BR112019018288A2 - Métodos e composições para transduzir e expandir linfócitos e regular a atividade dos mesmos - Google Patents

Métodos e composições para transduzir e expandir linfócitos e regular a atividade dos mesmos Download PDF

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Joseph Onuffer James
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Haerizadeh Farzad
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Abstract

a presente revelação fornece métodos para modificar geneticamente linfócitos e métodos para realizar terapia celular adotiva que incluem transduzir células t e/ou células nk. os métodos podem incluir molécula (ou moléculas) de rna inibidora e/ou polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados que podem incluir um elemento linfoproliferativo e/ou um receptor de antígeno quimérico (car), por exemplo, um car biológico restrito ao microambiente (mrb-car). os elementos adicionais de tais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados são fornecidos no presente documento, como aqueles que acionam a proliferação e elementos reguladores da mesma, assim como partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação e linhagens de célula de empacotamento e métodos para produzir as mesmas. inúmeros elementos e métodos para regular células t e/ou células nk transduzidas e/ou geneticamente modificadas são fornecidos, como, por exemplo, aqueles que incluem riboswitches, mrb-cars, domínios de reconhecimento e/ou agentes de modulação de ph.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRANSDUZIR E EXPANDIR LINFÓCITOS E REGULAR A ATIVIDADE DOS MESMOS”
Referência cruzada a pedidos relacionados [ 1 ] Esse pedido é uma continuação em parte de Pedido Internacional n° PCT/US2017/023112 depositado 19 de março de 2017; uma continuação em parte do Pedido Internacional n° PCT/US2017/041277 depositado 8 de julho de 2017; uma continuação em parte do Pedido n° U.S. 15/462.855 depositado 19 de março de 2017; e uma continuação de parte do Pedido n° U.S. 15/644.778 depositado em 8 de julho de 2017; e reivindica o benefício do Pedido Provisório n° U.S. 62/467.039 depositado 03 de março de 2017; Pedido Provisório n° U.S. 62/560.176 depositado 19 de setembro de 2017; Pedido Provisório n° U.S. 62/564.253 depositado 27 de setembro de 2017; e Pedido Provisório n° U.S. 62/564.991 depositado 28 de setembro de 2017; Pedido Internacional n° PCT/US2017/023112 reivindica o benefício do Pedido Provisório n° U.S. 62/390.093 depositado em 19 de março de 2016; Pedido Provisório n° U.S. 62/360.041 depositado 8 de julho de 2016; e Pedido Provisório n° U.S. 62/467.039 depositado 03 de março de 2017; Pedido Internacional n° PCT/US2017/041277 reivindica o benefício do Pedido Internacional n° PCT/US2017/023112 depositado 19 de março de 2017; Pedido de Patente n° U.S. 15/462.855, depositado 19 de março de 2017; Pedido Provisório n° U.S. 62/360.041 depositado 8 de julho de 2016; e Pedido Provisório n° U.S. 62/467.039, depositado 03 de março de 2017; Pedido n° U.S. 15/462.855 reivindica o benefício de Pedido Provisório n° U.S. 62/390.093 depositado 19 de março de 2016; Pedido Provisório n° U.S. 62/360.041 depositado 8 de julho de 2016; e Pedido Provisório n° U.S. 62/467.039 depositado 03 de março de 2017; e Pedido n° U.S. 15/644.778 é uma continuação em parte do Pedido Internacional n° PCT/US2017/023112 depositado 19 de março de 2017 e uma continuação em parte do Pedido de Patente n° U.S. 15/462.855 depositado 19 de março de 2017, e reivindica o benefício de Pedido Provisório n° U.S. 62/360.041 depositado 8 de julho de 2016 e Pedido Provisório n° U.S. 62/467.039 depositado 03 de março de 2017. Esses pedidos são incorporados a título de referência no presente documento em sua totalidade.
Listagem de sequências [ 2 ] Este pedido incorpora por referência o material da Listagem de Sequência
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4248/5200
2/540 eletrônica arquivada concomitantemente. Os materiais na listagem de sequência eletrônica são submetidos como um arquivo de texto (-txt) intitulado “Fl_001_WO_03_Sequence_Listing_2018_03_03.txt” criado em sábado, 3 de março de 2018, que tem um tamanho de arquivo de 526 KB e está incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade.
Campo da Invenção [ 3 ] Essa revelação se refere ao campo de imunologia ou, mais especificamente, à modificação genética de linfócitos T ou outras células imunes e métodos para produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação e controlar a expressão de genes nas mesmas.
Antecedentes da revelação [ 4 ] Os linfócitos isolados de um sujeito (por exemplo, paciente) podem ser ativados in vitro e geneticamente modificados para expressar proteínas sintéticas que possibilitam a interconexão redirecionada a outras células e ambientes com base nos programas genéticos incorporados. Um exemplo de tal proteína sintética é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Um exemplo de tal proteína sintética é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Um CAR que é atualmente usado é uma fusão de um domínio de reconhecimento extracelular (por exemplo, um domínio de ligação a antígeno), um domínio transmembranar e um ou mais domínios de sinalização intracelulares codificados por um retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[ 5 ] Embora os retrovirus recombinantes tenham mostrado eficácia na infecção de células que não se dividem, linfócitos CD4 e CD8 em repouso são refratários à transdução genética por esses vetores. Para superar essa dificuldade, essas células são tipicamente ativadas in vitro com o uso de reagentes de estimulação antes de a modificação genética com o vetor de gene de CAR poder ocorrer. Após a estimulação e a transdução, as células geneticamente modificadas são expandidas in vitro e subsequentemente reintroduzidas em um paciente linfodepletado. Mediante a interconexão de antígeno in vivo, a porção de sinalização intracelular do CAR pode iniciar uma resposta relacionada à ativação em uma célula imune e a liberação de moléculas citolíticas para induzir a morte de célula tumoral.
[ 6 ] Tais métodos atuais exigem manipulação extensiva e fabricação de células T
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4249/5200
3/540 proliferativas fora do corpo antes de sua reinfusão no paciente, assim como quimioterapia de linfodepleção para libertar citocinas e depletar receptores de competição para facilitar o enxerto de célula T. Tais terapias de CAR não podem mais ser controladas para taxa de propagação in vivo uma vez introduzidas no corpo, nem direcionadas com segurança para os alvos que são também expressos fora do tumor. Como um resultado, terapias de CAR hoje em dia são tipicamente infundidas a partir de células expandidas ex vivo de 12 a 28 dias com o uso de doses de 1 x 105 a 1 x 108 células/kg e são direcionadas para os alvos, por exemplo, alvos de tumor, para os quais toxicidade no alvo e fora do tumor é geralmente aceitável. Esses tempos de expansão ex vivo relativamente longos criam problemas de viabilidade e esterilidade de célula, assim como identidade da amostra adicionalmente aos desafios de escalabilidade. Assim, há necessidades significativas para uma terapia de célula T ou célula NK escalonável mais eficaz.
[ 7 ] Devido ao nosso entendimento de processos que acionam a transdução, proliferação e sobrevivência de linfócitos é central a vários usos comerciais potenciais que envolvem processos imunológicos, há uma necessidade de métodos e composições aprimorados para estudar linfócitos. Por exemplo, seria útil identificar métodos e composições que podem ser usados para mais bem caracterizar e entender como linfócitos pode ser geneticamente modificada e os fatores que influenciam sua sobrevivência e proliferação. Ademais, seria útil identificar as composições que acionam a proliferação e sobrevivência de linfócito. Tais composições poderíam ser usadas para estudar a regulação de tais processos. Em adição a métodos e composições para estudar os linfócitos, há uma necessidade de linhagens de célula de empacotamento virais aprimoradas e métodos para produzir e usar as mesmas. Por exemplo, tais linhagens celulares e métodos seriam úteis na análise componentes diferentes de vírus recombinantes, como partículas retrovirais recombinantes e para métodos que usam linhagens celulares de empacotamento para a produção de partículas retrovirais recombinantes.
Sumário [ 8 ] São fornecidos que no presente documento métodos, composições e kits que ajudam a superar problemas relacionados à eficácia e segurança de métodos para transduzir e/ou modifica geneticamente linfócitos como células T e/ou células NK. Certas modalidades de tais métodos são úteis para realizar terapia celular adotiva com essas células. Consequentemente, em alguns aspectos, são fornecidos no presente documento métodos, composições e kits para
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4/540 modificar geneticamente e/ou transduzir linfócitos, especificamente célula T e/ou células NK e/ou para regular a atividade de células T e/ou células NK transduzidas e/ou geneticamente modificadas. Tais métodos, composições e kits fornecem eficácia aprimorada e segurança através de tecnologias atuais, especificamente em relação a células T e/ou células NK que expressam receptores de antígeno quimérico (CARs) e em modalidades ilustrativas, CARs biológicos restritos ao microambiente. As células T e/ou células NK transduzidas e/ou geneticamente modificadas que são produzidas por e/ou usadas em métodos fornecidos no presente documento incluem funcionalidade e combinações de funcionalidade, em modalidades ilustrativas entregues a partir de genomas retrovirais (por exemplo, lentivirais) por meio de partículas retrovirais (por exemplo, lentivirais), que fornecem recursos aprimorados para tais células e para métodos que utilizam tais células, como métodos de busca, métodos de produção comercial e terapia celular adotiva. Por exemplo, tais células podem ser produzidas em menos tempo ex vivo, e têm propriedades de crescimento aprimoradas que podem ser mais bem reguladas.
[ 9 ] São fornecidos no presente documento, em alguns aspectos, elementos reguladores para regular a expressão de CARs, mRNA, RNA (ou RNAs) inibidor e/ou elementos linfoproliferativos, por exemplo, elementos linfoproliferativos quiméricos, em linfócitos como células B, células T e células NK. Ademais, são fornecidos no presente documento, em alguns aspectos, retrovirus recombinantes que expressam vários elementos funcionais e que portam vários elementos funcionais em sua superfície e métodos e linhagens de célula de empacotamento para produzir os retrovirus recombinantes. Esses retrovirus recombinantes e métodos e células para produzir os mesmos superam as limitações da técnica anterior em relação ao número e ao tamanho em um genoma, de diferentes elementos funcionais que fornecem benefícios quando entregues a uma célula T e/ou células NK.
[10] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para transduzir e/ou modificar geneticamente os linfócitos como células T e/ou células NK, e, em modalidades ilustrativas, métodos ex vivo para transduzir e/ou modificar geneticamente as células T e/ou células NK em repouso. Alguns desses aspectos podem ser realizados muito mais rapidamente do que os métodos anteriores, que podem facilitar uma busca mais eficaz, uma produção comercial mais eficaz e métodos aprimorados de cuidados com o paciente. Ademais, são fornecidos no presente documento métodos que, em algumas modalidades, utilizam retrovirus recombinantes fornecidos
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5/540 no presente documento em alguns aspectos juntamente com agentes farmacológicos para fornecer mecanismos de segurança aprimorados para ajudar a modular a atividade de linfócitos transduzidos e/ou geneticamente modificados como células T e/ou células NK. Tais métodos, composições e kits podem ser usados como ferramentas de busca em produção comercial e em terapia celular adotiva com células T e/ou células NK transduzidas e/ou geneticamente modificadas que expressam um CAR.
[11] Os detalhes adicionais a respeito de aspectos e modalidades da presente revelação são fornecidos ao longo do presente pedido de patente. As seções e os cabeçalhos de seção não são destinados a limitar combinações de métodos, composições e kits ou elementos funcionais nos mesmos.
Breve descrição dos desenhos [12] A Figura 1 mostra um esquema de composições ilustrativas que incluem uma célula de empacotamento (100) e uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) de uma modalidade exemplificativa e não limitante da presente revelação, produzida pela célula de empacotamento (100). Na Figura 1, vários vetores (chamados de polinucleotídeos recombinantes (110)) capazes de codificar aspectos da invenção são empacotados em uma partícula retroviral recombinante (200) que inclui em seu genoma um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que inclui um ou mais elementos linfoproliferativos e, em algumas modalidades, um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que é um receptor de antígeno quimérico ou um CAR. A partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação expressa em sua membrana, um elemento de pseudotipagem (em uma modalidade não limitante, um polipeptídeo de hemaglutinina do Vírus do Sarampo (H) e um polipeptídeo de fusão do Vírus do Sarampo (F) ou variantes de deleção do domínio citoplasmático dos mesmos) (240) que permite que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação se ligue e se funda a uma célula-alvo; um elemento de ativação (em modalidades não limitantes, um elemento de ativação que tem um polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD28 e um polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD3) (210 e 220, respectivamente) que tem a capacidade para se ligar e ativar uma célula T em repouso; e uma citocina ligada à membrana (em uma modalidade não limitante, um polipeptídeo de fusão de DAF de IL-7) (230). As partes identificadas como (250), (260), (270), (280) e (290) são Src-
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FLAG-Vpx, matriz de gag de HIV, capsídeo de gag de HIV, RNA e pol de HIV, respectivamente.
[13] A Figura 2 mostra um esquema de composições ilustrativas que incluem uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) produzida por uma célula de empacotamento (100) e uma célula T em repouso (300) transfectada pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200). Os elementos na superfície da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) se ligam aos receptores e/ou ligantes na superfície de uma célula T em repouso. O elemento de pseudotipagem pode incluir, em modalidades não limitantes, um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico (em modalidades não limitantes, um polipeptídeo de hemaglutinina do Vírus do Sarampo (H) e um polipeptídeo de fusão do Vírus do Sarampo (F) ou variantes de deleção do domínio citoplasmático dos mesmos) que facilitam a ligação e a fusão da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) à célula T. Em modalidades não limitantes, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) inclui, em sua superfície, um elemento de ativação (em modalidades não limitantes, um elemento de ativação que tem um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 e um polipeptídeo capaz de se ligar a CD3) que é capaz de ativar a célula T em repouso através do engate do complexo de receptor de célula T e opcionalmente um correceptor (320). Ademais, as citocinas ligadas à membrana (em modalidades não limitantes, um polipeptídeo de fusão de DAF de IL-7) presentes na superfície da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) se ligam a IL-7Ra (310) na superfície da célula T em repouso. A partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) se funde com a célula T e os polinucleotídeos que codificam o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que inclui o elemento linfoproliferativo (em modalidades ilustrativas, um ativo IL-7Ra constitutivamente ativo) (370) são transcritos de modo reverso no citosol antes da migração para o núcleo a ser incorporado no DNA da célula T ativada. Sem se limitar à teoria, em algumas modalidades não limitantes, Src-FLAG-Vpx (250) empacotado com o vírus entra no citosol das células T em repouso e promove a degradação de SAMHD1 (350), resultando em um agrupamento aumentado de dNTPs citoplasmáticos disponíveis para a transcrição reversa. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos também podem codificar um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que inclui um CAR (360). Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é expressado quando um composto se liga a um elemento de controle
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7/540 que regula sua expressão (em exemplo não limitante, o elemento de controle é um riboswitch que se liga a um análogo de nucleosídeo). Em algumas modalidades, a expressão do CAR também é regulada pelo elemento de controle. A parte (330) é SLAM e CD46. A parte (340) é CD3.
[14] As Figuras 3A a 3E mostram esquemas de construtos de vetor exemplificativos não limitantes para transfectar as células de empacotamento para produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação descritas no presente documento. A Figura A Figura 3A mostra um construto contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um domínio FRB fundido ao domínio ativador NFkB p65 (p65 AD) e domínio de ligação de DNA de ZFHD1 fundido a três repetições FKBP que é constitutivamente expresso. O construto na Figura 3A também inclui REV e Vpx de HIV 1 como uma fusão SrcFlagVpx sob o promotor de ZFHDl/p65 AD induzível por rapamicina. A Figura A Figura 3B mostra um construto contendo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de rtTA sob o controle do promotor de ZFHDl/p65 AD. A Figura A Figura 3C mostra um construto contendo um polinucleotídeo que codifica um gene de resistência à puromicina flanqueado por sítios loxP e a etiqueta MYC extracelular flanqueada por sítios lox2272. Ambos os marcadores selecionáveis estão sob o controle de um promotor BiTRE, que é flanqueado por sítios FRT. A Figura 3D mostra um construto que contém um polinucleotídeo que codifica RFP flanqueado por sítios loxP que está sob o controle de um promotor TRE e um único sítio FRT entre o promotor TRE e o sítio loxP 5' de RFP. A Figura 3E mostra um construto contendo um polinucleotídeo que codifica GFP flanqueado por sítios loxP que está sob o controle do promotor TRE e um único sítio FRT entre o promotor TRE e o sítio loxP 5' de GFP. Os construtos nas Figuras 3C a 3E funcionam como blocos de depósito para outras sequências de polinucleotídeos para inserção no genoma da linhagem de células de empacotamento.
[15] As Figuras 4A a 4C mostram esquemas de construtos de vetor exemplificativos não limitantes para transfectar as células de empacotamento para produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação descritas no presente documento. A Figura 4A mostra um construto contendo um polinucleotídeo tricistrônico que codifica scFvFc anti-CD3 (clone UCHT1) com um sítio de ligação de âncora de GPI de CD 14, domínio extracelular de CD80 (ECD) com a capacidade para se ligar a CD28 com um sítio de ligação de âncora de GPI de CD16B e IE-7 fundida ao fator de aceleração de decaimento (DAF) com sequências de
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8/540 transposons que flanqueiam a região de polinucleotídeo para integração ao genoma HEK293S. A Figura 4B mostra um construto contendo um polinucleotídeo com um promotor BiTRE e uma região de polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos gag e pol em uma direção e uma região de polinucleotídeo que codifica as proteínas FAx e HAy do vírus do sarampo na outra direção. A Figura 4C mostra um construto contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CAR e o elemento linfoproliferativo IL7Ra-insPPCL sob o controle de um promotor CD3Z que não é ativo em células HEK293S, em que o CAR e IL7Ra-insPPCL são separados por uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma sequência de salto de ribossoma T2A e o IL7RainsPPCL tem uma ribozima controlada por riboswitch de aciclovir. O construto contendo CAR inclui adicionalmente cPPT/CTS, uma sequência RRE e uma sequência de polinucleotídeos que codifica HIV-1 Psi (Ψ). A sequência de polinucleotídeos inteira no construto contendo CAR a ser integrado ao genoma é flanqueada por sítios FRT.
[16] As Figuras 5A a 5C mostram estruturas moleculares de aciclovir (Figura 5A), penciclovir (Figura 5B) e 2'-desoxiguanonsina (Figura 5C) como análogos de nucleosídeo representativos para controle de riboswitch seletivo.
[17] A Figura 6 representa a região reguladora de riboswitch de desoxiguanosina do tipo I-A de Mesoplasma florum e produto de gene associado. A sequência é o complemento reverso do DNA genômico de M. florum El (AE017263.1) nt624396 a nt625670 que é igual ao DNA genômico de M. florum W37 (CP006778.1) nt636277 a nt637550. A sequência de aptâmero de ligação à desoxiguanosina usada para triagem inicial é indicada em negrito e sublinhada. O produto de gene a jusante (Ribonucleotídeo redutase da classe Ib (aeróbica), subunidade beta) é indicado em letras maiúsculas.
[18] A Figura 7 representa as regiões de aptâmero de riboswitch de desoxiguanosina do tipo I-A de M. florum tidas como alvo para estratégia de evolução dirigida. Os nucleotídeos dentro de ovais vazios foram tidos como alvo para randomização. Os nucleotídeos dentro de ovais listrados foram tidos como alvo para inserção/deleção e randomização.
[19] As Figuras 8A e 8B representam a biblioteca de triagem de aptâmero de riboswitch de desoxiguanosina do tipo I-A de M. florum. Na Figura 8A, nucleotídeos dentro de caixas com linhas contínuas são regiões de sequência tidas como alvo para randomização e os nucleotídeos dentro de caixas com linhas tracejadas são regiões de sequência tidas como alvo para
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9/540 inserção/deleção e randomização. A Figura 8B mostra as sequências possíveis geradas através de mutação (nucleotídeos aleatórios (N)) e deleção/inserção.
[20] A Figura 9 representa a biblioteca de oligo de aptâmero de riboswitch de desoxiguanosina do tipo I-A de M. florum sintetizada como um complemento reverso com pares de bases adicionais adicionados para possibilitar a amplificação por PCR e adição de promotor T7 para transcrição in vitro para triagem de biblioteca. O iniciador de amplificação de promotor T7 e o iniciador de amplificação reverso correspondentes são também mostrados.
[21] A Figura 10 representa a região reguladora de riboswitch de xpt de guanosina de Bacillus subtilis e o produto de gene associado. A sequência é o complemento reverso do DNA genômico de B. subtilis subsp. subtilis 6051-HGW (CP003329.1) nt2319439 a nt2320353. A sequência de aptâmero de ligação à guanosina usada para triagem inicial é indicada em negrito e sublinhada. O produto de gene a jusante (xpt de Xantina fosforribosiltransferase xpt) é indicado em letras maiúsculas.
[22] A Figura 11 representa as regiões de aptâmero de riboswitch de xpt de guanosina de B. subtilis tidas como alvos para estratégia de evolução dirigida. Os nucleotídeos dentro de ovais vazios foram tidos como alvo para randomização. Os nucleotídeos dentro de ovais listrados foram tidos como alvo para inserção/deleção e randomização.
[23] As Figuras 12A e 12B representam a biblioteca de triagem de aptâmero de riboswitch de xpt de guanosina de B. subtilis. Na Figura 12A, nucleotídeos dentro de caixas com linhas contínuas são regiões de sequência tidas como alvo para randomização e os nucleotídeos dentro de caixas com linhas tracejadas são regiões de sequência tidas como alvo para inserção/deleção e randomização. A Figura 12B mostra as sequências possíveis geradas através de mutação (nucleotídeos aleatórios (N)) e deleção/inserção.
[24] A Figura 13 representa a biblioteca de oligo de aptâmero de riboswitch de xpt de guanosina B. subtilis sintetizada como um complemento reverso com pares de bases adicionais adicionados para possibilitar a amplificação por PCR e adição de promotor T7 para transcrição in vitro para triagem de biblioteca. O iniciador de amplificação de promotor T7 e o iniciador de amplificação reverso correspondentes são também mostrados.
[25] A Figura 14 mostra a construção da biblioteca de seleção. A biblioteca foi construída com base no RNA de ligação à guanosina e desoxiguanosina conhecido (Pikovskaya,
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2013).
[26] A Figura 15 mostra uma ilustração da seleção de aptâmero de óxido de grafeno (GrO). Na etapa (1), o RNA foi transcrito e purificado. Na etapa (2), o RNA purificado foi eluído. Na etapa (3), os aptâmeros foram incubados com contra-alvos e tampão. Na etapa (4), as sequências ligadas aos contra-alvos ou componentes de tampão foram removidas com óxido de grafeno. Na etapa (5), a centrifugação dividiu as espécies não especificamente responsivas dentro do sobrenadante, que é, então, descartado. Duas lavagens de 5 minutos adicionais removeram a maioria das sequências de ligação a tampão e ligação a contra-alvo residuais. Na etapa (6), uma solução de aciclovir em tampão de seleção IX foi adicionada à biblioteca ligada a GrO para seleção positiva de modo que as sequências de aptâmero potenciais dessorvam do GrO através da interação com o alvo positivo. Na etapa (7), uma etapa de centrifugação final separa as sequências de ligação a alvo no sobrenadante das sequências não responsivas ainda adsorvidas ao GrO. Na etapa (8), as sequências selecionadas foram transcritas de modo reverso, então, a biblioteca foi amplificada através de PCR, então, transcrita para gerar a biblioteca para o próximo ciclo de seleção.
[27] A Figura 16 mostra uma ilustração de avaliação paralela de óxido de grafeno. As bibliotecas enriquecidas que passam por avaliação paralela foram divididas em quatro porções iguais. As amostras de biblioteca foram, então, adicionadas a óxido de grafeno e deixadas em incubação para carregar a biblioteca no óxido de grafeno. Duas lavagens de 5 minutos foram usadas para remover material de não ligação. Para a amostra positiva (aciclovir) e alvo especial (penciclovir), cada alvo foi preparado separadamente em tampão de seleção IX a 1 μΜ; o contraalvo substituiu o alvo positivo por 10 μΜ de cada contra-alvo na solução; a amostra negativa substituiu o alvo positivo por um volume igual de água isentas de nuclease. As amostras foram, então, combinadas com suas respectivas preparações de óxido de grafeno e incubadas. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas para recuperar seus sobrenadantes, e a recuperação de biblioteca foi determinada por leitura de espectrofotômetro NanoDrop-1.000 (Thermo Fisher Scientific; Wilmington, DE). A amostra de biblioteca restante foi analisada em PAGE desnaturante. As imagens dos géis foram tiradas após coloração/descoloração com Gel-Star. As bandas que correspondem ao tamanho de biblioteca esperado foram recuperadas para um ciclo de acompanhamento da avaliação paralela, com o alvo positivo aciclovir substituindo contra-alvos
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11/540 para a incubação de pré-carregamento das amostras-alvo negativas, contrárias e especiais. O material recuperado da segunda avaliação paralela foi usado para sequenciamento e análise.
[28] A Figura 17 mostra sete candidatos de aptâmero contra aciclovir. A energia livre para cada aptâmero foi computada a 37 °C e Na+ 1 M por Quikfold 3.0 (Zuker 2003). As sequências foram identificadas com o uso de algoritmos proprietários. As regiões sublinhadas em cada sequência são as regiões de hibridização de iniciador de PCR.
[29] A Figura 18 mostra sete candidatos de aptâmero contra penciclovir. A energia livre para cada aptâmero foi computada a 37 °C e Na+ 1 M por Quikfold 3.0 (Zuker 2003). As sequências foram identificadas com o uso de algoritmos proprietários. As regiões sublinhadas em cada sequência são as regiões de hibridização de iniciador de PCR.
[30] A Figura 19A fornece um desenho esquemático de variantes de IL7Ra testadas quanto à atividade linfoproliferativa/de sobrevivência quando expressas em PBMCs. A Figura 19B fornece um gráfico de barras que mostra o percentual de viabilidade de PBMCs na presença e ausência de IL-2.
[31] A Figura 20 mostra um esquema do vetor de expressão lentiviral que codifica GFP, um receptor de antígeno quimérico anti-CD19 e um eTAG chamado, no presente documento, de Fl-0-03.
[ 32 ] A Figura 21A e a Figura 21B mostram um histograma da porcentagem (%) de células de CD3+GFP+ na população de CD3+ total e um histograma da contagem de célula absoluta por poço da população de CD3+GFP+, respectivamente, em 3, 6, 9, 13 e 17 dias após a transdução de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas do Doador 12M, por 14 h com as partículas lentivirais indicadas. Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas.
[33] A Figura 22A e a Figura 22B mostram um histograma de (%) de células de CD3+GFP+ na população de CD3+ total e um histograma da contagem de célula absoluta por poço da população de CD3+GFP+, respectivamente, em 3 e 6 dias após a transdução de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas do Doador 13F, por 14 h com as partículas lentivirais indicadas. Observa-se que “A” mostra resultados com o uso de partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G (experimentos triplicados); “B” mostra resultados com o uso de partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G com OKT3 Ab (1 ug/ml) adicionadas ao meio de transdução (experimentos duplicados); “C” mostra resultados com o uso de partículas lentivirais
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12/540 pseudotipadas com VSV-G expressando UCHTlscFvFc ancorado em GPI em sua superfície (experimentos triplicados); e “D” mostra resultados com o uso de partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G expressando UCHTlscFvFc ancorado em GPI e CD80 ancorado em GPI ou um fragmento extracelular funcional dos mesmos, em sua superfície (experimentos duplicados). Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas ou triplicatas, como indicado na Figura 22A.
[34] A Figura 23A e a Figura 23B mostram um histograma de porcentagem (%) de células de CD3+GFP+ na população de CD3+ total e um histograma da contagem de célula absoluta por poço da população de CD3+GFP+, respectivamente, em 3, 6 e 9 dias após a transdução de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas do Doador 12M pelo tempo indicado de exposição (2 a 20 h), com as partículas lentivirais indicadas. A transdução foi realizada em uma placa ou um frasco de agitador como indicado. Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas para partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G (“[VSV-G]”); os outros experimentos não tiveram réplicas.
[35] A Figura 24A é um esquema da cadeia principal de vetor lentiviral F1-0-02 incluindo um cassete de expressão transgene que aciona a expressão de GFP e eTag e um promotor EF-lalfa sintético e intron A a montante do GFP. A Figura 24B mostra a inserção dos miRNAs em intron A de EFlalfa da cadeia principal de Fl-0-02. “1” representa a sobreposição EFlalfa; “2” representa o braço 5'; “3” representa a haste 5' de miRNAl; “4” representa um laço; “5” representa a haste 3' de miRNAl; “6” representa um braço 3'; “7” representa um aglutinante; “8” representa a haste 5' de miRNA2; “9” representa a haste 3' de miRNA2; “10” representa a haste 5' de miRNA3; “11” representa a haste 3' de miRNA3; “12” representa a haste 5' de miRNA4; e “13” representa a haste 3' de miRNA4.
[36] A Figura 25 é um gráfico que mostra que os miRNAs que alvejam CD3zeta que estão no íntron de promotor EF-lalfa são capazes de realizar knockdown da expressão do complexo de CD3.
[37] A Figura 26 é um histograma que mostra o AACt de amostras transduzidas com miR-TCRa contendo partículas lentivirais incompetentes em replicação. Os valores de AACt são representativos da quantidade de miRNA de miR-TCRa processado em cada amostra transduzida em relação ao controle não transduzido.
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13/540 [38] As Figuras 27A a 27C são gráficos que mostram a lise específica por cento de células-alvo de CHO 1 com e sem tratamento com um agente farmacológico de modulação de pH. Na Figura 27A, as células-alvo de CHO 1 estavam inicialmente em pH 6,7 e poços experimentais (linha sólida) e células de controle (linha tracejada) foram tratadas com ou sem NaHCOs, respectivamente, no tempo indicado pela seta. Na Figura 27B, as células-alvo de CHO 1 estavam inicialmente em pH 6,7 e poços experimentais (linha sólida) e células de controle (linha tracejada) foram tratadas com ou sem NaOH, respectivamente, no tempo indicado pela seta. Na Figura 27C, as células-alvo de CHO 1 estavam inicialmente em pH 7,4 e poços experimentais (linha sólida) e células de controle (linha tracejada) foram tratados com ou sem HC1, respectivamente.
[39] A Figura 28 é um gráfico que mostra o fluxo de calor versus o tempo para F1A795 na ausência (círculos) ou presença (quadrados) de aciclovir como medido por DSC.
[40] A Figura 29 é um gráfico que mostra a porcentagem de RFU da sonda ProSense FAST em camundongos com tumor de xenoenxerto-CHO antes e após a administração de PBS ou bicarbonate.
[41] A Figura 30 é um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificativo não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos que codificam um CAR e um elemento linfoproliferativo quimérico (CLE) candidato das Bibliotecas IA, 1.1 A, e 1.1B.
[42] A Figura 31 é um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificativo não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CLE candidato das Bibliotecas 2B e 2.1B.
[43] A Figura 32 é um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificativo não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CAR e um CLE candidato das Bibliotecas 3A, 3B, 3.1 A e 3.1B.
[44] A Figura 33 é um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificativo não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CLE candidato das Bibliotecas 4B e 4.1 B.
[45] A Figura 34 mostra um histograma da porcentagem (%) de células de CD3+GFP+ na População de CD3+ viva da Figura 34A, e um histograma da contagem de célula absoluta por ul da população viva total de 34B, respectivamente, no dia 3 pós-transdução de PBMCs recém-
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14/540 isoladas e não estimuladas do Doador 18, com as partículas lentivirais indicadas. Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas.
[46] A Figura 35 é um gráfico que mostra a expansão multiplicada de PBMCs transduzidas com partículas lentivirais que codificam os CLEs individuais e cultivados por 35 dias na ausência de citocinas exógenas.
[47] A Figura 36 é um gráfico que mostra a expansão multiplicada de PBMCs transduzidas com partículas lentivirais que codificam um construto de CAR anti-CD 19 e CLEs individuais e cultivadas por 35 dias na presença de PBMCs correspondentes ao doador, porém, na ausência de citocinas exógenas.
[48] A Figura 37 é um gráfico que mostra a eficácia pela qual a partícula lentiviral indicada transduziu as PBMCs em repouso em 4 horas. A eficácia de transdução foi medida como a % de PBMCs de CAR+ após 6 dias em cultura na ausência de citocinas exógenas como determinado por FACS. Cada partícula lentiviral codificou um CAR e um CLE. As partículas lentivirais transduzidas com F1-1-228U e F1-3-219U exibiram UCHTlscFvFc-GPI em sua superfície.
[49] A Figura 38A e a Figura 38B são gráficos que mostram um decorrer do tempo do número total de células viáveis após as PBMCs em repouso serem transduzidas com a partícula lentiviral indicada por 4 horas e cultivadas in vitro na ausência de citocinas exógenas por 6 dias. Cada partícula lentiviral codificou um CAR e um CLE. As partículas lentivirais transduzidas com F1-1-228U e F1-3-219U exibiram UCHTlscFvFc-GPI em sua superfície.
[50] As Figuras 39A, 39B e 39C são gráficos que mostram um decorrer do tempo das cópias de genoma lentiviral por pg de DNA genômico do sangue de camundongos NSG portadores de tumor dosados com PBMCs humanas transduzidas com a partícula lentiviral indicada por 4 horas e injetados de modo intravenoso sem que as PBMCs tenham sido expandidas ex vivo. Cada partícula lentiviral codificou um CAR. Fl-1-228, F1-1-228U, Fl-3-219 e Fl-3219U também codificaram um CLE. As partículas lentivirais transduzidas com F1-1-228U e Fl3-219U exibiram UCHTlscFvFc-GPI em sua superfície.
[51] A Figura 40 é um gráfico que mostra o número de células CAR+ por 200 pl de sangue de camundongos NSG portadores de tumor dosados com PBMCs humanas transduzidas com a partícula lentiviral indicada por 4 horas e injetados de modo intravenoso sem que as PBMCs
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15/540 tenham sido expandidas ex vivo. O sangue foi amostrado no momento que os camundongos foram submetidos à eutanásia. Cada partícula lentiviral codificou um CAR. Fl-1-228, F1-1-228U, Fl3-219 e F1-3-219U também codificaram um CLE. As partículas lentivirais transduzidas com Fl1-228U e F1-3-219U exibiram UCHTlscFvFc-GPI em sua superfície.
[ 52 ] A Figura 41A é um gráfico que mostra o volume de tumor médio de tumores CHO-ROR2 em camundongos NSG dosados de modo intravenoso com PBS ou PBMCs humanas transduzidas com a partícula lentiviral indicada codificando um CAR de MRB anti-ROR2 e um CLE por 4 horas sem que as PBMCs tenham sido expandidas ex vivo. 41B é um gráfico que mostra o volume de tumor médio de tumores Raji em camundongos NSG dosados de modo intravenoso com PBS ou PBMCs humanas transduzidas com a partícula lentiviral indicada codificando um CAR anti-CD19 e um CLE por 4 horas sem que as PBMCs tenham sido expandidas ex vivo. As partículas lentivirais transduzidas com F1-1-228U e F1-3-219U exibiram UCHTlscFvFc-GPI em sua superfície.
Definições [53] Conforme usado no presente documento, o termo receptor de antígeno quimérico ou CAR ou CARs refere-se a receptores geneticamente modificados que enxertam uma especificidade de antígeno em células, por exemplo, células T, células NK, macrófagos e células-tronco. Os CARs da invenção incluem pelo menos uma região de alvejamento específica para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar (TM) e um domínio de ativação intracelular (IAD) e podem incluir uma haste e um ou mais domínios coestimuladores (CSDs). Em uma outra modalidade, o CAR é um CAR biespecífico, que é específico para dois antígenos ou epítopos diferentes. Depois que o ASTR se liga especificamente a um antígeno alvo, o IAD ativa a sinalização intracelular. Por exemplo, o IAD pode redirecionar a especificidade e a reatividade das células T para um alvo selecionado de uma maneira não restrita pelo MHC, explorando as propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos. O reconhecimento do antígeno não restrito pelo MHC fornece às células T que expressam o CAR a capacidade de reconhecer um antígeno independente do processamento do antígeno, evitando assim um mecanismo principal de escape do tumor. Além disso, quando expressas em células T, os CARs não dimerizam vantajosamente com cadeias alfa e beta de receptor de célula T endógeno (TCR).
[54] Conforme usado no presente documento, o termo microambiente significa
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16/540 qualquer porção ou região de um tecido ou corpo que tem diferenças físicas ou químicas constantes ou temporais de outras regiões do tecido ou regiões do corpo. Por exemplo, um “microambiente tumoral” como usado aqui se refere ao ambiente no qual existe um tumor, que é a área não celular dentro do tumor e a área diretamente fora do tecido tumoral, mas não pertence ao compartimento intracelular da própria célula cancerosa. O microambiente de tumor pode se referir a toda e qualquer condição do meio do tumor incluindo as condições que criam um ambiente estrutural e/ou funcional para o processo maligno sobreviver e/ou expandir e/ou espalhar. Por exemplo, o microambiente de tumor pode incluir alterações em condições tais como, porém sem limitação, pressão, temperatura, pH, força iônica, pressão osmótica, osmolalidade, estresse oxidativo, concentração de um ou mais solutos, concentração de eletrólitos, concentração de glicose, concentração de hialuronano, concentração de ácido láctico ou lactato, concentração de albumina, níveis de adenosina, níveis de R-2-hidroxiglutarato, concentração de piruvato, concentração de oxigênio e/ou presença de oxidantes, redutores ou cofatores, assim como outras condições que uma pessoa versada na técnica entenderá.
[55] Conforme usado de forma intercambiável no presente documento, os termos polinucleotídeo e ácido nucleico referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ou ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, esse termo inclui, entre outros, DNA ou RNA de cadeia simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNAc, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina ou outras bases naturais, químicas ou bases nucleotídicas modificadas bioquimicamente, não naturais ou derivatizadas.
[56] Conforme usado no presente documento, o termo anticorpo inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos que retêm ligação específica a antígeno. Os fragmentos de anticorpo podem ser, porém sem limitação, fragmentos de ligação a antígeno de fragmento (Fab), fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos Fab'-SH, fragmentos (Fab')2 Fv, fragmentos Fd, fragmentos de IgG recombinante (rlgG), fragmentos de anticorpo de cadeia única, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), scFv's divalentes, scFv's trivalentes e fragmentos de anticorpo de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo). O termo inclui formas geneticamente modificadas e/ou modificadas de outro modo de imunoglobulinas, tais como intracorpos, pepticorpos,
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17/540 anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, anticorpos completamente humanos, anticorpos humanizados, proteínas de fusão incluindo uma região de alvejamento específica para antígeno de um anticorpo e uma proteína de não anticorpo, anticorpos heteroconjugados, anticorpos multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, diacorpos, triacorpos e tetracorpos, discFv's em tandem e tri-scFv's em tandem. A não ser que especificado de outro modo, o termo “anticorpo” deve ser entendido como incluindo fragmentos de anticorpo funcionais do mesmo. O termo também inclui anticorpos intactos ou de comprimento completo, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e subclasses da mesma, IgM, IgE, IgA e IgD.
[57] Conforme usado no presente documento, o termo fragmento de anticorpo inclui uma porção de um anticorpo intacto, por exemplo, a ligação de antígeno ou região variável de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab’, F(ab’)2 e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057 a 1062 (1995)); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um único local de ligação ao antígeno, e um fragmento residual “Fe”, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação com o antígeno e tem ainda a capacidade de reticular o antígeno.
[58] [0236] Conforme usado de forma intercambiável no presente documento, os termos fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única”, “scFv” ou “sFv” incluem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeos única. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fv inclui ainda um ligante ou espaçador polipeptídico entre os domínios VH e VL, o que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma análise de sFv, consulte Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, edições de Rosenburg e Moore, Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 269 a 315 (1994).
[59] Conforme usado no presente documento, domínios VH e VL de ocorrência natural referem-se aos domínios VH e VL que foram isolados de um hospedeiro sem evolução molecular adicional para alterar suas afinidades quando gerados em um formato scFv sob condições específicas tais como aquelas reveladas na patente no US 8709755 B2 e no pedido
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WO/2016/033331A1.
[60] Como usado aqui, o termo “afinidade” se refere à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes e é expresso como uma constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser pelo menos 1 vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior , pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, ou pelo menos 1.000 vezes maior, ou mais, do que a afinidade de um anticorpo para sequências de aminoácidos não relacionadas. A afinidade de um anticorpo para uma proteína alvo pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nanomolar (nM) a cerca de 0,1 nM, de cerca de 100 nM a cerca de 1 picomolar (pM), ou de cerca de 100 nM a cerca de 1 femtomolar (fM) ou mais. Como aqui utilizado, o termo “avidez” se refere à resistência de um complexo de dois ou mais agentes à dissociação após a diluição. Os termos “imunorreativo” e “liga-se preferencialmente” são aqui usados indistintamente em relação a anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno.
[61] Como usado no presente documento, o termo “ligação” se refere a uma associação direta entre duas moléculas, devido, por exemplo, a interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas e iônicas e/ou ligações de hidrogênio, incluindo interações como pontes salinas e pontes de água. A ligação não específica se refere à ligação com uma afinidade inferior a cerca de 107 M, por exemplo, ligação com uma afinidade de 10 6 M, 105 M, 10 4 M, etc.
[62] Conforme usado no presente documento, a referência a um sistema de expressão de superfície celular ou sistema de apresentação em superfície celular refere-se à apresentação ou expressão de uma proteína ou porção da mesma na superfície de uma célula. Tipicamente, uma célula é gerada que expressa proteínas de interesse fundidas a uma proteína de superfície celular. Por exemplo, uma proteína é expressa como uma proteína de fusão com um domínio transmembranar.
[63] Conforme usado no presente documento, o termo elemento inclui polipeptídeos, incluindo fusões de polipeptídeos, regiões de polipeptídeos e mutantes ou
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19/540 fragmentos funcionais dos mesmos e polinucleotídeos, incluindo microRNAs e shRNAs e mutantes ou fragmentos funcionais dos mesmos.
[ 64 ] Conforme usado no presente documento, o termo região é qualquer segmento de um polipeptídeo ou polinucleotídeo.
[65] Conforme usado no presente documento, um domínio é uma região de um polipeptídeo ou polinucleotídeo com uma propriedade funcional e/ou estrutural.
[66] Conforme usado no presente documento, os termos haste ou domínio de haste referem-se a uma região conectora de polipeptídeo flexível que fornece flexibilidade estrutural e espaçamento a regiões de polipeptídeo de flanqueamento e podem consistir em polipeptídeos naturais ou sintéticos. Uma haste pode ser derivada de uma dobradiça ou região de dobradiça de uma imunoglobulina (por exemplo, IgGl) que é geralmente definida como se estendendo de Glu216 a Pro230 da IgGl humana (Burton (1985) Molec. Immunol., 22:161 a 206). As regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgGl colocando os primeiros e últimos resíduos de cisteína formando ligações de dissulfureto inter cadeias pesadas (S-S) nas mesmas posições. A haste pode ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, incluindo, porém sem limitação, uma região de dobradiça alterada, conforme revelado na patente n° U.S. 5.677.425. A haste pode incluir uma região de dobradiça completa derivada de um anticorpo de qualquer classe ou subclasse. A haste pode também incluir regiões derivadas de CD8, CD28 ou outros receptores que fornecem uma função similar no fornecimento de flexibilidade e espaçamento a regiões de flanqueamento.
[67] Conforme usado no presente documento, o termo isolado significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se o mesmo for de ocorrência natural). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos poderíam ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderíam ser parte de uma composição e ainda poderíam ser isolados de modo que tal vetor ou composição não seja parte de seu ambiente natural.
[68] Conforme usado no presente documento, um “polipeptídeo” é uma cadeia única de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Um polipeptídeo não enovela em uma
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20/540 estrutura fixa nem tem qualquer modificação pós-translacional. Uma “proteína” é um polipeptídeo que enovela em uma estrutura fixa. “Polipeptídeos” e “proteínas” são usados de forma intercambiável no presente documento.
[69] Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo pode ser “purificado” para remover os componentes contaminantes de um ambiente natural do polipeptídeo, por exemplo, materiais que interferiríam com usos diagnósticos ou terapêuticos para o polipeptídeo, tais como, por exemplo, enzimas, hormônios e outros solutos proteáceos ou não proteáceos. Um polipeptídeo pode ser purificado (1) até mais de 90%, mais de 95% ou mais de 98% em peso do anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry, por exemplo, mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna com o uso de um sequenciador de copo giratório ou (3) até homogeneidade por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições de redução ou não redução com o uso de mancha prata ou azul Coomassie.
[70] Conforme usado no presente documento, o termo células imunológicas geralmente inclui eritrócitos (leucócitos) que são derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSC) produzidas na medula óssea. Células imunes incluem, por exemplo, linfócitos (células T, células B, células exterminadoras naturais (NK)) e células derivadas de mieloide (neutrófilo, eosinófilo, basófilo, monócito, macrófago, células dendríticas).
[71] Conforme usado no presente documento, célula T inclui todos os tipos de células imunes que expressam CD3 incluindo células auxiliares T (células CD4+), células T citotóxicas (células CD8+), células reguladoras T (Treg) e células T gama-delta.
[72] Conforme usado no presente documento, uma célula citotóxica inclui células T CD8+, células exterminadoras naturais (NK), células NK-T, células γδ T, uma subpopulação de células CD4+ e neutrófilos que são células com a capacidade para mediar respostas de citotoxicidade.
[73] Como usado no presente documento, o termo “célula-tronco” geralmente inclui células-tronco pluripotentes ou multipotentes. “Células-tronco” inclui, por exemplo, célulastronco embrionárias (ES); células-tronco mesenquimatosas (MSC); células-tronco pluripotentes induzidas (iPS); e células progenitoras comprometidas (células-tronco hematopoiéticas (HSC); células derivadas da medula óssea, etc.).
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21/540 [74] Como aqui usado, os termos “tratamento”, “tratar” e similares, se referem à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou sintoma do mesmo e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento”, como aqui usado, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um ser humano, e inclui: (a) impedir que a doença ocorra em um indivíduo que possa estar predisposto à doença, mas ainda não tenha sido diagnosticado como portador da doença; (b) inibir a doença, isto é, parar o seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença.
[75] Conforme usado de forma intercambiável no presente documento, os termos indivíduo, sujeito, hospedeiro e paciente referem-se a um mamífero, incluindo, porém sem limitação, seres humanos, murinos (por exemplo, ratos, camundongos), lagomorfos (por exemplo, coelhos), primatas não humanos, seres humanos, caninas, felinas, ungulados (por exemplo, equinos, bovinos, ovinos, porcinos, caprinos), etc.
[76] Conforme usado no presente documento, os termos quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade eficiente se refere à quantidade de um agente ou quantidades combinadas de dois agentes, que, quando administrados a um mamífero ou outro sujeito para tratar uma doença, é suficiente para afetar tal tratamento para a doença. A “quantidade terapeuticamente eficaz” irá variar dependendo do agente (ou agentes), da doença e da sua gravidade e da idade, peso, etc., do indivíduo a ser tratado.
[77] Como usado aqui, o termo “evolução” ou “evoluir”, se refere ao uso de um ou mais métodos de mutagênese para gerar um polinucleotídeo diferente que codifica um polipeptídeo diferente, que é o próprio uma molécula biológica melhorada e/ou contribui para a geração de outra molécula biológica melhorada. Condições fisiológicas ou normais ou fisiológicas normais são condições tais como, porém sem limitação, pressão, temperatura, pH, força iônica, pressão osmótica, osmolalidade, estresse oxidativo, concentração de um ou mais solutos, concentração de eletrólitos, concentração de glicose, concentração de hialuronano, concentração de ácido láctico ou lactato, concentração de albumina, níveis de adenosina, níveis de R-2-hidroxiglutarato, concentração de piruvato, concentração de oxigênio e/ou presença de oxidantes, redutores ou cofatores, assim como outras condições, que serem consideradas dentro
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22/540 de uma faixa normal no sítio de administração, ou no tecido ou órgão no sítio de ação, a um sujeito.
[78] Conforme usado no presente documento, uma “célula geneticamente modificada” inclui células que contêm ácidos nucleicos exógenos se os ácidos nucleicos exógenos forem integrados ao genoma da célula ou não.
[79] Um “polipeptídeo”, conforme usado no presente documento pode incluir parte de ou uma molécula de proteína inteira assim como quaisquer modificações pós-traducionais ou outras.
[80] Um elemento de pseudotipagem, conforme usado no presente documento, pode incluir um polipeptídeo de ligação que inclui um ou mais polipeptídeos, tipicamente glicoproteínas, que identificam e se ligam à célula-alvo hospedeira, e um ou mais polipeptídeos fusogênicos que mediam a fusão das membranas de célula-alvo hospedeira e retroviral, possibilitando, assim, que um genoma retroviral entre na célula-alvo hospedeira. O “polipeptídeo de ligação”, conforme usado no presente documento, pode também denominado um “polipeptídeo de ligação à célula T e/ou célula NK” ou um “elemento de interconexão de alvo”, e o “polipeptídeo fiisogênico” pode também ser denominado um “elemento fiisogênico”.
[81] Um linfócito “em repouso”, tal como, por exemplo, uma célula T em repouso, é um linfócito no estágio GO do ciclo celular que não expressa marcados de ativação, tal como Ki67. Os linfócitos em repouso podem incluir células T virgens que nunca encontraram antígeno específico e células T de memória que foram alteradas por um encontro anterior com um antígeno. Um linfócito “em repouso” pode também ser denominado um linfócito “quiescente”.
[82] Conforme usado no presente documento, “linfodepleção” envolve métodos que reduzem o número de linfócitos em um sujeito, por exemplo, pela administração de um agente de linfodepleção. A linfodepleção pode também ser alcançada por radioterapia fracionada de corpo inteiro ou corpo parcial. Um agente de linfodepleção pode ser um composto ou composição química com a capacidade para diminuir o número de linfócitos funcionais em um mamífero quando administrada ao mamífero. Um exemplo de tal agente é um ou mais agentes quimioterápicos. Tais agentes e dosagens são conhecidos e podem ser selecionados por um médico responsável pelo tratamento dependendo do sujeito a ser tratado. Os exemplos de agentes de linfodepleção incluem, porém sem limitação, fludarabina, ciclofosfamida, cladribina,
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23/540 denileucina diftitox ou combinações dos mesmos.
[83] A interferência de RNA (RNAi) é um processo biológico em que moléculas de RNA inibem a expressão de gene ou a tradução através da neutralização de moléculas de RNA alvejadas. O alvo de RNA pode ser mRNA ou pode ser qualquer outro RNA suscetível à inibição funcional por RNAi. Como usado no presente documento, uma “molécula de RNA inibidora” se refere a uma molécula de RNA cuja presença dentro de uma célula resulta em RNAi e leva à expressão reduzida de uma transcrição à qual a molécula de RNA inibidora é alvejada. Uma molécula de RNA inibidora como usado no presente documento tem uma haste 5 ’ e uma haste 3 ’ que é capaz de formar um dúplex de RNA. A molécula de RNA inibidora pode ser, por exemplo, um miRNA (endógeno ou artificial) ou um shRNA, um precursor de um miRNA (isto é, um PrimiRNA ou Pre-miRNA) ou shRNA ou um dsRNA que é transcrito ou introduzido diretamente como um ácido nucleico isolado, a uma célula ou sujeito.
[84] Como usado no presente documento, “RNA de fita dupla” ou “dsRNA” ou “dúplex de RNA” se refere a moléculas de RNA que são compreendidas de duas fitas. As moléculas de fita dupla incluem aquelas compreendidas de duas fitas de RNA que se hibridizam para formar a estrutura de RNA de dúplex ou uma fita simples de RNA que se dobra sobre si mesma para formar uma estrutura de dúplex. A maior parte, mas não necessariamente todas as bases nas regiões de dúplex são emparelhadas com base. A região de dúplex compreende uma sequência complementar a um RNA-alvo. A sequência complementar a um RNA-alvo é uma sequência antissenso, e tem frequentemente de 18 a 29, de 19 a 29, de 19 a 21 ou de 25 a 28 nucleotídeos de comprimento ou, em algumas modalidades, entre 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 na extremidade baixa e 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 29 ou 30 na extremidade alta, em que uma dada faixa sempre tem uma extremidade baixa mais baixa do que uma extremidade alta. Tais estruturas tipicamente incluem uma haste 5’, um laço e uma haste 3’ conectada por um laço que é contíguo a cada haste e que não é parte do dúplex. O laço compreende, em certas modalidades, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos. Em outras modalidades o laço compreende de 2 a 40, de 3 a 40, de 3 a 21 ou de 19 a 21 nucleotídeos ou, em algumas modalidades, entre 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 na extremidade baixa e 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 ou 40 na extremidade alta, em que uma dada faixa sempre tem uma extremidade baixa do que uma extremidade alta.
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24/540 [85] O termo “sequência de flanqueamento de microRNA” como usado no presente documento se refere às sequências de nucleotídeos incluindo elementos de processamento de microRNA. Os elementos de processamento de MicroRNA são as sequências de ácido nucleico mínimas que contribuem para a produção de microRNA maduro do microRNA precursor. Frequentemente esses elementos são localizados dentro de uma sequência de 40 nucleotídeos que flanqueia uma estrutura tipo haste-laço de microRNA. Em algumas ocorrências, os elementos de processamento de microRNA são encontrados dentro de um trecho de sequências de nucleotídeos entre 5 e 4.000 nucleotídeos de comprimento que flanqueiam uma estrutura tipo haste-laço de microRNA.
[86] O termo “aglutinante”, quando usado em referência a uma molécula de RNA inibidora de multiplex se refere a um meio de conexão que une duas moléculas inibidoras de RNA.
[87] Como usado no presente documento, um “retrovirus recombinante” se refere a um retrovirus não replicável ou “incompetente em replicação”, exceto se for explicitamente observado como um retrovirus replicável. Os termos “retrovirus recombinante” e “partícula retroviral recombinante” são usados de modo intercambiável no presente documento. Tal partícula retroviral/retrovírus pode ser qualquer tipo de partícula retroviral incluindo, por exemplo, retrovirus gama e, em modalidades ilustrativas, lentivírus. Como se sabe, tais partículas retrovirais, por exemplo, partículas lentivirais, são tipicamente formadas em células de empacotamento através da transfecção das células de empacotamento com plasmídeos que incluem componentes de empacotamento como Gag, Pol e Rev, um plasmídeo de envelope ou pseudotipagem que codifica um elemento de pseudotipagem e um vetor de expressão de transferência, genômico ou retroviral (por exemplo lentiviral), que é tipicamente um plasmídeo em que um gene (ou genes) ou outra sequência de codificação de interesse é codificada. Consequentemente, um vetor de expressão retroviral (por exemplo, lentiviral) inclui sequências (por exemplo, uma 5’ LTR e uma 3’ LTR que flanqueiam, por exemplo, um elemento de empacotamento de psi e uma sequência de codificação heteróloga-alvo) que promovem a expressão e o empacotamento após a transfecção em uma célula. Os termos “lentivírus” e “partícula lentiviral” são usados de modo intercambiável no presente documento.
[88] Um “framework” de um miRNA consiste em “sequência de flanqueamento de
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25/540 microRNA 5”’ e/ou “sequência de flanqueamento de microRNA 3”’ que circunda um miRNA e, em alguns casos, uma sequência de laço que separa as hastes de uma estrutura tipo haste-laço em um miRNA. Em alguns exemplos, o “framework” é derivado de miRNAs de ocorrência natural, como, por exemplo, miR-155. Os termos “sequência de flanqueamento de microRNA 5”’ e “braço 5”’ são usados de modo intercambiável no presente documento. Os termos “sequência de flanqueamento de microRNA 3”’ e “braço 3”’ são usados de modo intercambiável no presente documento.
[89] Como usado no presente documento, o termo “miRNA precursor” se refere a uma molécula de RNA de qualquer comprimento que pode ser enzimaticamente processada em um miRNA, como uma transcrição de RNA primária, um pri-miRNA, ou um pre-miRNA.
[90] Será entendido que a presente revelação e os aspectos e modalidades aqui fornecidas não estão limitadas a exemplos particulares revelados, que podem, evidentemente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de revelar exemplos particulares e apenas modalidades, e não pretende ser limitativa, uma vez que o âmbito da presente revelação será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[91] Quando um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor interveniente, para o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente esse intervalo declarado, é abrangido pela revelação. Os limites superior e inferior desses intervalos mais pequenos podem, independentemente, ser incluídos nos intervalos mais pequenos e estão também abrangidos no âmbito do invento, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Onde o intervalo declarado incluir um ou ambos os limites, os intervalos excluindo qualquer um ou ambos os limites incluídos estão também incluídos na invenção. Quando são dados múltiplos valores baixos e múltiplos valores altos para faixas que se sobrepõem, um técnico versado irá reconhecer que uma faixa selecionada irá incluir um valor baixo que é menor que o valor alto. Todos os cabeçalhos no presente relatório descritivo são para conveniência do leitor e não são limitantes.
[ 92 ] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer
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26/540 métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos também possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para revelar e descrever os métodos e/ou materiais em relação aos quais as publicações são citadas.
[ 93 ] Deve ser notado que, como aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um receptor de antígeno quimérico” inclui uma pluralidade de tais receptores de antígeno quiméricos e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante. Note-se ainda que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como “somente”, “apenas” e similares em conjunto com a recitação de elementos de reivindicação, ou uso de uma limitação “negativa”.
[94] Entende-se que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada. Todas as combinações das modalidades referentes à invenção são especificamente abrangidas pela presente invenção e são reveladas aqui como se cada uma das combinações fosse divulgada individual e explicitamente. Além disso, todas as subcombinações das várias modalidades e seus elementos são também especificamente abrangidas pela presente invenção e são aqui reveladas como se cada uma e todas as subcombinações fossem aqui reveladas individual e explicitamente.
Descrição detalhada [95] A presente revelação supera os desafios da técnica anterior através do fornecimento de métodos e composições aprimorados para modificar geneticamente os linfócitos, por exemplo, células NK e em modalidades ilustrativas, células T. Por exemplo, alguns desses métodos não incluem ativação anterior do linfócito e alguns desses métodos são realizados em menos tempo do que os métodos anteriores. Ademais, as composições que têm muitos usos, incluindo seu uso nesses métodos aprimorados, são fornecidas. Algumas dessas composições são linfócitos geneticamente modificados que têm qualidades de sobrevivência e proliferativas
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27/540 aprimoradas, incluindo em cultura in vitro, por exemplo, na ausência de fatores de crescimento. Tais linfócitos geneticamente modificados terão utilidade, por exemplo, como ferramentas de busca para mais bem entender os fatores que influenciam a proliferação e sobrevivência de célula T, e para produção comercial, por exemplo, para a produção de certos fatores, como fatores de crescimento e agentes imunomodulatórios, que podem ser coletados e testados ou usados em produtos comerciais.
[96] Algumas modalidades fornecidas no presente documento são métodos para realizar a terapia celular adotiva que inclui transduzir células T e/ou células NK, que exige bem menos tempo ex vivo, por exemplo, 24, 12 ou 8 horas ou menos e, em algumas modalidades, sem estímulo ex vivo anterior. Esses métodos são bem adequados para processamento ex vivo de sistema fechado de sangue de um sujeito, e podem ser realizados com o sujeito presente no mesmo ambiente que e/ou, em algumas modalidades, na linha de visão de seu sangue ou células sanguíneas isoladas do mesmo, a tomo momento, durante a realização do método. Mais especificamente, os aspectos e modalidades da revelação no presente documento superam problemas associados a terapias celulares adotivas atuais através do fornecimento de métodos para transduzir células T em repouso e/ou células NK em repouso que tipicamente utilizam um elemento de pseudotipagem que facilita a ligação e a fusão de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação a uma célula T em repouso e/ou uma célula NK em repouso, para facilitar a modificação genética das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Ademais, os métodos fornecidos no presente documento superam problemas da técnica através da utilização nas modalidades ilustrativas, um receptor de antígeno quimérico e um ou mais elementos linfoproliferativos cuja expressão é sob o controle de um elemento de controle, de modo que a exposição do sujeito a um composto que se liga ao elemento de controle, ou terminação de tal exposição, promova a expansão das células T e/ou células NK geneticamente modificadas in vivo.
[97] Como um resultado desses e de outros aprimoramentos revelados em detalhes no presente documento, em um aspecto fornecido no presente documento é um método para modificar geneticamente as células T em repouso e/ou células NK em repouso de um sujeito, como um paciente que tem uma doença ou transtorno, em que o sangue do sujeito é coletado; as células T e/ou células NK em repouso são geneticamente modificadas através do contato das
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28/540 mesmas com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação; e as células geneticamente modificadas são reintroduzidas no sujeito tipicamente dentro de um período de tempo mais curto do que os métodos anteriores, por exemplo, dentro de 24 horas e em algumas modalidades não limitantes, dentro de 12 horas e/ou sem expandir adicionalmente a população de células T e/ou células NK geneticamente modificadas ex vivo, por exemplo, de modo que as células T geneticamente modificadas e/ou células NK em repouso não sejam submetidas a mais de 4 divisões de célula ex vivo. Assim, os métodos fornecidos no presente documento podem ser realizados em muito menos tempo do que as terapias de CAR atuais, fornecendo, assim, processos através dos quais um sujeito pode permanecer em uma clínica por todo o tempo das etapas ex vivo. Isso facilita o desempenho das etapas ex vivo em um sistema fechado, o que reduz as chances de contaminação e mistura de amostras de paciente e pode ser realizado mais prontamente por laboratórios clínicos.
[98] Consequentemente, as Figuras 1 e 2 fornecem diagramas esquemáticos de composições ilustrativas usadas em métodos fornecidos no presente documento. A Figura 1 fornece um diagrama de uma célula de empacotamento (100) e uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação produzida por tal célula de empacotamento (200). A célula de empacotamento (100) inclui polinucleotídeos recombinantes (110) incorporados em seu genoma que incluem elementos transcricionais recombinantes que expressam proteínas retrovirais e vários polipeptídeos ligados a membrana diferentes sob o controle de promotores induzíveis que são regulados por transativadores, que se ligam e são ativados por ligantes. Esses transativadores, promotores induzíveis e ligantes são usados para induzir a expressão sequencial e acúmulo de polipeptídeos ligados à membrana celular que irão se tornar incorporados na membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação assim como componentes retrovirais necessários para o empacotamento e a montagem das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação.
[99] Como um resultado da expressão induzida sequencial dos vários polinucleotídeos como discutido em detalhes no presente documento abaixo, a célula de empacotamento ilustrativa (100) ilustrada na Figura 1 é produzida e pode ser usada em métodos ilustrativos para produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação usados em métodos de transfectar células T e/ou células NK em repouso ((300) na Figura 2) fornecidos no presente
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29/540 documento. A célula de empacotamento (100), nas modalidades não limitantes ilustrativas, inclui, em seu genoma, ácidos nucleicos que codificam um genoma de RNA retroviral empacotável que inclui pelo menos alguns dos elementos de um genoma retroviral necessários para o empacotamento e a montagem de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (como exemplos ilustrativos não limitantes, um elemento de psi retroviral, um polipeptídeo gag retroviral e um polipeptídeo pol retro viral).
[10 0] Alguns polipeptídeos ligados à membrana incorporados ou associados à célula membrana da célula de empacotamento irão se tornar incorporados ou associados nas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, porém, não são codificados pelo genoma retroviral. Por exemplo, a célula de empacotamento e partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação formadas da mesma podem incluir um polipeptídeo Vpx retroviral (250), que nos exemplos ilustrativos não limitantes podem ser expressados como uma proteína de fusão associada à membrana, por exemplo, um polipeptídeo Src-Flag-Vpx; um elemento de pseudotipagem que pode incluir um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico (240) que, em uma modalidade não limitante, inclui um polipeptídeo de hemaglutinina do Vírus do Sarampo (H) e um polipeptídeo de fusão do Vírus do Sarampo (F) ou variantes de deleção do domínio citoplasmático dos mesmos; opcionalmente, um ou mais elementos de ativação (210, 220), que, em uma modalidade não limitante inclui um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 e um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28; e/ou opcionalmente uma citocina ligada à membrana (230), uma modalidade não limitante da qual é um polipeptídeo de fusão que inclui IL-7 fundido a DAF ou um fragmento do mesmo. Vários outros tipos específicos desses polipeptídeos ligados à membrana são fornecidos no presente documento.
[101] Como um resultado da expressão sequencial dos elementos transcricionais pela célula de empacotamento, uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação é produzida. O genoma retroviral de RNA dentro de e tipicamente integrado no genoma da célula de empacotamento que se torna o genoma da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, inclui componentes retrovirais (como exemplos ilustrativos não limitantes, polinucleotídeos Gag e Pol retrovirais) que são necessários para produção retroviral, infecção e integração no genoma de uma célula hospedeira, que é tipicamente
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30/540 uma célula T e/ou célula NK em repouso. Ademais, o genoma retroviral inclui adicionalmente polinucleotídeos que codificam um ou tipicamente dois polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados fornecidos no presente documento. Um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados tipicamente codifica pelo menos um elemento linfoproliferativo (em exemplos não limitantes, um mutante de receptor de interleucina 7 constitutivo) e o outro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado tipicamente codifica um receptor de antígeno quimérico.
[102] A partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) é, então, usada para transduzir uma célula T e/ou célula NK em repouso (300) em métodos fornecidos no presente documento. Conforme mostrado na Figura 2, após a célula T e/ou célula NK em repouso (300) ser colocada em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200), os polipeptídeos de membrana discutidos acima na superfície da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação se ligam aos receptores e/ou ligantes na superfície da célula T e/ou célula NK em repouso (300). Por exemplo, o elemento de pseudotipagem que, como indicado acima, pode incluir um polipeptídeo de ligação que se liga às moléculas na superfície de células T em repouso e/ou células NK em repouso e um polipeptídeo fusogênico, facilita a ligação e a fusão de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) à membrana de célula T e/ou célula NK. O elemento (ou elementos) de ativação (210, 220) ativa a célula T e/ou célula NK em repouso (300) através do engate do complexo de receptor de célula T, um processo que ocorre ao longo do decorrer do tempo do contato ou de uma incubação em seguida. Ademais, as citocinas ligadas à membrana (230) podem estar presentes na superfície da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação e se ligar aos receptores de citocina (310) na superfície da célula T e/ou célula NK em repouso (300), promovendo, assim, adicionalmente a ligação e ativação. Assim, sem se limitar à teoria, nas modalidades ilustrativas fornecidas no presente documento, como um resultado de uma ou mais desses componentes de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação (200), estímulo ou ativação ex vivo por um elemento que já não está dentro ou na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação (200) não é necessário. Isso, por sua vez, ajuda a reduzir o tempo ex vivo que for necessário para a conclusão dos métodos nesses métodos ilustrativos fornecidos no presente documento.
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31/540 [103] Mediante a ligação à célula T e/ou célula NK (200), a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, então, se funde com a célula T e/ou célula NK (300), e os polipeptídeos e ácidos nucleicos na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação entram na célula T e/ou célula NK (300). Como indicado acima, um desses polipeptídeos na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação é o polipeptídeo Vpx (250). O polipeptídeo Vpx (250) se liga a e induz a degradação do fator de restrição de SAMHD1 (350), que degrada dNTPs livres no citoplasma. Assim, a concentração de dNTPs livres no citoplasma aumenta à medida em que Vpx degrada SAMHD1, e a atividade de transcrição reversa é aumentado, assim, facilitando a transcrição reversa do genoma retroviral e integração no genoma de célula T e/ou célula NK.
[104] Após a integração do genoma retroviral na célula T e/ou célula NK (200), o genoma de célula T e/ou célula NK inclui ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo de sinalização que codifica o elemento linfoproliferativo (370) e opcionalmente o polipeptídeo de sinalização que codifica o CAR (360). A expressão do elemento linfoproliferativo e opcionalmente o CAR são sob o controle de um elemento de controle. A exposição a um composto que se liga ao elemento de controle, que pode ocorrer in vitro ou in vivo através da administração do mesmo a um sujeito cuja célula T e/ou célula NK (300) foi transduzido, promove a proliferação da célula T e/ou célula NK (300) in vitro ou in vivo através da expressão do elemento linfoproliferativo e opcionalmente como resultado de expressão do CAR e ligação do CAR à sua célula-alvo. Assim, as células T e/ou células NK que são transduzidas com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação no presente documento têm um ou mais sinais que acionam a proliferação e/ou inibem a morte celular que, por sua vez, em modalidades ilustrativas, previne a necessidade de métodos anteriores de linfodepletar um hospedeiro antes de retornar as células T e/ou células NK transduzidas de volta para o sujeito. Isso, por sua vez, nas modalidades ilustrativas, reduz adicionalmente a necessidade de dias de processamento antes que as células T e/ou células NK transduzidas sejam reintroduzidas em um sujeito. Assim, nas modalidades ilustrativas, não mais de 36 horas, 24 horas, 12 horas ou, em alguns casos, até mesmo 8 horas de tempo são necessárias da coleta de sangue do sujeito à reintrodução do sangue ao sujeito, que fundamentalmente altera o processo de CAR-T de métodos anteriores. Ademais, o elemento de controle fornece um dos mecanismos de segurança fornecidos no presente documento também.
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Por exemplo, cessar a administração do composto pode regular de modo descendente ou até mesmo finalizar a expressão do elemento linfoproliferativo e opcionalmente o CAR, terminando, assim, um sinal de proliferação e/ou sobrevivência para a célula T e/ou célula NK transduzida e sua progênie.
Métodos para transduzir e/ou modificar geneticamente linfócitos [105] E fornecido no presente documento, em certos aspectos, um método de transduzir e/ou modificar geneticamente um linfócito, tipicamente uma célula T e/ou uma célula NK, e tipicamente uma célula T e/ou célula NK em repouso, que inclui colocar o linfócito em contato com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação tipicamente compreende um elemento de pseudotipagem em sua superfície, em que o dito contato (e incubação sob condições de contato) facilita a transdução da célula T e/ou célula NK em repouso pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada. O elemento de pseudotipagem é tipicamente capaz de se ligar à célula T e/ou célula NK em repouso e tipicamente facilitar a fusão de membrana em sua própria ou em conjunto com outra proteína (proteínas) das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação.
[10 6] Em algumas modalidades, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação pode incluir adicionalmente um elemento de ativação, que pode ser qualquer elemento de ativação fornecido no presente documento. Nas modalidades ilustrativas, o elemento de ativação pode ser anti-CD3, como scFv anti-CD3, ou scFvFc anti-CD3. Em algumas modalidades, o contato pode ser realizado por entre 1 e 24 horas, por exemplo, entre 1 e 12 horas ou entre 1 e 6 horas. Em algumas modalidades, o contato pode ser realizado por menos de 24 horas, por exemplo, menos de 12 horas, menos de 8 horas ou menos de 4 horas. Uma célula de empacotamento e, em modalidades ilustrativas, uma linhagem de célula de empacotamento e, em modalidades particularmente ilustrativas, a célula de empacotamento fornecida em certos aspectos no presente documento são usadas para produzir a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Em modalidades exemplificativas de tais métodos, a célula T ou célula NK geneticamente modificada é capaz de sobrevivência em cultura ex vivo por pelo menos 7, 14, 21, 28, 35, 42 ou 60 dias na ausência de um antígeno-alvo reconhecido pelo CAR e na
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33/540 ausência de citocinas como IL-2, IL-15 ou IL-7. Em modalidades exemplificativas de tais métodos, a célula T ou célula NK geneticamente modificada é capaz de enxerto in vivo em camundongos e/ou enriquecimento in vivo in camundongos por pelo menos 7, 14 ou 28 dias. Um técnico versado reconhecerá que tais camundongos podem ser tratados ou, de outro modo, geneticamente modificados de modo que quaisquer diferenças imunológicas entre a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada não resultem em uma resposta imune sendo suscitada nos camundongos contra qualquer componente do linfócito transduzido pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Em algumas modalidades, a linhagem de célula de empacotamento pode ser uma linhagem de célula de suspensão. Em modalidades ilustrativas, a linhagem de célula de empacotamento pode ser cultivada em meios livres de soro. Em algumas modalidades, o linfócito pode ser de um sujeito. Em modalidades ilustrativas, o linfócito pode ser de sangue de um sujeito.
[107] As modalidades adicionais de qualquer um dos aspectos acima para transduzir e/ou modificar geneticamente um linfócito, por exemplo, uma célula NK ou em modalidades ilustrativas, uma célula T, podem incluir qualquer uma das modalidades de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, elementos linfoproliferativos, CARs, elementos de pseudotipagem, riboswitches, elementos de ativação, citocinas ligadas à membrana, miRNAs e/ou outros elementos revelados no presente documento, e podem ser combinados com métodos no presente documento para produzir partículas retrovirais com o uso de uma célula de empacotamento. Em certas modalidades ilustrativas, a partícula retroviral é uma partícula lentiviral. Tal método para transduzir uma célula T e/ou célula NK pode ser realizado in vitro ou ex vivo. Um técnico versado irá reconhecer que detalhes fornecidos no presente documento para transduzir e/ou modificar geneticamente a célula (ou células) T e/ou célula (ou células) NK podem se aplicar a qualquer aspecto que inclui tal etapa (ou etapas), incluindo aspectos que são direcionados a métodos para transduzir e/ou modificar geneticamente um linfócito como célula (ou células) T e/ou célula (ou células) NK.
[10 8] Consequentemente, é fornecido em um aspecto no presente documento um método para transduzir (e/ou modificar geneticamente) linfócitos, tipicamente células T em repouso e/ou células NK em repouso de sangue isolado, compreendendo:
A. coletai- sangue de um sujeito;
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B. isolar as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) compreendendo células T em repouso e/ou células NK em repouso; e
C. colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK em repouso e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas, em que o dito contato facilita a transdução de pelo menos 5% das células T em repouso e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas, transduzindo, assim, células T e/ou células NK em repouso.
[10 9] Em algumas modalidades de qualquer método no presente documento que inclui uma etapa de transduzir células T e/ou células NK, as células podem ser colocadas em contato com uma partícula retroviral sem ativação anterior. Em algumas modalidades de qualquer método no presente documento que inclui uma etapa de transduzir células T e/ou células NK, as células T e/ou células NK não foram incubadas em um substrato que adere a monócitos por mais de 4 horas em uma modalidade, ou por mais de 6 horas em outra modalidade ou por mais de 8 horas em outra modalidade antes da transdução. Em uma modalidade ilustrativa, as células T e/ou células NK foram incubadas de um dia para o outro em um substrato aderente para remove monócitos antes da transdução. Em outra modalidade, o método pode incluir incubar as células T e/ou células NK em um substrato aderente que se liga aos monócitos por não mais de 30 minutos, 1 hora ou 2 horas antes da transdução. Em outra modalidade as células T e/ou células NK não são expostas a nenhuma etapa de remover os monócitos por uma incubação em um substrato aderente antes da dita etapa de transdução. Em outra modalidade, as células T e/ou células NK não são incubadas com ou expostas a um soro bovino, como um soro bovino de cultura celular, por exemplo, soro bovino fetal antes ou durante a transdução.
[110] Consequentemente, é fornecido em outro aspecto no presente documento um método para modificar geneticamente ou transduzir um linfócito de um sujeito, em modalidades ilustrativas, uma célula T e/ou e célula NK ou uma população de células T ou células
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NK, que inclui colocar a célula (ou células) T e/ou célula (ou células) NK, tipicamente de um sujeito ex vivo, em contato com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA e a segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica a receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o dito contato facilita a transdução das, ou pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada.
[111] E fornecido no presente documento, em outro aspecto, um método para modificar geneticamente ou transduzir um linfócito (por exemplo, uma célula T ou uma célula NK) ou uma população do mesmo, de um sujeito, compreendendo colocar o linfócito (por exemplo, a célula T ou célula NK) ou uma população do mesmo, do sujeito ex vivo, com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em linfócitos (por exemplo, células T e/ou células NK), em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um ou mais (por exemplo, dois ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o dito contato facilita modificação genética e/ou transdução do linfócito (por exemplo, célula T ou célula NK) ou pelo menos alguns dos linfócitos (por exemplo, células T e/ou células NK) pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, um linfócito geneticamente modificado e/ou transduzido (por exemplo célula T e/ou célula NK).
[112] Em algumas modalidades do método fornecido imediatamente acima, o
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36/540 linfócito geneticamente modificado e/ou transduzido (por exemplo, célula T e/ou célula NK), ou população do mesmo, é introduzido no sujeito. Em algumas modalidades, o linfócito geneticamente modificado e/ou transduzido (por exemplo, célula T e/ou célula NK) ou população do mesmo, é submetido a 4 ou menos divisões de célula ex vivo antes de ser introduzido ou reintroduzido no sujeito. Em algumas modalidades, o linfócito (ou linfócitos) consiste em células T em repouso e/ou células NK em repouso que estão em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação por entre 1 hora e 12 horas. Em algumas modalidades, não mais de 8 horas passam entre o momento em que o sangue é coletado do sujeito e o momento em que as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são reintroduzidas no sujeito. Em algumas modalidades, todas as etapas após o sangue ser coletado e antes que o sangue seja reintroduzido são realizadas em um sistema fechado em que uma pessoa monitora o sistema fechado ao longo do processamento.
[113] Em qualquer um dos aspectos do método fornecidos imediatamente acima que incluem um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, o polinucleotídeo pode incluir adicionalmente uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos um elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser uma citocina ou receptor de citocina polipeptídeo ou um fragmento do mesmo compreendendo um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é constitutivamente ativo. Em certas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser um receptor de IL-7 ou um fragmento do mesmo. Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode ser um receptor de IL-7 constitutivamente ativo ou um fragmento constitutivamente ativo do mesmo.
[114] Em qualquer um dos aspectos do método fornecido imediatamente acima que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas
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37/540 de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos de RNA, uma molécula de RNA inibidora pode, em algumas, modalidades, incluir uma fita 5 ’ e uma fita 3’ que são parcial ou totalmente complementares uma à outra, em que a dita fita 5' e a dita fita 3' são capazes de formar um dúplex de RNA de 18 a 25 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a fita 5' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento e a fita 3' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita 5' e a fita 3' pode ter comprimentos iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, a dúplex de RNA pode incluir uma ou mais incompatibilidades. Em modalidades alternadas, o dúplex de RNA não tem incompatibilidades.
[115] Em qualquer um dos aspectos do método fornecido imediatamente acima que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos de RNA, pode ser uma molécula de RNA inibidora pode ser a miRNA. Em algumas modalidades, a molécula inibidora pode ser um precursor de um miRNA como, por exemplo, um Pri-miRNA ou um Pre-miRNA ou um precursor de um shRNA. Em algumas modalidades, a molécula inibidora pode ser um miRNA ou shRNA artificialmente derivado. Em outras modalidades, a molécula de RNA inibidora pode ser um dsRNA (transcrito ou artificialmente introduzido) que é processado em um siRNA ou o siRNA em si. Em algumas modalidades, a molécula de RNA inibidora pode ser um miRNA ou shRNA que tem uma sequência que não é encontrada na natureza, ou tem pelo menos um segmento funcional que não é encontrada natureza ou tem uma combinação de segmentos funcionais que não são encontrados na natureza. Em modalidades ilustrativas, pelo menos uma ou todas as moléculas inibidoras de RNA são miR-155.
