KR20230020351A - B2m 유전자의 발현이 저해된 유전적으로 조작된 줄기세포 및 이의 이용방법 - Google Patents

B2m 유전자의 발현이 저해된 유전적으로 조작된 줄기세포 및 이의 이용방법 Download PDF

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Abstract

B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 줄기세포 및 이의 이용방법에 관한 것이다. 일 양상은 B2M 유전자가 낙아웃된 체세포로를 제조하고 이로부터 체세포 핵 치환을 통해 제조한 만능 줄기세포(PCNT-PSCs) 및 이로부터 분화를 유도한 면역세포에 관한 것으로, 일 양상의 만능 줄기세포와 면역세포는 B2M 유전자가 낙아웃되어도 정상적인 면역세포인 NK 세포와 감마델타 T세포로 분화가 가능하다. 아울러 상기 제조된 세포는 B2M 유전자를 표적으로 하여 HLA class I 분자의 넉아웃을 유도하였으므로 동종 T 세포의 반응을 유도하지 않는 'off-the-shelf' 개념의 면역거부회피를 통해 생체 내에서 오랜기간 생존 가능하고 주입횟수를 최소화할 수 있으므로 저-면역세포 또는 면역거부회피 줄기세포와 면역세포로 활용되어 세포치료제로서 널리 활용될 수 있다.

Description

B2M 유전자의 발현이 저해된 유전적으로 조작된 줄기세포 및 이의 이용방법{Genetically engineered stem cells with inhibited expression of the B2M gene and use thereof}
B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 줄기세포 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
최근 10년 사이 전 분화능 줄기세포 유래 세포치료제 원료의 발굴과 기술개발이 지속되고 있다. 특히 세포치료제의 가장 큰 난관 중 하나인 면역 거부반응을 회피하면서 세포치료 원료로의 고품질의 세포주 확립을 위하여 종래 성인유래 혹은 전분화능 줄기세포주 유래의 세포주와는 완전히 다른 개념의 새로운 세포치료원료를 찾을 필요성이 있다. 다만, 유전자 조작에 의한 면역거부반응을 원칙적으로 제거하면서도 세포의 손상을 회복한 세포치료제 기술은 현재 알려진 바가 없다.
이러한 문제를 해결하기 위해 건강한 기증자로부터 면역 효과세포(immune effector cells)를 만들어 사용하는 기성품 세포치료제로의 개발이 이루어지고 있다. 면역세포 치료제로는 지금까지 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor; CAR)를 활용한 자가 말초혈액 유래 T 세포를 사용하였으나, 충분한 수의 T 세포를 수득하는 것이 어렵고, 자가치료제로만 사용 가능한 단점이 존재하였다. 이와는 달리 NK 세포(natural killer cell)는 이러한 선천적 면역으로 인한 동종이식의 거부 반응이 없고, 면역 저하 환자에게 다량을 주입하더라도 GVHD (Graft-versus-host-disease)를 유발하지 않기 때문에 HLA와 일치하지 않는 경우에도 활용할 수 있어 그 활용성이 증가하고 있다. 또한 NK 세포는 별도의 항원제시가 필요하지 않기 최근 NK 세포를 기반으로 하는 면역 항암치료제에 대한 연구가 증가하고 있다. 그러나 주입된 NK 세포는 환자의 면역체계에 의해 인식이 거부되기 때문에 생체 내 수명이 제한되고 여러 번 주입해야 하는 번거로움이 있어, 세포치료제로 사용되는 NK세포의 수명을 늘리려는 시도가 계속되고 있다.
또한 현재 새로운 면역세포 치료제로 떠오르고 있는 감마 델타 T세포(Gamma delta T cell)는 MHC 매개 항원 제시에 제한되지 않은 기능을 가진 비통상적인 T 세포이다. 일반적으로 림프기관이 아닌 말초 조직으로 이동하여 MHC 의존성 항원 제시와는 독립적인 기능을 수행하면서 풍부한 사이토카인 분비 능력을 가지고 있어 암세포를 효율적으로 식별하고 죽일 수 있는 능력을 가진 것으로 알려져 있다. 특히 종양 세포는 MHC 이종항원 및 낮은 항원 확산을 통해 면역 체계를 회피할 수 있는 능력이 있기 때문에 MHC로부터 독립적인 감마 델타 T세포는 새로운 면역 치료제로 개발의 필요성이 대두되고 있다.
따라서, 최근 이러한 주요조직 복합체(MHC)를 조절한 동종유래 면역 세포치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
일 양상은 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 줄기세포를 제공하는 것이다.
일 양상은 상기 줄기세포로부터 분화시킨 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 면역세포를 제공하는 것이다.
일 양상은 상기 제조된 줄기세포 또는 면역세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.
다른 양상은 체세포를 면역거부회피 줄기세포로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 면역거부회피 면역세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 B2M (β2-마이크로글로불린) 유전자에 특이적으로 결합하는 유전자 편집 복합체, 외인성 핵산 분자, 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터를 포함하는, B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 줄기세포를 제공한다.
상기 “B2M”로도 알려진 베타-2 마이크로글로불린(β2-microglobulin)은 주요면역적합항원(Major Histocompatibility Antigen Complex : MHC) 클래스(class) I 분자들의 가벼운 체인이며, 통상적으로 알려진 주요조직적합성 복합체의 필수 부분이다. 인간에서, B2M는 염색체 6 번 상(on)에 유전자 클러스터(cluster)로서 위치되는 다른 MHC 유전자들에 반대되는, 염색체 15번 상에 위치되는 B2m 유전자에 의하여 코딩된다. 인간 B2M 단백질은 119개 아미노산들로 11.800 달톤(Daltons)의 분자량을 갖는 것으로 알려져 있다. 상기 B2M 유전자는 마우스 B2M 유전자 Mus musculus (house mouse)는 예를 들어, NCBI Accession No. NC_000068.8일 수 있으며, 인간 B2M 유전자 (Homo sapiens (human))는 예를 들어 NCBI Accession No. NC_000015.10 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 통상의 기술자라면 상기 등록번호를 이용하여 변이의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. NCBI, UCSC genome browser 또는 GenBank에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
상기 주요면역적합항원(MHC)는 6 종의 HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR)는 세포 표면 단백질이며, 사람은 부계 유전자에서 유래한 6 종과 모계 유전자에서 유래한 6 종, 즉 총 6 쌍을 발현하고 있는 것으로 알려져 있다. 좀 더 자세히 구분해 보면 일반 체세포는 MHC 클래스 I에 속하는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 총 3 쌍을 발현하는 것으로 알려져 있다.
상기 B2M 유전자 또는 B2M 및 단백질이 동일 종의 체세포 또는 그의 모세포에서 측정된 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성 수준보다 낮은 정도의 발현 또는 활성이 나타내거나 발현 또는 활성이 없는 것을 의미한다. 즉 체세포에 있어서 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 본래 조작되지 않은 체세포의 발현 또는 활성보다 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 체세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 단백질이 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감소 (depression)"는 B2M 유전자가 조작되지 않은 체세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 단백질이 발현이 되더라도 그 활성이 낮은 것을 의미할 수 있다. 상기 모세포는 인위적인 조작을 수행하지 않은 세포로서, 인체에서 갓 분리된 세포 및 이를 배양한 세포를 의미한다.
상기 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는 것은 상기 B2M를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 상기 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것에 의한 것일 수 있으며, 이는 B2M 유전자 교정 수단 또는 유전자 편집 복합체에 의할 수 있다.
상기 유전자 편집 복합체는 ZFN(zinc finger nuclease), TALEN(transcription activator-like effector nuclease), AAV, 및 RGEN(RNA-guided engineered nuclease)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 이중, RGEN은 B2M 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 CRISPR 시스템과 이를 포함하는 벡터에 의한 것일 수 있다.
상기 RGEN은 B2M 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 것일 수 있다.
