CN117098849A

CN117098849A - 靶向cd8的病毒载体的用途

Info

Publication number: CN117098849A
Application number: CN202280019634.4A
Authority: CN
Inventors: J·V·沙阿; C·班多罗; P·克鲁伊特; K·埃尔派克; A·O·伊曼纽尔; L·P·麦肯齐; K·M·特鲁多
Original assignee: Sana'a Biotechnology Co
Current assignee: Sana'a Biotechnology Co
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-11-21

Abstract

本文提供了使用靶向CD8的病毒载体转导静息或未活化的T细胞的方法。

Description

靶向CD8的病毒载体的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年1月11日提交的标题为“USE OF CD8-TARGETED VIRALVECTORS”的美国临时申请号63/136,202、2021年2月17日提交的标题为“USE OF CD8-TARGETED VIRAL VECTORS”的美国临时申请号63/150,498、2021年3月30日提交的标题为“USE OF CD8-TARGETED VIRAL VECTORS”的美国临时申请号63/168,235和2021年6月17日提交的标题为“USE OF CD8-TARGETED VIRAL VECTORS”的美国临时申请号63/211,947的优先权，这些临时申请的内容全文以引用方式并入用于所有目的。

序列表以引用方式并入

本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表以2022年1月10日创建的标题为186152004640SeqList.TXT的文件形式提供，大小为318,898字节。序列表电子格式中的信息以引用方式整体并入。

技术领域

本公开涉及使用靶向CD8的病毒载体转导静息或未活化的T细胞的方法。

背景技术

病毒载体，包括慢病毒载体，通常用于将外源试剂递送至细胞。然而，将病毒载体转导至某些靶细胞可能具有挑战性。需要改进的病毒载体，包括慢病毒载体，用于靶向所需细胞和改进递送的方法。所提供的公开内容解决了这种需要。

发明内容

本申请尤其基于令人惊讶的发现，即使用靶向CD8的病毒载体可以在体外和体内有效地转导静息或未活化的T细胞。

本文提供了一种转导T细胞的方法，该方法包括使未活化的T细胞与包含CD8结合剂的慢病毒载体接触，其中该慢病毒载体转导未活化的T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方案中，未活化的T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性。

在一些实施方案中，未活化的T细胞尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)处理。在一些实施方案中，未活化的T细胞尚未用抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。在一些实施方案中，未活化的T细胞尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)或抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。在一些实施方案中，未活化的T细胞尚未用与抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体(例如CD28.2)偶联的珠处理，任选地其中该珠是超顺磁珠。在一些实施方案中，该珠是超顺磁珠。在一些实施方案中，未活化的T细胞尚未用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)处理，任选地其中T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在一些实施方案中，未活化的T细胞尚未用可溶性T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体或可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD137L或可溶性ICOS-L)处理。

在任何提供的实施方案中的一些中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原。在一些实施方案中，工程化受体是工程化T细胞受体(eTCR)。在一些实施方案中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含CD3ζ信号传导结构域和共刺激信号传导结构域的细胞内组分的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是4-1BB信号传导结构域。在一些实施方案中，4-1BB信号传导结构域包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100中所示的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:94、95和96中任一个所示的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:94中所示的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:95中所示的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:96中所示的序列。在一些实施方案中，CAR包含铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:88、89、90、91、92、93和180中任一个所示的序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:88中所示的序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:89中所示的序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:90中所示的序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQID NO:91中所示的序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:92中所示的序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:93中所示的序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:180中所示的序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域结合选自由CD19、CD20、CD22和BCMA组成的组的抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合CD19。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:108、109和110中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:103、104和105中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:102中所示的氨基酸序列的VL区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:101中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQID NO:111中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:115中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:117中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:119中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含由SEQ ID NO:112中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含由SEQ ID NO:114中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含由SEQ ID NO:116中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含由SEQ ID NO:118中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域结合CD20。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:126、127和182中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:122、123和124中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:125中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:121中所示的氨基酸序列的VL区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:120中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域结合CD22。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:130、131和132中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:134、135和136中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:139、140和142中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:143、144和145中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQID NO:129中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:133中所示的氨基酸序列的VL区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:138中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:142中所示的氨基酸序列的VL区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:128中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ IDNO:137中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域结合BCMA。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:152、152和154中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:148、149和150中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:161、162和163中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:157、158和159中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:165、166和167中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:174、175和176中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及包含SEQ ID NO:170、171和172中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:151中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:147中所示的氨基酸序列的VL区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:160中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:156中所示的氨基酸序列的VL区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQ IDNO:173中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:169中所示的氨基酸序列的VL区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:164中所示的氨基酸序列的VH区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:146中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:155中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:168中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQID NO:178中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含由SEQ ID NO:177中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含：(i)抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含SEQ IDNO:102中所示的VL区、包含SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的接头和SEQ ID NO:107中所示的VH区；和/或SEQ ID NO:101中所示的scFv；(ii)包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列的铰链；(iii)包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列的跨膜结构域；(iv)包含SEQ IDNO:97中所示的氨基酸序列的4-1BB信号传导结构域；以及(v)包含SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR由SEQ ID NO:112中所示的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，未活化的T细胞是人T细胞。

在一些实施方案中，未活化的T细胞在受试者中。在一些实施方案中，未活化的T细胞是在体外的。在一些实施方案中，未活化的T细胞是来自受试者的离体的。在所提供的方法的一些实施方案中，在接触之前，受试者尚未被施用T细胞活化治疗。

在一些实施方案中，本文提供的任何方法都是在体内进行的。在一些实施方案中，本文提供的任何方法都不是离体的或不是体外的。

在所提供的方法的任何实施方案中的一些中，受试者患有疾病或疾患，诸如癌症。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原，任选地其中工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，工程化受体是工程化T细胞受体(TCR)。

在任何所提供的方法中的一些中，该方法还包括编辑T细胞以使B2M、CIITA、TRAC和TRB基因中的一种或多种失活。在一些实施方案中，编辑T细胞以使B2M、CIITA和TRAC基因失活。在任何所提供的方法中的一些中，该方法还包括在确定的基因座处插入编码CD47的基因。在一些实施方案中，该确定的基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港基因座组成的组。在一些实施方案中，安全港基因座选自由AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座组成的组。

本文还提供了一种通过任何所提供的方法产生的转导的T细胞。在一些实施方案中，T细胞在一种或多种基因的两个等位基因处失活。本文还提供了一种包含所提供的转导的T细胞的组合物。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。

本文提供了一种转导T细胞群体的方法，该方法包括：使未活化的T细胞群体与包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物接触，其中该未活化的T细胞群体以至少1％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少5％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少10％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少15％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少20％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少25％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少30％的效率转导。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体以至少35％的效率转导。

在一些实施方案中，未活化的T细胞群体中至少75％的T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性(例如群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的T细胞对于T细胞活化标志物呈表面阴性)。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体包含CD8+ T细胞(例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的未活化的T细胞群体是CD8+ T细胞)。在一些实施方案中，至少75％的CD8+ T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性(例如群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的CD8+ T细胞对于T细胞活化标志物呈表面阴性)。在一些实施方案中，一种或多种T细胞活化标志物是CD25。在一些实施方案中，一种或多种T细胞活化标志物是CD44。在一些实施方案中，一种或多种T细胞活化标志物是CD69。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体中的CD8+T细胞以至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的效率转导。

在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)处理。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)或抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用与抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体(例如CD28.2)偶联的珠处理，任选地其中该珠是超顺磁珠。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用与抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体(例如CD28.2)偶联的珠处理。在一些实施方案中，该珠是超顺磁珠。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)处理，任选地其中T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)处理。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体尚未用可溶性T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体或可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD137L或可溶性ICOS-L)处理。

在一些实施方案中，未活化的T细胞群体是人细胞。

在一些实施方案中，未活化的T细胞群体在受试者中。在一些实施方案中，在接触之前，受试者尚未被施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体是在体外的。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体是来自受试者的离体的。在一些实施方案中，未活化的T细胞群体包含外周血单核细胞(PBMC)或其包含CD8+ T细胞的亚群。在一些实施方案中，未活化的细胞群体是选自来自受试者的生物样品的富集的T细胞群体，任选地其中T细胞是针对对于T细胞标志物(例如，CD3或CD8)呈表面阳性的T细胞而选择的。在一些实施方案中，未活化的细胞群体是选自来自受试者的生物样品的富集的T细胞群体。在一些实施方案中，T细胞是针对对于T细胞标志物(例如，CD3或CD8)呈表面阳性的T细胞而选择的。在一些实施方案中，T细胞标志物是CD3。在一些实施方案中，T细胞标志物是CD8。在一些实施方案中，生物样品是全血样品、单采样品或白细胞单采样品。在一些实施方案中，生物样品是全血样品。在一些实施方案中，生物样品是单采样品。在一些实施方案中，生物样品是白细胞单采样品。

在一些实施方案中，受试者患有疾病或疾患。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原，任选地其中工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原。在一些实施方案中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，工程化受体是工程化T细胞受体(TCR)。

在任何所提供的方法中的一些中，该方法还包括编辑T细胞或T细胞群体以使B2M、CIITA、TRAC和TRB基因中的一种或多种失活。在任何所提供的方法中的一些中，编辑T细胞群体以使B2M、CIITA和TRAC基因失活。在一些实施方案中，编辑T细胞群体的T细胞以使B2M、CIITA和TRB基因失活。在一些实施方案中，该方法还包括在确定的基因座处插入编码CD47的基因。在一些实施方案中，该确定的基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港基因座组成的组。在一些实施方案中，安全港基因座选自由AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座组成的组。

在任何所提供的方法中的一些中，该方法还包括扩增转导的T细胞群体。在一些实施方案中，扩增包括将转导的细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育，任选地其中T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在一些实施方案中，扩增包括将转导的细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在任何所提供的方法中的一些中，该方法还包括将转导的T细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育，任选地其中T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在任何所提供的方法中的一些中，该方法还包括将转导的T细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

本文还提供了通过任何所提供的方法产生的转导的T细胞群体。在一些实施方案中，未活化的细胞群体中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的细胞在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的未活化的CD8+ T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约1％的未活化的CD8+T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约5％的未活化的CD8+ T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约10％的未活化的CD8+ T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约15％的未活化的CD8+T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约20％的未活化的CD8+ T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约25％的未活化的CD8+ T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约30％的未活化的CD8+ T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体中约35％的未活化的CD8+ T细胞被转导并在一种或多种基因处失活。在一些实施方案中，群体的细胞在一种或多种基因的两个等位基因处失活。

本文还提供了一种包含转导的T细胞群体的组合物，任选地其中该组合物是药物组合物。本文还提供了一种包含转导的T细胞群体的组合物。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。本文还提供了一种包含转导的T细胞群体的药物组合物。本文还提供了一种治疗患有疾病或疾患的受试者的方法，该方法包括向受试者施用任何所提供的包含转导的T细胞群体的组合物。在一些实施方案中，组合物不是皮下(SC)施用的。在一些实施方案中，组合物不是肌内(IM)施用的。在一些实施方案中，组合物是静脉内(IV)施用的。

在任何所提供的组合物中的一些中，组合物还包含冷冻防腐剂(cyropreservant)。在一些实施方案中，冷冻防腐剂是DMSO。

本文提供了一种体内转导T细胞的方法，该方法包括：向受试者施用包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，其中慢病毒载体在受试者中转导T细胞，并且其中受试者在施用该组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。本文还提供了一种体内转导T细胞的方法，该方法包括：向受试者施用所提供的组合物中的任一种，其中慢病毒载体在受试者中转导T细胞，并且其中受试者在施用该组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，受试者患有疾病或疾患。

本文还提供了一种治疗患有疾病或疾患的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，并且其中受试者在施用该组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。本文还提供了一种治疗患有疾病或疾患的受试者的方法，该方法包括向受试者施用所提供的组合物中的任一种，其中受试者在施用该组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，疾病或疾患是癌症。

本文还提供了一种用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的方法，该方法包括：向受试者施用包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，并且其中受试者在施用该组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。本文还提供了一种用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的方法，该方法包括：向受试者施用本文提供的组合物，并且其中受试者在施用该组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。本文还提供了一种用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的方法，该方法包括向受试者施用本文提供的组合物。在一些实施方案中，组合物不是皮下(SC)施用的。在一些实施方案中，组合物不是肌内(IM)施用的。在一些实施方案中，组合物是静脉内(IV)施用的。

本文还提供了包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者的用途。本文还提供了本文提供的组合物用于配制用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者的药物的用途。本文还提供了包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物用于治疗患有疾病或疾患的受试者的用途。本文还提供了本文提供的组合物用于配制用于治疗患有疾病或疾患的受试者的药物的用途。在一些实施方案中，疾病或疾患是癌症。

本文还提供了一种包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，该组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者。本文还提供了一种本文提供的组合物，该组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者。本文还提供了一种包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，该组合物用于治疗患有疾病或疾患的受试者。本文还提供了一种本文提供的组合物，该组合物用于治疗患有疾病或疾患的受试者。在一些实施方案中，疾病或疾患是癌症。

本文还提供了包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物用于配制用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的药物的用途。本文还提供了本文提供的组合物用于配制用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的药物的用途。

本文提供了一种包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，该组合物用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞。本文还提供了一种本文提供的任一种组合物，该组合物用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞。

在任何所提供的实施方案中的一些中，本文提供的用途或使用的组合物用于在施用该组合物时(例如之前、之后或同时)不施用或待施用T细胞活化治疗的受试者。

在任何所提供的方法、本文提供的用途或使用的组合物中的一些中，疾病或疾患是癌症。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别在肿瘤细胞上表达的蛋白质。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原，任选地其中工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，该工程化受体结合或识别在肿瘤细胞上表达的蛋白质，任选地其中工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用可溶性T细胞共刺激分子(例如，抗CD28抗体或重组CD80、CD86、CD137L、ICOS-L)。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)，任选地其中T细胞活化细胞因子是人细胞因子。在任何实施方案中的一些中，T细胞活化治疗包括施用重组IL-7，任选地人IL-7。在任何实施方案中的一些中，T细胞活化治疗包括施用重组IL-7。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用重组人IL-7。在任何实施方案中的一些中，T细胞活化治疗包括施用淋巴细胞清除疗法，任选地施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。在任何实施方案中的一些中，T细胞活化治疗包括施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用环磷酰胺或氟达拉滨。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用环磷酰胺。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用氟达拉滨。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括施用环磷酰胺和氟达拉滨。

在任何所提供的实施方案中的一些中，受试者不同时施用慢病毒载体与T细胞活化治疗。在任何所提供的实施方案中的一些中，在与慢病毒载体接触之前或在施用包含慢病毒载体的组合物之前1个月内受试者未施用T细胞活化治疗。在任何所提供的实施方案中的一些中，在与慢病毒载体接触之前或在施用包含慢病毒载体的组合物之前1周、2周、3周或4周内或1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周时，任选地在1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，受试者未施用T细胞活化治疗。在任何所提供的实施方案中的一些中，在与慢病毒载体接触之前或在施用包含慢病毒载体的组合物之前1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，受试者未施用T细胞活化治疗。在任何所提供的实施方案中的一些中，在与慢病毒载体接触之后或在施用包含慢病毒载体的组合物之后1个月内受试者未施用T细胞活化治疗。在任何所提供的实施方案中的一些中，在与慢病毒载体接触之后或在施用包含慢病毒载体的组合物之后1周、2周、3周或4周内或1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周时，任选地在1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，受试者未施用T细胞活化治疗。在任何所提供的实施方案中的一些中，在与慢病毒载体接触之后或在施用包含慢病毒载体的组合物之后1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，受试者未施用T细胞活化治疗。

在任何所提供的实施方案中的一些中，慢病毒载体不包含或编码T细胞活化剂。在任何所提供的实施方案中的一些中，慢病毒载体不包含或编码膜结合T细胞活化剂。在任何所提供的实施方案中的一些中，慢病毒载体不包含或编码展示在表面上的T细胞活化剂。在任何所提供的实施方案中的一些中，慢病毒载体不包含展示在表面上的T细胞活化剂，诸如其中T细胞活化剂选自由以下组成的组：CD3抗体(例如抗CD3 scFv)；T细胞活化细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21)；或T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体、CD80、CD86、CD137L或ICOS-L)。在一些实施方案中，T细胞活化剂选自由以下组成的组：CD3抗体(例如抗CD3 scFv)；T细胞活化细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21)；以及T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体、CD80、CD86、CD137L或ICOS-L)。在一些实施方案中，T细胞活化剂是能够结合CD3和/或CD28的多肽。在一些实施方案中，T细胞活化剂是能够结合CD3的多肽。在一些实施方案中，T细胞活化剂是能够结合CD28的多肽。在一些实施方案中，T细胞活化剂是淋巴组织增生元件。在一些实施方案中，T细胞活化剂是活化STAT3途径、STAT4途径和/或Jak/STAT5途径的细胞因子或细胞因子受体或其信号传导结构域。在一些实施方案中，T细胞活化剂是T细胞存活基序。在一些实施方案中，T细胞存活基序是IL-7受体、IL-15受体或CD28或其功能部分。在一些实施方案中，T细胞活化剂是微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shrRNA)。在一些实施方案中，miRNA或shRNA刺激STAT5途径。在一些实施方案中，miRNA或shRNA抑制SOCS途径。在一些实施方案中，miRNA或shRNA刺激STAT5途径并抑制SOCS途径。

在一些实施方案中，慢病毒载体不包含或编码抑制性RNA分子。在一些实施方案中，抑制性RNA分子靶向从由T细胞表达的基因转录的mRNA。在一些实施方案中，抑制性RNA分子靶向编码T细胞受体(TCR)组分的基因。在一些实施方案中，基因是PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS1、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、TRAIL2和/或ABCG1。

在一些实施方案中，慢病毒载体包含或编码抑制性RNA分子。在一些实施方案中，抑制性RNA分子靶向从由T细胞表达的基因转录的mRNA。在一些实施方案中，抑制性RNA分子靶向编码T细胞受体(TCR)组分的基因。在一些实施方案中，基因是PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS1、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、TRAIL2和/或ABCG1。

在任何所提供的实施方案中的一些中，CD8结合剂是抗CD8抗体或抗原结合片段。在任何所提供的实施方案中的一些中，抗CD8抗体或抗原结合片段是小鼠、兔、人或人源化的。在一些实施方案中，抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗CD8抗体或抗原结合片段是单结构域抗体。在一些实施方案中，抗CD8抗体或抗原结合片段是骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)抗体或抗原结合片段(例如VHH)。

在任何所提供的实施方案中的一些中，CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。在任何所提供的实施方案中的一些中，CD8结合剂结合CD8α链。在任何所提供的实施方案中的一些中，CD8结合剂结合CD8β链。在任何所提供的实施方案中的一些中，CD8结合剂结合CD8α链和CD8β链。

在任何所提供的实施方案中的一些中，CD8结合剂暴露在慢病毒载体的表面上。在一些实施方案中，CD8结合剂与掺入病毒包膜中的跨膜结构域融合。

在一些实施方案中，慢病毒载体是用病毒融合蛋白假型化的。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是VSV-G蛋白或其功能性变体。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是科卡尔(Cocal)病毒G蛋白或其功能性变体。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是甲病毒属(Alphavirus)融合蛋白(例如辛德比斯病毒)或其功能性变体。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是副粘病毒科(Paramyxoviridae)融合蛋白(例如麻疹病毒属(Morbillivirus)或亨尼帕病毒属(Henipavirus))或其功能性变体。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是麻疹病毒属融合蛋白(例如，麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒、鲸类麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、海豹瘟热病毒、牛瘟病毒)或其功能性变体。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是亨尼帕病毒属融合蛋白(例如，尼帕病毒、亨德拉病毒、雪松病毒、库马西病毒、墨江病毒)或其功能性变体。

在任何所提供的实施方案中的一些中，病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以减少与其天然受体的结合。

在任何所提供的实施方案中的一些中，病毒融合蛋白与CD8结合剂融合。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是或包含尼帕病毒融合蛋白。在一些实施方案中，病毒融合蛋白是尼帕病毒融合蛋白或其功能性变体。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含尼帕病毒F糖蛋白(NiV-F)或其生物活性部分和尼帕病毒G糖蛋白(NiV-G)或其生物活性部分。在一些实施方案中，CD8结合剂与NiV-G或其生物活性部分融合。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含尼帕病毒F糖蛋白(NiV-F)或其生物活性部分和尼帕病毒G糖蛋白(NiV-G)或其生物活性部分，并且其中CD8结合剂与NiV-G或其生物活性部分融合。在一些实施方案中，CD8结合剂与尼帕病毒G糖蛋白或其生物活性部分的C末端融合。在一些实施方案中，CD8结合蛋白直接融合或通过肽接头融合。

在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分是野生型NiV-G蛋白或其功能活性变体或生物活性部分。

在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分是截短的，并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达40个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的5个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5)的N末端处或附近的5个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的10个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:44中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的10个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:44中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的15个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:45中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的15个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:45中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5)的N末端处或附近的20个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的20个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的25个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的25个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:14中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的30个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的30个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短，任选地其中NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分是突变型NiV-G蛋白。在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-G-蛋白或其生物活性部分是表现出与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的结合降低的突变型NiV-G蛋白。在任何所提供的实施方案中的一些中，突变型NiV-G蛋白或生物活性部分包含：与选自由参考SEQ ID NO:4中所示的编号的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的氨基酸取代相对应的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白或生物活性部分具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:17中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白或生物活性部分具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或生物活性部分具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-F蛋白或其生物活性部分是野生型NiV-F蛋白或是其功能活性变体或生物活性部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在野生型NiV-F蛋白(不具有信号序列的SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:40)的C末端处或附近的20个氨基酸截短，任选地其中NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:20中所示的序列，或与SEQ ID NO:20中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:41)的C末端处或附近的20个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:20中所示的序列，或与SEQ ID NO:20中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:20中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-F蛋白或其生物活性部分包含：i)在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:41)的C末端处或附近的20个氨基酸截短；以及ii)在N-连接的糖基化位点上的点突变，任选地其中NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:15中所示的序列，或与SEQ ID NO:15中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-F蛋白或其生物活性部分包含：i)在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:41)的C末端处或附近的20个氨基酸截短；以及ii)在N-连接的糖基化位点上的点突变。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:15中所示的序列，或与SEQ ID NO:15中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:15中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在野生型NiV-F蛋白(不具有信号序列的SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:40)的C末端处或附近的22个氨基酸截短，任选地其中NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQID NO:16或21中所示的序列，或与SEQ ID NO:16或21中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在野生型NiV-F蛋白(不具有信号序列的SEQ ID NO:41或SEQID NO:40)的C末端处或附近的22个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:16或21中所示的序列，或与SEQ ID NO:16或21中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:16中所示的序列，或与SEQ ID NO:16中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:16中所示的序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:21中所示的序列，或与SEQ ID NO:21中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:21中所示的序列。

在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，并且NiV-F蛋白或其生物活性部分包含SEQ ID NO:21中所示的序列。在一些实施方案中，NiV-G蛋白或其生物活性部分由SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列组成，并且NiV-F蛋白或其生物活性部分由SEQ ID NO:21中所示的序列组成。

在任何所提供的实施方案中的一些中，慢病毒载体包含转基因。在一些实施方案中，转基因包含编码能够进行RNA干扰的RNA序列(例如pre-miRNA、siRNA或shRNA)的核酸序列。在一些实施方案中，转基因选自由以下组成的组：治疗性基因、报告基因、编码酶的基因、编码前体药物酶的基因、编码细胞凋亡诱导剂的基因、编码荧光蛋白的基因、编码前体药物活化酶的基因、编码凋亡蛋白的基因、编码凋亡酶的基因、编码自杀蛋白的基因、编码细胞因子的基因、编码抗免疫抑制蛋白的基因、编码表观遗传调节剂的基因、编码T细胞受体(TCR)的基因、编码嵌合抗原受体(CAR)的基因、编码修饰转导细胞的细胞表面的蛋白质的基因、编码修饰内源TCR表达的蛋白质的基因，以及编码将促肿瘤信号转化为抗肿瘤信号的开关受体的基因。在一些实施方案中，转基因编码工程化受体，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞或病灶(例如肿瘤)表达的蛋白质或抗原，任选地其中工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，转基因编码工程化受体，该工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞或病灶(例如肿瘤)表达的蛋白质或抗原。在一些实施方案中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

在一些实施方案中，转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，转基因编码工程化T细胞受体(TCR)。

在一些实施方案中，接触通过使用封闭的流体回路向受试者离体施用慢病毒载体来进行。在一些实施方案中，施用通过使用封闭的流体回路向受试者离体施用慢病毒载体来进行。在一些实施方案中，离体施用包括(a)从受试者获得全血；(b)收集含有包含T细胞(例如CD8+T细胞)的白细胞组分的血液部分；(c)使包含T细胞(例如CD8+ T细胞)的白细胞组分与包含慢病毒载体的组合物接触；以及(d)将接触的包含T细胞(例如CD8+ T细胞)的白细胞组分再输注到受试者中，其中步骤(a)-(d)在封闭的流体回路中串联(in-line)进行。在一些实施方案中，步骤(c)中的接触不超过24小时、不超过18小时、不超过12小时或不超过6小时。

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本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。

附图说明

图1A描绘了注射人外周血单核细胞(hPBMC)(预先用CD3/CD28复合物进行T细胞活化)，并在一天后注射CD8-VHH CD19CAR LV后，Nalm6肿瘤随时间的生长。结果表明，CD8-CD19CAR LV和活化的hPBMC处理导致Nalm6肿瘤生长随时间得到强有力的控制。

图1B描绘了注射未活化的hPBMC(没有预先进行T细胞活化)，并在一天后注射CD8-VHH CD19CAR LV后，Nalm6肿瘤随时间的生长。结果表明，高剂量CD8-VHH CD19CAR LV和未活化的hPBMC处理导致Nalm6肿瘤生长的延迟但强有力的控制。

图1C示出了注射CD8-VHH CD19CAR LV后从脾、骨髓或外周血回收的总活淋巴细胞中CD8⁺CD19CAR⁺细胞的百分比，如PBMC对照(顶部图)和CD8融合体处理的动物(底部图)两者的FAC图的右上限所示。

图2A描绘了用VSV-G假型化的LV或用两种不同的CD8 scFv(CD8 scFv-1和CD8scFV-2)之一或CD8 VHH再靶向的尼帕病毒融合剂(fusogen)转导后，用或不用抗CD3和抗CD28抗体活化的人PBMC的转导效率(％CAR)。

图2B描绘了在用VSV-G假型化的LV或用两种不同的CD8 scFv(CD8 scFv-1和CD8scFV-2)之一或CD8 VHH再靶向的尼帕病毒融合剂转导的情况下，用或不用抗CD3和抗CD28抗体活化，通过转导产生的CD19CAR-T细胞对PBMC中的CD19+细胞的细胞杀伤。

图3描绘了施用用靶向CD8+ T细胞的抗CD8结合蛋白假型化的慢病毒载体以递送CD20 CAR转基因后，非人灵长类动物(NHP)模型中的B细胞水平。

图4A描绘了离体给药研究中不同时间点的肿瘤生长。

图4B示出了在D14时外周血中检测到的CAR+CD8+ T细胞的百分比。

图5描绘了用于离体给药的示例性系统。

I.定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或术语学意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文包括此类定义不应解释为表示与本领域通常理解的含义的显著差异。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语、首字母缩略词和缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，否则化学和生物化学名称的缩写和符号是按照IUPAC-IUB命名法。除非另有说明，否则所有数值范围包括定义所述范围的值以及介于中间的所有整数值。

如本文所用，冠词“一个/一种(a/an)”是指所述冠词的语法对象中的一个/一种或多于一个/多于一种(即，至少一个/至少一种)。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

如本文所用，术语“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且将在其使用的上下文中在一定程度上变化。如本文所用，“约”当指可测量的值诸如量、短暂的持续时间等时，意指涵盖与指定值相差±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、以及还更优选±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所公开的方法。

如本文所用，“融合体”是指含有围绕内腔或空腔的两亲性脂质双层和与两亲性脂质双层相互作用的融合剂的颗粒。在实施方案中，融合体包含核酸。在一些实施方案中，融合体是膜包围的制剂。在一些实施方案中，融合体来源于源细胞。

如本文所用，“融合体组合物”是指包含一种或多种融合体的组合物。

如本文所用，“融合剂”是指在两个膜包围的内腔之间产生相互作用的剂或分子。在实施方案中，融合剂促进膜的融合。在其他实施方案中，融合剂在两个内腔(例如，逆转录病毒载体的内腔和靶细胞的细胞质)之间产生连接，例如小孔。在一些实施方案中，融合剂包含两种或更多种蛋白质的复合物，例如，其中两种蛋白质单独都不具有融合活性。在一些实施方案中，融合剂包含靶向结构域。

如本文所用，“再靶向融合剂”是指包含具有不是融合剂的天然存在形式的一部分的序列的靶向部分的融合剂。在实施方案中，融合剂包含相对于融合剂的天然存在形式中的靶向部分不同的靶向部分。在实施方案中，融合剂的天然存在形式缺乏靶向结构域，并且再靶向融合剂包含融合剂的天然存在形式不存在的靶向部分。在实施方案中，融合剂被修饰以包含靶向部分。在实施方案中，相对于融合剂的天然存在形式，融合剂包含在靶向部分的外侧的一个或多个序列改变，例如在跨膜结构域、融合活性结构域或胞质结构域中。

关于蛋白质的位置的术语“对应于”，诸如叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开的序列(诸如序列表中所示的)中的核苷酸或氨基酸位置，是指基于结构序列比对或使用标准比对算法(诸如GAP算法)与所公开的序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如，相似序列(例如片段或物种变体)的对应残基可以通过结构比对方法与参考序列比对来确定。通过比对序列，本领域技术人员可以鉴定对应的残基，例如，使用保守的和相同的氨基酸残基作为指导。

如本文所用，术语“有效量”意指足以显著且正面地改变待治疗的症状和/或疾患(例如，提供正面临床反应)的药物组合物的量。用于药物组合物的活性成分的有效量将随所治疗的具体疾患、疾患的严重程度、治疗的持续时间、并行疗法的性质、所使用的具体活性成分、所使用的具体药学上可接受的赋形剂和/或载体和主治医师知识和专业知识内的类似因素而变化。

如本文所用，关于病毒载体的“外源试剂”是指既不被相应的野生型病毒或由相应的野生型源细胞制备的融合剂包含也不被编码的试剂。在一些实施方案中，外源性剂不是天然存在的，诸如具有相对于天然存在的蛋白质改变(例如，通过插入、缺失或取代)的序列的蛋白质或核酸。在一些实施方案中，外源性剂不天然存在于源细胞中。在一些实施方案中，外源性剂天然存在于源细胞中，但对于病毒而言是外源的。在一些实施方案中，外源性剂不天然存在于受体细胞中。在一些实施方案中，外源性剂天然存在于受体细胞中，但不以期望的水平或在期望时间存在。在一些实施方案中，外源药剂包含RNA或蛋白质。

如本文所用，“启动子”是指当与基因编码序列可操作地连接时驱动基因转录的顺式调节DNA序列。启动子可包含转录因子结合位点。在一些实施方案中，启动子与基因远端的一个或多个增强子协同工作。

如本文所用，“可操作地连接”或“可操作地缔合”包括指至少两个序列的功能性连接。例如，可操作地连接包括启动子与第二序列之间的连接，其中启动子序列启动并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。可操作地缔合包括诱导或阻抑元件与启动子之间的连接，其中诱导或阻抑元件作为启动子的转录激活因子。

如本文所用，“逆转录病毒核酸”是指含有单独或与辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒组合包装到逆转录病毒或逆转录病毒载体中的至少最小序列要求的核酸。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还包含或编码外源药剂、阳性靶细胞特异性调控元件、非靶细胞特异性调控元件或阴性TCSRE。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含5'LTR(例如，以促进整合)、U3(例如，以激活病毒基因组RNA转录)、R(例如，Tat结合区)、U5、3'LTR(例如，以促进整合)、包装位点(例如，psi(Ψ))、RRE(例如，以结合Rev并促进核输出)中的一个或多个(例如，全部)。逆转录病毒核酸可包含RNA(例如，当为病毒体的一部分时)或DNA(例如，当被引入源细胞中时或在受体细胞中逆转录之后)。在一些实施方案中，使用包含gag、pol和env中的一种或多种(例如，全部)的辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒来包装逆转录病毒核酸。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料(诸如载体或稀释剂)，即，所述材料可以施用于个体而不引起不期望的生物效应或以有害方式与包含其的组合物的任何组分相互作用。

如本文所用，术语“药物组合物”是指本发明的至少一种化合物与其他化学组分(诸如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂)的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。本领域中存在多种施用化合物的技术，包括但不限于静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。

如本文所用，术语“治疗”是指改善疾病或病症，例如减缓或阻止或减少疾病或病症的发展，例如病症的根本原因或其至少一种临床症状。

如本文所用，术语“有效量”和“药学有效量”是指无毒但足以提供所需生物学结果的药剂或药物的量。该结果可以是疾病或病症的体征、症状或病因的减轻和/或缓解，体外或体内系统(包括活生物体)的成像或监测，或生物系统的任何其他所需的改变。在任何单独情况下的适当有效量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。

II.方法

在一些方面，使静息或未活化的T细胞与包含CD8结合剂的病毒载体(例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体)接触。接触可以在体外(例如，用源自健康供体或需要细胞治疗的供体的T细胞)进行或通过向受试者施用病毒载体在体内进行。

在一些实施方案中，不用一种或多种T细胞刺激分子(例如，抗CD-3抗体)、一种或多种T细胞共刺激分子和/或一种或多种T细胞活化细胞因子处理静息或未活化的T细胞。在一些实施方案中，不用一种或多种T细胞刺激分子(例如，抗CD-3抗体)、一种或多种T细胞共刺激分子和/或一种或多种T细胞活化细胞因子中的任一种处理静息或未活化的T细胞。

在另外的方面，本申请包括向受试者施用包含抗CD8结合剂的病毒载体的方法，其中该受试者未施用或尚未施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括一种或多种T细胞刺激分子(例如，抗CD-3抗体)、一种或多种T细胞共刺激分子和/或一种或多种T细胞活化细胞因子。在一些实施方案中，受试者未施用或尚未施用一种或多种T细胞刺激分子(例如，抗CD-3抗体)、一种或多种T细胞共刺激分子和/或一种或多种T细胞活化细胞因子中的任一种。在一些实施方案中，T细胞活化治疗是淋巴细胞清除。在一些实施方案中，受试者未施用或尚未施用淋巴细胞清除疗法。在某些实施方案中，在施用病毒载体之前或之后1个月内，受试者未施用或尚未施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，在施用病毒载体之前1个月内，诸如在施用病毒载体之前4周、3周、2周或1周内或在4周、3周、2周或1周或约4周、3周、2周或1周时，诸如在约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天时，受试者未施用或尚未施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，在施用病毒载体之后1个月内，诸如在施用病毒载体之后4周、3周、2周或1周内或在4周、3周、2周或1周或约4周、3周、2周或1周时，诸如在约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天时，受试者未施用T细胞活化治疗。

在一些方面，病毒载体不包含或编码T细胞活化剂。在一些实施方案中，病毒载体不包含或编码膜结合T细胞活化剂。在一些实施方案中，病毒载体不包含或编码展示在表面上的T细胞活化剂。在一些实施方案中，T细胞活化剂是抗CD3抗体(例如抗CD3 scFv)、T细胞活化细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21)或T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体、CD80、CD86、CD137L或ICOS-L)。在一些实施方案中，T细胞活化剂是能够结合CD3的多肽、能够结合CD28的多肽或两者。在一些方面，病毒载体不包括一种或多种T细胞刺激分子(例如，抗CD-3抗体)、一种或多种T细胞共刺激分子和/或一种或多种T细胞活化细胞因子。

