JP2024521811A - 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、ならびに関連する方法及び使用 - Google Patents

短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、ならびに関連する方法及び使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024521811A
JP2024521811A JP2023573116A JP2023573116A JP2024521811A JP 2024521811 A JP2024521811 A JP 2024521811A JP 2023573116 A JP2023573116 A JP 2023573116A JP 2023573116 A JP2023573116 A JP 2023573116A JP 2024521811 A JP2024521811 A JP 2024521811A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
seq
truncated
envelope glycoprotein
lentiviral
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023573116A
Other languages
English (en)
Inventor
リチャード シー． モリガン
マイケル ジェイ． フォレス
Original Assignee
サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド filed Critical サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド
Publication of JP2024521811A publication Critical patent/JP2024521811A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本明細書において、全長の野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）阻害性Ｒペプチドよりも短い部分的阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が組み込まれているか、または前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された、脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子を提供する。本明細書ではまた、前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む前記脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子を調製するためのプロデューサー細胞、ならびに前記脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子を調製及び使用するための方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２８日に提出された「短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子ならびに関連する方法及び使用」と題する米国特許仮出願第６３／１９４，８８０号に対する優先権を主張し、その内容はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
配列表の参照による援用
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、２０２２年５月２７日に作成された「１８６１５＿２００４４４０＿ＳＥＱＬＩＳＴ」という表題のファイルとして提供され、サイズは１３８，２５５バイトである。この配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。
分野
本開示は、全長の野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）阻害性Ｒペプチドよりも短い部分的阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が組み込まれているか、または前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された、脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子に関する。本開示はまた、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子を調製するためのプロデューサー細胞、ならびに脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子を調製及び使用するための方法も提供する。
概要
ウイルス様粒子及びウイルスベクターを含む脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子は、外因性作用因子を細胞へ送達するために一般的に使用される。様々な粒子、例えばレンチウイルスベクター粒子の場合、宿主範囲は、異種エンベロープタンパク質によって偽型化することによって改変され得る。特定の異種偽型エンベロープタンパク質を含む粒子の効率的な調製及び産生は、生成されるレンチウイルスベクター粒子の低力価に対するエンベロープタンパク質の影響などにより、必ずしも効率的ではない場合がある。より高力価で、かつ効率的な形質導入効率の望ましい細胞で産生することができる、ウイルス様粒子及びウイルスベクターを含む、改良された脂質粒子が必要とされている。提供される開示は、この必要性に対処する。
本明細書において、野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子を提供し、ここで、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥｖエンベロープ糖タンパク質の、少なくとも１個のアミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含む。
また、本明細書において、野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子を提供し、ここで、細胞質尾部は、２５アミノ酸長であり、かつ野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端酸の阻害性Ｒペプチド（Ｒ＋８）を含む。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、レンチウイルス粒子は複製欠損性である。提供する実施形態のいずれかうちのいくつかでは、提供するレンチウイルス粒子を、Ｇａｇ－ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｔａｔ、及び短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするパッケージングプラスミドをプロデューサー細胞に形質導入することを含む方法によって調製する。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、レンチウイルス粒子は、ウイルス核酸をさらに含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、ウイルス核酸は、以下の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／セントラル終結配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡフラップ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３を欠く）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、レンチウイルス粒子は、ウイルスのゲノムＤＮＡを有さない。
本明細書において、（ａ）内腔を囲む脂質二重層、及び（ｂ）野生型短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質、を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子を提供し、ここで、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの、少なくとも１個の連続アミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含み、エンベロープ糖タンパク質は、脂質二重層に埋め込まれている。
本明細書において、（ａ）内腔を囲む脂質二重層、及び（ｂ）野生型短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質、を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子を提供し、ここで、細胞質尾部は２５アミノ酸長であり、かつ野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端酸の阻害性Ｒペプチド（Ｒ＋８）を含み、エンベロープ糖タンパク質は、脂質二重層に埋め込まれている。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、脂質二重層は、レトロウイルス粒子またはレトロウイルス様粒子を生成するために使用される宿主細胞の膜に由来する。任意の実施形態のうちのいくつかでは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、脂質二重層は、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質以外の１つ以上の他のウイルス成分であるか、またはそれを含む。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、１つ以上のウイルス成分は、レトロウイルス由来である。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、レトロウイルスは、レンチウイルス粒子またはレンチウイルス様粒子である。提供される実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質は、（ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び（ｉｉ）部分的阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分を含む。任意の実施形態のいくつかでは、糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分は、サブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。任意の実施形態のいくつかでは、ＢａＥＶ糖タンパク質は、ＡＳＣＴ－２またはＡＳＣＴ－１受容体に結合する。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分は、配列番号２５に示されているアミノ酸配列、あるいは配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含む。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分は、配列番号２６、あるいは配列番号２６に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含み、かつ部分的阻害性Ｒペプチドを含む。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大１６個の連続アミノ酸を欠く。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１４個の連続アミノ酸を欠き、任意選択で、配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１３個の連続アミノ酸欠く。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１４（Ｒ＋９）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３７に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１３（Ｒ＋８）に示されている。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３６に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１２（Ｒ＋７）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３５に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１１（Ｒ＋６）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３４に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１０（Ｒ＋５）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３３に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号９（Ｒ＋４）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３２に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号８（Ｒ＋３）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３１に示されている。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、粒子は、外因性作用因子をさらに含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、外因性作用因子は、内腔に存在する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、外因性作用因子は、タンパク質または核酸であり、任意選択で、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、粒子は、参照粒子調製物と比較して力価が増加した調製物として作製され、前記参照粒子調製物は、同様に作製されるが、全長Ｒペプチドまたは１０アミノ酸長以上のＲペプチド部分を伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の組み込みを有する。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、力価は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って、任意選択で、５倍以上、または約５倍以上、または５倍以上を上回って、増加する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、形質導入後の標的細胞、任意選択でＨＥＫ２９３細胞における力価は、３×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、４×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、５×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、６×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、７×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、８×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、９×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、１×１０７ＴＵ／ｍＬ以上、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ以上である。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも約（０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、または０．５）個の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質／ｎｍ２の密度で粒子の表面上に存在する。
本明細書において、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を提供し、ここで、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の、少なくとも１個の連続アミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドアミノ酸を含む。
提供される実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質は、（ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び（ｉｉ）部分的阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分を含む。任意の実施形態のいくつかでは、糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分は、サブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、ＢａＥＶ糖タンパク質は、ＡＳＣＴ－２またはＡＳＣＴ－１受容体に結合する。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分は、配列番号２５に示されているアミノ酸配列、あるいは配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含む。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分は、配列番号２６、あるいは配列番号２６に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含み、かつ部分的阻害性Ｒペプチドを含む。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大１６個の連続アミノ酸を欠く。任意の実施形態のいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１４個の連続アミノ酸を欠き、任意選択で、配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１３個の連続アミノ酸を欠く。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１４（Ｒ＋９）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３７に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１３（Ｒ＋８）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３６に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１２（Ｒ＋７）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３５に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１１（Ｒ＋６）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３４に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号１０（Ｒ＋５）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３３に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号９（Ｒ＋４）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３２に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、部分的融合阻害性Ｒペプチドを、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されており、任意選択で、細胞質尾部を配列番号８（Ｒ＋３）に示されている。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を、配列番号３１に示されている。
本明細書において、提供する実施形態のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、ポリヌクレオチドをコドン最適化する。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、ポリヌクレオチドは、核酸の発現を制御するために作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。任意の実施形態のいくつかでは、プロモーターは構成的プロモーターである。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、プロモーターは誘導性プロモーターである。
本明細書において、提供するポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターを提供する。本明細書において、提供するポリヌクレオチドのいずれかを含むプラスミドを提供する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、プラスミドは、レンチウイルス産生用のタンパク質をコードする１つ以上の核酸をさらに含む。
本明細書において、提供するポリヌクレオチド、ベクター、またはプラスミドのいずれかを含む細胞を提供する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、細胞は、レンチウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞である。
本明細書において、（ｉ）ウイルス核酸と（ｉｉ）請求項４３～６４のいずれかに記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸とを含む、プロデューサー細胞を提供し、任意選択で、ウイルス核酸はレンチウイルス核酸である。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、プロデューサー細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、プロデューサー細胞は２９３Ｔ細胞を含む。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、ウイルス核酸は、ウイルス複製に関与する１つ以上の遺伝子を欠損している。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、ウイルス核酸は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔのうちの１つ以上から選択されるウイルスパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、ウイルス核酸は、以下の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージング要素（ｐｓｉ）、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／セントラル終結配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡフラップ）、ポリＡテール配列、転写後制御要素（例えば、ＷＰＲＥ）、Ｒｅｖ反応要素（ＲＲＥ）、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３を欠く）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む。
本明細書において、ａ）提供するポリヌクレオチドのいずれか、提供するベクターのいずれか、または提供するプラスミドのいずれかを、ソース細胞に導入すること、ｂ）脂質粒子を産生可能な条件下で細胞を培養すること、及びｃ）細胞から脂質粒子を分離、濃縮、または精製し、それによって脂質粒子を作製することを含む、短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質を含む脂質粒子の作製方法を提供する。
提供する実施形態いずれかのうちのいくつかでは、ソース細胞は、哺乳類細胞である。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、ソース細胞はプロデューサー細胞であり、脂質粒子はウイルス粒子またはウイルス様粒子であり、任意選択でレトロウイルス粒子またはレトロウイルス様粒子であり、任意選択でレンチウイルス粒子またはレンチウイルス様粒子である。
本明細書において、偽型レンチウイルス粒子の作製方法を提供し、この方法は、ａ）レンチウイルス核酸と、提供するポリヌクレオチドの、もしくはそのいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする提供する核酸のいずれかとを含むプロデューサー細胞を提供すること、ｂ）レンチウイルス粒子を産生可能な条件下で細胞を培養すること、及びｃ）プロデューサー細胞からレンチウイルス粒子を分離、濃縮、または精製し、それによって偽型レンチウイルス粒子を作製することを含む。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、プロデューサー細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、プロデューサー細胞は、２９３Ｔ細胞を含む。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、この方法は、参照レンチウイルス粒子調製物と比較して力価が増加したレンチウイルス調製物を作製し、前記参照レンチウイルス粒子調製物が、同様に作製されるが、全長Ｒペプチドまたは１０アミノ酸長以上のＲペプチド部分を伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化されている。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、力価は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って、任意選択で、５倍以上、または約５倍以上、または５倍以上を上回って、増加する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、この方法は、形質導入後の標的細胞、任意選択でＨＥＫ２９３細胞における力価が、３×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、４×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、５×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、６×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、７×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、８×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、９×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、１×１０７ＴＵ／ｍＬ以上、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ以上である、レンチウイルス調製物、を作製する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、この方法は、同様の方法ではあるが野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質Ｒペプチドと比べてＲペプチドを伴わないか（Ｒなし）または長さが３個の連続アミノ末端アミノ酸もしくはそれ未満であるＲペプチドを伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された参照レンチウイルス粒子調製物を産生するための方法、と比較して、プロデューサー細胞の合胞体形成の低減をもたらす。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、この方法は、高力価（例えば、４×１０６ＴＵ／ｍＬ超、５×１０６ＴＵ／ｍＬ超、６×１０６ＴＵ／ｍＬ超、７×１０６ＴＵ／ｍＬ超、８×１０６ＴＵ／ｍＬ超、９×１０６ＴＵ／ｍＬ超、１×１０７ＴＵ／ｍＬ超、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ超）を有するレンチウイルス調製物を作製し、作製方法の最中にプロデューサー細胞の最小限の合胞体形成をもたらす。
本明細書において、提供する方法のいずれかによって作製される脂質粒子を提供する。また、本明細書において、提供する方法のいずれかによって作製されるレンチウイルス粒子も提供する。
本明細書において、提供する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のいずれかを含む脂質粒子を提供する。本明細書において、複数の提供するレンチウイルス粒子のいずれかを含む組成物を提供する。本明細書において、複数の提供する脂質粒子のいずれかを含む組成物を提供する。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
本明細書において、細胞への形質導入方法を提供し、この方法は、細胞を、提供するレンチウイルス粒子のいずれか、または提供する組成物のいずれかと接触させることを含む。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、脂質粒子またはレンチウイルスベクターは外因性作用因子を含み、形質導入によって外因性作用因子は細胞内に導入される。
本明細書において、外因性作用因子を細胞内に送達する方法を提供し、この方法は、提供するレンチウイルス粒子のいずれか、または提供する脂質粒子のいずれか、または提供する組成物のいずれかを、細胞と接触させることを含む。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、接触させることが、インビトロまたはエクスビボである。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、接触させることが、対象におけるインビボである。
本明細書において、外因性作用因子を対象の細胞に送達する方法を提供し、この方法は、対象に、提供するレンチウイルス粒子、脂質粒子、または組成物のいずれかを投与することを含む。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、細胞は、造血系細胞である。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、細胞は、骨髄系－リンパ系分化に偏りのない（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｂａｌａｎｃｅｄ）造血系細胞、骨髄系に分化が偏った（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、リンパ系に分化が偏った（ｌｙｍｐｈｏｉｄ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、血小板に分化が偏った（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、血小板－骨髄系に分化が偏った（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｍｙｅｌｏｉｄ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、長期再増殖（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）造血系細胞、中期再増殖（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）造血系細胞、または短期再増殖（ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）造血系細胞からなる群から選択される。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、及び血小板から選択される。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び自然リンパ球から選択される。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、対象は、造血幹細胞移植を受けたことがある。
提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、外因性作用因子は、タンパク質または核酸であり、任意選択で、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、外因性作用因子は、対象における疾患もしくは病態を治療するための治療用物質であるか、またはそれをコードする。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、外因性作用因子は、対象における疾患もしくは病態に関連する抗原を標的とするための膜タンパク質、任意選択でキメラ抗原受容体であるか、またはそれをコードする。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、外因性作用因子は、対象における遺伝子欠損を修正するための遺伝子治療に使用するためのものであるか、または欠損もしくは欠失している遺伝子を置換する。提供する実施形態のいずれかのうちのいくつかでは、対象はヒト対象である。
パッケージングプラスミド及び異なる長さの阻害性Ｒペプチドを含む様々な短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をトランスフェクトされたプロデューサー細胞から産生されたレンチウイルスベクター粒子のウイルス力価を示す。 パッケージングプラスミド及び異なる長さの阻害性Ｒペプチドを含む様々な短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によるプロデューサー細胞のトランスフェクションによるレンチウイルスベクター粒子の産生中のプロデューサー細胞の合胞体形成を示す。 パッケージングプラスミドと、Ｒ＋８短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする異なる濃度のプラスミドをトランスフェクトされたプロデューサー細胞から産生した後の、野生型ＢａＥＶエンベロープタンパク質のＲペプチド（Ｒ＋８）の８個の連続アミノ末端アミノ酸を有する部分的阻害性Ｒペプチドを含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された例示的なレンチベクター調製物のウイルス力価を示す。 ＢａＥＶ＋８、ＢａＥＶＴＲ、ＢａＥＶＲなし、またはＶＳＶ－Ｇ偽型ベクターによる形質導入から８日後のＧＦＰ＋細胞の割合を示す。
詳細な説明
本明細書において、全長野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によって偽型化された、脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子を提供する。本明細書ではまた、（ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的活性部分と、（ｉｉ）部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットと、を含む短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によって偽型化された、脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子も提供する。特定の実施形態では、Ｒペプチドは、阻害性Ｒペプチドの少なくとも３個の連続アミノ末端アミノ酸を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の所望の標的細胞への融合を媒介することができる。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、脂質粒子に埋め込まれている。脂質粒子は、非ウイルス粒子、ウイルス粒子、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）であってもよい。
提供する実施形態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）と休止期Ｔ細胞及びＢ細胞とを含む造血細胞への遺伝子導入に特に適した形質導入特性を示すＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質に基づいている。これは、遺伝子治療法に関連して遺伝子を置換または修正するために、すべての造血系譜に分化することができる治療用遺伝子をＨＳＣに送達するための送達ベクターを提供する。さらに、遺伝子治療または免疫療法のための静止または休止Ｔリンパ球及びＢリンパ球への効率的な遺伝子導入は、ウイルス粒子送達のエクスビボ及びインビボ方法と関連して多くの利点も有する。
ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部ドメインなど、他のレトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質と共通の構造的及び機能的特徴を有する。ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、Ｎ－グリコシル化された不活性前駆体として合成され、ゴルジ内の宿主細胞のフリンまたはフリン様プロテアーゼによって２つのサブユニット、表面ユニットタンパク質またはｇｐ７０、及び膜貫通タンパク質ｐ２０Ｅにプロセシングされる。ｇｐ７０とｐ２０Ｅの間の切断部位には最小限の配列［ＫＲ］－Ｘ－［ＫＲ］－Ｒ（Ｘは任意のアミノ酸である）が必要であり、ｇｐ７０とｐ２０Ｅは、ジスルフィド結合を含み得る不安定な相互作用で結合したままである。ｇｐ７０は、受容体に結合することによってウイルスを宿主細胞に結合させ、これがｐ２０Ｅのリフォールディングを引き起こし、宿主細胞膜との融合を促進すると考えられている。ｐ２０ＥはクラスＩウイルス融合タンパク質として機能し、多くのファミリーの融合タンパク質（例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１またはインフルエンザウイルス血球凝集素［ＨＡ］）と共通の構造的及び機能的特徴を共有する。天然条件下では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質も、ｐ２０Ｅの細胞質ドメインまたは細胞質尾部で第２の切断を受ける。細胞質尾部のＣ末端の１７アミノ酸、融合阻害性Ｒペプチドは、チロシンエンドサイトーシスシグナルＹＸＸＬを含み、ウイルスプロテアーゼによるタンパク質分解切断の結果として除去される。Ｒペプチドの除去は、エンベロープ糖タンパク質の膜融合性の促進と関連している（Ｂｅｎｅｖｉｓｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｎａｔｕｒｅ ２４８：１７－２０；Ｔｏｄａｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｃｅｌｌ ２：５５－６１；Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（２）：１２８１－１２９１）。
Ｒペプチド切断が膜融合性を高めるメカニズムは十分に解明されていないが、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の融合効率は、ウイルスプロテアーゼの非存在下でのＲペプチドの切断を改変することによって向上させることができる。１７アミノ酸のＲ－ペプチドを完全に切断するＢａＥＶの変異が同定されている（ＵＳ９２４９４２６、Ｂｅｒｎａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｌｏｏｄ．３（３）：４６１－４７５）。さらに、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）とテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）の間の相同性はわずか３３％であるなど、Ｒペプチド間の相同性は低いが、Ｒペプチドは交換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒａｌ ７５（４）：４１２９－４１３８）。バリアントＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部がＭｕＬＶによって置換されている、そのような研究がいくつか特定されている（ＵＳ９２４９４２６、Ｂｅｒｎａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｌｏｏｄ．３（３）：４６１－４７５）。
しかしながら、細胞質尾部から全長Ｒペプチドをトランケートすることにより、エンベロープ糖タンパク質の膜融合性が高くなり、大規模な合胞体形成が引き起こされる（Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８９７５－８９８１；Ｒａｇｈｅｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６８：３２２０－３２３１；Ｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ １７７３－１７８１）。ＭｕＬＶ及びＢａＥＶを形成するものを含む様々なエンベロープ糖タンパク質は、様々な細胞株にわたって、全長Ｒペプチドと比較して、Ｒペプチドが欠如している場合の細胞間融合アッセイにおいて合胞体を誘導するより高い能力を示す（Ａｇｕｉｌａｒ（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２）：１２８１－１２９１）。さらに、レンチウイルスベクター産生中の合胞体形成は、より高い力価プロトコルを最適化しようとする条件下であっても、低い力価をもたらすことが示されている（Ｂａｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１７；Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＡＳＧＣＴ ２３ｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ． Ｐｏｓｔｅｒ ＃９８８）。
野生型Ｒペプチドを欠損したＢａＥＶを組み込んだ粒子が生成されている一方で、合胞体形成が低い超融合性変異体は、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の特異的な尾部切断に起因することが本明細書で見出される。さらに、Ｒペプチドの特定のアミノ酸トランケートを発現させると、変異型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質がレンチウイルス調製物の力価の向上をもたらすことが本明細書で見出される。例えば、Ｒペプチドの８アミノ酸を含むＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、Ｒペプチドの１０アミノ酸を発現するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質よりも５倍高い力価をもたらすことがわかる。
レンチウイルス粒子などの提供する脂質粒子には、全長野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が組み込まれている。部分的融合阻害性ペプチドは、阻害性Ｒペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、または９個の連続アミノ末端アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、提供するレンチウイルスベクターなどの脂質粒子は、特に完全阻害性Ｒペプチドを含む全長ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比較して、プロデューサー細胞による産生後に高い力価を示す。さらに、提供する脂質粒子、例えばレンチウイルスベクターは、特に完全なＲペプチドを欠損する（Ｒなし）変異型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比較して、より低い膜融合活性を示し、その結果、プロデューサー細胞の合胞体形成が低下するかまたは最小限になる。
また、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む粒子も提供する。粒子には、脂質粒子、ウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、非ウイルス粒子、もしくは合成粒子、または本明細書に記載の粒子のいずれかが含まれ得る。
また、対象へのインビボ投与後を含む、例えば、診断用物質または治療用物質を細胞へ送達するための、１つ以上の外因性作用因子を追加的に含有する粒子を提供する。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、所望のタンパク質をコードする核酸などの導入遺伝子であってもよいか、または異種タンパク質であってもよい。いくつかの態様では、導入遺伝子は、遺伝子が欠損または不全である細胞内の遺伝子を置き換えるためなど、遺伝子治療と関連させて使用することができる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、標的細胞に送達されることが望ましいタンパク質をコードし得るかまたは望ましいタンパク質である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするか、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、遺伝子編集に関連する因子であるか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、塩基編集及び／もしくはプライム編集（すなわち、ＴＰＲＴ（ｔａｒｇｅｔ－ｐｒｉｍｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））に関連する因子であるか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、遺伝子編集法などで使用されるヌクレアーゼをコードするか、またはヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、トランスポザーゼ及び／もしくはリコンビナーゼであるか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、もしくは逆転写酵素であるか、またはそれをコードする。
また、本明細書において、診断方法及び治療方法などにおける、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質及び粒子の方法及び使用も提供する。また、ポリヌクレオチド、糖タンパク質及び粒子を改変、調製、及び生成するための方法、ならびにその粒子を含み、それを使用、作製、及び投与するためのキット及び装置を提供する。
本出願で言及される特許文献、科学記事、及びデータベースを含むすべての刊行物は、各々の個々の刊行物があたかも参照により個別に開示されているのと同じ程度にあらゆる目的のためにその全体が参照により援用される。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に援用される特許、出願、公開出願、及び他の刊行物に記載の定義に反するか、または矛盾する場合、参照により本明細書に援用される定義よりも本明細書に記載の定義が優先される。
本明細書で使用される節の見出しは、単に構成目的のものであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
Ｉ． 定義
別段定義されない限り、本明細書で使用される当技術分野のすべての用語、表記ならびに他の技術的及び科学的用語または専門用語は、請求される主題が関連する当技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有することが意図されている。いくつかの場合では、一般に理解されている意味を有する用語を、明確にするため、及び／または容易に参照できるように本明細書で定義されており、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも当技術分野で一般に理解されている意味との実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語のうちの１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、当業者によって理解され、それが用いられる文脈においてある程度異なるであろう。本明細書で使用される場合、「約」は、測定可能な値、例えば、量、時間的継続時間などに言及する場合、指定された値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、またより好ましくは±０．１％の変動を包含するが、それは、そのような変動が、開示される方法を実施するために適切であるからである。
本明細書で使用される場合、「脂質粒子」は、内腔または腔を包囲する両親媒性脂質の二重層を含有する任意の生物学的または合成粒子を指す。一般的には、粒子は、核を含有しない。脂質粒子の例には、固体粒子、例えば、ナノ粒子、ウイルス由来粒子、または細胞由来粒子が含まれる。そのような脂質粒子としては、ウイルスベースの粒子、例えば、ウイルス様粒子またはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、エクソソーム、除核された細胞、様々な小胞、例えば、微小胞、膜小胞、細胞外膜小胞、細胞膜小胞、巨大細胞膜小胞、アポトーシス小体、ミト粒子（ｍｉｔｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、ピレノサイト、またはリソソームが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、フソソームであり得る。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、血小板ではない。
用語「ウイルスベースの粒子」とは、ウイルス由来またはウイルスタンパク質由来の任意の種類の脂質粒子、例えばウイルスベクター粒子及びウイルス様粒子であり得る。
用語「ウイルスベクター粒子」及び「ウイルスベクター」は、本明細書では同じ意味で使用される。ウイルスベクター粒子は、少なくとも１つの非構造ウイルスゲノム成分またはその機能的断片（すなわち、ポリメラーゼ、インテグラーゼ、プロテアーゼ、または他の非構造成分）に加えて、１つ以上のウイルス構造タンパク質を含む任意の種類の脂質粒子であり得る。
用語「ウイルス様粒子」またはＶＬＰとは、少なくとも１つのウイルス構造タンパク質を特徴とし、ウイルス遺伝物質を欠く任意の種類の粒子であり得る。
本明細書で使用される場合、「フソソーム」は、内腔または腔を包囲する両親媒性脂質の二重層、及びその両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンを含有する粒子を指す。いくつかの実施形態では、フソソームは、外因性作用因子を含む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、ペプチド、またはタンパク質である。いくつかの実施形態では、フソソームは、膜封入調製物である。いくつかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞に由来する。
本明細書で使用される場合、「フソソーム組成物」とは、１つ以上のフソソームを含む組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「フソゲン」とは、膜で囲まれた内腔を含む、２つの膜間の相互作用を生み出す作用因子または分子を指す。実施形態では、フソゲンは、膜の融合を促進する。他の実施形態では、フソゲンは、例えば、２つの膜または内腔の間（例えば、レトロウイルスベクターの内腔と標的細胞の細胞質）の細孔に接続を作り出す。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス核酸」は、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターに、単独でまたはヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドと組み合わせてパッケージングするための少なくとも最小配列要件を含有する核酸を指す。いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、５’ＬＴＲ（例えば、組み込みを促進するため）、Ｕ３（例えば、ウイルスゲノムＲＮＡ転写を活性化するため）、Ｒ（例えば、Ｔａｔ結合領域）、Ｕ５、３’ＬＴＲ（例えば、組み込みを促進するため）、パッケージング部位（例えば、ｐｓｉ（Ψ））、ＲＲＥ（例えば、Ｒｅｖに結合し、核輸送を促進するため）の１つ以上を含む。レトロウイルス核酸は、ＲＮＡ（例えば、ビリオンの一部の場合）またはＤＮＡ（例えば、ソース細胞に導入される場合、またはレシピエント細胞における逆転写後の場合）を含み得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖのうちの１つ以上（例えば、すべて）を含むヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドを使用してパッケージングされる。
本明細書で使用される場合、ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関して、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」とは、配列同一性の最大割合を達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない、特定のペプチドもしくはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的としたアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内である様々な方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