일반적으로, 널리 알려진 유전자 교정 수단인 "CRISPR 시스템"은 집합적으로 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부" 및 tracrRNA-가공 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭), 가이드 RNA 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사물을 포함하는 CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현에 수반되거나, 그의 활성을 유도하는 전사물 및 다른 요소를 지칭한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열" 또는 "표적 유전자"는 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 증진시킨다. 본질적으로 완전한 상보성이 필요하지 않지만, 혼성화를 야기하고, CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 충분한 상보성이 존재한다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질 내에 위치할 수 있다.
상기 Cas 단백질은 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다. 상기 Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 이들 효소가 알려져 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 비변형 CRISPR 효소, 예를 들어, Cas9는 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9이며, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터의 Cas9일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
일부 구현예에서, Cas9 단백질은 진핵 세포 내의 핵 내에 위치하기 위하여 Cas9 단백질의 5'- 또는 3'-, 또는 양 말단 부분에 NLS(nuclear localization sequence or signal)를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 NLS는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “핵 위치화 서열 또는 신호(Nuclear localization sequence or signal, NLS)"는 특정물질(예컨대, 단백질)을 세포 핵 내로 운반하는 역할을 하는 아미노산 서열을 의미하며, 대체적으로 핵공(Nuclear Pore)을 통하여 세포 핵 내로 운반하는 작용을 한다(Kalderon D, et al., Cell 39:499509(1984); Dingwall C, et al., J CellBiol. 107(3):8419(1988)). 상기 핵 위치화 서열은 진핵생물에서 CRISPR 복합체 활성에 필요하지 않지만, 이러한 서열을 포함하여, 시스템의 활성을 증진시켜, 특히 핵 내의 핵산 분자를 표적화하는 것으로 여겨진다.
또한 RNA 유전자 가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas9는 표적 유전자의 넉-아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 타겟팅하는 것으로 알려져 있다.
Cas9 (또는 Cpf1) 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, 상기 Cas9 (또는 Cpf1) 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas (또는 Cpf1)단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 유전자는 약 40 개 이상의 서로 다른 Cas (또는 Cpf1) 단백질 패밀리가 존재하는 것으로 알려져 있으며, cas 유전자 및 반복 구조 (repeat structure)의 특정 조합에 따라 8개의 CRISPR 하위 유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 Mtube)을 정의할 수 있다. 따라서 상기 각 CRISPR 하위 유형이 반복단위를 이루어 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 형성할 수 있다.
일 양상에 따른 B2M 녹-아웃 체세포를 제조하기 위하여 유전체 교정 기술로서 유전체 중 존재 비율이 매우 낮은 희귀 유전자 서열을 절단하는 희귀 절단 엔도뉴클레아제(rare-cutting endonuclease)를 사용하는 기술이 채용될 수 있다.
상기 유전자 녹-아웃은 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드)의 결실, 치환, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입에 의한 유전자의 활성 조절, 예컨대, 불활성화를 의미하는 것일 수 있다. 상기 유전자 불활성화는 유전자의 발현 억제 또는 발현 감소 (downregulation) 또는 본래의 기능을 상실한 단백질을 코딩하도록 변형된 것을 의미한다. 또한 유전자 조절은 타겟 유전자의 하나 이상의 Exon을 둘러싸고 있는 양쪽 인트론 부위를 동시에 타겟팅함으로 인한 엑손 부위의 결실로 인해 얻어지는 단백질의 구조 변형, 도미넌트 네가티브(Dominant negative) 형태의 단백질 발현, 가용성으로 분비되는 경쟁적 저해제 발현 등의 결과에 의한 유전자의 기능 변화를 의미하는 것일 수 있다.
상기 B2M 유전자 또는 B2M 단백질 발현 또는 활성이 감소되도록 인위적으로 수행하는 유전자 조작은 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질에 의하여 유도될 수 있다. 상기 유전자 조작에 사용될 수 있는Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용하여 유도될 수 있다. 상기 Cas9 (또는 Cpf1) 가 DNA로 암호화되어 개체 또는 세포로 전달되는 경우, 상기 DNA는 일반적으로 (그러나 필수적이지는 않음) 타겟 세포에서 작동 가능한 조절 요소 (예컨대, 프로모터)를 포함할 수 있다. 상기 Cas9 (또는 Cpf1) 발현을 위한 프로모터는, 예컨대, CMV, EF-l a, EFS, MSCV, PGK, 또는 CAG 프로모터일 수 있다. gRNA 발현을 위한 프로모터는, 예컨대, HI, EF-la, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다. Cas9 (또는 Cpf1) 암호화 서열은 nuclear localization signal (NLS) (e.g., SV40 NLS)를 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 프로모터는 조직 특이성 또는 세포 특이성을 갖는 것일 수 있다.
상기 B2M 유전자 또는 B2M 단백질 발현 또는 활성이 감소되도록 인위적으로 수행하는 유전자 조작은 B2M 유전자를 구성하는 핵산서열 내 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열 중 또는 이의 5' 말단 또는 3'말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp의 염기서열 부위 내의 유전자의 전부 또는 연속하는 염기서열 부위의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오티드로의 치환, 각각 독립적으로 A, T, C 및 G 중에서 선택된 1 내지 23개의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 상기 변형의 조합에 의한 것일 수 있다.
상기 희귀 절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크핑거(Zinc finger) 뉴클레아제,　CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질), CRISPR-Cpf1 (Cpf1 단백질) 및 TALE-뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 희귀 절단 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질일 수 있다.
용어 "키메라 RNA", "키메라 가이드 RNA", "가이드 RNA", "단일의 가이드 RNA" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호교환가능하게 사용되며, 가이드 서열, tracr 서열 및/또는 tracr 메이트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 지정하는 가이드 RNA 내의 약 20bp 서열을 지칭하며, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또한, 용어 "tracr 메이트 서열"은 용어 "직접 반복부(들)"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 상기 표적 DNA와 혼성화하는 단일 사슬 RNA (single-chain RNA, sgRNA)일 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 또한 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 유전자 조작에 이용할 수 있는 염기서열이라면 제한 없이 가이드 RNA로 이용할 수 있으며, 예컨대 상기 염기서열은 B2M 유전자와 혼성화할 수 있는 서열일 수 있다. 또한 상기 가이드 RNA의 기능을 변형/증진시키기 위하여 가이드 RNA 염기서열의 일부분을 변형할 수 있다. 또한 일부 구현예에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼(Burrows-Wheeler Transform)에 기초한 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크라프트 테크놀로지즈(Novocraft Technologies), ELAND(일루미나(Illumina), 미국 캘리포니아주 샌디에고), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 예컨대 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예를 들어, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로의 트랜스펙션 후에, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 서베이어 검정에 의한 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해서와 같이, 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 당업자에게 떠오를 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 독특한 것들을 포함한다.
상기 복합체에 있어서, crRNA는 tracrRNA 와 연결되는 것일 수 있다.
또는 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는 것은 외인성 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터에 의할 수 있다.
외인성 핵산 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 간섭 RNA (RNAi) 분자일 수 있다.
상기 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미할 수 있다.
상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
또한 상기 벡터는 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adenoassociatedvirus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말 (episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터인 것일 수 있다.
용어 "체세포"는, 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 쥐 등의 포유 동물 유래의 것 또는 분리된 것일 수 있다. 또한 상기 체세포는 상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 비장세포, 간세포, 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 성상교세포(astrocyte), 혈관모세포, 혈액세포, 신경 줄기세포, 희소돌기아교 전구세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다만, 본 발명에의 구체적인 일 실시예에서는 상기 체세포를 섬유아세포, 비장세포 또는 간세포로 사용하였다.
