WO2023140349A1 - 細胞シート - Google Patents

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WO2023140349A1
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克人 玉井
康 菊池
智樹 玉越
尊彦 山崎
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国立大学法人大阪大学
株式会社ステムリム
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • Epidermolysis bullosa is a disease in which the adhesive structural molecules responsible for the adhesion of skin tissues are missing or lost, and when force is applied to the skin, the epidermis peels off from the dermis, resulting in blisters (blisters) and skin ulcers.
  • the disease type in which the epidermis is torn off and blisters is called simple epidermolysis bullosa
  • the disease type in which the separation between the epidermis and the basement membrane causes blisters is called junctional epidermolysis bullosa
  • the disease type in which the separation between the basement membrane and the dermis is called dystrophic epidermolysis bullosa.
  • Dystrophic epidermolysis bullosa is the most common disease type, accounting for about 50% of all epidermolysis bullosa, and is a genetic disease caused by mutations in the COL7A1 gene that encodes type VII collagen.
  • the epidermal basal cells at the very bottom of the epidermis are bound by a sheet-like structure called the basement membrane.
  • Type VII collagen forms fibers called anchoring fibrils in the dermis, connecting the basement membrane and the dermis. Therefore, if there is an abnormality in the type VII collagen gene, the adhesive function between the basement membrane and the dermis is impaired, resulting in dystrophic epidermolysis bullosa, in which blisters form between the basement membrane and the dermis.
  • dystrophic epidermolysis bullosa severe recessive dystrophic epidermolysis bullosa is an extremely serious hereditary blistering skin disease in which systemic burn-like skin symptoms continue immediately after birth, and cutaneous squamous cell carcinoma (scar cancer) frequently occurs at a high rate around the age of 30, leading to death.
  • scar cancer cutaneous squamous cell carcinoma
  • the present application provides a cell sheet effective for the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa.
  • One aspect of the cell sheet of the present invention is obtained from the bodily fluid in the blister of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa, and is composed of cells into which the type VII collagen gene has been introduced. This cell sheet is applied to the skin of patients with dystrophic epidermolysis bullosa.
  • the bodily fluid in the blisters of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa is seeded in a medium.
  • Cells adhering to the bottom of the culture vessel are then obtained.
  • the type VII collagen gene is introduced into these cells.
  • the cells into which the type VII collagen gene has been introduced are cultured.
  • the cultured cells are taken out from the culture vessel as a cell sheet.
  • the present invention is useful for treating dystrophic epidermolysis bullosa.
  • FIG. 1 is a process diagram showing an outline of the process of preparing a cell sheet from blister-derived cells.
  • FIG. 2 is a photograph showing the appearance of blister-derived cells up to 20 days after the start of culture.
  • FIG. 3 shows the results of FACS analysis of blister-derived cells and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 4 shows the results of culturing blister-derived cells of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells under conditions inducing differentiation into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes, followed by alkaline phosphatase (ALP) staining, Oil Red O staining, and Alcian Blue staining, respectively.
  • ALP alkaline phosphatase
  • FIG. 5 shows the amount of type VII collagen expressed and secreted by various cells.
  • FIG. 5 (top) is a photograph (left) showing the results of Western blotting of a cell lysate using an anti-type VII collagen antibody and a graph (right) quantifying the densities of the obtained bands.
  • FIG. 5 (bottom) is a photograph (left) showing the results of Western blotting of the medium in which the cells were cultured, and a graph (right) quantifying the densities of the obtained bands.
  • “KC” indicates human epidermal keratinocytes.
  • FB indicates human dermal fibroblasts.
  • MSC indicates human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • BFC indicates blister-derived cells.
  • FIG. 6 shows the cleavage of genomic DNA by the designed sgRNAs (sgAAVS1-#1 to #3) and the cleavage efficiency thereof.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of genome editing to introduce the COL7A1 gene into the AAVS1 region.
  • HA-R and HA-L are homologous sequence portions
  • SA is the splice acceptor sequence
  • T2A is the T2A sequence encoding the T2A peptide
  • Puro is the puromycin resistance gene
  • CAG is the CAG promoter sequence.
  • FIG. 8 shows the expression and secretion levels of type VII collagen after introduction of the COL7A1 gene into various cells using CRISPR-Cas9.
  • FIG. 8 (top) is a photograph (left) showing the results of Western blotting of a cell lysate using an anti-type VII collagen antibody, and a graph (right) quantifying the densities of the obtained bands.
  • FIG. 8 (bottom) is a photograph (left) showing the results of Western blotting of the medium in which the cells were cultured, and a graph (right) quantifying the densities of the obtained bands.
  • FB indicates human dermal fibroblasts.
  • MSC indicates human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • BFC indicates blister-derived cells.
  • FIG. 9 shows fluorescence micrographs after 72 hours of infection of various cells with a GFP lentiviral vector.
  • GFP is a photograph showing green fluorescence of cells.
  • “merge” is a superimposition of the bright field photograph on the "GFP” photograph. For “MOI 1", cells were infected with a lentiviral vector at MOI 1.
  • FIG. 10 is a graph showing the GFP-positive rate of cells 72 hours after each cell type was infected with a GFP lentiviral vector at MOI 1 .
  • Figure 11 is a plasmid map.
  • FIG. 11 (left) shows the structure of the plasmid pLVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 constructed by the present inventor.
  • FIG. 11 (left) shows the structure of the plasmid pLVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 constructed by the present inventor.
  • FIG. 11 shows the structure of the plasmid pLVSIN-PGK-COL7A1 constructed by the present inventors.
  • the pLVSIN vector is a SIN (self-inactivating) lentiviral vector plasmid that expresses the human collagen VII gene driven by the EF1 ⁇ promoter (left) or the PGK promoter (right).
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing the gene structure of the lentiviral vector produced by the present inventors.
  • the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 vector shown in FIG. 12 (upper) has the EF1 ⁇ promoter and the COL7A1 gene in the expression cassette.
  • FIG. 12 is a photograph of blister-derived cells immunostained with an anti-type VII collagen antibody 14 days after infection with the EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector.
  • DAPI is a picture of DAPI staining.
  • EEF1a-C7 is a photograph showing the results of immunostaining for type VII collagen.
  • MOI 0.5, MOI 1,” and MOI 2 cells were infected with lentiviral vectors at MOI 0.5, MOI 1, and MOI 2, respectively.
  • FIG. 14 is a photograph of blister-derived cells immunostained with an anti-type VII collagen antibody 14 days after infection with the PGK-COL7A1 lentiviral vector.
  • DAPI is a picture of DAPI staining.
  • PGK-C7 is a photograph showing the results of immunostaining for type VII collagen. For “mock”, cells were not infected with the lentiviral vector.
  • FIG. 15 shows the results of FACS analysis using an anti-type VII collagen antibody after infecting blister-derived cells with a type VII collagen gene-carrying lentiviral vector 14 days later.
  • blister-derived cells were infected with a lentiviral vector containing the EF1 ⁇ promoter and the COL7A1 gene in the expression cassette.
  • PGK-C7 blister-derived cells were infected with a lentiviral vector containing the PGK promoter and the COL7A1 gene in the expression cassette.
  • FIG. 16 is a graph quantifying the FACS data shown in FIG.
  • FIG. 16 (left) is a bar graph showing the rate of type VII collagen-positive cells.
  • FIG. 16 (right) is a bar graph showing the average fluorescence intensity of type VII collagen-positive cells.
  • FIG. 17 is a graph showing temporal changes in vector copy number in the genome of blister-derived cells infected with a lentiviral vector carrying a type VII collagen gene.
  • FIG. 18 (upper) is a photograph of the prepared cell sheet.
  • FIG. 18 (bottom row) is an illustration and photographs showing the procedure for transplanting the prepared cell sheet into an epidermolysis bullosa model mouse.
  • FIG. 18 (upper left) is a photograph of the prepared cell sheet being peeled off from the plate.
  • FIG. 18 (top middle) is a photograph of the cell sheet detached from the plate.
  • FIG. 18 (upper right) is a vertical cross-sectional photomicrograph of the prepared cell sheet stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 18 (bottom left) is an illustration showing a procedure for transplanting the prepared cell sheet into an epidermolysis bullosa model mouse.
  • FIG. 18 (second from the left in the lower row) is a photograph of an affected skin area of an epidermolysis bullosa model mouse.
  • FIG. 18 (second from the left in the lower row) is a photograph of an affected skin area of an epidermolysis bullosa model mouse.
  • FIG. 18 (second from the left in the lower row) is
  • FIG. 18 (second from the right in the lower row) is a photograph of the epidermis of the affected skin of the epidermolysis bullosa model mouse incised to expose the dermis.
  • FIG. 18 (bottom right) is a photograph immediately after the prepared cell sheet was applied to the wound site of the epidermolysis bullosa model mouse.
  • FIG. 19 shows a skin tomographic image of an epidermolysis bullosa model mouse in which the cell sheet was transplanted to the affected skin area.
  • DAPI is a picture of DAPI staining.
  • COL7 is a photograph showing the results of immunostaining for type VII collagen.
  • “Merge” is a superimposition of the results of DAPI staining and the results of immunostaining for type VII collagen.
  • Cell sheet transplantation indicates the results of transplanting a cell sheet prepared from blister-derived cells into which the COL7A1 gene was introduced using CRISPR-Cas9 into the affected skin area.
  • Cell suspension intradermal administration indicates the results of intradermal administration of a suspension of blister-derived cells into which the COL7A1 gene was introduced using CRISPR-Cas9 to the affected skin area.
  • FIG. 20 is a photograph showing results similar to FIG. 19, and is a micrograph at a higher magnification than FIG. FIG.
  • FIG. 21 is a graph showing the fluorescence intensity after type VII collagen immunostaining was performed on the skin 4 weeks after transplantation of the blister-derived cell sheet into the affected skin of epidermolysis bullosa model mice.
  • FIG. 22 is a photograph of in situ hybridization and immunostaining of the skin of an epidermolysis bullosa model mouse in which the cell sheet was transplanted to the affected skin area.
  • "Bright Field” is a bright field photograph in which probes complementary to collagen VII mRNA are visualized.
  • DAPI is a picture of DAPI staining.
  • COL7 is a photograph showing the results of immunostaining for type VII collagen.
  • "Probe” indicates the fluorescent label of the probe.
  • FIG. 23 shows the results of an experiment similar to that of FIG. 22 performed on another epidermolysis bullosa model mouse.
  • FIG. 24 is an electron micrograph of the skin of an epidermolysis bullosa model mouse in which the cell sheet was transplanted to the affected skin area.
  • Cell sheet transplantation indicates the results of transplanting a cell sheet prepared from blister-derived cells into which the COL7A1 gene was introduced using CRISPR-Cas9 into the affected skin area.
  • FIG. 25 shows a skin tomographic image of an epidermolysis bullosa model mouse in which the cell sheet was transplanted to the affected skin area.
  • LVSIN-EF1 ⁇ -COL7 cell sheet shows the results of transplanting a cell sheet made of blister-derived cells infected with a lentiviral vector containing the EF1 ⁇ promoter and COL7A1 gene in the expression cassette into the affected skin area.
  • “LVSIN-PGK-COL7 cell sheet” shows the results of transplanting a cell sheet made of blister-derived cells infected with a lentiviral vector having a PGK promoter and COL7A1 gene in an expression cassette into an affected skin area.
  • FIG. 26 (left) is a graph showing the deposition distance of type VII collagen in the basement membrane 4 weeks after transplantation of a cell sheet prepared from blister-derived cells transfected with the COL7A1 gene with a lentiviral vector into the affected skin area, or after intradermal administration of a suspension of blister-derived cells transfected with the COL7A1 gene with a lentiviral vector into the affected skin area.
  • FIG. 26 (right) is a graph showing fluorescence intensity.
  • One embodiment of the present disclosure relates to cell sheets.
  • This cell sheet contains cells derived from fluid within the bulla of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa. A type VII collagen gene has been introduced into this cell. This cell sheet is transplanted into the skin of patients with dystrophic epidermolysis bullosa.
  • a type VII collagen gene expression cassette is preferably introduced into the cells.
  • the type VII collagen gene expression cassette preferably contains the EF1 ⁇ promoter and the COL7A1 gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter.
  • the cells overlap in the thickness direction of the sheet, that is, in the normal direction.
  • the cells preferably form a plurality of layers.
  • the thickness of the cell sheet is preferably about 5-50 ⁇ m, more preferably about 10-25 ⁇ m. With this thickness, the mechanical strength of the cell sheet can be ensured, and sufficient oxygen is supplied to the cells inside the sheet.
  • the cell density near the surface of the sheet is preferably higher than the cell density in the center of the sheet. Further, on both surfaces of the cell sheet, it is more preferable that the cell density near the surface is higher than the cell density in the central part of the sheet.
  • the central portion of the sheet is exemplified by a portion positioned just midway between one surface and the other surface of the sheet.
  • Dystrophic epidermolysis bullosa is a genetic disease caused by mutations in the COL7A1 gene that encodes type VII collagen. It is known to be characterized by either no type VII collagen being produced or the production of type VII collagen with reduced function due to the mutation.
  • Type VII collagen forms fibers called anchoring fibrils in the dermis, connecting the basement membrane and the dermis.
  • Type VII collagen comprises a first non-collagen region, a collagen region, and a second non-collagen region from the N-terminus, forms a triple strand in the collagen region part characterized by a repeating sequence of glycine-X-Y, binds two molecules at the C-terminus, and binds to the basement membrane at the N-terminus.
  • Mutations include mutations in which glycine in the collagen region is replaced with other amino acids, termination codon mutations that stop protein translation, and splice site mutations. Mutations may be in one or both alleles.
  • Dystrophic epidermolysis bullosa includes dominant dystrophic type and recessive dystrophic type, and recessive dystrophic type includes severe generalized type and other generalized types with relatively mild symptoms.
  • Dystrophic epidermolysis bullosa in the present specification may be any type of dystrophic epidermolysis bullosa, and may be caused by any mutation in the COL7A1 gene.
  • a blister is an accumulation of fluid such as body fluid or interstitial fluid under the epidermis.
  • the blister is in the form of a fluid-filled space formed between the epidermis and the dermis due to detachment of the epidermis from the dermis.
  • the blister is a blister in the form of a fluid-filled space formed between the basement membrane of the epidermis and the dermis by detachment of the basement membrane from the dermis.
  • blister-derived cells of dystrophic epidermolysis bullosa patients refer to adherent cells collected from the blister of dystrophic epidermolysis bullosa patients, and are also referred to as "DEB patient blister-derived cells” or "blister-derived cells” in the present disclosure.
  • the cells can be obtained by culturing the blister contents of patients with dystrophic epidermolysis bullosa on a solid phase.
  • the blister content is fluid that has accumulated within the blister (ie, fluid within the blister), which is also referred to herein as "intrablister solution.”
  • the blister contents can be collected from the blister of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa by means of a syringe or the like.
  • the blister solution in the case of a blister solution, can be aspirated into the syringe of the syringe by piercing the injection needle into the blister and pulling the plunger of the syringe while the tip of the injection needle is positioned in the space formed between the epidermis and the dermis.
  • the blister-derived cells can be obtained by inoculating a blister-derived cell solution in a medium without treating it with an enzyme such as collagenase or dispase and culturing it on a solid phase.
  • the blister-derived solution collected from the blister is directly seeded in a medium, the medium is incubated on the solid phase for a predetermined period of time, and the cells adhering to the solid phase can be used as blister-derived cells. At this time, it is preferable to obtain cells that have formed colonies on the solid phase.
  • the blister solution is preferably sown in the medium within 3 hours, more preferably within 2 hours, and even more preferably within 1 hour after collection.
  • a solid phase means a solid support to which cells can adhere, and includes, for example, plastic or glass culture vessels such as culture dishes, flasks, and multiwell plates. In one embodiment, the solid phase is a plastic culture vessel.
  • the solid phase may be coated, and examples of substances for coating include collagen I, laminin, vitronectin, fibronectin, poly-L-lysine, poly-L-ornithine, and the like.
  • the solid phase is coated with collagen I. Cultivation can be performed in a general incubator under conditions such as "37°C, 5% CO2 ", "37°C, 5% O2 , 5% CO2 ".
  • the culture medium may be any medium that can be used for culturing animal cells, and examples thereof include MEM, MEM ⁇ , DMEM, GMEM, RPMI 1640, MesenCult TM (STEMCELL Technologies), Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell), MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (Lonza Culture), Cellartis MSC Xeno-Free Medium (Takara Bio), and mixed media thereof.
  • media for mesenchymal stem cells such as MesenCult TM , Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2, MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium, and Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium are preferably used.
  • the medium is preferably a serum-free medium.
  • the culture period may be any period of time sufficient for the cells to adhere to the solid phase, for example, 1 day to several months (e.g. 2, 3 or 4 months), 1 day to 1 month, 1 day to several weeks (e.g. 2, 3 or 4 weeks), 1 day to 1 week.
  • the DEB patient blister-derived cells have one or more characteristics selected from 1) to 6) below: 1) having adhesion to the solid phase; 2) positive for one or more surface markers selected from the group consisting of CD73, CD105 and CD90; 3) negative for one or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79A, HLA-DR and CD31; 4) have no ability to differentiate into osteoblasts, or have lower differentiation ability than bone marrow-derived mesenchymal stem cells; 5) have no ability to differentiate into adipocytes, or have lower differentiation ability than bone marrow-derived mesenchymal stem cells; 6) They do not have the ability to differentiate into chondrocytes, or their differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • a cell when a cell is "not capable of differentiating" into osteoblasts, adipocytes or chondrocytes, it means that differentiation into osteoblasts, adipocytes or chondrocytes cannot be detected using normal differentiation induction conditions and detection methods (such as staining).
  • the DEB patient blister-derived cells are CD73-positive, CD105-positive, and CD90-positive cells.
  • the DEB patient blister-derived cells are CD45-negative, CD34-negative, CD11b-negative, CD79A-negative, HLA-DR-negative, and CD31-negative cells.
  • the DEB patient blister-derived cells are cells that have a lower ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes compared to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • blister-derived cells of patients with dystrophic epidermolysis bullosa that are genetically modified to produce type VII collagen are used.
  • a "cell genetically modified to produce type VII collagen” in the present disclosure means a cell genetically modified to produce functional (ie, capable of forming anchoring fibrils) type VII collagen.
  • genetic modification of cells means both modification of genes in the genome of cells and modification of cells to express genes from extragenomic nucleic acid constructs (eg, vectors). That is, the expression “genetically modified to produce type VII collagen” includes modification of cells to express type VII collagen from the COL7A1 gene in the genome and modification of cells to express type VII collagen from the COL7A1 gene of the extragenomic nucleic acid construct. In addition, “genetically modified cells to produce type VII collagen” include cells that express type VII collagen from the COL7A1 gene in the genome and cells that express type VII collagen from the COL7A1 gene of the extragenomic nucleic acid construct.
  • Genetic modification of cells can be performed by introducing the COL7A1 gene or by correcting mutations in the COL7A1 gene in the genome.
  • the present disclosure uses cells transfected with the COL7A1 gene.
  • Introduction of the COL7A1 gene can be carried out by introducing the COL7A1 gene into the genome of the cell, or by allowing a nucleic acid construct containing the COL7A1 gene to exist in the cell so that the COL7A1 gene is expressed from an extragenomic nucleic acid construct.
  • the COL7A1 gene When the COL7A1 gene is introduced into the cell genome, it may be introduced at a specific position or randomly.
  • the COL7A1 gene is introduced into the genome at the COL7A1 locus, or a safe harbor such as the AAVS1 region.
  • the DEB patient blister-derived cells may be cells of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa to whom the cells are administered (i.e., autologous cells), or cells of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa other than the patient who receives the cells (i.e., allogeneic cells).
  • Cells of dystrophic epidermolysis bullosa patients include cells that do not produce type VII collagen and cells that produce type VII collagen but whose function is reduced due to mutation.
  • DEB patient blister-derived cells should be cells that can produce type VII collagen near the epidermal basement membrane when administered to patients.
  • the term "cells” is used in the sense of including those that have been proliferated as necessary. Proliferation of cells can be performed by culturing the cells. For example, "blister-derived cells (of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa)" include those obtained from the patient and then expanded, and “genetically modified cells” include those obtained by genetic modification manipulation and grown. If genetic modification is performed, the cells may be grown until the quantity required for the genetic modification is obtained. Also, after genetic modification, the cells may be grown to obtain therapeutic quantities.
  • cell can mean one cell or a plurality of cells depending on the context. Moreover, the cells may be a cell population consisting of one type of cells, or a cell population containing multiple types of cells.
  • type VII collagen gene or COL7A1 gene means a nucleic acid sequence encoding type VII collagen, and cDNA is also used to include sequences containing one or more introns (e.g., genomic sequences or minigenes).
  • a representative nucleic acid sequence of human COL7A1 gene (cDNA) is shown in SEQ ID NO: 1, and a representative amino acid sequence of human type VII collagen is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the cDNA sequence of the COL7A1 gene is disclosed in GenBank: NM_000094.3 and the genomic sequence in GenBank: AC121252.4.