アミノ酸置換には、ポリペプチドにおけるあるアミノ酸から別のアミノ酸への置き換えが含まれ得るがこれらに限定されない。例示的な置換を表１に示す。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、その産物を、所望の活性、例えば、結合の維持／向上についてスクリーニングしてもよい。
（表１）
Figure 2024521811000001
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従って分類され得る：
（１） 疎水性： ノルロイシン， Ｍｅｔ， Ａｌａ， Ｖａｌ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ；
（２） 中性親水性： Ｃｙｓ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ；
（３） 酸性： Ａｓｐ， Ｇｌｕ；
（４） 塩基性： Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ａｒｇ；
（５） 鎖配向に影響を及ぼす残基： Ｇｌｙ， Ｐｒｏ；
（６） 芳香族： Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
タンパク質の位置を参照して「に対応する」という用語、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置が、配列表に示されるものなどの開示される配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸位置「に対応する」という記述は、構造的配列アラインメントに基づいてまたはＧＡＰアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムを使用して開示される配列とのアラインメントで同定されるヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。例えば、類似配列の対応する残基（例えば、断片または種バリアント）は、構造アラインメント法による参照配列とのアラインメントによって決定することができる。配列をアラインメントすることにより、当業者は、例えば、ガイドとして保存された及び同一のアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。
用語「単離された」とは、本明細書で使用される場合、天然で一般的に見出されるまたは産生される成分の少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合、「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、産生した細胞からポリペプチドを含有する上清を物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離すること」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、天然で一般的に見出されるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡなど）の一部ではない場合、または例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合、「単離された」と称される。したがって、宿主細胞内部のベクターに含有されるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称され得る。
用語「有効量」とは、本明細書で使用される場合、処置される症状及び／または病態を有意にかつ良好に改変する（例えば、良好な臨床的反応を提供する）のに十分な医薬組成物の量を意味する。医薬組成物において使用するための活性成分の有効量は、治療される特定の病態、病態の重症度、治療の継続期間、併用療法の特質、用いられる特定の活性成分、使用される特定の薬学的に許容される賦形剤及び／または担体、及び同様の要因に応じて担当医の知識及び専門的技術によって変化する。
粒子に関して本明細書で使用される場合の「外因性作用因子」とは、対応する野生型のソース細胞から作製される対応する野生型ウイルスまたはフソゲンに含まれず、コードもされない作用因子を指す。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、天然には存在せず、例えば、天然のタンパク質に対して（例えば、挿入、欠失、または置換によって）変更された配列を有するタンパク質または核酸である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ソース細胞内に天然には存在しない。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ソース細胞内に天然に存在するが、ウイルスに対しては外因性である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、レシピエント細胞内に天然には存在しない。いくつかの実施形態では、外因性作用因子はレシピエント細胞内に天然に存在するが、所望のレベルまたは所望の時間には存在しない。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ＲＮＡまたはタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、遺伝子コード配列に作動可能に連結された場合に、遺伝子の転写を駆動するシス調節性ＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、転写因子結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、遺伝子と遠位の１つ以上のエンハンサーと協働して作用する。
本明細書で使用される場合、組成物は、細胞を含む、２つ以上の生成物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」とは、化合物の生物学的活性または特性を抑止せず、かつ比較的非毒性である担体または希釈剤などの物質を指し、すなわち、物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、それが含有される組成物の成分のいずれとも有害な様態で相互作用することもなく、個体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」とは、本発明の少なくとも１つの化合物と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／または賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。医薬組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼内、肺、及び局所投与を含むがこれらに限定されない化合物を投与する複数の技術が当技術分野で存在する。
「疾患」または「障害」とは、本明細書で使用される場合、治療が必要とされ、及び／または所望される状態を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」とは、疾患または障害を改善すること、例えば、疾患もしくは障害の発症を遅延もしくは停止させること、または少なくとも１つのその臨床症状を軽減することを指す。本開示の目的のために、疾患または障害の改善には、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の拡大（例えば、転移、例えば、肺またはリンパ節への転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善、疾患または疾患進行の抑制、疾患またはその進行の抑制または減速、その進展の停止、及び寛解（部分的または全体的にかかわらず）のうちの任意の１つ以上を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の臨床的結果を得ることが含まれ得る。
用語「個体」及び「対象」は、動物、例えば哺乳類を指すために本明細書では同じ意味で使用される。患者という用語には、ヒト及び獣医学的対象が含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳類実験動物、哺乳類牧場動物、哺乳類スポーツ動物、及び哺乳類ペットを含むがこれらに限定されない哺乳類の治療方法を提供する。対象は、オスまたはメスであり得、幼児、若年、青年、成人、及び老年対象を含む任意の好適な年齢であり得る。いくつかの例では、「個体」または「対象」とは、疾患または障害のための治療を必要とする個体または対象を指す。いくつかの実施形態では、治療を受ける対象は、対象が治療に関連する障害を有するか、または障害に罹患する十分なリスクがあると識別されているという事実を示す患者であり得る。特定の実施形態では、対象は、ヒト、例えば、ヒト患者である。
ＩＩ． 短縮型ＢａＥＶフソゲン
本明細書では、脂質粒子に、例えば、レンチウイルス粒子またはレンチウイルス様粒子を含むウイルス粒子に組み込まれるまたは組み込むことができる短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を提供する。例えば、本明細書では、提供する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のいずれかによって偽型化されたレンチウイルス粒子を提供する。本明細書ではまた、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。
野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、Ｃ末端細胞質尾部（例えば、配列番号４、または配列番号２４のアミノ酸５１２～５４５に対応する）、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号３、または配列番号２４のアミノ酸４８９～５１１に対応する）、及び細胞外ドメイン（例えば、配列番号２、または配列番号２４のアミノ酸１～４８８に対応する）を含むレトロウイルスエンベロープタンパク質である。最小配列［ＫＲ］－Ｘ－［ＫＲ］－Ｒ（Ｘは任意のアミノ酸）を必要とするゴルジ内の前駆体タンパク質の成熟により、表面ユニットタンパク質すなわちｇｐ７０と、膜貫通タンパク質ｐ２０Ｅという２つのサブユニットが生じる。表面ユニットタンパク質すなわちｇｐ７０（例えば、配列番号２５または配列番号２４のアミノ酸１～３５８に対応する）及び膜貫通タンパク質ｐ２０Ｅ（例えば、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２４のアミノ酸３５９～５４５に対応する）は、ジスルフィド結合を含み得る不安定な相互作用で結合したままである。野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質では、細胞質尾部ドメインのＣ末端に局在する、融合阻害性Ｒペプチド（例えば、配列番号２２に示されている）と呼ばれる短い１７アミノ酸配列によって膜融合性が制御される。融合阻害性Ｒペプチドは、チロシンエンドサイトーシスシグナルＹＸＸＬを保有しており、ウイルスプロテアーゼによるその切断は、膜貫通ドメイン及びエンベロープ糖タンパク質の細胞外領域における分子再配列を介して膜融合活性化を増強すると考えられている（Ｓａｌａｍａｎｇｏ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８９（２４）：１２４９２－１２５００）。
野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質では、ｇｐ７０は、宿主細胞上のＡＳＣＴ－２及びＡＳＣＴ－１受容体への受容体結合を媒介する。いくつかの実施形態では、糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分は、ＡＳＣＴ－２及びＡＳＣＴ－１受容体に結合する。野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質では、ｐ２０ＥはクラスＩウイルス融合タンパク質として機能する。ｇｐ７０サブユニットと宿主細胞膜の相互作用は、ｐ２０Ｅのリフォールディングを引き起こし、融合ペプチドのマスクを解除することによって膜融合潜在性を活性化すると考えられる。
いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含み、Ｒペプチドは、阻害性Ｒペプチドの連続部分を含むが、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長Ｒペプチドを欠いている。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて、阻害性Ｒペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、または少なくとも３個の連続アミノ末端アミノ酸を有するが、全長Ｒペプチドよりも短い、部分的阻害性Ｒペプチドからなる細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの１～１６個の連続アミノ末端アミノ酸からなる、例えば、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２、１４、１５、または１６個のアミノ末端アミノ酸からなる部分的阻害性Ｒペプチドを有する細胞質尾部を有する。
特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの１～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの２～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの３～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの４～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの５～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの６～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの７～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの８～９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。特定の実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの９個の連続アミノ末端アミノ酸（ただし全長未満）を含む。
いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、部分的阻害性Ｒペプチドを含むため、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長細胞質尾部よりも短い細胞質尾部を含む。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号４に示されている全長細胞質尾部の部分を含む。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号４の１８～３３個の連続アミノ末端アミノ酸、例えば、配列番号４の１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３個の連続アミノ末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープの細胞質尾部は、１８～３３アミノ酸長であり、例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３アミノ酸長である。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２３または２４のいずれかに示されている配列の部分を含み、これは、膜融合活性を保有するその機能的に活性なバリアントまたは生物学的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２３または配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大で１６個の連続アミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２３または配列番号２４のＣ末端細胞質尾部の１～１６個の連続アミノ酸、例えば、配列番号２３または配列番号２４のＣ末端細胞質尾部の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の連続アミノ酸を欠く。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２３または配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大で８～１４個の連続アミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２３または配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大で８～１３個の連続アミノ酸を欠く。
いくつかの実施形態では、提供する短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質は、脂質粒子（例えば、レンチウイルス粒子）に組み込まれる場合など、（ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニット、またはその生物学的に活性な部分、及び（ｉｉ）記載される部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質ドメインを含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分を含む２つの鎖からなる。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ７０サブユニットは、配列番号２５に示されている配列を有するか、または配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、少なくとも８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示すその機能的または生物学的に活性なバリアントである。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質ｐ２０Ｅサブユニットの部分は、配列番号２６に示されている配列を有するか、または膜融合活性を保有するその機能的または生物学的に活性なバリアントであり、かつ部分的阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ｐ２０Ｅサブユニットの機能的または生物学的に活性なそのバリアントは、配列番号２６に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含み、かつ部分的阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ｐ２０Ｅサブユニットの部分は、配列番号４４～６０のいずれかに示されている配列を有する。
特定の実施形態では、提供する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、脂質粒子（例えば、レンチウイルス粒子）に組み込まれた場合などに、部分的融合阻害性Ｒペプチドによって媒介される膜融合活性を示す。いくつかの実施形態では、部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む提供する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性を保持する。膜融合活性には、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、標的細胞の２つの膜内腔、及び細胞質、例えば、短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質によって認識または結合する表面受容体または分子を含む細胞の融合を促進または容易にする能力が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、中性アミノ酸輸送体受容体ＡＳＣＴ－２またはＡＳＣＴ－１に結合する。ＡＳＣＴ－２受容体とＡＳＣＴ－１受容体は、およそ５７％の配列同一性を共有し、細胞（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）で示差的に発現し、重複しているが同一ではない中性アミノ酸セットのトランスポーターである（Ｃｏｌｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０（２８７３）：１－７；Ｇｉｒａｒｄ－Ｇａｇｎｅｐａｉｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ １２４：１２２１－１２３１；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １４：２４７８－２４９２）。
膜融合活性の保持への言及には、配列番号２４に示されているような、対応する野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の結合レベルまたは結合度の１０％から、１５０％以上または約１５０％以上の活性が含まれる。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性は、配列番号２４に示されているような、対応する野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の結合レベルまたは結合度の５０％～１２５％である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性は、配列番号２４に示されているような、対応する野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の結合レベルまたは結合度の８０％～１２０％である。
いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性は、完全阻害性Ｒペプチドを欠く（Ｒなし）ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性よりも低い。例えば、いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性は、配列番号２４のアミノ酸５２９～５４５に対応する野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の遠位Ｃ末端部分に１７アミノ酸のトランケートを有するＲなしＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性よりも低い。いくつかの実施形態では、ＲなしＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２８に示されているアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、提供する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ＲなしＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜融合活性の１０％～９０％、例えば、ＲなしＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質、例えば配列番号２８に示されている膜融合活性の９０％もしくは約９０％、８５％もしくは約８５％、８０％もしくは約８０％、７５％もしくは約７５％、７０％もしくは約７０％、６０％もしくは約６０％、５０％もしくは約５０％、４０％もしくは約４０％、３０％もしくは約３０％、２０％もしくは約２０％、または１０％以下もしくは約１０％以下を示す。いくつかの実施形態では、膜融合活性の低下により、提供する脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子の産生中の高レベルの細胞融合が回避される。例えば、脂質粒子、例えばレンチウイルス粒子を産生する方法の最中に短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を組み込むと、粒子の産生中のプロデューサー細胞の高レベルの合胞体形成が回避または低減される。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの９個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋９）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号１４に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３７に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されている９個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３７に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号５３に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋８）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号１３に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３６に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されている８個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３６に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号５２に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの７個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋７）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号１２に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３５に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されている７個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３５に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号５１に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの６個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋６）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号１１に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３４に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されている６個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３４に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号５０に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの５個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋５）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号１０に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３３に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されている５個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３３に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号４９に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの４個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋４）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号９に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３２に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されている４個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３２に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号４８に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの３個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋３）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号８に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３１に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されている３個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３１に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号４７に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの２個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋２）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１～２として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号７に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３０に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～１として示されている２個のアミノ酸の部分的阻害物質ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３０に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号４６に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットはｓであり、ｐ２０Ｅの部分はサブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、野生型阻害性Ｒペプチドの１個の連続アミノ末端アミノ酸を含む部分的融合阻害性Ｒペプチド（例えば、Ｒ＋１）を含む。特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸１として示されている部分的融合阻害性Ｒペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号６に示されている細胞質尾部を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２９に示されている配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸として示されている１個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２９に示されている配列を有する。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ７０またはその生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２５に示されている）、及び部分的阻害性ポリペプチドを有する細胞質ドメインを含むｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２５に示されているｇｐ７０サブユニット、及び配列番号４５に示されているｐ２０Ｅサブユニットの部分を含む２鎖形態である。いくつかの実施形態では、ｇｐ７０サブユニットとｐ２０Ｅの部分は、サブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している。
Ａ． ポリヌクレオチド
本明細書において、本明細書に記載の野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドには、上述した短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチドの配列が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの９個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋９）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３７に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されている９個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３７に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋８）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３６に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されている８個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３６に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの７個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋７）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されている７個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの６個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋６）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されている６個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３４に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの５個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋５）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３３に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されている５個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３３に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの４個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋４）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されている４個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの３個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋３）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されている３個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３１に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの２個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋２）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３０に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１～２として示されている２個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３０に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型阻害性Ｒペプチドの１個の連続アミノ末端アミノ酸（例えば、Ｒ＋１）を含む部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２９に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示し、例えば、配列番号２２のアミノ酸１として示されている１個のアミノ酸の部分的阻害性ペプチドを有する細胞質ドメインを含むアミノ酸の配列を有する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２９に示されている短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成核酸であり得る。提供するポリヌクレオチドのいずれかを含有する発現ベクターも提供する。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、天然または合成核酸の発現は、一般的には、関心対象の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核生物における複製及び組み込みに好適であり得る。いくつかの実施形態では、クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含有する。任意の実施形態のうちのいくつかでは、プラスミドは、細胞における発現に好適なプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の発現を制御するために作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の発現のため、各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成のための開始部位を配置するように機能する。この最も知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば、哺乳類末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子用のプロモーター及びＳＶ４０遺伝子用のプロモーターでは、開始部位自体に重なっている別のエレメントが、開始の箇所を固定させるのに役立つ。
いくつかの実施形態では、追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーが、転写開始の頻度を制御する。いくつかの実施形態では、追加のプロモーターエレメントは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、複数のプロモーターが、開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含有することが最近示されている。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメント間の間隔は頻繁にフレキシブルであるため、プロモーター機能は、エレメントが互いに反転または移動した場合に維持される。いくつかの実施形態では、チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーター、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に５０ｂｐ間隔まで増加させることができる。いくつかの実施形態では、プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協働的にまたは独立してのいずれかで機能して転写を活性化することができる。
プロモーターは、コードセグメント及び／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得し得るように、遺伝子またはポリヌクレオチド配列に天然に関連付けられるものであり得る。そのようなプロモーターは、「内在性」と称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置するポリヌクレオチド配列に天然に関連付けられるものであり得る。あるいは、その天然環境においてポリヌクレオチド配列に通常は関連付けられないプロモーターを指す、組換えまたは異種プロモーターの制御下でコードポリヌクレオチドセグメントを配置することによって特定の利点が得られる。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その天然環境におけるポリヌクレオチド配列に通常関連付けられないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、及び任意の他の原核生物、ウイルス、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、及び「天然の」、すなわち、異なる転写制御領域の異なるエレメント、及び／または発現を改変する変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物と組み合わせて、組換えクローニング及び／またはＰＣＲを含む核酸増幅技術を使用して作製され得る（米国特許第４，６８３，２０２号及び第５，９２８，９０６号）。
いくつかの実施形態では、好適なプロモーターは、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を誘導することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、好適なプロモーターは、伸長成長因子－ｌａ（ＥＦ－ｌａ）である。いくつかの実施形態では、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含むがこれらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用され得る。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、そのような発現が所望される場合に作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を作動させ、または発現が所望されない場合に発現を停止することが可能な分子スイッチを提供する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、外因的に制御される誘導性プロモーターを使用して、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の発現を調節することができる。例えば、放射線誘導性プロモーター、熱誘導性プロモーター、及び／または薬物誘導性プロモーターを、例えば、標的とされる領域における導入遺伝子発現を選択的に誘導するために使用することができる。そのような実施形態では、導入遺伝子発現の位置、持続期間、及びレベルを、誘導の外因性供給源の投与によって調節することができる。
いくつかの実施形態では、薬物誘導性プロモーターを使用して、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の発現を調節する。例えば、いくつかの場合では、プロモーター、エンハンサー、またはトランス活性化因子は、Ｌａｃオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列、ドキシサイクリンオペレーター配列、ラパマイシンオペレーター配列、タモキシフェンオペレーター配列、もしくはホルモン反応性オペレーター配列、またはそれらのアナログを含む。いくつかの例では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、タモキシフェンの存在下で遺伝子発現を活性化し得るエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）を含む。いくつかの例では、薬物誘導性エレメント、例えば、ＴＲＥを、選択されたプロモーターと組み合わせて、薬物、例えば、ドキシサイクリンの存在下で転写を向上させることができる。いくつかの実施形態では、薬物誘導性プロモーターは、小分子誘導性プロモーターである。
提供するポリヌクレオチドのいずれかを修飾して、特定の種、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシなどの種における翻訳のためにＣｐＧモチーフを除去するために及び／またはコドンを最適化することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、ヒトコドン使用頻度について最適化する（すなわち、ヒトコドン最適化する）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、ＣｐＧモチーフが除去されるように修飾する。他の実施形態では、提供するポリヌクレオチドを、ＣｐＧモチーフが除去されるように修飾し、コドン最適化、例えば、ヒトコドン最適化する。コドン最適化ならびにＣｐＧモチーフ検出及び修飾の方法は、周知である。一般的には、ポリヌクレオチド最適化は、導入遺伝子発現を向上させ、導入遺伝子安定性を増加させ、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を保存する。
短縮型エンベロープ糖タンパク質の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクターはまた、発現する粒子、例えば、ウイルス粒子の特定及び選択を容易化するために選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有し得る。他の実施形態では、選択マーカーを、ＤＮＡの分離断片上に搭載し、コトランスフェクション手順において使用してもよい。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方を、宿主細胞において発現可能なように適切な調節配列に隣接させてもよい。有用な選択マーカーは、当技術分野で公知であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ｎｅｏなどが挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクションされた可能性のある細胞を同定するために及び調節配列の機能性を評価するために使用される。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子は周知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在せず、またはそれによって発現されず、発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかになるタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。
好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４７９：７９－８２を参照されたい）。好適な発現系は周知であり、周知の技術を使用して調製され、または商業的に入手され得る。内部欠失構築物は、ユニークな内部制限酵素部位を使用して、またはユニークではない制限酵素部位の部分的消化によって生成され得る。次いで構築物は、高レベルの所望のポリヌクレオチド及び／またはポリペプチド発現を示す細胞にトランスフェクションされ得る。通常、レポーター遺伝子の最も高いレベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして識別される。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、プロモーター誘導転写を調節する能力について作用因子評価するために使用してもよい。
ＩＩＩ． 脂質粒子及び脂質粒子の生成のための方法
本明細書において、脂質二重層、脂質二重層によって囲まれた内腔、及び脂質二重層内に短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質が埋め込まれている、記載されたものなどの短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質を含む粒子を提供する。いくつかの実施形態では、提供する脂質粒子は、短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質の向性によって媒介される造血細胞（例えば、Ｔ細胞）を優先的に標的とする。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、細胞に送達するための外因性作用因子（例えば、治療用物質）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、脂質粒子を、対象の細胞に導入する。また、提供する脂質粒子のいずれかを細胞に送達する方法も提供する。
いくつかの実施形態では、提供する脂質粒子は、脂質粒子の２つの内腔と標的細胞膜との合体または融合を促進する短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質によって媒介される膜融合活性を示す。したがって、提供する脂質粒子はフソソームである。いくつかの実施形態では、フソソームは、フソゲンとして短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質を有する両親媒性脂質の天然由来二重層を含む。いくつかの実施形態では、フソソームは、（ａ）脂質二重層、（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、サイトゾルを含む）、及び（ｃ）外因性であるかまたはソース細胞と比べて過剰発現するフソゲンを含む。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質を、脂質二重層に配置した。いくつかの実施形態では、フソソームは、いくつかの異なる種類の脂質、例えば、リン脂質などの両親媒性脂質を含む。いくつかの実施形態では、フソソームは、最外表面として脂質二重層を含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、内腔または腔を包囲する両親媒性脂質の天然由来の二重層を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、最外表面として脂質二重層を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、内腔を包囲する。いくつかの実施形態では、内腔は水性である。いくつかの実施形態では、内腔は、脂質二重層の内部の親水性頭部基と接触している。いくつかの実施形態では、内腔はサイトゾルである。いくつかの実施形態では、サイトゾルは、ソース細胞に存在する細胞成分を含有する。いくつかの実施形態では、サイトゾルは、ソース細胞に存在する成分を含有しない。いくつかの実施形態では、内腔は腔である。いくつかの実施形態では、腔は、水性環境を含有する。いくつかの実施形態では、腔は、水性環境を含有しない。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、小胞、エクソソーム、デンドリマー、レンチウイルス、ウイルスベクター、除核細胞、微小胞、膜小胞、細胞外膜小胞、細胞膜小胞、巨大細胞膜小胞、アポトーシス小体、ミト粒子、ピレノサイト、リソソーム、別の膜包囲小胞、またはレンチウイルスベクター、ウイルスベースの粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または細胞ベースの粒子であり得る。
いくつかの態様では、脂質二重層は、脂質含有粒子を作製するためのプロセス中にソース細胞から得られる。脂質含有粒子を作製するための例示的な方法を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、脂質二重層には、脂質二重層の由来元の宿主細胞の膜成分、例えば、リン脂質、膜タンパク質などが含まれる。いくつかの実施形態では、脂質二重層には、ビヒクルの由来元の細胞に認められる成分を含むサイトゾル、例えば、溶質、タンパク質、核酸などが含まれるが、細胞の成分のすべてではなく、例えば、それらは核を欠く。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、エクソソーム様とみなされる。脂質二重層は、サイズが様々であり得、いくつかの例では、４０～１００ｎｍを含む、３０～１５０ｎｍなどの３０～３００ｎｍの範囲の直径を有する。
特定の実施形態では、脂質粒子はウイルス由来である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ウイルスベクター粒子（例えば、レンチウイルスベクター粒子）またはウイルス様粒子（例えば、レンチウイルス様粒子）などのウイルスベースの粒子であり得る。いくつかの実施形態では、脂質二重層はウイルスエンベロープである。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープを、宿主細胞から取得する。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープを、ソース細胞の細胞膜由来のウイルスキャプシドによって取得する。いくつかの実施形態では、脂質二重層を、宿主細胞の細胞膜以外の膜から取得する。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープ脂質二重層には、ウイルス糖タンパク質を含むウイルスタンパク質が埋め込まれている。
特定の実施形態では、脂質粒子はウイルス由来ではない。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ナノ粒子、小胞、エクソソーム、デンドリマー、除核細胞、微小胞、膜小胞、細胞外膜小胞、細胞膜小胞、巨大細胞膜小胞、アポトーシス小体、ミト粒子、ピレノサイト、リソソーム、別の膜包囲小胞、または細胞由来の粒子であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質二重層には、脂質二重層の由来元の宿主細胞の膜成分、例えば、リン脂質、膜タンパク質などが含まれる。いくつかの実施形態では、脂質二重層には、ビヒクルの由来元の細胞に認められる成分を含むサイトゾル、例えば、溶質、タンパク質、核酸などが含まれるが、細胞の成分のすべてではなく、例えば、それらは核を欠く。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、エクソソーム様とみなされる。脂質二重層は、サイズが様々であり得、いくつかの例では、４０～１００ｎｍを含む、３０～１５０ｎｍなどの３０～３００ｎｍの範囲の直径を有する。