용어 "줄기세포"는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래 ('전이:transit') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다. 이러한 줄기세포는 다양한 방법으로 분류할 수 있다. 그 중 가장 흔히 이용되는 방법 중 하나는 줄기세포의 분화능에 따른 것으로 3배엽으로의 분화가 가능한 만능줄기세포(pluripotent stem cells), 특정 배엽 이상으로의 분화로 한정되는 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells) 및 특정 배엽으로만 분화가 가능한 단분화능 줄기세포(unipotent stem cells)로 나눌 수 있다. 용어 "만능 줄기세포"라 함은 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화될 수 있는 전능성을 지닌 줄기세포를 지칭하며, 일반적으로 배아줄기세포(ESC)와 유도만능줄기세포(iPSC)가 이에 해당될 수 있다.
일 양상의 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 또는 내배엽의 분화세포로의 분화를 유도하는 물질을 더 포함할 수 있고, 상기 분화 유도 물질에 의하여 외배엽, 중배엽 또는 내배엽의 세포로 분화가 가능할 수 있다. 일 구체예에 있어서 일 양상의 줄기세포를 외배엽, 중배엽, 또는 내배엽을 포함하는 테라토마로 분화시킬 수 있다.
일 양상에 있어서 상기 줄기세포는 예를 들어, 유도만능줄기세포(iPSC), 배아줄기세포, 체세포 핵치환 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer-PSC) 또는 성체줄기세포일 수 있다. 일 구체예에서는 체세포로부터 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성을 감소시킨 체세포 핵치환 배아줄기세포를 효과적으로 제조하여 면역거부회피 세포로 저면역을 유도하는 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 줄기세포를 제조하였다.
상기 본 명세서에서 사용하는 용어 "면역거부회피 세포"는 성인 줄기세포 또는 면역세포의 치료적 단점을 보완하여 면역거부의 반응이 일어나지 않는 세포를 의미한다. 이중 면역거부회피 줄기세포는 여러 전분화 관련 능력이 안정화되면서도 면역거부반응으로부터의 회피성은 그대로 유지하는 세포를 의미한다. 상기 면역거부회피 세포는 B2M 유전자가 낙아웃, "발현 또는 활성이 감소" 또는 B2M "불활성화", B2M 단백질의 "발현 또는 활성이 감소" 또는 B2M 의 "불활성화"된 유전적으로 조작된 세포를 의미할 수 있다.
일 양상은 상기 줄기세포로부터 분화시킨 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 면역세포를 제공한다.
상기 면역세포는 상기 제조된 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 면역거부회피 줄기세포를 면역세포로 유도하는 물질에 의할 수 있고, 상기 면역세포로 유도하는 물질은 당업계에서 줄기세포를 면역세포로 유도하는 물질로 사용되는 물질이면 제한 없이 사용가능하다.
상기 면역세포는 혈관모세포의 기반을 통해 분화 유도된 림프구계 세포일 수 있으며, 예를 들면 CD8+ T 세포, 헬퍼 CD4+ T 세포, 헬퍼 CD4+ T 세포, 조절 T 세포, CD3 세포, 상피내 림프구 (IEL), 감마델타(gamma delta) T세포 또는 NK세포인 것일 수 있다. 일 구체예에서는 체세포로부터 체세포 핵 치환(Somatic-cell nuclear transfer: SCNT)을 통해 만능줄기세포(SCNT-PSC)로부터 분화가 유도된 감마델타 T세포 또는 NK세포를 제조할 수 있다.
상기 SCNT-PSC로부터 분화가 유도된 유전적으로 조작된 면역세포는 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소되어 면역거부회피 면역세포로서의 특성이 나타날 수 있다.
일 양상은 상기 제조된 줄기세포 또는 면역세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.
용어 “세포치료제”는 조직의 기능을 복원하기 위하여 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 이용한 치료제로, 암의 억제를 위해 사용되는 치료제를 의미한다. 상기 제조된 줄기세포 또는 면역세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제일 수 있다.
상기 세포치료제에 포함되는 면역거부회피 줄기세포는 B2M을 발현하지 않는 체세포의 핵을 탈핵난자에 주입하여 제조한 핵치환기술 유래 배아줄기세포주를 포함하고, 이외에도 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예컨대 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 세포치료제는 상기 면역거부회피 줄기세포 외에 외배엽, 중배엽, 또는 내배엽의 분화세포로의 분화 유도용 물질을 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 분화 유도용 물질에 의하여 분화된 모든 리니지의 세포를 포함할 수 있다.
또한 상기 세포치료제는 그 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황(含硫)환원제, 산화방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다. 상기 현탁제의 예로는, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트말, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 들 수 있다.
용액보조제로는, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리소르베이트 80, 니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 메크로골, 피마자유지방산에틸에스테르 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타황산나트륨 등을 들 수 있다.
등장화제로는, 예를 들어 D-만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있다.
보존제로는, 예를 들어 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있다.
흡착방지제로는, 예를 들어 인간혈청알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌옥사이드프로필렌옥사이드 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다.
함황환원제로는, 예를 들어 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥토산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 탄소원자수 1~7 의티오알칸산 등의 술푸히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
산화방지제로는, 예를 들어 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
또한 상기 세포치료제는 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000 세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 주사제품은 환자의 체질 및 결함의 종류에 따라 당업계에 통상적으로 알려진 분량을 취하여 충전된 주사의 형태로 제조될 수 있다.
상기 세포치료제는 암의 예방 또는 치료용으로 활용이 가능하며, NK공격을 회피하게 만드는 CD47, 인체백혈구항원-E(human leukocyte antigen-E), 및 인체백혈구항원-G(human leukocyte antigen-G)를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터를 더 포함할 수 있다.
용어 "예방"은 암의 병인을 제거하거나 조기 발견하여 해당 질환을 막는 모든 행위를 의미한다.
용어 "치료"는 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
용어 '암'이란 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말한다. 상기 암은 예컨대, 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma)(예를 들어, 섬유세포암), 백혈병, 림프종, 조혈세포에서 유래하는 혈액암 (예를 들어, 다발성골수종), 신경조직에 발생하는 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 일 양상은 상기 제조된 줄기세포 또는 면역세포를 포함하는 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본원에서 용어, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 암 질환 또는 암세포를 가진 개체, 더욱 구체적으로는 인간(암 환자) 또는 비-인간인 영장류, 설치류 (랫트, 생쥐, 기니피그 등), 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 포유류를 의미할 수 있다.
상기 제조된 줄기세포 또는 면역세포를 포함하는 세포치료제는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있고, 예를 들어 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 B2M 유전자에 특이적으로 결합하는 유전자 편집 복합체, 외인성 핵산 분자, 상기 핵산분자가 도입된 벡터를 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계를 포함하는, 체세포를 면역거부회피 줄기세포로 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 체세포의 핵을 공여세포로하여 탈핵 난자에 주입시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 면역거부회피 면역세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 면역세포를 제조하는 방법은 B2M 유전자에 특이적으로 결합하는 유전자 편집하며, 이후에 체세포의 핵을 공여세포로하여 탈핵 난자에 주입시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 방법은 제조된 면역거부회피 줄기세포를 면역세포로 유도하는 물질을 면역세포 분화 물질을 세포에 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 면역세포 분화 물질은 당업계에서 줄기세포를 면역세포로 분화시키는 물질을 모두 포함하는 의미로 활용될 수 있다.
상기 면역세포를 제조하는 방법은 B2M (β2-마이크로글로불린)유전자에 특이적으로 결합하는 유전자 편집 복합체, 외인성 핵산분자, 상기 외인성 핵산분자가 도입된 벡터를 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계; 상기 체세포의 핵을 공여세포로하여 탈핵 난자에 주입시켜 체세포 복제 만능 줄기세포(SCNT-PSCs)를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 면역세포로 분화를 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서 제조되는 면역 세포는 상기 면역세포는 CD8+ T 세포, 헬퍼 CD4+ T 세포, 헬퍼 CD4+ T 세포, 조절 T 세포, 상피내 림프구 (IEL), CD3 세포, 감마델타(gamma delta) T세포 또는 NK세포인 것일 수 있다. 일 양상의 방법을 활용하면 체세포로부터 체세포 핵 치환(Somatic-cell nuclear transfer: SCNT)을 통해 만능줄기세포(SCNT-PSC)로부터 분화가 유도된 감마델타 T세포 또는 NK세포를 높은 효율로 제조가 가능하다.
