KR20210116531A - 영양 장애형 표피 수포증 치료약 - Google Patents

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야스시 기쿠치
도모키 다마코시
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고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
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Abstract

본 개시는 영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물이며, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포를 포함하고, 상기 세포가 간엽계 줄기 세포인 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 또한, 영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물이며, VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 포함하고, 수포내에 투여되는 조성물에 관한 것이다.

Description

영양 장애형 표피 수포증 치료약
본 출원은 일본특허출원 제2019-007201호에 대해서 우선권을 주장하는 것이며, 여기에 참조함으로써, 그 전체가 본 명세서 중에 내장되는 것으로 한다.
본 개시는 영양 장애형 표피 수포증의 치료약에 관한 것이다.
표피 수포증은 피부 조직의 접착을 담당하고 있는 접착 구조 분자가 결손 또는 소실되어 있음으로써, 피부에 힘이 가해지면, 표피가 진피로부터 박리되어 물집(수포)이나 피부 궤양을 발생시키는 질환이다. 이 중, 표피가 찢어져서 수포가 생기는 병형은 단순형 표피 수포증, 표피와 기저막 사이가 박리되어 수포가 생기는 병형은 접합부형 표피 수포증, 기저막과 진피 사이가 박리되는 병형은 영양 장애형 표피 수포증이라 불린다.
영양 장애형 표피 수포증은 표피 수포증 전체의 약 5할로 가장 많은 병형이며, VII형 콜라겐을 코드하는 COL7A1 유전자의 변이를 원인으로 하는 유전성 질환이다. 피부의 구조에 있어서, 표피의 제일 아래에 있는 표피 기저 세포는, 기저막이라 불리는 시트형의 구조체와 결합하고 있다. VII형 콜라겐은, 진피 내에서 앵커링 피브릴이라고 하는 섬유를 형성하여 기저막과 진피를 연결시키고 있다. 이 때문에, VII형 콜라겐 유전자에 이상이 있으면 기저막과 진피의 접착 기능이 손상되어 기저막과 진피 사이에 수포가 생기는 영양 장애형 표피 수포증이 된다. 영양 장애형 표피 수포증 중에서도, 중증 열성 영양 장애형 표피 수포증은, 출생 직후부터 전신 열상형 피부 증상이 계속되어, 30세 전후부터 고율로 피부 유극 세포암(반흔암)이 다발해서 죽음에 이르는, 매우 위독한 유전성 수포성 피부 질환이다.
표피 수포증에 대하여, 현재 유효한 치료법은 없고, 근치적으로 수포 형성을 억제하는 유전자 치료법의 개발이 요구되고 있다. 이러한 유전자 치료로서, 환자의 피부 세포를 채취하고, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 조작한 후, 배양해서 피부 시트를 형성하고, 환자에게 이식하는 치료 기술이 개시되어 있다(특허문헌 1 참조). 또한, VII형 콜라겐의 활성이 실활하고 있는 간엽계 줄기 세포에 대하여 게놈 편집을 실시하고, VII형 콜라겐을 산생 가능하게 된 간엽계 줄기 세포를 케라티노사이트나 섬유아세포로 분화시킴과 함께, 배양해서 피부 시트를 형성하고, 환자의 치료에 사용할 것이 제안되어 있다(특허문헌 2 참조).
국제공개 제2017/120147호 공보 국제공개 제2018/154413호 공보
피부 시트는 고도의 공정 관리나 배양 기술이 필요한 점에서 제조의 난이도가 높고, 고비용이 되는 점에서 보다 제조가 용이한 치료약이 요구되고 있다.
어떤 양태에 있어서, 본 개시는 영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포를 포함하고, 상기 세포가 간엽계 줄기 세포인 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 개시는 영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 포함하고, 수포내에 투여되는 조성물에 관한 것이다.
본 개시에 의해, 영양 장애형 표피 수포증의 치료약이 제공된다.
도 1은 설계한 sgRNA(sgAAVS1-#1 내지 #3)에 의한 게놈 DNA의 절단 및 그 절단 효율을 나타낸다.
도 2는 AAVS1 영역에 COL7A1 유전자를 도입하는 게놈 편집의 설명도이다. HA-R 및 HA-L은 상동 서열 부분, SA는 스플라이스 억셉터 서열, T2A는 T2A 펩티드를 코드하는 T2A 서열, Puro는 퓨로마이신 내성 유전자, CAG는 CAG 프로모터 서열을 나타낸다. 야생형 게놈(상)에서의 F2부터 R2까지의 길이는 1952bp, COL7A1 유전자가 도입된 게놈(하)에서의 F1부터 R1까지의 길이는 1246bp, F2부터 R2까지의 길이는 14249bp이다.
도 3은 간엽계 줄기 세포(MSC)에 있어서의 CRISPR-Cas9 시스템에 의한 유전자 도입 효율과 유전자 도입 후의 세포 생존율을 나타낸다. 파선이 게놈 편집된 세포수, 칼럼이 세포 생존율을 나타낸다.
도 4는 게놈 편집에 의한 COL7A1 유전자의 도입을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 MSC에 있어서의 VII형 콜라겐의 발현을 나타낸다. 「(-)」은 게놈 편집을 행하지 않은 컨트롤, 「COL7A1-Donor(도너)」는 게놈 편집에 의해 COL7A1 유전자를 도입한 유전자 개변 MSC이다. 좌측 사진은 세포의 면역 염색, 우측 그래프는 세포의 배양 상청의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸다
도 6은 표피 수포증 모델 마우스의 제작 설명도이다. 우측 사진은 형성된 수포를 나타낸다.
도 7은 유전자 개변 MSC를 피내 또는 수포내 주입한 표피 수포증 모델 마우스의 피부 단층 화상을 나타낸다. 상측 사진은 DAPI 염색과 VII형 콜라겐에 대한 면역 염색의 결과를 겹친 것이며, 하측 사진은 VII형 콜라겐에 대한 면역 염색의 결과를 나타낸다. 화살표가 VII형 콜라겐의 발현을 나타낸다.
도 8은 유전자 개변 MSC를 피하 주입한 표피 수포증 모델 마우스의 피부 단층 화상을 나타낸다.
도 9는 유전자 개변 MSC를 수포내 주입한 표피 수포증 모델 마우스의 피부 전자 현미경 관찰 화상을 나타낸다. 화살표는 앵커링 피브릴을 나타낸다.
특별히 구체적인 규정이 없는 한, 본 개시에서 사용되는 용어는, 유기 화학, 의학, 약학, 분자 생물학, 미생물학 등의 분야에 있어서의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 이하에 몇 가지 본 개시에서 사용되는 용어에 관한 정의를 기재하지만, 이들 정의는, 본 개시에 있어서, 일반적인 이해에 우선한다.
영양 장애형 표피 수포증은, VII형 콜라겐을 코드하는 COL7A1 유전자의 변이를 원인으로 하는 유전성 질환이며, VII형 콜라겐이 전혀 산생되지 않거나, 변이에 의해 기능이 저하된 VII형 콜라겐이 산생되는 것이, 그 특징으로서 알려져 있다. VII형 콜라겐은, 진피 내에서 앵커링 피브릴이라고 하는 섬유를 형성하고, 기저막과 진피를 연결하고 있다. VII형 콜라겐은, N 말단으로부터, 제1 비콜라겐 영역, 콜라겐 영역 및 제2 비콜라겐 영역을 포함하고, 글리신-X-Y의 반복 서열을 특징으로 하는 콜라겐 영역 부분에서 3개쇄를 형성하고, C 말단에서 2 분자가 결합하고, N 말단이 기저막에 결합한다. 변이에는, 콜라겐 영역의 글리신이 다른 아미노산으로 치환되는 변이, 단백질의 번역이 멈추는 시종 코돈 변이, 스플라이스 부위 변이 등이 있다. 변이는 대립 유전자의 한쪽에 있는 경우와, 양쪽에 있는 경우가 있다. 영양 장애형 표피 수포증에는, 우성 영양 장애형과 열성 영양 장애형이 포함되고, 열성 영양 장애형에는, 중증 범발형과, 비교적 증상이 가벼운 기타 범발형이 포함된다. 본 명세서에 있어서의 영양 장애형 표피 수포증은, 어느 것의 병형의 영양 장애형 표피 수포증이어도 되고, 또한 어떠한 COL7A1 유전자의 변이를 원인으로 하는 것이어도 된다.
본 개시에 있어서는, VII형 콜라겐을 산생하는 세포가 사용된다. 본 개시에 있어서의 「VII형 콜라겐을 산생하는 세포」는, 기능적인(즉, 앵커링 피브릴을 형성할 수 있는) VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 의미한다. VII형 콜라겐을 산생하는 세포는, 천연으로 VII형 콜라겐을 산생하는 세포이거나, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 세포여도 된다.
본 개시에 있어서, 세포의 유전자 개변이란, 세포의 게놈의 유전자를 개변하는 것과, 게놈 외의 핵산 구축물(예를 들어, 벡터)로부터 유전자를 발현하도록 세포를 개변하는 것의 어느 것을 의미한다. 즉, 「VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변한다」라는 표현에는, 게놈 중의 COL7A1 유전자로부터 VII형 콜라겐을 발현하도록 세포를 개변하는 것, 및 게놈 외의 핵산 구축물의 COL7A1 유전자로부터 VII형 콜라겐을 발현하도록 세포를 개변하는 것이 포함된다. 또한, 「VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 세포」에는, 게놈 중의 COL7A1 유전자로부터 VII형 콜라겐을 발현하는 세포와, 게놈 외의 핵산 구축물의 COL7A1 유전자로부터 VII형 콜라겐을 발현하는 세포가 포함된다.
세포의 유전자 개변은, COL7A1 유전자를 도입함으로써, 또는 게놈의 COL7A1 유전자의 변이를 수정함으로써 행할 수 있다. COL7A1 유전자의 도입은, 세포의 게놈에 COL7A1 유전자를 도입함으로써도, 게놈 외의 핵산 구축물로부터 COL7A1 유전자를 발현하도록, COL7A1 유전자를 포함하는 핵산 구축물을 세포 내에 존재시킴으로써도, 행할 수 있다. COL7A1 유전자를 세포의 게놈에 도입하는 경우, 특정한 위치에 도입해도 되고, 랜덤하게 도입해도 된다. 어느 실시 형태에 있어서, COL7A1 유전자는 게놈의 COL7A1 유전자좌 또는 AAVS1 영역과 같은 세이프·하버에 도입된다.
세포는 그 세포가 투여되는 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포(즉, 자가 세포)이거나, 환자 이외의 대상의 세포(즉, 타가 세포)여도 된다. 환자 이외의 대상으로서는, 건강한 사람, 특히 HLA가 적합한 건강한 사람, 또는 환자의 모친을 들 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, 세포는 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포이다. 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포에는, VII형 콜라겐을 산생하지 않는 세포와, VII형 콜라겐을 산생하지만 변이에 의해 그 기능이 저하되고 있는 세포가 있지만, 본 개시에 있어서의 「영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포」는, 그 어느 것이어도 된다.
세포는 환자에게 투여된 경우에 표피 기저막 근방에서 VII형 콜라겐을 산생할 수 있는 세포이면 된다. 세포는 피부, 골수 또는 혈액(예를 들어 말초혈)으로부터 얻은 세포일 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, 세포는 케라티노사이트, 피부 섬유아세포 또는 간엽계 줄기 세포이다. 다른 실시 형태에 있어서, 세포는, 환자 또는 환자 이외의 대상의 세포로부터 유도되는 iPS 세포 또는 당해 iPS 세포로부터 유도되는 세포이다. 이와 같이, 세포는 환자 또는 환자 이외의 대상으로부터 취득된 세포이거나, 취득된 세포로부터 유도된 세포여도 된다. 세포가 환자 또는 환자 이외의 대상으로부터 취득된 세포로부터 유도된 세포를 유전자 개변한 것인 경우, 유전자 개변은, 그 유도 전이거나 후여도 된다.
본 개시에 있어서, 세포는 필요에 따라 증식시킨 것을 포함하는 의미로 사용된다. 세포의 증식은 세포를 배양함으로써 행할 수 있다. 예를 들어, 「환자의 세포 또는 환자 이외의 대상의 세포」는, 환자 또는 환자 이외의 대상으로부터 취득된 후에 증식시킨 것을 포함하고, 「유전자 개변된 세포」는, 유전자 개변 조작에 의해 얻어진 세포를 증식시킨 것을 포함한다. 유전자 개변을 행하는 경우, 유전자 개변에 필요한 양을 얻을 때까지, 세포를 증식시켜도 된다. 또한, 유전자 개변후에, 치료에 필요한 양을 얻을 때까지, 세포를 증식시켜도 된다.