[116] Em qualquer um dos aspectos do método fornecido imediatamente acima que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais
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38/540 (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos de RNA, em algumas modalidades, pode compreender de orientação 5’ a 3’: um braço 5’, uma haste 5’, um laço, uma haste 3’ que é parcial ou totalmente complementar à dita haste 5' e um braço 3 ’. Em algumas modalidades, pelo menos uma de duas ou mais moléculas inibidoras de RNA tem essa disposição. Em outras modalidades, todas as duas ou mais moléculas inibidoras têm essas disposições. Em algumas modalidades, a haste 5' pode ter 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a haste 3' pode ter 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o laço pode ter 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,2 5, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o braço 5’, o braço 3’, ou ambos, são derivados de um miRNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o braço 5’, braço 3’, ou ambos, são derivados de um miRNA de ocorrência natural que é selecionado a partir do grupo que consiste em: miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122 e miR-21. Em modalidades ilustrativas, o braço 5’, braço 3’, ou ambos, são derivados de miR-155. Em algumas modalidades, o braço 5’, braço 3’ ou ambos são derivados de miR-155 de Mus musculus ou miR-155 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, o braço 5' tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:256 ou é uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, uma sequência que é igual ao comprimento como SEQ ID NO:256, ou 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 50% desde que SEQ ID NO: 256 ou é 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:256. Em algumas modalidades, o braço 3' tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:260 ou é uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, igual ao comprimento como SEQ ID NO:260, ou 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 50% desde que SEQ ID NO: 260 ou é uma sequência que tem 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50
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39/540 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:260. Em algumas modalidades, o braço 3' compreende os nucleotídeos 221 a 283 do Mus musculus BIC.
[117] Em qualquer um dos aspectos do método fornecidos imediatamente acima que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA, em algumas modalidades, podem ser posicionadas na primeira sequência de ácidos nucleicos em série. Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA podem ser adjuntas uma à outra direta ou indiretamente por sequência (ou sequências) de aglutinante não funcional. Em algumas modalidades, as sequências de aglutinante podem ser entre 5 e 120 nucleotídeos de comprimento ou entre 10 e 40 nucleotídeos de comprimento.
[118] Em qualquer um dos aspectos do método fornecidos imediatamente acima que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica duas a quatro moléculas inibidoras de RNA. Em modalidades ilustrativas, entre 2 e 10, 2 e 8, 2 e 6, 2 e 5, 2 e 4, 3 e 5 ou 3 e 6 moléculas inibidoras de RNA são incluídos na primeira sequência de ácidos nucleicos. Em uma modalidade ilustrativa, quatro moléculas inibidoras de RNA são incluídas na primeira sequência de ácidos nucleicos.
[119] Em qualquer um dos aspectos do método fornecido imediatamente acima que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos
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40/540 de RNA, a uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA podem ser em um íntron. Em algumas modalidades, o íntron está em um promotor. Nas modalidades ilustrativas, o íntron é íntron A EF-lalfa. Em algumas modalidades, o íntron é adjacente a e a jusante de um promotor que, nas modalidades ilustrativas, é inativo em uma célula de empacotamento usada para produzir a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[12 0] Em qualquer um dos aspectos do método fornecidos imediatamente acima que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA, em algumas modalidades, podem ser direcionadas contra alvos diferentes. Em uma modalidade alternada, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA são direcionados contra o mesmo alvo. Em algumas modalidades, os alvos de RNA são mRNAs transcritos de genes que são expressados por células T como, mas sem limitações, PD-1 (prevenir inativação); CTLA4 (prevenir inativação); TCRa (segurança - prevenir autoimunidade); TCRb (segurança - prevenir autoimunidade); CD3Z (segurança - prevenir autoimunidade); SOCS1 (prevenir inativação); SMAD2 (prevenir inativação); um alvo de miR-155 (promover ativação); IFN gama (reduzir CRS); cCBL (prolongar sinalização); TRAIL2 (prevenir morte); PP2A (prolongar sinalização); ABCG1 (aumentar teor de microdomínio de colesterol através da limitação da liberação de colesterol). Em algumas modalidades, os alvos de RNA são mRNAs transcritos a partir de genes que codificam componentes do complexo de receptor de célula T (TCR). Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre duas ou mais das moléculas inibidoras de RNA pode diminuir a expressão de receptores de célula T, em modalidades ilustrativas, um ou mais receptor (ou receptores) de célula T endógeno de uma célula T. Em certas modalidades, o alvo de RNA pode ser mRNA transcrito do gene de TCRa ou TCRp endógeno da célula T cujo genoma compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica o um ou mais miRNAs. Em modalidades ilustrativas, o alvo de RNA é mRNA transcrito do gene de TCRa.
[121] Em qualquer um dos aspectos do método fornecidos imediatamente acima que incluem um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico
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41/540 ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em algumas modalidades, o CAR é um CAR biológico restrito ao microambiente (MRB). Em outras modalidades, o ASTR do CAR se liga a um antígeno associado ao tumor. Em outras modalidades, o ASTR do CAR é um ASTR biológico restrito ao microambiente (MRB).
[122] Em qualquer um dos aspectos do método fornecidos imediatamente acima que incluem um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular e, em alguns casos, uma terceira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam pelo menos um elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora, em algumas modalidades, qualquer uma ou todas dentre a primeira sequência de ácidos nucleicos, a segunda sequência de ácidos nucleicos e a terceira sequência de ácidos nucleicos é operacionalmente ligada a um riboswitch. Em algumas modalidades, o riboswitch é capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo. Em algumas modalidades, o análogo de nucleosídeo é um fármaco antiviral.
[12 3] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para ativar e/ou modificar geneticamente e tipicamente transduzir células T em repouso ou células NK, em modalidades ilustrativas, células T em repouso, através do contato das células com uma partícula retroviral revelada no presente documento e anticorpos anti-CD3 solúveis em 25 a 200, 50 a 150, 75 a 125 ou 100 ng/ml. Em modalidades ilustrativas, tais métodos são realizados sem ativação
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42/540 anterior e podem ser executados, por exemplo, por 8 horas ou menos, 4 horas ou menos, ou entre 2 e 8 horas, 2 e 4 horas ou entre 2 e 3 horas.
[12 4] Em certos aspectos, são fornecidos no presente documento métodos para realizar terapia celular adotiva em um sujeito. Como um exemplo ilustrativo, o método pode incluir o seguinte:
A. coletai- sangue de um sujeito;
B. isolar as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) compreendendo células T em repouso e/ou células NK em repouso;
C. colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK em repouso e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas; e
D. reintroduzir as células geneticamente modificadas no sujeito dentro de 36, 24, 12 ou até mesmo 8 horas da coleta de sangue do sujeito, realizando, assim, terapia celular adotiva no sujeito.
[12 5] Em alguns aspectos fornecidos no presente documento, os métodos com etapas similares são chamados de métodos para modificar geneticamente e expandir os linfócitos de um sujeito. Um técnico versado entenderá que a discussão no presente documento como se aplicando a métodos e composições para realizar a terapia celular adotiva se aplicam a métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos de um sujeito também.
[12 6] Tipicamente, os métodos de terapia celular adotiva da presente revelação são executados por transferência autóloga, em que as células são isoladas e/ou de outro modo preparadas a partir do sujeito que deve receber a terapia celular ou de uma amostra derivada de tal sujeito. Assim, em alguns aspectos, as células são derivadas de um sujeito, por exemplo, paciente, que precisa de um tratamento e as células, após o isolamento e o processamento são
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43/540 administradas ao mesmo sujeito. Em algumas modalidades dos métodos e composições revelados no presente documento, um sujeito que tem uma doença ou transtorno entra em instalações médicas em que o sangue do sujeito é coletado com o uso de métodos conhecidos, como venopunção. Em certas modalidades, o volume de sangue coletado de um sujeito é entre 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 ou 100 ml na extremidade baixa da faixa e 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1.000, 2.000 ou 2.500 ml na extremidade alta da faixa. Em algumas modalidades, entre 10 e 400 ml são coletados do sujeito. Em algumas modalidades, entre 20 e 250 ml de sangue são coletados do sujeito. Em algumas modalidades, o sangue está fresco quando é processado. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, sangue fresco pode ser sangue que foi coletado de um sujeito há menos de 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ou 180 minutos. Em algumas modalidades, o sangue é processado nos métodos fornecidos no presente documento sem armazenamento.
[12 7] O contato entre as células T e/ou células NK e as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação tipicamente facilita a transdução das células T e/ou células NK pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Ao longo da presente revelação, uma célula T e/ou célula NK transduzida inclui a progênie de células transduzidas ex vivo que retêm pelo menos parte dos ácidos nucleicos ou polinucleotídeos que são incorporados na célula durante a transdução ex vivo. Nos métodos aqui descritos que recitam a reintrodução de uma célula transduzida, será entendido que tal célula tipicamente não está em um estado transduzido quando é coletada do sangue de um indivíduo. Um sujeito em qualquer um dos aspectos revelados no presente documento pode ser, por exemplo, um animal, um mamífero e, em modalidades ilustrativas, um ser humano.
[12 8] Sem se ater à teoria, em métodos ilustrativos não limitantes, a entrega de um polinucleotídeo que codifica um elemento linfoproliferativo, como um mutante constitutivamente ativo de IL7, a uma célula T e/ou célula NK em repouso ex vivo, que pode se integrar no genoma da célula T ou célula NK, proporciona que a célula com um condutor para expansão in vivo sem a necessidade de linfodepletar o hospedeiro. Assim, em modalidades ilustrativas, o sujeito não é exposto a um agente de linfodepleção a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 2 ou 28 dias, ou a 1 mês, 2 meses, 3 meses ou 6 meses da realização do contato, durante o contato e/ou em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 10, 14, 21 ou 28 dias ou a 1 mês, 2 meses, 3 meses ou 6 meses após as células
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T e/ou células NK modificadas são reintroduzidas de volta no sujeito. Ademais, em modalidades não limitantes ilustrativas, os métodos fornecidos no presente documento podem ser realizados sem expor o sujeito a um agente de linfodepleção durante uma etapa em que uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação está em contato com células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito e/ou durante a totalidade do método ex vivo.
[12 9] Portanto, os métodos de expandir células T e/ou células NK geneticamente modificadas em um sujeito in vivo é um recurso de algumas modalidades da presente revelação. Em modalidades ilustrativas, tais métodos são livres de propagação ou substancialmente livres de propagação ex vivo.
[130] Todo esse método/processo de sangue coletado de um sujeito para reintrodução de sangue de volta no sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK, em modalidades não limitantes ilustrativas no presente documento, pode ocorrer ao longo de um período de tempo de menos de 48 horas, menos de 36 horas, menos de 24 horas, menos de 12 horas, menos de 11 horas, menos de 10 horas, menos de 9 horas, menos de 8 horas, menos de 7 horas, menos de 6 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas, menos de 3 horas, 2 horas ou menos de 2 horas. Em outras modalidades, todo o método/processo de retirada/coleta de sangue de um sujeito para reintrodução de sangue de volta no sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK, em modalidades não limitantes ilustrativas no presente documento, ocorre ao longo de um período de tempo entre 1 hora e 12 horas ou entre 2 horas e 8 horas ou entre 1 hora e 3 horas ou entre 2 horas e 4 horas ou entre 2 horas e 6 horas ou entre 4 horas e 12 horas ou entre 4 horas e 24 horas ou entre 8 horas e 24 horas ou entre 8 horas e 36 horas ou entre 8 horas e 48 horas ou entre 12 horas e 24 horas ou entre 12 horas e 36 horas ou entre 12 horas e 48 horas ou ao longo de um período de tempo entre 15, 30, 60, 90, 120, 180 e 240 minutos na extremidade baixa da faixa e 120, 180, e 240, 300, 360, 420, e 480 minutos na extremidade alta da faixa. Em outras modalidades, todo o método/processo de retirada/coleta de sangue de um sujeito para reintrodução de sangue de volta no sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK ocorre ao longo de um período de tempo entre 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 e 12 horas na extremidade baixa da faixa e 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 36 ou 48 horas na extremidade alta da faixa. Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são separadas das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação após o período de tempo em
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45/540 que o contato ocorre.
[131] Em algumas modalidades de qualquer método no presente documento que inclui uma etapa de coleta de sangue e uma etapa de transdução de linfócitos, em modalidades ilustrativas, células T e/ou células NK, incluindo célula T em repouso e células NK, o método de coleta de sangue através de transdução de células T e/ou células NK não inclui uma etapa de remover os monócitos por uma incubação em um substrato aderente de mais de 4 horas em uma modalidade ou por mais de 6 horas em outra modalidade, ou por mais de 8 horas em outra modalidade. Em uma modalidade ilustrativa, o método de coleta de sangue através da transdução de células T e/ou células NK não inclui uma incubação de um dia para o outro em um substrato aderente para remover monócitos. Em outra modalidade, o método de coleta de sangue através da transdução de células T e/ou células NK inclui uma etapa de remover monócitos por uma incubação em um substrato aderente por não mais de 30 minutos, 1 hora ou 2 horas. Em outra modalidade, o método de coleta de sangue de um sujeito através da transdução de linfócitos, em modalidades ilustrativas, células T e/ou células NK, incluindo células T e/ou células NK em repouso, não inclui a etapa de remover monócitos por uma incubação em um substrato aderente. Em outra modalidade, o método de coleta de sangue de um sujeito através da transdução de linfócitos, em modalidades ilustrativas células T e/ou células NK, incluindo células T e/ou células NK em repouso, inclui, células T e/ou células NK não são incubadas com ou expostas a um soro bovino como um soro bovino de cultura celular, por exemplo, soro bovino fetal durante o método.
[132] Em algumas modalidades de qualquer método no presente documento que inclui uma etapa de coleta de sangue e uma etapa de transdução de linfócitos, em modalidades ilustrativas, células T e/ou células NK, incluindo célula T em repouso e células NK, o método de coleta de sangue de um sujeito através de reintrodução de células T e/ou células NK no sujeito não inclui uma etapa de remover os monócitos por uma incubação em um substrato aderente de mais de 4 horas em uma modalidade ou por mais de 6 horas em outra modalidade, ou por mais de 8 horas em outra modalidade. Em uma modalidade ilustrativa, o método de coleta de sangue de um sujeito através da reintrodução de células T e/ou células NK no sujeito não inclui uma incubação de um dia para o outro em um substrato aderente para remover monócitos. Em outra modalidade, o método de coleta de sangue do sujeito através da reintrodução de células T e/ou células NK no sujeito inclui uma etapa de remover monócitos por uma incubação em um substrato
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46/540 aderente por não mais de 30 minutos, 1 hora ou 2 horas. Em outra modalidade, o método de coleta de sangue do sujeito através da reintrodução de células T e/ou células NK no sujeito não inclui uma etapa de remover monócitos por uma incubação em um substrato. Em outra modalidade, o método da coleta de sangue de um sujeito através da reintrodução de células T e/ou células NK no sujeito, as células T e/ou células NK não são incubadas com ou expostas a um soro bovino, como um soro bovino de cultura celular, por exemplo, soro bovino fetal durante o método.
[133] Visto que os métodos fornecidos no presente documento para terapia celular adotiva e métodos relacionados para modificar células T em repouso e/ou células NK em repouso ex vivo antes de expandir as mesmas in vivo podem ser realizados em significativamente menos tempo do que os métodos anteriores, os aprimoramentos fundamentais in cuidados com o paciente e segurança assim como a viabilidade de fabrico do produto são possibilitados. Portanto, espera-se que tais processos sejam favoráveis na visão de agências reguladoras responsáveis para aprovar tais processos quando executados in vivo para propósitos terapêuticos. Por exemplo, o sujeito nos exemplos não limitantes pode permanecer no mesmo prédio (por exemplo, clínica de infusão) ou cômodo que o instrumento que processa seu sangue ou amostra por todo o tempo que a amostra é processada antes que as células T e/ou células NK modificadas sejam reintroduzidas no paciente. Em modalidades não limitantes ilustrativas, um sujeito permanece dentro da linha do sítio e/ou a 30,48, 15,24, 7,62 ou 3,66 metros (100, 50, 25 ou 12 pés ou braças) de distância de seu sangue ou células que são processadas, durante todo o método/processo a partir da retirada/coleta de sangue do sujeito à reintrodução de sangue ao sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK. Em outras modalidades não limitantes ilustrativas, um sujeito permanece desperto e/ou pelo menos uma pessoa pode continuar a monitorar o sangue ou as células do sujeito que estão sendo processadas, ao longo e/ou continuamente por todo o método/processo a partir da retirada/coleta de sangue do sujeito à reintrodução de sangue ao sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK. Devido aos aprimoramentos fornecidos no presente documento, todo o método/processo para a terapia celular adotiva e/ou para transduzir as células T e/ou células NK em repouso a partir da retirada/coleta de sangue do sujeito à reintrodução de sangue no sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK pode ser realizado com monitoramento contínuo por um ser humano. Em outras modalidades não limitantes ilustrativas, em nenhum ponto na totalidade do método/processo a partir da
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47/540 retirada/coleta de sangue do sujeito à reintrodução de sangue ao sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK, são células sanguíneas incubadas em um cômodo que não tem uma pessoa presente. Em outras modalidades não limitantes ilustrativas, todo o método/processo da retirada/coleta de sangue do sujeito à reintrodução de sangue no sujeito após a transdução ex vivo de células T e/ou células NK é realizado próximo ao sujeito e/ou no mesmo cômodo que o sujeito e/ou próximo ao leito ou à cadeira do sujeito. Assim, as confusões de identidade de amostra podem ser evitadas, assim como incubações longas e dispendiosas ao longo de períodos de dias ou semanas. Isso é adicionalmente proporcionado pelo fato de que os métodos fornecidos no presente documento são prontamente adaptáveis a sistemas de processamento de sangue fechados e automatizados, em que uma amostra de sangue e seus componentes que serão reintroduzidos no sujeito, apenas fazem contato com componentes de uso único descartáveis.
[134] Os métodos para realizar terapia celular adotiva fornecidos no presente documento tipicamente incluem 1) métodos para transduzir linfócitos, como célula (ou células) T ou célula (ou células) NK que, em modalidades ilustrativas, consiste em célula (ou células) T em repouso e/ou célula (ou células) NK e/ou incluem 2) métodos para modificar geneticamente um linfócito como célula (ou células) T e/ou uma célula (ou células) NK que, em modalidades ilustrativas, consiste em célula (ou células) T em repouso e/ou célula (ou células) NK, ambos (1 e 2) os quais, em si, formam aspectos distintos da presente revelação. Tais métodos podem ser realizados com ou sem outras etapas identificadas no presente documento para realizar terapia celular adotiva. Em métodos para terapia celular adotiva e qualquer método fornecido no presente documento que inclui transduzir as células T em repouso e/ou células NK em repouso ex vivo, tipicamente, neutrófilos/granulócitos são separados das células sanguíneas antes que as células sejam colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em algumas modalidades, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) incluindo linfócitos de sangue periférico (PBLs) como célula T e/ou células NK são isoladas de outros componentes de uma amostra de sangue com o uso, por exemplo, aférese e/ou centrifugação por gradiente de densidade. Em algumas modalidades, neutrófilos são removidos antes que PBMCs e/ou células T e/ou células NK sejam processadas, colocadas em contato com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, transduzidas ou transfectadas. Com referência ao sujeito a ser tratado, as células podem ser alogênicas e/ou
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48/540 autólogas.
[135] Como exemplos não limitantes, em algumas modalidades para métodos para transdução ou modificação genética no presente documento, as PBMCs são isoladas com o uso de um sistema de processamento celular Sepax ou Sepax 2 (BioSafe). Em algumas modalidades, as PBMCs são isoladas com o uso de um processador celular CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). Em algumas modalidades, é usado um separador automático de aférese que retira sangue do indivíduo, passa o sangue através de um aparelho que classifica um tipo de célula particular (como, por exemplo, PBMCs) e retorna o restante de volta para o indivíduo. A centrifugação em gradiente de densidade pode ser realizada após aférese. Em algumas modalidades, as PBMCs são isoladas usando um dispositivo de filtro de leucorredução. Em algumas modalidades, a separação de células ativadas por esferas magnéticas é então usada para purificar uma população celular específica de PBMCs, como, por exemplo, PBLs ou um subconjunto das mesmas, de acordo com um fenótipo celular (isto é, seleção positiva). Outros métodos para purificação também podem ser usados como, por exemplo, adesão de substrato, que utiliza um substrato que simula o ambiente que uma célula T encontra durante o recrutamento, permitindo que a mesma adere e migra, ou seleção negativa, em que células indesejadas são alvejadas para remoção com complexos de anticorpo que alvejam as células indesejadas. Em algumas modalidades, a formação de roseta de hemácia pode ser usada para purificar células.
[13 6] Em algumas modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos relevantes no presente documento, os PBLs incluem células T e/ou células NK. As células T e/ou células NK que são colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação da presente revelação durante certas modalidades no presente documento, por exemplo, em métodos para modificar linfócitos e métodos para realizar terapia celular adotiva são principalmente células T em repouso. Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK consistem em entre 95 e 100% células em repouso (Ki-67). Em algumas modalidades, a célula T e/ou células NK que é colocada em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação incluem entre 90, 91, 92, 93, 94 e 95% de células em repouso na extremidade baixa da faixa e 96, 97, 98, 99 ou 100% de células em repouso na extremidade alta da faixa. Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK incluem células virgens.
[137] Em algumas modalidades dos métodos e composições reveladas no
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49/540 presente documento, as células T e/ou células NK são colocadas em contato ex vivo com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação para modificar geneticamente as células T e/ou células NK para suscitar uma resposta imune alvejada no sujeito quando reintroduzidas no sujeito. Durante o período de contato, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes para a replicação identificam e se ligam às células T e/ou às células NK, ponto em que as membranas das células retrovirais e do hospedeiro começam a fundir-se. Então, através do processo de transdução, o material genético das partículas retrovirais recombinantes incompetentes para replicação entra nas células T e/ou células NK e é incorporado ao DNA da célula hospedeira. Os métodos de transdução lentiviral são conhecidos. Métodos exemplificadores são descritos em, por exemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; e Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.
[13 8] Muitos dos métodos fornecidos no presente documento incluem transdução de células T e/ou células NK. Os métodos são conhecidos na técnica para transduzir células T e/ou células NK ex vivo com partículas retrovirais recombinantes incompetentes para replicação, como partículas lentivirais recombinantes incompetentes para replicação. Os métodos fornecidos no presente documento, em modalidades ilustrativas, não exigem estímulo ou ativação ex vivo. Assim, essa etapa comum nos métodos anteriores pode ser evitada no presente método, embora a molécula (ou moléculas) estimulante ex vivo como microesferas anti-CD3 e/ou antiCD28 possa estar presente durante a transdução. Entretanto, com métodos ilustrativos fornecidos no presente documento, o estímulo ex vivo não é necessário. Em certos métodos exemplificativos, a multiplicidade de infecção (MOI) entre 3 e 10, e em algumas modalidades, entre 5 e 10 unidades de MOI de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, por exemplo, lentivírus, podem ser usadas.
[13 9] A reação de transdução pode ser executada em um sistema fechado, como um sistema Sepax, como discutido no presente documento, em que a reação de transdução pode ser executada em bolsas descartáveis carregadas no sistema. As células sanguíneas, como PBMCs, da amostra de sangue coletada do sujeito, podem ser colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação reveladas no presente documento, em uma bolsa assim que essas células sanguíneas forem separadas, isoladas e/ou
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50/540 purificadas do granulócitos, incluindo neutrófilos, que tipicamente não estão presentes durante a etapa de contato (isto é, a reação de transdução).
[14 0] As partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem ser introduzidas na bolsa que contém as PBMCs isoladas, entrando em contato, assim, com as PBMCs. O tempo da coleta de sangue do sujeito ao momento em que as células sanguíneas, como as PBMCs são adicionadas à bolsa de reação de transdução, pode ser entre 30 minutos e 4 horas, entre 30 minutos e 2 horas ou cerca de 1 hora, em alguns exemplos. Os aditivos como meios, albumina de soro humano, soro AB+ humano e/ou soro derivado do sujeito podem ser adicionados à mistura de reação de transdução. Os meios estão tipicamente presentes, como os conhecidos na técnica para processos ex vivo (como exemplos não limitativos, meio X-VIVO 15 (Lonza) ou CTS (Thermo Fisher Scientific). Citocinas de suporte podem ser adicionadas à mistura de reação de transdução, tais como IL2, IL7 ou IL15 ou aquelas encontradas em HSA.
[141] A mistura de reação de transdução pode ser incubada entre 23 e 39 °C e, em algumas modalidades ilustrativas, a 37 °C. Em determinadas modalidades, a reação de transdução pode ser executada a 37 a 39 °C para fusão/transdução mais rápida. dGTP pode ser adicionado à reação de transdução. A mistura de reação de transdução pode ser incubada por 1 a 12 horas e, em algumas modalidades, 6 a 12 horas antes de uma lavagem ser realizada independentemente da possibilidade de tais células serem destinadas a serem estudadas in vitro, ex vivo ou introduzidas em um sujeito. Consequentemente, em certas modalidades em que as células são infundidas em um sujeito, após a transdução, antes que as células T e/ou células NK transduzidas sejam infundidas de volta no sujeito, as células são lavadas para remover a mistura de reação de transdução antes de serem infundidas de volta no sujeito. Por exemplo, o sistema, como um instrumento Sepax, pode ser usado para lavar as células, por exemplo, como 10 a 50 ml de solução de lavagem, antes que as células transduzidas sejam infundidas de volta no sujeito. Em algumas modalidades, neutrófilos são removidos antes q ue PBMCs e/ou células T e/ou células NK sejam processadas, colocadas em contato com partículas de retrovirus recombinantes incompetentes em replicação, transduzidas ou transfectadas.
[142] Em uma modalidade ilustrativa para realizar a terapia celular adotiva, o sangue é coletado de um sujeito em uma bolsa de sangue e a bolsa de sangue é fixada a um sistema de processamento celular como um sistema de processamento celular Sepax. As PBMCs isoladas
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51/540 com o uso do sistema de processamento celular são coletadas em uma bolsa, colocadas em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em condições suficientes para transduzir células T e/ou células NK e incubadas. Após a incubação, a bolsa contendo a mistura de PBMCs e partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação é fixada a um sistema de processamento celular e as PBMCs são lavadas. As PBMCs lavadas são coletadas em uma bolsa e reinfundidas no sujeito. Em algumas modalidades, o método inteiro, da coleta de sangue à reinfusão de células T e/ou NK transduzidas, é realizado com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18 ou 24 horas. Em modalidades ilustrativas, o método inteiro é realizado dentro de 12 horas.
[14 3] Em algumas modalidades, as células-alvo para as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação são PBLs. Em algumas modalidades, as células-alvo são células T e/ou células NK. Em algumas modalidades, as células T são células T auxiliares e/ou células T exterminadoras.
[14 4] Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento têm elementos de pseudotipagem em sua superfície que são capazes de se ligar às células T e/ou células NK e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas. Em outras modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação têm elementos de ativação em sua superfície que são capazes de se ligar às células T e/ou células NK em repouso. Ainda em outras modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação têm citocinas ligadas à membrana em sua superfície. Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação incluem um polinucleotídeo que tem uma ou mais unidades transcricionais que codificam um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados, um ou mais dos quais incluem um ou mais elementos linfoproliferativos. Em outras modalidades, quando dois polipeptídeos de sinalização são utilizados, um inclui pelo menos um elemento linfoproliferativo e o outro é tipicamente um receptor de antígeno quimérico (CAR) que inclui uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Como indicado no presente documento, um elemento (ou elementos) de ativação que é tipicamente associado à superfície de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação
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52/540 fornecida no presente documento é capaz de, e como um resultado do contato com células T e/ou células NK em repouso por um período de tempo suficiente e sob condições adequadas, ativa células T e/ou células NK em repouso. Será entendido que tal ativação ocorre ao longo do tempo durante uma etapa de contato de métodos no presente documento. Ademais, será entendido que em algumas modalidades em que um elemento de pseudotipagem é encontrado na superfície de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, que se liga a uma célula T e/ou uma célula NK, em métodos no presente documento, a ativação pode ser induzida através da ligação do elemento de pseudotipagem. Um elemento de ativação é opcional em tais modalidades.
[14 5] Os detalhes adicionais a respeito de um elemento de pseudotipagem, um elemento de ativação, uma citocina ligada à membrana, um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, um elemento linfoproliferativo e um CAR são fornecidos em outras seções no presente documento.
[14 6] Em algumas modalidades dos métodos e composições revelados no presente documento, entre 5% e 90% dos linfócitos totais coletados do sangue são transduzidos. Em algumas modalidades, a porcentagem de linfócitos que são transduzidos é entre 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 e 60% na extremidade baixa da faixa e 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 e 90% na extremidade alta da faixa. Em algumas modalidades, a porcentagem de linfócitos que são transduzidos é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55% ou pelo menos 60%.
[14 7] Em algumas modalidades dos métodos e composições revelados no presente documento, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são introduzidas de volta, reintroduzidas ou reinfundidas no sujeito sem manipulação ex vivo adicional, como estímulo e/ou ativação de células T e/ou NKs. Nos métodos da técnica anterior, a manipulação ex vivo é usada para estímulo/ativação de células T e/ou células NK e para expansão de células T e/ou células NK geneticamente modificadas antes de introduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito. Nos métodos da técnica anterior, isso geralmente leva dias ou semanas e exige que um sujeito retorne a uma clínica para uma infusão de sangue dias ou semanas após uma retirada de sangue inicial. Em algumas modalidades dos métodos e composições revelados no presente documento, células T e/ou células NK não são estimuladas ex
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53/540 vivo por exposição a suportes sólidos anti-CD3/anti-CD28 como, por exemplo, microesferas revestidas com anti-CD3/anti-CD28, antes de entrar em contato com as células T e/ou células NK com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Como tal, é fornecido no presente documento um método livre de propagação ex vivo. Em outras modalidades, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas não são expandidas ex vivo, ou apenas expandidas por um pequeno número de divisões de célula (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ciclos de divisão de célula) mas, em vez disso, são expandidas, ou predominantemente expandidas, in vivo, isto é, no sujeito. Em algumas modalidades, nenhum meio adicional é adicionado para permitir a expansão adicional das células. Em algumas modalidades, não ocorre nenhuma fabricação de célula dos PBLs enquanto os PBLs são colocados em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em modalidades ilustrativas, não ocorre nenhuma fabricação de célula dos PBLs enquanto os PBLs são ex vivo. Em métodos anteriores de terapia celular adotiva, os sujeitos foram linfodepletados antes da reinfusão com células T e ou células NK geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, os pacientes ou sujeitos não são linfodepletados antes que o sangue seja retirado. Em algumas modalidades, os pacientes ou sujeitos não são linfodepletados antes da reinfusão com células T e ou células NK geneticamente modificadas.
[14 8] Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o número de células T e/ou células NK a serem reinfundidas em um sujeito pode ser entre 1 x 103, 2,5 x 103, 5 x 103,1 x 104, 2,5 x 104, 5 x 104,1 x 105, 2,5 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2,5 x 106, 5 x 106, e 1 x 107 células/kg na extremidade baixa da faixa e 5 x 104, 1 x 105, 2,5 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2,5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, e 1 x 108 células/kg na extremidade alta da faixa. Em modalidades ilustrativas, o número de células T e/ou células NK a serem reinfundidas em um sujeito pode ser entre 1 x 104, 2,5 x 104, 5 x 104, e 1 x 105 células/kg na extremidade baixa da faixa e 2,5 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 2,5 x 105, 5 x 105, e 1 x 106 células/kg na extremidade alta da faixa. Em algumas modalidades, o número de PBLs a serem reinfundidos em um sujeito pode ser menor que 5 x 105, 1 x 106, 2,5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, e 1 x 108 células e a extremidade baixa da faixa e 2,5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2,5 x 108, 5 x 108 e 1 x 109 células na extremidade alta da faixa. Em algumas modalidades, o número de células T e/ou células NK disponíveis para reinfusão em um sujeito ou paciente de 70 kg é entre 7 x 105
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54/540 e 2,5 x 108 células. Em outras modalidades, o número de células T e/ou células NK disponíveis para transdução é aproximadamente 7 x 106 mais ou menos 10%.
[14 9] Nos métodos revelados no presente documento, o procedimento inteiro de terapia celular adotiva, a partir da retirada de sangue à reinfusão de células T e/ou células NK geneticamente modificadas, pode ser vantajosamente realizado em um tempo mais curto do que os métodos anteriores. Em algumas modalidades, o procedimento inteiro de terapia celular adotiva pode ser realizado em menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18 ou 24 horas. Em modalidades ilustrativas, o procedimento inteiro de terapia celular adotiva pode ser realizado em menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 horas. Em algumas modalidades, o procedimento inteiro de terapia celular adotiva pode ser realizado em entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 15 horas na extremidade baixa da faixa e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18 ou 24 horas na extremidade alta da faixa.
[150] Em algumas modalidades no presente documento, um sistema fechado é usado para processar PBMCs, por exemplo, em métodos que incluem modificar geneticamente PBMCs, células NK e, em modalidades ilustrativas, células T, por exemplo, através da transdução das PBMCs ou do subconjunto (ou subconjuntos) das mesmas. Tais métodos podem ser usados para modificar geneticamente linfócitos para serem usados na pesquisa científica, produção comercial ou métodos terapêuticos. Por exemplo, tais métodos podem incluir transferir células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) incluindo células NK, células T ou ambos e, em algumas modalidades, células T em repouso e/ou células NK em repouso de um vaso em uma mistura de reação de transdução dentro de um sistema fechado, que, assim, é sem exposição ambiental. O vaso, por exemplo, pode ser um tubo, uma bolsa, seringa ou outro recipiente. Em algumas modalidades, o vaso é um vaso que é usado em uma instalação de pesquisa. Em algumas modalidades, o vaso é um vaso usado na produção comercial. Em outras modalidades, o vaso pode ser um vaso de coleta usado em um processo de coleta de sangue. Os métodos para modificação genética no presente documento tipicamente envolvem uma etapa de contato em que os linfócitos são colocados em contato com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. O contato, em algumas modalidades, pode ser realizado no vaso, por exemplo, dentro de uma bolsa de sangue. Em outras modalidades, PBMCs ou uma subfração das mesmas pode ser transferida do vaso para outro vaso (por exemplo, de um primeiro vaso a um
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55/540 segundo vaso) dentro do sistema fechado para o contato. O segundo vaso pode ser um compartimento de processamento de célula de um dispositivo fechado, como um dispositivo GRex. Em algumas modalidades, após o contato, as células geneticamente modificadas (por exemplo, transduzidas) podem ser transferidas para um vaso diferente dentro do sistema fechado (isto é, sem exposição ao ambiente). Antes ou após essa transferência, as células são tipicamente lavadas dentro do sistema fechado para remover substancialmente todas ou todas as partículas retrovirais. Em algumas modalidades, o processo revelado nesse parágrafo de transferência das PBMCs ou uma fração das mesmas para o vaso em que o contato (por exemplo, transdução) irá ocorrer através da lavagem das células após o contato, é realizado em 12 horas. Em algumas modalidades o mesmo é realizado por entre 1, 2, 3 ou 4 horas na extremidade baixa da faixa e 4, 8, 10 ou 12 horas na extremidade alta da faixa.
[151] Em algumas modalidades fornecidas no presente documento, as etapas de retirar uma amostra de sangue de um sujeito, colocar as células T e/ou células NK em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação e/ou introduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito ocorrem em um sistema fechado. Um sistema fechado é um processo de cultura que é geralmente fechado ou totalmente fechado para contaminação. Assim, tal sistema ou processo não expõe as células a um ambiente. Uma vantagem da presente invenção é que são fornecidos, no presente documento, métodos para realizar terapia de CAR em um sistema fechado. Um dos maiores riscos à segurança e controle regulador no procedimento de processamento de célula é o risco de contaminação através da exposição frequente ao ambiente como se encontra em sistemas de cultura celular abertos tradicionais. Para mitigar esse risco, particularmente na ausência de antibióticos, alguns processos comerciais foram desenvolvidos, os quais focam no uso de equipamento descartável (uso único). Entretanto, mesmo com seu uso sob condições assépticas, sempre há um risco de contaminação da abertura de frascos para a amostra ou adição de meios de crescimento adicional. Para superar esse problema, é fornecido, no presente documento, um processo de sistema fechado, um processo que é projetado e pode ser operado de modo que o produto não seja exposto ao ambiente externo. Isso é importante, visto que o ambiente externo tipicamente não é estéril. A transferência de material ocorre por meio de conexões estéreis ou soldagem de tubo. O ar para troca de gás ocorre por meio de uma membrana permeável ao gás ou como outras adições por meio de 0,2 um de
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56/540 filtro para prevenir exposição ambiental.
[152] Em algumas modalidades, o sistema fechado inclui um sistema de circulação ex vivo conectado ao sistema circulatório in vivo do sujeito de modo que o sangue seja retirado e, então, circulado para o sistema circulatório ex vivo antes de ser introduzido de volta ao sujeito. Em algumas modalidades, o sistema circulatório ex vivo inclui um sistema ou aparelho para isolar PBLs e/ou um sistema ou aparelho para isolar células T e/ou células NK, em combinação com o sistema ou aparelho para expor as células às partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em algumas modalidades, o sistema fechado não permite que as células T e/ou células NK sejam expostas ao ar.
[153] Tais métodos de sistema fechado podem ser realizados com dispositivos comercialmente disponíveis. Por exemplo, o método pode ser executado em dispositivos adaptados para a produção de célula T de sistema fechado. Tais dispositivos incluem um GRex™, um WAVE Bioreactor™, bolsas de OriGen PermaLife™ e bolsas de VueLife®.
[154] Em algumas modalidades dos métodos e composições revelados no presente documento, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas dentro de um sujeito são expostas a um composto que se liga a um elemento de controle in vivo presente no mesmo, em que o elemento de controle é uma parte do material genético introduzido pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em algumas modalidades, o elemento de controle pode ser um riboswitch e o composto pode se ligar ao domínio de aptâmero do riboswitch. Em algumas modalidades, o elemento de controle pode ser uma chaperona molecular. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o composto pode ser um análogo de nucleosídeo. Em algumas modalidades, o análogo de nucleosídeo pode ser um fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo, em que um fármaco antiviral é um composto aprovado pela Administração de Alimentos e Medicamentos para o tratamento antiviral ou um composto em um teste clínico antiviral nos Estados Unidos. Nas modalidades ilustrativas, o composto pode ser aciclovir ou penciclovir. Em algumas modalidades, o composto pode ser fanciclovir, o pró-fármaco oral de penciclovir, ou valaciclovir, o pró-fármaco oral de aciclovir. A ligação do composto ao elemento de controle in vivo afeta a expressão do material genético introduzido e, portanto, a propagação de células T e/ou células NK geneticamente modificadas.
[155] Em algumas modalidades, o fármaco ou pró-fármaco antiviral análogo ao
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57/540 nucleosídeo, por exemplo, aciclovir, valaciclovir, penciclovir ou famciclovir é administrado ao sujeito antes, simultaneamente e/ou após os PBLs serem isolados do sangue do sujeito e antes que as células T e/ou células NK sejam colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em algumas modalidades, o fármaco ou pró-fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo é administrado ao sujeito por entre 5, 10, 15, 30 e 60 minutos na extremidade baixa da faixa e 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas na extremidade alta da faixa antes que os PBLs sejam isolados do sangue ou antes que as células T e/ou células NK sejam colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em outras modalidades, o fármaco ou pró-fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo é administrado ao sujeito por entre 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas na extremidade baixa da faixa e 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 ou 28 dias na extremidade alta da faixa após os PBLs serem isolados do sangue e células T e/ou células NK são colocados em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em métodos fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o fármaco ou pró-fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo é administrado ao sujeito por pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas, ou pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 ou 28 dias após os PBLs serem isolados do sangue e células T e/ou células NK serem colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em métodos fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o fármaco ou pró-fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo é administrado ao sujeito por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90 ou 120 dias ou 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120 meses ou indefinidamente após os PBLs terem sido reinfundidos no sujeito. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o fármaco ou pró-fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo pode ser administrado antes e/ou durante a reinfusão dos PBLs e/ou após os PBLs terem sido reinfundidos.
[15 6] Em algumas modalidades, o composto que se liga ao elemento de controle é administrado uma vez, duas vezes, três vezes ou quatro vezes diariamente ao sujeito. Em algumas modalidades, as doses diárias do composto são fornecidas por 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 3 meses, 6 meses, 1 ano, até que um sujeito esteja livre de doença, como livre de câncer ou indefinidamente. O fármaco, em modalidades ilustrativas, é um fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo que se liga a um análogo de nucleosídeo, como um riboswitch, como
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58/540 revelado em maiores detalhes no presente documento.
[157] Os métodos são conhecidos na técnica para entregar fármacos, ou moléculas pequenas ou produtos biológicos, e podem ser usados nos métodos fornecidos no presente documento. Quaisquer tais métodos podem ser usados para entregar fármacos ou compostos candidatos ou anticorpos para uso nos métodos da presente invenção. Por exemplo, as vias de administração comuns incluem as vias peroral não invasiva (através da boca), tópica (pele), transmucosal (nasal, bucal/sublingual, vaginal, ocular e retal) e por inalação. Muitos fármacos de proteína e peptídeo, tais como anticorpos monoclonais, têm que ser entregues por injeção ou um arranjo de nanoagulha. Por exemplo, muitas imunizações baseiam-se na entrega de fármacos de proteína e são frequentemente feitas por injeção.
Polipeptídeo (ou polipeptídeos) de sinalização geneticamente modificado [158] Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação usadas para o contato com células T e/ou células NK têm um polinucleotídeo que tem uma ou mais unidades transcricionais que codificam um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui qualquer combinação de um domínio extracelular (por exemplo, uma região de alvejamento específico para antígeno ou ASTR), uma haste e um domínio transmembranar, combinado com um ou mais domínios de ativação intracelulares, um ou mais domínios moduladores (como um domínio coestimulante), e um ou mais motivos de sobrevivência de célula T. Em modalidades ilustrativas, pelo menos um, dois ou todos os polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados consistem em um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um elemento linfoproliferativo incluindo um elemento linfoproliferativo quimérico (CLE). Em algumas modalidades, quando dois polipeptídeos de sinalização são utilizados, um codifica um elemento linfoproliferativo e o outro codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que inclui uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Um elemento de habilidade comum na técnica seria capaz de configurar o sistema para colocar o elemento linfoproliferativo e o CAR em polinucleotídeos distintos com similar ou dissimilar elementos de controle para os métodos e composições reveladas no presente documento. Um técnico versado irá reconhecer que tais polipeptídeos geneticamente modificados também podem
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59/540 ser chamados de polipeptídeos recombinantes.
Domínio extracelular [159] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um domínio extracelular que é um membro de um par de ligação específico. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio extracelular pode ser o domínio extracelular de um receptor de citocina ou um mutante do mesmo ou um receptor de hormônio ou um mutante do mesmo. Tais domínios extracelulares mutantes em algumas modalidades foram relatados como sendo constitutivamente ativos quando expressados pelo menos em alguns tipos de célula. Em modalidades ilustrativas, tais domínios extracelulares e transmembranares não incluem uma região de ligação de ligante. Acredita-se que tais domínios não se ligam a um ligante quando presente em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e expressado em células B, células T e/ou células NK. As mutações em tais mutantes de receptor podem ocorrer na região de justamembrana extracelular. Sem se ater à teoria, uma mutação em pelo menos alguns domínios extracelulares (e alguns domínios transmembranares extracelulares) de polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados fornecidos no presente documento são responsáveis pela sinalização do polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado na ausência do ligante, unindo-se cadeias de ativação que não são normalmente juntas. As modalidades adicionais a respeito de domínios extracelulares que compreendem mutações nos domínios extracelulares podem ser encontradas, por exemplo, na seção de Elemento Linfoproliferativo no presente documento.
[160] Em certas modalidades ilustrativas, o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização. Em uma modalidade ilustrativa, o motivo de dimerização compreende um zíper de leucina. Em algumas modalidades, o zíper de leucina é de um polipeptídeo jun, por exemplo, c-jun. As modalidades adicionais a respeito de domínios extracelulares que compreendem um motivo de dimerização podem ser encontradas, por exemplo, na seção de Elemento Linfoproliferativo no presente documento.
[161] Em certas modalidades, o domínio extracelular é uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), por vezes chamada de um domínio de ligação de antígeno no presente documento. Pares de ligação específica incluem, sem limitação, pares de ligação antígeno-anticorpo; pares de ligação ligante-receptor; e similares. Assim, um membro de
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60/540 um par de ligação específica adequado para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação inclui um ASTR que é um anticorpo, um antígeno, um ligante, um domínio de ligação ao receptor de um ligante, um receptor, um domínio de ligação ao ligante de um receptor e um aficorpo.
[162] Um ASTR adequado para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação pode ser qualquer polipeptídeo de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, o ASTR é um anticorpo como um anticorpo de comprimento total, um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento (Fab’)2, um fragmento Fv e um anticorpo de cadeia simples divalente ou um diacorpo.
[163] Em algumas modalidades, o ASTR é um Fv de cadeia simples (scFv). Em algumas modalidades, a cadeia pesada está posicionada no N-terminal da cadeia leve no polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. Em outras modalidades, a cadeia leve está posicionada no N-terminal da cadeia pesada no polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. Em qualquer uma das modalidades reveladas, as cadeias pesadas e leves podem ser separadas por um ligante como discutido em mais detalhes aqui. Em qualquer uma das modalidades reveladas, a cadeia pesada ou leve pode estar no N-terminal N do polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e está tipicamente C-terminal de outro domínio, como uma sequência de sinais sinalizadora ou peptídeo.
[164] Outros domínios de reconhecimento baseados em anticorpos (cAb VHH (domínios variáveis de anticorpos de camelídeos) e versões humanizadas, IgNAR VH (domínios variáveis de anticorpos de tubarão) e versões humanizadas, sdAb VH (domínios variáveis de anticorpo de domínio único) e domínios variáveis “camelizados” são adequados para uso com os polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados e métodos usando os polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados da presente revelação. Em alguns casos, os domínios de reconhecimento baseados no receptor de células T (TCR), como TCR de cadeia simples (scTv, TCR de dois domínios de cadeia simples contendo VaVP) também são adequados para utilização.
[165] Em algumas modalidades, o ASTR pode ser multiespecífico, por exemplo, anticorpos biespecíficos. Anticorpos multiespecíficos têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em certas modalidades, uma das especificidades de ligação é para um antígeno-alvo e a outra é para outro antígeno-alvo. Em certas modalidades, os
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61/540 anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes de antígeno-alvo ta. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam um antígeno-alvo. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo.
[16 6] Um ASTR adequado para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação pode ter uma variedade de especificidades de ligação ao antígeno. Em alguns casos, o domínio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo presente em um antígeno que é expressado por (sintetizado por) uma célula-alvo. Em um exemplo, a célula-alvo é um antígeno associado à célula de câncer. O antígeno associado a células cancerosas pode ser um antígeno associado a, por exemplo, uma célula de câncer da mama, um linfoma de células B, uma célula de linfoma de Hodgkin, uma célula de câncer do ovário, uma célula de câncer da próstata, um mesotelioma, uma célula de câncer do pulmões (por exemplo, célula de câncer de pulmão de pequenas células), uma célula de linfoma de células B não Hodgkin (B-NHL), uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer de próstata, uma célula de mesotelioma, uma célula de câncer de pulmão, uma célula de melanoma, uma célula de leucemia linfocítica crônica, uma célula leucêmica linfocítica aguda, uma célula de neuroblastoma, um glioma, um glioblastoma, um meduloblastoma, uma célula cancerígena colorretal, etc. Um antígeno associado a células cancerosas pode também ser expresso por uma célula não cancerosa.
[167] Os exemplos não limitantes de antígenos aos quais um ASTR de um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado podem se ligar incluem, por exemplo, CD19, CD20, CD38, CD30, ERBB2, CA125, MUC-1, antígeno de membrana específico à próstata (PSMA), molécula de adesão à superfície de CD44, mesotelina, antígeno carcinoembrionário (CEA), receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), EGFRvIII, receptor de fator de crescimento endotelial vascular-2 (VEGFR2), antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, Axl, Ror2 e similares.
[168] Em alguns casos, um membro de um par de ligação específico adequado para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é um ASTR que é um ligante para um receptor. Os ligantes incluem, mas sem limitações, hormônios (por exemplo, eritropoietina, hormônio de crescimento, leptina, etc.); citocinas (por exemplo, interferons,
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62/540 interleucinas, certos hormônios, etc.); fatores de crescimento (por exemplo, heregulina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); e similares); um peptídeo de ligação de integrina (por exemplo, um peptídeo compreendendo a sequência Arg-Gly-Asp); e similares.
[169] Quando o membro de um par de ligação específica em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é um ligante, o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode ser ativado na presença de um segundo membro do par de ligação específica, em que o segundo membro do par de ligação específica um receptor para o ligante. Por exemplo, quando o ligando é VEGF, o segundo membro do par de ligação específica pode ser um receptor de VEGF, incluindo um receptor de VEGF solúvel.
[17 0] Como referido acima, em alguns casos, o membro de um par de ligação específica que está incluído em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é um ASTR que é um receptor, por exemplo, um receptor para um ligante, um correceptor, etc. O receptor pode ser um fragmento de ligação ao ligante de um receptor. Os receptores adequados incluem, sem limitação, um receptor do fator de crescimento (por exemplo, um receptor de VEGF); um polipeptídeo K, membro 1 (NKG2D) da subfamília do receptor do tipo lectina similar a uma célula assassina (receptor para MICA, MICB e ULB6); um receptor de citocina (por exemplo, um receptor de IL-13; um receptor de IL-2; etc.); CD27; um receptor de citotoxicidade natural (NCR) (por exemplo, polipeptídeo NKP30 (NCR3 / CD337) (receptor para transcrito associado a HLA-B 3 (BAT3) e B7-H6), etc.); etc.
[171] Em certas modalidades de qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que incluem um ASTR, o ASTR pode ser direcionado a uma proteína intermediária que liga o ASTR a uma molécula-alvo expressada em uma célula-alvo. A proteína intermediária pode ser endogenamente expressada ou introduzida endogenamente e pode ser natural, geneticamente modificada ou modificada quimicamente. Em certas modalidades o ASTR pode ser um ASTR antietiqueta de modo que pelo menos um intermediário etiquetado, tipicamente um conjugado de etiqueta de anticorpo é incluído entre uma etiqueta reconhecida pelo ASTR e uma molécula-alvo, tipicamente um alvo de proteína, expressado em uma célula-alvo. Consequentemente, em tais modalidades, o ASTR se liga a uma etiqueta e a etiqueta é conjugada a um anticorpo direcionado contra um antígeno em uma célula-alvo, como uma célula de câncer. Os exemplos não limitantes de etiquetas incluem isotiocianato de fluoresceína (FITC),
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63/540 estreptavidina, biotina, histidina, dinitrofenol, complexo de proteína de clorofila de peridinina, proteína fluorescente verde, ficoeritrina (PE), peroxidase de raiz forte, palmitoilação, nitrosilação, fosfatase alcalina, glucose oxidase e proteína de ligação à maltose. Assim, o ASTR compreende uma molécula que se liga à etiqueta.
Haste [172] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui uma haste que é localizada na porção do polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que se encontra fora da célula e interposta entre a ASTR e o domínio transmembranar. Em alguns casos, a haste tem pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com uma região de haste de CD8 do tipo selvagem (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA (SEQ ID NO:79), tem pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com uma região de haste de CD28 do tipo selvagem (FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO:80)) ou tem pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com uma região de haste de cadeia pesada de imunoglobulina do tipo selvagem. Em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, a haste empregada permite que a região de alvejamento específica para antígeno, e tipicamente o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inteiro, retenha ligação aumentada a um antígeno-alvo.
[17 3] A região de haste pode ter um comprimento de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, por exemplo, de cerca de 4 aa a cerca de 10 aa, de cerca de 10 aa a cerca de 15 aa, de cerca de 15 aa a cerca de 20 aa 20 aa a cerca de 25 aa, de cerca de 25 aa a cerca de 30 aa, de cerca de 30 aa a cerca de 40 aa, ou de cerca de 40 aa a cerca de 50 aa.
[17 4] Em alguns casos, a haste de um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui pelo menos uma cisteína. Por exemplo, em alguns casos, a haste pode incluir a sequência Cys-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO:62). Se estiver presente, uma cisteína na haste de um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode estar disponível para formar uma ligação de dissulfeto com uma haste em um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado.
[17 5] As hastes podem incluir sequências de aminoácidos de região de dobradiça de imunoglobulina que são conhecidas na técnica; consultar, por exemplo, Tan et al.
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64/540 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:162; e Huck et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:1779 Como exemplos não limitativos, uma região de dobradiça de imunoglobulina pode incluir um domínio com pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com um trecho de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos de qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos: DKTHT (SEQ ID NO:63); CPPC (SEQ ID NO:62); CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO:64) (consulte, por exemplo, Glaser et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:41494); ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO:65); KSCDKTHTCP (SEQ ID NO:66); KCCVDCP (SEQ ID NO:67); KYGPPCP (SEQ ID NO:68); EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:69) (dobradiça de IgGl humana); ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:70) (dobradiça de IgG2 humana); ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:71) (dobradiça de IgG3 humana); SPNMVPHAHHAQ (SEQ ID NO:72) (dobradiça de IgG4 humana); e similares. A haste pode incluir uma região de dobradiça com uma sequência de aminoácidos de uma região de dobradiça de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. A haste pode incluir uma ou mais substituições e/ou inserções e/ou deleções de aminoácidos em comparação com uma região de dobradiça de tipo selvagem (de ocorrência natural). Por exemplo, His229 da dobradiça de IgG humana 1 pode ser substituída por Tyr, de modo que a haste inclua a sequência EPKSCDKTYTCPPCP (consultar, por exemplo, Yan et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:5891). A haste pode incluir uma sequência de aminoácidos derivada de CD8 humano; por exemplo, a haste pode incluir a sequência de aminoácidos: TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:73), ou uma variante da mesma.
Domínio transmembranar [17 6] Um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação pode incluir domínios transmembranares para inserção em uma membrana de célula eucariótica. O domínio transmembrana pode ser interposto entre o ASTR e o domínio coestimulador. O domínio transmembranar pode ser interposto entre a haste e o domínio coestimulador, de modo que o receptor do antígeno quimérico inclua, por ordem do terminal amino (N-terminal), ao terminal carboxila (C-terminal): um ASTR; uma haste; um domínio transmembranar; e um domínio de ativação.
[17 7] Qualquer domínio transmembranar (TM) que forneça a inserção de um polipeptídeo na membrana celular de uma célula eucariótica (por exemplo, mamífero) é adequado
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65/540 para uso em aspectos e modalidades aqui descritas. Os exemplos não limitantes de domínios TM adequados para qualquer um dos aspectos ou modalidades fornecidos no presente documento incluem um domínio com pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com uma extensão de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos de qualquer um dos seguintes domínios TM ou haste e TM domínios combinados: a) CD8 alfa TM (SEQ ID NO:46); b) CD8 beta TM (SEQ ID NO:47); c) haste de CD4 (SEQ ID NO:48); d) CD3Z TM (SEQ ID NO:49); e) CD28 TM (SEQ ID NO:50); f) CD134 (0X40) TM: (SEQ ID NO:51); g) CD7 TM (SEQ ID NO:52); h) haste de CD8 e TM (SEQ ID NO:75); e i) haste de CD28 e TM (SEQ ID NO:76).
[17 8] Como exemplos não limitativos, um domínio transmembranar de um aspecto da invenção pode ter pelo menos 80, 90 ou 95% de identidade de sequência com o domínio transmembranar de SEQ ID NO: 46, o domínio transmembranar de CD8 beta, o domínio transmembranar de CD4, o domínio transmembranar CD3 zeta, o domínio transmembranar CD28, o domínio transmembranar CD134 ou o domínio transmembranar CD7.
Domínio de ativação intracelular [17 9] Os domínios de ativação intracelulares adequados para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação, quando ativados, induzem tipicamente a produção de uma ou mais citocinas; morte celular aumentada e/ou proliferação aumentada de células T CD8+, células T CD4+, células NKT, células T γδ e/ou neutrófilos. Os domínios ativadores podem também ser denominados domínios de ativação no presente documento. Os domínios ativadores podem ser usados em CARs ou em elementos linfoproliferativos fornecidos no presente documento.
[18 0] Em algumas modalidades, o domínio de ativação intracelular inclui pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, etc.) motivos ITAM como descrito abaixo. Em algumas modalidades, um domínio de ativação intracelular de um aspecto da invenção pode ter pelo menos 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência aos CD3Z, CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, DAP12, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C. Os domínios de DAP10/CD28 ou ZAP70 como descrito abaixo.
[181] Os domínios de ativação intracelular adequados para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação incluem
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66/540 polipeptídeos de sinalização intracelular contendo motivos de ativação baseados em tirosina imunoreceptora (IT AM). Um motivo IT AM é YX1X2L/I, em que Xi e X2 são independentemente qualquer aminoácido. Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular de um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui 1, 2, 3, 4 ou 5 motivos IT AM. Em alguns casos, um motivo ITAM é repetido duas vezes em um domínio de ativação intracelular, em que a primeira e a segunda instâncias do motivo ITAM são separadas uma da outra por 6 a 8 aminoácidos, por exemplo, (YX1X2L/I) (X3)n (YX1X2L/I), em que n é um número inteiro de 6 a 8 e cada um dos 6-8 X3 pode ser qualquer aminoácido. Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular de um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui 3 motivos ITAM.
[182] Um domínio de ativação intracelular adequado pode ser uma porção contendo um motivo ITAM que é derivada de um polipeptídeo que contém um motivo ITAM. Por exemplo, um domínio de ativação intracelular adequado pode ser um domínio contendo um motivo ITAM de qualquer proteína contendo um motivo ITAM. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado não precisa conter toda a sequência de toda a proteína da qual é derivada. Exemplos de polipeptídeos contendo motivos ITAM adequados incluem, mas não se limitam a: CD3Z (CD3 zeta); CD3D (CD3 delta); CD3E (CD3 epsilon); CD3G (CD3 gama); CD79A (cadeia alfa de proteína associada a complexo de receptor de antígeno); DAP12; e FCER1G (cadeia gama de receptor I epsilon de Fc).
[18 3] Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular é derivado da cadeia beta da glicoproteína CD3 da superfície das células T (também conhecida como CD3Z, cadeia zeta do receptor de células T T3, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ, etc.). Por exemplo, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas seguintes sequências ou em um alongamento contínuo de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa para cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa de uma das seguintes sequências de aminoácidos (2 isoformas):
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILHYGVILTALFLRVKFSRSAD
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APAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQK DKMAEAYSEI1GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (SEQ ID NO: 11) ou
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSAD APAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQ KDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (SEQ ID NO: 12), em que os motivos de IT AM são destacados com colchetes.
[18 4] Do mesmo modo, um polipeptídeo de domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um motivo ITAM contendo uma porção da sequência completa de aminoácidos CD3 zeta. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma extensão de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas sequências seguintes ou numa extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALP PR (SEQ ID NO: 13);
RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNP QEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQA LPPR (SEQ ID NO:81); NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR SEQ ID NO:14); EGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK (SEQ ID NO: 15); ou DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ (SEQ ID NO: 16), em que o motivos de ITAM são apontados com colchetes.
[18 5] Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular é derivado da cadeia delta CD3 da glicoproteína de superfície (também conhecida como CD3D; CD3-DELTA; T3D; antígeno CD3, subunidade delta; CD3 delta; antígeno CD3d, delta polipeptídeo (complexo TiT3); OKT3, cadeia delta, cadeia delta do receptor T3 de células T, cadeia delta CD3 da glicoproteína
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68/540 de superfície de células T, etc.). Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma extensão de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas sequências seguintes ou numa extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLG KRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLAL GVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK (SEQ ID NO: 17) ou
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLG KRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSH L]GGNWARNK (SEQ ID NO: 18), em que os motivos IT AM são apontados com colchetes.
[18 6] Do mesmo modo, um polipeptídeo de domínio de ativação intracelular adequado pode compreender uma porção contendo um motivo ITAM da sequência de aminoácidos delta CD3 completa. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na seguinte sequência: DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN (SEQ ID NO: 19), em que os motivos de ITAM são apontados com colchetes.
[18 7] Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular é derivado da glicoproteína CD3 epsilon da superfície da célula T (também conhecida como CD3e, cadeia de antígeno de superfície de células T T3/Leu-4 epsilon, cadeia CD3 epsilon de glicoproteína de células T, AI504783, CD3, CD3epsilon, T3e, etc.). Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma extensão de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas sequências seguintes ou numa extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca
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69/540 de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa a seguinte sequência de aminoácidos:
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEIL WQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRA RVCENCMEMDMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRG QNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI (SEQ ID NO:20), em que os motivos IT AM são apontados com colchetes.
[18 8] Do mesmo modo, um polipeptídeo de domínio de ativação intracelular adequado pode compreender uma porção contendo um motivo ITAM da sequência de aminoácidos CD3 epsilon inteira. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na seguinte sequência: NPD[YEPIRKGQRDLYSGLJNQR (SEQ ID NO:21), em que os motivos de ITAM são apontados com colchetes.
[18 9] Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular é derivado da cadeia gama da glicoproteína CD3 da superfície das células T (também conhecida como CD3G, cadeia gama do receptor T3 das células T, CD3-GAMMA, T3G, polipeptídeo gama (complexo TiT3), etc.). Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma extensão de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas sequências seguintes ou numa extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa a seguinte sequência de aminoácidos: MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKD GKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATI SGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL[YQPLKDREDDQYSH L]QGNQLRRN (SEQ ID NO:22), em que os motivos ITAM são apontados com colchetes.
[190] Do mesmo modo, um polipeptídeo do domínio de ativação intracelular
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70/540 adequado pode compreender uma porção contendo um motivo ITAM da sequência de aminoácidos gama CD3 completa. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na seguinte sequência: DQLfYQPLKDREDDQYSHLJQGN (SEQ ID NO:23), em que os motivos de ITAM são apontados com colchetes.
[191] Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular é derivado de
CD79A (também conhecido como cadeia alfa da proteína alfa associada ao complexo antígeno da célula B; antígeno CD79a (alfa associado à imunoglobulina); glicoproteína de membrana MB1; Ig-alfa; proteína associada a imunoglobulina, proteína associada a IgM de superfície, etc.). Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma extensão de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas sequências seguintes ou numa extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos: MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNS SNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESY QQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLG LDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO:24) ou
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNS SNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFC AVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQ DVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO:25), em que os motivos ITAM são apontados com colchetes.
[192] Do mesmo modo, um polipeptídeo de domínio de ativação intracelular adequado pode compreender uma porção contendo um motivo ITAM da sequência de aminoácidos CD79A de comprimento total. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado
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71/540 pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na seguinte sequência: ENL| YEGLNLDDCSM YEDIJSRG (SEQ ID NO:26) em que os motivos IT AM são apontados com colchetes.
[193] Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular é derivado de
DAP12 (também conhecida como TYROBP; proteína de ligação à proteína tirosina quinase TYRO; KARAP; PLOSL; proteína 12 de ativação de DNAX; proteína associada a KAR; proteína de ligação tirosina quinase TYRO; proteína associada a receptor; proteína associada ao receptor ativador de killer; etc.). Por exemplo, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas seguintes sequências ou em um alongamento contínuo de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa para cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa de uma das seguintes sequências de aminoácidos (4 isoformas):
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIAL AVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (SEQ ID NO:27),
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIAL AVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ (SEQ ID NO:28), MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPR GRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (SEQ ID NO:29), ou MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPR GRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (SEQ ID NO:30), em que os motivos IT AM são apontados com colchetes.
[194] Do mesmo modo, um polipeptídeo de domínio de ativação intracelular adequado pode compreender uma porção contendo um motivo ITAM da sequência de aminoácidos DAP12 de comprimento total. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado
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72/540 pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na seguinte sequência: ESP| YQELQGQRSDV YSDLJNTQ (SEQ ID NO: 31), em que os motivos de IT AM são apontados com colchetes.
[195] Em alguns casos, o domínio de ativação intracelular é derivado de FCER1G (também conhecido como FCRG; cadeia gama do receptor I epsilon; cadeia gama do receptor Fc; fc-epsilon RI-gama; fcRgama; fceRI gama; subunidade gama do receptor epsilon de alta afinidade da imunoglobulina receptor de imunoglobulina E, alta afinidade, cadeia gama, etc. Por exemplo, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos nas sequências seguintes ou em um alongamento contígua de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos (aa), de cerca de 60 aa cerca de 70 aa, de cerca de 70 aa a cerca de 80 aa, ou de cerca de 80 aa a cerca de 88 aa, da seguinte sequência de aminoácidos: MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKS DGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ (SEQ ID NO:32), em que os motivos ITAM são apontados com colchetes.
[19 6] Do mesmo modo, um polipeptídeo de domínio de ativação intracelular adequado pode compreender uma porção contendo um motivo ITAM da sequência de aminoácidos FCERIG de comprimento total. Assim, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na seguinte sequência: DGV[YTGLSTRNQETYETL]KHE (SEQ ID NO:33), em que os motivos de ITAM são apontados com colchetes.
[197] Os domínios de ativação intracelular adequados para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação incluem uma cadeia de sinalização do tipo DAP10/CD28. Um exemplo de uma cadeia de sinalização de D AP 10 é um aminoácido SEQ ID NO:34. Em algumas modalidades, um domínio de ativação intracelular adequado inclui um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10,
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15, 20 ou todos os aminoácidos em SEQ ID NO:34.
[198] Um exemplo de uma cadeia de sinalização de CD28 é a sequência de aminoácido SEQ ID NO:35. Em algumas modalidades, um domínio intracelular adequado inclui um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos da SEQ ID NO:35.
[199] [0349] Os domínios de ativação intracelulares adequados para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação incluem um polipeptídeo ZAP70, por exemplo, um domínio de ativação intracelular adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma extensão de pelo menos 10, 15, 20, ou todos os aminoácidos nas sequências a seguir ou com uma extensão contígua de cerca de 300 aminoácidos a cerca de 400 aminoácidos, de cerca de 400 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, ou de cerca de 500 aminoácidos a 619 aminoácidos, da SEQ ID NO:36.
Domínios modulatórios [200] Os domínios moduladores podem alterar o efeito do domínio de ativação intracelular no polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, incluindo acentuar ou suprimir os efeitos a jusante do domínio de ativação ou alterar a natureza da resposta. Os domínios moduladores adequados para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação incluem domínios coestimuladores. Um domínio modulador adequado para a inclusão no polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode ter um comprimento de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos (aa), por exemplo, um domínio modulador pode ter um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa. Em outros casos, o domínio modulatório pode ter um comprimento de cerca de 70 aa a cerca de 100 aa, de cerca de 100 aa a cerca de 200 aa, ou superior a 200 aa.
[201] Os domínios coestimuladores tipicamente aumentam e/ou alteram a natureza da resposta a um domínio de ativação. Os domínios coestimuladores adequados para uso em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado da presente revelação são
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74/540 geralmente polipeptídeos derivados de receptores. Em algumas modalidades, domínios coestimuladores homodimerizam. Um domínio coestimulador do indivíduo pode ser uma porção intracelular de uma proteína transmembranar (isto é, o domínio coestimulador pode ser derivado de uma proteína transmembranar). Os exemplos não limitantes de polipeptídeos coestimuladores adequados incluem, porém sem limitação, 4-1BB (CD137), CD27, CD28, CD28 deletado para ligação de Lck (ICA), ICOS, 0X40, BTLA, CD27, CD30, GITR e HVEM. Por exemplo, um domínio coestimulador de um aspecto da invenção pode ter pelo menos 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com o domínio coestimulador de 4-1BB (CD 137), CD27, CD28, CD28 deletado para Ligação de Lck (ICA), ICOS, 0X40, BTLA, CD27, CD30, GITR ou HVEM. Por exemplo, um domínio coestimulador de um aspecto da invenção pode ter pelo menos 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com o domínio coestimulador dos exemplos não limitantes de polipeptídeos coestimuladores adequados que incluem, porém sem limitação, 4-1BB (CD 137), CD27, CD28, CD28 deletado para ligação de Lck (ICA), ICOS, 0X40, BTLA, CD27, CD30, GITR ou HVEM. Por exemplo, um domínio coestimulador de um aspecto da invenção pode ter pelo menos 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com o domínio coestimulador de 41BB (CDI37), CD27, CD28, CD28 deletado para Ligação de Lck (ICA), ICOS, 0X40, BTLA, CD27, CD30, GITR ou HVEM.
[202] [0376] Um domínio coestimulador adequado para a inclusão em um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode ter um comprimento de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos (aa), por exemplo, um domínio coestimulador pode ter um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa. Em outros casos, o domínio coestimulador pode ter um comprimento de cerca de 70 aa a cerca de 100 aa, de cerca de 100 aa a cerca de 200 aa ou maior do que 200 aa.
[203] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana CD137 (também conhecida como TNFRSF9; CD137; 41BB; CDwl37; ILA; etc.). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os
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75/540 aminoácidos na SEQ ID NO:1. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.
[204] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana CD28 (também conhecida como Tp44). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:2. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.
[205] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana CD28 deletada para ligação Lek (IC Δ). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:3. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.
[206] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana ICOS (também conhecida como AILIM, CD278 e CVID1). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:4. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de
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76/540 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.
[207] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana 0X40 (também conhecida como TNFRSF4, RP5902P8.3, ACT35, CD134, OX-40, TXGP1L). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:5. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.
[208] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana CD27 (também conhecida como S 152, T 14, TNFRSF 7 e Tp55). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:6. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, ou de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa.
[209] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana BTLA (também conhecida como BTLA1 e CD272). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:7.
[210] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana CD30 (também conhecida como TNFRSF8, D1S166E e Ki-1). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo
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77/540 menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência a um trecho de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, ou de cerca de 160 aa a cerca de 185 aa da SEQ ID NO:8.
[211] Em alguns casos, o domínio coestimulador é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembrana GITR (também conhecida como TNFRSF18, RP5902P8.2, AITR, CD357 e GITR-D). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:9. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.
[212] Em alguns casos, o domínio coestimulador derivou de uma porção intracelular da proteína transmembranar HVEM (também conhecida como TNFRSF14, RP3395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR e TR2). Por exemplo, um domínio coestimulador adequado pode incluir um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com um alongamento de pelo menos 10, 15, 20 ou todos os aminoácidos na SEQ ID NO:10. Em algumas dessas modalidades, o domínio coestimulador do primeiro e do segundo polipeptídeo tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.
Ligante [213] Em alguns casos, o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um ligante entre dois domínios adjacentes. Por exemplo, um ligante pode estar entre o domínio transmembranar e o primeiro domínio coestimulador. Como outro exemplo, o
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ASTR pode ser um anticorpo e um ligante pode estar entre a cadeia pesada e a cadeia leve. Como outro exemplo, um ligante pode estar entre o ASTR e o domínio transmembranar e um domínio coestimulador. Como outro exemplo, um ligante pode estar entre o domínio coestimulador e o domínio de ativação intracelular do segundo polipeptídeo. Como outro exemplo, o aglutinante pode estar entre a ASTR e o domínio de sinalização intracelular.
[214] O peptídeo ligante pode ter qualquer uma de uma variedade de sequências de aminoácidos. As proteínas podem ser unidas por um peptídeo espaçador, geralmente de natureza flexível, embora outras ligações químicas não sejam excluídas. Um ligante pode ser um peptídeo com entre cerca de 1 e cerca de 100 aminoácidos de comprimento, ou entre cerca de 1 e cerca de 25 aminoácidos de comprimento. Esses ligantes podem ser produzidos com o uso de oligonucleotídeos codificadores de ligação sintéticos para acoplar as proteínas. Ligantes peptídicos com um grau de flexibilidade podem ser usados. Os peptídeos de ligação podem ter praticamente qualquer sequência de aminoácidos, tendo em conta que os ligantes adequados terão uma sequência que resulta em um peptídeo geralmente flexível. O uso de pequenos aminoácidos, como glicina e alanina, é útil na criação de um peptídeo flexível. A criação de tais sequências é rotineira para os versados na técnica.
[215] Ligantes adequados podem ser facilmente selecionados e podem ser de qualquer um de diferentes comprimentos adequados, como desde 1 aminoácido (por exemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, e podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos.
[216] Ligantes flexíveis exemplificadores incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, GSGGSn, GGGSn e GGGGSn, em que n é um número inteiro de pelo menos um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alaninaserina e outros ligantes flexíveis conhecidos na técnica. Polímeros de glicina e glicina-serina são de interesse, uma vez que ambos os aminoácidos são relativamente não estruturados e, portanto, podem servir como uma ligação neutra entre os componentes. Polímeros de glicina são de particular interesse, uma vez que a glicina acessa significativamente mais espaço phi-psi do que a alanina, e é muito menos restrita do que os resíduos com cadeias laterais mais longas (por exemplo, Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Ligantes flexíveis
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79/540 exemplificadores incluem, sem limitação, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:53), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:54), GGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGSG (SEQ ID NO:56), GGSGG (SEQ ID NO:57), GSGSG (SEQ ID NO:58), GSGGG (SEQ ID NO:59), GGGSG (SEQ ID NO:60), GSSSG (SEQ ID NO:61), e similares. O versado na técnica reconhece que a concepção de um peptídeo conjugado com quaisquer elementos descritos acima pode incluir ligantes que sejam total ou parcialmente flexíveis, de modo que o ligante possa incluir um ligante flexível bem como uma ou mais porções que conferem estrutura menos flexível.
Combinações [217] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo fornecido pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação tem uma ou mais unidades transcricionais que codificam determinadas combinações do um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados. Em alguns métodos e composições fornecidos no presente documento, células T geneticamente modificadas incluem as combinações do um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados após a transdução de células T pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Será entendido que a referência de um primeiro polipeptídeo, um segundo polipeptídeo, um terceiro polipeptídeo, etc. são para conveniência, e elementos em um “primeiro polipeptídeo” e aqueles em um “segundo polipeptídeo” significam que os elementos estão em diferentes polipeptídeos que são referidos como primeiro ou segundo para referência e convenção apenas, tipicamente em elementos ou etapas mais afastadas desse polipeptídeo específico.
[218] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um domínio de ligação de antígeno extracelular, que tem a capacidade para se ligar a um antígeno, e um domínio de sinalização intracelular. Em outras modalidades, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado também inclui um motivo de sobrevivência de célula T e/ou um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado não inclui um domínio coestimulador, ao mesmo tempo que, em outras modalidades, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado não inclui um domínio coestimulador.
[219] Em algumas modalidades, um segundo polipeptídeo de sinalização
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80/540 geneticamente modificado inclui um produto de gene linfoproliferativo e, opcionalmente, um domínio de ligação de antígeno extracelular. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado também inclui um ou mais dos seguintes: um motivo de sobrevivência de célula T, um domínio de sinalização intracelular e um ou mais domínios coestimuladores. Em outras modalidades, quando dois polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados são usados, pelo menos um é um CAR.
[220] Em uma modalidade, o um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados são expressos sob um promotor específico para célula T ou um promotor geral sob o mesmo transcrito em que, no transcrito, ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados são separados por ácidos nucleicos que codificam um ou mais sítios de entrada ribossômicos internos (IREs) ou um ou mais peptídeos de divagem de protease.
[221] Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo codifica dois polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados em que o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um primeiro domínio de ligação de antígeno extracelular, que tem a capacidade para se ligar a um primeiro antígeno, e um primeiro domínio de sinalização intracelular, mas não um domínio coestimulador, e o segundo polipeptídeo inclui um segundo domínio de ligação de antígeno extracelular, que tem a capacidade para se ligar a VEGF, e um segundo domínio de sinalização intracelular, tal como, por exemplo, o domínio de sinalização de uma molécula coestimuladora. Em uma determinada modalidade, o primeiro antígeno é PSCA, PSMA ou BCMA. Em uma determinada modalidade, o primeiro domínio de ligação de antígeno extracelular compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo (por exemplo, scFv), por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo específico para PSCA, PSMA ou BCMA. Em uma determinada modalidade, o segundo domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a VEGF é um receptor para VEGF, isto é, VEGFR. Em determinadas modalidades, o VEGFR é VEGFR 1, VEGFR2 ou VEGFR3. Em uma determinada modalidade, o VEGFR é VEGFR2.
[222 ] [0410] Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo codifica dois polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados em que o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um domínio de ligação de antígeno tumoral
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81/540 extracelular e um domínio de sinalização €Ό3ζ. e o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um domínio de ligação a antígeno, em que o antígeno é um fator angiogênico ou vasculogênico, e um ou mais domínios de sinalização de molécula coestimuladora. O fator angiogênico pode ser, por exemplo, VEGF. O um ou mais motivos de sinalização de molécula coestimuladora podem compreender, por exemplo, domínios de sinalização coestimuladores de cada um dentre CD27, CD28, 0X40, ICOS e 4-1BB.
[223] Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo codifica dois polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados em que o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um domínio de ligação de antígeno tumoral extracelular e a domínio de sinalização de €Ό3ζ. o segundo polipeptídeo compreende um domínio de ligação a antígeno, que tem a capacidade para se ligar a VEGF, e domínios de sinalização coestimuladores de cada um dentre CD27, CD28, 0X40, ICOS e 4-1BB. Em uma modalidade adicional, o primeiro polipeptídeo de sinalização ou o segundo polipeptídeo de sinalização também tem um motivo de sobrevivência de célula T. Em algumas modalidades, o motivo de sobrevivência de célula T é, ou é derivado de, um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-7 (IL-7R), um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-12, um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-15, um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-21 ou um domínio de sinalização intracelular do receptor de fator de crescimento de transformação β (TGFP) ou do receptor chamariz de TGFp (TGF-β—receptor II negativo dominante(DNRII)).
[224] Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo codifica dois polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados em que o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um domínio de ligação de antígeno tumoral extracelular e um domínio de sinalização €Ό3ζ. e o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um domínio de ligação a antígeno, que tem a capacidade para se ligar a VEGF, um motivo de sobrevivência de célula T intracelular de receptor de IL-7 e domínios de sinalização coestimuladores de cada um dentre CD27, CD28, 0X40, ICOS e 4-1BB.
[225] Em algumas modalidades, mais do que dois polipeptídeos de sinalização são codificados pelo polinucleotídeo. Em determinadas modalidades, apenas um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados inclui um domínio de ligação a antígeno
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82/540 que se liga a um antígeno associado a tumor ou um antígeno específico para tumor; cada um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados compreende um domínio de ligação a antígeno que se liga a um antígeno que não é um antígeno associado a tumor ou um antígeno específico para tumor. Em outras modalidades, dois ou mais dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados incluem domínios de ligação a antígeno que se ligam a um ou mais antígenos associados a tumor ou antígenos específicos para tumor, em que pelo menos um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados compreende um domínio de ligação a antígeno que não se liga a um antígeno associado a tumor ou um antígeno específico para tumor.
[226] Em algumas modalidades, o antígeno associado a tumor ou antígeno específico para tumor é Her2, antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA), PSMA (antígeno de membrana específico para próstata), antígeno de maturação de célula B (BCMA), alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno-125 de câncer (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), tirosinase, antígeno associado a melanoma (MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína de fluido de doença cística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, proteína melan-A (antígeno de melanoma reconhecido por linfócitos T; MART-1), myo-Dl, actina específica para músculo (MSA), neurofilamento, enolase específica a neurônio (NSE), fosfatase alcalina placentária, sinaptofisina, tiroglobulina, fator-1 de transcrição da tireoide, a forma dimérica da isoenzima piruvato quinase tipo M2 (M2-PK de tumor), CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (G2 de gangliosídeo), EphA2, CSPG4, CD138, FAP (Proteína de Ativação de Fibroblasto), CD171, kappa, lambda, 5T4, integrina ανβό, integrina ανβ3 (CD61), galactina, K-Ras (oncogene viral de sarcoma de rato V-Ki-ras2 Kirsten), Ral-B, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD20, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, EGFR, EGP2, EGP40, EpCAM, fetal AchR, FRa, GD3, HLA-A1+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, IL-llRa, IL-13Ra2, Lewis-Y, Mucló, NCAM, Ligantes NKG2D, NYESO-1, PRAME, ROR1, Survivina, TAG72, TEMs, VEGFR2, EGFRvIII (variante de fator de crescimento epidérmico III), proteína de esperma 17 (Spl7), mesotelina, PAP (ácido prostático fosfatase), prosteina, TARP (proteína de quadro de leitura alternativa de receptor gama de célula T), Trp-p8, STEAP1 (antígeno epitelial com sais transmembranas da próstata 1), uma proteína ras anormal ou um proteína p53 anormal.