일 양상은 B2M 유전자가 낙아웃된 체세포로를 제조하고 이로부터 체세포 핵 치환을 통해 제조한 만능 줄기세포(PCNT-PSCs) 및 이로부터 분화를 유도한 면역세포에 관한 것으로, 일 양상의 만능 줄기세포와 면역세포는 B2M 유전자가 낙아웃되어도 정상적인 면역세포인 NK 세포와 감마델타 T세포로 분화가 가능하다. 아울러 상기 제조된 세포는 B2M 유전자를 표적으로 하여 HLA class I 분자의 넉아웃을 유도하였으므로 동종 T 세포의 반응을 유도하지 않는 'off-the-shelf' 개념의 면역거부회피를 통해 생체 내에서 오랜기간 생존 가능하고 주입횟수를 최소화할 수 있으므로 저-면역세포 또는 면역거부회피 줄기세포와 면역세포로 활용되어 세포치료제로서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 마우스의 섬유아세포의 B2M 유전자를 낙아웃시키고, 7일동안 계대배양을 수행하고, 이의 세포의 형태를 확인한 도이다.
도 2는 마우스의 섬유아세포의 B2M 유전자를 낙아웃키기고, 실제적으로 낙아웃이 일어났는지를 PCR 전자영동으로 확인한 결과를 나타낸 도이며, 도 2A 는 160/184 프라이머를 통해 확인한 결과에 관한 것이고, 도 2B는 185/184 프라이머를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 B2M 유전자가 낙아웃된 섬유아세포를 체세포 핵 치환체세포 핵 치환(Somatic-cell nuclear transfer: SCNT)을 통해 만능줄기세포로 제조하고, 이의 형태를 확인한 도이다.
도 4는 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포주를 면역형광염색법을 통해 OCT4, SSEA, 및 NANOG 마커를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포주가 실제적으로 낙아웃이 일어났는지를 PCR 전지영동으로 확인한 결과이며, 160/184 프라이머 및 185/184 프라이머를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포주를 고환캡슐이 주입하여 테라토마 형성을 유도한 결과를 확인한 도이다.
도 7은 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포주의 테라토마 조직의 면역조직화학염색을 확인한 도로서, 도 7A는 테라토마 조직 내에서 대조군으로 PBS 주입한 군의 H-E 염색결과를 나타낸 도이며, 도 7B는 신경 로제트 구조(Neural rosette structure)로의 분화양상을 확인한 도이며, 도 7C는 *표시된 부분에서 장 상피 구조(Gut Epithelium structure)로의 분화양상을 확인한 도이며, 도 7D는 연골 구조(Cartilage structure)로의 분화양상을 확인한 도이며, 도 7E는 근 섬유 구조(Muscle fibers structure)로의 분화양상을 확인한 도이다.
도 8은 B2M 유전자를 낙아웃시킨 간 및 비장세포의 B2M의 발현을 mRNA, gDNA 수준에서 160/184 및 185/184 프라이머로 확인한 결과를 확인한 도이다.
도 9a는 B2M유전자가 낙아웃 되지 않은 정상 생쥐의 비장 세포를 이용하여 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도 (CD-NK1.1+)와 살해능을 나타내는 마커들을 (NKP46, Ly49, KLRG1) 확인한 도이다 (정상생쥐의 대조군임).
도 9b는 B2M 유전자를 낙아웃시킨 생쥐의 비장 세포에서 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도 (CD3-NK1.1+)와 살해능을 나타내는 마커들을 (NKP46, Ly49, KLRG1) 비교한 도이다.
도 9c는 야생형 생쥐와 B2M 유전자가 낙아웃 된 생쥐 비장 세포를 이용하여 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도를 확인한 도이다.
도 10a는 야생형 생쥐의 간 세포를 이용하여 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도와 살해능을 나타내는 마커들을 (NKP46, Ly49, KLRG1) 확인한 도이다.
도 10b는 B2M 유전자를 낙아웃시킨 생쥐의 간세포에서 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도와 살해능을 나타내는 마커들을 (NKP46, Ly49, KLRG1) 비교한 도이다.
도 10c는 야생형 생쥐와 B2M 유전자가 낙아웃 된 생쥐의 간 세포를 이용하여 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도를 확인한 도이다.
도 11a는 야생형의 배아줄기세포를 혈액세포의 일종인 NK세포로 분화를 유도하고, 1 2, 3, 5, 6, 9, 10,11, 12 및 13일에서의 형태를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 야생형의 배아줄기세포를 혈액세포의 일종인 NK세포로 분화를 유도한 13일에서의 분화정도를 확인한 도이다.
도 11c는 B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포를 혈액세포의 일종인 NK세포로 분화를 유도하고, 1 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13일 및 그 이후에서의 형태를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11d는 B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포를 혈액세포의 일종인 NK세포로 분화를 유도한 13일에서의 분화정도를 확인한 도이다.
도 12a는 제조된 줄기세포로부터 감마델타 T세포로의 분화를 유도하고, 이의 형태를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12b는 분화 유도된 감마델타 T세포의 11일차에 효과적으로 감마델타 세포로 분화가 유도되었는지 단일마커 및 이중발현, 삼중발현 및 사중발현마커로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12c는 감마델타 T세포 마커의 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12d는 상기 분화 결과를 FACS로 확인한 정량결과를 나타낸 도이다.
도 13a는 B2M 낙아웃이 없는 야생형과 B2M 낙아웃을 유도한 섬유아세포(skin)와 이로부터 체세포 복제 만능 줄기세포(ES)에 있어서 B2M 낙아웃 검증한 결과에 관한 도이다.
도 13b는 B2M 낙아웃이 없는 야생형과 B2M 낙아웃을 유도한 섬유아세포(skin)와 이로부터 체세포 복제 만능 줄기세포(B2M-/-SCNT-PSCs)와 이를 NK세포로 분화시킨 세포(B2M-/-Blood cells)의 B2M 낙아웃 검증한 결과를 나타낸 도이다.
도 13c는 B2M 낙아웃이 없는 야생형(wild blood cells)과 B2M 낙아웃을 유도한 섬유아세포로부터 체세포 복제 만능 줄기세포를 제조하고 이를 감마델타 T세포로 분화시킨 세포(B2M-/-Blood cells)에 있어서 B2M 낙아웃 검증한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. B2M 유전자의 낙아웃(Knock-out) 한 섬유아세포로부터 체세포 핵 치환을 통해 제조한 만능 줄기세포의 확인
1.1 B2M 유전자를 낙아웃 시킨 섬유아세포의 제조
마우스의 피부 섬유아세포(skin fibroblast)로부터 B2M 유전자를 낙아웃 시키는 실험을 수행하였다.
구체적으로, B2mtm1Unc표적 돌연변이에 대해 동형접합인 B2M이 결손된 마우스를 구매하였다. 상기 구매한 B2mtm1Unc돌연변이 종은 B2M 유전자를 표적 파괴에 의해 제조된 것으로, 129유래 E14TG2aES세포주를 사용하여 B6 마우스와 B2mtm1Unc표적 돌연변이 마우스 종을 11번 근친 교배하여 제조된 것이다. 상기 마우스의 꼬리와 피부에서 조직를 채취하였다. 채취한 조직을 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), 10% 소태아혈청(FBS)와 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(penicillin streptomycin: P/S)을 포함한 배양액에 세포가 충분히 나올 때까지 배양하였다. 배양된 세포에 붙은 조직을 제거하고, B2M 유전자를 낙아웃시킨 섬유아세포를 7일이상 계대배양을 수행하였으며, 7일간 배양을 수행한 세포를 확인하여 도 1에 나타내었다.