使用抗CD3抗体活化T细胞是众所周知的。抗CD3抗体可以是任何物种的，例如小鼠、兔、人、人源化或骆驼科动物。示例性抗体包括OKT3、CRIS-7、I2C、包含在DYNABEADS人T-激活因子CD3/CD28(Thermo Fisher)中的抗CD3抗体，以及批准的和临床研究的分子的抗CD3结构域，诸如博纳吐单抗、卡妥索单抗、伏妥珠单抗、特利司他单抗、厄妥索单抗、艾可瑞妥单抗、塔奎妥单抗、奥尼妥单抗、西比他单抗(cibistamab)、奥布林达单抗(obrindatamab)、泰妥单抗、度妥昔珠单抗、索利托单抗、埃卢维他单抗(eluvixtamab)、帕武鲁他单抗、特波达单抗(tepoditamab)、维克妥单抗、帕拉莫妥单抗、格菲妥单抗、艾替瑞妥单抗和塔拉妥单抗。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞共刺激分子包括CD28配体(例如，CD80和CD86)；结合CD28诸如CD28.2的抗体；包含在DYNABEADS人T-激活因子CD3/CD28(ThermoFisher)中的抗CD28抗体和US2020/0199234、US2020/0223925、US2020/0181260、US2020/0239576、US2020/0199233、US2019/0389951、US2020/0299388、US2020/0399369和US2020/0140552中公开的抗CD28结构域；CD137配体(CD137L)；抗CD137抗体，诸如乌瑞芦单抗和乌托鲁单抗；ICOS配体(ICOS-L)；以及抗ICOS抗体，诸如菲阿迪利单抗(feladilimab)、沃帕利单抗(vopratlimab)和伊祖拉利单抗(izuralimab)的抗ICOS结构域。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞活化细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、干扰素(例如，干扰素-γ)以及它们的功能性变体和修饰形式。

在一些方面，病毒载体不包含或编码T细胞活化剂。在一些实施方案中，病毒载体不包含或编码膜结合T细胞活化剂。在一些实施方案中，病毒载体不包含或编码展示在表面上的T细胞活化剂。在一些实施方案中，T细胞活化剂是淋巴组织增生元件。在一些实施方案中，淋巴组织增生元件是活化STAT3途径、STAT4途径和/或Jak/STAT5途径的细胞因子或细胞因子受体或其信号传导结构域。在一些实施方案中，淋巴组织增生元件是T细胞存活基序，诸如IL-7受体、IL-15受体或CD28或其功能部分。在一些实施方案中，淋巴组织增生元件是刺激STAT5途径、抑制SOCS途径或两者的微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。

在一些实施方案中，载体不包含或编码抑制性RNA分子。在一些实施方案中，抑制性RNA分子靶向从由T细胞表达的基因、编码T细胞受体(TCR)组分的基因或两者转录的mRNA。在一些实施方案中，基因是PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS1、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、TRAIL2和/或ABCG1。

在一些实施方案中，载体包含或编码抑制性RNA分子。在一些实施方案中，抑制性RNA分子靶向从由T细胞表达的基因、编码T细胞受体(TCR)组分的基因或两者转录的mRNA。在一些实施方案中，基因是PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS1、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、TRAIL2和/或ABCG1。

在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括向受试者施用淋巴细胞清除疗法。淋巴细胞清除可以通过破坏受试者中的淋巴细胞和T细胞的各种治疗来诱导。例如，淋巴细胞清除可以包括清髓性化疗，诸如氟达拉滨、环磷酰胺、苯达莫司汀以及它们的组合。淋巴细胞清除也可以由受试者的辐射(例如，全身辐射)诱导。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法包含环磷酰胺和/或氟达拉滨。在一些实施方案中，该方法还包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。

III.病毒载体

在一些实施方案中，本文公开的病毒载体是逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)。在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何鸟类或哺乳动物细胞来源的逆转录病毒。逆转录病毒通常是双嗜性的，意味着其能够感染几种物种(包括人)的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因取代了逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740)。

慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法在例如Wang等人,J.Immunother.35(9):689-701,2012、Cooper等人,Blood.101:1637–1644,2003、Verhoeyen等人,Methods MolBiol.506:97-114,2009和Cavalieri等人,Blood.102(2):497-505,2003中进行了描述。

在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如，全部)：5'启动子(例如，用于控制整个包装的RNA的表达)、5'LTR(例如，其包括R(聚腺苷酸化尾信号)和/或包括引物活化信号的U5)、引物结合位点、psi包装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其他外源药剂元件)、多嘌呤区和3'LTR(例如，其包括突变的U3、R和U5)。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还包含cPPT、WPRE和/或绝缘子元件中的一种或多种。

逆转录病毒通常通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中来复制。适用于特定的实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗瑞德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。

在一些实施方案中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是δ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是慢病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是泡沫逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是内源性逆转录病毒。

例示性的慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维士那-梅地病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施方案中，使用基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)。在一些实施方案中，病毒颗粒源自慢病毒。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒是人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)。

在一些实施方案中，病毒载体诸如逆转录病毒或慢病毒载体包含gag多蛋白、聚合酶(例如，pol)、整合酶(例如，功能性或非功能性变体)、蛋白酶和融合剂中的一种或多种。在一些实施方案中，载体还包含rev。在一些实施方案中，一种或多种前述蛋白质在逆转录病毒基因组中编码，并且在一些实施方案中，一种或多种前述蛋白质例如由辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒以反式提供。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含一种或多种以下核酸序列：5'LTR(例如，包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、与有效负载基因可操作地连接的中央多嘌呤区(cPPT)启动子、有效负载基因(任选地包含在开放阅读框之前的内含子)、聚A尾序列、WPRE和3'LTR(例如，包含U5并且缺乏功能性U3)。在一些实施方案中，非逆转录病毒核酸还包含一种或多种绝缘子元件。在一些实施方案中，识别位点位于聚A尾序列与WPRE之间。

1.转移载体

在一些实施方案中，病毒载体包含包括病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，所述病毒来源的核酸元件通常促进核酸分子的转移或整合到细胞基因组或介导核酸转移的病毒颗粒中。在一些方面，载体颗粒通常包括各种病毒组分，有时除核酸外还包括宿主细胞组分。在一些实施方案中，载体包含例如能够将核酸转移到细胞中或转移到转移的核酸(例如，作为裸mRNA)的病毒或病毒颗粒。在一些实施方案中，病毒载体和转移质粒包含主要源自病毒的结构和/或功能遗传元件。逆转录病毒载体可包含病毒载体或质粒，其含有主要源自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分。慢病毒载体可包含含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒，包括主要源自慢病毒的LTR。

在实施方案中，慢病毒载体(例如慢病毒表达载体)可包含慢病毒转移质粒(例如作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等元件，应理解这些元件的序列可以在慢病毒颗粒中以RNA形式存在，并且可以在DNA质粒中以DNA形式存在。

在一些实施方案中，在本文所述的载体中，与对应的野生型病毒相比，可能不存在有助于复制或为复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分。在一些实施方案中，病毒载体是复制缺陷型的。在一些实施方案中，载体能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。

在一些实施方案中，野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR，在它们之间或在它们内定位有使得基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合到宿主细胞基因组中的整合位点、以及编码促进病毒颗粒组装的包装组分的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有附加的特征，诸如HIV中的rev和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA转录物能够从感染靶细胞的细胞核有效输出到细胞质。在原病毒中，病毒基因在两个末端侧接称为长末端重复序列(LTR)的区域。在一些实施方案中，LTR参与原病毒整合和转录。在一些实施方案中，LTR充当增强子-启动子序列并且可以控制病毒基因的表达。在一些实施方案中，逆转录病毒RNA的衣壳化通过位于病毒基因组5'末端的psi序列发生。

在一些实施方案中，LTR是可以分成称为U3、R和U5的三个元件的相似序列。U3源自对RNA的3'末端独特的序列。R源自在RNA两端重复的序列，并且U5源自RNA的5'端特有的序列。这三种元件的尺寸在不同的逆转录病毒中可以有相当大的变化。

在一些实施方案中，对于病毒基因组，转录起始位点通常在一个LTR中的U3与R之间的边界处，而聚(A)添加(终止)位点在另一个LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件，其包括对细胞和在一些情况下病毒转录激活因子蛋白作出应答的启动子和多个增强子序列。在一些实施方案中，逆转录病毒包含编码参与调节基因表达的蛋白质的以下基因中的任何一种或多种：tat、rev、tax和rex。

在一些实施方案中，结构基因包括gag、pol和env，gag编码病毒的内部结构蛋白。在一些实施方案中，Gag蛋白被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。在一些实施方案中，pol基因编码逆转录酶(RT)，其含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关的RNA酶H和整合酶(IN)。在一些实施方案中，env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性地相互作用的复合物。在一些实施方案中，相互作用通过病毒膜与细胞膜的融合促进感染。

在一些实施方案中，复制缺陷逆转录病毒载体基因组gag、pol和env可以不存在或没有功能。在一些实施方案中，RNA两个末端的R区通常是重复序列。在一些实施方案中，U5和U3分别代表RNA基因组的5'和3'末端的独特序列。

在一些实施方案中，逆转录病毒还可以含有编码除gag、pol和env之外的蛋白质的附加基因。附加基因的示例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(尤其)附加基因S2。在一些实施方案中，由附加基因编码的蛋白质具有多种功能，其中一些可以是由细胞蛋白质提供的功能的复制。例如，在EIAV中，tat充当病毒LTR的转录激活因子(Derse和Newbold 1993Virology 194:530-6；Maury等人1994Virology 200:632-42)。其与称为TAR的稳定的茎环RNA二级结构结合。Rev通过rev反应元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(Martarano等人1994J.Virol.68:3102-11)。

在一些实施方案中，除蛋白酶、逆转录酶和整合酶之外，非灵长类慢病毒还含有编码脱氧尿苷三磷酸酶(dUTP酶)的第四pol基因产物。在一些实施方案中，这在这些慢病毒感染某些不分裂或缓慢分裂的细胞类型的能力中起作用。

在实施方案中，重组慢病毒载体(RLV)是具有足够的逆转录病毒遗传信息以允许在包装组分的存在下将RNA基因组包装成能够感染靶细胞的病毒颗粒的载体。在一些实施方案中，靶细胞的感染可包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，RLV通常携带将由载体递送至靶细胞的非病毒编码序列。在一些实施方案中，RLV不能独立复制以在靶细胞内产生感染性逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，RLV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或参与复制的其他基因。在一些实施方案中，载体可以被配置为分裂内含子载体，例如，如PCT专利申请WO 99/15683中所述，该专利申请以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，慢病毒载体包含最小的病毒基因组，例如，病毒载体已被操纵以除去非必需元件并保留必需元件，从而提供感染、转导和递送感兴趣的核苷酸序列至靶宿主细胞所需的功能，例如，如WO 98/17815中所述，该专利以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，最小慢病毒基因组可包含例如(5')R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3')。在一些实施方案中，用于在源细胞内产生慢病毒基因组的质粒载体还可包括可操作地连接到慢病毒基因组以指导基因组在源细胞中转录的转录调节控制序列。在一些实施方案中，调节序列可包含与转录的逆转录病毒序列相关的天然序列，例如5'U3区，或者它们可包含异源启动子，诸如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。在一些实施方案中，慢病毒基因组包含附加序列以促进有效的病毒产生。在一些实施方案中，在HIV的情况下，可包括rev和RRE序列。在一些实施方案中，可替代地或组合地，可以使用密码子优化，例如，编码外源性剂的基因可以是密码子优化的，例如，如WO 01/79518中所述，该专利以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，也可以使用执行与rev/RRE系统相似或相同功能的替代序列。在一些实施方案中，在Mason Pfizer猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能类似物。在一些实施方案中，这被称为CTE并且包含在基因组中的据信与感染细胞中的因子相互作用的RRE型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。在一些实施方案中，CTE可以用作rev/RRE系统的替代物。在一些实施方案中，HTLV-I的Rex蛋白质可以在功能上替代HIV-I的Rev蛋白质。Rev和Rex具有与IRE-BP相似的效应。

在一些实施方案中，逆转录病毒核酸(例如慢病毒核酸，例如灵长类或非灵长类慢病毒核酸)(1)包含缺失的gag基因，其中gag中的缺失除去了gag编码序列的约核苷酸350或354下游的一个或多个核苷酸；(2)在所述逆转录病毒核酸中不存在一个或多个辅助基因；(3)缺乏tat基因但包含位于5'LTR的末端与gag的ATG之间的前导序列；和(4)(1)、(2)和(3)的组合。在一个实施方案中，慢病毒载体包含所有特征(1)和(2)和(3)。在WO 99/32646中更详细地描述了这种策略，该专利以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，灵长类慢病毒最小系统不需要HIV/SIV附加基因vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef用于载体产生或用于转导分裂和非分裂细胞。在一些实施方案中，EIAV最小载体系统不需要S2用于载体产生或用于转导分裂和非分裂细胞。

在一些实施方案中，附加基因的缺失可以允许产生没有与慢病毒(例如HIV)感染中的疾病相关的基因的载体。在一些实施方案中，tat与疾病相关。在一些实施方案中，附加基因的缺失允许载体包装更多的异源DNA。在一些实施方案中，可以省略功能未知的基因，诸如S2，从而降低引起不希望的效应的风险。最小慢病毒载体的示例公开于WO 99/32646和WO 98/17815中。

在一些实施方案中，逆转录病毒核酸至少缺乏tat和S2(如果其是EIAV载体系统)，也可能缺乏vif、vpr、vpx、vpu和nef。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还缺乏rev、RRE或两者。

在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含vpx。Vpx多肽结合并诱导SAMHD1限制因子的降解，所述SAMHD1限制因子降解细胞质中的游离dNTP。在一些实施方案中，游离dNTP在细胞质中的浓度随着Vpx降解SAMHD1而增加并且逆转录活性增加，因此促进逆转录病毒基因组的逆转录和整合到靶细胞基因组中。

在一些实施方案中，不同的细胞在它们对特定密码子的使用方面不同。在一些实施方案中，此密码子偏倚对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度的偏倚。在一些实施方案中，通过改变序列中的密码子以使它们适合与对应tRNA的相对丰度相匹配，其可能增加表达。在一些实施方案中，有可能通过故意选择已知对应tRNA在特定细胞类型中罕见的密码子来降低表达。在一些实施方案中，附加程度的翻译控制是可用的。密码子优化的另外描述见于例如WO 99/41397中，该专利以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，病毒(包括HIV和其他慢病毒)使用大量罕见密码子，并且通过将这些改变为对应于常用的哺乳动物密码子，可以实现包装组分在哺乳动物生产细胞中的增加的表达。

在一些实施方案中，密码子优化具有许多其他优点。在一些实施方案中，由于它们序列的改变，编码包装组分的核苷酸序列可以从它们中减少或清除RNA不稳定性序列(INS)。同时，保留包装组分的氨基酸序列编码序列，使得由所述序列编码的病毒组分保留相同或至少足够相似，使得包装组分的功能不受损害。在一些实施方案中，密码子优化还克服了输出的Rev/RRE要求，使得优化的序列为Rev非依赖性的。在一些实施方案中，密码子优化还减少了载体系统内不同构建体之间的同源重组(例如在gag-pol和env开放阅读框中重叠的区域之间)。在一些实施方案中，密码子优化导致病毒滴度增加和/或安全性提高。

在一些实施方案中，只有与INS有关的密码子被密码子优化。在其他实施方案中，除了包含gag-pol移码位点的序列外，所述序列全部是密码子优化的。

gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达取决于翻译期间的移码。由于翻译期间核糖体“滑动”而发生这种移码。这种滑动被认为至少部分是由核糖体-停滞RNA二级结构引起的。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于HIV，重叠区从gag起点(其中核苷酸1是gag ATG的A)下游的核苷酸1222延伸到gag的末尾(nt 1503)。因此，跨越移码位点的281bp片段和两个阅读框的重叠区优选不是密码子优化的。在一些实施方案中，保留此片段将能够更有效地表达gag-pol蛋白。对于EIAV，重叠的起点位于nt 1262(其中核苷酸1是gag ATG的A)。重叠的末尾位于nt 1461。为了确保移码位点和gag-pol重叠被保留，可以保留从nt 1156到1465的野生型序列。

在一些实施方案中，例如为了适应方便的限制性位点，可以从最佳密码子使用中进行衍生，并且可以将保守氨基酸改变引入gag-pol蛋白中。

在一些实施方案中，密码子优化是基于哺乳动物系统中具有较差密码子使用的密码子。可以改变第三个碱基，有时也可以改变第二和第三个碱基。

在一些实施方案中，由于遗传密码的简并性，可以理解，技术人员可以获得许多gag-pol序列。此外，描述了许多逆转录病毒变体，它们可以用作产生密码子优化的gag-pol序列的起点。慢病毒基因组可以是相当可变的。例如，存在许多仍有功能的HIV-I的准种类。这也是EIAV的情况。这些变体可以用于增强转导过程的特定部分。HIV-I变体的示例可以在os Alamos国家实验室维护的HIV数据库中找到。EIAV克隆的细节可以在国家卫生研究院(National Institutes of Health)维护的NCBI数据库中找到。

在一些实施方案中，密码子优化的gag-pol序列的策略可用于任何逆转录病毒，例如EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。此外，此方法可以用于增加来自HTLV-I、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源性逆转录病毒(HERV)、MLV和其他逆转录病毒的基因的表达。

在实施方案中，逆转录病毒载体包含包装信号，所述包装信号在仍保留env序列的载体中包含gag的255至360个核苷酸，或在剪接供体突变gag和env缺失的特定组合中包含gag的约40个核苷酸。在一些实施方案中，逆转录病毒载体包括包含一个或多个缺失的gag序列，例如所述gag序列包含可从N末端衍生的约360个核苷酸。

在一些实施方案中，逆转录病毒载体、辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒可包含逆转录病毒结构蛋白和辅助蛋白，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef蛋白或其他逆转录病毒蛋白。在一些实施方案中，逆转录病毒蛋白源自相同的逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒蛋白源自多于一种逆转录病毒，例如2种、3种、4种或更多种逆转录病毒。

在一些实施方案中，gag和pol编码序列通常在天然慢病毒中被组织为Gag-Pol前体。gag序列编码55-kD Gag前体蛋白，也称为p55。p55在成熟过程期间被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)切割成四种较小的蛋白质，命名为MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6。pol前体蛋白被病毒编码的蛋白酶从Gag上切割开，并进一步消化以分离蛋白酶(p10)、RT(p50)、RNA酶H(p15)和整合酶(p31)活性。

在一些实施方案中，慢病毒载体是整合缺陷的。在一些实施方案中，pol是整合酶缺陷的，诸如由于整合酶基因中的突变而编码。例如，pol编码序列可以含有整合酶中的失活突变，诸如通过突变参与催化活性的一个或多个氨基酸，即突变天冬氨酸64、天冬氨酸116和/或谷氨酸152中的一个或多个。在一些实施方案中，整合酶突变是D64V突变。在一些实施方案中，整合酶中的突变允许将病毒RNA包装成慢病毒。在一些实施方案中，整合酶中的突变允许将病毒蛋白包装成慢病毒。在一些实施方案中，整合酶中的突变降低了插入诱变的可能性。在一些实施方案中，整合酶中的突变降低了产生具有复制能力的重组体(RCR)的可能性(Wanisch等人2009.Mol Ther.1798):1316-1332)。在一些实施方案中，天然Gag-Pol序列可以用于辅助载体(例如辅助质粒或辅助病毒)，或者可以进行修饰。这些修饰包括嵌合Gag-Pol，其中Gag和Pol序列获自不同的病毒(例如不同的物种、亚种、病毒株、分化体等)，和/或其中所述序列已被修饰以改善转录和/或翻译和/或减少重组。

在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包括编码gag蛋白的150-250个(例如168个)核苷酸部分的多核苷酸，所述多核苷酸(i)包括相对于野生型INS1减少RNA核输出限制的突变INS1抑制序列，(ii)含有导致移码和提前终止的两个核苷酸插入，和/或(iii)不包括gag的INS2、INS3和INS4抑制序列。

在一些实施方案中，本文所述的载体是包含逆转录病毒(例如慢病毒)序列和非慢病毒病毒序列的杂合载体。在一些实施方案中，杂合载体包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列。

在一些实施方案中，大部分或全部病毒载体骨架序列源自慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解，可以使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，并且可以容纳某些慢病毒序列中的许多取代和改变而不损害转移载体执行本文所述的功能的能力。Naldini等人,(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号和第5,994,136号中描述了多种慢病毒载体，其中许多可以适于产生逆转录病毒核酸。

在一些实施方案中，在原病毒的每个末端，通常发现长末端重复序列(LTR)。LTR通常包含位于逆转录病毒核酸末端的结构域，在其天然序列背景下其是正向重复序列并且含有U3、R和U5区。LTR通常促进逆转录病毒基因的表达(例如，基因转录物的促进、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制。LTR可包含许多调节信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号和用于病毒基因组复制和整合的序列。病毒LTR通常分为三个区域，称为U3、R和U5。U3区通常含有增强子和启动子元件。U5区通常是在引物结合位点与R区之间的序列，并且可以含有聚腺苷酸化序列。R(重复)区可以侧接U3和U5区。LTR通常由U3、R和U5区构成并且可以出现在病毒基因组的5'和3'末端。在一些实施方案中，与5'LTR相邻的是用于逆转录基因组(tRNA引物结合位点)和用于将病毒RNA有效包装成颗粒(Psi位点)的序列。

在一些实施方案中，包装信号可包含位于逆转录病毒基因组内介导病毒RNA插入到病毒衣壳或颗粒中的序列，参见例如Clever等人,1995.J.of Virology,第69卷第4期；第2101-2109页。几种逆转录病毒载体使用最小包装信号(psi[Ψ]序列)用于病毒基因组的衣壳化。

在各种实施方案中，逆转录病毒核酸包含经修饰的5'LTR和/或3'LTR。LTR中的任一个或两个可包含一个或多个修饰，包括但不限于一个或多个缺失、插入或取代。通常对3'LTR进行修饰以通过使病毒成为复制缺陷的(例如不能完全、有效地复制从而不产生感染性病毒体的病毒(例如复制缺陷慢病毒子代))来改善慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。

在一些实施方案中，载体是自我失活(SIN)载体，例如复制缺陷载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中右(3')LTR增强子-启动子区(称为U3区)已被修饰(例如通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。这是因为在病毒复制期间右(3')LTR U3区可以用作左(5')LTR U3区的模板，并且因此不存在U3增强子-启动子会抑制病毒复制。在实施方案中，3'LTR被修饰使得U5区被除去、改变或例如被外源聚(A)序列替换。3'LTR、5'LTR或3'和5'LTR两者可以是经修饰的LTR。

在一些实施方案中，5'LTR的U3区被异源启动子替换以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的示例包括例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。在一些实施方案中，启动子能够以Tat非依赖性方式驱动高水平的转录。在某些实施方案中，异源启动子在控制病毒基因组转录的方式方面具有附加的优点。例如，异源启动子可以是诱导型的，使得只有当存在诱导因子时才发生全部或部分病毒基因组的转录。诱导因子包括但不限于一种或多种化学化合物或培养宿主细胞的生理条件诸如温度或pH。

在一些实施方案中，病毒载体包含TAR(反式激活反应)元件，例如位于慢病毒(例如HIV)LTR的R区中。此元件与慢病毒反式激活因子(tat)遗传元件相互作用以增强病毒复制。然而，例如在其中5'LTR的U3区被异源启动子替换的实施方案中，此元件不是必需的。

在一些实施方案中，R区(例如逆转录病毒LTR内起始于封端基团的起点(即转录的起点)并紧接在多聚A片段的起点之前终止的区域)可以侧接U3和U5区。R区在将新生DNA从基因组的一端转移到另一端的逆转录期间起作用。

在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还可包含FLAP元件，例如其序列包括逆转录病毒(例如HIV-1或HIV-2)的中央多嘌呤区和中央终止序列(cPPT和CTS)的核酸。合适的FLAP元件在美国专利第6,682,907号中和在Zennou等人,2000,Cell,101:173中有所描述，该文献以引用方式整体并入本文。在HIV-1逆转录期间，正链DNA在中央多嘌呤区(cPPT)的中央起始和在中央终止序列(CTS)的中央终止可以导致三链DNA结构的形成：HIV-1中央DNA瓣。在一些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体骨架包含在编码外源性剂的基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。例如，在一些实施方案中，转移质粒包括FLAP元件，例如源自或分离自HIV-1的FLAP元件。

在实施方案中，逆转录病毒或慢病毒核酸包含一个或多个输出元件，例如调节将RNA转录物从细胞核转运到细胞质的顺式作用转录后调控元件。RNA输出元件的示例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)(参见例如Cullen等人,1991.J.Virol.65:1053；以及Cullen等人,1991.Cell 58:423)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)，这些文献以引用方式整体并入本文。通常，将RNA输出元件置于基因的3'UTR内，并且可以作为一个或多个拷贝插入。

在一些实施方案中，通过将转录后调控元件、聚腺苷酸化位点和转录终止信号中的一个或多个(例如，全部)掺入载体中来增加异源序列的表达。多种转录后调控元件可以增加异源核酸表达于蛋白质，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等人,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒(HPRE)中的转录后调控元件(Huang等人,Mol.Cell.Biol.,5:3864)；等等(Liu等人,1995,Genes Dev.,9:1766)，这些文献中的每一篇以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒核酸包含转录后调控元件诸如WPRE或HPRE。

在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒核酸缺乏或不包含转录后调控元件诸如WPRE或HPRE。

在一些实施方案中，可包括指导异源核酸转录物终止和聚腺苷酸化的元件，例如以增加外源性剂的表达。可以在聚腺苷酸化信号的下游发现转录终止信号。在一些实施方案中，载体包含编码外源性剂的多核苷酸3'的聚腺苷酸化序列。polyA位点可包含指导RNA聚合酶II终止和聚腺苷酸化新生RNA转录物的DNA序列。聚腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3'末端添加polyA尾来促进mRNA稳定性，并且因此有助于增加翻译效率。可以用于逆转录病毒核酸中的polyA信号的例示性示例包括AATAAA、ATTAAA、AGTAAA、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β珠蛋白polyA序列(rβgpA)或另一种合适的异源或内源polyA序列。

在一些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件，例如本文所述的绝缘子元件。

在各种实施方案中，载体包含与编码外源性剂的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一个LTR包含一个或多个修饰，诸如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体还可包含一个或多个增加转导效率的辅助元件(例如cPPT/FLAP)、病毒包装(例如Psi(Ψ)包装信号，RRE)和/或增加外源基因表达的其他元件(例如聚(A)序列)，并且可以包含WPRE或HPRE。

在一些实施方案中，慢病毒核酸例如从5'至3'包含以下中的一种或多种(例如全部)：启动子(例如CMV)、R序列(例如包含TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚化)、psi包装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源性剂表达的启动子、编码外源性剂的基因、WPRE序列(例如，用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如，用于逆转录)、R序列(例如，用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如，用于整合)。

一些慢病毒载体整合在活性基因内部，并具有强剪接和聚腺苷酸化信号，这可导致异常和可能截短的转录物的形成。

原癌基因活化机制可能涉及嵌合转录物的产生，所述嵌合转录物源自插入诱变剂基因组中含有的启动子元件或剪接位点与整合所靶向的细胞转录单位的相互作用(Gabriel等人2009.Nat Med 15:1431-1436；Bokhoven等人J Virol 83:283-29)。包含载体序列和细胞mRNA的嵌合融合转录物可以通过从载体序列开始并进入侧翼细胞基因(或反之亦然)的通读转录来产生。

在一些实施方案中，本文所述的慢病毒核酸包含慢病毒骨架，其中至少两个剪接位点已被消除，例如以改善慢病毒载体的安全性。此类剪接位点的种类和鉴定方法在WO2012156839A2中有所描述，所有所述专利都以引用方式纳入本文。

2.包装载体

大规模载体颗粒生产通常有助于获得所需浓度的载体颗粒。可以通过将转移载体转染到包装细胞系中来产生颗粒，所述包装细胞系包含病毒结构和/或辅助基因，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其他逆转录病毒基因。

在一些实施方案中，包装载体是缺乏包装信号的表达载体或病毒载体，并且包含编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的多核苷酸。通常，包装载体包含在生产细胞中，并且通过转染、转导或感染引入细胞中。可以通过转染、转导或感染将逆转录病毒(例如慢病毒)转移载体引入生产细胞系中，以产生源细胞或细胞系。通过标准方法将包装载体引入人细胞或细胞系，所述标准方法包括例如磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔。在一些实施方案中，将包装载体与显性选择标志物诸如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA一起引入细胞中，随后在适当药物的存在下进行选择并分离克隆。选择标记基因可以例如通过IRES或自切割病毒肽与由包装载体编码的基因物理连接。

在一些实施方案中，生产细胞系包括不含有包装信号但稳定或瞬时表达可以包装病毒颗粒的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)的细胞系。可以使用任何合适的细胞系，例如哺乳动物细胞，例如人细胞。可以使用的合适细胞系包括例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在实施方案中，包装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。

在一些实施方案中，源细胞系包括能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，所述细胞系包含生产细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。制备病毒原液的方法由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66:5110-5113描绘，这些文献以引用方式并入本文。可以从生产细胞收集感染性病毒颗粒，例如通过细胞裂解或收集细胞培养物的上清液。可以富集或纯化所收集的病毒颗粒。

在一些实施方案中，源细胞包含一种或多种质粒，所述质粒编码可包装病毒颗粒的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体中的至少两种的序列在相同质粒上。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体的序列在不同的质粒上。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体的序列具有相同的表达信号，例如启动子。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体的序列具有不同的表达信号，例如不同的启动子。在一些实施方案中，gag、pol和env前体的表达是诱导型的。在一些实施方案中，在相同时间或在不同时间转染编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒。在一些实施方案中，在与包装载体相同的时间或不同的时间转染编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒。

在一些实施方案中，源细胞系包含一个或多个稳定整合的病毒结构基因。在一些实施方案中，稳定整合的病毒结构基因的表达是诱导型的。

在一些实施方案中，病毒结构基因的表达在转录水平上受到调节。在一些实施方案中，病毒结构基因的表达在翻译水平上受到调节。在一些实施方案中，病毒结构基因的表达在翻译后水平受到调节。

在一些实施方案中，病毒结构基因的表达受四环素(Tet)依赖性系统调节，其中Tet调节的转录阻遏物(Tet-R)与在启动子中包含的DNA序列结合并且通过空间位阻抑制转录(Yao等人,1998；Jones等人,2005)。在添加多西环素(dox)后，Tet-R被释放，从而允许转录。多种其他合适的转录调节启动子、转录因子和小分子诱导物适合用于调节病毒结构基因的转录。

在一些实施方案中，将在Tet调节的启动子的控制下并与抗生素抗性盒偶联的第三代慢病毒组分、人免疫缺陷病毒1型(HIV)、Rev、Gag/Pol和包膜分别整合到源细胞基因组中。在一些实施方案中，源细胞仅在基因组中整合了一个拷贝的Rev、Gag/Pol和包膜蛋白中的每一种。

在一些实施方案中，编码外源性剂的核酸(例如，编码外源性剂的逆转录病毒核酸)也被整合到源细胞基因组中。

在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒核酸不能进行逆转录。在实施方案中，这样的核酸能够瞬时表达外源性剂。逆转录病毒或VLP可能包含无效的逆转录酶蛋白，或者可能不包含逆转录酶蛋白。在实施方案中，逆转录病毒核酸包含无效的引物结合位点(PBS)和/或att位点。在实施方案中，一种或多种病毒辅助基因(包括rev、tat、vif、nef、vpr、vpu、vpx和S2或其功能等效物)在逆转录病毒核酸中是无效的或缺失的。在实施方案中，选自S2、rev和tat的一个或多个辅助基因在逆转录病毒核酸中是无效的或缺失的。

在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒载体系统包含携带顺式作用载体序列的病毒基因组，该顺式作用载体序列用于将病毒RNA转录、逆转录、整合、翻译和包装到病毒颗粒中，以及(2)生产细胞系，其表达生产病毒颗粒所需的反式作用逆转录病毒基因序列(例如，gag、pol和env)。在一些实施方案中，通过完全分离顺式和反式作用载体序列，病毒无法在超过一个感染周期内维持复制。可以通过许多策略来避免活病毒的产生，例如通过使顺式作用序列和反式作用序列之间的重叠最小化来避免重组。

在一些实施方案中，包含缺乏或缺少病毒RNA的序列的病毒载体颗粒可以是从序列中除去或消除病毒RNA的结果。在一个实施方案中，这可以通过使用gag上的内源性包装信号结合位点来实现。在一些实施方案中，内源性包装信号结合位点是在pol上。在该实施方案中，待递送的RNA将含有同源包装信号。在另一个实施方案中，位于待递送RNA上的异源结合结构域(与gag异源)和位于gag或pol上的同源结合位点可用于确保待递送RNA的包装。在一些实施方案中，异源序列可以是非病毒的，或者也可以是病毒的，在这种情况下，它可以来源于不同的病毒。在一些实施方案中，载体颗粒用于递送治疗性RNA，在这种情况下不需要功能性整合酶和/或逆转录酶。在一些实施方案中，载体颗粒也可用于递送目标治疗性基因，在这种情况下通常包括pol。

在一些实施方案中，gag-pol被改变，并且包装信号被替换为相应的包装信号。在该实施方案中，颗粒可以用新的包装信号包装RNA。这种方法的优点是可以包装不含病毒序列的RNA序列，例如RNAi。

在一些实施方案中，替代方法依赖于待包装RNA的过表达。在一个实施方案中，待包装的RNA在不存在任何含有包装信号的RNA的情况下过量表达。这可能导致大量的治疗性RNA被包装，并且该量足以转导细胞并具有生物学效应。

在一些实施方案中，多核苷酸包含编码病毒gag蛋白或逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，其中gag蛋白或pol蛋白包含能够识别RNA序列中相应序列的异源RNA结合结构域，以便于将RNA序列包装到病毒载体颗粒中。

在一些实施方案中，异源RNA结合结构域包含来源于噬菌体外壳蛋白、Rev蛋白、U1小核核糖核蛋白颗粒蛋白、Nova蛋白、TF111A蛋白、TIS11蛋白、trp RNA结合衰减蛋白(TRAP)或假尿苷合酶的RNA结合结构域。

在一些实施方案中，本文的方法包括检测或确认复制型逆转录病毒的缺失。所述方法可包括评估一种或多种靶基因的RNA水平，所述靶基因例如病毒基因，例如结构基因或包装基因，其基因产物在感染复制型逆转录病毒(例如γ-逆转录病毒或慢病毒)的某些细胞中表达，但不存在于用于转导具有异源核酸的细胞的病毒载体中，并且不存在于和/或表达于或预期不存在于和/或表达于不含有复制型逆转录病毒的细胞中。如果一种或多种靶基因的RNA水平高于参考值，可以确定存在复制型逆转录病毒，所述参考值可以直接或间接例如从含有靶基因的阳性对照样品中测量。对于进一步的公开内容，参见WO2018023094A1。

IV.融合剂

在一些实施方案中，病毒载体包含一种或多种融合剂。在一些实施方案中，融合剂促进病毒载体与膜的融合。在一些实施方案中，膜是浆细胞膜。

在一些实施方案中，包含融合剂的病毒载体整合到膜中，进入靶细胞的脂质双层。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种融合剂可以包含在病毒载体中。