他の態様では、脂質二重層には、合成脂質複合体が含まれる。いくつかの実施形態では、合成脂質複合体はリポソームである。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、リン脂質二重層膜及び内側水性媒体を特徴とする小胞構造である。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁された場合に自発的に形成する。いくつかの例では、脂質成分は、近接した構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層間の水及び溶解した溶質を捕捉する。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、いくつかの異なる種類の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質は両親媒性脂質である。いくつかの実施形態では、両親媒性脂質はリン脂質である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルセリンを含む。いくつかの実施形態では、脂質は、ホスホコリン及びホスホイノシトールなどのリン脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、及びＤＳＰＣを含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの外因性作用因子が脂質粒子の内腔内に封入される。提供する脂質粒子の実施形態は、標的細胞へのペイロード、例えば、所望の導入遺伝子または外因性作用因子などの送達を促進する様々な特性を有し得る。外因性作用因子は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する脂質粒子を、対象、例えば、哺乳類、例えば、ヒトに投与する。そのような実施形態では、対象は、特定の疾患もしくは病態のリスクがある場合、その症状を有する場合、またはそれと診断されているもしくはそれを有するものとして特定されている場合がある。一実施形態では、対象は、がんを有する。一実施形態では、対象は、感染性疾患を有する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、疾患または病態を治療するための、外因性作用因子をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド）、またはポリペプチドの外因性作用因子を含む。
脂質粒子は、球状粒子を含み得るか、または細長い形状もしくは不規則な形状の粒子を含み得る。
いくつかの実施形態では、粒子の組成を、直径、その直径の平均（平均）または中央値の上下の変動範囲、変動係数、多分散性指数、または組成物中の粒子のサイズの他の尺度を含む、粒子のサイズに関連する１つ以上の特性について評価することができる。粒子の特性評価には、レーザー回折、動的光散乱（ＤＬＳ、光子相関分光法としても知られる）、または顕微鏡や自動画像分析などの画像分析を含むがこれらに限定されない様々な方法を使用することができる。
いくつかの実施形態では、提供する脂質粒子は、組成物中の粒子の直径、または平均（平均）直径が、約３μｍ未満、約２μｍ未満、約１μｍ未満、約９００ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、または約２０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、組成物中の粒子の直径、または粒子の平均（平均）直径が、約４００ｎｍ未満である。別の実施形態では、脂質粒子は、組成物中の粒子の直径、または粒子の平均（平均）直径が、約１５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、組成物中の粒子の直径または平均（平均）直径が、２μｍもしくは約２μｍから、１μｍもしくは約１μｍ、１μｍもしくは約１μｍから、９００ｎｍもしくは約９００ｎｍ、９００ｎｍもしくは約９００ｎｍから、８００ｎｍもしくは約８００ｎｍ、８００ｎｍもしくは約８００ｎｍから、７００ｎｍもしくは約７００ｎｍ、７００ｎｍもしくは約７００ｎｍから、６００ｎｍもしくは約６００ｎｍ、６００ｎｍもしくは約６００ｎｍから、５００ｎｍもしくは約５００ｎｍ、５００ｎｍもしくは約５００ｎｍから、４００ｎｍもしくは約４００ｎｍ、４００ｎｍもしくは約４００ｎｍから、３００ｎｍもしくは約３００ｎｍ、３００ｎｍもしくは約３００ｎｍから、２００ｎｍもしくは約２００ｎｍ、２００ｎｍもしくは約２００ｎｍから、１００ｎｍもしくは約１００ｎｍ、１００ｎｍもしくは約１００ｎｍから、５０ｎｍもしくは約５０ｎｍ、または２０ｎｍもしくは約２０ｎｍから、５０ｎｍもしくは約５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、粒子の組成物中での直径の中央値は、１０ｎｍもしくは約１０ｎｍから、１０００ｎＭもしくは約１０００ｎＭ、２５ｎｍもしくは約２５ｎｍから、５００ｎｍもしくは約５００ｎｍ、４０ｎｍもしくは約４０ｎｍから、３００ｎｍもしくは約３００ｎｍ、５０ｎｍもしくは約５０ｎｍから、２５０ｎｍもしくは約２５０ｎｍ、６０ｎｍもしくは約６０ｎｍから、２２５ｎｍもしくは約２２５ｎｍ、７０ｎｍもしくは約７０ｎｍから、２００ｎｍもしくは約２００ｎｍ、８０ｎｍもしくは約８０ｎｍから、１７５ｎｍもしくは約１７５ｎｍ、または９０ｎｍもしくは約９０ｎｍから、１５０ｎｍもしくは約１５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の９０％が、脂質粒子の中位径の５０％以内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の９０％が、脂質粒子の中位径の２５％以内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の９０％が、中位径の２０％以内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の９０％が、脂質粒子の中位径の１５％以内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の９０％が、脂質粒子の中位径の１０％以内に入る。
いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の７５％が、脂質粒子の平均径の±２または±１ Ｓｔ Ｄｅｖの標準偏差（Ｓｔ Ｄｅｖ）内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の８０％が、脂質粒子の平均径の±２ Ｓｔ Ｄｅｖまたは±１ Ｓｔ Ｄｅｖ内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の８５％が、脂質粒子の平均径の±２ Ｓｔ Ｄｅｖまたは±１ Ｓｔ Ｄｅｖ内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の９０％が、脂質粒子の平均径の±２ Ｓｔ Ｄｅｖまたは±１ Ｓｔ Ｄｅｖ内に入る。いくつかの実施形態では、組成物中の脂質粒子の９５％が、脂質粒子の平均径の±２ Ｓｔ Ｄｅｖまたは±１ Ｓｔ Ｄｅｖ内に入る。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えばＤＬＳによって測定されるように、約１００ｎｍから、約２マイクロメートルの平均流体力学半径を有する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、平均流体力学半径が、２μｍもしくは約２μｍから、１μｍもしくは約１μｍ、１μｍもしくは約１μｍから、９００ｎｍもしくは約９００ｎｍ、９００ｎｍもしくは約９００ｎｍから、８００ｎｍもしくは約８００ｎｍ、８００ｎｍもしくは約８００ｎｍから、７００ｎｍもしくは約７００ｎｍ、７００ｎｍもしくは約７００ｎｍから、６００ｎｍもしくは約６００ｎｍ、６００ｎｍもしくは約６００ｎｍから、５００ｎｍもしくは約５００ｎｍ、５００ｎｍもしくは約５００ｎｍから、４００ｎｍもしくは約４００ｎｍ、４００ｎｍもしくは約４００ｎｍから、３００ｎｍもしくは約３００ｎｍ、３００ｎｍもしくは約３００ｎｍから、２００ｎｍもしくは約２００ｎｍ、２００ｎｍもしくは約２００ｎｍから、１００ｎｍもしくは約１００ｎｍ、１００ｎｍもしくは約１００ｎｍから、５０ｎｍもしくは約５０ｎｍ、または２０ｎｍもしくは約２０ｎｍから、５０ｎｍもしくは約５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば多角度光散乱によって測定されるように、約１００ｎｍから、約２マイクロメートルの平均幾何学半径を有する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、平均幾何学半径が、２μｍもしくは約２μｍから、１μｍもしくは約１μｍ、１μｍもしくは約１μｍから、９００ｎｍもしくは約９００ｎｍ、９００ｎｍもしくは約９００ｎｍから、８００ｎｍもしくは約８００ｎｍ、８００ｎｍもしくは約８００ｎｍから、７００ｎｍもしくは約７００ｎｍ、７００ｎｍもしくは約７００ｎｍから、６００ｎｍもしくは約６００ｎｍ、６００ｎｍもしくは約６００ｎｍから、５００ｎｍもしくは約５００ｎｍ、５００ｎｍもしくは約５００ｎｍから、４００ｎｍもしくは約４００ｎｍ、４００ｎｍもしくは約４００ｎｍから、３００ｎｍもしくは約３００ｎｍ、３００ｎｍもしくは約３００ｎｍから、２００ｎｍもしくは約２００ｎｍ、２００ｎｍもしくは約２００ｎｍから、１００ｎｍもしくは約１００ｎｍ、１００ｎｍもしくは約１００ｎｍから、５０ｎｍもしくは約５０ｎｍ、または２０ｎｍもしくは約２０ｎｍから、５０ｎｍもしくは約５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、脂質粒子の組成物の変動係数（ＣＯＶ）（すなわち、標準偏差を平均で割ったもの）は、３０％未満もしくは約３０％未満、２５％未満もしくは約２５％未満、２０％未満もしくは約２０％未満、１５％未満もしくは約１５％未満、１０％未満もしくは約１０％未満、または５％未満もしくは約５％未満である。
いくつかの実施形態では、提供する脂質粒子の組成物は、粒子のサイズ分布の尺度である多分散指数によって特徴付けられ、１（最大分散）と０（すべての粒子が同一サイズ）の間の値が可能である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する脂質粒子の組成物は、０．０５もしくは約０．０５から、０．７もしくは約０．７、０．０５もしくは約０．０５から、０．６もしくは約０．６、０．０５もしくは約０．０５から、０．５もしくは約０．５、０．０５もしくは約０．０５から、０．４もしくは約０．４、０．０５もしくは約０．０５から、０．３もしくは約０．３、０．０５もしくは約０．０５から、０．２もしくは約０．２、０．０５もしくは約０．０５から、０．１もしくは約０．１、０．０５もしくは約０．０５から、０．１もしくは約０．１、０．１もしくは約０．１から、０．７もしくは約０．７、０．１もしくは約０．１から、０．６もしくは約０．６、０．１もしくは約０．１から、０．５もしくは約０．５、０．１もしくは約０．１から、０．４もしくは約０．４、０．１もしくは約０．１から、０．３もしくは約０．３、０．１もしくは約０．１から、０．２もしくは約０．２、０．２もしくは約０．２から、０．７もしくは約０．７、０．２もしくは約０．２から、０．６もしくは約０．６、０．２もしくは約０．２から、０．５もしくは約０．５、０．２もしくは約０．２から、０．４もしくは約０．４、０．２もしくは約０．２から、０．３もしくは約０．３、０．３もしくは約０．３から、０．７もしくは約０．７、０．３もしくは約０．３から、０．６もしくは約０．６、０．３もしくは約０．３から、０．５もしくは約０．５、０．３もしくは約０．３から、０．４もしくは約０．４、０．４もしくは約０．４から、０．７もしくは約０．７、０．４もしくは約０．４から、０．６もしくは約０．６、０．４もしくは約０．４から、０．５もしくは約０．５、０．５もしくは約０．５から、０．７もしくは約０．７、０．５もしくは約０．５から、０．６もしくは約０．６、または０．６もしくは約０．６から、０．７もしくは約０．７の多分散指数を有する。いくつかの実施形態では、多分散指数は、０．０５もしくは約０．０５未満、０．１もしくは約０．１未満、０．１５もしくは約０．１５未満、０．２もしくは約０．２未満、０．２５もしくは約０．２５未満、０．３もしくは約０．３未満、０．４もしくは約０．４未満、０．５もしくは約０．５未満、０．６もしくは約０．６未満、または０．７もしくは約０．７未満である。様々な脂質粒子が知られており、そのいずれも、提供する実施形態に従って生成することができる。脂質粒子の非限定的な例としては、国際公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／０９５９４６；ＷＯ２０１７／０９５９４４；ＷＯ２０１７／０９５９４０；ＷＯ２０１９／１５７３１９；ＷＯ２０１８／２０８７２８；ＷＯ２０１９／１１３５１２；ＷＯ２０１９／１６１２８１；ＷＯ２０２０／１０２５７８；ＷＯ２０１９／２２２４０３；ＷＯ２０２０／０１４２０９；ＷＯ２０２０／１０２４８５；ＷＯ２０２０／１０２４９９；ＷＯ２０２０／１０２５０３；ＷＯ２０１３／１４８３２７；ＷＯ２０１７／１８２５８５；ＷＯ２０１１／０５８０５２；またはＷＯ２０１７／０６８０７７に記載されているもの、または記載されている特徴を含むものが挙げられ、それぞれの全体が参照により援用される。
例示的な提供する脂質粒子の特徴を、以下の小節に記載する。
Ａ． ウイルスベースの粒子
本明細書において、第Ｉ節に記載されるような短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質を含む、レトロウイルスまたはレンチウイルスに由来するものを含む、ウイルス由来のウイルスベースの粒子を提供する。いくつかの実施形態では、脂質粒子の両親媒性脂質二重層は、ウイルスエンベロープであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、両親媒性脂質の脂質粒子の二重層は、プロデューサー細胞に由来する脂質であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープは、フソゲン、例えば、ウイルスに対して内在性であるフソゲンまたは偽型フソゲンを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質粒子の内腔または腔は、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸、例えば、レンチウイルス核酸を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス核酸は、ウイルスゲノムであり得る。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、１つ以上のウイルス非構造タンパク質を、例えば、その腔または内腔にさらに含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベースの粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはウイルス遺伝物質を含まない。いくつかの実施形態では、ウイルスベースの粒子は、ウイルス由来の核酸またはウイルス構造タンパク質などのウイルスタンパク質を含まない。
外因性作用因子を宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用を含む。ＤＮＡ及びＲＮＡベクターは、ポリヌクレオチド及びポリペプチドを収容し、送達するために使用することもできる。ウイルスベクター及びウイルス様粒子、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法である。他のウイルスベクター及びウイルス様粒子は、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい。ベクター及び／または外因性の酸を含む細胞の産生方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
いくつかの実施形態では、両親媒性脂質のウイルス粒子またはウイルス様粒子二重層は、感染した宿主細胞に由来する脂質であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層はウイルスエンベロープである。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子またはウイルス様粒子のエンベロープを、宿主細胞から取得する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子またはウイルス様粒子のエンベロープを、ソース細胞の細胞膜由来のウイルスキャプシドによって取得する。いくつかの実施形態では、脂質二重層を、宿主細胞の細胞膜以外の膜から取得する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子またはウイルス様粒子のエンベロープ脂質二重層には、ウイルス糖タンパク質を含むウイルスタンパク質が埋め込まれている。
いくつかの実施形態では、ウイルス粒子またはウイルス様粒子、例えばレトロウイルス粒子またはレトロウイルス様粒子の１以上の形質導入単位を対象に投与する。いくつかの実施形態では、１ｋｇあたり少なくとも１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４形質導入単位を対象に投与する。いくつかの実施形態では、血液１ｍｌあたり少なくとも１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４形質導入単位／標的細胞を対象に投与する。
１． ウイルスベクター粒子
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ウイルスまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスまたはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスまたはレンチウイルスベクターであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスまたはウイルスベクターは組換え体である。例えば、ウイルス粒子は、組換えウイルスまたは組換えウイルスベクターと呼ばれる場合があり、これらは同じ意味で使用される。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、組換えレンチウイルスベクター粒子である。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、エンベロープを含むレトロウイルスベクターを含む脂質二重層を含む。例えば、いくつかの実施形態では、両親媒性脂質二重層は、ウイルスエンベロープであるか、またはそれを含む。ウイルスエンベロープは、フソゲン、例えば、ウイルスに対して内在性であるフソゲン、例えば短縮型ＢａＥＶフソゲンまたは偽型フソゲンを含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの内腔または空洞は、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸、例えば、レンチウイルス核酸を含む。ウイルス核酸は、ウイルスゲノムであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはさらに、１つ以上のウイルス非構造タンパク質を、例えば、その空洞または内腔に含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベースのベクター粒子はレンチウイルスである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクター粒子はヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター粒子は、パッケージングできるポリヌクレオチドの数に制限がある。いくつかの実施形態では、パッケージングされるポリペプチドをコードするヌクレオチドを、コード領域において野生型ペプチドをコードするヌクレオチドよりも少ないヌクレオチドで機能活性を保持するように改変することができる。そのような改変には、短縮または他の欠失が含まれ得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドとなるように、複数のポリペプチドを同じプロモーターから発現させることができる。いくつかの実施形態では、パッケージングされるインサートのサイズ（すなわち、ウイルスゲノムもしくはその部分、または記載の異種ポリヌクレオチド）は、５００～１０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、または７０００～８０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、インサートは、８０００ヌクレオチド長超、例えば９０００、１００００、または１１０００ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター粒子、例えば、レトロウイルスベクター粒子は、ｇａｇポリタンパク質、ポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ）、インテグラーゼ（例えば、機能性または非機能性バリアント）、プロテアーゼ、及びフソゲンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ｒｅｖをさらに含む。いくつかの実施形態では、前述のタンパク質の１つ以上は、レトロウイルスゲノム（すなわち、上記のインサート）にコードされ、いくつかの実施形態では、前述のタンパク質の１つ以上は、例えば、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドによってトランスで提供される。いくつかの実施形態では、脂質粒子核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、以下の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、ペイロード遺伝子に作動可能に連結されたセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）プロモーター、ペイロード遺伝子（任意選択でオープンリーディングフレームの前のイントロンを含む）、ポリＡテール配列、ＷＰＲＥ、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３を欠く）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子核酸は、レトロウイルスシス作用性ＲＮＡパッケージングエレメント及びｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子核酸は、１つ以上のインシュレーターエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、認識部位は、ポリＡテール配列とＷＰＲＥとの間に位置する。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、キャプシドへ自己構築するウイルスタンパク質によって形成される超分子複合体を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ウイルスキャプシドに由来するウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ウイルスヌクレオキャプシドに由来するウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、核酸をパッケージングする特性を保持するヌクレオキャプシド由来を含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、発現プロセス中に１つ以上のウイルス核酸（例えば、レトロウイルス核酸）を保有する宿主細胞由来の核酸をパッケージングする。いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルス複製に関与するいかなる遺伝子もコードしない。特定の実施形態では、脂質粒子は、例えば、複製欠損性であるウイルスベースの粒子、例えば、レンチウイルス粒子などのレトロウイルス粒子である。
いくつかの場合では、脂質粒子は、野生型感染性ウイルスから形態的に区別不可能なウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、ウイルスプロテオーム全体を抗原として提示する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、プロテオームの一部のみを抗原として提示する。
いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、５’プロモーター（例えば、パッケージングされたＲＮＡ全体の発現を制御するためのもの）、５’ＬＴＲ（例えば、Ｒ（ポリアデニル化テールシグナル）及び／またはプライマー活性化シグナルを含むＵ５を含む）、プライマー結合部位、Ｐｓｉパッケージングシグナル、核外輸送のためのＲＲＥエレメント、導入遺伝子発現を制御するための導入遺伝子の直接的上流のプロモーター、導入遺伝子（または他の外因性作用因子エレメント）、ポリプリントラクト、及び３’ＬＴＲ（例えば、変異型Ｕ３、Ｒ、及びＵ５を含む）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、及び／またはインシュレーターエレメントのうちの１つ以上をさらに含む。
レトロウイルスは、通常、そのゲノムＲＮＡの線状二本鎖ＤＮＡコピーへの逆転写によって複製し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込む。特定の実施形態において使用するために好適な例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スピューマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、イプシロンレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、アルファレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、ベータレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、デルタレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、スプーマレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、内在性レトロウイルスである。
例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型、及びＨＩＶ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）を使用する。
ウイルスベクターは、一般的に核酸分子（例えば、外因性作用因子をコードする核酸を含む）の移行または細胞のゲノムもしくは核酸移行を媒介するウイルス粒子への組み込みを促進するウイルス由来核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移入プラスミド）を含み得る。ウイルスベクター粒子は、通常、核酸に加えて様々なウイルス構成要素及び時に宿主細胞構成要素も含み得る。ウイルスベクターは、核酸を細胞に（例えば、外因性作用因子をコードする核酸）、または移入された核酸（例えば、むき出しのＤＮＡとして）に移入することが可能なウイルスまたはウイルス粒子を含み得る。ウイルスベクター及びトランスファープラスミドは、主にウイルスに由来する構造的及び／または機能的遺伝子エレメントを含み得る。レトロウイルスベクターは、主にレトロウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝子エレメント、またはその部分を含むウイルスベクターまたはプラスミドを含み得る。レンチウイルスベクターは、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む、構造的及び／または機能的遺伝子エレメント、またはその部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを含み得る。
実施形態では、レンチウイルスベクター（例えば、レンチウイルス発現ベクター）は、レンチウイルストランスファープラスミド（例えば、むき出しのＤＮＡとして）または感染性レンチウイルス粒子を含み得る。クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに関して、これらのエレメントの配列は、レンチウイルス粒子にはＲＮＡ形態で存在し得、ＤＮＡプラスミドにはＤＮＡ形態で存在し得ることが理解されるべきである。
本明細書に記載のいくつかのベクターにおいて、複製に寄与する、または必須である１つ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部は、対応する野生型ウイルスと比較して存在しない場合がある。これにより、ウイルスベクターは複製欠損性となる。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的非分裂宿主細胞を形質導入すること、及び／またはそのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことが可能である。
野生型レトロウイルスゲノムの構造は、多くの場合、５’末端反復配列（ＬＴＲ）及び３’ＬＴＲを含み、その間またはその中に、ゲノムがパッケージングされることを可能にするためのパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能とするための組み込み部位、ならびにウイルス粒子の構築を促進するパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子が配置されている。より複雑なレトロウイルスは、追加の特徴、例えば、ＨＩＶにおけるｒｅｖ及びＲＲＥ配列を有し、これは、感染した標的細胞の核から細胞質への組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物の効率的な搬出を可能とする。プロウイルスでは、ウイルス遺伝子の両端に末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスの組み込み及び転写に関与する。ＬＴＲはまた、エンハンサー－プロモーター配列として機能し、ウイルス遺伝子の発現を制御し得る。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列により生じる。
ＬＴＲ自体は通常、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分割することができる同様の（例えば、同一の）配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端での反復配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間で大きく異なり得る。
ウイルスゲノムについては、転写開始の部位は、通常、一方のＬＴＲにおけるＵ３とＲとの間の境界であり、ポリ（Ａ）付加（終結）の部位は、他方のＬＴＲにおけるＲとＵ５との間の境界である。Ｕ３は、細胞性、及びいくつかの場合では、ウイルス転写活性化因子タンパク質に対して応答性のプロモーター及び複数のエンハンサー配列を含む、プロウイルスの転写制御エレメントのほとんどを含有する。いくつかのレトロウイルスは、遺伝子発現の制御に関与するタンパク質をコードする以下の遺伝子：ｔｏｔ、ｒｅｖ、ｔａｘ、及びｒｅｘのうちの任意の１つ以上を含む。構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ自体に関して、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解的に、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）、及びＮＣ（ヌクレオキャプシド）へとプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、これは、ゲノムの複製を媒介する、ＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮａｓｅ Ｈ、及びインテグラーゼ（ＩＮ）を含有する。ｅｎｖ遺伝子は、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質及び膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードし、これらは、細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する。この相互作用は、感染を、例えば、ウイルス膜と細胞膜との融合によって促進する。
複製欠損性レトロウイルスベクターゲノムｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖは、存在しない場合があるか、または機能性ではない場合がある。ＲＮＡの両末端におけるＲ領域は、一般的には反復配列である。Ｕ５及びＵ３は、ＲＮＡゲノムの５’及び３’末端に特有の配列をそれぞれ表す。
レトロウイルスはまた、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ以外のタンパク質をコードする追加の遺伝子を含有し得る。追加の遺伝子の例には、（ＨＩＶにおける）、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、及びｎｅｆのうちの１つ以上が含まれる。ＥＩＡＶは、（とりわけ）追加の遺伝子Ｓ２を有する。追加の遺伝子によってコードされるタンパク質は、様々な機能を果たし、その一部は、細胞タンパク質によって提供される機能の重複であり得る。ＥＩＡＶにおいて、例えば、ｔａｔは、ウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用する（Ｄｅｒｓｅ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｌｄ １９９３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：５３０－６；Ｍａｕｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００：６３２－４２）。これは、ＴＡＲと呼ばれる安定したステムループＲＮＡ二次構造に結合する。Ｒｅｖは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節し、調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３１０２－１１）。これら２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスの類似機序とほぼ同様であると考えられる。さらに、ＥＩＡＶタンパク質Ｔｔｍが同定されており、これは、膜貫通タンパク質の開始点でｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの第１のエクソンによってコードされる。
プロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼに加えて、非霊長類レンチウイルスは、ｄＵＴＰａｓｅをコードする第４のｐｏｌ遺伝子産物を含む。これは、これらのレンチウイルスが、特定の非分裂細胞または徐々に分裂する細胞型に感染する能力において役割を果たし得る。
実施形態では、組み換えレンチウイルスベクター（ＲＬＶ）は、ＲＮＡゲノムを、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することが可能なウイルス粒子にパッケージングすることを可能にするのに十分なレトロウイルスの遺伝子情報を有するベクターである。標的細胞の感染は、逆転写及び標的細胞ゲノムへの組み込みを含み得る。ＲＬＶは、通常、本明細書に記載の外因性作用因子をコードする核酸など、ベクターによって標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を保有する。実施形態では、ＲＬＶは、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を生成するための独立した複製が不可能である。通常、ＲＬＶは、機能性ｇａｇ－ｐｏｌ及び／またはｅｎｖ遺伝子及び／または複製に関与する他の遺伝子を欠く。ベクターは、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願第ＷＯ９９／１５６８３号に記載されているように、スプリット－イントロンベクターとして構成され得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、最小ウイルスゲノムを含み、例えば、ウイルスベクターは、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＷＯ９８／１７８１５に記載されているように、関心対象のヌクレオチド配列を標的宿主細胞に感染させ、形質導入し、送達するために必要とされる機能性を提供するために、非必須エレメントを除去し、必須エレメントを保持するように操作されている。
最小レンチウイルスゲノムは、例えば、（５’）Ｒ－Ｕ５－１つ以上の第１のヌクレオチド配列－Ｕ３－Ｒ（３’）を含み得る。しかしながら、ソース細胞内でレンチウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターにはまた、ソース細胞におけるゲノムの転写を誘導するためのレンチウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節性制御配列が含まれ得る。これらの調節配列は、転写されたレトロウイルス配列、例えば、５’Ｕ３領域に関連する天然の配列を含んでもよいか、またはそれらは、異種プロモーター、例えば、別のウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターを含む場合もある。いくつかのレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス産生を促進するための追加の配列を含む。例えば、ＨＩＶの場合、ｒｅｖ及びＲＲＥ配列が含まれ得る。代替的にまたは組み合わせて、コドン最適化を使用してもよく、例えば、外因性作用因子をコードする遺伝子は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＷＯ０１／７９５１８に記載されているように、コドン最適化され得る。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と類似するまたは同じ機能を発揮する選択的配列も使用され得る。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能性アナログは、マソン・ファイザー・サルウイルスに認められる。これは、ＣＴＥとして知られており、感染細胞内の因子と相互作用すると考えられるＲＲＥ型配列をゲノム内に含む。細胞因子は、ｒｅｖアナログと考えられ得る。したがって、ＣＴＥは、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替として使用され得る。さらに、ＨＴＬＶ－ＩのＲｅｘタンパク質は、ＨＩＶ－ＩのＲｅｖタンパク質に機能的に取って代わり得る。Ｒｅｖ及びＲｅｘは、ＩＲＥ－ＢＰに対して類似する効果を有する。
いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸（例えば、レンチウイルス核酸、例えば、霊長類または非霊長類レンチウイルス核酸）は、（１）ｇａｇ遺伝子が削除されており、ｇａｇの削除により、ｇａｇコード配列のほぼヌクレオチド３５０または３５４の下流の１つ以上のヌクレオチドが除去されており、（２）レトロウイルス核酸には存在しない１つ以上のアクセサリー遺伝子を有し、（３）ｔａｔ遺伝子を欠くが、５’ＬＴＲの末端とｇａｇのＡＴＧとの間にリーダー配列を含み、ならびに（４）（１）、（２）、及び（３）の組み合わせである。実施形態では、レンチウイルスベクターは、（１）及び（２）及び（３）の特徴すべてを含む。このストラテジーは、参照によりその全体が本明細書に援用されるＷＯ９９／３２６４６においてより詳細に記載されている。
いくつかの実施形態では、霊長類レンチウイルスの最小系は、ベクター産生または分裂細胞及び非分裂細胞の形質導入のいずれかのためにＨＩＶ／ＳＩＶの追加の遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、及びｎｅｆのいずれも必要としない。いくつかの実施形態では、ＥＩＡＶ最小ベクター系は、ベクター産生または分裂細胞及び非分裂細胞の形質導入のいずれかのためにＳ２を必要としない。
追加の遺伝子の欠失により、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症における疾患に関連する遺伝子を伴わずにベクターを産生することが可能となり得る。特に、ｔａｔは疾患に関連する。第二に、追加の遺伝子の欠失により、ベクターは、より多くの異種ＤＮＡをパッケージングすることが可能となる。第三に、Ｓ２などの機能が不明である遺伝子を含めなくてもよく、ひいては不要な効果を引き起こすリスクが減少し得る。最小レンチウイルスベクターの例は、ＷＯ９９／３２６４６及びＷＯ９８／１７８１５に開示されている。
いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、少なくともｔａｔ及びＳ２（ＥＩＡＶベクター系の場合）を欠損しており、場合によってはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、及びｎｅｆも欠損している。いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、ｒｅｖ、ＲＲＥ、または両方を欠損している。
いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸はｖｐｘを含む。Ｖｐｘポリペプチドは、細胞質における遊離ｄＮＴＰを分解するＳＡＭＨＤ１制限因子に結合し、その分解を誘導する。したがって、細胞質における遊離ｄＮＴＰの濃度は、ＶｐｘがＳＡＭＨＤ１を分解し、逆転写活性が増加するとともに増加し、ひいてはレトロウイルスゲノムの逆転写及び標的細胞ゲノムへの組み込みが促進される。
異なる細胞は、特定のコドンのそれらの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応する。配列中のコドンを改変して、対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致させるようにそれらを調整することにより、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって発現を減少させることが可能である。したがって、さらなる程度の翻訳制御が可能である。コドン最適化の追加的説明は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＷＯ９９／４１３９７に記載されている。
ＨＩＶ及び他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数の希少コドンを使用し、これらを一般に使用される哺乳類コドンに対応するように変化させることによって、哺乳類のプロデューサー細胞におけるパッケージング成分の発現を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、コドン最適化は、いくつかの他の利点を有する。いくつかの実施形態では、それらの配列における改変により、パッケージング成分をコードするヌクレオチド配列から、ＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を低減または排除し得る。同時に、パッケージング成分用のアミノ酸配列コード配列は、その配列によってコードされるウイルス成分が、パッケージング成分の機能が損なわれないように同じ、または少なくとも十分に類似したままとなるように保持される。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、搬出のためのＲｅｖ／ＲＲＥ要件も克服し、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ベクター系内の異なる構築物間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）の相同組換えも減少させる。いくつかの実施形態では、コドン最適化により、ウイルス力価の増加及び／または安全性の向上が得られる。
いくつかの実施形態では、ＩＮＳに関連するコドンのみをコドン最適化する。他の実施形態では、配列は、ｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を包含する配列を除いて、その全体をコドン最適化する。
ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複するリーディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソームの「ずれ」の結果として生じる。このずれは、少なくとも部分的にはリボソーム停滞ＲＮＡ二次構造によって引き起こされると考えられる。そのような二次構造は、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇの開始点の下流のヌクレオチド１２２２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの終結点（ｎｔ １５０３）まで広がる。したがって、フレームシフト部位及び２つのリーディングフレームの重複領域にわたる２８１ｂｐの断片は、コドン最適化されないことが好ましい。いくつかの実施形態では、この断片を保持することにより、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現が可能となる。ＥＩＡＶの場合、重複の開始点はｎｔ１２６２である（ヌクレオチド１は、ｇａｇ ＡＴＧのＡである）。重複の終結点はｎｔ１４６１である。フレームシフト部位及びｇａｇ－ｐｏｌ重複が確実に保存されるように、野生型配列は、ｎｔ１１５６から１４６５まで保持され得る。
いくつかの実施形態では、例えば、好都合な制限酵素部位を提供するために、最適なコドン使用頻度からの導出を行ってもよく、保存的アミノ酸変化をｇａｇ－ｐｏｌタンパク質に導入してもよい。
いくつかの実施形態では、コドン最適化は、哺乳類系におけるコドン使用頻度が少ないコドンに基づく。３番目ならびに時として２番目と３番目の塩基が変更され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子コードの縮重特性により、当業者によって多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列が達成され得ることが理解されよう。また、コドン最適化ｇａｇ－ｐｏｌ配列を生成するための開始点として使用可能な多くのレトロウイルスバリアントが記載されている。レンチウイルスのゲノムは非常に多様であり得る。例えば、ＨＩＶ－１には依然として機能する疑似種が多数存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらのバリアントを、形質導入プロセスの特定の部分を増強するために使用してもよい。ＨＩＶ－Ｉバリアントの例は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって維持されているＨＩＶデータベースに見出され得る。ＥＩＡＶクローンの詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって維持されているＮＣＢＩデータベースに見出され得る。
ウイルス配列の適切なコドン最適化を経験的に決定することは、当業者のレベルの範囲内である。ｇａｇ－ｐｏｌを含むコドン最適化された配列のためのストラテジーを、任意のレトロウイルス、例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－Ｉ及びＨＩＶ－２に関して使用することができる。また、この方法を使用して、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ、及びヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ、及び他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を増加させることができる。
実施形態では、レトロウイルスベクターは、ｅｎｖ配列を依然として保持するベクターにおけるｇａｇの２５５～３６０ヌクレオチド、またはスプライスドナー変異、ｇａｇ及びｅｎｖ欠失の特定の組み合わせにおけるｇａｇの約４０ヌクレオチドを含むパッケージングシグナルを含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、１つ以上の欠失を含むｇａｇ配列を含み、例えば、ｇａｇ配列は、Ｎ末端から誘導可能な約３６０ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドは、レトロウイルスの構造及びアクセサリータンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆタンパク質または他のレトロウイルスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルスタンパク質は、同じレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスタンパク質は、複数のレトロウイルス、例えば、２、３、４、またはそれ以上のレトロウイルスに由来する。
いくつかの実施形態では、ｇａｇ及びｐｏｌのコード配列は通常、天然のレンチウイルスにおいてＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体として組織化される。ｇａｇ配列は、ｐ５５とも呼ばれる５５ｋＤのＧａｇ前駆体タンパク質をコードする。ｐ５５は、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（キャプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド［ｐ９］）、及びｐ６と指定された４つのより小さなタンパク質への成熟のプロセス中にウイルスにコードされるプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）によって切断される。ｐｏｌ前駆体タンパク質は、ウイルスにコードされるプロテアーゼによってＧａｇから切断され、さらに消化されてプロテアーゼ（ｐ１０）、ＲＴ（ｐ５０）、ＲＮａｓｅ Ｈ（ｐ１５）、及びインテグラーゼ（ｐ３１）活性を分離する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、組み込み欠損型である。いくつかの実施形態では、ｐｏｌは、インテグラーゼ遺伝子内の変異に起因したコード化などにより、インテグラーゼ欠損型である。例えば、ｐｏｌコード配列は、触媒活性に関与するアミノ酸の１つ以上の変異、すなわちアスパラギン酸６４、アスパラギン酸１１６、及び／またはグルタミン酸１５２のうちの１つ以上の変異など、インテグラーゼにおける不活性化変異を含み得る。いくつかの実施形態では、インテグラーゼ変異は、Ｄ６４Ｖ変異である。いくつかの実施形態では、インテグラーゼにおける変異により、ウイルスＲＮＡのレンチウイルスへのパッケージングが可能になる。いくつかの実施形態では、インテグラーゼにおける変異により、ウイルスタンパク質のレンチウイルスへのパッケージングが可能になる。いくつかの実施形態では、インテグラーゼにおける変異により、挿入変異誘発の可能性が減少する。いくつかの実施形態では、インテグラーゼにおける変異により、複製能を有する組換え体（ＲＣＲ）を生成する可能性が減少する（Ｗａｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１７９８）：１３１６－１３３２）。いくつかの実施形態では、天然のＧａｇ－Ｐｏｌ配列をヘルパーベクター（例えば、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルス）で使用することができ、または改変することができる。これらの改変としては、キメラＧａｇ－Ｐｏｌが挙げられ、この場合、Ｇａｇ及びＰｏｌ配列は、異なるウイルス（例えば、異なる種、亜種、株、分岐群など）から得られ、及び／または配列は、転写及び／または翻訳を改善するように、及び／または組み換えを減少させるように改変されている。
いくつかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、ｇａｇタンパク質の１５０～２５０（例えば、１６８）ヌクレオチド部分をコードするポリヌクレオチドを含み、これは、（ｉ）野生型ＩＮＳ１に対してＲＮＡの核外輸送の制限を減少させる変異型ＩＮＳ１阻害配列を含み、（ｉｉ）フレームシフト及び早期終結をもたらす２つのヌクレオチド挿入を含み、かつ／または（ｉｉｉ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、及びＩＮＳ４阻害配列を含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）配列及び非レンチウイルス性ウイルス配列の両方を含むハイブリッドベクターである。いくつかの実施形態では、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み、かつ／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列を含む。
特定の具体的な実施形態によれば、ウイルスベクターの骨格配列のほとんどまたはすべては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－Ｉに由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／またはレンチウイルス配列の多くの異なる起源を使用するか、または組み合わせることができ、所定のレンチウイルス配列における多数の置換及び改変を、移入ベクターが本明細書に記載の機能を発揮する能力を損なうことなく提供し得ることが理解されるべきである。多様なレンチウイルスベクターがＮａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、及び１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、及び第５，９９４，１３６号に記載されており、その多くは、レトロウイルス核酸を産生するために適応され得る。