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83/540 [227] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um primeiro domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a um primeiro antígeno, e um primeiro domínio de sinalização intracelular; e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um segundo domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a um segundo antígeno, ou um receptor que se liga ao segundo antígeno; e um segundo domínio de sinalização intracelular, em que o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado não compreende um domínio coestimulante. Em uma determinada modalidade, o primeiro domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno são, independentemente, uma porção de ligação a antígeno de um receptor ou uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo. Em uma determinada modalidade, cada um ou tanto o primeiro domínio de ligação a antígeno quanto o segundo domínio de ligação a antígeno são fragmentos de anticorpo scFv. Em determinadas modalidades, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendem adicionalmente um domínio transmembranar. Em uma determinada modalidade, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado ou o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende um motivo de sobrevivência de célula T, por exemplo, qualquer um dentre os motivos de sobrevivência de célula T descritos no presente documento.
[228] Em outra modalidade, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um primeiro domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a HER2 e o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado inclui um segundo domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a MUC-1.
[229] Em outra modalidade, o segundo domínio de ligação de antígeno extracelular do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado se liga a uma interleucina.
[230] Em outra modalidade, o segundo domínio de ligação de antígeno extracelular do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado se liga a uma molécula de padrão molecular associado a danos (DAMP; também conhecida como uma alarmina). Em outras modalidades, uma DAMP é uma proteína de choque térmico, proteína associada à cromatina box 1 do grupo de alta mobilidade (HMGB1), S100A8 (também conhecido
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84/540 como MRP8 ou calgranulina A), S100A9 (também conhecido como MRP14 ou calgranulina B), amiloide sérico A (SAA), ácido desoxirribonucleico, trifosfato de adenosina, ácido úrico ou sulfato de heparina.
[231] Em determinadas modalidades, o dito segundo antígeno é um antígeno em um anticorpo que se liga a um antígeno apresentado por uma célula tumoral.
[2 32 ] Em algumas modalidades, a ativação de transdução de sinal através do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é não antigênica, mas está associada à hipoxia. Em determinadas modalidades, a hipoxia é induzida pela ativação do fatorla induzível por hipoxia (HIF-la), HIF-Ιβ, HIF-2a, ΗΙΡ-2β, HIF-3a ou ΗΙΡ-3β.
[233] Em algumas modalidades, a expressão do um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados é regulada por um elemento de controle, que é revelado em mais detalhes no presente documento.
Sequências adicionais [234] Os polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados, como CARs, podem incluir adicionalmente um ou mais domínios de polipeptídeo adicionais, em que tais domínios incluem, mas sem limitações, uma sequência de sinal; uma etiqueta de epítopo; um domínio de afinidade; e um polipeptídeo cuja presença ou atividade pode ser detectada (marcador detectável), por exemplo, por um ensaio de anticorpo ou devido ao fato de que é um polipeptídeo que produz um sinal detectável. Exemplos não limitativos de domínios adicionais para qualquer um dos aspectos ou modalidades aqui fornecidas, incluem um domínio com pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das seguintes sequências, como descrito abaixo: uma sequência sinal, um marcador epitópico, um domínio de afinidade ou um polipeptídeo que produz um sinal detectável.
[235] Sequências de sinalização que são adequadas para uso em um CAR de tópico, por exemplo, no primeiro polipeptídeo de um CAR de tópico, incluem qualquer sequência de sinalização eucariótica, incluindo uma sequência de sinalização de ocorrência natural, uma sequência de sinalização sintética (por exemplo, artificial), etc. Em algumas modalidades, por exemplo, a sequência de sinalização pode ser a sequência de sinalização CD8 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 74).
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85/540 [236] As etiquetas de epitópicos adequadas incluem, sem limitação, hemaglutinina (HA; por exemplo, YPYDVPDYA; SEQ ID NO:37); FLAG (por exemplo, DYKDDDDK; SEQ ID NO:38); c-myc (por exemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO:39) e similares.
[237] Os domínios de afinidade incluem sequências de peptídeos que podem interagir com um parceiro de ligação, por exemplo, um imobilizado em um suporte sólido, útil para identificação ou purificação. Sequências de DNA que codificam múltiplos aminoácidos únicos consecutivos, como histidina, quando fundidas com a proteína expressa, podem ser usadas para purificação de uma etapa da proteína recombinante por ligação de alta afinidade a uma coluna de resina, como a sefarose de níquel. Domínios de afinidade exemplificadores incluem His5 (HHHHH; SEQ ID NO:40), HisXó (HHHHHH; SEQ ID NO:41), c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:39), Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO:38), Strep Tag (WSHPQFEK; SEQ ID NO:42), hemaglutinina, por exemplo, HA Tag (YPYDVPDYA; SEQ ID NO:37), GST, tioredoxina, domínio de ligação a celulose, RYIRS (SEQ ID NO:43), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO:44), domínio de ligação a quitina, S-peptídeo, peptídeo T7, domínio SH2, marcador de RNA de extremidade C, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO:45), domínio de ligação a metal, por exemplo, domínio de ligação a zinco ou domínio de ligação a cálcio como aqueles de proteína de ligação a cálcio, por exemplo, calmodulina, troponina C, calcineurina B, cadeia leve de miosina, recoverina, S-modulina, visinina, VILIP, neurocalcina, hipocalcina, frequenina, caltractina, subunidade grande de calpaína, proteínas S100, parvalbumina, calbindina D9K, calbindina D28K, e calretinina, inteínas, biotina, estreptavidina, MyoD, Id, sequências zipper de leucina, e proteína de ligação a maltose.
[238] Proteínas produtoras de sinal detectáveis adequadas incluem, por exemplo, proteínas fluorescentes; enzimas que catalisam uma reação que gera um sinal detectável como produto; e similar.
[239] Proteínas fluorescentes adequadas incluem, sem limitação, proteína fluorescente verde (GFP) ou variantes das mesmas, variante fluorescente azul de GFP (BFP), variante fluorescente ciano de GFP (CFP), variante fluorescente amarela de GFP (YFP), GFP melhorada (EGFP), reforçada CFP (ECFP), melhorada YFP (EYFP), GFPS65T, Esmeralda, Topázio (TYFP), Vênus, Citrino, mCitrina, GFPuv, desestabilizado EGFP (dEGFP),
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86/540 desestabilizado ECFP (dECFP), desestabilizado EYFP (dEYFP) , mCFPm, Cerulean, T-Safira, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-monômero, J-Vermelho, dimer2, t-dimer2 (12), mRFPl, pocilisina, Renilla GFP, Monster GFP, paGFP, protei/Ga Kaede e proteína de kindling, conjugados Ficobiliproteínas e Ficobiliproteína incluindo B-ficoeritrina, Rficoeritrina e aloficocianina. Outros exemplos de proteínas fluorescentes incluem mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrapel, mRaspberry, mGrape2, mPlum (Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909) e similares. Qualquer uma de uma variedade de proteínas fluorescentes e coloridas das espécies de Anthozoan, como descrito em, por exemplo, Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973, é adequada para uso.
[240] Enzimas adequadas incluem, sem limitação, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), beta-galactosidase (GAL), desidrogenase de glucose-6-fosfato, beta-N-acetilglucosaminidase, β-glucuronidase, invertase, Xantina Oxidase, luciferase de pirilampo, glucose oxidase (GO) e similares.
Domínio de reconhecimento e/ou eliminação [241] Qualquer uma das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento pode incluir ácidos nucleicos que codificam um domínio de reconhecimento ou eliminação como parte, ou separado, dos ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados fornecidos no presente documento. Assim, qualquer um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados fornecidos no presente documento pode incluir um domínio de reconhecimento ou eliminação. Por exemplo, qualquer um dos CARs revelados no presente documento pode incluir um domínio de reconhecimento ou eliminação. Além disso, um domínio de reconhecimento ou eliminação pode ser expresso juntamente com, ou até mesmo fundido a, qualquer um dos elementos linfoproliferativos revelados no presente documento. Os domínios de reconhecimento ou eliminação são expressos na célula T e/ou célula NK, mas não são expressos nas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação.
[242] Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento ou eliminação pode ser derivado de enzima timidina quinase derivada do vírus herpes simplex (HSV-tk) ou caspase-9 induzível. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento ou eliminação pode
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87/540 incluir uma molécula de superfície celular endógena modificada, por exemplo, como revelado na Patente n° U.S. 8.807.274. A molécula de superfície celular endógena modificada pode ser qualquer receptor, ligando, glicoproteína, molécula de adesão celular, antígeno, integrina ou grupo de diferenciação (CD) relacionado à superfície celular que é modificado. Em algumas modalidades, a molécula de superfície celular endógena modificada é um receptor de tirosinaquinase truncado. Em um aspecto, o receptor de tirosina-quinase truncado é um membro da família de receptores do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, ErbBl, ErbB2, ErbB3 e ErbB4). Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento pode ser um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo que reconhece o domínio extracelular de um membro de EGFR. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento pode ser pelo menos 20 aminoácidos contíguos de um membro da família de EGFR ou, por exemplo, entre 20 e 50 aminoácidos contíguos de um membro da família de EGFR. Por exemplo, SEQ ID NO:78, é um polipeptídeo exemplificativo que é reconhecido e, sob as condições apropriadas, ligado por um anticorpo que reconhece o domínio extracelular de um membro de EGFR. Tais epítopos de EGFR extracelulares são algumas vezes denominados no presente documento eTags. Nas modalidades ilustrativas, tais epítopos são reconhecidos por anticorpos monoclonais anti-EGFR comercialmente disponíveis.
[243] O receptor do fator de crescimento epidérmico, também conhecido como EGFR, ErbBl e HER1, é um receptor de superfície celular para membros da família dos fatores de crescimento epidérmicos de ligantes extracelulares. Alterações na atividade do EGFR foram implicadas em certos tipos de câncer. Em algumas modalidades, um gene que codifica um polipeptídeo EGFR incluindo o receptor do fator de crescimento epidérmico humano (EGFR) é construído por remoção de sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos incluindo o domínio de ligação de EGF distai da membrana e a cauda de sinalização citoplasmática, mas retém o epítopo proximal de membrana extracelular reconhecido por um anticorpo anti-EGFR. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal anti-EGFR comercialmente disponível conhecido, como cetuximab, matuzumab, necitumumab ou panitumumab.
[244] Outros mostraram que a aplicação de cetuximab biotinilado à seleção imunomagnética em combinação com microesferas antibiotina enriquece com sucesso as células T que foram transduzidas lentiviralmente com construtos contendo EGFRt de tão baixo quanto 2% da população a mais de 90% de pureza sem toxicidade observável para a célula preparação.
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Ademais, outros mostraram que a expressão constitutiva dessa molécula de EGFR inerte não afeta o fenótipo de células T ou função efetora como dirigido pelo receptor de antígeno quimérico (CAR) CD19R expresso coordenadamente. Adicionalmente, outros mostraram que, através da análise citométrica de fluxo, EGFR foi utilizado de modo bem-sucedido como um marcador de rastreamento in vivo para enxerto de célula T em camundongos. Além disso, demonstrou-se que o EGFR tem potencial genético suicida através das vias de citotoxicidade celular dependente de anticorpos mediada por Erbitux® (ADCC). Ademais, EGFR demonstrou ter potencial de gene suicida através de trajetórias de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) mediadas por Erbitux®. Os inventores da presente revelação expressaram de modo bem-sucedido eTag em PBMCs com o uso de vetores lentivirais e constataram que a expressão de eTag in vitro por PBMCs expostas a Cetuximabe forneceu um mecanismo de eliminação eficaz para PBMCs. Assim, o EGFR pode ser usado como uma ferramenta de seleção não imunogênica, marcador de rastreamento e gene suicida para células T transduzidas que têm potencial imunoterápico. O ácido nucleico de EGFR também pode ser detectado por meios bem conhecidos na técnica.
[245] Em algumas modalidades fornecidas no presente documento, EGFR é expresso como parte de um único polipeptídeo que também inclui o CAR ou como parte de um único polipeptídeo que inclui o elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos que codifica o domínio de reconhecimento de EGFR pode ser separada da sequência de aminoácidos que codifica o receptor de antígeno quimérico por um sinal de divagem e/ou uma sequência de salto de ribossoma. O salto de ribossoma e/ou sinal de divagem podem ser qualquer salto de ribossoma e/ou sinal de divagem conhecidos na técnica. Sem aterse à teoria, a sequência de salto de ribossoma pode ser, por exemplo, T2A (também chamado de 2 A-1 no presente documento) com a sequência de aminoácidos
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:77). Sem ater-se à teoria, outros exemplos de sinais de divagem e sequências de salto de ribossoma incluem FMDV 2A (F2A); vírus 2A da rinite equina A (abreviado como E2A); teschovírus-1 2A porcino (P2A); e vírus 2A de Thoseaasigna (T2A). Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeos que codifica o domínio de reconhecimento pode estar no mesmo transcrito que o CAR ou elemento linfoproliferativo, mas separado da sequência de polinucleotídeos que codifica o CAR ou elemento linfoproliferativo por um sítio de entrada de ribossoma interno.
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89/540 [246] Em outras modalidades conforme empiricamente exemplificado no presente documento, um domínio de reconhecimento pode ser expresso como parte de um polipeptídeo de fusão, fundido a um elemento linfoproliferativo. Tais construtos fornecem a vantagem, especialmente em combinação com outros elementos de “economia de espaço” fornecidos no presente documento, de ocupar menos espaço genômico em um RNA genoma em comparação aos polipeptídeos separados. Em uma modalidade ilustrativa, um eTag é expresso como um polipeptídeo de fusão, fundido a um mutante de IL7Ra, conforme experimentalmente demonstrado no presente documento.
Receptor de antígeno quimérico [247] Em alguns aspectos da presente invenção, um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um polinucleotídeo que codifica um CAR, que, visando a simplicidade, é chamado no presente documento de CAR. Um CAR da presente revelação inclui: a) pelo menos uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR); b) um domínio transmembranar; e c) um domínio de ativação intracelular. Em modalidades ilustrativas, a região de alvejamento específico para antígeno do CAR é uma porção de scFv de um anticorpo para o antígeno-alvo. Em modalidades ilustrativas, o domínio de ativação intracelular é de CD3z.
[248] Um CAR da presente revelação pode estar presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero, onde células de mamífero adequadas incluem, sem limitação, uma célula citotóxica, um linfócito T, uma célulatronco, uma progênie de uma célula-tronco, uma célula progenitora, uma progênie de uma célula progenitora e uma célula NK, uma célula NK-T e um macrófago. Quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, um CAR da presente revelação é ativo na presença de um ou mais antígenos-alvo que, em certas condições, se ligam ao ASTR. O antígeno-alvo é o segundo membro do par de ligação específico. O antígeno-alvo do par de ligação específica podem ser um fator solúvel (por exemplo, não ligado a uma célula); um fator presente na superfície de uma célula, como uma célula-alvo; um fator apresentado em uma superfície sólida; um fator presente em uma bicamada lipídica; e similar. Quando o ASTR é um anticorpo, e o segundo membro do par de ligação específica é um antígeno, o antígeno pode ser um antígeno solúvel (por exemplo, não ligado a uma célula); um antígeno presente na superfície de uma célula, como uma célula
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90/540 alvo; um antígeno apresentado em uma superfície sólida; um antígeno presente em uma bicamada lipídica; e similar.
[249] Em alguns casos, um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um ou mais antígenosalvo, aumenta a expressão de pelo menos um ácido nucleico na célula. Por exemplo, em alguns casos, um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um ou mais antígenos-alvo, aumenta a expressão de pelo menos um ácido nucleico na célula em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com o nível de transcrição do ácido nucleico na ausência de um ou mais antígenos-alvo.
[250] Como um exemplo, o CAR da presente revelação pode incluir um polipeptídeo de sinalização intracelular contendo motivo de ativação do imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM).
[251] Um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um ou mais antígenos-alvo, pode, em alguns casos, resultar no aumento da produção de uma ou mais citocinas pela célula. Por exemplo, um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica e quando ativado pelo um ou mais antígenos-alvo, pode aumentar a produção de uma citocina pela célula em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes, em comparação à quantidade de citocina produzida pela célula na ausência do um ou mais antígenosalvo. As citocinas cuja produção pode ser aumentada incluem, sem limitação, interferon gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral alfa (TNF-a), IL-2, IL-15, IL-12, IL-4, IL- 5, IL-10; uma quimiocina; um fator de crescimento; e similar.
[2 52 ] Em alguns casos, um CAR da presente revelação, quando presente na
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91/540 membrana plasmática de uma célula eucariótica e quando ativado por um ou mais antígenos-alvo, pode resultar tanto em um aumento na transcrição de um ácido nucleico na célula quanto em um aumento na produção de uma citocina pela célula.
[253] Em alguns casos, um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um ou mais antígenosalvo, resulta em atividade citotóxica pela célula em direção a uma célula alvo que expressa em sua superfície celular um antígeno ao qual o domínio de ligação ao antígeno do primeiro polipeptídeo do CAR se liga. Por exemplo, quando a célula eucariótica é uma célula citotóxica (por exemplo, uma célula NK ou um linfócito T citotóxico), um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática da célula, e quando ativada por um ou mais antígenosalvo aumenta a atividade citotóxica da célula em direção a uma célula alvo que expressa, na sua superfície celular, um ou mais antígenos-alvo. Por exemplo, quando a célula eucariótica é uma célula NK ou um linfócito T, um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática da célula, e quando ativada por um ou mais antígenos-alvo, aumenta a atividade citotóxica da célula por pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica da célula na ausência do um ou mais antígenos-alvo.
[2 54 ] Em alguns casos, um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um ou mais antígenosalvo, pode resultar em outros eventos relacionados à ativação de CAR, tais como proliferação e expansão (devido ao aumento divisão celular ou respostas antiapoptóticas).
[255] Em alguns casos, um CAR da presente revelação, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um ou mais antígenosalvo, pode resultar em outros eventos relacionados à ativação de CAR, como modulação de sinalização intracelular, diferenciação celular ou morte celular.
[256] Em algumas modalidades, os CARs da presente revelação são restritos ao microambiente. Essa propriedade é tipicamente o resultado da natureza restrita ao microambiente do domínio ASTR do CAR. Assim, os CARs da presente revelação podem ter
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92/540 uma afinidade de ligação mais baixa ou, nas modalidades ilustrativas, podem ter uma afinidade de ligação mais alta a um ou mais antígenos-alvo sob uma condição (ou condições) em um microambiente do que sob uma condição em um ambiente fisiológico normal.
Elementos linfoproliferativos [257] Os números de linfócitos T periféricos são mantidos a níveis notavelmente estáveis por toda a fase adulta, apesar da adição contínua de células, devido à emigração do timo e proliferação em resposta ao encontro de antígeno, e perda de células devido à remoção de efetores específicos para antígeno após a liberação de antígeno (Marrak, P. et al. 2000. Nat Immunol 1:107 a 111; Freitas, A.A. et al. 2000. Annu Rev Immunol 18:83 a 111). O tamanho do compartimento de célula T periférico é regulado por múltiplos fatores que influenciam tanto a proliferação quanto a sobrevivência. Entretanto, em um ambiente linfopênico, os linfócitos T se dividem independentemente do antígeno cognato, devido a mecanismos de “proliferação homeostática aguda” que mantêm o tamanho do compartimento de célula T periférico. As condições para linfopenia foram estabelecidas em sujeitos ou pacientes durante a terapia celular adotiva proliferando-se as células T in vitro e introduzindo as mesmas em sujeitos linfodepletados, resultando em enxerto melhorado e função antitumoral das células T transferidas. Entretanto, a linfodepleção de um sujeito não é desejável devido ao fato de que a mesma pode causar sérios efeitos colaterais, incluindo disfunção imunológica e morte.
[258] Estudos mostraram que a linfodepleção remove os linfócitos endógenos que funcionam como sequestradores celulares para citocinas homeoestáticas, liberando, assim, as citocinas para induzir a sobrevivência e proliferação de células adotivamente transferidas. Algumas citocinas, tais como, por exemplo, IL-7 e IL-15, são conhecidas por mediar a proliferação independente de antígeno de células T e têm, assim, capacidade para estimular a proliferação homeostática em ambientes não linfopênicos. Entretanto, essas citocinas e seus receptores têm mecanismos de controle intrínsecos que previnem distúrbios linfoproliferativos na homeostase.
[259] Muitos dos aspectos fornecidos no presente documento incluem um elemento linfoproliferativo, ou um ácido nucleico que codifica o mesmo, tipicamente como parte de um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. Consequentemente, em alguns aspectos da presente invenção, um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é um
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93/540 elemento linfoproliferativo como um elemento linfoproliferativo quimérico (CLE). Tipicamente, o CLE contém um domínio extracelular, um domínio transmembranar e pelo menos um domínio de sinalização intracelular que aciona a proliferação. Um CLE não compreende tanto um ASTR quanto um domínio de ativação. Em modalidades ilustrativas no presente documento, um ou mais elementos linfoproliferativos são introduzidos em uma célula T e/ou célula NK em repouso, tipicamente através da transdução da célula T e/ou célula NK em repouso com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação cujo genoma codifica o elemento linfoproliferativo como parte de um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. O elemento linfoproliferativo pode incluir um único domínio intracelular ou pode incluir mais de um domínio intracelular. Em certas modalidades ilustrativas, um elemento linfoproliferativo inclui dois domínios intracelulares. As tabelas 7 a 23 fornecidas no presente documento e discutidas nos Exemplos 17 e 18 dotam CLEs de um domínio intracelular e CLEs de dois domínios intracelulares que foram identificados com o uso de métodos experimentais fornecidos nos mesmos que testaram polipeptídeos quiméricos candidatos que incluíram diferentes combinações de domínios extracelulares e domínios intracelulares que são identificados na Tabela 6.
[260] Em algumas modalidades ilustrativas, um elemento linfoproliferativo pode ser ou pode compreender uma citocina ou em modalidades adicionalmente ilustrativas, a receptor de citocina, ou um fragmento que inclui um domínio de sinalização do mesmo, que ativa uma trajetória de STAT3, uma trajetória de STAT4 ou até mesmo em modalidades adicionalmente ilustrativas, uma trajetória de Jak/STAT5. Assim, um elemento linfoproliferativo, pode ser, em um exemplo não limitante, um receptor de citocina, ou fragmento ativo que inclui um domínio de sinalização do mesmo, como um receptor de interleucina ou um fragmento ativo que inclui um domínio de sinalização do mesmo, que ativa STAT5. Assim, um elemento linfoproliferativo é um polipeptídeo que promove proliferação e opcionalmente sobrevivência (antiapopótica) e opcionalmente fornece um sinal coestimulante que aprimora um estado de diferenciação, potencial proliferativo ou resistência à morte celular de um linfócito. Em certas modalidades ilustrativas, um elemento linfoproliferativo é um polipeptídeo que induz proliferação de uma célula T e/ou célula NK. Os elementos linfoproliferativos ilustrativos induzem a proliferação por ativar STAT5. Assim, os fragmentos de tais elementos linfoproliferativos retêm
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94/540 a capacidade de induzir proliferação de células T e/ou células NK, em modalidades ilustrativas, ativando-se STAT5.
[261] Em modalidades ilustrativas, os elementos linfoproliferativos, quando presentes em PBMCs geneticamente modificadas, linfócitos ou células T e/ou células NK geneticamente modificadas são capazes de promover proliferação/expansão de linfócito e opcionalmente sobrevivência ex vivo ou in vitro em cultura na ausência de exposição das células a citocinas como IL-15, IL-7 e, em modalidades ilustrativas, IL-2 e o alvo para um ASTR de um CAR expressado pelas células durante a cultura por 6, 7, 14, 21 ou 35 dias.
[262] Em alguns dos métodos e composições apresentados no presente documento, um elemento linfoproliferativo é usado para promover a proliferação ou expansão de células T geneticamente modificadas in vivo sem precisar linfodepletar sujeitos. Assim, as modalidades não limitantes ilustrativas de métodos fornecidos no presente documento que incluem inserir um elemento linfoproliferativo em uma célula T e/ou célula NK em repouso de um sujeito, tipicamente através da transdução de tal célula T e/ou célula NK pode ser realizada sem linfodepletar o sujeito antes, durante e/ou após a realização do método, ou sem linfodepletar o sujeito antes, durante e/ou após coletar o sangue de um sujeito antes de realizar tal método, ou sem linfodepletar o sujeito antes, durante e/ou após modificar geneticamente as células T ou células NK ex vivo do sujeito, e/ou antes, durante ou após reintroduzir as células T e/ou células NK modificar geneticamente no sujeito. Os fatores que promovem a proliferação de células T in vivo incluem citocinas e seus receptores, em que um receptor tipicamente inclui um domínio de ligação de ligante e um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo usado nos métodos e composições revelados no presente documento é uma citocina e/ou um receptor de citocina. A citocina pode ser uma interleucina, e o receptor de citocina pode ser um receptor de interleucina. O elemento linfoproliferativo pode ser um fragmento funcional de uma citocina e/ou a fragmento funcional de um receptor de citocina, como um domínio de sinalização do mesmo, em que o fragmento é capaz de promover a proliferação de células T, por exemplo, através da ativação de STAT5.
[263] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo de citocina nos métodos e composições no presente documento incluem um ou mais dos seguintes: Interleucina7 (IL-7) ou seu receptor (IL-7R) ou um domínio de sinalização dos mesmos; Interleucina-12 (IL
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12) ou seu receptor (IL-12R) ou um domínio de sinalização dos mesmos; Interleucina-23 (IL-23) ou seu receptor composto de IL-12R βΐ e IL-23R ou um domínio de sinalização dos mesmos; Interleucina-27 (IL-27) ou seu receptor (IL-27R) ou um domínio de sinalização dos mesmos; Interleucina-15 (IL-15) ou seu receptor (IL-15R) ou um domínio de sinalização dos mesmos; Interleucina-21 (IL-21) ou seu receptor (IL-21R) ou um domínio de sinalização dos mesmos; ou fator de crescimento de transformação β (ΤΘΡβ) ou seu receptor (TGFβR) ou um domínio de sinalização dos mesmos; ou o receptor chamariz de ΤΟΡβ (TGF-β—receptor II negativo dominante(DNRII)). Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é o IL-12R ou o receptor chamariz de ΤΟΡβ (TGF-β—receptor II negativo dominante (DNRII)).
[264] IL-7 liga-se ao receptor de IL-7, um heterodímero que consiste em IL-7R alfa e receptor de cadeia gama comum. A ligação resulta em uma cascata de sinais importantes para o desenvolvimento da célula T dentro do timo e para a sobrevivência dentro da periferia. A ligação de IL-7 ao receptor de IL-7 é conhecida por ativar a trajetória Jak/STAT5.
[265] IL-12 está envolvida na diferenciação de células T virgens de células Thl (Hsieh CS et al. 1993. Science. 260(5107):547-9) e é conhecida como um fator estimulante de célula T. IL-12 liga-se ao receptor de IL-12, que é um receptor heterodimérico formado por IL12Κ-β1 e IL-12R^2. IL12 pode atuar ativando-se STAT4, mas mostrou ativar STAT5 em células T também (Ahn, H., et al. 1998. J. Immun. 161:5.893 a 5.900). A família IL-12 é composta pelas citocinas IL-12, IL-23 e IL-27. O receptor para IL-23 é composto de IL-12R βΐ e IL-23R. IL-27 é uma citocina heterodimérica que é composta de dois genes distintos, gene 3 induzido por vírus Epstein-Barr (EBI3) e IL-27p28. IL-27 interage com o receptor de IL-27.
[266] IL-15 é um fator estimulante de célula T e NK que é similar em estrutura e função à IL-2. Ambas as citocinas induzem a proliferação de células T; e acredita-se que suas funções compartilhadas resultam de ambos os receptores com o uso das cadeias γ comuns e IL2/ΙΕ-15Κβ. A trajetória de sinalização de IL-15 começa com a ligação ao receptor IL-15Ra, com apresentação subsequente a células circundantes portando o complexo ΙΕ-15Κβγο em sua superfície celular. Mediante ligação, a subunidade IL-Ιόβ ativa Janus quinase 1 (Jakl) e Janus quinase 3 (Jak3) de subunidade yc, o que leva à fosforilação e ativação de STAT3 e STAT5.
[267] IL-21 é expressado em células T CD4+ humanas ativadas e em células NKT, e expressão de IL-21 é regulado de modo ascendente em subconjuntos de Th2 e Th 17 de
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96/540 células T auxiliares. O receptor de IL-21 (IL-21R) é expresso na superfície de células T, B e NK e é similar em estrutura aos receptores para outras citocinas do tipo I como IL-2R ou IL-15. IL21R exige a dimerização com cadeia gama comum (yc) a fim de se ligar à IL-21. Quando ligado a IL-21, o receptor de IL-21 atua através da trajetória de Jak/STAT, ativando STAT1, STAT3 e STAT5.
[268] Os receptores de chamariz de ΤΟΡβ (TGF-β—receptor II negativo dominante (DNRII)) bloqueiam a sinalização de ΤΟΡβ competindo com os receptores naturais por ligação de ΤΟΡβ. ΤΟΡβ-DNRII é uma forma truncada sem atividade de quinase de RII que contém o domínio de ligação a ΤΟΡβ extracelular e o domínio transmembranar de RH. ΤΟΡβDNRII se liga ao ligante, mas não fosforila e ativa RI, o que diminui ou elimina, assim, a fosforilação de Smad.
[269] Mutações de ganho de função em IL-7Ra foram identificadas em sujeitos com leucemias linfoblásticas agudas de célula B e T (B-ALL e T-ALL) (Zenatti PP, et al. 2011. Nat Genet 43:932 a 939; Snochat, C. et al. 2011. JExp Med 208:901-908; McElroy, C.A. et al. 2012. PNAS 109(7):2.503 a 2.508). As mutações incluíram inserções e deleções na região Nterminal do IL-7Ra TMD, com quase todas as sequências contendo um resíduo Cys extra e uma mutação SI65 a Cl65. A cisteína resultou na ativação constitutiva do receptor. Algumas das mutações no grupo T-all ativaram JAKL Esses mutantes de IL-7R de ganho de função podem ser usados em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento como um elemento (ou elementos) linfoproliferativo.
[270] Consequentemente, em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é um receptor de IL-7 com mutação. Em outras modalidades, o receptor de IL7 com mutação é constitutivamente ativo, ativando a trajetória JAK-STAT5 na ausência do ligante de citocina. Em ainda outras modalidades, o receptor de IL-7 com mutação compreende uma inserção de 1 a 10 aminoácidos em uma posição entre 237 e 254 que inclui um resíduo de cisteína que inclui a capacidade para ativar constitutivamente a trajetória STAT5. Em algumas modalidades, o receptor de IL-7 mutado é IL-7Ra-insPPCL (representado por SEQ ID NO:82). Ademais, em algumas modalidades fornecidas do elemento linfoproliferativo quimérico (CLE) no presente documento, um ou mais, mas não todos os domínios são de IL-7Ra-insPPCL.
[271] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é um receptor de
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97/540 citocina quimérico, tal como, porém sem limitação, uma citocina aglutinada a seu receptor que ativa típica e constitutivamente a mesma trajetória STAT que um receptor de citocina do tipo selvagem ativado correspondente, tais como STAT3, STAT4 e, nas modalidades ilustrativas, STAT5. Em algumas modalidades, o receptor de citocina quimérico é uma interleucina, ou um fragmento da mesma, aglutinada ou covalentemente ligada a seu receptor cognato, ou um fragmento do mesmo, por meio de um aglutinante. Em algumas modalidades, o receptor de citocina quimérico é IL-7 aglutinado a IL-7Ra. Em outras modalidades, o receptor de citocina quimérico é IL-7 aglutinado a um domínio de IL-7Ra, tal como, por exemplo, o domínio extracelular de IL-7Ra e/ou o domínio transmembranar de IL-7Ra. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é um receptor de citocina que não é aglutinado a uma citocina e, de fato, nas modalidades ilustrativas, fornecido no presente documento, um elemento linfoproliferativo é um receptor de citocina constitutivamente ativo que não é aglutinado a uma citocina. Esses receptores de IL-7 quiméricos ativam típica e constitutivamente STAT5 quando expressos.
[272] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui um elemento linfoproliferativo, em que o elemento linfoproliferativo é uma citocina ou receptor de citocina polipeptídeo ou um fragmento do mesmo compreendendo um domínio de sinalização, o elemento linfoproliferativo pode compreender um polipeptídeo de interleucina covalentemente ligado a uma porção de seu receptor de polipeptídeo de interleucina cognato por meio de um aglutinante. Tipicamente, essa porção do receptor de interleucina cognato inclui uma porção funcional do domínio extracelular capaz de ligar a interleucina citocina e o domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio intracelular é uma porção intracelular do receptor de interleucina cognato. Em algumas modalidades, o domínio intracelular é uma porção intracelular de um receptor de citocina diferente que é capaz de promover a proliferação de linfócito. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é um polipeptídeo de interleucina covalentemente ligado ao seu receptor de polipeptídeo de interleucina cognato de comprimento total por meio de um aglutinante.
[273] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode incluir um receptor de citocina ou um fragmento que inclui um domínio de sinalização do mesmo. Em
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98/540 algumas modalidades, o receptor de citocina pode ser CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF2RB, CSF3R, EPOR, GHR, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR1, IFNGR2, IFNLR1, IL1R1, IL1RAP, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RG, IL2RB, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL6ST, IL7RA, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL12RB1, IL13RA2, IL15RA, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL20RB, IL21R, IL22RA1, IL23R, IL27R, IL31RA, LEPR, LIFR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14 ou TNFRSF18. As modalidades exemplificativas de receptores de citocina quiméricos que incluem domínios intracelulares funcionais dos receptores de citocina listados acima foram testados nos Exemplos 17 e 18 para confirmar que os receptores de citocina quiméricos que incluíam esses domínios intracelulares funcionais poderíam funcionar como elementos linfoproliferativos.
[274] Em certas modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo compreende um receptor de citocina ou um fragmento do mesmo que inclui um domínio de sinalização que ativa uma trajetória de Jak/STAT5. Por exemplo, tal elemento linfoproliferativo pode incluir um domínio intracelular de IL21R, IL27R, IL31RA, LIFR e OSMR. Como mostrado nos experimentos dos Exemplos 17 e 18 e tabelas 7 a 17, os elementos linfoproliferativos quiméricos que incluem domínios intracelulares desses genes foram encontrados dentre os polipeptídeos quiméricos candidatos que induziram a maior magnitude de proliferação em PBMCs cultivadas na ausência de citocinas exógenas como IL-2.
[275] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular que é uma interleucina ou um receptor de interleucina e que foi uma parte de um Construto de Topo identificado nas Bibliotecas IA, 1.1 A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B e/ou 4.1B dos Exemplos 17 e 18 (tabelas 7 a 17). Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular que é um receptor de citocina e que foi uma parte de um Construto de Topo identificado nas Bibliotecas IA, 1.1 A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1 A, 3B, 3.1B, 4B e/ou 4.1B dos Exemplos 17 e 18 (tabelas 7 a 17). Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular que inclui pelo menos um motivo de IT AM e que foi uma parte de um Construto de Topo identificado nas Bibliotecas ΙΑ, 1.1A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B e/ou 4.1B dos Exemplos 17 e 18 (tabelas 7 a 17).
[276] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode
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99/540 compreender um domínio intracelular de IL7R, IL12RB1, IL15RA ou IL27RA, que esteve presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitou a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[277] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular dos receptores de citocina CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, GHR, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL1RL1, IL2RA, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17RB, IL18R1, IL18RAP, IL20RB, IL22RA1, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14 ou TNFRSF18, que estiveram presentes em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[278] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo compreende um domínio intracelular de CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A ou FCGR2C, que inclui pelo menos um motivo de IT AM e esteve presente nos construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitou a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[279] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo nesse parágrafo, que foi mostrado nos exemplos 17 e 18 como sendo ativo em construtos com apenas um único domínio intracelular, pode ser o domínio intracelular de um elemento linfoproliferativo com dois ou mais domínios intracelulares ou, em modalidades ilustrativas, um único domínio intracelular, isto é, o elemento linfoproliferativo não compreende dois ou mais domínios intracelulares. Em modalidades ilustrativas, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo compreende um domínio de CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, MYD88, TNFRSF14, ou TNFRSF18, que está presente nos construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 como domínios de sinalização
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100/540 intracelular únicos (tabelas 22 e 23). Em modalidades ilustrativas, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo compreende um domínio de IL7R ou IL12RB1, que está presente nos construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 (tabelas 22 e 23). Em algumas modalidades, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo com um único domínio intracelular pode ser um receptor de citocina. Em modalidades ilustrativas, o receptor de citocina em um elemento linfoproliferativo com um único domínio intracelular compreende um domínio de CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, TNFRSF14 ou TNFRSF18, que está presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 (tabelas 22 e 23). Em algumas modalidades, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo pode incluir pelo menos um motivo de ITAM. Em modalidades ilustrativas, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo que inclui pelo menos um motivo de ITAM compreende um domínio de FCGR2A, que estava presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 (Tabela 22).
[280] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio coestimulante de CD27, CD28, 0X40 (também chamado de TNFRSF4), GITR (também chamado de TNFRSF18) ou HVEM (também chamado de TNFRSF14), que está presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[281] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser um dos construtos M024-S190-S047, M025-S050-S197, M036-S170-S047, M012-S045-S048, M049S194-S064, M025-S190-S050, M025-S190-S05, E013-T041-S186-S051, E013-T028-S186S051, E014-T015-S186-S051, E011-T016-S186-S050, E011-T073-S186-S050 ou E013-T011S186-S211, todos os quais estimularam a proliferação de linfócitos em repouso após a transdução como mostrado no Exemplo 21 (Figuras 35 e 36). Em certas modalidades, os elementos
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101/540 linfoproliferativos compreendem um domínio extracelular de CSF3R, IL3RA, ICOS, CRLF, CSF2RA, LIFR ou CD40; um primeiro domínio intracelular de MyD88, CD40 ou MPL e/ou um segundo domínio intracelular de CD27 ou MyD88.
[282] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser o construto E013-T041-S186-S051, que estimulou a proliferação de linfócitos em repouso após a transdução com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação que exibe UCHTlscFvFc-GPI como mostrado e analisado no Exemplo 22 (Figuras 38A e B). Em outras modalidades, o elemento linfoproliferativo é IL7-IL7RA-IL2RB, como mostrado e analisado no Exemplo 22.
[283] Como detalhado no Exemplo 17, para as Bibliotecas IA e 1.1 A, os construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, IL1RL1, IL6R, IL31RA, TNFRSF4 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas IA e 1.1 A (Tabela 19).
[284] Como detalhado no Exemplo 17, para as Bibliotecas 2B e 2.1B, os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, FCER1G, FCGR2C, IFNGR2, GHR, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RB, IL22RA1, TNFRSF14 ou TNFRSF9 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20).
[285] Como detalhado no Exemplo 18, para as Bibliotecas 3A e 3.1 A, os construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, CSF2RA, FCGR2A, MPL, OSMR, TNFRSF4 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1A (Tabela 21).
[28 6] Como detalhado no Exemplo 18, para as Bibliotecas 3B e 3.1B, os construtos com os domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1RL1, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL18RAP, IL20RB, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22).
[287] Como detalhado no Exemplo 18, para as Bibliotecas 4B e 4.1B, os
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102/540 construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL2RA, IL3RA, IL2RG, IL6R, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL31RA, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, MPL, OSMR, TNFRSF4, TNFRSF9 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23).
[288] Em certas modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo compreende um domínio intracelular de CD40, MPL e IL2Rb, que são demonstrados nos Exemplos no presente documento para promover a proliferação de PBMC.
[289] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser diferente de um receptor de citocina. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo diferente de um receptor de citocina pode incluir um domínio de sinalização intracelular de CD2, CD3D, CD3G, CD3Z, CD4, CD8RA, CD8RB, CD28, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C ou ICOS. As modalidades exemplificativas de elementos linfoproliferativos quiméricos que incluem esses genes mencionados são fornecidos nos Exemplos 17 e 18 e as tabelas mencionadas nos mesmos.
[290] Em algumas modalidades, CLE é diferente de IL-15 aglutinado ao receptor de IL-2/IL-15.
[291] Em alguns dos métodos e composições revelados no presente documento, a expressão do elemento linfoproliferativo é induzida por e pode até mesmo depender da ligação de um composto a um elemento de controle (como discutido em outra parte no presente documento) que, em modalidades não limitantes, é um riboswitch. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é expressado de um promotor ativo em uma célula T e/ou uma célula NK. Para os métodos e composições fornecidos no presente documento, um técnico versado irá reconhecer que são conhecidos promotores que são ativos em células T e/ou células NK e podem ser usados para expressar um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado ou um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, ou qualquer componente do mesmo. Em modalidades ilustrativas, tal promotor não é ativo em uma linhagem celular de empacotamento, como as linhagens de empacotamento reveladas no presente documento. Em algumas modalidades, o promotor é o promotor EFla ou o promotor de vírus de célula-tronco murina (MSCV) (Jones et al., Human Gene Therapy (2009) 20: 630-40). Em modalidades
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103/540 ilustrativas, o promotor é o promotor zeta CD3 específico para célula T.
[292] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é restrito ao microambiente. Por exemplo, o elemento linfoproliferativo pode ser um receptor mutado que liga sua respectiva citocina de modo diferencial em condições aberrantes versus fisiológicas. Por exemplo, um IL-7R que pode se ligar a IL7 de modo mais forte em um ambiente de tumor do que um ambiente fisiológico normal pode ser usado.
[293] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é fundido a um domínio de reconhecimento ou eliminação. Tais domínios de reconhecimento ou eliminação são revelados em mais detalhes no presente documento. Tal fusão fornece a vantagem, especificamente quando um elemento linfoproliferativo truncado ou mutado é usado, de exigir menos polinucleotídeos no genoma retroviral. Isso é importante, em modalidades ilustrativas fornecidas no presente documento, visto que ajuda a permitir que mais ácidos nucleicos que codificam elementos funcionais sejam incluídos no genoma retro viral e visto que adiciona um mecanismo através do qual as células que expressam o elemento linfoproliferativo podem ser exterminadas se sua proliferação não for mais desejada ou for prejudicial a um organismo.
[294] Em algumas modalidades, um elemento linfoproliferativo, incluindo um CLE, compreende um domínio de ativação intracelular como revelado acima no presente documento. Em algumas modalidades ilustrativas um elemento linfoproliferativo é um CLE que compreende um domínio de ativação intracelular que compreende um domínio contendo ITAM. Assim, o CLE pode compreender um domínio de ativação intracelular que tem pelo menos 80%, 90%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com o CD3Z, CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, DAP12, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C. Os domínios de DAP10/CD28 ou ZAP70 fornecidos no presente documento. Em certas modalidades ilustrativas, o domínio de ativação intracelular é um domínio contendo ITAM de CD3D, CD3G, CD3Z, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A ou FCGR2C. CLEs compreendendo esses domínios de ativação intracelulares são demonstrados nos Exemplos 17 e 18 no presente documento e nas tabelas associadas 18 a 23, como sendo eficazes na promoção da proliferação de PBMCs ex vivo em culturas na ausência de citocinas exógenas como IL-2 exógeno. Em algumas modalidades, são fornecidos no presente documento os CLEs compreendendo um domínio intracelular de CD3D, CD3G, CD3Z, CD79A, FCER1G.
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104/540 [295] Em algumas modalidades, um ou mais domínios de um elemento linfoproliferativo é fundido a um domínio coestimulante e/ou um domínio de ativação intracelular de um CAR. Um elemento linfoproliferativo quimérico como revelado no presente documento, não é um receptor de antígeno quimérico (CAR) visto que não compreende um ASTR. Entretanto, em algumas modalidades, um ou mais domínios intracelulares de um elemento linfoproliferativo pode ser parte do mesmo polipeptídeo que um CAR ou pode ser fundido e opcionalmente conectado de modo funcional a alguns componentes de CARs. Por exemplo, um elemento linfoproliferativo pode ser fundido a uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR) e ativado através da ligação do ASTR ao seu antígeno. Ainda em outras modalidades, um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode incluir um ASTR, um domínio de ativação intracelular (como um domínio de sinalização zeta CD3), um domínio coestimulante e um domínio linfoproliferativo. Os detalhes adicionais a respeito de domínios coestimulantes, domínios de ativação intracelulares, ASTRs e outros domínios de CAR, são revelados em outra parte no presente documento.
[296] Em modalidades ilustrativas no presente documento, um elemento de sobrevivência de célula T e/ou célula NK é introduzido em uma célula T e/ou célula NK em repouso, tipicamente através da transdução da célula T e/ou célula NK em repouso com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação cujo genoma codifica o elemento de sobrevivência de célula T e/ou célula NK como parte de um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. Em algumas modalidades, um elemento linfoproliferativo também é um elemento de sobrevivência de célula T e/ou célula NK. Como discutido acima, alguns dos elementos linfoproliferativos, não apenas promovem a proliferação, as promovem a sobrevivência celular também. Em algumas modalidades, o motivo de célula T e/ou célula sobrevivente NK não é um elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades, o motivo de sobrevivência de célula T e/ou célula NK pode ser um motivo de sobrevivência de célula T CD28 ou um motivo de sobrevivência de célula CD 137. Tais motivos de sobrevivência de célula T podem ser encontrados em polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados que incluem um ASTR, como um scFv. Em uma modalidade ilustrativa, o motivo de sobrevivência de célula T é um motivo de sobrevivência de célula T CD28 ou um motivo de CD 137 conectado a um scFv através de um domínio transmembranar de CD 8 a ou um domínio transmembranar CD28. Em
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105/540 certas modalidades, o dito domínio de sinalização intracelular compreende uma sequência de polipeptídeos compreendendo um motivo de ativação do imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM). Em uma certa modalidade, a dita sequência de polipeptídeos é um domínio de sinalização de €Ό3ζ.
[297] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo não é um polipeptídeo, mas em vez disso, compreende um RNA inibidor. Em algumas modalidades, os métodos, usos, composições e produtos de processos de acordo com qualquer aspecto no presente documento incluem tanto um elemento linfoproliferativo compreendendo um RNA inibidor quanto um elemento linfoproliferativo que é um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. Em modalidades em que um elemento linfoproliferativo é um RNA inibidor, tal RNA inibidor pode ser um miRNA que estimula a trajetória de STAT5 tipicamente através da potencialização de ativação de STAT5 através da degradação ou causando a regulação descendente de um regulador negativo na trajetória de SOCS. Em algumas modalidades, o miRNA é direcionado às proteínas de codificação de mRNA que afetam a proliferação como, mas sem limitações, ABCG1, SOCS1, TGFbR2, SMAD2, cCBL e PD1. Em modalidades ilustrativas, como exemplificado no presente documento, tal RNA inibidor (por exemplo, miRNAs) pode ser localizado em introns em células de empacotamento e/ou uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação genoma e/ou um vetor retroviral, tipicamente com expressão acionada por um promotor que é ativo em uma célula T e/ou célula NK. Sem se ater à teoria, acredita-se que a inclusão de introns em unidade de transcrição são resulte em expressão e/ou estabilidade superiores de transcrições. Assim, a capacidade para colocar miRNAs dentro de introns de um genoma retroviral se soma aos ensinamentos da presente revelação que superam os desafios na técnica anterior de tentar obter atividades máximas nas restrições de tamanho de um genoma retroviral, como um genoma de lentivírus. Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 miRNAs, em modalidades ilustrativas, entre 2 e 5, por exemplo, 4 miRNAs, um ou mais dos quais, cada um se liga a ácidos nucleicos que codificam um ou mais dentre ABCG1, SOCS1, TGFbR2, SMAD2, cCBL e PD1 podem ser incluídos no genoma retroviral recombinante e entregues a uma célula-alvo, por exemplo, as células T e/ou células NK, com o uso de métodos fornecidos no presente documento. De fato, como fornecido no presente documento 1, 2, 3 ou 4 miRNAs podem ser entregues em um único íntron como o íntron EFla.
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106/540 [298] ABCG1 é um transportador de cassete de ligação a ATP que regula negativamente a proliferação de linfócito periférico e de timócito (Armstrong et al. 2010. J Immunol 184(1):173 a 183).
[299] SOCS1 é um membro da família dos SOCS (supressor de sinalização de citocina) de reguladores negativos de transdução de sinal de citocina que inibem a trajetória de Jak/Stat como STAT5. SOCS1 também é conhecido como JAB (proteína de ligação de Janus Cinase), SSI-1 (inibidor-1 de Stat induzido por Stat) e TIP3 (proteína de interação de Tec).
[300] TGFbR2 é um membro da família de cinase de proteína de serina/treonina que se liga a TGF-β, formando um complexo que fosforila as proteínas que, então, entram no núcleo e regulam a transcrição de genes relacionados à proliferação.
[301] SMAD2 media o sinal do fator de crescimento de transformação (TGF)β e regula múltiplos processos celulares, como a proliferação, apoptose e diferenciação celular.
[ 3 02 ] cCBL é uma E3 ubiquitina ligase que inibe a sinalização de TCR pela desfosforilação e inativação de ZAP-70 e através da internalização do TCR.
[303] PD1 (CD279) é um receptor de superfície celular expresso nas células T e células ProB. PD-1 liga-se a dois ligantes, PD-L1 e PD-L2. A sinalização através de PD-1 funciona para evitar a ativação das células.
[304] Em algumas modalidades, no presente documento o elemento linfoproliferativo é um polipeptídeo compreendendo a região intracelular de qualquer um dos genes da Tabela 18. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo compreende ou é um domínio intracelular identificado nos polipeptídeos quiméricos na Tabela 18. Nessas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser um polipeptídeo que é um polipeptídeo quimérico (consultar CLEs abaixo), ou não é um CLE, mas compreende ou é um domínio intracelular de um gene identificado na posição de P3 (primeiro domínio intracelular) da Tabela 18. A Tabela 18 identifica construtos de CLE que promoveu a proliferação celular de PBMCs entre o dia 7 e o último dia, em que um segundo domínio intracelular não estava presente no construto. Em algumas submodalidades desta modalidade, o elemento linfoproliferativo é um polipeptídeo quimérico (isto é, um CLE - consultar abaixo) que inclui uma combinação do domínio transmembranar e do domínio intracelular, com ou sem um domínio extracelular compreendendo um motivo de dimerização.
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107/540 [305] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo compreende MPL, ou é MPL ou uma variante e/ou fragmento do mesmo, incluindo uma variante e/ou fragmento que inclui pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% do domínio intracelular de MPL, com ou sem uma domínio de transmembrana e/ou extracelular de MPL e/ou tem pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio intracelular de MPL, com ou sem uma domínio de transmembrana e/ou extracelular de MPL, em que a variante e/ou fragmento retém a capacidade de promover a proliferação celular de PBMCs e, em algumas modalidades, células T. Em algumas modalidades, um fragmento de MPL incluído nas composições e métodos no presente documento tem e/ou retém um domínio de ligação de JAK-2. Em algumas modalidades, um fragmento de MPL incluído no presente documento tem ou retém a capacidade para ativar um STAT. O domínio intracelular completo de MPL é SEQ ID NO:491 (parte SI86 nas tabelas 7 a 18). MPL é o receptor para trombopoietina. Várias citocinas como a trombopoietina e EPO são chamadas na literatura e no presente documento como um hormônio ou uma citocína.
[306] Em algumas modalidades, que fornece aspectos separados da presente revelação, fornecida no presente documento, são polipeptídeos quiméricos que são elementos linfoproliferativos quiméricos (CLEs), assim como polinucleotídeos isolados e sequências de ácido nucleico que codificam os mesmos. Os CLEs exemplificativos são ilustrados nas Figuras 30 a 33. Os CLEs no presente documento promovem a proliferação celular de células T e/ou células NK e também podem promover opcionalmente a sobrevivência de células T e/ou células NK. Alguns CLEs promovem a proliferação e opcionalmente, ainda, a sobrevivência de outros tipos de PBMCs, por exemplo, células B. As modalidades fornecidas no presente documento que incluem as sequências de ácido nucleico que codificam um CLE e um CAR podem ser chamadas no presente documento de modalidades de polinucleotídeo de CAR de CLE para conveniência de elaboração. Em algumas modalidades, os CLEs podem incluir um domínio transmembranar e um primeiro domínio intracelular. Ademais, em modalidades ilustrativas, como mostrado nas Figuras 30 a 33, os CLEs incluem um domínio extracelular e/ou um segundo domínio intracelular (e, em modalidades adicionais, terceiro, quarto, etc. domínios intracelulares). Os polipeptídeos quiméricos no presente documento são quiméricos visto que pelo menos um domínio é de um polipeptídeo diferente do que pelo menos um dos outros domínios e tais quiméricos não são
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108/540 encontrados naturalmente em um organismo sem intervenção humana. Alguns CLEs incluem um ligante para um receptor e alguns CLEs não incluem um ligante para um receptor.
[307] Sem se ater à teoria, tais CLEs foram projetados para promover a proliferação e opcionalmente a sobrevivência celular em células B, células NK e/ou células T de uma maneira constitutiva (isto é, sem a exigência de ligação de ligante para ativação). Nenhum dos CLEs são encontrados na natureza, e muitos dos CLEs têm componentes que não são geralmente expressados em células B, células T e/ou células NK in vivo e/ou alguns CLEs candidatos não são geralmente conhecidos por promover especificamente a proliferação celular e/ou a sinalização de sobrevivência celular em células B, células T e/ou células NK. Por exemplo, o MPL geralmente não é expressado em células B, células T e/ou células NK. Surpreendentemente, novos CLEs foram identificados através da triagem de um grande número de polipeptídeos quiméricos candidatos como apontados nos Exemplos 17 e 18, que promoveram a proliferação celular de PBMC. Tais CLEs ajudam a satisfazer a antiga necessidade de mecanismos de identificação de estimular a proliferação e opcionalmente a sobrevivência também, de células B, células T e/ou células NK, como seria benéfico para tecnologias clinicamente relevantes, como CAR-T e células T que são geneticamente modificadas para expressar uma TCR definida. Assim, acredita-se que alguns CLEs irão fornecer uma célula T e/ou célula NK a capacidade para expandir in vivo sem a necessidade de lifodeletar o hospedeiro.
[308] Os elementos linfoproliferativos quiméricos fornecidos no presente documento e polinucleotídeos isolados e ácidos nucleicos que codificam o mesmo podem ser incluídos em qualquer aspecto fornecido no presente documento que inclui um elemento linfoproliferativo. Por exemplo, um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode ser, ou pode incluir um CLE em aspectos fornecidos no presente documento que incluem uma ou mais unidades transcricionais que codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado regulado por um elemento de controle. Ademais, os aspectos separados da invenção são fornecidos, os quais incluem especificamente um CLE. Por exemplo, tais aspectos incluem polipeptídeos linfoproliferativos quiméricos isolados, polinucleotídeos isolados e sequências de ácido nucleico que codifica os mesmos e vetores, incluindo vetores de plasmídeos, virais e retrovirais incluindo tais sequências de ácido nucleico ou polinucleotídeos isolados. Tais aspectos incluem adicionalmente, os métodos para transduzir
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109/540 ou transfectar PBMCs, como células B ou especificamente células T e células NK, com os polinucleotídeos isolados e vetores compreendendo os mesmos. Tais células podem ser isoladas, células inalteradas ou os mesmos podem ser células que foram modificadas como células que são geneticamente modificadas, como para expressar uma TCR definida ou CAR-células T.
[309] Em algumas modalidades, CLEs incluem tanto uma porção extracelular quanto uma porção de transmembrana que é da mesma proteína, em modalidades ilustrativas, o mesmo receptor, em que um dos mesmos, em modalidades ilustrativas, é um mutante, formando, assim, um domínio extracelular e transmembranar. Esses domínios podem ser de um receptor de citocina ou um mutante do mesmo ou um receptor de hormônio ou um mutante do mesmo, em algumas modalidades, que foi relatado como sendo constitutivamente ativo quando expressado pelo menos em alguns tipos de célula. Em modalidades ilustrativas, tais domínios extracelulares e transmembranares não incluem uma região de ligação de ligante. Acredita-se que tais domínios não se ligam a um ligante quando presente em CLEs e expressado em células B, células T e/ou células NK. As mutações em tais mutantes de receptor podem ocorrer na região de transmembrana ou na região de justamembrana extracelular. Sem se ater à teoria, uma mutação em pelo menos alguns domínios extracelulares-transmembranares de CLEs fornecidos no presente documento são responsáveis por sinalizar o CLE na ausência de ligante, unindo-se as cadeias de ativação que não são normalmente unidas, ou alterando-se a confirmação de um domínio transmembranar e/ou intracelular ligado.
[310] Um aspecto que utiliza tais domínios transmembranares de mutantes de receptor, fornecido no presente documento, é um polinucleotídeo isolado que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi, (a) um domínio extracelular e transmembranar de um receptor de citocina ou um receptor de hormônio, em que pelo menos um dentre o domínio extracelular e o domínio transmembranar compreende uma mutação que é encontrada em um mutante constitutivamente ativo do receptor de citocina e em que a sequência extracelular não se liga a um ligante do receptor de citocina; e
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110/540 (b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de um gene que tem um primeiro domínio intracelular e opcionalmente um segundo domínio de um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 7 a 11, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de células B, células T e/ou células NK.
[311] A região extracelular de tais domínios extracelulares e transmembranares nessas modalidades é tipicamente suficientemente longa para formar um aglutinante, em modalidades ilustrativas, um aglutinante flexível entre um domínio transmembranar e outra região de peptídeo funcional, como um domínio de liberação, que em algumas modalidades, é ligado à terminação amino da região extracelular. Consequentemente, a região extracelular, quando presente para formar um domínio extracelular e transmembranar, pode ter entre 1 e 1.000 aminoácidos, e tem tipicamente entre 4 e 400 aminoácidos, entre 4 e 200 aminoácidos, entre 4 e 100 aminoácidos, entre 4 e 50 aminoácidos, entre 4 e 25 ou entre 4 e 20 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, a região extracelular é GGGS para um domínio extracelular e transmembranar desse aspecto da invenção.
[312] O domínio transmembranar, como parte de modalidades que incluem um domínio extracelular e transmembranar como uma parte, por exemplo, como mostrado nas Bibliotecas IA, 1.1 A, 1.1B, 2B e 2.1B do Exemplo 17, ou como parte das modalidades que incluem um motivo de dimerização extracelular, como mostrado nas Bibliotecas 3A, 3B, 3.1 A, 3.1B, 4B e 4.1B do Exemplo 18, como discutido em maiores detalhes abaixo, são tipicamente pelo menos suficientemente longos para cruzar uma membrana de plasma. Consequentemente, os domínios transmembranares ou regiões de transmembrana de domínios extracelulares e transmembranares, podem ter entre 10 e 250 aminoácidos e mais tipicamente têm pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e podem ter, por exemplo, entre 15 e 100, 15 e 75, 15 e 50, 15 e 40 ou 15 e 30 aminoácidos.
[313] Os extracelulares e transmembranares exemplificativos para CLEs das modalidades que incluem tais domínios, em modalidades ilustrativas, são regiões extracelulares, tipicamente menos de 30 aminoácidos dos domínios extracelulares proximais à membrana juntamente com domínios transmembranares de receptores mutantes que foram relatados como sendo constitutivos, que não é exigida ligação de ligante para a ativação de um domínio intracelular associado. Em modalidades ilustrativas, tais domínios extracelulares e
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111/540 transmembranares incluem IL7RA Ins PPCL, CRLF2 F232C, CSF2RB V449E, CSF3R T640N, EPOR L251C I252C, GHR E260C I270C, IL27RA F523C e MPL S505N. Os exemplos adicionais não limitantes de tais domínios extracelulares e transmembranares são fornecidos na Tabela 6 e exemplificados no Exemplo 17 e nas tabelas correspondentes. Em algumas modalidades, o domínio extracelular e transmembranar não compreende mais de 10, 20, 25 30 ou 50 aminoácidos consecutivos que são idênticos quanto à sequência a uma porção do domínio extracelular e/ou transmembranar de IL7RA ou um mutante do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio extracelular e transmembranar é diferente de IL7RA Ins PPCL. Em algumas modalidades, o extracelular e transmembranar não compreende mais de 10, 20, 25 30 ou 50 aminoácidos consecutivos que são idênticos quanto à sequência a uma porção do domínio extracelular e/ou transmembranar de IL15R.
[314] Os domínios transmembranares exemplificativos adicionais são fornecidos no Exemplo 18. Esses domínios transmembranares em modalidades ilustrativas são de proteínas transmembranares tipo I.
[315] Consequentemente, é fornecido no presente documento, em um aspecto, um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar tipo I; e (b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de um gene que tem um primeiro domínio intracelular de um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 12 a 17, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de células B, células T e/ou células NK.
[316] Em modalidades ilustrativas, o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs, por exemplo, células B e/ou células NK e/ou, em modalidades ilustrativas, células T. Como mostrado no Exemplo 18, tais polipeptídeos quiméricos são capazes de promover a proliferação celular de PBMCs na ausência de exposição das PBMCs às citocinas exógenas como IL-2, IL-15 ou IL-7 durante o cultivo, por exemplo, na ausência da adição de IL2 ao meio de cultura de PBMCs (por exemplo, células B, células T ou células NK) que expressam
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112/540 um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo quimérico. Como ilustrativo no Exemplo 18, para tais modalidades, o IL-2 pode ser adicionado durante a transdução de PBMCs, mas não em cultura subsequente. Por exemplo, os polipeptídeos quiméricos revelados no presente documento são elementos linfoproliferativos, visto que são capazes de promover a proliferação celular e opcionalmente a sobrevivência celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas, as células T, sem adicionar IL-2 durante a cultura de PBMCs (por exemplo, células T) após o dia 1, 2, 3, 4, 5 ou 7 de cultura, opcionalmente, após a transdução das PBMCs com um ácido nucleico que codifica o elemento linfoproliferativo quimérico. O Exemplo 21 fornece outro exemplo de um método que pode ser usado para identificar e analisar os elementos linfoproliferativos. Tal análise pode incluir, por exemplo, medir a atividade linfoproliferativa relativa de tais elementos linfoproliferativos, por exemplo, analisando-se a magnitude de enriquecimento fornecido por linfócitos geneticamente modificados expressando tais elementos linfoproliferativos comparados com os linfócitos de controle que não expressam tais elementos linfoproliferativos.
[317] Em uma modalidade desse aspecto, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um domínio extracelular e, em modalidades ilustrativas, o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização. Em modalidades ilustrativas desse aspecto, o domínio extracelular compreende um zíper de leucina. Em algumas modalidades, o zíper de leucina é de um polipeptídeo jun, por exemplo, c-jun. Em certas modalidades, o polipeptídeo c-jun é a região de polipeptídeo c-jun de ECD-11.
[318] Em modalidades de qualquer um desses aspectos e modalidades em que o domínio transmembranar é uma proteína transmembranar tipo I, o domínio transmembranar pode ser um receptor de fator de crescimento tipo I, um receptor de hormônio, um receptor de célula T ou um receptor de família de TNF. Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos e modalidades em que o polipeptídeo quimérico compreende um domínio extracelular e em que o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização, o domínio transmembranar pode ser um receptor de citocina tipo I, um receptor de hormônio, um receptor de célula T ou um receptor de família de TNF.
[319] Os domínios transmembranares exemplificativos incluem qualquer domínio transmembranar que foi usado no Exemplo 18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é de CD4, CD8RB, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2C, GHR,
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ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IFNGR2, IL1R1, IL1RAP, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6ST, IL7RA, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL22RA1, IL31RA, LEPR, PRLR e TNFRSF8 ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é de CD40, ICOS, FCGR2C, PRLR, IL3RA ou IL6ST. Em algumas modalidades, a transmembrana é o domínio transmembranar específico fornecido para esses genes nos construtos de qualquer uma ou mais das tabelas 12 a 17, ou um domínio transmembranar a partir de qualquer um dos construtos nos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados dessas tabelas. Em modalidades ilustrativas, o domínio transmembranar é de CD40 ou ICOS, como exemplos não limitantes, os domínios transmembranares para esses genes fornecidos na Tabela 6, ou um fragmento dos mesmos que retém a capacidade de ser transmembrana e/ou mutantes da mesma que são conhecidos para promover a atividade de sinalização constitutiva em certos tipos de célula.
[320] Os domínios transmembranares exemplificativos desse aspecto são mostrados como P2 nas tabelas 12 a 17. Para a Biblioteca 3A, os domínios transmembranares (P2) de CD40, CD8B, CRLF2, CSF2RA, GCGR2C, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IL10RB, IL18R1, IL18RAP, IL3RA, LEPR e PRLR ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização constitutiva em certos tipos de célula, se tais mutantes estão presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18, quando encontrados na posição de domínio transmembranar (P2) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um domínio transmembranar derivado de tal gene. Nas triagens fornecidas nos Exemplos 17 e 18, as células foram transduzidas com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação contendo uma biblioteca e, então, PBMCs alimentadas ou PBMCs não alimentadas, como discutido nos Exemplos 17 e 18. As triagens em que as células foram PBMCs alimentadas são identificadas com um “A” após o número da biblioteca, por exemplo, Biblioteca 1A e as triagens em que as células foram PBMCs não alimentadas são identificadas com um “B” após o número da biblioteca, por exemplo, Biblioteca 1.1B. Adicionalmente, as triagens identificadas como bibliotecas contendo “.1”, por exemplo, Biblioteca LIA, foram realizadas de uma maneira
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114/540 idêntica às triagens da biblioteca correspondente sem o “.1”, por exemplo, a Biblioteca 1.1 A foi uma triagem de repetição da Biblioteca IA. Para a Biblioteca 3B, os domínios transmembranares de CD40, ICOS, CSF2RA, IL18R1, IL3RA e TNFRSF14, ou mutantes dos mesmos, que são conhecidos por promover a atividade de sinalização constitutiva em certos tipos de célula, se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18, foram mais capazes de promover a proliferação celular. Para a Biblioteca 4B, os domínios transmembranares de IL3RA, CSFR2RA, IL18R1, CD8B, CD40, ICOS, ou mutantes dos mesmos, que são conhecidos por promover a atividade de sinalização constitutiva em certos tipos de célula, se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18, foram mais capazes de promover a proliferação celular. Em modalidades ilustrativas, um domínio transmembranar em um CLE fornecido no presente documento é um domínio transmembranar de CD40 e ICOS. Exemplos de domínios transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estiveram presentes em construtos que promoveram a proliferação celular para as Bibliotecas 3A, 3B, 3.1A, 3.1B, 4B e 4.1B são fornecidos nas tabelas fornecidas no Exemplo 18.
[321] Em algumas modalidades de qualquer aspecto no presente documento, um polipeptídeo quimérico compreende um domínio transmembranar identificado em qualquer um dos construtos mostrados nas tabelas 12 a 17 diferentes de um mutante de domínio transmembranar V449E de CSF2RB.
[ 322 ] Em algumas modalidades, o domínio extracelular e transmembranar é a proteína viral LMP1 ou um mutante e/ou fragmento da mesma. LMP1 é uma proteína transmembranar multiabrangente que é conhecida por ativar a sinalização celular independente de ligante quando alvejado para balsas lipídicas ou quando fundida a CD40 (Kaykas et al. EMBO J. 20: 2641 (2001)). Um fragmento de LMP1 é tipicamente longo o suficiente para abranger uma membrana de plasma e para ativar um domínio (ou domínios) intracelular ligado. Por exemplo, o LMP1 pode ser entre 15 e 386, 15 e 200, 15 e 150, 15 e 100, 18 e 50, 18 e 30, 20 e 200, 20 e 150, 20 e 50, 20 e 30, 20 e 100, 20 e 40 ou 20 e 25 aminoácidos. A mutante e/ou fragmento de LMP1, quando incluído em um CLE fornecido no presente documento, retém sua capacidade para ativar um domínio intracelular. Ademais, se estiver presente, o domínio extracelular inclui pelo menos 1, mas tipicamente pelo menos 4 aminoácidos e é tipicamente ligado a outro polipeptídeo funcional, como um domínio de liberação, por exemplo, um eTag.
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115/540 [323] Em outras modalidades de CLEs fornecidas no presente documento, o domínio extracelular inclui uma porção química de dimerização. Muitas químicas de dimerização diferentes reveladas no presente documento podem ser usadas para essas modalidades. Em modalidades ilustrativas, as porções químicas de dimerização são capazes de homodimerização. Sem se ater à teoria, as porções químicas de dimerização podem fornecer uma função de ativação nos domínios intracelulares conectados às por meio de domínios transmembranares. Tal ativação pode ser fornecida, por exemplo, mediante a dimerização de uma porção química de dimerização, que pode causar uma alteração na orientação de domínios intracelulares conectados ao mesmo por meio de um domínio transmembranar ou que pode fazer com que os domínios intracelulares entrem em proximidade. Um domínio extracelular com uma porção química de dimerização também pode servir uma função de conectar uma etiqueta de reconhecimento a uma célula que expressa CLE. Em algumas modalidades, o agente de dimerização pode ser localizado de modo intracelular em vez de extracelular. Em algumas modalidades, mais de um ou múltiplos dos domínios de dimerização podem ser usados.
[324] Os domínios extracelulares para as modalidades em que os domínios extracelulares têm um motivo de dimerização são longos o suficiente para formar dímeros como dímeros de zíper de leucina. Assim, os domínios extracelulares que incluem uma porção química de dimerização podem ter de 15 a 100, 20 ato 50, 30 a 45 ou 35 a 40 aminoácidos, em modalidades ilustrativas, é uma porção de c-Jun de um domínio extracelular de c-Jun fornecido na Tabela 6. Os domínios extracelulares de polipeptídeos que incluem uma porção química de dimerização podem não reter outras funcionalidades. Por exemplo, para as modalidades de zíper de leucina, tais zíperes de leucina são capazes de formar dímeros, visto que retêm um motivo de leucinas afastadas a 7 resíduos ao longo de uma hélice alfa. Entretanto, as porções químicas de zíper de leucina de certas modalidades de CLEs fornecidas no presente documento podem reter ou podem não reter sua função de ligação de DNA.
[325] Um domínio extracelular exemplificativo desse tipo, é um domínio de zíper de leucina de uma proteína de Jun, como c-Jun. Por exemplo, um domínio extracelular pode ser uma variante de c-Jun encontrado em NM_002228_3 (Tabela 6). Tal domínio extracelular foi usado nos construtos discutidos no Exemplo 18.
[326] Um espaçador de entre 1 e 4 resíduos de alanina pode ser incluído em
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CLEs entre o domínio extracelular que tem uma porção química de dimerização e o domínio transmembranar. Sem se ater à teoria, acredita-se que o espaçador de alanina afete a sinalização dos domínios intracelulares conectados à região extracelular de zíper de leucina por meio do domínio transmembranar através da alteração da orientação dos domínios intracelulares.
[327] O primeiro e o segundo domínios intracelulares de CLEs fornecidos no presente documento são domínios de sinalização intracelulares de genes que são conhecidos em pelo menos alguns tipos de célula para promover a proliferação, a sobrevivência (antiapopótica) e/ou fornecer um sinal coestimulante que aprimora um estado de diferenciação, potencial proliferativo ou resistência à morte celular. Assim, esses domínios intracelulares podem ser domínios intracelulares de elementos linfoproliferativos e domínios coestimulantes fornecidos no presente documento. Alguns dos domínios intracelulares de polipeptídeos quiméricos candidatos são conhecidos por ativar sinalização de JAK1/JAK2 e STAT5. Os genes e domínios intracelulares dos mesmos que são encontrados em um primeiro domínio intracelular são iguais ao segundo domínio intracelular, exceto pelo fato de que, se o primeiro e o segundo domínios intracelulares forem idênticos, então, pelo menos um, e tipicamente ambos o domínio transmembranar e o domínio extracelular não são do mesmo gene.
[328] Os domínios intracelulares exemplificativos incluem aqueles dos construtos listados nas tabelas 7 a 11. Os domínios intracelulares exemplificativos desses genes que foram determinados empiricamente como ativos no experimento do Exemplo 17 são fornecidos nas localizações do primeiro domínio intracelular (P3) e do segundo domínio intracelular (P4) das tabelas fornecidas no Exemplo 17 e como adicionalmente listado nessa seção abaixo. Os domínios intracelulares ilustrativos identificados nas compatibilidades principais para a triagem do Exemplo 17 incluíram CD40, CSF2RA, IFNAR1, IL1RAP, IL4R, IL6ST, IL11RA, IL12RB2, IL17RA, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL21R, IL23R, MPL e MyD88. Os domínios intracelulares ilustrativos identificados nas compatibilidades principais para a triagem do Exemplo 18 incluíram CD40, LEPR, MyD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R ou CSF2RA. Em certas modalidades ilustrativas, o primeiro domínio intracelular é MPL, LEPR, MyD88 ou IFNAR2. Para essas certas modalidades ilustrativas, os domínios do segundo domínio intracelular (P4) exemplificativos não limitantes são aqueles de genes que são ligados ao primeiro domínio intracelular (P3) correspondente MPL, LEPR, MyD88, IFNAR2, CD40,
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CD79B, ou CD27 fornecido nas tabelas 12 a 17, incluindo, em alguns exemplos não limitantes, o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares para aqueles genes fornecidos nessas tabelas. Para essas certas modalidades ilustrativas, outros segundos domínios intracelulares (P4) exemplificativos não limitantes são aqueles dos genes que são ligados ao primeiro domínio intracelular correspondente MPL, LEPR, MYD88, IFNAR2, CD40, CD79B ou CD27 nas tabelas fornecidas no Exemplo 18, incluindo como exemplos não limitantes, o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares daqueles genes fornecidos nessas tabelas. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo quimérico pode ser qualquer um dos polipeptídeos nas tabelas 19 a 23 dos Exemplos 17 e 18.
[329] Em certas modalidades ilustrativas o segundo domínio intracelular é de CD3D, CD3G, CD27, CD40, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGRA2, ICOS, TNFRSF4 e TNFRSF8 ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18. Em certas modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G ou CD27, incluindo em exemplos ilustrativos, um domínio intracelular de CD40, CD79B e CD27. Para essas certas modalidades ilustrativas, os primeiros domínios intracelulares (P3) exemplificativos não limitantes são aqueles de genes que são ligados a CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G ou CD27 incluindo, nos exemplos ilustrativos, um domínio intracelular de CD40, CD79B ou CD27 nas tabelas 12 aa 17, incluindo, como exemplos não limitantes, o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares daqueles genes fornecidos nessas tabelas. Para essas certas modalidades ilustrativas, outros primeiros domínios intracelulares (P3) exemplificativos não limitantes são aqueles de genes que são ligados a CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G ou CD27, incluindo, em exemplos ilustrativos, um domínio intracelular de CD40, CD79B e segundos domínios intracelulares CD27 nas tabelas para esses genes como P3 fornecidos no Exemplo 18, incluindo, como exemplos não limitantes, o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares daqueles genes fornecidos nessas tabelas.
[330] As informações detalhadas, incluindo as informações de sequência, a respeito de domínios intracelulares exemplificativos dos genes acima que foram identificados nos Exemplos 17 e 18 dentro de construtos que promoveram a sobrevivência celular e a proliferação
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118/540 são fornecidas na Tabela 6. Os domínios intracelulares que podem ser incluídos nas modalidades de CLE fornecidas no presente documento incluem mutantes e/ou fragmentos dos domínios intracelulares dos genes mencionados fornecidos em que tais mutantes e/ou fragmentos retêm a capacidade para promover a proliferação, sobrevivência (antiapopótica) e/ou fornecer um sinal coestimulante que intensifica um estado de diferenciação, potencial proliferativo ou resistência à morte celular. Assim, os domínios intracelulares podem ter, por exemplo, entre 10 e 1.000, 10 e 750, 10 e 500, 10 e 250, 10 e 100 aminoácidos.
[331] Em algumas modalidades, todos os domínios de um CLE são diferentes de um receptor de IL-7, ou um mutante do mesmo, e/ou um fragmento do mesmo que tem pelo menos 10, 15, 20, ou 25 aminoácidos contíguos de receptor de IL-7 ou diferente de um receptor de IL-15 ou um mutante do mesmo e/ou um fragmento do mesmo que tem pelo menos 10, 15, 20 ou 25 aminoácidos contíguos de receptor de IL-15. Em algumas modalidades, um CLE não compreende uma combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular de CD40 e MyD88.
[332] Em modalidades ilustrativas, os CLEs incluem um domínio de reconhecimento e/ou eliminação. Os detalhes a respeito dos domínios de reconhecimento e/ou eliminação são fornecidos em outras seções no presente documento. Qualquer um dos domínios de reconhecimento e/ou eliminação fornecidos no presente documento pode ser parte de um CLE. Tipicamente, o domínio de reconhecimento é ligado à terminação N do domínio extracelular. Sem se ater à teoria, em algumas modalidades, o domínio extracelular inclui a função de fornecer um aglutinante, em modalidades ilustrativas, um aglutinante flexível, ligando um domínio de reconhecimento a uma célula que expressa o CLE.
[333] Em modalidades ilustrativas, como ilustrado na Figura 30 e na Figura 32, um CLE fornecido no presente documento é coexpressado com um CAR que pode ser projetado de acordo com qualquer uma das modalidades de CAR fornecidas no presente documento ou, de outro modo, conhecidas na técnica.
[334] Algumas modalidades fornecidas no presente documento são polinucleotídeos isolados e sequências de ácido nucleico que codificam qualquer um dos CLEs fornecidos no presente documento, como exemplificado nas Figuras 30 a 33. Tais polinucleotídeos isolados podem incluir quaisquer elementos conhecidos na técnica para fornecer
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119/540 a expressão de uma transcrição, como a transcrição que codifica um CLE. Por exemplo, o polinucleotídeo isolado pode incluir um elemento promotor que é ativo nas células B, células T e/ou células NK. Tais promotores que são adequados para essas modalidades são conhecidos na técnica, alguns dos quais são identificados em outras seções da presente revelação. Um técnico versado irá entender, como discutido, em maiores detalhes nos Exemplos 17 e 18, por exemplo, como projetar os polinucleotídeos isolados e vetores contendo os mesmos, para expressar qualquer uma das modalidades de CLE fornecidas no presente documento. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência de Kozak é fornecida dentro de 10 nucleotídeos a montante de um sítio inicial de ATG que codifica o ácido de amina de terminal amino de um CLE ou um CAR localizado a montante de um CLE na mesma unidade de transcrição. Consequentemente, em modalidades de polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um CLE fornecido no presente documento, o polinucleotídeo pode compreender adicionalmente um ou mais de um dentre uma sequência relacionada a Kozak, um elemento de WPRE e uma sequência de múltiplas interrupções, por exemplo, uma sequência de interrupção dupla ou uma sequência de interrupção tripla.
[335] Ademais, os polinucleotídeos que incluem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CLE fornecido no presente documento, também compreendem, tipicamente, uma sequência de sinal para direcionar a expressão para a membrana de plasma. As sequências de sinal exemplificativas são fornecidas no presente documento em outras seções. Os elementos podem ser fornecidos na transcrição, de modo que tanto um CAR quanto um CLE sejam expressados a partir da mesma transcrição. Tal construto é vantajoso na exigência de menos ácidos nucleicos do que se esses elementos fossem expressados a partir de diferentes transcrições, que é um recurso importante que permite que tais construtos estejam presentes nos vetores, como genomas retrovirais usados para transfectar ou transduzir células B, células T e/ou células NK, por exemplo.