A.蛋白质融合剂

在一些实施方案中，融合剂是蛋白质融合剂，例如哺乳动物蛋白质或哺乳动物蛋白质的同源物(例如，具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)、非哺乳动物蛋白质(诸如病毒蛋白或病毒蛋白的同源物)(例如，具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)、天然蛋白质、天然蛋白质的衍生物、合成蛋白质、其片段、其变体、包含一种或多种融合剂或片段的蛋白融合物以及它们的任何组合。

在一些实施方案中，融合剂导致病毒载体中的脂质与靶细胞中的脂质之间的混合。在一些实施方案中，融合剂导致在病毒载体的内部与靶细胞的胞质溶胶之间形成一个或多个孔。

1.哺乳动物蛋白质

在一些实施方案中，融合剂可以包括哺乳动物蛋白。哺乳动物融合剂的示例可以包括但不限于SNARE家族蛋白诸如vSNARE和tSNARE、合胞素蛋白诸如合胞素-1(DOI:10.1128/JVI.76.13.6442–6452.2002)和合胞素-2、myomaker(biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158,doi.org/10.1101/123158,doi:10.1096/fj.201600945R,doi:10.1038/nature12343)、myomixer(www.nature.com/nature/journal/v499/n7458/full/nature12343.html,doi:10.1038/nature12343)、myomerger(science.sciencemag.org/content/early/2017/04/05/science.aam9361,DOI:10.1126/science.aam9361)、FGFRL1(成纤维细胞生长因子受体样1)、Minion(doi.org/10.1101/122697)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的同种型(例如，如US 6,099,857A中公开的)、间隙连接蛋白诸如连接蛋白43、连接蛋白40、连接蛋白45、连接蛋白32或连接蛋白37(例如，如US 2007/0224176中公开的，Hap2、能够诱导异源细胞之间合胞体形成的任何蛋白质(参见表2)、具有融合剂性质的任何蛋白质、其同源物、其片段、其变体，以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合物。在一些实施方案中，融合剂由人基因组中发现的人内源性逆转录病毒元件(hERV)编码。在US6,099,857A和US 2007/0224176中公开了另外的示例性融合剂，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。

2.病毒蛋白质

在一些实施方案中，融合剂可包括非哺乳动物蛋白，例如病毒蛋白。在一些实施方案中，病毒融合剂是I类病毒膜融合蛋白、II类病毒膜融合蛋白、III类病毒膜融合蛋白、病毒膜糖蛋白或其他病毒融合蛋白、或其同源物、其片段、其变体或包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合物。

在一些实施方案中，I类病毒膜融合蛋白包括但不限于杆状病毒F蛋白，例如核多角体病毒(NPV)属的F蛋白，例如MNPV甜菜夜蛾(SeMNPV)F蛋白和舞毒蛾MNPV(LdMNPV)以及副粘病毒F蛋白。

在一些实施方案中，II类病毒膜蛋白包括但不限于蜱骨脑炎E(TBEV E)、塞姆利基森林病毒E1/E2。

在一些实施方案中，III类病毒膜融合蛋白包括但不限于弹状病毒G(例如，水泡性口膜病毒的融合蛋白G(VSV-G)、科卡尔病毒G蛋白)、疱疹病毒糖蛋白B(例如，单纯疱疹病毒1(HSV-1)gB))、爱泼斯坦巴尔病毒糖蛋白B(EBV gB)、托高土病毒G(thogotovirus G)、杆状病毒gp64(例如，苜蓿银纹夜蛾多NPV(AcMNPV)gp64)和博尔纳病病毒(BDV)糖蛋白(BDV G)。

其他病毒融合剂例如膜糖蛋白和病毒融合蛋白的示例包括但不限于：病毒合胞体蛋白诸如流感血凝素(HA)或其突变体或融合蛋白；人免疫缺陷病毒1型包膜蛋白(HIV-1ENV)，来自HIV结合LFA-1以形成淋巴细胞合胞体的gp120、HIV gp41、HIV gp160或HIV反式转录激活因子(TAT)；病毒糖蛋白VSV-G，来自弹状病毒科的水泡性口炎病毒的病毒糖蛋白；水痘带状疱疹病毒(VZV)的糖蛋白gB和gH-gL；鼠白血病病毒(MLV)-10A1；长臂猿白血病病毒糖蛋白(GaLV)；狂犬病、莫科拉病毒、水泡性口炎病毒和披膜病毒中的G型糖蛋白；鼠肝炎病毒JHM表面突起蛋白；猪呼吸道冠状病毒刺突糖蛋白和膜糖蛋白；禽传染性支气管炎刺突糖蛋白及其前体；牛肠道冠状病毒刺突蛋白；麻疹病毒属(例如，麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒、鲸类麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、海豹瘟热病毒、牛瘟病毒)、新城疫病毒、人副流感病毒3、猿猴病毒41、仙台病毒和人呼吸道合胞病毒的F和H、HN或G基因；人疱疹病毒1型和猿猴水痘病毒的gH，以及伴侣蛋白gL；人、牛和猕猴疱疹病毒gB；Friend鼠白血病病毒和MasonPfizer猴病毒的包膜糖蛋白；流行性腮腺炎病毒血凝素神经氨酸酶，以及糖蛋白F1和F2；来自委内瑞拉马脑脊髓炎的膜糖蛋白；副粘病毒F蛋白；SIV gp160蛋白；埃博拉病毒G蛋白；或仙台病毒融合蛋白或其同源物、其片段、其变体，以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合物。

非哺乳动物融合剂包括病毒融合剂、其同源物、其片段以及包含一种或多种蛋白质或其片段的融合蛋白。病毒融合剂包括I类融合剂、II类融合剂、III类融合剂和IV类融合剂。在实施方案中，I类融合剂诸如人免疫缺陷病毒(HIV)gp41，具有特征性融合后构象，其具有带有中心卷曲螺旋结构的α-螺旋发夹的特征三聚体。I类病毒融合蛋白包括具有中心融合后六螺旋束的蛋白质。I类病毒融合蛋白包括流感HA、副流感F、HIV Env、埃博拉GP、来自正粘病毒的血凝素、来自副粘病毒的F蛋白(例如麻疹，(Katoh等人BMCBiotechnology2010,10:37))、来自逆转录病毒的ENV蛋白以及丝状病毒和冠状病毒的融合剂。在实施方案中，II类病毒融合剂诸如登革热E糖蛋白，具有形成延长的胞外域的β-折叠的结构特征，所述胞外域重折叠产生发夹三聚体。在实施方案中，II类病毒融合剂缺乏中央卷曲螺旋。II类病毒融合剂可在甲病毒(例如E1蛋白)和黄病毒(例如E糖蛋白)中发现。II类病毒融合剂包括来自塞姆利基森林病毒、辛比斯病毒、风疹病毒和登革热病毒的融合剂。在实施方案中，III类病毒融合剂诸如水疱性口炎病毒G糖蛋白结合了在I类和II类中发现的结构特征。在实施方案中，III类病毒融合剂包含α螺旋(例如，与I类病毒融合剂一样，形成六螺旋束以折叠蛋白质)和在其末端具有两亲融合肽的β折叠，使人想起II类病毒融合剂。III类病毒融合剂可在弹状病毒和疱疹病毒中发现。在实施方案中，IV类病毒融合剂是融合相关性小跨膜(FAST)蛋白(doi:10.1038/sj.emboj.7600767,Nesbitt,Rae L.,"TargetedIntracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated withMultifunctional FAST proteins"(2012)。Electronic Thesis and DissertationRepository.论文388)，其由无包膜呼肠孤病毒编码。在实施方案中，IV类病毒融合剂足够小，使得它们不形成发夹(doi:10.1146/annurev-cellbio-101512-122422,doi:10.1016/j.devcel.2007.12.008)。

a.G蛋白

在一些实施方案中，G蛋白是亨尼帕病毒属G蛋白或其生物活性部分。在一些实施方案中，亨尼帕病毒属G蛋白是亨德拉(HeV)病毒G蛋白、尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、雪松(CedPV)病毒G蛋白、墨江病毒(Mojiang virus)G蛋白、蝙蝠副粘病毒G蛋白或其生物活性部分。示例性G蛋白的非限制性列表在表1中示出。

附着G蛋白是II型跨膜糖蛋白，其含有N末端胞质尾(例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-49)、跨膜结构域(例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸50-70)，以及含有胞外茎(例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸71-187)和球状头(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸188-602)的胞外结构域。N末端胞质结构域在脂质双层的内部内腔中，并且C末端部分是暴露在脂质双层外侧的胞外结构域。已显示C端区中的茎的区域(例如，对应于NiV-G的氨基酸159-167)参与与F蛋白的相互作用和F蛋白融合的触发(Liu等人2015J of Virology 89:1838)。在野生型G蛋白中，球状头介导受体与亨尼帕病毒属进入受体肝配蛋白B2和肝配蛋白B3的结合，但不是膜融合所必需的(Brandel-Tretheway等人Journal of Virology.2019.93(13)e00577-19)。

在本文的特定实施方案中，G蛋白的向性被修饰。G蛋白与结合配偶体的结合可以触发由相容的F蛋白或其生物活性部分介导的融合。本文所公开的G蛋白序列主要公开为包括翻译起始所必需的N端甲硫氨酸的表达序列。由于这样的N端甲硫氨酸通常被共翻译或翻译后切割，所以本文所公开的所有G蛋白序列的成熟蛋白序列也被认为缺乏N端甲硫氨酸。

G糖蛋白在亨尼帕病毒属物种之间高度保守。例如，NiV和HeV病毒的G蛋白共享79％的氨基酸同一性。研究已显示G蛋白与不同物种的F蛋白之间的高度相容性，如通过异型融合活化所证明(Brandel-Tretheway等人Journal of Virology.2019)。如下所述，再靶向脂质颗粒可以含有来自不同物种的异源蛋白质。

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在一些实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO:1-11中任一个所示的序列或是其功能活性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一个至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％相同的序列。在一些实施方案中，G蛋白具有SEQ IDNO:1中所示的序列或是其功能活性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:1至少或约80％、至少或约90％、至少或约95％或至少或约99％相同的序列。在一些实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO:4中所示的序列或是其功能活性变体或生物活性部分，其具有与SEQ IDNO:4至少或约80％、至少或约90％、至少或约95％或至少或约99％相同的序列。在一些实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO:5中所示的序列或是其功能活性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:5至少或约80％、至少或约90％、至少或约95％或至少或约99％相同的序列。

在特定实施方案中，G蛋白或功能活性变体或生物活性部分是与亨尼帕病毒属F蛋白(例如NiV-F或HeV-F)一起保留融合活性的蛋白。融合活性包括G蛋白与亨尼帕病毒属F蛋白结合以促进或帮助两个膜内腔(诸如在其脂质双层中包埋了亨尼帕病毒属F和G蛋白的靶向脂质颗粒的内腔)和靶细胞(例如含有被靶向包膜蛋白识别或结合的表面受体或分子的细胞)的细胞质融合的活性。在一些实施方案中，F蛋白和G蛋白来自相同的亨尼帕病毒属物种(例如NiV-G和NiV-F)。在一些实施方案中，F蛋白和G蛋白来自不同的亨尼帕病毒属物种(例如NiV-G和HeV-F)。

在具体的实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或是其功能活性变体或其保留融合活性的生物活性部分。在一些实施方案中，功能活性变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与亨尼帕病毒属F蛋白(例如，NiV-F或HeV-F)结合的融合活性。在一些实施方案中，生物活性部分具有与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与亨尼帕病毒属F蛋白(例如，NiV-F或HeV-F)结合的融合活性。

提及保留融合活性包括这样的活性(与亨尼帕病毒属F蛋白结合)，即介于相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所示)的结合水平或程度的或约10％和或约150％或更高之间，诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约10％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约15％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约20％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约25％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约30％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约35％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约40％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约45％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约50％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约55％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约60％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约65％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约70％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约75％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约80％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约85％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约90％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约95％、诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约100％、或诸如相应野生型G蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约120％。

在一些实施方案中，G蛋白是含有一个或多个氨基酸突变(诸如一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或截短)的功能活性变体或生物活性部分的突变型G蛋白。在一些实施方案中，本文所述的突变涉及与参考G蛋白序列相比氨基酸的氨基酸插入、缺失、取代或截短。在一些实施方案中，参考G蛋白序列是G蛋白的野生型序列或其生物活性部分。在一些实施方案中，其功能活性变体或生物活性部分是野生型亨德拉(HeV)病毒G蛋白、野生型尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、野生型雪松(CedPV)病毒G蛋白、野生型墨江病毒G蛋白、野生型蝙蝠副粘病毒G蛋白或其生物活性部分的突变体。在一些实施方案中，野生型G蛋白具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中任一个所示的序列。

在一些实施方案中，G蛋白是突变型G蛋白，其是野生型亨德拉(HeV)病毒G蛋白、野生型尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、野生型雪松(CedPV)病毒G蛋白、野生型墨江病毒G蛋白、野生型蝙蝠副粘病毒G蛋白的N末端和/或C末端截短片段的生物活性部分。在具体的实施方案中，截短是全部或部分胞质结构域的N末端截短。在一些实施方案中，突变型G蛋白是截短的生物活性部分并且缺少野生型G蛋白的N末端处或附近的多达49个连续氨基酸残基，诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中任一个所示的野生型G蛋白。在一些实施方案中，突变型F蛋白是截短的并且缺少野生型G蛋白的N末端的多达49个连续氨基酸，诸如多达49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、30、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个连续氨基酸。

在一些实施方案中，G蛋白是野生型尼帕病毒G(NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白，或是其功能活性变体或生物活性部分。在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5中所示的序列的NiV-G蛋白，或是其功能性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:1中所示的序列的NiV-G蛋白，或是其功能性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:1具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:1中所示的序列的NiV-G蛋白。在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:4中所示的序列的NiV-G蛋白，或是其功能性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:4具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:4中所示的序列的NiV-G蛋白。在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:5中所示的序列的NiV-G蛋白，或是其功能性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:5具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:5中所示的序列的NiV-G蛋白。

在一些实施方案中，G蛋白是突变型NiV-G蛋白，其是野生型NiV-G的生物活性部分。在一些实施方案中，生物活性部分是N末端截短的片段。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达5个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达6个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达7个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达8个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达9个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达10个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达11个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达12个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5)的N末端处或附近的多达13个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达14个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达15个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达16个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达17个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达18个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达19个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达20个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达21个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达22个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达23个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5)的N末端处或附近的多达24个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达25个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达26个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达27个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达28个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达29个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达30个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达31个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达32个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达33个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达34个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5)的N末端处或附近的多达35个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达36个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达37个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达38个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达39个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达40个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达41个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达42个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达43个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达44个连续氨基酸残基，或缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达45个连续氨基酸残基。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的5个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5)的N末端处或附近的10个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的15个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的20个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5)的N末端处或附近的25个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的30个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，NiV-G蛋白是不含有胞质结构域的生物活性部分。在一些实施方案中，没有胞质结构域的NiV-G蛋白由SEQ ID NO:22编码。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白包含SEQ ID NO:12-14、17、18和22或42-45中任一个所示的序列或是其功能性变体，其具有与SEQ ID NO:12-14、17、18和22或42-45具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的5个氨基酸的截短，诸如SEQ ID NO:12中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:12具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性，或诸如SEQ ID NO:17中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:17具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的10个氨基酸截短，诸如SEQID NO:44中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:44具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的20个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:13中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:13具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的25个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:14中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:14具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5)的N末端处或附近的33个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:17中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:17具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:18中所示或其功能性变体，其与SEQ IDNO:18具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的48个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:22中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:22具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的15个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:45中所示或其功能性变体，其具有与SEQ ID NO:45具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的20个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:13中所示或其功能性变体，其具有与SEQ ID NO:13具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的25个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:14中所示或其功能性变体，其具有与SEQ ID NO:14具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的30个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:43中所示或其功能性变体，其具有与SEQ ID NO:43具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:42中所示或其功能性变体，其具有与SEQ ID NO:42具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的48个氨基酸截短，诸如SEQ ID NO:22中所示或其功能性变体，其具有与SEQ ID NO:22具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，G蛋白是突变型HeV-G蛋白，其是野生型HeV-G的生物活性部分。在一些实施方案中，生物活性部分是N末端截短的片段。

在一些实施方案中，G蛋白是具有SEQ ID NO:23或24中所示的序列的野生型HeV-G蛋白或是其功能性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:23或24具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、或约85％、至少或约86％、至少或约87％、或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，G蛋白是突变型HeV-G蛋白，它是野生型HeV-G(SEQ ID NO:23或24)的生物活性部分。在一些实施方案中，生物活性部分是N末端截短的片段。在一些实施方案中，突变型HeV-G蛋白是截短的并且缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达5个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达6个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达7个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达8个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达9个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达10个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达11个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达12个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达13个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24或24)的N末端处或附近的多达14个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达15个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达16个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达17个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达18个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达19个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达20个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达21个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达22个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达23个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达24个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达25个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达26个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达27个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达28个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达29个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达30个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达31个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达32个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达33个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达34个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达35个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达36个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达37个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达38个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达39个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达40个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达41个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达42个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达43个连续氨基酸残基，缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达44个连续氨基酸残基，或缺少野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端处或附近的多达45个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，HeV-G蛋白是不含有胞质结构域的生物活性部分。

在一些实施方案中，突变型HeV-G蛋白缺乏野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端胞质结构域，诸如SEQ ID NO:25中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:25具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。在一些实施方案中，突变型HeV-G蛋白缺乏野生型HeV-G蛋白(SEQ ID NO:23或24)的N末端胞质结构域，诸如SEQ ID NO:26中所示或其功能性变体，其与SEQ ID NO:26具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、或约84％、至少或约85％、至少或约86％、或至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性。

在一些实施方案中，G蛋白或其功能活性变体或生物活性部分结合肝配蛋白B2或肝配蛋白B3。在一些方面，G蛋白具有SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中任一个所示的氨基酸序列，或是其功能活性变体或其能够结合肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的生物活性部分。在一些实施方案中，功能活性变体或生物活性部分具有与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中任一个具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、或约86％、至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列，或其功能活性变体或生物活性部分，并且保留与肝配蛋白B2或B3的结合。

在一些实施方案中，功能活性变体或生物活性部分具有与SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少约80％、至少约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列，或其功能活性变体或生物活性部分，并且保留与肝配蛋白B2或B3的结合。提及保留与肝配蛋白B2或B3的结合包括这样的结合，即为相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的至少或至少约5％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的10％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的15％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的20％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的25％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的30％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的35％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的40％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的45％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的50％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的55％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的60％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的65％、相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的70％、诸如相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的至少或至少约75％、诸如相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的至少或至少约80％、诸如相应野生型G蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的至少或至少约85％、诸如相应野生型G蛋白(诸如SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的至少或至少约90％、或诸如相应野生型蛋白(诸如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示)或其功能活性变体或生物活性部分的结合水平或程度的至少或至少约95％。在一些实施方案中，G蛋白是NiV-G或其功能活性变体或生物活性部分，并且与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3结合。在一些方面，NiV-G具有SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列，或是其功能活性变体或其能够结合肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的生物活性部分。在一些实施方案中，功能活性变体或生物活性部分具有与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27具有至少约80％、至少约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与肝配蛋白B2或B3的结合。示例性生物活性部分包括缺少全部或部分胞质结构域的N末端截短的变体，例如1个或多个，诸如1至49个连续N末端氨基酸残基。提及保留与肝配蛋白B2或B3的结合包括这样的结合，即为相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的至少或至少约5％、相应野生型NiV-G(诸如SEQID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的10％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的15％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的20％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的25％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的30％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:27中所示)的结合水平或程度的35％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的40％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的45％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的50％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的55％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的60％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的65％、相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:27中所示)的结合水平或程度的70％、诸如相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的至少或至少约75％、诸如相应野生型NIV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的至少或至少约80％、诸如相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的至少或至少约85％、诸如相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的至少或至少约90％、或诸如相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27中所示)的结合水平或程度的至少或至少约95％。

在一些实施方案中，G蛋白或其生物是突变型G蛋白，其表现出对野生型G蛋白的天然结合配偶体的降低的结合。在一些实施方案中，突变型G蛋白或其生物活性部分是野生型Niv-G的突变体，并且表现出与天然结合配偶体肝配蛋白B2或肝配蛋白B3中的一者或两者的降低的结合。在一些实施方案中，突变型G蛋白或生物活性部分(诸如突变型NiV-G蛋白)表现出与天然结合配偶体的降低的结合。在一些实施方案中，与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的降低的结合降低了大于为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％、为或约30％、为或约40％、为或约50％、为或约60％、为或约70％、为或约80％、为或约90％、或为或约100％。

在一些实施方案中，本文所述的突变可以改善转导效率。在一些实施方案中，本文所述的突变允许特异性靶向不是肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的其他期望的细胞类型。在一些实施方案中，本文所述的突变导致至少部分不能结合至少一种天然受体，这降低了与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3中的至少一种的结合。在一些实施方案中，本文所述的突变干扰天然受体识别。

在一些实施方案中，G蛋白是HeV-G或其功能活性变体或生物活性部分，并结合肝配蛋白B2或肝配蛋白B3。在一些方面，HeV-G具有SEQ ID NO:23或24中所示的氨基酸序列，或是其功能活性变体或其能够结合肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的生物活性部分。在一些实施方案中，功能活性变体或生物活性部分具有与SEQ ID NO:23或24具有至少约80％、至少约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与肝配蛋白B2或B3的结合。示例性生物活性部分包括缺少全部或部分胞质结构域的N末端截短的变体，例如1个或多个，诸如1至49个连续N末端氨基酸残基。提及保留与肝配蛋白B2或B3的结合包括这样的结合，即为相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的至少或至少约5％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的10％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的15％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的20％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的25％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的30％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的35％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ IDNO:23或24中所示)的结合水平或程度的40％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的45％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的50％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的55％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的60％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的65％、相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的70％、诸如相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的至少或至少约75％、诸如相应野生型NIV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的至少或至少约80％、诸如相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的至少或至少约85％、诸如相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的至少或至少约90％、或诸如相应野生型HeV-G(诸如SEQ ID NO:23或24中所示)的结合水平或程度的至少或至少约95％。

在一些实施方案中，G蛋白含有在参与与肝配蛋白B2和肝配蛋白B3中的一者或两者相互作用的残基中的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代对应于参考SEQ ID NO:4中所示的编号的突变E501A、W504A、Q530A和E533A。

在一些实施方案中，G蛋白是突变型G蛋白。在一些实施方案中，G蛋白是含有选自由参考SEQ ID NO:4中所示的编号的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的一种或多种氨基酸取代的突变型G蛋白。在一些实施方案中，G蛋白是含有选自由参考SEQ ID NO:4的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的一种或多种氨基酸取代的突变型G蛋白，并且是其含有N末端截短的生物活性部分。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白或其生物活性部分是截短的并且缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达5个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达6个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达7个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达8个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达9个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达10个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达11个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:4)的N末端处或附近的多达12个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ IDNO:4)的N末端处或附近的多达13个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达14个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达15个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达16个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达17个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达18个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达19个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达20个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达21个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达22个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达23个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达24个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达25个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达26个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达27个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达28个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达29个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:4)的N末端处或附近的多达30个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ IDNO:4)的N末端处或附近的多达31个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达32个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达33个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达34个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达35个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达36个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达37个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达38个连续氨基酸残基，缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达39个连续氨基酸残基，或缺少野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:4)的N末端处或附近的多达40个连续氨基酸残基。

在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有SEQ ID NO:17或18中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:17或18具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO 17或18中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:17具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO 17中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-G蛋白具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:18具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，G蛋白是含有选自由参考SEQ ID NO:4中所示的编号的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的一种或多种氨基酸取代的突变型G蛋白。在一些实施方案中，G蛋白是含有选自由参考SEQ ID NO:4的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的一种或多种氨基酸取代的突变型G蛋白，并且是其含有N末端截短的生物活性部分。

b.F蛋白

在一些实施方案中，载体表面靶向部分包含具有疏水性融合肽结构域的蛋白质。在一些实施方案中，载体表面靶向部分包含亨尼帕病毒属F蛋白分子或其生物活性部分。在一些实施方案中，亨尼帕病毒属F蛋白是亨德拉(Hev)病毒F蛋白、尼帕(NiV)病毒F蛋白、雪松(CedPV)病毒F蛋白、墨江病毒F蛋白或蝙蝠副粘病毒F蛋白或其生物活性部分。

表2提供了F蛋白的非限制性示例。在一些实施方案中，F蛋白分子的N末端疏水性融合肽结构域或其生物活性部分暴露在脂质双层外侧。

亨尼帕病毒属的F蛋白被编码为含有信号肽(例如对应于SEQ ID NO:28的氨基酸残基1-26)的F₀前体。切割信号肽后，成熟的F₀(例如SEQ ID NO:29)被转运至细胞表面，然后被组织蛋白酶L内吞并切割为成熟的融合亚基F1和F2。在一些实施方案中，信号肽包含SEQID NO:38中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，成熟F₀包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，F1亚基包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，F2亚基包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列。F1和F2亚基通过二硫键结合并循环回细胞表面。F1亚基包含位于F1亚基的N末端的融合肽结构域，在此其能够插入细胞膜以驱动融合。在一些方面，融合被F蛋白与G蛋白的缔合所阻断，直到G蛋白与靶分子接合，导致其从F解离并暴露融合肽以介导膜融合。

在不同的亨尼帕病毒属物种中，F蛋白的序列和活性是高度保守的。例如，NiV和HeV病毒的F蛋白共享89％的氨基酸序列同一性。此外，在一些情况下，亨尼帕病毒属F蛋白表现出与来自其他物种的G蛋白的相容性，以触发融合(Brandel-Tretheway等人Journalof Virology.2019.93(13):e00577-19)。在一些方面或所提供的再靶向脂质颗粒中，F蛋白与G蛋白是异源的，即F和G蛋白或生物活性部分来自不同的亨尼帕病毒属物种。例如，F蛋白来自亨德拉病毒，并且G蛋白来自尼帕病毒。在其他方面，F蛋白可以是含有来自不同亨尼帕病毒属物种的F蛋白区域的嵌合F蛋白。在一些实施方案中，将F蛋白的氨基酸残基的区域从亨尼帕病毒属的一个物种转换为另一个物种可以导致与包含氨基酸插入的物种的G蛋白融合。(Brandel-Tretheway等人Journal of Virology.2019.93(13):e00577-19)。在一些情况下，嵌合F蛋白含有来自一种亨尼帕病毒属物种的胞外结构域和来自不同亨尼帕病毒属物种的跨膜和/或细胞质结构域。例如，F蛋白含有亨德拉病毒的胞外结构域和尼帕病毒的跨膜/细胞质结构域。本文所公开的F蛋白序列主要公开为包括N端信号序列的表达序列。由于这样的N末端信号序列通常被共翻译或翻译后切割，所以本文所公开的所有F蛋白序列的成熟蛋白序列也被认为缺乏N末端信号序列。

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在一些实施方案中，F蛋白由编码SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37中任一个所示的序列的核苷酸序列编码，或是其功能活性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37中任一个至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、或至少或约99％相同的序列。在一些实施方案中，F蛋白由编码SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQID NO:36或SEQ ID NO:37中任一个所示的序列的核苷酸序列编码。

在具体的实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分保留与亨尼帕病毒属G蛋白(诸如第IV.A.2节(例如NiV-G或HeV-G)中所述的G蛋白)结合的融合活性。融合活性包括F蛋白与G蛋白结合以促进或帮助两个膜内腔(诸如在其脂质双层中包埋了亨尼帕病毒属F和G蛋白的靶向脂质颗粒的内腔)和靶细胞(例如含有被靶向包膜蛋白识别或结合的表面受体或分子的细胞)的细胞质融合的活性。在一些实施方案中，F蛋白和G蛋白来自相同的亨尼帕病毒属物种(例如NiV-G和NiV-F)。在一些实施方案中，F蛋白和G蛋白来自不同的亨尼帕病毒属物种(例如NiV-G和HeV-F)。在具体的实施方案中，功能活性变体或生物活性部分的F蛋白保留被组织蛋白酶L切割的切割位点(例如对应于SEQ ID NO:30的氨基酸109-110之间的切割位点)。

在具体的实施方案中，F蛋白具有SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列或是其功能活性变体或其保留融合活性的生物活性部分。在一些实施方案中，功能活性变体包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36或SEQ ID NO:37具有至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与亨尼帕病毒属G蛋白(例如，NiV-G或HeV-G)结合的融合活性。在一些实施方案中，生物活性部分具有与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

提及保留融合活性包括这样的活性(与亨尼帕病毒属G蛋白结合)，即介于相应野生型F蛋白(诸如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37中所示)的结合水平或程度的或约10％和或约150％或更高之间，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约10％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约15％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约20％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约25％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约30％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约35％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约40％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约45％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约50％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约55％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约60％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约65％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约70％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约75％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约80％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约85％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约90％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约95％、诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约100％、或诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约120％。

在一些实施方案中，F蛋白是含有一个或多个氨基酸突变(诸如一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或截短)的功能活性片段或生物活性部分的突变型F蛋白。在一些实施方案中，本文所述的突变涉及与参考F蛋白序列相比氨基酸的氨基酸插入、缺失、取代或截短。在一些实施方案中，参考F蛋白序列是F蛋白的野生型序列或其生物活性部分。在一些实施方案中，突变型F蛋白或其生物活性部分是野生型亨德拉(Hev)病毒F蛋白、尼帕(NiV)病毒F蛋白、雪松(CedPV)病毒F蛋白、墨江病毒F蛋白或蝙蝠副粘病毒F蛋白的突变体。在一些实施方案中，野生型F蛋白由编码SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37中任一个的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，突变型F蛋白是野生型F蛋白的生物活性部分，其是N末端和/或C末端截短片段。在一些实施方案中，突变型F蛋白或其野生型F蛋白的生物活性部分包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文所述的突变可以改善转导效率。在一些实施方案中，本文所述的突变可以增加融合能力。示例性突变包括所描述的任何突变，参见例如Khetawat和Broder 2010Virology Journal7:312；Witting等人2013Gene Therapy 20:997-1005；国际公布；专利申请号WO/2013/148327。

在一些实施方案中，突变型F蛋白是截短的生物活性部分，并且缺少野生型F蛋白的C末端处或附近的多达20个连续氨基酸残基，诸如由编码SEQ ID NO:28-37中任一个所示的F蛋白的核苷酸序列编码的野生型F蛋白。在一些实施方案中，突变型F蛋白是截短的并且缺少野生型F蛋白的C末端的多达20个连续氨基酸，诸如多达19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个连续氨基酸。在一些实施方案中，突变型F蛋白包含SEQ IDNO:15中所示的序列。在一些实施方案中，突变型F蛋白包含SEQ ID NO:20中所示的序列。在一些实施方案中，突变型F蛋白被截短并且在野生型F蛋白的C末端处缺乏多达19个连续氨基酸，诸如多达18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个连续氨基酸。

在一些实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包含F1亚基或其融合剂部分。在一些实施方案中，F1亚基是F₀前体的蛋白水解切割部分。在一些实施方案中，F₀前体是非活性的。在一些实施方案中，F₀前体的切割形成二硫键连接的F1+F2异二聚体。在一些实施方案中，切割暴露融合肽并产生成熟的F蛋白。在一些实施方案中，切割发生在单个碱性残基处或周围。在一些实施方案中，切割发生在NiV-F蛋白的精氨酸109处。在一些实施方案中，切割发生在亨德拉病毒F蛋白的赖氨酸109处。

在一些实施方案中，F蛋白是野生型尼帕病毒F(NiV-F)蛋白或是其功能活性变体或生物活性片段。在一些实施方案中，F₀前体由编码SEQ ID NO:20中所示的序列的核苷酸序列编码。编码核酸可以编码具有序列MVVILDKRCY CNLLILILMI SECSVG(SEQ ID NO:38)的信号肽序列。在一些示例中，F蛋白被切割成包含SEQ ID NO:46中所示的序列的F1亚基和包含SEQ ID NO:39中所示的序列的F2亚基。

在一些实施方案中，F蛋白是由编码SEQ ID NO:30中所示的序列的核苷酸序列编码的NiV-F蛋白，或是其功能活性变体或生物活性部分，其具有与SEQ ID NO:30具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、或约86％、至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，F蛋白是由编码SEQID NO:30中所示的序列的核苷酸序列编码的NiV-F蛋白。在一些实施方案中，NiV-F蛋白具有30中所示的序列，或是其功能活性变体或生物活性部分，其具有与30具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、或约86％、至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白具有30中所示的序列。在特定实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分保留了被组织蛋白酶L切割的切割位点。

在一些实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包括具有SEQ IDNO:46中所示的序列的F1亚基，或具有与SEQ ID NO:46具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包括具有SEQ IDNO:39中所示的序列的F2亚基，或具有与SEQ ID NO:39具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包括具有SEQ IDNO:46中所示的序列的F1亚基，或具有与SEQ ID NO:46具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、或约86％、至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包括具有SEQ IDNO:39中所示的序列的F2亚基，或具有与SEQ ID NO:39具有至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、或约86％、至少或约87％、至少或约88％、或至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，F蛋白是突变型NiV-F蛋白，它是其生物活性部分，该生物活性部分是截短的并且缺少野生型NiV-F蛋白(例如SEQ ID NO:40所示)的C末端处或附近的多达20个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变型NiV-F蛋白包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-F蛋白具有与SEQ ID NO:200具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型F蛋白含有具有SEQ ID NO:46中所示的序列的F1蛋白。在一些实施方案中，突变型F蛋白具有与SEQ ID NO:46具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，F蛋白是突变型NiV-F蛋白，它是其生物活性部分，该生物活性部分包含在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:40)的C末端处或附近的20个氨基酸截短；以及在N-连接的糖基化位点上的点突变。在一些实施方案中，突变型NiV-F蛋白包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型NiV-F蛋白具有与SEQ ID NO:15具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，F蛋白是突变型NiV-F蛋白，它是其生物活性部分，该生物活性部分包含在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:40)的C末端处或附近的25个氨基酸截短。在一些实施方案中，F蛋白是突变型NiV-F蛋白，它是其生物活性部分，该生物活性部分包含在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:40)的C末端处或附近的22个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-F蛋白由编码SEQ ID NO:20中所示的序列的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，NiV-F蛋白由编码与SEQ ID NO:20具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的序列的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，F蛋白是突变型NiV-F蛋白，它是其生物活性部分，该生物活性部分包含在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:40)的C末端处或附近的22个氨基酸截短。在一些实施方案中，NiV-F蛋白包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:21具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白由编码SEQ ID NO:21中所示的序列的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，NiV-F蛋白由编码与SEQ ID NO:21具有至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、或约96％、至少或约97％、至少或约98％或至少或约99％序列同一性的序列的核苷酸序列编码。

B.CD8结合剂

本文公开的病毒载体包括一种或多种CD8结合剂。例如，CD8结合剂可以与蛋白融合剂或病毒包膜蛋白融合或掺入其中。在另一个实施方案中，CD8结合剂可以通过与跨膜结构域融合而掺入病毒包膜中。