プロウイルスの各末端には、末端反復配列（ＬＴＲ）が通常見出される。ＬＴＲは通常、それらの天然配列状況において、ダイレクトリピートであり、かつＵ３、Ｒ、及びＵ５領域を含むレトロウイルス核酸の末端に位置するドメインを含む。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写産物の促進、開始、及びポリアデニル化）及びウイルス複製を促進する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、及びウイルスゲノムの複製及び組み込みのための配列を含む多数の調節シグナルを含み得る。ウイルスのＬＴＲは通常、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分割される。Ｕ３領域は通常、エンハンサーエレメント及びプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は通常、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含み得る。Ｒ（リピート）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に隣接し得る。ＬＴＲは通常、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域からなり、ウイルスゲノムの５’末端と３’末端の両方に出現し得る。いくつかの実施形態では、ゲノムの逆転写のための配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、及び粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングのための配列（ｐｓｉ部位）が、５’ＬＴＲに隣接する。
いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、ウイルスＲＮＡのウイルスキャプシドまたは粒子への挿入を媒介するレトロウイルスゲノム内に配置された配列を含み得る。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５． Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１－２１０９を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのキャプシド形成のための最小パッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ｙ］配列）を使用する。
様々な実施形態では、レトロウイルス核酸は、改変５’ＬＴＲ及び／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲの一方または両方は、１つ以上の欠失、挿入、または置換を含むがこれらに限定されない１つ以上の改変を含み得る。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスを複製欠損性、例えば、感染性ビリオンが産生されないように、完全かつ効果的な複製ができないウイルス（例えば、複製欠損性のレンチウイルス子孫）にすることにより、レンチウイルスまたはレトロウイルス系の安全性を向上させるために行われる。
いくつかの実施形態では、ベクターは自己不活化（ＳＩＮ）ベクター、例えば複製欠損性ベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、その場合、Ｕ３領域として知られる右側（３’）のＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、ウイルス複製の第１ラウンド以降のウイルスの転写を防止するために改変されている（例えば、欠失または置換によって）。いくつかの態様では、本明細書において、パッケージング細胞の非存在下では複製に参加できない（すなわち、形質導入された細胞からウイルスベクター粒子が産生されない）、複製不能（本明細書では複製欠損性とも呼ばれる）ベクター粒子を提供する。いくつかの態様では、これは、ウイルス複製中に右側（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域が左側（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域の鋳型として使用され得、したがって、Ｕ３エンハンサープロモーターの欠損によってウイルス複製が阻害されるためである。実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が除去、改変、または例えば外因性ポリ（Ａ）配列で置換されるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’及び５’の両方のＬＴＲが、改変されたＬＴＲであってもよい。ウイルスベクター、すなわちレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターに対する、前記ベクターの複製を不可能にするための他の改変は、当技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置換して、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動する。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔａｔ非依存的に高レベルの転写を駆動することができる。特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御においてさらなる利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導因子が存在する場合にのみウイルスゲノムの全部または一部の転写が起こるように、誘導可能であり得る。誘導因子には、１つ以上の化合物、または宿主細胞を培養する温度またはｐＨなどの生理学的条件が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えばレンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置するＴＡＲ（トランス活性化応答）エレメントを含む。このエレメントは、レンチウイルスのトランスアクチベーター（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用して、ウイルスの複製を増強する。しかしながら、このエレメントは、例えば、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられる実施形態では必要とされない。
Ｒ領域、例えば、キャッピング基の開始点（すなわち、転写の開始点）で開始し、ポリＡトラクトの開始点の直前に終結するレトロウイルスＬＴＲ内の領域には、Ｕ３及びＵ５領域が隣接し得る。Ｒ領域は、ゲノムの一端から他端への発生期ＤＮＡの移入において逆転写の過程で役割を果たす。
レトロウイルス核酸はまた、ＦＬＡＰエレメント、例えば、その配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－ＩまたはＨＩＶ－２のセントラルポリプリントラクト及びセントラル終結配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む核酸も含み得る。好適なＦＬＡＰエレメントは、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｈ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ－Ｉの逆転写の過程で、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）におけるプラス鎖ＤＮＡの中央開始及びセントラル終結配列（ＣＴＳ）における中央終結は、三本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ－ＩセントラルＤＮＡフラップの形成をもたらし得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターバックボーンは、外因性作用因子をコードする遺伝子の上流または下流に１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、ＦＬＡＰエレメント、例えば、ＨＩＶ－Ｌに由来するか、またはそこから単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルス核酸は、１つ以上の輸送エレメント、例えば、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写産物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを含む。ＲＮＡ輸送エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；及びＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１． Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照のこと）、ならびにＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される。一般に、ＲＮＡ輸送エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは複数のコピーとして挿入され得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列（例えば、外因性作用因子をコードする核酸）の発現は、転写後調節エレメント、ポリアデニル化部位、及び転写終結シグナルのうちの１つ以上、例えば、すべてを該ベクターに組み込むことによって増加する。多様な転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）など（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）が、タンパク質での異種核酸の発現を増加させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルス核酸は、転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルス核酸は、転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠損しているか、または含まない。
例えば、外因性作用因子の発現を増加させるために、異種核酸転写産物の終結及びポリアデニル化を指示するエレメントを含ませてもよい。転写終結シグナルは、ポリアデニル化シグナルの下流に見出され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、外因性作用因子をコードするポリヌクレオチドの３’にポリアデニル化配列を含む。ポリＡ部位は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写産物の終結とポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を含み得る。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加することによってｍＲＮＡの安定性を促進し、翻訳効率の向上に寄与し得る。レトロウイルス核酸において使用することができるポリＡシグナルの例示的な例としては、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβグロビンポリＡ配列（ｒＰｇｐＡ）、または別の好適な異種もしくは内在性ポリＡ配列が挙げられる。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターはさらに、１つ以上のインシュレーター配列、例えば、本明細書に記載のインシュレーター配列を含む。
様々な実施形態において、ベクターは、外因性作用因子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有してもよく、いずれかのＬＴＲは、１つ以上の改変、例えば、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を含む。ベクターは、形質導入効率を増加させるための１つ以上のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージングを増加させるための１つ以上のアクセサリーエレメント（例えば、Ｐｓｉ（Ｙ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、及び／または外因性遺伝子の発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでもよく、任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、レンチウイルス核酸は、例えば、５’から３’方向の、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）、Ｒ配列（例えば、ＴＡＲを含む）、Ｕ５配列（例えば、組み込みのため）、ＰＢＳ配列（例えば、逆転写のため）、ＤＩＳ配列（例えば、ゲノム二量化のため）、ｐｓｉパッケージングシグナル、部分的ｇａｇ配列、ＲＲＥ配列（例えば、核外輸送のため）、ｃＰＰＴ配列（例えば、核内移行のため）、外因性作用因子の発現を誘導するためのプロモーター、外因性作用因子をコードする遺伝子、ＷＰＲＥ配列（例えば、効率的な導入遺伝子発現のため）、ＰＰＴ配列（例えば、逆転写のため）、Ｒ配列（例えば、ポリアデニル化及び終結のため）、及びＵ５シグナル（例えば、組み込みのため）のうちの１つ以上、例えば、すべてを含む。
２． ウイルス様ベクター粒子
いくつかの実施形態では、ウイルスベースの粒子は、ウイルス由来のウイルス様脂質粒子（ＶＬＰ）である。いくつかの実施形態では、ウイルスのエンベロープは、フソゲン、例えば、ウイルスに対して内在性であるフソゲンまたは偽型フソゲンを含み得る。ＶＬＰとしては、レトロウイルスまたはレンチウイルスに由来するものが挙げられる。ＶＬＰは、天然のビリオン構造を模倣しているが、宿主細胞内での独立した複製に必要なウイルスのゲノム情報を欠損している。したがって、いくつかの態様では、ＶＬＰは非感染性である。特定の実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスゲノムを含まない。いくつかの実施形態では、ＶＬＰの両親媒性脂質二重層は、ウイルスエンベロープであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、両親媒性脂質のターゲティングされた脂質粒子の二重層は、細胞に由来する脂質であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルス由来の少なくとも１種類の構造タンパク質を含む。ほとんどの場合、このタンパク質は、タンパク質性キャプシドを形成する。いくつかの場合では、キャプシドはまた、組み立てられたＶＬＰを放出した細胞に由来する脂質二重層に覆われる（例えば、ＧＡＧなどのヒト免疫不全ウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰ）。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはさらに、脂質二重層内のエンベロープタンパク質としてターゲティング部分を含む。
いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、キャプシドへ自己構築するウイルスタンパク質によって形成される超分子複合体を含む。いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、ウイルスキャプシドタンパク質に由来するウイルス様粒子である。いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、ウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質に由来するウイルス様粒子である。いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、核酸をパッケージングする特性を保持するヌクレオキャプシド由来タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベースの粒子、例えば、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノム由来のタンパク質の中でもウイルスの構造糖タンパク質のみを含む。いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、ウイルスゲノムを含まない。
いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、発現プロセスの過程で宿主細胞由来の核酸、例えば、外因性作用因子をコードする核酸をパッケージングする。いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルス複製に関与するいかなる遺伝子もコードしない。特定の実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、例えば、複製欠損性であるウイルス様粒子、例えば、レンチウイルス様粒子などのレトロウイルス様粒子である。
いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、配列からウイルスＲＮＡを除去または排除する結果であり得るウイルスＲＮＡが存在しないか、または欠失している配列を含むウイルス様粒子である。いくつかの実施形態では、これは、ｇａｇ上の内在性パッケージングシグナル結合部位を使用することによって達成され得る。いくつかの実施形態では、内在性パッケージングシグナル結合部位は、ｐｏｌ上にある。いくつかの実施形態では、送達されるＲＮＡは、同族パッケージングシグナルを含有する。いくつかの実施形態では、送達されるＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種である）、及びｇａｇまたはｐｏｌ上に位置する同族結合部位は、送達されるＲＮＡのパッケージングを確保するために使用され得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、非ウイルス性であり得、またはそれは、ウイルス性であり得、その場合、それは異なるウイルスに由来し得る。いくつかの実施形態では、ベクター粒子は、治療ＲＮＡを送達するため使用され得、その場合、機能性インテグラーゼ及び／または逆転写酵素は必要とされない。いくつかの実施形態では、ベクター粒子はまた、関心対象の治療遺伝子を送達するために使用することができ、その場合、ｐｏｌが一般的に含まれる。
いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、キャプシドに自己組織化するウイルスタンパク質によって形成される超分子複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスキャプシドに由来する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスヌクレオキャプシドに由来する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ヌクレオキャプシド由来であり、核酸をパッケージングする特性を保持する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルス構造糖タンパク質のみを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスゲノムを含まない。
３． ウイルスベースの粒子の生成方法
大規模なウイルス粒子の産生は、多くの場合、所望のウイルス力価を達成するために有用である。ウイルス粒子は、ウイルスの構造遺伝子及び／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株に移入ベクターをトランスフェクトすることによって産生され得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター粒子は、細菌、哺乳類細胞株、昆虫細胞株、酵母、及び植物細胞を含む複数の細胞培養系において産生され得る。ウイルスベクター粒子を作製するための例示的な方法を記載する。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター、すなわち複製不能レンチウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターの産生のためのエレメントは、パッケージング細胞株に含まれるか、またはパッケージングベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１つ以上のパッケージングベクターを介してパッケージング細胞株に送達されるパッケージングエレメント、ｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌを含み得る。
実施形態では、パッケージングベクターは、パッケージングシグナルを欠損しており、かつ１、２、３、４つ、またはそれ以上のウイルスの構造遺伝子及び／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターである。通常、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入、または感染を介して細胞に導入される。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの移入ベクターを、トランスフェクション、形質導入、または感染を介してパッケージング細胞株に導入して、ソース細胞または細胞株を生成することができる。パッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む標準的な方法によってヒト細胞または細胞株に導入することができる。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターを、優性選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンテターゼ、またはＡＤＡと共に細胞に導入し、続いて適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離する。選択マーカー遺伝子を、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによってコードされる遺伝子に物理的に連結することができる。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターはパッケージングプラスミドである。
プロデューサー細胞株（パッケージング細胞株とも呼ばれる）としては、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子をパッケージングすることができるウイルスの構造タンパク質及び複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）を安定的にまたは一過性に発現する細胞株が挙げられる。任意の好適な細胞株、例えば、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞を使用することができる。使用可能な好適な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞が挙げられる。実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。
いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞（すなわち、ソース細胞株）には、パッケージング細胞株、及びパッケージングシグナルを含むトランスファーベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を生成することが可能な細胞株が含まれる。ウイルスストック溶液を調製する方法は、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８－６３３、及びＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０－５１１３（参照により本明細書に援用される）によって説明されている。感染性ウイルス粒子は、例えば、細胞溶解によって、または細胞培養物の上清の回収によって、パッケージング細胞から回収され得る。任意選択で、回収されたウイルス粒子を、濃縮または精製してもよい。
いくつかの実施形態では、ソース細胞は、ウイルス粒子をパッケージングし得るウイルス構造タンパク質及び複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）をコードする１つ以上のプラスミド（すなわち、パッケージングプラスミド）を含む。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体のうちの少なくとも２つをコードする配列は、同じプラスミド上にある。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体をコードする配列は、異なるプラスミド上にある。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体をコードする配列は、同じ発現シグナル、例えば、プロモーターを有する。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体をコードする配列は、異なる発現シグナル、例えば、異なるプロモーターを有する。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体の発現は、誘導性である。いくつかの実施形態では、ウイルスの構造タンパク質及び複製酵素をコードするプラスミドを、同時にまたは異なる時点でトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、ウイルスの構造タンパク質及び複製酵素をコードするプラスミドを、パッケージングベクターと同時に、または異なる時点でトランスフェクトする。
いくつかの実施形態では、ソース細胞株は、１つ以上の安定に組み込まれたウイルスの構造遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、安定に組み込まれたウイルスの構造遺伝子の発現は、誘導性である。
いくつかの実施形態では、ウイルスの構造遺伝子の発現を、転写レベルで調節する。いくつかの実施形態では、ウイルスの構造遺伝子の発現を、翻訳レベルで調節する。いくつかの実施形態では、ウイルスの構造遺伝子の発現を、翻訳後レベルで調節する。
いくつかの実施形態では、ウイルス構造遺伝子の発現を、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）依存系によって調節し、その場合、Ｔｅｔ調節転写リプレッサー（Ｔｅｔ－Ｒ）は、プロモーターに含まれるＤＮＡ配列に結合し、立体障害によって転写を抑制する（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，２００５）。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を添加すると、Ｔｅｔ－Ｒが放出され、転写が可能になる。他の複数の好適な転写調節プロモーター、転写因子、及び小分子誘導因子が、ウイルス構造遺伝子の転写の調節に好適である。
いくつかの実施形態では、Ｔｅｔ調節プロモーターの制御下にあり、抗生物質耐性カセットと結合させた、第３世代レンチウイルス成分、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ）Ｒｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、及びエンベロープを、ソース細胞のゲノムに別々に組み込む。いくつかの実施形態では、ソース細胞は、ゲノムに組み込まれたＲｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、及びエンベロープタンパク質のそれぞれのコピーを１つだけ有する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子をコードする核酸（例えば、外因性作用因子をコードするレトロウイルス核酸）もまた、ソース細胞ゲノムに組み込む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子をコードする核酸を、エピソームで維持する。いくつかの実施形態では、外因性作用因子をコードする核酸を、ゲノムに安定に組み込まれたＲｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、及びエンベロープタンパク質を有するソース細胞にトランスフェクトする。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＭｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルス核酸は、逆転写を受けることができない。そのような核酸は、実施形態では、外因性作用因子を一過性に発現することができる。レトロウイルスまたはＶＬＰは、機能しない逆転写酵素タンパク質を含む場合があるか、または逆転写酵素タンパク質を含まない場合がある。実施形態では、レトロウイルス核酸は、機能しないプライマー結合部位（ＰＢＳ）及び／またはａｔｔ部位を含む。実施形態では、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、及びＳ２またはその機能的等価物を含む１つ以上のウイルスアクセサリー遺伝子は、機能しないか、またはレトロウイルス核酸に存在しない。実施形態では、Ｓ２、ｒｅｖ、及びｔａｔから選択される１つ以上のアクセサリー遺伝子は、機能しないか、またはレトロウイルス核酸には存在しない。
通常、現代のレトロウイルスベクター系は、転写、逆転写、組み込み、翻訳、及びウイルス粒子へのウイルスＲＮＡのパッケージングのためのシス作用性ベクター配列を有するウイルスゲノム、ならびに（２）ウイルス粒子の産生に必要なトランス作用性レトロウイルス遺伝子配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）を発現するプロデューサー細胞株を含む。シス作用性ベクター配列とトランス作用性ベクター配列を完全に分離することにより、ウイルスは、感染の複数のサイクルのための複製を維持できなくなる。生きたウイルスの生成は、いくつかのストラテジーによって、例えば、シス作用性配列とトランス作用性配列との間の重複を最小限に抑えて組み換えを回避することによって回避することができる。
第ＩＩＩ．Ａ．２節に記載されるように、ウイルスＲＮＡを有さないかまたは欠損している配列を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、配列からウイルスＲＮＡを除去または排除した結果であり得る。第ＩＩＩ．Ａ．１節に開示されるウイルスベクター粒子と同様に、ＶＬＰは、宿主細胞（すなわち、プロデューサー細胞またはソース細胞）の脂質二重層から作られたウイルス外エンベロープ及び少なくとも１つのウイルス構造タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質とは、ウイルスのコアまたはキャプシドの構造に寄与する任意のウイルスタンパク質またはその断片を指す。
一般に、第ＩＩＩ．Ａ．１節に記載されているウイルスベクター粒子の場合、ｇａｇ前駆体タンパク質の発現のみがベクターの構築と放出を媒介する。いくつかの態様では、ｇａｇタンパク質またはその断片は、ウイルスコアに類似した構造に集合することが示されている。一実施形態では、これは、ｇａｇ上の内在性パッケージングシグナル結合部位を使用することによって達成され得る。あるいは、内在性パッケージングシグナル結合部位は、ｐｏｌ上にある。本実施形態では、送達されるＲＮＡは、同族のパッケージングシグナルを含む。別の実施形態では、送達されるＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種である）、及びｇａｇまたはｐｏｌ上に位置する同族結合部位を使用して、送達されるＲＮＡのパッケージングを確実にすることができる。異種配列は、非ウイルス性であってもウイルス性であってもよく、その場合、異なるウイルスに由来してもよい。ＶＬＰを使用して治療用ＲＮＡを送達することができ、この場合、機能的インテグラーゼ及び／または逆転写酵素は必要ない。これらのＶＬＰを使用して、関心対象の治療遺伝子を送達することもでき、その場合、ｐｏｌが通常含まれる。
実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌを改変し、パッケージングシグナルを、対応するパッケージングシグナルに置き換える。本実施形態では、粒子は、ＲＮＡを新規パッケージングシグナルでパッケージングすることができる。本アプローチの利点は、ウイルス配列を欠くＲＮＡ配列、例えば、ＲＮＡｉのパッケージングが可能であることである。
代替的なアプローチは、パッケージングされるＲＮＡの過剰発現に依存することである。一実施形態では、パッケージングされるＲＮＡを、パッケージングシグナルを含むＲＮＡが存在しない状態で過剰発現させる。これにより、かなりのレベルの治療用ＲＮＡがパッケージングされる可能性があり、この量は細胞に形質導入して生物学的効果をもたらすのに十分である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスｇａｇタンパク質またはレトロウイルスｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ｇａｇタンパク質またはｐｏｌタンパク質は、ＲＮＡ配列中の対応する配列を認識して、ウイルスベクター粒子へのＲＮＡ配列のパッケージングを容易にすることができる異種ＲＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、異種ＲＮＡ結合ドメインは、バクテリオファージコートタンパク質、Ｒｅｖタンパク質、Ｕ１核内小型リボ核タンパク質粒子のタンパク質、Ｎｏｖａタンパク質、ＴＦ１１１Ａタンパク質、ＴＩＳ１１タンパク質、ｔｒｐ ＲＮＡ結合減弱タンパク質（ＴＲＡＰ）、またはプソイドウリジンシンターゼに由来するＲＮＡ結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベースのベクタービヒクル粒子（すなわち、ＶＬＰ）の構築は、ウイルスゲノム内のユニークなキャプシド形成配列（例えば、ステムループ構造を有するＵＴＲ）へのコアタンパク質の結合によって開始される。いくつかの実施形態では、コアとキャプシド形成配列との相互作用により、オリゴマー化が促進される。
いくつかの実施形態では、ＶＬＰ産生用のソース細胞は、ウイルス粒子をパッケージングし得るウイルスの構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ）をコードする１つ以上のプラスミド（すなわち、パッケージングプラスミド）を含む。いくつかの実施形態では、ｇａｇ及びｐｏｌ前駆体のうちの少なくとも２つをコードする配列は、同じプラスミド上にある。いくつかの実施形態では、ｇａｇ及びｐｏｌ前駆体をコードする配列は、異なるプラスミド上にある。いくつかの実施形態では、ｇａｇ及びｐｏｌ前駆体をコードする配列は、同じ発現シグナル、例えば、プロモーターを有する。いくつかの実施形態では、ｇａｇ及びｐｏｌ前駆体をコードする配列は、異なる発現シグナル、例えば、異なるプロモーターを有する。いくつかの実施形態では、ｇａｇ及びｐｏｌ前駆体の発現は、誘導性である。
いくつかの実施形態では、第ＩＩＩ節における上記のＶＬＰまたは任意のウイルスベースの粒子の形成を、当技術分野で公知の任意の好適な技術によって検出することができる。そのような技術の例としては、例えば、電子顕微鏡観察、動的光散乱法、選択的クロマトグラフィー分離及び／または密度勾配遠心分離が挙げられる。
Ｂ． 細胞ベースの粒子
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、天然由来の膜を含む細胞ベースの粒子である。いくつかの実施形態では、天然由来の膜は、細胞または組織から調製された膜小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、細胞から得ることができる小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、微小胞、エクソソーム、膜封入体、アポトーシス小体（アポトーシス細胞由来）、粒子（例えば、血小板由来であり得る）、エクトソーム（例えば、血清における好中球及び単球に由来し得る）、プロスタトソーム（前立腺癌細胞から得ることができる）、またはカーディオソーム（心臓細胞に由来し得る）を含む。
いくつかの実施形態では、ソース細胞は、内皮細胞、線維芽細胞、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、対象の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児皮膚、青年皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球生成組織、造血組織からの幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）前駆体細胞（例えば、網膜前駆体細胞、骨髄芽球、骨髄前駆体細胞、胸腺細胞、減数分裂細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラノブラスト、リンパ芽球、骨髄前駆体細胞、正赤芽球、または血管芽細胞）、前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓前駆細胞、内皮前駆細胞、芽細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＥａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－ｌ、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ ９０、ＩＭＲ ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、またはＢＪ細胞）である。いくつかの実施形態では、ソース細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外である。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、＜１、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、１．２５～１．３５、または＞１．３５ｇ／ｍｌの密度を有する。いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子組成物は、タンパク質質量に基づいて０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満のソース細胞、または０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満の機能性核を有する細胞を含む。
実施形態では、細胞ベースの粒子は、ソース細胞のサイズの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満のサイズを有するか、またはベクタービヒクル粒子の集団は、ソース細胞の平均サイズの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満の平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、細胞外小胞、例えば、内部空間を包囲し、かつその由来となった細胞よりも小さな直径を有する膜を含む細胞ベースの小胞である。実施形態では、細胞外小胞は、２０ｎｍ～１０００ｎｍの直径を有する。実施形態では、細胞ベースの粒子は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的または間接的操作によって細胞から得られた小胞、小胞化細胞小器官、及び生存細胞によって（例えば、直接的細胞膜出芽または後期エンドソームと細胞膜との融合によって）生成される小胞である。実施形態では、細胞外小胞は、生存している生物もしくは死んだ生物、移植された組織もしくは器官、または培養された細胞に由来する。
実施形態では、細胞ベースの粒子は、ナノ小胞、例えば、内部空間を包囲し、かつ直接的または間接的操作によって前記細胞から生成された膜を含む細胞由来の小さな（例えば、直径が２０～２５０ｎｍ、または直径が３０～１５０ｎｍの）小胞である。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、ソース細胞の破壊をもたらし得る。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み得る。
実施形態では、細胞ベースの粒子はエクソソームである。実施形態では、エクソソームは、内部空間を包囲し、かつ直接的細胞膜出芽によってまたは後期エンドソームと細胞膜との融合によって前記細胞から生成された膜を含む細胞由来の小さな（例えば、直径が２０～３００ｎｍ、または直径が４０～２００ｎｍの）小胞である。実施形態では、エクソソームの生成は、ソース細胞の破壊をもたらさない。実施形態では、エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含む。例示的なエクソソーム及び他の膜封入体はまた、ＷＯ／２０１７／１６１０１０、ＷＯ／２０１６／０７７６３９、ＵＳ２０１６０１６８５７２、ＵＳ２０１５０２９０３４３、及びＵＳ２００７０２９８１１８（その各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は微小胞である。いくつかの実施形態では微小胞は、約１００ｎｍ～約２０００ｎｍの直径を有する。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は細胞ゴーストである。いくつかの実施形態では、小胞は、細胞膜小胞、例えば、巨大細胞膜小胞である。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、免疫抑制因子などの免疫調節因子の発現を増加させる遺伝子改変を有するソース細胞に由来する。いくつかの実施形態では、免疫抑制因子は、細胞の外部表面にある。いくつかの実施形態では、免疫抑制因子は、ベクタービヒクル粒子の外部表面に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子は、共有結合または非共有結合によって固体粒子の表面に結合した免疫調節因子を含む。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、エクソソーム、微小胞、膜小胞、細胞外膜小胞、細胞膜小胞、巨大細胞膜小胞、アポトーシス小体、ミト粒子、ピレノサイト、リソソーム、または他の膜封入小胞の出芽を誘導することによって生成される。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、細胞除核を誘導することによって生成される。除核は、遺伝子的、化学的（例えば、アクチノマイシンＤを使用する、Ｂａｙｏｎａ－Ｂａｆａｌｕｙｅｔ ａｌ．，“Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｏ ρ° ｃｅｌｌｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ａｕｇ １５；３１（１６）：ｅ９８を参照されたい）、機械的方法（例えば、絞りまたは吸入、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｗｏ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｉｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．” Ａｎｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；１９（２）：７１－９を参照されたい）、またはそれらの組み合わせなどのアッセイを使用して実施され得る。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子は、細胞断片化を誘導することによって生成される。いくつかの実施形態では、細胞断片化は、以下の方法（化学的方法、機械的方法（例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離、または密度遠心分離）、凍結解凍、または超音波処理）、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない）を使用して実施することができる。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子を作製するために使用するソース細胞は、ベクタービヒクル粒子が作製された後の試験のために利用可能ではない。
いくつかの実施形態では、細胞ベースの粒子の特徴を、参照細胞に対する比較によって説明する。実施形態では、参照細胞は、ソース細胞である。実施形態では、参照細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、またはＢＪ細胞である。いくつかの実施形態では、ベクタービヒクル粒子の集団の特徴を、参照細胞の集団、例えば、ソース細胞の集団、またはＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ ９０、ＩＭＲ ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、またはＢＪ細胞の集団に対する比較によって説明する。
Ｃ． 外因性作用因子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子またはそれを含む医薬組成物は、外因性作用因子を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子またはそれを含む医薬組成物は、外因性作用因子をコードする核酸を含有する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、外因性作用因子を含有する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、外因性作用因子をコードする核酸を含有する。外因性作用因子をコードする核酸のコード配列に対する言及はまた、本明細書でペイロード遺伝子と称される。いくつかの実施形態では、外因性作用因子または外因性作用因子をコードする核酸は、脂質粒子の内腔に存在する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子はタンパク質である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、膜タンパク質を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、治療用物質を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態では、治療用物質は、タンパク質、例えば、酵素、膜貫通タンパク質、受容体、もしくは抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ、または小分子のうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態では、脂質粒子または医薬組成物は、脂質粒子に含まれる外因性作用因子（例えば、治療用物質を含むかまたはコードする外因性作用因子）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を標的細胞に送達する。いくつかの実施形態では、標的細胞と接触、例えば融合させる脂質粒子、例えばフソソームは、標的細胞と接触、例えば融合させる脂質粒子、例えばフソソームに含まれる外因性作用因子（例えば、治療用物質を含むかまたはコードする外因性作用因子）の平均で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を標的細胞に送達する。いくつかの実施形態では、脂質粒子組成物は、脂質粒子組成物に含まれる外因性作用因子（例えば、治療用物質を含むかまたはコードする外因性作用因子）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を標的組織に送達する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、脂質粒子の由来元の細胞において天然に発現していない。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、脂質粒子の由来元の細胞において天然に発現している。いくつかの実施形態では、外因性作用因子を、脂質粒子の由来元の細胞における発現（例えば、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションを介して導入されたＤＮＡまたはｍＲＮＡからの発現）を介して脂質粒子内に充填させる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子を、ゲノムに組み込まれたか、またはエピソーム的に維持されたＤＮＡから発現させる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子の発現は構成的である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、外因性作用因子の発現を、脂質粒子を生成する直前に誘導する。いくつかの実施形態では、外因性作用因子の発現を、フソゲンの発現と同時に誘導する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子を、脂質粒子自体への、または脂質粒子の由来元の細胞へのエレクトロポレーションを介して脂質粒子に充填する。いくつかの実施形態では、外因性作用因子を、脂質粒子自体への、または脂質粒子の由来元の細胞への（例えば、外因性作用因子をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの）トランスフェクションを介して脂質粒子に充填する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子には、１つ以上の核酸配列、１つ以上のポリペプチド、核酸配列及び／またはポリペプチドの組み合わせ、１つ以上の細胞小器官、ならびにそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態では、外因性作用因子には、１つ以上の細胞成分が含まれ得る。いくつかの実施形態では、外因性作用因子には、１つ以上の細胞質成分及び／または核成分が含まれる。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、核酸である外因性因子を含有するか、または外因性作用因子をコードする核酸を含有する。いくつかの実施形態では、核酸を、「正の標的細胞特異的調節エレメント」（または正のＴＣＳＲＥ）に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、正のＴＣＳＲＥは、機能的核酸配列である。いくつかの実施形態では、正のＴＣＳＲＥは、プロモーターまたはエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＳＲＥは、標的細胞内の外因性作用因子のレベルを増加させる核酸配列である。いくつかの実施形態では、正の標的細胞特異的調節エレメントは、Ｔ細胞特異的プロモーター、Ｔ細胞特異的エンハンサー、Ｔ細胞特異的スプライス部位、ＲＮＡまたはタンパク質の半減期を延長するＴ細胞特異的部位、Ｔ細胞特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、Ｔ細胞特異的翻訳増強部位、またはＴ細胞特異的翻訳後修飾部位を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーターは、その全体が参照により本明細書に援用されるＩｍｍｇｅｎコンソーシアムに記載されているプロモーターであり、例えば、Ｔ細胞特異的プロモーターは、ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、ＬＲＲＣ３２、ＦＯＸＰ３、またはＩＫＺＦ２プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーターまたはエンハンサーは、その全体が参照により本明細書に援用されるＳｃｈｍｉｄｌ ｅｔ ａ，Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ａｐｒ ２４；１２３（１７）：ｅ６８－７８．に記載されているプロモーターまたはエンハンサーである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーターは、前述のいずれかの転写活性断片である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーターは、前述のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するバリアントである。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、核酸である外因性因子を含有するか、または外因性作用因子をコードする核酸を含有する。いくつかの実施形態では、核酸を、「負の標的細胞特異的調節エレメント」（または負のＴＣＳＲＥ）に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、負のＴＣＳＲＥは、機能的核酸配列である。いくつかの実施形態では、負のＴＣＳＲＥは、非標的細胞における脂質粒子の阻害の分解を引き起こすｍｉＲＮＡ認識部位である。いくつかの実施形態では、外因性作用因子を、「非標的細胞特異的調節エレメント」（すなわち、ＮＴＣＳＲＥ）に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＳＲＥは、標的細胞内と比較して、非標的細胞内の外因性作用因子のレベルを減少させる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＳＲＥは、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、または非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＳＲＥは、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、または組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＳＲＥは、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、または非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＳＲＥは、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含み、ｍｉＲＮＡ認識配列には、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ３６３、またはｍｉＲ２９ｃのうちの１つ以上が結合することができる。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＳＲＥは、外因性作用因子をコードする転写領域内に位置するか、またはコードされ、任意選択で、転写領域によって産生されるＲＮＡは、ＵＴＲまたはコード領域内にｍｉＲＮＡ認識配列を含む。
１． 核酸