[336] Inúmeros candidatos de polipeptídeo quimérico foram projetados e identificados como elementos linfoproliferativos nos Exemplos 17 e 18 no presente documento. Para a Biblioteca IA, que incluiu construtos que codificaram os polipeptídeos quiméricos e um CAR, 172 candidatos superiores de polipeptídeos quiméricos foram identificados (consultar a Tabela 7) que promoveu a proliferação de PB MC entre o dia 7 e o último dia quando cultivado
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120/540 na ausência de IL-2. Para a Biblioteca 2B, que incluiu construtos que codificaram os polipeptídeos quiméricos mas não incluiu um CAR, 167 candidatos superiores de polipeptídeos quiméricos foram identificados (consultar a Tabela 8) que promoveu a proliferação de PB MC entre o dia 7 e o último dia quando cultivado na ausência de IL-2. Certos CLEs ilustrativos, assim como polinucleotídeos, e sequências de ácido nucleico que codificam os mesmos, e métodos que incluem qualquer um desses, incluem domínios intracelulares de genes que têm domínios compatibilizados (por exemplo, gene transmembranar e primeiro gene intracelular e opcionalmente segundo gene intracelular) em construtos fornecidos nas tabelas 7 a 11, assim como, nos exemplos não limitantes, os domínios compatibilizados específicos fornecidos nessas tabelas, alguns dos quais são apontados na seção de Modalidades exemplificativas no presente documento. Em modalidades ilustrativas, os domínios intracelulares de CLEs tendo domínios compatibilizados (por exemplo, o gene transmembranar e o primeiro gene intracelular e opcionalmente o segundo gene intracelular) em construtos que tinham enriquecimentos particularmente notáveis em uma primeira triagem e uma triagem repetida com os mesmos domínios de Pl a P2, P3 e P4, por exemplo, as Bibliotecas IA e LIA, podem ser usados, como mostrado nas tabelas 7 a 11. Para as Bibliotecas IA e LIA, os construtos M001-S116-S044, M024-S192-S045, M001-S047-S102, M048-S195-S043, M012-S216-S211 e M030-S170-S194 tinham enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens.
[337] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 1A quanto da Biblioteca LIA são fornecidas na Tabela 19, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de IT AM. Como mostrado no Exemplo 17, os construtos com domínios intracelulares de IL6R, MYD88, CD27, MYD88, TNFRSF18 ou IL31RA, quando presente no primeiro domínio intracelular (P3), e construtos com domínios intracelulares de CD8B, IL1RL1, CD8A, TNFRSF4, ou MYD88, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas IA e LIA (Tabela 19). Os construtos com domínios dos receptores de citocina IL6R, CD27, TNFRSF18 ou IL31RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4367/5200
121/540 (P3), e os construtos com os domínios dos receptores de citocina IL1RL1 ou TNFRSF4, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas IA e 1.1 A (Tabela 19).
[ 338 ] Para as Bibliotecas 2B e 2.1B, os construtos M007-S049-S051, M007S050-S039, M012-S050-S043, M012-S161-S213, M030-S142-S049, M001-S145-S130, M018S085-S039, M018-S075-S053, M012-S135-S074 e M007-S214-S077 tiveram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2.
[339] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 2B quanto da Biblioteca 2.1B são fornecidas na Tabela 20, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de CD28, CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA ou TNFRSF14, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD40, CD3G, CD8A, TNFRSF9, CD28, IL10RB, CD79B, FCER1G ou GHR, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20). Os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA ou TNFRSF14, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina TNFRSF9, IL10RB, FCER1G, GHR ou CD40, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20). Os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de FCGR2C, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de CD3G, CD79B ou FCER1G, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20).
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4368/5200
122/540 [340] Em uma análise interina inicial, para a Biblioteca 3A, que incluiu construtos que codificaram os polipeptídeos quiméricos e um CAR, 126 candidatos superiores de polipeptídeos quiméricos foram identificados (consultar a Tabela 12), que promoveram a proliferação de PBMC entre o dia 7 e o último dia em PBMCs transduzidas estimuladas com PBMCs não transduzidas como apontado no Exemplo 18, quando cultivados na ausência de IL2. Para a análise interina inicial, da Biblioteca 3B, que incluiu construtos que codificaram os polipeptídeos quiméricos e um CAR, 127 candidatos superiores de polipeptídeos quiméricos foram identificados (consultar a Tabela 13), que promoveram a proliferação de PBMC entre o dia 7 e o último dia em PBMCs transduzidas que não foram estimuladas com PBMCs não transduzidas como apontado no Exemplo 18, quando cultivados na ausência de IL-2. Para a Biblioteca 4B, que incluiu construtos que codificaram os polipeptídeos quiméricos, mas não um CAR, 154 candidatos superiores de polipeptídeos quiméricos foram identificados (consultar a Tabela 16), que promoveram a proliferação de PBMC entre o dia 7 e o último dia em PBMCs transduzidas que não foram estimuladas com PBMCs não transduzidas como apontado no Exemplo 18, quando cultivados na ausência de IL-2.
[341] Após a decodificação adicional, que forneceu uma decodificação profunda, nas Bibliotecas 3A e 3B, que incluíram construtos que codificaram os polipeptídeos quiméricos e um CAR e PBMCs transduzidas que foram suplementadas com (Biblioteca 3A) ou sem (Biblioteca 3B) PBMCs frescas não transduzidas, 134 candidatos superiores foram identificados para a Biblioteca 3A no dia 21, 124 candidatos superiores foram identificados para a Biblioteca 3A no dia 35 e 131 candidatos superiores foram identificados para a Biblioteca 3B no dia 21 (consultar as tabelas 12 e 13, respectivamente) que promoveram a proliferação de PBMC entre o dia 7 e o último dia, quando cultivados na ausência de IL-2 (isto é, IL-2 não foi adicionado ao meio de cultura durante a cultura após a transdução inicial), IL-7 ou qualquer outra citocina exógena.
[342] Certos CLEs ilustrativos, assim como polinucleotídeos, e sequências de ácido nucleico que codificam os mesmos, e métodos que incluem qualquer um desses, incluem domínios intracelulares de genes que têm domínios compatibilizados (por exemplo, gene transmembranar e primeiro gene intracelular e opcionalmente segundo gene intracelular) em construtos fornecidos nas tabelas 12 a 17, ou mutantes dos mesmos que retêm atividade de
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123/540 sinalização, assim como nos exemplos não limitantes, os domínios compatibilizados específicos fornecidos nessas tabelas, alguns dos quais são apontados na seção de Modalidades exemplificativas no presente documento. Os domínios intracelulares que são identificados nos dados fornecidos no Exemplo 17 e Exemplo 18, da posição tanto do primeiro domínio intracelular quanto do segundo domínio, são contemplados em modalidades de CLE exemplificativas, de modo intercambiável como o primeiro ou o segundo domínios intracelulares. Em modalidades ilustrativas, os domínios intracelulares de genes tendo domínios compatibilizados (por exemplo, o gene transmembranar e o primeiro gene intracelular e opcionalmente o segundo gene intracelular) em construtos que tinham enriquecimentos particularmente notáveis em uma primeira triagem e uma triagem repetida com os mesmos domínios de Pl, P2, P3 e P4, por exemplo, as Bibliotecas 3A e 3.1 A, podem ser usados. Para as Bibliotecas 3A e 3.1 A, os construtos E008/E013-T041-S186-S050, E006/E011-T077-S186-S211, E007/E012-T021-S186S051, E009/E014-T041-S186-S053, E007/E012-T073-S186-S053, E006/E011-T017-S186S051, E006/E011-T031-S186-S211, E006/E011-T011-S186-S050, E006/E011-T011-S186S047, E007/E012-T001-S186-S050, E006/E011-T041-S186-S051, E008/E013-T028-S186S076, E009/E014-T029-S199-S053, E009/E014-T062-S186-S216, E007/E012-T006-S058S051, E009/E014-T076-S186-S211 e E007/E012-T001-S186-S047 apresentaram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as friagens, em que as partes de Pl separadas por uma barra aqui incluíram diferentes etiquetas para as Bibliotecas 3A e 3.1 A como mostrado nas tabelas 6, 12 e 14. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7 + 1)) acima de 2.
[343] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 3A quanto da Biblioteca 3.1 A são fornecidas na Tabela 21, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de MPL, OSMR, ou CSF2RA, quando presentes no primeiro domínio
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124/540 intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD40, TNFRSF4, CD79B, CD27, FCGR2A ou TNFRSF18, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1 A (Tabela 21). Os construtos com domínios dos receptores de citocina MPL, OSMR ou CSF2RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, TNFRSF4, CD27, FCGR2A ou TNFRSF18, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1 A (Tabela 21). Os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de MPL ou OSMR, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1 A (Tabela 21).
[344] Para as Bibliotecas 3B e 3.1B, os construtos E007/E012-T017-S186-
5051, E007/E012-T073-S186-S053, E008/E013-T028-S186-S047, E006/E011-T011-S186-
5047, E007/E012-T082-S176-S214, E006/E011-T046-S186-S052, E008/E013-T029-S186-
5052, E009/E014-T011-S186-S053, E008/E013-T032-S186-S039, E007/E012-T034-S186S051, E007/E012-T041-S192-S213, E006/E011-T014-S069-S213, E006/E011-T022-S186-
5053, E006/E011-T023-S115-S075, E006/E011-T029-S106-S213, E006/E011-T032-S155S080, E006/E011-T041-S186-S216, E006/E011-T057-S135-S080, E006/E011-T072-S191X002, E006/E011-T077-S186-S216, E006/E011-T080-S141-S080, E007/E012-T001-X001S214, E007/E012-T007-S059-S211, E007/E012-T016-S186-S052, E007/E012-T031-S186S053, E007/E012-T044-S102-S052, E007/E012-T044-S142-X002, E007/E012-T055-S069S053, E007/E012-T063-S176-S216, E007/E012-T065-S157-S075, EOO8/EO13-TOO8-SO85X002, E008/E013-T011-S085-S048, E008/E013-T021-S109-X002, E008/E013-T021-S168S211, E008/E013-T032-S064-S214, E008/E013-T037-S170-S215, E008/E013-T038-S176-
5048, E008/E013-T039-S137-S216, E008/E013-T041-S141-S053, E008/E013-T045-S177S048, E008/E013-T048-S109-S074, E008/E013-T073-S199-S075, E009/E014-T001-S157S074, E009/E014-T005-S196-S049, E009/E014-T011-S130-X002, E009/E014-T013-S155X002, E009/E014-T017-S186-S076, E009/E014-T021-S142-S080, E009/E014-T023-S082S076, E009/E014-T038-S196-S037, E009/E014-T055-S186-S052, E009/E014-T060-S175S053, E009/E014-T070-S085-S212, E008/E013-T026-S054-S213, E009/E014-T007-S120S053, E007/E012-T045-S186-S211, E008/E013-T073-S186-X002, E008/E013-T074-S186
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125/540
X002, E007/E012-T055-S186-S053, E008/E013-T036-S186-S053, E007/E012-T017-S058S053, E008/E013-T030-S189-S080, E006/E011-T029-S081-S047, E009/E014-T044-S194S050, E006/E011-T028-S121-X002, E008/E013-T028-S186-S053, E009/E014-T078-S142S213, E009/E014-T041-S186-S051, E008/E013-T006-S186-S050, E006/E011-T028-S186S075, E006/E011-T040-S120-S038, E007/E012-T044-S115-S211, E009/E014-T039-S176-
5075, E007/E012-T028-S186-S050, E008/E013-T031-S202-S050, E007/E012-T072-S192-
S053, E006/E011-T065-X001-S051, E007/E012-T030-S062-X002, E007/E012-T073-S186X002, E009/E014-T056-S186-S053, E008/E013-T046-S137-X002, E006/E011-T016-S136-
5076, E007/E012-T032-S142-S037, E007/E012-T065-S120-S215, E009/E014-T077-S186-
S047, E009/E014-T001-S126-S051, E006/E011-T030-S121-S039, E008/E013-T006-S176S213, E009/E014-T032-S130-S215, E008/E013-T041-S186-S039, E009/E014-T021-S186S047, E008/E013-T026-S137-S214, E007/E012-T029-S116-S075, E008/E013-T026-S106S049, e E007/E012-T032-S168-S075 tiveram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens, em que as partes de PI separadas por uma barra aqui incluíram diferentes etiquetas para as Bibliotecas 3B e 3.1B como mostrado nas tabelas 6, 13 e 15. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2.
[345] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 3B quanto da Biblioteca 3.1B são fornecidas na Tabela 22, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de MPL, LEPR, MYD88, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA,
IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R ou IL15RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD40, CD79B, CD27, TNFRSF14, CD79A, CD3G, TNFRSF9, FCGR2C, ICOS, TNFRSF18, TNFRSF4, CD28, FCER1G, FCGR2A, CD3D, TNFRSF8 ou CD3E, quando
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126/540 presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22). OS construtos com domínios dos receptores de citocina MPL, LEPR, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA, IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R ou IL15RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, CD27, TNFRSF14, TNFRSF9, FCGR2C, TNFRSF18, TNFRSF4, FCER1G, FCGR2A ou TNFRSF8, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22). Os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de CD79B, CD79A, CD3G, FCGR2C, FCER1G, FCGR2A, CD3D ou CD3E, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22).
[346] Para as Bibliotecas 4B e 4.1B, os construtos E007/E012-T078-S154-
5047, E008/E013-T062-S186-X002, E008/E013-T055-S186-S050, E009/E014-T057-S186S050, E007/E012-T077-S054-S053, E007/E012-T034-S135-S211, E009/E014-T071-X001S216, E009/E014-T011-S141-S037, E008/E013-T041-S186-S037, E006/E011-T038-S106S039, E006/E011-T011-S121-X002, E007/E012-T007-S085-S215, E006/E011-T041-S186-
5050, E007/E012-T008-S064-S051, E006/E011-T041-S186-S047, E008/E013-T045-S186-
5051, E008/E013-T003-S104-S216, E006/E011-T019-S186-S053, E008/E013-T071-S064S080, E006/E011-T021-S054-X002, E006/E011-T003-S135-X002, E009/E014-T020-S199S213, E008/E013-T027-S121-S211, E009/E014-T032-S195-X002, E009/E014-T050-S171X002, E008/E013-T069-S083-X002, E008/E013-T026-S116-S038, E009/E014-T072-S195X002, E007/E012-T047-S058-S211, E008/E013-T046-S142-S080, E006/E011-T065-S186S076, E006/E011-T062-S069-X002, E007/E012-T047-S098-X002, E009/E014-T069-S099-
5048, E008/E013-T039-S141-S050, E006/E011-T052-S130-S052, E008/E013-T041-S186X002, E007/E012-T019-S120-X002, E008/E013-T045-S186-S053, E006/E011-T003-S170S039, E007/E012-T047-S058-S051, E007/E012-T069-S109-X002, E009/E014-T019-S130S075, e E006/E011-T047-S054-S053 tiveram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens, em que as partes de PI separadas por uma barra aqui incluíram diferentes
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127/540 etiquetas para as Bibliotecas 4B e 4.1B como mostrado nas tabelas 6, 16 e 17. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2. As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares nos construtos com enriquecimentos particularmente notáveis nas triagens tanto da Biblioteca 4B quanto da Biblioteca 4.1B são fornecidas na Tabela 23, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e o segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e independentemente de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de IT AM. Os construtos com domínios intracelulares de IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, MYD88, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB ou IL3RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD27, CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF18, CD3D, CD3G, CD27, ICOS, TNFRSF9, CD3E, FCGR2A, CD28, CD79A ou FCGR2C, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23). Os construtos com domínios dos receptores de citocina IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB ou IL3RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, TNFRSF4, TNFRSF18, TNFRSF9, FCGR2A ou FCGR2C, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23). Os construtos com domínios contendo motivos de IT AM de CD79B, CD3D, CD3G, CD3E, FCGR2A, CD79A ou FCGR2C, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23).
[347] Em algumas modalidades ilustrativas, o CLE compreende um domínio intracelular de um receptor de citocina em qualquer um dos construtos das tabelas 19 a 23. Em algumas modalidades ilustrativas, o CLE compreende um domínio intracelular de qualquer um dos construtos das tabelas 19 a 23 com apenas um único domínio intracelular (outro P3 ou P4 foi
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128/540 um aglutinante ou interrupção).
[348] As informações a respeito de vários domínios de CLE exemplificativos fornecidos no presente documento são encontradas na Tabela 6. Por exemplo, o primeiro CLE identificado na Tabela 7 é M008-S212-S075. Para esse CLE, o domínio extracelular e transmembranar (Pl-2) é M008, o primeiro domínio intracelular (P3) é S212 e o segundo domínio intracelular (P4) é S075. As informações detalhadas a respeito da identidade desses domínios ou módulos ao considerar ácidos nucleicos que codificam o mesmo, por exemplo, M008, são encontradas na Tabela 6. A Tabela 6 revela que M008 é ECDTM-8 e, mais especificamente, que esse é um mutante de receptor alfa de interleucina 7 (IL7RA) com uma inserção de PPCL e que o construto inclui uma eTag.
[349] Para a Biblioteca IA, os domínios intracelulares de CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8 e TNFRSF9 ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por terem a atividade de sinalização, quando encontrados na posição do primeiro domínio intracelular (P3) de polipeptídeos quiméricos candidatos promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia, quando os dados foram considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com os primeiros domínios intracelulares (P3) derivados de tal gene. Consequentemente, as modalidades exemplificativas de CLEs fornecidas no presente documento têm domínios intracelulares de CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8 e TNFRSF9, incluindo mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, como o segundo domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o primeiro domínio intracelular.
[350] Para a Biblioteca IA, os domínios intracelulares de CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS , IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9 e TNFRSF18, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por terem atividade de sinalização quando encontrados na posição de segundo domínio intracelular (P4) de polipeptídeos quiméricos candidatos promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia, quando os dados foram considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com segundos domínios intracelulares (P4) derivados de tal gene. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estiveram presentes nos construtos que promoveram a proliferação celular são fornecidos nas tabelas no Exemplo 17.
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Consequentemente, as modalidades exemplificativas de CLEs fornecidos no presente documento têm domínios intracelulares de CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS, IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9 e TNFRSF18, incluindo mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, como o primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular.
[351] Para a Biblioteca 3A, os primeiros domínios intracelulares (P3) de CSF2RA, IFNAR1, IL1RAP, IL4R, IL6ST, IL11RA, IL12RB2, IL17RA, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL21R, IL23R, MPL e MyD88, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18, quando encontrados no primeiro domínio intracelular (P3) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia ou entre o dia 7 e o dia 21, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um primeiro domínio intracelular derivado de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PB MC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada no último dia indicado na tabela mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Para a Biblioteca 3B, os primeiros domínios intracelulares de CSF2RB, IL4R e MPL, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18, obtiveram o melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a proliferação celular para as Bibliotecas 3A, 3B, 3.1 A e 3.1B são fornecidos nas tabelas 12 a 15.
[352] Para a Biblioteca 3A, os segundos domínios intracelulares (P4) de CD3D, CD3G, CD27, CD40, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGRA2, ICOS, TNFRSF4 e TNFRSF8, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos no Exemplo 18, quando encontrados no segundo domínio intracelular (P4) de elementos de polipeptídeos quiméricos
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130/540 candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o dia 21 ou entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um segundo domínio intracelular derivado de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada no último dia indicado na tabela mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Os Exemplos de segundo domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a proliferação celular para as Bibliotecas 3A, e 3B são fornecidos nas tabelas 12 a 17.
[353] Após uma análise de decodificação interina inicial, para a Biblioteca 3A, os primeiros domínios intracelulares (P3) de IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula, quando encontrados no primeiro domínio intracelular (P3) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o dia 21, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um primeiro domínio intracelular derivado de tal gene. Para a Biblioteca 3B, os primeiros domínios intracelulares de IL21R, MPL e OSMR, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula obtiveram o melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a proliferação celular para as Bibliotecas 3A, e 3B são fornecidos nas tabelas no Exemplo 18. Consequentemente, as modalidades exemplificativas de CLEs fornecidas no presente documento têm domínios intracelulares de IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL F9, incluindo mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, como o segundo domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o primeiro domínio intracelular.
[354] Após uma análise de decodificação inicial, para a Biblioteca 3A, os segundos domínios intracelulares (P4) de CD27, CD3G, CD40, e CE79B ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula,
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131/540 quando encontrados no segundo domínio intracelular (P4) dos elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um segundo domínio intracelular derivado de tal gene. Para a Biblioteca 3B, os segundos domínios intracelulares de CD40, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula obtiveram o melhor desempenho quando analisados dessa forma. Consequentemente, as modalidades exemplificativas de CLEs fornecidas no presente documento têm domínios intracelulares de CD27, CD3G, CD40 e CE79B, incluindo mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, como o primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular.
[355] Como mostrado nas tabelas 12 a 17, os primeiros domínios intracelulares (P3) de MPL, LEPR, MYD88, IFNAR2 ou, em alguns casos, mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, quando encontrados no primeiro domínio intracelular (P3) de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o final do experimento, ao considerar os primeiros domínios intracelulares que ocorrem mais frequentemente nos construtos candidatos superiores. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a proliferação celular para as Bibliotecas 3A, 3B, 3.1 A, 3,1B, 4B e 4.1B são fornecidos nas tabelas no Exemplo 18. Consequentemente, as modalidades exemplificativas de CLEs fornecidas no presente documento têm domínios intracelulares de MPL, LEPR, MYD88, IFNAR2, incluindo mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, como o segundo domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o primeiro domínio intracelular.
[356] Como mostrado nas tabelas 12 a 17, os segundos domínios intracelulares (P4) de CD40, CD79B, CD27 ou, em alguns casos, mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, quando encontrados no segundo domínio intracelular (P4) de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, ao considerar os primeiros domínios intracelulares que ocorrem mais frequentemente nos construtos candidatos superiores. Os Exemplos de primeiros
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132/540 domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a proliferação celular para as Bibliotecas 3A, 3B, 3.1A, 3,1B, 4B e 4.1B são fornecidos nas tabelas no Exemplo 18. Consequentemente, as modalidades exemplificativas de CLEs fornecidas no presente documento têm domínios intracelulares de CD40, CD79B, CD27, incluindo mutantes dos mesmos que retêm a atividade de sinalização, como o primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular.
[357] Em modalidades notáveis de qualquer um dentre o polinucleotídeo isolado ou os aspectos e modalidades de vetor fornecidos no presente documento que compreendem uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK (isto é, um CLE) e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos podem ser separadas por uma sequência de salto ribossômica. Em algumas modalidades, a sequência de salto ribossômica é F2A, E2A, P2A ou T2A.
[358] Como revelado no presente documento, os elementos linfoproliferativos, como exemplificado no presente documento com CLEs, em algumas modalidades ilustrativas, pode incluir um motivo de dimerização para ajudar a intensificar e/ou regular a atividade dos mesmos, por exemplo, para afetar os sinais em uma célula, como os sinais que afetam a expressão de gene ou atividade de proteína. Tal motivo de dimerização é tipicamente uma porção de, ou a totalidade do domínio extracelular. Em algumas modalidades, uma porção química de dimerização pode ser fixada a uma sequência de reconhecimento e liberação no domínio extracelular de um CLE no presente documento. De fato, em algumas modalidades, um elemento linfoproliferativo pode incluir um elemento linfoproliferativo inteiro de uma proteína, exceto pelo fato de que o domínio extracelular inclui uma porção química de dimerização.
[359] Em algumas modalidades de elementos linfoproliferativos e CLEs que incluem agentes de dimerização e polinucleotídeos e sequências de ácido nucleico que codificam os mesmos, o motivo de dimerização pode incluir uma sequência de aminoácidos de polipeptídeos
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133/540 homodiméricos transmembranares que existem naturalmente como homodímeros. Por exemplo, o motivo de dimerização pode ser um polipeptídeo de zíper de leucina, por exemplo, um polipeptídeo Jun como exemplificado no Exemplo 18 no presente documento. Em algumas modalidades, esses polipeptídeos homodiméricos transmembranares podem incluir ativação antígeno CD69 precoce (CD69), proteína 1 de receptor de Transferina (CD71), antígeno de diferenciação de célula B (CD72), proteína de superfície de célula T tátil (CD96), Endoglina (Cdl05), membro 1 de subfamília B de receptor tipo lectina de célula exterminadora (Cdlól), ligante 1 de glicoproteína de selectina P (Cdl62), Glutamila aminopeptidase (Cd249), membro 16 da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (CD271), Caderina-1 (E-Caderina) (Cd324) ou fragmentos ativos dos mesmos. Em algumas modalidades, o motivo de dimerização pode incluir uma sequência de aminoácidos de transmembrana proteínas que se dimeriza mediante a ligação de ligante (também chamado no presente documento de um dimerizador ou agente de dimerização). Em algumas modalidades, o motivo de dimerização e o dimerizador podem incluir (em que o dimerizador está em parênteses após o par de ligação de dimerizador): FKBP e FKBP (rapamicina); GyrB e GyrB (cumermicina); DHFR e DHFR (metotrexato); ou DmrB e DmrB (AP20187). Como observado acima, a rapamicina pode servir como um dimerizador. Alternativamente, um derivado ou análogo de rapamicina pode ser usado (consultar, por exemplo, WO96/41865; WO 99/36553; WO 01/14387; e Ye et al (1999) Science 283:88-91). Por exemplo, os análogos, homólogos, derivados e outros compostos relacionados estruturalmente à rapamicina (”rapalogos“) incluem, dentre outros, variantes de rapamicina que têm uma ou mais das seguintes modificações em relação à rapamicina: desmetilação, eliminação ou substituição do metóxi em C7, C42 e/ou C29; eliminação, derivatização ou substituição do hidróxi em C13, C43 e/ou C28; redução, eliminação ou derivatização da cetona em C14, C24 e/ou C30; substituição do anel de pipecolato de 6 membros com um anel prolila de 5 membros; e substituição alternativa no anel de ciclo-hexila ou substituição do anel de ciclo-hexila com um anel de ciclopentila substituída. As informações adicionais são apresentadas, por exemplo, nos documentos de Patente n° U.S. 5.525.610; 5.310.903, 5.362.718; e 5.527.907. A epimerização seletiva do grupo de C-28 hidroxila foi descrita (consultar, por exemplo, documento WO 01/14387). Os agentes de dimerização sintéticos adicionais adequados para uso como uma alternativa à rapamicina incluem aqueles descritos em Publicação de Patente n° U.S.
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2012/0130076. Como observado acima, a cumermicina pode servir como um agente de dimerização. Alternativamente, um analógico de cumermicina pode ser usado (consultar, por exemplo, Farrar et al. (1996) Nature 383:178 a 181; e Patente n°U.S. 6.916.846). Como observado acima, em alguns casos, o agente de dimerização é metotrexato, por exemplo, um dímero de metotrexato homobifuncional não citotóxico (consultar, por exemplo, Patente n° U.S. 8.236.925).
[360] Em algumas modalidades, quando presente na membrana de plasma de uma célula eucariótica, um elemento linfoproliferativo, em modalidades ilustrativas, um CLE, incluindo um motivo de dimerização pode ser ativo na ausência de um agente de dimerização. Por exemplo, os elementos linfoproliferativos que incluem um motivo de dimerização contendo zíper de leucina ou que incluem um motivo de dimerização de polipeptídeos homodiméricos transmembranares incluindo CD69, CD71, CD72, CD96, Cdl05, Cdl61, Cdl62, Cd249, CD271, Cd324, mutantes ativos dos mesmos e/ou fragmentos ativos dos mesmos podem ser ativos na ausência de um agente de dimerização. Em algumas modalidades, quando presente na membrana de plasma de uma célula eucariótica, um elemento linfoproliferativo, incluindo um motivo de dimerização pode ser ativo na presença de um agente de dimerização. Por exemplo, os elementos linfoproliferativos incluindo um motivo de dimerização de FKBP, GyrB, DHFR ou DmrB pode ser ativo na presença dos respectivos agentes de dimerização ou análogos dos mesmos, por exemplo, rapamicina, cumermicina, metotrexato e AP20187, respectivamente.
[361] Em método modalidades incluindo elementos linfoproliferativos, por exemplo, CLE, que incluem um dimerizador para dimerizar um polipeptídeo compreendendo um motivo de dimerização, um dimerizador pode ser administrado ao hospedeiro (sujeito) com o uso de qualquer meio conveniente capaz de resultar no efeito desejado. Assim, o dimerizador pode ser incorporado em uma variedade de formulações para administração. Mais particularmente, um dimerizador pode ser formulado em composições farmacêuticas por combinação com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis adequados e podem ser formulados em preparações em formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, supositórios, injeções, inalantes e aerossóis.
[362] Aqueles versados observarão prontamente que os níveis de dose podem variar como uma função do dimerizador específico, a gravidade dos sintomas e a suscetibilidade do sujeito a efeitos colaterais. As dosagens preferenciais para um dado composto são prontamente
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135/540 determináveis por aqueles versados na técnica por uma variedade de meios.
[363] Um dimerizador é administrado a um indivíduo com o uso de qualquer método disponível e via adequada para fármaco entrega, incluindo métodos in vivo e ex vivo, assim como vias sistêmicas e localizadas de administração.
[364] Em quaisquer aspectos ou modalidades em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o motivo de dimerização pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: um polipeptídeo contendo motivo de zíper de leucina, CD69, CD71, CD72, CD96, Cdl05, Cdlól, Cdl62, Cd249, CD271 e Cd324, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos que retêm a capacidade para dimerizar. Em qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento, em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o motivo de dimerização pode exigir um agente de dimerização e o motivo de dimerização e o agente de dimerização associado pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: FKBP e rapamicina ou análogos dos mesmos, GyrB e cumermicina ou análogos dos mesmos, DHFR e metotrexato ou análogos dos mesmos ou DmrB e AP20187 ou análogos dos mesmos, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos das proteínas de dimerização mencionadas que retêm a capacidade para dimerizar.
[365] Em modalidades ilustrativas de quaisquer aspectos ou modalidades no presente documento em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o domínio extracelular pode compreender um motivo de zíper de leucina. Em algumas modalidades, o motivo de zíper de leucina é de um polipeptídeo jun, por exemplo, c-jun. Em certas modalidades, o polipeptídeo c-jun é a região de polipeptídeo c-jun de ECD-11.
[366] Em qualquer um dos aspectos e modalidades fornecidos no presente documento que incluem elemento linfoproliferativo, o elemento linfoproliferativo pode ser um polipeptídeo compreendendo uma região de alvejamento de membrana, um domínio de dimerização (ou multimerização), um primeiro domínio intracelular e opcionalmente um segundo domínio intracelular e, ainda opcionalmente, um terceiro domínio intracelular e opcionalmente um quarto domínio intracelular, em que pelo menos um dentre o primeiro e o segundo, terceiro e quarto domínios intracelulares opcionais são de qualquer gene com um domínio intracelular identificado nas tabelas 7 a 17, ou selecionado a partir de qualquer um dentre o primeiro ou segundo domínios intracelulares identificados nas tabelas 7 a 17, e em que o dito elemento
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136/540 linfoproliferativo de dimerização e/ou multimerização interna promove a proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas, de células B, células T e/ou células NK. Tal polipeptídeo pode ser chamado, no presente documento, de um elemento linfoproliferativo de dimerização e/ou multimerização interna. Em certas modalidades, os ligantes podem ser adicionados entre qualquer um dos domínios. Em certas modalidades, o primeiro e segundo domínios intracelulares são diferentes de MyD88 e CD40. Em algumas modalidades, o domínio intracelular é MPL ou um fragmento intracelular do mesmo que retém a capacidade para promover a proliferação celular de PBMC. Em algumas modalidades, o domínio intracelular é diferente de MPL ou um fragmento intracelular do mesmo que retém a capacidade para promover a proliferação celular de PBMC. Em algumas modalidades, o domínio intracelular é diferente de MyD88 ou um fragmento intracelular do mesmo que retém a capacidade para promover a proliferação celular de PBMC.
[367] O domínio de dimerização de tais elementos linfoproliferativos de polipeptídeo de dimerização e/ou multimerização interna em modalidades ilustrativas é localizado entre a região de alvejamento de membrana e o primeiro domínio intracelular. Em certas modalidades, o domínio de dimerização (ou multimerização) compreende sítios de ligação de ligante de multimerização ou dimerização, como, por exemplo, uma região de FKBP, por exemplo, FKBP12. Em algumas modalidades, o polipeptídeo pode compreender um domínio extracelular, como qualquer um dos domínios extracelulares fornecidos no presente documento, por exemplo, nas tabelas 7 a 11 do Exemplo 17 ou nas tabelas 12 a 17 de Exemplo 18, com ou sem o domínio reconhecimento e de liberação. Em certas modalidades, a região de alvejamento de membrana é selecionada a partir do grupo que consiste em uma região de miristoilação, região de palmitoilação, região de prenilação e sequências transmembranares de receptores. Em certas modalidades, a região de alvejamento de membrana é uma região de miristoilação. O elemento linfoproliferativo de dimerização e/ou multimerização interna é tipicamente aglutinado à membrana de plasma por meio da região de alvejamento de membrana, por exemplo, aglutinado à membrana com um miristato N terminal. Em modalidades ilustrativas, a região de FKBP se liga a FK506.
[368] Os elementos linfoproliferativos de dimerização e/ou multimerização interna em uma modalidade são uma parte integral de um sistema que usa um análogo dimérico do fármaco imunossupressor de preâmbulo lipídico, FK506, que perde sua bioatividade normal
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137/540 enquanto ganha a capacidade para reticular moléculas geneticamente fundidas à proteína de ligação de FK506, FKBP12. Fundindo-se um ou mais FKBPs e uma sequência de miristoilação ao domínio de sinalização citoplasmática de um receptor-alvo, é possível estimular a sinalização em um dependente de fármaco dimerizador, porém, de maneira independente de ligante e ectodomínio. Isso fornece o sistema com controle temporal, reversibilidade com o uso de análogos de fármaco monomérico e especificidade intensificada. A alta afinidade de fármacos de dimerizador de AP20187/AP1903 da terceira geração para seu domínio de ligação, o FKBP12 permite a ativação específica do receptor recombinante in vivo sem a indução de efeitos colaterais não específicos através de FKBP12 endógeno. Os variantes de FKBP12 que têm substituições e deleções de aminoácido, como FKBP12V36, que se ligam a um fármaco dimerizador, também podem ser usados. Além disso, os ligantes sintéticos são resistentes à degradação de protease, tornando os mesmos mais eficazes na ativação de receptores in vivo do que a maioria dos agentes de proteína entregues.
Elementos de pseudotipagem [369] Muitos dos métodos e composições fornecidos no presente documento incluem elementos de pseudotipagem. A pseudotipagem de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação com glicoproteínas de envelope heterólogas altera tipicamente o tropismo de um vírus e facilita a transdução de células hospedeiras. Um elemento de pseudotipagem, conforme usado no presente documento, pode incluir um polipeptídeo de ligação que inclui um ou mais polipeptídeos, tipicamente glicoproteínas, que identificam e se ligam à célula-alvo hospedeira, e um ou mais polipeptídeos fusogênicos que mediam a fusão das membranas de célula-alvo hospedeira e retroviral, possibilitando, assim, que um genoma retroviral entre na célula-alvo hospedeira. Em algumas modalidades fornecidas no presente documento, os elementos de pseudotipagem são fornecidos como polipeptídeo (ou polipeptídeos)/proteína (ou proteínas) ou como sequências de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo (ou polipeptídeos)/proteína (ou proteínas).
[370] Em algumas modalidades, o elemento de pseudotipagem é a proteína de envelope do vírus endógeno felino (RD114), a proteína de envelope anfotrópica oncorretroviral, a proteína de envelope ecotrópica oncorretroviral, a proteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) e/ou as proteínas de envelope do paramixovírus Sarampo H e F.
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138/540 [371] Em algumas modalidades, os elementos de pseudotipagem incluem um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico derivados de diferentes proteínas. Por exemplo, as proteínas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação dos métodos e composições revelados no presente documento podem ser pseudotipados com os polipeptídeos de fusão (F) e hemaglutinina (H) do vírus do sarampo (MV), como exemplos não limitantes, cepas do tipo selvagem clínicas de MV e cepas de vacina incluindo cepa de Edmonston (MV-Edm) ou fragmentos da mesma. Sem ater-se à teoria, acredita-se que ambos os polipeptídeos de hemaglutinina (H) e fusão (F) desempenham um papel na entrada em células hospedeiras em que a proteína H liga MV aos receptores CD46, SLAM e Nectina-4 em células-alvo e F media a fusão das membranas de célula retroviral e hospedeira. Em uma modalidade ilustrativa, especialmente quando a célula-alvo é uma célula T e/ou célula NK, o polipeptídeo de ligação é um polipeptídeo do Vírus do Sarampo H e o fusogênico é um polipeptídeo do Vírus do Sarampo F.
[372] Em alguns estudos, as partículas lentivirais pseudotipadas com polipeptídeos F e H truncados tiveram um aumento significativo em titulações e eficácia de transdução (Funke et al. 2008. Molecular Therapy. 16(8):1.427 a 1.436), (Frecha et al. 2008. Blood. 112;13:4.843 a 4.852. As titulações mais altas foram obtidas quando a cauda citoplasmática F foi truncada por 30 resíduos (denominados MV(Ed)-FA30 (SEQ ID NO: 105)). Para as variantes Η, o truncamento ideal ocorreu quando 18 ou 19 resíduos foram deletados (MV(Ed)-HA18 (SEQ ID NO: 106) ou MV(Ed)-HA19), embora as variantes com um truncamento de 24 resíduos com e sem a substituição dos resíduos deletados por alanina (MV(Ed)-HA24 (SEQ ID NO:235) e MV(Ed)-HA24+A) também tenham resultado em titulações ideais.
[373] Em algumas modalidades, incluindo aquelas direcionadas à transdução de células T e/ou células NK, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação dos métodos e composições revelados no presente documento são pseudotipados com versões com mutação ou variantes dos polipeptídeos de fusão (F) e hemaglutinina (H) do vírus do sarampo, nos exemplos ilustrativos, as variantes de deleção de domínio citoplasmático dos polipeptídeos F e H do vírus do sarampo Em algumas modalidades, os polipeptídeos F e H com mutação são os polipeptídeos Ή truncados ou F truncados, cuja porção citoplasmática foi truncada, isto é, resíduos de aminoácido (ou ácidos nucleicos de codificação da molécula de ácido nucleico correspondente que codifica a proteína) foram deletados. ΉΔΥ e FAX designam tal
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139/540 polipeptídeo H e F truncado, respectivamente, em que Y refere-se a 1 a 34 resíduos que foram deletados das terminações amino, e X refere-se a 1 a 35 resíduos que foram deletados das terminações carbóxi dos domínios citoplasmáticos. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo F truncado é FA24 ou FA30 e/ou a proteína H truncada é selecionada a partir do grupo que consiste em ΗΔ14, ΗΔ15, ΗΔ16, ΗΔ17, ΗΔ18, ΗΔ19, ΗΔ20, ΗΔ21+Α, ΗΔ24 e ΗΔ24+4Α, mais preferencialmente, ΗΔ18 ou ΗΔ24. Em uma modalidade ilustrativa, o polipeptídeo F truncado é MV(Ed)-FA30 e o polipeptídeo H truncado é MV(Ed)-FLX 18.
[374] Em algumas modalidades, o polipeptídeo fusogênico inclui múltiplos elementos expressos como um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação e polipeptídeo fusogênico são traduzidos a partir do mesmo transcrito, mas a partir de sítios de ligação a ribossoma separados; em outras modalidades, o polipeptídeo de ligação e o polipeptídeo fusogênico são separados por um sítio de peptídeo de divagem, que, sem ater-se à teoria, é clivado após a tradução, conforme é comum na literatura, ou uma sequência de salto de ribossoma. Em algumas modalidades, a tradução do polipeptídeo de ligação e polipeptídeo fusogênico de sítios de ligação a ribossoma separados resulta em uma quantidade mais alta do polipeptídeo fusogênico em comparação ao polipeptídeo de ligação. Em algumas modalidades, a razão entre o polipeptídeo fusogênico e o polipeptídeo de ligação é pelo menos 2:1, pelo menos 3:1, pelo menos 4:1, pelo menos 5:1, pelo menos 6:1, pelo menos 7:1 ou pelo menos 8:1. Em algumas modalidades, a razão entre o polipeptídeo fusogênico e o polipeptídeo de ligação está entre 1,5:1, 2:1 ou 3:1, na extremidade inferior da faixa e3:l,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1 ou 10:1 na extremidade superior da faixa.
Elementos de ativação [375] Muitos dos aspectos de métodos e composição da presente revelação incluem um elemento de ativação, também chamado no presente documento de um elemento de ativação de célula T, ou um ácido nucleico que codifica um elemento de ativação. As restrições associadas à transdução lentiviral (LV) em células T em repouso são atribuídas a uma série de barreiras pré-entrada e pós-entrada assim como fatores restritivos celulares (Strebel et al 2009. BMC Medicine 7:48). Uma restrição é a incapacidade para as partículas LV pseudotipadas de envelope reconhecerem os receptores potenciais e mediarem a fusão à membrana celular. Entretanto, sob determinadas condições, a transdução das células T em repouso com vetores
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140/540 lentivirais com base em HIV-1 é possível principalmente mediante complexo de CD3 de receptor de célula T (TCR) e coestimulação de CD28 (Korin & Zack. 1998. Journal of Virology. 72:31618, Maurice et al. 2002. Blood 99:2.342 a 2.350), assim como através da exposição a citocinas (Cavalieri et al 2003).
[376] As células do sistema imunológico, tais como linfócitos T, reconhecem e interagem com antígenos específicos através de receptores ou complexos de receptor que, mediante reconhecimento ou uma interação com tais antígenos, causam a ativação da célula e a expansão no corpo. Um exemplo de tal receptor é o complexo de receptor de linfócito T específico para antígeno (TCR/CD3). O receptor de célula T (TCR) é expresso na superfície dos linfócitos T. Um componente, CD3, é responsável pela sinalização intracelular após a ocupação do TCR pelo ligante. O receptor de linfócito T para o complexo de antígeno-CD3 (TCR/CD3) reconhece peptídeos antigênicos que são apresentados ao mesmo pelas proteínas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). Os complexos de MHC e peptídeo são expressos na superfície do antígeno que apresenta células e outros alvos de linfócito T. A estimulação do complexo TCR/CD3 resulta na ativação do linfócito T e uma resposta imunológica específica para antígeno consequente. O TCR/complexo de CD3 desempenha um papel central na função efetora e a regulação do sistema imune. Assim, os elementos de ativação fornecidos no presente documento ativam as células T através da ligação a um ou mais componentes do complexo associado ao receptor de célula T, por exemplo, através da ligação ao CD3. Em alguns casos, o elemento de ativação pode se ativar sozinho. Em outros casos, a ativação requer ativação através do complexo de receptor TCR para ativar adicionalmente as células.
[377] Os linfócitos T também exigem um segundo sinal coestimulante para se tornar totalmente ativos. Sem tal sinal, os linfócitos T são não responsíveis à ligação de antígeno ao TCR ou se tornam anérgicos. Tal sinal coestimulante, por exemplo, é fornecido por CD28, uma proteína de linfócito T, que interagem com CD80 e CD86 em células de produção de antígeno. Como usado no presente documento, um fragmento extracelular funcional de CD80 retém sua capacidade para interagir com CD28. ICOS (Coestimulante induzível), outra proteína de linfócito T, fornece um sinal coestimulante quando ligado ao ligante de ICOS.
[378] A ativação do receptor de célula T (TCR) complexo de CD3 e coestímulo com CD28 pode ocorrer por exposição ex vivo a superfícies sólidas (por exemplo, microesferas)
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141/540 revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. Em algumas modalidades, dos métodos e composições revelados no presente documento, as células T em repouso são ativadas pela exposição ex vivo às superfícies sólidas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28 ex vivo. Em outras modalidades, as células T ou células NK em repouso, em modalidades ilustrativas, células T, são ativadas por exposição ex vivo aos anticorpos anti-CD3 solúveis (por exemplo, a 50 a 150 ou 75 a 125 ou 100 ng/ml). Em tais modalidades, que podem ser parte de métodos para modificar geneticamente ou transduzir, em modalidades ilustrativas, sem a ativação anterior, tal ativação e/ou contato pode ser executado, por exemplo, por 8 horas ou menos, 4 horas ou menos ou entre 2 e 8 horas, 2 e 4 horas ou entre 2 e 3.
[379] Em determinadas modalidades ilustrativas dos métodos e composições fornecidos no presente documento, os polipeptídeos que têm a capacidade para se ligar a CD3 e/ou CD28 são apresentados como elementos de ativação na superfície de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação dos métodos e composições revelados no presente documento, que são também aspectos da invenção. Os polipeptídeos que se ligam a CD3 e/ou CD28 são denominados “elementos de ativação” devido a sua capacidade para ativar células T em repouso.
[380] Em algumas modalidades, o elemento de ativação é um polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD3 é um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para se ligar a CD3. Nas modalidades ilustrativas, o anticorpo anti-CD3 ou fragmento do mesmo é um anticorpo anti-CD3 de cadeia única, tal como, porém sem limitação, um scFV anti-CD3. Em outra modalidade ilustrativa, o polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD3 é antiCD3scFvFc.
[381] Vários anticorpos monoclonais de CD3 anti-humanos e fragmentos de anticorpo dos mesmos estão disponíveis e podem ser usados na presente invenção, incluindo, porém sem limitação, UCHT1, OKT-3, HIT3A, TRX4, X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT31, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW24B6, OKT3D, M-T301, SMC2 e F101.01.
[382] Em algumas modalidades, o elemento de ativação é um polipeptídeo com
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142/540 a capacidade para se ligar a CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD28 é um anticorpo anti-CD28 ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para se ligar a CD28. Em outras modalidades, o polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD28 é CD80, CD86 ou um fragmento funcional dos mesmos que tem a capacidade para se ligar a CD28 e induzir a ativação mediada por CD28 de Akt, tal como um fragmento externo de CD80. Em alguns aspectos no presente documento, um fragmento externo de CD80 significa um fragmento que tipicamente está presente no lado externo de uma célula na localização celular normal de CD80, que retém a capacidade de se ligar a CD28. Nas modalidades ilustrativas, o anticorpo anti-CD28 ou fragmento do mesmo é um anticorpo anti-CD28 de cadeia única, tal como, porém sem limitação, um scFV anti-CD28. Em outra modalidade ilustrativa, o polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD28 é CD80 ou um fragmento de CD80, tal como um fragmento externo de CD80.
[383] Os anticorpos anti-CD28 são conhecidos na técnica e podem incluir, como exemplos não limitantes, anticorpo monoclonal 9.3, um anticorpo IgG2a (Dr. Jeffery Ledbetter, Bristol Myers Squibb Corporation, Seattle, Wash.), anticorpo monoclonal KOLT-2, um anticorpo IgGl, 15E8, um anticorpo IgGl, 248.23.2, um anticorpo IgM e EX5.3D10, um anticorpo IgG2a.
[384] Em uma modalidade ilustrativa, um elemento de ativação inclui dois polipeptídeos, um polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD3 e um polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD28.
[385] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD3 ou CD28 é um anticorpo, um anticorpo monoclonal de cadeia única ou um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo de cadeia única. Consequentemente, o fragmento de anticorpo pode ser, por exemplo, uma região variável de fragmento de cadeia única (scFv), um fragmento de ligação a anticorpo (Fab) de um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno de cadeia única (scFab), um fragmento de ligação a antígeno de cadeia única sem cisteínas (scFabAC), uma região variável de fragmento (Fv), um construto específico para epítopos adjacentes de um antígeno (CRAb) ou um anticorpo de domínio único (VH ou VL).
[386] Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, um elemento de ativação ou um ácido nucleico que codifica o mesmo, pode incluir um motivo de
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143/540 dimerização ou multimerização de ordem superior. Os motivos de dimerização e multimerização são bem conhecidos na técnica e um técnico versado entenderá como incorporar os mesmos nos polipeptídeos para dimerização ou multimerização eficaz. Por exemplo, em algumas modalidades, o elemento de ativação que inclui um motivo de dimerização pode ser um ou mais polipeptídeos capazes de se ligarem a CD3 e/ou CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo com a capacidade para se ligar a CD3 é um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para se ligar a CD3. Nas modalidades ilustrativas, o anticorpo anti-CD3 ou fragmento do mesmo é um anticorpo anti-CD3 de cadeia única, tal como, porém sem limitação, um scFV anti-CD3. Em outra modalidade ilustrativa, o polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 é anti-CD3scFvFc que, em algumas modalidades, é considerado um anti-CD3 com um motivo de dimerização sem qualquer motivo de dimerização adicional, visto que os construtos antiCD3scFvFc são conhecidos como sendo capazes de dimerizar sem a necessidade de um motivo de dimerização separado.
[387] Em algumas modalidades, o motivo de dimerização ou multimerização ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o mesmo, pode ser uma sequência de aminoácidos de polipeptídeos transmembranares que existem naturalmente como homodímeros ou multímeros. Em algumas modalidades, o motivo de dimerização ou multimerização, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o mesmo, pode ser uma sequência de aminoácidos de um fragmento de uma proteína natural ou uma proteína geneticamente modificada. Em uma modalidade, o polipeptídeo homodimérico é um polipeptídeo contendo motivo de zíper de leucina (polipeptídeo de zíper de leucina). Por exemplo, um polipeptídeo de zíper de leucina derivado de c-JUN, cujos exemplos não limitantes são revelados em relação aos elementos linfoproliferativos quiméricos (CLEs) no presente documento.
[388] Em algumas modalidades, esses polipeptídeos homodiméricos transmembranares podem incluir ativação antígeno CD69 precoce (CD69), proteína 1 de receptor de Transferina (CD71), antígeno de diferenciação de célula B (CD72), proteína de superfície de célula T tátil (CD96), Endoglina (Cdl05), membro 1 de subfamília B de receptor tipo lectina de célula exterminadora (Cdlól), ligante 1 de glicoproteína de selectina P (Cd 162), Glutamila aminopeptidase (Cd249), membro 16 da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (CD271), Caderina-1 (E-Caderina) (Cd324) ou fragmentos ativos dos mesmos. Em algumas
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144/540 modalidades, o motivo de dimerização, e o ácido nucleico que codifica o mesmo, pode incluir uma sequência de aminoácidos de transmembrana proteínas que se dimeriza mediante a ligação de ligante (também chamado no presente documento de um dimerizador ou agente de dimerização). Em algumas modalidades, o motivo de dimerização e o dimerizador podem incluir (em que o dimerizador está em parênteses após o par de ligação de dimerizador): FKBP e FKBP (rapamicina); GyrB e GyrB (cumermicina); DHFR e DHFR (metotrexato); ou DmrB e DmrB (AP20187). Como observado acima, a rapamicina pode servir como um dimerizador. Alternativamente, um derivado ou análogo de rapamicina pode ser usado (consultar, por exemplo, WO96/41865; WO 99/36553; WO 01/14387; e Ye et al (1999) Science 283:88-91). Por exemplo, os análogos, homólogos, derivados e outros compostos relacionados estruturalmente à rapamicina (”rapalogos“) incluem, dentre outros, variantes de rapamicina que têm uma ou mais das seguintes modificações em relação à rapamicina: desmetilação, eliminação ou substituição do metóxi em C7, C42 e/ou C29; eliminação, derivatização ou substituição do hidróxi em C13, C43 e/ou C28; redução, eliminação ou derivatização da cetona em C14, C24 e/ou C30; substituição do anel de pipecolato de 6 membros com um anel prolila de 5 membros; e substituição alternativa no anel de ciclo-hexila ou substituição do anel de ciclo-hexila com um anel de ciclopentila substituída. As informações adicionais são apresentadas, por exemplo, nos documentos de Patente n° U.S. 5.525.610; 5.310.903, 5.362.718; e 5.527.907. A epimerização seletiva do grupo de C-28 hidroxila foi descrita (consultar, por exemplo, documento WO 01/14387). Os agentes de dimerização sintéticos adicionais adequados para uso como uma alternativa à rapamicina incluem aqueles descritos em Publicação de Patente n° U.S. 2012/0130076. Como observado acima, a cumermicina pode servir como um agente de dimerização. Alternativamente, um analógico de cumermicina pode ser usado (consultar, por exemplo, Farrar et al. (1996) Nature 383:178 a 181; e Patente n° U.S. 6.916.846). Como observado acima, em alguns casos, o agente de dimerização é metotrexato, por exemplo, um dímero de metotrexato homobifuncional não citotóxico (consultar, por exemplo, Patente n° U.S. 8.236.925).
[389] Em algumas modalidades, quando presente na superfície de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, um elemento de ativação incluindo um motivo de dimerização pode ser ativo na ausência de um agente de dimerização. Por exemplo, elementos de ativação incluindo um motivo de dimerização contendo zíper de leucina ou que
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145/540 incluem um motivo de dimerização de polipeptídeos homodiméricos transmembranares incluindo CD69, CD71, CD72, CD96, Cdl05, Cdlól, Cdl62, Cd249, CD271, Cd324, mutantes ativos dos mesmos e/ou fragmentos ativos dos mesmos podem ser ativos na ausência de um agente de dimerização. Em algumas modalidades, o elemento de ativação pode ser um fragmento de cadeia única anti-CD3 e incluir um motivo de dimerização selecionado a partir do grupo que consiste em CD69, CD71, CD72, CD96, Cdl05, Cdlól, Cdl62, Cd249, CD271, Cd324, mutantes ativos dos mesmos e/ou fragmentos ativos dos mesmos.
[390] Em algumas modalidades, quando presente na superfície de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, um elemento de ativação incluindo um motivo de dimerização pode ser ativo na presença de um agente de dimerização. Por exemplo, os elementos de ativação incluindo um motivo de dimerização de FKBP, GyrB, DHFR ou DmrB pode ser ativo na presença dos respectivos agentes de dimerização ou análogos dos mesmos, por exemplo, rapamicina, cumermicina, metotrexato e AP20187, respectivamente. Em algumas modalidades, o elemento de ativação pode ser um fragmento de anticorpo de cadeia única contra anti-CD3 ou anti-CD28, ou outra molécula que se ligar a CD3 ou CD28, e o motivo de dimerização e o agente de dimerização podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em FKBP e rapamicina ou análogos dos mesmos, GyrB e cumermicina ou análogos dos mesmos, DHFR e metotrexato ou análogos dos mesmos, ou DmrB e AP20187 ou análogos dos mesmos.
[391] Em algumas modalidades, um elemento de ativação é fundido a uma sequência de sinalização heteróloga e/ou uma sequência de ligação à membrana heteróloga, ambas as quais ajudam a direcionar o elemento de ativação à membrana. A sequência de sinalização heteróloga direciona o elemento de ativação ao retículo endoplásmico, em que a sequência de ligação à membrana heteróloga se liga covalentemente a um ou diversos ácidos graxos (também conhecido como modificação lipídica pós-traducional) de modo que os elementos de ativação que são fundidos à sequência de ligação à membrana heteróloga sejam ancorados nas balsas lipídicas da membrana plasmática. Em algumas modalidades, a modificação lipídica pós-traducional pode ocorrer por meio de miristoilação, palmitoilação ou ancoragem de GPI. A miristoilação é uma modificação de proteína pós-traducional que corresponde à ligação covalente de um ácido graxo saturado de 14 carbonos, o ácido mirístico, à glicina N-terminal de uma proteína eucariótica ou viral. A palmitoilação é uma modificação de proteína pós-traducional
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146/540 que corresponde à ligação covalente de uma C16 cadeia de acila a cisteínas, e menos frequentemente a resíduos de serina e treonina, de proteínas. A ancoragem de GPI refere-se à ligação de glicosilfosfatidilinositol, ou GPI, à terminação C de uma proteína durante a modificação pós-traducional.
[392] Em algumas modalidades, a sequência de ligação à membrana heteróloga é uma sequência de ligação de âncora de GPI. A sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga pode ser derivada de qualquer proteína ancorada em GPI conhecida (revisada em Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. Em: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editores. Essentials of Glycobiology. 2a edição. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Capítulo 11). Em algumas modalidades, a sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga é a sequência de ligação de âncora de GPI de CD 14, CD 16, CD48, CD55 (DAF), CD59, CD80 e CD87. Em algumas modalidades, a sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga é derivada de CD 16. Nas modalidades ilustrativas, a sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga é derivada do receptor Fc FcyRIIIb (CD 16b) ou fator de aceleração de decaimento (DAF), conhecido de outro modo como fator de aceleração de decaimento de complemento ou CD55.
[393] Em algumas modalidades, um ou ambos os elementos de ativação incluem uma sequência de sinalização heteróloga para ajudar a direcionar a expressão do elemento de ativação à membrana celular. Qualquer sequência de sinalização que é ativa na linhagem de células de empacotamento pode ser usada. Em algumas modalidades, a sequência de sinalização é uma sequência de sinalização de DAF. Nas modalidades ilustrativas, um elemento de ativação é fundido a uma sequência de sinalização de DAF em sua terminação N e uma sequência de ligação de âncora de GPI em sua terminação C.
[394] Em uma modalidade ilustrativa, o elemento de ativação inclui scFVFc anti-CD3 fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI derivada de CD14 e CD80 fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI derivada de CD 16b; e ambos são expressos na superfície de uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, o scFVFc anti-CD3 é fundido a uma sequência de sinalização de DAF em sua terminação N e uma sequência de ligação de âncora de GPI derivada de CD14 em sua terminação Ceo CD80 é fundido a uma sequência de sinalização de
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DAF em sua terminação N e uma sequência de ligação de âncora de GPI derivada de CD 16b em sua terminação C; e ambos são expressos na superfície de uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação fornecida no presente documento. Em algumas modalidades, a sequência de sinalização de DAF inclui resíduos de aminoácido 1 a 30 da proteína de DAF.
Citocinas ligadas à membrana [395] Algumas modalidades dos aspectos de método e composição fornecidos no presente documento incluem uma citocina ligada à membrana ou polinucleotídeos que codificam uma citocina ligada à membrana. As citocinas são tipicamente, mas nem sempre, proteínas secretadas. As citocinas que são naturalmente secretadas podem ser geneticamente modificadas como proteínas de fusão para serem ligadas à membrana. Os polipeptídeos de fusão de citocina ligados à membrana são incluídos nos métodos e composições revelados no presente documento e são também um aspecto da invenção. Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação têm um polipeptídeo de fusão de citocina ligada à membrana em sua superfície que tem a capacidade para se ligar a uma célula T e/ou célula NK e promover a proliferação e/ou sobrevivência dos mesmos. Tipicamente, os polipeptídeos ligados à membrana são incorporados nas membranas de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação e, quando uma célula é transduzida pelo retrovirus recombinante, a fusão das membranas de célula retroviral e hospedeira resulta no polipeptídeo sendo ligado à membrana da célula transduzida.
[396] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão de citocina inclui IL7, IL-15 ou um fragmento ativo das mesmas. Os polipeptídeos de fusão de citocina ligados à membrana são tipicamente uma citocina fundida à sequência de sinalização heteróloga e/ou a uma sequência de ligação à membrana heteróloga. Em algumas modalidades, a sequência de ligação à membrana heteróloga é uma sequência de ligação de âncora de GPI. A sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga pode ser derivada de qualquer proteína ancorada em GPI conhecida (revisada em Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. Em: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2a edição. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Capítulo 11). Em algumas modalidades, a sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga é a sequência de ligação de âncora de GPI de CD14, CD16, CD48, CD55 (DAF), CD59, CD80 e CD87. Em algumas
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148/540 modalidades, a sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga é derivada de CD 16. Em uma modalidade ilustrativa, a sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga é derivada do receptor Fc FcyRIIIb (CD16b). Em algumas modalidades, a âncora de GPI é a âncora de GPI de DAF.
[397] Nas modalidades ilustrativas, a citocina ligada à membrana é um polipeptídeo de fusão de uma citocina fundida a DAF. DAF é conhecido por acumular em balsas lipídicas que são incorporadas nas membranas de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação que germinam a partir de células de empacotamento. Consequentemente, sem ater-se à teoria, acredita-se que as proteínas de fusão de DAF são, de preferência, direcionadas a porções de membranas de células de empacotamento que se tornarão parte de uma membrana retroviral recombinante.
[398] Nas modalidades ilustrativas não limitantes, o polipeptídeo de fusão de citocina é uma IL-7, ou um fragmento ativo da mesma, fundida a DAF. Em uma modalidade ilustrativa não limitante específica, o polipeptídeo de citocina de fusão inclui, em ordem: a sequência de sinalização de DAF (resíduos 1 a 31 de DAF), IL-7 sem sua sequência de sinalização e resíduos 36 a 525 de DAF.
Elemento de controle de Riboswitch
Riboswitches [399] Algumas das composições e métodos fornecidos no presente documento incluem um ou mais riboswitches ou polinucleotídeos que incluem um ou mais riboswitches, que formam aspectos distintos da presente revelação. Os riboswitches são um recurso comum nas bactérias para regular a expressão gênica e são um meio para alcançar o controle de RNA de funções biológicas. Os riboswitches são polinucleotídeos que podem estar presentes na região não traduzida 5' de mRNAs e possibilitam o controle regulador sobre a expressão gênica através da ligação de um ligante de molécula pequena que induz ou suprime uma atividade de riboswitch. Tipicamente, o riboswitch controla um produto de gene envolvido na geração do ligante de molécula pequena, formando, assim, um laço de retroalimentação. Os riboswitches atuam tipicamente de uma maneira cis, embora riboswitches tenham sido identificados que atuam de uma maneira trans. Os riboswitches naturais consistem em dois domínios: um domínio de aptâmero que se liga ao ligante através de uma estrutura de RNA enovelada tridimensional e um domínio de comutação de função que induz ou suprime uma atividade no riboswitch com base na
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149/540 ausência ou presença do ligante. Assim, há duas conformações sensíveis a ligante alcançadas pelo riboswitch, representando estados ativado e desativado (Garst et al., 2011). The função O domínio de comutação de função pode afetar a expressão de um polinucleotídeo regulando-se: um sítio de entrada de ribossoma interno, acessibilidade de doador de splicing de pré-mRNA no construto de gene retroviral, splicing de pré-mRNA, tradução, terminação de transcrição, degradação de transcrito, expressão de miRNA ou expressão de shRNA (Dambach e Winkler 2009). Os domínios de comutação de função e aptâmero podem ser usados como componentes modulares que possibilitam que dispositivos de RNA sintéticos controlem a expressão gênica ou como aptâmeros nativos, aptâmeros nativos com mutação/evoluídos ou aptâmeros totalmente sintéticos que são identificados a partir da triagem de bibliotecas de RNA aleatórias (McKeague et al 2016).
[400] A família de riboswitch de purina representa uma das maiores famílias com mais de 500 sequências encontradas (Mandai et al 2003; US20080269258; e W02006055351). Os riboswitches de purina compartilham uma estrutura similar que consiste em três elementos helicoidais conservados/estruturas de haste (Pl, P2, P3) com elementos de junção/laço intervenientes (Jl-2, L2, J2-3, L3, J3-1). Os domínios de aptâmero da família de purina dos riboswitches variam naturalmente em sua afinidade/regulação por vários compostos de purina, tais como adenina, guanina, adenosina, guanosina, desoxiadenosina, desoxiguanosina (Figura 5), etc. devido à variação de sequência (Kim et al. 2007).
[401] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado para regular a expressão de um polinucleotídeo-alvo incluindo: um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo-alvo ligado de maneira funcional a um promotor e um riboswitch, em que o riboswitch inclui: a.) um domínio de aptâmero com a capacidade para se ligar a um fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo e que tem ligação reduzida à guanina ou 2'-desoxiguanosina em relação ao fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo; e b.) um domínio de comutação de função com a capacidade para regular a expressão do polinucleotídeo-alvo, em que a ligação do análogo de nucleosídeo pelo domínio de aptâmero induz ou suprime a atividade de regulação de expressão do domínio de comutação de função, regulando, assim, a expressão do gene-alvo Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo pode ser uma região codificadora de polipeptídeo, um miRNA ou um shRNA. Em um exemplo não limitante, o riboswitch é ligado de maneira funcional a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, miRNA ou shRNA com atividade
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150/540 in vivo, por exemplo, que é eficaz no tratamento de uma doença. Por exemplo, em tal exemplo não limitante, o riboswitch é ligado de maneira funcional a um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico. Nos exemplos ilustrativos não limitantes fornecidos no presente documento, o polinucleotídeo-alvo codifica um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados incluídos em vários outros aspectos da presente revelação. Nesses exemplos ilustrativos não limitantes, o riboswitch e o polinucleotídeo-alvo que codifica um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados podem ser encontrados no genoma de uma célula de empacotamento, uma partícula retroviral recombinante em replicação, em uma célula T e/ou uma célula NK.
[402] Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ter entre 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 e 70 nucleotídeos de comprimento na extremidade inferior da faixa e 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 e 100 nucleotídeos de comprimento na extremidade superior da faixa, por exemplo, entre 45 e 80 nucleotídeos de comprimento, entre 45 e 60 nucleotídeos de comprimento ou entre 45 e 58 nucleotídeos de comprimento. Nas modalidades ilustrativas, o fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo pode ser o ligante farmacêutico aciclovir (também conhecido como aciclovir e acicloguanosina) ou penciclovir (Figura 5). Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ter uma afinidade de ligação ao fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo maior do que, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes maior do que a afinidade de ligação ao nucleosídeo ou nucleotídeo.
[403] O elemento de controle, por exemplo, um riboswitch, em algumas modalidades é operacionalmente ligado a um gene-alvo e pode controlar a expressão do genealvo in vitro e/ou in vivo. Promove a expansão de células transduzidas T in vivo. Em algumas modalidades, a expansão depende da presença do elemento de controle. Entretanto, em outras modalidades, a expansão das células T transduzidas pode ser pelo menos parcialmente acionada por outros fatores, tais como a presença de interleucinas dentro do sujeito e a ligação da ASTR de um CAR na célula T recombinante a seu ligante.
[404] Em algumas modalidades, um fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo, por exemplo, aciclovir ou penciclovir, é administrado a um sujeito antes, durante e/ou após PBLs serem isolados do sangue e antes de as células T e/ou células NK serem colocadas
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151/540 em contato com uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que inclui um elemento de controle, que, nos exemplos não limitantes ilustrativos, é um riboswitch, que se liga ao fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo e regula a expressão de um ou mais polinucleotídeos-alvo. O um ou mais polinucleotídeos-alvo podem codificar um ou mais polipeptídeos que, nos exemplos ilustrativos não limitantes, são um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados, sendo pelo menos um dos quais codifica pelo menos um elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades, o fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo, por exemplo, aciclovir ou penciclovir é administrado ao sujeito por entre 5, 10, 15, 30 e 60 minutos na extremidade baixa da faixa e 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48 ou 72 horas na extremidade alta da faixa antes que os PBLs sejam isolados do sangue ou antes que as células T e/ou células NK sejam colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em algumas modalidades, o fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo, por exemplo, anciclovir ou penciclovir é administrado ao sujeito por entre 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas na extremidade baixa da faixa e 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 ou 28 dias na extremidade alta da faixa após os PBLs serem isolados do sangue ou após as células T e/ou células NK serem colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em métodos fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo, por exemplo, aciclovir ou penciclovir é administrado ao sujeito por pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas, ou pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 ou 28 dias após os PBLs serem isolados do sangue ou após as células T e/ou células NK serem colocadas em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em métodos fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo, por exemplo, aciclovir ou penciclovir é administrado ao sujeito por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90 ou 120 dias ou 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120 meses ou indefinidamente após os PBLs terem sido reinfundidos no sujeito. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo pode ser administrado antes e/ou durante a reinfusão dos PBLs e/ou após os PBLs terem sido reinfundidos. Em algumas modalidades, o fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo é administrado até um sujeito não mais experimentar sintomas de, ou ser afligido por, uma doença à qual o polinucleotídeo-alvo está relacionado.
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152/540 [405] Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode, de preferência, se ligar a penciclovir em vez de aciclovir ou, alternativamente, a outro agente antiviral, de modo que a terapia antiviral concomitante possa ser utilizada sem afetar o riboswitch. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode se ligar a penciclovir com uma afinidade de ligação maior do que, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes maior do que o domínio de aptâmero que se liga a aciclovir ou outro agente antiviral. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode, de preferência, se ligar a aciclovir em vez de penciclovir ou, alternativamente, a outro agente antiviral, de modo que a terapia antiviral concomitante possa ser utilizada sem afetar o riboswitch. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode se ligar a aciclovir com uma afinidade de ligação maior do que, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes maior do que o domínio de aptâmero que se liga a penciclovir ou outro agente antiviral. Em algumas modalidades, os pró-fármacos orais de penciclovir (fanciclovir) e aciclovir (valaciclovir) podem ser dados a um sujeito.
[406] Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica a qualquer uma das sequências das SEQ ID NOs:87 a 93 e pode reter a capacidade para se ligar a aciclovir e uma capacidade reduzida para se ligar à guanina ou 2'-desoxiguanosina em relação ao fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo, e em que o domínio de aptâmero retém a capacidade para induzir ou suprimir a atividade de regulação de expressão do domínio de comutação de função quando ligado por aciclovir. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica ao domínio de aptâmero das SEQ ID NOs:94 a 100 e pode reter a capacidade para se ligar a penciclovir e uma capacidade reduzida para se ligar à guanina ou 2'-desoxiguanosina em relação ao fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo, e em que o domínio de aptâmero retém a capacidade para induzir ou suprimir a atividade de regulação de expressão do domínio de comutação de função quando ligado por penciclovir. Em algumas modalidades, uma região de um polinucleotídeo isolado ou uma região de um riboswitch pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%
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153/540 de identidade de sequência ou ser idêntica a qualquer uma das sequências das SEQ ID NOs:87 a 100.
[407] Em algumas modalidades, uma sequência de DNA contendo uma região de um domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica a qualquer uma das sequências das SEQ ID NOs:108 a 221. Em algumas modalidades, uma região de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica a qualquer uma das sequências das SEQ ID NOs:108 a 221.
[408] Em algumas modalidades, uma sequência de DNA contendo uma região de um domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 91.84%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica à SEQ ID NO: 108. Em algumas modalidades, uma sequência de DNA contendo uma região de um domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,83%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica à SEQ ID NO: 147. Em algumas modalidades, uma sequência de DNA contendo uma região de um domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93,88%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica à SEQ ID NO: 164. Em algumas modalidades, uma sequência de DNA contendo uma região de um domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95,83%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica à SEQ ID NO: 183. Em algumas modalidades, uma sequência de DNA contendo uma região de um domínio de aptâmero de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 91,84%, 92%, 93%, 94%, 95,83%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou ser idêntica à SEQ ID NO: 198.
[409] Em algumas modalidades, uma região de um polinucleotídeo isolado pode incluir qualquer uma das sequências consenso das SEQ ID NOs:222 a 226. Em algumas modalidades, uma região de um polinucleotídeo isolado pode compartilhar pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,83%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência
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154/540 ou ser idêntica a qualquer uma das sequências das SEQ ID NOs:222 a 226.
[410] Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o polinucleotídeo isolado pode reter a capacidade para se ligar a aciclovir e/ou penciclovir. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, um polinucleotídeo isolado pode ser o complemento reverso de qualquer uma das sequências das SEQ ID NOs: 87 a 100 ou SEQ ID NOs: 108 a 221. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, um polinucleotídeo isolado pode ser uma transcrição ou versão de RNA ou das sequências de DNA de SEQ ID NOs: 108 a 221 ou das sequências de DNA complementares às SEQ ID NOs: 108 a 221. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, um polinucleotídeo isolado pode ser uma transcrição reversa ou versão de DNA de qualquer uma das sequências de RNA das SEQ ID NOs:87 a 100 ou a fita de DNA complementar a uma transcrição reversas de qualquer uma das sequências de RNA das SEQ ID NOs:87 a 100.
[411] Em algumas modalidades fornecidas no presente documento, arcabouços de riboswitch podem ser usados para análise mutacional ou evolução molecular. Os riboswitches selecionados para mutacional ou evolução molecular podem ser de qualquer organismo conhecido, por exemplo, bactérias. Em algumas modalidades, o riboswitch de desoxiguanosina do tipo I-A de Mesoplasma florum pode ser usado para evolução molecular. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero derivado pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico ao domínio de aptâmero do riboswitch de desoxiguanosina do tipo ΙΑ de Mesoplasma florum (SEQ ID NO:237). Em outras modalidades, o riboswitch de xpt de Bacillus subtilis pode ser usado. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero derivado pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico ao domínio de aptâmero do riboswitch de xpt de Bacillus subtilis (SEQ ID NO:243).
[412] Os domínios de aptâmero podem ser usados como componentes modulares e combinados com qualquer um dos domínios de comutação de função para afetar o transcrito de RNA. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o riboswitch pode afetar o transcrito de RNA regulando-se qualquer uma das seguintes atividades: sítio de entrada ribossômico interno (IRES), acessibilidade de doador de splicing de pré-mRNA, splicing de pré-mRNA, tradução, terminação de transcrição, degradação de transcrito, expressão de miRNA ou expressão de shRNA. Em algumas modalidades, o domínio de comutação de
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155/540 função pode controlar a ligação de um anti-IRES a um IRES (consultar, por exemplo Ogawa, RNA (2011), 17:478 a 488, cuja revelação é incorporada a título de referência ao presente documento em sua totalidade). Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, a presença ou ausência do ligante de molécula pequena pode fazer com que o riboswitch afete o transcrito de RNA. Em algumas modalidades, o riboswitch pode incluir uma ribozima. Riboswitches com ribozimas podem inibir ou acentuar a degradação de transcrito dos polinucleotídeos-alvo na presença do ligante de molécula pequena. Em algumas modalidades, a ribozima pode ser uma classe pistola de ribozima, uma classe cabeça de martelo de ribozima, classe torcida de ribozima, uma classe machado de ribozima ou a ribozima de HDV (vírus da hepatite delta).
[413] Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o riboswitch pode ser localizado em várias posições em relação ao polinucleotídeo-alvo, conforme é conhecido geralmente para riboswitches. Em algumas modalidades, o riboswitch pode regular a acessibilidade de doador de splicing de pré-mRNA, splicing de pré-mRNA e pode ser localizado antes do polinucleotídeo-alvo. Em algumas modalidades, o riboswitch pode regular a inclusão de uma cauda poli(A) e ser localizado após o polinucleotídeo-alvo. Em algumas modalidades, o riboswitch pode regular um anti-IRES e ser localizado a montante de um IRES. Em modalidades ilustrativas não limitantes, um riboswitch fornecido no presente documento pode ser localizado em qualquer uma dessas posições em relação a um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados fornecidos no presente documento.
[414] Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento que inclui um polinucleotídeo incluindo um riboswitch, o polinucleotídeo pode incluir adicionalmente uma ou mais de uma sequência tipo Kozak, um elemento de WPRE e um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla, em que um ou mais dos códons de interrupção do códon de interrupção dupla ou do códon de interrupção tripla definem uma terminação de uma leitura de pelo menos uma dentre a uma ou mais unidades transcricionais. Em certas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma sequência tipo Kozak selecionada a partir de CCACCAUG(G) (SEQ ID NO:515), CCGCCAT/UG(G) (SEQ ID NO:516), GCCGCCGCCAT/UG(G) (SEQ ID NO:517) ou GCCGCCGCCAT/UG. Em certas modalidades, tanto os nucleotídeos -3 e +4 em relação a um códon inicial da primeira sequência de ácidos nucleicos incluem um G. Em outra
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156/540 modalidade, que pode ser combinada com a modalidade precedente que inclui uma sequência tipo Kozak e/ou a seguinte modalidade que inclui códon de interrupção tripla, o polinucleotídeo inclui um elemento de WPRE. Em algumas modalidades, o elemento de WPRE é localizado 3 ’ de um códon de interrupção da uma ou mais unidades transcricionais e 5’ a um 3’ LTR do polinucleotídeo. Em outra modalidade, que pode ser combinada com uma ou ambas as modalidades anteriores (isto é, uma modalidade em que o polinucleotídeo inclui uma sequência tipo Kozak e/ou uma modalidade em que o polinucleotídeo incluiu um WPRE), a uma ou mais unidades transcricionais terminam com um ou mais códons de interrupção de um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla.
[415] Em algumas modalidades, o riboswitch pode ser desestabilizado em temperaturas acima de 37,5 °C, 38 °C, 38,5 °C, 39 °C, 39,5 °C ou 40 °C de modo que o riboswitch não seja mais responsivo ao ligante. Em algumas modalidades, a evolução molecular pode ser usada para selecionar os riboswitches que são desestabilizados em temperaturas acima 37,5 °C, 38 °C, 38,5 °C, 39 °C, 39,5 °C ou 40 °C.
[416] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo pode codificar um miRNA, shRNA e/ou um polipeptídeo, em que o polinucleotídeo-alvo é operacionalmente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo pode codificar um elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo pode ser um miRNA ou shRNA. Em algumas modalidades, o miRNA ou shRNA pode potencializar a trajetória de STAT5 ou inibir a trajetória de SOCS. Em algumas modalidades, o miRNA ou shRNA pode alvejar as transcrições de SOCS1, SMAD2, TGFb ou PD-1. Em algumas modalidades, o miRNA é miR155. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo codifica um polipeptídeo e o polipeptídeo pode incluir um CAR incluindo uma região de alvejamento específico para antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[417] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado para regular a expressão de um polinucleotídeo-alvo, incluindo: um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo-alvo ligado de modo operacional a um promotor e um riboswitch, em que o riboswitch inclui: a.) um domínio de aptâmero capaz de se ligar a um fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo com uma afinidade de ligação pelo menos duas vezes maior do que o domínio de aptâmero se liga à guanina ou 2'-deoxiguanosina; e b.) um domínio de comutação de
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157/540 função capaz de regular a expressão do polinucleotídeo-alvo, em que a ligação do análogo de nucleosídeo pelo domínio de aptâmero induz ou suprime a atividade de regulação de expressão do domínio de comutação de função. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode se ligar ao fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo com uma afinidade de ligação pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes maior do que o domínio de aptâmero se liga à guanina ou 2'-deoxiguanosina. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ter entre 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 e 70 nucleotídeos de comprimento na extremidade inferior da faixa e 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 e 100 nucleotídeos de comprimento na extremidade superior da faixa, por exemplo, entre 45 e 80 nucleotídeos de comprimento ou entre 45 e 58 nucleotídeos de comprimento. Nas modalidades ilustrativas, o fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo pode ser o ligante farmacêutico aciclovir (também conhecido como aciclovir e acicloguanosina) ou penciclovir. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ter uma afinidade de ligação ao fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo que é maior do que, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes maior do que a afinidade de ligação ao nucleosídeo ou nucleotídeo. Em algumas modalidades, a ligação do análogo de nucleosídeo pelo domínio de aptâmero pode induzir uma atividade no riboswitch.