  • the sequence of the COL7A1 gene is not limited as long as it encodes a functional type VII collagen (that is, capable of forming anchoring fibrils).
  • cDNA sequence of human COL7A1 gene (8835 bp) (SEQ ID NO: 1) Amino acid sequence of human collagen VII (2944 AA) (SEQ ID NO: 2) *
  • the COL7A1 gene comprises or consists of a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the COL7A1 gene comprises or consists of a nucleic acid sequence in which 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 to 2 or 1 bases are inserted, deleted, substituted or added to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the COL7A1 gene comprises or consists of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • type VII collagen comprises or consists of an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • type VII collagen comprises or consists of an amino acid sequence in which 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid residue is inserted, deleted, substituted, or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • the type VII collagen comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • the COL7A1 gene comprises or consists of a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • the COL7A1 gene comprises or consists of a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence in which 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid residue is inserted, deleted, substituted, or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • sequence identity with respect to a nucleic acid sequence or an amino acid sequence means the proportion of identical bases or amino acid residues between two sequences that are optimally aligned (maximum matching) over the entire region of the sequences to be compared.
  • sequences to be compared may have insertions, additions or deletions (eg, gaps, etc.) in the optimal alignment of the two sequences.
  • Sequence identity can be calculated using programs such as FASTA, BLAST, and CLUSTAL W provided in public databases (eg, DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp)). Alternatively, it can be determined using commercially available sequence analysis software (eg, Vector NTI® software, GENETYX® ver. 12).
  • the method of genetically modifying cells is not particularly limited.
  • the cells are genetically modified by genome editing such as CRISPR systems (eg, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1), TALENs, ZFNs.
  • the cells are genetically modified with viral vectors such as retroviral vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors.
  • the cells are genetically modified with CRISPR/Cas9.
  • the cells are genetically modified with retroviral or lentiviral vectors.
  • the sequence can be inserted into the cleavage site of the genome by cutting the genome and introducing a donor vector containing the target sequence into the cell.
  • the sequence to be inserted into the genome can be the COL7A1 gene or a sequence (eg, a partial sequence of the COL7A1 gene) for replacement with the mutation-containing site of the COL7A1 gene.
  • the donor vector may contain regulatory sequences such as promoters and enhancers that control the expression of the sequence of interest, and other elements such as drug resistance genes for cell selection, and may contain sequences homologous to both ends of the insertion site in the genome at both ends.
  • the donor vector can be introduced at the desired site by non-homologous end joining or homologous recombination.
  • Plasmids and viral vectors such as adeno-associated viral vectors and integrase-deficient lentiviral vectors can be used as donor vectors.
  • endonucleases such as Cas9 or Cas12 (e.g., Cas12a (also called Cpf1), Cas12b, Cas12e) recognize a specific base sequence, the PAM sequence, and the action of the endonuclease cuts the double strand of the target DNA. If the endonuclease is Cas9, it cuts approximately 3-4 bases upstream of the PAM sequence.
  • Endonucleases include S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis, S. thermophilus, or Cas9 of T. denticola, Cpfl of L. bacterium ND2006 or Acidaminococcus sp. BV3L6, and the like.
  • the PAM sequence is endonuclease dependent, eg the PAM sequence of Cas9 of S. pyogenes is NGG.
  • the gRNA contains a sequence of about 20 bases upstream of the PAM sequence (target sequence) or a sequence complementary thereto on the 5' end side, and serves to recruit an endonuclease to the target sequence.
  • the sequence of the portion of the gRNA other than the target sequence (or the sequence complementary thereto) can be appropriately determined by those skilled in the art according to the endonuclease to be used.
  • the gRNA can include crRNA (CRISPR RNA) that contains the target sequence or a sequence complementary thereto and is responsible for the sequence specificity of the gRNA, and tracrRNA (Trans-activating crRNA) that forms a double strand and contributes to complex formation with Cas9.
  • crRNA and tracrRNA may exist as separate molecules.
  • the endonuclease is Cpf1
  • only crRNA functions as gRNA.
  • gRNA containing elements necessary for gRNA function on a single strand may be specifically referred to as sgRNA.
  • the gRNA sequence can be determined by tools available for target sequence selection and gRNA design, such as CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/).
  • a vector containing a nucleic acid sequence encoding a gRNA and a nucleic acid sequence encoding an endonuclease may be introduced into a cell and expressed, or gRNA produced outside the cell and the endonuclease protein may be introduced into the cell.
  • the endonuclease may have a nuclear localization signal.
  • the nucleic acid sequence encoding the gRNA and the nucleic acid sequence encoding the endonuclease may be present on separate vectors.
  • Vectors, gRNAs and endonucleases can be introduced into cells by lipofection, electroporation, microinjection, calcium phosphate method, DEAE-dextran method and the like, but are not limited to these methods.
  • the gRNA that can be used to introduce the COL7A1 gene into the genome comprises any of SEQ ID NOS: 3-5 or a sequence complementary thereto.
  • the COL7A1 gene can be introduced into the cell genome using a retroviral vector or lentiviral vector with integrase activity.
  • Retroviral and lentiviral vectors may be integrase-deficient.
  • An integrase-deficient vector lacks integrase activity, for example, due to mutation of the integrase gene.
  • adenoviral vectors or adeno-associated viral vectors sequences incorporated into the vector are not usually introduced into the genome of the cell.
  • type VII collagen is expressed from the intracellular (nuclear) vector COL7A1 gene.
  • a viral vector contains a sequence encoding the COL7A1 gene, and may contain regulatory sequences such as promoters and enhancers that control the expression of the COL7A1 gene, and other elements such as drug resistance genes for cell selection.
  • Viral vectors may be produced by any method known in the art. For example, retroviral and lentiviral vectors can be generated by introducing a viral vector plasmid containing flanking LTR sequences (5'LTR and 3'LTR), a packaging signal, and a sequence of interest into packaging cells along with one or more plasmid vectors expressing viral structural proteins such as Gag, Pol, Env, or into packaging cells expressing these structural proteins.
  • Packaging cells include, but are not limited to, 293T cells, 293 cells, HeLa cells, COS1 cells, COS7 cells, and the like.
  • Viral vectors may be pseudotyped and may, for example, express an envelope protein such as the vesicular stomatitis virus G protein (VSV-G).
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G protein
  • the viral vector is a lentiviral vector.
  • Lentiviral vectors include HIV (human immunodeficiency virus) (e.g., HIV-1 and HIV-2), SIV (simian immunodeficiency virus), FIV (feline immunodeficiency virus), MVV (Maedi-Visna virus), EV1 (Maedi-Visna-like virus), EIAV (equine infectious anemia virus), and CAEV (caprine arthritis encephalitis virus). virus), but are not limited to these.
  • the lentiviral vector is HIV.
  • a lentiviral vector can be produced as follows. First, a viral vector plasmid encoding the viral genome and one or more plasmid vectors expressing Gag, Pol, and Rev (and optionally Tat) and one or more plasmid vectors expressing envelope proteins such as VSV-G are introduced into packaging cells.
  • the viral vector plasmid contains flanking LTR sequences (5'LTR and 3'LTR), a packaging signal, and the COL7A1 gene and a promoter (eg, CMV promoter, CAG promoter, EF1 ⁇ promoter, PGK promoter, or hCEF promoter) that controls its expression.
  • the 5'LTR functions as a promoter that induces transcription of the viral RNA genome, but may be replaced with another promoter such as the CMV promoter to enhance expression of the RNA genome.
  • the viral RNA genome is transcribed from the vector plasmid and packaged to form the viral core.
  • the viral core is transported to the plasma membrane of the packaging cell, encapsulated in the plasma membrane, and released from the packaging cell as viral particles.
  • the released viral particles can be recovered from the culture supernatant of packaging cells. For example, viral particles can be recovered by conventional purification methods such as centrifugation, filter filtration, and column purification.
  • Lentiviral vectors can also be produced using kits such as Lentiviral High Titer Packaging Mix, Lenti-X TM Packaging Single Shots (Takara Bio Inc.), and ViraSafe TM Lentiviral Complete Expression System (Cell Biolabs Inc.).
  • Adeno-associated virus vectors can be produced using kits such as AAVpro (registered trademark) Helper Free System (Takara Bio Inc.).
  • the present disclosure provides a plasmid used for the production of a lentiviral vector, the plasmid having an EF1 ⁇ promoter and a COL7A1 gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter.
  • the disclosure provides a lentiviral vector having an EF1 ⁇ promoter and a COL7A1 gene located downstream of said EF1 ⁇ promoter.
  • EF1 ⁇ promoter (SEQ ID NO: 6)
  • the EF1 ⁇ promoter comprises or consists of a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:6.
  • the EF1 ⁇ promoter comprises or consists of a nucleic acid sequence in which 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 or 1 bases are inserted, deleted, substituted or added to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:6.
  • the EF1 ⁇ promoter comprises or consists of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:6.
  • Cells into which the desired sequence has been introduced can be confirmed by Southern blotting or PCR.
  • the sequence of interest should be introduced into at least one of the alleles.
  • the cell sheet is transplanted into the affected area of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa.
  • the cell sheet is transplanted into the epidermis-deficient portion of the skin.
  • a specific example of the epidermis-deficient portion of the skin is an ulcerated surface of the skin.
  • the cell sheet may be transplanted to a portion where the epidermis has separated from the dermis.
  • the cell sheet is transplanted by applying it to the affected skin area. At that time, it is preferable to apply the cell sheet to the affected area so that the cell sheet adheres to the dermis.
  • one aspect of the present disclosure is a method for treating dystrophic epidermolysis bullosa, comprising transplanting a cell sheet of the present disclosure into the skin of a dystrophic epidermolysis bullosa patient.
  • compositions comprising the cell sheet of the present disclosure.
  • the composition may be used to treat dystrophic epidermolysis bullosa.
  • the composition may contain a pharmaceutically acceptable medium and/or additives in addition to the cell sheet.
  • Pharmaceutically acceptable vehicles include water, media, saline, infusion solutions containing glucose, D-sorbitol, D-mannitol, and the like, phosphate buffered saline (PBS), and the like.
  • Additives include solubilizers, stabilizers, preservatives and the like.
  • the composition may be frozen and may contain cryoprotectants such as DMSO, glycerol, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, dextran, sucrose and the like.
  • FIG. 1 shows an outline of the cell sheet manufacturing method.
  • the outline of each step is as follows. 1. Fluid in the blister is collected from a patient with dystrophic epidermolysis bullosa. 2. At least a portion of the collected bodily fluid is inoculated into a culture medium and cultured. 3. Obtain cells attached to the bottom of the culture vessel. The cells are then subcultured as necessary. 4. A type VII collagen gene is introduced into the obtained cells. 5. Cells into which the type VII collagen gene has been introduced are cultured and, if necessary, subcultured. 6. Cells into which the type VII collagen gene has been introduced are seeded in a culture vessel. 7. The cultured cells are taken out as a cell sheet from the culture vessel.
  • At least part of the collected bodily fluid is seeded in a medium and cultured.
  • At least a portion of the bodily fluid refers to one component of the bodily fluid.
  • One component includes the sediment after centrifuging the bodily fluid. Fractions obtained using devices capable of separating specific cells, such as magnetic beads and flow cytometers, are also included as one component.
  • the bodily fluid within the blister, a component of the bodily fluid, or the cells obtained from the bodily fluid be seeded into the medium without enzymatic treatment. Since the seeding and culturing methods have been described above, they will be omitted.
  • Adherent Cell Subculture After seeding and culturing, cells adhering to the bottom of the culture vessel are obtained. Then, if necessary, cells are passaged repeatedly as appropriate. This yields the number of cells required for gene transfer. In the middle of subculturing, the cells can also be frozen and preserved, if necessary.
  • the cryopreservation of blister-derived cells can be performed using a general cell cryopreservation medium and a general work process.
  • the cryopreservation solution may be any solution that can be used for cryopreservation of animal cells.
  • cryopreservation solutions for stem cells such as STEM-CELLBANKER GMP grade and HSC-BANKER (registered trademark) GMP grade are preferably used.
  • the cell cryopreservation medium is preferably serum-free.
  • a type VII collagen gene is introduced into the subcultured cells. Since the gene introduction method has been described above, it will be omitted.
  • a lentiviral vector is preferably used to introduce the type VII collagen gene into the blister-derived cells.
  • the cells into which the type VII collagen gene has been introduced are cultured, and if necessary, the cells are passaged repeatedly. As a result, the number of cells necessary for making a cell sheet can be obtained. In addition, the cells can be frozen and preserved during subculturing, if necessary. For cryopreservation of cells, the cryopreservation solution described above can be used.
  • Blister-derived cells into which the type VII collagen gene has been introduced are sown in a culture vessel. At this time, the cells are preferably seeded in the culture vessel so as to be over-confluent. Specifically, the cells are preferably sown at a confluency of 150% or higher, more preferably at a confluency of 300% or higher, and even more preferably at a confluency of 600% or higher. By seeding cells at such a confluency, a layered cell sheet suitable for sheet transplantation can be obtained.
  • the blister-derived cells into which the type VII collagen gene has been introduced are preferably seeded in a culture vessel at a cell density of 1x10 4 cells/cm 2 or higher, more preferably 5x10 4 cells/cm 2 or higher, and even more preferably 1x10 5 cells/cm 2 or higher.
  • the cells are seeded at such a density, the number of cell layers in the cell sheet becomes optimal, the mechanical strength is excellent, and the cells inside the cell sheet are well oxygenated.
  • a normal culture vessel whose surface is made of polystyrene can be used as the culture vessel. That is, it is not necessary to use a temperature-responsive culture vessel.
  • the present inventors discovered that blister-derived cells can be detached from the bottom of a culture vessel without using a temperature-responsive culture vessel.
  • blister-derived cells may be cultured in a temperature-responsive culture vessel.
  • the temperature-responsive culture vessel includes a culture vessel whose surface is processed with a temperature-responsive polymer.
  • a temperature-responsive polymer changes from hydrophobic to hydrophilic at a certain temperature, eg, 32°C. Therefore, for example, at 37° C., cells adhere to the temperature-responsive polymer, and when the temperature is lowered to, for example, 20° C., the cells can no longer adhere to the temperature-responsive polymer and are detached from the bottom of the culture vessel.
  • the cultured blister-derived cells are extracted from the culture container as a cell sheet.
  • the present inventors have discovered that blister-derived cells can be detached as a cell sheet from a culture vessel without being treated with an enzyme such as trypsin or dispase.
  • a cell sheet composed of blister-derived cells can be peeled off and removed from the bottom of a normal culture vessel, which is not a temperature-responsive culture vessel, using only tweezers.
  • a cell sheet may be prepared using a temperature-responsive culture vessel, and the cell sheet may be detached and taken out by lowering the temperature of the vessel.
  • a support means a membrane or sheet material to which a cell sheet can be adhered to reinforce the strength of the cell sheet.
  • a cell sheet which is derived from bodily fluid in a blister of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa, contains cells into which a type VII collagen gene has been introduced, and is transplanted to the skin of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa.
  • [2] 2. The cell sheet according to 1 above, wherein the type VII collagen gene is introduced into the cell genome.
  • the cells have introduced a type VII collagen gene expression cassette, 3.
  • the cell sheet according to 1 or 2 above, wherein the type VII collagen gene expression cassette comprises an EF1 ⁇ promoter and a type VII collagen gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter.
  • the type VII collagen gene comprises a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • [6] 6.
  • the cell sheet according to any one of 1 to 6 above wherein in a longitudinal section of the cell sheet, the cell density near the surface of the sheet is higher than the cell density in the center of the sheet.
  • the cell sheet according to any one of 1 to 7 above which has a thickness of 5 to 50 ⁇ m.
  • a composition for treating dystrophic epidermolysis bullosa comprising the cell sheet according to any one of 1 to 10 above. [12] 12. The composition according to 11 above, wherein the cell sheet is transplanted to the affected area. [13] 12. The composition according to 10 or 11 above, wherein the cell sheet is transplanted to a site where the epidermis is missing.
  • a method for treating dystrophic epidermolysis bullosa comprising transplanting the cell sheet according to any one of 1 to 10 above to the skin of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa. [15] 15. The method according to 14 above, wherein the cell sheet is transplanted to the affected area. [16] 16. The method according to 14 or 15 above, wherein the cell sheet is transplanted into the epidermis-deficient part.
  • a method for producing a cell sheet to be transplanted into the skin of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa comprising: seeding a culture medium with at least a portion of the bodily fluid within the blister of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa; obtaining cells attached to the bottom of the culture vessel; introducing a type VII collagen gene into the cell; a step of culturing cells into which the type VII collagen gene has been introduced; A step of removing the cultured cells from the culture vessel as a cell sheet; A method for producing a cell sheet, comprising: [18] 18.
  • the method for producing a cell sheet according to 17 above wherein the cells obtained from the bodily fluid in the blister are seeded in a medium without being treated with an enzyme. [19] 19 The method for producing a cell sheet according to 17 or 18 above, wherein the type VII collagen gene is introduced into the cells using a lentiviral vector. [20] 20. The method for producing a cell sheet according to any one of 17 to 19 above, wherein the lentiviral vector contains a type VII collagen gene expression cassette, and the type VII collagen gene expression cassette contains an EF1 ⁇ promoter and a type VII collagen gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter.
  • the type VII collagen gene comprises a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • 21. A method for producing a cell sheet according to any one of 17 to 20.
  • 22 22.
  • the method for producing a cell sheet according to any one of 17 to 22 above further comprising the step of seeding the type VII collagen gene-introduced cells in a culture vessel at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more.
  • 24. The method for producing a cell sheet according to any one of 17 to 23 above, wherein the cultured cells are taken out from the culture container as a cell sheet without being treated with an enzyme.
  • a blister solution from a patient with dystrophic epidermolysis bullosa was collected and centrifuged at 300 g for 5 minutes.
  • the resulting precipitate was suspended in a medium (Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell, C-28009) supplemented with penicillin and streptomycin to a final concentration of 100 unit/mL and 100 ⁇ g/mL, respectively), seeded on a collagen I-coated 6-well plate, and cultured at 37°C and 5% CO 2 to obtain adherent cells.
  • the time required from the collection of the blister solution to the seeding in the culture medium varied from patient to patient, but ranged from 18 minutes to 1 hour.
  • BM-MSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • CD73-CFS Mouse IgG2B, CD90-APC Mouse IgG2A, and Negative Marker Cocktail CD45-PE Mouse IgG1, CD34-PE Mouse IgG1, CD11b-PE Mouse IgG2B, CD79A-PE Mouse IgG1, HLA-DR-PE Mouse IgG1 included in the Human Mesenchymal Stem Cell Verification Flow Kit (R&D Systems, FMC020) and 5 ⁇ l of Brilliant Violet 421 TM anti-human CD105 Antibody (BioLegend, 323219) was added and allowed to react for 30 minutes at room temperature in the dark.
  • CD31 was also subjected to FACS analysis by the following procedure to confirm the presence or absence of expression in blister-derived cells and human BM-MSCs:
  • the cells were detached from the plate using Accutase-Solution (PromoCell, C-41310), washed with medium, and based on the cell count results, 100,000 cells each were sorted into two tubes.
  • Cells were washed with PBS containing 2% FBS and resuspended in 100 ⁇ l of PBS containing 2% FBS.
  • 5 ⁇ l of Human TruStain FcX TM BioLegend, 422301 was added and allowed to react on ice for 10 minutes.
  • both blister-derived cells and BM-MSCs were positive for CD73, CD105 and CD90, and negative for CD45, CD34, CD11b, CD79A, HLA-DR and CD31 (Fig. 3).
  • osteoblasts osteoblasts, adipocytes and chondrocytes
  • the blister-derived cells and BM-MSCs obtained in 1. above were induced to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes under the following conditions.
  • Induction of differentiation into osteoblasts The cells were cultured in a medium containing 0.1 ⁇ M Dexamethasone, 0.2 mM Ascorbic acid 2-phosphate, and 10 mM Glycerol 2-phosphate (all values are final concentrations) under conditions of 37° C. and 5% CO 2 for 3 weeks (medium change twice a week) to induce differentiation into osteoblasts.
  • Alkaline phosphatase (ALP) staining was performed using TRACP & ALP Assay Kit (Takara Bio Inc., MK301) according to the product manual.
  • Induction of differentiation into adipocytes The cells were cultured in a medium containing 1 ⁇ M dexamethasone, 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylanxthine (IBMX), 10 ⁇ g/mL insulin, and 100 ⁇ M indomethacin (all values are final concentrations) under conditions of 37° C. and 5% CO 2 for 3 weeks (the medium was changed twice a week) to induce differentiation into adipocytes.
  • IBMX 3-Isobutyl-1-methylanxthine
  • a chondrogenic differentiation induction medium (incomplete medium) was prepared by mixing the components of Human Mesenchymal Stem Cell (hMSC) Chondrogenic Differentiation Medium Bullet Kit (tm) (Lonza, PT-3003) according to the instructions. Recombinant Human TGF-beta 3 Protein (R&D Systems, 243-B3) was added to this to a final concentration of 10 ng/ml to prepare a chondrogenesis induction medium (complete medium) each time it was used.