케라티노사이트 및 피부 섬유아세포는, 당업계에서 알려진 어느 방법으로 취득해도 된다. 예를 들어, 피부 생검 조직을 효소 처리 및/또는 기계적 처리함으로써 표피와 진피를 분리하고, 분리한 표피 및 진피를 각각 더 효소 처리한다. 케라티노사이트는 표피 시료로부터, 피부 섬유아세포는 진피 시료로부터, 각각 얻을 수 있다.
어느 실시 형태에 있어서, 세포는 간엽계 줄기 세포이다. 간엽계 줄기 세포는, 환자에게 투여된 경우에, 케라티노사이트나 피부 섬유아세포보다 길게 환자 조직에 존재할 수 있다고 생각된다. 또한, 환자가 지금까지 산생하지 않았던 단백질이 유전자 개변 세포로부터 산출되면 염증 반응이 발생할 것이 예상되는바, 간엽계 줄기 세포에는 염증 억제 효과가 있는 점에서, 케라티노사이트나 피부 섬유아세포보다 유리하다고 생각된다.
간엽계 줄기 세포(본 명세서 중, MSC라고도 기재한다)는, 고상(예를 들어 플라스틱제 배양 용기)으로의 접착성을 갖고, 자기 복제능과, 간엽계 조직(뼈, 연골, 지방, 근육 등)으로의 분화능을 겸비한 세포이다. 어느 실시 형태에 있어서, 간엽계 줄기 세포는, 골아세포, 연골 세포 및 지방 세포 중 적어도 1개로의 분화능을 갖는 세포이다. 어느 실시 형태에 있어서 간엽계 줄기 세포는, 골아세포, 연골 세포 및 지방 세포로의 분화능을 갖는 세포이다. 세포 집단이 상기 능력을 갖는 경우, 간엽계 줄기 세포를 포함한다고 이해된다. 간엽계 줄기 세포는, 골수 또는 기타 조직(혈액, 예를 들어 제대혈 및 말초혈, 그리고 피부, 지방, 치수 등)으로부터 얻을 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, 간엽계 줄기 세포는, 골수 유래 간엽계 줄기 세포(본 명세서 중, BM-MSC라고도 기재한다)이다. 골수 유래 간엽계 줄기 세포는, 대퇴골, 추골, 흉골, 장골, 경골 등의 어느 것의 부위에서 얻은 것이어도 된다.
간엽계 줄기 세포는, 당업계에서 알려진 어느 것의 방법으로 취득해도 된다. 예를 들어, 접착성에 기초하는 방법, 세포 표면 마커에 기초하는 방법, 밀도차에 기초하는 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 플라스틱제 또는 유리제의 배양 용기에, 간엽계 줄기 세포를 포함하는 골수 기타 조직으로부터 얻은 세포를 파종하고, 배양 용기에 부착되어 증식하는 세포를 회수한다. 혹은, 간엽계 줄기 세포는, 간엽계 줄기 세포의 표면 마커에 대한 항체를 사용한 셀 소팅(FACS, MACS 등)에 의해서도, 얻을 수 있다. 인간 간엽계 줄기 세포의 표면 마커로서는, 이하의 1 이상을 들 수 있다: PDGFRα 양성, PDGFRβ 양성, Lin 음성, CD45 음성, CD44 양성, CD90 양성, CD29 양성, Flk-1 음성, CD105 양성, CD73 양성, CD90 양성, CD71 양성, Stro-1 양성, CD106 양성, CD166 양성, CD31 음성, CD271 양성 및 CD11b 음성.
iPS 세포는 당업계에서 알려진 어느 것의 방법으로 제작해도 된다. 예를 들어, iPS 세포는 환자 또는 환자 이외의 대상으로부터 취득한 섬유아세포 등의 체세포에, OCT4, SOX2 및 NANOG의 3종류의 전사 인자를 도입함으로써, 제작할 수 있다(Budniatzky and Gepstein, Stem Cells Transl Med. 3(4): 448-57, 2014; Barrett et al, Stem Cells Trans Med 3: 1-6 sctm. 2014-0121, 2014; Focosi et al., Blood Cancer Journal 4: e211, 2014).
본 명세서에 있어서, 「세포」란, 문맥에 따라서 1개의 세포 또는 복수개의 세포를 의미할 수 있다. 또한, 세포는, 1종류의 세포를 포함하는 세포 집단이어도 되고, 복수종의 세포를 포함하는 세포 집단이어도 된다.
본 명세서에 있어서, COL7A1 유전자란, VII형 콜라겐을 코드하는 핵산 서열을 의미하고, cDNA도, 1 이상의 인트론을 포함하는 서열(예를 들어, 게놈 서열 또는 미니진)도 포함하는 의미로 사용된다. 인간 COL7A1 유전자(cDNA)의 대표적 핵산 서열을 서열 번호 1로, 인간 VII형 콜라겐의 대표적 아미노산 서열을 서열 번호 2로 나타낸다. COL7A1 유전자의 cDNA 서열은 GenBank: NM_000094.3에, 게놈 서열은 GenBank: AC121252.4에 개시되어 있다. COL7A1 유전자는, 기능적인(즉, 앵커링 피브릴을 형성할 수 있는) VII형 콜라겐을 코드하는 것이면 되고, 그 서열은 한정되지 않는다.
인간 COL7A1 유전자의 cDNA 서열(8835 bp)(서열 번호 1)
ATGACGCTGCGGCTTCTGGTGGCCGCGCTCTGCGCCGGGATCCTGGCAGAGGCGCCCCGAGTGCGAGCCCAGCACAGGGAGAGAGTGACCTGCACGCGCCTTTACGCCGCTGACATTGTGTTCTTACTGGATGGCTCCTCATCCATTGGCCGCAGCAATTTCCGCGAGGTCCGCAGCTTTCTCGAAGGGCTGGTGCTGCCTTTCTCTGGAGCAGCCAGTGCACAGGGTGTGCGCTTTGCCACAGTGCAGTACAGCGATGATCCACGGACAGAGTTCGGCCTGGATGCACTTGGCTCTGGGGGTGATGTGATCCGCGCCATCCGTGAGCTTAGCTACAAGGGGGGCAACACTCGCACAGGGGCTGCAATTCTCCATGTGGCTGACCATGTCTTCCTGCCCCAGCTGGCCCGACCTGGTGTCCCCAAGGTCTGCATCCTGATCACAGACGGGAAGTCCCAGGACCTGGTGGACACAGCTGCCCAAAGGCTGAAGGGGCAGGGGGTCAAGCTATTTGCTGTGGGGATCAAGAATGCTGACCCTGAGGAGCTGAAGCGAGTTGCCTCACAGCCCACCAGTGACTTCTTCTTCTTCGTCAATGACTTCAGCATCTTGAGGACACTACTGCCCCTCGTTTCCCGGAGAGTGTGCACGACTGCTGGTGGCGTGCCTGTGACCCGACCTCCGGATGACTCGACCTCTGCTCCACGAGACCTGGTGCTGTCTGAGCCAAGCAGCCAATCCTTGAGAGTACAGTGGACAGCGGCCAGTGGCCCTGTGACTGGCTACAAGGTCCAGTACACTCCTCTGACGGGGCTGGGACAGCCACTGCCGAGTGAGCGGCAGGAGGTGAACGTCCCAGCTGGTGAGACCAGTGTGCGGCTGCGGGGTCTCCGGCCACTGACCGAGTACCAAGTGACTGTGATTGCCCTCTACGCCAACAGCATCGGGGAGGCTGTGAGCGGGACAGCTCGGACCACTGCCCTAGAAGGGCCGGAACTGACCATCCAGAATACCACAGCCCACAGCCTCCTGGTGGCCTGGCGGAGTGTGCCAGGTGCCACTGGCTACCGTGTGACATGGCGGGTCCTCAGTGGTGGGCCCACACAGCAGCAGGAGCTGGGCCCTGGGCAGGGTTCAGTGTTGCTGCGTGACTTGGAGCCTGGCACGGACTATGAGGTGACCGTGAGCACCCTATTTGGCCGCAGTGTGGGGCCCGCCACTTCCCTGATGGCTCGCACTGACGCTTCTGTTGAGCAGACCCTGCGCCCGGTCATCCTGGGCCCCACATCCATCCTCCTTTCCTGGAACTTGGTGCCTGAGGCCCGTGGCTACCGGTTGGAATGGCGGCGTGAGACTGGCTTGGAGCCACCGCAGAAGGTGGTACTGCCCTCTGATGTGACCCGCTACCAGTTGGATGGGCTGCAGCCGGGCACTGAGTACCGCCTCACACTCTACACTCTGCTGGAGGGCCACGAGGTGGCCACCCCTGCAACCGTGGTTCCCACTGGACCAGAGCTGCCTGTGAGCCCTGTAACAGACCTGCAAGCCACCGAGCTGCCCGGGCAGCGGGTGCGAGTGTCCTGGAGCCCAGTCCCTGGTGCCACCCAGTACCGCATCATTGTGCGCAGCACCCAGGGGGTTGAGCGGACCCTGGTGCTTCCTGGGAGTCAGACAGCATTCGACTTGGATGACGTTCAGGCTGGGCTTAGCTACACTGTGCGGGTGTCTGCTCGAGTGGGTCCCCGTGAGGGCAGTGCCAGTGTCCTCACTGTCCGCCGGGAGCCGGAAACTCCACTTGCTGTTCCAGGGCTGCGGGTTGTGGTGTCAGATGCAACGCGAGTGAGGGTGGCCTGGGGACCCGTCCCTGGAGCCAGTGGATTTCGGATTAGCTGGAGCACAGGCAGTGGTCCGGAGTCCAGCCAGACACTGCCCCCAGACTCTACTGCCACAGACATCACAGGGCTGCAGCCTGGAACCACCTACCAGGTGGCTGTGTCGGTACTGCGAGGCAGAGAGGAGGGCCCTGCTGCAGTCATCGTGGCTCGAACGGACCCACTGGGCCCAGTGAGGACGGTCCATGTGACTCAGGCCAGCAGCTCATCTGTCACCATTACCTGGACCAGGGTTCCTGGCGCCACAGGATACAGGGTTTCCTGGCACTCAGCCCACGGCCCAGAGAAATCCCAGTTGGTTTCTGGGGAGGCCACGGTGGCTGAGCTGGATGGACTGGAGCCAGATACTGAGTATACGGTGCATGTGAGGGCCCATGTGGCTGGCGTGGATGGGCCCCCTGCCTCTGTGGTTGTGAGGACTGCCCCTGAGCCTGTGGGTCGTGTGTCGAGGCTGCAGATCCTCAATGCTTCCAGCGACGTTCTACGGATCACCTGGGTAGGGGTCACTGGAGCCACAGCTTACAGACTGGCCTGGGGCCGGAGTGAAGGCGGCCCCATGAGGCACCAGATACTCCCAGGAAACACAGACTCTGCAGAGATCCGGGGTCTCGAAGGTGGAGTCAGCTACTCAGTGCGAGTGACTGCACTTGTCGGGGACCGCGAGGGCACACCTGTCTCCATTGTTGTCACTACGCCGCCTGAGGCTCCGCCAGCCCTGGGGACGCTTCACGTGGTGCAGCGCGGGGAGCACTCGCTGAGGCTGCGCTGGGAGCCGGTGCCCAGAGCGCAGGGCTTCCTTCTGCACTGGCAACCTGAGGGTGGCCAGGAACAGTCCCGGGTCCTGGGGCCCGAGCTCAGCAGCTATCACCTGGACGGGCTGGAGCCAGCGACACAGTACCGCGTGAGGCTGAGTGTCCTAGGGCCAGCTGGAGAAGGGCCCTCTGCAGAGGTGACTGCGCGCACTGAGTCACCTCGTGTTCCAAGCATTGAACTACGTGTGGTGGACACCTCGATCGACTCGGTGACTTTGGCCTGGACTCCAGTGTCCAGGGCATCCAGCTACATCCTATCCTGGCGGCCACTCAGAGGCCCTGGCCAGGAAGTGCCTGGGTCCCCGCAGACACTTCCAGGGATCTCAAGCTCCCAGCGGGTGACAGGGCTAGAGCCTGGCGTCTCTTACATCTTCTCCCTGACGCCTGTCCTGGATGGTGTGCGGGGTCCTGAGGCATCTGTCACACAGACGCCAGTGTGCCCCCGTGGCCTGGCGGATGTGGTGTTCCTACCACATGCCACTCAAGACAATGCTCACCGTGCGGAGGCTACGAGGAGGGTCCTGGAGCGTCTGGTGTTGGCACTTGGGCCTCTTGGGCCACAGGCAGTTCAGGTTGGCCTGCTGTCTTACAGTCATCGGCCCTCCCCACTGTTCCCACTGAATGGCTCCCATGACCTTGGCATTATCTTGCAAAGGATCCGTGACATGCCCTACATGGACCCAAGTGGGAACAACCTGGGCACAGCCGTGGTCACAGCTCACAGATACATGTTGGCACCAGATGCTCCTGGGCGCCGCCAGCACGTACCAGGGGTGATGGTTCTGCTAGTGGATGAACCCTTGAGAGGTGACATATTCAGCCCCATCCGTGAGGCCCAGGCTTCTGGGCTTAATGTGGTGATGTTGGGAATGGCTGGAGCGGACCCAGAGCAGCTGCGTCGCTTGGCGCCGGGTATGGACTCTGTCCAGACCTTCTTCGCCGTGGATGATGGGCCAAGCCTGGACCAGGCAGTCAGTGGTCTGGCCACAGCCCTGTGTCAGGCATCCTTCACTACTCAGCCCCGGCCAGAGCCCTGCCCAGTGTATTGTCCAAAGGGCCAGAAGGGGGAACCTGGAGAGATGGGCCTGAGAGGACAAGTTGGGCCTCCTGGCGACCCTGGCCTCCCGGGCAGGACCGGTGCTCCCGGCCCCCAGGGGCCCCCTGGAAGTGCCACTGCCAAGGGCGAGAGGGGCTTCCCTGGAGCAGATGGGCGTCCAGGCAGCCCTGGCCGCGCCGGGAATCCTGGGACCCCTGGAGCCCCTGGCCTAAAGGGCTCTCCAGGGTTGCCTGGCCCTCGTGGGGACCCGGGAGAGCGAGGACCTCGAGGCCCAAAGGGGGAGCCGGGGGCTCCCGGACAAGTCATCGGAGGTGAAGGACCTGGGCTTCCTGGGCGGAAAGGGGACCCTGGACCATCGGGCCCCCCTGGACCTCGTGGACCACTGGGGGACCCAGGACCCCGTGGCCCCCCAGGGCTTCCTGGAACAGCCATGAAGGGTGACAAAGGCGATCGTGGGGAGCGGGGTCCCCCTGGACCAGGTGAAGGTGGCATTGCTCCTGGGGAGCCTGGGCTGCCGGGTCTTCCCGGAAGCCCTGGACCCCAAGGCCCCGTTGGCCCCCCTGGAAAGAAAGGAGAAAAAGGTGACTCTGAGGATGGAGCTCCAGGCCTCCCAGGACAACCTGGGTCTCCGGGTGAGCAGGGCCCACGGGGACCTCCTGGAGCTATTGGCCCCAAAGGTGACCGGGGCTTTCCAGGGCCCCTGGGTGAGGCTGGAGAGAAGGGCGAACGTGGACCCCCAGGCCCAGCGGGATCCCGGGGGCTGCCAGGGGTTGCTGGACGTCCTGGAGCCAAGGGTCCTGAAGGGCCACCAGGACCCACTGGCCGCCAAGGAGAGAAGGGGGAGCCTGGTCGCCCTGGGGACCCTGCAGTGGTGGGACCTGCTGTTGCTGGACCCAAAGGAGAAAAGGGAGATGTGGGGCCCGCTGGGCCCAGAGGAGCTACCGGAGTCCAAGGGGAACGGGGCCCACCCGGCTTGGTTCTTCCTGGAGACCCTGGCCCCAAGGGAGACCCTGGAGACCGGGGTCCCATTGGCCTTACTGGCAGAGCAGGACCCCCAGGTGACTCAGGGCCTCCTGGAGAGAAGGGAGACCCTGGGCGGCCTGGCCCCCCAGGACCTGTTGGCCCCCGAGGACGAGATGGTGAAGTTGGAGAGAAAGGTGACGAGGGTCCTCCGGGTGACCCGGGTTTGCCTGGAAAAGCAGGCGAGCGTGGCCTTCGGGGGGCACCTGGAGTTCGGGGGCCTGTGGGTGAAAAGGGAGACCAGGGAGATCCTGGAGAGGATGGACGAAATGGCAGCCCTGGATCATCTGGACCCAAGGGTGACCGTGGGGAGCCGGGTCCCCCAGGACCCCCGGGACGGCTGGTAGACACAGGACCTGGAGCCAGAGAGAAGGGAGAGCCTGGGGACCGCGGACAAGAGGGTCCTCGAGGGCCCAAGGGTGATCCTGGCCTCCCTGGAGCCCCTGGGGAAAGGGGCATTGAAGGGTTTCGGGGACCCCCAGGCCCACAGGGGGACCCAGGTGTCCGAGGCCCAGCAGGAGAAAAGGGTGACCGGGGTCCCCCTGGGCTGGATGGCCGGAGCGGACTGGATGGGAAACCAGGAGCCGCTGGGCCCTCTGGGCCGAATGGTGCTGCAGGCAAAGCTGGGGACCCAGGGAGAGACGGGCTTCCAGGCCTCCGTGGAGAACAGGGCCTCCCTGGCCCCTCTGGTCCCCCTGGATTACCGGGAAAGCCAGGCGAGGATGGCAAACCTGGCCTGAATGGAAAAAACGGAGAACCTGGGGACCCTGGAGAAGACGGGAGGAAGGGAGAGAAAGGAGATTCAGGCGCCTCTGGGAGAGAAGGTCGTGATGGCCCCAAGGGTGAGCGTGGAGCTCCTGGTATCCTTGGACCCCAGGGGCCTCCAGGCCTCCCAGGGCCAGTGGGCCCTCCTGGCCAGGGTTTTCCTGGTGTCCCAGGAGGCACGGGCCCCAAGGGTGACCGTGGGGAGACTGGATCCAAAGGGGAGCAGGGCCTCCCTGGAGAGCGTGGCCTGCGAGGAGAGCCTGGAAGTGTGCCGAATGTGGATCGGTTGCTGGAAACTGCTGGCATCAAGGCATCTGCCCTGCGGGAGATCGTGGAGACCTGGGATGAGAGCTCTGGTAGCTTCCTGCCTGTGCCCGAACGGCGTCGAGGCCCCAAGGGGGACTCAGGCGAACAGGGCCCCCCAGGCAAGGAGGGCCCCATCGGCTTTCCTGGAGAACGCGGGCTGAAGGGCGACCGTGGAGACCCTGGCCCTCAGGGGCCACCTGGTCTGGCCCTTGGGGAGAGGGGCCCCCCCGGGCCTTCCGGCCTTGCCGGGGAGCCTGGAAAGCCTGGTATTCCCGGGCTCCCAGGCAGGGCTGGGGGTGTGGGAGAGGCAGGAAGGCCAGGAGAGAGGGGAGAACGGGGAGAGAAAGGAGAACGTGGAGAACAGGGCAGAGATGGCCCTCCTGGACTCCCTGGAACCCCTGGGCCCCCCGGACCCCCTGGCCCCAAGGTGTCTGTGGATGAGCCAGGTCCTGGACTCTCTGGAGAACAGGGACCCCCTGGACTCAAGGGTGCTAAGGGGGAGCCGGGCAGCAATGGTGACCAAGGTCCCAAAGGAGACAGGGGTGTGCCAGGCATCAAAGGAGACCGGGGAGAGCCTGGACCGAGGGGTCAGGACGGCAACCCGGGTCTACCAGGAGAGCGTGGTATGGCTGGGCCTGAAGGGAAGCCGGGTCTGCAGGGTCCAAGAGGCCCCCCTGGCCCAGTGGGTGGTCATGGAGACCCTGGACCACCTGGTGCCCCGGGTCTTGCTGGCCCTGCAGGACCCCAAGGACCTTCTGGCCTGAAGGGGGAGCCTGGAGAGACAGGACCTCCAGGACGGGGCCTGACTGGACCTACTGGAGCTGTGGGACTTCCTGGACCCCCCGGCCCTTCAGGCCTTGTGGGTCCACAGGGGTCTCCAGGTTTGCCTGGACAAGTGGGGGAGACAGGGAAGCCGGGAGCCCCAGGTCGAGATGGTGCCAGTGGAAAAGATGGAGACAGAGGGAGCCCTGGTGTGCCAGGGTCACCAGGTCTGCCTGGCCCTGTCGGACCTAAAGGAGAACCTGGCCCCACGGGGGCCCCTGGACAGGCTGTGGTCGGGCTCCCTGGAGCAAAGGGAGAGAAGGGAGCCCCTGGAGGCCTTGCTGGAGACCTGGTGGGTGAGCCGGGAGCCAAAGGTGACCGAGGACTGCCAGGGCCGCGAGGCGAGAAGGGTGAAGCTGGCCGTGCAGGGGAGCCCGGAGACCCTGGGGAAGATGGTCAGAAAGGGGCTCCAGGACCCAAAGGTTTCAAGGGTGACCCAGGAGTCGGGGTCCCGGGCTCCCCTGGGCCTCCTGGCCCTCCAGGTGTGAAGGGAGATCTGGGCCTCCCTGGCCTGCCCGGTGCTCCTGGTGTTGTTGGGTTCCCGGGTCAGACAGGCCCTCGAGGAGAGATGGGTCAGCCAGGCCCTAGTGGAGAGCGGGGTCTGGCAGGCCCCCCAGGGAGAGAAGGAATCCCAGGACCCCTGGGGCCACCTGGACCACCGGGGTCAGTGGGACCACCTGGGGCCTCTGGACTCAAAGGAGACAAGGGAGACCCTGGAGTAGGGCTGCCTGGGCCCCGAGGCGAGCGTGGGGAGCCAGGCATCCGGGGTGAAGATGGCCGCCCCGGCCAGGAGGGACCCCGAGGACTCACGGGGCCCCCTGGCAGCAGGGGAGAGCGTGGGGAGAAGGGTGATGTTGGGAGTGCAGGACTAAAGGGTGACAAGGGAGACTCAGCTGTGATCCTGGGGCCTCCAGGCCCACGGGGTGCCAAGGGGGACATGGGTGAACGAGGGCCTCGGGGCTTGGATGGTGACAAAGGACCTCGGGGAGACAATGGGGACCCTGGTGACAAGGGCAGCAAGGGAGAGCCTGGTGACAAGGGCTCAGCCGGGTTGCCAGGACTGCGTGGACTCCTGGGACCCCAGGGTCAACCTGGTGCAGCAGGGATCCCTGGTGACCCGGGATCCCCAGGAAAGGATGGAGTGCCTGGTATCCGAGGAGAAAAAGGAGATGTTGGCTTCATGGGTCCCCGGGGCCTCAAGGGTGAACGGGGAGTGAAGGGAGCCTGTGGCCTTGATGGAGAGAAGGGAGACAAGGGAGAAGCTGGTCCCCCAGGCCGCCCCGGGCTGGCAGGACACAAAGGAGAGATGGGGGAGCCTGGTGTGCCGGGCCAGTCGGGGGCCCCTGGCAAGGAGGGCCTGATCGGTCCCAAGGGTGACCGAGGCTTTGACGGGCAGCCAGGCCCCAAGGGTGACCAGGGCGAGAAAGGGGAGCGGGGAACCCCAGGAATTGGGGGCTTCCCAGGCCCCAGTGGAAATGATGGCTCTGCTGGTCCCCCAGGGCCACCTGGCAGTGTTGGTCCCAGAGGCCCCGAAGGACTTCAGGGCCAGAAGGGTGAGCGAGGTCCCCCCGGAGAGAGAGTGGTGGGGGCTCCTGGGGTCCCTGGAGCTCCTGGCGAGAGAGGGGAGCAGGGGCGGCCAGGGCCTGCCGGTCCTCGAGGCGAGAAGGGAGAAGCTGCACTGACGGAGGATGACATCCGGGGCTTTGTGCGCCAAGAGATGAGTCAGCACTGTGCCTGCCAGGGCCAGTTCATCGCATCTGGATCACGACCCCTCCCTAGTTATGCTGCAGACACTGCCGGCTCCCAGCTCCATGCTGTGCCTGTGCTCCGCGTCTCTCATGCAGAGGAGGAAGAGCGGGTACCCCCTGAGGATGATGAGTACTCTGAATACTCCGAGTATTCTGTGGAGGAGTACCAGGACCCTGAAGCTCCTTGGGATAGTGATGACCCCTGTTCCCTGCCACTGGATGAGGGCTCCTGCACTGCCTACACCCTGCGCTGGTACCATCGGGCTGTGACAGGCAGCACAGAGGCCTGTCACCCTTTTGTCTATGGTGGCTGTGGAGGGAATGCCAACCGTTTTGGGACCCGTGAGGCCTGCGAGCGCCGCTGCCCACCCCGGGTGGTCCAGAGCCAGGGGACAGGTACTGCCCAGGACTGA
인간 VII형 콜라겐의 아미노산 서열(2944 AA)(서열 번호2)
MTLRLLVAALCAGILAEAPRVRAQHRERVTCTRLYAADIVFLLDGSSSIGRSNFREVRSFLEGLVLPFSGAASAQGVRFATVQYSDDPRTEFGLDALGSGGDVIRAIRELSYKGGNTRTGAAILHVADHVFLPQLARPGVPKVCILITDGKSQDLVDTAAQRLKGQGVKLFAVGIKNADPEELKRVASQPTSDFFFFVNDFSILRTLLPLVSRRVCTTAGGVPVTRPPDDSTSAPRDLVLSEPSSQSLRVQWTAASGPVTGYKVQYTPLTGLGQPLPSERQEVNVPAGETSVRLRGLRPLTEYQVTVIALYANSIGEAVSGTARTTALEGPELTIQNTTAHSLLVAWRSVPGATGYRVTWRVLSGGPTQQQELGPGQGSVLLRDLEPGTDYEVTVSTLFGRSVGPATSLMARTDASVEQTLRPVILGPTSILLSWNLVPEARGYRLEWRRETGLEPPQKVVLPSDVTRYQLDGLQPGTEYRLTLYTLLEGHEVATPATVVPTGPELPVSPVTDLQATELPGQRVRVSWSPVPGATQYRIIVRSTQGVERTLVLPGSQTAFDLDDVQAGLSYTVRVSARVGPREGSASVLTVRREPETPLAVPGLRVVVSDATRVRVAWGPVPGASGFRISWSTGSGPESSQTLPPDSTATDITGLQPGTTYQVAVSVLRGREEGPAAVIVARTDPLGPVRTVHVTQASSSSVTITWTRVPGATGYRVSWHSAHGPEKSQLVSGEATVAELDGLEPDTEYTVHVRAHVAGVDGPPASVVVRTAPEPVGRVSRLQILNASSDVLRITWVGVTGATAYRLAWGRSEGGPMRHQILPGNTDSAEIRGLEGGVSYSVRVTALVGDREGTPVSIVVTTPPEAPPALGTLHVVQRGEHSLRLRWEPVPRAQGFLLHWQPEGGQEQSRVLGPELSSYHLDGLEPATQYRVRLSVLGPAGEGPSAEVTARTESPRVPSIELRVVDTSIDSVTLAWTPVSRASSYILSWRPLRGPGQEVPGSPQTLPGISSSQRVTGLEPGVSYIFSLTPVLDGVRGPEASVTQTPVCPRGLADVVFLPHATQDNAHRAEATRRVLERLVLALGPLGPQAVQVGLLSYSHRPSPLFPLNGSHDLGIILQRIRDMPYMDPSGNNLGTAVVTAHRYMLAPDAPGRRQHVPGVMVLLVDEPLRGDIFSPIREAQASGLNVVMLGMAGADPEQLRRLAPGMDSVQTFFAVDDGPSLDQAVSGLATALCQASFTTQPRPEPCPVYCPKGQKGEPGEMGLRGQVGPPGDPGLPGRTGAPGPQGPPGSATAKGERGFPGADGRPGSPGRAGNPGTPGAPGLKGSPGLPGPRGDPGERGPRGPKGEPGAPGQVIGGEGPGLPGRKGDPGPSGPPGPRGPLGDPGPRGPPGLPGTAMKGDKGDRGERGPPGPGEGGIAPGEPGLPGLPGSPGPQGPVGPPGKKGEKGDSEDGAPGLPGQPGSPGEQGPRGPPGAIGPKGDRGFPGPLGEAGEKGERGPPGPAGSRGLPGVAGRPGAKGPEGPPGPTGRQGEKGEPGRPGDPAVVGPAVAGPKGEKGDVGPAGPRGATGVQGERGPPGLVLPGDPGPKGDPGDRGPIGLTGRAGPPGDSGPPGEKGDPGRPGPPGPVGPRGRDGEVGEKGDEGPPGDPGLPGKAGERGLRGAPGVRGPVGEKGDQGDPGEDGRNGSPGSSGPKGDRGEPGPPGPPGRLVDTGPGAREKGEPGDRGQEGPRGPKGDPGLPGAPGERGIEGFRGPPGPQGDPGVRGPAGEKGDRGPPGLDGRSGLDGKPGAAGPSGPNGAAGKAGDPGRDGLPGLRGEQGLPGPSGPPGLPGKPGEDGKPGLNGKNGEPGDPGEDGRKGEKGDSGASGREGRDGPKGERGAPGILGPQGPPGLPGPVGPPGQGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGSVPNVDRLLETAGIKASALREIVETWDESSGSFLPVPERRRGPKGDSGEQGPPGKEGPIGFPGERGLKGDRGDPGPQGPPGLALGERGPPGPSGLAGEPGKPGIPGLPGRAGGVGEAGRPGERGERGEKGERGEQGRDGPPGLPGTPGPPGPPGPKVSVDEPGPGLSGEQGPPGLKGAKGEPGSNGDQGPKGDRGVPGIKGDRGEPGPRGQDGNPGLPGERGMAGPEGKPGLQGPRGPPGPVGGHGDPGPPGAPGLAGPAGPQGPSGLKGEPGETGPPGRGLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGQAVVGLPGAKGEKGAPGGLAGDLVGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKGAPGPKGFKGDPGVGVPGSPGPPGPPGVKGDLGLPGLPGAPGVVGFPGQTGPRGEMGQPGPSGERGLAGPPGREGIPGPLGPPGPPGSVGPPGASGLKGDKGDPGVGLPGPRGERGEPGIRGEDGRPGQEGPRGLTGPPGSRGERGEKGDVGSAGLKGDKGDSAVILGPPGPRGAKGDMGERGPRGLDGDKGPRGDNGDPGDKGSKGEPGDKGSAGLPGLRGLLGPQGQPGAAGIPGDPGSPGKDGVPGIRGEKGDVGFMGPRGLKGERGVKGACGLDGEKGDKGEAGPPGRPGLAGHKGEMGEPGVPGQSGAPGKEGLIGPKGDRGFDGQPGPKGDQGEKGERGTPGIGGFPGPSGNDGSAGPPGPPGSVGPRGPEGLQGQKGERGPPGERVVGAPGVPGAPGERGEQGRPGPAGPRGEKGEAALTEDDIRGFVRQEMSQHCACQGQFIASGSRPLPSYAADTAGSQLHAVPVLRVSHAEEEERVPPEDDEYSEYSEYSVEEYQDPEAPWDSDDPCSLPLDEGSCTAYTLRWYHRAVTGSTEACHPFVYGGCGGNANRFGTREACERRCPPRVVQSQGTGTAQD*
어느 실시 형태에 있어서, COL7A1 유전자는 서열 번호 1의 핵산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 상기 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, COL7A1 유전자는, 서열 번호 1의 핵산 서열에 있어서 0 내지 30개, 0 내지 20개, 0 내지 10개, 0 내지 5개, 0 내지 3개, 0 내지 2개 또는 0 내지 1개의 염기가 결실, 치환, 또는 부가된 핵산 서열을 포함하거나, 상기 핵산 서열을 포함한다. 가일층의 실시 형태에 있어서, COL7A1 유전자는, 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하거나, 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함한다.
어느 실시 형태에 있어서, VII형 콜라겐은, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, VII형 콜라겐은, 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서 0 내지 30개, 0 내지 20개, 0 내지 10개, 0 내지 5개, 0 내지 3개, 0 내지 2개 또는 0 내지 1개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열을 포함한다. 가일층의 실시 형태에 있어서, VII형 콜라겐은, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
어느 실시 형태에 있어서, COL7A1 유전자는, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하거나, 상기 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, COL7A1 유전자는, 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서 0 내지 30개, 0 내지 20개, 0 내지 10개, 0 내지 5개, 0 내지 3개, 0 내지 2개 또는 0 내지 1개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하거나, 상기 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에 있어서의, 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 관한 「서열 동일성」이란, 비교 대상의 서열의 전체 영역에 걸쳐서 최적의 상태로(일치가 최대가 되는 상태로) 얼라인먼트된 2개의 서열간에서 일치하는 염기 또는 아미노산 잔기의 비율을 의미한다. 여기서, 비교 대상의 서열은, 2개의 서열이 최적의 얼라인먼트에 있어서, 부가 또는 결실(예를 들어 갭 등)을 갖고 있어도 된다. 서열 동일성은, 공공의 데이터베이스(예를 들어, DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp))에서 제공되는 FASTA, BLAST, CLUSTAL W 등의 프로그램을 사용해서 산출할 수 있다. 혹은, 시판 중인 서열 해석 소프트웨어(예를 들어, Vector NTI(등록상표) 소프트웨어, GENETYX(등록상표) ver. 12)를 사용해서 구할 수도 있다.
세포를 유전자 개변하는 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 어느 실시 형태에 있어서, 세포는 CRISPR 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1), TALEN, ZFN 등의 게놈 편집에 의해, 유전자 개변된다. 다른 실시 형태에 있어서, 세포는 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터에 의해, 유전자 개변된다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 세포는 CRISPR/Cas9에 의해 유전자 개변된다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 세포는 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터에 의해 유전자 개변된다.
게놈 편집에 의한 경우, 게놈에 절단을 발생시킴과 함께, 목적의 서열을 포함하는 도너 벡터를 세포에 도입함으로써, 당해 서열을 게놈의 절단 부위에 삽입 할 수 있다. 게놈에 삽입하는 서열은, COL7A1 유전자 또는 COL7A1 유전자의 변이를 포함하는 부위와 치환하기 위한 서열(예를 들어, COL7A1 유전자의 부분 서열)일 수 있다. 도너 벡터는, 목적의 서열에 더하여, 목적의 서열의 발현을 제어하는 프로모터나 인핸서 등의 조절 서열이나 세포 선택을 위한 약제 내성 유전자 등의 다른 요소를 포함해도 되고, 그 양단에 게놈의 삽입 부위의 양단에 상동의 서열을 포함해도 된다. 도너 벡터는, 비상동성 말단 결합 또는 상동 재조합에 의해, 원하는 부위에 도입될 수 있다. 도너 벡터로서는, 플라스미드나, 아데노 수반 바이러스 벡터, 인테그라제 결손형 렌티 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
CRISPR 시스템에서는, Cas9 또는 Cas12(예를 들어, Cas12a(Cpf1이라고도 한다), Cas12b, Cas12e) 등의 엔도뉴클레아제가, 특정한 염기 서열인 PAM 서열을 인식하고, 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 표적 DNA의 이중쇄를 절단한다. 엔도뉴클레아제가 Cas9이면, PAM 서열의 약 3-4염기 상류를 절단한다. 엔도뉴클레아제로서는, S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis, S. thermophilus 또는 T. denticola의 Cas9, L. bacterium ND2006 또는 Acidaminococcus sp. BV3L6의 Cpfl 등을 들 수 있다. PAM 서열은 엔도뉴클레아제에 의존하고, 예를 들어 S.pyogenes의 Cas9의 PAM 서열은 NGG이다. gRNA는 PAM 서열의 상류 약 20 염기의 서열(표적 서열) 또는 이것에 상보적인 서열을 5' 말단측에 포함하고, 표적 서열에 엔도뉴클레아제를 동원하는 역할을 한다. gRNA 중, 표적 서열(또는 이것에 상보적인 서열) 이외의 부분의 서열은, 사용하는 엔도뉴클레아제에 따라서 당업자가 적절히 결정할 수 있다. gRNA는, 표적 서열 또는 그것에 상보적인 서열을 포함하고 gRNA의 서열 특이성을 담당하는 crRNA(CRISPR RNA)와, 이중쇄를 형성하여 Cas9와의 복합체 형성에 기여하는 tracrRNA(Trans-activating(트랜스 엑티베이팅) crRNA)를 포함할 수 있다. crRNA와 tracrRNA는, 다른 분자로서 존재해도 된다. 엔도뉴클레아제가 Cpf1의 경우, crRNA만으로 gRNA로서 기능한다. 본 명세서에 있어서, gRNA의 기능에 필요한 요소를 단일쇄 상에 포함하는 gRNA를 특히 sgRNA라 기재하는 경우가 있다. gRNA의 서열은, CRISPRdirect(https://crispr.dbcls.jp/) 등, 표적 서열의 선택 및 gRNA의 설계에 이용 가능한 툴에 따라 결정할 수 있다.
세포에, gRNA를 코드하는 핵산 서열과 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입하여 발현시켜도 되고, 세포 외에서 제작한 gRNA와 엔도뉴클레아제의 단백질을 세포에 도입해도 된다. 또한, 엔도뉴클레아제는 핵 이행 시그널을 구비하고 있어도 된다. gRNA를 코드하는 핵산 서열과 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산 서열이란, 다른 벡터 상에 존재해도 된다. 벡터, gRNA 및 엔도뉴클레아제는, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법 등에 의해 세포에 도입할 수 있지만, 이들 방법에 한정되지 않는다.