이후 상기 계대배양을 수행한 섬유아세포로부터 실제적으로 B2M유전자 결손이 나타났는지를 확인하기 위하여, B2M 유전자를 낙아웃시키지 않은 야생형 생쥐의 섬유아세포 및 상기 제조된 B2M KO 섬유아세포로부터 유전자 DNA (genomic DNA)를 추출하였다. 이로부터 B2M 유전자가 실제적으로 낙아웃되었는지 각각 두종류의 160/184 및 185/184 프라이머를 이용하고 전기영동을 통하여 확인하였으며, 대조유전자로 GAPDH를 사용하였다. 160/184 프라이머를 통해 확인한 결과를 도 2A에, 및 185/184 프라이머를 통해 확인한 결과를 도 2B에 나타내었다. 사용한 프라이머는 하기와 같다.
160 뮤턴트 정방향 : TCT GGA CGA AGA GCA TCA GGG (서열번호 1),
184 공통 서열: TAT CAG TCT CAG TGG GGG TG (서열번호 2),
185 야생형 정방향 : CTG AGC TCT GTT TTC GTC TG (서열번호 3)
상기 도 2A에서 확인한 바와 같이, B2M 유전자가 낙아웃된 모든 섬유아세포에서 야생형과 달리 420bp에서 밴드가 나타나는 것으로 B2M이 결손 되는 것을 확인하였다. 또한 도 2B에서도 야생형과 달리 1kb 근처에서 밴드가 나타나는 것을 확인하여, 제조된 섬유아세포에서 실제적으로 B2M 유전자가 낙아웃 된 것을 확인하였다.
1.2 B2M 유전자를 낙아웃 시킨 섬유아세포로부터 체세포 핵 치환을 통해 만능 줄기세포의 제조및 제조된 줄기세포의 능력 확인
8-10주 된 암컷 B6 마우스에, 5IU PMSG와 5IU hCG호르몬을 투여하였다. hCG투여 14시간 후, 과잉 배란된 마우스에서 히알루로니다제 (hyaluronidase)를 사용하여 난구세포를 분리하고 난자를 분리하였다. 분리된 난자는 37℃ 인큐베이터 KSOM배양액에 실험 시작 전까지 보관하였다. 이후, 체세포 복제 실험을 위해 성숙된 난자에서 핵을 제거하고, 상기 실시예 1.1에서 제조한 B2M 유전자가 낙아웃된 섬유아세포를 체세포 핵 치환(Somatic-cell nuclear transfer: SCNT)을 통해 체세포복제 배반포를 만들고 배반포의 내세포괴를 분리하여 만능줄기세포를 제조하였다. 제조한 B2M 낙아웃 체세포 복제 만능 줄기세포 (KO SCNT-PSCs)는 DMEM, 20% FBS, 1% P/S, 1% 비필수 아미노산 (nonessential amino acids: NEAA), 0.1% 베타 메르캅토에탄올(beta mercaptoethanol)를 포함하는 줄기세포 배양액에 배양하여, 3계대까지 넘겨 배양한, 제조된 세포의 형태를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 방법에 따라 제조된 만능 줄기세포가 실제적인 줄기세포로서의 분화능을 가진 줄기세포능을 가졌는지를 확인하기 위하여 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포주를0.1% BSA가 첨가된 PBS에서 세척하고 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 실온에서 30분간 처리하여 고정하였고, Triton X가 0.1% 첨가된 PBS에 처리하여 냉장보관 24시간 후 면역형광염색법을 통해 OCT4, SSEA, 및 NANOG 마커를 확인하였다. 이를 공초점 형광 현미경으로 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인한 바와 같이, 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포주는 OCT4, SSEA, 및 NANOG가 모두 선명하게 나타나 모든 세포로 분화할 수 있는 줄기세포능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 상기 제조된 줄기세포 역시 B2M 유전자가 실제적으로 낙아웃되었는지 각각 두종류의 160/184 및 185/184 프라이머를 이용하여 전기영동을 통하여 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인한 바와 같이, 체세포 복제 만능 줄기세포주(SCNT-PSCs)는 160/184 프라이머를 통한 경우 420bp에서 밴드가 나타나고, 185/184 프라이머를 통해 확인한 결과 1kb 근처에서 밴드가 나타나는 것을 확인하여, 제조된 SCNT-PSCs는 실제적으로 B2M 유전자가 낙아웃되어 면역거부회피 줄기세포로 활용될 수 있음을 구체적으로 확인하였다.
실시예 2. B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포(SCNT-PSCs)의 줄기세포능의 확인
실시예 1에서 사용한 방법을 활용해 B2M 유전자가 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포가 줄기세포능을 나타낼 수 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 상시 실시예 1에서 수립된 B2M 결손 체세포복제 배아줄기세포를 F-12, 20% FBS, 1% P/S, 1% 비필수 아미노산 (nonessential amino acids: NEAA), 0.1% 베타 메르캅토에탄올(beta mercaptoethanol)을 포함하는 줄기세포 배양액에 배양하여, 면역이 결핍된 마우스 (severe combined immunodeficient mice)의 고환캡슐 (testis capsule)에 한쪽 고환은 control 그룹으로 PBS만 주입하였고 다른 한쪽 고환은 B2M 결손 체세포복제 배아줄기세포 1X106개의 세포를 PBS에 섞어준 뒤 주입하여 테라토마(teratoma) 형성을 유도하였다. 이식한 마우스는 5주동안 SPF (Specific Pathogen Free) 시설에서 관리하였고, 이식 후 5주 뒤에 대조군 및 이식된 부위에서의 형성된 테라토마를 확인하고, 이를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인한 바와 같이, 이식 5주 후에는 이식된 모든 부위에서 테라토마가 형성되었음을 확인하였다. 아울러, 이식된 부위에서 형성된 테라토마를 면역조직화학염색 (H-E 및 special staining)을 통하여 테라토마 조직의 분화양상을 분석하고, 이를 도 7A 내지 도 7E에 나타내었다.
도 7A는 대조군인 PBS 처리한 군을 H-E 염색을 통하여 확인한 도이며, 도 7B 내지 도 7E에서 확인한 것과 같이, 테라토마 표지인자인 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm)으로 분화가 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 도 7B에서 확인한 바와 같이, 신경 로제트 구조(neural rosette structure)로의 분화양상을 확인하여 외배엽으로의 분화를 확인하였다. 도 7C에서는 *표시된 부분에서 장 상피 구조(Gut Epithelium structure)로의 분화양상을 확인하여 내배엽으로의 분화를 확인하였고, 도 7D에서 확인한 바와 같이, 알시안 블루(Alcian blue)로 염색된 도의 가운데 원형의 연골 구조(Cartilage structure)로의 분화양상을 확인하여 중배엽으로의 분화를 확인할 수 있었다. 도 7E에서는 Masson's trichrome 염색을 통하여 가운데 진하게 염색된 근 섬유 구조(Muscle fibers structure)로의 분화양상을 확인하여 내배엽으로의 분화를 확인하였다. 이에, B2M 유전자가 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포는 삼배엽으로 효과적인 분화가 가능한 것을 확인하였다. 따라서, B2M 유전자가 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포는 이후 어느 조직으로든 분화가 가능한 미분화 만능배아줄기세포주 고유의 능력을 가졌음을 확인하였다.
실시예 3. 간 및 비장 세포로부터 B2M 유전자의 낙아웃(Knock-out)의 확인
3.1 간 및 비장세포에서 B2M 유전자의 낙아웃(Knock-out) 확인
실시예 1에서 사용한 방법 및 시약으로 간 및 비장 세포에 활용한 경우 B2M 유전자가 효과적으로 낙아웃될 수 있는지를 확인하는 실험을 수행하였다. 즉, B2M을 낙아웃 시킨 후 만든 줄기세포주를 이용하여 정확하게 B2M이 낙아웃 되었는지 PCR로 검증하는 실험을 수행하였다.