  • hMSC Human Mesenchymal Stem Cell
  • tm Chondrogenic Differentiation Medium Bullet Kit
  • R&D Systems Recombinant Human TGF-beta 3 Protein
  • the pellet was removed, fixed with 4% paraformaldehyde, frozen sections were prepared, and chondrocyte-derived proteoglycans were stained with alcian blue staining.
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were also subjected to the same differentiation-inducing operation.
  • Fig. 4 shows the results of the above differentiation induction experiment.
  • BM-MSCs were positive in all of ALP staining, Oil Red O staining, and Alcian Blue staining.
  • Blister-derived cells were positive for ALP staining (but less intense than BM-MSC), positive for Oil Red O staining (but less intense than BM-MSC), and positive for Alcian Blue staining (but less intense than BM-MSC).
  • KCs human epidermal keratinocytes
  • FBs human skin fibroblasts
  • MSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • BFC epidermolysis bullosa patient blister-derived cells
  • the cells When the cells reached 90-95% confluency, they were washed with D-PBS(-), ascorbic acid (nacalai tesque, 13048-42, final concentration 50 ug/ml) and protease inhibitor cocktail (SIGMA, P1860-1ML, 1/400 dilution) added to each medium (supplement not added), and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. After cultivation, the medium was concentrated using a methanol-chloroform precipitation method. A cell lysate was also prepared from the cells using RIPA buffer (nacalai tesque, 08714-04).
  • Each lysate was corrected based on the protein concentration, and a sample for electrophoresis was prepared using LDS sample buffer and sample reducing agent (Invitrogen, NP0007 and NP0009, respectively). After performing electrophoresis using 3-8% NuPAGE gel (Invitrogen, EA0375BOX), it was transferred to a PVDF membrane (Millipore, IPVH07850), and antibody reaction was performed using Anti-Col7 (Atlas, HPA042420) as the primary antibody and Anti-Rabbit IgG-HRP (GE healthcare, NA9340-1ML) as the secondary antibody.
  • LDS sample buffer and sample reducing agent Invitrogen, NP0007 and NP0009, respectively.
  • sgRNAs Three types of sgRNA were prepared in order to select a site with good cleavage efficiency by the CRISPR-Cas9 system in the AAVS1 (Adeno-associated virus integration site 1) region in the human genome.
  • the AAVS1 region is a safe region (safe harbor) that is not easily affected by gene transfer. Since the CRISPR-Cas9 system recognizes the base sequence of "NGG” and cleaves 3 bases upstream of it, the region where "GG" is arranged at the end was selected, and sgRNAs (sgAAVS1-#1 to #3) containing the target sequence of 20 bases upstream of "NGG" were designed (Fig. 6, top; Table 2).
  • This plasmid (2.5 ⁇ g) was introduced into HEK293 cells (human embryonic kidney cell line) seeded in a 6-well dish using Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific). Forty-eight hours after transfection, genomic DNA was extracted from the cells and the region containing the target site was amplified by PCR. The PCR-amplified fragments were made single-stranded by heat treatment, annealed by slow cooling, and then treated with a mismatch site-specific endonuclease.
  • COL7A1 Gene into Bulla-Derived Cells
  • a plasmid expressing the COL7A1 gene under the control of the CAG promoter was designed (Fig. 7).
  • COL7A1 cDNA was obtained from a Flexi ORF sequence-verified clone (Promega, Madison, WI, USA).
  • COL7A1 cDNA was subcloned into the pENTR1A plasmid (Thermo Fisher Scientific, A10462) resulting in pENTR1A-COL7A1.
  • COL7A1 cDNA was introduced from pENTR1A-COL7A1 into pAAVS1-P-CAG-DEST (Addgene plasmid # 80490) by Gateway reaction using LR recombinase (Thermo Fisher Scientific) to obtain donor plasmid pAAVS1-P-CAG-COL7A1.
  • the blister-derived cells obtained in 1. above were suspended in a special buffer for the Neon transfection system (Thermo Fisher Scientific), and mixed with the Cas9-sgRNA expression plasmid (eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#3) and the donor plasmid (pAAVS1-P-CAG-COL7A1) as follows.
  • the above plasmid was introduced into the blister-derived cells by electroporation under the conditions of 1,200 V, 20 ms, 2 pulses, and then seeded on a 6-well plate and cultured.
  • the medium used was an equal volume mixed medium of Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell, C-28009) and MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (Lonza, PT-3001). Forty-eight hours after transfection, puromycin was added to a final concentration of 0.5 ⁇ g/mL, and the cells selected after culturing for about 2 weeks were used in the mouse transplantation experiment described in “5. Transplantation of genetically modified blister-derived cells into mice” below.
  • Retronectin [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), T100B] was diluted to 40 ⁇ g/mL with PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline (Ca, Mg-free)) [Nacalai Tesque Co., Ltd. (Kyoto, Japan), 14249-95]. Added as 100 ⁇ L/well. The plate was then left overnight at 4°C. Before using the plates, the retronectin solution was removed, the plates were washed twice with PBS, and the following operations were performed.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • Blister-derived cells with Accutase-Solution [PromoCell (Heidelberg, Germany), C-41310]
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells with Trypsin/EDTA for Mesenchymal Stem Cells [Lonza (Basel, Switzerland), CC-3232]
  • normal adult skin fibroblasts with Trypsin/EDTA Solution [Lonza (Basel, Switzerland), CC-5] 012]
  • the number of collected cells was measured and seeded on the aforementioned Retronectin-coated 96-well plate at 2500 cells/well.
  • a lentivirus carrying a GFP gene pLenti-C-mGFP [ORIGENE (Rockville, USA), PS100071] was added to each well at MOI 1 or 5, and the cells were cultured in a CO 2 incubator for 72 hours.
  • Detection of GFP-positive cells Detection of the GFP-positive cell rate was performed with a fluorescence microscope [Keyence (Tokyo, Japan), BZ-X710]. The results are shown in FIG.
  • GFP-positive cells of each cell type infected with MOI 1 were quantified by the following method. First, the ratio of the number of GFP-positive cells to the total number of cells in the visual field was defined as the GFP-positive cell ratio. This measurement was repeated three times and statistically processed (*: P ⁇ 0.05, Dunnett's test). The results are shown in FIG.
  • bleb-derived fluid cells have higher efficiency of lentiviral gene delivery compared to mesenchymal stem cells and fibroblasts.
  • a lentiviral vector plasmid containing the EF1 ⁇ promoter and the COL7A1 gene in the expression cassette was constructed.
  • the Flexi ORF sequence-verified clone (Promega) containing the COL7A1 cDNA the COL7A1 cDNA was treated with SpeI and XbaI to generate a paired sequence, and ligated to pLVSIN-EF1 ⁇ Puro (Takara Bio Inc.) treated with XbaI to prepare pLVSIN-EF1 ⁇ -C7 Puro. This was further treated with NotI and MluI to remove the PGK-Puro cassette to generate pLVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1.
  • a lentiviral vector plasmid was prepared with the PGK promoter and the COL7A1 gene in the expression cassette, as shown in Fig. 11 (right).
  • pLVSIN-EF1 ⁇ -Col7A1 was treated with ClaI and SwaI to excise the EF1 ⁇ promoter region, and the PGK promoter region (501 bp) amplified by PCR using AAVS1 hPGK-PuroR-pA donor plasmid (addgene #22072) as a template was incorporated by Gibson assembly to prepare pLVSIN-PGK-COL7A1.
  • KOD One Toyobo
  • NEBuilder HiFi DNA Assembly kit (New England Biolabs) was used for Gibson assembly.
  • a lentiviral vector carrying the COL7A1 gene shown in FIG. 12 was produced. Transfection using lentiviral plasmid: The plasmid shown in Figure 11 was used as the lentiviral vector plasmid. As the packaging plasmid, Lentiviral High Titer Packaging Mix [Takara Bio (Shiga, Japan), 6194] was used. First, Lenti-X 293T cells [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), 632180], a cell line for lentivirus packaging, were seeded in a 100 mm dish [Corning Inc.
  • DMEM Nacalai (Kyoto, Japan), 08457-55] containing 10% FBS and penicillin and streptomycin (added to final concentrations of 100 unit/mL and 100 ⁇ g/mL, respectively) was used as the medium for Lenti-X 293T cells.
  • the vector and packaging plasmids were then transfected using polyethylenimine. After culturing the transfected cells overnight in a CO 2 incubator, the medium was changed.
  • OPTI-MEM Thermo Fisher Science (Tokyo, Japan), 31985062] and PEI-MAX [Polysciences (Warrington, USA), 24765-100] were used as transfection reagents.
  • the transfection protocol followed the PEI-MAX recommended protocol.
  • the mixing ratio of vector plasmid and packaging plasmid was according to the recommended protocol of Lentiviral High Titer Packaging Mix. Collection and Purification of Lentiviral Vector: The culture supernatant of Lenti-X 293T cells 72 hours after transfection was collected and coarsely centrifuged at 300 g for 5 min to remove cell debris.
  • the supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter [Merck (Tokyo, Japan), SLHVR33RS] to further remove cell debris.
  • the filtered supernatant was then centrifuged (6000g, 4°C, 20hr) to pellet the lentiviral vector and the pellet was resuspended in 1.5mL of PBS.
  • a 55% sucrose/PBS solution (1 mL), a 20% sucrose/PBS solution (2.5 mL), and a lentiviral vector solution (1.5 mL) were layered in an ultracentrifugation tube [Beckman Coulter (Tokyo, Japan), 344058], and ultracentrifuged (41000 rpm, 4°C, 2 hr).
  • Retronectin [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), T100B] was diluted with PBS to 100 ⁇ g/mL, and added to a flat-bottom 48-well plate [IWAKI (Tokyo, Japan), 1830-048] without surface treatment at 100 ⁇ L/well. The plate was then left overnight at 4°C. Before using the plate, the retronectin solution was removed and the plate was blocked with 2% FBS-containing PBS at room temperature for 30 minutes, followed by the following operations.
  • LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector or LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector was added to each well of a Retronectin-coated 48-well plate, and centrifuged at 2000 g and 32° C. for 2 hours. After that, the virus solution was removed and washed once with PBS. Next, the blister-derived cells were detached from the plate using Accutase-Solution and collected using medium. The collected cells were counted and seeded on the above-described Retronectin-coated 48-well plate at 12,500 cells/well. Cells on day 14 after infection were detached from plates using Accutase-Solution and collected using medium.
  • VCN Vector Copy Number
  • Lenti-X TM Provirus Quantitation Kit Takara Bio (Shiga, Japan), 631239].
  • the virus titer (TU/mL, TU: Transduction Unit) was calculated from the VCN and the virus volume at the time of virus infection. The calculation formula is as follows. Based on the virus titer thus obtained, the volume of virus required for setting the multiplicity of infection (MOI) in the lentivirus infection experiment was calculated.
  • RetroNectin-coated plate A plate was coated with Retronectin in the same manner as in "11. Production of lentiviral vector carrying type VII collagen gene”.
  • Cell seeding and lentiviral infection LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector or LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector (see FIG. 12) was added to each well of a 48-well plate coated with Retronectin at MOI 0.5, MOI 1, or MOI 2, and centrifuged at 2000 g and 32° C. for 2 hours.
  • the virus solution was removed and washed once with PBS.
  • the blister-derived cells were detached from the plate using Accutase-Solution and collected using medium. The collected cells were counted and seeded on the above-described Retronectin-coated 48-well plate at 12,500 cells/well.
  • Immunostaining Blister-derived cells 14 days after lentivirus infection were detached from the plate using Accutase-Solution and collected using medium. The collected cells were counted, seeded on a CC2-coated chamber slide [Thermo Fisher Science (Tokyo, Japan), 154852] at 50,000 cells/well, and cultured in a CO 2 incubator.
  • immunostaining was performed using an anti-type VII collagen antibody (clone LH7.2) [Sigma Aldrich (Tokyo, Japan), C6805] and Alexa488 [Thermo Fisher Science (Tokyo, Japan), A-11001). Then, the expression of type VII collagen was analyzed with a confocal fluorescence microscope [Nikon (Tokyo, Japan), Nikon A1R HD25].
  • the blister-derived cells infected with the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector had a higher rate of type VII collagen-positive cells and the staining intensity was stronger than the blister-derived cells infected with the LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector.
  • FACS Flow Cytometry
  • immunostaining was performed using an anti-type VII collagen antibody (clone LH7.2) [Sigma Aldrich (Tokyo, Japan), C6805] and Alexa488 [Thermo Fisher Science (Tokyo, Japan), A-11001), and the expression of type VII collagen was analyzed by a flow cytometer (BD FACSCanto TM II) [Nippon Becton Dickinson (Tokyo, Japan)].
  • clone LH7.2 Sigma Aldrich (Tokyo, Japan), C6805
  • Alexa488 Thermo Fisher Science (Tokyo, Japan), A-11001
  • the ratio of cells contained in the framed portion in each FACS data is shown as the type VII collagen-positive cell ratio in FIG. 16 (left).
  • the mean fluorescence intensity (MFI) within the framed region is shown in FIG. 16 (right) as the mean fluorescence intensity of type VII collagen-positive cells.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIGS. 15 and 16 (left) the rate of type VII collagen-positive cells increased MOI-dependently. The highest percentage of type VII collagen-positive cells was observed with MOI 2 infection, approximately 18% with EF1 ⁇ -COL7A1 lentivirus and approximately 12% with PGK-COL7A1 lentivirus.
  • the MFI of EF1 ⁇ -COL7A1 lentivirus-infected cells was about 2.2 times higher than that of PGK-COL7A1 lentivirus-infected cells. This suggests that the EF1 ⁇ promoter expresses a higher amount of COL7A1 than the PGK promoter in bleb-derived cells transfected with a lentiviral vector.
  • blister-derived cells, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and normal adult skin fibroblasts were infected with EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector or PGK-COL7A1 lentiviral vector, immunostaining and flow cytometry (FACS) were performed in the same manner as above, and the rate of type VII collagen-positive cells was measured.
  • FACS flow cytometry
  • VCN Vector Copy Number
  • VCN increased MOI-dependently.
  • VCN decreased with the passage of days of infection, but VCN stabilized after 21 days after infection. This result suggests that the type VII collagen gene inserted into the genome of blister-derived cells by a lentiviral vector can persist in the genome for a long period of time.
  • the COL7A1 gene was introduced into the blister-derived cells in the same manner as in "4. Introduction of the COL7A1 gene into the blister-derived cells" above.
  • a CAG promoter was used as the promoter.
  • the blister-derived cells into which the gene had been introduced were appropriately changed in medium and subcultured to proliferate to the desired cell number.
  • the transgenic blister-derived cells were seeded in a 12-well plate at 0.4 ⁇ 10 6 cells/cm 2 (corresponding to a confluency of 700%).
  • a medium an equal volume mixed medium of Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell, C-28009) and MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (Lonza, PT-3001) was used. Plates were incubated for 2 days at 37°C, 5% CO2 . This formed a cell sheet on the bottom of the 12-well plate. A 1 ⁇ 1 cm square cut was made in the cell sheet with a blade, and the cell sheet was peeled off from the bottom of the plate with tweezers.
  • FIG. 18 (upper left) shows the cell sheet during detachment. The cell sheet removed from the plate is shown in FIG. 18 (top middle).
  • Fig. 18 shows a photograph of hematoxylin and eosin staining (HE staining) of the obtained cell sheet.
  • HE staining hematoxylin and eosin staining
  • transfected blister-derived cells were seeded in 12-well plates at 0.1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 (corresponding to a confluency of 175%) and 0.2 ⁇ 10 6 cells/cm 2 (corresponding to a confluency of 350%).
  • a cell sheet was formed, but the result was that the mechanical strength was inferior to that when seeding at 0.4 ⁇ 10 6 cells/cm 2 and the sheet was slightly torn easily.
  • a cell sheet was also formed when seeded at 0.1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , but the mechanical strength was further inferior to that when seeded at 0.2 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , and the result was that it was easily broken and difficult to handle.
  • the transfected blister-derived cells were seeded in a 12-well plate at 0.4 ⁇ 10 6 cells/cm 2 and cultured for 1 day and 3 days.
  • a cell sheet was formed, but the mechanical strength was inferior to that when cultured for 2 days, and the result was that the sheet was easily broken.
  • the strength of the cell sheet was slightly improved compared to when cultured for 2 days.
  • ISH in situ hybridization
  • a probe that specifically binds to human COL7A1 mRNA but not to mouse Col7a1 mRNA were performed according to the technical notes of RNAscope registered trademark RED Assay and Immunofluorescence (Advanced Cell Diagnostics).
  • the ISH probe targeted 1510-4172 of NM_000094.4 and was designed and manufactured by Advanced Cell Diagnostics (Newark, CA).
  • the ISH portion of the multiple staining was performed using RNAscope® 2.5 HD Detection Reagents-RED (Advanced Cell Diagnostics, 322360).
  • Immunostained sections were performed using an anti-type VII collagen antibody (Atlas Antibodies, HPA042420). The results are shown in Figures 22 and 23. Furthermore, 32 days after transplantation of the cell sheet, the skin of the transplanted part was observed with an electron microscope. We asked Tokai Electron Microscopy Analysis Co., Ltd. (Nagoya, Japan) to prepare specimens for electron microscope observation by the chemical fixation/resin-embedded ultrathin section method, and to perform observations and photographs by a transmission electron microscope. The results are shown in FIG.
  • human COL7A1 mRNA was detected just below the epidermis in the cell sheet-implanted skin. This suggests that cells derived from the cell sheet remain near the surface of the dermis. As shown in FIG. 23, cells derived from the cell sheet occasionally form thick layers near the surface of the dermis. In the epidermis, old cells are lost and gradually replaced by new cells. On the other hand, it is known that cells remain in the dermis for a long period of time and maintain the functions of the skin. The fact that the transplanted cells remain thick in the dermis suggests the possibility that these cells remain in the dermis for a long period of time and provide long-term efficacy.
  • anchoring fibrils were formed near the basement membrane in the cell sheet-implanted skin. On the other hand, no anchoring fibrils were formed in the skin to which the cell sheet was not transplanted.
  • the prepared cell sheet was transplanted to the affected skin area of an epidermolysis bullosa model mouse.
  • 0.4 ⁇ 10 6 cells of the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentivirus-infected blister-derived cells obtained above were seeded at a normal passage density (confluence of about 10% to 20%).
  • the cells were detached using Accutase-Solution, and the obtained cell suspension was intradermally administered into the dermis of the affected skin.
  • the blister-derived cell sheet transfected with the LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector had a higher fluorescence intensity in immunostaining of type VII collagen than the cell suspension.
  • type VII collagen deposition was observed over a very long distance along the basement membrane.
  • the blister-derived cell sheet transfected with the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector also exhibited high fluorescence intensity in immunostaining of type VII collagen.
  • the blister-derived cell sheet transfected with the LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector is expected to have a higher therapeutic effect than the cell suspension.
  • Blister-derived cell sheets transfected with the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector are expected to have even higher therapeutic effects.

