開結果を再現する。これらの結果は、ＧＭＰ生産において用いるための、ｈＮＳＣへのレンチウイルス形質導入の方法を検証し、ｈＮＳＣ送達の可能性を確立する。

ウイルス形質導入ｈＮＳＣはマウスへの埋め込み後に分泌性ＡｐｉＣＣＴ１を産生する
ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣを上に記載したようにＵＣＩにおいて培養した。ｈＮＳＣに１５のＭＯＩでレンチウイルスを４８時間形質導入し、次いでｈＮＳＣを５週齢のマウスに、上に記載したように移植した。雄および雌Ｒ６／２および非トランスジェニック同齢同腹仔、ならびにビヒクル対照を含めた。免疫抑制を全てのマウスに投与した。マウスを９週齢時に安楽死させ、脳を採取し、その半分を組織学のために後固定し、半分を生化学のために急速凍結した。ｈＮＳＣ－ＡｐｉＣＣＴ埋め込み細胞は、ｈＮＳＣに関して記載したのと類似したＩＨＣを有した（図１７）。ヒト核抗原マーカー（ＨＮＡ）を使用して、細胞を主に、初期ニューロンマーカーのダブルコルチン（ＤＣＸ、青色）を用いて染色した（図１７Ａの混ぜ合わさったピンク色）。一部の細胞はＨＡタグ付きＡｐｉＣＣＴを発現する（図１７Ｂ）。

考察
幹細胞に基づく移植戦略は、その戦略が再生および回復機構を介して病態をモジュレートできることに基づく、神経変性障害のための有望な手法である。ＨＤモデルにおいて、マウス由来ＮＳＣは有望な結果を示しているが、ｈＮＳＣに基づく手法は、混在した成功を収めており、毒モデルでは堅牢な有効性を伴い、遺伝的ＨＤマウスでは限定された神経保護を伴う（El-Akabawyet al., 2012；Golas and Sander, 2016）。ここで、本発明者
らは、欠損の堅牢なレスキューと、ｍＨＴＴタンパク質の蓄積を標的とする疾患修飾活性とを提供するＧＭＰグレードのｈＮＳＣの移植を記載する。ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣは、Ｒ６／２マウスでは、電気生理学的に活性であったが、線条体ＭＳＮ膜特性に対しても自発性シナプス活性に対しても有意な効果を有しなかった。しかしながら、ＭＳＮのサブセットでは、ビククリンを用いたＧＡＢＡＡ受容体の広範囲にわたる遮断の後に共通して観察されるｓＥＰＳＣの周波数の増加が生じず、移植片が皮質の興奮性亢進を減少させるのに役立つことを示唆した。本出願人らは、この効果の根底にある機構を決定していないが、移植片内部への電気刺激は近接している細胞においてＩＰＳＣを誘導し、刺激が抑制性であることを示唆する。微細構造データは、宿主が、ｈＮＳＣとの同数の対称性（抑制性）シナプス結合と非対称性（興奮性）シナプス結合との両方を潜在的に作ることを示す。本発明者らの仮定は、効果は埋め込んだ細胞に由来し、Ｒ６／２マウスにおいて、埋め込んだ細胞は主にニューロンの系譜に沿って分化するというものである。しかしながら、Ｑ１４０マウスを含む他の実験では、グリアの潜在的な効果が存在し、改善の駆動因子が未だ理解されていないことを示唆する。ニューロンの喪失がこれらのマウスにおいては疾患の最晩期まで生じないことを考慮すると、線条体特異的移植は、ＢＤＮＦ等の栄養因子を介した神経保護と、ｍＨＴＴ種の異常な蓄積を予防することとの両方によって作用するようである。しかしながら、移植した細胞における電気生理学的活性の所見、および改善した電気生理学的転帰を容易にし得るヒト細胞と内在性マウス細胞との結合は、再生効果の機会もまた存在し得ることを示唆する。

他の前駆体細胞種ではなくＮＳＣを移植することに関する理論的根拠は、複数の系譜に沿って分化するＮＳＣの能力に基づいている。Ｒ６／２マウスにおいて、細胞は早期の星状細胞またはニューロン分化の証拠を呈し、大半はニューロン限定前駆体細胞マーカー（ＤＣＸ、βＩＩＩ－チューブリン、およびＭＡＰ－２）で同時標識する。ｈＮＳＣは最終分化するのに典型的には数か月かかるため、本発明者らは、４週時点では移植した細胞の部分的分化のみを観察すると予期した。興味深いことに、ＥＳＩ－０１７ ｈＮＳＣは埋め込み前、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてほとんどがＤＣＸ陽性ではない。Ｒ６／２マウスにおける細胞運命の結果は、Ｑ１４０長期ＨＤモデルにおける本発明者らの所見、ならびにより多くの細胞が星状細胞になるｈＮＳＣを使用するパーキンソン病およびアルツハイマー病（ＡＤ）モデルにおける他の研究（Goldberget al., 2017）と対照的であるが、後
者は、よりグリア分化に適している（ｇｌｉｏｇｅｎｉｃ）傾向がある胎児ＮＳＣに由来する。これらのデータは、疾患のニッチに応じて異なる応答が存在し得ること、免疫抑制の方法論が仕様に影響を与え得ること、またはマウス細胞ではなくヒト細胞に特異的な発生刺激および時機が転帰に影響を与えることを示唆する。