B2M 유전자를 낙아웃시킨 간 및 비장세포를 7일이상 계대배양을 수행하였으며, 상기 계대배양을 수행한 간 및 비장세포로부터 실제적으로 B2M유전자 결손이 나타났는지를 확인하기 위하여, B2M 유전자를 낙아웃시키지 않은 야생형 생쥐의 간 및 비장세포 및 상기 제조된 B2M KO 간 및 비장세포로부터 유전자 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 이로부터 B2M 유전자가 실제적으로 낙아웃되었는지 각각 두종류의 160/184 및 185/184 프라이머를 이용하고 전기영동을 통하여 확인하였으며, 대조유전자로 GAPDH를 사용하였고, B2M의 발현을 mRNA, gDNA 수준에서 160/184 및 185/184 프라이머로 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인한 바와 같이, 간 및 비장세포에서 mRNA로 발현을 확인한 경우, B2M이 발현되지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 gDNA에 있어서도, 160/184 프라이머로 확인한 경우 420bp에서 밴드가 나타나고, 185/184 프라이머로 확인한 경우 1kb 근처에서 밴드가 나타나는 것을 확인하여, B2M이 gDNA 수준에서도 발현되지 않음을 확인하여, 실제적으로 제조된 세포 모두 B2M 유전자가 효과적으로 결손된 것을 확인하였다. 따라서 B2M의 발현이 억제되지 않은 정상군에서는 PCR 에서 B2M 산물의 밴드화가 나타났으며, 그렇지 않은 B2M 낙아웃 생쥐의 피부, 간, 비장 조직들에서는 B2M 산물에 대한 밴드가 나타나지 않아 B2M 유전자 결손을 구체적으로 확인하였다.
3.2 간 및 비장에서 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도의 확인
B2M 낙아웃 생쥐의 간 및 비장에서 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도가 얼마나 나타날 수 있는지를 확인하기 위하여 유전자가 조작되지 않은 야생형의 생쥐와 비교를 위한 유세포 분석(Fluorescence-activated cell sorting :FACS)을 수행하였다. 유세포 분석을 위해 정상 생쥐와 B2M 낙아웃 생쥐의 조직 중 간과 비장을 적출하고 멸균된 배양접시에서 eppendorf 뚜껑을 이용해 으깬 후 0.4uM 필터로 걸러 single cell들을 추출하였다. 이들 세포로 DPBS로 두번 세척 한 후 (1200rpm, 5분) 유세포 분석을 위해 5X105 이하의 세포로 elution 하여 CD3 항체와 nk1.1 항체 (NKP46, Ly49, KLRG1)를 각각 붙이고 (1:100) 20분간 4℃ 냉장고에 인큐베이팅한다. 그 후 DPBS로 세포를 한차례 세척하고 유세포 분석기에서 분석하였다. 감마델타 T 세포의 경우도 각각의 항체를 1:100 농도로 세포에 적용하여 냉장고에서 20분간 인큐베이팅한 후 DPBS로 세포를 한차례 세척하고 유세포 분석기에서 분석하였다. 비장에서 수행한 야생형 마우스의 유세포 분석을 수행한 결과를 도 9a에, B2M 낙아웃 마우스의 유세포 분석을 수행한 결과를 도 9b에, 야생형 및 B2M 낙아웃 마우스의 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도를 확인한 결과를 도 9c에 나타내었다. 간에서 수행한 야생형 마우스의 유세포 분석을 수행한 결과를 도 10a에, B2M 낙아웃 마우스의 유세포 분석을 수행한 결과를 도 10b에, 야생형 및 B2M 낙아웃 마우스의 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도를 확인한 결과를 도 10c에 나타내었다.
도 9a 내지 도 9c에서 확인한 바와 같이, 비장에서는 야생형 마우스의 경우 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도가 3.3±0.1%로, B2M 낙아웃 마우스의 경우 3.6±0.1%정도의 빈도차이를 나타내, 유의한 정도의 차이가 나타나는 것을 확인하였다(*P-value<0.03). 또한 NK 세포내에서의 활성도는 NKP46의 경우 야생형 마우스 39.6%, B2M 낙아웃 마우스 48.9%로 나타났으며, Ly49의 경우 야생형 마우스, 24.1%, B2M 낙아웃 마우스 30.9%로 나타났고, KLRG1의 경우 야생형 마우스는 14.4%, B2M 낙아웃 마우스는 10.1% 정도의 빈도차이가 나타나는 것을 확인하였다.
또한 도 10a 내지 10c에서 확인한 바와 같이, 간에서 야생형 마우스의 경우 CD3-NK1.1+ 세포인 자연살해세포의 빈도가 5.8±1.3%로, B2M 낙아웃 마우스의 경우 2.4±0.1% 의 빈도차이가 나타나는 것을 확인하였다. NK 세포 내에서의 활성도는 NKP46의 경우 야생형 마우스가 9.4%, B2M 낙아웃 마우스가 14.3%로 나타났고, Ly49의 경우 야생형 마우스가 11.5%, B2M 낙아웃 마우스가 5.2%로 나타났으며, KLRG1의 경우 야생형 마우스가 12.1%, B2M 낙아웃 마우스가 9.1% 정도의 빈도가 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 4. B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포(SCNT-PSCs)의 면역세포로의 분화 확인
상기 실시예 1에서 제조한 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 림프구계 세포의 일종인 면역세포로의 효과적인 분화를 유도되는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이와 같은 실험을 통하여 림프구계 세포내에 B2M 유전자가 결손된 상태를 유지하며 면역세포로의 분화가 이뤄지는지를 확인할 수 있는지와 분화된 세포의 분화정도와 상기 제조된 만능 줄기세포의 분화 속도가 배아줄기세포와 비교할때 지연(Retardation)과 같은 차이점이 존재하는지 여부를 확인해 볼 수 있었다.
구체적으로 B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포와 야생형의 배아줄기세포를 혈액세포의 일종인 NK세포 포함 림프구계 세포로의 분화를 유도하였다. 분화를 위한 분화 메디아의 조성은 다음과 같이 하였다.
마우스의 배아줄기세포 유지 메디아는 고함량의 글루코오스(high glucose)가 함유된 DMEM에 NEAA (nonessential amino acid) 5ml, 20% SR, 메르캅토에탄올 (500μl/500ml), 페니실린5ml, LIF (1μl/ml, 1x)에 배양한 후 매트리젤을 이용해 단일세포로 분리하였다. 6 웰 배양접시 200000개의 세포를, 12 웰 배양접시 50000 개의 세포를 올려 2일간 배양접시에 부착하고 증식시켰다. 분화가 시작되는 시점에서 세포는 Apel2 메디아를 기본으로 혈액 리니지 세포를 분화시키기 위한 메디아 조성을 각 단계에 맞게 사용하였다. 혈액 리니지 세포의 일종으로 분화시키기 위해 사용한 메디아의 조성은 다음과 같이 하고, 처리 단계를 아래와 같이 하였다.
1. 중배엽 분화 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml bFGF, 3nM CHIR, 100ng/ml 아스코르브산 (ascorbic acid), 20ng/ml VEGFA, 50ng/ml SCF 및 25ng/ml BMP4 를 포함한다. 중배엽으로 분화시키기 위하여 상기 분화 메디아로 처리하여 2일간 분화시켰다.
2. 혈관모 전구세포를 위한 분화 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml bFGF, 100ng/ml의 VEGFA, 250ng/ml의 SCF, 200ng/ml의 FLT3L, 20ng/ml의 GCSF, 100ng/ml의 TPO, 20 ng/ml의 EPO, 50ng/ml의 IL-6 및, 50ng/ml의 IGF-1 를 포함하며, 상기의 조성을 가진 메디아를 세포에 처리하여 2일간 분화시켰다.