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Abstract

本開示は、栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植される細胞シートに関する。この細胞シートは、栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液から採取された細胞で構成される。この細胞には、VII型コラーゲン遺伝子が導入されている。

Description

細胞シート
　本出願は、特願２０２２－００８０５７号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、細胞シートに関する。
　表皮水疱症は、皮膚組織の接着を担っている接着構造分子が欠損または消失していることにより、皮膚に力が加わると、表皮が真皮から剥がれて水ぶくれ（水疱）や皮膚潰瘍を生じる疾患である。このうち、表皮が千切れて水疱ができる病型は単純型表皮水疱症、表皮と基底膜の間が剥がれて水疱ができる病型は接合部型表皮水疱症、基底膜と真皮の間が剥がれる病型は栄養障害型表皮水疱症と称される。
　栄養障害型表皮水疱症は表皮水疱症全体の約５割と最も多い病型であり、VII型コラーゲンをコードするCOL7A1遺伝子の変異を原因とする遺伝性疾患である。皮膚の構造において、表皮の一番下にある表皮基底細胞は、基底膜と称されるシート様の構造体と結合している。VII型コラーゲンは、真皮内でアンカリングフィブリルという線維を形成し基底膜と真皮をつなげている。このため、VII型コラーゲン遺伝子に異常があると基底膜と真皮の接着機能が損なわれ基底膜と真皮の間で水疱ができる栄養障害型表皮水疱症となる。栄養障害型表皮水疱症のなかでも、重症劣性栄養障害型表皮水疱症は、生直後より全身熱傷様皮膚症状が続き、３０歳前後より高率に皮膚有棘細胞癌（瘢痕癌）が多発して死に至る、極めて重篤な遺伝性水疱性皮膚疾患である。
　表皮水疱症に対して、現在有効な治療法はなく、根治的に水疱形成を抑制する遺伝子治療法の開発が求められている。このような遺伝子治療として、患者の皮膚細胞を採取し、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子操作した後、培養して皮膚シートを形成し、患者に移植する治療技術が開示されている（特許文献１参照）。また、VII型コラーゲンの活性が失活している間葉系幹細胞に対してゲノム編集を施し、VII型コラーゲンを産生可能となった間葉系幹細胞をケラチノサイトや線維芽細胞に分化させると共に、培養して皮膚シートを形成し、患者の治療に用いることが提案されている（特許文献２参照）。
国際公開第２０１７/１２０１４７号公報 国際公開第２０１８/１５４４１３号公報
　本願は、栄養障害型表皮水疱症の治療に有効な細胞シートを提供する。
　本発明の細胞シートの一態様は、栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液から得られ、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞で構成される。この細胞シートは、栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に適用される。
　細胞シートの製造方法の一態様では、まず、栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液を、培地に播種する。次いで、培養容器の底に付着した細胞を取得する。次いで、この細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する。次いで、このVII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養する。最後に、培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す。
　本発明は、栄養障害型表皮水疱症の治療に有用である。
図１は、水疱由来細胞から細胞シートを作成する作業の概略を示す工程図である。 図２は、培養開始20日後までの水疱由来細胞の外観を示す写真である。 図３は、水疱由来細胞とヒト骨髄由来間葉系幹細胞のFACS解析の結果を示す。 図４は、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞とヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化誘導条件下で培養し、それぞれアルカリホスファターゼ（ALP）染色、オイルレッドO染色、アルシアンブルー染色を行った結果を示す。 図５は、各種細胞のVII型コラーゲン発現量および分泌量を示す。図５（上）は、細胞のライセートに対して抗VII型コラーゲン抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。図５（下）は、細胞を培養した培地に対してウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。「KC」はヒト表皮角化細胞を示す。「FB」はヒト皮膚線維芽細胞を示す。「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞を示す。「BFC」は水疱由来細胞を示す。 図６は、設計したsgRNA（sgAAVS1-#1～#3）によるゲノムDNAの切断およびその切断効率を示す。 図７は、AAVS1領域にCOL7A1遺伝子を導入するゲノム編集の説明図である。HA-RおよびHA-Lは相同配列部分、SAはスプライスアクセプター配列、T2AはT2AペプチドをコードするT2A配列、Puroはピューロマイシン耐性遺伝子、CAGはCAGプロモーター配列を示す。野生型ゲノム（上）でのF2からR2までの長さは1952bp、COL7A1遺伝子が導入されたゲノム（下）でのF1からR1までの長さは1246bp、F2からR2までの長さは14249bpである。 図８は、各種細胞にCRISPR-Cas9でCOL7A1遺伝子を導入した後のVII型コラーゲンの発現および分泌量を示す。図８（上）は、細胞のライセートに対して抗VII型コラーゲン抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。図８（下）は、細胞を培養した培地に対してウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ(右）である。「FB」はヒト皮膚線維芽細胞を示す。「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞を示す。「BFC」は水疱由来細胞を示す。 図９は、各種細胞にGFPレンチウイルスベクターを感染させて７２時間経過後の蛍光顕微鏡写真である。「GFP」は、細胞の緑色蛍光を示す写真である。「merge」は、「GFP」の写真に明視野の写真を重ね合わせたものである。「MOI 1」では、細胞にレンチウイルスベクターをMOI 1で感染させた。「MOI 5」では、細胞にレンチウイルスベクターをMOI 5で感染させた。「BFC」は水疱由来細胞の写真であり、「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞の写真であり、「NHDF」は正常成人皮膚線維芽細胞の写真である。 図１０は、各細胞種にMOI 1でGFPレンチウイルスベクターを感染させて72時間経過後の細胞のGFP陽性率を示すグラフである。 図１１は、プラスミドマップである。図１１（左）は、本発明者が作成したプラスミド、pLVSIN-EF1α-COL7A1の構造を示す。図１１（右）は、本発明者が作成したプラスミド、pLVSIN-PGK-COL7A1の構造を示す。pLVSINベクターは、SIN（self-inactivating）型のレンチウイルスベクタープラスミドで、EF1αプロモーター（左）またはPGKプロモーターに（右）よって、ヒトVII型コラーゲン遺伝子を発現する。 図１２は、本発明者が製造したレンチウイルスベクターの遺伝子構造を示す模式図である。図１２（上）に示すLVSIN-EF1α-COL7A1ベクターは、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備える。図１２（下）に示すLVSIN-PGK-COL7A1ベクターは、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備える。本ベクターは、HIV-1 LTR（5'LTRおよび3'LTR/ΔU3）とパッケージングシグナル（ψ）に加えて、導入遺伝子の発現やウイルス力価などを向上させるためにWPRE（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）、cPPT/CTS（セントラルポリプリン配列/セントラルターミネーション配列）、およびRRE（Rev応答エレメント）を含む。 図１３は、水疱由来細胞にEF1α-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させて14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いて免疫染色した写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「EF1a-C7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」「MOI 1」「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5, MOI 1, MOI 2で感染させた。 図１４は、水疱由来細胞にPGK-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させて14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いて免疫染色した写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「PGK-C7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」「MOI 1」「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5, MOI 1, MOI 2で感染させた。 図１５は、水疱由来細胞をVII型コラーゲン遺伝子搭載レンチウイルスベクターで感染させ、14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いてFACS解析した結果を示す。「EF1a-C7」では、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスベクターで、水疱由来細胞を感染させた。「PGK-C7」では、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスベクターで、水疱由来細胞を感染させた。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」、「MOI 1」、および「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5、MOI 1、およびMOI 2で感染させた。 図１６は、図１５に示すFACSデータを定量化したグラフである。図１６（左）は、VII型コラーゲン陽性細胞率を示す棒グラフである。図１６（右）は、VII型コラーゲン陽性細胞の平均蛍光強度を示す棒グラフである。 図１７は、VII型コラーゲン遺伝子搭載レンチウイルスベクターを感染させた水疱由来細胞のゲノム中のベクターコピー数の経時変化を示すグラフである。 図１８（上段）は、作成した細胞シートの写真である。図１８（下段）は、作成した細胞シートを表皮水疱症モデルマウスに移植する手順を示すイラストおよび写真である。図１８（上段左）は、作成した細胞シートをプレートから剥離している途中の写真である。図１８（上段真ん中）は、プレートから剥離した細胞シートの写真である。図１８（上段右）は、作成した細胞シートのヘマトキシリン・エオジン染色の縦断面顕微鏡写真である。図１８（下段左）は、作成した細胞シートを表皮水疱症モデルマウスに移植する手順を示すイラストである。図１８（下段左から二番目）は、表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部の写真である。図１８（下段右から二番目）は、表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部の表皮を切開して、真皮を露出させた状態の写真である。図１８（下段右）は、表皮水疱症モデルマウスの創傷部位に、作成した細胞シートを貼付した直後の写真である。 図１９は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚断層画像を示す。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「COL7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「Merge」は、DAPI染色の結果とVII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を重ねたものである。「細胞シート移植」は、CRISPR-Cas9を用いてCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞で作成した細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。「細胞懸濁液皮内投与」は、CRISPR-Cas9を用いてCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞の懸濁液を、皮膚患部に皮内投与した結果を示す。 図２０は、図１９と同様の結果を示す写真であり、図１９より高い倍率の顕微鏡写真である。 図２１は、水疱由来細胞シートを表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部に移植して４週間経過後の皮膚に対してVII型コラーゲン免疫染色を行った後の蛍光強度を示すグラフである。 図２２は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚に、in situ hybridizationと免疫染色を行った写真である。「Bright Field」は、VII型コラーゲンmRNAに相補的なプローブが可視化された明視野の写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「COL7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「Probe」は、プローブの蛍光標識を示す。「Merge」は、DAPI染色の結果とVII型コラーゲンに対する免疫染色の結果とプローブの蛍光標識の結果を重ねたものである。 図２３は、図２２と同様の実験を別の表皮水疱症モデルマウスに対して行った実験結果である。 図２４は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚の電子顕微鏡写真である。「細胞シート移植」は、CRISPR-Cas9を用いてCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞で作成された細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。「細胞シートなし」は、細胞シートを移植しなかった表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部を示す。「低倍率」は、25300倍の写真である。「低倍率」の写真の短辺は3.482μmであり、長辺は4.642μmである。「高倍率」は、84200倍の写真である。「高倍率」の写真の短辺は1.045μmであり、長辺は1.394μmである。 図２５は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚断層画像を示す。「LVSIN-EF1α-COL7　細胞シート」は、発現カセットにEF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子とを備えるレンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞で作成された細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。「LVSIN-PGK-COL7　細胞シート」は、発現カセットにPGKプロモーターとCOL7A1遺伝子とを備えるレンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞で作成された細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。「LVSIN-EF1α-COL7　細胞懸濁液」は、発現カセットにEF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子とを備えるレンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞の懸濁液を、皮膚患部に皮内投与した結果を示す。 図２６（左）は、レンチウイルスベクターでCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞から作成された細胞シートを皮膚患部に移植した後、またはレンチウイルスベクターでCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞の懸濁液を皮膚患部に皮内投与した後、４週間経過後の基底膜におけるVII型コラーゲンの沈着距離を示すグラフである。図２６（右）は、蛍光強度を示すグラフである。
　特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
　本開示の一実施形態は、細胞シートに関する。この細胞シートは、栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液に由来する細胞を含む。この細胞には、VII型コラーゲン遺伝子が導入されている。この細胞シートは、栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植される。
　細胞には、VII型コラーゲン遺伝子発現カセットが導入されていることが好ましい。VII型コラーゲン遺伝子発現カセットは、EF1αプロモーターと、EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子とを含むことが好ましい。
　細胞シート内では、細胞がシートの厚さ方向、すなわち法線方向に重なり合っていることが好ましい。また、細胞シートでは、細胞が複数の層を形成していることが好ましい。これにより、細胞シートの機械的強度が向上し、また、単位面積あたりでより多数の細胞を患部に供給できる。細胞シートの厚さは、５～５０μm程度であることが好ましく、１０～２５μm程度であることがより好ましい。この厚みだと、細胞シートの機械的強度を確保でき、かつシート内部の細胞にも十分な酸素が供給される。
　細胞シートを縦断面で見た場合、シートの表面近傍の細胞密度は、シートの中心部の細胞密度よりも高いことが好ましい。そして、細胞シートの両方の表面において、表面近傍の細胞密度が、シートの中心部の細胞密度よりも高いことがより好ましい。シートの表面付近で細胞が密になっていると、細胞シートの強度が増して、剥がすときや移植する際に、破れにくい。シートの中心部としては、シートの一方の表面と他方の表面の丁度中間に位置する部分が例示される。
　栄養障害型表皮水疱症（Dystrophic Epidermolysis Bullosa, DEB）は、VII型コラーゲンをコードするCOL7A1遺伝子の変異を原因とする遺伝性疾患であり、VII型コラーゲンが全く産生されないか、変異により機能の低下したVII型コラーゲンが産生されることが、その特徴として知られている。VII型コラーゲンは、真皮内でアンカリングフィブリルという線維を形成し、基底膜と真皮とをつないでいる。VII型コラーゲンは、N末端から、第一非コラーゲン領域、コラーゲン領域、および第二非コラーゲン領域を含み、グリシン-X-Yの繰り返し配列を特徴とするコラーゲン領域部分で3本鎖を形成し、C末端で2分子が結合し、N末端が基底膜に結合する。変異には、コラーゲン領域のグリシンが他のアミノ酸に置換される変異、タンパク質の翻訳が止まる終始コドン変異、スプライス部位変異などがある。変異は、対立遺伝子の一方にある場合と、両方にある場合がある。栄養障害型表皮水疱症には、優性栄養障害型と劣性栄養障害型とが含まれ、劣性栄養障害型には、重症汎発型と、比較的症状の軽いその他の汎発型が含まれる。本明細書における栄養障害型表皮水疱症は、いずれの病型の栄養障害型表皮水疱症であってもよく、また、如何なるCOL7A1遺伝子の変異を原因とするものであってもよい。
　水疱とは、表皮下に、体液、組織液等の液体が溜まったものをいう。好ましくは、水疱は、表皮が真皮から剥離することにより表皮と真皮との間に形成された空間に液体が溜まった形態の水疱である。より好ましくは、水疱は、表皮の基底膜が真皮から剥離することにより当該基底膜と真皮との間に形成された空間に液体が溜まった形態の水疱である。
　本開示において、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞とは、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内から採取される付着性の細胞をいい、本開示において「DEB患者水疱由来細胞」または「水疱由来細胞」とも称される。当該細胞は、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内容物を固相上で培養することによって得ることができる。一実施形態では、水疱内容物は、水疱内に溜まった液体（すなわち、水疱内の体液）であり、本明細書においてこの液体を「水疱内溶液」とも称する。水疱内容物は、注射器等の手段により、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱から採取することができる。例えば、水疱内溶液の場合、注射針を水疱内に穿刺し、注射針の先端を表皮と真皮との間に形成された空間内に位置させた状態で注射器の押し子を引くことで、注射器のシリンジ内に水疱内溶液を吸引することができる。一実施形態では、水疱由来細胞は、水疱内溶液をコラゲナーゼ、ディスパーゼ等の酵素で処理せず培地に播種して固相上で培養することにより、得ることができる。具体的には、水疱から採取した水疱内溶液を直接培地に播種し、当該培地を固相上で所定時間インキュベートした後、固相上に付着した細胞を水疱由来細胞とすることができる。このとき、固相上でコロニーを形成した細胞を取得することが好ましい。水疱内溶液は、採取後、3時間以内に培地に播種することが好ましく、2時間以内に播種することがより好ましく、1時間以内に播種することがさらに好ましい。本開示において、固相とは、細胞が接着できる固体の支持体を意味し、例えば、プラスチック製またはガラス製の、培養皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどの培養容器が含まれる。ある実施形態では、固相は、プラスチック製の培養容器である。固相はコーティングされていてもよく、コーティング用の物質としては、例えば、コラーゲンI、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリL-リジン、ポリL-オルニチンなどが挙げられる。ある実施形態では、固相はコラーゲンIでコーティングされている。培養は、一般的なインキュベーター内で、「37℃、5％CO2」、「37℃、5％O2、5％CO2」などの条件下で行うことができる。培養用の培地は、動物細胞の培養に用いることができる培地であればよく、例えば、MEM、MEMα、DMEM、GMEM、RPMI 1640、MesenCultTM（STEMCELL Technologies社）、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社)、MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社）、Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium（タカラバイオ社）、およびこれらの混合培地などが挙げられる。その中でも、MesenCultTM、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2、MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium、Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium等の間葉系幹細胞用培地が好ましく用いられる。また、培地は、無血清培地であることが好ましい。培養期間は、細胞が固相に接着するのに十分な期間であればよく、例えば、1日間～数カ月間（例えば、2、3または4カ月間）、1日間～1カ月間、1日間～数週間（例えば、2、3または4週間）、1日間～1週間でありうる。
　ある実施形態において、DEB患者の水疱由来細胞は、以下の1)～6)から選択される１つ以上の特徴を有する：
　1)固相への接着性を有する、
　2)CD73、CD105およびCD90からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陽性である、
　3)CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陰性である、
　4)骨芽細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　5)脂肪細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　6)軟骨細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い。
　本開示において、ある細胞が骨芽細胞、脂肪細胞または軟骨細胞への「分化能を有しない」とは、通常の分化誘導条件および検出方法（染色等）を用いて骨芽細胞、脂肪細胞または軟骨細胞への分化を検出できないことを意味する。
　ある実施形態において、DEB患者水疱由来細胞は、CD73陽性、CD105陽性、且つCD90陽性の細胞である。別の実施形態において、DEB患者水疱由来細胞は、CD45陰性、CD34陰性、CD11b陰性、CD79A陰性、HLA-DR陰性、且つCD31陰性の細胞である。さらなる実施形態において、DEB患者水疱由来細胞は、骨芽細胞への分化能、脂肪細胞への分化能、および軟骨細胞への分化能がいずれも骨髄由来間葉系幹細胞と比較して低い細胞である。
　本開示においては、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞が用いられる。本開示における「VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された細胞」とは、機能的な（すなわち、アンカリングフィブリルを形成しうる）VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された細胞を意味する。