[418] Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ser específico para penciclovir e desprovido de reatividade para aciclovir ou, alternativamente, a outro agente antiviral, de modo que a terapia antiviral concomitante possa ser utilizada sem afetar o riboswitch. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode se ligar a penciclovir com uma afinidade de ligação pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes maior do que o domínio de aptâmero que se liga a aciclovir ou outro agente antiviral. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ser específico para aciclovir e desprovido de reatividade para penciclovir ou, alternativamente, a outro agente antiviral, de modo que a terapia antiviral concomitante possa ser utilizada sem afetar o riboswitch. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode se ligar a aciclovir com uma afinidade de ligação pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes maior do que o domínio de aptâmero que se liga a penciclovir ou outro agente antiviral. Em algumas modalidades, os pró-fármacos orais de penciclovir (fanciclovir) e aciclovir (valaciclovir) podem ser dados a um sujeito. Em
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158/540 algumas modalidades, o domínio de aptâmero derivado pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico ao domínio de aptâmero do riboswitch de desoxiguanosina do tipo I-A de Mesoplasma florum. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero derivado pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico ao domínio de aptâmero do riboswitch de xpt de Bacillus subtilis. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o riboswitch pode afetar o transcrito de RNA regulando-se qualquer uma das seguintes atividades: sítio de entrada ribossômico interno, acessibilidade de doador de splicing de pré-mRNA no construto de gene retroviral, splicing de pré-mRNA, tradução, terminação de transcrição, degradação de transcrito, expressão de miRNA ou expressão de shRNA. Em algumas modalidades, o domínio de comutação de função pode controlar a ligação de um anti-IRES a um IRES. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, a presença ou ausência do ligante de molécula pequena pode fazer com que o riboswitch afete o transcrito de RNA. Em algumas modalidades, o riboswitch pode incluir uma ribozima. Riboswitches com ribozimas podem inibir ou acentuar a degradação de transcrito dos genes de interesse na presença do ligante de molécula pequena. Em algumas modalidades, a ribozima pode ser uma classe pistola de ribozima, uma classe cabeça de martelo de ribozima, classe torcida de ribozima, uma classe machado de ribozima ou a ribozima de HDV (vírus da hepatite delta). Em algumas modalidades, o riboswitch pode ser desestabilizado em temperaturas acima de 37,5 °C, 38 °C, 38,5 °C, 39 °C, 39,5 °C ou 40 °C de modo que o riboswitch não seja mais responsivo ao ligante. Em algumas modalidades, a evolução molecular pode ser usada para selecionar os riboswitches que são desestabilizados em temperaturas acima 37,5 °C, 38 °C, 38,5 °C, 39 °C, 39,5 °C ou 40 °C. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo pode codificar um miRNA, shRNA e/ou um polipeptídeo, em que o polinucleotídeo-alvo é operacionalmente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo pode codificar um elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo pode ser um miRNA e, opcionalmente, o miRNA pode estimular a trajetória de STAT5 ou inibir a trajetória de SOCS. Em algumas modalidades, o miRNA pode alvejar as transcrições de SOCS1, SHP, SMAD2, TGFb ou PD-1. Nessas modalidades, o miRNA pode ser miR-155. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo codifica um polipeptídeo e o polipeptídeo pode incluir um CAR incluindo uma região de alvejamento específico para antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de ativação
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159/540 intracelular. As modalidades adicionais de CARs são reveladas em outra parte no presente documento.
[419] Em algumas modalidades, a evolução de aptâmeros pode ser realizada por meio da seleção de aptâmero a partir de bibliotecas de aptâmero de purina ou guanina nativas randomizadas com o uso de métodos SELEX (Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial) incluindo, porém sem limitação, aqueles métodos que empregam óxido de grafeno no processo de seleção e triagem. Em outras modalidades, a metodologia de mutagênese aleatória, tal como PCR propensa a erro, pode ser usada para evoluir construtos de aptâmero ou construtos de riboswitch em que o aptâmero é incorporado no contexto de qualquer uma das atividades de riboswitch descritas no presente documento por triagem in vitro ou em células de mamífero. Em outras modalidades, bibliotecas aleatórias de nucleotídeos podem ser usadas na evolução do riboswitch. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, riboswitches podem ser identificados a partir da triagem de tais bibliotecas in vitro ou em células de mamífero.
[420] Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero evoluído ou derivado pode ter ligação aumentada a análogos do ligante nativo e ligação diminuída ao ligante nativo. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ser configurado para ter ligação aumentada a análogos do ligante nativo e ligação diminuída ao ligante nativo. Em algumas modalidades, o domínio de aptâmero pode ser derivado da família de riboswitch de purina. Em algumas modalidades, o ligante nativo pode ser um nucleosídeo ou nucleotídeo e o análogo pode ser um análogo de nucleosídeo ou análogo de nucleotídeo. Em algumas modalidades, o análogo de nucleosídeo é um fármaco antiviral. Nas modalidades ilustrativas, os domínios de aptâmero podem ser derivados de arcabouços de riboswitch de 2'-desoxiguanosina e guanina e os domínios de aptâmero derivados podem mostrar ligação reduzida à 2'-desoxiguanosina e guanina em relação ao riboswitch do tipo selvagem.
[421] Em algumas modalidades, o riboswitch pode regular a acessibilidade de doador de splicing de pré-mRNA no construto de gene retroviral, em que o construto retroviral aciona os genes de CAR ou outros genes de interesse a partir da fita reversa sob um promotor geral ou um promotor específico para célula T. Em outras modalidades, o riboswitch pode regular um IRES no construto de gene retroviral, em que o construto retroviral aciona a tradução de genes
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160/540 de CAR ou outros genes de interesse. Em outras modalidades, o riboswitch pode controlar a terminador de transcrição dos transcritos de RNA, miRNA ou gene ou pode controlar a tradução do transcrito. Em outras modalidades, o análogo de nucleosídeo riboswitch pode ser integrado a uma ribozima para inibir ou acentuar a degradação de transcrito dos genes de CAR ou outros genes de interesse na presença do análogo de nucleosídeo.
[422] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado para regular a expressão de um polinucleotídeo-alvo que inclui um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo-alvo ligado de maneira funcional a um promotor e um riboswitch que se liga a um fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo, é um vetor de clonagem molecular. O vetor de clonagem molecular pode ser qualquer tipo de vetor de clonagem molecular conhecido na técnica. Como exemplos não limitantes, o vetor pode ser um plasmídeo, a vírus, uma partícula viral incompetente em replicação, um retrovirus ou a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, qualquer um dos quais pode ser um vetor de expressão. Tal vetor de expressão pode codificar qualquer um dos polinucleotídeos-alvo fornecidos anteriormente neste documento. Um ou mais sítios de clonagem múltipla e/ou de restrição podem ser incluídos em um vetor de clonagem molecular 5 ’ ou 3 ’ a um riboswitch fornecido no presente documento de modo que o riboswitch seja ligado de maneira funcional a um polinucleotídeo-alvo inserido no sítio de clonagem múltipla e/ou de restrição.
Chaperonas moleculares [423] Em um aspecto, é fornecido no presente um método para modificar geneticamente e expandir linfócitos de um sujeito que compreende:
A. colocar células T e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo, tipicamente sem exigir estimulação ex vivo anterior em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação que compreendem:
i. um elemento de pseudotipagem em sua superfície que tem a capacidade para se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas; e ii. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de maneira funcional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização
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161/540 geneticamente modificado regulado por um elemento de controle, em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende pelo menos um elemento linfoproliferativo e/ou um receptor de antígeno quimérico, em que o dito contato facilita a transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas;
B. introduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito; e
C. expor as células T e/ou células NK geneticamente modificadas in vivo a um composto que atua como o elemento de controle para afetar a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e promover a expansão dos linfócitos in vivo, modificando geneticamente e expandindo, assim, os linfócitos do sujeito.
[424] Nas modalidades ilustrativas, a transdução é executada sem estimulação ex vivo. Nas modalidades ilustrativas, o composto é uma chaperona molecular, tal como uma chaperona molecular de molécula pequena. Nas modalidades ilustrativas, a ligação da chaperona molecular ao elemento linfoproliferativo e/ou componente CAR aumenta a atividade proliferativa do elemento linfoproliferativo e/ou do CAR. A chaperona molecular pode ser administrada ao sujeito antes de o sangue ser coletado, durante o contato e/ou após as células T e/ou células NK serem introduzidas no sujeito. Algumas modalidades desse aspecto incluem coletar sangue do sujeito. Nessas modalidades, a introdução é uma reintrodução das células que foram coletadas e geneticamente modificadas antes da reintrodução. O processo inteiro, nas modalidades ilustrativas, é um processo mais curto do que os métodos da técnica anterior, como para outros aspectos no presente documento. Por exemplo, o processo inteiro pode ser concluído em menos do que 48 horas, menos do que 24 horas ou menos do que 12 horas. O processo inteiro, em outras modalidades, pode ser concluído em 2, 4, 6 ou 8 horas na extremidade inferior da faixa e 12, 24, 36 ou 48 horas na extremidade superior da faixa.
[425] Consequentemente, em algumas modalidades dos métodos e composições fornecidos no presente documento, o elemento de controle in vivo é uma chaperona molecular. Em comparação a outras modalidades no presente documento com outros elementos de controle in vivo, tais como riboswitches que se ligam tipicamente a um composto para afetar a expressão de um elemento linfoproliferativo ou outro componente de um primeiro ou segundo
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162/540 polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado no presente documento, as chaperonas moleculares são compostos que são os elementos de controle e, como tais, afetam diretamente a atividade de, tipicamente ligando-se a, um elemento linfoproliferativo ou outro componente de um primeiro ou segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado no presente documento. Nos exemplos ilustrativos de tais modalidades dos métodos no presente documento que incluem a administração de chaperonas moleculares, um elemento linfoproliferativo, citocina ligada à membrana e/ou componente de CAR podem ser um elemento linfoproliferativo, citocina ligada à membrana e/ou componente de CAR inativos ou menos ativos que são ligados pela chaperona molecular para aumentar sua atividade. Assim, a ligação-alvo por uma chaperona molecular é tipicamente um polipeptídeo-alvo. Em algumas modalidades, conforme indicado, o polipeptídeo pode ser um primeiro e/ou um segundo polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados, ou um componente de polipeptídeo dos mesmos, cuja atividade é afetada ligandose à chaperona molecular, que, nas modalidades ilustrativas, é uma chaperona molecular de molécula pequena. Em algumas modalidades, o polipeptídeo pode incluir um elemento linfoproliferativo cuja atividade é regulada, nas modalidades ilustrativas, regulada crescentemente por uma chaperona molecular, de preferência, uma chaperona molecular de molécula pequena. A chaperona molecular nos métodos fornecidos no presente documento pode ser um composto que se liga ao elemento linfoproliferativo mutante e/ou componente de CAR inativo, assim, tornando os mesmos ativos.
[426] Em outras modalidades, um elemento linfoproliferativo ou outro domínio de sinalização sofreu mutação para permitir o trânsito para a membrana plasmática apenas na presença de uma chaperona sintética de molécula pequena. Em outras modalidades, a chaperona promove a estabilidade do elemento linfoproliferativo ou outro domínio de sinalização ou proteína e a meia-vida como um potenciado.
[427] Será entendido que os aspectos e modalidades da presente invenção incluem muitas das mesmas etapas e composições fornecidas em detalhes no presente documento. Consequentemente, será entendido que os ensinamentos por todo este relatório descritivo que se referem a esses elementos comuns se aplicam aos aspectos e modalidades que utilizam uma chaperona molecular como o elemento de controle, que se liga tipicamente a um elemento linfoproliferativo ou outra molécula-alvo diretamente, adicionalmente ou em vez de outros
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163/540 elementos de controle in vivo fornecidos no presente documento, tais como riboswitches, que utilizam tipicamente uma molécula, tal como um fármaco, que se liga ao riboswitch.
[428] Em algumas modalidades, a chaperona molecular é um composto que pode regular a localização subcelular de um alvo, por exemplo, o enovelamento e o trânsito apropriados de uma proteína-alvo, tal como um elemento linfoproliferativo e/ou um componente de um CAR, do retículo endoplasmático para a membrana plasmática ou sua meia-vida na superfície. Em outras modalidades, a chaperona molecular pode promover a conformação funcional de um alvo disfuncional, atuando, assim, como um potenciador. Os exemplos de moléculas que atuam como chaperonas ou potenciadores para proteínas que sofreram mutação naturalmente incluem lumacaftor e ivacaftor. Essas proteínas atuam sobre as variantes de canal de cloreto CFTR mutante, tais como G551D ou F508del. Ivacaftor potencializa a atividade do canal de íon com mutação G551D ou F508del, ao mesmo tempo que lumacaftor promove a estabilização de canais de cloreto mutantes e potencialização subsequente por ivacaftor. Tais proteínas dependentes de chaperona podem ser geradas a partir de proteínas naturalmente funcionais e triagem por atividade funcional apenas na presença das chaperonas moleculares. Assim, tais proteínas são apenas ativas quando a chaperona está presente. Os exemplos de tais moléculas que podem ser tríadas por atividade de chaperona específica incluem antivirais ou antiinfecciosos de molécula pequena que não mostram nenhuma atividade a proteínas humanas normais. Consequentemente, em uma modalidade, a chaperona molecular usada nos métodos no presente documento é um composto antiviral ou anti-infeccioso de molécula pequena que não mostra nenhuma atividade a proteínas humanas normais.
[429] Em algumas modalidades, linfócitos geneticamente modificados podem ser expostos e/ou um sujeito pode receber a chaperona molecular. Em algumas modalidades, o composto é administrado ao sujeito antes, durante e/ou após PBLs serem isolados do sangue e antes de as células T e/ou células NK serem colocadas em contato com uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação. A partícula retroviral recombinante incompetente em replicação em tais modalidades inclui um elemento linfoproliferativo e/ou componente de CAR inativo ou menos ativo que se liga ou é regulado pelo composto de chaperona molecular.
[430] Para qualquer uma das modalidades fornecidas no presente documento para modificar e expandir linfócitos, que podem ser parte dos métodos da terapia celular adotiva,
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164/540 o composto pode ser administrado ao sujeito por entre 5, 10, 15, 30 e 60 minutos na extremidade inferior da faixa e 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas na extremidade superior da faixa, antes de os PBLs serem isolados do sangue ou antes de as células T e/ou células NK serem colocadas em contato com uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação. Em algumas modalidades, o composto é administrado ao sujeito por entre 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas na extremidade baixa da faixa e 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 ou 28 dias na extremidade alta da faixa após os PBLs serem isolados do sangue ou após as células T e/ou células NK serem colocadas em contato com partícula retroviral recombinante incompetente em replicação em métodos fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o composto é administrado ao sujeito por pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas ou pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 ou 28 dias após os PBLs serem isolados do sangue ou após as células T e/ou células NK serem colocadas em contato com uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação nos métodos fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o composto é administrado ao sujeito por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90 ou 120 dias ou 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120 meses ou indefinidamente após os PBLs terem sido reinfundidos no sujeito. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, o composto pode ser administrado antes e/ou durante a reinfusão dos PBLs e/ou após os PBLs terem sido reinfundidos.
[431] Para qualquer uma das modalidades no presente documento, as chaperonas moleculares não estão nos elementos de controle que são ligados por compostos que regulam e/ou ativam as mesmas. As chaperonas moleculares são compostos, de preferência, compostos de molécula pequena, que são os elementos de controle e regulam a atividade dos elementos linfoproliferativos e/ou componentes funcionais de CARs.
Linhagens celulares de empacotamento/métodos para fabricar partículas retrovirais recombinantes [432] A presente revelação fornece células de empacotamento de mamífero e linhagens celulares de empacotamento que produzem partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. As linhagens celulares que produzem partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação também são chamadas no presente documento de linhagens celulares de empacotamento. Um exemplo não limitante de tal método é fornecido no
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Exemplo 7 no presente documento. As células da linhagem celular de empacotamento podem ser aderentes ou células em suspensão. Em modalidades ilustrativas, a linhagem celular de empacotamento pode ser uma linhagem celular em suspensão, isto é, uma linhagem celular que não adere a uma superfície durante o crescimento. As células podem ser cultivadas em um meio quimicamente definido e/ou um meio livre de soro. Em algumas modalidades, a linhagem celular de empacotamento pode ser uma linhagem celular em suspensão derivada de uma linhagem celular aderente, por exemplo, a linhagem celular de HEK293 pode ser cultivada em condições para gerar uma linhagem celular de HEK293 adaptada à suspensão de acordo com métodos conhecidos na técnica. A linhagem celular de empacotamento é tipicamente cultivada em meios quimicamente definidos. Em algumas modalidades, os meios de linhagem celular de empacotamento podem incluir soro. Em algumas modalidades, os meios de linhagem celular de empacotamento podem incluir uma substituição de soro, como conhecido na técnica. Em modalidades ilustrativas, os meios de linhagem celular de empacotamento podem ser meios livres de soro. Tal meio pode ser uma formulação livre de soro quimicamente definida fabricada em conformidade com o regulamento da Boa Prática de Fabricação Atual (CGMP) da Administração de Alimento e Fármaco dos EUS (Food and Drug Administration (FDA)). Os meios de linhagem celular de empacotamento podem ser livres de xeno e completos. Em algumas modalidades, os meios de linhagem celular de empacotamento foram liberados por agências reguladoras para uso em processamento celular ex vivo, como um dispositivo liberado pela FDA 510(k). Será entendido no presente documento, onde for mencionado que o meio inclui a composição do meio basal com um suplemento de meio de um número de catálogo como A1048501 ou A1048503, que inclui um suplemento de meio, que a composição mencionada é destinada a significar a composição do meio com o suplemento adicionado. Tipicamente, o fabricante do meio e suplemento fornece instruções para volumes de suplemento a serem adicionados.
[433] Consequentemente, em um aspecto, é fornecido no presente documento um método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação incluindo: A. cultivar uma célula de empacotamento em suspensão em meios livres de soro, em que a célula de empacotamento compreende sequências de ácido nucleico que codificam um genoma de RNA empacotável da partícula retroviral incompetente em replicação, uma proteína REV, um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um elemento de pseudotipagem; e B. coletar a
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166/540 partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação dos meios livres de soro. Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para transduzir um linfócito com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação que compreende: A. cultivar uma célula de empacotamento em suspensão em meios livres de soro, em que a célula de empacotamento compreende sequências de ácido nucleico que codificam um genoma de RNA empacotável da partícula retroviral incompetente em replicação, uma proteína REV, um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um elemento de pseudotipagem; B. coletar a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação dos meios livres de soro; e C. colocar o linfócito em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que o contato é realizado por menos de 24 horas, 20 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 4 horas ou 2 horas (ou entre 1, 2, 3 ou 4 horas na extremidade baixa da faixa e 4, 6, 8, 12, 18, 20 ou 24 horas na extremidade alta da faixa), transduzindo, assim, o linfócito.
[434] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um sistema de empacotamento retroviral que inclui: uma célula de mamífero que inclui: a) um primeiro transativador expresso a partir de um promotor constitutivo e com a capacidade para se ligar a um primeiro ligante e a um primeiro promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência do primeiro ligante; a) um segundo transativador com a capacidade para se ligar a um segundo ligante e a um segundo promotor induzível e afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência de um segundo ligante; e c) um genoma de RNA empacotável para uma partícula retroviral, em que o primeiro transativador regula a expressão do segundo transativador, e em que o segundo transativador regula a expressão de polipeptídeos retrovirais envolvidos no empacotamento viral, tal como, por exemplo, um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e/ou um elemento de pseudotipagem e, opcionalmente, outros polipeptídeos que se tornarão incorporados dentro ou sobre a partícula retroviral recombinante incompetente em replicação e que se acredita que sejam tóxicos às linhagens de células de empacotamento, tais como, por exemplo, HEK-293. Em determinados aspectos, o próprio segundo transativador é citotóxico às linhagens de células de empacotamento. Os elementos de pseudotipagem têm tipicamente a capacidade para se ligar a uma membrana celular de uma célula-alvo e facilitar a fusão à mesma, conforme discutido em detalhes no presente
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167/540 documento. Assim, sem ater-se à teoria, o sistema fornece a capacidade para acumular determinados polipeptídeos/proteínas que não inibem ou não inibem substancialmente ou não se acredita que inibam a proliferação ou sobrevivência das células de mamífero, por exemplo, proteínas não tóxicas, ao mesmo tempo que cultivar uma população das células de mamífero por dias ou indefinidamente e controlar a indução de polipeptídeos que são desejados para o produto retroviral, mas que são inibidores ou podem ser inibidores ou foram relatados como sendo inibidores da sobrevivência e/ou proliferação da célula de mamífero, por exemplo, polipeptídeos tóxicos, até um momento posterior mais próximo do momento em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação serão produzidas e coletadas. O genoma de RNA empacotável é tipicamente codificado por um polinucleotídeo ligado de maneira funcional a um promotor, algumas vezes denominado no presente documento um terceiro promotor para conveniência, em que o dito terceiro promotor é tipicamente induzível ou pelo primeiro transativador ou pelo segundo transativador. Nas modalidades ilustrativas, o genoma de RNA empacotável é codificado por um polinucleotídeo ligado de maneira funcional a um terceiro promotor, em que o dito terceiro promotor é induzível pelo segundo transativador. Como tal, o genoma de RNA empacotável pode ser produzido no ponto de tempo posterior, mais próximo de quando as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação serão coletadas.
[435] Uma pessoa versada na técnica entenderá que muitos transativadores, ligantes e promotores induzíveis diferentes podem ser usados no sistema de empacotamento retroviral. Tais promotores induzíveis podem ser isolados e derivados de muitos organismos, por exemplo, eucariotas e procariotas. A modificação de promotores induzíveis derivados de um primeiro organismo para uso em um segundo organismo, por exemplo, um primeiro procariota e um segundo eucariota, um primeiro eucariota e um segundo um procariota, etc., também é conhecida na técnica. Tais promotores induzíveis, e sistemas baseados em tais promotores induzíveis, mas que também incluem proteínas de controle adicionais, incluem, sem limitação, promotores regulados pelo álcool (por exemplo, promotor do gene da álcool desidrogenase I (alcA), promotores responsivos às proteínas transativadoras de álcool (AlcR) , etc.), promotores regulados por tetraciclina (por exemplo, sistemas promotores incluindo TetActivators, TetON, TetOFF, etc.), promotores regulados por esteroides (por exemplo, sistemas promotores do receptor de glicocorticoides de camundongo, sistemas promotores do receptor de estrogênio
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168/540 humano, sistemas promotores resinoides, sistemas promotores da tiroide, sistemas promotores de ecdisona, sistemas promotores de mifepristona, etc.), promotores regulados por metais (por exemplo, sistemas promotores de metalotioneína, etc.), promotores regulados relacionados com patogênese (por exemplo, promotores regulados por ácido salicílico, promotores regulados por etileno, promotores regulados por benzotiadiazol, etc.) promotores regulados pela temperatura (por exemplo, promotores induzíveis por choque térmico (por exemplo, HSP-70, HSP-90, promotores de choque térmico da soja, etc.), promotores regulados por luz, promotores induzíveis por síntese e similares. Em algumas modalidades, um sistema regulado por mifepristona pode ser usado. Em algumas modalidades, um sistema induzível por mifepristona com um laço de retroalimentação autorregulador pode ser usado. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão reguladora GAL4 é expressa a partir de um construto que também contém as repetições terminais de transposon e sítios lox e FRT. Em algumas modalidades, a proteína de fusão reguladora GAL4 contra a expressão de um transativador tet reverso (rtTA) e BiTRE. Em algumas modalidades, outro construto com sítios lox e FRT contém uma sequência de ativação a montante (UAS) de GAL4 e um promotor Elb TATA box que aciona um repórter como mCherry. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão reguladora GAL4 se liga a sequências de ativação a montante (UAS) de GAL4 tanto no promotor que controla a expressão da proteína de fusão reguladora GAL4 e no promotor que controla a expressão de um polinucleotídeo-alvo. Em algumas modalidades, mifepristona, doxiciclina e puromicina serão usados para indução e seleção da linhagem de células de empacotamento.
[436] Em algumas modalidades, cada um ou ambos os transativadores podem ser divididos em dois ou mais polipeptídeos. Em algumas modalidades, os dois ou mais polipeptídeos podem incluir um domínio de ligação a DNA e um domínio de ativação com a capacidade para estimular um domínio de ativação com a capacidade para estimular a transcrição em polipeptídeos separados. Esse “domínio de ativação” não deve ser confundido com um “elemento de ativação”, tal como um polipeptídeo que se liga a CD3, que tem a capacidade para ativar uma célula T e/ou célula NK e não ativa tipicamente tal célula T e/ou célula NK quando colocado em contato com as mesmas, conforme discutido em detalhes no presente documento. Os polipeptídeos separados podem incluir adicionalmente fusões com polipeptídeos com a capacidade para dimerização através da adição de um ligante. Em algumas modalidades, o
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169/540 domínio de ativação pode ser o domínio de ativação p65 ou um fragmento funcional do mesmo. Nas modalidades ilustrativas dos sistemas de empacotamento no presente documento, o domínio de ligação a DNA pode ser o domínio de ligação a DNA de ZFHD1 ou um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode ser uma fusão com FKBP, ou mutantes e/ou fragmentos funcionais do mesmo, ou múltiplos FKBPs, e outro polipeptídeo pode ser uma fusão com o domínio FRB de mTOR, ou mutantes e/ou fragmentos funcionais do mesmo, e o ligante pode ser rapamicina ou um rapalog funcional. Em algumas modalidades, o FRB contém as mutações K2095P, T2098L e/ou W2101F. Em algumas modalidades, os polipeptídeos separados podem ser FKBP, ou fragmentos funcionais do mesmo, e Calcineurina A, ou fragmentos funcionais da mesma, e o agente de dimerização pode ser FK506. Em algumas modalidades, os polipeptídeos separados podem ser FKBP, ou fragmentos funcionais do mesmo, e CyP-Fas, ou fragmentos funcionais do mesmo, e o agente de dimerização pode ser FKCsA. Em algumas modalidades, os polipeptídeos separados podem ser GAI, ou fragmentos funcionais do mesmo, e GID1, ou fragmentos funcionais do mesmo, e o agente de dimerização pode ser giberelina. Em algumas modalidades, os polipeptídeos separados podem ser Snap-tag e HaloTag, ou fragmentos funcionais dos mesmos, e o agente de dimerização pode ser HaXS. Em algumas modalidades, os polipeptídeos separados podem incluir o mesmo polipeptídeo. Por exemplo, o domínio de ligação a DNA e o domínio de ativação podem ser expressos como proteínas de fusão com FKBP ou GyrB, o agente de dimerização pode ser FK1012 ou coumermicina, respectivamente. Em algumas modalidades, o promotor induzível pode ser a sequência de DNA em que o domínio de ligação a DNA se liga tipicamente. Em algumas modalidades, o promotor induzível pode variar da sequência de DNA em que o domínio de ligação a DNA se liga tipicamente. Em algumas modalidades, o transativador pode ser um rtTA, o ligante pode ser tetraciclina ou doxiciclina, e o promotor induzível pode ser a TRE. Nas modalidades ilustrativas, o primeiro transativador é o domínio de ativação p65 fundido a FRB e o domínio de ligação a DNA ZFHD1 fundido a três polipeptídeos FKBP e o primeiro ligante é rapamicina. Nas modalidades ilustrativas adicionais, o segundo transativador pode ser um rtTA, o segundo ligante pode ser tetraciclina ou doxiciclina, e o promotor induzível pode ser a TRE.
[437] Em algumas modalidades, o primeiro transativador pode regular a expressão de um elemento para controlar a exportação nuclear de transcritos contendo uma
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170/540 sequência consenso, tal como uma Rev de HIV e a sequência consenso pode ser o elemento de resposta de Rev. Nas modalidades ilustrativas, a célula-alvo é uma célula T.
[438] Em algumas modalidades, o elemento de pseudotipagem é um polipeptídeo de envelope retroviral. O elemento de pseudotipagem inclui tipicamente um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico para se ligar e facilitar a fusão de membrana da célula-alvo e membranas virais, conforme discutido em mais detalhes no presente documento. Em algumas modalidades, o elemento de pseudotipagem é a proteína de envelope do vírus endógeno felino (RD 114), a proteína de envelope anfotrópica oncorretroviral, a proteína de envelope ecotrópica oncorretroviral e/ou a proteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Nas modalidades ilustrativas, o elemento de pseudotipagem inclui um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico derivado de diferentes proteínas, conforme discutido em mais detalhes no presente documento. Por exemplo, em uma modalidade ilustrativa, especialmente quando a célula-alvo é uma célula T e/ou célula NK, o polipeptídeo de ligação é um polipeptídeo de hemaglutinina (H) de um Vírus do Sarampo (tal como a cepa de Edmonston do Vírus do Sarampo), ou uma variante de deleção de domínio citoplasmático do mesmo, e o polipeptídeo fusogênico é um polipeptídeo de fusão (F) de um Vírus do Sarampo (tal como a cepa de Edmonston do Vírus do Sarampo), ou um variante de deleção de domínio citoplasmático do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo fusogênico pode incluir múltiplos elementos expressos como um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação e o polipeptídeo fusogênico podem ser traduzidos a partir do mesmo transcrito, mas de sítios de ligação de ribossoma separados, ou o polipeptídeo é clivado após a tradução com o uso de um sinal de divagem de peptídeo ou uma sequência de salto de ribossoma, conforme revelado em outra parte no presente documento, para gerar o polipeptídeo de ligação e o polipeptídeo fusogênico. Em algumas modalidades, quando o polipeptídeo de ligação é um polipeptídeo do Vírus do Sarampo H, ou uma deleção de domínio citoplasmático do mesmo, e o polipeptídeo fusogênico é um polipeptídeo do Vírus do Sarampo F, ou uma deleção de domínio citoplasmático do mesmo, a tradução dos polipeptídeos F e H de sítios de ligação de ribossoma separados resulta em uma quantidade mais alta do polipeptídeo F em comparação ao polipeptídeo H. Em algumas modalidades, a razão entre os polipeptídeos F (ou deleções de domínio citoplasmático dos mesmos) e polipeptídeos H (ou deleções de domínio citoplasmático dos mesmos) é pelo menos
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2:1, pelo menos 3:1, pelo menos 4:1, pelo menos 5:1, pelo menos 6:1, pelo menos 7:1 ou pelo menos 8:1.
[439] Em algumas modalidades, o primeiro transativador pode regular a expressão de um elemento de ativação capaz de se ligar a e ativar uma célula-alvo, como uma célula T ou célula NK. Qualquer um dos elementos de ativação revelado no presente documento pode ser expressado. Por exemplo, nessas modalidades, o elemento de ativação pode incluir: a.) polipeptídeo ligado à membrana a capaz de se ligar a e ativar CD3; e/ou b.) polipeptídeo ligado à membrana a capaz de se ligar a e ativar CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a e ativar CD3 pode ser um anticorpo anti-CD3. Nas modalidades adicionais, o anticorpo anti-CD3 pode ser scFvFc anti-CD3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a e ativar CD28 é CD80, CD86 ou fragmentos funcionais dos mesmos, como um domínio extracelular de CD80.
[440] Em algumas modalidades, o segundo transativador pode regular a expressão de um genoma de RNA empacotável que pode incluir um RNA que codifica um ou mais polipeptídeos-alvo, incluindo como um exemplo não limitante, qualquer um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados revelados no presente documento e/ou uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA. Deve ser observado que é contemplado que o aspecto de sistema de empacotamento retroviral, e o método para produzir um aspecto de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação não são limitados a produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação para transdução de célula T e/ou células NK, mas, em vez disso, para qualquer tipo de célula que pode ser transduzido por partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. O genoma de RNA empacotável, em certas modalidades ilustrativas, é projetado para expressar um ou mais polipeptídeos-alvo, incluindo como um exemplo não limitante, qualquer um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados revelados no presente documento e/ou uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA na orientação oposta (por exemplo, que codifica na fita oposta e na orientação oposta), aos componentes retrovirais como gag e pol. Por exemplo, o genoma de RNA empacotável pode incluir de 5' a 3': uma repetição de terminal longo 5’, ou fragmento truncado ativo da mesma; uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral; uma sequência de ácidos nucleicos
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172/540 que codifica um primeiro e opcionalmente um segundo polipeptídeos-alvo, como, mas sem limitações, um polipeptídeo (ou polipeptídeos) de sinalização geneticamente modificado nas orientação oposta, que pode ser acionado a partir de um promotor nessa orientação oposta em relação à repetição terminal longa de 5' e o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis, que, em algumas modalidades, é chamado de um “quarto” promotor apenas por conveniência (e, por vezes, chamado no presente documento de o promotor ativo em células T e/ou células NK), que é ativo em uma célula-alvo como uma célula T e/ou uma célula NK, porém, nos exemplos ilustrativos, não é ativo na célula de empacotamento ou é ativo apenas de modo induzível ou minimamente ativo na célula de empacotamento; e uma repetição terminal longa de 3', ou fragmento truncado ativo da mesma. Em algumas modalidades, o genoma de RNA empacotável pode incluir um elemento de trato de polipurina central (cPPT)/sequência de terminação central (CTS). Em algumas modalidades, o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral pode ser HIV Psi. Em algumas modalidades, o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral pode ser o Elemento de Resposta Rev. O polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado acionado pelo promotor na orientação oposta a partir da repetição de terminal longa 5', em modalidades ilustrativas, é um ou mais dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados revelados no presente documento e pode expressar opcionalmente uma ou mais moléculas inibidoras de RNA como revelado em maiores detalhes no presente documento.
[441] Será entendido que o número de promotor, como um primeiro, segundo, terceiro, quarto, etc. promotor é apenas para conveniência. Um promotor que é chamado de um “quarto” promotor não deve ser tomado para implicar que há quaisquer promotores adicionais, tais como primeiro, segundo ou terceiro promotores, a não ser que tais outros promotores sejam explicitamente citados. Deve ser observado que cada um dos promotores é capaz de acionar a expressão de uma transcrição em um tipo de célula adequado e tal transcrição forma uma unidade de transcrição.
[442] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode incluir um primeiro elemento linfoproliferativo. Os elementos linfoproliferativos adequados são revelados em outras seções no presente documento. Como um exemplo não limitante, o elemento linfoproliferativo pode ser expresso como uma fusão com um domínio de reconhecimento, tal como um eTag, conforme revelado no presente documento. Em
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173/540 algumas modalidades, o genoma de RNA empacotável pode incluir adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo polipeptídeo geneticamente modificado incluindo um receptor de antígeno quimérico que codifica qualquer modalidade de CAR fornecida no presente documento. Por exemplo, o segundo polipeptídeo geneticamente modificado pode incluir uma primeira região de alvejamento específica para antígeno, um primeiro domínio transmembranar e um primeiro domínio de ativação intracelular. Os exemplos de regiões de alvejamento específicas para antígeno, domínios transmembranares e domínios de ativação intracelulares são revelados em outra parte no presente documento. Em algumas modalidades em que a célula-alvo é uma célula T, o promotor que é ativo em uma célula-alvo é ativo em uma célula T, conforme revelado em outra parte no presente documento, em algumas modalidades em que a célula-alvo é uma célula T, o promotor que é ativo em uma célula-alvo é ativo em uma célula T, como revelado em outra parte no presente documento.
[443] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode incluir um CAR, e a sequência de ácidos nucleicos pode codificar qualquer modalidade de CAR fornecida no presente documento. Por exemplo, o segundo polipeptídeo geneticamente modificado pode incluir uma primeira região de alvejamento específica para antígeno, um primeiro domínio transmembranar e um primeiro domínio de ativação intracelular. Os exemplos de regiões de alvejamento específicas para antígeno, domínios transmembranares e domínios de ativação intracelulares são revelados em outra parte no presente documento. Em algumas modalidades, o genoma de RNA empacotável pode incluir adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo polipeptídeo geneticamente modificado. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo geneticamente modificado pode ser um elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades em que a célula-alvo é uma célula T ou célula NK, o promotor que é ativo em uma célula-alvo é ativo em uma célula T ou célula NK, como revelado em outra parte no presente documento.
[444] Em algumas modalidades, o genoma de RNA empacotável pode incluir adicionalmente um riboswitch, como discutido em outras seções no presente documento. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode estar em orientação reversa. Em modalidades adicionais, o genoma de RNA empacotável pode incluir adicionalmente um riboswitch e, opcionalmente, o
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174/540 riboswitch pode estar em orientação reversa. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, um polinucleotídeo incluindo qualquer um dos elementos pode incluir um sítio de ligação a iniciador. Nas modalidades ilustrativas, bloqueadores de transcrição ou sequências poliA podem ser colocadas próximas aos genes para impedir ou reduzir a transcrição não regulada. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica Vpx na segunda ou na terceira unidade transcricional opcional ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de maneira funcional ao primeiro promotor induzível.
[445] E fornecida em outro aspecto no presente documento uma linhagem celular de empacotamento de mamífero compreendendo um genoma de RNA empacotável para uma partícula retroviral incompetente em replicação, em que o genoma de RNA empacotável compreende:
a. uma repetição terminal longa 5' ou fragmento ativo da mesma;
b. uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral;
c. um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos de um ou mais ácidos nucleicos codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular; e
d. uma repetição terminal longa 3' ou fragmento ativo da mesma.
[446] As moléculas inibidoras de RNA no aspecto acima podem incluir qualquer uma das moléculas inibidoras de RNA, como exemplos não limitantes, shRNA ou miRNA, fornecidas no presente documento em outras seções da presente revelação.
[447] Em algumas modalidades do aspecto de linhagem celular de empacotamento de mamífero, o polinucleotídeo de (c) pode estar em orientação reversa à sequência de ácidos nucleicos que codifica o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis
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175/540 retroviral (b), a repetição terminal longa 5' (a) e/ou a repetição terminal longa 3' (d).
[448] Em algumas modalidades do aspecto de linhagem celular de empacotamento de mamífero, a expressão do genoma de RNA empacotável é acionada por um promotor ativo induzível na linhagem celular de empacotamento de mamífero.
[449] O promotor ativo em células T e/ou células NK que acionam a expressão do RNA induzível e o CAR nesses aspectos fornecidos imediatamente acima, em modalidades ilustrativas, não é ativo ou é apenas minimamente ativo ou ativo de modo induzível na linhagem celular de empacotamento. Esse promotor ativo em células T e/ou células NK em modalidades ilustrativas é localizado no genoma de RNA empacotável entre os ácidos nucleicos que codificam o um (por exemplo, dois) ou mais RNAs induzíveis e o CAR e o 3 ’ LTR.
[450] Em qualquer um dos aspectos direcionados às células empacotáveis ou linhagens celulares no presente documento, que codificam uma ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, pelo menos uma e, em algumas modalidades, todas as moléculas inibidoras de RNA podem incluir uma fita 5’ e uma fita 3’ que são parcial ou totalmente complementares uma à outra, em que a dita fita 5' e a dita fita 3' são capazes de formar um dúplex de RNA de 18 a 25 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a fita 5' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento e a fita 3' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita 5' e a fita 3' pode ter comprimentos iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, a dúplex de RNA pode incluir uma ou mais incompatibilidades. Em modalidades alternadas, o dúplex de RNA não tem incompatibilidades.
[451] Em qualquer um dos aspectos fornecidos imediatamente acima direcionados às células empacotáveis ou linhagens celulares no presente documento, que codificam moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, a molécula de RNA inibidora pode ser um miRNA ou um shRNA. Em algumas modalidades, a molécula inibidora pode ser um precursor de um miRNA como, por exemplo, um Pri-miRNA ou um Pre-miRNA ou um precursor de um shRNA. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas inibidoras de RNA podem ser um miRNA ou shRNA artificialmente derivado. Em outras modalidades, a molécula de RNA inibidora pode ser um dsRNA (transcrito ou artificialmente introduzido) que é processado em um siRNA ou o siRNA em si. Em algumas
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176/540 modalidades, a molécula de RNA inibidora pode ser um miRNA ou shRNA que tem uma sequência que não é encontrada na natureza, ou tem pelo menos um segmento funcional que não é encontrada natureza ou tem uma combinação de segmentos funcionais que não são encontrados na natureza. Em modalidades ilustrativas, pelo menos uma ou todas as moléculas inibidoras de RNA são miR-155.
[452] Em qualquer um dos aspectos fornecidos imediatamente acima direcionados às células empacotáveis ou linhagens celulares no presente documento, que codificam moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, a uma ou mais molécula (ou moléculas) de RNA inibidora, em algumas modalidades, podem compreender orientação de 5 ’ a 3 ’: um braço 5 uma haste 5 um laço, uma haste 3 ’ que é parcial ou totalmente complementar à dita haste 5' e um braço 3’. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas inibidoras de RNA tem essa disposição. Em outras modalidades, todas as duas ou mais moléculas de RNA inibidoras têm essas disposições. Em algumas modalidades, a haste 5' pode ter 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a haste 3' pode ter 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o laço pode ter 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,2 5, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o braço 5’, o braço 3’, ou ambos, são derivados de um miRNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o braço 5’, braço 3’, ou ambos, são derivados de um miRNA de ocorrência natural que é selecionado a partir do grupo que consiste em: miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122 e miR-21. Em modalidades ilustrativas, o braço 5’, braço 3’, ou ambos, são derivados de miR-155. Em algumas modalidades, o braço 5’, braço 3’ ou ambos são derivados de miR-155 de Mus musculus ou miR-155 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, o braço 5' tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:256 ou é uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, uma sequência que é igual ao comprimento como SEQ ID NO:256, ou 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 50% desde que SEQ ID NO: 256 ou é 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou
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177/540 menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:256. Em algumas modalidades, o braço 3' tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:260 ou é uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, igual ao comprimento como SEQ ID NO:260, ou 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 50% desde que SEQ ID NO: 260 ou é uma sequência que tem 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:260. Em algumas modalidades, o braço 3' compreende os nucleotídeos 221 a 283 do Mus musculus BIC.
[453] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para produzir um retrovirus recombinante, incluindo: cultivar uma população de células de empacotamento para acumular um primeiro transativador, em que as células de empacotamento incluem o primeiro transativador expresso a partir de um promotor constitutivo, em que o primeiro transativador tem a capacidade para se ligar a um primeiro ligante e a um primeiro promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência do primeiro ligante, e em que a expressão de um segundo transativador é regulada pelo primeiro transativador; incubar a população de células de empacotamento incluindo o primeiro transativador acumulado na presença do primeiro ligante para acumular o segundo transativador, em que o segundo transativador tem a capacidade para se ligar a um segundo ligante e a um segundo promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência do segundo ligante; e incubar a população de células de empacotamento incluindo o segundo transativador acumulado na presença do segundo ligante induzindo, assim, a expressão dos polipeptídeos retrovirais envolvidos no empacotamento viral, tal como, por exemplo, um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e/ou um elemento de pseudotipagem e, opcionalmente, outros polipeptídeos que se acredita que inibam a proliferação ou sobrevivência de células de mamífero que se tornarão incorporados no ou sobre a partícula retroviral recombinante
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178/540 incompetente em replicação, produzindo, assim, a partícula retroviral recombinante incompetente em replicação. Nas modalidades ilustrativas, um genoma de RNA empacotável é codificado por um polinucleotídeo ligado de maneira funcional a um promotor, algumas vezes denominado, por conveniência, um “terceiro” promotor em que o dito terceiro promotor é ou constitutivamente ativo ou induzível ou pelo primeiro transativador ou, nas modalidades ilustrativas, pelo segundo transativador, produzindo, assim, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Os elementos de pseudotipagem têm tipicamente a capacidade para se ligar a uma membrana celular de uma célula-alvo e facilitar a fusão da membrana de célula-alvo à membrana de partícula retroviral recombinante incompetente em replicação. Os elementos de pseudotipagem podem ser quaisquer proteínas de envelope conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a proteína de envelope pode ser proteína de envelope do vírus de estomatite vesicular (VSV-G), proteína de envelope do vírus endógeno felino (RD114), proteína de envelope anfotrópica oncorretroviral e/ou proteína de envelope ecotrópica oncorretroviral. Uma pessoa versada na técnica entenderá que muitos transativadores, ligantes e promotores induzíveis diferentes podem ser usados no método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Os transativadores, ligantes e promotores induzíveis adequados são revelados em outra parte no presente documento, incluindo acima. Uma pessoa versada na técnica entenderá adicionalmente que os ensinamentos anteriormente neste documento relacionados a um aspecto do sistema de empacotamento retroviral fornecido no presente documento aplicam-se também aos aspectos do método para produzir partícula retroviral recombinante incompetente em replicação, e o inverso.
[454] Em algumas modalidades, o primeiro transativador pode regular a expressão de um elemento para controlar a exportação nuclear de transcritos contendo uma sequência consenso, tal como uma Rev de HIV e a sequência consenso pode ser o elemento de resposta de Rev (RRE). Nas modalidades ilustrativas, a célula-alvo é tipicamente uma célula T. Em algumas modalidades, os RREs de HIV e a região de polinucleotídeo que codifica Rev de HIV podem ser substituídos por RREs de HIV-2 e uma região de polinucleotídeo que codifica a Rev de HIV-2, respectivamente. Em algumas modalidades, os RREs de HIV e a região de polinucleotídeo que codifica Rev de HIV podem ser substituídos por RREs de SIV e uma região de polinucleotídeo que codifica a Rev de SIV, respectivamente. Em algumas modalidades, os
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RREs de HIV e a região de polinucleotídeo que codifica Rev de HIV podem ser substituídos por RemREs e uma região de polinucleotídeo que codifica um betarretrovírus Rem, respectivamente. Em algumas modalidades, os RREs de HIV e a região de polinucleotídeo que codifica Rev de HIV podem ser substituídos por um deltarretrovírus RexRRE e uma região de polinucleotídeo que codifica um deltarretrovírus Rex, respectivamente. Em algumas modalidades, uma proteína do tipo Rev não é exigida, e os RREs podem ser substituídos por elementos de RNA de atuação, tal como o elemento de transporte constitutivo (CTE).
[455] Em algumas modalidades, o elemento de pseudotipagem é uma proteína de envelope viral. O elemento de pseudotipagem inclui tipicamente um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico para se ligar e facilitar a fusão de membrana das membranas de célula-alvo e viral. Em algumas modalidades, o elemento de pseudotipagem pode ser a proteína de envelope do vírus endógeno felino (RD114), a proteína de envelope anfotrópica oncorretroviral, a proteína de envelope ecotrópica oncorretroviral e/ou a proteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Nas modalidades ilustrativas, o elemento de pseudotipagem inclui um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico derivado de diferentes proteínas, conforme discutido em mais detalhes no presente documento. Por exemplo, em uma modalidade ilustrativa, especialmente quando a célula-alvo é uma célula T e/ou célula NK, o polipeptídeo de ligação pode ser uma variante de deleção de domínio citoplasmático de um polipeptídeo do Vírus do Sarampo H e o polipeptídeo fusogênico pode ser a variante de deleção de domínio citoplasmático de um polipeptídeo do Vírus do Sarampo F. Em algumas modalidades, o polipeptídeo fusogênico pode incluir múltiplos elementos expressos como um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação e o polipeptídeo fusogênico podem ser traduzidos a partir do mesmo transcrito e traduzidos a partir de sítios de ligação de ribossoma separados, ou o polipeptídeo pode ser clivado após a tradução com o uso de um sinal de divagem de peptídeo ou uma sequência de salto de ribossoma, conforme revelado em outra parte no presente documento, para gerar o polipeptídeo de ligação e o polipeptídeo fusogênico. Em algumas modalidades, a tradução do polipeptídeo de ligação e polipeptídeo fusogênico de sítios de ligação a ribossoma separados resulta em uma quantidade mais alta do polipeptídeo fusogênico em comparação ao polipeptídeo de ligação. Em algumas modalidades, a razão entre o polipeptídeo fusogênico e o polipeptídeo de ligação é pelo menos 2:1, pelo menos 3:1, pelo menos 4:1, pelo
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180/540 menos 5:1, pelo menos 6:1, pelo menos 7:1 ou pelo menos 8:1.
[456] Em algumas modalidades, o primeiro transativador pode regular a expressão de um elemento de ativação capaz de se ligar a e ativar uma célula-alvo, como uma célula T. Nessas modalidades, o elemento de ativação pode incluir: a.) polipeptídeo ligado à membrana aa capaz de se ligar a e ativar CD3: e/ou b.) polipeptídeo ligado à membrana a capaz de se ligar a e ativar CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a e ativar CD28 é CD80, CD86 ou fragmentos funcionais dos mesmos. Em algumas modalidades, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação pode incluir o elemento de ativação em uma membrana retroviral e o RNA retroviral dentro de um nucleocapsídeo, produzindo, assim, partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação.
[457] Em algumas modalidades, o segundo transativador pode regular a expressão de um RNA incluindo de 5' a 3': uma repetição terminal longa 5', ou fragmento truncado ativo da mesma; uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral; uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro polipeptídeo-alvo e segundo polipeptídeo-alvo opcional, como exemplo não limitante, um ou dois polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados; um promotor que é ativo em uma célula-alvo; e uma repetição terminal longa 3', ou fragmento truncado ativo da mesma. Em algumas modalidades, o RNA pode incluir um elemento cPPT/CTS. Em algumas modalidades, o RNA pode incluir um sítio de ligação a iniciador. Em algumas modalidades, o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral pode ser HIV Psi. Em algumas modalidades, o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral pode ser o Elemento de Resposta Rev. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, os componentes retrovirais no RNA, incluindo RRE e Psi, podem ser localizados em qualquer posição, conforme uma pessoa versada na técnica entenderá. O polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado nas modalidades ilustrativas é um ou mais dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados revelados no presente documento.
[458] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode incluir um primeiro elemento linfoproliferativo. Os elementos linfoproliferativos adequados são revelados em outras seções no presente documento. Em
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181/540 algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é um mutante de receptor de IL-7 fundido a um domínio de reconhecimento, tal como um eTag. Em algumas modalidades, o genoma de RNA empacotável pode incluir adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo polipeptídeo geneticamente modificado incluindo um receptor de antígeno quimérico que codifica qualquer modalidade de CAR fornecida no presente documento. Por exemplo, o segundo polipeptídeo geneticamente modificado pode incluir uma primeira região de alvejamento específica para antígeno, um primeiro domínio transmembranar e um primeiro domínio de ativação intracelular. Os exemplos de regiões de alvejamento específicas para antígeno, domínios transmembranares e domínios de ativação intracelulares são revelados em outra parte no presente documento. Em algumas modalidades em que a célula-alvo é uma célula T, o promotor que é ativo em uma célula-alvo é ativo em uma célula T, como revelado em outra parte no presente documento.
[459] Em algumas modalidades, o genoma de RNA empacotável pode incluir adicionalmente um riboswitch, como discutido em outras seções no presente documento. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode estar em orientação reversa. Em modalidades adicionais, o genoma de RNA empacotável pode incluir adicionalmente um riboswitch e, opcionalmente, o riboswitch pode estar em orientação reversa. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, um polinucleotídeo incluindo qualquer um dos elementos pode incluir um sítio de ligação a iniciador. Nas modalidades ilustrativas, bloqueadores de transcrição ou sequências poliA podem ser colocadas próximas aos genes para impedir ou reduzir a transcrição não regulada. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica Vpx na segunda ou na terceira unidade transcricional opcional ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de maneira funcional ao primeiro promotor induzível.
[460] Em algumas modalidades dos aspectos do sistema de empacotamento ou métodos para produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, o RNA codificado pode incluir um íntron, que pode ser transcrito, por exemplo, a partir do mesmo promotor para expressar o polipeptídeo-alvo (ou polipeptídeos-alvo). Tal íntron pode codificar 1, 2, 3 ou 4 miRNAs, em determinadas modalidades ilustrativas. Nessas e em outras modalidades
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182/540 dos aspectos do sistema de empacotamento ou métodos para produzir aspectos de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, o genoma de RNA empacotável é 11.000 KB ou menos e, em alguns casos, 10.000 KB ou menos em tamanho.
[461] Em algumas modalidades, o primeiro transativador pode afetar a expressão de um ou mais polipeptídeos que são não tóxicos. Em algumas modalidades, o segundo transativador pode afetar a expressão de um ou mais polipeptídeos que são tóxicos. Por exemplo, o primeiro transativador pode induzir a expressão das proteínas retrovirais Rev e Vpx adicionalmente aos polipeptídeos que serão transportados para a membrana celular da célula de empacotamento, e o segundo transativador pode induzir a expressão das proteínas retrovirais GAG, POL, MV(Ed)-FA30, e MV(Ed)-HA18 ou MV(Ed)-HA24 e a expressão do genoma lentiviral. Em algumas modalidades, o primeiro transativador pode afetar a expressão de um ou mais polipeptídeos que são tóxicos e/ou o segundo transativador pode afetar a expressão de um ou mais polipeptídeos que são não tóxicos.
[462] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma célula de empacotamento de mamífero, incluindo: a.) uma primeira unidade transcricional no genoma da célula de empacotamento de mamífero, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro transativador, em que a dita primeira unidade transcricional é ligada de maneira funcional a um promotor constitutivo e em que o dito transativador tem a capacidade para se ligar a um primeiro promotor induzível e afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência de um primeiro ligante, e em que o dito primeiro transativador tem a capacidade para se ligar ao dito primeiro ligante; b.) uma segunda unidade transcricional e uma terceira unidade transcricional opcional no genoma da célula de empacotamento de mamífero, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína REV retroviral e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo transativador com a capacidade para se ligar a um segundo promotor induzível e afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência de um segundo ligante, em que o segundo transativador tem a capacidade para se ligar ao segundo ligante, e em que a segunda unidade transcricional e a terceira unidade transcricional opcional são ligadas de maneira funcional ao primeiro promotor induzível; c.) uma quarta unidade transcricional e uma quinta unidade transcricional opcional no genoma da célula de
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183/540 empacotamento de mamífero, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo gag retroviral e um polipeptídeo pol retroviral, e um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico que têm a capacidade para se ligar e facilitar a fusão de uma membrana de célula-alvo e da membrana retroviral, em que a quarta unidade transcricional e a quinta unidade transcricional opcional são ligadas de maneira funcional ao segundo promotor induzível; e d) uma sexta unidade transcricional no genoma da célula de empacotamento de mamífero, incluindo, de 5' a 3', uma 5' LTR, ou fragmento truncado ativo da mesma, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral, um elemento cPPT/CTS, um complemento reverso de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, um íntron, um promotor que é ativo em uma célula-alvo, e uma 3' LTR, ou fragmento truncado ativo da mesma, em que a sexta unidade transcricional é ligada de maneira funcional ao segundo promotor induzível.
[463] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para produzir uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que inclui: m outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para produzir um retrovirus recombinante que inclui: 1.) cultivar uma população de células de empacotamento para acumular um primeiro transativador, em que as células de empacotamento incluem: a.) uma primeira unidade transcricional no genoma da célula de empacotamento de mamífero, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro transativador, em que a dita primeira unidade transcricional é ligada de maneira funcional a um promotor constitutivo e em que o dito transativador tem a capacidade para se ligar a um primeiro promotor induzível e afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência de um primeiro ligante, e em que o dito primeiro transativador tem a capacidade para se ligar ao dito primeiro ligante; b.) uma segunda unidade transcricional e uma terceira unidade transcricional opcional no genoma da célula de empacotamento de mamífero, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína REV retroviral e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo transativador com a capacidade para se ligar a um segundo promotor induzível e afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência de um segundo ligante, em que o segundo transativador tem a capacidade para se ligar ao segundo ligante, e em que a segunda
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184/540 unidade transcricional e a terceira unidade transcricional opcional são ligadas de maneira funcional ao primeiro promotor induzível; c.) uma quarta unidade transcricional e uma quinta unidade transcricional opcional no genoma da célula de empacotamento de mamífero, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo gag retroviral e um polipeptídeo pol retroviral, e um polipeptídeo de ligação e um polipeptídeo fusogênico que têm a capacidade para se ligar e facilitar a fusão da membrana retroviral com uma membrana de célula-alvo, em que a quarta polipeptídeo e a quinta unidade transcricional opcional são ligadas de maneira funcional ao segundo promotor induzível; e d.) uma sexta unidade transcricional no genoma da célula de empacotamento de mamífero, incluindo de 5' a 3', uma 5' LTR, ou fragmento truncado ativo da mesma, um sítio de ligação a iniciador (PBS), uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral, um elemento cPPT/CTS, um complemento reverso de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, um íntron, um promotor de célula-alvo que é ativo em uma célula-alvo, uma 3' LTR, ou fragmento truncado ativo da mesma, em que a quinta unidade transcricional é ligada de maneira funcional ao segundo promotor induzível; e 2.) incubar a população de células de empacotamento incluindo o primeiro transativador na presença do primeiro ligante para acumular o segundo transativador e a proteína REV retroviral; e 3.) incubar a população de células de empacotamento incluindo o segundo transativador e a proteína REV retroviral na presença do segundo ligante induzindo, assim, a expressão do polipeptídeo gag retroviral, do polipeptídeo pol retroviral, do polipeptídeo de ligação, do polipeptídeo fusogênico e de um RNA retroviral incluindo de 5' a 3', de uma 5' LTR, ou fragmento ativo da mesma, do PBS, do elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral, do complemento reverso da sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, do promotor de célula-alvo, e de uma 3' LTR, ou fragmento truncado ativo da mesma, em que os retrovirus recombinantes são formados e liberados a partir das células de empacotamento, e em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação incluem o polipeptídeo de ligação e/ou o polipeptídeo fusogênico em uma membrana retroviral e o RNA retroviral dentro de um nucleocapsídeo, produzindo, assim, partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação.
[464] Em um aspecto fornecido no presente documento, o sistema de
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185/540 empacotamento retroviral pode incluir uma célula de mamífero incluindo: 1.) um primeiro transativador expresso a partir de um promotor constitutivo e com a capacidade para se ligar a um primeiro ligante e a um primeiro promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência do primeiro ligante; 2.) um segundo transativador com a capacidade para se ligar a um segundo ligante e a um segundo promotor induzível e afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira funcional ao mesmo na presença versus ausência de um segundo ligante; e 3.) um genoma de RNA empacotável para uma partícula retroviral, em que o primeiro transativador regula a expressão do segundo transativador, Rev de HIV, um DAF de GPI de IL7 e um elemento de ativação, e em que o segundo transativador regula a expressão de um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol, um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral e um ou mais polipeptídeos de envelope. Nas modalidades ilustrativas, o primeiro transativador pode ser um domínio FRB fundido a um domínio de ativação p65 e um ou mais domínios FKBP fundidos a um domínio de ligação de DNA de ZFHD1, o primeiro ligante pode ser rapamicina, e o primeiro promotor induzível pode ser um ou mais sítios de ligação de ZFHD1. Nas modalidades ilustrativas, o segundo transativador pode ser uma proteína rtTA, o segundo ligante pode ser tetraciclina ou doxiciclina, e o segundo promotor induzível pode ser um promotor TRE ou um promotor TRE bidirecional. Em modalidades ilustrativas, o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral pode ser HIV Psi. Nas modalidades ilustrativas, a uma ou mais proteínas de envelope incluem variantes de deleção de domínio citoplasmático de polipeptídeos F e H de um Vírus do Sarampo. Nas modalidades ilustrativas, bloqueadores de transcrição ou sequências poliA podem ser colocadas próximas aos genes para impedir ou reduzir a transcrição não regulada. Em algumas modalidades, um genoma lentiviral induzível por rapamicina-doxiciclina com riboswitch pode ser usado (SEQ ID NO:83). Em algumas modalidades, um GAG POL ENV induzível por rapamicina-doxiciclina pode ser usado (SEQ ID NO:84). Em algumas modalidades, um ativador TET induzível por rapamicina pode ser usado (SEQ ID NO:85). Em algumas modalidades, um srcVpx de REV induzível por indutor de rapamicina pode ser usado (SEQ ID NO:86).
[465] Alguns aspectos da presente revelação incluem ou são células, em exemplos ilustrativos, células de mamífero, que são usadas como células de empacotamento para
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186/540 produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, como lentivírus, para transdução de células T e/ou células NK. Qualquer uma dentre uma ampla variedade de células pode ser selecionada para a produção in vitro de um vírus ou partícula viral, tal como uma partícula retroviral recombinante, de acordo com a invenção. As células eucarióticas são tipicamente usadas, particularmente células de mamíferos incluindo células humanas, símio, caninas, felinas, equinas e de roedores. Em exemplos ilustrativos, as células são células humanas. Em outras modalidades ilustrativas, as células reproduzem indefinidamente e são, portanto, imortais. Exemplos de células que podem ser vantajosamente usadas na presente invenção incluem células NIH 3T3, células COS, células de rim canino Madin-Darby, células 293T embrionárias humanas e quaisquer células derivadas de tais células, como células gpnlslacZ φΝΧ, que são derivadas de células 293T. Podem ser usadas células altamente transfectáveis, como células 293T de rim embrionário humano. Por “altamente transfectável” entende-se que pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% das células podem expressar os genes do DNA introduzido.
[466] Células de mamífero adequadas incluem células primárias e linhas celulares imortalizadas. As linhas celulares de mamífero adequadas incluem linhas celulares humanas, linhas celulares de primatas não humanas, linhas celulares de roedores (por exemplo, camundongos, ratos) e similares. Linhas celulares de mamífero adequadas incluem, sem limitação, células HeLa (por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC) n° CCL-2), células CHO (por exemplo, ATCC n° CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 células (por exemplo, ATCC n° CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC n° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por exemplo, ATCC n° CCL1O), células PC12 (ATCC n° CRL1721) , Células COS, células COS-7 (ATCC n° CRL1651), células RAT1, células L de camundongo (ATCC n° CCLI.3), células de rim embrionário humano (HEK) (ATCC n° CRL1573), células HLHepG2, Hut-78 , Jurkat, HL-60, linhas celulares NK (por exemplo, NKL, NK92 e YTS) e similares.
[467] Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, os métodos para produzir um retrovirus recombinante podem incluir cultivar uma célula de empacotamento de mamífero a 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de confluência ou confluência ou a 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de densidade celular de pico ou
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187/540 densidade celular de pico e, então, dividir e diluir as células. Em algumas modalidades, um reator com tanque de agitação pode ser usado para cultivar as células. Em algumas modalidades, as células podem ser divididas pelo menos cerca de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15 ou 1:20 com o uso de métodos que um versado na técnica entenderá. Em algumas modalidades, as células podem ser diluídas a 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de densidade celular de pico. Em algumas modalidades, após a divisão ou diluição das células, as células podem ser cultivadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou 16 horas ou 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias antes da adição do primeiro ligante. Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença do primeiro ligante por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 ou 28 dias na presença do primeiro ligante, que, nas modalidades ilustrativas, pode ser rapamicina ou um rapalog. Em algumas modalidades, o segundo ligante pode ser adicionado e as células podem ser cultivadas por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 ou 28 dias que, nas modalidades ilustrativas, podem ser tetraciclina ou doxiciclina. As condições para cultura dependerão das células e ligantes usados, e os métodos são conhecidos na técnica. Um exemplo específico das condições para cultivar e induzir células HEK293S é mostrado no Exemplo 8.
[468] Conforme revelado no presente documento, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação são uma ferramenta comum para a entrega de gene (Miller, Nature (1992) 357:455 a 460). A capacidade para retrovirus recombinantes entregarem uma sequência de ácidos nucleicos não rearranjada em uma ampla gama de células somáticas de roedores, primatas e seres humanos torna as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação bem adequadas para transferir genes para uma célula. Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem ser derivadas do gênero Alpharetrovirus, do gênero Betaretrovirus, do gênero Gammaretrovirus, do gênero Deltaretrovirus, do gênero Epsilonretrovirus, do gênero Lentivirus ou do gênero Spumavirus. Há muitos retrovirus adequados para o uso nos métodos revelados no presente documento. Por exemplo, vírus da leucemia murina (MLV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), vírus do sarcoma de Rous (RSV), vírus do sarcoma de Fujinami (FuSV), vírus da leucemia murina de Moloney (Mo-MLV), vírus do osteossarcoma murino de FBR (FBR MSV), vírus do sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV), vírus da leucemia murina de Abelson (A-MLV), vírus-29 da
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Mielocitomatose aviária (MC29) e vírus da Eritoblastose aviária (AEV) podem ser usados. Uma lista detalhada de retrovirus pode ser encontrada em Coffin et al (“Retroviruses” 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, Η E Varmus páginas 758 a 763). Os detalhes sobre a estrutura genômica de alguns retrovirus podem ser encontrados na técnica. A título de exemplo, os detalhes sobre HIV podem ser encontrados a partir do NCBI Genbank (isto é, Número de Acesso de Genoma AF033819).
[469] Nas modalidades ilustrativas, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação recombinante podem ser derivadas do gênero Lentivírus. Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem ser derivadas de HIV, SIV ou FIV. Em modalidades ilustrativas adicionais, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem ser derivadas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) no gênero Lentivírus. Lentivírus são retrovirus complexos que, além dos genes retrovirais comuns gag, pol e env, contêm outros genes com função reguladora ou estrutural. A complexidade mais alta possibilita que o lentivírus module o ciclo de vida do mesmo, como no curso da infecção latente. Um lentivírus típico é o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente etiológico da AIDS. In vivo, o HIV pode infectar células terminalmente diferenciadas que raramente se dividem, tais como linfócitos e macrófagos.
[470] Nas modalidades ilustrativas, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento contêm o polipeptídeo Vpx. O polipeptídeo Vpx pode ser expresso em uma linhagem de células de empacotamento, após a integração de um ácido nucleico de codificação de Vpx em seu genoma, por exemplo, como uma proteína ligada à membrana celular que é incorporada a uma membrana de retrovirus (Durand et al., J. Virol. (2013) 87: 234 a 242). Um Vpx ligado à membrana retroviral pode ser construído com uma sequência de processamento para uma protease viral de modo que Vpx livre seja liberado uma vez que incorporado em uma partícula viral. Tal exemplo de uma fusão de Vpx com essa funcionalidade é Src-Flag-Vpx, que inclui um domínio de alvejamento de membrana (MGSSKSKPKDP) (SEQ ID NO:227) dos primeiros 11 aminoácidos de c-Src seguido de um domínio de divagem de protease viral KARVLAEA (SEQ ID NO:228) seguido de Vpx etiquetado com Flag.
[471] Sem ater-se à teoria, o polipeptídeo Vpx auxilia na transdução de células
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189/540 em repouso estimulando-se a eficácia do processo de transcrição reversa degradando-se o fator de restrição SAMHD1. Consequentemente, acredita-se que, nos métodos fornecidos no presente documento em que Vpx está presente em uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação usada para transduzir células T e/ou células NK, Vpx é liberada no citoplasma de uma célula T em repouso ou uma célula NK em repouso mediante a transdução da célula por uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que contém Vpx. Vpx, então, degrada SAMHD1, o que causa um aumento em dNTPs livres, que, por sua vez, estimulam a transcrição reversa do genoma retroviral.
[472] Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento compreendem e/ou contêm o polipeptídeo Vpu. O polipeptídeo Vpu pode ser expressado de um plasmídeo ou em uma linhagem celular de empacotamento, após a integração de um ácido nucleico de codificação de Vpu em seu genoma, por exemplo, como uma proteína de membrana viral que se torna incorporado na membrana retroviral. Uma forma recombinante de Vpu, com seu códon de sequência otimizado para a expressão em seres humanos, pode ser construída e expressada de modo que Vpu livre possa se incorporar nas partículas virais. Vpu é uma proteína suplementar encontrada em HIV-1 e algum isolado de vírus de imunodeficiência símia relacionada ao HIV-1 (SIV), como SIVcpz, SlVgsn e SlVmon, porém, não em HIV-2 ou a maioria de isolados de SIV. A proteína Vpu participa da regulação descendente de CD4 e antagonismo de teterina para liberação de partícula. Mais importante, Vpu compartilha similaridades estruturais com viroporinas, e particularmente a proteína de viroporina M2 do vírus Influenza A (IAV). Assim, a Vpu mostrou formar canais iônicos seletivos de cátion e permeabilizar membranas, em vários modelos. Foi mostrado que IAV-M2 ajuda a acidificar as partículas e, assim, favorece uma liberação precoce da trajetória endossômica usada para a entrada, reduzindo a quantidade de produtos de trânsito sem saída.
[473] O Exemplo 20 no presente documento demonstra que a transdução de PBMCs em repouso por partículas retrovirais é intensificada pela presença de Vpu nas partículas retrovirais. Sem se ater à teoria, o polipeptídeo Vpu auxilia na transdução de células em repouso acelerando-se a acidificação dos pseudotipos lentivirais, permitindo que mais capsídeos alcancem o citoplasma mais rápido. A acidificação do interior viral leva ao enfraquecimento da interação eletrostática entre proteínas de estrutura viral e, assim, facilita a dissociação de complexos de
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190/540 cepsídeo e ribonucleoproteína viral (RNP). Consequentemente, acredita-se que, nos métodos fornecidos no presente documento, onde Vpu estiver presente em uma membrana de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação usada para transduzir as células T e/ou células NK, o Vpu acelera a acidificação das partículas lentivirais na trajetória endossômica, e favorece a liberação de capsídeos no citoplasma de células T em repouso ou células NK em repouso mediante a transdução das células por uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação que contém Vpu. Consequentemente, em algumas modalidades é incluído um polipeptídeo Vpu que compreende ou é um fragmento de Vpu que retém a capacidade para promover a transdução de PBMCs em repouso e em algumas modalidades, células T em repouso. O fragmento pode compreender um fragmento de 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de Vpu que tem pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ou 100% de identidade como um Vpu tipo selvagem. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Vpu inclui um fragmento de Vpu que retém a capacidade para acelerar a acidificação de uma partícula lentiviral na trajetória endossômica.
Tamanho de genoma retroviral [474] Nos métodos e composições fornecidos no presente documento, os genomas retrovirais recombinantes, nos exemplos ilustrativos não limitantes, genomas lentivirais, têm uma limitação ao número de polinucleotídeos que podem ser empacotados na partícula viral. Em algumas modalidades fornecidas no presente documento, os polipeptídeos codificados pela região de codificação de polinucleotídeo podem ser truncamentos ou outras deleções que retêm uma atividade funcional de modo que a região de codificação de polinucleotídeo seja codificada por menos nucleotídeos do que a região de codificação de polinucleotídeo para o polipeptídeo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pela região de codificação de polinucleotídeo podem ser polipeptídeos de fusão que podem ser expressos a partir de um promotor. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão pode ter um sinal de divagem para gerar dois ou mais polipeptídeos funcionais a partir de um polipeptídeo de fusão e um promotor. Ademais, algumas funções que não são exigidas após a transdução ex vivo inicial não são incluídas no genoma retroviral, mas, em vez disso, estão presentes na superfície do vírus ou partícula retroviral recombinante incompetente em replicação por meio da membrana de célula de empacotamento. Essas várias estratégias são usadas no presente documento para maximizar os
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191/540 elementos funcionais que são empacotados dentro das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação.
[475] Em algumas modalidades, o genoma retroviral recombinante a ser empacotado pode ser entre 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000 e 8.000 nucleotídeos na extremidade baixa da faixa e 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, e 11.000 nucleotídeos na extremidade alta da faixa. O genoma retroviral a ser empacotado inclui uma ou mais regiões de polinucleotídeo que codificam um primeiro e um segundo polipeptídeo de sinalização de modificação genética como revelado em detalhes no presente documento. Em algumas modalidades, o genoma retroviral recombinante a ser empacotado pode ter menos de 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000 ou 11.000 nucleotídeos. As funções discutidas em outra parte no presente documento que podem ser empacotadas incluem sequências retrovirais exigidas para montagem e empacotamento retrovirais, tais como regiões de codificação de rev, gag e pol retrovirais, assim como uma 5' LTR e uma 3 ' LTR, ou um fragmento truncado ativo das mesmas, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral e um elemento cPPT/CTS. Ademais, nas modalidades ilustrativas, um vírus ou partícula retroviral recombinante incompetente em replicação no presente documento pode incluir qualquer um ou mais ou todos os seguintes, em algumas modalidades, em orientação reversa dessas regiões funcionais retrovirais: uma ou mais regiões de polinucleotídeo que codificam um primeiro e um segundo polipeptídeos de sinalização de modificação genética, pelo menos um dos quais inclui um elemento linfoproliferativo e pode incluir adicionalmente uma ASTR; um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que pode incluir um receptor de antígeno quimérico; um elemento de controle in vivo, tal como um riboswitch, que regula tipicamente a expressão do primeiro e/ou do segundo polipeptídeos de sinalização de modificação genética; um domínio de reconhecimento, um íntron, um promotor que é ativo em uma célula-alvo, tal como uma célula T, um sinal de divagem 2A e/ou um IRES.
Partículas retrovirais recombinantes [476] As partículas retrovirais recombinantes são reveladas nos métodos e composições fornecidos no presente documento, por exemplo, para transduzir células T e/ou células NK para produzir células T e/ou células NK geneticamente modificadas. As partículas retrovirais recombinantes são, em si, aspectos da presente invenção. Tipicamente, as partículas
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192/540 retrovirais recombinantes incluídas em aspectos fornecidos no presente documento são incompetentes em replicação, o que significa que uma partícula retroviral recombinante não pode se replicar uma vez que sai da célula de empacotamento. Em modalidades ilustrativas, as partículas retrovirais recombinantes são partículas lentivirais.
[477] São fornecidas no presente documento, em alguns aspectos, partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação para uso em transdução de células, tipicamente linfócitos e, em modalidades ilustrativas, células T e/ou células NK. As partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem incluir qualquer um dos elementos de pseudotipagem discutidos em outra parte no presente documento. Em algumas modalidades, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem incluir qualquer um dos elementos de ativação discutidos em outra parte no presente documento. Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação incluindo um polinucleotídeo incluindo: A. uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico (CAR); e B. um elemento de pseudotipagem e um elemento de ativação de célula T em sua superfície, em que o elemento de ativação de célula T não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Em algumas modalidades, o elemento de ativação de célula T pode ser qualquer um dos elementos de ativação discutidos em outra parte no presente documento. Em modalidades ilustrativas, o elemento de ativação de célula T pode ser scFvFc anti-CD3. Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, incluindo um polinucleotídeo incluindo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo incluindo um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo incluindo um elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser um elemento linfoproliferativo quimérico. Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo não compreende IL-7 aglutinado à cadeia de receptor de IL-7 alfa ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo não compreende IL-15 aglutinado à cadeia de receptor de IL-2/IL-15 beta.
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193/540 [478] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, compreendendo um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo compreendendo um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo quimérico, por exemplo, um elemento linfoproliferativo quimérico constitutivamente ativo. Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo quimérico não compreende uma citocina aglutinada ao seu receptor cognato ou aglutinada a um fragmento de seu receptor cognato.
[479] E fornecida no presente documento, em alguns aspectos, uma partícula retroviral recombinante que inclui (i) um elemento de pseudotipagem capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula retroviral recombinante à mesma; (ii) um polinucleotídeo que tem uma ou mais unidades transcricionais ligadas de maneira funcional a um promotor ativo nas células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que tem um receptor de antígeno quimérico que inclui uma região de alvejamento específica para antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que inclui pelo menos um elemento linfoproliferativo; em que a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é regulada por um elemento de controle in vivo; e (iii) um elemento de ativação em sua superfície, em que o elemento de ativação tem a capacidade para se ligar a uma célula T e/ou célula NK e não é codificado por um polinucleotídeo na partícula retroviral recombinante. Em algumas modalidades, o princípio ativo nas células T e/ou células NK não é ativo na linhagem de células de empacotamento ou é ativo apenas na linhagem de células de empacotamento de uma maneira induzível. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento, qualquer um dentre o primeiro e segundo polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados pode ter pelo menos um receptor de antígeno quimérico e o outro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode ter um elemento linfoproliferativo.
[480] Vários elementos e combinações de elementos que são incluídos em
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194/540 partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação são fornecidas ao longo da presente revelação, como, por exemplo, elementos de pseudotipagem, elementos de ativação e citocinas ligadas à membrana, assim como sequências de ácido nucleico que são incluídas em um genoma de uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação como, mas sem limitações, um ácido nucleico que codifica um CAR; um ácido nucleico que codifica um elemento linfoproliferativo; um ácido nucleico que codifica um elemento de controle, como um riboswitch; um promotor, especificamente um promotor que é constitutivamente ativo ou induzível em uma célula T; e um ácido nucleico que codifica uma molécula de RNA inibidora. Ademais, vários aspectos fornecidos no presente documento, como métodos para produzir partículas retrovirais recombinantes, métodos para realizar terapia celular adotiva e métodos para transduzir células T produzem e/ou incluem partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Os recombinantes incompetentes em replicação que são produzidas e/ou incluídas em tais métodos em si formam aspectos separados da presente invenção como composições de partícula retroviral recombinante incompetente em replicação, que podem estar em uma forma isolada. Tais composições podem estar na forma seca (por exemplo, liofilizada) ou podem estar em uma solução adequada ou meio conhecido na técnica para armazenamento e uso de partículas retrovirais.
[481] Consequentemente, como um exemplo não limitante, é fornecida no presente documento, em outro aspecto, uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação que tem em seu genoma um polinucleotídeo que tem uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo nas células T e/ou células NK que, em alguns casos, inclui uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico, ou CAR, como descrito no presente documento. Em outras modalidades, está presente uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos um elemento linfoproliferativo descrito anteriormente no presente documento que não é uma molécula de RNA inibidora. Em certas modalidades, o polinucleotídeo inclui um ou mais riboswitches como apresentado no presente documento, ligados de modo operacional à primeira sequência de ácidos nucleicos, à segunda sequência de ácidos nucleicos e/ou à terceira sequência de ácidos nucleicos,
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195/540 se estiver presente. Em tal construto, a expressão de um ou mais RNAs inibidores, o CAR e/ou um ou mais elementos linfoproliferativos que não são RNAs inibidores é controlada pelo riboswitch. Em algumas modalidades, duas a 10 moléculas inibidoras de RNA são codificadas pela primeira sequência de ácidos nucleicos. Em modalidades adicionais, duas a seis moléculas inibidoras de RNA são codificadas pela primeira sequência de ácidos nucleicos. Em modalidades ilustrativas, 4 moléculas inibidoras de RNA são codificadas pela primeira sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica uma ou mais moléculas inibidoras de RNA e é localizada dentro de um íntron. Em certas modalidades, o íntron inclui toda ou uma porção de um promotor. O promotor pode ser um promotor Pol I, Pol II ou Pol III. Em algumas modalidades ilustrativas, o promotor é um promotor Pol II. Em algumas modalidades, o íntron é adjacente a e a jusante do promotor ativo em uma célula T e/ou célula NK. Em algumas modalidades, o íntron é íntron A EF1 -a.
[482] As modalidades de partícula retroviral recombinante no presente documento incluem aquelas em que a partícula retroviral compreende um genoma que inclui um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas inibidoras de RNA. Várias modalidades alternativas de tais ácidos nucleicos que codificam moléculas inibidoras de RNA que podem ser incluídas em um genoma de uma partícula retroviral, incluindo combinações de tais ácidos nucleicos com outros ácidos nucleicos que codificam um CAR ou um elemento linfoproliferativo diferente de uma molécula de RNA inibidora, são incluídas, por exemplo, na seção de RNA inibidor fornecida no presente documento, assim como em vários outros parágrafos que combinam essas modalidades. Ademais, várias alternativas de tais retrovirus recombinantes incompetentes em replicação podem ser identificadas por ácidos nucleicos exemplificativos que são revelados dentro de aspectos de linhagem celular de empacotamento revelados no presente documento. Um técnico versado irá reconhecer que a revelação, nesta seção, de uma partícula retroviral recombinante que inclui um genoma que codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA, pode ser combinado com várias alternativas para tais ácidos nucleicos que codificam moléculas inibidoras de RNA fornecidas em outras seções no presente documento. Ademais, um técnico versado reconhecerá que tais ácidos nucleicos que codificam ou mais moléculas inibidoras de RNA podem ser combinados com vários outros elementos funcionais de ácido nucleico fornecidos no presente documento como, por exemplo, revelado na
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196/540 seção no presente documento que foca em moléculas inibidoras de RNA e ácido nucleico que codifica essas moléculas. Além disso, as várias modalidades de moléculas inibidoras de RNA específicas fornecidas no presente documento em outras seções podem ser usadas em aspectos de partícula retroviral recombinante da presente revelação.