3. 혈관모세포의 안정화를 위한 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml의 bFGF, 100ng/ml의 VEGFA, 250ng/ml의 SCF, 200ng/ml의 FLT3L, 20ng/ml의 GCSF, 100ng/ml 의 TPO, 50ng/ml의 IL-6, 50ng/ml의 IGF-1, 20ng/ml의 IL-7, 20ng/ml의 IL-15, 50ng/ml의 IL-5 및 25ng/ml의 DLL1 를 포함하며, 상기 메디아를 세포에 처리하여 6일동안 세포가 안정화되도록 분화시켰다.
4. 림프구계 세포로 진입을 유도하면서 안정화를 유도하기 위한 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml의 bFGF, 20ng/ml의 VEGFA, 250ng/ml의 SCF, 200ng/ml의 FLT3L, 20ng/ml의 GCSF, 50ng/ml의 EGF, 50ng/ml의 IL-7, 100ng/ml의 IL-15, 50ng/ml의 IL-5, 40ng/ml의 IL-2, 25ng/ml의 DLL1 및 10nM의 EZH저해제를 세포에 처리하여 3-5일동안 배양하여 분화시켰다.
마지막 4번 단계 이후에는 림프모구를 시작으로 NK세포로 분화를 포함한 T 세포, 감마델타 T cell 등의 림프구계 세포로의 분화를 확인하였다. 이에, 상기 분화를 유도하는 1 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12 및 13일에서의 세포의 형태를 확인한 야생형의 배아줄기세포를 확인한 결과를 도 11a에, B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포를 확인한 결과를 도 11c에, 분화 유도 이후 13일에서의 분화정도를 야생형의 배아줄기세포에 있어서 확인한 결과를 도 11b에, B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포를 확인한 결과를 도 11d에 나타내었다. 또한, 이 세포주는 GFP형광이 나오도록 유전자 편집을 유도한 세포이기 때문에 모든 세포에서 GFP가 발현한다.
도 11a 내지 11d에서 확인한 바와 같이, 배아줄기세포와 B2M 이 결손된 체세포 복제 만능 줄기세포 간 혈액 리니지의 NK세포를 분화하였을 때 분화의 지연 정도나 빈도에 대한 유의적 차이는 형태학적으로 나타나지 않음을 확인하였다.
또한 줄기세포로부터 4단계의 분화 메디아를 적용하여 13일차까지 분화를 유도한 경우 야생형 ES 세포주 (C57/BL6 STRAIN)에서는 6.6%로, B2M KO 의 경우 6.4% 정도의 자연살해세포로의 분화수준을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 마우스의 비장에서 NK세포로의 분화 효율보다 약 2배정도 높은 결과인 것을 확인하여 섬유아세포로부터 만능 줄기세포를 제조하고, 이를 체세포 복제를 통해 줄기세포로 제조하더라도 야생형 줄기세포와 동일한 유도능을 가지고 있어 효율적인 분화가 가능하고, 이는 종전의 비장세포에서의 분화보다 효율이 우수한 것임을 확인할 수 있었다.
또한, 최종 분화유도된 배아줄기세포에서는 B2M을 7.2%로 발현하는 것과 비교하여, 제조한 SCNT-PSCs는 현저하게 낮은 비율인 B2M을 0.4%로 발현하는 것을 확인하여, 실제적으로 최종 분화될 때까지 B2M의 발현없이 제조할 수 있어 면역거부회피가 가능한 저면역의 NK세포로까지 효과적인 제조가 가능함을 확인하였다.
실시예 5. B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포(SCNT-PSCs)의 감마 델타 T세포로의 분화 확인
상기 실시예 1에서 제조한 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 감마델타 T세포로 B2M 유전자가 결손된 상태를 유지하며 효과적인 분화가 유도되는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 분화를 위하여 사용한 분화 메디아의 조성은 아리와 같다.
구체적으로 B2M 낙아웃된 체세포 복제 만능 줄기세포를 림프구계 세포의 일종인 감마델타 T세포로의 분화를 유도하였다. 분화를 위한 분화 메디아의 조성은 다음과 같이 하였다.
마우스의 배아줄기세포 유지 메디아는 고함량의 글루코오스(high glucose)가 함유된 DMEM에 NEAA (nonessential amino acid) 5ml, 20% SR, 메르캅토에탄올 (500μl/500ml), 페니실린5ml, LIF (1μl/ml, 1x)에 배양한 후 매트리젤을 이용해 단일세포로 분리하였다. 6 웰 배양접시 200000개의 세포를, 12 웰 배양접시 50000 개의 세포를 올려 2일간 배양접시에 부착하고 증식시켰다. 분화가 시작되는 시점에서 세포는 Apel2 메디아를 기본으로 혈액 리니지 세포를 분화시키기 위한 메디아 조성을 각 단계에 맞게 사용하였다. 혈액 리니지 세포의 일종으로 분화시키기 위해 사용한 메디아의 조성은 다음과 같이 하고, 처리 단계를 아래와 같이 하였다.
1. 중배엽 분화 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml의 bFGF, 3nM CHIR, 100ng/ml 의 아스코르브산 (ascorbic acid), 20ng/ml의 VEGFA, 50ng/ml의 SCF 및 25ng/ml의 BMP4 를 포함한다. 중배엽으로 분화시키기 위하여 상기 분화 메디아로 처리하여 2일간 분화시켰다.
2. 혈관모 전구세포를 위한 분화 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml의 bFGF, 100ng/ml의 VEGFA, 250ng/ml의 SCF, 200ng/ml의 FLT3L, 20ng/ml의 GCSF, 100ng/ml의 TPO, 20 ng/ml의 EPO, 50ng/ml의 IL-6 및, 50ng/ml의 IGF-1 를 포함하며, 상기의 조성을 가진 메디아를 세포에 처리하여 2일간 분화시켰다.
3. 혈관모세포의 안정화를 위한 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml의 bFGF, 100ng/ml의 VEGFA, 250ng/ml의 SCF, 200ng/ml의 FLT3L, 20ng/ml의 GCSF, 100ng/ml의 TPO, 50ng/ml의 IL-6, 50ng/ml의 IGF-1, 20ng/ml의 IL-7, 20ng/ml의 IL-15, 50ng/ml의 IL-5 및 25ng/ml의 DLL1 를 포함하며, 상기 메디아를 세포에 처리하여 6일동안 세포가 안정화되도록 분화시켰다.
4. 림프구계 세포로 진입을 유도하면서 안정화를 유도하기 위한 메디아는 Apel-2 메디아, 10ng/ml의 bFGF, 20ng/ml의 VEGFA, 250ng/ml의 SCF, 200ng/ml의 FLT3L, 20ng/ml의 GCSF, 50ng/ml의 EGF, 50ng/ml의 IL-7, 100ng/ml의 IL-15, 50ng/ml의 IL-5, 40ng/ml의 IL-2, 25ng/ml의 DLL1 및 10nM의 EZH저해제를 세포에 처리하여 3-5일동안 배양하여 분화시켰다.