　本開示において、細胞の遺伝子改変とは、細胞のゲノムの遺伝子を改変することと、ゲノム外の核酸構築物（例えば、ベクター）から遺伝子を発現するよう細胞を改変することのいずれをも意味する。すなわち、「VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変する」との表現には、ゲノム中のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現するよう細胞を改変すること、およびゲノム外の核酸構築物のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現するよう細胞を改変することが含まれる。また、「VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された細胞」には、ゲノム中のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現する細胞と、ゲノム外の核酸構築物のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現する細胞とが含まれる。
　細胞の遺伝子改変は、COL7A1遺伝子を導入することにより、またはゲノムのCOL7A1遺伝子の変異を修正することにより、行うことができる。一実施形態において、本開示はCOL7A1遺伝子が導入された細胞を用いる。COL7A1遺伝子の導入は、細胞のゲノムにCOL7A1遺伝子を導入することによっても、ゲノム外の核酸構築物からCOL7A1遺伝子を発現するよう、COL7A1遺伝子を含む核酸構築物を細胞内に存在させることによっても、行うことができる。COL7A1遺伝子を細胞のゲノムに導入する場合、特定の位置に導入してもよく、ランダムに導入してもよい。ある実施形態において、COL7A1遺伝子は、ゲノムのCOL7A1遺伝子座、またはAAVS1領域のようなセーフ・ハーバーに導入される。
　DEB患者水疱由来細胞は、その細胞が投与される栄養障害型表皮水疱症患者の細胞（すなわち、自家細胞）であっても、その細胞の投与を受ける患者とは別の栄養障害型表皮水疱症患者の細胞（すなわち、他家細胞）であってよい。栄養障害型表皮水疱症患者の細胞には、VII型コラーゲンを産生しない細胞と、VII型コラーゲンを産生するが変異によりその機能が低下している細胞とがあるが、本開示における「栄養障害型表皮水疱症患者の細胞」は、そのいずれであってもよい。
　DEB患者水疱由来細胞は、患者に投与された場合に表皮基底膜近傍でVII型コラーゲンを産生しうる細胞であればよい。
　本開示において、細胞は、必要に応じて増殖させたものを包含する意味で用いられる。細胞の増殖は、細胞を培養することによって行うことができる。例えば、「（栄養障害型表皮水疱症患者の）水疱由来細胞」は、患者から取得された後に増殖させたものを包含し、「遺伝子改変された細胞」は、遺伝子改変操作により得られた細胞を増殖させたものを包含する。遺伝子改変を行う場合、遺伝子改変に必要な量を得るまで、細胞を増殖させてもよい。また、遺伝子改変後に、治療に必要な量を得るまで、細胞を増殖させてもよい。
　本明細書において、「細胞」とは、文脈に応じて１個の細胞または複数個の細胞を意味しうる。また、細胞は、一種類の細胞からなる細胞集団であってもよく、複数種の細胞を含む細胞集団であってもよい。
　本明細書において、VII型コラーゲン遺伝子またはCOL7A1遺伝子とは、VII型コラーゲンをコードする核酸配列を意味し、cDNAも、１以上のイントロンを含む配列（例えば、ゲノム配列またはミニジーン）も包含する意味で用いられる。ヒトCOL7A1遺伝子（cDNA）の代表的核酸配列を配列番号１に、ヒトVII型コラーゲンの代表的アミノ酸配列を配列番号２に示す。COL7A1遺伝子のcDNA配列はGenBank: NM_000094.3に、ゲノム配列はGenBank: AC121252.4に開示されている。COL7A1遺伝子は、機能的な（すなわち、アンカリングフィブリルを形成しうる）VII型コラーゲンをコードするものであればよく、その配列は限定されない。

ヒトCOL7A1遺伝子のcDNA配列（8835 bp）（配列番号１）
ATGACGCTGCGGCTTCTGGTGGCCGCGCTCTGCGCCGGGATCCTGGCAGAGGCGCCCCGAGTGCGAGCCCAGCACAGGGAGAGAGTGACCTGCACGCGCCTTTACGCCGCTGACATTGTGTTCTTACTGGATGGCTCCTCATCCATTGGCCGCAGCAATTTCCGCGAGGTCCGCAGCTTTCTCGAAGGGCTGGTGCTGCCTTTCTCTGGAGCAGCCAGTGCACAGGGTGTGCGCTTTGCCACAGTGCAGTACAGCGATGATCCACGGACAGAGTTCGGCCTGGATGCACTTGGCTCTGGGGGTGATGTGATCCGCGCCATCCGTGAGCTTAGCTACAAGGGGGGCAACACTCGCACAGGGGCTGCAATTCTCCATGTGGCTGACCATGTCTTCCTGCCCCAGCTGGCCCGACCTGGTGTCCCCAAGGTCTGCATCCTGATCACAGACGGGAAGTCCCAGGACCTGGTGGACACAGCTGCCCAAAGGCTGAAGGGGCAGGGGGTCAAGCTATTTGCTGTGGGGATCAAGAATGCTGACCCTGAGGAGCTGAAGCGAGTTGCCTCACAGCCCACCAGTGACTTCTTCTTCTTCGTCAATGACTTCAGCATCTTGAGGACACTACTGCCCCTCGTTTCCCGGAGAGTGTGCACGACTGCTGGTGGCGTGCCTGTGACCCGACCTCCGGATGACTCGACCTCTGCTCCACGAGACCTGGTGCTGTCTGAGCCAAGCAGCCAATCCTTGAGAGTACAGTGGACAGCGGCCAGTGGCCCTGTGACTGGCTACAAGGTCCAGTACACTCCTCTGACGGGGCTGGGACAGCCACTGCCGAGTGAGCGGCAGGAGGTGAACGTCCCAGCTGGTGAGACCAGTGTGCGGCTGCGGGGTCTCCGGCCACTGACCGAGTACCAAGTGACTGTGATTGCCCTCTACGCCAACAGCATCGGGGAGGCTGTGAGCGGGACAGCTCGGACCACTGCCCTAGAAGGGCCGGAACTGACCATCCAGAATACCACAGCCCACAGCCTCCTGGTGGCCTGGCGGAGTGTGCCAGGTGCCACTGGCTACCGTGTGACATGGCGGGTCCTCAGTGGTGGGCCCACACAGCAGCAGGAGCTGGGCCCTGGGCAGGGTTCAGTGTTGCTGCGTGACTTGGAGCCTGGCACGGACTATGAGGTGACCGTGAGCACCCTATTTGGCCGCAGTGTGGGGCCCGCCACTTCCCTGATGGCTCGCACTGACGCTTCTGTTGAGCAGACCCTGCGCCCGGTCATCCTGGGCCCCACATCCATCCTCCTTTCCTGGAACTTGGTGCCTGAGGCCCGTGGCTACCGGTTGGAATGGCGGCGTGAGACTGGCTTGGAGCCACCGCAGAAGGTGGTACTGCCCTCTGATGTGACCCGCTACCAGTTGGATGGGCTGCAGCCGGGCACTGAGTACCGCCTCACACTCTACACTCTGCTGGAGGGCCACGAGGTGGCCACCCCTGCAACCGTGGTTCCCACTGGACCAGAGCTGCCTGTGAGCCCTGTAACAGACCTGCAAGCCACCGAGCTGCCCGGGCAGCGGGTGCGAGTGTCCTGGAGCCCAGTCCCTGGTGCCACCCAGTACCGCATCATTGTGCGCAGCACCCAGGGGGTTGAGCGGACCCTGGTGCTTCCTGGGAGTCAGACAGCATTCGACTTGGATGACGTTCAGGCTGGGCTTAGCTACACTGTGCGGGTGTCTGCTCGAGTGGGTCCCCGTGAGGGCAGTGCCAGTGTCCTCACTGTCCGCCGGGAGCCGGAAACTCCACTTGCTGTTCCAGGGCTGCGGGTTGTGGTGTCAGATGCAACGCGAGTGAGGGTGGCCTGGGGACCCGTCCCTGGAGCCAGTGGATTTCGGATTAGCTGGAGCACAGGCAGTGGTCCGGAGTCCAGCCAGACACTGCCCCCAGACTCTACTGCCACAGACATCACAGGGCTGCAGCCTGGAACCACCTACCAGGTGGCTGTGTCGGTACTGCGAGGCAGAGAGGAGGGCCCTGCTGCAGTCATCGTGGCTCGAACGGACCCACTGGGCCCAGTGAGGACGGTCCATGTGACTCAGGCCAGCAGCTCATCTGTCACCATTACCTGGACCAGGGTTCCTGGCGCCACAGGATACAGGGTTTCCTGGCACTCAGCCCACGGCCCAGAGAAATCCCAGTTGGTTTCTGGGGAGGCCACGGTGGCTGAGCTGGATGGACTGGAGCCAGATACTGAGTATACGGTGCATGTGAGGGCCCATGTGGCTGGCGTGGATGGGCCCCCTGCCTCTGTGGTTGTGAGGACTGCCCCTGAGCCTGTGGGTCGTGTGTCGAGGCTGCAGATCCTCAATGCTTCCAGCGACGTTCTACGGATCACCTGGGTAGGGGTCACTGGAGCCACAGCTTACAGACTGGCCTGGGGCCGGAGTGAAGGCGGCCCCATGAGGCACCAGATACTCCCAGGAAACACAGACTCTGCAGAGATCCGGGGTCTCGAAGGTGGAGTCAGCTACTCAGTGCGAGTGACTGCACTTGTCGGGGACCGCGAGGGCACACCTGTCTCCATTGTTGTCACTACGCCGCCTGAGGCTCCGCCAGCCCTGGGGACGCTTCACGTGGTGCAGCGCGGGGAGCACTCGCTGAGGCTGCGCTGGGAGCCGGTGCCCAGAGCGCAGGGCTTCCTTCTGCACTGGCAACCTGAGGGTGGCCAGGAACAGTCCCGGGTCCTGGGGCCCGAGCTCAGCAGCTATCACCTGGACGGGCTGGAGCCAGCGACACAGTACCGCGTGAGGCTGAGTGTCCTAGGGCCAGCTGGAGAAGGGCCCTCTGCAGAGGTGACTGCGCGCACTGAGTCACCTCGTGTTCCAAGCATTGAACTACGTGTGGTGGACACCTCGATCGACTCGGTGACTTTGGCCTGGACTCCAGTGTCCAGGGCATCCAGCTACATCCTATCCTGGCGGCCACTCAGAGGCCCTGGCCAGGAAGTGCCTGGGTCCCCGCAGACACTTCCAGGGATCTCAAGCTCCCAGCGGGTGACAGGGCTAGAGCCTGGCGTCTCTTACATCTTCTCCCTGACGCCTGTCCTGGATGGTGTGCGGGGTCCTGAGGCATCTGTCACACAGACGCCAGTGTGCCCCCGTGGCCTGGCGGATGTGGTGTTCCTACCACATGCCACTCAAGACAATGCTCACCGTGCGGAGGCTACGAGGAGGGTCCTGGAGCGTCTGGTGTTGGCACTTGGGCCTCTTGGGCCACAGGCAGTTCAGGTTGGCCTGCTGTCTTACAGTCATCGGCCCTCCCCACTGTTCCCACTGAATGGCTCCCATGACCTTGGCATTATCTTGCAAAGGATCCGTGACATGCCCTACATGGACCCAAGTGGGAACAACCTGGGCACAGCCGTGGTCACAGCTCACAGATACATGTTGGCACCAGATGCTCCTGGGCGCCGCCAGCACGTACCAGGGGTGATGGTTCTGCTAGTGGATGAACCCTTGAGAGGTGACATATTCAGCCCCATCCGTGAGGCCCAGGCTTCTGGGCTTAATGTGGTGATGTTGGGAATGGCTGGAGCGGACCCAGAGCAGCTGCGTCGCTTGGCGCCGGGTATGGACTCTGTCCAGACCTTCTTCGCCGTGGATGATGGGCCAAGCCTGGACCAGGCAGTCAGTGGTCTGGCCACAGCCCTGTGTCAGGCATCCTTCACTACTCAGCCCCGGCCAGAGCCCTGCCCAGTGTATTGTCCAAAGGGCCAGAAGGGGGAACCTGGAGAGATGGGCCTGAGAGGACAAGTTGGGCCTCCTGGCGACCCTGGCCTCCCGGGCAGGACCGGTGCTCCCGGCCCCCAGGGGCCCCCTGGAAGTGCCACTGCCAAGGGCGAGAGGGGCTTCCCTGGAGCAGATGGGCGTCCAGGCAGCCCTGGCCGCGCCGGGAATCCTGGGACCCCTGGAGCCCCTGGCCTAAAGGGCTCTCCAGGGTTGCCTGGCCCTCGTGGGGACCCGGGAGAGCGAGGACCTCGAGGCCCAAAGGGGGAGCCGGGGGCTCCCGGACAAGTCATCGGAGGTGAAGGACCTGGGCTTCCTGGGCGGAAAGGGGACCCTGGACCATCGGGCCCCCCTGGACCTCGTGGACCACTGGGGGACCCAGGACCCCGTGGCCCCCCAGGGCTTCCTGGAACAGCCATGAAGGGTGACAAAGGCGATCGTGGGGAGCGGGGTCCCCCTGGACCAGGTGAAGGTGGCATTGCTCCTGGGGAGCCTGGGCTGCCGGGTCTTCCCGGAAGCCCTGGACCCCAAGGCCCCGTTGGCCCCCCTGGAAAGAAAGGAGAAAAAGGTGACTCTGAGGATGGAGCTCCAGGCCTCCCAGGACAACCTGGGTCTCCGGGTGAGCAGGGCCCACGGGGACCTCCTGGAGCTATTGGCCCCAAAGGTGACCGGGGCTTTCCAGGGCCCCTGGGTGAGGCTGGAGAGAAGGGCGAACGTGGACCCCCAGGCCCAGCGGGATCCCGGGGGCTGCCAGGGGTTGCTGGACGTCCTGGAGCCAAGGGTCCTGAAGGGCCACCAGGACCCACTGGCCGCCAAGGAGAGAAGGGGGAGCCTGGTCGCCCTGGGGACCCTGCAGTGGTGGGACCTGCTGTTGCTGGACCCAAAGGAGAAAAGGGAGATGTGGGGCCCGCTGGGCCCAGAGGAGCTACCGGAGTCCAAGGGGAACGGGGCCCACCCGGCTTGGTTCTTCCTGGAGACCCTGGCCCCAAGGGAGACCCTGGAGACCGGGGTCCCATTGGCCTTACTGGCAGAGCAGGACCCCCAGGTGACTCAGGGCCTCCTGGAGAGAAGGGAGACCCTGGGCGGCCTGGCCCCCCAGGACCTGTTGGCCCCCGAGGACGAGATGGTGAAGTTGGAGAGAAAGGTGACGAGGGTCCTCCGGGTGACCCGGGTTTGCCTGGAAAAGCAGGCGAGCGTGGCCTTCGGGGGGCACCTGGAGTTCGGGGGCCTGTGGGTGAAAAGGGAGACCAGGGAGATCCTGGAGAGGATGGACGAAATGGCAGCCCTGGATCATCTGGACCCAAGGGTGACCGTGGGGAGCCGGGTCCCCCAGGACCCCCGGGACGGCTGGTAGACACAGGACCTGGAGCCAGAGAGAAGGGAGAGCCTGGGGACCGCGGACAAGAGGGTCCTCGAGGGCCCAAGGGTGATCCTGGCCTCCCTGGAGCCCCTGGGGAAAGGGGCATTGAAGGGTTTCGGGGACCCCCAGGCCCACAGGGGGACCCAGGTGTCCGAGGCCCAGCAGGAGAAAAGGGTGACCGGGGTCCCCCTGGGCTGGATGGCCGGAGCGGACTGGATGGGAAACCAGGAGCCGCTGGGCCCTCTGGGCCGAATGGTGCTGCAGGCAAAGCTGGGGACCCAGGGAGAGACGGGCTTCCAGGCCTCCGTGGAGAACAGGGCCTCCCTGGCCCCTCTGGTCCCCCTGGATTACCGGGAAAGCCAGGCGAGGATGGCAAACCTGGCCTGAATGGAAAAAACGGAGAACCTGGGGACCCTGGAGAAGACGGGAGGAAGGGAGAGAAAGGAGATTCAGGCGCCTCTGGGAGAGAAGGTCGTGATGGCCCCAAGGGTGAGCGTGGAGCTCCTGGTATCCTTGGACCCCAGGGGCCTCCAGGCCTCCCAGGGCCAGTGGGCCCTCCTGGCCAGGGTTTTCCTGGTGTCCCAGGAGGCACGGGCCCCAAGGGTGACCGTGGGGAGACTGGATCCAAAGGGGAGCAGGGCCTCCCTGGAGAGCGTGGCCTGCGAGGAGAGCCTGGAAGTGTGCCGAATGTGGATCGGTTGCTGGAAACTGCTGGCATCAAGGCATCTGCCCTGCGGGAGATCGTGGAGACCTGGGATGAGAGCTCTGGTAGCTTCCTGCCTGTGCCCGAACGGCGTCGAGGCCCCAAGGGGGACTCAGGCGAACAGGGCCCCCCAGGCAAGGAGGGCCCCATCGGCTTTCCTGGAGAACGCGGGCTGAAGGGCGACCGTGGAGACCCTGGCCCTCAGGGGCCACCTGGTCTGGCCCTTGGGGAGAGGGGCCCCCCCGGGCCTTCCGGCCTTGCCGGGGAGCCTGGAAAGCCTGGTATTCCCGGGCTCCCAGGCAGGGCTGGGGGTGTGGGAGAGGCAGGAAGGCCAGGAGAGAGGGGAGAACGGGGAGAGAAAGGAGAACGTGGAGAACAGGGCAGAGATGGCCCTCCTGGACTCCCTGGAACCCCTGGGCCCCCCGGACCCCCTGGCCCCAAGGTGTCTGTGGATGAGCCAGGTCCTGGACTCTCTGGAGAACAGGGACCCCCTGGACTCAAGGGTGCTAAGGGGGAGCCGGGCAGCAATGGTGACCAAGGTCCCAAAGGAGACAGGGGTGTGCCAGGCATCAAAGGAGACCGGGGAGAGCCTGGACCGAGGGGTCAGGACGGCAACCCGGGTCTACCAGGAGAGCGTGGTATGGCTGGGCCTGAAGGGAAGCCGGGTCTGCAGGGTCCAAGAGGCCCCCCTGGCCCAGTGGGTGGTCATGGAGACCCTGGACCACCTGGTGCCCCGGGTCTTGCTGGCCCTGCAGGACCCCAAGGACCTTCTGGCCTGAAGGGGGAGCCTGGAGAGACAGGACCTCCAGGACGGGGCCTGACTGGACCTACTGGAGCTGTGGGACTTCCTGGACCCCCCGGCCCTTCAGGCCTTGTGGGTCCACAGGGGTCTCCAGGTTTGCCTGGACAAGTGGGGGAGACAGGGAAGCCGGGAGCCCCAGGTCGAGATGGTGCCAGTGGAAAAGATGGAGACAGAGGGAGCCCTGGTGTGCCAGGGTCACCAGGTCTGCCTGGCCCTGTCGGACCTAAAGGAGAACCTGGCCCCACGGGGGCCCCTGGACAGGCTGTGGTCGGGCTCCCTGGAGCAAAGGGAGAGAAGGGAGCCCCTGGAGGCCTTGCTGGAGACCTGGTGGGTGAGCCGGGAGCCAAAGGTGACCGAGGACTGCCAGGGCCGCGAGGCGAGAAGGGTGAAGCTGGCCGTGCAGGGGAGCCCGGAGACCCTGGGGAAGATGGTCAGAAAGGGGCTCCAGGACCCAAAGGTTTCAAGGGTGACCCAGGAGTCGGGGTCCCGGGCTCCCCTGGGCCTCCTGGCCCTCCAGGTGTGAAGGGAGATCTGGGCCTCCCTGGCCTGCCCGGTGCTCCTGGTGTTGTTGGGTTCCCGGGTCAGACAGGCCCTCGAGGAGAGATGGGTCAGCCAGGCCCTAGTGGAGAGCGGGGTCTGGCAGGCCCCCCAGGGAGAGAAGGAATCCCAGGACCCCTGGGGCCACCTGGACCACCGGGGTCAGTGGGACCACCTGGGGCCTCTGGACTCAAAGGAGACAAGGGAGACCCTGGAGTAGGGCTGCCTGGGCCCCGAGGCGAGCGTGGGGAGCCAGGCATCCGGGGTGAAGATGGCCGCCCCGGCCAGGAGGGACCCCGAGGACTCACGGGGCCCCCTGGCAGCAGGGGAGAGCGTGGGGAGAAGGGTGATGTTGGGAGTGCAGGACTAAAGGGTGACAAGGGAGACTCAGCTGTGATCCTGGGGCCTCCAGGCCCACGGGGTGCCAAGGGGGACATGGGTGAACGAGGGCCTCGGGGCTTGGATGGTGACAAAGGACCTCGGGGAGACAATGGGGACCCTGGTGACAAGGGCAGCAAGGGAGAGCCTGGTGACAAGGGCTCAGCCGGGTTGCCAGGACTGCGTGGACTCCTGGGACCCCAGGGTCAACCTGGTGCAGCAGGGATCCCTGGTGACCCGGGATCCCCAGGAAAGGATGGAGTGCCTGGTATCCGAGGAGAAAAAGGAGATGTTGGCTTCATGGGTCCCCGGGGCCTCAAGGGTGAACGGGGAGTGAAGGGAGCCTGTGGCCTTGATGGAGAGAAGGGAGACAAGGGAGAAGCTGGTCCCCCAGGCCGCCCCGGGCTGGCAGGACACAAAGGAGAGATGGGGGAGCCTGGTGTGCCGGGCCAGTCGGGGGCCCCTGGCAAGGAGGGCCTGATCGGTCCCAAGGGTGACCGAGGCTTTGACGGGCAGCCAGGCCCCAAGGGTGACCAGGGCGAGAAAGGGGAGCGGGGAACCCCAGGAATTGGGGGCTTCCCAGGCCCCAGTGGAAATGATGGCTCTGCTGGTCCCCCAGGGCCACCTGGCAGTGTTGGTCCCAGAGGCCCCGAAGGACTTCAGGGCCAGAAGGGTGAGCGAGGTCCCCCCGGAGAGAGAGTGGTGGGGGCTCCTGGGGTCCCTGGAGCTCCTGGCGAGAGAGGGGAGCAGGGGCGGCCAGGGCCTGCCGGTCCTCGAGGCGAGAAGGGAGAAGCTGCACTGACGGAGGATGACATCCGGGGCTTTGTGCGCCAAGAGATGAGTCAGCACTGTGCCTGCCAGGGCCAGTTCATCGCATCTGGATCACGACCCCTCCCTAGTTATGCTGCAGACACTGCCGGCTCCCAGCTCCATGCTGTGCCTGTGCTCCGCGTCTCTCATGCAGAGGAGGAAGAGCGGGTACCCCCTGAGGATGATGAGTACTCTGAATACTCCGAGTATTCTGTGGAGGAGTACCAGGACCCTGAAGCTCCTTGGGATAGTGATGACCCCTGTTCCCTGCCACTGGATGAGGGCTCCTGCACTGCCTACACCCTGCGCTGGTACCATCGGGCTGTGACAGGCAGCACAGAGGCCTGTCACCCTTTTGTCTATGGTGGCTGTGGAGGGAATGCCAACCGTTTTGGGACCCGTGAGGCCTGCGAGCGCCGCTGCCCACCCCGGGTGGTCCAGAGCCAGGGGACAGGTACTGCCCAGGACTGA

ヒトVII型コラーゲンのアミノ酸配列（2944 AA）（配列番号２）
MTLRLLVAALCAGILAEAPRVRAQHRERVTCTRLYAADIVFLLDGSSSIGRSNFREVRSFLEGLVLPFSGAASAQGVRFATVQYSDDPRTEFGLDALGSGGDVIRAIRELSYKGGNTRTGAAILHVADHVFLPQLARPGVPKVCILITDGKSQDLVDTAAQRLKGQGVKLFAVGIKNADPEELKRVASQPTSDFFFFVNDFSILRTLLPLVSRRVCTTAGGVPVTRPPDDSTSAPRDLVLSEPSSQSLRVQWTAASGPVTGYKVQYTPLTGLGQPLPSERQEVNVPAGETSVRLRGLRPLTEYQVTVIALYANSIGEAVSGTARTTALEGPELTIQNTTAHSLLVAWRSVPGATGYRVTWRVLSGGPTQQQELGPGQGSVLLRDLEPGTDYEVTVSTLFGRSVGPATSLMARTDASVEQTLRPVILGPTSILLSWNLVPEARGYRLEWRRETGLEPPQKVVLPSDVTRYQLDGLQPGTEYRLTLYTLLEGHEVATPATVVPTGPELPVSPVTDLQATELPGQRVRVSWSPVPGATQYRIIVRSTQGVERTLVLPGSQTAFDLDDVQAGLSYTVRVSARVGPREGSASVLTVRREPETPLAVPGLRVVVSDATRVRVAWGPVPGASGFRISWSTGSGPESSQTLPPDSTATDITGLQPGTTYQVAVSVLRGREEGPAAVIVARTDPLGPVRTVHVTQASSSSVTITWTRVPGATGYRVSWHSAHGPEKSQLVSGEATVAELDGLEPDTEYTVHVRAHVAGVDGPPASVVVRTAPEPVGRVSRLQILNASSDVLRITWVGVTGATAYRLAWGRSEGGPMRHQILPGNTDSAEIRGLEGGVSYSVRVTALVGDREGTPVSIVVTTPPEAPPALGTLHVVQRGEHSLRLRWEPVPRAQGFLLHWQPEGGQEQSRVLGPELSSYHLDGLEPATQYRVRLSVLGPAGEGPSAEVTARTESPRVPSIELRVVDTSIDSVTLAWTPVSRASSYILSWRPLRGPGQEVPGSPQTLPGISSSQRVTGLEPGVSYIFSLTPVLDGVRGPEASVTQTPVCPRGLADVVFLPHATQDNAHRAEATRRVLERLVLALGPLGPQAVQVGLLSYSHRPSPLFPLNGSHDLGIILQRIRDMPYMDPSGNNLGTAVVTAHRYMLAPDAPGRRQHVPGVMVLLVDEPLRGDIFSPIREAQASGLNVVMLGMAGADPEQLRRLAPGMDSVQTFFAVDDGPSLDQAVSGLATALCQASFTTQPRPEPCPVYCPKGQKGEPGEMGLRGQVGPPGDPGLPGRTGAPGPQGPPGSATAKGERGFPGADGRPGSPGRAGNPGTPGAPGLKGSPGLPGPRGDPGERGPRGPKGEPGAPGQVIGGEGPGLPGRKGDPGPSGPPGPRGPLGDPGPRGPPGLPGTAMKGDKGDRGERGPPGPGEGGIAPGEPGLPGLPGSPGPQGPVGPPGKKGEKGDSEDGAPGLPGQPGSPGEQGPRGPPGAIGPKGDRGFPGPLGEAGEKGERGPPGPAGSRGLPGVAGRPGAKGPEGPPGPTGRQGEKGEPGRPGDPAVVGPAVAGPKGEKGDVGPAGPRGATGVQGERGPPGLVLPGDPGPKGDPGDRGPIGLTGRAGPPGDSGPPGEKGDPGRPGPPGPVGPRGRDGEVGEKGDEGPPGDPGLPGKAGERGLRGAPGVRGPVGEKGDQGDPGEDGRNGSPGSSGPKGDRGEPGPPGPPGRLVDTGPGAREKGEPGDRGQEGPRGPKGDPGLPGAPGERGIEGFRGPPGPQGDPGVRGPAGEKGDRGPPGLDGRSGLDGKPGAAGPSGPNGAAGKAGDPGRDGLPGLRGEQGLPGPSGPPGLPGKPGEDGKPGLNGKNGEPGDPGEDGRKGEKGDSGASGREGRDGPKGERGAPGILGPQGPPGLPGPVGPPGQGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGSVPNVDRLLETAGIKASALREIVETWDESSGSFLPVPERRRGPKGDSGEQGPPGKEGPIGFPGERGLKGDRGDPGPQGPPGLALGERGPPGPSGLAGEPGKPGIPGLPGRAGGVGEAGRPGERGERGEKGERGEQGRDGPPGLPGTPGPPGPPGPKVSVDEPGPGLSGEQGPPGLKGAKGEPGSNGDQGPKGDRGVPGIKGDRGEPGPRGQDGNPGLPGERGMAGPEGKPGLQGPRGPPGPVGGHGDPGPPGAPGLAGPAGPQGPSGLKGEPGETGPPGRGLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGQAVVGLPGAKGEKGAPGGLAGDLVGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKGAPGPKGFKGDPGVGVPGSPGPPGPPGVKGDLGLPGLPGAPGVVGFPGQTGPRGEMGQPGPSGERGLAGPPGREGIPGPLGPPGPPGSVGPPGASGLKGDKGDPGVGLPGPRGERGEPGIRGEDGRPGQEGPRGLTGPPGSRGERGEKGDVGSAGLKGDKGDSAVILGPPGPRGAKGDMGERGPRGLDGDKGPRGDNGDPGDKGSKGEPGDKGSAGLPGLRGLLGPQGQPGAAGIPGDPGSPGKDGVPGIRGEKGDVGFMGPRGLKGERGVKGACGLDGEKGDKGEAGPPGRPGLAGHKGEMGEPGVPGQSGAPGKEGLIGPKGDRGFDGQPGPKGDQGEKGERGTPGIGGFPGPSGNDGSAGPPGPPGSVGPRGPEGLQGQKGERGPPGERVVGAPGVPGAPGERGEQGRPGPAGPRGEKGEAALTEDDIRGFVRQEMSQHCACQGQFIASGSRPLPSYAADTAGSQLHAVPVLRVSHAEEEERVPPEDDEYSEYSEYSVEEYQDPEAPWDSDDPCSLPLDEGSCTAYTLRWYHRAVTGSTEACHPFVYGGCGGNANRFGTREACERRCPPRVVQSQGTGTAQD*