示例性CD8结合剂包括与CD8α和CD8β中的一种或多种结合的抗体及其片段(例如，scFv、VHH)。此类抗体可以源自任何物种，并且可以是例如小鼠、兔、人、人源化或骆驼科动物抗体。示例性抗体包括WO2014025828、WO2014164553、WO2020069433、WO2015184203、US20160176969、WO2017134306、WO2019032661、WO2020257412、WO2018170096、WO2020060924、US10730944、US20200172620中公开的那些；以及非人抗体OKT8；RPA-T8、12.C7(Novus)；17D8、3B5、LT8、RIV11、SP16、YTC182.20、MEM-31、MEM-87、RAVB3、C8/144B(Thermo Fisher)；2ST8.5H7、Bu88、3C39、Hit8a、SPM548、CA-8、SK1、RPA-T8(GeneTex)；UCHT4(Absolute Antibody)；BW135/80(Miltenyi)；G42-8(BD Biosciences)；C8/1779R、mAB 104(Enzo Life Sciences)；B-Z31(Sapphire North America)；32-M4、5F10、MCD8、UCH-T4、5F2(Santa Cruz)；D8A8Y、RPA-T8(Cell Signaling Technology)。其他示例性结合剂包括设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)和基于纤连蛋白III型(Fn3)支架的结合剂。

在一些实施方案中，CD8结合剂包含分别包含SEQ ID NO:52、53和54中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及分别包含SEQ ID NO:55、56和57中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，CD8结合剂包含：包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:47中所示的序列。

在一些实施方案中，CD8结合剂包含分别包含SEQ ID NO:60、61和62中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及分别包含SEQ ID NO:63、64和65中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，CD8结合剂包含：包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:48中所示的序列。

在一些实施方案中，CD8结合剂包含分别包含SEQ ID NO:68、69和70中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及分别包含SEQ ID NO:55、56和71中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，CD8结合剂包含：包含SEQ ID NO:72中所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:73中所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:49中所示的序列。

在一些实施方案中，CD8结合剂包含分别包含SEQ ID NO:74、75和76中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及分别包含SEQ ID NO:77、78和79中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，CD8结合剂包含：包含SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:50中所示的序列。

在一些实施方案中，CD8结合剂包含分别包含SEQ ID NO:82、83和84中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，CD8结合剂包含：包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:51中所示的序列。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:47、48、49、50或51中任一个所示的序列。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:47中所示的序列。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:48中所示的序列。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:49中所示的序列。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:50中所示的序列。在一些实施方案中，CD8结合剂包含SEQ ID NO:51中所示的序列。

在一些实施方案中，CD8结合剂包含如US 2019/0144885中所描述的任何CD8结合剂，该专利以引用方式全文并入本文。

在一些实施方案中，可以通过突变融合蛋白或靶向蛋白(例如血凝素蛋白)中的氨基酸残基来重新靶向蛋白融合剂或病毒包膜蛋白。在特定实施方案中，融合剂(例如，G蛋白)被突变以减少与融合剂的天然结合配偶体的结合。在一些实施方案中，融合剂是或含有突变型G蛋白或其生物活性部分，它是野生型Niv-G的突变体，并且表现出与天然结合配偶体肝配蛋白B2或肝配蛋白B3(包括上述任一种)中的一种或两种的降低的结合。因此，在一些方面，融合剂可以被再靶向以显示改变的向性。在一些实施方案中，与其中赋予新的或不同的结合活性的野生型表面糖蛋白的结合相比，该结合赋予再靶向结合。在特定的实施方案中，与其中赋予新的或不同的结合活性的野生型G蛋白的结合相比，该结合赋予再靶向结合。在一些实施方案中，融合体剂被随机突变。在一些实施方案中，融合剂被合理地突变。在一些实施方案中，融合剂经历定向进化。在一些实施方案中，融合剂被截短并且在病毒载体中仅使用肽的子集。在一些实施方案中，麻疹血凝素蛋白中的氨基酸残基可以被突变以改变该蛋白的结合性质，从而再定向融合(doi:10.1038/nbt942,Molecular Therapy,第16卷第8期,1427–1436,2008年8月；doi:10.1038/nbt1060,DOI:10.1128/JVI.76.7.3558–3563.2002；DOI:10.1128/JVI.75.17.8016–8020.2001；doi:10.1073pnas.0604993103)。

在一些实施方案中，可以通过将CD8结合剂与融合蛋白或靶向蛋白(例如血凝素蛋白)共价缀合来再靶向蛋白融合剂。在一些实施方案中，融合剂和CD8结合剂通过包含与CD8结合剂连接的融合剂的嵌合蛋白的表达共价缀合。在一些实施方案中，单链可变片段(scFv)可以缀合至融合剂，以将融合活性重定向到展示scFv结合靶标的细胞(doi:10.1038/nbt1060,DOI 10.1182/blood-2012-11-468579,doi:10.1038/nmeth.1514,doi:10.1006/mthe.2002.0550,HUMAN GENE THERAPY 11:817–826,doi:10.1038/nbt942,doi:10.1371/journal.pone.0026381,DOI 10.1186/s12896-015-0142-z)。在一些实施方案中，设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)可以缀合至融合剂，以将融合活性重定向到展示DARPin结合靶标(doi:10.1038/mt.2013.16,doi:10.1038/mt.2010.298,doi:10.4049/jimmunol.1500956)以及不同DARPin的组合(doi:10.1038/mto.2016.3)的细胞。在一些实施方案中，受体配体和抗原可以缀合至融合剂，以将融合活性重定向到展示靶受体的细胞(DOI:10.1089/hgtb.2012.054,DOI:10.1128/JVI.76.7.3558–3563.2002)。在一些实施方案中，靶向蛋白还可包括抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、纳米抗体或骆驼科动物VHH结构域)、抗原结合纤连蛋白III型(Fn3)支架诸如纤连蛋白多肽微抗体、配体、细胞因子、趋化因子或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，可以通过将CD8结合剂与融合蛋白或靶向蛋白(例如血凝素蛋白)非共价缀合来再靶向蛋白融合剂。在一些实施方案中，融合蛋白可以被工程化以结合靶向靶细胞上的抗原的抗体的Fc区，将融合活性重定向到展示抗体靶标的细胞(DOI:10.1128/JVI.75.17.8016–8020.2001,doi:10.1038/nm1192)。在一些实施方案中，改变的和未改变的融合剂可以展示在相同的逆转录病毒载体或VLP上(doi:10.1016/j.biomaterials.2014.01.051)。

在一些实施方案中，CD8结合剂包含人源化抗体分子、完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如，等)；抗体片段，诸如Fab片段、Fab'片段、F(ab’)₂片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽-Fc融合物；单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体诸如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；掩蔽抗体(例如，)；小型模块免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双抗体/>VHH；迷你体；/>锚蛋白重复蛋白或DARTs；TCR样抗体；微生物蛋白质；/>以及/>

在一些实施方案中，CD8结合剂是肽。在一些实施方案中，CD8结合剂是抗体，诸如单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，CD8结合剂是抗体，诸如单结构域抗体。在一些实施方案中，CD8结合剂是VHH。在一些实施方案中，抗体可以是人的或人源化的。在一些实施方案中，抗体或其部分是天然存在的。在一些实施方案中，抗体或其部分是合成的。

在一些实施方案中，抗体可以从噬菌体展示文库中产生，以对期望的靶配体具有特异性。在一些实施方案中，噬菌体展示文库产生自用各种抗原免疫的骆驼科动物的VHH库，如以下文献所述：Arbabi等人,FEBS Letters,414,521-526(1997)；Lauwereys等人,EMBO J.,17,3512-3520(1998)；Decanniere等人,Structure,7,361-370(1999)。在一些实施方案中，产生包含未免疫骆驼科动物的抗体片段的噬菌体展示文库。在一些实施方案中，通过将多样性引入到一个或多个支架中来合成产生人单结构域抗体的文库。

在一些实施方案中，CD8结合剂的C末端连接至G蛋白(例如，融合剂)或其生物活性部分的C末端。在一些实施方案中，CD8结合剂的N末端暴露在脂质双层的外表面上。

在一些实施方案中，CD8结合剂是病毒载体的唯一表面展示的非病毒序列。在一些实施方案中，CD8结合剂是病毒载体的唯一膜结合非病毒序列。在一些实施方案中，除了CD8结合剂之外，病毒载体不含有接合或刺激T细胞的分子。

在一些实施方案中，病毒载体可以展示未与蛋白融合剂缀合的CD8结合剂，以便将融合活性再定向至由靶向部分结合的细胞，或影响归巢。

在一些实施方案中，源自不感染人的病毒或生物体的蛋白融合剂在患者体内不具有天然融合靶标，因此具有高特异性。

V.工程化受体有效负载

在一些实施方案中，本文公开的病毒载体编码工程化受体。在一些实施方案中，用于所提供的方法中使用或与所提供的方法结合施用的细胞含有或被工程化以含有工程化受体，例如工程化抗原受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)。还提供了此类细胞的群体、含有此类细胞和/或富集此类细胞的组合物，诸如其中富集或选择了某种类型的细胞，诸如T细胞或CD8+细胞。这些组合物包括用于施用的药物组合物和制剂，诸如用于过继性细胞疗法。还提供了根据所提供的方法和/或所提供的制品或组合物向受试者(例如，患者)施用细胞和组合物的治疗方法。

在一些实施方案中，基因转移无需首先刺激细胞而完成，诸如通过将其与诱导反应诸如增殖、存活和/或活化的刺激物组合，例如如通过细胞因子或活化标志物的表达所测量的，随后将核酸例如通过转导引入到受刺激的细胞中，并任选地在培养物中孵育或扩增至足以用于临床应用的数量。

病毒载体可以表达重组受体，诸如抗原受体，包括嵌合抗原受体(CAR)，以及其他抗原结合受体，诸如转基因T细胞受体(TCR)。受体中还有其他嵌合受体。

A.嵌合抗原受体(CAR)

在所提供的方法和用途的一些实施方案中，嵌合受体(诸如嵌合抗原受体)含有一个或多个结合抗原或配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)的结构域，其提供对所需抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性与细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域是刺激或活化胞内结构域部分，诸如T细胞刺激或活化结构域，从而提供初级活化信号或初级信号。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在一些实施方案中，当嵌合受体被基因工程化到免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下，可以调节T细胞分化或稳态，从而产生具有改善的寿命、存活和/或体内持久性的基因工程化细胞，例如用于在过继性细胞治疗方法中使用。

示例性抗原受体(包括CAR)以及用于工程化此类受体和将其引入到细胞中的方法包括例如W0200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、W02013/123061、美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118以及欧洲专利申请号EP2537416中描述的那些和/或由Sadelain等人,CancerDiscov.2013年4月；3(4):388-398、Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338、Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39、Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75中描述的那些。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR和WO/2014055668中描述的那些。CAR的示例包括如上述公开诸如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、US 7,446,190、US 8,389,282、Kochenderfer等人,(2013)Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276、Wang等人,(2012)J.Immunother.35(9):689-701和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)中的任一个中公开的CAR。还参见WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、US7,446,190和US 8,389,282。重组受体(诸如CAR)通常包括胞外抗原结合结构域，诸如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。在一些实施方案中，CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单结构域抗体(SdAb)、VH或VL结构域或骆驼科动物VHH结构域。

在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含CD19抗体、CD22抗体、T细胞α链抗体、T细胞β链抗体、T细胞γ链抗体、T细胞δ链抗体、CCR7抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD5抗体、CD7抗体、CD8抗体、CD11b抗体、CD11c抗体、CD16抗体、CD20抗体、CD21抗体、CD25抗体、CD28抗体、CD34抗体、CD35抗体、CD40抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、CD52抗体、CD56抗体、CD62L抗体、CD68抗体、CD80抗体、CD95抗体、CD117抗体、CD127抗体、CD133抗体、CD137(4-1BB)抗体、CD163抗体、F4/80抗体、IL-4Ra抗体、Sca-1抗体、CTLA-4抗体、GITR抗体、GARP抗体、LAP抗体、粒酶B抗体、LFA-1抗体、MR1抗体、uPAR抗体或转铁蛋白受体抗体的scFv或Fab片段。

在一些实施方案中，CAR包含作为共刺激结构域的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含共刺激结构域，该共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体中的一种或多种。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是不同的。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是相同的。

除了本文所述的CAR之外，多种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列是本领域已知的，并且将适用于如本文所述的体内和体外的靶细胞的融合体递送和重编程。参见例如WO2013040557、WO2012079000、WO2016030414、Smith T等人,NatureNanotechnology.2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57，它们的公开内容以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，受体靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或疾患的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。

在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，诸如多种已知B细胞标志物中的任一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD47、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。

在一些实施方案中，CAR结合CD19。在一些实施方案中，CAR结合CD22。在一些实施方案中，CAR结合CD19和CD22。在一些实施方案中，CAR选自由第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR和第四代CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR包括结合单个靶抗原的单个结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括结合多于一个靶抗原(例如，2、3或更多个靶抗原)的单个结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域结合不同的靶抗原。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域结合相同的靶抗原。包括CD19特异性、CD22特异性和CD19/CD22双特异性CAR的示例性CAR的详细描述可以在WO2012/079000、WO2016/149578和WO2020/014482中找到，包括序列表和附图的公开内容以引用方式全文并入本文。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的胞外部分和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向的抗原是CD19。在一些方面，重组受体(例如，CAR)的抗原结合结构域和抗原结合结构域结合(诸如特异性结合或特异性识别)CD19(诸如人CD19)。在一些实施方案中，scFv含有源自CD19特异性抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，诸如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如，如美国专利公开号US 2016/0152723中描述的。

在一些实施方案中，抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自CD 19特异性抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD 19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，诸如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如，如美国专利公开号US 2016/0152723中描述的。

在一些实施方案中，scFv源自FMC63。FMC63通常是指针对表达人来源的CD19的Naim-1和-16细胞产生的小鼠单克隆IgGl抗体(Fing,N.R.等人(1987).Leucocyte typingIII.302)。

在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的抗体部分还包括跨膜结构域与胞外抗原结合结构域之间的间隔区。在一些实施方案中，间隔区包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，诸如铰链区，例如IgG4铰链区，和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG，诸如IgG4或IgGl。在一些方面，恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔区。与不存在间隔区的情况相比，间隔区的长度可以提供抗原结合后细胞的增加的反应性。示例性间隔区包括但不限于Hudecek等人(2013)Clin.CancerRes.,19:3153、WO2014031687、美国专利号8,822,647或公开申请号US 2014/0271635中描述的那些。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG，诸如IgG4或IgGl。

在一些实施方案中，抗原受体包含与胞外结构域直接或间接连接的胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接胞外结构域和胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含IT AM。例如，在一些方面，抗原识别结构域(例如胞外结构域)通常连接至一种或多种胞内信号传导组分，诸如在CAR的情况下模拟通过抗原受体复合物(诸如TCR复合物)的活化的信号传导组分，和/或经由另一种细胞表面受体的信号传导。在一些实施方案中，嵌合受体包含在胞外结构域(例如scFv)与胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如抗体)与一个或多个跨膜和胞内信号传导结构域连接。

在一个实施方案中，使用与受体例如CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

在一些实施方案中，CAR跨膜结构域至少包含以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能性变体。在一些实施方案中，跨膜结构域至少包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能性变体。在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或合成来源。当来源是天然来源时，在一些方面，结构域源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD 137、CD 154的跨膜区(即至少包含它们的跨膜区)。替代性地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成跨膜结构域的每个末端都会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，通过接头、间隔区和/或跨膜结构域连接。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。

在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜通过间隔区连接，诸如本文所述的任何间隔区。在一些实施方案中，受体含有衍生跨膜结构域的分子的胞外部分，诸如CD28胞外部分。

胞内信号传导结构域是模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体组合的这种受体的信号和/或通过单独的共刺激受体的信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度为2至10个氨基酸的接头，诸如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。

T细胞活化在某些方面被描述为由两类胞质信号传导序列介导：通过TCR引发抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。

受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种胞内信号传导组分。在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级活化的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有初级胞质信号传导序列的ITAM的示例包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的胞质信号传导分子含有胞质信号传导结构域、其部分或源自CD3ζ的序列。

在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的胞内组分，诸如介导T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分与一种或多种细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，胞内组分是或包括CD3-ζ胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内组分是或包括来自Fc受体γ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)包括胞内信号传导结构域，并且还包括一种或多种另外的分子(诸如CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分，诸如跨膜结构域和/或铰链部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体是CD3-ζ(CD3-z)或Fc受体g以及CD8、CD4、CD25或CD16之一的一部分的嵌合分子。

在一些实施方案中，在CAR或其他嵌合受体连接后，受体的胞质结构域或胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如经工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，诸如细胞溶解活性或辅助T细胞活性，诸如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，抗原受体组分或共刺激分子的胞内信号传导结构域的截短部分用于代替完整的免疫刺激链，例如，如果它转导效应子功能信号。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括在天然环境中与此类受体协同作用以在抗原受体接合后引发信号转导的共受体的那些。

在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR的信号传导，而且需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也包含在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包含用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达并提供用于生成次级或共刺激信号的组分。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(诸如CD28、4-1BB、0X40、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括活化组分和共刺激组分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有源自T细胞共刺激分子或其功能性变体的胞内结构域，诸如在跨膜结构域与胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。

在一些实施方案中，活化结构域包含在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括活化或刺激CAR、共刺激CAR，两者均在同一细胞上表达(参见WO2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或活化CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，诸如识别除与疾病或疾患相关和/或对疾病或疾患具有特异性的抗原以外的抗原的CAR，由此通过靶向疾病的CAR递送的活化信号通过抑制性CAR与其配体的结合而减少或抑制，例如以减少脱靶效应。

在某些实施方案中，胞内信号传导结构域包含与CD3(例如CD3-ζ)胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含与CD3ζ胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激结构域。

在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如两个或更多个)共刺激结构域和活化结构域(例如初级活化结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的胞内组分。

在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域的胞内组分。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括CD28信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域的胞内组分。

在一些实施方案中，CD19特异性CAR包括抗CD19单链抗体片段(scFv)、跨膜结构域(诸如源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD22特异性CAR包括抗CD22 scFv、跨膜结构域(诸如源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD19/CD22双特异性CAR包括抗CD19 scFv、抗CD22 scFv、跨膜结构域(源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，CAR包含由T细胞携带的商业CAR构建体。基于商业CAR-T细胞的疗法的非限制性示例包括得自Cartesian Therapeutics的布瑞基奥仑赛阿基仑赛/>艾基维仑赛/>利基迈仑赛/>替沙仑赛/>Descartes-08和Descartes-11、得自Novartis的CTL110、得自Poseida Therapeutics的P-BMCA-101、得自Autolus Limited的AUTO4、得自Cellectis的UCARTCS、得自Precision Biosciences的PBCAR19B和PBCAR269A、得自Fate Therapeutics的FT819以及得自Clyad Oncology的CYAD-211。

本文还提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含编码包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含含有抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含含有抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR是或包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号传导结构域(例如，一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域的第二代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体、抗体片段、scFv或Fab。

在一些实施方案中，抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞特征性抗原。换句话说，抗原结合结构域靶向肿瘤细胞或癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，ABD结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞特征性抗原(例如，与肿瘤细胞或癌细胞相关的抗原)或肿瘤相关抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、Bestrophins、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序、T细胞α链、T细胞β链、T细胞γ链、T细胞δ链、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、粒酶B、LFA-1、转铁蛋白受体、NKp46、穿孔素、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、典型Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、T_REG、CDCP、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ²、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性复合物I类相关基因蛋白(MR1)、尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素、端粒酶、PCTA-1/Galectin8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A,B,C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC或其抗原片段或抗原部分。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向T细胞特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与T细胞相关的抗原。在一些情况下，这种抗原由T细胞表达或位于T细胞的表面上。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原或T细胞相关抗原选自细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如，离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞特征性细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性病症特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与自身免疫或炎性病症相关的抗原。在一些情况下，抗原由与自身免疫或炎性病症相关的细胞表达。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症选自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、葡萄膜炎、肝炎、系统性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化、冷凝集素病、寻常型天疱疮、格雷夫氏病、自身免疫性溶血性贫血、A型血友病、原发性干燥综合征、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征、IgM介导的神经病、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫性血小板减少症或中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，虽然同种免疫疾病的示例性非限制性示例包括同种异体致敏(参见例如Blazar等人,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41)或来自造血或实体器官移植、输血、妊娠与胎儿的异种致敏、新生儿同种免疫血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏，诸如用酶或蛋白质替代疗法治疗的遗传性或获得性缺陷病症的替代、血液制品和基因疗法可发生。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶或组氨酸激酶相关受体。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合B细胞、浆细胞或成浆细胞上表达的配体。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体，GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。参见例如US 2003/0077249、WO 2017/058753、WO 2017/058850，这些文献的内容以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向衰老细胞特征性抗原，例如尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)。在一些实施方案中，ABD结合与衰老细胞相关的抗原。在一些情况下，抗原由衰老细胞表达。在一些实施方案中，CAR可用于治疗或预防以衰老细胞的异常积累为特征的病症，例如肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向感染性疾病特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与感染性疾病相关的抗原。在一些情况下，抗原由感染性疾病的细胞表达。在一些实施方案中，其中感染性疾病选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8型(HHV-8、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人T-淋巴细胞病毒-1性(HTLV-1)、默克尔细胞多瘤病毒(MCV)、猿猴病毒40(SV40)、爱泼斯坦巴尔病毒、CMV、人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，感染性疾病特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。

在一些实施方案中，抗原结合结构域结合细胞的细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原是具体或特定细胞类型的特征(例如，由其表达)。在一些实施方案中，细胞表面抗原是多于一种类型的细胞的特征。

在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域结合T细胞特征性细胞表面抗原，诸如T细胞上的细胞表面抗原。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如，离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞特征性细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶或组氨酸激酶相关受体。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合T细胞受体。在一些实施方案中，T细胞受体可以是AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。

在一些实施方案中，CAR包含与抗原(例如肿瘤抗原)结合的胞外抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段，诸如scFv)、间隔子(例如含有铰链结构域，诸如本文所述的任何一种)、跨膜结构域(例如本文所述的任何一种)和胞内信号传导结构域(例如任何胞内信号传导结构域，诸如本文所述的初级信号传导结构域或共刺激信号传导结构域)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域是或包括初级胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域另外包括共刺激分子的胞内信号传导结构域(例如，共刺激结构域)。CAR的示例性组分的示例描述于表3中。在所提供的方面，CAR中的每个组分的序列可以包括表3中列出的任何组合。

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在一些实施方案中，抗原受体还包括标志物和/或表达CAR的细胞，或其他抗原受体还包括替代标志物，诸如细胞表面标志物，其可用于确认转导或工程化细胞以表达受体。在一些方面，标志物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如，截短形式)，诸如这样的细胞表面受体(例如，tEGFR)的截短形式。在一些实施方案中，编码标志物的核酸可操作地连接至编码接头序列(诸如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸。例如，标志物和任选的接头序列可以是公开的专利申请号WO2014031687中公开的任何标志物和接头序列。例如，标志物可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，诸如T2A可切割接头序列。

在一些实施方案中，标志物是非天然存在于T细胞上或非天然存在于T细胞表面上的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，该分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被细胞将过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。

在一些实施方案中，标志物除了用作用于基因工程化(例如，用于选择成功工程化的细胞)的标志物之外，不发挥治疗功能和/或不产生作用。在其他实施方案中，标志物可以是治疗性分子或以其他方式发挥某些所需作用的分子，诸如体内遇到的细胞的配体，诸如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或抑制细胞在过继转移和遇到配体时的反应。

在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体诸如CD28或CD 137的胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。

例如，在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28或其功能性变体的跨膜部分)和胞内信号传导结构域(其含有CD28或其功能性变体的信号传导部分和CD3ζ或其功能性变体的信号传导部分)。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28或其功能性变体的跨膜部分)和胞内信号传导结构域(其含有4-IBB或其功能性变体的信号传导部分和CD3ζ或其功能性变体的信号传导部分)。在一些这样的实施方案中，受体还包括含有Ig分子(诸如人Ig分子)的一部分的间隔区，诸如Ig铰链，例如IgG4铰链，诸如仅铰链间隔区。

在一些方面，间隔区仅含有IgG的铰链区，诸如仅含有IgG4或IgGl的铰链。在其他实施方案中，间隔区是或含有Ig铰链，例如IgG4衍生的铰链，任选地连接至CH2和/或CH3结构域。在一些实施方案中，间隔区是连接至CH2和CH3结构域的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔区是仅连接至CH3结构域的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔区是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，诸如已知的柔性接头。

例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体诸如抗体片段(包括scFv)、间隔区(诸如含有免疫球蛋白分子的一部分(诸如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔区，诸如含有Ig铰链的间隔区)、含有CD28衍生的跨膜结构域的全部或一部分的跨膜结构域、CD28衍生的胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(诸如scFv)、间隔区(诸如任何含有Ig铰链的间隔区)、CD28衍生的跨膜结构域、4-lBB衍生的胞内信号传导结构域和CD3ζ衍生的信号传导结构域。

由施用于受试者的细胞表达的重组受体，诸如CAR，通常识别或特异性结合在所治疗的疾病或疾患或其细胞中表达的、与所治疗的疾病或疾患或其细胞相关的和/或对被治疗的疾病或疾患或其细胞特异性的分子。当与分子(例如，抗原)特异性结合时，受体通常将免疫刺激信号(诸如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或疾患的免疫反应。例如，在一些实施方案中，细胞表达与由疾病或疾患的细胞或组织表达的或与疾病或疾患相关的抗原特异性结合的CAR。

B.T细胞受体(TCR)

在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品或组合物结合使用的工程化细胞(诸如T细胞)是表达识别肽表位或靶多肽的T细胞表位(诸如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分的细胞。

在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变a链和b链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变g链和d链(也分别称为TCRα和TCRβ)或其抗原结合部分的分子，并且其能够特异性结合与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，TCR为ab形式。通常，以ab和gd形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖位置或功能。TCR可以存在于细胞表面或以可溶形式存在。通常，TCR存在于T细胞(或T淋巴细胞)的表面，其中它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。

除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括ab形式或gd形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是比全长TCR短但结合MHC分子中结合的特定肽(诸如结合MHC-肽复合物)的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可仅含有全长或完整TCR的结构域的一部分，但仍能够结合完整TCR所结合的肽表位，诸如MHC-肽复合物。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，诸如TCR的可变a链和可变b链，其足以形成用于结合特异性MHC-肽复合物的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物识别的互补决定区。

C.多靶向

在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品和组合物结合使用的细胞包括采用多靶向策略的细胞，诸如在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体，每种识别不同抗原的基因工程化受体并且通常每种包括不同的胞内信号传导组分。这种多靶向策略在例如WO 2014055668(描述了活化和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于脱靶(例如正常细胞)上但一起仅存在于待治疗的疾病或疾患的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013)(描述了表达活化和抑制性CAR的细胞，诸如其中活化CAR与在正常或非患病细胞和待治疗的疾病或疾患的细胞上表达的一种抗原结合，并且抑制性CAR与仅在正常细胞或不需要治疗的细胞上表达的另一种抗原结合的细胞)中进行了描述。

例如，在一些实施方案中，细胞包含表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR)的受体，其通常在与由第一受体识别的抗原(例如，第一抗原)特异性结合后能够将活化或刺激信号诱导至细胞。在一些实施方案中，细胞还包含第二基因工程化抗原受体(例如，CAR)，例如嵌合共刺激受体，其通常在与由第二受体识别的第二抗原特异性结合后能够将共刺激信号诱导至免疫细胞。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原相同。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原不同。

在一些实施方案中，第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如CAR)能够将活化信号诱导至细胞。在一些实施方案中，受体包含含有ITAM或ITAM样基序的胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的活化涉及细胞中的信号转导或蛋白质表达的变化，导致免疫反应的引发，诸如ITAM磷酸化和/或IT AM介导的信号转导级联的引发、免疫突触的形成和/或结合受体附近的分子(例如CD4或CD8等)的聚集、一种或多种转录因子诸如NF-KB和/或AP-1的活化和/或因子诸如细胞因子的基因表达的诱导、增殖和/或存活。

在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体诸如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS的胞内信号传导结构域或区域。在一些实施方案中，第一和第二受体包括不同的共刺激受体的胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区，并且第二受体含有4-IBB共刺激信号传导区，反之亦然。

在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的胞内信号传导结构域和共刺激受体的胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，第一受体包含含有ITAM或ITAM样基序的胞内信号传导结构域，并且第二受体包含共刺激受体的胞内信号传导结构域。在同一细胞中诱导的共刺激信号与活化信号的组合是这样的信号，即导致免疫反应，诸如强烈且持续的免疫反应，诸如增加的基因表达、细胞因子和其他因子的分泌，以及T细胞介导的效应子功能诸如细胞杀伤。

在一些实施方案中，本文所述的CAR包含选自以下中的一种或多种的一个或至少一个信号传导结构域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6)、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNF RII/TNFRSF1B)、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150)、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，或其功能片段。

在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能性变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能性变体。在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在其他实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能性变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能性变体。在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能性变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能性变体。在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能性变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体，和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域

在一些实施方案中，第一、第二、第三或第四代CAR还包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因对于包含CAR的靶细胞是内源性或外源性的，该CAR包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，转录因子或其功能结构域或片段是或包含活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-kB或其功能结构域或片段。参见例如Zhang.C.等人,Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.5:22(2017)；WO 2016126608；Sha,H.等人Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumourimmunotherapy.Bioscience Reports,2017年1月27日,37(1)。

在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个间隔区，例如，其中间隔区是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔区。在一些实施方案中，第一间隔区包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰形式的至少一部分。在一些实施方案中，间隔区是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第二间隔区是寡肽，例如，其中寡肽包含甘氨酸和丝氨酸残基，例如但不限于甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个间隔区，例如抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔区以及跨膜结构域与信号传导结构域之间的间隔区。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第一代CAR的核酸。在一些实施方案中，第一代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和一个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第二代CAR的核酸。在一些实施方案中，第二代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和两个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第三代CAR的核酸。在一些实施方案中，第三代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少三个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。在一些实施方案中，第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，该至少两个共刺激结构域不同。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第四代CAR的核酸。在一些实施方案中，第四代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少两个、三个或四个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。

在一些实施方案中，单独连接第一受体和单独连接第二受体都不诱导强烈的免疫反应。在一些方面，如果仅连接一种受体，则细胞对抗原变得耐受或无反应，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或执行效应子功能。然而，在一些这样的实施方案中，当连接多个受体时，诸如在遇到表达第一抗原和第二抗原的细胞时，实现期望的反应，诸如完全免疫激活或刺激，例如，如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或执行免疫效应子功能诸如靶细胞的细胞毒性杀伤所指示的。

在一些实施方案中，两种受体分别诱导细胞的活化和抑制信号，使得受体之一与其抗原的结合活化细胞或诱导反应，但第二抑制性受体与其抗原的结合诱导抑制或减弱该反应的信号。示例是活化CAR和抑制性CAR或iCAR的组合。可以使用这样的策略，例如，其中活化CAR结合在疾病或疾患中表达但也在正常细胞上表达的抗原，而抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在疾病或疾患的细胞上表达的单独抗原。

在一些实施方案中，在与特定疾病或疾患相关的抗原在非患病细胞上表达和/或在工程化细胞自身上暂时(例如，在与基因工程化相关的刺激下)或永久表达的情况下采用多靶向策略。在这种情况下，通过需要连接两个分离且单独的特异性抗原受体，可以提高特异性、选择性和/或功效。

在一些实施方案中，多种抗原(例如，第一抗原和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或疾病或疾患上(诸如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病或疾患是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，多种抗原中的一种或多种通常也在细胞疗法所不期望靶向的细胞上表达，诸如正常或未患病的细胞或组织，和/或工程化细胞本身。在这样的实施方案中，通过需要连接多个受体以实现细胞的反应，实现特异性和/或功效。

D.嵌合自身抗体受体(CAAR)

在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR结合例如特异性结合或识别自身抗体。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞，诸如被工程化为表达CAAR的T细胞，可用于结合并杀死表达自身抗体的细胞，但不杀死表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可用于治疗与自身抗原表达相关的自身免疫疾病，诸如自身免疫疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身抗体并将自身抗体展示在其细胞表面上的B细胞，将这些B细胞标记为疾病特异性靶标用于治疗干预。在一些实施方案中，通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向致病B细胞，表达CAAR的细胞可用于有效靶向并杀死自身免疫疾病中的致病B细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAAR，诸如美国专利申请公开号US 2017/0051035中描述的任一种。

在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内信号传导区或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区)。在一些实施方案中，胞内信号传导区包含胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中刺激和/或诱导T细胞中的初级活化信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域(例如CD3-ζ链或其功能性变体或信号传导部分的胞内信号传导结构域或区)，和/或包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的信号传导结构域。

在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，可以选择自身抗原，因为它识别与特定疾病状态(例如自身免疫疾病，诸如自身抗体介导的自身免疫疾病)相关的靶细胞(诸如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，自身免疫疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsgl)和Dsg3。

在一些实施方案中，编码的核酸可操作地连接至“阳性靶细胞特异性调控元件”(或阳性TCSRE)。在一些实施方案中，阳性TCSRE是功能性核酸序列。在一些实施方案中，阳性TCSRE包含启动子或增强子。在一些实施方案中，TCSRE是增加靶细胞中外源试剂水平的核酸序列。在一些实施方案中，阳性靶细胞特异性调控元件包含T细胞特异性启动子、T细胞特异性增强子、T细胞特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质半衰期的T细胞特异性位点、T细胞特异性mRNA核输出促进位点、T细胞特异性翻译增强位点或T细胞特异性翻译后修饰位点。在一些实施方案中，T细胞特异性启动子是Immgen consortium中描述的启动子，其以引用方式全文并入本文，例如，T细胞特异性启动子是IL2RA(CD25)、LRRC32、FOXP3或IKZF2启动子。在一些实施方案中，T细胞特异性启动子或增强子是Schmidl等人,Blood.2014年4月24日；123(17):e68-78中描述的启动子或增强子，其以引用方式全文并入本文。在一些实施方案中，T细胞特异性启动子是前述任一种的转录活性片段。在一些实施方案中，T细胞特异性启动子是与前述任一种具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。

在一些实施方案中，编码的核酸可操作地连接至“阴性靶细胞特异性调控元件”(或阴性TCSRE)。在一些实施方案中，阴性TCSRE是功能性核酸序列。在一些实施方案中，阴性TCSRE是导致非靶细胞中病毒载体的抑制降解的miRNA识别位点。在一些实施方案中，外源试剂可操作地连接至“非靶细胞特异性调控元件”(或NTCSRE)。在一些实施方案中，NTCSRE包含与非靶细胞中相比降低非靶细胞中的外源试剂的水平的核酸序列。在一些实施方案中，NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。在一些实施方案中，NTCSRE包含组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。在一些实施方案中，NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。在一些实施方案中，NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列，并且该miRNA识别序列能够被miR3 1、miR363或miR29c中的一种或多种结合。在一些实施方案中，NTCSRE位于或编码在编码外源试剂的转录区内，任选地其中转录区产生的RNA包含UTR或编码区内的miRNA识别序列。

E.CAR的其他描述

在某些实施方案中，细胞可以包含编码CAR的外源多核苷酸。CAR(也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是已被工程化以赋予宿主细胞(例如，T细胞)靶向特定蛋白的新能力的受体蛋白。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞活化功能结合在单个受体中。本公开的多顺反子载体可用于在宿主细胞(例如，T细胞)中表达一种或多种CAR，用于针对各种靶抗原的基于细胞的疗法。由一个或多个表达盒表达的CAR可以相同或不同。在这些实施方案中，CAR可以包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域(也称为“结合剂”)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR还可以包含一种或多种另外的元件，包括一种或多种信号肽、一种或多种胞外铰链结构域和/或一种或多种胞内共刺激结构域。结构域可以彼此直接相邻，或者可以有一个或多个氨基酸连接结构域。编码CAR的核苷酸序列可以源自哺乳动物序列，例如小鼠序列、灵长类动物序列、人序列或它们的组合。在编码CAR的核苷酸序列是非人的情况下，CAR的序列可以是人源化的。编码CAR的核苷酸序列还可以针对在哺乳动物细胞例如人细胞中表达进行密码子优化。在这些实施方案中的任一个中，编码CAR的核苷酸序列可以与本文公开的任何核苷酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)。序列变异可能是由于密码子优化、人源化、基于限制酶的克隆疤痕和/或连接功能结构域的额外氨基酸残基等。