いくつかの実施形態では、外因性作用因子には、核酸が含まれ得る。例えば、外因性作用因子は、内在性タンパク質の発現を向上させるためのＲＮＡ、または内在性タンパク質のタンパク質発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含み得る。例えば、内在性タンパク質は、標的細胞において構造または機能を調節し得る。いくつかの実施形態では、外因性作用因子には、標的細胞において構造または機能を調節する改変タンパク質をコードする核酸が含まれ得る。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、標的細胞において構造または機能を調節する転写活性化因子を標的とする核酸である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質粒子は、核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然の核酸残基であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸アナログであるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸を、天然源からの単離、相補的な鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組換え細胞または系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製する。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基、またはそれ以上の長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に一本鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。核酸は、例えば、参照核酸と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的な配列同一性を有するバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、バリアント核酸は、参照核酸と少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを共有していない。いくつかの実施形態では、バリアント核酸は、参照核酸の生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。いくつかの実施形態では、核酸バリアントは、特定の位置における少数の配列改変を除いて参照の核酸配列と同一の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、参照と比較して、バリアント内の残基の約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、または約２％未満を、置換、挿入、または欠失させる。いくつかの実施形態では、バリアント核酸は、参照と比較して、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１個の置換残基を含む。いくつかの実施形態では、バリアント核酸は、参照と比べて、特定の生物学的活性に関与する非常に少数（例えば、約５、約４、約３、約２、または約１個未満）の置換、挿入、または欠失の機能的残基を含む。いくつかの実施形態では、バリアント核酸は、参照と比較して、約１５、約１２、約９、約３、または約１個以下の付加または欠失を含み、いくつかの実施形態では、付加または欠失を含まない。いくつかの実施形態では、バリアント核酸は、参照と比較して、約２７、約２４、約２１、約１８、約１５、約１２、約９、約６、約３個未満、または約９、約６、約３、もしくは約２個未満の付加または欠失を含む。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子としては、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、タンパク質コードＤＮＡ、遺伝子、オペロン、染色体、ゲノム、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ウイルスゲノム、イントロン、エクソン、改変ＤＮＡ、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、改変ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｔｍＲＮＡ（トランスファーメッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ（ｍＲＮＡトランス－スプライシングＲＮＡ）、ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、ＴＥＲＣ（テロメラーゼＲＮＡ成分）、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）、ｃｉｓ－ＮＡＴ（シス－天然アンチセンス転写産物）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ＩｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）、ｔａｓｉＲＮＡ（トランス作用性ｓｉＲＮＡ）、ｅＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ｐｃＲＮＡ（タンパク質コードＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ（環状ＲＮＡ）、再プログラム化ＲＮＡ、アプタマー、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は野生型核酸である。いくつかの実施形態では、タンパク質は変異型核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、複数の核酸配列の融合体またはキメラである。
実施形態では、核酸は、１つ以上のＲＮＡ標的に対して向けられた１つ以上（例えば、２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードする。阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、阻害性分子は、例えば、Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡもしくはＰｒｅ－ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡの前駆体、またはｓｈＲＮＡの前駆体であり得る。いくつかの実施形態では、阻害性分子は、人工的に誘導されたｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。他の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡにプロセシングされるｄｓＲＮＡ（転写されるか人工的に導入される）、またはｓｉＲＮＡ自体であり得る。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、天然に見出されない配列を有するか、天然に見出されない少なくとも１つの機能セグメントを有するか、または天然に見出されない機能セグメントの組み合わせを有するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。例示的な実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子の少なくとも１つまたはすべてがｍｉＲ－ｌ５５である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクターは、１つ以上のＲＮＡ標的に対して向けられた２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードする。いくつかの実施形態では、２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子が、異なる標的に対して向けられ得る。他の実施形態では、２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子は、同じ標的に対して向けられる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を含み得る。ｓｈＲＮＡ構築物は、標的遺伝子のコード配列または非コード配列のいずれかの部分と同一のヌクレオチド配列を含み得る。標的配列に対して挿入、欠失、及び単一点変異を含むＲＮＡ配列も使用することができる。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の部分の間の９０％超の配列同一性、またはさらには１００％の配列同一性を使用することができる。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡの二重鎖形成部分の長さは、少なくとも２０、２１、または２２ヌクレオチド長であり、これは、例えばダイサー依存的切断によって生成されるＲＮＡ産物のサイズに相当する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、または４００塩基長である。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡ構築物は、４００～８００塩基長である。ｓｈＲＮＡ構築物は、ループ配列とループサイズの変動に対して高度に耐性がある。実施形態では、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはリボザイムをコードするレトロウイルスベクターは、例えば、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩ、例えば、ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨ ｌ ＲＮＡプロモーター、及びヒトｔＲＮＡ－ｖａｌプロモーター、または強力な構成的ｐｏｌ ＩＩプロモーターなどの１つ以上の調節配列を含む。
２． ポリペプチド
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、タンパク質の外因性作用因子をコードする核酸を含有する（「外因性作用因子をコードするペイロード遺伝子」とも呼ばれる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子は、タンパク質であるか、またはそれを含む外因性作用因子を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであってよい）を含み得、及び／またはプロセシングもしくは改変され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって連結されるか、または他の手段によって結合する複数のポリペプチド鎖を含み得る場合がある。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその両方を含む場合があり、様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、及び／またはその特徴的な部分である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、例えば、参照ポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的な配列同一性を有するそのバリアントが含まれ得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドと少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを共有していない。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドバリアントは、特定の位置における少数の配列改変を除いて参照のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、参照と比較して、バリアント内の残基の約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、または約２％未満を、置換、挿入、または欠失させる。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照と比較して、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１個の置換残基を含む。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照と比べて、特定の生物学的活性に関与する非常に少数（例えば、約５、約４、約３、約２、または約１個未満）の置換、挿入、または欠失の機能性を含む。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照と比較して、約５、約４、約３、約２、または約１個以下の付加または欠失を含み、いくつかの実施形態では、付加または欠失を含まない。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照と比較して、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６個未満の、一般的には、約５、約４、約３、または約２個未満の付加または欠失を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質には、ポリペプチド、例えば、酵素、構造ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、調節性ポリペプチド、輸送ポリペプチド、感覚ポリペプチド、運動ポリペプチド、防御ポリペプチド、保存ポリペプチド、転写因子、抗体、サイトカイン、ホルモン、異化ポリペプチド、同化ポリペプチド、タンパク質分解ポリペプチド、代謝ポリペプチド、キナーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、酵素調節因子ポリペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、脂質結合ポリペプチド、膜融合ポリペプチド、細胞分化ポリペプチド、エピジェネティックポリペプチド、細胞死ポリペプチド、核輸送ポリペプチド、核酸結合ポリペプチド、再プログラム化ポリペプチド、ＤＮＡ編集ポリペプチド、ＤＮＡ修復ポリペプチド、ＤＮＡ組み換えポリペプチド、トランスポサーゼポリペプチド、ＤＮＡ組み込みポリペプチド、標的エンドヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｃａｓ９及びそのホモログ）、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ならびにそれらの任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞内のタンパク質を分解の標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞内のタンパク質を、そのタンパク質をプロテアソームに局在化させることによって分解の標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質は野生型タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は変異型タンパク質である。
例示的なタンパク質外因性作用因子を、以下の小節で説明する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される脂質粒子は、そのような外因性作用因子のいずれかを含み得る。特定の実施形態では、脂質粒子は、そのような外因性因子のいずれかをコードする核酸を含有する。
ａ． 細胞質タンパク質
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、細胞質タンパク質、例えば、レシピエント細胞において産生され、レシピエントの細胞質に局在化するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、分泌タンパク質、例えば、レシピエント細胞によって産生され、分泌されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、核タンパク質、例えば、レシピエント細胞において産生され、レシピエント細胞の核に移入されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、細胞小器官タンパク質（例えば、ミトコンドリアタンパク質）、例えば、レシピエント細胞において産生され、レシピエント細胞の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）に移入されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、野生型タンパク質または変異型タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、融合タンパク質またはキメラタンパク質である。
ｂ． 膜タンパク質
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、膜タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、インテグリン、イオンチャネル、ポア形成タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体、インターロイキン受容体、細胞接着タンパク質、または輸送タンパク質を含む。
１） キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペイロード遺伝子は、抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の外因性作用因子は、抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、抗原結合ドメイを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン（例えば、１、２、または３つのシグナル伝達ドメイン）を含む第一世代のＣＡＲであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第三世代のＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、第四世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、及びＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞型に特徴的な抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、新生細胞に特徴的な抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、新生細胞に特有の抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／トレオニンキナーゼ、受容体型グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、及びＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、及びＦＧＦ２１を含む）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及びＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体及びＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、及びＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通型タンパク質、多重スパン膜貫通型タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ；Ｔ細胞α鎖；Ｔ細胞β鎖；Ｔ細胞γ鎖；Ｔ細胞δ鎖；ＣＣＲ７；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ７；ＣＤ８；ＣＤ１１ｂ；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１６；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３４；ＣＤ３５；ＣＤ４０；ＣＤ４５ＲＡ；ＣＤ４５ＲＯ；ＣＤ５２；ＣＤ５６；ＣＤ６２Ｌ；ＣＤ６８；ＣＤ８０；ＣＤ９５；ＣＤ１１７；ＣＤ１２７；ＣＤ１３３；ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）；ＣＤ１６３；Ｆ４／８０；ＩＬ－４Ｒａ；Ｓｃａ－１；ＣＴＬＡ－４；ＧＩＴＲ；ＧＡＲＰ；ＬＡＰ；グランザイムＢ；ＬＦＡ－１；トランスフェリン受容体；ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋；Ｔｈ１；Ｔｈ２；Ｔｈ１７；Ｔｈ４０；Ｔｈ２２；Ｔｈ９；Ｔｆｈ、カノニカルＴｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋；Ｔｒ１；Ｔｈ３；Ｔｒｅｇ１７；ＴＲＥＧ；ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、ルイス－γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、スムーズンド、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、またはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体α（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体－β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、主要組織適合性複合体クラスＩ関連遺伝子タンパク質（ＭＲ１）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢ Ｉ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ（ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ）、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、もしくはｔｒｋＣ、またはそれらの抗原断片もしくは抗原部分から選択される。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞に特徴的な抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｔ細胞に特徴的な、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、能動的または受動的輸送タンパク質、例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質など）、膜貫通受容体、膜酵素、及び／または細胞接着タンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／トレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＴＦ２、ＢＣＬ１０、ＣＡＬＭ１、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＥＬＫ１、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＥＲＫ２、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＧＲＡＰ２（ＧＡＤＳ）、ＧＲＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＲＡＳ、ＩＫＢＫＡ（ＣＨＵＫ）、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＢＫＧ（ＮＥＭＯ）、ＩＬ２、ＩＴＰＲ１、ＩＴＫ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ２、ＬＡＴ、ＬＣＫ、ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）、ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）、ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）、ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）、ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）、ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）、ＭＡＰ３Ｋ１（ＭＥＫＫ１）、ＭＡＰ３Ｋ３、ＭＡＰ３Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰ３Ｋ１４（ＮＩＫ）、ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）、ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）、ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）、ＭＡＰＫ１１（ｐ３８β）、ＭＡＰＫ１２（ｐ３８γ）、ＭＡＰＫ１３（ｐ３８δ）、ＭＡＰＫ１４（ｐ３８α）、ＮＣＫ、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲＡＳ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ４、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３Ｃ３（ＶＰＳ３４）、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＭ、ＰＫＣＱ、ＰＬＣＹ１、ＰＲＦ１（パーフォリン）、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＥＬＡ、ＳＤＦ１、ＳＨＰ２、ＳＬＰ７６、ＳＯＳ、ＳＲＣ、ＴＢＫ１、ＴＣＲＡ、ＴＥＣ、ＴＲＡＦ６、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２、またはＺＡＰ７０であり得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、障害に特徴的な抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、自己免疫障害または炎症性障害を特徴とする抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害は、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素症、尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫溶血性貧血、血友病Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、エバンス症候群、ＩｇＭ媒介性ニューロパチー、クリオグロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管性浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発ニューロパチー、及び自己免疫血小板減少症または好中球減少症または赤芽球癆から選択され、一方で、例示的な同種異系免疫疾患の非限定的な例としては、造血または実質臓器移植、輸血による同種異系感作（ａｌｌｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５（４）：９３１－４１を参照されたい）または異種感作、胎児同種異系感作を伴う妊娠、新生児の同種異系免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製剤、及び遺伝子療法で処置される遺伝性または後天性欠損障害の補充に伴い起こり得るものなどの外来性抗原への感作が挙げられる。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害を特徴とする抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／トレオニンキナーゼ、受容体型グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞、形質細胞、形質芽細胞上に発現するリガンド、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ、ＺＡＰ－７０、ＬＦＡ－１、ＣＤ３γ、ＣＤ５、またはＣＤ２に結合する。ＵＳ２００３／００７７２４９、ＷＯ２０１７／０５８７５３、ＷＯ２０１７／０５８８５０を参照されたい（同文献の内容は参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、老化細胞に特徴的な抗原、例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを、老化細胞の異常な蓄積を特徴とする障害、例えば、肝線維症及び肺線維症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、ならびに骨関節炎の治療または予防に使用してもよい。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、感染性疾患に特徴的な抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴリンパ向性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン・バーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、感染性疾患に特有の抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／トレオニンキナーゼ、受容体型グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ｇｐｌ２０、またはＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上のＣＤ４誘導性エピトープから選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β、もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはその機能的バリアントの少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、またはその機能的バリアントの少なくとも膜貫通領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ζドメイン、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの機能的断片のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインまたは免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、または４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアント、及び／または（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のスペーサーをさらに含み、例えば、スペーサーは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１のスペーサーである。いくつかの実施形態では、第１のスペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは改変バージョンの少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２のスペーサーである。いくつかの実施形態では、第２のスペーサーはオリゴペプチドであり、例えば、オリゴペプチドは、グリシン－セリンダブレットを含む。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ＣＡＲ、例えば、第一世代ＣＡＲまたは第一世代ＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中の下流シグナル伝達を媒介する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、第２世代ＣＡＲまたは第２世代ＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、第２世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中の下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、第３世代ＣＡＲまたは第３世代ＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中の下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの共刺激ドメインは、同じではない。
いくつかの実施形態では、前記の外因性のものは、第４世代ＣＡＲまたは第４世代ＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、第４世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２、３、または４つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中の下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。
いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、または第４世代ＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むＣＡＲを含む標的細胞にとって内在性または外因性である。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、炎症促進性サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ、もしくはＩＦＮ－γ、またはそれらの機能的断片をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片は、活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、またはその機能的ドメインもしくは断片であるか、またはそれを含む。例えば、Ｚｈａｎｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５：２２（２０１７）；ＷＯ２０１６１２６６０８；Ｓｈａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｊａｎ ２７，２０１７，３７（１）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合部分であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４－１ ＢＢ）抗体、ＣＤ１６３抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ－４Ｒａ抗体、Ｓｃａ－１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＧＩＴＲ抗体ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ－１抗体、ＭＲ１抗体、ｕＰＡＲ抗体、もしくはトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片を含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、１つの細胞型に特徴的である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、複数の細胞型に特徴的である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｔ細胞に特徴的な細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｔ細胞に特徴的な細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質、膜孔形成タンパク質などの、例えば、能動または受動輸送タンパク質）、膜貫通型受容体、膜酵素、及び／または細胞接着タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／トレオニンキナーゼ、受容体型グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体であり得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｔ細胞受容体であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＡＴＦ２；ＢＣＬ１０；ＣＡＬＭ１；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）；ＣＤ４；ＣＤ８；ＣＤ２８；ＣＤ４５；ＣＤ８０（Ｂ７－１）；ＣＤ８６（Ｂ７－２）；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）；ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）；ＥＬＫ１；ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）；ＥＲＫ２；ＦＯＳ；ＦＹＮ；ＧＲＡＰ２（ＧＡＤＳ）；ＧＲＢ２；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＬＡ－ＤＲＢ１；ＨＬＡ－ＤＲＢ３；ＨＬＡ－ＤＲＢ４；ＨＬＡ－ＤＲＢ５；ＨＲＡＳ；ＩＫＢＫＡ（ＣＨＵＫ）；ＩＫＢＫＢ；ＩＫＢＫＥ；ＩＫＢＫＧ（ＮＥＭＯ）；ＩＬ２；ＩＴＰＲ１；ＩＴＫ；ＪＵＮ；ＫＲＡＳ２；ＬＡＴ；ＬＣＫ；ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）；ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）；ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）；ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）；ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）；ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）；ＭＡＰ３Ｋ１（ＭＥＫＫ１）；ＭＡＰ３Ｋ３；ＭＡＰ３Ｋ４；ＭＡＰ３Ｋ５；ＭＡＰ３Ｋ８；ＭＡＰ３Ｋ１４（ＮＩＫ）；ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）；ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）；ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）；ＭＡＰＫ１１（ｐ３８β）；ＭＡＰＫ１２（ｐ３８γ）；ＭＡＰＫ１３（ｐ３８δ）；ＭＡＰＫ１４（ｐ３８α）；ＮＣＫ；ＮＦＡＴ１；ＮＦＡＴ２；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＦＫＢＩＡ；ＮＲＡＳ；ＰＡＫ１；ＰＡＫ２；ＰＡＫ３；ＰＡＫ４；ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ；ＰＩＫ３Ｃ３（ＶＰＳ３４）；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３ＣＤ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＫＣＡ；ＰＫＣＢ；ＰＫＣＭ；ＰＫＣＱ；ＰＬＣＹ１；ＰＲＦ１（パーフォリン）；ＰＴＥＮ；ＲＡＣ１；ＲＡＦ１；ＲＥＬＡ；ＳＤＦ１；ＳＨＰ２；ＳＬＰ７６；ＳＯＳ；ＳＲＣ；ＴＢＫ１；ＴＣＲＡ；ＴＥＣ；ＴＲＡＦ６；ＶＡＶ１；ＶＡＶ２；またはＺＡＰ７０であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインであるシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第２の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３特異的結合リガンドのうちの１つ以上から選択される共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインまたは免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、または４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアント、及び／または（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ζ）の細胞内ドメインに連結されたＣＤ２８の膜貫通及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインに連結されたキメラＣＤ２８及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞質部分における１つ以上、例えば２つ以上の共刺激ドメイン及び活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを包含する。例示的なＣＡＲには、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び４－１ＢＢの細胞内成分が含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの細胞内成分を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの細胞内成分を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ）、スペーサー（例えば、本明細書に記載のいずれかなどのヒンジドメインを含む）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載のいずれか）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、任意の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、さらに、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン）を含む。ＣＡＲの例示的な成分の例を、表２に記載する。提供する態様では、ＣＡＲにおける各成分の配列には、表２に列挙される任意の組み合わせが含まれ得る。
（表２）ＣＡＲ成分及び例示的な配列
Figure 2024521811000002
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のスペーサーをさらに含み、例えば、スペーサーは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１のスペーサーである。いくつかの実施形態では、第１のスペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは改変バージョンの少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２のスペーサーである。いくつかの実施形態では、第２のスペーサーはオリゴペプチドであり、例えば、オリゴペプチドは、グリシン－セリンダブレットを含む。
本明細書に記載のＣＡＲに加えて、様々なキメラ抗原受容体及びそれをコードするヌクレオチド配列が当技術分野で公知であり、本明細書に記載されるインビボ及びインビトロでの標的細胞のフソソーム送達及び再プログラム化に好適であろう。例えば、ＷＯ２０１３０４０５５７；ＷＯ２０１２０７９０００；ＷＯ２０１６０３０４１４；Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７． ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい（同文献の開示は参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはＣＡＲをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ＭＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）を含む脂質粒子を標的細胞に送達する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、１つ以上のＦｃ受容体を発現し、かつ１つ以上のエフェクター機能を媒介するエフェクター細胞、例えば、免疫系の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞としては、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞）、γδＴ細胞、Ｂリンパ球（例えば、Ｂ細胞）のうちの１つ以上を挙げてもよいがこれらに限定されなくてもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが挙げられるがこれらに限定されない任意の生物に由来してもよい。
３． 遺伝子編集物質 （例えば、ヌクレアーゼ酵素）
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、遺伝子編集技術に関連する。例えば、遺伝子編集機構を細胞へ送達するための、遺伝子編集技術に関連する様々な因子のいずれも、外因性作用因子として含めることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術には、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼを含む系が含まれ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンに使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ゲノム領域へのＤＮＡのノックインまたは組み込みに使用することができる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）に関するものを含む二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ＤＳＢを媒介しない。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ＤＮＡベースの編集またはプライム編集に使用することができる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ＰＡＳＴＥ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｖｉａ Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔ）のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、遺伝子編集法で使用するためのヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）またはフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）細菌由来のＣａｓ１２ａ（ｃｐｆ１としても知られる）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、任意選択でバチルス・ヒサシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ）由来のＣａｓ１２ｂである。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの送達を、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ）をコードする提供されるベクターによって行う。
いくつかの実施形態では、提供するウイルスベクター粒子がヌクレアーゼタンパク質を含有し、ヌクレアーゼタンパク質を標的細胞に直接送達する。ヌクレアーゼタンパク質の送達方法としては、例えば、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｌｉｆｅ，２０１４，３：ｅ０１９１１及び国際特許公開第ＷＯ２０１７０６８０７７号に記載されている方法が挙げられる。例えば、提供するウイルスベクター粒子は、Ｃａｓ９などの１つ以上のＣａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター粒子（例えば、レンチウイルスベクター粒子）内にパッケージングするために、ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓ）をウイルス構造タンパク質（例えば、ＧＡＧ）とのキメラヌクレアーゼタンパク質として改変する。例えば、キメラＣａｓ９タンパク質と構造ＧＡＧタンパク質の融合体をレンチウイルスベクター粒子内にパッケージングすることができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、（ｉ）ウイルス構造タンパク質（例えば、ＧＡＧ）と（ｉｉ）ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質）との間で切断可能な融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓは野生型Ｃａｓ９であり、二本鎖ＤＮＡを部位特異的に切断することができ、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機構の活性化をもたらす。ＤＳＢは、細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって修復することができるが（Ｏｖｅｒｂａｌｌｅ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１１０：１９８６０－１９８６５）、これは挿入及び／または欠失（インデル）を生じさせ、標的遺伝子座を破壊する。あるいは、標的遺伝子座と相同性のあるドナーテンプレートを供給する場合、ＤＳＢを相同組換え修復（ＨＤＲ）経路によって修復し、正確な置換変異の作成を可能としてもよい（Ｏｖｅｒｂａｌｌｅ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１１０：１９８６０－１９８６５；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．１２：３０４－３１２）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、ニッカーゼ活性のみを有するＣａｓ９ Ｄ１０Ａとして知られる変異型である。これは、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａが１本のＤＮＡ鎖のみを切断し、ＮＨＥＪを活性化しないことを意味する。代わりに、相同修復テンプレートが提供されると、ＤＮＡ修復は高忠実度のＨＤＲ経路のみを介して行われ、その結果、インデル変異が減少する（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３３９：８１９－８２３；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３３７：８１６－８２１；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１５２：１１７３－１１８３）。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａは、隣接するＤＮＡニックを生成するように設計された対のＣａｓ９複合体によって遺伝子座が標的とされる場合、標的特異性の点でさらに魅力的である（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１５４：１３８０－１３８９）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９である（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１５２：１１７３－１１８３）。例えば、ＨＮＨドメインのＨ８４０Ａ変異及びＲｕｖＣドメインのＤ１０Ａ変異は切断活性を不活化するが、ＤＮＡ結合は妨げない。したがって、このバリアントを使用して、切断することなくゲノムの任意の領域を配列特異的に標的にすることができる。代わりに、様々なエフェクタードメインと融合することにより、ｄＣａｓ９を遺伝子サイレンシングまたは活性化ツールとして使用することができる。さらに、ガイドＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質をフルオロフォアまたは蛍光タンパク質と結合させることによって、可視化ツールとして使用することができる。
特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を使用して、単一のｇＲＮＡを介して、特定の標的遺伝子に単一の点変異（欠失または挿入）を導入することができる。代わりに、ｇＲＮＡ指向性Ｃａｓ９ヌクレアーゼのペアを使用して、逆位や転座などの大きな欠失やゲノム再構成を誘導することも可能である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のｄＣａｓ９バージョンを使用して、転写調節、エピジェネティック修飾、及び特定のゲノム遺伝子座の顕微鏡視覚化のためにタンパク質ドメインを標的にすることができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含有する、提供されるウイルス粒子（例えば、レンチウイルス粒子）は、所望の標的遺伝子を標的とするための１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のガイドＲＮＡをさらに含むか、またはそれとさらに複合体化する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、ＣＡＳ含有ウイルス粒子内に効率的に封入される。いくつかの実施形態では、提供するウイルス粒子（例えば、レンチウイルス粒子）は、ターゲティング核酸をさらに含むか、またはそれとさらに複合体化する。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）、すなわち「プライム編集」で使用するためのものである。いくつかの実施形態では、プライム編集は、ＤＳＢまたはドナーＤＮＡテンプレートを必要とせずに、ヒト細胞におけるターゲティングされた挿入、欠失、可能な１２個の塩基対塩基変換、及びそれらの組み合わせを媒介する。