[483] Os elementos necessários de vetores retrovirais recombinantes, como vetores lentivirais, são conhecidos na técnica. Esses elementos são incluídos na seção de linhagem celular de empacotamento e em detalhes para produzir partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidos na seção Exemplos. Por exemplo, as partículas lentivirais tipicamente incluem elementos de empacotamento REV, GAG e POL, que podem ser entregues às linhagens celulares de empacotamento por meio de um ou mais plasmídeos de empacotamento, um elemento de pseudotipagem, vários exemplos que são fornecidos no presente documento, que podem ser entregues a uma linhagem celular de empacotamento por meio de um plasmídeo de pseudotipagem e um genoma, que é produzido por um polinucleotídeo que é entregue a uma célula hospedeira por meio de um plasmídeo de transferência. Esse polinucleotídeo tipicamente inclui os LTRs virais e um sinal de empacotamento de psi. A 5’ LTR pode ser uma 5’ LTR quimérica fundida a um promotor heterólogo, que inclui 5 ’ LTRs que não são dependentes de transativação de Tat. O plasmídeo de transferência pode ser autoinativador, por exemplo, removendo-se uma região U3 da 3’ LTR. Em algumas modalidades não limitantes, Vpu, como um polipeptídeo compreendendo Vpu (por vezes chamado de um “polipeptídeo Vpu” no presente documento) incluindo, mas sem limitações, Src-FLAG-Vpu, é empacotado dentro da partícula retroviral para qualquer aspecto de composição ou método e modalidade fornecida no presente documento que inclui uma partícula retroviral. Em algumas modalidades não limitantes, Vpx, como Src-FLAG-Vpx, é empacotado dentro da partícula retroviral. Sem se ater à teoria, mediante a transdução de células T, o Vpx entra no citosol das células e promove a degradação de SAMHD1, resultando em um agrupamento aumentado de dNTPs citoplasmáticos disponíveis para transcrição reversa. Em algumas modalidades não limitantes, Vpu e Vpx são empacotados dentro da partícula retroviral para qualquer aspecto de composição ou método e modalidade que inclui uma partícula retroviral fornecida no presente documento.
[484] As partículas retrovirais (por exemplo, partículas lentivirais) incluídas em vários aspectos da presente invenção são, em modalidades ilustrativas, incompetentes em
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197/540 replicação, especificamente por razões de segurança para modalidades que incluem introduzir células transduzida com tais partículas retrovirais em um sujeito. Quando as partículas retrovirais incompetentes em replicação são usadas para transduzir uma célula, as partículas retrovirais não são produzidas a partir da célula transduzida. As modificações no genoma retroviral são conhecidas na técnica para assegurar que as partículas retrovirais que incluem o genoma sejam incompetentes em replicação. Entretanto, será entendido que, em algumas modalidades, para qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento, as partículas retrovirais recombinantes competentes em replicação podem ser usadas.
[485] Um técnico versado reconhecerá que os elementos funcionais discutidos no presente documento podem ser entregues às células de empacotamento e/ou às células T com o uso de diferentes tipos de vetores, como vetores de expressão. Os aspectos ilustrativos da invenção utilizam vetores retrovirais e, em algumas modalidades particularmente ilustrativas, vetores lentivirais. Outros vetores de expressão adequados podem ser usados para alcançar certas modalidades no presente documento. Tais vetores de expressão incluem, sem limitação, vetores virais (por exemplo, vetores virais à base de vírus vaccinia; poliovirus; adenovirus (consulte, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sei 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li e Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adenoassociado (consulte, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sei 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava no documento WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3.822 a 3.828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154 a 165; e Flotte et al., PNAS (1993) 90: 10.613 a 10.617); SV40; vírus herpes simplex; ou um vetor retroviral (por exemplo, Vírus da Leucemia Murina, vírus da necrose do baço e vetores derivados de retrovirus, como Vírus Sarcoma de Rous, Vírus Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário), por exemplo, um retrovirus gama; ou vírus da imunodeficiência humana (consulte, por exemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10.319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7.812, 7.816, 1999); e similares.
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198/540 [486] Em modalidades ilustrativas, uma partícula retroviral é uma partícula lentiviral. Tal partícula retroviral tipicamente inclui um genoma retroviral dentro de um capsídeo que está localizado dentro de um envelope viral.
[487] Em algumas modalidades, Partículas virais contendo DNA são utilizadas em vez de partículas retrovirais recombinantes. Tais partículas virais podem ser adenovirus, vírus adenoassociados, herpesvirus, citomegalovírus, poxvirus, vírus avipox, vírus influenza, vírus da estomatite vesicular (VSV) ou vírus Sindbis. Um versado na técnica apreciará como modificar os métodos aqui descritos para uso com diferentes vírus e retrovirus ou particular retrovirais. Quando são usadas partículas virais que incluem um genoma de DNA, um versado na técnica apreciará que unidades funcionais podem ser incluídas nesses genomas para induzir a integração da totalidade ou de uma porção do genoma de DNA da partícula viral no genoma de uma célula T transduzida com esse vírus.
[488] Em algumas modalidades, o HIV RREs e a região de polinucleotídeo que codifica HIV Rev podem ser substituídos por motivos de ligação de RNA de RGG box Nterminais e uma região de polinucleotídeo que codifica ICP27. Em algumas modalidades, a região de polinucleotídeo que codifica Rev de HIV pode ser substituída por uma ou mais regiões de polinucleotídeo que codificam adenovirus E1B 55-kDa e E4 Orf6.
[489] E fornecido no presente documento, em um aspecto, um recipiente, como um recipiente ou pacote comercial, ou um kit compreendendo o mesmo, compreendendo partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação isoladas de acordo com qualquer um dos aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento. Ademais, é fornecido no presente documento, em outro aspecto, um recipiente, como um recipiente ou pacote comercial, ou um kit que compreende o mesmo, compreendendo células de empacotamento isoladas, em modalidades ilustrativas, células de empacotamento isoladas de uma linhagem celular de empacotamento, de acordo com qualquer um dos aspectos de célula de empacotamento e/ou linhagem celular de empacotamento fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o kit inclui recipientes adicionais que incluem reagentes adicionais como tampões ou reagentes usados em métodos fornecidos no presente documento. Ademais, são fornecidos no presente documento, em certos aspectos, usos de qualquer partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecida no presente
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199/540 documento em qualquer aspecto, na fabricação de um kit para modificar geneticamente uma célula T ou célula NK de acordo com qualquer aspecto fornecido no presente documento. Ademais, são fornecidos no presente documento, em certos aspectos, usos de qualquer célula de empacotamento ou linhagem celular de empacotamento fornecida no presente documento em qualquer aspecto, na fabricação de um kit para produzir as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação de acordo com qualquer aspecto fornecido no presente documento.
[490] E fornecido no presente documento, em um aspecto, um recipiente comercial que contém uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação e instruções para o uso da mesma para tratar crescimento tumoral em um sujeito, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácidos nucleicos pode codificar um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácidos nucleicos pode codificar duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA.
[491] O recipiente que contém as partículas retrovirais recombinantes pode ser um tubo, frasco, poço de uma placa ou outro recipiente para armazenamento de uma partícula retroviral recombinante. O kit pode incluir dois ou mais recipientes, em que um segundo ou outro recipiente pode incluir, por exemplo, uma solução ou meios para transdução de células T e/ou células NK, e/ou o segundo ou outro recipiente pode incluir um agente farmacológico de modulação de pH. Qualquer um desses recipientes pode ser de resistência e grau industrial. A partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação em tais aspectos que incluem um kit e um ácido nucleico que codifica uma molécula de RNA inibidora, pode ser qualquer uma das modalidades para tais partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento, que incluem qualquer uma das modalidades para RNA inibidor fornecidas no presente documento.
[492] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento o uso de uma
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200/540 partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação na fabricação de um kit para modificar geneticamente uma célula T ou célula NK, em que o uso do kit inclui: colocar em contato a célula T ou célula NK ex vivo com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação inclui um elemento de pseudotipagem em uma superfície e um elemento de ativação de célula T na superfície, em que o dito contato facilita a transdução da célula T ou célula NK pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, uma célula T ou célula NK geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a célula T ou célula NK pode ser de um sujeito. Em algumas modalidades, o elemento de ativação de célula T pode ser ligado à membrana. Em algumas modalidades, o contato pode ser realizado por entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 horas na extremidade baixa da faixa e 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 18, 21 e 24 horas na extremidade alta da faixa, por exemplo, entre 1 e 12 horas. A partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação para uso na fabricação de um kit pode incluir qualquer um dos aspectos, modalidades ou submodalidades discutidos em outra parte no presente documento.
Células T e células NK geneticamente modificadas [493] Em modalidades dos métodos e composições no presente documento, linfócitos geneticamente modificados são produzidos, em que os mesmos são um aspecto separado da invenção. Tais linfócitos geneticamente modificados podem ser linfócitos transduzidos. Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma célula T ou célula NK geneticamente modificada em que a célula T ou célula NK foi geneticamente modificada para expressar um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode ser um elemento linfoproliferativo ou um CAR que inclui uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, a célula T ou célula NK pode incluir adicionalmente um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que pode ser um CAR ou um elemento linfoproliferativo. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser um elemento linfoproliferativo quimérico. Em algumas modalidades, a célula T ou célula NK pode incluir adicionalmente um elemento de pseudotipagem em uma superfície. Em algumas modalidades, a célula T ou célula NK pode incluir adicionalmente um elemento de ativação em uma superfície.
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O CAR, elemento linfoproliferativo, elemento de pseudotipagem e elemento de ativação da célula T ou célula NK geneticamente modificada podem incluir qualquer um dos aspectos, modalidades ou submodalidades revelados no presente documento. Em modalidades ilustrativas, o elemento de ativação pode ser scFvFc anti-CD3.
[494] Alguns aspectos fornecidos no presente documento incluem uma célula T ou célula NK geneticamente modificada produzida através da transdução de células T em repouso e/ou células NK em repouso de acordo com um método compreendendo colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um elemento de ligação de célula T ligado à membrana em sua superfície, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas, e em que o contato é realizado por entre 1, 2, 3, 4 ou 6 horas na extremidade baixa da faixa e 4, 6, 8, 10, 12, 18, 20 ou 24 horas na extremidade alta da faixa, por exemplo, entre 1 hora e 12 horas.
[495] Em algumas modalidades, os linfócitos geneticamente modificados são linfócitos como células T ou células NK que foram geneticamente modificados para expressar um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende pelo menos um elemento linfoproliferativo e/ou um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico, que inclui uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos no presente documento, as células NK são células NKT. As células NKT são um subconjunto de células T que expressam CD3 e tipicamente coexpressam um receptor de célula T αβ, mas também expressam uma variedade de marcadores moleculares que são tipicamente associados às células NK (como NK1.1 ou CD56).
[496] Os linfócitos geneticamente modificados da presente revelação têm uma sequência de ácidos nucleicos heterólogos que foi introduzida no linfócito por um método de DNA recombinante. Por exemplo, a sequência heteróloga em modalidades ilustrativas é inserida
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202/540 no linfócito durante um método para transduzir o linfócito fornecido no presente documento. O ácido nucleico heterólogo é encontrado dentro do linfócito e em algumas modalidades é ou não é integrado no genoma do linfócito geneticamente modificado.
[497] Em modalidades ilustrativas, o ácido nucleico heterólogo é integrado ao genoma do linfócito geneticamente modificado. Tais linfócitos são produzidos, em modalidades ilustrativas, com o uso de um método para transduzir linfócitos fornecido no presente documento, que utiliza uma partícula retroviral recombinante. Tal partícula retroviral recombinante pode incluir um polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico que tipicamente inclui pelo menos uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. São fornecidas no presente documento, em outras seções desta revelação, várias modalidades de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação e polinucleotídeos codificados em um genoma da partícula retroviral incompetente em replicação, que podem ser usadas para produzir linfócitos geneticamente modificados que, em si, formam outro aspecto da presente revelação.
[498] Linfócitos geneticamente modificados da presente revelação podem ser isolados fora do corpo. Por exemplo, tais linfócitos podem ser encontrados em meios e outras soluções que são usadas para transdução ex vivo como fornecido no presente documento. Os linfócitos podem estar presentes em uma forma geneticamente não modificada no sangue que é coletado de um sujeito em métodos fornecidos no presente documento e, então, geneticamente modificada durante o método de transdução. Os linfócitos geneticamente modificados podem ser encontrados dentro de um sujeito após serem introduzidos ou reintroduzidos no sujeito após terem sido geneticamente modificados. Os linfócitos geneticamente modificados podem ser uma célula T em repouso ou uma célula NK em repouso, ou a célula T ou célula NK geneticamente modificada pode ser ativamente dividida, especificamente após expressar alguns dos elementos funcionais fornecidos nos ácidos nucleicos que são inseridos na célula T ou célula NK após a transdução como revelado no presente documento.
[499] E fornecida no presente documento, em um aspecto, uma célula T ou célula NK transduzida e/ou geneticamente modificada, que compreende um polinucleotídeo recombinante compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em seu genoma, que expressa um ou mais dos
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203/540 elementos funcionais fornecidos em qualquer um dos aspectos e modalidades da presente revelação. Por exemplo, a uma ou mais unidades transcricionais podem expressar um CAR, que pode incluir qualquer um dos elementos de CAR fornecidos no presente documento como um ASTR, como um exemplo não limitante, um MBR-ASTR, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, e podem incluir adicionalmente, como exemplo não limitante, um domínio modulador. Ademais, o elemento funcional (ou elementos funcionais) expressados dentro da célula T ou célula NK transduzida e/ou geneticamente modificada, um ou mais dos elementos linfoproliferativos fornecidos no presente documento, por exemplo, um receptor de IL7 mutante constitutivamente ativo ou outro elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora (por exemplo, um miRNA ou um shRNA), um domínio de reconhecimento e/ou eliminação.
[500] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma célula T ou célula NK geneticamente modificada que compreende:
a. uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA; e
b. um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, e/ou ácidos nucleicos que codificam as moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA e o CAR, em que a dita uma (por exemplo, duas) ou mais moléculas inibidoras de RNA e o CAR, ou os ácidos nucleicos que codificam as mesmas são codificados por ou são sequências de ácido nucleico que são modificações genéticas da célula T e/ou célula NK.
[501] A célula T ou célula NK geneticamente modificada pode ser uma população de células T e/ou células NK geneticamente modificadas que incluem a uma (por exemplo, duas) ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA; e o CAR.
[502] Em algumas modalidades do aspecto imediatamente acima em que a célula T ou célula NK compreende uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA e o CAR, ou ácidos nucleicos que codificam as mesmas, qualquer uma das modalidades
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204/540 específicas fornecidas no presente documento para elementos que podem ser incluídos como parte do CAR ou que podem ser expressados juntamente com um elemento linfoproliferativo ou usados para controlar um elemento linfoproliferativo pode ser incluída.
[503] Em algumas modalidades do aspecto imediatamente acima em que a célula T ou célula NK compreende uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA e o CAR, ou ácidos nucleicos que codificam as mesmas, o CAR é um CAR biológico restrito ao microambiente (MRB) e/ou a célula T ou célula NK geneticamente modificada pode incluir adicionalmente pelo menos um elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora, e/ou um ácido nucleico que codifica o elemento linfoproliferativo. Em tais modalidades, o elemento linfoproliferativo é codificado por sequências de ácido nucleico que são modificações genéticas da célula T e/ou célula NK. Qualquer um dos elementos linfoproliferativos revelados no presente documento pode ser usado e/ou é possível codificai' para o mesmo em tais modalidades. Por exemplo, o pelo menos um elemento linfoproliferativo pode ser um receptor de IL-7 constitutivamente ativo.
[504] Em algumas modalidades do aspecto imediatamente acima, em que a célula T ou célula NK compreende uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA e o CAR, ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, a molécula de RNA inibidora é um precursor de um miRNA ou um shRNA. Em algumas modalidades desse aspecto, a uma (por exemplo, duas) ou mais moléculas inibidoras de RNA são policistrônicas. Em algumas modalidades deste aspecto, a uma (por exemplo, duas) ou mais moléculas inibidoras de RNA são direcionadas contra os mesmos ou, em modalidades ilustrativas, diferentes alvos de RNA. Em algumas modalidades deste aspecto, uma, a maioria ou todas da uma (por exemplo, duas) ou mais moléculas inibidoras de RNA diminui a expressão de uma TCR endógena.
[505] Em algumas modalidades do aspecto imediatamente acima, em que a célula T ou a célula NK compreende uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA e o CAR, ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, o alvo de RNA é mRNA transcrito de um gene selecionado a partir do grupo que consiste em: PD-1, CTLA4, TCR alfa, TCR beta, CD3 zeta, SOCS, SMAD2, um alvo de miR-155, IFN gama, cCBL, TRAIL2, PP2A e ABCGL Em algumas modalidades deste aspecto, pelo menos uma da uma (por exemplo, duas) ou mais moléculas inibidoras de RNA é miR-155.
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205/540 [506] Em algumas modalidades do aspecto imediatamente acima, em que a célula T ou célula NK compreende uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA e o CAR, ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, a ASTR do CAR é uma MRB ASTR e/ou a ASTR do CAR se liga a um antígeno associado ao tumor. Ademais, em algumas modalidades do aspecto acima, a primeira sequência de ácidos nucleicos é ligada de modo operacional a um riboswitch, que, por exemplo, é capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo e, em modalidades ilustrativas, é um fármaco antiviral como aciclovir.
[507] Nos métodos e composições revelados no presente documento, a expressão de polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados é regulada por um elemento de controle, e em algumas modalidades, o elemento de controle é um polinucleotídeo que compreende um riboswitch. Em certas modalidades, o riboswitch é capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo e, quando o análogo de nucleosídeo está presente, um ou ambos os polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados são expressados.
[508] Os linfócitos geneticamente modificados revelados no presente documento também podem ter polipeptídeos em sua superfície que são restantes de fusão de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação durante um método de transdução fornecido no presente documento. Tais polipeptídeos podem incluir um elemento de ativação, um elemento de pseudotipagem e/ou um ou mais polipeptídeos de fusão que incluem uma citocina.
[509] E fornecida no presente documento, em um aspecto, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada que expressa uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA e um receptor de antígeno quimérico ou CAR, como revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada expressa adicionalmente pelo menos um elemento linfoproliferativo como revelado no presente documento que não é uma molécula de RNA inibidora. Em certas modalidades, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada também expressa um ou mais riboswitches que controlam a expressão da uma ou mais moléculas inibidoras de RNA, do CAR e/ou do pelo menos um elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora. Em algumas modalidades, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada expressa duas a 10 moléculas inibidoras de RNA. Em modalidades adicionais, a célula
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T e/ou célula NK geneticamente modificada expressa duas a seis moléculas inibidoras de RNA. Em modalidades ilustrativas, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada expressa quatro moléculas inibidoras de RNA.
Ácidos nucleicos [510] A presente revelação fornece ácido nucleico que codificam polipeptídeos da presente revelação. Um ácido nucleico, em algumas modalidades, será DNA, incluindo, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Um ácido nucleico, em algumas modalidades, será RNA, por exemplo, RNA sintetizado in vitro.
[511] Em alguns casos, um ácido nucleico fornece a produção de um polipeptídeo da presente revelação, por exemplo, em uma célula de mamífero. Em outros casos, um sujeito ácido nucleico fornece a amplificação do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente revelação.
[512] Uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo da presente revelação pode ser operacionalmente ligada a um elemento de controle da transcrição, por exemplo, um promotor, e potenciador, etc.
[513] Elementos promotores e potenciadores adequados são conhecidos na técnica. Para expressão em uma célula bacteriana, os promotores adequados incluem, sem limitação, lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P e trc. Para expressão em uma célula eucariótica, os promotores adequados incluem, sem limitação, promotor do gene da imunoglobulina de cadeia leve e/ou pesada e elementos potenciadores; promotor precoce imediato de citomegalovírus; promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex; promotores iniciais e tardios de SV40; promotor presente em repetições terminais longas de um retrovirus; promotor de metalotioneínaI de camundongo; e vários promotores específicos do tecido conhecidos na técnica.
[514] Promotores reversíveis adequados, incluindo promotores induzíveis reversíveis são conhecidos na técnica. Tais promotores reversíveis podem ser isolados e derivados de muitos organismos, por exemplo, eucariotas e procariotas. A modificação de promotores reversíveis derivados de um primeiro organismo para uso em um segundo organismo, por exemplo, um primeiro procariota e um segundo eucariota, um primeiro eucariota e um segundo um procariota, etc., também é conhecida na técnica. Tais promotores reversíveis, e sistemas baseados em tais promotores reversíveis, mas que também compreendem proteínas de controle
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207/540 adicionais, incluem, sem limitação, promotores regulados pelo álcool (por exemplo, promotor do gene da álcool desidrogenase I (alcA), promotores responsivos às proteínas transativadoras de álcool (AlcR) , etc.), promotores regulados por tetraciclina (por exemplo, sistemas promotores incluindo TetActivators, TetON, TetOFF, etc.), promotores regulados por esteroides (por exemplo, sistemas promotores do receptor de glicocorticoides de camundongo, sistemas promotores do receptor de estrogênio humano, sistemas promotores resinoides, sistemas promotores da tiroide, sistemas promotores de ecdisona, sistemas promotores de mifepristona, etc.), promotores regulados por metais (por exemplo, sistemas promotores de metalotioneína, etc.), promotores regulados relacionados com patogênese (por exemplo, promotores regulados por ácido salicílico, promotores regulados por etileno, promotores regulados por benzotiadiazol, etc.) promotores regulados pela temperatura (por exemplo, promotores induzíveis por choque térmico (por exemplo, HSP-70, HSP-90, promotores de choque térmico da soja, etc.), promotores regulados por luz, promotores induzíveis por síntese e similares.
[515] Em alguns casos, o locus ou construto ou gene trans contendo o promotor adequado é irreversivelmente trocado através da indução de um sistema induzível. Sistemas adequados para indução de um comutador irreversível são bem conhecidos na técnica, por exemplo, a indução de um comutador irreversível pode fazer uso de uma recombinação mediada por Cre-lox (consulte, por exemplo, Fuhrmann-Benzakein, et al., PNAS (2000)). 28: e99, cuja revelação está aqui incorporada a título de referência). Qualquer combinação adequada de recombinase, endonuclease, ligase, sítios de recombinação, etc. conhecidos na técnica, pode ser usada na geração de um promotor irreversivelmente comutável. Os métodos, mecanismos e requisitos para realizar a recombinação específica de sítio, aqui descritos em outro local, encontram uso na geração de promotores irreversivelmente comutados e são bem conhecidos na técnica, consulte, por exemplo, Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605 e Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA), cujas revelações estão aqui incorporadas a título de referência.
[516] Em alguns casos, o promotor é um promotor específico de células CD8, um promotor específico de células CD4, um promotor específico de neutrófilos ou um promotor específico de NK. Por exemplo, um promotor de gene CD4 pode ser usado; consulte, por exemplo, Salmon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7739; e Marodon et al. (2003) Blood
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101:3.416. Como outro exemplo, um promotor de gene CD8 pode ser usado. A expressão específica para célula NK pode ser conseguida com o uso de um promotor Neri (p46); consulte, por exemplo, Eckelhart et al. (2011) Blood 117:1.565.
[517] Em algumas modalidades, por exemplo, para expressão em uma célula de levedura, um promotor adequado é um promotor constitutivo, tal como um promotor de ADH1, um promotor de PGK1, um promotor de ENO, um promotor de PYK1 e similares; ou um promotor regulável, como um promotor GALI, um promotor GAL1O, um promotor ADH2, um promotor PH05, um promotor CUP1, um promotor GAL7, um promotor MET25, um promotor MET3, um promotor CYCI, um promotor HIS3, um promotor ADH1, um promotor de PGK, um promotor de GAPDH, um promotor de ADCL, um promotor de TRP1, um promotor de URA3, um promotor de LEU2, um promotor de ENO, um promotor de TP1 e AOX1 (por exemplo, para uso em Pichiã). A seleção do vetor e promotor apropriados está bem dentro do nível do versado na técnica.
[518] Promotores adequados para uso em células hospedeiras procariotas incluem, sem limitação, um promotor de RNA polimerase do bacteriófago T7; um promotor trp; um promotor do operon lac; um promotor híbrido, por exemplo, um promotor híbrido lac/tac, um promotor híbrido tac/trc, um promotor trp/lac, um promotor T7/lac; um promotor trc; um promotor tac e similares; um promotor araB AD; promotores regulados in vivo, como um promotor ssaG ou um promotor relacionado (consulte, por exemplo, Publicação de Patente ri US 20040131637), um promotor de pagC (Pulkkinen e Miller, J. Bacterial., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), um promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mal. Micro. 6:2805-2813), e similares (consulte, por exemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; e Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); um promotor sigma70, por exemplo, um promotor de consenso sigma70 (consulte, por exemplo, os números de acesso GenBank AX798980, AX798961 e AX798183); um promotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor dps, um promotor spv e similares; um promotor derivado da ilha de patogenicidade SPI-2 (consulte, por exemplo, o documento WO96/17951); um promotor actA (consulte, por exemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); um promotor rpsM (consulte, por exemplo, Valdivia e Falkow (1996). Mal. Microbial. 22:367); um promotor tet (consulte, por exemplo, Hillen, W. e Wissmann, A.
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209/540 (1989) In Saenger, W. e Heinemann, U. (edições), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, páginas 143-162); um promotor SP6 (consulte, por exemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); e similares. Promotores fortes adequados para uso em procariotas, como Escherichia coli, incluem, sem limitação, Trc, Tac, T5, T7 e PLambda. Exemplos não limitantes de operadores para uso em células hospedeiras bacterianas incluem um operador promotor da lactose (a proteína repressora Laci muda de conformação quando colocada em contato com a lactose, impedindo assim que a proteína repressora Laci se ligue ao operador), um operador promotor do triptofano (quando complexado com triptofano, proteína repressora TrpR tem uma conformação que se liga ao operador, na ausência de triptofano, a proteína repressora TrpR tem uma conformação que não se liga ao operador) e um operador promotor tac (consulte, por exemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21 a 25).
[519] Uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da revelação pode estar presente em um vetor de expressão e/ou um vetor de clonagem. As sequências de nucleotídeos que codificam dois polipeptídeos separados podem ser clonadas nos mesmos vetores ou em vetores separados. Um vetor de expressão pode incluir um marcador selecionável, uma origem de replicação e outros recursos que fornecem replicação e/ou manutenção do vetor. Vetores de expressão adequados incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores virais e similares.
[520] Um grande número de vetores e promotores adequados são conhecidos pelos versados na técnica; muitos estão comercialmente disponíveis para gerar construtos recombinantes de sujeito. Os vetores bacterianos a seguir são fornecidos a título de exemplo: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, CA, EUA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, e pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suécia). Os vetores eucarióticos a seguir são fornecidos a título de exemplo: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL (Pharmacia).
[521] Os vetores de expressão geralmente têm sítios de restrição convenientes localizados perto da sequência promotora para fornecer a inserção de sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas heterólogas. Um marcador selecionável operativo no hospedeiro de expressão pode estar presente.
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210/540 [522] Conforme observado acima, em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente revelação será, em algumas modalidades, RNA, por exemplo, RNA sintetizado in vitro. Os métodos para a síntese in vitro de RNA são conhecidos na técnica; qualquer método conhecido pode ser usado para sintetizar RNA incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da presente revelação. Os métodos para introduzir RNA em uma célula hospedeira são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Zhao et al. (2010) Cancer Res. 15:9053 A introdução de RNA incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da presente revelação em uma célula hospedeira pode ser executada in vitro ou ex vivo ou in vivo. Por exemplo, uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula NK, um linfócito T citotóxico, etc.) pode ser eletroporada in vitro ou ex vivo com RNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo da presente revelação.
[523] Vários aspectos e modalidades que incluem um polinucleotídeo, uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma unidade transcricional e/ou um vetor que inclui os mesmos, inclui adicionalmente um ou mais dentre uma sequência tipo Kozak, um elemento regular pós-transcricional de vírus da hepatite tipo woodchuck (WPRE) e um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla, em que um ou mais códons de interrupção do códon de interrupção dupla ou do códon de interrupção tripla definem uma terminação de uma leitura da pelo menos um dentre a ou mais unidades transcricionais. Em certas modalidades, um polinucleotídeo, uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma unidade transcricional e/ou um vetor incluindo os mesmos, inclui adicionalmente uma sequência tipo Kozak que tem um nucleotídeo de 5’ em 10 nucleotídeos a montante de um códon inicial de pelo menos uma dentre a uma ou mais unidades transcricionais. Em uma modalidade, a sequência tipo Kozak é ou inclui CCACCAT/UG(G) (SEQ ID NO:515), CCGCCAT/UG(G) (SEQ ID NO:516), GCCGCCGCCAT/UG(G) (SEQ ID NO:517) ou GCCGCCACCAT/UG(G) (SEQ ID NO:515) (com nucleotídeos em parênteses representando nucleotídeos opcionais e os nucleotídeos separados por uma barra indica diferentes nucleotídeos possíveis em tal posição, por exemplo, dependendo da possibilidade de o ácido nucleico ser DNA ou RNA. Nessas modalidades que incluem o códon inicial AU/TG, o A pode ser considerado a posição 0. Em certas modalidades ilustrativas, os nucleotídeos em -3 e +4 são idênticos, por exemplo, os nucleotídeos -3 e +4 podem ser G. Em outra modalidade, a sequência tipo Kozak inclui um A ou G na 3a posição a montante
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211/540 de ATG, em que ATG é o códon inicial. Em outra modalidade, a sequência tipo Kozak inclui um A ou G na 3a posição a montante de AUG, em que AUG é o códon inicial. Em uma modalidade ilustrativa, a sequência de Kozak é (GCC)GCCRCCATG, em que R é uma purina (A ou G). Em uma modalidade ilustrativa, a sequência tipo Kozak é GCCGCCACCAUG (SEQ ID NO:518). Em outra modalidade, que pode ser combinada com a modalidade precedente que inclui uma sequência tipo Kozak e/ou a modalidade seguinte que inclui o códon de interrupção tripla, o polinucleotídeo inclui um elemento de WPRE. WPREs foram caracterizados na técnica (consultar, por exemplo, (Higashimoto et al., Gene Ther. 2007) 14: 1298)) e exemplificado nos Exemplos 17 e 18 no presente documento. Em algumas modalidades, o elemento de WPRE é localizado 3 ’ de um códon de interrupção da uma ou mais unidades transcricionais e 5 ’ a um 3 ’ LTR do polinucleotídeo. Em outra modalidade, que pode ser combinada com uma ou ambas as modalidades anteriores (isto é, uma modalidade em que o polinucleotídeo inclui uma sequência tipo Kozak e/ou uma modalidade em que o polinucleotídeo inclui um WPRE), a uma ou mais unidades transcricionais terminam com um ou mais códons de interrupção de um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla, em que o códon de interrupção dupla inclui um primeiro códon de interrupção em um primeiro quadro de leitura e um segundo códon de interrupção em um segundo quadro de leitura, ou um primeiro códon de interrupção em quadro com um segundo códon de interrupção, e em que o códon de interrupção tripla inclui um primeiro códon de interrupção em um primeiro quadro de leitura, um segundo códon de interrupção em um segundo quadro de leitura e um terceiro códon de interrupção em um terceiro quadro de leitura ou um primeiro códon de interrupção em quadro com um segundo códon de interrupção e um terceiro códon de interrupção.
[524] Um códon de interrupção tripla no presente documento inclui três códons de interrupção, um em cada quadro de leitura, a 10 nucleotídeos um do outro e, preferencialmente, tendo sequência sobreposta, ou três códons de interrupção no mesmo quadro de leitura, preferencialmente em códons consecutivos. Um códon de interrupção dupla significa dois códons de interrupção, cada um em um quadro de leitura diferente, a 10 nucleotídeos um do outro e preferencialmente tendo sequências sobrepostas ou dois códons de interrupção no mesmo quadro de leitura, preferencialmente nos códons consecutivos.
[525] Em alguns dos métodos e composições revelados no presente documento,
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212/540 a introdução de DNA em PBMCs, células B, células T e/ou células NK e opcionalmente a incorporação do DNA no genoma de célula hospedeira, é realizado com o uso de métodos que não utilizam partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Por exemplo, outros vetores virais podem ser utilizados, como aqueles derivados de adenovirus, vírus adenoassociado ou vírus-1 do herpes simplex, como exemplos não limitantes.
[526] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos no presente documento podem incluir transfectar e/ou transduzir células-alvo com vetores não virais. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento que utiliza vetores não virais para transfectar as células-alvo, os vetores não virais, incluindo DNA puro, pode ser introduzido nas células-alvo como, por exemplo, PBMCs, células B, células T e/ou células NK com o uso de métodos que incluem eletroporação, nucleofecção, formulações lipossômicas, lipídios, dendrímeros, polímeros catiônicos como poli(etilenimina) (PEI) e poli(l-lisina) (PLL), nanopartículas, peptídeos de penetração celular, microinjeção e/ou vetores não integrantes. Em algumas modalidades, o DNA pode ser introduzido em células-alvo, como PBMCs, células B, células T e/ou células NK em um complexo com lipossomos e protamina. Outros métodos para transfectar e/ou transduzir células T e/ou células NK ex vivo que podem ser usadas em modalidades de métodos fornecidos no presente documento são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Morgan and Boyerinas, Biomedicines, abril de 2016 20;4(2). pii: E9, incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade).
[527] Em algumas modalidades do método fornecido no presente documento, o DNA pode ser integrado no genoma com o uso de sistemas de carreador à base de transposons por cotransfecção, conucleofecção ou coeletroporação de DNA-alvo como plasmídeo contendo os fragmentos de ITR de transposon em extremidades 5 ’ e 3 ’ do gene de interesse e sistema de carreador de transposase como DNA ou mRNA ou proteína ou recombinases de serina específicas de sítio como phiC31 que integra o gene de interesse em sítios de pseudo attP no genoma humano, nesse caso, o vetor de DNA contém um sítio de attB de 34 a 40 bp que é a sequência de reconhecimento para a enzima de recombinase (Bhaskar Thyagarajan et al. Site-Specific Genomic Integration in Mammalian Cells Mediated by Phage cpC31 Integrase, Mol Cell Biol. Junho de 2001; 21(12): 3.926 a 3.934) e cotransfectada com a recombinase. Para as células T e/ou células NK, os sistemas à base de transposon que podem ser usados em certos métodos fornecidos no
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213/540 presente documento utilizam o sistema de carreador de DNA Sleeping Beauty (consultar, por exemplo, Patente n° U.S. 6.489.458 e Pedido de Patente n° 15/434.595, incorporados a título de referência no presente documento em suas totalidades), o sistema de carreador de DNA PiggyBac (consultar, por exemplo, Manuri et al., Hum Gene Ther. abril de 2010;21(4):427-37, incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade), ou o sistema de transposon Tol2 (consultar, por exemplo, Tsukahara et al., Gene Ther. fevereiro de 2015; 22(2): 209 a 215, incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade) em forma de DNA, mRNA ou proteína. Em algumas modalidades, os transposon e/ou transposase dos sistemas de vetor à base de transposon podem ser produzidos como um vetor de DNA minicírculo antes da introdução nas células T e/ou células NK (consultar, por exemplo, Hudecek et al., Recent Results Cancer Res. 2016;209:37 a 50 e Monjezi et al., Leukemia, janeiro de 2017;31(1): 186 a 194, incorporados a título de referência no presente documento em suas totalidades). O CAR ou elemento linfoproliferativo também pode ser integrado nos sítios definidos e específicos no genoma com o uso de integração mediada por CRISPR ou TALEN, adicionando-se braços de homologia de 50 a 1.000 bp homólogos à integração 5’ e 3’ do sítio-alvo (Jae Seong Lee et al. Scientific Reports 5, Artigo número: 8.572 (2015), Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway). CRISPR ou TALEN fornecem especificidade e divagem alvejada genômica e o construto será integrado por meio de união de extremidade mediada por homologia (Yao X at al. Cell Res. junho de 2017;27(6):801 a 814. doi: 10.1038/cr.2017.76. Epub 19 de maio de 2017). O CRISPR ou TALEN pode ser cotransfectado com plasmídeo-alvo como DNA, mRNA ou proteína.
Células de empacotamento [528] A presente revelação fornece células de empacotamento e linhagens celulares de mamífero que são linhagens celulares de empacotamento que produzem partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação que modificam geneticamente célulasalvo de mamífero e as próprias células-alvo de mamífero. Em modalidades ilustrativas, a célula de empacotamento compreende sequências de ácido nucleico que codificam um genoma de RNA empacotável da partícula retroviral incompetente em replicação, uma proteína REV, um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um elemento de pseudotipagem.
[529] Células de mamífero adequadas incluem células primárias e linhas
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214/540 celulares imortalizadas. As linhas celulares de mamífero adequadas incluem linhas celulares humanas, linhas celulares de primatas não humanas, linhas celulares de roedores (por exemplo, camundongos, ratos) e similares. Linhas celulares de mamífero adequadas incluem, sem limitação, células HeLa (por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC) n° CCL-2), células CHO (por exemplo, ATCC n° CRL9618, CCL61, CRL9096), células HEK293 (por exemplo, ATCC n° CRL-1573), células HEK293 adaptadas a suspensão, células Vero, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC n° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por exemplo, ATCC n° CCL1O), células PC12 (ATCC n° CRL1721) , Células COS, células COS-7 (ATCC n° CRL1651), células RAT1, células L de camundongo (ATCC n° CCLI.3), células de rim embrionário humano (HEK) (ATCC n° CRL1573), células HLHepG2, Hut-78 , Jurkat, HL-60, linhas celulares NK (por exemplo, NKL, NK92 e YTS) e similares.
[530] Em algumas ocorrências, a célula não é uma linhagem celular imortalizada, mas, em vez disso, uma célula (por exemplo, uma célula primária) obtida a partir de um indivíduo ou uma célula ex vivo. Por exemplo, em alguns casos, a célula é uma célula imune obtida a partir de um indivíduo. Com outro exemplo, a célula é uma célula-tronco ou uma célula progenitora obtida a partir de um indivíduo. Em qualquer uma das modalidades e aspectos fornecidos no presente documento, os quais incluem uma célula B, célula T, ou célula NK, a célula pode ser uma célula autóloga ou pode ser uma célula alogeneica (também chamada de célula alogênica no presente documento). Em algumas modalidades, a célula alogênica pode ser uma célula alogênica geneticamente modificada. As células alogeneicas, como células T alogênicas, e os métodos para modificar geneticamente as células alogeneicas são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a célula alogeneica pode ser uma célula imortalizada. Em algumas modalidades em que a célula alogeneica é uma célula T, a célula T foi geneticamente modificada, de modo que pelo menos uma de suas cadeias de receptor de célula T não funcione e/ou seja pelo menos parcialmente deletada. Em algumas modalidades, a célula alogeneica pode ser modificada de modo que falte todo ou parte do gene de microglobulina B2. Em algumas modalidades em que as células alogeneicas são usadas em métodos no presente documento, os elementos linfoproliferativos e/ou CLEs podem funcionar para reduzir o número de células que são necessárias para praticar uma invenção no presente documento e pode facilitar a fabricação celular de células T, células B ou células NK de um sujeito.
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Métodos para ativar uma célula imune [531] A presente revelação fornece métodos de ativação de célula imune, em modalidades ilustrativas, um linfócito, in vitro, in vivo ou ex vivo. Os métodos geralmente envolvem colocai' uma célula imune (in vitro, in vivo ou ex vivo) em contato com um elemento de ativação ou com um ou mais antígenos-alvo, em que a célula imune foi geneticamente modificada para produzir um CAR restrito ao microambiente da presente revelação. Na presença do um ou mais antígenos-alvo, o CAR restrito ao microambiente ativa a célula imune, produzindo, assim, uma célula imune ativada. As células imunes incluem, por exemplo, um linfócito T citotóxico, uma célula NK, uma célula T CD4+, uma célula reguladora T (Treg), uma célula T γδ, uma célula NK-T, neutrófilos, etc. Em outras modalidades, colocar uma célula T em contato com um agente de ativação de célula T ativa a célula T. Tais métodos são fornecidos no presente documento e discutidos na seção Elemento de ativação no presente documento.
[532] O contato da célula imunológica geneticamente modificada (por exemplo, um linfócito T, uma célula NK) com um ou mais antígenos-alvo pode aumentar a produção de uma citocina pela célula imunológica em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20 %, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a quantidade de citocina produzida pela célula imune na ausência do um ou mais antígenos-alvo. As citocinas cuja produção pode ser aumentada incluem, sem limitação, IL2 e IFN-γ.
[533] O contato de uma célula citotóxica geneticamente modificada (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) com AAR pode aumentar a atividade citotóxica da célula citotóxica em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25% cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica da célula citotóxica na ausência do um ou mais antígenos-alvo.
[534] O contato de uma célula citotóxica geneticamente modificada (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) com um ou mais antígenos-alvo pode aumentar a atividade
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216/540 citotóxica da célula citotóxica em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25% cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica da célula citotóxica na ausência do um ou mais antígenos-alvo.
[535] Em outras modalidades, por exemplo, dependendo da célula imune do hospedeiro, o contato de uma célula hospedeira geneticamente modificada com um antígeno pode aumentar ou diminuir a proliferação celular, a sobrevivência celular, a morte celular e similares.
Métodos para produzir uma região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente [536] Em algumas modalidades, os domínios de ligação a antígeno (também denominados no presente documento regiões-alvo específicas para antígeno ou ASTRs) de CARs se ligam constitutivamente a seus antígenos cognatos. Em outras modalidades, as ASTRs podem ser restritas ao microambiente, de preferência, ou apenas se ligando a seu antígeno cognato sob determinadas condições anormais, tais como aquelas que existem no microambiente de tumor, conforme revelado em mais detalhes no presente documento. As ASTRs restritas ao microambiente que se ligam preferencial ou exclusivamente sob condições anormais de um microambiente de tumor podem fornecer uma redução nos efeitos em alvo fora de tumor na medida em que a ligação ao antígeno em condições fisiológicas normais é reduzida, em algumas situações, a níveis abaixo da detecção por imunoensaios. Em determinados aspectos, os CARs fornecidos no presente documento incluem uma ASTR restrita ao microambiente que se liga especificamente a uma proteína-alvo, em que a ASTR é um fragmento scFv que inclui uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve.
[537] Determinadas modalidades ilustrativas dos aspectos revelados no presente documento, por exemplo, os métodos, células, linhagens de células, partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, polinucleotídeos ou vetores revelados no presente documento incluem CARs que incluem regiões de alvejamento específicas para antígeno restritas ao microambiente.
[538] Consequentemente, em um aspecto, é fornecido no presente documento
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217/540 um receptor de antígeno quimérico para se ligar a um antígeno-alvo que inclui:
a) uma região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente que exibe um aumento na ligação ao antígeno-alvo em uma condição anormal em comparação a um ambiente fisiológico normal, em que a região de alvejamento específica para antígeno se liga ao alvo;
b) um domínio transmembranar; e
c) um domínio de ativação intracelular.
[539] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um receptor de antígeno quimérico para se ligar a um antígeno-alvo que inclui:
a) pelo menos uma região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente selecionada pela triagem de uma biblioteca de polipeptídeo e que tem um aumento na atividade em um ensaio de ligação a antígeno-alvo em uma condição anormal em comparação a uma condição fisiológica normal;
b) um domínio transmembranar; e
c) um domínio de ativação intracelular.
[540] Em algumas modalidades de qualquer aspecto revelado no presente documento, qualquer um dos receptores de antígeno quiméricos pode ser restrito ao microambiente de modo que os mesmos exibam um aumento na atividade de ligação em uma condição anormal em comparação a uma condição fisiológica normal. Em algumas modalidades ilustrativas de qualquer aspecto revelado no presente documento, a ASTR restrita ao microambiente é identificada a partir de uma biblioteca de polipeptídeo inicial sem membros de mutação/evolução da biblioteca antes da triagem/evolução e/ou sem mutação durante ou entre os ciclos repetidos opcionais de triagem. Domínios transmembranares exemplificativos e domínios de ativação intracelular podem ser quaisquer daqueles aqui revelados para CARs.
[541] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método para selecionar uma ASTR restrita ao microambiente que compreende a triagem de uma biblioteca de apresentação em polipeptídeo:
a. submetendo polipeptídeos da biblioteca de apresentação em polipeptídeo a um ensaio de ligação a antígeno-alvo sob uma condição fisiológica normal e um ensaio de ligação a antígeno-alvo sob uma condição anormal; e
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b. selecionando um polipeptídeo que exibe um aumento na atividade de ligação a antígeno-alvo na condição anormal em comparação à condição fisiológica, selecionando, assim, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente.
[542] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para isolar uma ASTR restrita ao microambiente que inclui a triagem de uma biblioteca de polipeptídeo:
colocando a biblioteca de polipeptídeo sob condições anormais em contato com um antígeno-alvo ligado a um suporte sólido, em que os clones que expressam polipeptídeos que se ligam ao antígeno-alvo permanecem ligados ao suporte sólido através do antígenoalvo;
incubando os suportes sólidos com polipeptídeos ligados sob condições fisiológicas; e coletando clones que eluem do suporte sólido sob as condições fisiológicas, isolando, assim, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente.
[543] Em algumas modalidades ilustrativas de qualquer aspecto revelado no presente documento, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente é identificada a partir de uma triagem de biblioteca de polipeptídeo inicial sem membros de mutação/evolução da biblioteca antes da triagem e/ou sem mutação/evolução durante ou entre os ciclos repetidos opcionais de triagem ou seleção.
[544] As condições fisiológicas normais podem incluir aquelas dentre temperatura, pH, pressão osmótico, osmolalidade, estresse oxidativo e concentração de eletrólitos que seriam consideradas dentro de uma faixa normal no sítio de administração, ou no tecido ou órgão no sítio de ação, a um sujeito. Uma condição anormal é esta que desvia da faixa normalmente aceitável para essa condição. Em um aspecto, uma região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente (isto é, polipeptídeo) é virtualmente inativa em condições normais, mas é ativa em condições diferentes de normais a um nível que é igual ou melhor do que em condições normais. Por exemplo, em um aspecto, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente é virtualmente inativa à temperatura corporal, mas é ativa a temperaturas mais baixas. Em outro aspecto, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente é reversível ou irreversivelmente inativada em condições normais. Em um aspecto adicional, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente
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219/540 é uma proteína terapêutica. Em outro aspecto, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente é usada como um fármaco ou agente terapêutico. Em ainda outro aspecto, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente é mais ou menos ativa em sangue altamente oxigenado, tal como, por exemplo, após a passagem através do pulmão ou nos ambientes de pH mais baixo encontrados no rim.
[545] Em algumas modalidades, um único ciclo de seleção é realizado para obter a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente. Em determinadas modalidades, o método de triagem ou seleção é repetido após a identificação de polipeptídeos livres que se ligam a antígeno sob condições anormais e não se ligam sob condições fisiológicas, ou células que expressam um polipeptídeo de teste que tinha essas propriedades, ou fago revestido com um polipeptídeo de teste que tem tais propriedades em um ciclo inicial ou anterior. Em alguns métodos, fagos que são coletados são usados para infectar células, que também podem ser infectadas com fago auxiliar, a fim de amplificar o fago coletado. Em outros métodos em que os polipeptídeos na superfície das células são testados, as células coletadas podem ser cultivadas para amplificar os polipeptídeos expressos pelas células amplificando-se os polinucleotídeos nas células que codificam os polipeptídeos. Em algumas modalidades, a amplificação é feita cultivando-se células que expressam os polipeptídeos identificados sem realizar um processo para realizar a mutação dos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos identificados entre os ciclos. Assim, os polipeptídeos que foram coletados em um ciclo anterior são enriquecidos amplificando-se as células que contêm polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos coletados.
[546] O método de seleção ou triagem pode ser realizado uma única vez, ou repetido por 1 a 1.000 vezes. Em modalidades ilustrativas, a seleção é repetida 1 a 20 vezes ou 2 a 10 vezes ou 2 a 5 vezes.
[547] Em outros métodos, as ASTRs restritas ao microambiente contra um antígeno de interesse (isto é, antígeno-alvo) são realizadas com o uso de um ou mais ciclos de mutação/evolução entre os ciclos de seleção. Num método, uma proteína de tipo selvagem é identificada, por exemplo, gerando uma biblioteca de polipeptídeos ou proteínas e pesquisando o polipeptídeo ou biblioteca de proteínas para um polipeptídeo ou proteína com uma afinidade de ligação desejada para um antígeno alvo. Em algumas modalidades em que as proteínas do tipo
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220/540 selvagem são anticorpos, os anticorpos do tipo selvagem podem ser revelados gerando e pesquisando bibliotecas de anticorpos policlonais ou monoclonais, incluindo bibliotecas de anticorpos de apresentação em fagos, por exemplo, bibliotecas de anticorpos humanizados para apresentação em fagos.
[548] Os ASTRs desenvolvidos podem ser gerados submetendo a proteína do tipo selvagem, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína de tipo selvagem, a um processo de mutagênese para produzir uma população de polipeptídeos mutantes que podem ser triados para identificar um mutante ASTR com uma atividade aumentada (por exemplo, maior afinidade de ligação ao antígeno alvo) em um ambiente tumoral e/ou em uma condição de ensaio substituto de tumor in vitro, em comparação com um ambiente fisiológico normal. Os exemplos de tais métodos são fornecidos no documento no WO2016033331 (CONDITIONALLY ACTIVE CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR MODIFIED T CELLS) ou na Patente no U.S. 8.709.755, ambos incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Esse método para gerar um anticorpo restrito ao microambiente é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[549] Em outras modalidades, os polipeptídeos específicos para antígeno restritos ao microambiente (isto é, regiões de alvejamento, por exemplo, anticorpos) podem ser identificados pela triagem de uma biblioteca de polipeptídeo inicial sob condições anormais versus fisiológicas e identificação de um polipeptídeo de teste a partir da biblioteca de polipeptídeo inicial, que se liga preferencial ou exclusivamente sob condições anormais versus fisiológicas. Em alguns exemplos, os polipeptídeos específicos para antígeno restritos ao microambiente identificados e isolados (isto é, regiões de alvejamento, por exemplo, anticorpos) identificados a partir de uma biblioteca de polipeptídeo inicial em uma triagem de biblioteca de polipeptídeo inicial se ligam a seu antígeno cognato preferencial ou exclusivamente sob condições anormais versus fisiológicas. Em tais casos, nenhum ciclo de mutação/evolução é realizado. Consequentemente, o método nas modalidades ilustrativas é realizado sem polinucleotídeos em mutação que codificam a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente isolada entre os ciclos de triagem (por exemplo, ciclos de seleção) ou é realizado apenas para um único ensaio de ligação sob condições anormais versus fisiológicas para isolar e identificar o polipeptídeo específico para antígeno restrito ao microambiente (isto é, região de
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221/540 alvejamento, por exemplo, anticorpo). O método pode ser realizado cultivando, amplificando com alta fidelidade e/ou diluindo polinucleotídeos que codificam regiões de alvejamento específicas para antígeno, ou organismos hospedeiros incluindo os mesmos, entre os ciclos de triagem e/ou seleção, sem qualquer mutação/evolução. Ademais, o método pode ser realizado sem repetir a triagem e/ou seleção e pode ser realizado sem mutação /evolução de um polinucleotídeo que codifica a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente isolada, após o polipeptídeo específico para antígeno restrito ao microambiente (isto é, região-alvo, por exemplo, anticorpo) ser isolado.
[550] Os ensaios para uso nos métodos fornecidos no presente documento para detectar a ligação de um polipeptídeo a um parceiro de ligação cognato incluem ensaios com base em célula e, em particular, ensaios realizados com o uso de sistemas de apresentação em superfície celular, tais como sistemas de apresentação em superfície de célula de mamífero. Em um método exemplificativo, os ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo ou uma biblioteca de polipeptídeos variantes, incluindo uma biblioteca de polipeptídeos modificados, podem ser introduzidos em um vetor adequado para expressão em células, tais como células de mamífero. As células são, então, transfectadas com o vetor, e o polipeptídeo (ou polipeptídeos) é expresso pelas células. A biblioteca de células contendo polipeptídeos expressos em superfície pode ser colocada em contato com uma solução contendo um parceiro de ligação cognato ligado à superfície ou solúvel. A atividade de ligação pode ser detectada com o uso de qualquer ensaio que possa detectar a ligação à superfície das células. A atividade também pode ser avaliada através da avaliação de uma atividade funcional do polipeptídeo ou polipeptídeo. Qualquer ensaio com base em célula conhecido pelo versado na técnica é contemplado para uso nos métodos fornecidos no presente documento, incluindo ensaios de proliferação celular, ensaios de morte celular, citometria de fluxo, técnicas de separação celular, classificação de célula ativada por fluorescência (FACS), microscopia de fase, microscopia de fluorescência, ensaios de ligação a receptor, ensaios de sinalização de célula, imunocitoquímica e ensaios de gene-repórter. Em alguns exemplos, os ensaios são ensaios de classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).
[551] Os polipeptídeos ou proteínas pode ser expressos por células de mamífero como moléculas solúveis secretadas, moléculas de superfície celular ou anticorpos intracelulares.
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Em um método exemplificativo, as células podem ser transfectadas com uma biblioteca de proteínas sob condições através das quais a maioria ou todas as células apresentam um membro da biblioteca de proteína ancorada na superfície celular. Opcionalmente, um sistema de expressão pode ser usado no qual a maioria dos transfectantes de célula de mamífero tem apenas um plasmídeo integrado a seu genoma. Portanto, a maioria (isto é, pelo menos cerca de 70% ou cerca de 80% ou cerca de 90%) dos transfectantes expressa uma ou mais moléculas de um polipeptídeo. Isso pode ser verificado, por exemplo, isolando e cultivando transfectantes individuais; e amplificando e sequenciando as sequências expressas para determinar se os mesmos têm uma única sequência.
[552] Em alguns exemplos dos métodos fornecidos no presente documento, os polipeptídeos são anticorpos apresentados na superfície de células de mamífero. Qualquer anticorpo descrito no presente documento pode ser expresso na superfície de células de mamífero, incluindo anticorpos funcionais bivalentes de comprimento completo, tais como anticorpos IgG. O anticorpo pode ser um fragmento, por exemplo, fragmentos Fab ou fragmentos scFv. Os anticorpos podem incluir uma região Fc, tal como um scFv-Fc ou um anticorpo de comprimento completo que compreende duas cadeias pesadas e duas leves. A pessoa versada na técnica pode selecionar um fragmento de anticorpo adequado. Por exemplo, ScFv-Fcs e anticorpos de comprimento completo produzidos em células de mamífero podem ter diversas vantagens em relação aos fragmentos scFv's ou Fab.
[553] Os suportes sólidos que podem ser usados nos ensaios de ligação fornecidos no presente documento incluem qualquer carreador que tenha a capacidade para ser afixado a um parceiro de ligação de um polipeptídeo, tal como um ligante, receptor ou antígeno. Tipicamente, para facilitar a triagem com alto rendimento, um parceiro de ligação cognato é afixado ao suporte sólido. Os exemplos de carreadores para uso como suportes sólidos nos métodos fornecidos no presente documento incluem, porém sem limitação, vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e suportes sólidos magnéticos, tais como suportes sólidos que incluem magnetita. O suporte sólido pode ser uma ou mais esferas ou partículas, microesferas, uma superfície de um tubo ou placa, uma membrana de filtro e outros suportes sólidos conhecidos na técnica. Os sistemas de suporte sólido exemplificativos incluem, porém sem limitação, uma
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223/540 superfície plana construída, por exemplo, de vidro, silício, metal, náilon, celulose, plástico ou um composite, incluindo membranas ou placas de múltiplas cavidades; ou podem estar na forma de uma microesfera, tal como um gel de silica, um vidro de poro controlado, uma microesfera magnética ou de celulose. Ademais, tais métodos podem ser adaptados para uso em suspensão ou na forma de uma coluna. Em algumas modalidades, o polipeptídeo específico para antígeno restrito ao microambiente (isto é, a região-alvo, por exemplo, anticorpo) é identificado e isolado pela biosseleção de uma biblioteca de anticorpo (por exemplo, anticorpo humanizado) de apresentação em fago ou apresentação em superfície de levedura (Colby et al., Engineering Antibody Affinity by Yeast Surface Display, Meth. Enzym. 388, 26 (2004)) com um antigenoalvo imobilizado. Por exemplo, ou uma biblioteca de anticorpo humanizado virgem ou uma biblioteca de anticorpo humanizado sintética pode ser selecionada com o uso dos métodos de apresentação em fago ou apresentação em superfície de levedura no presente documento. Em algumas modalidades, em um processo de apresentação em fago inicial, clones de fago podem ser transferidos para um vetor de mamífero e usados para um método de triagem de superfície de célula de mamífero (consultar, por exemplo, Yoon et al., BMC Biotechnology 12:62; 1.472 a 6.750 (2012)). Um método exemplificativo para realizar a apresentação em fago para isolar uma região-alvo específica para antígeno restrita ao microambiente é fornecido no Exemplo 2.
[554] Uma ASTR restrita ao microambiente identificada com o uso de métodos fornecidos no presente documento pode ser um anticorpo, um antígeno, um ligante, um domínio de ligação a receptor de um ligante, um receptor, um domínio de ligação a ligante de um receptor ou um afficorpo. Nas modalidades em que a ASTR restrita ao microambiente é um anticorpo, a mesma pode ser um anticorpo de comprimento completo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento (Fab')2, um fragmento Fv e um anticorpo de cadeia única divalente ou um diacorpo, em que a região de alvejamento específica para antígeno compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo. Em algumas modalidades, a ASTR restrita ao microambiente é um fragmento variável de cadeia única. Tal fragmento variável de cadeia única pode ter cadeias pesada e leve separadas por um aglutinante, em que o aglutinante tem entre 6 e 100 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, a cadeia pesada está em posição N-terminal em relação à cadeia leve no receptor de antígeno quimérico. Em outras modalidades, a cadeia leve está em posição N-terminal em relação à cadeia pesada. A ASTR
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224/540 restrita ao microambiente pode ser uma ASTR biespecífica.
[555] As ASTRs restritas ao microambiente identificadas com o uso de métodos fornecidos no presente documento são tipicamente polipeptídeos e mais especificamente anticorpos de polipeptídeo e, nas modalidades ilustrativas, anticorpos de cadeia única. Esses polipeptídeos podem se ligar a seus antígenos cognatos com afinidade mais alta ou mais baixa sob condições anormais versus condições normais, mas, nas modalidades ilustrativas, se ligam com afinidade mais alta sob condições anormais do que condições normais. Em algumas modalidades, esses polipeptídeos podem se ligar a seu antígeno cognato com uma afinidade 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% ou 99% maior sob condições anormais do que condições fisiológicas (isto é, normais). Em algumas modalidades, os ASTRs que identificam com o uso de métodos aqui fornecidos não se ligam aos seus antígenos cognatos sob condições fisiológicas normais a qualquer nível detectável acima dos níveis de fundo obtidos com o uso de controles negativos, como anticorpos de controle negativo.
[556] A sequência de nucleotídeos que codifica uma ASTR restrita ao microambiente isolada pelo método fornecido no presente documento pode ser determinada sequenciando-se os nucleotídeos da célula coletada que expressa o alvejamento específico para antígeno restrito ao microambiente. Essas informações de sequência de nucleotídeos podem, então, ser usadas para produzir um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) gerando-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente (MRBASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. As regiões de alvejamento específicas para antígeno restritas ao microambiente podem ser clonadas em um sistema de expressão de construto de CAR, que pode ser usado para gerar lentivírus recombinantes que incluem o CAR em seu genoma, e, então, os lentivírus recombinantes podem ser usados para transduzir as células T para testar o extermínio de célula-alvo que expressa antígeno de tumor mediado por CAR em um ambiente seletivo de tumor em comparação às condições fisiológicas.
Condições para atividade condicional [557] Nos métodos fornecidos no presente documento, a atividade de um ou mais polipeptídeos, tais como, por exemplo, anticorpos de cadeia única, é tríada ou testada sob
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225/540 dois conjuntos de condições diferentes que simulam uma condição ou condições em dois ambientes fisiológicos diferentes tais como, por exemplo, um microambiente doente e a condição fisiológica normal de um microambiente não doente. Tipicamente, as condições são condições que podem ser simuladas ou replicadas in vitro. Um conjunto de condições pode incluir uma ou mais condições para simular um microambiente associado a uma doença. A doença pode alterar a homeostase intracelular e extracelular. Por exemplo, o microambiente doente pode simular uma ou mais condições em um microambiente de tumor ou um microambiente de câncer. Tipicamente, a diferença ou diferenças na atividade sob os dois conjuntos de condições podem resultar na atividade condicional da molécula. Assim, uma molécula que exibe atividade maior sob o primeiro conjunto de condições (por exemplo, simulando condições em um microambiente de tumor) em comparação ao segundo conjunto de condições (por exemplo, simulando condições em um ambiente normal ou não doente) é identificada como uma molécula candidata que é restrita ao microambiente.
[558] Os dois conjuntos de condições podem ser selecionados para variar por um ou mais parâmetros que se diferem em dois ambientes fisiológicos, tal como descrito no presente documento ou conhecido por um versado na técnica, incluindo, porém sem limitação, condições químicas, condições biológicas ou condições físicas. Os parâmetros que podem ser variados entre os dois conjuntos de podem incluir uma ou mais condições selecionadas dentre pressão, temperatura, pH, força iônica, pressão osmótica, osmolalidade, estresse oxidativo, turbidez, exposição à luz (incluindo UV, luz infravermelha ou visível), concentração de um ou mais solutos, tais como eletrólitos, concentração de glicose, concentração de hialuronano, concentração de ácido láctico ou lactato, concentração de albumina, níveis de adenosina, níveis de R-2-hidroxiglutarato, concentração de piruvato, concentração de oxigênio e/ou presença de oxidantes, redutantes ou cofatores. Variando-se os sistemas de tampão e eletrólito nas soluções de calibração, condições fisiológicas, tais como pH, capacidade para tampão, ambiente iônico, temperatura, concentração de glicose e força iônica podem ser ajustadas por aquelas do ambiente biológico a ser simulado. O conjunto de condições que simulam um ambiente fisiológico normal pode ser selecionado para ser diferente do conjunto de condições que simulam um microambiente doente, tal como um microambiente de tumor, por uma ou mais condições descritas no presente documento.
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226/540 [559] Por exemplo, conforme discutido abaixo, vários parâmetros do microambiente de tumor diferem-se em comparação a um microambiente de não tumor, incluindo, porém sem limitação, concentração de oxigênio, pressão, presença de cofatores, pH, concentração de hialuronano, concentração de lactato, concentração de albumina, níveis de adenosina, níveis de R-2-hidroxiglutarato e concentração de piruvato. Qualquer um desses parâmetros pode ser replicado in vitro para simular uma ou mais condições que existem em um ambiente de tumor ou câncer em comparação às condições que existem em um ambiente de não tumor ou normal. As condições fisiológicas normais que podem ser simuladas incluem ambientes encontrados em tecido saudável ou não doente em qualquer localização do corpo, tal como no trato GI, na pele, na vasculatura, no sangue e matriz extracelular. Tipicamente, nos ensaios no presente documento, as condições fisiológicas podem ser similares in vitro pela escolha do tampão que é usado para avaliar a atividade da proteína. Por exemplo, qualquer uma ou mais condições de um microambiente doente (tal como um microambiente de tumor) e um ambiente não doente podem ser simuladas pelas diferenças no tampão de ensaio usado para avaliar a atividade no ensaio. Portanto, nos métodos no presente documento para identificai· um polipeptídeo restrito ao meio ambiente, um componente ou componentes ou característica ou características de um tampão de ensaio são alteradas ou tornadas diferentes em um primeiro ensaio para testar a atividade sob uma primeira condição e em um segundo ensaio para testar a atividade sob uma segunda condição. Por exemplo, conforme discutido no presente documento, vários parâmetros do microambiente de tumor são diferentes em comparação a um ambiente de não tumor incluindo, porém sem limitação, oxigênio, pressão, presença de cofatores, pH, concentração de hialuronano (tal como concentração de hialuronano aumentada ou diminuída), concentração de lactato (tal como concentração de lactato aumentada ou diminuída), concentração de albumina (tal como concentração de albumina aumentada ou diminuída), níveis de adenosina (tais como níveis de adenosina aumentados ou diminuídos), níveis de R-2-hidroxiglutarato (tais como níveis de R-2-hidroxiglutarato aumentados ou diminuídos) e concentração de piruvato (incluindo concentração de piruvato aumentada ou diminuída)). Mais especificamente, as condições em um microambiente de tumor podem incluir pH mais baixo, concentrações mais altas de hialuronano, concentrações mais altas de lactato e piruvato, concentrações mais altas de albumina, níveis aumentados de adenosina, níveis aumentados de R-2-hidroxiglutarato, hipoxia,
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227/540 concentração mais baixa de glicose e temperatura ligeiramente mais alta em comparação ao microambiente de não tumor. Por exemplo, uma ASTR restrita ao microambiente é virtualmente inativa a uma temperatura corporal normal, mas é ativa a uma temperatura mais alta em um microambiente de tumor. Em ainda outro aspecto, o anticorpo restrito ao microambiente é menos ativo em sangue oxigenado normal, mas mais ativo sob um ambiente menos oxigenado que existe em um tumor. Em ainda outro aspecto, o anticorpo restrito ao microambiente é menos ativo em pH fisiológico normal 7,2 a 7,8, mas mais ativo sob umpH ácido 5,8 a 7,0 ou 6,0 a 6,8 que existe em um microambiente de tumor. Por exemplo, o anticorpo restrito ao microambiente é mais ativo a um pH de 6,7 do que a um pH de 7,4. Há outras condições no microambiente de tumor conhecidas por uma pessoa versada na técnica que podem também ser usadas como a condição na presente invenção sob a qual as ASTRs condicionalmente ativas têm diferentes afinidades de ligação. As condições de ensaio in vitro que imitam essas condições de tumor in vivo são denominadas no presente documento condições de ensaio substituto de tumor in vivo.
[560] Qualquer uma ou mais dessas condições podem ser simuladas in vitro pela escolha do tampão de ensaio particular. A composição do tampão de ensaio que simula um microambiente doente pode ser selecionada para ser idêntica à composição do tampão de ensaio que simula um ambiente normal, com a exceção de uma ou mais condições conhecidas ou descritas no presente documento que são alteradas no microambiente doente. Ademais, na triagem ou identificação da atividade de um ou mais polipeptídeos sob dois conjuntos de condições diferentes, geralmente as únicas condições que são variadas no ensaio referem-se às condições de tampão que simulam o microambiente in vivo. As outras condições do ensaio, tais como tempo, temperatura e condições de incubação, podem ser iguais para ambos os conjuntos de condições. Tipicamente, o mesmo tampão-base é usado no conjunto de condições que simulam um microambiente doente e condições que simulam um microambiente normal, mas o projeto da composição de tampão pode ser feito para se diferir em um ou mais parâmetros, tais como pH, oxigênio, pressão, presença de cofatores, pH, concentração de hialuronano (tal como concentração de hialuronano aumentada ou diminuída), concentração de lactato (tal como concentração de lactato aumentada ou diminuída), concentração de albumina (tal como concentração de albumina aumentada ou diminuída) e/ou concentração de piruvato (incluindo concentração de piruvato aumentada ou diminuída). Nas condições que simulam um
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228/540 microambiente doente e nas condições que simulam um microambiente normal, qualquer tampãobase conhecido por um versado na técnica pode ser usado.
Métodos para gerar uma célula restrita ao microambiente [561] A presente revelação fornece um método para gerar uma célula restrita ao microambiente. O método geralmente envolve modificar uma célula de mamífero com um vetor de expressão (por exemplo, um plasmídeo ou um vetor retroviral) ou um RNA (por exemplo, RNA transcrito in vitro), incluindo sequências de nucleotídeos que codificam os CARs restritos ao microambiente da presente revelação. A célula geneticamente modificada é restrita ao microambiente na presença de um ou mais antígenos-alvo. A modificação genética pode ser realizada in vivo, in vitro ou ex vivo. A célula pode ser uma célula imune (por exemplo, um linfócito T, uma célula auxiliar T ou uma célula NK), uma célula-tronco, uma célula progenitora, etc.
[562] Em alguns casos, a modificação genética é realizada ex vivo. Por exemplo, um linfócito T, uma célula-tronco, uma célula auxiliar T ou uma célula NK é obtida de um indivíduo; e a célula obtida do indivíduo é geneticamente modificada para expressar um CAR da presente revelação. A célula geneticamente modificada é restringível ao microambiente na presença de um ou mais antígenos-alvo. Em alguns casos, a célula geneticamente modificada é ativada ex vivo. Em outros casos, a célula geneticamente modificada é introduzida em um indivíduo (por exemplo, o indivíduo de quem a célula foi obtida); e a célula geneticamente modificada é ativada in vivo. Por exemplo, quando o um ou mais antígenos-alvo estão presentes na superfície de uma célula no indivíduo, não há necessidade de administrar o antígeno. A célula geneticamente modificada entra em contato com o antígeno presente na superfície de uma célula no indivíduo e a célula geneticamente modificada é ativada. Por exemplo, quando a célula geneticamente modificada é um linfócito T, a célula geneticamente modificada pode exibir citotoxicidade em direção a uma célula que expressa o um ou mais antígenos-alvo em sua superfície à qual o CAR se liga.
Métodos para modular a atividade das células T e/ou NK que expressam mrb-car alterando o pH [563] São aqui fornecidos, em certos aspectos, métodos para modular a ligação e a lise/morte resultante de uma célula alvo por uma célula T e/ou célula NK expressando MRB
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CAR, causando uma alteração ou mudança no pH dentro de um microambiente que inclui uma célula alvo dentro um tecido-alvo ou dentro de um ou mais tecidos não-alvo (por exemplo, saudáveis/normais), modulando a ligação do MRB-CAR ao seu antígeno cognato em uma célula alvo (ou células alvo). Tais métodos incluem tipicamente colocar uma célula alvo, como uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula humana) em contato com uma célula T E/ou célula NK que expressa MRB-CAR em um microambiente e depois alterar o pH do microambiente, diminuindo ou mais tipicamente aumentando o pH. O microambiente pode ser um microambiente alvo, por exemplo, um tumor, ou um microambiente fora do alvo, onde a ligação fora do alvo pode causar efeitos colaterais. Em algumas modalidades, esses métodos podem fornecer uma redução transitória da ligação ao alvo de CAR-T sensível ao microambiente tumoral.
[564] Consequentemente, em um aspecto, é aqui fornecido um método para modular a ligação de uma célula T ou célula NK que expressa o receptor de antígeno quimérico biológico (MRB-CAR) restrito ao microambiente a uma célula que expressa um antígeno cognato do MRB-CAR em um indivíduo, que inclui o seguinte:
a. introduzir uma célula T e/ou célula NK que compreende um ácido nucleico que codifica o MRB-CAR no sujeito, em que, após (e opcionalmente e/ou durante) a introdução, a célula T e/ou a célula NK que compreende i ácido nucleico que codifica MRB-CAR expressa o MRB-CAR e se liga à célula que expressa o antígeno cognato no sujeito; e
b. administrar um agente farmacológico ao indivíduo em quantidade suficiente para aumentar o pH sanguíneo e/ou o pH de um tecido e/ou pH de um microambiente, em que a administração é realizada antes, durante ou após a introdução e em que o pH aumentado do sangue, do tecido e/ou do microambiente modulam a ligação da célula T e/ou célula NK que expressa MRB-CAR à célula que expressa o antígeno cognato no sangue, no tecido ou no microambiente com o aumento do pH.
[565] A alteração/deslocamento do pH em aspectos que incluem uma etapa de administração de um agente farmacológico modulador de pH da presente revelação pode ser conseguida expondo células/tecido alvo ou não alvo a um agente farmacológico modulador de pH, como administrando o agente farmacológico de modulação de pH para um indivíduo. Exemplos não limitantes de agentes farmacológicos moduladores do pH são aqui fornecidos. Em certos aspectos, é fornecido aqui um agente farmacológico para uso em um método para modular
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230/540 a ligação de um MRB-CAR ao seu antígeno cognato ou para modular a ligação de uma célula T e/ou célula NK expressando MRB-CAR a uma célula que expressa seu antígeno cognato ou para reduzir ou aliviar o alvo da toxicidade do tumor em um indivíduo. Tais aspectos, em certas modalidades, se referem ao tratamento do crescimento de tumores, câncer, hiperplasia ou distúrbios proliferativos das células.
[566] Em outros aspectos, é fornecido aqui o uso de um agente farmacológico modulador de pH para uso na fabricação de um medicamento ou um kit para controlar a ligação de uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada a uma célula alvo de mamífero em um indivíduo in vivo. Em outros aspectos, é fornecido no presente documento um kit que inclui um recipiente que contém uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, e instruções para uso das mesmas para realizar um método para tratar o crescimento tumoral, em que as instruções instruem um método para controlar a ligação de uma célula T e/ou célula NK a uma célula-alvo de mamífero através da modulação de pH. Tal método pode ser qualquer um dos métodos aqui fornecidos para modular a ligação de células T e/ou células NK que expressam MRB-CAR e/ou atividade por alteração do pH. O recipiente que contém as partículas retrovirais recombinantes pode ser um tubo, frasco, poço de uma placa ou outro recipiente para armazenamento de uma partícula retroviral recombinante e/ou um agente farmacológico modulador de pH. Qualquer um desses pode ser de resistência e grau industrial. O kit pode incluir dois ou mais recipientes em certas modalidades. Um recipiente/vaso pode incluir as partículas retrovirais recombinantes e outro recipiente/vaso pode incluir um agente farmacológico modulador de pH. Em tais métodos, o agente farmacológico é distribuído/administrado em quantidade suficiente para aumentar o pH sanguíneo e/ou um pH tecidual e/ou um pH do microambiente para modular a ligação do MRB-CAR de uma célula T modificada/recombinante e/ou célula NK expressando o MRB-CAR, ao seu antígeno cognato no sangue e/ou tecido com o aumento do pH. Detalhes exemplificativos não limitativos são fornecidos aqui para administrar um agente farmacológico modulador de pH em quantidade suficiente e por um tempo suficiente.
[ 5 67 ] As células alvo, seja no alvo ou fora do alvo em relação a um tecido, podem ser colocadas em contato com um agente de modulação de pH, tal como um agente farmacológico modulador de pH, depois de introduzir o MRB-CAR em um indivíduo. Consequentemente, os aspectos exemplificativos fornecidos no presente documento para modular
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231/540 a ligação e/ou atividade citotóxica de uma célula T que expressa MRB CAR, por exemplo, para aliviar a atividade em alvo fora do tumor e/ou para inibir a proliferação de célula-alvo, como proliferação celular de tumor, pode incluir as seguintes etapas:
a. introduzir uma célula T e/ou célula NK que compreende um ácido nucleico que codifica o MRB-CAR em um sujeito, em que, após a introdução, a célula T e/ou a célula NK que compreende i ácido nucleico que codifica MRB-CAR expressa o MRB-CAR e opcionalmente se liga à célula que expressa o antígeno cognato no sujeito; e
b. administrar um agente farmacológico ao indivíduo em quantidade suficiente para aumentar o pH sanguíneo e/ou um pH tecidual e/ou um pH do microambiente para modular a ligação da célula T e/ou célula NK que expressa MRB-CAR a células que expressam o antígeno cognato do MRB-CAR, no sangue, no tecido ou no microambiente com o aumento do pH. Será entendido que, dependendo do método específico usado para introduzir o ácido nucleico que codifica o MRB-CAR na célula T e/ou na célula NK, a célula T e/ou a célula NK pode ou não expressar o MRB-CAR antes de o mesmo ser introduzido no indivíduo. No entanto, em algum momento após a introdução no indivíduo, por exemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias e/ou 7 dias, ou mais, as células T e/ou células NK que incluem o ácido nucleico que codifica o MRB-CAR, expressam o MRB-CAR. Então, tais células tipicamente se ligam a uma célula alvo que expressa o antígeno cognato para o MRB-CAR.
[568] Os métodos aqui fornecidos para modificar geneticamente e expandir opcionalmente os linfócitos de um indivíduo podem ser usados para introduzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um MRB-CAR no genoma de uma célula T e/ou célula NK do indivíduo para produzir uma célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar o MRB -CAR e, depois, introduzir as células T e/ou as células NK com capacidade de expressar o MRB-CAR no indivíduo, em que, após a introdução, a célula T e/ou célula NK expressa o MRB-CAR para colocar o MRB-CAR em contato com células/tecido alvo. A presente revelação fornece detalhes de como realizar tais métodos, juntamente com várias alternativas para modificar e expandir linfócitos, qualquer dos quais pode ser usado em aspectos da revelação que incluem mudança de pH para modular a ligação de uma célula T e/ou célula NK expressando MRB-CAR a uma célula alvo expressando um antígeno cognato para o MRB-CAR.
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232/540 [569] Tais métodos para modificar e expandir geneticamente linfócitos envolvem tipicamente colocar células T e/ou células NK, que podem ser células em repouso em modalidades ilustrativas, em contato com uma partícula retroviral recombinante incompetente para replicação, para transduzir as células T e/ou células NK. Tal contato tipicamente ocorre ex vivo após a remoção dos linfócitos do indivíduo. As células T e/ou as células NK são então introduzidas/reintroduzidas no indivíduo, tipicamente de quem foram removidas. A partícula retroviral recombinante incompetente para replicação inclui um genoma com um polinucleotídeo que codifica o MRB-CAR. Muitas modalidades alternativas e outros detalhes relativos a essa partícula retroviral recombinante incompetente para replicação são fornecidas em outras seções aqui e podem ser usadas em métodos aqui fornecidos para regulação da ligação e lise/morte resultantes de MRB-CARs, modulando-se o pH em um microambiente de uma célula que expressa um polipeptídeo alvo cognato reconhecido pelo MRB-CAR de um modo dependente do pH.
[570] Os aspectos particularmente ilustrativos que incluem tais combinações podem incluir outros elementos para regular a ligação, a atividade de extermínio celular e/ou a sobrevivência de células T que expressam MRB CAR que são fornecidos no presente documento em outras seções. Tais elementos de controle que podem ser combinados com expressão de MRB CAR em métodos que incluem uma alteração no pH, assim como outras modalidades fornecidas no presente documento, incluem riboswitches e domínios de eliminação. Assim, a combinação de tais métodos e composições fornecidos no presente documento forma uma abordagem multifacetada potente para garantir a segurança de um sujeito após a administração de células T que expressam, incluindo células T que expressam MRB CAR, a um sujeito.
[571] Tais modos para modular a ligação de uma célula alvo por uma célula T e/ou uma célula NK expressando MRB-CAR podem ser usados, por exemplo, para reduzir a toxicidade fora do tumor alvo aumentando o pH do sangue e/ou um tecido (ou tecidos) tumoral dentro do indivíduo. Por exemplo, em uma situação em que um pH “normal” do tecido dentro de um indivíduo torna-se transitoriamente mais baixo, um agente de modulação do pH pode ser administrado de uma maneira onde o pH do tecido normal é aumentado enquanto o pH do tumor permanece mais baixo e ainda a um pH onde a célula T e/ou célula NK que expressa MRB-CAR se liga a uma célula tumoral alvo. Nessas modalidades, o agente de modulação de pH pode ser
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233/540 distribuído a uma concentração mais baixa ou de um modo direcionado ao tecido normal.
[572] Em algumas modalidades, isso pode ser conseguido enquanto se permite que o pH dentro do microambiente tumoral permaneça suficientemente baixo para que uma célula T e/ou célula NK de MRB-CAR se ligue às células cognatas que expressam o alvo dentro do tumor. Em aspectos ilustrativos dos métodos aqui fornecidos, o pH de um tecido permanece a um pH sob o qual uma célula T e/ou uma célula NK expressando MRB -CAR se liga ao seu alvo por um período de tempo suficiente para que uma célula T e/ou célula NK que expressa MRB -CAR entre em contato e se ligue a uma célula que expressa seu antígeno cognato (por exemplo, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas, ou 2, 4, 7, 14, 28 ou 30 dias, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24 meses ou mais) e, em seguida, o pH é trocado/alterado, por exemplo, aumentando o pH do tecido a uma magnitude tal que afete a ligação de células T e/ou células NK que expressam MRB -CAR a uma célula-alvo.