B2M 유전자가 결손된 상태를 유지하며 혈액세포 중 감마 델타 T 세포로의 분화가 이뤄지는지를 확인하기 위하여 분화 이후 FACS 및 면역염색을 수행하였다. 상기 마지막 4번 단계 이후에 림프모구를 시작으로 감마 델타 T 세포로의 분화를 포함한 T 세포, NK세포로의 분화 및 성숙이 나타나는 것을 확인하였다. 특히 감마 델타 T 세포는 분화 후 2-3일안에 가장 빠르게 분화 진입이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 상기 제조된 줄기세포로부터 감마델타 T세포로의 분화를 유도하고, 이의 형태를 확인한 결과를 도 12a에 나타내었다. 또한 감마델타 TCR 항체를 이용하여 B2M KO 섬유아세포를 CD3, NKG2D, 및 NK1.1 과 함께 분화를 유도한 후 이들의 단백질 발현을 확인하여 분화 유도된 감마델타 T세포의 11일차에 효과적으로 감마델타 세포로 분화가 유도되었는지 단일마커 및 이중발현, 삼중발현 및 사중발현마커로 확인한 결과를 도 12b에 나타내었다. 또한 마커의 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과를 도 12c에 나타내었고, 분화 결과를 FACS를 통하여 확인한 결과를 도 12d에 나타내었다.
도 12a에서 확인한 바와 같이, 제조한 체세포 복제 만능 줄기세포를 감마델타 T세포로 분화를 유도한 경우, 분화의 지연 정도나 빈도에 대한 유의적 차이가 없이 약 12일 이후에는 감마델타 T세포로 효과적으로 분화가 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 도 12b 및 도 12d에서 확인한 바와 같이, 분화 후 11일이 지나면 감마델타 T세포와 CD3 T 세포로 분화가 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 단일 마커로 확인한 CD3의 빈도는 4.9±0.6%, NK1.1은 10.1±0.6%로 나타나는 것을 확인하였다. NKG2D의 빈도는 22.1±1.9%, 및 감마델타 TCR은 29.0±3.1%로 나타나는 것을 확인하였다. 또한 이중발현, 삼중발현 및 사중발현을 통해 감마델타 T 세포군으로 동정을 더 확실히 하기 위해 FACS를 수행한 결과, CD3+gd TCR+ 세포의 경우 이의 비율은 3.7±0.6%로, NKG2D+gd TCR+ 세포는 12.6±1.5%로 나타나는 것을 확인하였다. 또한 NKG2D+NK1.1+세포는 7.6±0.8% 로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 삼중발현의 경우, CD3 세포내에서의 NKG2D+gd TCR+ 세포의 발현은 11.1±1.3%, NK1.1 세포내에서는 NKG2D+gd TCR+ 세포의 빈도가 12.7±1.6%인 것을 확인하였다. 특히 상기 세포들은 각 리니지의 성숙한 세포로의 분화가 완료되지 않아 어떤 조합으로 삼중발현을 조사한 경우라도 각 군간 빈도 차이가 많이 나타나지 않아 분화중인 림프구계 전구세포의 형태인 것을 확인할 수 있었다. 최종 NK1.1+CD3+ 세포내에서 NKG2D+gd TCR+ 세포는 10.6±0.7%이 빈도수가 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 도 12c에서 확인한 바와 같이, 면역염색을 통해서도 제조된 SCNT-PSCs 세포는 감마델타 T세포 마커 발현을 확인하여 감마델타 T세포로의 분화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 림프구계 세포 중 일종인 감마델타 T 세포로의 분화 유도 11일이 된 세포에서는 초기 림프구계 전구세포로 여겨지는 혈액 감마 T 세포의 발현이 30% 로 나타나 현저하게 높은 비율로 감마델타 T세포로 발현이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포(SCNT-PSCs)로부터 분화시킨 면역세포의 B2M 낙아웃 검증
상기 실시예 3 및 4를 통해 제조한 체세포 복제 만능 줄기세포(SCNT-PSCs)로부터 최종적으로 분화시킨 면역세포인 NK세포 및 감마델타 T세포에서도 B2M 낙아웃이 되어 있어 면역거부회피가 가능한 저면역의 면역세포로 제조가 가능한지 여부를 확인하는 실험을 수행하였고, 이를 PCR을 통해 구체적으로 확인하고 이의 결과를 도 13a 내지 13c에 나타내었다. 실험 방법은 상기 실시예에서 제조한 세포를 통하여 상기 실시예에서 확인한 방법을 통하여 수행하였다.
구체적으로 B2M 낙아웃이 없는 야생형과 B2M 낙아웃을 유도한 섬유아세포(skin)와 이로부터 체세포 복제 만능 줄기세포(ES)에 있어서 B2M 낙아웃 검증한 결과를 도 13a에, B2M 낙아웃이 없는 야생형과 B2M 낙아웃을 유도한 섬유아세포(skin)와 이로부터 체세포 복제 만능 줄기세포(B2M-/-SCNT-PSCs)와 이를 NK세포로 분화시킨 세포(B2M-/-Blood cells)에 있어서 B2M 낙아웃 검증한 결과를 도 13b에, B2M 낙아웃이 없는 야생형(wild blood cells)과 B2M 낙아웃을 유도한 섬유아세포로부터 체세포 복제 만능 줄기세포를 제조하고 이를 감마델타 T세포로 분화시킨 세포(B2M-/-Blood cells)에 있어서 B2M 낙아웃 검증한 결과를 도 13c에 나타내었다.
도 13 a, b 및 c에서 확인한 바와 같이, 160/184 프라이머의 경우 410bp에서, 185/184 프라이머의 경우 261bp에서 B2M 결손을 확인할 수 있었다. 따라서, B2M 낙아웃을 유도한 섬유아세포, 이를 체세포 복제 만능 줄기세포로 제조한 경우 및 상기 제조된 B2M-/-SCNT-PSCs로부터 유도된 NK세포와 감마델타 T세포 역시 모두 B2M 낙아웃이 나타나, 실제적으로 최종 분화될 때까지 B2M의 발현이 나타나지 않으므로 면역거부회피가 가능한 저면역의 NK세포로 효과적인 제조가 가능함을 확인하였다.

Claims (13)

  1. B2M (β2-마이크로글로불린)유전자에 특이적으로 결합하는 유전자 편집 복합체, 외인성 핵산분자, 또는 상기 외인성 핵산분자가 도입된 벡터를 포함하는, B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 줄기세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPSC), 배아줄기세포, 체세포 핵치환 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer-PSC) 또는 성체줄기세포인 것인 줄기세포.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 비장세포, 간세포, 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 성상교세포(astrocyte), 혈관모세포, 혈액세포, 신경 줄기세포, 희소돌기아교 전구세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인 줄기세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 편집 복합체는 ZFN(zinc finger nuclease), TALEN(transcription activator-like effector nuclease), 및 RGEN(RNA-guided engeineered nucelase)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 줄기세포.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 RGEN은 B2M 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 것인 줄기세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 외인성 핵산분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 간섭 RNA (RNAi) 분자인 것인 줄기세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adenoassociatedvirus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말 (episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터인 것인 줄기세포.
  8. 청구항 1의 줄기세포로부터 분화시킨 B2M 유전자 또는 B2M 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 면역세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 면역세포는 CD8+ T 세포, 헬퍼 CD4+ T 세포, 헬퍼 CD4+ T 세포, 조절 T 세포, 상피내 림프구 (IEL), 감마델타(gamma delta) T세포 또는 NK세포인 것인 면역세포.
  10. 청구항 1의 줄기세포 또는 청구항 8의 면역세포를 포함하는 세포치료제.
  11. B2M 유전자에 특이적으로 결합하는 유전자 편집 복합체, 외인성 핵산분자, 상기 외인성 핵산분자가 도입된 벡터를 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계를 포함하는, 체세포를 면역거부회피 줄기세포로 제조하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 체세포의 핵을 공여세포로하여 탈핵 난자에 주입시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. B2M (β2-마이크로글로불린)유전자에 특이적으로 결합하는 유전자 편집 복합체, 외인성 핵산분자, 상기 외인성 핵산분자가 도입된 벡터를 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계;
    상기 체세포의 핵을 공여세포로하여 탈핵 난자에 주입시켜 체세포 복제 만능 줄기세포(SCNT-PSCs)를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 면역세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 체세포 복제 만능 줄기세포로부터 면역거부회피 면역세포를 제조하는 방법.

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