プライム編集は、ポリメラーゼと連携して機能する核酸プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（「ｎａｐＤＮＡｂｐ」）を使用して（すなわち、融合タンパク質の形態で、またはｎａｐＤＮＡｂｐと共にトランスで提供される）、指定されたＤＮＡ部位に新規遺伝情報を直接書き込むゲノム編集方法であり、プライム編集系は、標的部位を指定し、ガイドＲＮＡ上に設計された伸長（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）（例えば、５’もしくは３’末端、またはガイドＲＮＡの内部部分における）による置換ＤＮＡ鎖の形態で所望の編集を合成し、これを鋳型化することの両方を行うプライム編集（ＰＥ）ガイドＲＮＡ（「ＰＥｇＲＮＡ」）でプログラムされている。所望の編集（例えば、単一の核酸塩基置換）を含む置換鎖は、編集される標的部位の内在性鎖と同じ配列を共有する（所望の編集を含んでいることを除く）。ＤＮＡ修復及び／または複製機構を通じて、標的部位の内在性鎖は、所望の編集を含む新規合成された置換鎖によって置き換えられる。いくつかの場合では、プライム編集は、編集対象の所望の標的部位を検索して特定し、同時に、対応する標的部位の内在性ＤＮＡ鎖の位置にインストールされる、所望の編集を含む置換鎖をコード化することから、プライム編集は、「検索及び置換」ゲノム編集技術と考えられる場合がある。例えば、プライム編集を、二本鎖切断をバイパスするために、精密なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ゲノム編集を実行するために適合させることができる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ガイドＲＮＡで特定のＤＮＡ配列を標的にし、標的部位に一本鎖ニックを生成し、ニックの入ったＤＮＡを、ガイドＲＮＡと統合された改変された逆転写酵素テンプレートを逆転写するためのプライマーとして使用するためのＣａｓタンパク質－逆転写酵素融合体または関連系であるか、またはそれをコードする。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、逆転写酵素または当技術分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼであるプライマー編集体であるか、またはそれをコードする。したがって、一態様では、プライム編集体は、標的ＤＮＡ中の相補的プロトスペーサーにアニーリングするスペーサー配列を含む特殊なガイドＲＮＡ（すなわち、ＰＥｇＲＮＡ）と関連付けることによってＤＮＡ配列を標的とするようにプログラムされたＣａｓ９（または同等のｎａｐＤＮＡｂｐ）を含み得る。そのような方法には、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４）、またはＰＣＴ公開第ＷＯ２０２０１９１２４８、ＷＯ２０２１２２６５５８、またはＷＯ２０２２０６７１３０に開示されている方法が含まれ、これらはその全体が本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ＰＡＳＴＥ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｖｉａ Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔ）に使用するためのものである。いくつかの態様では、ＰＡＳＴＥは、逆転写酵素とセリンインテグラーゼの両方に融合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ニッカーゼを介してゲノム挿入を指示するプラットフォームである。Ｉｏａｎｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ．（ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．１１．０１．４６６７８６）に記載されているように、ＰＡＳＴＥは二本鎖切断を生成しないが、最大約３６ｋｂの配列の組み込みを可能にする。いくつかの実施形態では、セリンインテグラーゼは、当技術分野で公知のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、セリンインテグラーゼは、ＰＡＳＴＥを多重遺伝子組み込みに使用して、少なくとも２つのゲノム遺伝子座で少なくとも２つの異なる遺伝子を同時に組み込むことができるように、十分な直交性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＳＴＥは、相同組換え修復または非相同末端結合ベースの組み込みと同等またはそれより優れた編集効率を有し、非分裂細胞において活性を有し、検出可能なオフターゲット事象が少ない。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、塩基編集に関連する。塩基編集体（ＢＥ）は通常、Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ関連」）ドメインドメインと核酸塩基修飾ドメインドメイン（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（「アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド１」）、ＣＤＡ（「シチジンデアミナーゼ」）、及びＡＩＤ（「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」））ドメインを含むシチジンデアミナーゼなどの天然または進化したデアミナーゼ）の融合体である。いくつかの場合では、塩基編集体には、細胞のＤＮＡ修復プロセスを改変して、結果として生じる単一ヌクレオチド変化の効率及び／または安定性を高めるタンパク質またはドメインも含まれ得る。
いくつかの態様では、現在利用可能な塩基編集体には、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａへ変換するシチジン塩基編集体（例えば、ＢＥ４）、及び標的Ａ・ＴをＧ・Ｃへ変換するアデニン塩基編集体（例えば、ＡＢＥ７．１０）が含まれる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９を標的とした脱アミノ化は、二本鎖ＤＮＡ切断を導入することなく塩基変化を誘導するように設計された塩基編集（ＢＥ）系と関連して最初に示された。さらに、失活したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）に融合したラットデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を使用して、ｓｇＲＮＡのＰＡＭの上流でシチジンをチミジンに変換することに成功した。いくつかの態様では、ｄＣａｓ９を、脱アミノ化されたシチジンの反対側の鎖にニックを入れる「ニッカーゼ」Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａに変化させることによって、この最初のＢＥ系を最適化した。理論に束縛されるものではないが、これによりロングパッチ塩基除去修復（ＢＥＲ）が開始されると予想される。この場合、脱アミノ化された鎖が修復の鋳型として優先的に使用されてＵ：Ａ塩基対が生成され、次いで、この塩基対がＤＮＡ複製中にＴ：Ａに変換される。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、塩基編集体（例えば、核酸塩基編集体）であるか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、触媒的に不活性である第１のＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、塩基編集活性を有するドメイン、及びニッカーゼ活性を有する第２のＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む核酸塩基編集体であり、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、単一の融合タンパク質上に、または別々に（例えば、別々の発現ベクター上で）発現させる。いくつかの実施形態では、塩基編集体は、塩基編集活性を有するドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）と、２つの核酸プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とを含む融合タンパク質であり、第１のドメインはニッカーゼ活性を含み、第２のｎａｐＤＮＡｂｐは触媒的に不活性であり、少なくとも２つのｎａｐＤＮＡｂｐがリンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、塩基編集体は、ニッカーゼ活性（ｎＣａｓ；ｎＣａｓ９）を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）のＤＮＡドメイン、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合活性（ｄＣａｓ；例えば、ｄＣａｓ９）を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）の触媒的に不活性なドメイン、及びデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質であり、ｄＣａｓは、リンカーによってｎＣａｓに結合し、ｄＣａｓは、デアミナーゼドメインに直接隣接する。いくつかの実施形態では、塩基編集体は、アデニンからチミン、すなわち「ＡＴＢＥ」（またはチミンからアデニン、すなわち「ＴＡＢＥ」）への転換塩基編集体である。例示的な塩基編集体及び塩基編集系としては、特許公開第ＵＳ２０２２０１２７６２２号、第ＵＳ２０２１００７９３６６号、第ＵＳ２０２００２４８１６９号、第ＵＳ２０２１００９３６６７号、第ＵＳ２０２１００７１１６３号、第ＷＯ２０２０１８１２０２号、第ＷＯ２０２１１５８９２１号、第ＷＯ２０１９１２６７０９号、第ＷＯ２０２０１８１１７８号、第ＷＯ２０２０１８１１９５号、第ＷＯ２０２０２１４８４２号、第ＷＯ２０２０１８１１９３号に記載されているものが挙げられ、これらはその全体が本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、ヌクレアーゼ活性（例えば、プログラム可能なヌクレアーゼ活性）、ニッカーゼ活性（例えば、プログラム可能なニッカーゼ活性）、ホーミング活性（例えば、プログラム可能なＤＮＡ結合活性）、核酸ポリメラーゼ活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ活性）、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、または塩基編集活性（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ活性）からなる群から選択される活性を有する１つ以上のポリペプチドであるか、またはそれをコードする。
４． 小分子
いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、小分子、例えば、イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｃ１－、Ｆｅ２＋）、炭水化物、脂質、反応性酸素種、反応性窒素種、イソプレノイド、シグナル伝達分子、ヘム、ポリペプチド補因子、電子求引性化合物、電子供与性化合物、代謝産物、リガンド、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、小分子は、細胞において標的と相互作用する薬剤である。いくつかの実施形態では、小分子は、細胞に含まれるタンパク質を分解の標的とする。いくつかの実施形態では、小分子は、細胞に含まれるタンパク質を、タンパク質をプロテアソームに局在化することによって分解の標的とする。いくつかの実施形態では、その小分子は、タンパク質分解ターゲティングキメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）である。
いくつかの実施形態では、外因性作用因子としては、タンパク質、核酸、または代謝産物の混合物、例えば、複数のポリペプチド、複数の核酸、複数の小分子、核酸、ポリペプチド、及び小分子の組み合わせ、リボヌクレオタンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体）、複数の転写因子、複数のエピジェネティック因子、再プログラム化因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４）、複数の調節性ＲＮＡ、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
D． 例示的な特徴
いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、Ｒペプチドのすべてのアミノ酸残基を欠損したＢａＥＶ（例えば、配列番号２４に示されているＢａＥＶ）を含む参照粒子と比較して粒子表面での発現が増加する。いくつかの実施形態では、その発現は、Ｒペプチドのすべてのアミノ酸残基を欠損したＢａＥＶ（例えば、配列番号２４に示されているＢａＥＶ）を含む参照粒子と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上、または５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上を上回って、増加する。いくつかの実施形態では、その発現は、Ｒペプチドのすべてのアミノ酸残基を欠損したＢａＥＶ（例えば、配列番号２４に示されているＢａＥＶ）を含む参照粒子と比較して、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って、好ましくは、１０倍以上、または約１０倍以上、または１０倍以上を上回って、増加する。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣｓを使用してインビトロで発現をアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、発現は、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質、例えば脂質粒子の表面上の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の数または密度として表すことができる。いくつかの実施形態では、発現は、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質、例えば脂質粒子の表面上の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の表面発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表すことができる。いくつかの実施形態では、発現は、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質、例えば、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質について表面陽性である集団における脂質粒子（例えば、レンチウイルスベクター）の割合として示され得る。
いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、レンチウイルスベクター）の集団において、脂質粒子の５０％超または約５０％超は、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質について表面陽性である。例えば、提供する脂質粒子（例えば、レンチウイルスベクター）の集団において、集団における細胞の５５％超または約５５％超、６０％超または約６０％超、６５％超または約６５％超、７０％超または約７０％超、７５％超または約７５％超が、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質について表面陽性である。
いくつかの実施形態では、形質導入などによる標的細胞（例えば、形質導入された細胞）への導入後の脂質粒子の力価は、同じ標的細胞内への、Ｒペプチドのすべてのアミノ酸残基を欠損しているＢａＥＶ（例えば、配列番号２４に示されているＢａＥＶ）を組み込む参照脂質粒子（例えば、参照レンチウイルスベクター）の力価と比較して、増加する。いくつかの例では、力価は、参照脂質粒子（例えば、参照レンチウイルスベクター）、例えば、Ｒペプチドのすべてのアミノ酸残基を欠損しているＢａＥＶ（例えば、配列番号２４に示されているＢａＥＶ）を含有する参照脂質粒子の力価と比較して、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って増加する。任意の実施形態のうちのいくつかでは、形質導入後の標的細胞における力価は、１×１０６形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ以上、２×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、３×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、４×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、５×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、６×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、７×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、８×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、９×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、または１×１０７ＴＵ／ｍＬ以上である。
特定の実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも約（０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、または０．５）個の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質／ｎｍ２の密度で粒子の表面上に存在する。
いくつかの実施形態では、提供する脂質粒子は、非標的細胞と比較して標的細胞を優先的に標的とする。いくつかの実施形態では、提供する脂質粒子は、内腔または腔に外因性作用因子を含み、そのような脂質粒子は、非標的細胞と比較して標的細胞への外因性作用因子の優先的な送達を示す。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質含有脂質粒子によって特異的に標的とされる種類の細胞を指す。実施形態では、標的細胞は、ＣＤ３４について表面陽性である細胞（ＣＤ３４＋細胞）などの造血細胞である。
本明細書で使用される場合、「非標的細胞」とは、例えば、外因性作用因子を送達するために、脂質粒子の標的とするのに望ましくない種類の細胞を指す。いくつかの実施形態では、非標的細胞は非造血細胞である。いくつかの実施形態では、非標的細胞は、ＣＤ３４について表面陰性である細胞（ＣＤ３４－細胞）である。
いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、例えば、ＢａＥＶ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子は、エクスビボで細胞を標的にすることができる。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、例えば、ＢａＥＶ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子は、インビボで細胞を標的にすることができる。いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、例えば、ＢａＥＶ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子は、固定化後にインビボで細胞を標的にすることができる。
いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、ＶＳＶ－Ｇと同様の向性及び細胞ターゲティングを示す。したがって、いくつかの実施形態では、短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、例えば、ＢａＥＶ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子を、ＶＳＶ－Ｇの代わりに使用することができる。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＡＳＣＴ１及び／またはＡＳＣＴ２の細胞表面発現について陽性である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、造血系細胞である。「造血細胞」への言及には、骨髄系及びリンパ系の両方に由来する血液細胞が含まれる。特に、用語「造血細胞」には、造血幹細胞及び前駆細胞などの未分化または低分化細胞、ならびにＴリンパ球、Ｂリンパ球または樹状細胞などの分化細胞の両方が含まれる。いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞、ＣＤ３４＋前駆細胞、特に末梢血ＣＤ３４＋細胞、極初期前駆細胞ＣＤ３４＋細胞、Ｂ細胞ＣＤ１９＋前駆細胞、骨髄前駆ＣＤ１３＋細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、がんＢ細胞、特にＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＢＣＬＬ）細胞及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）Ｂ細胞、ならびに胸腺細胞である。
当業者には公知であるように、多くの造血細胞は、骨髄造血幹細胞から産生される。
いくつかの実施形態では、造血細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、これは、すべての血液細胞型を補充し、自己複製することができる細胞である。枯渇化させた造血系をレシピエントマウスの循環に注射した場合、１６週間にわたって骨髄細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞のレベルをロバストに検出可能なレベル（通常、末梢血細胞の１％超）に維持する細胞として、造血幹細胞を具体的に定義してもよい（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：２０３－２０７）。
いくつかの実施形態では、造血細胞は「ＣＤ３４＋前駆細胞」であり、これは、ＨＳＣ、多能性幹細胞、及び系統決定の初期段階にある細胞の部分集団を含む異種細胞集団である。ＣＤ３４＋前駆細胞は、正常な成体動物において、骨髄との間で継続的に移動する。それらは分化して、循環中に認められるすべての造血細胞系統を生成することができる。いくつかの実施形態では、造血細胞は、ＨＳＣから濃縮されたＣＤ３４＋前駆細胞のサブグループである最初期の前駆ＣＤ３４＋細胞である。
いくつかの実施形態では、造血細胞には、血液中に存在するＣＤ３４＋細胞である「末梢血ＣＤ３４＋細胞」が含まれる。
いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面ＣＤ１０、ＣＤ３４、及びＣＤ１９を発現するＢ系統細胞の集団であるＢ細胞ＣＤ１９＋前駆細胞である。
いくつかの実施形態では、造血細胞は、骨髄前駆細胞ＣＤ１３＋細胞であり、細胞表面ＣＤ３４及びＣＤ３４、いくつかの場合ではＣＤ３３も発現する骨髄系細胞の集団である。
いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄系－リンパ系分化に偏りのない造血系細胞、骨髄系に分化が偏った造血系細胞、リンパ系に分化が偏った造血系細胞、血小板に分化が偏った造血系細胞、血小板－骨髄系に分化が偏った造血系細胞、長期再増殖造血系細胞、中期再増殖造血系細胞、または短期再増殖造血系細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、及び血小板から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び自然リンパ球から選択される。
いくつかの実施形態では、造血細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は記憶Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、造血細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ナイーブまたは記憶Ｂ細胞などの休止Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＢＣＬＬ）細胞または辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）Ｂ細胞などのがんＢ細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は胸腺細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、胸腺細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８を発現する。いくつかの実施形態では、胸腺細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８を発現しない。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＣＤ５６を発現する細胞である。
ＩＶ． 医薬組成物及びその製造方法
短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質または短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する本明細書の脂質粒子を含有する組成物（医薬組成物及び製剤を含む）も提供する。医薬組成物は、記載される短縮型ＢａＥＶ含有脂質粒子のいずれかを含み得る。
本開示はまた、いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
用語「医薬製剤」とは、調製物の中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない、調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、担体の選択は、特定の脂質粒子及び／または投与方法によって部分的に決定される。したがって、様々な好適な製剤が存在する。例えば、医薬組成物には、保存剤を含めることができる。好適な保存剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。いくつかの態様では、２つ以上の保存剤の混合物を使用する。保存剤またはその混合物は、通常、全組成物の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、用いる用量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムなど；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免役グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、医薬品製造基準または優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）を満たす。いくつかの実施形態では、脂質粒子を、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）に従って作製する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、既定の参照値未満の病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、既定の参照値未満の混入物質レベルを有し、例えば、混入物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、低い免疫原性を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学分野において公知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、調製方法は、活性成分を担体または１つ以上の他の補助成分と結合させ、その後、必要であれば、または望ましい場合、製品を所望の単回もしくは多回投与単位に成形またはパッケージングするステップを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む医薬組成物の個別量である。いくつかの実施形態では、活性成分の量は、一般に、対象に投与するであろう活性成分の用量、またはそのような用量の簡便な画分、例えば、そのような用量の２分の１または３分の１に等しい。いくつかの実施形態では、単位剤形は、単回１日用量または複数回１日用量（例えば、１日当たり約１～４回以上）であり得る。いくつかの実施形態では、複数回１日用量を使用する場合、単位剤形は、各用量につき同じであっても、異なってもよい。
いくつかの実施形態では、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含有する脂質粒子は、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子である（例えば、第ＩＩ節）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する組成物は、ゲノムコピー（ＧＣ）の用量単位で製剤化することができる。ＧＣを決定するための好適な方法が記載されており、例えば、参照により本明細書に援用されるＭ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（２）：１１５－２５．２０１４に記載されているようなｑＰＣＲまたはデジタルドロプレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０４～約１０１０ＧＣ単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０９～約１０１５ＧＣ単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０５～約１０９ＧＣ単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０６～約１０９ＧＣ単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０１２～約１０１４ＧＣ単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、投与量は、１．０×１０９ＧＣ単位、５．０×１０９ＧＣ単位、１．０×１０１０ＧＣ単位、５．０×１０１０ＧＣ単位、１．０×１０１１ＧＣ単位、５．０×１０１１ＧＣ単位、１．０×１０１２ＧＣ単位、５．０×１０１２ＧＣ単位、または１．０×１０１３ＧＣ単位、５．０×１０１３ＧＣ単位、１．０×１０１４ＧＣ単位、５．０×１０１４ＧＣ単位、または１．０×１０１５ＧＣ単位である。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０４～約１０１０感染単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０９～約１０１５感染単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、１０５～約１０９感染単位である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０６～約１０９感染単位である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０１２～約１０１４感染単位（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、投与量は、１．０×１０９感染単位、５．０×１０９感染単位、１．０×１０１０感染単位、５．０×１０１０感染単位、１．０×１０１１感染単位、５．０×１０１１感染単位、１．０×１０１２感染単位、５．０×１０１２感染単位、または１．０×１０１３感染単位、５．０×１０１３感染単位、１．０×１０１４感染単位、５．０×１０１４感染単位、または１．０×１０１５感染単位である。感染単位を定量化するために利用可能な技術は、当技術分野において日常的であり、ウイルス粒子数の決定、蛍光顕微鏡検査、及びプラークアッセイによる力価測定を含む。例えば、アデノウイルス粒子の数は、Ａ２６０での吸光度を測定することによって決定することができる。同様に、感染単位も、モノクローナル抗体を使用したベクター特異的タンパク質の定量的免疫蛍光法またはプラークアッセイによって決定することができる。
いくつかの実施形態では、感染単位を計算する方法には、ウイルスの力価を細胞単層上で成長させ、数日～数週間後にプラークの数を計数するプラークアッセイが含まれる。例えば、感染力価は、プラークアッセイ、例えば細胞変性効果（ＣＰＥ）を評価するアッセイなどによって決定される。いくつかの実施形態では、ＣＰＥアッセイを、アガロースで覆われたＨＦＦ細胞などの細胞の単層上でウイルスを段階的に希釈することによって実施する。細胞変性効果を達成するための一定期間（例えば、約３～２８日、一般的には７～１０日）のインキュベーション後、細胞を固定し、プラークとして視覚化される細胞が存在しない病巣を決定することができる。いくつかの実施形態では、感染単位は、細胞培養物の５０％が感染するウイルスの希釈率を決定する終点希釈（ＴＣＩＤ５０）法を使用して決定することができ、したがって、一般に、１ｌｏｇなどの特定の範囲内で力価を決定することができる。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０４～約１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０９～約１０１５ｐｆｕ（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、１０５～約１０９ｐｆｕである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０６～約１０９ｐｆｕである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子の投与量は、約１０１２～約１０１４ｐｆｕ（両端を含む）である。いくつかの実施形態では、投与量は、１．０×１０９ｐｆｕ、５．０×１０９ｐｆｕ、１．０×１０１０ｐｆｕ、５．０×１０１０ｐｆｕ、１．０×１０１１ｐｆｕ、５．０×１０１１ｐｆｕ、１．０×１０１２ｐｆｕ、５．０×１０１２ｐｆｕ、または１．０×１０１３ｐｆｕ、５．０×１０１３ｐｆｕ、１．０×１０１４ｐｆｕ、５．０×１０１４ｐｆｕ、または１．０×１０１５ｐｆｕである。
いくつかの実施形態では、対象は、単回注射を受ける。いくつかの実施形態では、投与を、無期限及び／または治療の有効性が確立されるまで、毎日／毎週／毎月の間隔で繰り返すことができる。本明細書に記載されるように、治療の有効性は、本明細書に記載される症状及び臨床パラメータを評価することによって、及び／または所望の応答を検出することによって判定することができる。
必要なビヒクル提供脂質粒子の正確な量は、対象の種、年齢、体重、及び全身状態、使用する特定のポリ核酸、ポリペプチド、またはベクター、その投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。本明細書の教示を考慮すれば、適切な量は、当業者であれば日常的な実験のみを使用して決定することができる。
いくつかの実施形態における組成物は、滅菌液体製剤、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供され、いくつかの態様では、選択されたｐＨに緩衝され得る。液体製剤は、通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射による投与がいくらかより簡便である。他方、粘性組成物を、特定の組織とより長い接触時間を提供するために、適切な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は、担体を含み得、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。
無菌注射用溶液は、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの好適な担体、希釈剤、または賦形剤との混合物などの溶媒に脂質粒子を組み込むことによって調製することができる。組成物は、凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路及び所望の調製に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化剤または粘度向上添加剤、保存剤、香味料、着色剤などの補助物質を含み得る。いくつかの態様では、好適な調製物を調製するために標準テキストを参照してもよい。
注射可能物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての従来の形態で、注射前に液体中の溶液または懸濁液に好適な固体形態、またはエマルジョンとして調製され得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」には、皮内、鼻腔内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び気管内の経路、ならびに一定の用量が維持されるような徐放系または持続放出系が含まれる。
抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む、組成物の安定性及び無菌性を高める様々な添加剤を添加することができる。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって、微生物の作用の予防を確実にすることができる。注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用因子、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
いくつかの実施形態では、ビヒクル製剤は、凍結保護剤を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「凍結保護剤」とは、所与の物質と組み合わせる場合、凍結時に生じるその物質への損傷を軽減または除去するのに役立つ１つ以上の剤を指す。いくつかの実施形態では、凍結中にベクタービヒクルを安定化させるために、凍結保護剤をベクタービヒクルと組み合わせる。いくつかの態様では、－２０℃～－８０℃でのＲＮＡの冷凍保存は、ポリヌクレオチドの長期（例えば、３６か月）安定性にとって有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ種はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、凍結保護剤をビヒクル製剤中に含めて、凍結／融解サイクルを通じて、かつ冷凍保存条件下でポリヌクレオチドを安定化する。提供する実施形態の凍結保護剤としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース、及び／またはマンニトールが挙げられるが、これらに限定されない。トレハロースは、食品医薬品局によって一般に安全とみなされているものとしてリストされており（ＧＲＡＳ）、市販の医薬品製剤に一般的に使用されている。
インビボ投与のために使用すべき製剤は、一般に滅菌されている。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって、容易に遂行され得る。
Ｖ． 使用方法及び治療的適用
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含有する脂質粒子（例えば、レンチウイルス粒子）を、外因性作用因子を標的細胞に送達するために使用する。外因性作用因子は、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）などの核酸、または小分子であり得る。送達のために本明細書において非細胞粒子に含まれ得る例示的な外因性作用因子を記載する。本明細書で提供する方法の中には、外因性作用因子を標的細胞に送達することを含む方法がある。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、完全に異種であるか、または標的細胞によって産生または正常発現しない作用因子である。
いくつかの実施形態では、送達は、提供するレンチウイルスベクター粒子の標的細胞への形質導入によって行われる。したがって、本明細書において、短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された、提供されるレンチウイルスベクター粒子を標的細胞に形質導入する方法も提供する。偽型ウイルスベクター粒子による造血細胞の形質導入をもたらす条件下で、造血細胞を上記で定義した偽型ウイルスベクター粒子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター粒子（例えば、レンチウイルスベクター粒子）による形質導入により、標的細胞に結合する際、最初に生体物質を標的細胞の膜または細胞質に送達される。送達後、生体物質は細胞の他の区画に移動することができる。いくつかの実施形態では、形質導入は、粒子によって発現される外因性遺伝子を、細胞のゲノムへ組み込むことを媒介する。標的細胞の形質導入を達成するための条件は当業者に周知であり、一般的には、フラスコ、プレート、またはディッシュ中での培養などによって、いくつかの場合では、形質導入アジュバント（例えば、レトロネクチン）の存在下で、形質導入される細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、標的細胞を刺激または活性化するためのサイトカインカクテルまたは他の刺激剤などを用いて、事前に刺激または活性化され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター粒子を、１、５、１０、もしくは１００のＭＯＩ、または前述のいずれかの間の任意の値で標的細胞と共にインキュベートする。いくつかの実施形態では、インキュベーションを無血清培地中で実施する。
いくつかの実施形態では、標的細胞は造血細胞である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、例えば、骨髄系またはリンパ系由来の血液細胞である。特に、造血細胞は、造血幹細胞及び前駆細胞などの未分化または低分化細胞、またはＴリンパ球、Ｂリンパ球または樹状細胞などの分化細胞であり得る。いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞、ＣＤ３４＋前駆細胞、特に末梢血ＣＤ３４＋細胞、極初期前駆細胞ＣＤ３４＋細胞、Ｂ細胞ＣＤ１９＋前駆細胞、骨髄前駆ＣＤ１３＋細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、がんＢ細胞、特にＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＢＣＬＬ）細胞及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）Ｂ細胞、ならびに胸腺細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、標的細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、すべての種類の血球を補充し、自己再生する幹細胞である。枯渇化させた造血系をレシピエントマウスの循環に注射した場合、１６週間にわたって骨髄細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞のレベルをロバストに検出可能なレベル（通常、末梢血細胞の１％超）に維持する細胞として、造血幹細胞を具体的に定義してもよい（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：２０３－２０７）。
いくつかの実施形態では、標的細胞はＣＤ３４＋前駆細胞である。いくつかの態様では、ＣＤ３４＋前駆細胞は、ＨＳＣ、多能性幹細胞、及び系統決定の初期段階にある細胞の部分集団を含む異種細胞集団である。ＣＤ３４＋前駆細胞は、正常な成体動物において、骨髄との間で継続的に移動する。それらは分化して、循環中に認められるすべての造血細胞系統を生成することができる。
いくつかの実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、休止Ｔ細胞または静止Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞または記憶Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、提供するレンチウイルスベクター粒子による形質導入前を含む、脂質粒子の送達前に活性化されていない。したがって、提供する方法の態様では、Ｔ細胞は、提供する短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型ウイルスベクター粒子（例えば、レンチウイルスベクター粒子）による形質導入前に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体試薬（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）などのＴ細胞刺激剤によって活性化されない。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらのサブセットであってもよい。
いくつかの実施形態では、標的細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、ナイーブＢ細胞または記憶Ｂ細胞などの休止Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＢＣＬＬ）細胞または辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）Ｂ細胞などのがんＢ細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞への外因性作用因子の送達は、対象における疾患または病態を治療するための治療効果を提供することができる。治療効果は、疾患または病態に関連するかまたは関与する標的細胞に存在するかまたは発現する抗原またはタンパク質を標的にすること、調節すること、または改変することによるものであり得る。治療効果は、外因性作用因子を提供することによるものであってもよく、その場合、外因性作用因子は、存在しないか、変異体であるか、または標的細胞において野生型に比べてより低いレベルのタンパク質（またはタンパク質をコードする核酸、例えばタンパク質をコードするｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、遺伝性疾患、例えば、一遺伝子性疾患、例えば、一遺伝子性細胞内タンパク質疾患を有する対象に由来する。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、造血疾患または造血障害を有する対象に由来する。いくつかの実施形態では、造血障害は、血液疾患、特に造血細胞が関与する疾患に起因し得る。いくつかの実施形態では、造血障害は、単一遺伝子の変異などによる一遺伝子性造血疾患である。いくつかの実施形態では、造血障害は、骨髄異形成、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイヤモンドブラックファン貧血、シュワッハマンダイヤモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫性疾患、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全症、血友病、サラセミア、βサラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、ウィスコット－アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫症、チェディアック－東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはエイズである。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、自己免疫疾患を有する対象に由来する。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病、バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ－ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素疾患、補体成分２欠損症、脳動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴ病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん性皮膚全身性硬化症、ドレスラー症候群、円板状エリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、ギラン－バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート－イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡多発血管炎、ミラー－フィッシャー症候群、混合性結合組織病、モルフェア、ミュシャ－ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経腎盂炎、神経筋緊張症、眼瘢痕性天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲性脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スチル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ－ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑、またはウェゲナー肉芽腫症である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、がんを有する対象に由来する。いくつかの実施形態において、がんは白血病である。いくつかの実施形態では、白血病は、Ｂ－ＣＬＬ、ＣＭＬ、またはＴ細胞ベースの白血病、例えばＡＬＴである。いくつかの実施形態では、がんは黒色腫である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、中枢神経系の脱髄疾患を有する対象に由来する。
本明細書に記載の脂質粒子、例えばレンチウイルスベクター、またはそれを含む医薬組成物は、対象、例えば哺乳類、例えばヒトに投与することができる。そのような実施形態では、対象は、特定の疾患もしくは病態（例えば、本明細書に記載の疾患もしくは病態）のリスクがある場合、その症状を有する場合、またはそれと診断されているもしくはそれを有するものとして特定されている場合がある。いくつかの実施形態では、疾患または病態は、投与する脂質粒子に含まれる外因性作用因子を対象の標的細胞に送達することによって治療されるものであってもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、特定の態様において、本明細書に記載の複数の脂質粒子を含む提供される脂質粒子組成物を対象に投与し、それによって脂質粒子組成物を対象に投与することを含む、対象（例えば、ヒト対象）への脂質粒子組成物の投与方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、特定の態様において、標的細胞を、本明細書に記載の複数の脂質粒子を含む提供される脂質粒子組成物と接触させ、それによって脂質粒子組成物を標的細胞に送達することを含む、標的細胞への脂質粒子組成物の送達方法を提供する。いくつかの実施形態では、接触させることは、提供する脂質粒子を対象に投与することによって実施し、対象に存在する標的細胞に脂質粒子を送達する。
いくつかの実施形態では、本開示は、特定の態様において、本明細書に記載の複数の脂質粒子、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、外因性作用因子、例えば治療用物質（例えば、ポリペプチド、核酸、代謝産物、細胞小器官、または細胞内構造）を対象または細胞に送達する方法を提供し、ここで、脂質粒子組成物を、治療用物質が送達されるような量及び／または時間で投与する。対象へ送達するために本明細書において脂質粒子に含まれ得る例示的な外因性作用因子を、第ＩＩＩ．Ｄ節に記載する。