[573] Consequentemente, é fornecido no presente documento, em um aspecto, um método para redução temporária de ligação de alvo de CAR-célula T sensível a microambiente de tumor através de modificação farmacológica de pH vascular e de tecido. As porções de ligação de alvo da CAR-célula T sensível a microambiente de tumor com ligação diferente em diferentes condições também são chamadas de biológicas restritas ao microambiente, restritas ao microambiente, microambientalmente controladas ou condicionalmente ativas e podem se referir à CAR inteira ou qualquer domínio de ligação de alvo da mesma, por exemplo, uma ASTR, scFv ou scFvFc. Esses ASTRs microambientalmente controlados nas células CAR-T fornecem um nível adicional de proteção contra a toxicidade tumoral não-alvo, exigindo condições ambientais locais do tumor para permitir o envolvimento das células T. Embora atraente para algumas terapias de anticorpo monoclonal, a terapia celular adotiva pode criar ambientes locais que são transitoriamente permissivos para seus alvos de CAR-T. Por exemplo, as células CAR-T ativadas em tecidos com pH baixo podem reduzir ainda mais o pH do microambiente, dependendo dos domínios citoplasmáticos presentes no construto de CAR. Em outros casos, a síndrome de liberação de citocinas e outras morbidades associadas à terapia celular adotiva podem resultar em perda da capacidade tamponante de bicarbonate do sangue, levando à acidose láctica. Foi estabelecido que terapias celulares adotivas administradas por infusão intravenosa resultam em retenção pulmonar temporária. Para algumas terapias celulares, a taxa de infusão requer monitoramento constante do oxigênio dissolvido (Fischer et al. Stem Cells Dev. Junho de 2009;
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18(5): 683-691). A extensão do aprisionamento pulmonar depende do tamanho da célula, do estado de ativação, da dose celular e da taxa de infusão. Cruz et al (Cytotherapy. Outubro de 2010; 12(6): 743-749) relatam as constatações adversas de mais de 300 infusões de células T, que doses baixas e infusão lenta podem reduzir o aprisionamento pulmonar. Entretanto, com certas células CAR-T de alta potência, os alvos apresentam-se mesmo em baixos níveis no endotélio pulmonar, como o Her2 (Morgan et al. Mol Ther. abril de 2010; 18(4): 843-851), pode resultar em toxicidade imediata que não pode ser controlada e resulta em rápida deterioração do paciente devido à alta concentração celular inicial de CAR-T no pulmão após a infusão e a presença do alvo de célula T nesses tecidos. Em outros casos, a presença de alvos de células T em outros tecidos alvos, como o duto biliar, pode criar um alvo fora das toxicidades tumorais que não podem ser controladas (Lamers Mol Ther. Abril de 2013;21(4):904-12) e resultam em toxicidade grave de órgãos antes que outros agentes como esteroides ou epítopos de eliminação celular possam ser usados. Embora o plasma arterial e venoso tenha uma forte capacidade tamponante contra a acidose, podem ocorrer estados de acidose respiratória, choque, acidose metabólica e acidose isquêmica em pacientes com câncer tratados com terapia celular adotiva.
[574] Em alguns aspectos aqui fornecidos, a ligação de um MRB-CAR em um indivíduo pode ser modulada por administração de um agente farmacológico ao indivíduo para aumentar ou diminuir o pH do sangue, um tecido e/ou um microambiente. Em alguns aspectos, a toxicidade tumoral não alvo no alvo pode ser aliviada em um indivíduo por administração de um agente farmacológico ao indivíduo para aumentar ou diminuir o pH do sangue e/ou o pH de um tecido e/ou o pH de um microambiente. Em alguns aspectos, a ligação de uma célula T e/ou célula NK a uma célula alvo de mamífero pode ser controlada pela introdução de um agente farmacológico para aumentar ou diminuir o pH do sangue e/ou o pH de um tecido e/ou o pH de um microambiente. Em alguns aspectos, a ligação de uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada a uma célula alvo de mamífero em um indivíduo in vivo pode ser controlada por administração de um agente farmacológico modulador de pH ao indivíduo. Em modalidades ilustrativas, o agente farmacológico pode aumentar o pH do sangue e/ou o pH de um tecido e/ou o pH de um microambiente. Em algumas modalidades, o microambiente pode ser um microambiente in vivo. Em modalidades ilustrativas, o microambiente pode ser um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, o microambiente pode incluir uma célula alvo
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235/540 de mamífero, em que a célula alvo de mamífero expressa o antígeno alvo na sua superfície. Em algumas modalidades, a administração de um agente farmacológico a um indivíduo pode aumentar o pH do sangue, um tecido e/ou um microambiente de um pH inferior a 5,8, 5,9, 6,0,
6.1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9 a umpH de pelo menos 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 ou 7,6, em que o pH do sangue, tecido e/ou microambiente inferior antes de administrar o agente farmacológico do que depois de administrar o agente farmacológico. Em algumas modalidades, a administração de um agente farmacológico a um indivíduo pode diminuir o pH do sangue, um tecido ou um microambiente de um pH superior a 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,
7.2, 7,3, 7,4, 7,5, ou 7,6 a um pH inferior a 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0, em que o pH do sangue, tecido e/ou microambiente é mais elevado antes de administrar o agente farmacológico do que depois de administrar o agente farmacológico. Em algumas modalidades, a administração de um agente farmacológico a um indivíduo pode causar uma alteração do pH no indivíduo no sangue, em um tecido e/ou em um microambiente. Em algumas modalidades, o desvio de pH pode ser pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7 ou 1,8 unidade de pH em qualquer direção, isto é, um aumento ou diminuição do pH após a administração do agente farmacológico em relação ao pH antes da administração do agente farmacológico. Em modalidades ilustrativas, o desvio do pH é um aumento no pH.
[575] Os MRB-CARs da presente revelação podem ter reduzida ligação ao seu antígeno cognato a um pH do que a um pH diferente. Em modalidades ilustrativas em que os valores de pH ilustrativos para ligação diferencial de um MRB-CAR não são já fornecidos no aspecto mais amplo e alternativamente para outras modalidades em vez dos valores para tais aspectos, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB-CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5 do que em um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0. Em outras modalidades, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB-CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 do que a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5. Em algumas modalidades ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,5 a 6,7 em comparação com pH 7,4 a 7,6. Em outras modalidades
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236/540 ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,7 em comparação com um pH de 7,4. Em outras modalidades, o MRB-CAR exibe ligação aumentada no pH de um tumor em comparação com o pH do sangue. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode incluir uma região de direcionamento específica do antígeno, um stalk e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, o MRB-CAR também pode incluir um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar a um antígeno associado ao tumor.
[576] Em métodos que incluem a modulação do pH do sangue, um tecido ou um microambiente, o pH do microambiente pode ser aumentado de um pH abaixo de 7,0 paia um pH acima de 7,0. Por exemplo, o pH pode ser aumentado a partir de um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 para um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 ou 7,4. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar ao antígeno cognato no aumento do pH, mas não no pH do microambiente antes da introdução do agente farmacológico. Em certas modalidades, o pH pode ser aumentado de abaixo de 7,0 para um pH de 7,1 a 8,0 ou para um pH de 7,1 a 7,8 ou para um pH de 7,2 a 7,8 ou um pH de 7,2 a 7,6 ou um pH de 7,3 a 7,6 ou a um pH de 7,4 a 7,8 ou a um pH de 7,4 a 7,6. Tal aumento no pH pode ocorrer por menos de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas ou por mais de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas, dependendo do tipo e dose de agente farmacológico administrado. Em certas modalidades, o agente farmacológico administrado é tal modo que o pH permanece acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5; ou entre 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 no limite inferior do intervalo e 7,4, 7,5, 7,6, 7,7 ou 7,8 no limite superior do intervalo, no tecido alvo, tal como um tumor e, por exemplo, em pelo menos uma superfície de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), em pelo menos uma porção de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), e em modalidades ilustrativas ao longo de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor). O microambiente pode ser um microambiente in vivo, como um tumor, um tecido, um tecido não tumoral, um tecido normal ou um tecido que sofreu uma alteração transitória do pH. Por exemplo, os tecidos que tipicamente sofrem alterações transitórias do pH incluem um tecido muscular em condições anaeróbicas ou tecido muscular submetido a exercício ou um tecido inflamado ou um tecido a experimentar inflamação. Em algumas modalidades que incluem uma célula alvo de mamífero, a célula alvo de mamífero pode ser uma célula tumoral ou uma célula não tumoral ou normal.
[ 57 7 ] Em alguns aspectos, os métodos para aumentar temporariamente o pH
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237/540 vascular para reduzir a afinidade de MRB-CARs microambientalmente controladas para seus antígenos são fornecidos. Um desvio de 0,4U no pH do sangue pode reduzir a afinidade de certos scFvs que formam uma porção de um MRB-CAR, por seu antígeno cognato em mais de 10 vezes. Em algumas modalidades, o controle terapêutico do pH pode ser conseguido através de vias de administração IV ou oral de vários agentes farmacológicos. Por exemplo, em algumas modalidades, a inativação da afinidade de ligação pode ser alcançada com bicarbonate ou bicarbonate de sódio. Em outras modalidades, Tris-hidroximetilaminometano (também conhecido como trometamina, trometamol e THAM) e/ou Carbicarb™ (uma solução hipertônica equimolar de bicarbonate de sódio e carbonato de sódio) podem ser usados para aumentar o pH do sangue em uma quantidade suficiente para aliviar eliminar toxicidades tumorais. Ainda em outras modalidades, Inibidores da bomba de prótons de pequenas moléculas podem ser usados para aumentar o pH do sangue e/ou o pH do tecido em quantidade suficiente para aliviar as toxicidades tumorais no alvo. Inibidores da bomba de prótons que podem ser usados em métodos que incluem pH modulante incluem, mas sem limitação, esomeprazol (Nexium), esomeprazol e naproxeno (Vimovo), lansoprazol (Prevacid), omeprazol (Prilosec e Zegerid) e rabeprazol (Aciphex). A administração de inibidores da bomba de prótons pode ser utilizada eficazmente ao longo de períodos de tempo mais longos para modular a afinidade de ligação do domínio de ligação do antígeno ao seu antígeno cognato durante dias, semanas, meses ou anos. Em outras modalidades, a afinidade do domínio de ligação ao antígeno pelo seu antígeno cognato pode ser modulada alterando o pH do sangue e/ou o pH do tecido controlando a transcrição, tradução, expressão da membrana e estabilidade de transportadores e bombas. Exemplos de tais transportadores e bombas cuja expressão alterada pode ser modular o pH incluem, sem limitação, bombas de prótons, membros da família de troca de prótons de sódio (NHE), família de transportadores de bicarbonate (BCT) e família transportadora de monocarboxilato.
[578] Em certas modalidades, um agente farmacológico modulador de pH, como, por exemplo, bicarbonate, THAM ou CaricarbTM administrado antes ou concomitantemente com a infusão de células CAR-T de um paciente que expressam ASTRs biológicas restritas ao microambiente (por exemplo, scFvs ou scFvFcs). Tal tratamento aliviará a citoxicidade imediata que está de outra forma associada ao encarceramento pulmonar temporário de infusões de células CAR-T. Consequentemente, em certos aspectos, é fornecido neste
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238/540 documento um método para reduzir a citotoxicidade causada ao tecido saudável normal de um sujeito pela administração de um agente farmacológico ao sujeito em quantidade suficiente para aumentar o pH do sangue e/ou um pH do tecido e/ou um pH do microambiente; e concomitante ou subsequentemente (por exemplo, 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas, ou 1, 2, 3, 4 ou 7 dias mais tarde) introduzindo uma célula T expressando MRB-CAR ou NK célula no indivíduo. Em certas modalidades, em um tempo alvo após tal introdução (por exemplo, 1, 2, 4, 6, 8, 12, ou 24 horas, ou 1, 2, 3, 4 ou 7 dias depois), a administração do agente farmacológico é terminada por um período de tempo ou indefinidamente, de modo a alterar o pH do sangue, um tecido ou um microambiente do indivíduo e modular a ligação/atividade das células T que expressam MRBCAR.
[579] Podem ser utilizados vários regimes de dosagem eficazes para administrar os agentes farmacológicos com capacidade de modular o pH (por exemplo, aumentando o pH sanguíneo e/ou um pH do tecido e/ou o pH de um microambiente em um indivíduo), como será entendido por um versado na técnica. Aqui, a administração pode referirse a administrar um agente farmacológico a um indivíduo, incluindo a injeção de um agente farmacológico por via intravenosa em um indivíduo ou a administração de uma dose oral de um agente farmacológico a um indivíduo ou a um indivíduo que tome um agente farmacológico. Os agentes farmacológicos podem ser administrados ao sujeito ou paciente durante vários períodos de tempo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 semanas; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 ou 18 meses; ou 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 anos ou indefinidamente. Em algumas modalidades, o agente farmacológico pode ser bicarbonate, bicarbonate de sódio (NaHCOs) ou uma solução de bicarbonate de sódio e carbonato de sódio e uma dose parenteral ou IV pode ser: 0,2 x peso do indivíduo (kg) x déficit de base do indivíduo; HCO3 (mEq) necessário = 0,5 x peso (kg) x [24 - HCO3 sérico (mEq/L)]; ou 2 a 5 mEq/kg de infusão IV durante 4 a 8 horas. Em algumas modalidades, podem ser usados esquemas de dosagem padrão de bicarbonate, bicarbonate de sódio ou uma solução de bicarbonate de sódio, dependendo da gravidade da acidose. Por exemplo, 50 a 150 mEq de bicarbonate diluído em 1 L de dextrose a 5% em água podem ser administrados via IV a uma taxa de 1 a 1,5 1/hora. Em outro exemplo não limitativo, 90 a 180 mEq de bicarbonate diluído em 1 1 de dextrose a 5% em água podem ser administrados via IV a uma taxa de 1 a 1,5 1/hora. Em algumas modalidades em que o agente
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239/540 farmacológico é bicarbonate» ou bicarbonate de sódio (NaHCOs), uma dosagem entérica ou oral pode ser, por exemplo, 325 a 2.000 mg de bicarbonate de sódio dado a um indivíduo 1 a 4 vezes/dia.
[580] Em algumas modalidades, o agente farmacológico pode ser trishidroximetilaminometano (também conhecido como trometamina, trometamol e THAM) e uma dosagem parenteral ou IV pode ser estimada como: Solução de trometamina (ml de 0,3 M) necessária = Peso Corporal (kg) x Déficit de Base (mEq/litro) x 1,1. Em algumas modalidades, a dosagem IV de tris-hidroximetilaminometano pode ser estimada a partir do défice da base tampão do fluido extracelular em mEq/1, como determinado por meio do nomograma de SiggaardAndersen. Em algumas modalidades, a dose inicial pode ser de 500 ml (150 mEq) de trishidroximetilaminometano injetado por infusão IV lenta com até 1.000 ml, em que a dose máxima é de 500 mg/kg (227 mg/lb) durante um período não inferior a uma hora.
[581] Em algumas modalidades, o agente farmacológico pode ser um inibidor da bomba de prótons de molécula pequena e pode ser administrado por extensões de tratamento prolongadas. Por exemplo, o inibidor da bomba de prótons de molécula pequena pode ser administrado durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 semanas; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 ou 18 meses; ou 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 anos ou indefinidamente. Em algumas modalidades, o inibidor da bomba de prótons pode ser esomeprazol (Nexium) e 20 mg ou 40 mg de esomeprazol pode ser administrado por via oral uma ou duas vezes ao dia. Em algumas modalidades, o inibidor da bomba de prótons pode ser uma combinação de esomeprazol e naproxeno (Vimovo) e 20 mg de esomeprazol com 375 ou 500 mg de naproxeno pode ser administrado por via oral duas vezes ao dia. Em algumas modalidades, o inibidor da bomba de prótons pode ser lansoprazol (Prevacid) e 15, 30 ou 60 mg de lansoprazol podem ser administrados por via oral uma ou duas vezes ao dia. Em algumas modalidades, O lansoprazol pode ser administrado por via intravenosa com 30 mg de lansoprazol injetado durante 30 minutos uma vez ao dia por até 7 dias. O indivíduo pode então mudar para o lansoprazol oral e continuar o tratamento. Em algumas modalidades, o inibidor da bomba de prótons pode ser omeprazol (Prilosec e Zegerid) e 10, 20 ou 40 mg de omeprazol podem ser administrados oralmente uma ou duas vezes por dia. Em algumas modalidades, o inibidor da bomba de prótons pode ser rabeprazol (Aciphex) e 20 ou 60 mg de rabeprazol podem ser administrados oralmente uma ou duas vezes
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240/540 por dia ou 100 mg de rabeprazol pode ser administrado oralmente uma vez por dia. Em qualquer uma das modalidades aqui reveladas, os agentes farmacológicos podem ser usados em combinação entre si.
[582] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o pH do sangue, tecido e/ou microambiente de um indivíduo pode ser medido antes, durante ou após a administração de um agente farmacológico. Em algumas modalidades, a decisão de administrar ou continuar a administrar a um indivíduo o agente farmacológico para aumentar ou diminuir o pH pode basearse na medição do pH do sangue, tecido e/ou microambiente do indivíduo. Métodos para medir o pH do sangue e/ou os níveis de bicarbonate do sangue de um indivíduo são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, tomografia por emissão de positrons (PET), espectroscopia de ressonância magnética (MRS), ressonância magnética (MRI) e imagem óptica podem ser usados para medir o pH in vivo em microambientes, por exemplo, em tumores (para detalhes de medição do pH do tumor, consulte: Zhang X, Lin Y, Gillies RJ. Tumor pH and its measurement. J Nucl Med. agosto de 2010;51(8):1167-70).
[583] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um método para aliviar a toxicidade do tumor alvo em um indivíduo, que inclui o disposto a seguir:
a. introduzir um polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) em uma célula T ou célula NK do indivíduo, para produzir uma célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar a MRB-CAR;
b. introduzir a célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar o MRB-CAR no indivíduo, em que a célula T e/ou a célula NK expressam o MRB-CAR no indivíduo; e
c. administrar um agente farmacológico ao indivíduo em quantidade suficiente para aumentar o pH sanguíneo e/ou o pH de um tecido e/ou pH de um microambiente para modular a ligação da MRB-CAR ao seu antígeno cognato no sangue, no tecido e/ou o microambiente com o aumento do pH, aliviando assim o alvo da toxicidade do tumor no indivíduo.
[584] Na etapa de introdução, a célula T ou célula NK é capaz de expressar o MRB-CAR visto que é geneticamente modificado para conter o ácido nucleico que codifica o MRB-CAR. Essa modificação genética pode ser a presença da sequência de codificação MRB
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CAR em um vetor que foi introduzido no interior da célula T ou célula NK por transfecção ou transdução. Em modalidades ilustrativas, o ácido nucleico que codifica o MRB-CAR é integrado ao genoma da célula T ou da célula NK.
[585] Prevê-se que vários métodos conhecidos na técnica para introduzir um polinucleotídeo em uma célula T e/ou célula NK possam ser usados com métodos aqui fornecidos para aspectos que incluem a alteração do pH para afetar a ligação de uma célula T de MRB -CAR ou de uma célula NK a o seu antígeno cognato em uma célula com o uso de um agente como um agente farmacológico modulador de pH (por vezes referido aqui como “aspectos de Comutador de pH”). Tipicamente, um vetor, em exemplos ilustrativos, um vetor de expressão, é usado para distribuir o polinucleotídeo. Tais vetores podem incluir vários vetores conhecidos na técnica para administrar ácidos nucleicos a células T e/ou a células NK. Aspectos ilustrativos da invenção usam vetores retrovirais e partículas retrovirais e, em algumas modalidades, particularmente ilustrativas, vetores lentivirais e, em modalidades ilustrativas, partículas lentivirais recombinantes.
[586] Outros vetores de expressão adequados podem ser usados em aspectos de comutação de pH aqui fornecidos. Tais vetores de expressão incluem, sem limitação, vetores virais (por exemplo, vetores virais à base de vírus vaccinia; poliovirus; adenovirus (consulte, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sei 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li e Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adenoassociado (consulte, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sei 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava no documento WO 93/09239, Samulskiet al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; e Flotte et al., PNAS (1993) 90: 10613-10617); SV40; vírus herpes simplex; ou um vetor retroviral (por exemplo, Vírus da Leucemia Murina, vírus da necrose do baço e vetores derivados de retrovirus, como Vírus Sarcoma de Rous, Vírus Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário), por exemplo, um retrovirus gama; ou vírus da imunodeficiência humana (consulte, por exemplo,
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Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); e similares.
[587] Em algumas modalidades, Partículas virais contendo DNA são utilizadas em vez de partículas retrovirais recombinantes. Tais partículas virais podem ser adenovirus, vírus adenoassociados, herpesvirus, citomegalovírus, poxvirus, vírus avipox, vírus influenza, vírus da estomatite vesicular (VSV) ou vírus Sindbis. Um versado na técnica apreciará como modificar os métodos aqui descritos para uso com diferentes vírus e retrovirus ou particular retrovirais. Quando são usadas partículas virais que incluem um genoma de DNA, um versado na técnica apreciará que unidades funcionais podem ser incluídas nesses genomas para induzir a integração da totalidade ou de uma porção do genoma de DNA da partícula viral no genoma de uma célula T e/ou célula NK transduzida com esse vírus. Alternativamente, o DNA funcional pode ser entregue a uma célula T e/ou célula NK que é expressa na célula, mas não está integrada ao genoma da célula T e/ou da célula NK.
[588] Em modalidades ilustrativas, o vetor usado em um aspecto de troca de pH da presente revelação é uma partícula retroviral recombinante e, em certas modalidades, uma partícula lentiviral recombinante. Tal partícula retroviral tipicamente inclui um genoma retroviral dentro de um capsídeo que está localizado dentro de um envelope viral. A presente revelação em diversas seções aqui apresentadas fornece diversas modalidades de partículas retrovirais recombinantes que revelam elementos que podem ser incluídos na superfície ou no interior e/ou no genoma de uma partícula retroviral recombinante. Qualquer uma dessas modalidades de partículas retrovirais recombinantes pode ser usada nos aspectos de comutação de pH aqui fornecidos.
Moléculas de RNA inibidoras [589] Em certas modalidades, os métodos fornecidos no presente documento para a presente revelação incluem inibir a expressão de um ou mais genes endógenos expressos em células T e/ou células NK. Os métodos fornecidos no presente documento ilustram a capacidade para produzir partículas retrovirais recombinantes que expressam uma ou mais e, em modalidades ilustrativas, duas ou mais, moléculas inibidoras de RNA, como, por exemplo, um miRNA ou shRNA, que podem ser usadas para tais métodos. De fato, os métodos fornecidos no presente documento ilustram que tais moléculas inibidoras de RNA podem ser codificadas dentro
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243/540 de introns, incluindo, por exemplo, um íntron Efla. Isso aproveita os presentes ensinamentos de métodos para maximizar os elementos funcionais que podem ser incluídos em um genoma retroviral empacotável para superar as desvantagens de ensinamentos anteriores e maximizar a eficácia de tais partículas retrovirais recombinantes em terapia de célula T adotiva.
[590] Em algumas modalidades, a molécula de RNA inibidora inclui uma fita 5’ e uma fita 3’ (em alguns exemplos, fita de sentido e fita antissentido) que são parcial ou totalmente complementares uma à outra, de modo que as duas fitas sejam capazes de formar um dúplex de RNA de 18 a 25 nucleotídeos em um ambiente celular. A fita 5' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento e a fita 3' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de comprimento. A fita 5' e a fita 3' podem ter comprimentos iguais ou diferentes, e o dúplex de RNA pode incluir uma ou mais incompatibilidades. Alternativamente, o dúplex de RNA não tem incompatibilidades.
[591] As moléculas inibidoras de RNA incluídas em composições e métodos fornecidos no presente documento, em certos exemplos ilustrativos, não existem e/ou não são expressas naturalmente em células T em cujo genoma são inseridas. Em algumas modalidades, a molécula de RNA inibidora é um miRNA ou um shRNA. Em algumas modalidades, onde é feita referência, no presente documento, ou em depósitos de prioridade, a um ácido nucleico que codifica um siRNA, especificamente em um contexto em que o ácido nucleico é parte de um genoma, será entendido que tal ácido nucleico é capaz de formar um precursor de siRNA como miRNA ou shRNA em uma célula que é processada por DICER para formar um RNA de fita dupla que tipicamente interage com, ou se torna parte de um complexo de RISK. Em algumas modalidades, uma molécula inibidora de uma modalidade da presente revelação é um precursor de um miRNA, como por exemplo, um Pri-miRNA ou um Pre-miRNA, ou um precursor de um shRNA. Em algumas modalidades, o miRNA ou shRNA são artificialmente derivados (isto é, miRNAs ou siRNAs artificiais). Em outras modalidades, a molécula de RNA inibidora é um dsRNA (transcrito ou artificialmente introduzido) que é processado em um siRNA ou o siRNA em si. Em algumas modalidades, o miRNA ou shRNA tem uma sequência que não é encontrada na natureza, ou tem pelo menos um segmento funcional que não é encontrada natureza ou tem uma combinação de segmentos funcionais que não são encontrados na natureza.
[592] Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA são
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244/540 posicionadas na primeira molécula de ácido nucleico em uma série de disposições de multiplex, de modo que múltiplas sequências de miRNA sejam simultaneamente expressadas a partir de uma única transcrição de miRNA policistrônica. Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA podem ser adjuntas uma à outra direta ou indiretamente por sequência (ou sequências) de aglutinante não funcional. A sequência aglutinante, em algumas modalidades, tem entre 5 e 120 nucleotídeos de comprimento e, em algumas modalidades, pode ter entre 10 e 40 nucleotídeos de comprimento, como exemplos não limitantes. Em modalidades ilustrativas, a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um ou mais (por exemplo, dois ou mais) RNAs inibidores e a segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um CAR (por exemplo, um MRB -CAR) são ligadas de modo operacional a um promotor que é constitutivamente ativo ou que pode ser induzido em uma célula T ou célula NK. Assim, a molécula (ou moléculas) de RNA inibidora (por exemplo, miRNAs), assim como o CAR, são expressos de uma maneira policistrônica. Adicionalmente, as sequências funcionais podem ser expressadas a partir da mesma transcrição. Por exemplo, qualquer um dos elementos linfoproliferativos fornecidos no presente documento que não são moléculas inibidoras de RNA, pode ser expressado a partir da mesma transcrição que o CAR e a uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA.
[593] Em algumas modalidades, a molécula de RNA inibidora é um miRNA de ocorrência natural como, mas sem limitações, miR-155. Alternativamente, os miRNAs artificiais podem ser produzidos, nos quais as sequências capazes de formar uma estrutura de haste de hibridização/complementar e direcionadas contra um RNA-alvo, são colocadas em um framework de miRNA que inclui sequências de flanqueamento de microRNA para processamento de microRNA e um laço, que pode ser opcionalmente derivado do mesmo miRNA de ocorrência natural que as sequências de flanqueamento, entre as sequências de haste. Assim, em algumas modalidades, uma molécula de RNA inibidora inclui uma orientação de 5' a 3': uma sequência de flanqueamento de microRNA 5’, uma haste 5’, um laço, uma haste 3’ que é parcial ou totalmente complementar à dita haste 5' e uma sequência de flanqueamento de microRNA 3’. Em algumas modalidades, a haste 5' (também chamada de um braço 5’ no presente documento) tem 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a haste 3' (também chamada de um braço 3’ no presente documento) tem 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o laço tem 3 a 40, 10 a 40, 20 a 40, ou
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245/540 a 30 nucleotídeos de comprimento e, em modalidades ilustrativas, o laço pode ter 18, 19, 20, ou 22 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, uma haste tem dois nucleotídeos a mais que a outra haste. A haste mais longa pode ser a haste 5' ou a haste 3'.
[ 594 ] Em algumas modalidades, a sequência de flanqueamento de microRNA 5’, a sequência de flanqueamento de microRNA 3’ ou ambas são derivadas de um miRNA de ocorrência natural como, mas sem limitações, miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122 e miR-21. Em certas modalidades, a sequência de flanqueamento de microRNA 5’, a sequência de flanqueamento de microRNA 3’ ou ambas são derivadas de um miR-155, como, por exemplo, o miR-155 de Mus musculus ou Homo sapiens. Inserir um haste-laço de miRNA sintético em um framework de miR-155 (isto é, a sequência de flanqueamento de microRNA 5’, a sequência de flanqueamento de microRNA 3' e o laço entre as hastes 5’ e 3’ de miRNA) é conhecido por um elemento de habilidade comum na técnica (Chung, K. et al. 2006. Nucleic Acids Research. 34(7):e53; documento n° U.S. 7.387.896). A sequência de SIBR (RNA derivado de BIC inibidor sintético) (Chung et al. 2006 acima), por exemplo, tem uma sequência de flanqueamento de microRNA 5' que consiste nos nucleotídeos 134 a 161 (SEQ ID NO:256) do mRNA de não codificação de Mus musculus BIC (Genbank ID AY096003.1) e uma sequência de flanqueamento de microRNA 3' que consiste nos nucleotídeos 223 a 283 do mRNA de não codificação de Mus musculus BIC (Genbank ID AY096003.1). Em um estudo, a sequência de SIBR foi modificada (eSIBR) para intensificar a expressão de miRNAs (Fowler, D.K. et al. 2015. Nucleic acids Research 44(5):e48). Em algumas modalidades da presente revelação, os miRNAs podem ser colocados no framework de miR-155 de SIBR ou eSIBR. Em modalidades ilustrativas no presente documento, os miRNAs são colocados em um framework de miR-155 que inclui a sequência de flanqueamento de microRNA 5' de miR-155 representada por SEQ ID NO:256, a sequência de flanqueamento de microRNA 3' representada por SEQ ID NO:260 (nucleotídeos 221 a 265 do mRNA de não codificação de Mus musculus BICy, e um laço de miR-155 modificado (SEQ ID NO:258). Assim, em algumas modalidades, a sequência de flanqueamento de microRNA 5’ de miR-155 é SEQ ID NO:256 ou uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, uma sequência que tem o mesmo comprimento que SEQ ID NO:256, ou 95%, 90%, 85%, 80%,75% ou 50% tão longa quanto SEQ ID NO: 256 ou tem 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75
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246/540 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:256. Em algumas modalidades, a sequência de flanqueamento de microRNA 3’ de miR-155 é SEQ ID NO:260 ou uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, o mesmo comprimento que SEQ ID NO:260, ou 95%, 90%, 85%, 80%,75% ou 50% tão longa quanto SEQ ID NO: 260 ou é uma sequência que tem 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:260. Entretanto, qualquer framework de microRNA conhecido, que seja funcional para fornecer processamento adequado dentro de uma célula de miRNAs inserida no mesmo para formar um miRNA maduro capaz de inibir a expressão de um mRNA-alvo ao qual se ligam, é contemplado na presente revelação.
[595] Em algumas modalidades, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro das moléculas inibidoras de RNA codificadas por uma sequência de ácidos nucleicos em um polinucleotídeo de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação tem as seguintes disposições na orientação de 5' a 3': uma sequência de flanqueamento de microRNA 5’, uma haste 5’, um laço, uma haste 3’ que é parcial ou totalmente complementar à dita haste 5' e uma sequência de flanqueamento de microRNA 3’. Em algumas modalidades, todas as moléculas inibidoras de RNA têm as seguintes disposições na orientação de 5' a 3': uma sequência de flanqueamento de microRNA 5’, uma haste 5’, um laço, uma haste 3’ que é parcial ou totalmente complementar à dita haste 5' e uma sequência de flanqueamento de microRNA 3’. Como revelado no presente documento, as moléculas inibidoras de RNA podem ser separadas por uma ou mais sequências de aglutinante que, em algumas modalidades, não têm uma função, exceto atuar como espaçadores entre as moléculas inibidoras de RNA.
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247/540 [596] Em algumas modalidades, onde duas ou mais moléculas inibidoras de RNA (em alguns exemplos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 moléculas inibidoras de RNA) são incluídas, essas moléculas inibidoras de RNA são direcionadas contra alvos de RNA iguais ou diferentes (como, por exemplo, mRNAs transcritos a partir de genes de interesse). Em modalidades ilustrativas, entre 2 e 10, 2 e 8, 2 e 6, 2 e 5, 3 e 5 ou 3 e 6 moléculas inibidoras de RNA são incluídos na primeira sequência de ácidos nucleicos. Em uma modalidade ilustrativa, quatro moléculas inibidoras de RNA são incluídas na primeira sequência de ácidos nucleicos.
[ 597 ] Em algumas modalidades, os alvos de RNA são mRNAs transcritos de genes que são expressados por células T como, mas sem limitações, PD-1 (prevenir inativação); CTLA4 (prevenir inativação); TCRa (segurança - prevenir autoimunidade); TCRb (segurança prevenir autoimunidade); CD3Z (segurança - prevenir autoimunidade); SOCS1 (prevenir inativação); SMAD2 (prevenir inativação); um alvo de miR-155 (promover ativação); IFN gama (reduzir CRS); cCBL (prolongar sinalização); TRAIL2 (prevenir morte); PP2A (prolongar sinalização); ABCG1 (aumentar teor de microdomínio de colesterol através da limitação da liberação de colesterol). Em exemplos ilustrativos, os miRNAs inseridos no genoma de células T, em métodos fornecidos no presente documento, são direcionados a alvos de modo que a proliferação das células T seja induzida e/ou intensificada e/ou a apoptose seja suprimida.
[598] Em algumas modalidades, os alvos de RNA incluem mRNAs que codificam componentes do complexo de receptor de célula T (TCR). Tais componentes podem incluir componentes para a geração e/ou formação de um complexo de receptor de célula T e/ou componentes para o funcionamento adequado de um complexo de receptor de célula T. Consequentemente, em uma modalidade, pelo menos uma dentre as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA causa uma diminuição na formação e/ou função de um complexo de TCR, em modalidades ilustrativas, um ou mais complexos de TCR endógena de uma célula T. O complexo de receptor de célula T inclui TCRa, TCRb, CD3d, CD3e, CD3g e CD3z. Sabe-se que há uma interdependência complexa desses componentes, de modo que uma diminuição na expressão de qualquer uma subunidade resulte em uma diminuição na expressão e função do complexo. Consequentemente, em uma modalidade, o alvo de RNA é um mRNA que expressa um ou mais dentre TCRa, TCRb, CD3d, CD3e, CD3g e CD3z endógeno a uma célula T transduzida. Em certas modalidades, o alvo de RNA é mRNA transcrito do gene de TCRa ou TCRB endógeno da
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248/540 célula T cujo genoma compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica o um ou mais miRNAs. Em modalidades ilustrativas, o alvo de RNA é mRNA transcrito do gene de TCRa. Em certas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra mRNAs transcritos a partir de genes-alvo com utilidades esperadas similares podem ser combinadas. Em outras modalidades, as moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra mRNAs transcritos a partir de genes-alvo com utilidades complementares podem ser combinadas. Em algumas modalidades, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA são direcionadas contra os mRNAs transcritos dos genes-alvo CD3Z, PD1, SOCS1, e/ou IFN gama.
[599] Em algumas modalidades fornecidas no presente documento, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA podem ser entregues em um único íntron, como, mas sem limitações, EFl-aa íntron A. Sequências de íntron que podem ser usadas para abrigar miRNAs para a presente revelação incluem qualquer íntron que seja processado dentro da célula T. Como indicado no presente documento, uma vantagem de tais disposições é que isso ajuda a maximizar a capacidade para incluir sequências de miRNA dentro das restrições de tamanho de um genoma retroviral usado para entregar tais sequências a uma célula T em métodos fornecidos no presente documento. Isso é especificamente verdadeiro onde um íntron da primeira sequência de ácidos nucleicos inclui toda ou uma porção de uma sequência promotora usada para expressar tal íntron, uma sequência de CAR e outras sequências funcionais fornecidas no presente documento, como elemento (ou elementos) linfoproliferativo que não são moléculas inibidoras de RNA, de uma maneira policistrônica. As exigências de sequência para introns são conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, tal processamento de íntron é ligado de modo operacional a um riboswitch, como qualquer riboswitch revelado no presente documento. Assim, o riboswitch pode fornecer um elemento regulador para o controle de expressão da uma ou mais sequências de miRNA na primeira sequência de ácidos nucleicos. Consequentemente, em modalidades ilustrativas fornecidas no presente documento, há uma combinação de um miRNA direcionado contra um receptor de célula T endógeno subunidade, em que a expressão do miRNA é regulada por um riboswitch, que pode ser qualquer um dos riboswitches discutidos no presente documento.
[600] Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA podem ser fornecidas em múltiplas sequências de ácido nucleico que podem ser incluídas em uma unidade transcricional igual ou diferente. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos pode
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249/540 codificar uma ou mais moléculas inibidoras de RNA e ser expressa a partir de um primeiro promotor e uma segunda sequência de ácidos nucleicos pode codificar uma ou mais moléculas inibidoras de RNA e ser expressa a partir de um segundo promotor. Em modalidades ilustrativas, duas ou mais moléculas inibidoras de RNA são localizadas em uma primeira sequência de ácidos nucleicos que é expressada a partir de um único promotor. O promotor usado para expressar tais miRNAs consiste tipicamente em promotores que são inativos em uma célula de empacotamento usada para expressar uma partícula retroviral que entregará os miRNAs em seu genoma para uma célula-alvo T, porém, tal promotor é ativo, constitutivamente ou de uma maneira induzível, dentro de uma célula T. O promotor pode ser um promotor Pol I, Pol II ou Pol III. Em algumas modalidades ilustrativas, o promotor é um promotor Pol II.
Caracterização e métodos de produção comercial [601] A presente revelação fornece vários métodos e composições que podem ser usados como reagentes de pesquisa em experimentação científica e para produção comercial. Tal experimentação científica pode incluir métodos para caracterização de linfócitos, como células NK e, em modalidades ilustrativas, métodos que usam células T para modificar geneticamente, por exemplo, transduzir linfócitos fornecidos no presente documento. Tais métodos, por exemplo, podem ser usados para estudar a ativação de linfócitos e os mecanismos moleculares detalhados pelos quais a ativação torna tais células transduzíveis. Ademais, são fornecidos no presente documento linfócitos geneticamente modificados que terão utilidade, por exemplo, como ferramentas de pesquisa para mais bem entender os fatores que influenciam a proliferação e a sobrevivência de célula T. Tais linfócitos geneticamente modificados, como as células NK e, em modalidades ilustrativas, células T, podem ser adicionalmente usados para a produção comercial, por exemplo, para a produção de certos fatores, como fatores de crescimento e agentes imunomodulatórios, que podem ser coletados e testados ou usados na produção de produtos comerciais.
[602] Os experimentos científicos e/ou a caracterização de linfócitos pode incluir qualquer um dos aspectos, modalidades ou submodalidades fornecidos no presente documento úteis para analisar ou comparar linfócitos. Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK podem ser transduzidas com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento, que incluem polinucleotídeos. Em algumas
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250/540 modalidades, a transdução das células T e/ou células NK pode incluir polinucleotídeos que incluem polinucleotídeos que codificam polipeptídeos da presente revelação, por exemplo, CARs, elementos linfoproliferativos e/ou elementos de ativação. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem incluir moléculas inibidoras de RNA como discutido em outra parte no presente documento. Em algumas modalidades, os elementos linfoproliferativo podem ser elementos linfoproliferativos quiméricos.
Métodos de tratamento [603] A presente revelação fornece vários métodos de tratamento com o uso de um CAR. Um CAR da presente revelação, quando presente em um linfócito T ou uma célula NK, pode mediar a citotoxicidade em direção a uma célula-alvo. Um CAR da presente revelação ligase a um antígeno presente em uma célula-alvo, mediando, assim, o extermínio de uma célula-alvo por um linfócito T ou uma célula NK geneticamente modificada para produzir o CAR. A ASTR do CAR se liga a um antígeno presente na superfície de uma célula-alvo.
[604] A presente revelação fornece métodos para matar ou inibir o crescimento de uma célula-alvo, em que o método envolve entrar em contato com uma célula efetora imune citotóxica (por exemplo, uma célula T citotóxica ou uma célula NK) que é geneticamente modificada para produzir um CAR de tópico, de modo que o linfócito T ou célula NK reconheça um antígeno presente na superfície de uma célula-alvo, e medeie a morte da célula alvo.
[605] A presente revelação fornece um método para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo que tem a doença ou distúrbio, sendo que o método inclui: a. introduzir um vetor de expressão incluindo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CAR em células sanguíneas periféricas obtidas a partir do sujeito para produzir uma célula citotóxica geneticamente modificada; e b. administrar a célula citotóxica geneticamente modificada ao sujeito.
[606] Em métodos fornecidos no presente documento que incluem administrar células T e/ou células NK geneticamente modificadas a um sujeito, especificamente onde o sujeito tem, ou suspeita-se que tenha câncer, os métodos podem incluir adicionalmente entregar uma dose eficaz de um inibidor de ponto de verificação imune ao sujeito. Essa entrega de inibidor de ponto de verificação pode ocorrer antes, após ou ao mesmo tempo que a administração das células T e/ou células NK geneticamente modificadas. Os inibidores de ponto de verificação imunes são
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251/540 conhecidos e vários compostos estão aprovados e em desenvolvimento clínico. As moléculas de ponto de verificação, muitas das quais são o alvo de compostos de inibidor de ponto de verificação, incluem o seguinte, com alguns inibidores de ponto de verificação notados:
[607] CD27. Essa molécula suporta expansão específica de antígeno de células
T virgens e é vital para a geração de memória de célula T. A Celldex Therapeutics está trabalhando em CDX-1127, um anticorpo monoclonal anti-CD27 agonístico.
[ 60 8 ] CD28. Essa molécula é constitutivamente expressa em quase todas as células T CD4+ humanas e em cerca de metade de todas as células T CD 8. CD28 foi o alvo do superagonista de TGN1412.
[609] CD40. Essa molécula, encontrada em uma variedade de células do sistema imunológico incluindo as células apresentando antígeno, tem CD40L, de outro modo conhecido como CD 154 e expresso de modo temporário na superfície de células T CD4+ ativadas, como seu ligante. Um anticorpo monoclonal agonista anti-CD40 foi licenciado à Roche.
[610] CD122. Essa molécula, que é a subunidade beta de receptor de interleucina-2, é conhecida por aumentar a proliferação de células T efetoras CD8+. A Nektar Therapeutics desenvolveu o NKTR-214, uma citocina imunoestimulante propensa ao CD122.
[611] CD137. Quando essa molécula, também chamada de 4-1BB, é ligada por ligante de CD 137, o resultado é a proliferação de célula T. A Pieris Pharmaceuticals desenvolveu uma lipocalina geneticamente modificada que é biespecífica para CD137 e HER2.
[612] 0X40. Essa molécula, também chamada de CD 134, tem OX40L, ou CD252, como seu ligante. Como CD27, a 0X40 promove a expansão de células T efetoras e de memória, entretanto também é observada por sua capacidade de suprimir a diferenciação e a atividade de células T reguladoras e, ainda, por sua regulação da produção de citocina. A AstraZeneca tem três fármacos em desenvolvimento alvejando a 0X40: MEDI0562 é um agonista de 0X40 humanizado; MEDI6469, agonista de 0X40 murino; e MEDI6383, um agonista de 0X40.
[613] GITR, abreviação para gene relacionado à família de TNFR Induzido por Glucocorticoide, induz a expansão de célula T, incluindo a expansão de Treg. A TG Therapeutics trabalha em anticorpos anti-GITR.
[614] ICOS. Essa molécula, abreviação para coestimulante de célula T
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Induzível, e também chamada de CD278, é expressa em células T ativadas. A Jounce Therapeutics está desenvolvendo um agonista de ICOS.
[615] A2AR. O receptor de A2A de adenosina é considerado um importante ponto de verificação na terapia de câncer, visto que a adenosina no microambiente imune, levando à ativação do receptor de A2a, é um laço de retroalimentação imune negativo e o microambiente de tumor tem concentrações relativamente altas de adenosina.
[616] B7-H3, também chamado de CD276, foi originalmente entendido como uma molécula coestimulante, porém, agora é considerado como coinibidora. A MacroGenics está trabalhando na MGA271, que é um anticorpo monoclonal otimizado para Fc que alveja B7-H3.
[617] B7-H4, também chamado de VTCN1, é expressado por células de tumor e macrófagos associados ao tumor e desempenha um papel no escape de tumor.
[618] BTLA. Essa molécula, abreviação para Atenuador de Linfócito B e T e também chamada de CD272, tem HVEM (Mediador de Entrada de Herpesvirus) como seu ligante.
[619] CTLA-4, abreviação para proteína 4 Associada ao Linfócito T Citotóxico e também chamada de CD152, é o alvo do composto da Bristol-Myers Squibb, Yervoy.
[620] IDO, abreviação para 2,3-dioxigenase de indolamina, é uma enzima catabólica de triptofano com propriedades imunoinibitórias. Outra molécula importante é a TDO, 2,3-dioxigenase de triptofano. IDO. A Newlink Genetics e a Incyte identificaram os inibidores de trajetória de IDO.
[621] KIR, abreviação para Receptor tipo Imunoglobulina de célula exterminadora, é um receptor para moléculas de Classe I de MHC em células Exterminadoras Naturais. A Bristol-Myers Squibb desenvolveu o Lirilumab, um anticorpo monoclonal para KIR.
[ 622 ] LAG3, abreviação para Gene-3 de ativação de linfócito, funciona para suprimir uma resposta imune pela ação para Tregs, assim como efeitos diretos sobre as células T CD8+. A Bristol-Myers Squibb desenvolveu um anticorpo monoclonal anti-LAG3 chamado BMS-986016.
[623] PD-1, abreviação para receptor de Morte Programada 1 (PD-1), tem dois ligantes, PD-L1 e PD-L2. Esse ponto de verificação é o alvo do fármaco de melanoma da Merck & Co., Keytruda, [624] TIM-3, abreviação para domínio de Mucina e domínio de
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Imunoglobulina de célula T-3, expressa em células T CD4+ humanas ativadas e regula citocinas de Thl e Thl7.
[625] VISTA (proteína), abreviação para supressor de Ig de domínio V de ativação de célula T, VISTA, é principalmente expressada em células hematopoiéticas.
Sujeitos adequados para o tratamento [626] Uma variedade de sujeitos é adequada para o tratamento com os métodos e composições apresentados no presente documento. Os sujeitos adequados incluem qualquer indivíduo, por exemplo, um ser humano ou animal não humano que tem uma doença ou transtorno, que foi diagnosticado com uma doença ou transtorno, que está em risco de desenvolver uma doença ou transtorno, que teve uma doença ou transtorno e está em risco de recorrência da doença ou transtorno, que foi tratado com um agente para a doença ou transtorno e falhou ao responder a tal tratamento ou que foi tratado com um agente para a doença ou transtorno, porém, sofre o relapso após a resposta inicial a tal tratamento.
[627] Os indivíduos adequados para o tratamento com um método imunomodulador incluem indivíduos que têm um distúrbio autoimune; indivíduos que são receptores de transplantes de órgãos ou tecidos; e similares; indivíduos imunocomprometidos; e indivíduos que estão infectados com um patógeno.
MODALIDADES explicativas [628] São fornecidos nesta seção de Modalidades exemplificativas os aspectos e modalidades exemplificativos fornecidos no presente documento e adicionalmente discutidos ao longo do presente relatório descritivo. Visando a brevidade e a conveniência, todos os aspectos e modalidades revelados e todas as combinações possíveis dos aspectos e modalidades revelados não são listados nessa seção. Será entendido que são fornecidas modalidades que são modalidades específicas para muitos aspectos, como discutido em toda esta revelação. Pretende-se, em vista da revelação completa no presente documento, que qualquer modalidade individual mencionada abaixo ou nesta revelação completa possa ser combinada com qualquer aspecto mencionado abaixo ou nesta revelação completa, em que é um elemento adicional que pode ser adicionado a um aspecto ou porque é um elemento mais estreito para um elemento já presente em um aspecto. Tais combinações são discutidas mais especificamente em outras seções desta descrição detalhada.
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254/540 [629] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação incluindo um polinucleotídeo incluindo:
A. uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico (CAR); e
B. um elemento de pseudotipagem e um elemento de ativação (por exemplo, um elemento de ativação de célula NK ou, em modalidades ilustrativas, um elemento de ativação de célula T) em sua superfície, em que o elemento de ativação não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[630] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, incluindo um polinucleotídeo incluindo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo incluindo um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo incluindo um elemento linfoproliferativo. Várias modalidades para tal partícula, como, mas sem limitações, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, elementos de controle, CARs e outros elementos são fornecidos no presente documento, nesta seção e nesta revelação.
[631] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, compreendendo um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo compreendendo um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo quimérico, por exemplo, um elemento linfoproliferativo quimérico constitutivamente ativo. Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo quimérico não compreende uma citocina aglutinada ao seu receptor cognato ou aglutinada a um fragmento de seu receptor cognato. Várias modalidades para tal partícula, como, mas sem limitações, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, elementos de controle, CARs e outros elementos são fornecidos no presente documento, nesta seção e nesta revelação.
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4501/5200
255/540 [632] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que compreende:
A. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico (CAR); e
B. um elemento de pseudotipagem e um elemento de ativação de célula T em sua superfície, em que o elemento de ativação de célula T não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, e em que o elemento de ativação de célula T é um anticorpo de scFvFc anti-CD3. Várias modalidades para tal partícula, como, mas sem limitações, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, elementos de controle, CARs e outros elementos são fornecidos no presente documento, nesta seção e nesta revelação.
[633] Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação que compreendem:
A. um ou mais elementos de pseudotipagem capazes de se ligar a uma célula T e/ou uma célula NK e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação das mesmas;
B. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo pelo menos um elemento linfoproliferativo; em que a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado são reguladas por um elemento de controle; e
C. um elemento de ativação em sua superfície, em que o elemento de ativação é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e não é codificado por um polinucleotídeo nas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Várias modalidades
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4502/5200
256/540 para tal partícula, como, mas sem limitações, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, elementos de controle, CARs e outros elementos são fornecidos no presente documento, nesta seção e nesta revelação.
[634] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um linfócito geneticamente modificado, como uma célula T ou célula NK produzida através da transdução de células T em repouso e/ou células NK em repouso de acordo com um método compreendendo colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso ex vivo, em contato com qualquer uma das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas. Em uma modalidade, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um elemento de ligação de célula T ligado à membrana em sua superfície. Várias modalidades para tal célula como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento nesta seção e nesta revelação.
[635] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento o uso de qualquer partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação na fabricação de um kit para modificar geneticamente uma célula T ou célula NK, em que o uso do kit inclui as etapas de qualquer um dos aspectos e modalidades de métodos fornecidos no presente documento. Por exemplo, em outro aspecto, é fornecido no presente documento o uso de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação na fabricação de um kit para modificar geneticamente uma célula T ou célula NK, em que o uso do kit inclui: colocar em contato a célula T ou célula NK ex vivo com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação inclui um elemento de pseudotipagem em uma superfície e tipicamente um elemento de ativação de célula T na superfície, em que o dito contato facilita a transdução da célula T ou célula NK pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, uma célula T ou célula NK geneticamente modificada. Em algumas modalidades, o elemento de ativação de célula T pode ser ligado à membrana. Em modalidades ilustrativas, o elemento de ativação de célula T
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4503/5200
257/540 ativa a célula T através do complexo de receptor associado ao receptor de célula T. Em algumas modalidades, o contato pode ser realizado por entre 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 horas na extremidade baixa da faixa e 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 18, 21 e 24 horas na extremidade alta da faixa, por exemplo, entre 1 e 12 horas ou entre 1 e 5 horas. Nesse aspecto de uso e outros aspectos de uso no presente documento, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação para uso na fabricação de um kit pode incluir qualquer um dos aspectos e modalidades de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento. Várias outras modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, outros tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
[636] E fornecido no presente documento, em outro aspecto, um método de transduzir e/ou modificar geneticamente um linfócito, tipicamente uma célula T e/ou uma célula NK, e tipicamente uma célula T e/ou célula NK em repouso, que inclui colocar o linfócito em contato com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação tipicamente compreende um elemento de pseudotipagem em sua superfície, em que o dito contato (que também pode ser considerado incubação sob condições de contato) facilita a transdução da célula T e/ou célula NK em repouso pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada. O elemento de pseudotipagem é tipicamente capaz de se ligar à célula T e/ou célula NK em repouso e tipicamente facilitar a fusão de membrana em sua própria ou em conjunto com outra proteína (proteínas) das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Em algumas modalidades do método, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um elemento de ativação, como um elemento de ativação de célula T que ativa uma célula T através do complexo associado ao receptor de célula T. Tal elemento de ativação pode ser um anticorpo anti-CD3, por exemplo, um scFv anti-CD3 ou um scFvFc antiCD3. Vários tempos de contato exemplificativos e ilustrativos são fornecidos no presente documento. Várias outras modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4504/5200
258/540 modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
[637] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para modificar geneticamente e/ou transduzir um linfócito, compreendendo colocar o linfócito ex vivo em contato com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um elemento de ligação de célula T ligado à membrana em sua superfície, em que o dito contato facilita transdução do linfócito pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, um linfócito geneticamente modificado. Em algumas modalidades, o elemento de ligação de célula T ligado à membrana é um anticorpo anti-CD3, por exemplo, um scFv anti-CD3 ou um scFvFc antiCD3. Várias outras modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
[638] E fornecido em outro aspecto, no presente documento, um método para transduzir linfócitos em repouso de um sujeito, compreendendo colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso de um sujeito ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK em repouso e facilitar a fusão de membrana da partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação à mesma, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas. Em modalidades ilustrativas deste aspecto, pelo menos 10%, 20% ou 25% das células T e/ou células NK em repouso, ou entre 10% e 70%, entre 10% e 50% ou entre 20% e 50% de células T e/ou células NK são transduzidas como um resultado do processo. Várias outras modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4505/5200
259/540 [639] E fornecido, em outro aspecto no presente documento, um método para transduzir células T em repouso e/ou células NK em repouso de sangue isolado, compreendendo:
A. coletai- sangue de um sujeito;
B. isolar as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) compreendendo células T em repouso e/ou células NK em repouso;
C. colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK em repouso e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas, em que o dito contato facilita a transdução de pelo menos 5% das células T em repouso e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas, transduzindo, assim, células T e/ou células NK em repouso. Várias outras modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
[640] Tipicamente, uma linhagem celular de empacotamento é usada para produzir a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação como discutido em outra parte no presente documento. Em algumas modalidades, a linhagem de célula de empacotamento pode ser uma linhagem de célula de suspensão. Em modalidades ilustrativas, a linhagem de célula de empacotamento pode ser cultivada em meios livres de soro. Em algumas modalidades, o linfócito pode ser de um sujeito. Em modalidades ilustrativas, o linfócito pode ser de sangue de um sujeito. Várias outras modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
[641] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4506/5200
260/540 transduzir um linfócito com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação que compreende:
A. transfectar uma célula de empacotamento com um grupo de vetores compreendendo componentes da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que a célula de empacotamento é cultivada em suspensão em meios livres de soro;
B. coletar a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação dos meios livres de soro; e
C. colocar o linfócito em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Várias modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
[642] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para transduzir um linfócito com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação que compreende:
A. cultivar uma célula de empacotamento em suspensão em meios livres de soro, em que a célula de empacotamento compreende sequências de ácido nucleico que codificam um genoma de RNA empacotável da partícula retroviral incompetente em replicação, uma proteína REV, um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um elemento de pseudotipagem;
B. coletar a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação dos meios livres de soro; e
C. colocar o linfócito em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que o contato é realizado por menos que 12 horas, transduzindo, assim, o linfócito. Várias outras modalidades para tais métodos como, mas sem limitações, outros tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de pseudotipagem, percentual de células transfectadas/geneticamente modificadas, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4507/5200
261/540 [ 64 3 ] Exceto se for incompatível, ou se já for declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas, a célula de empacotamento é uma célula imortalizada que compreende ácidos nucleicos de DNA integrados de modo estável na mesma, que codifica o genoma de RNA empacotável. Em algumas modalidades, o polipeptídeo gag e o polipeptídeo pol são expressados a partir de um ou mais promotores induzíveis e em que o método compreende adicionalmente, durante a cultura, adicionar um transativador para induzir a expressão do polipeptídeo gag e do polipeptídeo pol a partir do um ou mais promotores induzíveis. Várias modalidades de tais métodos como, mas sem limitações, tempos de contato, elementos linfoproliferativos, elementos de ativação, elementos de controle e outros elementos são fornecidos no presente documento.
[644] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e/ou transduzir linfócitos, por exemplo, linfócitos T, para modificar geneticamente e expandir linfócitos, por exemplo, linfócitos T, ou para realizar terapia celular no presente documento ou métodos similares, o contato pode ser executado por entre 15, 30 ou 45 minutos ou 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 horas na extremidade baixa da faixa e entre 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48 e 72 horas na extremidade alta da faixa. Por exemplo, em modalidades ilustrativas, o contato é executado por entre 2 e 24 horas, entre 2 e 20 horas, entre 2 e 6 horas, entre 1 e 20 horas, entre 1 e 12 horas, entre 1 e 4 horas, entre 4 e 12 horas ou entre 4 e 8 horas. Em algumas modalidades, o contato de uma PBMC, célula NK e, em modalidades ilustrativas, uma célula T com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em qualquer um dos métodos, processos para produzir produtos ou usos das mesmas exceto se declarado, ou declarado de outro modo em um aspecto mais amplo, fornecidos no presente documento, pode ser realizado for entre 1 e 24 horas, por exemplo, entre 1 e 12 horas, entre 1 e 6 horas. Em algumas modalidades, o contato pode ser realizado por menos de 24 horas, por exemplo, menos de 12 horas, menos de 8 horas ou menos de 4 horas. Em modalidades ilustrativas, o contato é realizado por entre 1 e 14 horas, entre 1 e 12 horas, entre 1 e 6 horas, entre 1 e 4 horas ou entre 2 e 14 horas. Tais métodos podem ser realizados sem ativação anterior.
[645] Exceto se incompatível, ou já declarado em um aspecto, as modalidades adicionais de qualquer um dos métodos, uso ou produto acima por aspectos de processo para transduzir e/ou modificar geneticamente um linfócito, por exemplo, uma célula NK ou, em
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4508/5200
262/540 modalidades ilustrativas, uma célula T, pode incluir qualquer uma das modalidades de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, elementos linfoproliferativos, CARs, elementos de pseudotipagem, riboswitches, elementos de ativação, citocinas ligadas à membrana, miRNAs e/ou outros elementos revelados no presente documento. Em certas modalidades ilustrativas, a partícula retroviral é uma partícula lentiviral.
[646] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em qualquer um dos métodos, kits, usos ou composições (por exemplo, polinucleotídeos, células de empacotamento ou partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação) fornecidos no presente documento, a partícula (ou partículas) de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende ou compreende adicionalmente um elemento de ativação em sua superfície que é capaz de ativar uma célula T em repouso e/ou uma célula NK em repouso. Tipicamente, o elemento de ativação, como um elemento de ativação de célula T, não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[647] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em qualquer um dos métodos, kits, usos ou composições (por exemplo, polinucleotídeos, células de empacotamento ou partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação) fornecidos no presente documento que menciona uma célula T e/ou a célula NK, ou uma célula T em repouso ou uma célula NK em repouso, em certas modalidades ilustrativas, a célula é uma célula T.
[648] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, tipicamente, a partícula retroviral recombinante em qualquer um dos métodos, kits, usos ou composições (por exemplo, polinucleotídeos, células de empacotamento ou partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação) fornecidos no presente documento, é incompetente em replicação, isto é, não pode se replicar. Em modalidades ilustrativas, o retrovirus é um lentivírus, como um lentivírus de HIV incompetente em replicação ou defeituoso em replicação. Em modalidades ilustrativas, a partícula retroviral é uma partícula lentiviral, como uma partícula lentiviram de HIV incompetente em replicação ou defeituosa em replicação. Assim, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos, kits, usos ou composições (por exemplo, polinucleotídeos, células de empacotamento ou partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação) fornecidos no presente documento, se já não for mencionado, ou não for ainda mencionado de outro modo, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação é uma partícula lentiviral e/ou
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4509/5200
263/540 a célula geneticamente modificada é uma célula T geneticamente modificada.
[649] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento, os linfócitos podem ser células T e/ou células NK. Em modalidades adicionalmente ilustrativas, as células T e/ou células NK podem ser células T em repouso e/ou células NK em repouso.
[650] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para transduzir, modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular adotiva no presente documento, ou métodos similares, entre 10% e 75%, ou 10% e 70%, ou 10% e 60%, ou 10% e 50%, ou 10% e 25%, ou 20% e 75%, ou 20% e 50%, ou pelo menos 10%, 20% ou 25% de células T em repouso são transduzidas e entre 0% e 75% das células NK são transduzidas. Em outras modalidades, entre 5% e 80%, ou 10% e 80%, ou 10% e 70%, ou 10% e 60%, ou 10% e 50%, ou 10% e 25%, ou 10% e 20% ou 20% e 50% de células NK em repouso são transduzidas.
[651] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir os linfócitos ou para realizar terapia celular adotiva no presente documento ou métodos similares ou quaisquer composições fornecidas no presente documento, a expressão do dito segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é regulada pelo elemento de controle.
[652] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em qualquer um dentre o método, uso, produto por processo ou composição aspectos no presente documento que incluem uma célula T ou célula NK geneticamente modificada ou uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, tal célula T ou célula NK geneticamente modificada ou partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação pode incluir um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codifica um primeiro polipeptídeo que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo de célula T. Em algumas modalidades, a expressão do CAR e/ou do elemento linfoproliferativo estão sob o controle de um elemento de controle ou de diferentes elementos de controle para cada. Em algumas modalidades, o CAR e o elemento linfoproliferativo podem ser expressos no mesmo
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4510/5200
264/540 polipeptídeo e, em modalidades ilustrativas, o CAR e o elemento linfoproliferativo são expressados como polipeptídeos separados. Em algumas modalidades, o CAR é um MRB CAR. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo quimérico é constitutivamente ativo, por exemplo, um receptor de citocina quimérico constitutivamente ativo. Em tais modalidades, o receptor de citocina quimérico constitutivamente ativo pode estar sob o controle de um elemento de controle.
[653] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em qualquer um dos aspectos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo nas células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo compreendendo um receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou um segundo polipeptídeo compreendendo um elemento linfoproliferativo de célula T, o polinucleotídeo pode compreender adicionalmente um ou mais de uma sequência relacionada a Kozak, um elemento de WPRE e uma sequência de múltiplas interrupções, como um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla, em que um ou mais dos códons de interrupção do códon de interrupção dupla ou o códon de interrupção tripla definem uma terminação de uma leitura da pelo menos uma da uma ou mais unidades transcricionais. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência tipo Kozak selecionada a partir de CCACCAT/UG(G), CCGCCAT/UG(G), GCCGCCGCCAT/UG(G) ou GCCGCCACCAT/U(G). Em certas modalidades, tanto os nucleotídeos -3 e +4 em relação a um códon inicial da primeira sequência de ácidos nucleicos compreendem um G. Em outra modalidade, que pode ser combinada com a modalidade precedente que compreende uma sequência tipo Kozak e/ou a seguinte modalidade que compreende códon de interrupção tripla, o polinucleotídeo inclui um elemento de WPRE. Em algumas modalidades, o elemento de WPRE é localizado 3 ’ de um códon de interrupção da uma ou mais unidades transcricionais e 5’ a um 3’ LTRdo polinucleotídeo. Em outra modalidade, que pode ser combinada com uma ou ambas as modalidades anteriores (isto é, uma modalidade em que o polinucleotídeo compreende uma sequência tipo Kozak e/ou uma modalidade em que o polinucleotídeo compreendeu um WPRE), a uma ou mais unidades transcricionais terminam com um ou mais códons de interrupção de um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla.
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4511/5200
265/540 [654] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos, usos e composições fornecidos no presente documento que incluem um elemento linfoproliferativo, o elemento linfoproliferativo pode ser um elemento linfoproliferativo quimérico. Em modalidades no presente documento que incluem um elemento linfoproliferativo quimérico, o elemento linfoproliferativo pode ser um receptor de citocina quimérico. Em modalidades no presente documento que incluem um elemento linfoproliferativo quimérico, o elemento linfoproliferativo IL-7 aglutinado ao receptor de IL-7 alfa ou diferente de IL-7 aglutinado ao receptor de IL-7 alfa. Em algumas modalidades, o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 aglutinado ao receptor de IL-7 alfa ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para promover a proliferação de células T e/ou células NK, e em que o receptor de citocina quimérico é constitutivamente ativo. Em algumas modalidades, o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 covalentemente ligado a um fragmento extracelular funcional do receptor de IL-7 capaz de se ligar a IL-7, um domínio transmembranar de IL-7 e um IL-7 domínio de sinalização.
[655] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em qualquer um dos aspectos ou modalidades no presente documento que inclui um elemento linfoproliferativo quimérico, o elemento linfoproliferativo quimérico pode ser diferente de um receptor de citocina quimérico. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que incluem um elemento linfoproliferativo, o elemento linfoproliferativo quimérico pode ser um receptor de citocina quimérico. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui um receptor de citocina quimérico, o receptor de citocina quimérico compreende um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-7, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL12, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-15/IL-2, tal receptor beta de IL15/IL-2, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-21, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-23, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-27, um domínio de sinalização intracelular de um receptor chamariz de fator de crescimento de transformação β (ΤΘΕβ) ou CD28. Em algumas modalidades, o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 fundido ao receptor de IL-7.
[656] Exceto se declarado de outro modo, ou já declarado em um aspecto mais
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266/540 amplo, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui um elemento linfoproliferativo, o elemento linfoproliferativo pode compreender um motivo de sobrevivência de célula T. O motivo de sobrevivência de célula T pode compreender todo ou um fragmento funcional do receptor de IL-7, receptor de IL-15 ou CD28. Em outras modalidades, o elemento linfoproliferativo pode incluir uma citocina ou receptor de citocina polipeptídeo ou um fragmento do mesmo compreendendo um domínio de sinalização. Por exemplo, o elemento linfoproliferativo pode compreender um polipeptídeo de interleucina e o elemento linfoproliferativo pode compreender adicionalmente uma porção de seu receptor de polipeptídeo de interleucina cognato covalentemente ligado por meio de um aglutinante. Tipicamente, essa porção do receptor de interleucina cognato inclui uma porção funcional do domínio extracelular capaz de ligar a interleucina citocina e o domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio intracelular é uma porção intracelular do receptor de interleucina cognato. Em algumas modalidades, o domínio intracelular é uma porção intracelular de um receptor de citocina diferente que é capaz de promover a proliferação de linfócito e opcionalmente a sobrevivência ex vivo ou in vitro em cultura na ausência da exposição ex vivo do linfócito a citocinas exógenas como IL-15, IL-7, e em modalidades ilustrativas IL-2 e na ausência do alvo para uma ASTR de uma CAR expressa pelos linfócitos durante a cultura por 6, 7, 14, 21 ou 35 dias, ou mais.
[ 657 ] Exceto se for incompatível com, ou se já for declarado em um aspecto, em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é um polipeptídeo de interleucina covalentemente ligado ao seu receptor de polipeptídeo de interleucina cognato de comprimento total por meio de um aglutinante. Alternativamente, o elemento linfoproliferativo pode ser um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-7, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-12, um domínio de sinalização intracelular de IL-23, um domínio de sinalização intracelular de IL-27, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-15, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-21 ou um domínio de sinalização intracelular de um receptor chamariz de fator de crescimento de transformação β (TGFP).
[658] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em algumas modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo é constitutivamente ativo. Ademais, o
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267/540 elemento linfoproliferativo pode incluir um receptor de IL-7 mutado ou um fragmento do mesmo, que pode incluir adicionalmente um receptor de IL-7 mutado constitutivamente ativo ou um fragmento constitutivamente ativo do mesmo. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo ou o receptor de citocina quimérico compreende um mutante de IL7 InsPPCL. Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em qualquer um dos aspectos no presente documento, que inclui um elemento linfoproliferativo, o elemento linfoproliferativo pode ser qualquer um dos CLEs mencionados na seção de Elemento Linfoproliferativo no presente documento. Por exemplo, em modalidades ilustrativas, os CLEs compreendem domínios dos genes especificamente apontados como especificamente notáveis e/ou construtos Superiores em relação aos Exemplos no presente documento.
[659] Em certas modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo compreende um receptor de citocina ou um fragmento do mesmo que inclui um domínio de sinalização que ativa uma trajetória de Jak/STAT5. Por exemplo, tal elemento linfoproliferativo pode incluir um domínio intracelular de IL21R, IL27R, IL31RA, LIFR e OSMR. Como mostrado nos experimentos dos Exemplos 17 e 18 e tabelas 7 a 17, os elementos linfoproliferativos quiméricos que incluem domínios intracelulares desses genes foram encontrados dentre os polipeptídeos quiméricos candidatos que induziram a maior magnitude de proliferação em PBMCs cultivadas na ausência de citocinas exógenas como IL-2.
[660] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular que é uma interleucina ou um receptor de interleucina e que foi uma parte de um Construto de Topo identificado nas Bibliotecas IA, LIA, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B e/ou 4.1B dps Exemplos 17 e 18 (tabelas 7 a 17). Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular que é um receptor de citocina e que foi uma parte de um Construto de Topo identificado nas Bibliotecas IA, LIA, 2B, 2.1B, 3A, 3.1 A, 3B, 3.1B, 4B e/ou 4.1B dps Exemplos 17 e 18 (tabelas 7 a 17). Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular que inclui pelo menos um motivo de IT AM e que foi uma parte de um Construto de Topo identificado nas Bibliotecas IA, LIA, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B e/ou 4.1B dos Exemplos 17 e 18 (tabelas 7 a 17).
[661] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode
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268/540 compreender um domínio intracelular de IL7R, IL12RB1, IL15RA ou IL27RA, que esteve presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitou a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[662] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio intracelular dos receptores de citocina CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, GHR, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL1RL1, IL2RA, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17RB, IL18R1, IL18RAP, IL20RB, IL22RA1, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14 ou TNFRSF18, que estiveram presentes em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[663] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo compreende um domínio intracelular de CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A ou FCGR2C, que inclui pelo menos um motivo de IT AM e esteve presente nos construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitou a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[664] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo nesse parágrafo, que foi mostrado nos exemplos 17 e 18 como sendo ativo em construtos com apenas um único domínio intracelular, pode ser o domínio intracelular de um elemento linfoproliferativo com dois ou mais domínios intracelulares ou, em modalidades ilustrativas, um único domínio intracelular, isto é, o elemento linfoproliferativo não compreende dois ou mais domínios intracelulares. Em modalidades ilustrativas, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo compreende um domínio de CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, MYD88, TNFRSF14, ou TNFRSF18, que está presente nos construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 como domínios de sinalização
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269/540 intracelular únicos (tabelas 22 e 23). Em modalidades ilustrativas, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo compreende um domínio de IL7R ou IL12RB1, que está presente nos construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 (tabelas 22 e 23). Em algumas modalidades, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo com um único domínio intracelular pode ser um receptor de citocina. Em modalidades ilustrativas, o receptor de citocina em um elemento linfoproliferativo com um único domínio intracelular compreende um domínio de CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, TNFRSF14 ou TNFRSF18, que está presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 (tabelas 22 e 23). Em algumas modalidades, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo pode incluir pelo menos um motivo de ITAM. Em modalidades ilustrativas, o domínio intracelular em um elemento linfoproliferativo que inclui pelo menos um motivo de ITAM compreende um domínio de FCGR2A, que estava presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado no Exemplo 18 (Tabela 22).
[665] Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode compreender um domínio coestimulante de CD27, CD28, 0X40 (também chamado de TNFRSF4), GITR (também chamado de TNFRSF18) ou HVEM (também chamado de TNFRSF14), que está presente em construtos que mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em uma triagem inicial e uma triagem repetida como detalhado nos Exemplos 17 e 18 (tabelas 19 a 23).
[666] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser um dos construtos M024-S190-S047, M025-S050-S197, M036-S170-S047, M012-S045-S048, M049S194-S064, M025-S190-S050, M025-S190-S05, E013-T041-S186-S051, E013-T028-S186S051, E014-T015-S186-S051, E011-T016-S186-S050, E011-T073-S186-S050 ou E013-T011S186-S211, todos os quais estimularam a proliferação de linfócitos em repouso após a transdução como mostrado no Exemplo 21 (Figuras 35 e 36). Em certas modalidades, os elementos
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270/540 linfoproliferativos compreendem um domínio extracelular de CSF3R, IL3RA, ICOS, CRLF, CSF2RA, LIFR ou CD40; um primeiro domínio intracelular de MyD88, CD40 ou MPL e/ou um segundo domínio intracelular de CD27 ou MyD88.
[667] Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser o construto E013-T041-S186-S051, que estimulou a proliferação de linfócitos em repouso após a transdução com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação que exibe UCHTlscFvFc-GPI como mostrado e analisado no Exemplo 22 (Figuras 38A e B). Em outras modalidades, o elemento linfoproliferativo é IL7-IL7RA-IL2RB, como mostrado e analisado no Exemplo 22.
[668] Como detalhado no Exemplo 17, para as Bibliotecas IA e LIA, os construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, IL1RL1, IL6R, IL31RA, TNFRSF4 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas IA e LIA (Tabela 19).
[669] Como detalhado no Exemplo 17, para as Bibliotecas 2B e 2.1B, os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, FCER1G, FCGR2C, IFNGR2, GHR, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RB, IL22RA1, TNFRSF14 ou TNFRSF9 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20).
[670] Como detalhado no Exemplo 18, para as Bibliotecas 3A e 3.1A, os construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, CSF2RA, FCGR2A, MPL, OSMR, TNFRSF4 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1A (Tabela 21).
[671] Como detalhado no Exemplo 18, para as Bibliotecas 3B e 3.1B, os construtos com os domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1RL1, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL18RAP, IL20RB, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22).
[672] Como detalhado no Exemplo 18, para as Bibliotecas 4B e 4.1B, os
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271/540 construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL2RA, IL3RA, IL2RG, IL6R, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL31RA, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, MPL, OSMR, TNFRSF4, TNFRSF9 ou TNFRSF18 mostraram enriquecimentos particularmente notáveis (isto é, suscitaram a maior magnitude de proliferação) em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23).
[673] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em qualquer um dos aspectos e modalidades revelados no presente documento como método, uso, composições e produto por aspectos de processo que inclui um elemento linfoproliferativo, em modalidades ilustrativas, as PBMCs geneticamente modificadas, linfócitos ou células T e/ou células NK geneticamente modificadas são capazes de promover a proliferação/expansão de linfócito e opcionalmente sobrevivência ex vivo ou in vitro em cultura na ausência de exposição ex vivo das células para citocinas como IL-15, IL-7 e, em modalidades ilustrativas, IL-2 e o alvo para uma ASTR de uma CAR expressa pelas células durante a cultura por 6, 7, 14, 21 ou 35 dias, ou mais. Em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento incluindo uma CAR e um elemento linfoproliferativo, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas podem ser capazes de enxerto in vivo em camundongos sem exposição ex vivo a um alvo reconhecido pela CAR.
[674] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidas no presente documento que incluem uma partícula (ou partículas) de retrovirus recombinante incompetente em replicação, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem compreender, em sua superfície, um elemento de ativação. Em modalidades ilustrativas, o elemento de ativação ativa uma célula T através do complexo associado ao receptor de célula T. Em alguns casos, o elemento de ativação pode ativar uma célula T sozinha. Em outros casos, um elemento de ativação requer ativação através do complexo de receptor TCR para ativar adicionalmente as células. Consequentemente, em algumas modalidades o elemento de ativação compreende:
A. um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3; e/ou
B. um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28.
[675] Ademais, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 é um polipeptídeo capaz de se ligar a CD3, que pode ser fundido a uma sequência de ligação de
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272/540 âncora de GPI heteróloga e o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 pode ser um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28, que é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 é CD80, CD86, ou um fragmento funcional do mesmo que é capaz de induzir ativação de Akt mediada por CD28, como o domínio extracelular de CD80.
[676] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidas no presente documento que são ou incluem uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, o elemento de ativação pode ser um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3, como um scFv anti-CD3 ou um scFvFc anti-CD3. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidas no presente documento que incluem uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação e um anti-CD3, o anti-CD3 pode ser um scFvFc antiCD3 fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que incluem uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 pode ser um scFv anti-CD3 ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD 14, e o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 pode ser CD80 ou o domínio extracelular do mesmo, ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD16B. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidas no presente documento que incluem uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem compreender em sua superfície, um scFv anti-CD3 ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD14, CD80 ou o domínio extracelular do mesmo, ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD16B, e um polipeptídeo de fusão de IL-7, ou um fragmento ativo do mesmo, e DAF compreendendo uma sequência de ligação de âncora de GPI. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que incluem uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, o IL-7, ou um fragmento ativo do mesmo e fusão de DAF, o scFV anti-CD3, e o CD80 ou domínio extracelular do mesmo, cada um compreende uma sequência de sinal de DAF.
[677] Exceto se declarado de outro modo ou já declarado em um aspecto mais
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273/540 amplo, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidas no presente documento que são ou incluem uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem compreender, em sua superfície, uma citocina ligada à membrana. A citocina ligada à membrana pode ser IL-7, IL-15 ou um fragmento ativo da mesma. Em outras modalidades, a citocina ligada à membrana é um polipeptídeo de fusão de IL-7, ou um fragmento ativo do mesmo, e DAF. Por exemplo, o polipeptídeo de fusão pode compreender a sequência de sinal de DAF (nucleotídeos 1 a 34 de SEQ ID NO:286), IL-7 sem sua sequência de sinal (nucleotídeos 35 a 186 de SEQ ID NO:286) e um fragmento de DAF que inclui sua sequência de ligação de âncora de GPI (nucleotídeos 187 a 532 de SEQ ID NO:286).
[678] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, as modalidades ilustrativas de qualquer um dentre os aspectos de método e composição fornecidos no presente documento, o elemento de pseudotipagem pode compreender uma ou mais proteínas de envelope heterólogas. Em outros exemplos, o elemento de pseudotipagem pode incluir um ou mais polipeptídeos virais reconhecidos por células T. O um ou mais elementos de pseudotipagem podem compreender um polipeptídeo F do Vírus do Sarampo, um polipeptídeo H do Vírus do Sarampo e/ou um fragmento dos mesmos. O um ou mais elementos de pseudotipagem podem ser variantes de deleção do domínio citoplasmático de um polipeptídeo F do vírus do sarampo e/ou um polipeptídeo H do vírus do sarampo.
[679] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui o elemento de controle é o elemento de controle que pode regular o elemento linfoproliferativo, em que o elemento linfoproliferativo é inativo ou menos ativo na promoção de proliferação das células T e/ou células NK na ausência do composto, e em que o composto é uma chaperona molecular que se liga ao elemento linfoproliferativo e induz a atividade do elemento linfoproliferativo.
[680] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui o elemento de controle, o elemento de controle pode ser um polinucleotídeo compreendendo um riboswitch. O riboswitch pode ser capaz de se ligar a um análogo de
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274/540 nucleosídeo e o composto que se liga ao elemento de controle é o análogo de nucleosídeo. O análogo de nucleosídeo pode ser um agente antiviral. O agente antiviral pode ser aciclovir ou penciclovir.
[681] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui um polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, que inclui uma ASTR, a ASTR de um ou ambos os polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados podem se ligar a um antígeno associado ao tumor. Em algumas modalidades ilustrativas, a região de alvejamento específico para antígeno do segundo polipeptídeo geneticamente modificado é restrita ao microambiente região de alvejamento específico para antígeno.