본 개시는, COL7A1 유전자의 게놈에의 도입에 사용할 수 있는, gRNA 및 gRNA를 코드하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 어느 실시 형태에 있어서, gRNA는 서열 번호 3 내지 5의 어느 것의 서열 또는 이것에 상보적인 서열을 포함한다.
바이러스 벡터에 의한 경우, 인테그라제 활성을 갖는 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터를 사용하면, COL7A1 유전자를 세포의 게놈에 도입할 수 있다. 레트로 바이러스 벡터 및 렌티 바이러스 벡터는, 인테그라제 결손형이어도 된다. 인테그라제 결손형 벡터는, 예를 들어 인테그라제 유전자의 변이에 의해 인테그라제 활성이 결여된다. 인테그라제 결손형 벡터나, 아데노 바이러스 벡터 또는 아데노 수반 바이러스 벡터를 사용하면, 통상 벡터에 내장된 서열은 세포의 게놈에 도입되지 않는다. 예를 들어, 인테그라제 결손형 렌티 바이러스 벡터나, 아데노바이러스 벡터에 COL7A1 유전자를 조합한 경우에는, 세포 내(핵 내)에 존재하는 벡터의 COL7A1 유전자로부터 VII형 콜라겐이 발현된다.
바이러스 벡터는, COL7A1 유전자를 코드하는 서열을 포함하고, COL7A1 유전자의 발현을 제어하는 프로모터나 인핸서 등의 조절 서열이나 세포 선택을 위한 약제 내성 유전자 등의 다른 요소를 포함해도 된다. 바이러스 벡터는, 당업계에서 알려진 어느 것의 방법으로 제작해도 된다. 예를 들어, 레트로 바이러스 벡터 및 렌티 바이러스 벡터는, 양단의 LTR 서열(5'LTR 및 3'LTR), 패키징 시그널 및 목적의 서열을 포함하는 바이러스 벡터 플라스미드를, Gag, Pol, Env 등의 바이러스의 구조 단백질을 발현하는 1 이상의 플라스미드 벡터와 함께 패키징 세포에 도입함으로써, 또는 이들 구조 단백질을 발현하는 패키징 세포에 도입함으로써, 제작할 수 있다. 패키징 세포로서는, 293T 세포, 293 세포, HeLa 세포, COS1 세포, COS7 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 바이러스 벡터는, 수도 타입화되어 있어도 되고, 예를 들어 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV-G) 등의 엔벨로프 단백질을 발현해도 된다. 제작된 바이러스 벡터를 표적 세포에 감염시킴으로써, 목적의 서열을 표적 세포에 도입할 수 있다.
어느 실시 형태에 있어서, 바이러스 벡터는, 렌티 바이러스 벡터이다. 렌티 바이러스 벡터로서는, HIV(human immunodeficiency virus(인체 면역 결핍 바이러스))(예를 들어, HIV-1 및 HIV-2), SIV(simian immunodeficiency virus(유인원 면역 결핍 바이러스)), FIV(feline immunodeficiency virus(고양이 면역 결핍 바이러스)), MVV(Maedi-Visna virus(메디-비스나 바이러스)), EV1(Maedi-Visna-like virus(메디-비스나형 바이러스)), EIAV(equine infectious anemia virus(말 전염성 빈혈 바이러스)) 및 CAEV(caprine arthritis encephalitis virus(염소 관절염 뇌염 바이러스))를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 어느 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터는 HIV이다.
일례로서, 렌티 바이러스 벡터는, 하기와 같이 제조할 수 있다. 먼저, 바이러스 게놈을 코드하는 바이러스 벡터 플라스미드와, Gag, Pol 및 Rev(및 경우에 따라 Tat)를 발현하는 1 이상의 플라스미드 벡터 및 VSV-G 등의 엔벨로프 단백질을 발현하는 1 이상의 플라스미드 벡터를, 패키징 세포에 도입한다. 바이러스 벡터 플라스미드는, 양단의 LTR 서열(5'LTR 및 3'LTR), 패키징 시그널, 그리고 COL7A1 유전자 및 그 발현을 제어하는 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, EF1α 프로모터 또는 hCEF 프로모터)를 포함한다. 5'LTR은, 바이러스 RNA 게놈의 전사를 유도하는 프로모터로서 기능하지만, RNA 게놈의 발현을 높이기 위해서, CMV 프로모터 등의 다른 프로모터로 치환되어 있어도 된다. 세포 내에서, 벡터 플라스미드로부터 바이러스 RNA 게놈이 전사되고, 패키징되어, 바이러스 코어가 형성된다. 바이러스 코어는, 패키징 세포의 세포막으로 수송되어, 세포막에 봉입되어, 패키징 세포로부터 바이러스 입자로서 방출된다. 방출된 바이러스 입자는, 패키징 세포의 배양 상청으로부터 회수할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자는, 원심 분리, 필터 여과, 칼럼 정제 등의 통상의 정제 방법에 의해, 회수할 수 있다. 또한, 렌티 바이러스 벡터는, Lentiviral High Titer Packaging Mix, Lenti-XTM Packaging Single Shots(Takara Bio Inc.), ViraSafeTM 렌티 바이러스 컴플리트 발현 시스템(Cell Biolabs Inc.) 등의 키트를 사용해서 제조할 수 있다. 아데노 수반 바이러스 벡터는, AAVpro(등록상표) Helper Free System(Takara Bio Inc.) 등의 키트를 사용해서 제조할 수 있다.
목적의 서열이 도입된 세포는, 서던 블로팅이나 PCR에 의해 확인할 수 있다. 목적의 서열은, 대립 유전자의 적어도 한쪽에 도입되어 있으면 된다.
본 개시의 조성물의 어느 실시 형태에서는, 간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포에서 가장 많은 세포이다. 가일층의 실시 형태에서는, 간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포의, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 또는 99% 이상을 차지한다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 조성물은, 실질적으로 간엽계 줄기 세포 이외의 세포를 포함하지 않는다. 「실질적으로 간엽계 줄기 세포 이외의 세포를 포함하지 않는다」란, 간엽계 줄기 세포의 취득 방법과 통상 당업자에게 이해되는 방법에 의해 얻어진 세포만을 포함하는 것을 의미한다.
조성물에 포함되는 세포의 수는, 원하는 효과의 발휘에 필요한 양(본 명세서에 있어서, 유효량이라고도 칭한다)이며, 당업자는 환자의 연령, 체중, 및 병상, 그리고 세포의 종류 및 유전자 개변 방법 등의 인자를 고려하여, 적절히 결정할 수 있다. 세포수는, 한정되지 않지만, 예를 들어 1세포 내지 1×107세포, 1×10세포 내지 1×107세포, 1×102세포 내지 1×107세포, 1×103세포 내지 1×107세포, 1×104세포 내지 1×107세포, 1×105세포 내지 1×107세포, 1×105세포 내지 5×106세포, 5×105 세포 내지 1×106세포 또는 1×105세포 내지 1×106세포이다. 조성물은 세포에 더하여, 의약상 허용되는 매체 및/또는 첨가물을 포함해도 된다. 의약상 허용되는 매체로서는, 물, 배지, 생리 식염수, 포도당, D-소르비톨 또는 D-만니톨 등을 포함하는 수액, 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등을 들 수 있다. 첨가물로서는, 용해 보조제, 안정제, 방부제 등을 들 수 있다. 조성물의 제형은, 특별히 한정되지 않지만, 비경구 투여 제제, 예를 들어 주사제이다. 주사제에는 용액성 주사제, 현탁성 주사제, 유탁성 주사제, 용시 조제형 주사제가 포함된다. 조성물은, 동결되어 있어도 되고, DMSO, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 수크로오스 등의 동결 보호제를 포함해도 된다.
본 개시의 조성물은, 전신에, 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, 조성물은, 영양 장애형 표피 수포증 환자의 환부에 투여된다. 본 명세서에 있어서, 환부란, 수포 또는 그 근방의 영역을 의미한다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 조성물은, 수포 부분의 피내 또는 수포내에 투여된다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 조성물은, 수포내에 투여된다. 본 명세서에 있어서, 수포내에 투여한다는 것은, 수포 부분의 표피 아래의 공간에 투여하는 것을 의미한다. 수포내로의 투여에 의해, 피내 또는 피하로의 투여와 비교하여, 환자의 고통을 경감시킬 수 있고, 또한 VII형 콜라겐을 기저막 근방에서 양호하게 발현시킬 수 있다. 1개소당에 투여되는 세포의 수는, 원하는 효과의 발휘에 필요한 양(유효량)이며, 당업자는 환자의 연령, 체중, 및 병상, 그리고 세포의 종류 및 유전자 개변 방법 등의 인자를 고려하여, 적절히 결정할 수 있다. 세포수는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어 1세포 내지 1×107세포, 1×10세포 내지 1×107세포, 1×102세포 내지 1×107세포, 1×103세포 내지 1×107세포, 1×104세포 내지 1×107세포, 1×105세포 내지 1×107세포, 1×105세포 내지 5×106세포, 5×105세포 내지 1×106세포 또는 1×105세포 내지 1×106세포이다. 어느 실시 형태에서는, 수포 1개당, 1세포 내지 1×107세포, 1×10세포 내지 1×107세포, 1×102세포 내지 1×107세포, 1×103세포 내지 1×107세포, 1×104세포 내지 1×107세포, 1×105세포 내지 1×107세포, 1×105세포 내지 5×106세포, 5×105세포 내지 1×106세포 또는 1×105세포 내지 1×106세포가 투여된다. 수포 1개당 투여량은, 수포를 원형 근사한 경우의 직경이 7 내지 8㎜인 것을 표준적인 수포로 하고, 상기 투여량을, 그 크기에 따라서 조정해도 된다.
본 발명의 예시적인 실시 형태를 이하에 기재한다.
[1]
영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포를 포함하고, 상기 세포가 간엽계 줄기 세포인, 조성물.
[2]
세포가, COL7A1 유전자를 도입함으로써 유전자 개변되어 있는, 상기 1에 기재된 조성물.
[3]
세포의 게놈에 COL7A1 유전자가 도입되어 있는, 상기 2에 기재된 조성물.
[4]
COL7A1 유전자가, 서열 번호 1의 핵산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 2 또는 3에 기재된 조성물.
[5]
간엽계 줄기 세포가, 골수 유래 간엽계 줄기 세포인, 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[6]
간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포에서 가장 많은 세포인, 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[7]
간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 또는 99% 이상을 차지하는, 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[8]
조성물이, 실질적으로 간엽계 줄기 세포 이외의 세포를 포함하지 않는, 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[9]
환부에 투여되는, 상기 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[10]
수포내에 투여되는, 상기 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[11]
게놈 편집에 의해 세포가 유전자 개변되어 있는, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[12]
게놈 편집이, CRISPR/Cas9에 의한, 상기 11에 기재된 조성물.
[13]
바이러스 벡터에 의해 세포가 유전자 개변되어 있는, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[14]
바이러스 벡터가, 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터인, 상기 13에 기재된 조성물.
[15]
바이러스 벡터가, 렌티 바이러스 벡터인, 상기 13 또는 14에 기재된 조성물.
[16]
영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 포함하고, 수포내에 투여되는, 조성물.
[17]
세포가, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 세포인, 상기 16에 기재된 조성물.
[18]
세포가, COL7A1 유전자를 도입함으로써 유전자 개변되어 있는, 상기 17에 기재된 조성물.
[19]
세포의 게놈에 COL7A1 유전자가 도입되어 있는, 상기 18에 기재된 조성물.
[20]
COL7A1 유전자가, 서열 번호 1의 핵산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 18 또는 19에 기재된 조성물.
[21]
세포가, 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포인, 상기 17 내지 20 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[22]
세포가, 골수로부터 얻은 세포인, 상기 16 내지 21 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[23]
세포가, 간엽계 줄기 세포인, 상기 16 내지 22 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[24]
간엽계 줄기 세포가, 골수 유래 간엽계 줄기 세포인, 상기 23에 기재된 조성물.
[25]
간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포에서 가장 많은 세포인, 상기 23 또는 24에 기재된 조성물.
[26]
간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 또는 99% 이상을 차지하는, 상기 23 내지 25 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[27]
조성물이, 실질적으로 간엽계 줄기 세포 이외의 세포를 포함하지 않는, 상기 23 내지 26 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[28]
게놈 편집에 의해 세포가 유전자 개변되어 있는, 상기 17 내지 27 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[29]
게놈 편집이, CRISPR/Cas9에 의한, 상기 28 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[30]
바이러스 벡터에 의해 세포가 유전자 개변되어 있는, 상기 17 내지 27 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[31]
바이러스 벡터가, 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터인, 상기 30에 기재된 조성물.