いくつかの実施形態では、本開示は、特定の態様において、標的細胞を、本明細書に記載の複数の脂質粒子、または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む、外因性作用因子、例えば治療用物質（例えば、ポリペプチド、核酸、代謝産物、細胞小器官、または細胞内構造）を標的細胞に送達する方法を提供し、ここで、脂質粒子組成物を、治療用物質が送達されるような条件下で標的細胞と接触させる。対象に送達するために本明細書の脂質粒子に含有させることができる例示的な外因性作用因子は、第ＩＩＩ．Ｄ節に記載されている。いくつかの実施形態では、接触させることを、提供される脂質粒子を対象に投与することによって実施し、その場合、脂質粒子に含まれる治療用物質（例えば外因性作用因子）が、対象に存在する標的細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子組成物の投与による外因性作用因子の送達は、細胞タンパク質発現レベルを改変し得る。特定の実施形態では、投与される組成物は、ポリペプチドが送達される細胞において実質的に非存在のまたは減少した機能的活性を提供する１つ以上の外因性作用因子カーゴ（例えば、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ）の上方制御（細胞における発現、細胞における送達、または細胞内の誘導を介する）を誘導する。いくつかの実施形態では、欠落した機能的活性は、酵素的、構造的、または制御的の性質のものであり得る。いくつかの実施形態では、投与される組成物は、ポリペプチドが上方制御された細胞において存在するが、実質的に欠損している機能的活性を増加させる（例えば、相乗的に）１つ以上のポリペプチドの上方制御を誘導する。任意の実施形態のうちのいくつかでは、投与される組成物は、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが送達される細胞において存在するまたは上方制御された機能的活性を抑制する１つ以上のカーゴ（例えば、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）の下方制御（細胞における発現、細胞における送達、または細胞内の誘導を介する）を誘導する。任意の実施形態のうちのいくつかでは、上方制御された機能的活性は、事実上、酵素的、構造的、または調節的であり得る。いくつかの実施形態では、投与される組成物は、ポリペプチドが下方制御された細胞において存在するまたは上方制御された機能的活性を低下させる（例えば、相乗的に）１つ以上のポリペプチドの下方制御を誘導する。いくつかの実施形態では、投与される組成物は、特定の機能的活性の上方制御及び他の機能的活性の下方制御を誘導する。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、脂質粒子組成物（例えば、ミトコンドリアまたはＤＮＡを含むもの）は、標的細胞に対する効果を媒介し、効果は、少なくとも１、２、３、４、５、６、もしくは７日間、２、３、もしくは４週間、または１、２、３、６、もしくは１２か月間持続する。いくつかの実施形態（例えば、脂質粒子組成物が外因性タンパク質を含む）では、効果は、１、２、３、４、５、６、もしくは７日、２、３、もしくは４週、または１、２、３、６、もしくは１２か月未満の間持続する。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、第２の外因性作用因子をさらに含むか、または方法は、前記第２の外因性作用因子を送達することをさらに含み、前記第２の外因性作用因子が、細胞表面受容体に結合する第２の細胞表面リガンドまたは抗体を含むかまたはコードし、任意選択で、細胞表面受容体（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０個、またはそれ以上）に結合する１個以上の追加の細胞表面リガンドもしくは抗体をさらに含むかまたはコードする。いくつかの実施形態では、第１の外因性作用因子及び第２の外因性作用因子は複合体を形成し、任意選択で、複合体は１個以上の追加の細胞表面リガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、細胞表面受容体、例えば、外因性細胞表面受容体を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、第２の外因性作用因子をさらに含むか、または方法は、前記第２の外因性作用因子を送達することをさらに含み、前記第２の外因性作用因子は、第２の細胞表面受容体を含むかまたはコードし、任意選択で、１個以上の追加の細胞表面受容体（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０個、またはそれ以上の細胞表面受容体）をさらに含むかまたはコードする。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、１個以上の細胞表面受容体を標的細胞（例えば、免疫細胞）に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、１個以上の細胞表面受容体を標的細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性作用因子及び第２の外因性作用因子は複合体を形成し、任意選択で、複合体は１個以上の追加の細胞表面受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、抗原または抗原提示タンパク質を含むか、またはコードする。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、標的細胞にタンパク質、例えば治療用タンパク質の分泌を起こさせることができる（例えば、引き起こす）。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば、標的細胞がタンパク質を産生及び分泌できる条件下で、タンパク質をコード化する核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を標的細胞に送達することによって、分泌される外因性作用因子、例えば、分泌タンパク質を、標的部位（例えば、細胞外領域）に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、本明細書に記載の分泌される外因性作用因子を送達することを含む。実施形態では、分泌タンパク質は、タンパク質治療薬、例えば、抗体分子、サイトカイン、または酵素を含む。実施形態では、分泌タンパク質は、自己分泌シグナル伝達分子またはパラクリンシグナル伝達分子を含む。実施形態では、分泌される外因性作用因子は、分泌顆粒を含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、外因性作用因子、例えば、タンパク質を分泌する（例えば、分泌する）ことができる。いくつかの実施形態では、外因性作用因子、例えば分泌される作用因子を、対象の標的部位に送達する。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、組換えで作製することができないか、または組換えで作製することが困難なタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質を分泌する脂質粒子は、ＭＳＣまたは軟骨細胞から選択されるソース細胞に由来する。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば、転写因子、転写因子をコードする核酸、ｍＲＮＡ、または複数の前記外因性作用因子から選択される外因性作用因子を送達することによって、標的細胞（例えば、免疫細胞）を再プログラムすることができる（例えば、再プログラムする）。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞を再プログラムすることを含む。実施形態では、再プログラミングは、枯渇したＴ細胞を誘導して、枯渇していないＴ細胞、例えばキラーＴ細胞の１つ以上の特徴を獲得することを含む。いくつかの実施形態では、外因性作用因子は、抗原を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、抗原を含む第１の外因性作用因子と、抗原提示タンパク質を含む第２の外因性作用因子とを含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば外因性作用因子（タンパク質または核酸）または外因性作用因子をコードする核酸を送達することによって、標的腫瘍細胞を修飾することができる。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的腫瘍細胞を修飾することを含む。実施形態では、脂質粒子は、免疫刺激性リガンド、抗原提示タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、またはアポトーシス促進タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、標的細胞における免疫抑制性リガンド、分裂誘起シグナル、または成長因子のレベルを低下させることができるｍｉＲＮＡを送達する。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、免疫調節性、例えば免疫刺激性の外因性作用因子を送達する。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば、抗原または抗原をコードする核酸を含む外因性作用因子を送達することによって、標的細胞に抗原提示を起こさせることができる（例えば、引き起こす）。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞上に抗原を提示することを含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、標的組織における再生を促進する。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的組織における再生を促進することを含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば遺伝子治療のために、例えば標的細胞のゲノムを安定に改変するために、標的細胞に核酸を送達することができる（例えば、送達する）。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞に核酸を送達することを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、酵素欠損を有し、例えば、酵素の活性の低下（例えば、不活性）をもたらす酵素の変異を含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、標的細胞内のＤＮＡ（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、またはＴＡＬＥＮ）に対する配列特異的修飾を媒介する試薬を送達することができる（例えば、送達する）。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞に試薬を送達することを含む。実施形態では、標的細胞はＣＮＳ細胞である。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば標的細胞における遺伝子発現を一過性に改変するために、標的細胞に核酸を送達することができる（例えば、送達する）。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、例えば、タンパク質の欠損を一過性にレスキューするために、標的細胞にタンパク質を送達することができる（例えば、送達する）。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞にタンパク質を送達することを含む。実施形態において、タンパク質は、膜タンパク質（例えば、膜輸送体タンパク質）、細胞質タンパク質（例えば、酵素）、または分泌タンパク質（例えば、免疫抑制タンパク質）である。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は細胞内分子送達が可能であり、例えば、タンパク質外因性作用因子を標的細胞に送達する。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞の細胞内領域に分子を送達することを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質外因性作用因子は阻害剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質外因性作用因子は、ナノボディ、ｓｃＦｖ、ラクダ科動物抗体、ペプチド、大環状分子、または小分子を含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、その膜上に１個以上の細胞表面リガンド（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０個、またはそれ以上の細胞表面リガンド）を含み、前記細胞表面リガンドは、脂質粒子によって標的細胞に提示される。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、１個以上の細胞表面リガンドを標的細胞に提示することを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面リガンドを有する脂質粒子は、好中球（例えば、標的細胞は腫瘍浸潤リンパ球である）、樹状細胞（例えば、標的細胞はナイーブＴ細胞である）、または好中球（例えば、標的は腫瘍細胞またはウイルス感染細胞である）から選択されるソース細胞に由来する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、膜複合体、例えば、少なくとも２、３、４、または５個のタンパク質、例えばホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含む複合体を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、抗体、例えば毒性抗体を含み、例えば、脂質粒子は、例えば、標的部位にホーミングすることによって、標的部位に抗体を送達することができる。いくつかの実施形態では、ソース細胞は、ＮＫ細胞または好中球である。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、脂質粒子上に細胞表面リガンドを提示することによって、標的細胞の表面上にリガンド提示を引き起こすことを含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、標的細胞の細胞死を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ＮＫソース細胞に由来する。いくつかの実施形態では、脂質粒子または標的細胞は、（例えば、病原体の）食作用が可能である。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、食作用を引き起こすことを含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、その局所環境を感知し、それに応答する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、代謝産物、インターロイキン、または抗原のレベルを感知することができる。
実施形態では、脂質粒子は、走化性、血管外遊出、または１つ以上の代謝活動が可能である。実施形態では、代謝活動は、キニューリニン、糖新生、プロスタグランジン脂肪酸酸化、アデノシン代謝、尿素サイクル、及び熱産生呼吸から選択される。いくつかの実施形態では、ソース細胞は好中球であり、脂質粒子は損傷部位にホーミングすることができる。いくつかの実施形態では、ソース細胞はマクロファージであり、脂質粒子は食作用が可能である。いくつかの実施形態では、ソース細胞は褐色脂肪組織細胞であり、脂質粒子は脂肪分解することができる。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、複数の外因性作用因子（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、または５０個の外因性作用因子）または複数の外因性作用因子をコードする核酸を含む（例えば、標的細胞に送達することができる）。実施形態では、脂質粒子は、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）及びｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、膜タンパク質または膜タンパク質をコードする核酸を含む（例えば、標的細胞に送達することができる）。実施形態では、脂質粒子は、標的細胞を再プログラミングまたは分化転換することができ、例えば、脂質粒子は、標的細胞の再プログラミングまたは分化転換を誘導する１つ以上の作用因子を含む。
ＶＩ． 例示的な実施形態
以下の実施形態を提供する。
１． 野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子であって、前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、前記野生型ＢａＥｖエンベロープ糖タンパク質の、少なくとも１個のアミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含む、前記ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子。
２． 野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子であって、前記細胞質尾部が、２５アミノ酸長であり、かつ野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端酸の阻害性Ｒペプチド（Ｒ＋８）を含む、前記ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子。
３． 複製欠損型である、実施形態１または実施形態２のレンチウイルス粒子。
４． Ｇａｇ－ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｔａｔ、及び前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするパッケージングプラスミドをプロデューサー細胞に形質導入することを含む方法によって調製する、実施形態１～３のいずれかのレンチウイルス粒子。
５． ウイルス核酸をさらに含む、実施形態１～４のいずれかのレンチウイルス粒子。
６． 前記ウイルス核酸が、以下の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／セントラル終結配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡフラップ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３を欠く）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む、実施形態５のレンチウイルス粒子。
７． ウイルスゲノムＤＮＡを有さない、実施形態１～４のいずれかのレンチウイルス粒子。
８． 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子であって、
（ａ）内腔を囲む脂質二重層、及び
（ｂ）野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質であって、前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの、少なくとも１個の連続アミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含み、エンベロープ糖タンパク質が、前記脂質二重層に埋め込まれている、前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
を含む、前記脂質粒子。
９． 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子であって、
（ａ）内腔を囲む脂質二重層、及び
（ｂ）野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質であって、前記細胞質尾部が、２５アミノ酸長であり、かつ野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端酸の阻害性Ｒペプチド（Ｒ＋８）を含み、エンベロープ糖タンパク質が、前記脂質二重層に埋め込まれている、前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
を含む、前記脂質粒子。
１０． 前記脂質二重層が、レトロウイルス粒子またはレトロウイルス様粒子を生成するために使用される宿主細胞の膜に由来する、実施形態８または実施形態９の脂質粒子。
１１． 前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される、実施形態１０の脂質粒子。
１２． 前記脂質二重層が、前記ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質以外の１つ以上の他のウイルス成分であるか、またはそれを含む、実施形態８～１１のいずれかの脂質粒子。
１３． 前記１つ以上のウイルス成分が、レトロウイルス由来である、実施形態１２の脂質粒子。
１４． 前記レトロウイルスが、レンチウイルス粒子またはレンチウイルス様粒子である、１０～１３の脂質粒子。
１５． 前記短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質が、（ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び（ｉｉ）前記部分的阻害性Ｒペプチドを伴う前記細胞質尾部を含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分を含む、実施形態１～７のいずれかのレンチウイルス粒子または実施形態８～１４のいずれかの脂質粒子。
１６． 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分が、サブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している、実施形態１５のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
１７． 前記ＢａＥＶ糖タンパク質が、ＡＳＣＴ－２またはＡＳＣＴ－１受容体に結合する、実施形態１～１６のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
１８． 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分が、配列番号２５に示されているアミノ酸配列、あるいは配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含む、実施形態１５～１７のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
１９． 前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分が、配列番号２６、あるいは配列番号２６に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含み、かつ前記部分的阻害性Ｒペプチドを含む、実施形態１５～１８のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２０． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大１６個の連続アミノ酸を欠く、実施形態１～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２１． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１４個の連続アミノ酸を欠き、任意選択で、配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１３個の連続アミノ酸を欠く、実施形態１～２０のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２２． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１４（Ｒ＋９）に示されている、実施形態１、３～７、８、及び１０～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２３． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３７に示されている、実施形態１、３～７、８、及び１０～２２のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２４． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１３（Ｒ＋８）に示されている、実施形態１～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２５． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３６に示されている、実施形態１～１９及び２４のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２６． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１２（Ｒ＋７）に示されている、実施形態１、３～７、８、及び１０～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２７． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３５に示されている、実施形態１、３～７、８、１０～１９、及び２６のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２８． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１１（Ｒ＋６）に示されている、実施形態１、３～７、８、及び１０～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
２９． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３４に示されている、実施形態１、３～７、８、１０～１９、及び２８のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３０． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１０（Ｒ＋５）に示されている、実施形態１、３～７、８、及び１０～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３１． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３３に示されている、実施形態１、３～７、８、１０～１９、及び３０のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３２． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号９（Ｒ＋４）に示されている、実施形態１、３～７、８、及び１０～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３３． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３２に示されている、実施形態１、３～７、８、１０～１９、及び３２のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３４． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号８（Ｒ＋３）に示されている、実施形態１、３～７、８、及び１０～１９のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３５． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３１に示されている、実施形態１、３～７、８、１０～１９、及び３４のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３６． 外因性作用因子をさらに含む、実施形態１～３５のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３７． 前記外因性作用因子が、内腔に存在する、実施形態３６のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３８． 前記外因性作用因子が、タンパク質または核酸であり、任意選択で、前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、実施形態３６または実施形態３７のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
３９． 前記外因性作用因子が、遺伝子編集に関連する因子であるか、またはそれをコードする、実施形態３６～３８のいずれかのレンチウイルス粒子。
４０． 前記外因性作用因子が、塩基編集及び／もしくはプライム編集（すなわち、ＴＰＲＴ（ｔａｒｇｅｔ－ｐｒｉｍｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））に関連する因子であるか、またはそれをコードする、実施形態３６～３９のいずれかのレンチウイルス粒子。
４１． 前記外因性作用因子が、ヌクレアーゼであるか、またはそれをコードし、任意選択で、前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）を含む群から選択される、実施形態３６～４０のいずれかのレンチウイルス粒子。
４２． 前記外因性作用因子が、トランスポザーゼ及び／もしくはリコンビナーゼであるか、またはそれをコードする、実施形態３６～４０のいずれかのレンチウイルス粒子。
４３． 前記外因性作用因子が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、もしくは逆転写酵素であるか、またはそれをコードする、実施形態３６～４０のいずれかのレンチウイルス粒子。
４４． 前記粒子が、参照粒子調製物と比較して力価が増加した調製物として作製され、前記参照粒子調製物が、同様に作製されるが、全長Ｒペプチドまたは１０アミノ酸長以上のＲペプチド部分を伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の組み込みを有する、実施形態１～４３のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
４５． 前記力価が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って、任意選択で、５倍以上、または約５倍以上、または５倍以上を上回って、増加する、実施形態４４のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
４６． 形質導入後の標的細胞、任意選択でＨＥＫ２９３細胞における力価が、３×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、４×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、５×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、６×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、７×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、８×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、９×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、１×１０７ＴＵ／ｍＬ以上、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ以上である、実施形態１～４５のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質。
４７． 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、少なくとも約（０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、または０．５）個の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質／ｎｍ２の密度で前記粒子の表面上に存在する、実施形態１～４６のいずれかのレンチウイルス粒子または脂質粒子。
４８． 野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質であって、前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の、少なくとも１個の連続アミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含む、前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
４９． （ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び（ｉｉ）前記部分的阻害性Ｒペプチドを伴う前記細胞質尾部を含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分を含む、実施形態４８の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５０． 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの前記部分が、サブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している、実施形態４９の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５１． 前記ＢａＥＶ糖タンパク質が、ＡＳＣＴ－２またはＡＳＣＴ－１受容体に結合する、実施形態４８～５０のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５２． 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分が、配列番号２５に示されているアミノ酸配列、あるいは配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含む、実施形態４８～５１のいずれかの短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質。
５３． 前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの前記部分が、配列番号２６、あるいは配列番号２６に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含み、かつ前記部分的阻害性Ｒペプチドを含む、実施形態４８～５２のいずれかの短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質。
５４． 配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大１６個の連続アミノ酸を欠く、実施形態４８～５３のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５５． 配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１４個の連続アミノ酸を欠き、任意選択で、配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１３個の連続アミノ酸を欠く、実施形態４８～５４のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５６． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１４（Ｒ＋９）に示されている、実施形態４８～５５のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５７． 配列番号３７に示されている、実施形態４８～５６のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５８． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１３（Ｒ＋８）に示されている、実施形態４８～５５のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
５９． 配列番号３６に示されている、実施形態４８～５５及び５８のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６０． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１２（Ｒ＋７）に示されている、実施形態４８～５５のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６１． 配列番号３５に示されている、実施形態４８～５５及び６０のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６２． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１１（Ｒ＋６）に示されている、実施形態４８～５５のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６３． 配列番号３４に示されている、実施形態４８～５５及び６２のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６４． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１０（Ｒ＋５）に示されている、実施形態４８～５５のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６５． 配列番号３３に示されている、実施形態４８～５５及び６４のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６６． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号９（Ｒ＋４）に示されている、実施形態４８～５５のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６７． 配列番号３２に示されている、実施形態４８～５５及び６６のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６８． 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号８（Ｒ＋３）に示されている、実施形態４８～５５のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
６９． 配列番号３１に示されている、実施形態４８～５５及び６８のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
７０． 実施形態４８～６９のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチド。
７１． コドン最適化されている、実施形態７０のポリヌクレオチド。
７２． 前記核酸の発現を制御するために作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターをさらに含む、実施形態７０または実施形態７１のポリヌクレオチド。
７３． 前記プロモーターが構成的プロモーターである、実施形態７２のポリヌクレオチド。
７４． 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、実施形態７２または実施形態７３のポリヌクレオチド。
７５． 実施形態７０～７４のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
７６． 実施形態７０～７４のいずれかのポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
７７． レンチウイルス生成のためのタンパク質をコードする１つ以上の核酸をさらに含む、実施形態７６のプラスミド。
７８． 実施形態７０～７４のいずれかのポリヌクレオチド、実施形態７５のベクター、または実施形態７６もしくは実施形態７７のプラスミド
を含む、細胞。
７９． レンチウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞である、実施形態７８の細胞。
８０． （ｉ）ウイルス核酸と（ｉｉ）実施形態４８～６９のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸とを含む、プロデューサー細胞であって、任意選択で、前記ウイルス核酸がレンチウイルス核酸である、前記プロデューサー細胞。
８１． ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される、実施形態８０のプロデューサー細胞。
８２． ２９３Ｔ細胞を含む、実施形態８０または実施形態８１のプロデューサー細胞。
８３． 前記ウイルス核酸が、ウイルス複製に関与する１つ以上の遺伝子を欠損している、実施形態８０～８２のいずれかのプロデューサー細胞。
８４． 前記ウイルス核酸が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔのうちの１つ以上から選択されるウイルスパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む、実施形態８０～８３のいずれかのプロデューサー細胞。
８５． 前記ウイルス核酸が、以下の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／セントラル終結配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡフラップ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３を欠く）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む、実施形態８０～８４のいずれかのプロデューサー細胞。
８６． 短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質を含む脂質粒子の作製方法であって、
ａ）実施形態７０～７４のいずれかのポリヌクレオチド、実施形態７５のベクター、または実施形態７６もしくは実施形態７７のプラスミドを、ソース細胞に導入すること、
ｂ）脂質粒子の産生を可能とする条件下で前記細胞を培養すること、及び
ｃ）前記細胞から前記脂質粒子を分離、濃縮、または精製し、それにより前記脂質粒子を作製すること
を含む、前記作製方法。
８７． 前記ソース細胞が、哺乳類細胞である、実施形態８６の方法。
８８． 前記ソース細胞がプロデューサー細胞であり、前記脂質粒子が、ウイルス粒子またはウイルス様粒子、任意選択でレトロウイルス粒子またはレトロウイルス様粒子、任意選択でレンチウイルス粒子またはレンチウイルス様粒子である、実施形態８６または実施形態８７の方法。
８９． 偽型レンチウイルス粒子の作製方法であって、
ａ）レンチウイルス核酸と、実施形態４８～６９のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸または実施形態７０～７４のいずれかのポリヌクレオチドとを含むプロデューサー細胞を提供すること、
ｂ）レンチウイルス粒子の産生を可能とする条件下で前記細胞を培養すること、及び
ｃ）前記プロデューサー細胞から前記レンチウイルス粒子を分離、濃縮、または精製し、それにより前記偽型レンチウイルス粒子を作製すること
を含む、前記作製方法。
９０． 前記プロデューサー細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される、実施形態８８または実施形態８９の方法。
９１． 前記プロデューサー細胞が、２９３Ｔ細胞を含む、実施形態８８～９０のいずれかの方法。
９２． 前記方法が、参照レンチウイルス粒子調製物と比較して力価が増加したレンチウイルス調製物を作製し、前記参照レンチウイルス粒子調製物が、同様に作製されるが、全長Ｒペプチドまたは１０アミノ酸長以上のＲペプチドの部分を伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化されている、実施形態８８～９１のいずれかの方法。
９３． 前記力価が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って、任意選択で、５倍以上、または約５倍以上、または５倍以上を上回って、増加する、実施形態９２の方法。
９４． 形質導入後の標的細胞、任意選択でＨＥＫ２９３細胞における力価が、３×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、４×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、５×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、６×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、７×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、８×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、９×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、１×１０７ＴＵ／ｍＬ以上、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ以上である、レンチウイルス調製物
を作製する、実施形態８８～９３のいずれかの方法。
９５． 同様の方法ではあるが、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質Ｒペプチドと比べてＲペプチドを伴わないか（Ｒなし）または長さが３個の連続アミノ末端アミノ酸もしくはそれ未満であるＲペプチドを伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された参照レンチウイルス粒子調製物を産生するための方法、と比較して、前記プロデューサー細胞の合胞体形成の低減をもたらす、実施形態８８～９４のいずれかの方法。
９６． 高力価（例えば、４×１０６ＴＵ／ｍＬ超、５×１０６ＴＵ／ｍＬ超、６×１０６ＴＵ／ｍＬ超、７×１０６ＴＵ／ｍＬ超、８×１０６ＴＵ／ｍＬ超、９×１０６ＴＵ／ｍＬ超、１×１０７ＴＵ／ｍＬ超、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ超）を有するレンチウイルス調製物を作製し、前記作製方法の最中に前記プロデューサー細胞の最小限の合胞体形成をもたらす、実施形態８８～９５のいずれかの方法。
９７． 実施形態８６～８８及び９０～９６のいずれかの方法によって作製される脂質粒子。
９８． 実施形態８９～９６のいずれかの方法によって作製されるレンチウイルス粒子。
９９． 実施形態４８～６９のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、脂質粒子。
１００． 実施形態４８～６９のいずれかの短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された、レンチウイルス粒子。
１０１． 実施形態１～７、１５～４７、９８、及び１００のいずれかのレンチウイルス粒子を複数含む、組成物。
１０２． 実施形態８～４７、９７、及び９９のいずれかの脂質粒子を複数含む、組成物。
１０３． 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１０１または実施形態１０２の組成物。
１０４． 細胞への形質導入方法であって、細胞を、実施形態１～７、１５～４７、９８、及び１００のいずれかのレンチウイルス粒子、または実施形態１０１もしくは実施形態１０３の組成物と接触させることを含む、前記形質導入方法。
１０５． 前記脂質粒子またはレンチウイルスベクターが、外因性作用因子を含み、形質導入によって前記外因性作用因子が前記細胞内に導入される、実施形態１０４の方法。
１０６． 細胞内への外因性作用因子の送達方法であって、実施形態１～４７及び９７～１００のいずれかのレンチウイルス粒子もしくは脂質粒子、または実施形態１０１～１０３のいずれかの組成物を、細胞と接触させることを含む、前記送達方法。
１０７． 前記接触させることが、インビトロまたはエクスビボである、実施形態１０４～１０６のいずれかの方法。
１０８． 前記接触させることが、対象におけるインビボである、実施形態１０４～１０６のいずれかの方法。
１０９． 対象の細胞への外因性作用因子の送達方法であって、実施形態１～４７及び９７～１００のいずれかのレンチウイルス粒子もしくは脂質粒子、または実施形態１０１～１０３のいずれかの組成物を、前記対象に投与することを含む、前記送達方法。
１１０． 前記細胞が造血系細胞である、実施形態１０４～１０９のいずれかの方法。
１１１． 前記細胞が、骨髄系－リンパ系分化に偏りのない造血系細胞、骨髄系に分化が偏った造血系細胞、リンパ系に分化が偏った造血系細胞、血小板に分化が偏った造血系細胞、血小板－骨髄系に分化が偏った造血系細胞、長期再増殖造血系細胞、中期再増殖造血系細胞、または短期再増殖造血系細胞からなる群から選択される、実施形態１０４～１１０のいずれかの方法。
１１２． 前記細胞が、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、及び血小板から選択される、実施形態１０４～１１１のいずれかの方法。
１１３． 前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び自然リンパ球から選択される、実施形態１０４～１１２のいずれかの方法。
１１４． 前記細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、実施形態１０４～１１３のいずれかの方法。
１１５． 前記対象が、造血幹細胞移植を受けたことがある、実施形態１１４の方法。
１１６． 前記外因性作用因子が、タンパク質または核酸であり、任意選択で、前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、実施形態１０５～１１５のいずれかの方法。
１１７． 前記外因性作用因子が、前記対象における疾患もしくは病態を治療するための治療用物質であるか、またはそれをコードする、実施形態１０５～１１６のいずれかの方法。
１１８． 前記外因性作用因子が、前記対象における疾患もしくは病態に関連する抗原を標的とするための膜タンパク質、任意選択でキメラ抗原受容体であるか、またはそれをコードする、実施形態１０５～１１６のいずれかの方法。
１１９． 前記外因性作用因子が、前記対象における遺伝子欠損を修正するための遺伝子治療に使用するためのものであるか、または欠損もしくは欠失している遺伝子を置換する、実施形態１０５～１１７のいずれかの方法。
１２０． 前記対象がヒト対象である、実施形態１０４～１１９のいずれかの方法。
ＶＩＩ． 実施例
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
実施例１ 短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化されたレンチウイルスの生成及び特徴決定
本実施例は、例示的な短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化されたレンチウイルスベクターの生成及び評価について説明する。
Ａ． ＢａＥＶ偽型化レンチウイルスの生成
高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを、以下のプラスミドによる一過性トランスフェクションによって２９３Ｔ細胞内で産生した：ＬＴＲ骨格、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｅＧＦＰ（ＣＭＶ－ｅＧＦＰ）、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｇａｇ－ｐｏｌ、及び表Ｅ１にまとめた短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のうちの１つをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド。本実験では、トランスフェクションごとに、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドおよそ１８８ｎｇを使用した。コードされた短縮型ＢａＥＶエンベロープタンパク質は、配列番号２４に示されている全長ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて短縮された配列を含有していたが、この短縮型ＢａＥｖエンベロープ糖タンパク質は、配列番号２４の全長Ｒペプチドを含有する野生型細胞質尾部（配列番号４に示されている全長Ｒペプチドを含有する野生型細胞質尾部）と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う短縮型細胞質尾部を有するように生成された。
（表Ｅ１）短縮型ＢａＥｖエンベロープタンパク質
Figure 2024521811000003
２日後、ウイルス上清を採取して凍結し、ＥＧＦＰについてプロデューサー細胞を画像化した。続いて、上清を解凍し、これを５ｕｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で規定数のＨＥＫ２９３細胞に添加することによって力価を測定した。さらに２４～４８時間後、これらの細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーでＥＧＦＰを分析した。力価は、ＧＦＰ＋であった細胞の割合（％）によって決定した。図１に示すように、阻害性Ｒペプチドの１～９個の連続アミノ末端アミノ酸（Ｒ＋１～Ｒ＋９）を含有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含有する構築物をトランスフェクトされた細胞は、阻害性Ｒペプチドの１０～１６個の連続アミノ末端アミノ酸、または全長配列を含む構築物に比べて力価の増加を示した。
図２に示すように、合胞体形成は、阻害性Ｒペプチドの４～９個の連続アミノ末端アミノ酸を含有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含有する構築物では実質的に減少したが、一方、Ｒなしの構築物は、プロデューサー細胞の大きな合胞体への融合を示した。
実施例２ 短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化されたレンチウイルスの最適化
本実施例は、実施例１に記載のＲペプチド（配列番号１３）の８つの連続アミノ酸を含むＲ＋８短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化されたレンチウイルスベクターの最適化について説明する。
２９３Ｔ細胞に、実施例１と同様のプラスミドをトランスフェクトしたが、例示的なＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質Ｒ＋８をコードするプラスミドを、０．００９、０．０３８、０．０９４、０．１８８、０．３７６、及び０．７５２μｇを含む異なる濃度範囲でトランスフェクトした点が異なる。力価の測定結果を図３に示し、この図は、ウイルス力価のプラスミド濃度の用量依存的影響を示している。
実施例３ ＣＤ３４＋細胞に対する偽型レンチウイルス活性
レンチウイルスベクターを、ＢａＥＶ＋８、ＢａＥＶＴＲ、ＢａＥＶＲなし、またはＶＳＶ－Ｇによって偽型化して上記のように生成した。粗生成上清の形質導入効率を、ヒトＣＤ３４＋細胞を用いて試験した。２人のドナーに由来するヒトＣＤ３４＋細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を、ヒト組換えサイトカインｃＫＩＴ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ）を添加した無血清培地中、６ウェルプレート上で２４時間インキュベートした。２×１０４個の事前刺激したＣＤ３４＋細胞を、無血清培地中、様々な希釈率の粗ＬＶの存在下でレトロネクチンコーティングされた９６ウェルプレート内で形質導入した。３日ごとに細胞にサイトカインを補充した。形質導入の８日後、ＧＦＰ＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって測定し、図４に示すように粗力価を推定した。ＢａＥＶ＋８の推定粗力価は、ＶＳＶ－ＧまたはＢａＥＶＲなしよりも高かった。本実施例は、ＢａＥＶ＋８によって偽型化されたレンチウイルスベクターを初代ヒトＣＤ３４＋陽性細胞に形質導入することができることを示している。
本発明は、例えば、本発明の様々な態様を例示するために提供される特定の開示される実施形態に範囲が限定されることを意図していない。記載される組成物及び方法に対する様々な修正は、本明細書の説明及び教示から明らかになるであろう。そのような変動は、開示の真の範囲及び精神から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内に入ることを意図している。
ＶＩＩＩ． 配列
Figure 2024521811000004
Figure 2024521811000005
Figure 2024521811000006
Figure 2024521811000007
Figure 2024521811000008
Figure 2024521811000009
Figure 2024521811000010
Figure 2024521811000011
Figure 2024521811000012
Figure 2024521811000013

Claims (120)

  1. 野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子であって、前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、前記野生型ＢａＥｖエンベロープ糖タンパク質の、少なくとも１個のアミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含む、前記ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子。