在某些实施方案中，CAR可以在N末端包含信号肽。信号肽的非限制性示例包括CD8α信号肽、IgK信号肽和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚基α(GMCSFR-α，也称为集落刺激因子2受体亚基α(CSF2RA))信号肽及其变体，其氨基酸序列提供于下表4中。

表4.信号肽的示例性序列

在某些实施方案中，CAR的胞外结合结构域可以包含对一种靶抗原或多种靶抗原具有特异性的一种或多种抗体。抗体可以是抗体片段，例如scFv，或单结构域抗体片段，例如VHH。在某些实施方案中，scFv可以包含通过接头连接的抗体的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。V_H和V_L可以以任一顺序连接，即V_H-接头-V_L或V_L-接头-V_H。接头的非限制性示例包括Whitlow接头、(G₄S)_n(n可以是正整数，例如，1、2、3、4、5、6等)接头以及它们的变体。在某些实施方案中，抗原可以是仅在肿瘤细胞上或优先在肿瘤细胞上表达的抗原，或是自身免疫或炎性疾病的特征性抗原。示例性靶抗原包括但不限于CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、κ、λ和B细胞成熟剂(BCMA)、G蛋白偶联受体家族C组5成员D(GPRC5D)(与白血病相关)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI和BCMA(与骨髓瘤相关)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、间皮素、MUC1、MUC16和ROR1(与实体瘤相关)。在这些实施方案中的任一个中，CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。

在某些实施方案中，CAR可以包含铰链结构域，也称为间隔区。术语“铰链”和“间隔区”在本公开中可以互换使用。铰链结构域的非限制性示例包括CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、IgG4铰链结构域、IgG4铰链-CH2-CH3结构域以及它们的变体，其氨基酸序列提供于下表5中。

表5.铰链结构域的示例性序列

在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域可以包含以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能性变体，包括这些序列中的每一种的人形式。在其他实施方案中，跨膜结构域可以包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能性变体，包括这些序列中的每一个的人形式。表6提供了一些示例性跨膜结构域的氨基酸序列。

表6.跨膜结构域的示例性序列

在某些实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域和/或胞内共刺激结构域可以包含选自以下中的一种或多种信号传导结构域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其功能性变体，包括这些序列中的每一种的人形式。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域和/或胞内共刺激结构域包含选自CD3ζ结构域、ITAM、CD28结构域、4-1BB结构域或其功能性变体的一个或多个信号传导结构域。表7提供了一些示例性胞内共刺激和/或信号传导结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，如在如下所述的替沙仑赛的情况下，SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域可以具有在氨基酸位置14处的突变，例如谷氨酰胺(Q)至赖氨酸(K)突变(参见SEQ ID NO:100)。

表7.细胞内共刺激和/或信号传导结构域的示例性序列

在多顺反子载体编码两个或更多个CAR的某些实施方案中，两个或更多个CAR可以包含相同的功能结构域，或一个或多个不同的功能结构域，如所描述的。例如，两个或更多个CAR可以包含不同的信号肽、胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域，以最小化由于序列相似性导致的重组风险。或者，替代性地，两个或更多个CAR可以包含相同的结构域。在使用相同结构域和/或主链的情况下，任选在核苷酸序列水平上引入密码子差异以最小化重组的风险。

CD19 CAR

在一些实施方案中，CAR是CD19 CAR(“CD19-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD19 CAR的核苷酸序列的表达盒。在一些实施方案中，CD19 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD19的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，CD19 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:86中所示的氨基酸序列或与SEQID NO:86中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域对CD19(例如，人CD19)具有特异性。CD19 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域包含源自FMC63单克隆抗体(FMC63)的scFv，其包含通过接头连接的FMC63的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。FMC63和衍生的scFv已在Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)和PCT申请公开号WO2018/213337中进行了描述，这些文献中每一篇的全部内容已引用方式并入本文。在一些实施方案中，完整FMC63衍生的scFv(也称为FMC63 scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表8中。在一些实施方案中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:101、102或107中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:101、102或107中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可以包含具有SEQ IDNO:103-105和108-110中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的轻链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:103-105中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的重链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:108-110中所示的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD19特异性scFv可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，CD19CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，连接scFv的V_H和V_L部分的接头是具有SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的Whitlow接头。在一些实施方案中，Whitlow接头可以被不同的接头替代，例如，具有SEQ ID NO:181中所示的氨基酸序列的3xG₄S接头，其产生具有SEQ ID NO:111中所示的氨基酸序列的不同的FMC63衍生的scFv。在这些实施方案中的某些中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:111中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:111中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

表8.抗CD19 scFv和组分的示例性序列

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在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域源自CD19特异性抗体，包括例如SJ25C1(Bejcek等人,Cancer Res.55:2346-2351(1995))、HD37(Pezutto等人,J.Immunol.138(9):2793-2799(1987))、4G7(Meeker等人,Hybridoma 3:305-320(1984))、B43(Bejcek(1995)),BLY3(Bejcek(1995))、B4(Freedman等人,70:418-427(1987))、B4HB12b(Kansas&Tedder,J.Immunol.147:4094-4102(1991)；Yazawa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:15178-15183(2005)；Herbst等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.335:213-222(2010))、BU12(Callard等人,J.Immunology,148(10):2983-2987(1992))和CLB-CD19(De Rie Cell.Immunol.118:368-381(1989))。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的V_H、V_L和/或一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。4-1BB(也称为CD137)向T细胞传递有效的共刺激信号，促进分化并增强T淋巴细胞的长期存活。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域。CD28是T细胞上的另一种共刺激分子。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19 CAR的胞内共刺激结构域包含如所描述的4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域。CD3ζ与T细胞受体(TCR)结合产生信号并含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ζ信号传导结构域是指来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域是人的。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD19 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:111中所示的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:88的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD19 CAR。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可以另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD19 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:111中所示的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD19 CAR。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可以另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD19 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:111中所示的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:89的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:98的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD19 CAR。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可以另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码如SEQ ID NO:112中所示的CD19 CAR或与SEQ ID NO:112中所示的核苷酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性)(参见表9)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:113中所示的相应氨基酸序列或与SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)，具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码可商购获得的CD19 CAR实施方案的核苷酸序列的表达盒。由T细胞表达和/或编码的CD19 CAR的市售实施方案的非限制性示例包括替沙仑赛(tisagenlecleucel)、利基迈仑赛(lisocabtagene maraleucel)、阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)和布瑞基奥仑赛(brexucabtagene autoleucel)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码替沙仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。替沙仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：CD8α信号肽、FMC63 scFv(V_L-3xG₄S接头-V_H)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。替沙仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表9中，序列的注释提供于表10中。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码利基迈仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。利基迈仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、IgG4铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。利基迈仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表9中，序列的注释提供于表11中。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码阿基仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。阿基仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。阿基仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表9中，序列的注释提供于表12中。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码布瑞基奥仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。布瑞基奥仑赛包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α信号肽、FMC63scFv、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码如SEQ ID NO:114、116或118中所示的CD19CAR或与SEQ ID NO:114、116或118中所示的核苷酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性)。编码的CD19 CAR分别具有SEQ ID NO:115、117或119中所示的相应氨基酸序列或分别与SEQ ID NO:115、117或119中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)。

表9.CD19 CAR的示例性序列

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表10.替沙仑赛CD19 CAR序列的注释

表11.利基迈仑赛CD19 CAR序列的注释

表12.阿基仑赛CD19 CAR序列的注释

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码如SEQ ID NO:114、116或118中所示的CD19CAR或与SEQ ID NO:114、116或118中所示的核苷酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性)。编码的CD19 CAR分别具有SEQ ID NO:115、117或119中所示的相应氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:115、117或119中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)。

CD20 CAR

在一些实施方案中，CAR是CD20 CAR(“CD20-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD20 CAR的核苷酸序列的表达盒。CD20是这样的抗原，早在前-B期就在B细胞表面上发现，并以逐渐增加的水平直到B细胞成熟，也在大多数B细胞肿瘤的细胞上发现。CD20阳性细胞有时也在霍奇金病、骨髓瘤和胸腺瘤的病例中发现。在一些实施方案中，CD20 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD20的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，CD20 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:86中所示的氨基酸序列或与SEQID NO:86中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域对CD20(例如，人CD20)具有特异性。CD20 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域源自CD20特异性抗体，包括例如Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔单抗、奥妥珠单抗、替伊莫单抗、奥法妥木单抗、托西莫单抗、奥尼妥单抗、维妥珠单抗、乌妥昔单抗和奥瑞利珠单抗。在这些实施方案中的任一个中，CD20CAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的V_H、V_L和/或一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域包含源自Leu16单克隆抗体的scFv，其包含通过接头连接的Leu16的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。参见Wu等人,Protein Engineering.14(12):1025-1033(2001)。在一些实施方案中，接头是3xG₄S接头。在其他实施方案中，接头是如本文所描述的Whitlow接头。在一些实施方案中，完整Leu16衍生的scFv(也称为Leu16 scFv)的不同部分及其不同部分的氨基酸序列提供于下表13中。在一些实施方案中，CD20特异性scFv包含SEQ ID NO:120、121或125中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:120、121或125中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可以包含具有SEQ ID NO:122-124、126、127和182中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的轻链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:122-124中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的重链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:126、127和182中所示的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD20特异性scFv可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，CD20CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

表13.抗CD20 scFv和组分的示例性序列

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在一些实施方案中，CD20 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:99中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD20 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:120中所示的序列的CD20特异性scFv、SEQ IDNO:88的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD20 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD20 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:120中所示的序列的CD20特异性scFv、SEQ IDNO:89的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD20 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD20 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:120中所示的序列的CD20特异性scFv、SEQ IDNO:91或SEQ ID NO:92的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD20 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD20 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:120中所示的序列的CD20特异性scFv、SEQ IDNO:88的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD20 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD20 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:120中所示的序列的CD20特异性scFv、SEQ IDNO:89的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD20 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD20 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:120中所示的序列的CD20特异性scFv、SEQ IDNO:91或SEQ ID NO:92的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD20 CAR。

CD22 CAR

在一些实施方案中，CAR是CD22 CAR(“CD22-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD22 CAR的核苷酸序列的表达盒。CD22是一种跨膜蛋白，主要存在于成熟B细胞的表面，作为B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体起作用。CD22在60％-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，B-慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特氏淋巴瘤)中表达，并且在B细胞发育早期的细胞表面上或在干细胞上不存在。在一些实施方案中，CD22 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD22的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，CD22 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:86中所示的氨基酸序列或与SEQID NO:86中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域对CD22(例如，人CD22)具有特异性。CD22 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域源自CD22特异性抗体，包括例如SM03、奥加伊妥珠单抗、依帕珠单抗、莫塞妥莫单抗和匹那妥珠单抗。在这些实施方案中的任一个中，CD22 CAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的V_H、V_L和/或一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含源自m971单克隆抗体(m971)的scFv，其包含通过接头连接的m971的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。在一些实施方案中，接头是3xG₄S接头。在其他实施方案中，可以使用Whitlow接头代替。在一些实施方案中，完整m971衍生的scFv(也称为m971 scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表14中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:128、129或133中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:128、129或133中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可以包含具有SEQ ID NO:130-132和134-136中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的重链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:130-132中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的轻链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:134-136中所示的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含源自m971-L7的scFv，其是与亲本抗体m971相比CD22结合亲和力显著提高(从约2nM提高至小于50pM)的m971的亲和力成熟变体。在一些实施方案中，源自m971-L7的scFv包含通过3xG₄S接头连接的m971-L7的V_H和V_L。在其他实施方案中，可以使用Whitlow接头代替。在一些实施方案中，完整m971-L7衍生的scFv(也称为m971-L7scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表14中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:137、138或142中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:137、138或142中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可以包含具有SEQ ID NO:139-141、143-145中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的重链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:139-141中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可以包含具有一个或多个CDR的轻链，该一个或多个CDR具有SEQID NO:143-145中所示的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

表14.抗CD22 scFv和组分的示例性序列

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在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22和HA22是包含与细菌毒素融合的CD22特异性scFv的治疗剂，因此可以结合表达CD22的癌细胞的表面并杀死癌细胞。BL22包含抗CD22抗体的dsFv，RFB4，其与38-kDa截短形式的假单胞菌属外毒素A融合(Bang等人,Clin.Cancer Res.,11:1545-50(2005))。HA22(CAT8015，莫塞妥莫单抗免疫毒素)是BL22的突变的、较高亲和力形式(Ho等人,J.Biol.Chem.,280(1):607-17(2005))。对CD22具有特异性的HA22和BL22的抗原结合结构域的合适序列公开于例如美国专利号7,541,034、7,355,012和7,982,011中，这些专利据此全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，CD22 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:99中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD22 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:137中所示的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:88的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD22 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD22 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:137中所示的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:89的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD22 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD22 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:137中所示的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD22 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD22 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:137中所示的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:88的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD22 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD22 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:137中所示的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:89的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD22 CAR。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码CD22 CAR，包括例如包含具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:137中所示的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:95的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)的CD22 CAR。

BCMACAR

在一些实施方案中，CAR是BCMACAR(“BCMA-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码BCMA-CAR的核苷酸序列的表达盒。BCMA是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员，在终末分化的B细胞或成熟的B淋巴细胞上表达最高。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。最近发现，BCMA的表达与多种癌症有关，诸如多发性骨髓瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，BCMACAR可以串联地包含信号肽、特异性结合BCMA的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，BCMACAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:86中所示的氨基酸序列或与SEQID NO:86中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域对BCMA(例如，人BCMA)具有特异性。BCMACAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。

在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域源自BCMA特异性抗体，包括例如贝兰他单抗、埃拉那他单抗、特利司他单抗、LCAR-B38M和西达基。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的V_H、V_L和/或一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自C11D5.3的scFv，其是如Carpenter等人,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)中描述的鼠单克隆抗体。还参见PCT申请公开号WO2010/104949。C11D5.3衍生的scFv可以包含通过Whitlow接头连接的C11D5.3的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，其氨基酸序列提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:146、147或151中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:146、147或151中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有SEQ ID NO:148-150和152-154中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有一个或多个CDR的轻链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:148-150中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有一个或多个CDR的重链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:152-154中所示的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自另一种鼠单克隆抗体C12A3.2的scFv，如Carpenter等人.,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)和PCT申请公开号WO2010/104949中所描述的，其氨基酸序列也提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:155、156或160中所示的氨基酸序列或与SEQID NO:155、156或160中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有SEQ ID NO:157-159和161-163中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有一个或多个CDR的轻链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:157-159中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有一个或多个CDR的重链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:161-163中所示的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含对人BCMA具有高特异性的鼠单克隆抗体，在Friedman等人,Hum.Gene Ther.29(5):585-601(2018)中称为BB2121。还参见PCT申请公开号WO2012163805。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含两条重链(VHH)的单个可变片段，其可以结合BCMA的两个表位，如Zhao等人,J.Hematol.Oncol.11(1):141(2018)中所描述的，也称为LCAR-B38M。还参见PCT申请公开号WO2018/028647。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含完全人重链可变结构域(FHVH)，如Lam等人,Nat.Commun.11(1):283(2020)中所描述的，也称为FHVH33。还参见PCT申请公开号WO2019/006072。FHVH33及其CDR的氨基酸序列提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:164中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:164中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有SEQ ID NO:165-167中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自CT103A(或CAR0085)的scFv，如美国专利号11,026,975B2中所描述的，其氨基酸序列提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:168、169或173中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:168、169或173中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有SEQ IDNO:170-172和174-176中所示的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有一个或多个CDR的轻链，该一个或多个CDR具有SEQ IDNO:170-172中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可以包含具有一个或多个CDR的重链，该一个或多个CDR具有SEQ ID NO:174-176中所示的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可以包含一个或多个CDR，该一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代，或包含与任何鉴定的序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

另外，针对BCMA的CAR和结合剂已在美国申请公开号2020/0246381A1和2020/0339699A1中进行了描述，这些申请中的每一个的全部内容以引用方式并入本文。

表15.抗BCMA结合剂和组分的示例性序列

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在一些实施方案中，BCMACAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:91或SEQ IDNO:92中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞内信号传导结构域包含CD3 zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:99中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码BCMACAR，包括例如包含如所描述的BCMA特异性胞外结合结构域、SEQ ID NO:88的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:97的4-1BB共刺激结构域、SEQID NO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)中的任一种的BCMACAR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA CAR可以另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码BCMACAR，包括例如包含如所描述的BCMA特异性胞外结合结构域、SEQ ID NO:88的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:94的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:98的CD28共刺激结构域、SEQ IDNO:99的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)中的任一种的BCMACAR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA CAR可以另外包含如所描述的信号肽。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码如SEQ ID NO:177中所示的BCMACAR或与SEQ ID NO:177中所示的核苷酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性)(参见表16)。编码的BCMACAR具有SEQ ID NO:178中所示的相应氨基酸序列或与SEQ ID NO:178中所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)，具有以下组分：CD8α信号肽、CT103A scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码可商购获得的BCMACAR实施方案的核苷酸序列的表达盒，包括例如艾基维仑赛(ide-cel，也称为bb2121)。在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码艾基维仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。艾基维仑赛包含具有以下组分的BCMACAR：BB2121结合剂、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

表16.BCMACAR的示例性序列

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VI.工程化T细胞的制造和施用

在一些实施方案中，通过与包含CD8结合剂的病毒载体接触将静息或未活化的T细胞体外工程化。在用于产生或制备工程化细胞的示例性方法的一些方面，CD8+细胞选自例如通过白细胞单采获得的人外周血单核细胞(PBMC)，产生富集的CD8+细胞组合物。在一些方面，此类细胞可以冷冻保存。在一些方面，可以将CD8+组合物解冻并对其进行转导和扩增步骤。

在用于产生或制备工程化细胞的示例性方法的一些方面，例如在与抗CD3和抗CD28抗体偶联的顺磁性聚苯乙烯包被的珠存在下，CD8+细胞不被刺激。在一些方面，刺激不在含有人重组IL-2、人重组IL-15或N-乙酰半胱氨酸(NAC)的培养基中进行。在某些方面，细胞培养基不包含人重组IL-7。在一些方面，在抗CD3和抗CD28抗体、IL-2、IL-15、N-乙酰基-半胱氨酸或IL-7中的任一种的存在下，CD8+细胞不被刺激。

细胞通常是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，诸如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如专能和多能干细胞，包括诱导的多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一种或多种亚群，诸如完整T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，诸如由功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌特征和/或分化程度定义的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些实施方案中，该方法包括从受试者分离细胞，对其进行制备、加工、培养和/或工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。

在一些方面，细胞来源或分离的样品是血液或血液来源的样品，或是或源自单采或白细胞单采产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继性细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体来源和同种异体来源的样品。

在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括用选择试剂孵育细胞，例如以选择CD8+ T细胞。用一种或多种选择试剂孵育，例如，作为选择方法的一部分，这些选择方法可以使用一种或多种选择试剂进行，以基于一种或多种特定分子在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型，该一只公或多种特定分子诸如表面标志物，例如表面蛋白、胞内标志物或核酸。在一些实施方案中，可以使用采用一种或多种选择试剂以基于这些标志物分离的任何已知方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，该选择包括用一种或多种试剂孵育，以基于一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的细胞表达或表达水平分离细胞和细胞群，例如通过用特异性结合此类标志物的抗体或结合配偶体孵育，随后通常进行洗涤步骤并将已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合抗体或结合配偶体的细胞分离。

分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标志物的细胞。例如，对特定类型的细胞(诸如表达标志物的细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达标志物的细胞完全不存在。同样地，对特定类型的细胞(诸如表达标志物的细胞)的阴性选择、去除或消除是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞完全去除。

在具体的实施方案中，对生物样品(例如，PBMC或其他白细胞的样品)进行CD4+ T细胞的选择，其中阴性和阳性部分均被保留。在某些实施方案中，CD8+ T细胞选自阴性部分。在一些实施方案中，对生物样品进行CD8+ T细胞的选择，其中阴性和阳性部分均被保留。在某些实施方案中，CD4+ T细胞选自阴性部分。

在一些实施方案中，通过对在非T细胞诸如B细胞、单核细胞或其他白细胞诸如CD14上表达的标志物的阴性选择，将T细胞从PBMC样品中分离出来。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标志物的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分选为亚群。

在一些实施方案中，CD8+细胞进一步富集或耗尽初始、中央记忆、效应记忆和/或中央记忆干细胞，诸如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在一些实施方案中，对中央记忆T(TCM)细胞进行富集以提高功效，诸如改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别强大。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TcM的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞进一步增强功效。

在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。PBMC可以富集或去除CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分，诸如使用抗CD8和抗CD62L抗体。

在某些实施方案中，一种或多种组合物是或包括CD8+ T细胞的组合物，该组合物是或包括至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或至少约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，CD8+ T细胞的组合物含有少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，富集的T细胞的组合物基本上由CD8+ T细胞组成。

在一些实施方案中，用于根据任何所提供的方法、用途、制品或组合物产生工程化细胞(例如，用于细胞疗法)的方法包括用于培养细胞(例如，在促进增殖和/或扩增的条件下培养细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化步骤(例如，通过转导或转染将重组多肽引入细胞)后，在促进增殖和/或扩增的条件下培养细胞。在具体的实施方案中，在细胞已在刺激条件下孵育并用重组多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)转导或转染后培养细胞。因此，在一些实施方案中，在促进增殖和/或扩增的条件下培养通过用编码CAR的重组多核苷酸转导或转染而工程化的CAR阳性T细胞的组合物。

在一个方面，T细胞被工程化以减少或缺乏MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达，并且具有减少或缺乏T细胞受体(TCR)复合物的表达。除了MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达减少或缺乏表达之外，原代T细胞可以被工程化以过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且具有T细胞受体(TCR)复合物的表达减少或缺乏表达。在一些情况下，CAR是CD19特异性CAR。在其他情况下，CAR是CD22特异性CAR。在一些情况下，CAR是双特异性CAR。在某些情况下，CAR是CD19/CD22双特异性CAR。任何细胞都可以表达结合CD19和CD22的双特异性CAR。

在一些实施方案中，T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括B2M基因的基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞被工程化以过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞被工程化以过表达CD47和CAR，并且包括TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一种或多种基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。

在一些实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRB^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRB^-/-、CD47tg细胞。在许多实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M^indel/indel、CIITA^indel ^/indel、TRAC^indel/indel、CD47tg细胞。在许多实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、TRB^indel/indel、CD47tg细胞。在许多实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、TRAC^indel/indel、TRB^indel/indel、CD47tg细胞。在一些实施方案中，所描述的修饰的细胞是多能干细胞、诱导的多能干细胞、从此类多能干细胞和诱导的多能干细胞分化的细胞、或原代T细胞。原代T细胞的非限制性示例包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、初始T细胞、调节性T(Treg)细胞、非调节性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、滤泡辅助T(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。

在一些实施方案中，将CD47转基因插入细胞的预先选择的基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的转基因插入细胞的预先选择的基因座。在许多实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入细胞的预先选择的基因座。预先选择的基因座可以是安全港基因座。安全港基因座的非限制性示例包括AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座。在一些实施方案中，预先选择的基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。在一些实施方案中，预先选择的基因座是B2M基因座。在一些实施方案中，预先选择的基因座是CIITA基因座。在一些实施方案中，预先选择的基因座是TRAC基因座。在一些实施方案中，预先选择的基因座是TRB基因座。

在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入相同的基因座。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入不同的基因座。在许多情况下，将CD47转基因插入安全港基因座。在许多情况下，将编码CAR的转基因插入安全港基因座。在一些情况下，将CD47转基因插入B2M基因座。在一些情况下，将编码CAR的转基因插入B2M基因座。在某些情况下，将CD47转基因插入CIITA基因座。在某些情况下，将编码CAR的转基因插入CIITA基因座。在具体的情况下，将CD47转基因插入TRAC基因座。在具体的情况下，将编码CAR的转基因插入TRAC基因座。在许多其他情况下，将CD47转基因插入TRB基因座。在许多其他情况下，将编码CAR的转基因插入TRB基因座。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入安全港基因座(例如，AAVS1基因座、CCR5基因座或ROSA26基因座)。

在许多实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入安全港基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由单个启动子控制并插入安全港基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由它们自己的启动子控制并插入安全港基因座。在许多实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入TRAC基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由单个启动子控制并插入TRAC基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由它们自己的启动子控制并插入TRAC基因座。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入TRB基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由单个启动子控制并插入TRB基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由它们自己的启动子控制并插入TRB基因座。在其他实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入B2M基因座。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由单个启动子控制并插入B2M基因座。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由它们自己的启动子控制并插入B2M基因座。在多种实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入CIITA基因座。在多种实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由单个启动子控制并插入CIITA基因座。在多种实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因由它们自己的启动子控制并插入CIITA基因座。在一些情况下，控制所描述的任何转基因的表达的启动子是组成型启动子。在其他情况下，所描述的任何转基因的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1α启动子。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因均受组成型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因均受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受组成型启动子控制，而编码CAR的转基因受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受诱导型启动子控制，而编码CAR的转基因受组成型启动子控制。在多种实施方案中，CD47转基因受EF1α启动子控制，而编码CAR的转基因受EF1α启动子控制。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因的表达均受单个EF1α启动子控制。

本技术考虑以技术人员可利用本技术的稀有切割核酸酶或CRISPR/Cas系统获得的任何方式改变靶多核苷酸序列。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。此类CRISPR-Cas系统可以采用多种Cas蛋白(Haft等人,PLoS ComputBiol.2005；1(6)e60)。此类Cas蛋白的允许CRISPR/Cas系统改变细胞中的靶多核苷酸序列的分子机制包括RNA结合蛋白、核酸内切酶和外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是I型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是V型CRISPR系统。

方法和编辑的细胞也在WO2016/183041和美国临时专利申请序列号63/133,171中公开，这些文献中的每一篇以引用方式全文并入本文。

如本文进一步详细描述的，本文提供了通过施用低免疫原性细胞、特别是低免疫原性T细胞治疗患有病症的患者的方法。如应当理解的，对于本文描述的涉及治疗的定时和/或组合的所有多个实施方案，细胞的施用通过导致引入的细胞至少部分定位在期望位点的方法或途径实现。可以将细胞直接输注、植入或移植到所需部位，或者通过任何合适的途径施用，从而导致递送至受试者中的所需部位，在该所需部位至少一部分植入的细胞或细胞组分保持存活。在一些实施方案中，细胞不是通过皮下(SC)或肌内(IM)施用于受试者来提供的。在一些实施方案中，细胞是通过静脉内(IV)施用于受试者来提供的。

本文所述的工程化T细胞可用于治疗患有病症的患者的方法中，这些方法包括向受试者(例如，人患者)施用细胞群。

对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对于人施用足够无菌的条件下制备。有关细胞组合物药物制剂的一般原则，参见“Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,”Morstyn&Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；以及“Hematopoietic Stem Cell Therapy,”E.D.Ball,J.Lister&P.Law,ChurchillLivingstone,2000。细胞可以包装在适于分配或临床使用的装置或容器中。

VII.药物组合物和制造方法

在一些方面，本公开还提供了包含本文所述的病毒载体或T细胞组合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可以包含任何所描述的病毒载体。

在一些实施方案中，组合物符合制药或药品生产质量管理规范(GMP)标准。在一些实施方案中，根据药品生产质量管理规范(GMP)制备组合物。在一些实施方案中，组合物具有低于预定参考值的病原体水平，例如基本上不含病原体。在一些实施方案中，组合物具有低于预定参考值的污染物水平，例如基本上不含污染物。在一些实施方案中，组合物具有低免疫原性。

在一些实施方案中，本文提供了本发明的药物组合物或其盐用于实践本发明的方法的用途。这样的药物组合物可以由适合施用于受试者的形式的至少一种本发明的化合物或缀合物或其盐组成，或者所述药物组合物可包含至少一种本发明的化合物或缀合物或其盐以及一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种附加成分或这些的一些组合。在一些实施方案中，本发明的化合物或缀合物可以以生理学上可接受的盐(诸如与生理学上可接受的阳离子或阴离子组合，如本领域中熟知的)的形式存在于药物组合物中。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何附加成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、大小和疾患并且进一步取决于组合物有待施用的途径而变化。在一些实施方案中，组合物可包含0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。

在一些实施方案中，可用于本发明方法的药物组合物可以适当地开发用于静脉内、瘤内、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺部、鼻内、口腔、眼部或其他施用途径。在一些实施方案中，可用于本发明方法中的组合物可以直接施用于哺乳动物的皮肤、阴道或任何其他组织。在一些实施方案中，配制品包括脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的配制品。在一些实施方案中，施用途径对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且将取决于许多因素，包括所治疗的疾病的类型和严重程度，所治疗的兽医或人受试者的类型和年龄等。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法来制备。在一些实施方案中，制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分缔合，然后如果有必要或需要，使产品成形或包装成所需的单剂量或多剂量单位。

在一些实施方案中，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的离散量的药物组合物。在一些实施方案中，活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量或这种剂量的方便部分(例如这种剂量的二分之一或三分之一)。在一些实施方案中，单位剂型可以用于单个日剂量或多个日剂量之一(例如，每天约1至4次或更多次)。在一些实施方案中，当使用多个日剂量时，单位剂型对于每个剂量可以是相同的或不同的。

在一些实施方案中，虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于向人进行伦理施用的药物组合物，但是本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合施用于所有种类的动物。在一些实施方案中，对适合于向人施用的药物组合物进行修饰以使所述组合物适合施用于各种动物得到很好地理解，并且普通熟练的兽医药理学家可以仅利用普通的实验(如果有的话)来设计和进行这种修饰。在一些实施方案中，预期施用本发明的药物组合物的受试者包括人和其他灵长类动物、哺乳动物(包括商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫和狗)。

在一些任何实施方案中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体配制本发明的组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的化合物或缀合物和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，有用的药学上可接受的载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其他药学上可接受的盐溶液诸如磷酸盐和有机酸盐。这些和其他药学上可接受的载体的示例在Remington's Pharmaceutical Sciences(1991,MackPublication Co.,New Jersey)中有所描述。

在一些实施方案中，所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。在一些实施方案中，可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散液的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在一些实施方案中，可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在一些实施方案中，优选的是在所述组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇诸如甘露醇和山梨糖醇。在一些实施方案中，可以通过在所述组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。在一个实施方案中，药学上可接受的载体不是单独的DMSO。

在一些实施方案中，配制品可以与常规赋形剂混合使用，所述常规赋形剂即适合于口服、阴道、肠胃外、鼻、静脉内、皮下、肠内或本领域已知的任何其他合适的施用模式的药学上可接受的有机或无机载体物质。在一些实施方案中，药物制剂可以被灭菌，并且如果需要可以与助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。在一些实施方案中，药物制剂还可以在需要时与其他活性剂例如其他镇痛剂组合。

在一些实施方案中，“附加成分”包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理可降解组合物，诸如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂，缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合材料或疏水性材料。在一些实施方案中，可包括在本发明的药物组合物中的“附加成分”是本领域已知的并且描述于例如Genaro编辑(1985,Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)中，该文献以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，本发明的组合物可包含按组合物的总重量计约0.005％至2.0％的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂用于在暴露于环境中的污染物的情况下防止腐败。在一些实施方案中，可用于本发明的防腐剂的示例包括但不限于选自由以下组成的组的那些：苄醇、山梨酸、对羟基苯甲酸酯、咪脲以及它们的组合。在一些实施方案中，特别优选的防腐剂是约0.5％至2.0％苯甲醇和0.05％至0.5％山梨酸的组合。

在一些实施方案中，组合物优选地包括抗氧化剂和抑制化合物降解的螯合剂。在一些实施方案中，用于一些化合物的抗氧化剂是BHT、BHA、α-生育酚和抗坏血酸，其范围优选地为按组合物的总重量计约0.01重量％至0.3重量％以及范围更优选地为0.03重量％至0.1重量％。在一些实施方案中，螯合剂以按组合物的总重量计0.01重量％至0.5重量％的量存在。特别优选的螯合剂包括依地酸盐(例如依地酸二钠)和柠檬酸，其重量范围为按组合物的总重量计约0.01重量％至0.20重量％、更优选地范围为0.02重量％至0.10重量％。在一些实施方案中，螯合剂可用于螯合组合物中可能对配制品的保质期有害的金属离子。在一些实施方案中，如本领域技术人员已知的，因此可以用其他合适和等效的抗氧化剂和螯合剂代替。

在一些实施方案中，可以使用常规方法制备液体悬浮液以实现活性成分悬浮于水性或油性媒介物中。在一些实施方案中，水性媒介物包括例如水和等渗盐水。在一些实施方案中，油性媒介物包括例如杏仁油、油性酯、乙醇、植物油(诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)、分馏的植物油和矿物油诸如液体石蜡。在一些实施方案中，液体悬浮液还可包含一种或多种附加成分，包括但不限于助悬剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、着色剂和甜味剂。在一些实施方案中，油性悬浮液还可包含增稠剂。在一些实施方案中，悬浮剂包括但不限于山梨糖醇糖浆、氢化食用脂肪、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、阿拉伯树胶和纤维素衍生物诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。在一些实施方案中，分散剂或润湿剂包括但不限于天然存在的磷脂诸如卵磷脂、环氧烷烃与脂肪酸、与长链脂肪醇、与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯、或与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如分别为聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯氧鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。已知的乳化剂包括但不限于卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂包括例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖和糖精。用于油性悬浮液的已知增稠剂包括例如蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。

在一些实施方案中，活性成分在水性或油性溶剂中的液体溶液可以以与液体悬浮液基本相同的方式制备，主要区别在于活性成分溶解而不是悬浮在溶剂中。如本文所用，“油性”液体是包含含碳液体分子并且表现出比水小的极性特征的液体。在一些实施方案中，本发明的药物组合物的液体溶液可包含关于液体悬浮液所述的每种组分，应当理解悬浮剂不一定有助于活性成分在溶剂中的溶解。在一些实施方案中，水性溶剂包括例如水和等渗盐水。在一些实施方案中，油性溶剂包括例如杏仁油、油性酯、乙醇、植物油(诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)、分馏的植物油和矿物油诸如液体石蜡。

在一些实施方案中，本发明的药物制剂的粉末和颗粒配制品可以使用已知方法制备。在一些实施方案中，配制品可以直接施用于受试者，用于例如形成片剂，填充胶囊或通过向其中添加水性或油性媒介物来制备水性或油性悬浮液或溶液。在一些任何实施方案中，配制品还可包含分散剂或润湿剂、悬浮剂和防腐剂中的一种或多种。这些配制品中还可包含附加的赋形剂，诸如填充剂和甜味剂、调味剂或着色剂。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物还可以以水包油乳液或油包水乳液的形式制备、包装或销售。在一些实施方案中，油相可以是植物油诸如橄榄油或花生油、矿物油诸如液体石蜡、或这些的组合。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种乳化剂，诸如天然存在的树胶(诸如阿拉伯树胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(诸如大豆磷脂或卵磷脂)、来源于脂肪酸和己糖醇酐的组合的酯或偏酯(诸如脱水山梨糖醇单油酸酯)以及此类偏酯与环氧乙烷的缩合产物(诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一些实施方案中，乳液还可以含有附加成分，包括例如甜味剂或调味剂。