　ある実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号１の核酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。別の実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号１の核酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個の塩基が挿入、欠失、置換、または付加された核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。さらなる実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号１の核酸配列を含むか、配列番号１の核酸配列からなる。
　ある実施形態において、VII型コラーゲンは、配列番号２のアミノ酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。別の実施形態において、VII型コラーゲンは、配列番号２のアミノ酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個のアミノ酸残基が挿入、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、VII型コラーゲンは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
　ある実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。別の実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個のアミノ酸残基が挿入、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。
　本明細書における、核酸配列またはアミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態に（一致が最大となる状態に）アラインメントされた２つの配列間で一致する塩基またはアミノ酸残基の割合を意味する。ここで、比較対象の配列は、2つの配列の最適なアラインメントにおいて、挿入、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Vector NTI（登録商標）ソフトウェア、GENETYX（登録商標） ver. 12）を用いて求めることもできる。
　細胞を遺伝子改変する方法は、特に限定されない。ある実施形態において、細胞は、CRISPRシステム（例えば、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1）、TALEN、ZFNなどのゲノム編集により、遺伝子改変される。別の実施形態において、細胞は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターにより、遺伝子改変される。さらなる実施形態において、細胞は、CRISPR/Cas9により遺伝子改変される。さらなる実施形態において、細胞は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターにより遺伝子改変される。
　ゲノム編集による場合、ゲノムに切断を生じさせるとともに、目的の配列を含むドナーベクターを細胞に導入することにより、当該配列をゲノムの切断部位に挿入することができる。ゲノムに挿入する配列は、COL7A1遺伝子、またはCOL7A1遺伝子の変異を含む部位と置換するための配列（例えば、COL7A1遺伝子の部分配列）でありうる。ドナーベクターは、目的の配列に加えて、目的の配列の発現を制御するプロモーターやエンハンサーなどの調節配列や細胞選択のための薬剤耐性遺伝子などの他の要素を含んでよく、その両端にゲノムの挿入部位の両端に相同な配列を含んでもよい。ドナーベクターは、非相同性末端結合または相同組み換えにより、所望の部位に導入されうる。ドナーベクターとしては、プラスミドや、アデノ随伴ウイルスベクター、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用することができる。
　CRISPRシステムでは、Cas9またはCas12（例えば、Cas12a（Cpf1ともいう）、Cas12b、Cas12e）などのエンドヌクレアーゼが、特定の塩基配列であるPAM配列を認識し、エンドヌクレアーゼの作用によって標的DNAの二本鎖を切断する。エンドヌクレアーゼがCas9であれば、PAM配列の約3-4塩基上流を切断する。エンドヌクレアーゼとしては、S. pyogenes、S. aureus、N. meningitidis、S. thermophilus、またはT. denticolaのCas9、L. bacterium ND2006またはAcidaminococcus sp. BV3L6のCpflなどが挙げられる。PAM配列はエンドヌクレアーゼに依存し、例えば、S. pyogenesのCas9のPAM配列はNGGである。gRNAは、PAM配列の上流約20塩基の配列（標的配列）またはこれに相補的な配列を5’末端側に含み、標的配列にエンドヌクレアーゼを動員する役割を果たす。gRNAのうち、標的配列（またはこれに相補的な配列）以外の部分の配列は、使用するエンドヌクレアーゼに応じて当業者が適宜決定しうる。gRNAは、標的配列またはそれに相補的な配列を含みgRNAの配列特異性を担うcrRNA（CRISPR RNA）と、二本鎖を形成してCas9との複合体形成に寄与するtracrRNA（Trans-activating crRNA）とを含み得る。crRNAとtracrRNAとは、別の分子として存在してもよい。エンドヌクレアーゼがCpf1の場合、crRNAのみでgRNAとして機能する。本明細書において、gRNAの機能に必要な要素を一本鎖上に含むgRNAを特にsgRNAと記載する場合がある。gRNAの配列は、CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/)など、標的配列の選択およびgRNAの設計に利用可能なツールにより決定することができる。
　細胞に、gRNAをコードする核酸配列とエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むベクターを導入し発現させてもよく、細胞外で作製したgRNAとエンドヌクレアーゼのタンパク質とを細胞に導入してもよい。なお、エンドヌクレアーゼは核移行シグナルを備えていてもよい。gRNAをコードする核酸配列とエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列とは、別のベクター上に存在してもよい。ベクター、gRNA、およびエンドヌクレアーゼは、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法などにより細胞に導入することができるが、これらの方法に限定されない。
　ある実施形態において、COL7A1遺伝子のゲノムへの導入に用いることができるgRNAは、配列番号３～５のいずれかの配列またはこれに相補的な配列を含む。
　ウイルスベクターによる場合、インテグラーゼ活性を有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いると、COL7A1遺伝子を細胞のゲノムに導入することができる。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損型であってもよい。インテグラーゼ欠損型ベクターは、例えば、インテグラーゼ遺伝子の変異によりインテグラーゼ活性を欠く。インテグラーゼ欠損型ベクターや、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを用いると、通常、ベクターに組み込まれた配列は細胞のゲノムに導入されない。例えば、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターや、アデノウイルスベクターにCOL7A1遺伝子を組み込んだ場合は、細胞内(核内)に存在するベクターのCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンが発現される。
　ウイルスベクターは、COL7A1遺伝子をコードする配列を含み、COL7A1遺伝子の発現を制御するプロモーターやエンハンサーなどの調節配列や細胞選択のための薬剤耐性遺伝子などの他の要素を含んでよい。ウイルスベクターは、当業界に知られるいずれの方法で作製してもよい。例えば、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、両端のLTR配列（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル、および目的の配列を含むウイルスベクタープラスミドを、Gag、Pol、Envなどのウイルスの構造タンパク質を発現する1以上のプラスミドベクターとともにパッケージング細胞に導入することにより、またはこれら構造タンパク質を発現するパッケージング細胞に導入することにより、作製することができる。パッケージング細胞としては、293T細胞、293細胞、HeLa細胞、COS1細胞、COS7細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、シュードタイプ化されていてもよく、例えば、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質（VSV-G）などのエンベロープタンパク質を発現してもよい。作製されたウイルスベクターを標的細胞に感染させることで、目的の配列を標的細胞に導入することができる。
　ある実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターとしては、HIV（human immunodeficiency virus）（例えば、HIV-1およびHIV-2)、SIV（simian immunodeficiency virus）、FIV（feline immunodeficiency virus）、MVV（Maedi-Visna virus）、EV1（Maedi-Visna-like virus）、EIAV（equine infectious anemia virus）、およびCAEV（caprine arthritis encephalitis virus）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、レンチウイルスベクターは、HIVである。
　一例として、レンチウイルスベクターは、下記のように製造することができる。まず、ウイルスゲノムをコードするウイルスベクタープラスミドと、Gag、Pol、およびRev（および場合によりTat）を発現する1以上のプラスミドベクターおよびVSV-Gなどのエンベロープタンパク質を発現する1以上のプラスミドベクターとを、パッケージング細胞に導入する。ウイルスベクタープラスミドは、両端のLTR配列（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル、並びにCOL7A1遺伝子およびその発現を制御するプロモーター（例えば、CMVプロモーター、CAGプロモーター、EF1αプロモーター、PGKプロモーター、またはhCEFプロモーター）を含む。5'LTRは、ウイルスRNAゲノムの転写を誘導するプロモーターとして機能するが、RNAゲノムの発現を高めるため、CMVプロモーターなどの別のプロモーターに置換されていてもよい。細胞内で、ベクタープラスミドからウイルスRNAゲノムが転写され、パッケージングされて、ウイルスコアが形成される。ウイルスコアは、パッケージング細胞の細胞膜に輸送され、細胞膜に封入されて、パッケージング細胞からウイルス粒子として放出される。放出されたウイルス粒子は、パッケージング細胞の培養上清から回収することができる。例えば、ウイルス粒子は、遠心分離、フィルターろ過、カラム精製などの通常の精製方法により、回収することができる。また、レンチウイルスベクターは、Lentiviral High Titer Packaging Mix、Lenti-XTM Packaging Single Shots （Takara Bio Inc.）、ViraSafeTM レンチウイルスコンプリート発現システム（Cell Biolabs Inc.）などのキットを用いて製造することができる。アデノ随伴ウイルスベクターは、AAVpro（登録商標） Helper Free System （Takara Bio Inc.）などのキットを用いて製造することができる。
　ある態様において、本開示は、レンチウイルスベクターの製造に用いられるプラスミドであって、EF1αプロモーターと、前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子とを有するプラスミドを提供する。さらなる態様において、本開示は、EF1αプロモーターと、前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子とを有するレンチウイルスベクターを提供する。
　EF1αプロモーターの代表的配列を配列番号６に示す。

EF1αプロモーター（配列番号６）
GTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCTTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAA

　ある実施形態において、EF1αプロモーターは、配列番号６の核酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。別の実施形態において、EF1αプロモーターは、配列番号６の核酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個の塩基が挿入、欠失、置換、または付加された核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。さらなる実施形態において、EF1αプロモーターは、配列番号６の核酸配列を含むか、配列番号６の核酸配列からなる。
　目的の配列が導入された細胞は、サザンブロッティングやPCRにより確認することができる。目的の配列は、対立遺伝子の少なくとも一方に導入されていればよい。
　一実施形態では、細胞シートは、栄養障害型表皮水疱症患者の患部に移植される。好ましい実施形態では、細胞シートは、皮膚の表皮が欠損した部分に移植される。皮膚の表皮が欠損した部分の具体例としては、皮膚潰瘍面が挙げられる。また、細胞シートは、表皮が真皮から剥離した部分に移植してもよい。一実施形態では、細胞シートは、皮膚患部に貼付することにより、移植される。その際、細胞シートが真皮に密着するように、細胞シートを患部に貼付することが好ましい。
　すなわち、本開示の一態様は、栄養障害型表皮水疱症を治療するための方法であって、本開示の細胞シートを栄養障害型表皮水疱症患者の皮膚に移植することを含む方法である。
　本開示の一態様は、本開示の細胞シートを含む組成物である。組成物は栄養障害型表皮水疱症の治療に用いられうる。組成物は、細胞シートに加えて、医薬上許容される媒体および/または添加物を含んでもよい。医薬上許容される媒体としては、水、培地、生理食塩水、ブドウ糖、D-ソルビトール、またはD-マンニトールなどを含む輸液、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられる。添加物としては、溶解補助剤、安定剤、防腐剤などが挙げられる。組成物は、凍結されていてもよく、DMSO、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、デキストラン、スクロースなどの凍結保護剤を含んでもよい。
　以下、細胞シートの製造方法の実施形態について説明する。図１に、細胞シートの製造方法の概要を示す。各工程の概略は、以下の通りである。
１．栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液を採取する。
２．採取した体液の少なくとも一部分を培地に播種し、培養する。
３．培養容器の底に付着した細胞を得る。そして、必要に応じ、この細胞を継代する。
４．得られた細胞に、VII型コラーゲン遺伝子を導入する。
５．VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養し、必要に応じ、継代を行う。
６．VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を、培養容器に播種する。
７．培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す。
　１．水疱内溶液採取
　水疱内の体液の採取方法については、上述したので省略する。
　２．水疱内溶液の播種・培養
　採取した体液の少なくとも一部分を培地に播種し、培養する。体液の少なくとも一部分とは、体液の一構成成分を指す。一構成成分としては、体液を遠心分離した後の沈殿物が挙げられる。また、磁気ビーズやフローサイトメーター等、特定の細胞を分離可能な装置を用いて得られた画分も、一構成成分として挙げられる。上述したように、水疱内の体液、体液の一構成成分、あるいは体液から得た細胞は、酵素処理しないで培地に播種することが望ましい。なお、播種、培養方法については、上述したので省略する。
　３．付着細胞継代
　播種・培養後、培養容器の底に付着した細胞を得る。そして、必要に応じ、細胞の継代を、適宜繰り返し行う。これにより、遺伝子導入に必要な数の細胞が得られる。継代の途中で、必要に応じ、細胞を凍結して保存することもできる。水疱由来細胞の凍結保存は、一般的な細胞凍結保存液を用いて一般的な作業工程で行うことができる。凍結保存液は、動物細胞の凍結保存に用いることができる溶液であればよく、例えば、CELLBANKER（登録商標） 1（ゼノジェンファーマ社）、STEM-CELLBANKER GMP grade（ゼノジェンファーマ社）、STEM-CELLBANKER DMSO Free GMP grade（ゼノジェンファーマ社）、HSC-BANKER（登録商標） GMP grade（ゼノジェンファーマ社）、あるいは５～１０%のDMSOを添加した培地、などが挙げられる。その中でも、STEM-CELLBANKER GMP grade、HSC-BANKER（登録商標） GMP grade等の幹細胞用の凍結保存液が好ましく用いられる。また、細胞凍結保存液は無血清であることが好ましい。
　４．遺伝子導入
　継代した細胞に、VII型コラーゲン遺伝子を導入する。遺伝子導入方法については、上述したので省略する。この工程では、レンチウイルスベクターを用いて水疱由来細胞に、VII型コラーゲン遺伝子を導入するのが好ましい。
　５．遺伝子導入細胞継代
　VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養し、必要に応じ、細胞の継代を、適宜繰り返し行う。これにより、細胞シートの作成に必要な数の細胞が得られる。また、継代の途中で必要に応じ、この細胞を凍結して保存することもできる。細胞の凍結保存には、上述した凍結保存液を用いることができる。
　６．遺伝子導入細胞播種
　VII型コラーゲン遺伝子が導入された水疱由来細胞を、培養容器に播種する。このとき、細胞を、オーバーコンフルエントとなるように培養容器に播種することが好ましい。具体的には、細胞を、コンフルエンシー１５０％以上となるように播種することが好ましく、３００％以上となるように播種することがより好ましく、６００％以上となるように播種することがさらに好ましい。このようなコンフルエンシーで細胞を播種することにより、シートの移植に適した層構造の細胞シートが得られる。
　また、VII型コラーゲン遺伝子が導入された水疱由来細胞を、1x104 cells/cm2以上の細胞密度で培養容器に播種することが好ましく、5x104 cells/cm2以上の細胞密度で播種することがより好ましく、1x105 cells/cm2以上の細胞密度で播種することがさらに好ましい。このような密度で細胞を播種すると、細胞シート中の細胞の層の数が至適なものとなり、機械的強度も優れかつ細胞シート内部の細胞にも酸素が行き渡るようになる。
　培養容器には、表面がポリスチレンで構成された通常の培養容器を用いることができる。すなわち、温度応答性培養容器を用いなくてもよい。本発明者は、水疱由来細胞は温度応答性培養容器を用いなくても培養容器の底から剥離できることを発見した。もちろん、水疱由来細胞を、温度応答性培養容器で培養してもよい。温度応答性培養容器としては、温度応答性ポリマーで表面が加工された培養容器が挙げられる。温度応答性ポリマーは、特定の温度、例えば32℃で疎水性から親水性に変化する。このため、例えば３７℃では、細胞は温度応答性ポリマーに付着し、温度を下げて例えば２０℃にすると、細胞は温度応答性ポリマーに付着できなくなり、培養容器の底から剥離する。
　７．細胞シート取り出し
　培養した水疱由来細胞を、培養容器から細胞シートとして取り出す。水疱由来細胞は、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素で処理しないでも、培養容器から細胞シートとして剥離できることを、本発明者は発見した。水疱由来細胞で構成された細胞シートは、温度応答性培養容器ではない通常の培養容器の底からでも、ピンセットだけで剥離し、取り出すことができる。ただし、細胞の形態を保持するためには支持体を用いることが望ましい。もちろん、温度応答性培養容器を用いて細胞シートを作成し、容器の温度を下げることによって細胞シートを剥離させ、取り出してもよい。この場合も、細胞の形態を保持するために支持体を用いることが望ましい。支持体とは、細胞シートを付着させて細胞シートの強度を補強できる膜材・シート材を意味し、例えば、不織布、親水性PVDF膜、ニトロセルロース膜、ガーゼ、生体吸収性材料からなる膜などが挙げられる。
　本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。

［１］
　栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液に由来し、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を含み、栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植されることを特徴とする細胞シート。
［２］
　VII型コラーゲン遺伝子が細胞のゲノムに導入されている、前記１に記載の細胞シート。
［３］
　細胞には、VII型コラーゲン遺伝子発現カセットが導入されており、
　VII型コラーゲン遺伝子発現カセットは、EF1αプロモーターと、EF1αプロモーターの下流に配置されたVII型コラーゲン遺伝子とを含む、前記１または２に記載の細胞シート。
［４］
　VII型コラーゲン遺伝子発現カセットが細胞のゲノムに導入されている、前記１～３のいずれかに記載の細胞シート。
［５］
　VII型コラーゲン遺伝子が、配列番号１の核酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記１～４のいずれかに記載の細胞シート。
［６］
　細胞がシートの厚さ方向に重なり合っている、前記１～５のいずれかに記載の細胞シート。
［７］
　細胞シートの縦断面では、シートの表面近傍の細胞密度が、シートの中心部の細胞密度よりも高い、前記１～６のいずれかに記載の細胞シート。
［８］
　厚さが５～５０μｍである、前記１～７のいずれかに記載の細胞シート。
［９］
　患部に移植される、前記１～８のいずれかに記載の細胞シート。
［１０］
　表皮が欠損した部分に移植される、前記１～９のいずれかに記載の細胞シート。
［１１］
　前記１～１０のいずれかに記載の細胞シートを含む、栄養障害型表皮水疱症を治療するための組成物。
［１２］
　細胞シートが患部に移植される、前記１１に記載の組成物。
［１３］
　細胞シートが表皮が欠損した部分に移植される、前記１０または１１に記載の組成物。
［１４］
　栄養障害型表皮水疱症を治療するための方法であって、前記１～１０のいずれかに記載の細胞シートを栄養障害型表皮水疱症患者の皮膚に移植することを含む方法。
［１５］
　細胞シートを患部に移植する、前記１４に記載の方法。
［１６］
　細胞シートを表皮が欠損した部分に移植する、前記１４または１５に記載の方法。
［１７］
　栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植される細胞シートの製造方法であって、
　　栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液の少なくとも一部分を、培地に播種する工程と、