[32]
바이러스 벡터가, 렌티 바이러스 벡터인, 상기 30 또는 31에 기재된 조성물.
[33]
영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물의 제조 방법으로서,
VII형 콜라겐을 산생하도록 세포를 유전자 개변하는 것, 및
유전자 개변된 세포를 포함하는 조성물을 조제하는 것
을 포함하는 방법.
[34]
영양 장애형 표피 수포증을 치료하기 위한 방법으로서, VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 포함하는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
[35]
세포가, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 세포인, 상기 34에 기재된 방법.
[36]
세포가, COL7A1 유전자를 도입함으로써 유전자 개변되어 있는, 상기 35에 기재된 방법.
[37]
세포의 게놈에 COL7A1 유전자가 도입되어 있는, 상기 36에 기재된 방법.
[38]
COL7A1 유전자가, 서열 번호 1의 핵산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 36 또는 37에 기재된 방법.
[39]
게놈 편집에 의해 세포가 유전자 개변되어 있는, 상기 35 내지 38 중 어느 하나에 기재된 방법.
[40]
게놈 편집이, CRISPR/Cas9에 의한, 상기 39에 기재된 방법.
[41]
바이러스 벡터에 의해 세포가 유전자 개변되어 있는, 상기 35 내지 38 중 어느 하나에 기재된 방법.
[42]
바이러스 벡터가, 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터인, 상기 41에 기재된 방법.
[43]
바이러스 벡터가, 렌티 바이러스 벡터인, 상기 41 또는 42에 기재된 방법.
[44]
환자에의 투여에 앞서, VII형 콜라겐을 산생하도록 세포를 유전자 개변하는 것을 더 포함하는, 상기 35 내지 43 중 어느 하나에 기재된 방법.
[45]
COL7A1 유전자를 도입함으로써 세포를 유전자 개변하는, 상기 33 또는 44에 기재된 방법.
[46]
세포의 게놈에 COL7A1 유전자를 도입하는, 상기 45에 기재된 방법.
[47]
COL7A1 유전자가, 서열 번호 1의 핵산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 45 또는 46에 기재된 방법.
[48]
게놈 편집에 의해 세포를 유전자 개변하는, 상기 33 및 44 내지 47 중 어느 하나에 기재된 방법.
[49]
게놈 편집이, CRISPR/Cas9에 의한, 상기 48에 기재된 방법.
[50]
바이러스 벡터에 의해 세포를 유전자 개변하는, 상기 33 및 44 내지 47 중 어느 하나에 기재된 방법.
[51]
바이러스 벡터가, 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터인, 상기 50에 기재된 방법.
[52]
바이러스 벡터가, 렌티 바이러스 벡터인, 상기 50 또는 51에 기재된 방법.
[53]
세포가, 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포인, 상기 33 내지 52 중 어느 하나에 기재된 방법.
[54]
유전자 개변에 앞서, 영양 장애형 표피 수포증 환자로부터 세포를 얻는 것을 더 포함하는, 상기 33 및 44 내지 53 중 어느 하나에 기재된 방법.
[55]
세포가, 골수로부터 얻은 세포인, 상기 33 내지 54 중 어느 하나에 기재된 방법.
[56]
세포가, 간엽계 줄기 세포인, 상기 33 내지 55 중 어느 하나에 기재된 방법.
[57]
간엽계 줄기 세포가, 골수 유래 간엽계 줄기 세포인, 상기 56에 기재된 방법.
[58]
간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포에서 가장 많은 세포인, 상기 56 또는 57에 기재된 방법.
[59]
간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 또는 99% 이상을 차지하는, 상기 56 내지 58 중 어느 하나에 기재된 방법.
[60]
조성물이, 실질적으로 간엽계 줄기 세포 이외의 세포를 포함하지 않는, 상기 56 내지 59 중 어느 하나에 기재된 방법.
[61]
조성물이, 환부에 투여되는, 상기 34 내지 60 중 어느 하나에 기재된 방법.
[62]
조성물이, 수포내에 투여되는, 상기 34 내지 61 중 어느 하나에 기재된 방법.
[63]
영양 장애형 표피 수포증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포를 포함하는 조성물의 사용으로서, 상기 세포가 간엽계 줄기 세포를 포함하는, 사용.
[64]
영양 장애형 표피 수포증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 포함하는 조성물의 사용으로서, 조성물이 수포내에 투여되는, 사용.
[65]
영양 장애형 표피 수포증을 치료하기 위한, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포를 포함하는 조성물의 사용으로서, 상기 세포가 간엽계 줄기 세포를 포함하는, 사용.
[66]
영양 장애형 표피 수포증을 치료하기 위한, VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 포함하는 조성물의 사용으로서, 조성물이 수포내에 투여되는, 사용.
[67]
서열 번호 3 내지 5의 어느 것의 서열 또는 이것에 상보적인 서열을 포함하는, gRNA.
[68]
상기 67의 gRNA를 코드하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하에 기재되는 양태에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 게놈 편집의 설계
인간 게놈 내의 AAVS1(Adeno-associated virus integration site 1(아데노 연관 바이러스 인티그레이션 사이트 1)) 영역에 있어서 CRISPR-Cas9 시스템에 의한 절단 효율이 양호한 위치를 선택하기 위해서, 세 종류의 sgRNA를 제작했다. AAVS1 영역은, 유전자 도입에 의한 영향을 받기 어려운 안전 영역(세이프·하버/safe harbor)이다. CRISPR-Cas9 시스템은 「NGG」의 염기 서열을 인식하고, 그 3염기 상류를 절단하는 점에서, 말단에 「GG」가 배치되는 영역을 선택하고, 「NGG」의 상류 20염기의 서열을 포함하는 sgRNA(sgAAVS1-#1 내지 #3)를 설계했다(도 1, 상; 표 1).
Figure pct00001
서열 번호 3 내지 5의 어느 것의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 그 상보쇄를 어닐링한 후에 eSpCas9(1.1)(Addgene plasmid # 71814)의 Bbs1 사이트에 클로닝했다. 이 플라스미드(2.5㎍)를, 6웰 디쉬에 파종한 HEK293 세포(인간 태아 신장 세포주)에 Lipofectamin 3000(ThermoFisher Scientific)에 의해 도입했다. 트랜스펙션의 48시간 후, 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고, 표적 부위를 포함하는 영역을 PCR로 증폭했다. PCR 증폭 단편은 열처리에 의해 단일쇄로 하고, 천천히 냉각함으로써 어닐링시킨 후에, 미스매치 부위 특이적 엔도뉴클레아제로 처리했다. 이것을 전기 영동으로 분획하고, 게놈 절단에 의해 도입된 삽입 또는 결실 변이의 정도를 밴드의 농도로 측정하고, 이하의 계산식에 의해 게놈 편집 효율을 산출했다(식 중, a는 소화되지 않은 밴드 농도, b, c는 절단된 밴드 농도를 나타낸다).
Figure pct00002
sgAAVS1-#1 내지 #3의 어느 것의 sgRNA에 의해서도 컨트롤과는 다른 짧은 DNA 단편이 발생하고, 2중쇄 절단이 발생하는 것이 확인되었다(도 1, 아래). 이하의 실험에서는, 가장 절단 효율이 높았던 sgAAVS1-#3을 사용했다.
2. BM-MSC에의 COL7A1 유전자의 도입
AAVS1 영역으로의 COL7A1 유전자의 도입을 위해, CAG 프로모터의 제어 하에 COL7A1 유전자를 발현하는 플라스미드를 설계했다(도 2). COL7A1 cDNA는, Flexi ORF sequence-verified clone(Promega, Madison, WI, USA)으로부터 얻었다. COL7A1 cDNA를 pENTR1A 플라스미드(ThermoFisher Scientific)에 서브 클로닝하고, pENTR1A-COL7A1을 제작하고, LR 리콤비나아제(ThermoFisher Scientific)와 pAAVS-P-CAG-DEST(Addgene plasmid # 80490) 및 pENTR1A-COL7A1을 사용하여, pAAVS-P-CAG-COL7A1을 얻었다.
세포에 대하여 플라스미드의 양이 많아지면 도입 효율은 상승하지만 세포 생존율이 저하하기 때문에, 먼저, 세포 생존율과 도입 효율과의 양쪽이 양호해지는 실험 조건을 검토했다. 인간 골수 유래 간엽계 줄기 세포(BM-MSC)[PromoCell(Heide1berg, Germany) 또는 Lonza(Basel, Switzerland)](1×105 세포)에, pAAVS-P-CAG-COL7A1(0㎍, 0.25㎍, 0.5㎍ 또는 1.0㎍)과, sgAAVS1-#3을 발현하는 eSpCas9(1.1)(0㎍, 0.25㎍, 0.5㎍ 또는 1.0㎍)를, 일렉트로포레이션에 의해 도입했다. 트랜스펙션의 24시간 후에 모든 세포를 회수하고, 총 세포수에 대한 트리판 블루 염색 양성 세포(사세포)수로부터 생존율을 산출했다. 또한, 트랜스펙션의 48시간 후부터 BM-MSC를 0.5㎍/mL 퓨로마이신(Invivogen, San Diego, CA, USA)을 포함하는 배지로 약 2주일 배양해서 선택을 행하여, 단리된 콜로니수를 측정함으로써 게놈 편집의 효율을 검토했다. 도 3에 나타내는 결과에 기초하여, 이하의 실험에서는, pAAVS-P-CAG-COL7A1을 0.25㎍, eSpCas9(1.1)을 0.5㎍을 사용했다.
BM-MSC(1×105세포)에, pAAVS-P-CAG-COL7A1(0.25㎍)과 sgAAVS1-#3을 발현하는 eSpCas9(1.1)(0.5㎍)을, 일렉트로포레이션에 의해 도입했다. 트랜스펙션의 48시간 후, BM-MSC를 0.5㎍/mL 퓨로마이신(Invivogen, San Diego, CA, USA)을 포함하는 배지로 약 2주일 배양해서 선택을 행하였다. BM-MSC로부터 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 게놈 편집 및 COL7A1 유전자의 도입을 확인했다.
F1-R1 사이의 증폭에 의해 PCR 산물이 얻어진 점에서, 게놈 편집이 발생한 것이 확인되었다(도 4, F1-R1). 또한, F2-R2 사이의 PCR 산물에 있어서 야생형(WT)에는 존재하지 않는 긴 DNA가 검출된 점에서, COL7A1 유전자가 도입된 것이 나타났다(도 4, F2-R2). COL7A1 유전자는 대립 유전자의 한쪽(도 4, Monoallelic(단일 대립 형질)), 또는 양쪽(도 4, Biallelic(이중 대립 형질))에 도입되었다.
콜라겐은 분비 단백이며 세포 밖으로 흘러 나오는 점에서, 항VII형 콜라겐 항체(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용한 면역 염색 및 배양 상청의 웨스턴 블로팅에 의해, BM-MSC에 있어서의 VII형 콜라겐의 발현을 관찰했다. 도 5에 도시한 바와 같이, 유전자 개변 MSC에 있어서, VII형 콜라겐의 발현이 확인되었다.
3. 표피 수포증 모델 마우스에 있어서의 VII형 콜라겐의 발현
표피 수포증 모델 마우스에 대한 유전자 개변 MSC의 투여에 의한 VII형 콜라겐의 발현을 검토했다. 수포 형성을 나타내는 Col7A1 유전자 녹아웃 마우스(Col7a1-/-)의 신생아의 전체층 피부를 절제하고, 면역 부전 마우스(NOD-SCID)의 배면부에 이식했다. 이식 1주일 후, 상기 2의 유전자 개변 MSC를, 0.1 내지 1.0×106세포로 피하 또는 피내에 주입했다(도 6). 수포내 주입으로는, 이식 직후에 피부 표면을 집고, 또한 문지르는 것으로 수포를 형성시키고, 바로 표피 아래의 공간에 0.1 내지 1.0×106세포의 유전자 개변 MSC를 주입했다. 각각 주입의 4주일 후, 이식 피부를 절제하고, 항VII형 콜라겐 항체(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용한 면역 염색에 의해, VII형 콜라겐의 발현을 평가했다.
도 7에 도시한 바와 같이, 피내 주입 및 수포내 주입으로는 기저막 근방에 VII형 콜라겐의 발현이 확인되었지만, 피내 주입으로는 발현이 부분적이었다. 피하 주입으로는, 기저막과는 다른 심층 부분에서 콜라겐이 발현하고 있었다(도 8). 이들 결과로부터, 특히 수포내 주입에 의해 우수한 치료 효과를 기대할 수 있는 것이 나타났다.
또한, 상기와 마찬가지로 하여, 상기 2의 유전자 개변 MSC를 2.0×106세포로 수포내 주입했다. 4주일 후에 이식 피부를 절제하고, 전자 현미경으로 관찰한바, 앵커링 피브릴의 형성이 확인되었다(도 9).