減少したＢＤＮＦレベルはＨＤマウスおよびヒトＨＤ被験体において存在し（Strandet
al., 2007；Zuccato et al., 2011）、ＨＤマウスにおける多くの有効な処置は、随伴するＢＤＮＦの増加を示す（RossandTabrizi, 2011）。幹細胞移植を介した栄養因子支援
という見解と矛盾せず、ＧＤＮＦを発現するマウスＮＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ送達は、ＨＤマウスにおいて運動機能を維持してニューロンの喪失を予防し（Ebertetal., 2010）、ＢＤＮＦは、ＡＤマウス（Blurton-Jones et al., 2009）またはレビー小体型認知症のモデル（Goldbergetal., 2015）のいずれかへのマウスＮＳＣ移植後の改善した認知に必要とされた。ＢＤＮＦは、ＨＤにおいて変化している皮質線条体路（Laforetetal., 2001
）を含む求心路を介して線条体に輸送しなければならない。栄養支援を線条体に供給することによって皮質線条体路が皮質におけるＢＤＮＦ産生をシグナル伝達するのに十分に保存されるか、または幹細胞由来ＢＤＮＦが線条体から皮質線条体ニューロンの細胞体へ逆行性に運ばれて、移植後の改善した電気生理学的活性をもたらすということが考えられる。

埋め込まれたｈＮＳＣの作用機構の１つは、凝集体の形成を潜在的に予防することかまたは選択的クリアランス機構を潜在的に誘導することによる、異常なｍＨＴＴ蓄積および凝集体の減少を介した機構であり得る（例えば、Chenet al., 2013）。本発明者らは近
年、特異的ＨＭＷ不溶性ｍＨＴＴ種の減少がＲ６／２マウスにおける改善した行動、およびいくつかの分子読出し結果の正常化と関連するという所見を記載した（Ochabaetal., 2016）。ｍＨＴＴおよびユビキチン化ＨＭＷ不溶性種の病原性蓄積の減少がＨＤマウスにおいて観察されるニューロンの機能不全を予防するということは理にかなっている。

凝集体がヒトＨＤ被験体における胎児細胞移植物の研究において獲得され得るという観察（Cicchettiet al., 2014）と対照的に、封入体等の後天性ＨＤ表現型の証拠がいずれ
のマウスモデルにおいても移植物の過程にわたり観察されなかったということを指摘することは重要である（図１０）。明らかなタンパク質伝播または後天性病態の欠如は、ｈＮＳＣの増加した栄養シグナル伝達の結果、またはそうでなければ移植した細胞へのタンパク質伝播を容易にすることができたｍＨＴＴ種を減少させたことからの結果であり得る。あるいは、マウス研究によって提示されていないが、細胞が病態を獲得するのには数年かかる可能性がある。

要約すると、本発明者らは、ＨＤマウスに移植されたｈＮＳＣが、生存し、神経集団に分化し、傷害組織を保護または修復して疾患進行を遅延する場合があり、病態を軽減して保護分子の産生を増加させ、周囲組織との結合を潜在的に形成したことを示し、これは、ＨＤに関する将来性のある処置戦略を示唆する。遺伝子的に是正された患者由来ＮＳＣがヒトニューロンおよびＤＡＲＰＰ－３２陽性細胞を形成することができることを示すAnet al. (2012)による結果、ならびにここで報告された結果を考慮すると、是正された患者細胞を使用する自家移植の将来的適用もまた実現可能であり得る。

均等物
本発明は上の実施形態と関連させて説明されたが、前述の説明および例は例示することが意図されており、本発明の範囲を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点、および変更は、本発明が属する技術分野の当業者には明らかだろう。

加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群によって記載される場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識するだろう。

本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが個々に参照によって組み込まれる場合と同じ程度に、その全体が参照によって明白に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。本明細書全体において、技術文献は著者の引用によって参照され、その完全な書誌の詳細は以下に提供される。

Claims (1)

1. 図面に記載の発明。