VIII.递送和治疗方法

在一些实施方案中，本文提供的病毒载体能够将外源试剂递送(例如，递送)至靶细胞。本文提供的方法包括将试剂递送至靶细胞的方法。在一些实施方案中，外源试剂是完全异源的或不由靶细胞产生或正常表达的试剂。在一些实施方案中，将外源试剂递送至靶细胞可以提供治疗受试者疾病或疾患的治疗效果。治疗效果可以通过靶向、调节或改变存在的或由靶细胞表达的抗原或蛋白来实现，该靶细胞与疾病或疾患相关或涉及疾病或疾患。治疗效果可以通过提供外源试剂来实现，其中外源试剂是靶细胞中不存在的、突变的或比野生型水平低的蛋白质(或编码该蛋白质的核酸，例如，编码该蛋白质的mRNA)。在一些实施方案中，靶细胞来自患有遗传疾病，例如单基因疾病，例如单基因胞内蛋白质疾病的受试者。

可以将本文所述的病毒载体施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在此类实施方案中，受试者可能有风险患上特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)，可能具有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的症状，或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)。在一些实施方案中，疾病或疾患可以是通过将包含在所施用的病毒载体中的外源试剂递送至受试者的靶细胞而治疗的疾病或疾患。

在某些方面，本公开还提供了一种向受试者(例如，人受试者)、靶组织或细胞施用病毒载体的方法，包括向受试者施用包含本文所述的多种病毒载体的组合物、本文所述的病毒载体组合物或本文所述的药物组合物或使靶组织或细胞与它们接触，从而向受试者施用病毒载体组合物。

在某些方面，本公开还提供了一种向受试者、靶组织或细胞递送外源试剂例如治疗剂(例如，多肽、核酸、代谢物、细胞器或亚细胞结构)的方法，包括向受试者施用本文所述的多种病毒载体、包含本文所述的多种病毒载体的病毒载体组合物或本文所述的药物组合物或使靶组织或细胞与它们接触，其中该组合物以一定量和/或时间施用，使得该治疗剂被递送。

在某些方面，本公开还提供了一种向受试者、靶组织或细胞递送一定功能的方法，包括向受试者施用本文所述的多种病毒载体、包含本文所述的多种病毒载体的病毒载体组合物、本文所述的病毒载体组合物或本文所述的药物组合物或使靶组织或细胞与它们接触，其中该病毒载体组合物以一定量和/或时间施用，使得该功能通过病毒载体组合物将外源试剂(例如，治疗剂)递送至靶组织或细胞来递送。

在一些实施方案中，靶细胞或组织是在WO 2020/102499、WO 2020/102485、WO2019/222403、WO 2020/014209和WO 2020/102503中的任一个中列出的任何此类靶细胞或组织，这些文献中的每一篇据此以引用方式全文并入。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、αβT细胞、γδT细胞、初始T细胞、效应T细胞、细胞毒性T细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)、调节性T细胞(例如，胸腺衍生的调节性T细胞、外周衍生的调节性T细胞、CD4+Foxp3+调节性T细胞或CD4+FoxP3-1型调节性T(Trl)细胞)、辅助性T细胞(例如，CD4+辅助性T细胞、Thl细胞、Th2细胞、Th3细胞、Th9细胞、Thl7细胞、Th22细胞或T滤泡辅助(Tfh)细胞)、记忆T细胞(例如，干细胞记忆T细胞、中央记忆T细胞或效应记忆T细胞)、NKT细胞和粘膜相关不变T(MAIT)细胞中的任一种。

A.递送

在一些实施方案中，病毒载体将外源试剂递送至靶细胞群(例如，CD8+ T细胞)中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞。在一些实施方案中，病毒载体将至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的外源试剂递送至靶细胞群(例如，CD8+ T细胞)。

在一些实施方案中，与非靶细胞群相比，病毒载体将至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上的外源试剂递送至靶细胞群(例如，CD8+T细胞)。在一些实施方案中，病毒载体将更多的外源试剂递送至靶细胞群，基于包含促进与靶细胞群结合但不与非靶细胞群结合的融合剂或再靶向融合剂的病毒载体。病毒载体可以包含本文所述的任何示例性融合剂和再靶向融合剂。在一些实施方案中，当多种病毒载体与包含靶细胞(例如，CD8+ T细胞)和非靶细胞的细胞群接触时，外源试剂在靶细胞中的存在量是在非靶细胞中的至少10倍。在一些实施方案中，当多种病毒载体与包含靶细胞(例如，CD8+ T细胞)和非靶细胞的细胞群接触时，外源试剂在靶细胞中的存在量是在非靶细胞中的至少2倍、5倍、10倍、20倍或50倍和/或外源试剂在靶细胞中的存在量是在非靶细胞中的至少2倍、5倍、10倍、20倍或50倍。在一些实施方案中，多个病毒载体与靶细胞的融合率比与非靶细胞的融合率高至少50％。

在一些实施方案中，病毒载体能够将核酸递送(例如，递送)至靶细胞，例如以稳定地修饰靶细胞的基因组，例如用于基因治疗。类似地，在一些实施方案中，本文的方法包括将核酸递送至靶细胞。

在一些实施方案中，本文的方法包括通过将细胞表面配体呈递在病毒载体上来引起配体呈递在靶细胞表面上。在一些实施方案中，病毒载体能够引起靶细胞的细胞死亡。在一些实施方案中，病毒载体来自NK源细胞。

在一些实施方案中，病毒载体或靶细胞能够吞噬(例如，病原体)。类似地，在一些实施方案中，本文的方法包括引起吞噬。

在一些实施方案中，病毒载体包含(例如，能够递送至靶细胞)膜蛋白或编码该膜蛋白的核酸。

在一些实施方案中，病毒载体(例如，融合体)与靶细胞(例如，CD8+ T细胞)的融合率比与非靶细胞的融合率高，基于包含促进与靶细胞结合而不与非靶细胞结合的融合剂或再靶向融合剂的病毒载体。病毒载体可以包含本文所述的任何示例性融合剂和再靶向融合剂。在一些实施方案中，病毒载体(例如，融合体)与靶细胞的融合率比与非靶细胞的融合率高，例如高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施方案中，病毒载体(例如，融合体)与靶细胞的融合率比与其他病毒载体的融合率高，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，病毒载体(例如，融合体)与靶细胞的融合率使得病毒载体中的外源试剂或编码外源试剂的核酸在24、48或72小时后递送至至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞。在实施方案中，靶向融合的量为约30％-70％、35％-65％、40％-60％、45％-55％或45％-50％。在实施方案中，靶向融合的量为约20％-40％、25％-35％或30％-35％。

在一些实施方案中，融合剂以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在。在一些实施方案中，病毒载体所包含的融合剂的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％位于细胞膜中。在实施方案中，病毒载体还在内部(例如，在细胞质或细胞器中)包含融合剂。在一些实施方案中，融合剂包含(或被鉴定为包含)病毒载体中总蛋白的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％或更多，或约1％-30％、5％-20％、10％-15％、12％-15％、13％-14％或13.6％，例如，如通过质谱分析所测定的。在实施方案中，融合剂包含(或被鉴定为包含)病毒载体中总蛋白的约13.6％。在一些实施方案中，融合剂(或被鉴定为)丰度比一种或多种另外的目标蛋白高或低。在一个实施方案中，融合剂与EGFP的比率为(或被鉴定为)约140、145、150、151、152、153、154、155、156、157(例如，156.9)、158、159、160、165或170。在另一个实施方案中，融合剂与CD63的比率为(或被鉴定为)约2700、2800、2900、2910(例如，2912)、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990或3000，或约1000-5000、2000-4000、2500-3500、2900-2930、2910-2915或2912.0，例如，通过质谱分析。在一个实施方案中，融合剂与ARRDC1的比率为(或被鉴定为)约600、610、620、630、640、650、660(例如，664.9)、670、680、690或700。在另一个实施方案中，融合剂与GAPDH的比率为(或被鉴定为)约50、55、60、65、70(例如，69)、75、80或85，或约1％-30％、5％-20％、10％-15％、12％-15％、13％-14％或13.6％。在另一个实施方案中，融合剂与CNX的比率为(或被鉴定为)约500、510、520、530、540、550、560(例如，558.4)、570、580、590或600，或约300-800、400-700、500-600、520-590、530-580、540-570、550-560或558.4，例如，通过质谱分析。

B.递送系统

本文提供了向受试者施用包含CD8结合剂的慢病毒载体的方法。在一些实施方案中，该方法包括a)从受试者获得全血；b)收集含有包含CD8+ T细胞的白细胞组分的血液部分；c)使包含CD8+ T细胞的白细胞组分与包含慢病毒载体的组合物接触以产生转染混合物；以及d)将接触的包含CD8+ T细胞的白细胞组分和/或转染混合物再输注到受试者中，从而将脂质颗粒和/或有效负载基因施用于受试者。在一些实施方案中，T细胞(例如CD8+ T细胞)在该方法过程中不被活化。

根据本公开的方法能够将慢病毒颗粒递送至离体系统。该方法可以包括使用各种单采机器硬件部件、软件控制模块和传感器模块的组合来串联测量柠檬酸盐或其他溶质水平，以确保治疗处方的最大准确性和安全性，以及使用设计为充分利用根据本发明方法的系统设计的替换流体。应当理解，针对根据本发明的一个系统描述的部件也可以在根据本发明的其他系统内实现。

在一些实施方案中，用于向受试者施用慢病毒载体的方法包括使用用于从受试者获得全血的血液处理装置、用于收集含有包含CD8+T细胞的白细胞组分的血液部分的分离室、用于使CD8+ T细胞与包含慢病毒载体的组合物接触的接触容器，以及用于将CD8+ T细胞再输注到患者体内的另一流体回路。在一些实施方案中，该方法还包括i)用于浓缩T细胞的洗涤部件和ii)用于监测细胞密度和/或浓度的传感器和/或模块中的任一种。在一些实施方案中，这些方法允许直接处理来自患者的血液，用慢病毒载体转导，并直接再输注到患者体内，而无需任何选择T细胞或CD8+ T细胞的步骤。此外，这些方法还可以在任何一个或多个步骤之前或之间不冷冻保存或冷冻任何细胞的情况下进行，使得不存在用冷冻保护剂例如DMSO配制细胞的步骤。在一些实施方案中，所提供的方法还不包括淋巴细胞清除方案。在一些实施方案中，包括步骤(a)-(d)的方法可以进行不超过24小时，诸如2小时至12小时，例如3小时至6小时。

在一些实施方案中，该方法是串联执行的。在一些实施方案中，该方法在封闭的流体回路或功能上封闭的流体回路中执行。在一些实施方案中，步骤(a)-(d)中的每一个在封闭的流体回路中串联执行，其中系统的所有部分可操作地连接，诸如经由至少一个管道线路。在一些实施方案中，系统是无菌的。在一些实施方案中，封闭的流体回路是无菌的。

本文还提供了用于向受试者施用包含CD8结合剂的慢病毒载体的系统，包括美国专利申请号63/298,196中描述的那些系统中的任一种，该专利申请以引用方式全文并入本文。图5示出了用于施用的示例性系统。

C.治疗和使用

在一些实施方案中，可以将如本文所述的本文提供的病毒载体或其药物组合物施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，施用将病毒载体递送至受试者中的靶细胞(例如，CD8+ T细胞)。在这样的实施方案中，受试者可能有风险患上特定疾病或疾患，可能具有特定疾病或疾患的症状，或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或疾患。在一些实施方案中，这些方法由此治疗受试者的疾病或疾患或病症。在一个实施方案中，受试者患有癌症。在一个实施方案中，受试者患有感染性疾病。在一些实施方案中，病毒载体(例如逆转录病毒颗粒、其他病毒载体或其融合体)含有编码用于治疗受试者疾病或疾患的外源试剂的核酸序列。例如，外源试剂是靶向肿瘤细胞的蛋白质或对其具有特异性的试剂，并且将病毒载体(例如逆转录病毒颗粒、其他病毒载体或其融合体)施用于受试者以治疗受试者的肿瘤或癌症。在另一个示例中，外源试剂是炎性介质或免疫分子(诸如细胞因子)，并且将病毒载体(例如逆转录病毒颗粒、其他病毒载体或其融合体)施用于受试者，用于治疗期望调节(例如增加)免疫反应的任何疾患，诸如癌症或感染性疾病。在一些实施方案中，以有效量或剂量施用病毒载体(例如逆转录病毒颗粒、其他病毒载体或其融合体)，以实现疾病、疾患或病症的治疗。

本文提供了任何所提供的病毒载体(例如逆转录病毒颗粒、其他病毒载体或其融合体)在这些方法和治疗中以及在制备药物以进行此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，这些方法通过将病毒载体(例如逆转录病毒颗粒、其他病毒载体或其融合体)或包含它们的组合物施用于患有、已经患有或怀疑患有疾病或疾患或病症的受试者来进行。在一些实施方案中，这些方法由此治疗受试者的疾病或疾患或病症。本文还提供了任何组合物(诸如本文提供的药物组合物)用于治疗与由外源药剂靶向或由外源药剂提供的特定基因或蛋白质相关的疾病、疾患或病症的用途。

在一些实施方案中，所提供的方法或用途涉及药物组合物的施用，所述施用包括口服、吸入、经皮或肠胃外(包括静脉内、肿瘤内、腹膜内、肌内、腔内和皮下)施用。在一些实施方案中，病毒载体可以单独施用或配制为药物组合物。在一些实施方案中，可以将本文所述的病毒载体或药物组合物施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在一些任何实施方案中，受试者可能有风险患上特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)，可能具有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的症状，或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)。在一些实施方案中，疾病是疾病或病症。

在一些实施方案中，病毒载体可以以单位剂量组合物的形式施用，例如单位剂量口服、肠胃外、透皮或吸入组合物。在一些实施方案中，所述组合物通过混合制备并且适于口服、吸入、经皮或肠胃外施用，并且因此可以呈片剂、胶囊、口服液体制剂、粉末、颗粒、锭剂、可重构粉末、可注射和可输注溶液或悬浮液或栓剂或气雾剂的形式。

在一些实施方案中，施用方案可能影响有效量的组成。在一些实施方案中，可以在疾病诊断之前或之后将治疗配制品施用于受试者。在一些实施方案中，可以每天或依序施用几个分剂量以及交错剂量，或者可以连续输注剂量，或者可以是推注注射。在一些实施方案中，如治疗或预防情况的紧急程度所指示，可以成比例地增加或减少治疗配制品的剂量。

在一些实施方案中，可以使用已知程序以有效预防或治疗疾病的剂量和时间段进行本发明的组合物向受试者(优选地哺乳动物，更优选地人)的施用。在一些实施方案中，实现治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据如下因素而变化，所述因素诸如所用的特定化合物的活性；施用的时间；化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与化合物组合使用的其他药物、化合物或材料；所治疗的受试者的疾病或病症的状态、年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往医疗史；以及医学领域熟知的类似因素。在一些实施方案中，可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。在一些实施方案中，可以每天施用几个分剂量，或者如治疗情况的紧急程度所指示，可以成比例减少所述剂量。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并确定治疗化合物的有效量而无需过多的实验。

在一些实施方案中，组合物可以每天数次的频率施用给受试者，或者可以更低的频率施用，诸如一天一次、一周一次、每两周一次、一月一次，或者甚至更低的频率，诸如每几个月一次或甚至一年一次或更少。在一些实施方案中，在非限制性示例中，组合物的量可以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天施用。剂量的频率对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且将取决于许多因素，诸如但不限于所治疗的疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中的活性成分的剂量水平可以改变，以便获得对于特定受试者、组合物和施用模式可有效实现期望的治疗反应而对受试者无毒的活性成分的量。

具有本领域普通技术的医生(例如医师或兽医)可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。在一些实施方案中，医师或兽医可以以低于实现期望的治疗效果所需的水平开始药物组合物中采用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加所述剂量直至实现期望的效果。

在一些实施方案中，尤其有利的是将化合物配制成易于施用和剂量均匀的剂量单位形式。在一些实施方案中，如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算可产生期望的治疗效果的预定量的治疗化合物以及期望的药物媒介物。在一些实施方案中，本发明的剂量单位形式由以下项规定并且直接取决于以下项：(a)治疗化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)本领域中混配/配制这种治疗化合物用于治疗受试者的疾病所固有的限制。

在一些实施方案中，本文提供的含有所提供的病毒载体(诸如本文所述的任何病毒载体或基于病毒的颗粒)的组合物可以以基因组拷贝(GC)的剂量单位配制。测定GC的合适方法已有描述，并且包括例如qPCR或数字液滴PCR(ddPCR)，如例如M.Lock等人,Hu GeneTherapy Methods,Hum Gene Ther Methods 25(2):115-25.2014所描述，该文献以引用方式并入本文。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁴至约10¹⁰GC单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁹至约10¹⁵GC单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁵至约10⁹GC单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁶至约10⁹GC单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁹至约10¹²GC单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10¹²至约10¹⁴GC单位，包括端点值。在一些实施方案中，施用剂量为1.0×10⁹GC单位、5.0×10⁹GC单位、1.0×10¹⁰GC单位、5.0×10¹⁰GC单位、1.0×10¹¹GC单位、5.0×10¹¹GC单位、1.0×10¹²GC单位、5.0×10¹²GC单位、或1.0×10¹³GC单位、5.0×10¹³GC单位、1.0×10¹⁴GC单位、5.0×10¹⁴GC单位或1.0×10¹⁵GC单位。

在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁴至约10¹⁰感染单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁹至约10¹⁵感染单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁵至约10⁹感染单位。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁶至约10⁹感染单位。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁹至约10¹²感染单位，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10¹²至约10¹⁴感染单位，包括端点值。在一些实施方案中，施用剂量为1.0×10⁹感染单位、5.0×10⁹感染单位、1.0×10¹⁰感染单位、5.0×10¹⁰感染单位、1.0×10¹¹感染单位、5.0×10¹¹感染单位、1.0×10¹²感染单位、5.0×10¹²感染单位，或1.0×10¹³感染单位、5.0×10¹³感染单位、1.0×10¹⁴感染单位、5.0×10¹⁴感染单位或1.0×10¹⁵感染单位。可用于定量感染单位的技术是本领域的常规技术，包括病毒颗粒数测定、荧光显微镜检查和通过噬菌斑测定的滴度。例如，腺病毒颗粒的数量可以通过测量A260的吸光度来确定。类似地，感染单位也可以通过使用单克隆抗体的载体特异性蛋白的定量免疫荧光或通过噬菌斑测定来确定。

在一些实施方案中，计算感染单位的方法包括噬斑测定，其中病毒的滴定在细胞单层上进行，并且在几天至几周后计数噬斑的数量。例如，确定感染滴度，诸如通过噬斑测定，例如评估细胞病变效应(CPE)的测定。在一些实施方案中，通过在覆盖有琼脂糖的单层细胞(诸如HFF细胞)上连续稀释病毒来进行CPE测定。在孵育一段时间以实现细胞病变效应，诸如约3至28天，通常7至10天后，可固定细胞，并且确定显现为噬斑的缺失细胞的病灶。在一些实施方案中，可以使用终点稀释(TCID₅₀)方法确定感染单位，所述方法确定50％细胞培养物被感染时的病毒稀释度，并且因此，通常可以确定一定范围内的滴度，诸如一个对数。

在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁴至约10¹⁰噬斑形成单位(pfu)，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁹至约10¹⁵pfu，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁵至约10⁹pfu。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁶至约10⁹pfu。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10⁹至约10¹²pfu，包括端点值。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约10¹²至约10¹⁴pfu，包括端点值。在一些实施方案中，施用剂量为1.0×10⁹pfu、5.0×10⁹pfu、1.0×10¹⁰pfu、5.0×10¹⁰pfu、1.0×10¹¹pfu、5.0×10¹¹pfu、1.0×10¹²pfu、5.0×10¹²pfu，或1.0×10¹³pfu、5.0×10¹³pfu、1.0×10¹⁴pfu、5.0×10¹⁴pfu或1.0×10¹⁵pfu。

在一些方面，本文提供的药物组合物中媒介物的施用剂量根据受试者的体重而变化。例如，组合物可以被调配为GC/kg、感染单位/kg、pfu/kg等。在一些方面，获得治疗效果的剂量为或约10⁸GC/kg或为或约10¹⁴GC/kg受试者体重，包括端点值。在一些方面，获得治疗效果的剂量为或约10⁸GC/kg受试者体重(GC/kg)。在一些方面，剂量为或约10⁸感染单位/kg至或约10¹⁴感染单位/kg受试者体重，包括端点值。

在任何实施方案中的一些中，本发明的组合物以每天一至五次或更多次的剂量施用于受试者。在另一个实施方案中，本发明的组合物以包括但不限于每天一次、每两天一次、每三天一次至每周一次和每两周一次的剂量范围施用于受试者。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的各种组合组合物的施用频率将根据许多因素在受试者之间变化，所述因素包括但不限于年龄、待治疗的疾病或病症、性别、总体健康状况和其他因素。

在任何实施方案中的一些中，本公开涉及一种包装的药物组合物，其包含容纳治疗有效量的单独的或与第二药剂组合的本发明的化合物或缀合物的容器；以及使用该化合物或缀合物治疗、预防或减轻受试者的疾病的一种或多种症状的说明书。

在一些实施方案中，术语“容器”包括用于容纳药物组合物的任何贮器。在一些实施方案中，容器是含有药物组合物的包装。在其他实施方案中，容器不是含有药物组合物的包装，即容器是贮器，诸如含有包装的药物组合物或未包装的药物组合物和药物组合物的使用说明书的盒子或小瓶。应当理解，药物组合物的使用说明书可包含在含有药物组合物的包装上，并且因此所述说明书形成增加的与包装产品的功能关系。在一些实施方案中，说明书可包含关于化合物执行其预期功能(例如治疗或预防受试者的疾病或向受试者递送成像剂或诊断剂)的能力的信息。

在一些实施方案中，本文公开的任何组合物的施用途径包括口服、鼻、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道周围)、内(鼻)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌内、皮内、动脉内、静脉内、瘤内、支气管内、吸入和局部施用。

在一些任何实施方案中，合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊、囊片、丸剂、凝胶帽、锭剂、分散体、悬浮液、溶液、糖浆、颗粒、珠粒、经皮贴片、凝胶、粉末、小丸、乳浆剂、锭剂、乳膏、糊剂、硬膏剂、洗剂、原片、栓剂、用于鼻或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或气溶胶化配制品、用于膀胱内施用的组合物和配制品等。

在任何实施方案中的一些中，将本文所述的病毒载体组合物离体递送至细胞或组织，例如人细胞或组织。在实施方案中，组合物改善离体细胞或组织的功能，例如改善细胞活力、呼吸或其他功能(例如本文所述的另一种功能)。

在一些实施方案中，将组合物递送至处于损伤状态(例如，来自创伤、疾病、缺氧、缺血或其他损伤)的离体组织。

在一些实施方案中，将组合物递送至离体移植物(例如用于移植的组织外植体或组织，例如人静脉、肌肉骨骼移植物诸如骨或肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经；或分离或培养的器官，例如待移植到人中的器官，例如人心脏、肝、肺、肾、胰腺、肠、胸腺、眼睛)。在一些实施方案中，在移植之前、期间和/或之后将组合物递送至组织或器官。

在一些实施方案中，将组合物与细胞(例如细胞制剂)一起递送、施用或与细胞(例如细胞制剂)接触。在一些实施方案中，细胞制剂可以是细胞治疗制剂(意图施用于人受试者的细胞制剂)。在实施方案中，细胞制剂包含表达嵌合抗原受体(CAR)(例如表达重组CAR)的细胞。表达CAR的细胞可以是例如T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞。在实施方案中，细胞制剂是神经干细胞制剂。在实施方案中，细胞制剂是间充质干细胞(MSC)制剂。在实施方案中，细胞制剂是造血干细胞(HSC)制剂。在实施方案中，细胞制剂是胰岛细胞制剂。

在一些实施方案中，本文所述的病毒载体组合物可施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在此类实施方案中，受试者可能有风险患上特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)，可能具有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的症状，或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)。

在一些实施方案中，病毒载体的来源来自施用病毒载体组合物的同一受试者。在其他实施方案中，他们是不同的。在一些实施方案中，病毒载体和受体组织的来源可以是自体的(来自同一受试者)或异源的(来自不同受试者)。在一些实施方案中，本文所述的病毒载体组合物的供体组织可以是与受体组织不同的组织类型。在一些实施方案中，供体组织可以是肌肉组织，并且受体组织可以是结缔组织(例如脂肪组织)。在其他实施方案中，供体组织和受体组织可以是相同或不同的类型，但来自不同的器官系统。

在一些实施方案中，可以将本文所述的病毒载体组合物施用于患有癌症、自身免疫疾病、感染性疾病、代谢性疾病、神经退行性疾病或遗传性疾病(例如，酶缺乏)的受试者。

IX.示例性实施方案

所提供的实施方案包括：

1.一种转导T细胞的方法，所述方法包括：

使未活化的T细胞与包含CD8结合剂的慢病毒载体接触，其中所述慢病毒载体转导所述未活化的T细胞。

2.如实施方案1所述的方法，其中所述T细胞是CD8+ T细胞。

3.如实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述未活化的T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性。

4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)处理。

5.如实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。

6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用与抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体(例如CD28.2)偶联的珠处理，任选地其中所述珠是超顺磁珠。

7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)处理，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

8.如实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用可溶性T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体或可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD137L或可溶性ICOS-L)处理。

9.如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原。

10.如实施方案9所述的方法，其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。

11.如实施方案9或实施方案10所述的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含CD3ζ信号传导结构域和共刺激信号传导结构域的细胞内组分的细胞内信号传导结构域。

12.如实施方案11所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域是4-1BB信号传导结构域。

13.如实施方案9所述的方法，其中所述工程化T细胞受体(TCR)。

14.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞是人T细胞。

15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞在受试者中。

16.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞是在体外的。

17.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞是来自受试者的离体的。

18.如实施方案15或实施方案17所述的方法，其中在接触之前，所述受试者尚未被施用T细胞活化治疗。

19.如实施方案15、17或18所述的方法，其中所述受试者患有疾病或疾患。

20.一种转导的T细胞，其通过如实施方案1-14、16-19和56-119中任一项所述的方法产生。

21.一种包含如实施方案20所述的转导的T细胞的组合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

22.一种转导T细胞群体的方法，所述方法包括：

使未活化的T细胞群体与包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物接触，其中所述未活化的T细胞群体以至少1％的效率转导。

23.如实施方案22所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体以至少5％的效率转导。

24.如实施方案22或实施方案23所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体以至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的效率转导。

25.如实施方案22-24中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体中至少75％的所述T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性(例如所述群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的所述T细胞对于所述T细胞活化标志物呈表面阴性)。

26.如实施方案22-25中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体包含CD8+ T细胞(例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的所述未活化的T细胞群体是CD8+ T细胞)。

27.如实施方案26所述的方法，其中至少75％的所述CD8+ T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性(例如所述群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的所述CD8+ T细胞对于所述T细胞活化标志物呈表面阴性)。

28.如实施方案26或实施方案27所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体中的所述CD8+ T细胞以至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的效率转导。

29.如实施方案22-28中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)处理。

30.如实施方案22-29中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。

31.如实施方案22-30中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用与抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体(例如CD28.2)偶联的珠处理，任选地其中所述珠是超顺磁珠。

32.如实施方案22-31中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)处理，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

33.如实施方案22-32中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用可溶性T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体或可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD137L或可溶性ICOS-L)处理。

34.如实施方案22-33中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体是人细胞。

35.如实施方案22-34中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体在受试者中。

36.如实施方案35所述的方法，其中在接触之前，所述受试者尚未被施用T细胞活化治疗。

37.如实施方案22-34中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体是在体外的。

38.如实施方案22-34中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体是来自受试者的离体的。

39.如实施方案22-34、37和38中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体包含外周血单核细胞(PBMC)或其包含CD8+ T细胞的亚群。

40.如实施方案22-34和37-39中任一项所述的方法，其中所述未活化的细胞群体是选自来自受试者的生物样品的富集的T细胞群体，任选地其中所述T细胞是针对对于T细胞标志物(例如，CD3或CD8)呈表面阳性的T细胞而选择的。

41.如实施方案40所述的方法，其中所述生物样品是全血样品、单采样品或白细胞单采样品。

42.如实施方案35、36和38-41所述的方法，其中所述受试者患有疾病或疾患。

43.如实施方案22-34和37-42中任一项所述的方法，其还包括扩增转导的T细胞群体。

44.如实施方案43所述的方法，其中所述扩增包括将所述转导的细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

45.如实施方案22-34和37-43中任一项所述的方法，其还包括将所述转导的T细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

46.一种转导的T细胞群体，其通过如实施方案22-34、37-45和56-119中任一项所述的方法产生。

47.一种包含通过如实施方案22-34、37-45和56-119中任一项所述的方法产生的转导的T细胞群体的组合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

48.如实施方案21或实施方案47所述的组合物，其还包含冷冻防腐剂，任选地其中所述冷冻防腐剂是DMSO。

49.一种体内转导T细胞的方法，所述方法包括：

向受试者施用包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，其中所述慢病毒载体在所述受试者中转导T细胞，并且其中所述受试者在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。

50.如实施方案49所述的方法，其中所述受试者患有疾病或疾患。

51.一种治疗患有疾病或疾患的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，并且其中所述受试者在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。

52.如实施方案19、42和51中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患是癌症。

53.如实施方案19、42、51和52中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别由与所述疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

54.一种用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的方法，所述方法包括：

55.如实施方案54所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别在所述肿瘤细胞上表达的蛋白质，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

56.如实施方案18、36、49-555、108-112和129-131中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用抗CD3抗体(例如，OKT3)。

57.如实施方案18、36、49-56、108-112和129-131中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用可溶性T细胞共刺激分子(例如，抗CD28抗体或重组CD80、CD86、CD137L、ICOS-L)。

58.如实施方案18、36、49-57、108-112和129-131中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

59.如实施方案18、36、49-58、108-112和129-131中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用重组IL-7，任选地人IL-7。

60.如实施方案18、36、49-59、108-112和129-131中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用淋巴细胞清除疗法，任选地施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。

61.如实施方案1-60中任一项所述的方法，其中所述CD8结合剂是抗CD8抗体或抗原结合片段。

62.如实施方案61所述的方法，其中所述抗CD8抗体或抗原结合片段是小鼠、兔、人或人源化的。

63.如实施方案56或实施方案57所述的方法，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。

64.如实施方案61所述的方法，其中所述抗CD8抗体或抗原结合片段是单结构域抗体。

65.如实施方案61或实施方案64所述的方法，其中所述抗CD8抗体或抗原结合片段是骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)(例如VHH)。

66.如实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。

67.如实施方案1-66中任一项所述的方法，其中所述CD8结合剂暴露在所述慢病毒载体的表面上。

68.如实施方案1-67中任一项所述的方法，其中所述CD8结合剂与掺入病毒包膜中的跨膜结构域融合。

69.如实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体是用病毒融合蛋白假型化的。

70.如实施方案69所述的方法，其中所述病毒融合蛋白是VSV-G蛋白或其功能性变体。

71.如实施方案69所述的方法，其中所述病毒融合蛋白是科卡尔病毒G蛋白或其功能性变体。

72.如实施方案69所述的方法，其中所述病毒融合蛋白是甲病毒属融合蛋白(例如辛德比斯病毒)或其功能性变体。

73.如实施方案69所述的方法，其中所述病毒融合蛋白是副粘病毒科融合蛋白(例如麻疹病毒属或亨尼帕病毒属)或其功能性变体。

74.如实施方案69或实施方案73所述的方法，其中所述病毒融合蛋白是麻疹病毒属融合蛋白(例如，麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒、鲸类麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、海豹瘟热病毒、牛瘟病毒)或其功能性变体。

75.如实施方案69或实施方案63所述的方法，其中所述病毒融合蛋白是亨尼帕病毒属融合蛋白(例如，尼帕病毒、亨德拉病毒、雪松病毒、库马西病毒、墨江病毒)或其功能性变体。

76.如实施方案69-75中任一项所述的方法，其中所述病毒融合蛋白包含一种或修饰以减少与其天然受体的结合。

77.如实施方案69-76中任一项所述的方法，其中所述病毒融合蛋白与所述CD8结合剂融合。

78.如实施方案69、73和75-77中任一项所述的方法，其中所述病毒融合蛋白包含尼帕病毒F糖蛋白(NiV-F)或其生物活性部分和尼帕病毒G糖蛋白(NiV-G)或其生物活性部分，并且其中所述CD8结合剂与所述NiV-G或其生物活性部分融合。

79.如实施方案78所述的方法，其中所述CD8结合剂与所述尼帕病毒G糖蛋白或其生物活性部分的C末端融合。

80.如实施方案77-79中任一项所述的方法，其中所述CD8结合蛋白直接融合或通过肽接头融合。

81.如实施方案78-80中任一项所述的方法，其中所述NiV-G或其生物活性部分是野生型NiV-G蛋白或其功能活性变体或生物活性部分。

82.如实施方案78-81中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分是截短的，并且缺少所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的多达40个连续氨基酸残基。

83.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的5个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

84.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的10个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:44中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

85.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的15个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:45中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

86.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的20个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

87.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的25个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

88.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的30个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

89.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

90.如实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的N末端处或附近的34个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

91.如实施方案78-90中任一项所述的方法，其中所述NiV-G-蛋白或其生物活性部分是表现出与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的结合降低的突变型NiV-G蛋白。

92.如实施方案91所述的方法，其中所述突变型NiV-G蛋白或所述生物活性部分包含：

与选自由参考SEQ ID NO:4中所示的编号的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的氨基酸取代相对应的一个或多个氨基酸取代。

93.如实施方案91或实施方案92所述的方法，其中所述突变型NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

94.如实施方案91或实施方案92所述的方法，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

95.如实施方案78-94中任一项所述的方法，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分是野生型NiV-F蛋白或是其功能活性变体或生物活性部分。

96.如实施方案78-95中任一项所述的方法，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在所述野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:41)的C末端处或附近的20个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:20中所示的序列，或与SEQ IDNO:20中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

97.如实施方案78-96中任一项所述的方法，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分包含：

i)在所述野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:41)的C末端处或附近的20个氨基酸截短；以及

ii)在N-连接的糖基化位点上的点突变，

任选地其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:15中所示的序列，或与SEQ ID NO:15中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

98.如实施方案78-95中任一项所述的方法，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在所述野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:41)的C末端处或附近的22个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:16或21中所示的序列，或与SEQID NO:16或21中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

99.如实施方案1-98中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含转基因。

100.如实施方案99所述的方法，其中所述转基因包含编码能够进行RNA干扰的RNA序列(例如pre-miRNA、siRNA或shRNA)的核酸序列。

101.如实施方案99所述的方法，其中所述转基因选自由以下组成的组：治疗性基因、报告基因、编码酶的基因、编码前体药物酶的基因、编码细胞凋亡诱导剂的基因、编码荧光蛋白的基因、编码前体药物活化酶的基因、编码凋亡蛋白的基因、编码凋亡酶的基因、编码自杀蛋白的基因、编码细胞因子的基因、编码抗免疫抑制蛋白的基因、编码表观遗传调节剂的基因、编码T细胞受体(TCR)的基因、编码嵌合抗原受体(CAR)的基因、编码修饰转导细胞的细胞表面的蛋白质的基因、编码修饰内源TCR表达的蛋白质的基因，以及编码将促肿瘤信号转化为抗肿瘤信号的开关受体的基因。

102.如实施方案99所述的方法，其中所述转基因编码工程化受体，所述工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞或病灶(例如肿瘤)表达的蛋白质或抗原，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

103.如实施方案53、实施方案55、实施方案99或实施方案102所述的方法，其中所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。