SEQUENCE LISTING <110> OSAKA UNIVERSITY <120> Composition for use in treating dystrophic epidermolysis bullosa <130> 675347 <150> JP 2019-007201 <151> 2019-01-18 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8835 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgacgctgc ggcttctggt ggccgcgctc tgcgccggga tcctggcaga ggcgccccga 60 gtgcgagccc agcacaggga gagagtgacc tgcacgcgcc tttacgccgc tgacattgtg 120 ttcttactgg atggctcctc atccattggc cgcagcaatt tccgcgaggt ccgcagcttt 180 ctcgaagggc tggtgctgcc tttctctgga gcagccagtg cacagggtgt gcgctttgcc 240 acagtgcagt acagcgatga tccacggaca gagttcggcc tggatgcact tggctctggg 300 ggtgatgtga tccgcgccat ccgtgagctt agctacaagg ggggcaacac tcgcacaggg 360 gctgcaattc tccatgtggc tgaccatgtc ttcctgcccc agctggcccg acctggtgtc 420 cccaaggtct gcatcctgat cacagacggg aagtcccagg acctggtgga cacagctgcc 480 caaaggctga aggggcaggg ggtcaagcta tttgctgtgg ggatcaagaa tgctgaccct 540 gaggagctga agcgagttgc ctcacagccc accagtgact tcttcttctt cgtcaatgac 600 ttcagcatct tgaggacact actgcccctc gtttcccgga 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aaccgtggtt 1500 cccactggac cagagctgcc tgtgagccct gtaacagacc tgcaagccac cgagctgccc 1560 gggcagcggg tgcgagtgtc ctggagccca gtccctggtg ccacccagta ccgcatcatt 1620 gtgcgcagca cccagggggt tgagcggacc ctggtgcttc ctgggagtca gacagcattc 1680 gacttggatg acgttcaggc tgggcttagc tacactgtgc gggtgtctgc tcgagtgggt 1740 ccccgtgagg gcagtgccag tgtcctcact gtccgccggg agccggaaac tccacttgct 1800 gttccagggc tgcgggttgt ggtgtcagat gcaacgcgag tgagggtggc ctggggaccc 1860 gtccctggag ccagtggatt tcggattagc tggagcacag gcagtggtcc ggagtccagc 1920 cagacactgc ccccagactc tactgccaca gacatcacag ggctgcagcc tggaaccacc 1980 taccaggtgg ctgtgtcggt actgcgaggc agagaggagg gccctgctgc agtcatcgtg 2040 gctcgaacgg acccactggg cccagtgagg acggtccatg tgactcaggc cagcagctca 2100 tctgtcacca ttacctggac cagggttcct ggcgccacag gatacagggt ttcctggcac 2160 tcagcccacg gcccagagaa atcccagttg gtttctgggg aggccacggt ggctgagctg 2220 gatggactgg agccagatac tgagtatacg gtgcatgtga gggcccatgt ggctggcgtg 2280 gatgggcccc ctgcctctgt ggttgtgagg actgcccctg agcctgtggg 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cctaccacat 3180 gccactcaag acaatgctca ccgtgcggag gctacgagga gggtcctgga gcgtctggtg 3240 ttggcacttg ggcctcttgg gccacaggca gttcaggttg gcctgctgtc ttacagtcat 3300 cggccctccc cactgttccc actgaatggc tcccatgacc ttggcattat cttgcaaagg 3360 atccgtgaca tgccctacat ggacccaagt gggaacaacc tgggcacagc cgtggtcaca 3420 gctcacagat acatgttggc accagatgct cctgggcgcc gccagcacgt accaggggtg 3480 atggttctgc tagtggatga acccttgaga ggtgacatat tcagccccat ccgtgaggcc 3540 caggcttctg ggcttaatgt ggtgatgttg ggaatggctg gagcggaccc agagcagctg 3600 cgtcgcttgg cgccgggtat ggactctgtc cagaccttct tcgccgtgga tgatgggcca 3660 agcctggacc aggcagtcag tggtctggcc acagccctgt gtcaggcatc cttcactact 3720 cagccccggc cagagccctg cccagtgtat tgtccaaagg gccagaaggg ggaacctgga 3780 gagatgggcc tgagaggaca agttgggcct cctggcgacc ctggcctccc gggcaggacc 3840 ggtgctcccg gcccccaggg gccccctgga agtgccactg ccaagggcga gaggggcttc 3900 cctggagcag atgggcgtcc aggcagccct ggccgcgccg ggaatcctgg gacccctgga 3960 gcccctggcc taaagggctc tccagggttg cctggccctc gtggggaccc 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aggagacaag 7380 ggagaccctg gagtagggct gcctgggccc cgaggcgagc gtggggagcc aggcatccgg 7440 ggtgaagatg gccgccccgg ccaggaggga ccccgaggac tcacggggcc ccctggcagc 7500 aggggagagc gtggggagaa gggtgatgtt gggagtgcag gactaaaggg tgacaaggga 7560 gactcagctg tgatcctggg gcctccaggc ccacggggtg ccaaggggga catgggtgaa 7620 cgagggcctc ggggcttgga tggtgacaaa ggacctcggg gagacaatgg ggaccctggt 7680 gacaagggca gcaagggaga gcctggtgac aagggctcag ccgggttgcc aggactgcgt 7740 ggactcctgg gaccccaggg tcaacctggt gcagcaggga tccctggtga cccgggatcc 7800 ccaggaaagg atggagtgcc tggtatccga ggagaaaaag gagatgttgg cttcatgggt 7860 ccccggggcc tcaagggtga acggggagtg aagggagcct gtggccttga tggagagaag 7920 ggagacaagg gagaagctgg tcccccaggc cgccccgggc tggcaggaca caaaggagag 7980 atgggggagc ctggtgtgcc gggccagtcg ggggcccctg gcaaggaggg cctgatcggt 8040 cccaagggtg accgaggctt tgacgggcag ccaggcccca agggtgacca gggcgagaaa 8100 ggggagcggg gaaccccagg aattgggggc ttcccaggcc ccagtggaaa tgatggctct 8160 gctggtcccc cagggccacc tggcagtgtt ggtcccagag gccccgaagg acttcagggc 8220 cagaagggtg agcgaggtcc ccccggagag agagtggtgg gggctcctgg ggtccctgga 8280 gctcctggcg agagagggga gcaggggcgg ccagggcctg ccggtcctcg aggcgagaag 8340 ggagaagctg cactgacgga ggatgacatc cggggctttg tgcgccaaga gatgagtcag 8400 cactgtgcct gccagggcca gttcatcgca tctggatcac gacccctccc tagttatgct 8460 gcagacactg ccggctccca gctccatgct gtgcctgtgc tccgcgtctc tcatgcagag 8520 gaggaagagc gggtaccccc tgaggatgat gagtactctg aatactccga gtattctgtg 8580 gaggagtacc aggaccctga agctccttgg gatagtgatg acccctgttc cctgccactg 8640 gatgagggct cctgcactgc ctacaccctg cgctggtacc atcgggctgt gacaggcagc 8700 acagaggcct gtcacccttt tgtctatggt ggctgtggag ggaatgccaa ccgttttggg 8760 acccgtgagg cctgcgagcg ccgctgccca ccccgggtgg tccagagcca ggggacaggt 8820 actgcccagg actga 8835 <210> 2 <211> 2944 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Leu Arg Leu Leu Val Ala Ala Leu Cys Ala Gly Ile Leu Ala 1 5 10 15 Glu Ala Pro Arg Val Arg Ala Gln His Arg Glu Arg Val Thr Cys Thr 20 25 30 Arg Leu Tyr Ala Ala Asp Ile Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Gly Arg Ser Asn Phe Arg Glu Val Arg Ser Phe Leu Glu Gly Leu 50 55 60 Val Leu Pro Phe Ser Gly Ala Ala Ser Ala Gln Gly Val Arg Phe Ala 65 70 75 80 Thr Val Gln Tyr Ser Asp Asp Pro Arg Thr Glu Phe Gly Leu Asp Ala 85 90 95 Leu Gly Ser Gly Gly Asp Val Ile Arg Ala Ile Arg Glu Leu Ser Tyr 100 105 110 Lys Gly Gly Asn Thr Arg Thr Gly Ala Ala Ile Leu His Val Ala Asp 115 120 125 His Val Phe Leu Pro Gln Leu Ala Arg Pro Gly Val Pro Lys Val Cys 130 135 140 Ile Leu Ile Thr Asp Gly Lys Ser Gln Asp Leu Val Asp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Gln Arg Leu Lys Gly Gln Gly Val Lys Leu Phe Ala Val Gly Ile Lys 165 170 175 Asn Ala Asp Pro Glu Glu Leu Lys Arg Val Ala Ser Gln Pro Thr Ser 180 185 190 Asp Phe Phe Phe Phe Val Asn Asp Phe Ser Ile Leu Arg Thr Leu Leu 195 200 205 Pro Leu Val Ser Arg Arg Val Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Pro Val 210 215 220 Thr Arg Pro Pro Asp Asp Ser Thr Ser Ala Pro Arg Asp Leu Val Leu 225 230 235 240 Ser Glu Pro Ser Ser Gln Ser Leu Arg Val Gln Trp Thr Ala Ala Ser 245 250 255 Gly Pro Val Thr Gly Tyr Lys Val Gln Tyr Thr Pro Leu Thr Gly Leu 260 265 270 Gly Gln Pro Leu Pro Ser Glu Arg Gln Glu Val Asn Val Pro Ala Gly 275 280 285 Glu Thr Ser Val Arg Leu Arg Gly Leu Arg Pro Leu Thr Glu Tyr Gln 290 295 300 Val Thr Val Ile Ala Leu Tyr Ala Asn Ser Ile Gly Glu Ala Val Ser 305 310 315 320 Gly Thr Ala Arg Thr Thr Ala Leu Glu Gly Pro Glu Leu Thr Ile Gln 325 330 335 Asn Thr Thr Ala His Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Ser Val Pro Gly 340 345 350 Ala Thr Gly Tyr Arg Val Thr Trp Arg Val Leu Ser Gly Gly Pro Thr 355 360 365 Gln Gln Gln Glu Leu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Val Leu Leu Arg Asp 370 375 380 Leu Glu Pro Gly Thr Asp Tyr Glu Val Thr Val Ser Thr Leu Phe Gly 385 390 395 400 Arg Ser Val Gly Pro Ala Thr Ser Leu Met Ala Arg Thr Asp Ala Ser 405 410 415 Val Glu Gln Thr Leu Arg Pro Val Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ile Leu 420 425 430 Leu Ser Trp Asn Leu Val Pro Glu Ala Arg Gly Tyr Arg Leu Glu Trp 435 440 445 Arg Arg Glu Thr Gly Leu Glu Pro Pro Gln Lys Val Val Leu Pro Ser 450 455 460 Asp Val Thr Arg Tyr Gln Leu Asp Gly Leu Gln Pro Gly Thr Glu Tyr 465 470 475 480 Arg Leu Thr Leu Tyr Thr Leu Leu Glu Gly His Glu Val Ala Thr Pro 485 490 495 Ala Thr Val Val Pro Thr Gly Pro Glu Leu Pro Val Ser Pro Val Thr 500 505 510 Asp Leu Gln Ala Thr Glu Leu Pro Gly Gln Arg Val Arg Val Ser Trp 515 520 525 Ser Pro Val Pro Gly Ala Thr Gln Tyr Arg Ile Ile Val Arg Ser Thr 530 535 540 Gln Gly Val Glu Arg Thr Leu Val Leu Pro Gly Ser Gln Thr Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asp Asp Val Gln Ala Gly Leu Ser Tyr Thr Val Arg Val Ser 565 570 575 Ala Arg Val Gly Pro Arg Glu Gly Ser Ala Ser Val Leu Thr Val Arg 580 585 590 Arg Glu Pro Glu Thr Pro Leu Ala Val Pro Gly Leu Arg Val Val Val 595 600 605 Ser Asp Ala Thr Arg Val Arg Val Ala Trp Gly Pro Val Pro Gly Ala 610 615 620 Ser Gly Phe Arg Ile Ser Trp Ser Thr Gly Ser Gly Pro Glu Ser Ser 625 630 635 640 Gln Thr Leu Pro Pro Asp Ser Thr Ala Thr Asp Ile Thr Gly Leu Gln 645 650 655 Pro Gly Thr Thr Tyr Gln Val Ala Val Ser Val Leu Arg Gly Arg Glu 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Gly Pro Leu Gly Pro Gln Ala Val Gln Val Gly Leu Leu Ser Tyr 1085 1090 1095 Ser His Arg Pro Ser Pro Leu Phe Pro Leu Asn Gly Ser His Asp 1100 1105 1110 Leu Gly Ile Ile Leu Gln Arg Ile Arg Asp Met Pro Tyr Met Asp 1115 1120 1125 Pro Ser Gly Asn Asn Leu Gly Thr Ala Val Val Thr Ala His Arg 1130 1135 1140 Tyr Met Leu Ala Pro Asp Ala Pro Gly Arg Arg Gln His Val Pro 1145 1150 1155 Gly Val Met Val Leu Leu Val Asp Glu Pro Leu Arg Gly Asp Ile 1160 1165 1170 Phe Ser Pro Ile Arg Glu Ala Gln Ala Ser Gly Leu Asn Val Val 1175 1180 1185 Met Leu Gly Met Ala Gly Ala Asp Pro Glu Gln Leu Arg Arg Leu 1190 1195 1200 Ala Pro Gly Met Asp Ser Val Gln Thr Phe Phe Ala Val Asp Asp 1205 1210 1215 Gly Pro Ser Leu Asp Gln Ala Val Ser Gly Leu Ala Thr Ala Leu 1220 1225 1230 Cys Gln Ala Ser Phe Thr Thr Gln Pro Arg Pro Glu Pro Cys Pro 1235 1240 1245 Val Tyr Cys Pro Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Glu Met Gly 1250 1255 1260 Leu Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly 1265 1270 1275 Arg Thr Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ser Ala Thr 1280 1285 1290 Ala Lys Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Arg Pro Gly 1295 1300 1305 Ser Pro Gly Arg Ala Gly Asn Pro Gly Thr Pro Gly Ala Pro Gly 1310 1315 1320 Leu Lys Gly Ser Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Asp Pro Gly 1325 1330 1335 Glu Arg Gly Pro Arg Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly 1340 1345 1350 Gln Val Ile Gly Gly Glu Gly Pro Gly Leu Pro Gly Arg Lys Gly 1355 1360 1365 Asp Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Leu Gly 1370 1375 1380 Asp Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Thr Ala Met 1385 1390 1395 Lys Gly Asp Lys Gly Asp Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro 1400 1405 1410 Gly Glu Gly Gly Ile Ala Pro Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Leu 1415 1420 1425 Pro Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Lys 1430 1435 