　　培養容器の底に付着した細胞を得る工程と、
　　前記細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する工程と、
　　VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養する工程と、
　　培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す工程と、
を有することを特徴とする細胞シートの製造方法。
［１８］
　水疱内の体液から得た細胞を、酵素処理しないで培地に播種する、前記１７に記載の細胞シートの製造方法。
［１９］
　レンチウイルスベクターを用いて細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する、前記１７または１８に記載の細胞シートの製造方法。
［２０］
　レンチウイルスベクターがVII型コラーゲン遺伝子発現カセットを含み、VII型コラーゲン遺伝子発現カセットが、EF1αプロモーターと、EF1αプロモーターの下流に配置されたVII型コラーゲン遺伝子とを含む、前記１７～１９のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
［２１］
　VII型コラーゲン遺伝子が、配列番号１の核酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記１７～２０のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
［２２］
　VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞をオーバーコンフルエントとなるように播種する工程をさらに含む、前記１７～２１のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
［２３］
　1x104 cells/cm2以上の細胞密度で、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養容器に播種する工程をさらに含む、前記１７～２２のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
［２４］
　酵素処理しないで、培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す、前記１７～２３のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下に記載される態様に限定されるものではない。
1. 水疱由来細胞の取得
　栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内溶液を採取し、300gで 5分遠心した。得られた沈殿を培地（Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)にペニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ終濃度100unit/mLおよび100μg/mLとなるよう添加したもの）で懸濁してコラーゲンIコート 6-well plateに播種し、37℃、5%CO2で培養することにより、付着性の細胞を得た。なお、水疱内溶液の採取から培地への播種までの所要時間は、患者によって異なるが、18分～1時間の範囲内であった。その後、適宜培地交換と継代を行って所望の細胞数まで増殖させた（培養開始20日後までの培養経過を図２に示す）。かかる方法によって得た細胞を、以下において「水疱由来細胞」とも称する。下記表面マーカー解析と分化誘導の実験には3継代目の細胞、遺伝子導入には3～4継代目の細胞をそれぞれ用いた。また、上記の培地に代えてMesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)とMSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社、PT-3001）の等量混合培地や、Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium (タカラバイオ社、Y50200)を用いた場合でも同等の水疱由来細胞が得られることを確認した。予備検討として、水疱内溶液を患者の水疱内から採取してから培地に播種するまでの時間と培養後にプレートに形成されたコロニー数との相関を調べたところ、水疱内溶液を採取後1時間以内に播種すると多数のコロニーが得られ、採取後3時間を超えてから播種すると極めて少数のコロニーしか得られない、あるいはほとんどコロニーが得られないという結果であった。
2. 水疱由来細胞の特徴決定
a) 表面マーカー解析（FACS）
　上記1.で得られた水疱由来細胞と、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、BM-MSCとも称する）[PromoCell社 (Heidelberg, Germany) または Lonza社 (Basel, Switzerland)より購入]について、以下の手順で表面マーカー解析を行った：　細胞をAccutase-Solution (PromoCell社、C-41310)を用いてプレートから剥がし、培地で洗浄した後、細胞数の計測結果を基に、2本のチューブに細胞を10万個ずつ分取した。細胞をFlow Cytometry Staining Buffer (1X) (R&D Systems社、FC001)で1回洗浄し、100μlのFlow Cytometry Staining Buffer (1X)に再懸濁した。Fc受容体のブロッキングを行うため、Human TruStain FcXTM (BioLegend社、422301)を5μl加えて、氷上で10分間反応させた。1本のチューブには、Human Mesenchymal Stem Cell Verification Flow Kit (R&D Systems社、FMC020)に含まれるCD73-CFS Mouse IgG2B、CD90-APC Mouse IgG2A、およびNegative Marker Cocktail（CD45-PE Mouse IgG1、CD34-PE Mouse IgG1、CD11b-PE Mouse IgG2B、CD79A-PE Mouse IgG1、HLA-DR-PE Mouse IgG1）をそれぞれ10μlずつ加え、さらにBrilliant Violet 421TM anti-human CD105 Antibody (BioLegend社、323219)を5μl加えて、室温・遮光下で30分間反応させた。もう1本のチューブは陰性コントロールとして使用するため、それぞれのアイソタイプコントロール抗体を同量加えて、室温・遮光下で30分間反応させた。細胞を2mlのFlow Cytometry Staining Buffer (1X)で1回洗浄し、300μlのFlow Cytometry Staining Buffer (1X)に再懸濁した後、BD FACSAria(BD社)で解析した。また、CD31についても以下の手順でFACS解析を行い、水疱由来細胞およびヒトBM-MSCにおける発現有無を確認した：細胞をAccutase-Solution (PromoCell社、C-41310)を用いてプレートから剥がし、培地で洗浄した後、細胞数の計測結果を基に、2本のチューブに細胞を10万個ずつ分取した。細胞を2%FBS含有PBSで洗浄し、100μlの2%FBS含有PBSに再懸濁した。Fc受容体のブロッキングを行うため、Human TruStain FcXTM (BioLegend社, 422301)を5μl加えて、氷上で10分間反応させた。1本のチューブには、APC anti-human CD31 Antibody (BioLegend社, 303116)を5μl(タンパク質量0.4μg)加えて、氷上・遮光下で60分間反応させた。もう1本のチューブは陰性コントロールとして使用するため、APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody (BioLegend社, 400120)を2μl(タンパク質量0.4μg)加えて、氷上・遮光下で60分間反応させた。細胞を2mlの2%FBS含有PBSで1回洗浄した後、300μlの2%FBS含有PBSに再懸濁し、BD FACSAria(BD社)で解析した。
　FACS解析の結果、水疱由来細胞とBM-MSCはいずれも、CD73、CD105およびCD90が陽性であり、CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31が陰性であった（図３）。
b) 分化誘導（骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞）
　上記1.で得られた水疱由来細胞とBM-MSCについて、下記の条件で骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞への分化誘導を行った。
骨芽細胞への分化誘導：
　細胞を、0.1μM Dexamethasone、0.2mM Ascorbic acid 2-phosphate、10mM Glycerol 2-phosphate（数値はいずれも終濃度）を含む培地で、37℃、5%CO2の条件下、3週間培養（週2回培地交換）して骨芽細胞への分化を誘導した。TRACP & ALP Assay Kit (タカラバイオ社, MK301)を製品マニュアル通りに用いて、アルカリホスファターゼ（ALP）染色を行った。
脂肪細胞への分化誘導：
　細胞を、1μM Dexamethasone、0.5mM 3-Isobutyl-1-methylanxthine (IBMX)、10μg/mL Insulin、100μM Indomethacin（数値はいずれも終濃度）を含む培地で、37℃、5%CO2の条件下、3週間培養（週2回培地交換）して脂肪細胞への分化を誘導した。リピットアッセイキット（コスモ・バイオ社、AK09F）を製品マニュアル通りに用いて、細胞のオイルレッドO染色を行った。
軟骨細胞への分化誘導：
　Human Mesenchymal Stem Cell (hMSC) Chondrogenic Differentiation Medium Bullet Kit(tm) (Lonza社, PT-3003)の構成品を指示通りに混合して、軟骨分化誘導培地(不完全培地)を調製した。これにRecombinant Human TGF-beta 3 Protein (R&D Systems社, 243-B3)を、最終濃度10ng/mlになるように添加して、軟骨分化誘導培地(完全培地)を使用毎に調製した。第三継代細胞をAccutase-Solution PromoCell社, C-41310)で剥がし、培地で洗浄した後、細胞数の計測結果を基に、250,000個の細胞を15mlポリプロピレンコニカルチューブに分取した。細胞を軟骨分化誘導培地(不完全培地)で2回洗浄し、上清を除去した後、500μlの軟骨分化誘導培地(完全培地)で懸濁した。150gで5分間遠心して細胞のペレットを形成させ、ふたを緩めてCO2インキュベーターに静置し（37℃、5%CO2）、その後2～3日毎に培地(完全培地)を交換した。3週間経過後にペレットを取り出して4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作成してアルシアンブルー染色により軟骨細胞由来のプロテオグリカンを染色した。ポジティブコントロールとしてヒト骨髄由来間葉系幹細胞についても同様の分化誘導操作を行った。
　上記分化誘導実験の結果を図４に示す。BM-MSCはALP染色、オイルレッドO染色、およびアルシアンブルー染色の全てにおいて陽性であった。水疱由来細胞は、ALP染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）、オイルレッドO染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）、アルシアンブルー染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）であった。
c) VII型コラーゲンの発現能力および分泌能力の評価
　水疱由来細胞がどの程度VII型コラーゲンを発現しているか、そして分泌しているかを、ウエスタンブロットで調べた。この実験では、VII型コラーゲンを発現するが、アミノ酸変異により発現したVII型コラーゲンが殆ど機能していないと考えられる患者から得られた水疱由来細胞を用いた。まず、ヒト表皮角化細胞（以下KCと称する）、ヒト皮膚線維芽細胞（以下FBと称する）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、MSCと称する）、及び表皮水疱症患者の水疱由来細胞（以下BFC; blister fluid cellとも称する）を、下記表１に示す培地でそれぞれ培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　細胞が90-95%コンフルエントに到達したら、D-PBS(-)で洗浄し、アスコルビン酸（nacalai tesque社、13048-42、終濃度50 ug/ml）とプロテアーゼ阻害剤カクテル（SIGMA社、P1860-1ML、1/400倍希釈）を添加したそれぞれの培地（サプリメント未添加）を加え、CO2インキュベーターで24時間培養した。培養後、培地はメタノール・クロロホルム沈殿法を用いて濃縮した。また、RIPA buffer(nacalai tesque社、08714－04)を用いて、細胞から細胞ライセートを調製した。それぞれのライセートをタンパク質濃度をもとに補正し、LDS sample buffer、sample reducing agent（それぞれInvitrogen社、NP0007、NP0009）を用いて、電気泳動用サンプルを調製した。3-8% NuPAGEゲル（Invitrogen社、EA0375BOX）を用いて電気泳動を行った後、PVDF膜（Millipore社、IPVH07850）に転写し、一次抗体にAnti-Col7 (Atlas社、HPA042420)、二次抗体にAnti-Rabbit IgG-HRP（GE helthcare社、NA9340-1ML）を用いて抗体反応を行った。そして、Chemi-lumi-one ultra (nacalai tesque社、11644－40)、 Chemi DOC (BioRad社、17001402JA)を用いてバンドを検出し、Image Lab software（BioRad社、1709690）で解析、定量化した。また、濃縮した培地に対しても同様にウエスタンブロットを行い、VII型コラーゲンの濃度を定量化した。
　結果を図５に示す。図５（上）に示すように、細胞ライセートに対してウエスタンブロットを行った結果、水疱由来細胞のCOL7A発現量は、皮膚線維芽細胞および骨髄由来間葉系幹細胞よりも高く、表皮角化細胞と遜色ないレベルであった。また、図５（下）に示すように、細胞を培養した培地の濃縮物に対してウエスタンブロットを行った結果、水疱由来細胞からのCOL7A分泌量は、どの細胞よりも多かった 。以上の結果から、水疱由来細胞は、遺伝子を導入してVII型コラーゲンを発現させる細胞として、至適であると推察される。
3. ゲノム編集の設計
　ヒトゲノム内のAAVS1（Adeno-associated virus integration site 1）領域においてCRISPR-Cas9システムによる切断効率が良好な位置を選択するため、３種類のsgRNAを作製した。AAVS1領域は、遺伝子導入による影響を受けにくい安全領域（セーフ・ハーバー／safe harbor）である。CRISPR-Cas9システムは「NGG」の塩基配列を認識し、その３塩基上流を切断することから、末端に「GG」が配置される領域を選択し、「NGG」の上流２０塩基の標的配列を含むsgRNA（sgAAVS1-#1～#3）を設計した（図６、上；表２）。
　配列番号３～５のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドとその相補鎖をアニーリングした後にeSpCas9(1.1) (Addgene plasmid # 71814)のBbs1サイトにクローニングすることにより、Cas9タンパク質とsgRNAを発現するプラスミドを作成した（それぞれ、eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#1、eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#2、eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#3）。このプラスミド（2.5 μg）を、6ウェルディッシュに播種したHEK293細胞（ヒト胎児腎細胞株）にLipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific)により導入した。トランスフェクションの48時間後、細胞からゲノムDNAを抽出し、標的部位を含む領域をPCRで増幅した。PCR増幅断片は熱処理により一本鎖にし、ゆっくり冷却することでアニーリングさせた後に、ミスマッチ部位特異的エンドヌクレアーゼで処理した。これを電気泳動で分画し、ゲノム切断によって導入された挿入または欠失変異の程度をバンドの濃さで測定し、以下の計算式によりゲノム編集効率を算出した(式中、aは消化されなかったバンド濃度、b, cは切断されたバンド濃度を示す)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　sgAAVS1-#1～#3のいずれのsgRNAによってもコントロールとは異なる短いDNA断片が生じ、二重鎖切断が生じることが確認された（図６、下）。以下の実験では、最も切断効率の高かったsgAAVS1-#3を使用した。
4. 水疱由来細胞へのCOL7A1遺伝子の導入
　AAVS1領域へのCOL7A1遺伝子の導入のため、CAGプロモーターの制御下にCOL7A1遺伝子を発現するプラスミドを設計した（図７）。COL7A1 cDNAは、Flexi ORF sequence-verified clone (Promega, Madison, WI, USA)より得た。COL7A1 cDNAをpENTR1Aプラスミド（Thermo Fisher Scientific, A10462）にサブクローニングし、pENTR1A-COL7A1を得た。LRリコンビナーゼ (Thermo Fisher Scientific) を用いたGateway反応によってpENTR1A-COL7A1からpAAVS1-P-CAG-DEST (Addgene plasmid # 80490)へCOL7A1 cDNAを導入し、ドナープラスミドpAAVS1-P-CAG-COL7A1を得た。
　上記1.で得られた水疱由来細胞をNeonトランスフェクションシステム（Thermo Fisher Scientific）の専用バッファーで懸濁し、Cas9-sgRNA発現プラスミド（eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#3）およびドナープラスミド（pAAVS1-P-CAG-COL7A1）と以下のように混合した。
　Neonトランスフェクションシステムを用い、1,200 V, 20 ms, 2 pulsesの条件でエレクトロポレーションにより上記プラスミドを水疱由来細胞に導入した後、6-wellプレートに播種して培養した。培地は、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)とMSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社、PT-3001）の等量混合培地を使用した。トランスフェクションの48時間後にpuromycinを最終濃度0.5μg/mLになるよう添加し、約2週間培養して選択された細胞を下記「5. 遺伝子改変水疱由来細胞のマウスへの移植」でのマウスへの移植実験に使用した。
　また、PGKプロモーターの制御下にCOL7A1遺伝子を発現するドナープラスミドを作成し、このプラスミドを水疱由来細胞を含む各種細胞に導入した。そして、改変した細胞のCOL7A1の発現量及び分泌量を、上記「2. 水疱由来細胞の特徴決定」の「c) VII型コラーゲンの発現能力および分泌能力の評価」と同様にしてウエスタンブロットを行い、評価した。この実験では、VII型コラーゲンを発現していない患者から得られた水疱由来細胞を用いた。結果を図８に示す。図８（上）に示すように、水疱由来細胞のライセートからは、線維芽細胞のライセートよりも、VII型コラーゲンが多く検出された。同様に、図８（下）に示すように、水疱由来細胞を培養した培地からも、線維芽細胞を培養した培地よりも、VII型コラーゲンが多く検出された。以上の結果から、COL7A1遺伝子をCRISPR-Cas9で細胞に導入すると、水疱由来細胞は線維芽細胞よりもVII型コラーゲンを多く発現し、かつ、多く分泌することが分かった。（EF1αプロモーターを用いたCOL7A1遺伝子ドナープラスミドで水疱由来細胞を遺伝子改変した場合でもVII型コラーゲンを発現および分泌する細胞が得られることを、免疫染色および培養上清のウェスタンブロッティングにより確認している。）
5. 水疱由来細胞に対するレンチウイルスの感染効率
　水疱由来細胞に対するレンチウイルスの感染効率を解析した。この実験で用いた細胞、および細胞の培養に用いた培地を、下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　レトロネクチンコーティングプレートの作製：　レトロネクチン[タカラバイオ社 (滋賀, 日本), T100B] を40μg/mLとなるようにPBS (ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)) [ ナカライテスク社（京都, 日本）, 14249-95 ] で希釈し、表面処理なしの 96-well plate [ Corning社(東京, 日本), 3370 ] に100μL/wellとして加えた。その後、プレートを4℃で一晩静置した。プレートを使用する前にレトロネクチン溶液を取り除き、PBSで2度洗浄し、以下の操作を実施した。
　細胞の播種・レンチウイルス感染：　水疱由来細胞をAccutase-Solution [ PromoCell社(Heidelberg, Germany), C-41310 ]、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞をTrypsin/EDTA for Mesenchymal Stem Cells [ Lonza社 (Basel, Switzerland), CC-3232 ]、正常成人皮膚線維芽細胞をTrypsin/EDTA Solution [ Lonza社 (Basel, Switzerland), CC-5012 ]、を用いてプレートから剥がし、それぞれの細胞の培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、2500個/wellとなるように上述のレトロネクチンコーティング96-well plateに播種した。その後、GFP遺伝子搭載レンチウイルス : pLenti-C-mGFP [ ORIGENE社(Rockville, USA), PS100071 ]をMOI 1またはMOI 5となるように各ウェルに加え、細胞をCO2インキュベーターで72時間培養した。
　GFP陽性細胞の検出：　GFP陽性細胞率の検出は、蛍光顕微鏡 [キーエンス社(東京, 日本), BZ-X710]で行った。その結果を、図９に示す。
　また、MOI 1で感染させた各細胞種のGFP陽性細胞を次の方法で定量した。まず、視野内の全細胞数に対するGFP陽性細胞数の割合をGFP陽性細胞率とした。この計測を3回繰り返し、統計処理を行った (＊: P < 0.05, Dunnett's test) 。結果を図１０に示す。
　図９に示すように、水疱由来細胞は、間葉系幹細胞や線維芽細胞と比較して、GFP陽性細胞率及びGFPの蛍光強度が高いことが明らかとなった。さらには、図１０に示すように、間葉系幹細胞や線維芽細胞と比較して、水疱由来細胞のGFP陽性細胞率が有意に高いことが明らかとなった。これらの結果は、水疱由来液細胞は、間葉系幹細胞や繊維芽細胞と比較して、レンチウイルスによる遺伝子送達効率が高いことを示唆している。
6. VII型コラーゲン遺伝子を搭載したレンチウイルスベクタープラスミドの作製
　図１１（左）に示すような、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスのベクタープラスミドを作成した。まず、COL7A1 cDNAを含むFlexi ORF sequence-verified clone (Promega社) から、対合配列を生じるSpeＩとXbaＩ処理によってCOL7A1 cDNAを切り出し、XbaＩで処理したpLVSIN-EF1α Puro (タカラバイオ社)にライゲーションすることでpLVSIN-EF1α-C7 Puroを作製した。これを更にNotＩおよびMluＩで処理することでPGK-Puroカセットを取り除き、pLVSIN-EF1α-COL7A1を作製した。
　さらに、図１１（右）に示すような、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスのベクタープラスミドを作成した。pLVSIN-EF1α-Col7A1をClaＩとSwaＩで処理してEF1αプロモーター領域を切り出し、AAVS1 hPGK-PuroR-pA donorプラスミド（addgene #22072）を鋳型にPCRで増幅したPGKプロモーター領域（501 bp）をGibson assemblyで組み込むことで、pLVSIN-PGK-COL7A1を作製した。PGKプロモーターの増幅には、KOD One (東洋紡社)を用いた。Gibson assemblyには、NEBuilder HiFi DNA Assemblyキット (New England Biolabs社)を用いた。
7. VII型コラーゲン遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターの製造
　図１２に示される、COL7A1遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを製造した。
　レンチウイルス用プラスミドを用いたトランスフェクション：　図１１に示したプラスミドを、レンチウイルスのベクタープラスミドとして用いた。また、パッケージングプラスミドには、Lentiviral High Titer Packaging Mix[タカラバイオ社(滋賀, 日本), 6194]を用いた。まず、レンチウイルスパッケージング用細胞株であるLenti-X 293T細胞[タカラバイオ社(滋賀, 日本), 632180]を 100mm dish[コーニング社(NewYork, USA), 353003] に5000000 cells/dishとなるように播種し、一晩CO2インキュベーターで培養した。Lenti-X 293T細胞の培地には、10％FBSおよびペニシリン, ストレプトマイシン(それぞれ終濃度100unit/mLおよび100μg/mLとなるよう添加したもの)を含むDMEM[ナカライ社(京都, 日本), 08457-55]を用いた。次に、ポリエチレンイミンを用いてベクタープラスミドおよびパッケージングプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を一晩CO2インキュベーターで培養した後、培地交換を行った。トランスフェクション試薬には、OPTI-MEM [Thermo Fisher Science社 (東京, 日本), 31985062]および、PEI-MAX [Polysciences社(Warrington, USA), 24765-100]を用いた。トランスフェクションのプロトコルは、PEI-MAXの推奨プロトコルに従った。また、ベクタープラスミドとパッケージングプラスミドの混合比については、Lentiviral High Titer Packaging Mixの推奨プロトコルに従った。