104.如实施方案103所述的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含CD3ζ信号传导结构域和共刺激信号传导结构域的细胞内组分的细胞内信号传导结构域。

105.如实施方案104所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域是4-1BB信号传导结构域。

106.如实施方案53、实施方案55、实施方案99或实施方案102所述的方法，其中所述转基因编码工程化的T细胞受体(TCR)。

107.如实施方案1-106中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体不包含展示在所述表面上的T细胞活化剂，任选地其中所述T细胞活化剂选自由以下组成的组：CD3抗体(例如抗CD3 scFv)；T细胞活化细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21)；或T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体、CD80、CD86、CD137L或ICOS-L)。

108.如实施方案1-106中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体不包含或编码T细胞活化剂，任选地其中所述T细胞活化剂是淋巴组织增生剂。

109.如实施方案108所述的方法，其中所述T细胞活性剂是：

能够结合CD3和/或CD28的多肽；

CD3抗体(例如抗CD3 scFv)；T细胞活化细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21)；或T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体、CD80、CD86、CD137L或ICOS-L)；

活化STAT3途径、STAT4途径和/或Jak/STAT5途径的细胞因子或细胞因子受体或其信号传导结构域；

T细胞存活基序，任选地IL-7受体、IL-15受体、或CD28，或其功能部分；和/或

微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shrRNA)，其中所述miRNA或所述shRNA刺激所述STAT5途径和/或抑制所述SOCS途径。

110.如实施方案1-106中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体不包含或编码膜结合和/或展示在所述表面上的T细胞活化剂，任选地其中所述T细胞活化剂是淋巴组织增生剂。

111.如实施方案18、36和49-110中任一项所述的方法，其中所述受试者不同时施用所述慢病毒载体与T细胞活化治疗。

112.如实施方案18、36和49-111中任一项所述的方法，其中在与所述慢病毒载体接触之前或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之前1个月内所述受试者未施用T细胞活化治疗。

113.如实施方案18、36、49-112中任一项所述的方法，其中在与所述慢病毒载体接触之前或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之前1周、2周、3周或4周内或1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周时，任选地在1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，所述受试者未施用T细胞活化治疗。

114.如实施方案18、36和49-113中任一项所述的方法，其中在与所述慢病毒载体接触之后或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之后1个月内所述受试者未施用T细胞活化治疗。

115.如实施方案18、36、49-114中任一项所述的方法，其中在与所述慢病毒载体接触之后或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之后1周、2周、3周或4周内或1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周时，任选地在1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，所述受试者未施用T细胞活化治疗。

116.如实施方案1-45中任一项所述的方法，其还包括编辑所述T细胞或T细胞群体以使B2M、CIITA、TRAC和TRB基因中的一种或多种失活。

117.如实施方案113所述的方法，其中编辑所述T细胞或T细胞群体以使B2M、CIITA和TRAC基因失活。

118.如实施方案116所述的方法，其中编辑所述T细胞或T细胞群体以使B2M、CIITA和TRB基因失活。

119.如实施方案116-118中任一项所述的方法，其还包括在确定的基因座处插入编码CD47的基因。

120.如实施方案119所述的方法，其中所述确定的基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港基因座组成的组。

121.如实施方案120所述的方法，其中所述安全港基因座选自由AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座组成的组。

122.如实施方案116-121中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别由与所述疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

123.一种转导的T细胞，其通过如实施方案116-122中任一项所述的方法产生。

124.如实施方案123所述的转导的T细胞，其中所述T细胞在一种或多种基因的两个等位基因处失活。

125.一种包含如实施方案123或实施方案124所述的转导的T细胞的组合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

126.一种转导的T细胞群体，其通过如实施方案116-122中任一项所述的方法产生。

127.如实施方案126所述的转导的T细胞群体，其中所述未活化的细胞群体中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的所述细胞在所述一种或多种基因处失活。

128.如实施方案126或实施方案127所述的转导的T细胞群体，其中所述群体中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的所述未活化的CD8+ T细胞被转导并在所述一种或多种基因处失活。

129.如实施方案126-128中任一项所述的转导的T细胞群体，其中所述群体的细胞在所述一种或多种基因的两个等位基因处失活。

130.一种包含如实施方案126-129中任一项所述的转导的T细胞群体的组合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

131.如实施方案125或实施方案130所述的组合物，其还包含冷冻防腐剂，任选地其中所述冷冻防腐剂是DMSO。

132.一种治疗患有疾病或疾患的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用如实施方案21、47、48、125、130和131中任一项所述的组合物，其中所述受试者在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。

133.如实施方案132所述的方法，其中所述疾病或疾患是癌症。

134.一种用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用如实施方案21、47、48、125、130和131中任一项所述的组合物，并且其中所述受试者在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。

135.包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者的用途。

136.如实施方案21、47、48、125、130和131中任一项所述的组合物用于配制用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者的药物的用途。

137.一种包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，所述组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者。

138.一种如实施方案21、47、48、125、130和131中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者。

139.包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物用于配制用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的药物的用途。

140.如实施方案21、47、48、125、130和131中任一项所述的组合物用于配制用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的药物的用途。

141.一种包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，所述组合物用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞。

142.一种如实施方案21、47、48、125、130和131中任一项所述的组合物，所述组合物用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞。

143.如实施方案135-142中任一项所述的用途或组合物，用于在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用或待施用T细胞活化治疗的受试者。

144.如实施方案11-19、104、105、107-115和117-122中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域是CD28共刺激结构域，任选地其中所述CD28共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列。

145.如实施方案12-19、105、107-115、117-122和144中任一项所述的方法，其中所述4-1BB信号传导结构域包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列。

146.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122、144和145中任一项所述的方法，其中所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100中所示的序列。

147.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-146中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:94、95和96中任一个所示的序列。

148.如实施方案10-19、103-105、107-115、117-122和144-147中任一项的方法，其中所述CAR包含铰链结构域，任选地其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:88、89、90、91、92、93和180中任一个所示的序列。

149.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-148中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合选自由CD19、CD20、CD22和BCMA组成的组的抗原。

150.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-149中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD19。

151.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-150中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(a)分别包含SEQ ID NO:108、109和110中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:103、104和105中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

(b)包含SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:102中所示的氨基酸序列的VL区；和/或

(c)SEQ ID NO:101或111中所示的氨基酸序列。

152.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-151中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:113、115、117或119中所示的氨基酸序列和/或由SEQ IDNO:112、114、116或118中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

153.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-149中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD20。

154.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122、144-149和153中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(a)分别包含SEQ ID NO:126、127和182中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:122、123和124中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

(b)包含SEQ ID NO:125中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:121中所示的氨基酸序列的VL区；和/或

(c)SEQ ID NO:120中所示的氨基酸序列。

155.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-149中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD22。

156.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122、144-149和155中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(a)分别包含SEQ ID NO:130、131和132中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:134、135和136中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或

分别包含SEQ ID NO:139、140和142中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:143、144和145中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或

(b)包含SEQ ID NO:129中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:133中所示的氨基酸序列的VL区；或

包含SEQ ID NO:138中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:142中所示的氨基酸序列的VL区；和/或

(c)SEQ ID NO:128或137中所示的氨基酸序列。

157.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122和144-149中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合BCMA。

158.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122、144-149和157中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(a)分别包含SEQ ID NO:152、152和154中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:148、149和150中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

分别包含SEQ ID NO:161、162和163中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:157、158和159中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

分别包含SEQ ID NO:165、166和167中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3；或

分别包含SEQ ID NO:174、175和176中所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDRH-2和CDR-H3，以及分别包含SEQ ID NO:170、171和172中所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或

(b)包含SEQ ID NO:151中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:147中所示的氨基酸序列的VL区；

包含SEQ ID NO:160中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:156中所示的氨基酸序列的VL区；

包含SEQ ID NO:173中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:169中所示的氨基酸序列的VL区；或

包含SEQ ID NO:164中所示的氨基酸序列的VH区；和/或

(c)SEQ ID NO:146、155或168中所示的氨基酸序列。

159.如实施方案11-19、104、105、107-115、117-122、144-149、157和158中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:178中所示的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO:177中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

160.如11-19、104、105、107-115、117-122、144-149和157-159中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CAR包含：

(a)抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:102中所示的VL区、包含SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的接头和SEQ ID NO:107中所示的VH区；和/或SEQID NO:101中所示的scFv；

(b)包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列的铰链；

(c)包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列的跨膜结构域；

(d)包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列的4-1BB信号传导结构域；和/或

(e)包含SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。

161.如11-19、104、105、107-115、117-122、144-149和157-160中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CAR包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列和/或由SEQ IDNO:112中所示的核苷酸序列编码。

162.如实施方案78-105、107-122和144-161中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:21中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

163.如实施方案78-105、107-122和144-162中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述Niv-G蛋白包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，并且所述NiV-F蛋白包含SEQID NO:21中所示的氨基酸序列。

164.如实施方案1-19、22-45、49-122、132-134和144-163中任一项所述的方法，其中所述接触或所述施用通过使用封闭的流体回路向受试者离体施用所述慢病毒载体来进行。

165.如实施方案164所述的方法，其中所述离体施用包括：

(a)从受试者获得全血；

(b)收集含有包含T细胞(例如CD8+ T细胞)的白细胞组分的血液部分；

(c)使所述包含T细胞(例如CD8+ T细胞)的白细胞组分与包含所述慢病毒载体的组合物接触；以及

(d)将接触的包含T细胞(例如CD8+ T细胞)的白细胞组分再输注到所述受试者中，其中步骤(a)-(d)在封闭的流体回路中串联进行。

166.如实施方案165所述的方法，其中步骤(c)中的所述接触不超过24小时、不超过18小时、不超过12小时或不超过6小时。

X.实施例

包括以下实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。

实施例1：在Nalm6肿瘤模型中作为T细胞活化状态的函数的CD8靶向融合剂的体内递送

该实施例描述了CD8再靶向的Nipah融合剂和VSV-G的转导效率的评估。

简言之，通过静脉内(IV)注射给六十二(62)只雌性NSG小鼠注射1E6 Nalm6-Luc白血病B细胞，三天后IV注射2E6人外周血单核细胞(hPBMC)，有或没有预先用CD3/CD28复合物活化T细胞。hPBMC注射后一天，将表达CD19 CAR的CD8 VHH Nipah融合剂假型慢病毒载体(LV)以一系列整合单位(IU)2E6-5E7注射到单独的动物组中。在整个研究期间每周使用Lago X成像系统通过生物发光成像(BLI)跟踪Nalm6肿瘤进展。CD19CAR含有针对CD19的抗scFv和含有4-1BB和CD3-ζ的胞内组分的胞内信号传导结构域。对来自每组的一半小鼠进行外周血分析以评估整个研究期间的循环T和B细胞频率、循环CAR-T细胞频率和细胞因子水平。该研究在hPBMC注射后28天结束，或者根据个体动物的健康状况提前结束。处死动物，收集外周血、脾和骨髓组织的细胞，并通过流式细胞术分析CD19CAR表达细胞和细胞因子分析。

如图1A所示，CD8-VHH CD19CAR LV和活化的hPBMC处理导致Nalm6肿瘤生长随时间得到强有力的控制。如图1B所示，高剂量CD8-VHH CD19CAR LV和未活化的hPBMC处理导致Nalm6肿瘤生长的轻微延迟但强有力的控制。图1C示出了回收的总活淋巴细胞中中靶CD19CAR表达细胞(CD8⁺CD19CAR⁺)的百分比，如PBMC对照(顶部图)和CD8 VHH融合体处理的动物(底部图)的FAC图的右上象限所示。接受5E7 IU的CD8-CD19CAR LV，有或没有hPBMC活化的动物骨髓中CAR-T细胞的频率没有统计学差异。结果表明，治疗后长达28天在外周血、脾和骨髓中的CD8+ T细胞中可以检测到CD19特异性CAR T细胞。

实施例2：活化状态融合剂测试—人PBMC供体

本实施例描述了在人PBMC中存在和不存在CD3/CD28活化的情况下，对携带CD19CAR构建体的四种不同慢病毒、三种CD8再靶向Nipah融合剂和VSV-G的转导效率的评估。CD19CAR含有针对CD19的抗scFv和含有4-1BB和CD3-ζ的胞内组分的胞内信号传导结构域。将来自三个供体的人PBMC解冻并在耗尽或不耗尽CD19细胞的情况下并且用或不用抗CD3和抗CD28抗体活化的情况下进行处理。PBMC群体用慢病毒载体(LV)进行转导，该慢病毒载体用尼帕病毒融合剂假型化，该尼帕病毒融合剂用两种不同的CD8scFv(CD8 scFv-1或CD8 scFV-2)、CD8 VHH或VSV-G之一再靶向。通过评估旋转转染后72小时表面上的CD19CAR表达来测量转导效率。

结果证明，再靶向的CD8融合剂在未活化为活化细胞的细胞中也转导(图2A)。在图2A中，在转导之前在耗尽CD19+B细胞的PBMC中测量CAR+细胞，并且转导效率被认为是活群体中CAR+细胞的％。值得注意的是，将VSV-G LV用于未活化的T细胞导致～0.5％的最大转导效率，而三种CD8 LV能够以约20％-35％的效率转导未活化的T细胞。

另外，观察到未活化产生的CAR-T细胞更有效地杀死CD19+细胞(图2B)。在转导时存在具有CD19+B细胞的PBMC，并且在活化样品中观察到抗原掩蔽(通过抗CD19 ab检测)。

总之，CD8载体能够以高效率转导未活化的T细胞，并且未活化的T细胞的转导导致所得细胞具有较高杀伤效率。

实施例3：在幼年雌性猕猴中静脉内输注CD8-SFFV-CD20CAR的5周和7周单剂量药代动力学和药效学研究

本实施例描述了用靶向CD8+ T细胞的抗CD8结合蛋白假型化以递送CD20 CAR转基因(CD8-SFFV-CD20CAR)的慢病毒载体。CD20CAR含有针对CD20的抗scFv和含有4-1BB和CD3-ζ的胞内组分的胞内信号传导结构域。本研究的目的是表征CD8-SFFV-CD20CAR转导T细胞和耗尽正常健康CD20+B细胞的能力、病毒整合的生物分布和静脉内施用的耐受性。八只幼年雌性猕猴经1小时静脉内施用7.69E8 IU/kg(n＝6)的单次最大可行剂量的CD8-SFFV-CD20CAR或10ml/kg(n＝2)的盐水对照。在基线(第-35天、-28天和-21天)评估动物的B和T细胞频率以及血液学和临床化学参数的评估。每天监测研究动物的临床观察结果，每周监测体重、体温、神经电池以及血液学和临床化学的变化。在研究前、第7天和终止时收集CSF样品。所有动物均在第3天、第5天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天、第28天和第35天进行常规血液采样和流式细胞术免疫表型分析以确定B和T细胞频率的变化。终止时，对动物进行全面尸检、收集血液、CSF和组织用于：淋巴组织的流式细胞术、Luminex的细胞因子分析、PCR的转基因表达、ddPCR的载体拷贝数(VCN)、通过深度测序的插入位点分布(ISD)、临床病理学(血液学和临床化学)、组织免疫组织化学和解剖组织病理学。

到第35天的中期数据表明，以7.69E8 IU/kg的单次最大可行剂量施用CD8-SFFV-CD20CAR在所有动物中均具有良好的耐受性。所有采样时间的临床观察结果(包括神经体征、体温或临床化学值)均没有化合物相关的变化。在第7-10天血小板和嗜中性粒细胞出现短暂最小减少，在第14天回到基线。两只动物的血细胞比容出现短暂、最小的降低和相关的网织红细胞计数的增加，这可能归因于重复的血液采样。如图3所示，流式细胞术分析表明，与动物体内给药前相比，在第7天开始的6只处理动物中有4只在外周血中CD20+B细胞显著减少，这种情况持续到第35天。这些数据与抗CD20CAR的预期药理活性一致。

使用ddPCR对来自第-35天、第14天和第35天的2只对照猴子和4只处理的猴子的样品进行外周血单核细胞(PBMC)以及终止时的脾和骨髓中进行初步VCN测量。在第-35天和注射后第35天，观察到PBMC中的VCN，尽管该值低于所有动物的定量限(BLQ)。通过比较，在脾中，在处理的动物中检测到VCN，而在对照动物中检测到BLQ。在第35天，在检查的CD8-SFFV-CD20CAR处理的猴子中，0.04％至1.3％的脾细胞(即67至1,970个细胞)含有至少一个插入拷贝。

这些数据证明了CD8-SFFV-CD20CAR在免疫活性动物中的中靶活性具有良好耐受性并且与脾细胞中载体的存在相关，即使在不施用T细胞活化治疗的情况下。

实施例4：用于小鼠肿瘤控制的人PBMC的离体给药

为了评估病毒载体离体给药的可行性，将人PBMC与编码抗CD19 CAR的病毒载体颗粒接触，并在最初与病毒载体接触后4小时内将转导细胞施用于表达CD19的携带Nalm6肿瘤的小鼠。

对于病毒载体生产，用表达病毒载体蛋白的质粒(gag/pol，rev)和编码抗CD19CAR的转移质粒(含有FMC63衍生的scFv胞外抗原结合结构域，以及含有4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域的胞内信号传导结构域)转染HEK293生产细胞。包膜蛋白作为表达Nipah F蛋白和CD8再靶向的Nipah G蛋白的质粒提供(参见US 2019/0144885，以引用方式并入本文)。CD8重靶向的Nipah G(NiV-G)蛋白含有抗CD8 scFv作为与示例性NiV-G序列GcΔ34的融合物(Bender等人2016 PLoS Pathol 12(6):e1005641；SEQ ID NO:17中所示)；并且Nipah F(NiV-F)蛋白是示例性NiV-F序列NivFdel22(不具有信号序列的SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:21，；Bender等人2016 PLoS)。病毒载体产生后，将细胞培养物离心以沉淀细胞，并收集含有粗制病毒的上清液。

给携带NSG的小鼠静脉内输注NALM6肿瘤细胞(1×10⁷个肿瘤细胞/小鼠)，并使肿瘤生长约72小时。施用的肿瘤细胞另外被工程化以含有荧光素酶标志物。将来自健康供体的约6×10⁷个人PBMC解冻并与病毒载体一起孵育，使得细胞将以1×10⁶IU至1×10⁷IU范围内的剂量暴露于载体。孵育4小时后，将转染的PBMC以500x g离心5分钟，重悬于1200μL盐水中，然后在D-1直接注射到小鼠体内。从研究D1开始对小鼠进行活体成像，并在D14和D28收集用于血液用于流式细胞术分析。在研究D28处死动物以研究脾。

在研究期间通过流式细胞术监测肿瘤细胞的数量作为总通量。对于每个病毒载体剂量，通过总通量监测的肿瘤生长示出在图4A中。还描述了几种对照，包括仅肿瘤对照、仅PBMC对照以及初始成像对照。如图所示，与未施用离体病毒载体的肿瘤对照小鼠相比，每种病毒载体剂量均减少了该模型中的肿瘤生长。

在小鼠外周血中检测到表达CAR的CD8+ T细胞，如图4B中描述的来自研究D14的外周血中CD8+细胞的流式细胞术分析所示。对照小鼠外周血的T细胞中没有检测到CAR。这些结果支持通过离体给药给予病毒载体实现转基因向靶细胞的递送。

本发明的范围并不意图局限于具体公开的实施方案，这些实施方案是为了举例说明本发明的各个方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化意图落入本公开的范围内。

XI.序列

/>

序列表

<110> 萨那生物科技公司(Sana Biotechnology, Inc.)

<120> 靶向CD8的病毒载体的用途

<130> 18615-20046.40

<140> 尚未分配

<141> 同时随同提交

<150> US 63/211,947

<151> 2021-06-17

<150> US 63/168,235

<151> 2021-03-30

<150> US 63/150,498

<151> 2021-02-17

<150> US 63/136,202

<151> 2021-01-11

<160> 182

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 602

<212> PRT

<213> 尼帕病毒(Nipah virus)

<220>

<223> NiVG蛋白附着糖蛋白 (602 aa)

<400> 1

Met Gly Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser

1 5 10 15

Asp Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr

20 25 30

Met Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu

35 40 45

Ser Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile

50 55 60

Val Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn

65 70 75 80

Gln Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys

85 90 95

Gly Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu

100 105 110

Ile Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu

115 120 125

Gly Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn

130 135 140

Glu Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn

145 150 155 160

Ile Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr

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<213> 尼帕病毒(Nipah Virus)

<220>

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Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser

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Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp

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Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu

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370 375 380

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Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn

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Leu Lys Asp Tyr Ile Thr Lys Ser Cys Gly Phe Lys Val Pro Glu Leu

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180 185 190

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195 200 205

Lys Ile Phe Cys Lys Ser Val Ser Lys Asp Pro Asp Phe Arg Leu Lys

210 215 220

Gln Ile Asp Tyr Val Ile Pro Val Gln Gln Asp Arg Ser Ile Cys Met

225 230 235 240

Asn Asn Pro Leu Leu Asp Ile Ser Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Ile His

245 250 255

Tyr Glu Gly Ile Asn Ser Cys Lys Lys Ser Asp Ser Phe Lys Val Leu

260 265 270

Leu Ser His Gly Glu Ile Val Asp Arg Gly Asp Tyr Arg Pro Ser Leu

275 280 285

Tyr Leu Leu Ser Ser His Tyr His Pro Tyr Ser Met Gln Val Ile Asn

290 295 300

Cys Val Pro Val Thr Cys Asn Gln Ser Ser Phe Val Phe Cys His Ile

305 310 315 320

Ser Asn Asn Thr Lys Thr Leu Asp Asn Ser Asp Tyr Ser Ser Asp Glu

325 330 335

Tyr Tyr Ile Thr Tyr Phe Asn Gly Ile Asp Arg Pro Lys Thr Lys Lys

340 345 350

Ile Pro Ile Asn Asn Met Thr Ala Asp Asn Arg Tyr Ile His Phe Thr

355 360 365

Phe Ser Gly Gly Gly Gly Val Cys Leu Gly Glu Glu Phe Ile Ile Pro

370 375 380

Val Thr Thr Val Ile Asn Thr Asp Val Phe Thr His Asp Tyr Cys Glu

385 390 395 400

Ser Phe Asn Cys Ser Val Gln Thr Gly Lys Ser Leu Lys Glu Ile Cys

405 410 415

Ser Glu Ser Leu Arg Ser Pro Thr Asn Ser Ser Arg Tyr Asn Leu Asn

420 425 430

Gly Ile Met Ile Ile Ser Gln Asn Asn Met Thr Asp Phe Lys Ile Gln

435 440 445

Leu Asn Gly Ile Thr Tyr Asn Lys Leu Ser Phe Gly Ser Pro Gly Arg

450 455 460

Leu Ser Lys Thr Leu Gly Gln Val Leu Tyr Tyr Gln Ser Ser Met Ser

465 470 475 480

Trp Asp Thr Tyr Leu Lys Ala Gly Phe Val Glu Lys Trp Lys Pro Phe

485 490 495

Thr Pro Asn Trp Met Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Asn Gln Gly

500 505 510

Asn Cys Pro Arg Tyr His Lys Cys Pro Glu Ile Cys Tyr Gly Gly Thr

515 520 525

Tyr Asn Asp Ile Ala Pro Leu Asp Leu Gly Lys Asp Met Tyr Val Ser

530 535 540

Val Ile Leu Asp Ser Asp Gln Leu Ala Glu Asn Pro Glu Ile Thr Val

545 550 555 560

Phe Asn Ser Thr Thr Ile Leu Tyr Lys Glu Arg Val Ser Lys Asp Glu

565 570 575

Leu Asn Thr Arg Ser Thr Thr Thr Ser Cys Phe Leu Phe Leu Asp Glu

580 585 590

Pro Trp Cys Ile Ser Val Leu Glu Thr Asn Arg Phe Asn Gly Lys Ser

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<212> PRT

<213> 雪松病毒(Cedar Virus)

<220>

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Leu Glu Leu Asp Lys Gly Gln Lys Asp Leu Asn Lys Ser Tyr Tyr Val

35 40 45

Lys Asn Lys Asn Tyr Asn Val Ser Asn Leu Leu Asn Glu Ser Leu His

50 55 60

Asp Ile Lys Phe Cys Ile Tyr Cys Ile Phe Ser Leu Leu Ile Ile Ile

65 70 75 80

Thr Ile Ile Asn Ile Ile Thr Ile Ser Ile Val Ile Thr Arg Leu Lys

85 90 95

Val His Glu Glu Asn Asn Gly Met Glu Ser Pro Asn Leu Gln Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Ser Leu Ser Ser Leu Thr Asn Met Ile Asn Thr Glu Ile Thr

115 120 125

Pro Arg Ile Gly Ile Leu Val Thr Ala Thr Ser Val Thr Leu Ser Ser

130 135 140

Ser Ile Asn Tyr Val Gly Thr Lys Thr Asn Gln Leu Val Asn Glu Leu

145 150 155 160

Lys Asp Tyr Ile Thr Lys Ser Cys Gly Phe Lys Val Pro Glu Leu Lys

165 170 175

Leu His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Ala Asp Pro Lys Ile Ser Lys Ser

180 185 190

Ala Met Tyr Ser Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Leu Ala Gly Pro Pro Lys

195 200 205

Ile Phe Cys Lys Ser Val Ser Lys Asp Pro Asp Phe Arg Leu Lys Gln

210 215 220

Ile Asp Tyr Val Ile Pro Val Gln Gln Asp Arg Ser Ile Cys Met Asn

225 230 235 240

Asn Pro Leu Leu Asp Ile Ser Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Ile His Tyr

245 250 255

Glu Gly Ile Asn Ser Cys Lys Lys Ser Asp Ser Phe Lys Val Leu Leu

260 265 270

Ser His Gly Glu Ile Val Asp Arg Gly Asp Tyr Arg Pro Ser Leu Tyr

275 280 285

Leu Leu Ser Ser His Tyr His Pro Tyr Ser Met Gln Val Ile Asn Cys

290 295 300

Val Pro Val Thr Cys Asn Gln Ser Ser Phe Val Phe Cys His Ile Ser

305 310 315 320

Asn Asn Thr Lys Thr Leu Asp Asn Ser Asp Tyr Ser Ser Asp Glu Tyr

325 330 335

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340 345 350

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<220>

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Tyr

625

<210> 11

<211> 624

<212> PRT

<213> 墨江病毒(Mojiang virus)

<220>

<223> 墨江病毒，潼关1 G (无Met)

<400> 11

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<220>

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325 330 335

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385 390 395 400

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405 410 415

Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp Gln Arg Leu Ser

420 425 430

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<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NiVG蛋白附着糖蛋白截短的

δ20

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Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp Glu Gly Tyr

195 200 205

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210 215 220

Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly Asp

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245 250 255

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Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser Thr

275 280 285

Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val Lys Pro Lys

290 295 300

Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu Arg Ser Ile

305 310 315 320

Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly Ile

325 330 335

Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Val Arg

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δ25

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275 280 285

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405 410 415

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 截短和突变的NiVG蛋白附着糖蛋白

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 截短的NiV融合糖蛋白

<220>

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(具有信号序列)

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305 310 315 320

Pro Met Thr Asn Asn Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys

325 330 335

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420 425 430

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<220>

<223> 在胞质尾处的截短的成熟NiV融合糖蛋白(Fcδ22)

<400> 21

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Val Ser Phe Asn Asn Asp Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn

275 280 285

Phe Ile Leu Val Arg Asn Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe

290 295 300

Cys Leu Ile Thr Lys Arg Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Pro Met Thr Asn Asn Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys

325 330 335

Cys Pro Arg Glu Leu Val Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu

340 345 350

Ser Asn Gly Val Leu Phe Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys

355 360 365

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370 375 380

Met Ile Asp Asn Thr Thr Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile

385 390 395 400

Ile Ser Leu Gly Lys Tyr Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly

405 410 415

Ile Ala Ile Gly Pro Pro Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser

420 425 430

Gln Ile Ser Ser Met Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile

435 440 445

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450 455 460

Met Leu Ser Met Ile Ile Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys

465 470 475 480

Ile Gly Leu Ile Thr Phe Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg

485 490 495

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<210> 22

<211> 552

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 没有胞质尾的NivG蛋白附着糖蛋白

<220>

<223> Uniprot Q9IH62

<400> 22

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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260 265 270

Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu

275 280 285

Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro

290 295 300

Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe

305 310 315 320

Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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<210> 23

<211> 604

<212> PRT

<213> 亨德拉病毒(Hendra virus)

<220>

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<400> 23

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305 310 315 320

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325 330 335

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<212> PRT

<213> 亨德拉病毒(Hendra virus)

<220>

<223> 没有N末端甲硫氨酸的亨德拉病毒G蛋白

<220>

<223> Uniprot O89343

<400> 24

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290 295 300

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305 310 315 320

Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile

325 330 335

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565 570 575

Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe

580 585 590

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595 600

<210> 25

<211> 555

<212> PRT

<213> 亨德拉病毒(Hendra virus)

<220>

<223> 没有胞质尾的亨德拉病毒G蛋白

<220>

<223> Uniprot O89343

<400> 25

Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val Met

1 5 10 15

Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala

20 25 30

Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu

35 40 45

Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys

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180 185 190

Arg Gly Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp

195 200 205

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210 215 220

Pro Asn Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp

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Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu

245 250 255

Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val

260 265 270

Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile

275 280 285

Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro

290 295 300

Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe

305 310 315 320

Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile

325 330 335

His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val

340 345 350

Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn

355 360 365

Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp

370 375 380

Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly

385 390 395 400

Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys

405 410 415

Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn

420 425 430

Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn

435 440 445

Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu

450 455 460

Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn

465 470 475 480

Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile

485 490 495

Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr

500 505 510

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515 520 525

Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe

530 535 540

Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

545 550 555

<210> 26

<211> 555

<212> PRT

<213> 亨德拉病毒(Hendra virus)

<220>

<223> 没有胞质尾的亨德拉病毒G蛋白

<220>

<223> Uniprot O89343

<400> 26

Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val Met

1 5 10 15

Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala

20 25 30

Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu

35 40 45

Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp

50 55 60

Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser

65 70 75 80

Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys

85 90 95

Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser

100 105 110

Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly

115 120 125

Val Ser Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr

130 135 140

Thr Ser Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile

145 150 155 160

Asn Thr Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp

165 170 175

Asn Gly Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr

180 185 190

Arg Gly Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp

195 200 205

Arg Gly Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro

210 215 220

Pro Asn Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp

225 230 235 240

Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu

245 250 255

Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val

260 265 270

Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile

275 280 285

Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro

290 295 300

Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe

305 310 315 320

Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile

325 330 335

His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val

340 345 350

Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn

355 360 365

Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp

370 375 380

Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly

385 390 395 400

Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys

405 410 415

Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn

420 425 430

Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn

435 440 445

Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu

450 455 460

Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn

465 470 475 480

Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile

485 490 495

Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr

500 505 510

Ile Thr Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu

515 520 525

Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe

530 535 540

Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

545 550 555

<210> 27

<211> 602

<212> PRT

<213> 尼帕病毒(Nipah virus)

<220>

<223> NiVG蛋白附着糖蛋白 (602 aa)

<400> 27

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20 25 30

Met Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu

35 40 45

Ser Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile

50 55 60

Val Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn

65 70 75 80

Gln Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys

85 90 95

Gly Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu

100 105 110

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<213> 亨德拉病毒(Hendra virus)

<220>

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<211> 520

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<213> 尼帕病毒(Nipah virus)

<220>

<223> 尼帕病毒F蛋白，无信号序列

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<212> PRT

<213> 雪松病毒(Cedar Virus)

<220>

<223> 雪松病毒F蛋白，无信号序列

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Phe Ala Leu Thr Asn Gly Val Ile Phe Ala Asn Cys Ile Asn Thr Ile

370 375 380

Cys Arg Cys Gln Asp Asn Gly Lys Thr Ile Thr Gln Asn Ile Asn Gln

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Leu Ile Ser Pro Ser Val Gln Leu Phe Leu Ile Ile Ile Ser Val Leu

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Ser Phe Ile Ile Leu Leu Ile Ile Ile Val Tyr Leu Tyr Cys Lys Ser

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<213> 墨江病毒(Mojiang virus)

<220>

<223> 墨江病毒，潼关1 F蛋白

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Leu Val Arg Lys Ala Leu Glu Pro Val Lys Met Ala Ile Asp Thr Met

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Leu Asn Asn Val Lys Ser Gly Asn Asn Lys Tyr Arg Phe Ala Gly Ala

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Ile Met Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Thr Val Thr

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Ala Gly Ile Ala Leu His Arg Ser Asn Glu Asn Ala Gln Ala Ile Ala

130 135 140

Asn Met Lys Ser Ala Ile Gln Asn Thr Asn Glu Ala Val Lys Gln Leu

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Gln Leu Ala Asn Lys Gln Thr Leu Ala Val Ile Asp Thr Ile Arg Gly

165 170 175

Glu Ile Asn Asn Asn Ile Ile Pro Val Ile Asn Gln Leu Ser Cys Asp

180 185 190

Thr Ile Gly Leu Ser Val Gly Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Tyr Ser Glu

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210 215 220

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Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Asp Asn Val Glu Leu Gly Pro Pro Ile

435 440 445

Val Ile Asp Lys Ile Asp Ile Gly Asn Gln Leu Ala Gly Ile Asn Gln

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465 470 475 480

Lys Gly Val Asn Pro Ser Ile Ile Thr Leu Gly Ser Met Val Val Leu

485 490 495

Tyr Ile Phe Met Ile Leu Ile Ala Ile Val Ser Val Ile Ala Leu Val

500 505 510

Leu Ser Ile Lys Leu Thr Val Lys Gly Asn Val Val Arg Gln Gln Phe

515 520 525

Thr Tyr Thr Gln His Val Pro Ser Met Glu Asn Ile Asn Tyr Val Ser

530 535 540

His

545

<210> 35

<211> 519

<212> PRT

<213> 墨江病毒(Mojiang virus)

<220>

<223> 墨江病毒，潼关1 F蛋白，无信号序列

<400> 35

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1 5 10 15

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50 55 60

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65 70 75 80

Tyr Arg Phe Ala Gly Ala Ile Met Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala

85 90 95

Thr Ala Ala Thr Val Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Arg Ser Asn Glu

100 105 110

Asn Ala Gln Ala Ile Ala Asn Met Lys Ser Ala Ile Gln Asn Thr Asn

115 120 125

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Leu Asp Asn Lys Arg Cys Ser Val Tyr Gln Val Gly Asp Val Leu Ile

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Ser Val Gly Ser Tyr Leu Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Asp Asn Val

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Ser Val Ile Ala Leu Val Leu Ser Ile Lys Leu Thr Val Lys Gly Asn

485 490 495

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500 505 510

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515

<210> 36

<211> 662

<212> PRT

<213> 蝙蝠副粘病毒(Bat Paramyxovirus)

<220>

<223> 蝙蝠副粘病毒F 蛋白

<400> 36

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Gly Ser Glu Trp Val Ser Leu Val Pro Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asn

405 410 415

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435 440 445

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500 505 510

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<210> 37

<211> 640

<212> PRT

<213> 蝙蝠副粘病毒(Bat Paramyxovirus)

<220>

<223> 蝙蝠副粘病毒F蛋白，无信号序列

<400> 37

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50 55 60

Ser Tyr Lys His Ile Lys Arg Gly Lys Arg Arg Asn Gly His Asn Gly

65 70 75 80

Asn Ile Ile Thr Ile Ile Leu Leu Leu Ile Leu Ile Leu Lys Thr Gln

85 90 95

Met Ser Glu Gly Ala Ile His Tyr Glu Thr Leu Ser Lys Ile Gly Leu

100 105 110

Ile Lys Gly Ile Thr Arg Glu Tyr Lys Val Lys Gly Thr Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Asp Ile Val Ile Lys Leu Ile Pro Asn Val Thr Gly Leu Asn Lys