  2. 野生型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子であって、前記細胞質尾部が、２５アミノ酸長であり、かつ野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端酸の阻害性Ｒペプチド（Ｒ＋８）を含む、前記ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルス粒子。
  3. 複製欠損型である、請求項１または請求項２に記載のレンチウイルス粒子。
  4. Ｇａｇ－ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｔａｔ、及び前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードするパッケージングプラスミドをプロデューサー細胞に形質導入することを含む方法によって調製する、請求項１～３のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  5. ウイルス核酸をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  6. 前記ウイルス核酸が、以下の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／セントラル終結配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡフラップ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３を欠く）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む、請求項５に記載のレンチウイルス粒子。
  7. ウイルスゲノムＤＮＡを有さない、請求項１～４のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  8. 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子であって、
    （ａ）内腔を囲む脂質二重層、及び
    （ｂ）野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質であって、前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドの、少なくとも１個の連続アミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含み、エンベロープ糖タンパク質が、前記脂質二重層に埋め込まれている、前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
    を含む、前記脂質粒子。
  9. 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子であって、
    （ａ）内腔を囲む脂質二重層、及び
    （ｂ）野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の阻害性Ｒペプチドと比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質であって、前記細胞質尾部が、２５アミノ酸長であり、かつ野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の全長阻害性Ｒペプチドの８個の連続アミノ末端酸の阻害性Ｒペプチド（Ｒ＋８）を含み、エンベロープ糖タンパク質が、前記脂質二重層に埋め込まれている、前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
    を含む、前記脂質粒子。
  10. 前記脂質二重層が、レトロウイルス粒子またはレトロウイルス様粒子を生成するために使用される宿主細胞の膜に由来する、請求項８または請求項９に記載の脂質粒子。
  11. 前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の脂質粒子。
  12. 前記脂質二重層が、前記ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質以外の１つ以上の他のウイルス成分であるか、またはそれを含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  13. 前記１つ以上のウイルス成分が、レトロウイルス由来である、請求項１２に記載の脂質粒子。
  14. 前記レトロウイルスが、レンチウイルス粒子またはレンチウイルス様粒子である、１０～１３のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  15. 前記短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質が、（ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び（ｉｉ）前記部分的阻害性Ｒペプチドを伴う前記細胞質尾部を含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または請求項８～１４のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  16. 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分が、サブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している、請求項１５に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  17. 前記ＢａＥＶ糖タンパク質が、ＡＳＣＴ－２またはＡＳＣＴ－１受容体に結合する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  18. 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分が、配列番号２５に示されているアミノ酸配列、あるいは配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  19. 前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分が、配列番号２６、あるいは配列番号２６に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含み、かつ前記部分的阻害性Ｒペプチドを含む、請求項１５～１８のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  20. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大１６個の連続アミノ酸を欠く、請求項１～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  21. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１４個の連続アミノ酸を欠き、任意選択で、配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１３個の連続アミノ酸を欠く、請求項１～２０のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  22. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１４（Ｒ＋９）に示されている、請求項１、３～７、８、及び１０～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  23. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３７に示されている、請求項１、３～７、８、及び１０～２２のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  24. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１３（Ｒ＋８）に示されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  25. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３６に示されている、請求項１～１９及び２４のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  26. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１２（Ｒ＋７）に示されている、請求項１、３～７、８、及び１０～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  27. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３５に示されている、請求項１、３～７、８、１０～１９、及び２６のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  28. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１１（Ｒ＋６）に示されている、請求項１、３～７、８、及び１０～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  29. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３４に示されている、請求項１、３～７、８、１０～１９、及び２８のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  30. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１０（Ｒ＋５）に示されている、請求項１、３～７、８、及び１０～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  31. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３３に示されている、請求項１、３～７、８、１０～１９、及び３０のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  32. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号９（Ｒ＋４）に示されている、請求項１、３～７、８、及び１０～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  33. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３２に示されている、請求項１、３～７、８、１０～１９、及び３２のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  34. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号８（Ｒ＋３）に示されている、請求項１、３～７、８、及び１０～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  35. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、配列番号３１に示されている、請求項１、３～７、８、１０～１９、及び３４のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  36. 外因性作用因子をさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  37. 前記外因性作用因子が、内腔に存在する、請求項３６に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  38. 前記外因性作用因子が、タンパク質または核酸であり、任意選択で、前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３６または請求項３７に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  39. 前記外因性作用因子が、遺伝子編集に関連する因子であるか、またはそれをコードする、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  40. 前記外因性作用因子が、塩基編集及び／もしくはプライム編集（すなわち、ＴＰＲＴ（ｔａｒｇｅｔ－ｐｒｉｍｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））に関連する因子であるか、またはそれをコードする、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  41. 前記外因性作用因子が、ヌクレアーゼであるか、またはそれをコードし、任意選択で、前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）を含む群から選択される、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  42. 前記外因性作用因子が、トランスポザーゼ及び／もしくはリコンビナーゼであるか、またはそれをコードする、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  43. 前記外因性作用因子が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、もしくは逆転写酵素であるか、またはそれをコードする、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子。
  44. 前記粒子が、参照粒子調製物と比較して力価が増加した調製物として作製され、前記参照粒子調製物が、同様に作製されるが、全長Ｒペプチドまたは１０アミノ酸長以上のＲペプチド部分を伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の組み込みを有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  45. 前記力価が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って、任意選択で、５倍以上、または約５倍以上、または５倍以上を上回って、増加する、請求項４４に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  46. 形質導入後の標的細胞、任意選択でＨＥＫ２９３細胞における力価が、３×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、４×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、５×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、６×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、７×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、８×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、９×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、１×１０７ＴＵ／ｍＬ以上、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ以上である、請求項１～４５のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質。
  47. 前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、少なくとも約（０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、または０．５）個の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質／ｎｍ２の密度で前記粒子の表面上に存在する、請求項１～４６のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子または脂質粒子。
  48. 野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と比べて部分的融合阻害性Ｒペプチドを伴う細胞質尾部を含む短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質であって、前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の、少なくとも１個の連続アミノ末端アミノ酸であるが全長未満である阻害性Ｒペプチドを含む、前記短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  49. （ｉ）糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び（ｉｉ）前記部分的阻害性Ｒペプチドを伴う前記細胞質尾部を含む糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの部分を含む、請求項４８に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  50. 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分、及び前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの前記部分が、サブユニット間ジスルフィド結合を介して結合している、請求項４９に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  51. 前記ＢａＥＶ糖タンパク質が、ＡＳＣＴ－２またはＡＳＣＴ－１受容体に結合する、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  52. 前記糖タンパク質７０（ｇ７０）サブユニットまたはその生物学的に活性な部分が、配列番号２５に示されているアミノ酸配列、あるいは配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質。
  53. 前記糖タンパク質ｐ２０Ｅ（ｐ２０Ｅ）サブユニットの前記部分が、配列番号２６、あるいは配列番号２６に対して少なくとも８０％もしくは約８０％、少なくとも８１％もしくは約８１％、少なくとも８２％もしくは約８２％、少なくとも８３％もしくは約８３％、８４％もしくは約８４％、少なくとも８５％もしくは約８５％、少なくとも８６％もしくは約８６％、または少なくとも８７％もしくは約８７％、少なくとも８８％もしくは約８８％、または少なくとも８９％もしくは約８９％、少なくとも９０％もしくは約９０％、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、または少なくとも９９％もしくは約９９％の配列同一性を示す配列を含み、かつ前記部分的阻害性Ｒペプチドを含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質。
  54. 配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から最大１６個の連続アミノ酸を欠く、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  55. 配列番号２４と比べて短縮されており、かつ配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１４個の連続アミノ酸を欠き、任意選択で、配列番号２４のＣ末端細胞質尾部から８～１３個の連続アミノ酸を欠く、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  56. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～９として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１４（Ｒ＋９）に示されている、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  57. 配列番号３７に示されている、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  58. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～８として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１３（Ｒ＋８）に示されている、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  59. 配列番号３６に示されている、請求項４８～５５及び５８のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  60. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～７として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１２（Ｒ＋７）に示されている、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  61. 配列番号３５に示されている、請求項４８～５５及び６０のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  62. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～６として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１１（Ｒ＋６）に示されている、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  63. 配列番号３４に示されている、請求項４８～５５及び６２のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  64. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～５として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号１０（Ｒ＋５）に示されている、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  65. 配列番号３３に示されている、請求項４８～５５及び６４のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  66. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～４として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号９（Ｒ＋４）に示されている、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  67. 配列番号３２に示されている、請求項４８～５５及び６６のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  68. 前記部分的融合阻害性Ｒペプチドが、配列番号２２のアミノ酸１～３として示されており、任意選択で、前記細胞質尾部が、配列番号８（Ｒ＋３）に示されている、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  69. 配列番号３１に示されている、請求項４８～５５及び６８のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質。
  70. 請求項４８～６９のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチド。
  71. コドン最適化されている、請求項７０に記載のポリヌクレオチド。
  72. 前記核酸の発現を制御するために作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターをさらに含む、請求項７０または請求項７１に記載のポリヌクレオチド。
  73. 前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
  74. 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項７２または請求項７３に記載のポリヌクレオチド。
  75. 請求項７０～７４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  76. 請求項７０～７４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
  77. レンチウイルス生成のためのタンパク質をコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項７６に記載のプラスミド。
  78. 請求項７０～７４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７５に記載のベクター、または請求項７６もしくは請求項７７に記載のプラスミド
    を含む、細胞。
  79. レンチウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞である、請求項７８に記載の細胞。
  80. （ｉ）ウイルス核酸と（ｉｉ）請求項４８～６９のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸とを含む、プロデューサー細胞であって、任意選択で、前記ウイルス核酸がレンチウイルス核酸である、前記プロデューサー細胞。
  81. ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される、請求項８０に記載のプロデューサー細胞。
  82. ２９３Ｔ細胞を含む、請求項８０または請求項８１に記載のプロデューサー細胞。
  83. 前記ウイルス核酸が、ウイルス複製に関与する１つ以上の遺伝子を欠損している、請求項８０～８２のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞。
  84. 前記ウイルス核酸が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔのうちの１つ以上から選択されるウイルスパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む、請求項８０～８３のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞。
  85. 前記ウイルス核酸が、以下の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／セントラル終結配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡフラップ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能性Ｕ３を欠く）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む、請求項８０～８４のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞。
  86. 短縮型ＢａＥＶ糖タンパク質を含む脂質粒子の作製方法であって、
    ａ）請求項７０～７４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７５に記載のベクター、または請求項７６もしくは請求項７７に記載のプラスミドを、ソース細胞に導入すること、
    ｂ）脂質粒子の産生を可能とする条件下で前記細胞を培養すること、及び
    ｃ）前記細胞から前記脂質粒子を分離、濃縮、または精製し、それにより前記脂質粒子を作製すること
    を含む、前記作製方法。
  87. 前記ソース細胞が、哺乳類細胞である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ソース細胞がプロデューサー細胞であり、前記脂質粒子が、ウイルス粒子またはウイルス様粒子、任意選択でレトロウイルス粒子またはレトロウイルス様粒子、任意選択でレンチウイルス粒子またはレンチウイルス様粒子である、請求項８６または請求項８７に記載の方法。
  89. 偽型レンチウイルス粒子の作製方法であって、
    ａ）レンチウイルス核酸と、請求項４８～６９のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸または請求項７０～７４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドとを含むプロデューサー細胞を提供すること、
    ｂ）レンチウイルス粒子の産生を可能とする条件下で前記細胞を培養すること、及び
    ｃ）前記プロデューサー細胞から前記レンチウイルス粒子を分離、濃縮、または精製し、それにより前記偽型レンチウイルス粒子を作製すること
    を含む、前記作製方法。
  90. 前記プロデューサー細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞からなる群から選択される、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
  91. 前記プロデューサー細胞が、２９３Ｔ細胞を含む、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記方法が、参照レンチウイルス粒子調製物と比較して力価が増加したレンチウイルス調製物を作製し、前記参照レンチウイルス粒子調製物が、同様に作製されるが、全長Ｒペプチドまたは１０アミノ酸長以上のＲペプチドの部分を伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化されている、請求項８８～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記力価が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、もしくはそれ以上を上回って、任意選択で、５倍以上、または約５倍以上、または５倍以上を上回って、増加する、請求項９２に記載の方法。
  94. 形質導入後の標的細胞、任意選択でＨＥＫ２９３細胞における力価が、３×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、４×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、５×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、６×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、７×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、８×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、９×１０６ＴＵ／ｍＬ以上、１×１０７ＴＵ／ｍＬ以上、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ以上である、レンチウイルス調製物
    を作製する、請求項８８～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 同様の方法ではあるが、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質Ｒペプチドと比べてＲペプチドを伴わないか（Ｒなし）または長さが３個の連続アミノ末端アミノ酸もしくはそれ未満であるＲペプチドを伴う細胞質尾部を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された参照レンチウイルス粒子調製物を産生するための方法、と比較して、前記プロデューサー細胞の合胞体形成の低減をもたらす、請求項８８～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 高力価（例えば、４×１０６ＴＵ／ｍＬ超、５×１０６ＴＵ／ｍＬ超、６×１０６ＴＵ／ｍＬ超、７×１０６ＴＵ／ｍＬ超、８×１０６ＴＵ／ｍＬ超、９×１０６ＴＵ／ｍＬ超、１×１０７ＴＵ／ｍＬ超、または１．２×１０７ＴＵ／ｍＬ超）を有するレンチウイルス調製物を作製し、前記作製方法の最中に前記プロデューサー細胞の最小限の合胞体形成をもたらす、請求項８８～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 請求項８６～８８及び９０～９６のいずれか一項に記載の方法によって作製される脂質粒子。
  98. 請求項８９～９６のいずれか一項に記載の方法によって作製されるレンチウイルス粒子。
  99. 請求項４８～６９のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含む、脂質粒子。
  100. 請求項４８～６９のいずれか一項に記載の短縮型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質によって偽型化された、レンチウイルス粒子。
  101. 請求項１～７、１５～４７、９８、及び１００のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子を複数含む、組成物。
  102. 請求項８～４７、９７、及び９９のいずれか一項に記載の脂質粒子を複数含む、組成物。
  103. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１０１または請求項１０２に記載の組成物。
  104. 細胞への形質導入方法であって、細胞を、請求項１～７、１５～４７、９８、及び１００のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子、または請求項１０１もしくは請求項１０３に記載の組成物と接触させることを含む、前記形質導入方法。
  105. 前記脂質粒子またはレンチウイルスベクターが、外因性作用因子を含み、形質導入によって前記外因性作用因子が前記細胞内に導入される、請求項１０４に記載の方法。
  106. 細胞内への外因性作用因子の送達方法であって、請求項１～４７及び９７～１００のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子もしくは脂質粒子、または請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の組成物を、細胞と接触させることを含む、前記送達方法。
  107. 前記接触させることが、インビトロまたはエクスビボである、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記接触させることが、対象におけるインビボである、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  109. 対象の細胞への外因性作用因子の送達方法であって、請求項１～４７及び９７～１００のいずれか一項に記載のレンチウイルス粒子もしくは脂質粒子、または請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記送達方法。
  110. 前記細胞が造血系細胞である、請求項１０４～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記細胞が、骨髄系－リンパ系分化に偏りのない（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｂａｌａｎｃｅｄ）造血系細胞、骨髄系に分化が偏った（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、リンパ系に分化が偏った（ｌｙｍｐｈｏｉｄ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、血小板に分化が偏った（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、血小板－骨髄系に分化が偏った（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｍｙｅｌｏｉｄ－ｂｉａｓｅｄ）造血系細胞、長期再増殖（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）造血系細胞、中期再増殖（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）造血系細胞、または短期再増殖（ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）造血系細胞からなる群から選択される、請求項１０４～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記細胞が、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、及び血小板から選択される、請求項１０４～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び自然リンパ球から選択される、請求項１０４～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１０４～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記対象が、造血幹細胞移植を受けたことがある、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記外因性作用因子が、タンパク質または核酸であり、任意選択で、前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１０５～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記外因性作用因子が、前記対象における疾患もしくは病態を治療するための治療用物質であるか、またはそれをコードする、請求項１０５～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記外因性作用因子が、前記対象における疾患もしくは病態に関連する抗原を標的とするための膜タンパク質、任意選択でキメラ抗原受容体であるか、またはそれをコードする、請求項１０５～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記外因性作用因子が、前記対象における遺伝子欠損を修正するための遺伝子治療に使用するためのものであるか、または欠損もしくは欠失している遺伝子を置換する、請求項１０５～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記対象がヒト対象である、請求項１０４～１１９のいずれか一項に記載の方法。
JP2023573116A 2021-05-28 2022-05-27 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、ならびに関連する方法及び使用 Pending JP2024521811A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163194880P 2021-05-28 2021-05-28
US63/194,880 2021-05-28
PCT/US2022/031459 WO2022251712A1 (en) 2021-05-28 2022-05-27 Lipid particles containing a truncated baboon endogenous retrovirus (baev) envelope glycoprotein and related methods and uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024521811A true JP2024521811A (ja) 2024-06-04

Family

ID=82851603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023573116A Pending JP2024521811A (ja) 2021-05-28 2022-05-27 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、ならびに関連する方法及び使用

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4347620A1 (ja)
JP (1) JP2024521811A (ja)
CN (1) CN117642420A (ja)
AU (1) AU2022280957A1 (ja)
CA (1) CA3219487A1 (ja)
IL (1) IL308836A (ja)
WO (1) WO2022251712A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023133595A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024081820A1 (en) * 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
WO1998017815A1 (en) 1996-10-17 1998-04-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral vectors
GB9720465D0 (en) 1997-09-25 1997-11-26 Oxford Biomedica Ltd Dual-virus vectors
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
CN1322137C (zh) 1997-12-22 2007-06-20 牛津生物医学（英国）有限公司 基于马传染性贫血病毒(eiav)的逆转录病毒载体
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
JP5878126B2 (ja) 2009-11-13 2016-03-08 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 工学操作された微小胞を用いての直接的なタンパク質の送達
KR20230133410A (ko) 2010-12-09 2023-09-19 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도
EP2756521A4 (en) 2011-09-16 2015-04-22 Univ Pennsylvania RNA-MANIPULATED T-CELLS FOR THE TREATMENT OF CANCER
CN104080917B (zh) * 2011-09-29 2016-11-02 国家健康与医学研究院 用突变体BaEV糖蛋白假型化的慢病毒载体
EP3971286A3 (en) 2012-03-26 2022-04-20 The Regents of the University of California Nipah virus envelope pseudotyped lentiviruses and methods of use
WO2014076137A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Lötvall Jan Delivery of therapeutic agent
EP2990416B1 (en) 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
WO2016077639A2 (en) 2014-11-12 2016-05-19 VL27, Inc. Nanovesicular therapies
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
DK3320099T3 (da) * 2015-07-09 2023-12-11 Inst Nat Sante Rech Med Membranforankret eller udskilt antistof til ekspression af lentivirale vektorer
EP3355937A4 (en) 2015-09-28 2019-04-17 Regents of the University of Minnesota CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) T CELLS AS THERAPEUTIC INTERVENTIONS AT AUTO AND ALLO IMMUNITY
WO2017058753A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Trustees Of Dartmouth College Chimeric antigen receptor, regulatory cells and methods of use
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
US11903974B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from cultured cells
KR20180122433A (ko) 2016-03-15 2018-11-12 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 치료용 막 소포
EP3235908A1 (en) 2016-04-21 2017-10-25 Ecole Normale Superieure De Lyon Methods for selectively modulating the activity of distinct subtypes of cells
MX2019013312A (es) 2017-05-08 2020-08-17 Flagship Pioneering Innovations V Inc Composiciones para facilitar la fusion de membranas y usos de estas.
WO2019005886A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-CYTIDINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED EDITING OF NUCLEIC ACIDS
WO2019005884A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-ADENINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION
CN111655292A (zh) 2017-12-07 2020-09-11 旗舰先锋创新V股份有限公司 细胞生物制品及其治疗用途
US20210071163A1 (en) 2017-12-22 2021-03-11 The Broad Institute, Inc. Cas12b systems, methods, and compositions for targeted rna base editing
EP3728588A4 (en) 2017-12-22 2022-03-09 The Broad Institute, Inc. CAS12A SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED RNA BASE EDITING
US20230193242A1 (en) 2017-12-22 2023-06-22 The Broad Institute, Inc. Cas12b systems, methods, and compositions for targeted dna base editing
WO2019157319A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Devices and methods for delivering material into a biological tissue or cell
WO2019161281A1 (en) 2018-02-17 2019-08-22 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions and methods for membrane protein delivery
AU2019269593A1 (en) 2018-05-15 2020-11-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions and uses thereof
WO2020014209A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions and uses thereof
EP3850088A4 (en) 2018-09-07 2023-07-19 Beam Therapeutics, Inc. BASIC EDITION ENHANCEMENT COMPOSITIONS AND METHODS
SG11202105085QA (en) 2018-11-14 2021-06-29 Flagship Pioneering Innovations V Inc Compositions and methods for compartment-specific cargo delivery
AU2019378881A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions for CNS delivery
AU2019378883A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions for T cell delivery
AU2019380517A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions for hematopoietic stem cell delivery
WO2020181178A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through thymine alkylation
WO2020181193A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenosine methylation
WO2020181195A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenine excision
WO2020181202A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to t:a base editing through adenine deamination and oxidation
EP3942040A1 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP3956349A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
EP4100519A2 (en) 2020-02-05 2022-12-14 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors and uses thereof
MX2022014008A (es) 2020-05-08 2023-02-09 Broad Inst Inc Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo.
EP4217490A2 (en) 2020-09-24 2023-08-02 The Broad Institute Inc. Prime editing guide rnas, compositions thereof, and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
IL308836A (en) 2024-01-01
CA3219487A1 (en) 2022-12-01
WO2022251712A1 (en) 2022-12-01
EP4347620A1 (en) 2024-04-10
AU2022280957A1 (en) 2023-11-30
AU2022280957A9 (en) 2023-12-07
CN117642420A (zh) 2024-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230043255A1 (en) Fusosome compositions for t cell delivery
JP2021523724A (ja) フソソーム組成物およびその使用
US20220241328A1 (en) Use of cd8-targeted viral vectors
US20210353543A1 (en) Targeted lipid particles and compositions and uses thereof
JP2024521811A (ja) 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、ならびに関連する方法及び使用
WO2023115041A1 (en) Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
CA3120103A1 (en) Fusosome compositions for t cell delivery
KR20230044420A (ko) 바이러스 푸소좀을 생산하기 위한 방법 및 조성물
CA3152525A1 (en) Cd24-associated particles and related methods and uses thereof
WO2023115039A2 (en) Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
WO2024081820A1 (en) Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2023150518A1 (en) Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2024044655A1 (en) Delivery of heterologous proteins
WO2024119157A1 (en) Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
WO2024064838A1 (en) Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
CN117098849A (zh) 靶向cd8的病毒载体的用途

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20231129