　レンチウイルスベクターの回収および精製：　トランスフェクション後72時間が経過したLenti-X 293T細胞の培養上清を回収し、300g, 5min で粗遠心することで、Cell debrisを除去した。その上清を0.45μm フィルター[メルク社(東京, 日本), SLHVR33RS]を用いてろ過し、Cell debrisをさらに除去した。次に、ろ過済みの上清を遠心（6000g, 4℃, 20hr）し、レンチウイルスベクターを沈殿させ、ペレットを1.5mLのPBSで再懸濁した。次に超遠心用チューブ[ベックマン・コールター社(東京, 日本), 344058]内に、55%スクロース/PBS溶液(1mL), 20%スクロース/PBS溶液(2.5mL),レンチウイルスベクター液(1.5mL) の層を作り、超遠心(41000rpm, 4℃, 2hr)した。超遠心機は [ベックマン・コールター社(東京, 日本), L-90K]を、ローターは [ベックマン・コールター社(東京, 日本), SW55Ti]を用いた。超遠心後、55%スクロース/PBS溶液と20%スクロース/PBS溶液の間に現れるレンチウイルスベクターの層を回収し、PBSを用いて1mLとなるように希釈した。次に、超遠心用チューブ内に20%スクロース/PBS溶液(4mL)およびレンチウイルスベクター液(1mL)の層を作り、再び超遠心(41000rpm, 4℃, 2hr)した。沈殿したレンチウイルスベクターのペレットを400μLのDMEMでよく懸濁し、レンチウイルスベクター溶液とした。
　レンチウイルスベクターの力価を、以下のようにして測定した。
　レトロネクチンコーティングプレートの作製：　レトロネクチン[タカラバイオ社 (滋賀, 日本), T100B] を100μg/mLとなるようにPBSで希釈し、表面処理なしの平底48-well plate[IWAKI(東京, 日本), 1830-048]に100μL/wellとして加えた。その後、プレートを4℃で一晩静置した。プレートを使用する前に、レトロネクチン溶液を取り除いて2%FBS含有PBSで30分間室温にてブロッキングし、以下の操作を実施した。
　細胞の播種およびレンチウイルス感染：　レトロネクチンでコーティングした48-well plateに、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターまたはLVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクター（図１２参照）を、任意のウイルス液量で各ウェルに加え、2000g、32℃で2時間遠心した。その後、ウイルス液を取り除き、PBSで1回 洗浄した。次に、水疱由来細胞をAccutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、12500個/wellとなるように、上述のレトロネクチンコーティング48-well plateに播種した。感染後14日目の細胞を、Accutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。次に、Maxwell（登録商標） RSC Instrument[ Promega社(東京、日本), AS4500 ] およびMaxwell（登録商標） RSC Blood DNA Kit [ Promega社(東京、日本), AS1400 ] を用いて、回収した細胞からゲノムDNAを抽出した。Lenti-XTM Provirus Quantitation Kit [タカラバイオ社(滋賀, 日本), 631239 ]を用いて、回収したゲノムDNAからVCN（Vector Copy Number）を算出した。VCNとウイルス感染時のウイルス液量からウイルス力価(TU/mL, TU : Transduction Unit)を計算した。計算式は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　このようにして得られたウイルス力価をもとに、レンチウイルス感染実験において多重感染度(MOI: Multiplicity of Infection)の設定に必要なウイルス液量を計算した。
8. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析
　水疱由来細胞に対するレンチウイルスベクターによるVII型コラーゲン遺伝子導入効率を解析した。
　レトロネクチンコーティングプレートの作製：　上記「11. VII型コラーゲン遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターの製造」と同様にして、プレートをレトロネクチンでコートした。
　細胞の播種およびレンチウイルス感染：　レトロネクチンでコーティングした48-well plateに、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターまたはLVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクター(図１２参照)を、MOI 0.5、MOI 1、またはMOI 2となるように各ウェルに加え、2000g、32℃で2時間遠心した。その後、ウイルス液を取り除き、PBSで1回洗浄した。次に、水疱由来細胞をAccutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、12500個/wellとなるように、上述のレトロネクチンコーティング48-well plateに播種した。
　免疫染色：　レンチウイルス感染後14日経過した水疱由来細胞をAccutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、50000個/wellとなるようにCC2コーティングチェンバースライド[Thermo Fisher Science社(東京, 日本), 154852]に播種し、CO2インキュベーターで培養した。24時間後、抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2)[Sigma Aldrich社(東京, 日本), C6805],および Alexa488[Thermo Fisher Science社(東京, 日本), A-11001) を用いて免疫染色した。そして、VII型コラーゲンの発現を、共焦点蛍光顕微鏡[Nikon社(東京, 日本), Nikon A1R HD25]により解析した。
　結果を図１３および図１４に示す。EF1αプロモーターおよびPGKプロモーター搭載レンチウイルスのいずれのベクターで細胞を感染させても、VII型コラーゲンの発現はMOI依存的に増加した。最もVII型コラーゲン陽性細胞率が高かったのはいずれの細胞においてもMOI 2で感染させたものであり、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターでは約30%、LVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターでは約16%であった。また、概して、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞の方が、LVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞に比べて、VII型コラーゲン陽性細胞率が高く、かつ染色強度が強かった。
9. フローサイトメトリー(FACS)によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析
　水疱由来細胞に対するレンチウイルスベクターによるVII型コラーゲン遺伝子導入効率を解析した。
　レンチウイルス感染細胞の作成：　上記「8. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析」と同様の手順で行った。
　FACS解析：　レンチウイルス感染後14日経過した水疱由来細胞を、Accutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、300000個/sampleとなるように分取し、eBioscienceTM Permeabilization Buffer [Thermo Fisher Science社 (東京, 日本), 00-8333-56]を用いて透過処理を行った。その後、抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2) [Sigma Aldrich社(東京, 日本), C6805],および Alexa488 [Thermo Fisher Science社(東京, 日本), A-11001)を用いた免疫染色を行い、VII型コラーゲンの発現をフローサイトメーター(BD FACSCantoTM II) [日本ベクトン・ディッキンソン社(東京, 日本)] により解析した。
　結果を図１５に示す。また、各FACSデータ中の枠で囲った部分に含まれる細胞の割合を、図１６（左）に、VII型コラーゲン陽性細胞率として示す。さらに、枠で囲った領域内の平均蛍光強度(MFI: Mean Fluorescence Intensity)を、VII型コラーゲン陽性細胞の平均蛍光強度として、図１６（右）に示す。図１５および図１６（左）に示すように、VII型コラーゲン陽性細胞率はMOI依存的に増加した。最もVII型コラーゲン陽性細胞率が高かったのは、いずれもMOI 2で感染させたものであり、EF1α-COL7A1レンチウイルスでは約18%、PGK-COL7A1レンチウイルスでは約12%であった。また、図１６（右）に示すように、EF1α-COL7A1レンチウイルス感染細胞のMFIは、PGK-COL7A1レンチウイルス感染細胞のMFIよりも、約2.2倍高かった。このことから、レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞では、EF1αプロモーターの方が、PGKプロモーターよりも、より多量のCOL7A1を発現させると考えられる。
　また、予備検討として、水疱由来細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、および正常成人皮膚線維芽細胞にEF1α-COL7A1レンチウイルスベクターまたはPGK-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させ、上記と同様の方法で免疫染色およびフローサイトメトリー(FACS)を行い、VII型コラーゲン陽性細胞率を測定した。その結果、水疱由来細胞では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞および正常成人皮膚線維芽細胞よりもVII型コラーゲン陽性細胞率が高かった。
10. レンチウイルス感染水疱由来細胞のVCN（Vector Copy Number）
　VII型コラーゲン搭載レンチウイルスベクターで感染した水疱由来細胞のVCNを解析した。まず、前記「8. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析」と同様の手順で、水疱由来細胞にレンチウイルスベクターを感染させた。感染後7、14、21、および28日目の細胞を、Accutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。次に、Maxwell（登録商標） RSC Instrument[ Promega社(東京、日本), AS4500 ] およびMaxwell（登録商標） RSC Blood DNA Kit [ Promega社(東京、日本), AS1400 ] を用いて、回収した細胞からゲノムDNAを抽出した。Lenti-XTM Provirus Quantitation Kit [タカラバイオ社(滋賀, 日本), 631239 ]を用いて、回収したゲノムDNAからVNCを算出した。
　結果を図１７に示す。同図に示すように、VCNはMOI依存的に増加した。また、感染日数が経過するごとにVCNは低下したが、感染後21日以降はVCNが安定した。この結果は、レンチウイルスベクターによって水疱由来細胞のゲノム内に挿入されたVII型コラーゲン遺伝子は、長期間ゲノム内に存続可能であることを示唆する。
11. 細胞シートの作成
　栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内溶液を採取した。得られた水疱内溶液を、コラーゲンIコート６－ウエルプレートに播種した。培地には、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)とMSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社、PT-3001）の等量混合培地にペニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ終濃度50unit/mLおよび50μg/mLとなるよう添加したものを用いた。プレートを37℃、5%CO2で培養することにより、プレートの底に付着性の細胞を得た。その後、得られた水疱由来細胞を、適宜培地交換と継代を行って、所望の細胞数まで増殖させた。
　次いで、上記「4. 水疱由来細胞へのCOL7A1遺伝子の導入」と同様の手順で、水疱由来細胞へCOL7A1遺伝子を導入した。プロモーターには、CAGプロモーターを用いた。その後、遺伝子を導入した水疱由来細胞を、適宜培地交換と継代を行って、所望の細胞数まで増殖させた。
　その後、0.4×106 cells/cm2（コンフルエンシー700%に相当）となるように、遺伝子導入水疱由来細胞を、１２－ウエルプレートに播種した。培地には、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)とMSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社、PT-3001）の等量混合培地を用いた。プレートを37℃、5%CO2で２日間培養した。これによって、１２－ウエルプレートの底に、細胞シートが形成された。細胞シートにブレードで１×１cmの正方形の切れ目を入れ、細胞シートを、ピンセットでプレートの底から剥がした。剥離途中の細胞シートを、図１８（上段左）に示す。プレートから取り出した細胞シートを、図１８（上段真ん中）に示す。
　図１８（上段右）に、得られた細胞シートのヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の写真を示す。同図に示すように、得られた細胞シートでは、シートの厚さ方向に細胞が重なり合っていることが確認された。すなわち、得られた細胞シートでは、細胞が複数の層を形成していた。ＨＥ染色を詳しく観察すると、シートの表面付近では細胞の密度が高く、内部、特に中心部分では、細胞密度が表面付近ほど高くないことが観察された。得られた細胞シートの厚さは、１５～２０μmであった。
　予備検討として0.1×106 cells/cm2（コンフルエンシー175%に相当）および0.2×106 cells/cm2（コンフルエンシー350%に相当）となるように、遺伝子導入した水疱由来細胞を、１２－ウエルプレートに播種した。0.2×106 cells/cm2で播種したときは、細胞シートは形成されたが、0.4×106 cells/cm2で播種したときよりも、機械的強度が劣り、若干破れやすいという結果が得られた。0.1×106 cells/cm2で播種したときも、細胞シートは形成されたが、0.2×106 cells/cm2で播種したときよりも、機械的強度がさらに劣り、簡単に破れ、取り扱いにくいという結果が得られた。また、0.4×106 cells/cm2となるように遺伝子導入した水疱由来細胞を１２－ウエルプレートに播種した後、１日および３日間培養した。１日培養した場合は、細胞シートは形成されたが、２日間培養したときよりも、機械的強度が劣り、破れやすいという結果が得られた。３日間培養した場合は、２日間培養したときよりも、細胞シートの強度が若干向上した。
12. 細胞シートの皮膚患部への適用
　図１８（下段左）に示すように、「11.細胞シートの作成」で得られた細胞シートを、表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部に移植した。まず、水疱形成を示すCol7Aa1遺伝子ノックアウトマウス新生児（Col7a1-/-）の全層皮膚を切除し、免疫不全マウス（NOD-SCID）の背部に植皮した。植皮９～１０日後に図１８（下段左から二番目）に示すように、ノックアウトマウス由来の植皮片が生着した表皮水疱症モデルマウスが得られた。次いで、図１８（下段右から二番目）に示すように、患部の表皮に１×１cmの正方形の３辺にメスで切れ目を入れて、表皮を剥離して、真皮を露出させた。そして、図１８（下段右）に示すように、露出された真皮に、細胞シートを貼付した。最後に、切開した表皮を元に戻して、医療用テープで留めた。また、比較対照として、上記「4. 水疱由来細胞へのCOL7A1遺伝子の導入」と同様の手順でCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞の懸濁液を、真皮内に皮内投与した。
　細胞シートの移植から４週間後、移植部分の皮膚を採取して抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2; Sigma Aldrich, C6805)を用いて免疫染色を行い、VII型コラーゲンの基底膜への沈着を、共焦点蛍光顕微鏡[Nikon社(東京, 日本), Nikon A1R HD25]により解析した。結果を、図１９～２１に示す。さらには、細胞シートの移植から７日後に、マウスCol7a1 mRNAには結合せずヒトCOL7A1 mRNAに特異的に結合するプローブを用いたin situ hybridization (ISH)、およびヒトVII型コラーゲンタンパク質に対する免疫染色の多重染色を、RNAscope登録商標 RED Assay and Immunofluorescence (Advanced Cell Diagnostics)のTECHNICAL NOTEに従って行った。ISHのプローブは、NM_000094.4の1510-4172をターゲットとしており、Advanced Cell Diagnostics (Newark, CA)に設計および製造を依頼した。多重染色のISH部分は、RNAscope登録商標 2.5 HD Detection Reagents-RED (Advanced Cell Diagnostics, 322360)を用いて行った。免疫染色部分は、抗VII型コラーゲン抗体(Atlas Antibodies, HPA042420)を用いて行った。結果を、図２２および２３に示す。さらには、細胞シートの移植から３２日後、移植部分の皮膚を、電子顕微鏡で観察した。化学固定・樹脂包埋超薄切法による電子顕微鏡観察用の試料作製と、透過型電子顕微鏡による観察および撮影を、株式会社東海電子顕微鏡解析（名古屋市、日本）に依頼した。結果を図２４に示す。
　図１９および２０に示すように、細胞シートを移植した皮膚では、非常に長い距離にわたって、基底膜近傍にVII型コラーゲンの沈着が認められた。一方、皮内投与した皮膚では、真皮深部でVII型コラーゲンの沈着が見られ、基底膜近傍ではVII型コラーゲンの沈着はほとんど見られなかった。細胞シートを移植した皮膚の基底膜におけるVII型コラーゲンの免疫染色の蛍光強度を定量したところ、図２１に示すように、健常ヒト皮膚よりも高かった。
　図２２に示すように、細胞シートを移植した皮膚では、ヒトCOL7A1 mRNAは、表皮直下で検出された。これは、細胞シートに由来する細胞は、真皮表面付近に留まっていることを示唆している。図２３に示すように、細胞シートに由来する細胞は、ところどころ真皮表面付近で厚みのある層を形成している。表皮では、古い細胞は失われ、徐々に新しい細胞に置き換わる。一方、真皮内部では、細胞は長期間残存し、皮膚の機能を維持することが知られている。移植した細胞が真皮に厚みをもって残存していることは、これらの細胞が長期間真皮内に残存し、長期に渡って薬効を提供する可能性を示唆している。
　図２４に示すように、細胞シートを移植した皮膚では、基底膜近傍にアンカリングフィブリルが形成されていた。一方、細胞シートを移植しなかった皮膚では、アンカリングフィブリルが形成されていなかった。
13. レンチウイルスベクターによりVII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞シートの作成
　「7. VII型コラーゲン遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターの製造」で製造したレンチウイルスベクターを用いて、「11. 細胞シートの作成」で得た水疱由来細胞に、VII型コラーゲン遺伝子を導入した。具体的には、「8. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析」と同じ方法で、MOI 2でLVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターまたはLVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターを、水疱由来細胞に感染させた。得られたレンチウイルス感染水疱由来細胞を用いて、「11. 細胞シートの作成」と同様にして、細胞シートを作成した。そして、「12. 細胞シートの皮膚患部への適用」と同様にして、作成した細胞シートを、表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部に移植した。また、比較対照として、上記で得られたLVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルス感染水疱由来細胞のうち0.4×106 cellsを、通常の継代密度（コンフルエンシー10%～20%程度）で播種した。そして、37℃、5%CO2で２日間培養した後、Accutase-Solutionを用いて細胞を剥離して、得られた細胞の懸濁液を、皮膚患部の真皮内に皮内投与した。
　移植から４週間後、移植部分の皮膚を採取して抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2; Sigma Aldrich, C6805)を用いて免疫染色を行い、VII型コラーゲンの基底膜への沈着を調べた。結果を、図２５および２６に示す。図２５および図２６左に示すように、水疱由来細胞の懸濁液を皮内投与した皮膚では、VII型コラーゲンの沈着が基底膜でごくわずかしか認められなかった。一方、LVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞シートでは、VII型コラーゲンの沈着が、基底膜に沿って認められた。加えて、図２５および図２６右に示すように、LVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞シートでは、VII型コラーゲンの免疫染色の蛍光強度が、細胞懸濁液よりも高かった。図２５および図２６左に示すように、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞シートでは、VII型コラーゲンの沈着が、基底膜に沿って非常に長い距離で認められた。加えて、図２５および図２６右に示すように、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞シートでは、VII型コラーゲンの免疫染色の蛍光強度も高かった。以上の結果から、LVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞シートは、細胞懸濁液よりも高い治療効果が期待できる。そして、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞シートは、さらに高い治療効果が期待できる。

Claims (11)

  1. 　栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液に由来し、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を含み、栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植されることを特徴とする細胞シート。
  2. 　細胞には、VII型コラーゲン遺伝子発現カセットが導入されており、
    　VII型コラーゲン遺伝子発現カセットは、EF1αプロモーターと、EF1αプロモーターの下流に配置されたVII型コラーゲン遺伝子とを含む、請求項１に記載の細胞シート。
  3. 　細胞がシートの厚さ方向に重なり合っている、請求項１に記載の細胞シート。
  4. 　細胞シートの縦断面では、シートの表面近傍の細胞密度が、シートの中心部の細胞密度よりも高い、請求項３に記載の細胞シート。
  5. 　表皮が欠損した部分に移植される、請求項１に記載の細胞シート。
  6. 　栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植される細胞シートの製造方法であって、
    　　栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液の少なくとも一部分を、培地に播種する工程と、
    　　培養容器の底に付着した細胞を得る工程と、
    　　前記細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する工程と、
    　　VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養する工程と、
    　　培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す工程と、
    を有することを特徴とする細胞シートの製造方法。
  7. 　水疱内の体液から得た細胞を、酵素処理しないで培地に播種する、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
  8. 　レンチウイルスベクターを用いて細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
  9. 　VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞をオーバーコンフルエントとなるように播種する工程をさらに含む、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
  10. 　1x104 cells/cm2以上の細胞密度で、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養容器に播種する工程をさらに含む、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
  11. 　酵素処理しないで、培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
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