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Ile Pro Ile Asn Asn Ile Ile Glu Leu Tyr Ala Asn Ser Thr Lys

165 170 175

Ser Ala Pro Gly Asn Ala Arg Phe Ala Gly Val Ile Ile Ala Gly Val

180 185 190

Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu

195 200 205

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<210> 38

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 信号序列

<400> 38

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<220>

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<400> 39

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Asp Val Arg

<210> 40

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<212> PRT

<213> 尼帕病毒(Nipah virus)

<220>

<223> 尼帕病毒F蛋白

<400> 40

Met Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys

20 25 30

Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys Ile

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu Ile

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Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile

115 120 125

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465 470 475 480

Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile

485 490 495

Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe

500 505 510

Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr Tyr Ser Arg Leu

515 520 525

Glu Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile

530 535 540

Gly Thr

545

<210> 41

<211> 520

<212> PRT

<213> 尼帕病毒(Nipah virus)

<220>

<223> 尼帕病毒NiV-F F0 (aa 27-546)

<400> 41

Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val

1 5 10 15

Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val

20 25 30

Ile Lys Met Ile Pro Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser

35 40 45

Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile

50 55 60

Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly

65 70 75 80

Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile

85 90 95

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100 105 110

Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr

115 120 125

Asn Glu Ala Val Val Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr

130 135 140

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145 150 155 160

Ile Asp Lys Ile Ser Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala

165 170 175

Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu

180 185 190

Gln Asp Pro Val Ser Asn Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala

195 200 205

Phe Gly Gly Asn Tyr Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr

210 215 220

Glu Asp Phe Asp Asp Leu Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile

225 230 235 240

Ile Tyr Val Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe

245 250 255

Pro Ile Leu Thr Glu Ile Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro

260 265 270

Val Ser Phe Asn Asn Asp Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn

275 280 285

Phe Ile Leu Val Arg Asn Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe

290 295 300

Cys Leu Ile Thr Lys Arg Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Pro Met Thr Asn Asn Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys

325 330 335

Cys Pro Arg Glu Leu Val Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu

340 345 350

Ser Asn Gly Val Leu Phe Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys

355 360 365

Gln Thr Thr Gly Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu

370 375 380

Met Ile Asp Asn Thr Thr Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile

385 390 395 400

Ile Ser Leu Gly Lys Tyr Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly

405 410 415

Ile Ala Ile Gly Pro Pro Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser

420 425 430

Gln Ile Ser Ser Met Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile

435 440 445

Lys Glu Ala Gln Arg Leu Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser

450 455 460

Met Leu Ser Met Ile Ile Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys

465 470 475 480

Ile Gly Leu Ile Thr Phe Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg

485 490 495

Asn Thr Tyr Ser Arg Leu Glu Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser

500 505 510

Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile Gly Thr

515 520

<210> 42

<211> 569

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NiVG蛋白附着糖蛋白

截短的 (Gc δ34)

<400> 42

Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala

1 5 10 15

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20 25 30

Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser

85 90 95

Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys

100 105 110

Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser

115 120 125

Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly

130 135 140

Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr

145 150 155 160

Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val

165 170 175

Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp

180 185 190

Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser

195 200 205

Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp

210 215 220

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NiVG蛋白附着糖蛋白

截短的δ15

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 53

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H3

<400> 54

Glu Arg Ala Ala Ala Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val

1 5 10

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L1

<400> 55

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L2

<400> 56

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L3

<400> 57

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 58

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成VH

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Arg Ala Ala Ala Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 59

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体VL

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H1

<400> 60

Asp Tyr Tyr Ile Gln

1 5

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H2

<400> 61

Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 62

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H3

<400> 62

Glu Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Ala

1 5 10

<210> 63

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L1

<400> 63

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L2

<400> 64

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L3

<400> 65

Met Gln Gly Leu Gln Thr Pro His Thr

1 5

<210> 66

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体VH

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 67

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体VL

<400> 67

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Gln Thr Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H1

<400> 68

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 69

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H2

<400> 69

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H3

<400> 70

Asp Gln Gly Trp Gly Met Asp Val

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L3

<400> 71

Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 72

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体VH

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gln Gly Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 73

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体VL

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H1

<400> 74

Asn His Tyr Met His

1 5

<210> 75

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H2

<400> 75

Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H3

<400> 76

Ser Glu Ser Gly Ser Asp Leu Asp Tyr

1 5

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L1

<400> 77

Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Asn Tyr Val Asn

1 5 10

<210> 78

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L2

<400> 78

Gly Ala Ser Asn Leu His Thr

1 5

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-L3

<400> 79

Gln Gln Thr Tyr Ser Ala Pro Leu Thr

1 5

<210> 80

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体VH

<400> 80

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Glu Ser Gly Ser Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 81

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体VL

<400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Asn Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Ala Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H1

<400> 82

Gly Tyr Val Met Gly

1 5

<210> 83

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H2

<400> 83

Ala Ile Ser Arg Gly Gly Leu Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 84

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CDR-H3

<400> 84

Asp Arg Ser Asp Leu Tyr Glu Ile Thr Ala Ala Ser Asn Ile Asp Ser

1 5 10 15

<210> 85

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α信号肽

<400> 85

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 86

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgK信号肽

<400> 86

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 87

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GMCSFR-α (CSF2RA) 信号肽

<400> 87

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 88

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α铰链结构域

<400> 88

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 89

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD28铰链结构域

<400> 89

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 90

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD28铰链结构域

<400> 90

Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu

1 5 10 15

Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro

20 25 30

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35 40

<210> 91

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG4铰链结构域

<400> 91

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 92

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG4铰链结构域

<400> 92

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 93

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG4铰链-CH2-CH3结构域

<400> 93

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 94

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α跨膜结构域

<400> 94

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 95

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD28跨膜结构域

<400> 95

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 96

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD28跨膜结构域

<400> 96

Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 97

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4-1BB共刺激结构域

<400> 97

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 98

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD28共刺激结构域

<400> 98

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 99

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD3ζ信号传导结构域

<400> 99

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 100

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD3ζ信号传导结构域 (在位置14处具有Q至K突变)

<400> 100

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 101

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv整个序列，具有Whitlow接头

<400> 101

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 102

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链可变区

<400> 102

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 103

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链CDR1

<400> 103

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

1 5

<210> 104

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链CDR2

<400> 104

His Thr Ser

1

<210> 105

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链CDR3

<400> 105

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 106

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Whitlow接头

<400> 106

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 107

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链可变区

<400> 107

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 108

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链CDR1

<400> 108

Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

1 5

<210> 109

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链CDR2

<400> 109

Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr

1 5

<210> 110

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链CDR3

<400> 110

Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 111

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD19 FMC63 scFv整个序列，具有3xG4S接头

<400> 111

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 112

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 示例性CD19 CAR核苷酸序列

<400> 112

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 420

gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480

tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540

agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600

gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660

aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720

tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc 780

tcagtcaccg tctcctcaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840

atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900

gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960

acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467

<210> 113

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 示例性CD19 CAR氨基酸序列

<400> 113

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro

145 150 155 160

Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro

165 170 175

Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala

195 200 205

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val

210 215 220

Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

290 295 300

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

305 310 315 320

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 114

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 替沙仑赛CD19 CAR核苷酸序列

<400> 114

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgc 1458

<210> 115

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 替沙仑赛CD19 CAR氨基酸序列

<400> 115

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 116

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利基迈仑赛CD19 CAR核苷酸序列

<400> 116

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60

atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120

gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180

aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240

cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300

gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360

ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420

ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480

cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540

gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600

agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660

agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720

tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780

accagcgtga ccgtgagcag cgaatctaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840

ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900

gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960

ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020

gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080

gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140

tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1200

aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1260

agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1320

ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1380

agg 1383

<210> 117

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利基迈仑赛CD19 CAR氨基酸

序列

<400> 117

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

275 280 285

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

290 295 300

Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

305 310 315 320

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

325 330 335

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

340 345 350

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

370 375 380

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

385 390 395 400

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

405 410 415

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

420 425 430

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

435 440 445

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 118

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 阿基仑赛CD19 CAR核苷酸序列

<400> 118

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467

<210> 119

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 阿基仑赛CD19 CAR氨基酸

序列

<400> 119

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

340 345 350

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

355 360 365

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 120

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv整个序列，具有Whitlow

接头

<400> 120

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser

100 105 110

Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu

115 120 125

Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn

210 215 220

Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Thr Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 121

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链可变区

<400> 121

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 122

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链CDR1

<400> 122

Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp

1 5 10

<210> 123

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链CDR2

<400> 123

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 124

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链CDR3

<400> 124

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 125

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv重链

<400> 125

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 126

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv重链CDR1

<400> 126

Ser Tyr Asn Met His

1 5

<210> 127

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv重链CDR2

<400> 127

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 128

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv整个序列，具有3xG4S

接头

<400> 128

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

180 185 190

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 129

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv重链可变区

<400> 129

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 130

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv重链CDR1

<400> 130

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala

1 5 10

<210> 131

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv重链CDR2

<400> 131

Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn

1 5

<210> 132

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv重链CDR3

<400> 132

Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 133

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv轻链

<400> 133

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 134

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv轻链CDR1

<400> 134

Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

1 5

<210> 135

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv轻链CDR2

<400> 135

Ala Ala Ser

1

<210> 136

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971 scFv轻链CDR3

<400> 136

Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr

1 5

<210> 137

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv整个序列，具有3xG4S

接头

<400> 137

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Val Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Met Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Asn Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Ile

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg

165 170 175

Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

180 185 190

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 138

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链可变区

<400> 138

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Val Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Met Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Asn Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 139

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链CDR1

<400> 139

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Val Ala

1 5 10

<210> 140

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链CDR2

<400> 140

Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn

1 5

<210> 141

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链CDR3

<400> 141

Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 142

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链可变区

<400> 142

Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 143

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链CDR1

<400> 143

Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

1 5

<210> 144

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链CDR2

<400> 144

Ala Ala Ser

1

<210> 145

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链CDR3

<400> 145

Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr

1 5

<210> 146

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv整个序列，具有

Whitlow接头

<400> 146

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile

20 25 30

Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp

165 170 175

Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp

180 185 190

Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

210 215 220

Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Ser Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 147

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv轻链可变区

<400> 147

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile

20 25 30

Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 148

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv轻链CDR1

<400> 148

Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His

1 5 10 15

<210> 149

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv轻链CDR2

<400> 149

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr

1 5

<210> 150

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv轻链CDR3

<400> 150

Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr

1 5

<210> 151

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv重链可变区

<400> 151

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 152

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv重链CDR1

<400> 152

Asp Tyr Ser Ile Asn

1 5

<210> 153

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv重链CDR2

<400> 153

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 154

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C11D5.3 scFv重链CDR3

<400> 154

Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 155

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv整个序列，具有

Whitlow接头

<400> 155

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu

20 25 30

Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His

145 150 155 160

Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp

165 170 175

Met Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp

180 185 190

Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe

210 215 220

Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Ala Leu Thr Val Ser Ser

245

<210> 156

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv轻链可变区

<400> 156

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu

20 25 30

Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 157

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv轻链CDR1

<400> 157

Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 158

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv轻链CDR2

<400> 158

Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr

1 5

<210> 159

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv轻链CDR3

<400> 159

Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr

1 5

<210> 160

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv重链可变区

<400> 160

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys

85 90 95

Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ala

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 161

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv重链CDR1

<400> 161

His Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 162

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv重链CDR2

<400> 162

Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 163

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA C12A3.2 scFv重链CDR3

<400> 163

Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe

1 5

<210> 164

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA FHVH33整个序列

<400> 164

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 165

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA FHVH33 CDR1

<400> 165

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 166

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA FHVH33 CDR2

<400> 166

Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile

1 5

<210> 167

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA FHVH33 CDR3

<400> 167

Ala Lys Glu Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr

1 5 10

<210> 168

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv整个序列，具有

Whitlow接头

<400> 168

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser

100 105 110

Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu Gln Leu

115 120 125

Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp

145 150 155 160

Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser

165 170 175

Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg

180 185 190

Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu

195 200 205

Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp

210 215 220

Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 169

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv轻链可变区

<400> 169

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 170

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv轻链CDR1

<400> 170

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 171

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv轻链CDR2

<400> 171

Ala Ala Ser

1

<210> 172

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv轻链CDR3

<400> 172

Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr

1 5

<210> 173

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv重链可变区

<400> 173

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 174

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv重链CDR1

<400> 174

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr

1 5 10

<210> 175

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv重链CDR2

<400> 175

Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 176

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti-BCMA CT103A scFv重链CDR3

<400> 176

Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val

1 5 10

<210> 177

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 示例性BCMA CAR核苷酸序列

<400> 177

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120

accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300

cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcag caaaaatacg acctcctcac ttttggcgga 360

gggaccaagg ttgagatcaa aggcagcacc agcggctccg gcaagcctgg ctctggcgag 420

ggcagcacaa agggacagct gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 480

gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggtggctcca tcagcagtag tagttactac 540

tggggctgga tccgccagcc cccagggaag gggctggagt ggattgggag tatctcctat 600

agtgggagca cctactacaa cccgtccctc aagagtcgag tcaccatatc cgtagacacg 660

tccaagaacc agttctccct gaagctgagt tctgtgaccg ccgcagacac ggcggtgtac 720

tactgcgcca gagatcgtgg agacaccata ctagacgtat ggggtcaggg tacaatggtc 780

accgtcagct cattcgtgcc cgtgttcctg cccgccaaac ctaccaccac ccctgcccct 840

agacctccca ccccagcccc aacaatcgcc agccagcctc tgtctctgcg gcccgaagcc 900

tgtagacctg ctgccggcgg agccgtgcac accagaggcc tggacttcgc ctgcgacatc 960

tacatctggg cccctctggc cggcacctgt ggcgtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc 1020

ctgtactgca accaccggaa caaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 1080

ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1140

gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga gtgaagttca gcagatccgc cgacgcccct 1200

gcctaccagc agggacagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag acgggaagag 1260

tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccccgaga tgggcggaaa gcccagacgg 1320

aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1380

agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cgcggcaagg gccacgatgg cctgtaccag 1440

ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc 1500

aga 1503

<210> 178

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 示例性BCMA CAR氨基酸序列

<400> 178

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys

100 105 110

Tyr Asp Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

145 150 155 160

Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser

165 170 175

Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro

195 200 205

Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

210 215 220

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala

260 265 270

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

275 280 285

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

290 295 300

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

305 310 315 320

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

325 330 335

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys

340 345 350

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

355 360 365

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

370 375 380

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

385 390 395 400

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

405 410 415

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

420 425 430

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

435 440 445

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

450 455 460

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

465 470 475 480

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

485 490 495

Ala Leu Pro Pro Arg

500

<210> 179

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8跨膜

<400> 179

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

1 5 10 15

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

20 25 30

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

35 40

<210> 180

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8铰链

<400> 180

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

20 25

<210> 181

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>接头

<400> 181

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 182

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD20 Leu16 scFv重链CDR3

<400> 182

Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val

Claims

1.一种转导T细胞的方法，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述未活化的T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)处理。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用与抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体(例如CD28.2)偶联的珠处理，任选地其中所述珠是超顺磁珠。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)处理，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞尚未用可溶性T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体或可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD137L或可溶性ICOS-L)处理。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含CD3ζ信号传导结构域和共刺激信号传导结构域的细胞内组分的细胞内信号传导结构域。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域是CD28共刺激结构域，任选地其中所述CD28共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列。

13.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域是4-1BB信号传导结构域，任选地其中所述4-1BB信号传导结构域包含SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列。

14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:99或SEQ ID NO:100中所示的序列。

15.如权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:94、95和96中任一个所示的序列。

16.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述CAR包含铰链结构域，任选地其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:88、89、90、91、92、93和180中任一个所示的序列。

17.如权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合选自由CD19、CD20、CD22和BCMA组成的组的抗原。

18.如权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD19。

19.如权利要求11-18中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(c)SEQ ID NO:101或111中所示的氨基酸序列。

20.如权利要求11-19中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:113、115、117或119中所示的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO:112、114、116或118中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

21.如权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD20。

22.如权利要求11-17和21中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(c)SEQ ID NO:120中所示的氨基酸序列。

23.如权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD22。

24.如权利要求11-17和23中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(c)SEQ ID NO:128或137中所示的氨基酸序列。

25.如权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合BCMA。

26.如权利要求11-17和25中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

包含SEQ ID NO:164中所示的氨基酸序列的VH区；和/或

(c)SEQ ID NO:146、155或168中所示的氨基酸序列。

27.如权利要求11-17、25和26中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:178中所示的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO:177中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

28.如权利要求9所述的方法，其中所述工程化受体是工程化T细胞受体(TCR)。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞是人T细胞。

30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞在受试者中。

31.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞是在体外的。

32.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞是来自受试者的离体的。

33.如权利要求30或权利要求32所述的方法，其中在接触之前，所述受试者尚未被施用T细胞活化治疗。

34.如权利要求30、32和33中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或疾患。

35.一种转导T细胞群体的方法，所述方法包括：

36.如权利要求35所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体以至少5％的效率转导。

37.如权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体以至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的效率转导。

38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体中至少75％的所述T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性(例如所述群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的所述T细胞对于所述T细胞活化标志物呈表面阴性)。

39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体包含CD8+T细胞(例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的所述未活化的T细胞群体是CD8+T细胞)。

40.如权利要求39所述的方法，其中至少75％的所述CD8+T细胞对于选自由CD25、CD44和CD69组成的组的一种或多种T细胞活化标志物呈表面阴性(例如所述群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的所述CD8+T细胞对于所述T细胞活化标志物呈表面阴性)。

41.如权利要求39或权利要求40所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体中的所述CD8+T细胞以至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的效率转导。

42.如权利要求35-41中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用抗CD3抗体(例如，OKT3)处理。

43.如权利要求35-42中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用抗CD28抗体(例如，CD28.2)处理。

44.如权利要求35-43中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用与抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体(例如CD28.2)偶联的珠处理，任选地其中所述珠是超顺磁珠。

45.如权利要求35-44中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)处理，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

46.如权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体尚未用可溶性T细胞共刺激分子(例如抗CD28抗体或可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD137L或可溶性ICOS-L)处理。

47.如权利要求35-46中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体是人细胞。

48.如权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体在受试者中。

49.如权利要求48所述的方法，其中在接触之前，所述受试者尚未被施用T细胞活化治疗。

50.如权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体是在体外的。

51.如权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体是来自受试者的离体的。

52.如权利要求35-47、50和51中任一项所述的方法，其中所述未活化的T细胞群体包含外周血单核细胞(PBMC)或其包含CD8+T细胞的亚群。

53.如权利要求35-47和50-52中任一项所述的方法，其中所述未活化的细胞群体是选自来自受试者的生物样品的富集的T细胞群体，任选地其中所述T细胞是针对对于T细胞标志物(例如，CD3或CD8)呈表面阳性的T细胞而选择的。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述生物样品是全血样品、单采样品或白细胞单采样品。

55.如权利要求48、49和51-54所述的方法，其中所述受试者患有疾病或疾患。

56.如权利要求35-47和50-55中任一项所述的方法，其还包括扩增转导的T细胞群体。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述扩增包括将所述转导的细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

58.如权利要求35-47和50-56中任一项所述的方法，其还包括将所述转导的T细胞与一种或多种T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合)一起孵育，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

59.一种体内转导T细胞的方法，所述方法包括：

60.如权利要求59所述的方法，其中所述受试者患有疾病或疾患。

61.包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者的用途。

62.一种包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，所述组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者。

63.一种治疗患有疾病或疾患的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，其中所述受试者在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。

64.如权利要求9-60和63中任一项所述的方法、如权利要求61所述的用途或如权利要求62所述的组合物，其中所述疾病或疾患是癌症。

65.如权利要求34、55-58、60、63和64中任一项所述的方法、如权利要求61或权利要求64所述的用途或如权利要求62或权利要求64所述的组合物，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别由与所述疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

66.一种用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的方法，所述方法包括：

67.如权利要求66所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别在所述肿瘤细胞上表达的蛋白质，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

68.如权利要求33-34、49、55-60、63-67、138-142和163-165中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用抗CD3抗体(例如，OKT3)。

69.如权利要求33-34、49、55-60、63-68、138-142和163-165中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用可溶性T细胞共刺激分子(例如，抗CD28抗体或重组CD80、CD86、CD137L、ICOS-L)。

70.如权利要求33-34、49、55-60、63-69、138-142和163-165中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用T细胞活化细胞因子(例如，重组IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)，任选地其中所述T细胞活化细胞因子是人细胞因子。

71.如权利要求33-34、49、55-60、63-70、138-142和163-165中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用重组IL-7，任选地人IL-7。

72.如权利要求33-34、49、55-60、63-71、138-142和163-165中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括施用淋巴细胞清除疗法，任选地施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。

73.如权利要求1-60和63-72中任一项所述的方法、如权利要求61、64和65中任一项所述的用途或如权利要求62、64和65中任一项所述的组合物，其中所述CD8结合剂是抗CD8抗体或抗原结合片段。

74.如权利要求73所述的方法、用途或组合物，其中所述抗CD8抗体或抗原结合片段是小鼠、兔、人或人源化的。

75.如权利要求73或权利要求74所述的方法、用途或组合物，其中所述抗CD8抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。

76.如权利要求73所述的方法、用途或组合物，其中所述抗CD8抗体或抗原结合片段是单结构域抗体。

77.如权利要求73、74和76中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗CD8抗体或抗原结合片段是骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)抗CD8抗体或抗原结合片段(例如VHH)。

78.如权利要求1-60和63-77中任一项所述的方法、如权利要求61、64-65和73-77中任一项所述的用途或如权利要求62、64、65和73-77中任一项所述的组合物，其中所述CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。

79.如权利要求1-60和63-78中任一项所述的方法、如权利要求61、64-65和73-78中任一项所述的用途或如权利要求62、64-65和73-78中任一项所述的组合物，其中所述CD8结合剂暴露在所述慢病毒载体的所述表面上。

80.如权利要求1-60和63-79中任一项所述的方法、如权利要求61、64-65和73-79中任一项所述的用途或如权利要求62、64-65和73-79中任一项所述的组合物，其中所述CD8结合剂与掺入病毒包膜中的跨膜结构域融合。

81.如权利要求1-60和63-80中任一项所述的方法、如权利要求61、64-65和73-80中任一项所述的用途或如权利要求62、64-65和73-80中任一项所述的组合物，其中所述慢病毒载体是用病毒融合蛋白假型化的。

82.如权利要求81所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白是VSV-G蛋白或其功能性变体。

83.如权利要求81所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白是科卡尔病毒G蛋白或其功能性变体。

84.如权利要求81所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白是甲病毒属融合蛋白(例如辛德比斯病毒)或其功能性变体。

85.如权利要求81所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白是副粘病毒科融合蛋白(例如麻疹病毒属或亨尼帕病毒属)或其功能性变体。

86.如权利要求81或权利要求85所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白是麻疹病毒属融合蛋白(例如，麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒、鲸类麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、海豹瘟热病毒、牛瘟病毒)或其功能性变体。

87.如权利要求81或权利要求85所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白是亨尼帕病毒属融合蛋白(例如，尼帕病毒、亨德拉病毒、雪松病毒、库马西病毒、墨江病毒)或其功能性变体。

88.如权利要求81-87中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以减少与其天然受体的结合。

89.如权利要求81-88中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白与所述CD8结合剂融合。

90.如权利要求81、85和87-89中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述病毒融合蛋白包含尼帕病毒F糖蛋白(NiV-F)或其生物活性部分和尼帕病毒G糖蛋白(NiV-G)或其生物活性部分，并且其中所述CD8结合剂与所述NiV-G或其生物活性部分融合。

91.如权利要求90所述的方法、用途或组合物，其中所述CD8结合剂与所述尼帕病毒G糖蛋白或其生物活性部分的C末端融合。

92.如权利要求89-91中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CD8结合蛋白直接或通过肽接头与所述病毒融合蛋白融合。

93.如权利要求89-92中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G或其生物活性部分是野生型NiV-G蛋白或其功能活性变体或生物活性部分。

94.如权利要求89-93中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分是截短的，并且缺少所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的多达40个连续氨基酸残基。

95.如权利要求89-94中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的5个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:12中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

96.如权利要求89-95中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的10个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:44中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

97.如权利要求89-94中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的15个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:45中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

98.如权利要求89-94中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的20个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:13中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

99.如权利要求89-94中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的25个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:14中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

100.如权利要求89-94中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的30个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:43中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

101.如权利要求89-94中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有在所述野生型NiV-G蛋白的N末端处或附近的34个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-G蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:42中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

102.如权利要求89-101中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G-蛋白或其生物活性部分是表现出与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的结合降低的突变型NiV-G蛋白。

103.如权利要求102所述的方法、用途或组合物，其中所述突变型NiV-G蛋白或所述生物活性部分包含与选自由参考SEQ ID NO:4中所示的编号的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的氨基酸取代相对应的一个或多个氨基酸取代。

104.如权利要求102或权利要求103所述的方法、用途或组合物，其中所述突变型NiV-G蛋白或所述生物活性部分包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

105.如权利要求102或权利要求103所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-G蛋白或所述生物活性部分具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

106.如权利要求89-105中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分是野生型NiV-F蛋白或是其功能活性变体或生物活性部分。

107.如权利要求89-106中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在所述野生型NiV-F蛋白的C末端处或附近的20个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:20中所示的序列，或与SEQ ID NO:20中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

108.如权利要求89-107中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分包含：

i)在所述野生型NiV-F蛋白的C末端处或附近的20个氨基酸截短；以及

ii)在N-连接的糖基化位点上的点突变，

109.如权利要求89-106中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有在所述野生型NiV-F蛋白的C末端处或附近的22个氨基酸截短，任选地其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分具有SEQ ID NO:16或21中所示的序列，或与SEQ IDNO:16或21中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

110.如权利要求89-106和109中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述NiV-F蛋白或其生物活性部分包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21中所示的序列表现出至少或约80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

111.如权利要求89-106、109和110中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述Niv-G蛋白包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，并且所述NiV-F蛋白包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。

112.如权利要求1-111中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述慢病毒载体包含转基因。

113.如权利要求112所述的方法、用途或组合物，其中所述转基因包含编码能够进行RNA干扰的RNA序列(例如pre-miRNA、siRNA或shRNA)的核酸序列。

114.如权利要求112所述的方法、用途或组合物，其中所述转基因选自由以下组成的组：治疗性基因、报告基因、编码酶的基因、编码前体药物酶的基因、编码细胞凋亡诱导剂的基因、编码荧光蛋白的基因、编码前体药物活化酶的基因、编码凋亡蛋白的基因、编码凋亡酶的基因、编码自杀蛋白的基因、编码细胞因子的基因、编码抗免疫抑制蛋白的基因、编码表观遗传调节剂的基因、编码T细胞受体(TCR)的基因、编码嵌合抗原受体(CAR)的基因、编码修饰转导细胞的细胞表面的蛋白质的基因、编码修饰内源TCR表达的蛋白质的基因，以及编码将促肿瘤信号转化为抗肿瘤信号的开关受体的基因。

115.如权利要求112所述的方法、用途或组合物，其中所述转基因编码工程化受体，所述工程化受体结合或识别由与疾病或疾患相关的细胞或病灶(例如肿瘤)表达的蛋白质或抗原，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

116.如权利要求65和67-115中任一项所述的方法或如权利要求112-115中任一项所述的用途或组合物，其中所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。

117.如权利要求116所述的方法、用途或组合物，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含CD3ζ信号传导结构域和共刺激信号传导结构域的细胞内组分的细胞内信号传导结构域。

118.如权利要求117所述的方法、用途或组合物，其中所述共刺激信号传导结构域是CD28共刺激结构域，任选地其中所述CD28共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列。

119.如权利要求117或权利要求118所述的方法、用途或组合物，其中所述共刺激信号传导结构域是4-1BB信号传导结构域，任选地其中所述4-1BB信号传导结构域包含SEQ IDNO:97中所示的氨基酸序列。

120.如权利要求117-119中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100中所示的序列。

121.如权利要求117-120中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:94、95和96中任一个所示的序列。

122.如权利要求117-121中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CAR包含铰链结构域，任选地其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:88、89、90、91、92、93和180中任一个所示的序列。

123.如权利要求117-122中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域结合选自由CD19、CD20、CD22和BCMA组成的组的抗原。

124.如权利要求117-123中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域结合CD19。

125.如权利要求117-124中任一项所述的权利要求方法、用途或组合物中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含：

(c)SEQ ID NO:101或111中所示的氨基酸序列。

126.如权利要求117-125中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CAR包含SEQID NO:113、115、117或119中所示的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO:112、114、116或118中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

127.如权利要求117-123中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域结合CD20。

128.如权利要求117-123和127中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域包含：

(c)SEQ ID NO:120中所示的氨基酸序列。

129.如权利要求117-123中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域结合CD22。

130.如权利要求117-123和129中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域包含：

(c)SEQ ID NO:128或137中所示的氨基酸序列。

131.如权利要求117-123中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域结合BCMA。

132.如权利要求117-123和131中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述抗原结合结构域包含：

包含SEQ ID NO:164中所示的氨基酸序列的VH区；和/或

(c)SEQ ID NO:146、155或168中所示的氨基酸序列。

133.如权利要求117-123、131和132中任一项所述的权利要求方法、用途或组合物中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:178中所示的氨基酸序列和/或由SEQ IDNO:177中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

134.如权利要求65和67-115中任一项所述的方法或如权利要求112-115中任一项所述的用途或组合物，其中所述转基因编码工程化T细胞受体(TCR)。

135.如权利要求1-134中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述慢病毒载体不包含或编码T细胞活化剂，任选地其中所述T细胞活化剂是淋巴组织增生剂。

136.如权利要求135所述的方法、用途或组合物，其中所述T细胞活性剂是：

能够结合CD3和/或CD28的多肽；

137.如权利要求1-136中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述慢病毒载体不包含或编码膜结合和/或展示在所述表面上的T细胞活化剂，任选地其中所述T细胞活化剂是淋巴组织增生剂。

138.如权利要求33-34、49和55-137中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述受试者不同时施用所述慢病毒载体与T细胞活化治疗。

139.如权利要求33-34、49和55-138中任一项所述的方法、用途或组合物，其中在与所述慢病毒载体接触之前或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之前1个月内所述受试者未施用T细胞活化治疗。

140.如权利要求33-34、49和55-139中任一项所述的方法、用途或组合物，其中在与所述慢病毒载体接触之前或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之前1周、2周、3周或4周内或1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周时，任选地在1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，所述受试者未施用T细胞活化治疗。

141.如权利要求33-34、49和55-140中任一项所述的方法、用途或组合物，其中在与所述慢病毒载体接触之后或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之后1个月内所述受试者未施用T细胞活化治疗。

142.如权利要求33-34、49和55-141中任一项所述的方法、用途或组合物，其中在与所述慢病毒载体接触之后或在施用包含所述慢病毒载体的所述组合物之后1周、2周、3周或4周内或1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周时，任选地在1、2、3、4、5、6或7天或约1、2、3、4、5、6或7天时，所述受试者未施用T细胞活化治疗。

143.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其还包括编辑所述T细胞或所述T细胞群体以使B2M、CIITA、TRAC和TRB基因中的一种或多种失活。

144.如权利要求143所述的方法，其中编辑所述T细胞或所述T细胞群体以使B2M、CIITA和TRAC基因失活。

145.如权利要求143所述的方法，其中编辑所述T细胞或所述T细胞群体以使B2M、CIITA和TRB基因失活。

146.如权利要求143-145中任一项所述的方法，其还包括在确定的基因座处将编码CD47的基因插入到所述T细胞或所述T细胞群体中。

147.如权利要求146所述的方法，其中所述确定的基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港基因座组成的组。

148.如权利要求147所述的方法，其中所述安全港基因座选自由AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座组成的组。

149.如权利要求143-148中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码工程化受体的转基因，所述工程化受体结合或识别由与所述疾病或疾患相关的细胞(例如肿瘤细胞)表达或在所述细胞上表达的蛋白质或抗原，任选地其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

150.如权利要求1-60或63-149中任一项所述的方法，其中所述接触或所述施用通过使用封闭的流体回路向受试者离体施用所述慢病毒载体来进行。

151.如权利要求150所述的方法，其中所述离体施用包括：

(a)从受试者获得全血；

(b)收集含有包含T细胞(例如CD8+T细胞)的白细胞组分的血液部分；

(c)使所述包含T细胞(例如CD8+T细胞)的白细胞组分与包含所述慢病毒载体的组合物接触；以及

(d)将接触的包含T细胞(例如CD8+T细胞)的白细胞组分再输注到所述受试者中，其中步骤(a)-(d)在封闭的流体回路中串联进行。

152.如权利要求151所述的方法，其中步骤(c)中的所述接触不超过24小时、不超过18小时、不超过12小时或不超过6小时。

153.一种转导的T细胞，其通过如权利要求1-29、31-60和68-152中任一项所述的方法产生。

154.如权利要求153所述的转导的T细胞，其中所述T细胞在一种或多种基因的两个等位基因处失活。

155.一种包含如权利要求153或权利要求154所述的转导的T细胞的组合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

156.一种转导的T细胞群体，其通过如权利要求35-47、50-58和68-152中任一项所述的方法产生。

157.如权利要求156所述的转导的T细胞群体，其中所述未活化的细胞群体中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的所述细胞在所述一种或多种基因处失活。

158.如权利要求156或权利要求157所述的转导的T细胞群体，其中所述群体中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的所述未活化的CD8+T细胞被转导并在所述一种或多种基因处失活。

159.如权利要求156-158中任一项所述的转导的T细胞群体，其中所述群体的细胞在所述一种或多种基因的两个等位基因处失活。

160.一种包含如权利要求156-159中任一项所述的转导的T细胞群体的组合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

161.一种包含通过如权利要求35-47、50-58和68-152中任一项所述的方法产生的转导的T细胞群体的组合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

162.如权利要求62、64、65、73-142、155、160和161中任一项所述的组合物，其还包含冷冻防腐剂，任选地其中所述冷冻防腐剂是DMSO。

163.一种治疗患有疾病或疾患的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用如权利要求62、64、65、73-142、155和160-162中任一项所述的组合物，其中所述受试者在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用T细胞活化治疗。

164.如权利要求163所述的方法，其中所述疾病或疾患是癌症。

165.一种用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的方法，所述方法包括：

166.如权利要求62、64、65、73-142、155和160-162中任一项所述的组合物用于配制用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者的药物的用途。

167.一种如权利要求62、64、65、73-142、155和160-162中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗患有疾病或疾患、任选地癌症的受试者。

168.包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物用于配制用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的药物的用途。

169.如权利要求62、64、65、73-142、155和160-162中任一项所述的组合物用于配制用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞的药物的用途。

170.一种包含含有CD8结合剂的慢病毒载体的组合物，所述组合物用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞。

171.一种如权利要求62、64、65、73-142、155和160-162中任一项所述的组合物，所述组合物用于在有需要的受试者中扩增能够识别和杀死肿瘤细胞的T细胞。

172.如权利要求166-171中任一项所述的用途或组合物，用于在施用所述组合物时(例如之前、之后或同时)不施用或待施用T细胞活化治疗的受试者。

173.如权利要求11-20和117-126中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CAR包含：

(a)抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:102中所示的VL区、包含SEQID NO:106中所示的氨基酸序列的接头和SEQ ID NO:107中所示的VH区；和/或SEQ ID NO:101中所示的scFv；

(b)包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列的铰链；

(c)包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列的跨膜结构域；

174.如权利要求11-20、117-126和173中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述CAR包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO:112中所示的核苷酸序列编码。