1440 Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ser Glu Asp Gly Ala Pro Gly Leu Pro 1445 1450 1455 Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Arg Gly Pro Pro 1460 1465 1470 Gly Ala Ile Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly Pro Leu 1475 1480 1485 Gly Glu Ala Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ala 1490 1495 1500 Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Arg Pro Gly Ala Lys 1505 1510 1515 Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Arg Gln Gly Glu Lys 1520 1525 1530 Gly Glu Pro Gly Arg Pro Gly Asp Pro Ala Val Val Gly Pro Ala 1535 1540 1545 Val Ala Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Asp Val Gly Pro Ala Gly 1550 1555 1560 Pro Arg Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly 1565 1570 1575 Leu Val Leu Pro Gly Asp Pro Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Asp 1580 1585 1590 Arg Gly Pro Ile Gly Leu Thr Gly Arg Ala Gly Pro Pro Gly Asp 1595 1600 1605 Ser Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Arg Pro Gly Pro 1610 1615 1620 Pro Gly Pro Val Gly Pro Arg Gly Arg Asp Gly Glu Val Gly Glu 1625 1630 1635 Lys Gly Asp Glu Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Lys 1640 1645 1650 Ala Gly Glu Arg Gly Leu Arg Gly Ala Pro Gly Val Arg Gly Pro 1655 1660 1665 Val Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly Asp Pro Gly Glu Asp Gly Arg 1670 1675 1680 Asn Gly Ser Pro Gly Ser Ser Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Glu 1685 1690 1695 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Leu Val Asp Thr Gly Pro 1700 1705 1710 Gly Ala Arg Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Arg Gly Gln Glu Gly 1715 1720 1725 Pro Arg Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly 1730 1735 1740 Glu Arg Gly Ile Glu Gly Phe Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly 1745 1750 1755 Asp Pro Gly Val Arg Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly 1760 1765 1770 Pro Pro Gly Leu Asp Gly Arg Ser Gly Leu Asp Gly Lys Pro Gly 1775 1780 1785 Ala Ala Gly Pro Ser Gly Pro Asn Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly 1790 1795 1800 Asp Pro Gly Arg Asp Gly Leu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Gln Gly 1805 1810 1815 Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Lys Pro Gly 1820 1825 1830 Glu Asp Gly Lys Pro Gly Leu Asn Gly Lys Asn Gly Glu Pro Gly 1835 1840 1845 Asp Pro Gly Glu Asp Gly Arg Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly 1850 1855 1860 Ala Ser Gly Arg Glu Gly Arg Asp Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly 1865 1870 1875 Ala Pro Gly Ile Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly 1880 1885 1890 Pro Val Gly Pro Pro Gly Gln Gly Phe Pro Gly Val Pro Gly Gly 1895 1900 1905 Thr Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Ser Lys Gly Glu 1910 1915 1920 Gln Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Leu Arg Gly Glu Pro Gly Ser 1925 1930 1935 Val Pro Asn Val Asp Arg Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ile Lys Ala 1940 1945 1950 Ser Ala Leu Arg Glu Ile Val Glu Thr Trp Asp Glu Ser Ser Gly 1955 1960 1965 Ser Phe Leu Pro Val Pro Glu Arg Arg Arg Gly Pro Lys Gly Asp 1970 1975 1980 Ser Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Glu Gly Pro Ile Gly Phe 1985 1990 1995 Pro Gly Glu Arg Gly Leu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Pro Gly Pro 2000 2005 2010 Gln Gly Pro Pro Gly Leu Ala Leu Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly 2015 2020 2025 Pro Ser Gly Leu Ala Gly Glu Pro Gly Lys Pro Gly Ile Pro Gly 2030 2035 2040 Leu Pro Gly Arg Ala Gly Gly Val Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly 2045 2050 2055 Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly 2060 2065 2070 Arg Asp Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly Pro Pro Gly 2075 2080 2085 Pro Pro Gly Pro Lys Val Ser Val Asp Glu Pro Gly Pro Gly Leu 2090 2095 2100 Ser Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Ala Lys Gly Glu 2105 2110 2115 Pro Gly Ser Asn Gly Asp Gln Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Val 2120 2125 2130 Pro Gly Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Gln 2135 2140 2145 Asp Gly Asn Pro Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Met Ala Gly Pro 2150 2155 2160 Glu Gly Lys Pro Gly Leu Gln Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro 2165 2170 2175 Val Gly Gly His Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Leu 2180 2185 2190 Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Leu Lys Gly Glu 2195 2200 2205 Pro Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly Arg Gly Leu Thr Gly Pro Thr 2210 2215 2220 Gly Ala Val Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Leu Val 2225 2230 2235 Gly Pro Gln Gly Ser Pro Gly Leu Pro Gly Gln Val Gly Glu Thr 2240 2245 2250 Gly Lys Pro Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Ala Ser Gly Lys Asp 2255 2260 2265 Gly Asp Arg Gly Ser Pro Gly Val Pro Gly Ser Pro Gly Leu Pro 2270 2275 2280 Gly Pro Val Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Ala Pro 2285 2290 2295 Gly Gln Ala Val Val Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Glu Lys Gly 2300 2305 2310 Ala Pro Gly Gly Leu Ala Gly Asp Leu Val Gly Glu Pro Gly Ala 2315 2320 2325 Lys Gly Asp Arg Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly Glu 2330 2335 2340 Ala Gly Arg Ala Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Glu Asp Gly Gln 2345 2350 2355 Lys Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Phe Lys Gly Asp Pro Gly Val 2360 2365 2370 Gly Val Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Lys 2375 2380 2385 Gly Asp Leu Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Val Val 2390 2395 2400 Gly Phe Pro Gly Gln Thr Gly Pro Arg Gly Glu Met Gly Gln Pro 2405 2410 2415 Gly Pro Ser Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Arg Glu 2420 2425 2430 Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Val 2435 2440 2445 Gly Pro Pro Gly Ala Ser Gly Leu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro 2450 2455 2460 Gly Val Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Glu Pro Gly 2465 2470 2475 Ile Arg Gly Glu Asp Gly Arg Pro Gly Gln Glu Gly Pro Arg Gly 2480 2485 2490 Leu Thr Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly 2495 2500 2505 Asp Val Gly Ser Ala Gly Leu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Ser Ala 2510 2515 2520 Val Ile Leu Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Lys Gly Asp Met 2525 2530 2535 Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Leu Asp Gly Asp Lys Gly Pro Arg 2540 2545 2550 Gly Asp Asn Gly Asp Pro Gly Asp Lys Gly Ser Lys Gly Glu Pro 2555 2560 2565 Gly Asp Lys Gly Ser Ala Gly Leu Pro Gly Leu Arg Gly Leu Leu 2570 2575 2580 Gly Pro Gln Gly Gln Pro Gly Ala Ala Gly Ile Pro Gly Asp Pro 2585 2590 2595 Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Pro Gly Ile Arg Gly Glu Lys 2600 2605 2610 Gly Asp Val Gly Phe Met Gly Pro Arg Gly Leu Lys Gly Glu Arg 2615 2620 2625 Gly Val Lys Gly Ala Cys Gly Leu Asp Gly Glu Lys Gly Asp Lys 2630 2635 2640 Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Arg Pro Gly Leu Ala Gly His Lys 2645 2650 2655 Gly Glu Met Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Gln Ser Gly Ala Pro 2660 2665 2670 Gly Lys Glu Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Asp 2675 2680 2685 Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Glu Arg 2690 2695 2700 Gly Thr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Ser Gly Asn Asp 2705 2710 2715 Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Val Gly Pro Arg 2720 2725 2730 Gly Pro Glu Gly Leu Gln Gly Gln Lys Gly Glu Arg Gly Pro Pro 2735 2740 2745 Gly Glu Arg Val Val Gly Ala Pro Gly Val Pro Gly Ala Pro Gly 2750 2755 2760 Glu Arg Gly Glu Gln Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly 2765 2770 2775 Glu Lys Gly Glu Ala Ala Leu Thr Glu Asp Asp Ile Arg Gly Phe 2780 2785 2790 Val Arg Gln Glu Met Ser Gln His Cys Ala Cys Gln Gly Gln Phe 2795 2800 2805 Ile Ala Ser Gly Ser Arg Pro Leu Pro Ser Tyr Ala Ala Asp Thr 2810 2815 2820 Ala Gly Ser Gln Leu His Ala Val Pro Val Leu Arg Val Ser His 2825 2830 2835 Ala Glu Glu Glu Glu Arg Val Pro Pro Glu Asp Asp Glu Tyr Ser 2840 2845 2850 Glu Tyr Ser Glu Tyr Ser Val Glu Glu Tyr Gln Asp Pro Glu Ala 2855 2860 2865 Pro Trp Asp Ser Asp Asp Pro Cys Ser Leu Pro Leu Asp Glu Gly 2870 2875 2880 Ser Cys Thr Ala Tyr Thr Leu Arg Trp Tyr His Arg Ala Val Thr 2885 2890 2895 Gly Ser Thr Glu Ala Cys His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gly 2900 2905 2910 Gly Asn Ala Asn Arg Phe Gly Thr Arg Glu Ala Cys Glu Arg Arg 2915 2920 2925 Cys Pro Pro Arg Val Val Gln Ser Gln Gly Thr Gly Thr Ala Gln 2930 2935 2940 Asp <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 accccacagt ggggccacta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtcaccaatc ctgtccctag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggggccacta gggacaggat 20

Claims (16)

  1. 영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물이며, VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포를 포함하고, 상기 세포가 간엽계 줄기 세포인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 COL7A1 유전자를 도입함으로써 유전자 개변되어 있는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, COL7A1 유전자가, 서열 번호 1의 핵산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽계 줄기 세포가, 골수 유래 간엽계 줄기 세포인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포에서 가장 많은 세포인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수포내에 투여되는, 조성물.
  7. 영양 장애형 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 조성물이며, VII형 콜라겐을 산생하는 세포를 포함하고, 수포내에 투여되는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 세포가 VII형 콜라겐을 산생하도록 유전자 개변된 세포인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 세포가 COL7A1 유전자를 도입함으로써 유전자 개변되어 있는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, COL7A1 유전자가, 서열 번호 1의 핵산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가, 영양 장애형 표피 수포증 환자의 세포인, 조성물.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가, 골수로부터 얻은 세포인, 조성물.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 간엽계 줄기 세포인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 간엽계 줄기 세포가, 골수 유래 간엽계 줄기 세포인, 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 간엽계 줄기 세포가, 조성물에 포함되는 세포에서 가장 많은 세포인, 조성물.
  16. 서열 번호 3 내지 5의 어느 것의 서열 또는 이것에 상보적인 서열을 포함하는, gRNA.
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