[682] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui uma partícula (ou partículas) de retrovirus recombinante incompetente em replicação, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação podem codificar um domínio de reconhecimento para um agente biológico aprovado para anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento é expresso na mesma transcrição que o receptor de antígeno quimérico e em que o domínio de reconhecimento é separado do receptor de antígeno quimérico por um sinal de salto e/ou divagem ribossomal. O sinal de salto e/ou divagem ribossomal pode ser 2A-1. O domínio de reconhecimento pode incluir um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo que reconhece EGFR, ou um epítopo do mesmo. O domínio de reconhecimento pode ser um mutante de EGFR que é reconhecido por um anticorpo de EGFR e expresso na superfície de células T e/ou células NK transduzidas como outro mecanismo de controle fornecido no presente documento. Em modalidades relacionadas, o domínio de reconhecimento pode incluir um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo que reconhece EGFR, ou um epítopo do mesmo.
[683] Exceto se incompatível ou já declarado em um aspecto, qualquer um dentre o método, use, produto por processo, o método pode incluir adicionalmente coletar sangue de um sujeito. O método pode incluir adicionalmente, após o contato das células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo, reintroduzir as células T e/ou células NK
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275/540 geneticamente modificadas no sujeito. Em certas modalidades, as células T em repouso e/ou células NK em repouso que são colocadas em contato são do sangue do sujeito, e em que a expansão das células T e/ou células NK geneticamente modificadas ocorre in vivo dentro do sujeito. Em certas modalidades, as etapas entre a coleta de sangue e a reintrodução das células T e/ou células NK geneticamente modificadas são realizadas em não mais de 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas ou 4 horas. Outros tempos são fornecidos no presente documento. Em certas modalidades, o sujeito não é exposto a um agente de linfodepleção em 7 dias da realização do contato, durante o contato e/ou em 7 dias após as células T e/ou células NK geneticamente modificadas serem reintroduzidas no sujeito.
[684] E fornecido no presente documento, em um aspecto, um método para transduzir e/ou modificar geneticamente os linfócitos (por exemplo, célula T e/ou células NK), em modalidades ilustrativas, linfócitos em repouso (células T e/ou células NK em repouso), de um sujeito, que compreende colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso de um sujeito ex vivo, em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um anticorpo de scFvFc antiCD3 ligado à membrana em sua superfície, que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK em repouso e facilitar a fusão de membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação ao mesmo, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas.
[685] E fornecido no presente documento, em um aspecto, um método para transduzir e/ou modificar geneticamente as células T em repouso e/ou células NK em repouso de sangue isolado, compreendendo: coletar sangue de um sujeito; isolar as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) compreendendo células T em repouso e/ou células NK em repouso; e colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo por um tempo eficaz, em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um anticorpo de scFvFc anti-CD3 ligado à membrana em sua superfície, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas,
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276/540 transduzindo, assim, células T e/ou células NK em repouso.
[686] Nos aspectos no presente documento, para transduzir e/ou modificar geneticamente linfócitos T (por exemplo, célula T e/ou células NK) que incluem um anticorpo de scFvFc anti-CD3 ligado à membrana, o elemento de pseudotipagem em certas modalidades é a proteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Em algumas modalidades, as partículas retrovirais incompetentes em replicação compreendem adicionalmente um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28, que pode incluir, por exemplo, um domínio extracelular de CD80, CD86 ou fragmentos funcionais do mesmo que retém a capacidade de se liar a CD28. Em algumas modalidades, em que o anticorpo de scFvFc anti-CD3 é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas modalidades, o anticorpo de scFvFc anti-CD3 não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[687] Nos aspectos no presente documento para transduzir e/ou modificar geneticamente linfócitos T (por exemplo célula T e/ou células NK) que incluem um anticorpo de scFvFc anti-CD3 ligado à membrana, a partícula retroviral recombinante pode incluir adicionalmente um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Em algumas modalidades, o anticorpo de scFvFc anti-CD3 não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[688] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para transduzir e/ou modificar geneticamente linfócitos em repouso de um sujeito, compreendendo colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso de um sujeito ex vivo, em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 em sua superfície, mas não um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a e ativar CD28 em sua superfície, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em
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277/540 repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas.
[689] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para transduzir e/ou modificar geneticamente células T em repouso e/ou células NK em repouso de sangue isolado, compreendendo: coletar sangue de um sujeito; isolar células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) compreendendo células T em repouso e/ou células NK em repouso; e colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo por um tempo eficaz, em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 em sua superfície, mas não um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a e ativar CD28 em sua superfície, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas, transduzindo, assim, células T e/ou células NK em repouso.
[690] Nos aspectos no presente documento para transduzir e/ou modificar geneticamente linfócitos em repouso T que incluem um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 em sua superfície, mas não um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a e ativar CD28 em sua superfície, o elemento de pseudotipagem pode ser, por exemplo, a proteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Em modalidades ilustrativas, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 é um anticorpo de scFvFc anti-CD3, que, em algumas modalidades, é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas modalidades deste aspecto, o contato é realizado por pelo menos 2 horas, ou entre 2 horas e 24 horas ou entre 2 horas e 6 horas. Em algumas modalidades, um marcador detectável é codificado pelo genoma da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação e detectado nas células T e/ou células NK após a transdução. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Em algumas modalidades, um marcador detectável é codificado pelo genoma das partículas de retrovirus recombinantes incompetentes em replicação e detectado nas células T e/ou células NK após a transdução.
[691] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, compreendendo: um ou mais elementos de
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278/540 pseudotipagem; um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico; e um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um elemento de ativação em sua superfície, em que o elemento de ativação é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, e em que o elemento de ativação é um anticorpo de scFvFc anti-CD3.
[692] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo: um ou mais elementos de pseudotipagem capazes de ligação a uma célula T e/ou uma célula NK e facilitando a fusão de membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação aos mesmos;
[693] um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico; e um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um elemento de ativação em sua superfície, em que o elemento de ativação é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, e em que os elementos de ativação são um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 em sua superfície, mas não um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a e ativar CD28 em sua superfície.
[694] Em algumas modalidades dos aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação no presente documento, a partícula retroviral recombinante compreende adicionalmente um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo nas células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades nesses aspectos, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Em algumas modalidades desses aspectos, o anticorpo de scFvFc anti-CD3 não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
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279/540 [695] Em qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento, como aqueles incluindo um polipeptídeo ou um ácido nucleico que codifica o mesmo, que inclui um elemento de ativação, por exemplo, presente na superfície de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, o elemento de ativação pode incluir adicionalmente, por exemplo, como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 ou, em modalidades ilustrativas, CD3, um motivo de dimerização que pode ser ativo na ausência de um agente de dimerização. Em algumas modalidades, o elemento de ativação pode ser um anticorpo de cadeia única anti-CD3 e o motivo de dimerização pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: um polipeptídeo de zíper de leucina, CD69, CD71, CD72, CD96, Cdl05, Cdlól, Cdl62, Cd249, CD271 e Cd324, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos que retêm a capacidade para dimerização.
[696] Em qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento, como aqueles incluindo um polipeptídeo ou um ácido nucleico que codifica o mesmo, que inclui um elemento de ativação, por exemplo, presente na superfície de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, o elemento de ativação pode incluir adicionalmente, por exemplo, como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 ou, em modalidades ilustrativas, CD3, um motivo de dimerização que pode ser ativo na presença de um agente de dimerização. Em algumas modalidades, o elemento de ativação pode ser um anticorpo de cadeia única anti-CD3 e o motivo de dimerização pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: FKBP e rapamicina ou análogos dos mesmos, GyrB e cumermicina ou análogos dos mesmos, DHFR e metotrexato ou análogos dos mesmos ou DmrB e AP20187 ou análogos dos mesmos, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos das proteínas de dimerização mencionadas que retêm a capacidade para dimerizar.
[697] Em qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento, como aqueles incluindo um polipeptídeo ou um ácido nucleico que codifica o mesmo, que inclui um elemento de ativação, por exemplo, presente na superfície de partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, o elemento de ativação pode incluir adicionalmente, uma porção química de antiCD3-scFvFc-GPI (UCHT1) e opcionalmente um VSV-G.
[698] Em uma modalidade do aspecto acima, o dito polinucleotídeo compreende adicionalmente uma ou mais de uma sequência tipo Kozak, um elemento de WPRE
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280/540 e um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla, em que um ou mais dos códons de interrupção do códon de interrupção dupla ou do códon de interrupção tripla definem uma terminação de uma leitura de pelo menos uma dentre a uma ou mais unidades transcricionais. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência tipo Kozak selecionada a partir de CCACCAT/UG(G), CCGCCAT/UG(G), GCCGCCGCCAT/UG(G) ou GCCGCCACCAT/U(G). Em certas modalidades, tanto os nucleotídeos -3 e +4 em relação a um códon inicial da primeira sequência de ácidos nucleicos compreendem um G. Em outra modalidade, que pode ser combinada com a modalidade precedente que compreende uma sequência tipo Kozak e/ou a seguinte modalidade que compreende códon de interrupção tripla, o polinucleotídeo inclui um elemento de WPRE. Em algumas modalidades, o elemento de WPRE é localizado 3 ’ de um códon de interrupção da uma ou mais unidades transcricionais e 5 ’ a um 3 ’ LTR do polinucleotídeo. Em outra modalidade, que pode ser combinada com uma ou ambas as modalidades anteriores (isto é, uma modalidade em que o polinucleotídeo compreende uma sequência tipo Kozak e/ou uma modalidade em que o polinucleotídeo compreendeu um WPRE), a uma ou mais unidades transcricionais terminam com um ou mais códons de interrupção de um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla.
[699] Em certas modalidades de qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que incluem uma ASTR, a ASTR pode ser uma ASTR antietiqueta. Tais métodos podem incluir adicionalmente, por exemplo, um anticorpo conjugado por etiqueta que se liga a uma molécula-alvo, como uma proteína-alvo em uma célula-alvo.
[700] Em qualquer uma das modalidades e aspectos fornecidos no presente documento, os quais incluem uma célula B, célula T, ou célula NK, a célula pode ser uma célula alogeneica, ou pode ser diferente de uma célula alogeneica.
[701] Em qualquer um dos aspectos e modalidades revelados no presente documento, a introdução de DNA em PBMCs, células B, células T e/ou células NK e opcionalmente a incorporação do DNA no genoma de célula hospedeira, pode ser realizado com o uso de métodos que não utilizam partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação. Por exemplo, outros vetores virais podem ser utilizados, como aqueles derivados de adenovirus, vírus adenoassociado ou vírus-1 do herpes simplex, como exemplos não limitantes. Em outras modalidades, esses aspectos e modalidades podem incluir transfectar e/ou transduzir
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281/540 células-alvo com vetores não virais. Em qualquer uma dessas modalidades reveladas no presente documento que utiliza vetores não virais para transfectar as células-alvo, os vetores não virais, incluindo DNA puro, pode ser introduzido nas células-alvo como, por exemplo, PBMCs, células B, células T e/ou células NK com o uso de métodos que incluem eletroporação, nucleofecção, formulações lipossômicas, lipídios, dendrímeros, polímeros catiônicos como poli(etilenimina) (PEI) e poli(l-lisina) (PLL), nanopartículas, peptídeos de penetração celular, microinjeção e/ou vetores não integrantes. Em algumas modalidades de métodos e composições fornecidos no presente documento, o DNA pode ser integrado no genoma com o uso de sistemas de carreador à base de transposons por cotransfecção, conucleofecção ou coeletroporação de DNA-alvo como plasmídeo contendo os fragmentos de ITR de transposon em extremidades 5’ e 3’ do gene de interesse e sistema de carreador de transposase. A transposase ou outra enzima, por exemplo, CRISPR ou TALEN, usada nesses métodos pode ser cotransfectada com plasmídeo-alvo como DNA, mRNA ou proteína.
[702] Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que cada uma compreende:
A. um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação ao mesmo, em que o dito elemento de pseudotipagem compreende variantes de deleção do domínio citoplasmático de um polipeptídeo F do vírus do sarampo e/ou um polipeptídeo H do vírus do sarampo;
B. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo; em que a expressão do receptor de IL-7 mutante é regulada por um ribos witch que se liga a um fármaco antiviral análogo de núcleos ideo; e
C. um polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 e um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28,
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282/540 em que os ditos polipeptídeos são expressados na superfície de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação; são capazes de se ligar a uma célula T e/ou célula NK; e não são codificados por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação. Em modalidades ilustrativas desse aspecto, a ligação do fármaco antiviral análogo de nucleosídeo ao riboswitch aumenta a expressão do receptor de IL-7 mutante.
[703] Em um aspecto, é fornecido no presente um método para modificar geneticamente e expandir linfócitos de um sujeito que compreende:
A. colocar células T e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo sem exigir estimulação ex vivo anterior em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação que compreendem:
i. um elemento de pseudotipagem em sua superfície que tem a capacidade para se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas; e ii. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de maneira funcional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado regulado por um elemento de controle, em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende pelo menos um elemento linfoproliferativo, em que o dito contato facilita a transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas;
B. introduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito; e
C. expor as células T e/ou células NK geneticamente modificadas in vivo a um composto que se liga ao elemento de controle para afetar a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e promover e/ou potenciar a expansão, o enxerto e/ou persistência dos linfócitos in vivo, modificando geneticamente e expandindo, assim, os linfócitos do sujeito. Nas modalidades ilustrativas, a transdução é executada sem estimulação ex vivo.
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283/540 [704] No aspecto acima e qualquer um dos aspectos do método para modificar geneticamente e expandir os linfócitos ou para realizar a terapia celular no presente documento, se não for mencionado em ou incompatível com o aspecto, em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma unidade transcricional que codifica um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um primeiro receptor de antígeno quimérico compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[705] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para realizar a terapia celular adotiva em um sujeito compreendendo:
A. coletai- sangue do sujeito;
B. colocar as células T e/ou células NK em repouso do sangue do sujeito ex vivo em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem
i. um elemento de pseudotipagem em sua superfície que tem a capacidade para se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas; e ii. um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo pelo menos um elemento linfoproliferativo cuja expressão é regulado por um elemento de controle, e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um receptor de antígeno quimérico compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o dito contato resulta em pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso se tornarem geneticamente modificadas; e
C. reintroduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito, em que a expansão, o enxerto e/ou a persistência das células T e/ou células NK geneticamente modificadas ocorre in vivo no sujeito e, em que o método entre a coleta de sangue e a reintrodução das células T e/ou células NK geneticamente modificadas é realizado em
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284/540 não mais de 24 horas, realizando, assim, a terapia celular adotiva no sujeito.
[706] E fornecido em outro aspecto no presente documento um método para realizar a terapia celular adotiva em um sujeito compreendendo:
A. coletai- sangue de um sujeito;
B. isolar as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) compreendendo células T em repouso e/ou células NK em repouso;
C. colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK em repouso e facilitar a fusão de membrana das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação às mesmas, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas; e
D. reintroduzir as células geneticamente modificadas no sujeito dentro de 24 horas da coleta de sangue do sujeito, realizando, assim, terapia celular adotiva no sujeito.
[707] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar a terapia celular adotiva no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, o método pode compreender adicionalmente expor as células T e/ou células NK geneticamente modificadas in vivo a um composto que se liga ao elemento de controle para afetar a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e opcionalmente o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, e para promover a expansão, o enxerto e/ou a persistência dos linfócitos in vivo.
[708] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir os linfócitos ou para realizar a terapia celular adotiva no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são submetidas a 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou menos divisões de célula ex vivo antes de serem introduzidas ou reintroduzidas no sujeito.
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285/540 [709] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar a terapia celular no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, a expansão, o enxerto e/ou a persistência de células T e/ou células NK geneticamente modificadas in vivo depende da presença ou da ausência do composto que se liga ao elemento de controle, e em modalidades ilustrativas, é dependente da presença do composto que se liga ao elemento de controle.
[710] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular adotiva no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, o sujeito não é exposto a um agente de linfodepleção em 7, 14 ou 21 dias da realização do contato, durante o contato e/ou em 7, 14 ou 21 dias após as células T e/ou células NK modificadas serem introduzida no sujeito. Em outras modalidades, o sujeito não é exposto a um agente de linfodepleção durante o contato.
[711] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, as células T em repouso e/ou células NK em repouso estão em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação por entre 15 minutos e 12 horas.
[712] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular adotiva no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, o método inclui adicionalmente a etapa de separar as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação das células T e/ou células NK após o contato. Em métodos que incluem uma introdução ou reintrodução, porém, a separação é realizada antes da introdução. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, a dita etapa de exposição compreende administrar uma dose do composto ao sujeito antes ou durante o contato e/ou após as células T e/ou células NK geneticamente modificadas terem sido introduzidas no sujeito.
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286/540 [713] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular adotiva no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, o método compreende coletar sangue compreendendo as células T e/ou as células NK do sujeito antes de colocar as células T e/ou células NK ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, e em que a introdução é reintrodução. Por exemplo, entre 20 e 250 ml de sangue são retirados do sujeito.
[714] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, no mais de 8, 12, 24 ou 48 horas se passam entre o momento em que o sangue é coletado do sujeito e o momento em que as células T e/ou células NK modificadas são reintroduzidas no sujeito.
[715] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, entre 4 ou 8 horas na extremidade baixa e 12, 24, 36 ou 48 horas na extremidade alta da faixa se passam entre o momento que o sangue é coletado do sujeito e o momento em que as células T e/ou células NK modificadas são reintroduzidas no sujeito.
[716] Em aspectos e modalidades fornecidos no presente documento que incluem administrar células T e/ou células NK geneticamente modificadas a um sujeito, especificamente onde o sujeito tem, ou suspeita-se que tenha câncer, os métodos podem incluir adicionalmente entregar uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação imune ao sujeito.
[717] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos aspectos de métodos para modificar geneticamente e expandir linfócitos ou para realizar terapia celular adotiva no presente documento, ou métodos similares, se não for explicitamente mencionado no aspecto mais amplo, todas as etapas após o sangue ser coletado e antes que o sangue seja reintroduzido, são realizadas em um sistema fechado em que uma pessoa monitora o sistema fechado ao longo do processamento. Em outra modalidade, após o sangue ser coletado e antes que o sangue seja
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287/540 reintroduzido, são realizadas em um sistema fechado que permanece no mesmo ambiente que o sujeito.
[718] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que incluem uma ou mais unidades transcricionais ou um ou mais polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados, se não for mencionado no aspecto mais amplo, uma das unidades transcricionais ou um dos polipeptídeos de sinalização geneticamente modificados pode codificar ou compreender ou compreender adicionalmente uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR) e um domínio transmembranar que conecta a ASTR ao elemento linfoproliferativo. A ASTR desse polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é capaz de se ligar a um primeiro antígeno de tumor e, onde estiver presente, a ASTR do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é capaz de se ligar a um segundo antígeno de tumor. Em modalidades ilustrativas, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende adicionalmente um domínio coestimulante. Ademais, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende adicionalmente uma haste. Ademais, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende adicionalmente um domínio de ativação intracelular. O domínio de ativação intracelular no primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou no segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado pode ser derivado de CD3 zeta. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui um elemento linfoproliferativo, o elemento linfoproliferativo pode compreender MPL ou pode ser MPL, ou uma variante e/ou fragmento do mesmo, incluindo uma variante e/ou fragmento que inclui pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% do domínio intracelular de MPL, com ou sem um domínio de transmembrana e/ou extracelular de MPL, e/ou tem pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio intracelular de MPL, com ou sem um domínio de transmembrana e/ou extracelular de MPL, em que a variante e/ou fragmento retém a capacidade para promover a proliferação celular de PBMCs, e em algumas modalidades, células T.
[719] Em qualquer um dos métodos ou composições fornecidos no presente
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288/540 documento que inclui um elemento linfoproliferativo, o elemento linfoproliferativo pode incluir uma molécula de RNA inibidora, como, por exemplo, um miRNA ou shRNA, que estimula a trajetória de STAT5 ou inibe a trajetória de SOCS. Por exemplo, uma molécula de RNA inibidora pode se ligar a um ácido nucleico que codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: ABCG1, SOCS, TGFbR2, SMAD2, cCBL e PD1. Em modalidades ilustrativas para qualquer uma das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação ou células transduzidas fornecidas no presente documento ou métodos incluindo as mesmas, tais partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação ou células transduzidas pode codificar duas ou mais moléculas inibidoras de RNA, como, por exemplo, um miRNA ou shRNA, dentro de um íntron, em algumas modalidades, 1, 2, 3 ou 4 moléculas inibidoras de RNA que se ligam a ácidos nucleicos que codificam um ou mais dos seguintes genes expressados em célula T endógena-alvo: PD-1; CTLA4; TCR alfa; TCR beta; CD3 zeta; SOCS; SMAD2; miR-155; IFN gama; cCBL; TRAIL2; PP2A; ou ABCG1. Por exemplo, em uma modalidade, uma combinação de miRNAs alvejando qualquer uma das seguintes pode ser incluída em um genoma de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação ou célula transduzida: TCR alfa, CD3 zeta, IFN gama e PD-1; e em outra modalidade SOCS 1, IFN gama, TCR alfa e CD3 zeta.
[720] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, células de mamífero e/ou células de empacotamento, pode compreender um polipeptídeo Vpu. O polipeptídeo Vpu pode ser, por exemplo, um polipeptídeo de fusão e, em alguns exemplos, especificamente em células de empacotamento, um polipeptídeo Vpu ligado à membrana. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, células de mamífero e/ou células de empacotamento, pode compreender tanto um polipeptídeo Vpu quanto um polipeptídeo Vpx.
[721] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, células de mamífero e/ou células de empacotamento, pode compreender um polipeptídeo Vpx. O polipeptídeo Vpx pode ser, por exemplo, um polipeptídeo de fusão e, em alguns exemplos, especificamente em células de empacotamento, um polipeptídeo Vpx ligado à
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289/540 membrana.
[722] Em qualquer um dos métodos ou composições fornecidos no presente documento, o um ou mais elementos de pseudotipagem podem incluir uma proteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), uma proteína de envelope de vírus endógeno felino (RD 114), uma proteína de envelope anfotrópico oncorretroviral ou uma proteína de envelope ecotrópica oncorretroviral ou fragmentos funcionais dos mesmos.
[723] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma célula T ou célula NK geneticamente modificada, em que a célula T ou célula NK foi geneticamente modificada para expressar um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um elemento linfoproliferativo e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo uma CAR que inclui uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[724] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma célula T ou célula NK geneticamente modificada compreendendo um elemento de pseudotipagem em uma superfície da célula T ou célula NK e um elemento de ativação na superfície da célula T ou célula NK, em que a célula T ou célula NK foi geneticamente modificada para expressar um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um elemento linfoproliferativo e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico que inclui uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[725] E fornecida, no presente documento, em outro aspecto, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada compreendendo:
A. um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo pelo menos um elemento linfoproliferativo; e
B. um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico que compreende uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[726] Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK geneticamente
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290/540 modificadas são capazes de sobrevivência em cultura ex vivo na ausência de IL-2. Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas compreendem um receptor de citocina quimérico. Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas não compreendem um receptor de citocina quimérico.
[727] Em qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que incluem uma célula de empacotamento de mamífero, incluindo um aspecto de sistema de empacotamento de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, ou um método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, por exemplo, o genoma de RNA empacotável é codificado por um polinucleotídeo ligado de modo operacional a um promotor, em que o dito promotor é constitutivamente ativo ou induzível pelo primeiro transativador ou o segundo transativador. O genoma de RNA empacotável pode ser codificado por um polinucleotídeo ligado de modo operacional a um promotor, em que o dito promotor é induzível pelo segundo transativador. Um promotor usado no presente documento para conduzir uma expressão do primeiro e/ou do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, é tipicamente ativo em células-alvo, por exemplo, linfócitos, PBLs, células T e/ou células NK, mas em modalidades ilustrativas, não é ativo na linhagem celular de empacotamento. O segundo transativador pode regular a expressão de um elemento de ativação capaz de se ligar a e ativar a célula-alvo. Em qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que inclui uma célula de empacotamento de mamífero, incluindo um aspecto de sistema de empacotamento de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, ou um método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, por exemplo, o genoma de RNA empacotável em algumas modalidades, expressão do genoma de RNA empacotável pode ser regulada pelo segundo transativador.
[728] Ademais, o genoma de RNA empacotável pode compreender de 5' a 3':
1) uma repetição terminal longa 5' ou fragmento ativo da mesma.
2) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral;
3) uma sequência de ácidos nucleicos codifica um primeiro polipeptídeo-alvo e/ou uma sequência de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA;
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4) um promotor que é ativo na célula-alvo; e
5) uma repetição terminal longa 3' ou fragmento ativo da mesma.
[729] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codificam o primeiro polipeptídeo-alvo está em orientação reversa a um RNA que codifica componentes retrovirais para empacotamento e montagem e a 5 ’ LTR.
[730] Em qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que inclui um célula de empacotamento de mamífero, incluindo um aspecto de sistema de empacotamento de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, ou um método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, por exemplo, o primeiro polipeptídeo-alvo compreende um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende pelo menos um elemento linfoproliferativo. O genoma de RNA empacotável pode compreender adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um segundo polipeptídeo-alvo. O segundo polipeptídeo-alvo pode compreender um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado incluindo um receptor de antígeno quimérico compreendendo:
1) uma primeira região de alvejamento específico para antígeno;
2) um primeiro domínio transmembranar; e
3) um primeiro domínio de ativação intracelular.
[731] Em qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que incluem uma célula de empacotamento de mamífero, incluindo um aspecto de sistema de empacotamento de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, ou um método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, por exemplo, a célula de mamífero, por exemplo, a célula de empacotamento pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo Vpu, por exemplo, na segunda ou uma terceira unidade transcricional opcional, ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de modo operacional ao primeiro promotor induzível. Em qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que incluem uma célula de empacotamento de mamífero, incluindo um aspecto de sistema de empacotamento de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, ou um método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente
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292/540 em replicação, por exemplo, a célula de mamífero, por exemplo, a célula de empacotamento pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codificam tanto um polipeptídeo Vpx quanto um polipeptídeo Vpu, por exemplo, na segunda ou uma terceira unidade transcricional opcional, ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de modo operacional ao primeiro promotor induzível. A célula de mamífero, que pode ser uma célula de empacotamento, pode ser uma célula 293.
[732] Em qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que incluem uma célula de empacotamento de mamífero, incluindo um aspecto de sistema de empacotamento de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, ou um método para produzir uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, por exemplo, a célula de mamífero, por exemplo, a célula de empacotamento pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codificam Vpx, por exemplo, na segunda ou uma terceira unidade transcricional opcional, ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de modo operacional ao primeiro promotor induzível. A célula de mamífero, que pode ser a célula de empacotamento, pode ser uma célula 293.
[733] Em qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que incluem uma célula de empacotamento de mamífero, incluindo um aspecto de sistema de empacotamento de partícula retroviral recombinante incompetente em replicação ou um método para produzir uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação, um primeiro ligante pode ser rapamicina e um segundo ligante pode ser tetraciclina ou doxorrubicina e o primeiro ligante pode ser tetraciclina ou doxorrubicina e o segundo ligante pode ser rapamicina.
[734] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma célula que foi transduzida com qualquer uma das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento. A célula pode ser, por exemplo, um linfócito, como uma célula T ou célula NK. A célula, nas modalidades ilustrativas, é uma célula humana.
[735] Em um aspecto fornecido no presente documento é um método para expandir células T e/ou células NK modificadas em um sujeito, sendo que o dito método compreende:
A. colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso isoladas obtidas a partir do dito sujeito em contato com a partícula retroviral recombinante incompetente em
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293/540 replicação de qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento;
B. introduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito; e
C. fornecer uma quantidade eficaz de aciclovir, um pró-fármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir ao dito sujeito, em que as ditas células T e/ou células NK modificadas proliferam no dito sujeito mediante a administração de aciclovir, um pró-fármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir, expandindo, assim, as células T e/ou células NK modificadas no sujeito.
[736] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para interromper a expansão, enxerto e/ou persistência de células T e/ou células NK modificadas em um sujeito, sendo que o dito método compreende:
A. colocar a célula T quiescente isolada e/ou células NK em repouso obtidas a partir do dito sujeito em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação de qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento;
B. introduzir a célula T e/ou células NK modificadas no sujeito;
C. administrar uma quantidade eficaz de aciclovir, um pró-fármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir ao dito sujeito para expandir a célula T e/ou células NK modificada no sujeito, em que a dita célula T e/ou células NK modificadas proliferam no dito sujeito mediante a administração de aciclovir, um prófármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir, expandindo, assim, os PBLs modificados no sujeito; e
D. interromper a administração de aciclovir, um pró-fármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir, em que a dita célula T e/ou células NK modificadas interrompem a proliferação no dito sujeito mediante a interrupção da administração de aciclovir, um pró-fármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir, controlando, assim, a expansão, expansão e/ou persistência da célula T e/ou células NK modificadas no sujeito.
[737] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para tratar câncer em um sujeito, sendo que o método compreende:
A. colocar as células T quiescente isolada e/ou células NK em repouso obtidas a partir do dito sujeito em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em
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294/540 replicação de acordo com qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento;
B. introduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito; e
C. administrar uma quantidade eficaz de aciclovir, um pró-fármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir ao dito sujeito para expandir a célula T e/ou células NK modificadas no sujeito, em que a dita célula T e/ou células NK modificadas proliferam no dito sujeito mediante a administração de aciclovir, um prófármaco de aciclovir, penciclovir ou um pró-fármaco de penciclovir, e em que o receptor de antígeno quimérico na dita célula T e/ou células NK modificadas se liga a células cancerosas no dito sujeito, tratando, assim, o câncer no sujeito.
[738] Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento uma célula T e/ou célula NK transduzidas que compreendem um polinucleotídeo recombinante que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de maneira funcional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado regulado por um elemento de controle in vivo, em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende um mutante de receptor de IL-7 constitutivamente ativo, e em que o elemento de controle in vivo tem a capacidade para se ligar e/ou é projetado e/ou configurado para se ligar a um composto in vivo.
[739] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um sistema de empacotamento retroviral que compreende:
uma célula de mamífero que compreende:
A. um primeiro transativador expresso a partir de um promotor constitutivo e com a capacidade para se ligar a um primeiro ligante e a um primeiro promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira operacional ao mesmo na presença versus ausência do primeiro ligante;
B. um segundo transativador com a capacidade para se ligar a um segundo ligante e a um segundo promotor induzível e afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira operacional ao mesmo na presença versus ausência do segundo ligante; e
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295/540
C. um genoma de RNA empacotável para uma partícula retroviral,
Em que o primeiro transativador regula a expressão do segundo transativador e uma proteína REV retroviral, em que o segundo transativador regula a expressão de um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um ou mais elementos de pseudotipagem com a capacidade para se ligar a uma célula-alvo e facilitar a fusão de membrana à mesma, e em que as proteínas retrovirais são derivadas de um retrovirus. As modalidades desse aspecto podem incluir qualquer uma das modalidades fornecidas no presente documento para os elementos citados em outros aspectos.
[740] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para produzir uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que compreende:
A. cultivar uma população de células de empacotamento para acumular um primeiro transativador, em que as células de empacotamento compreendem o primeiro transativador expresso a partir de um primeiro promotor constitutivo, em que o primeiro transativador tem a capacidade para se ligar a um primeiro ligante e a um primeiro promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira operacional ao mesmo na presença versus ausência do primeiro ligante, e em que a expressão de um segundo transativador e uma proteína REV retroviral é regulada pelo primeiro transativador;
B. incubar a população de células de empacotamento que compreende o primeiro transativador acumulado na presença do primeiro ligante para acumular o segundo transativador e a proteína REV retroviral, em que o segundo transativador tem a capacidade para se ligar a um segundo ligante e a um segundo promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira operacional ao mesmo na presença versus ausência do segundo ligante; e
C. incubar a população de células de empacotamento que compreende o segundo transativador e a proteína REV retroviral acumulados na presença do segundo ligante induzindo, assim, a expressão de um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um ou mais elementos de pseudotipagem, produzindo, assim, a partícula retroviral recombinante incompetente em replicação, em que um genoma de RNA empacotável é codificado por um polinucleotídeo ligado de
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296/540 maneira funcional a um terceiro promotor, em que o dito terceiro promotor é constitutivamente ativo ou induzível pelo primeiro transativador ou pelo segundo transativador, e em que o um ou mais elementos de pseudotipagem têm a capacidade para se ligarem a uma célula-alvo e/ou facilitarem a fusão de membrana da partícula retroviral recombinante incompetente em replicação à mesma.
[741] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir partículas de retrovirus recombinantes incompetentes em replicação fornecidas no presente documento, a célula de mamífero compreende adicionalmente um elemento de ativação com a capacidade para se ligar e ativar uma célula-alvo e o primeiro transativador regula a expressão do elemento de ativação. O elemento de ativação está na superfície da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação e em que o elemento de ativação pode incluir: um polipeptídeo ligado à membrana com a capacidade para se ligar a CD3; e/ou um polipeptídeo ligado à membrana com a capacidade para se ligar a CD28. O polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 é um polipeptídeo capaz de se ligar a CD3, que é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga e o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 é um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28, que é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. O polipeptídeo ligado à membrana com a capacidade para se ligar a CD28, em algumas modalidades, compreende CD80, CD 8 6 ou um fragmento funcional dos mesmos que tem a capacidade para induzir ativação mediada por CD28 de Akt, tal como o domínio extracelular de CD80. Em outras modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana com a capacidade para se ligar a CD3 é um scFv anti-CD3 ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD 14, e em que o polipeptídeo ligado à membrana com a capacidade para se ligar a CD28 é CD80, ou um fragmento extracelular do mesmo, ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD16B.
[742] Em algumas modalidades dos aspectos do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula retroviral recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, a célula de mamífero compreende adicionalmente uma citocina ligada à membrana e o primeiro transativador regula a expressão da citocina ligada à membrana. A citocina ligada à membrana pode ser, por exemplo, IL-7, IL-15 ou um fragmento ativo da mesma. A citocina ligada à membrana nas modalidades pode ser um polipeptídeo de
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297/540 fusão de IL-7, ou um fragmento ativo do mesmo, e DAF. Por exemplo, o polipeptídeo de fusão pode compreender a sequência de sinalização de DAF e IL-7 sem sua sequência de sinalização, seguido pelos resíduos 36 a 525 de DAF.
[743] Em algumas modalidades do retroviral sistema de empacotamento e método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, a célula de mamífero compreende, associado à sua membrana, um elemento de ativação compreendendo um scFV anti-CD3 ou um scFvFc anti-CD3 ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD14 e uma CD80 ligado, ou um fragmento extracelular do mesmo a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD16B; e citocina ligada à membrana compreendendo um polipeptídeo de fusão de IL-7, ou um fragmento ativo do mesmo, e DAF compreendendo uma sequência de ligação de âncora de GPI, e em que o primeiro transativador regula a expressão de cada um dentre o elemento de ativação e a citocina ligada à membrana. Em algumas modalidades, o IL-7 ou um fragmento ativo do mesmo, e a fusão de DAF, o scFV anti-CD3 ou um scFvFc anti-CD3, e o CD80, ou fragmento extracelular do mesmo, cada um compreende uma sequência de sinal de DAF.
[744] Em algumas modalidades dos aspectos do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula retroviral recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, a célula de mamífero compreende um polipeptídeo Vpu. Em algumas modalidades dos aspectos do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula retroviral recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, a célula de mamífero compreende um polipeptídeo Vpu e um polipeptídeo Vpx. Em algumas modalidades dos aspectos do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula retroviral recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, a célula de mamífero compreende um polipeptídeo Vpx. Nessas ou outras modalidades, o um ou mais elementos de pseudotipagem compreendem um ou mais polipeptídeos virais reconhecidos por células T. O um ou mais elementos de pseudotipagem podem compreender um polipeptídeo F do Vírus do Sarampo, um polipeptídeo H do Vírus do Sarampo e/ou um fragmento dos mesmos. Em certas modalidades ilustrativas, o um ou mais elementos de pseudotipagem são variantes de deleção do domínio citoplasmático de um polipeptídeo F do vírus do sarampo e/ou um polipeptídeo H do vírus do sarampo.
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298/540 [745] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, o genoma de RNA empacotável é codificado por um polinucleotídeo ligado de modo operacional a um terceiro promotor, em que o dito terceiro promotor é constitutivamente ativo ou induzível pelo primeiro transativador ou o segundo transativador. Nas modalidades ilustrativas, o genoma de RNA empacotável é codificado por um polinucleotídeo ligado de maneira funcional a um terceiro promotor, em que o dito terceiro promotor é induzível pelo segundo transativador.
[746] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e do método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, o genoma de RNA empacotável compreende adicionalmente, de 5' a 3':
a) uma repetição terminal longa 5' ou fragmento ativo da mesma;
b) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral;
c) uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um primeiro polipeptídeo-alvo e um segundo polipeptídeo-alvo opcional;
d) um quarto promotor ligado de modo operacional ao primeiro polipeptídeo-alvo e o opcional segundo polipeptídeo, em que o dito quarto promotor é ativo na célula-alvo, mas não ativo na linhagem celular de empacotamento; e
e) uma repetição terminal longa 3' ou fragmento ativo da mesma.
[747] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento incluindo o construto imediatamente acima, o terceiro promotor promove a transcrição ou a expressão na direção oposta à transcrição ou expressão promovida a partir do quarto promotor.
[748] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, o genoma de RNA empacotável codifica a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação de qualquer modalidade revelada nessa
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299/540 revelação, em que o primeiro polipeptídeo-alvo e o segundo polipeptídeo-alvo são o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado, respectivamente. Em algumas modalidades, por exemplo, o genoma de RNA empacotável compreende adicionalmente um elemento de controle ligado de modo operacional ao ácido nucleico que codifica o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado ou o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado. O elemento de controle em modalidades ilustrativas é um riboswitch. O riboswitch em modalidades ilustrativas é capaz de se ligar a um composto e o composto que se liga ao elemento de controle é um análogo de nucleosídeo, e o análogo de nucleosídeo pode ser um fármaco antiviral, por exemplo, aciclovir ou penciclivir.
[749] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, o genoma de RNA empacotável compreende adicionalmente um íntron que compreende um polinucleotídeo que codifica as moléculas inibidoras de RNA, como, por exemplo, uma miRNA ou shRNA. O íntron pode ser adjacente a e a jusante do quarto promotor.
[750] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecida no presente documento, a célula-alvo pode ser uma célula T e/ou uma célula NK.
[751] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e método para realizar aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, o um ou mais elementos de pseudotipagem compreendem uma proteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), uma proteína de envelope de vírus endógeno felino (RD114), uma proteína de envelope anfotrópico oncorretroviral ou uma proteína de envelope ecotrópica oncorretroviral ou fragmentos funcionais das mesmas.
[752] Em algumas modalidades do sistema de empacotamento retroviral e do método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, o genoma de RNA empacotável é 11.000 KB ou menos ou 10.000 KB ou menos de tamanho: Em algumas modalidades do sistema de
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300/540 empacotamento retroviral e método para produzir aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação fornecidos no presente documento, o primeiro polipeptídeo-alvo compreende um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende pelo menos uma elemento linfoproliferativo, e o segundo polipeptídeo-alvo compreende a segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado incluindo a CAR.
[753] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado para regular uma expressão de um polinucleotídeo-alvo, xlmp:
um polinucleotídeo que codifica um polinucleotídeo-alvo ligado de modo operacional a um promotor e um riboswitch, em que o riboswitch compreende:
a) um domínio de aptâmero capaz de se ligar a um fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo e que tem ligação reduzida à guanina ou 2'-deoxiguanosina em relação ao fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo; e
b) um domínio de comutação de função capaz de regular a expressão do polinucleotídeoalvo, em que a ligação do análogo de nucleosídeo pelo domínio de aptâmero induz ou suprime a atividade de regulação de expressão do domínio de comutação de função, regulando, assim, a expressão do polinucleotídeo-alvo.
[754] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui o elemento de controle pode ser um polinucleotídeo que compreende um riboswitch. O riboswitch pode ser capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo e o composto que se liga ao elemento de controle é o análogo de nucleosídeo. O análogo de nucleosídeo pode ser um agente antiviral. O agente antiviral pode ser aciclovir ou penciclovir. O riboswitch pode se ligar preferencialmente a aciclovir através de penciclovir ou preferencialmente se ligar a penciclovir através de aciclovir. O riboswitch pode ter ligação reduzida ao fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo em temperaturas acima de 37 °C, 37.5 °C, 38 °C, 38,5 °C ou 39 °C, por exemplo, acima de 39 °C. O riboswitch pode ter entre 35, 40, 45, e 50 nucleotídeos de comprimento na extremidade baixa da faixa e 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 e 100 nucleotídeos de comprimento na extremidade alta da faixa, por exemplo, entre 45 e 80 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que incluem o riboswitch, o polinucleotídeo-alvo
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301/540 que é regulado pelo riboswitch pode incluir uma região que codifica uma miRNA, um shRNA e/ou um polipeptídeo. O polinucleotídeo-alvo pode codificar um elemento linfoproliferativo. O polinucleotídeo-alvo pode ser ligado de modo operacional a um promotor. O polinucleotídeo-alvo pode incluir uma região que codifica um polipeptídeo e o polipeptídeo pode incluir um receptor de antígeno quimérico que compreende uma região de alvejamento específico para antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que inclui o riboswitch, o domínio de comutação de função pode regular um sítio de entrada de ribossomo interno, acessibilidade de doador de splicing pre-mRNA no construto de gene viral, tradução, terminação de transcrição, degradação de transcrição, expressão de miRNA ou expressão de shRNA, regulando, assim, a expressão do polinucleotídeo-alvo. O riboswitch pode incluir uma ribozima. Nas modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que incluem o riboswitch, o polinucleotídeo isolado pode ser um vetor de clonagem molecular ou um vetor de expressão. Nas modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecidos no presente documento que incluem o riboswitch, o polinucleotídeo isolado pode ser integrado a um genoma retroviral ou a um cromossomo de mamífero ou fragmento dos mesmos. Em certas modalidades deste e de qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento que compreendem um riboswitch, o riboswitch regula o splicing pre-mRNA. Por exemplo, o riboswitch pode compreender uma sequência de ponto de ramificação, tipicamente entre dois éxons em um polinucleotídeo e/ou unidade transcricional no presente documento. Assim, a ligação de um análogo de nucleosídeo antiviral composto ou um fármaco ao riboswitch regula o splicing de éxon. Tais modalidades podem incluir um polinucleotídeo que compreende um primeiro éxon, um segundo éxon e um riboswitch entre o primeiro éxon e o segundo éxon, em que o riboswitch compreende uma sequência de ponto de ramificação, e em que a ligação de um composto ou fármaco antiviral análogo de nucleosídeo (por exemplo, aciclovir) ao riboswitch regula o splicing de éxon do primeiro e do segundo éxon. Em outras modalidades deste e de qualquer um doa aspectos e modalidades no presente documento que compreendem um riboswitch, o riboswitch pode controlar a expressão de gene através da regulação de transplicing de pre-mRNA. Em tais modalidades, o riboswitch é localizado dentro de um íntron de transplicing. Por exemplo, um aspecto pode incluir um
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302/540 polinucleotídeo que compreende um primeiro éxon, um segundo éxon e um riboswitch entre o primeiro éxon e o segundo éxon, em que o riboswitch compreende uma sequência de ponto de ramificação, e em que a ligação de aciclovir ao riboswitch regula o splicing de éxon do primeiro e do segundo éxon.
[755] Outro aspecto fornecido no presente documento é um método para modificar geneticamente e expandir linfócitos de um sujeito que compreende:
A. coletai- sangue do sujeito;
B. colocar as células T e/ou células NK do sangue do sujeito ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendendo:
i. um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação ao mesmo, em que o dito elemento de pseudotipagem compreende variantes de deleção do domínio citoplasmático de um polipeptídeo F do vírus do sarampo e/ou um polipeptídeo H do vírus do sarampo;
ii. um polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 e um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28, em que os ditos polipeptídeos são expressados na superfície de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação e são capazes de se ligar a uma célula T e/ou uma célula NK e, adicionalmente, em que os ditos polipeptídeos não são codificados por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação; e iii. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais encode a primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico que compreende uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que a expressão do receptor de IL-7 mutante é regulada por um riboswitch que se liga a um fármaco antiviral análogo de nucleosídeo, em que a ligação do fármaco antiviral
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303/540 análogo de nucleosídeo ao riboswitch aumenta a expressão do receptor de IL-7 mutante, e em que o dito contato resulta em pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso se tornarem geneticamente modificadas;
C. reintroduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito; e
D. expor as células T e/ou células NK geneticamente modificadas in vivo ao fármaco antiviral análogo de nucleosídeo para promover a expansão das células T e/ou células NK, em que o método entre a coleta de sangue e a reintrodução das células T e/ou células NK geneticamente modificadas é realizado em não mais de 24 horas e/ou sem exigir estímulo ex vivo anterior, modificando geneticamente e expandindo, assim, os linfócitos do sujeito.
[756] Em modalidades ilustrativas deste aspecto de método, a partícula retroviral é uma partícula lentiviral. Em outra modalidade ilustrativa, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação modifica geneticamente uma célula T. Em outra modalidade ilustrativa, o polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 e o polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 são, cada um, fundidos a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas ocorrências, o polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 pode ser scFvFc anti-CD3 ou scFv anti-CD3, e o polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 pode ser CD80. O scFvFc anti-CD3 ou scFv anti-CD3 e CD80 podem, cada um, ser adicionalmente fundidos a uma sequência de sinal de DAF. Em outra modalidade ilustrativa, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem adicionalmente, em sua superfície, um polipeptídeo de fusão que compreende uma citocina covalentemente ligada a DAF. Em algumas ocorrências, a citocinapode ser IL-7 ou IL-15, e o polipeptídeo de fusão pode compreender a sequência de sinal de DAF, IL7 sem sua sequência de sinal, e um fragmento de DAF que compreende uma sequência de ligação de âncora de GPI.
[757] Em outra modalidade ilustrativa deste aspecto de método imediatamente acima, o riboswitch controla adicionalmente a expressão do receptor de antígeno quimérico de uma maneira regulada através da ligação do riboswitch ao fármaco antiviral análogo de nucleosídeo, que, em alguns casos, é aciclovir e/ou penciclovir. Em outra modalidade, o IL-7 constitutivamente ativo pode ser substituído por um miRNA ou shRNA ou ácidos nucleicos que
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304/540 codificam um miRNA ou shRNA e IL-7 pode estar presente. Em algumas ocorrências, o miRNA ou shRNA pode ser codificado por ácidos nucleicos dentro de um íntron.
[758] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que compreende:
A. um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação ao mesmo, em que o dito elemento de pseudotipagem compreende variantes de deleção do domínio citoplasmático de um polipeptídeo F do vírus do sarampo e/ou um polipeptídeo H do vírus do sarampo;
B. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo; em que a expressão do receptor de IL-7 mutante é regulada por um riboswitch que se liga a um fármaco antiviral análogo de nucleosídeo, em que a ligação do fármaco antiviral análogo de nucleosídeo ao riboswitch aumenta a expressão do receptor de IL-7 mutante; e
C. um polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 e um polipeptídeo capaz de se ligar a CD28, em que os ditos polipeptídeos são expressados na superfície de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação; são capazes de se ligar a uma célula T e/ou célula NK; e não são codificados por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[759] Em modalidades ilustrativas de qualquer aspecto de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, a partícula retroviral é uma partícula lentiviral. Em outras modalidades ilustrativas do método, o polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 e o polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 são, cada um, fundidos a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas ocorrências, o polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 pode
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305/540 ser scFvFc anti-CD3 ou scFv anti-CD3, e o polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 pode ser CD80. O scFvFc anti-CD3 ou scFv anti-CD3 e CD80 podem, cada um, ser adicionalmente fundidos a uma sequência de sinal de DAF. Em outra modalidade ilustrativa, as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem adicionalmente, em sua superfície, um polipeptídeo de fusão que compreende uma citocina covalentemente ligada a DAF. Em algumas ocorrências, a citocina pode ser IL-7 ou IL-15, e o polipeptídeo de fusão pode compreender a sequência de sinal de DAF, IL-7 sem sua sequência de sinal, e um fragmento de DAF que compreende uma sequência de ligação de âncora de GPI.
[760] Em outra modalidade ilustrativa de qualquer aspecto de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação no presente documento, o riboswitch controla adicionalmente a expressão do receptor de antígeno quimérico de uma maneira regulada através da ligação do riboswitch ao fármaco antiviral análogo de nucleosídeo, que, em alguns casos, é aciclovir e/ou penciclovir. Em outra modalidade, o IL-7 constitutivamente ativo pode ser substituído por um miRNA ou shRNA ou ácidos nucleicos que codificam um miRNA ou shRNA e IL-7 pode estar presente. O miRNA ou shRNA pode ser codificado por ácidos nucleicos dentro de um íntron.
[761] Outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para produzir uma partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que compreende:
A. cultivar uma população de células de empacotamento para acumular um primeiro transativador, em que as células de empacotamento compreendem o primeiro transativador expresso a partir de um promotor constitutivo, em que o primeiro transativador tem a capacidade para se ligar a um primeiro ligante e a um primeiro promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de maneira operacional ao mesmo na presença versus ausência do primeiro ligante, e em que a expressão de um segundo transativador e uma proteína REV retroviral é regulada pelo primeiro transativador;
B. incubar a população de células de empacotamento compreendendo o primeiro transativador acumulado na presença do primeiro ligante para acumular o segundo transativador e a proteína REV retroviral e um elemento de ativação tipicamente em sua superfície, compreendendo um polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 e um polipeptídeo
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306/540 capaz de se ligar a CD28, em que o segundo transativador é capaz de se ligar um segundo ligante e um segundo promotor induzível para afetar a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de modo operacional ao mesmo na presença versus ausência do segundo ligante; e
C. incubar a população de células de empacotamento compreendendo o segundo transativador acumulado e proteína REV retroviral na presença do segundo ligante induzindo, assim, a expressão de um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um elemento de pseudotipagem capaz de se ligar a uma célula T e/ou uma célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação ao mesmo, em que o dito elemento de pseudotipagem compreende variantes de deleção do domínio citoplasmático de um polipeptídeo F do vírus do sarampo e/ou um polipeptídeo H do vírus do sarampo, em que um genoma de RNA empacotável é codificado por polinucleotídeo ligado de modo operacional a um terceiro promotor e em que o dito promotor é induzível pelo segundo transativador, em que o genoma de RNA empacotável compreende de 5' a 3':
i. uma repetição terminal longa 5' ou fragmento ativo da mesma;
ii. uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral;
iii. uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um receptor de antígeno quimérico e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo separado por um sinal de divagem;
iv. um quarto promotor que é ativo na célula T e/ou na célula NK; e
v. uma repetição terminal longa 3' ou fragmento ativo da mesma, e em que o genoma de RNA empacotável compreende adicionalmente um riboswitch que se liga a um fármaco antiviral análogo de nucleosídeo, em que a ligação do riboswitch ao fármaco antiviral análogo de nucleosídeo aumenta a expressão do receptor de IL-7 mutante,
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307/540 produzindo, assim, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[762] Em uma modalidade ilustrativa do método, o riboswitch controla adicionalmente a expressão do receptor de antígeno quimérico de uma maneira regulada através da ligação do riboswitch ao fármaco antiviral análogo de nucleosídeo. Em outra modalidade ilustrativa, o fármaco antiviral análogo de nucleosídeo é aciclovir e/ou penciclovir. Em outra modalidade ilustrativa, o genoma de RNA empacotável compreende adicionalmente um domínio de reconhecimento, em que o domínio de reconhecimento compreende um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo que reconhece EGFR ou um epítopo do mesmo. Em outra modalidade ilustrativa, o primeiro ligante é rapamicina e o segundo ligante é tetraciclina ou doxorrubicina ou o primeiro ligante é tetraciclina ou doxorrubicina e o segundo ligante é rapamicina. Em outra modalidade ilustrativa, a célula de empacotamento compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codificam Vpu na segunda ou em uma terceira unidade transcricional opcional, ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de modo operacional ao primeiro promotor induzível. Em outra modalidade ilustrativa, a célula de empacotamento compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo Vpu e opcionalmente um polipeptídeo VPX na segunda ou em uma terceira unidade transcricional opcional, ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de modo operacional ao primeiro promotor induzível. Em outra modalidade ilustrativa, a célula de empacotamento compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codificam Vpx na segunda ou em uma terceira unidade transcricional opcional, ou em uma unidade transcricional adicional que é ligada de modo operacional ao primeiro promotor induzível. Em outra modalidade ilustrativa, o polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 e o polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 são, cada um, fundidos a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas ocorrências, o polipeptídeo capaz de se ligar a CD3 pode ser scFvFc anti-CD3 ou scFv anti-CD3, e o polipeptídeo capaz de se ligar a CD28 pode ser CD80. O scFvFc anti-CD3 ou scFv anti-CD3 e CD80 podem, cada um, ser adicionalmente fundidos a uma sequência de sinal de DAF. Em outra modalidade ilustrativa, a expressão de um polipeptídeo de fusão compreendendo uma citocina covalentemente ligada a DAF também é induzida. Em algumas ocorrências, a citocina pode ser IL-7 ou IL-15, e o polipeptídeo de fusão pode compreender a sequência de sinal de DAF, IL-7 sem sua sequência de sinal, e um fragmento de DAF que
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308/540 compreende uma sequência de ligação de âncora de GPI. Em outra modalidade ilustrativa, o riboswitch controla adicionalmente a expressão do receptor de antígeno quimérico de uma maneira regulada através da ligação do riboswitch ao fármaco antiviral análogo de nucleosídeo, que, em alguns casos, é aciclovir e/ou penciclovir. Em outra modalidade, o IL-7 constitutivamente ativo pode ser substituído por um miRNA ou shRNA ou ácidos nucleicos que codificam um miRNA ou shRNA e IL-7 pode estar presente. O miRNA ou shRNA pode ser codificado por ácidos nucleicos dentro de um íntron. Em uma modalidade ilustrativa, a partícula retroviral é uma partícula lentiviral.
[763] E fornecido, em outro aspecto no presente documento, um linfócito geneticamente modificado que compreende:
A. um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo; e
B. um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico que compreende uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[764] Em modalidades ilustrativas do aspecto de linfócito geneticamente modificado acima, o linfócito geneticamente modificado é uma célula T e/ou uma célula NK. Em certas modalidades, o linfócito é uma célula T. Em outra modalidade ilustrativa, a expressão do dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou do dito segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é regulada por um riboswitch que se liga a um fármaco antiviral análogo de nucleosídeo, em que a ligação do fármaco antiviral análogo de nucleosídeo ao riboswitch aumenta a expressão do receptor de IL-7 mutante. Em outra modalidade, os linfócitos geneticamente modificados expressam pelo menos uma (por exemplo, duas) moléculas inibidoras de RNA, como, por exemplo, um miRNA ou um shRNA. As moléculas inibidoras de RNA podem ser adicionalmente codificadas por ácidos nucleicos dentro de um íntron.
[765] E fornecida, em outro aspecto no presente documento, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada que compreende:
a. um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo
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309/540 pelo menos um elemento linfoproliferativo; e
b. um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico que compreende uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[766] Em modalidades ilustrativas do aspecto de célula T e/ou célula NK geneticamente modificada, o elemento linfoproliferativo é constitutivamente ativo e, em alguns casos, é um receptor de IL-7 mutado constitutivamente ativo ou um fragmento do mesmo. Em outra modalidade ilustrativa, a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou do segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado é regulada por um elemento de controle. Em algumas ocorrências, o elemento de controle é um polinucleotídeo compreendendo um riboswitch. Em algumas ocorrências, o riboswitch é capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo e, quando o análogo de nucleosídeo está presente, o primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e/ou o segundo polipeptídeo geneticamente modificado são expressos. Em outras modalidades ilustrativas, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada tem, em sua superfície, um elemento de ativação, um elemento de pseudotipagem e/ou uma citocina ligada à membrana. Em algumas ocorrências, o elemento de ativação compreende um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3; e/ou um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28. Em uma certa modalidade, o elemento de ativação compreende scFV anti-CD3 ou um scFvFc anti-CD3 fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga e/ou CD80 fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em uma modalidade ilustrativa, o elemento de pseudotipagem compreende um polipeptídeo F do Vírus do Sarampo, um polipeptídeo H do Vírus do Sarampo e/ou variantes de deleção do domínio citoplasmático de um polipeptídeo F do vírus do sarampo e/ou um polipeptídeo H do vírus do sarampo. Em outras modalidades, a citocina ligada à membrana é um polipeptídeo de fusão compreendendo IL-7 ou um fragmento do mesmo, fundido a DAF, ou um fragmento do mesmo compreendendo uma sequência de ligação de âncora de GPI.
[767] Em um aspecto, é fornecido no presente um método para modificar geneticamente e expandir linfócitos de um sujeito que compreende:
A. colocar células T e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo, tipicamente sem
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310/540 exigir estimulação ex vivo anterior em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação que compreendem:
i. um elemento de pseudotipagem em sua superfície que tem a capacidade para se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula retroviral recombinante incompetente em replicação às mesmas; e ii. um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado regulado por um elemento de controle, em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende pelo menos um elemento linfoproliferativo e opcionalmente codifica um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado opcionalmente regulado por um elemento de controle, em que o segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende um domínio de ativação intracelular e opcionalmente outros componentes de uma CAR, em que o dito contato facilita a transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas;
B. introduzir as células T e/ou células NK geneticamente modificadas no sujeito; e expor as células T e/ou células NK geneticamente modificadas in vivo a um composto que atua como o elemento de controle para afetar a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado e promover a expansão, o enxerto e/ou persistência dos linfócitos in vivo, modificando geneticamente e expandindo, assim, os linfócitos do sujeito.
[768] Nas modalidades ilustrativas, a transdução é executada sem estimulação ex vivo. Nas modalidades ilustrativas, o composto é uma chaperona molecular, tal como uma chaperona molecular pequena. Nas modalidades ilustrativas, a ligação da chaperona molecular ao elemento linfoproliferativo aumenta a atividade proliferativa do elemento linfoproliferativo. A chaperona molecular pode ser administrada ao sujeito antes de o sangue ser coletado, durante o contato e/ou após as células T e/ou células NK serem introduzidas no sujeito. Será entendido,
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311/540 com esse aspecto, em que o composto é o elemento de controle, que tal composto tipicamente é capaz de se ligar a um elemento linfoproliferativo e/ou um componente de uma CAR, e não se liga a tal elemento linfoproliferativo ou componente de CAR durante a realização do método. Outras modalidades e ensinamentos relacionados a métodos fornecidos no presente documento que incluem transfectar uma célula T e/ou uma célula NK com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, se aplicam a este aspecto, incluindo uma modalidade de chaperona molecular também.
[769] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para selecionar uma região de alvejamento específico para antígeno restrita ao microambiente, compreendendo a seleção de uma biblioteca de apresentação em polipeptídeo por:
a. submetendo polipeptídeos da biblioteca de apresentação em polipeptídeo a um ensaio de ligação sob uma condição fisiológica normal e um ensaio de ligação sob uma condição anormal; e
b. selecionando um polipeptídeo que exibe um aumento na atividade de ligação na condição anormal em comparação à condição fisiológica, selecionando, assim, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente.
[770] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para isolar uma região de alvejamento específico para antígeno restrita ao microambiente compreendendo:
selecionar uma biblioteca de polipeptídeo:
a) colocando a biblioteca de polipeptídeo sob condições anormais em contato com um antígeno-alvo ligado a um suporte sólido, em que os clones que expressam polipeptídeos que se ligam ao antígeno-alvo permanecem ligados ao suporte sólido através do antígenoalvo;
b) incubando os suportes sólidos com polipeptídeos ligados sob condições fisiológicas; e
c) coletando clones que eluem do suporte sólido sob as condições fisiológicas, isolando, assim, a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente.
[771] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um receptor de antígeno quimérico para se ligar a um antígeno-alvo compreendendo:
a) pelo menos uma região de alvejamento específica para antígeno restrita ao
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312/540 microambiente selecionada pela seleção de uma biblioteca de polipeptídeo e que tem um aumento na atividade em um ensaio de ligação em uma condição anormal em comparação a uma condição fisiológica normal;
b) um domínio transmembranar; e
c) um domínio de ativação intracelular.
[772] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um receptor de antígeno quimérico para se ligar a um antígeno-alvo compreendendo:
a) uma região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente que exibe um aumento na ligação ao antígeno-alvo em uma condição anormal em comparação a um ambiente fisiológico normal, em que a região de alvejamento específica para antígeno se liga ao alvo;
b) um domínio transmembranar; e
c) um domínio de ativação intracelular.
[773] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos e composições fornecido no presente documento que incluem uma região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente (ASTR), a ASTR pode ter pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% na afinidade de ligação ao antígeno-alvo no ensaio na condição anormal comparada com a condição normal. As condições anormais podem ser hipoxia, um pH ácido, uma concentração mais alta de ácido láctico, uma concentração mais alta de hialuronano, uma concentração mais alta de albumina, uma concentração mais alta de adenosina, uma concentração mais alta de R-2-hidroxiglutarato, uma concentração mais alta de enzimas PAD, uma pressão mais alta, uma oxidação mais alta e uma disponibilidade de nutriente mais baixa. A ASTR restrita ao microambiente pode exibir um aumento na ligação de antígeno a um pH de 6,7 em comparação a um pH de 7,4. A ASTR restrita ao microambiente pode exibir um aumento na ligação de antígeno em um ambiente de tumor e/ou em uma condição de ensaio substituto de tumor in vitro, em relação a uma condição fisiológica correspondente. O alvo pode ser 4-lBB,ST4, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, AXL, BAFF, célula de linfoma B, C242 antígeno, CA-125, anidrase carbônica 9 (CA- IX), CMET, CCR4, CD 152, CD 19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888,
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CTLA-4, DRS, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, domínio B extra de fibronectina, receptor de folato 1, GD2, GD3 gangliosídeo, glicoproteína 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, cinase de receptor de fator de difusão humano, receptor de IGF-1, IGF -I, IgGl, Ll-CAM, IL-13, IL-6, receptor de fator de crescimento tipo insulina I, integrina nSPl, integrina nvP3, MGRAb-009, MS4A1, MUC1, mucina CanAg, ácido Nglicolilneuramínico, NPC-1C, PDGF-R a, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, ROR1, ROR2 SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascina C, TGF beta 2, TGF-P, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16. 88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 e vimentina. A ASTR pode ser um anticorpo, um antígeno, um ligante, um domínio de ligação a receptor de um ligante, um receptor, um domínio de ligação a ligante de um receptor ou um afficorpo. A ASTR pode ser um anticorpo de comprimento completo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento (Fab’)2, um fragmento Fv e um anticorpo de cadeia única divalente ou um diacorpo. A ASTR pode incluir uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo. O anticorpo pode ser um fragmento variável de cadeia única. Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve podem ser separadas por um aglutinante, em que o aglutinante tem entre 6 e 100 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, a cadeia pesada pode ser posicionada N-terminal à cadeia leve no receptor de antígeno quimérico e em algumas modalidades a cadeia leve pode ser posicionada N-terminal à cadeia pesada no receptor de antígeno quimérico.
[774] Em modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos que inclui uma biblioteca de apresentação em polipeptídeo, a biblioteca de apresentação em polipeptídeo pode ser uma biblioteca de apresentação de fago ou uma biblioteca de apresentação de levedura. A biblioteca de apresentação em polipeptídeo pode ser uma biblioteca de apresentação de anticorpo. A biblioteca de apresentação de anticorpo pode ser uma biblioteca de apresentação de anticorpo humano ou humanizado. A biblioteca de apresentação de anticorpo pode ser uma biblioteca virgem. Os métodos podem incluir infectar células bacterianas com o fago coletado para gerar uma biblioteca de apresentação em fago refinada e repetir o contato, a incubação e a coleta por 1 a 1.000 ciclos, com o uso da biblioteca de apresentação em fago refinada gerada a partir de um ciclo anterior.
[775] Nas modalidades ilustrativas de qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento que incluem isolar ou selecionar uma ASTR restrita ao microambiente, o
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314/540 método pode incluir determinar a sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente, determinando, assim, a sequência de polipeptídeos da ASTR restrita ao microambiente. Os métodos podem incluir produzir um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente gerando-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a ASTR restrita ao microambiente, um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. A biblioteca pode ser uma biblioteca de anticorpo de cadeia única.
[776] Os métodos para isolar uma ASTR restrita ao microambiente podem incluir a seleção ser repetida entre 1 e 1.000 vezes. Os métodos para isolar uma ASTR restrita ao microambiente podem ser realizados sem a mutação de polinucleotídeos que codificam a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente isolada entre os ciclos de seleção. Os métodos para isolar uma ASTR restrita ao microambiente podem ser realizados cultivando-se, amplificando-se com alta fidelidade e/ou diluindo-se polinucleotídeos que codificam regiões de alvejamento específicas para antígeno ou organismos hospedeiros incluindo as mesmas, entre os ciclos de seleção. Os métodos podem incluir, antes da repetição, mutagenizar a região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente selecionada e/ou isolada. Os métodos podem incluir determinar a sequência da região de alvejamento específica para antígeno restrita ao microambiente selecionada e/ou isolada, e/ou um polinucleotídeo que codifica a mesma, após um ou mais ciclos de seleção por meio de sequenciamento de DNA de leitura longa. Os métodos podem incluir determinar a sequência antes e após a expansão da ASTR restrita ao microambiente isolada. Os métodos para isolar uma ASTR restrita ao microambiente podem ser realizados sem repetir a seleção. Os métodos para isolar uma ASTR restrita ao microambiente podem ser realizados sem a mutação de um polinucleotídeo que codifica a ASTR restrita ao microambiente isolada após a ASTR restrita ao microambiente ser isolada.
[777] Em modalidades ilustrativas de qualquer das composições fornecidas no presente documento que incluem um receptor de antígeno quimérico com uma ASTR restrita ao microambiente, a ASTR restrita ao microambiente pode ser identificada por seleção de uma biblioteca de anticorpo. Em algumas modalidades, a ASTR restrita ao microambiente é identificada por selecionar uma apresentação de fago ou uma biblioteca de apresentação de levedura. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico compreende uma ASTR
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315/540 biespecífica.
[778] E fornecida, no presente documento, em outro aspecto, uma célula T e/ou célula NK transduzida, compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo e, células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado regulado por um elemento de controle, em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo, e em que o elemento de controle é capaz de ligação a um composto in vitro ou in vivo ou é configurada para se ligar a um composto in vivo.
[779] E fornecida, no presente documento, em outro aspecto, uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, compreendendo a polinucleotídeo recombinante compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado regulado por um elemento de controle, que pode ser um elemento de controle in vivo, em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo, e em que o elemento de controle é capaz de se ligar a um composto in vivo ou é configurado para se ligar a um composto in vivo.
[780] E fornecido, no presente documento, em outro aspecto, um método para transduzir a célula T e/ou célula NK, compreendendo o contato de uma célula T e/ou célula NK, com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado regulado por um elemento de controle, em que o dito primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreende um receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo, e em que o elemento de controle in vivo é capaz de se ligar a um composto in vivo ou in vitro, sob condições de transdução, transduzindo, assim, a célula T e/ou a célula NK.
[781] Em modalidades ilustrativas de aspectos de célula T e/ou célula NK transduzida, os aspectos de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, e
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316/540 os aspectos do método, fornecidos nos parágrafos anteriores, o polinucleotídeo recombinante compreende adicionalmente uma unidade transcricional que codifica um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado compreendendo um primeiro receptor de antígeno quimérico compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em outras modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo compreende um receptor de IL-7 mutado ou um fragmento do mesmo. Em outras modalidades ilustrativas, o elemento de controle é um polinucleotídeo compreendendo um riboswitch. Em algumas ocorrências, o riboswitch é capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo e o composto que se liga ao elemento de controle é o análogo de nucleosídeo. Em algumas ocorrências, o análogo de nucleosídeo é um agente antiviral como, por exemplo, aciclovir ou penciclovir. Em certas modalidades, o agente antiviral é aciclovir. Em outras modalidades ilustrativas, o receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo é fundido a EGFR ou um epítopo do mesmo. Em outras modalidades ilustrativas, o receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo compreende uma eTag. Em outras modalidades ilustrativas, o receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo compreende uma inserção de PPCL. Em outras modalidades ilustrativas, o receptor de IL-7 mutante constitutivamente ativo compreende uma inserção de PPCL em uma posição equivalente à posição 243 em um receptor de IL-8 humano tipo selvagem. Em outras modalidades ilustrativas, a célula T transduzida ou célula NK é uma célula T transduzida.
[782] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método para modular a ligação de uma célula T ou célula NK que expressa o receptor de antígeno quimérico restrito ao microambiente (MRB-CAR) condicionalmente a uma célula que expressa um antígeno cognato do MRB-CAR em um indivíduo, incluindo:
a. introduzir uma célula T e/ou célula NK que inclui um ácido nucleico que codifica uma MRB-CAR em um sujeito, em que, após a introdução, a célula T e/ou a célula NK que inclui i ácido nucleico que codifica MRB-CAR expressa o MRB-CAR e se liga à célula que expressa o antígeno cognato no sujeito; e
b. administrar um agente farmacológico ao indivíduo em quantidade suficiente para aumentar o pH sanguíneo e/ou o pH de um tecido e/ou pH de um microambiente, em que a administração é realizada antes, durante ou após a introdução e em que o pH aumentado
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317/540 do sangue, do tecido e/ou do microambiente modulam a ligação da célula T e/ou célula NK que expressa MRB-CAR à célula que expressa o antígeno cognato no sangue, no tecido ou no microambiente com o aumento do pH.
[783] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um método para aliviar uma toxicidade de tumor fora do alvo em um indivíduo, incluindo:
a. introduzir um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) em uma célula T ou célula NK do indivíduo para produzir uma célula T e/ou célula NK incluindo um ácido nucleico que codifica o MRBCAR;
b. introduzir a célula T e/ou célula NK que inclui o ácido nucleico que codifica uma MRBCAR em um sujeito, em que, após a introdução, a célula T e/ou a célula NK que inclui i ácido nucleico que codifica MRB-CAR expressa o MRB-CAR e se liga à célula que expressa o antígeno cognato no sujeito; e
c. administrar um agente farmacológico ao indivíduo em quantidade suficiente para aumentar o pH sanguíneo e/ou o pH de um tecido e/ou pH de um microambiente para modular a ligação da MRB-CAR ao seu antígeno cognato no sangue, no tecido e/ou o microambiente com o aumento do pH, aliviando assim o alvo da toxicidade do tumor no indivíduo.
[784] Em algumas modalidades, o ácido nucleico pode ser um vetor. Em modalidades ilustrativas, o vetor é uma partícula retroviral.
[785] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um método para controlar a ligação de uma célula T e/ou célula NK a uma célula alvo de mamífero, incluindo:
a. colocar a célula alvo de mamífero em contato com a célula T e/ou célula NK em um microambiente, em que a célula alvo de mamífero expressa um antígeno cognato, e a célula T e/ou célula NK expressa um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (CAB-CAR) que se liga ao antígeno cognato diferencialmene a pH 6,7 em comparação com pH 7,4; e
b. aumentar o pH do microambiente por meio da introdução de um agente farmacológico no microambiente em uma quantidade suficiente, controlando assim a ligação da célula T e/ou célula NK à célula alvo de mamífero.
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318/540 [786] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um método para controlar a ligação da uma célula T e/ou célula NK que expressa um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) a uma célula alvo de mamífero em um indivíduo in vivo, incluindo administrar um agente farmacológico modulador de pH ao indivíduo através de um regime de dosagem eficaz que aumenta o pH de um microambiente em um indivíduo, em que o indivíduo inclui a célula T e/ou a célula NK que expressa o MRB-CAR, em que o MRB-CAR se liga ao seu antígeno cognato diferencialmente a pH 6,7 em comparação com pH 7,4, em que o microambiente inclui a célula alvo de mamífero, em que a célula alvo de mamífero expressa o antígeno cognato em sua superfície, e em que a célula T e/ou célula NK se liga à célula alvo de mamífero diferencialmente antes versus depois de o pH do microambiente ser aumentado, controlando assim a ligação da célula T e/ou célula NK à célula alvo de mamífero em um indivíduo in vivo.
[787] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento, que incluem um agente farmacológico e um MRB-CAR, o MRB-CAR pode reduzir a ligação ao seu antígeno cognato em um pH do que em um pH diferente. Em modalidades ilustrativas em que os valores de pH ilustrativos para ligação diferencial de um MRB-CAR não são já fornecidos no aspecto mais amplo e alternativamente para outras modalidades em vez dos valores para tais aspectos, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB-CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5 do que em um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0. Em outras modalidades, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB-CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 do que a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5. Em algumas modalidades ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,5 a 6,7 em comparação com pH 7,4 a 7,6. Em outras modalidades ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,7 em comparação com um pH de 7,4. Em outras modalidades, o MRB-CAR exibe ligação aumentada no pH de um tumor em comparação com o pH do sangue. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode incluir uma região de direcionamento específica do antígeno, um stalk e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, o MRB-CAR também pode incluir um domínio coestimulador. Em
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319/540 algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar a um antígeno associado ao tumor.
[788] Em qualquer dos aspectos fornecidos no presente documento que incluem um agente farmacológico e um MRB-CAR, o pH do microambiente pode ser aumentado de um pH abaixo de 7,0 para um pH acima de 7,0. Por exemplo, o pH pode ser aumentado a partir de um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 para um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 ou 7,4. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar ao antígeno cognato no aumento do pH, mas não no pH do microambiente antes da introdução do agente farmacológico. Em certas modalidades, o pH pode ser aumentado de abaixo de 7,0 para um pH de 7,1 a 8,0 ou para um pH de 7,1 a 7,8 ou para um pH de 7,2 a 7,8 ou um pH de 7,2 a 7,6 ou um pH de 7,3 a 7,6 ou a um pH de 7,4 a 7,8 ou a um pH de 7,4 a 7,6. Tal aumento no pH pode ocorrer por menos de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas ou por mais de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas, dependendo do tipo e dose de agente farmacológico administrado. Em certas modalidades, o agente farmacológico administrado é tal modo que o pH permanece acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5; ou entre 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 no limite inferior do intervalo e 7,4, 7,5, 7,6, 7,7 ou 7,8 no limite superior do intervalo, no tecido alvo, tal como um tumor e, por exemplo, em pelo menos uma superfície de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), em pelo menos uma porção de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), e em modalidades ilustrativas ao longo de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor).
[789] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento, que incluem um agente farmacológico e um MRB-CAR, o microambiente pode ser um microambiente in vivo, como um tumor, um tecido, um tecido não tumoral, um tecido normal ou um tecido que sofreu um desvio transitório do pH. Por exemplo, os tecidos que tipicamente sofrem alterações transitórias do pH incluem um tecido muscular em condições anaeróbicas ou tecido muscular submetido a exercício ou um tecido inflamado ou um tecido a experimentar inflamação. Em algumas modalidades que incluem uma célula alvo de mamífero, a célula alvo de mamífero pode ser uma célula tumoral ou uma célula não tumoral ou normal.
[790] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que incluem um agente farmacológico e um MRB-CAR, o agente farmacológico pode ser bicarbonate de sódio, tris-hidroxilmetilaminometano, uma solução hipertônica equimolar de bicarbonate de sódio e carbonato de sódio, ou inibidores da bomba de prótons tais esomeprazol, esomeprazol e
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320/540 naproxeno, lansoprazol, omeprazol e rabeprazol.
[791] Os ácidos nucleicos que codificam MRB-CARs da presente revelação podem ser introduzidos através de vários meios em células T e/ou células NK. Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um agente farmacológico e um MRBCAR, a etapa ou etapas de introdução ou etapas podem ser realizadas através de:
A. colocar células T e/ou células NK em repouso do sujeito ex vivo sem exigir estimulação ex vivo anterior em contato com a partícula retroviral recombinante incompetente em replicação que inclui:
i. um ou mais elementos de pseudotipagem em sua superfície que têm a capacidade para se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula retroviral recombinante incompetente em replicação à mesma; e ii. um polinucleotídeo incluindo uma unidade transcricional ligada de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, que codifica a MRB -CAR, em que o dito contato facilita a transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, as células T e/ou células NK capazes de expressar a MRBCAR, tipicamente visto que agora incluem o polinucleotídeo que inclui uma unidade transcricional ligada de modo operacional a um promotor ativo nas células T e/ou células NK, que codifica a MRB-CAR; e
b. introduzir as células T e/ou células NK capazes de expressar a MRB-CAR no sujeito.
[792] Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK podem ser submetidas a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou menos divisões celulares ex vivo antes de serem introduzidas. Em algumas modalidades, as células T em repouso e/ou células NK em repouso podem estar em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação por entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 horas na extremidade baixa da faixa e 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22, 23 ou 24 horas na extremidade alta da faixa, em que, para uma dada faixa, um valor baixo é abaixo de um valor alto. Em algumas modalidades, as células T em repouso e/ou células NK em repouso podem ser de sangue que foi coletado do sujeito. Em modalidades ilustrativas, não mais de 12, 15, 16, 18, 21, 24, 30, 36, 42, ou 48 horas podem passar entre o momento em que o sangue é coletado do sujeito e o momento em que as
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321/540 células T e/ou células NK em repouso capazes de expressar a MRB -CAR são introduzidas no sujeito. Em algumas modalidades, todas as etapas após coletar o sangue e antes de introduzir as células T e/ou células NK em repouso capazes de expressar a MRB-CAR podem ser realizadas em um sistema fechado.
[793] Em qualquer modalidade fornecida no presente documento que inclui uma partícula retroviral recombinante incompetente para replicação em um método que inclui um MRB-CAR e um agente farmacológico, o polinucleotídeo que inclui uma unidade de transcrição operativamente ligada a um promotor ativo em células T e/ou células NK que codificam o CABCAR é absorvida pela célula T (ou células T) e/ou célula NK (ou células NK) de modo que essa célula (ou células) tenha a capacidade de expressar o MRB-CAR. Em modalidades ilustrativas, a célula T (ou células) e/ou célula NK (ou células NK) integram o polinucleotídeo a seu genoma.
[794] Em qualquer modalidade fornecidas no presente documento que inclui uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação em um método que inclui uma MRB-CAR e um agente farmacológico, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação pode incluir adicionalmente um elemento de ativação em sua superfície, como um elemento de ativação que é capaz de ativar uma célula T e/ou célula NK em repouso. Em algumas modalidades, o elemento de ativação pode incluir qualquer elemento de ativação fornecido na presente revelação. Em modalidades ilustrativas, o elemento de ativação pode incluir um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 e/ou um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28. Em qualquer uma das modalidades que inclui um elemento de ativação na superfície de partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação em um método que inclui uma MRB-CAR e um agente farmacológico, um ou mais dos polipeptídeos ligados à membrana podem ser fundidos a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 e/ou o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 pode ser um scFv ou scFvFc que se liga a CD3 ou CD28, respectivamente. Em modalidades ilustrativas, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 pode ser um scFv ou scFvFc que se liga a CD3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 pode consistir nos domínios extracelulares de CD80, CD86, ou um fragmento funcional dos mesmos, que é capaz de induzir a ativação de Akt mediada por CD28.
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322/540 [795] Em qualquer modalidade fornecida no presente documento que inclui uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação em um método que inclui uma MRB-CAR e um agente farmacológico, o polinucleotídeo que codifica a MRB-CAR pode ser ligado de modo operacional a um riboswitch. Em algumas modalidades, o riboswitch pode ser capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo. Em algumas modalidades, o análogo de nucleosídeo pode ser um fármaco antiviral, como aciclovir ou penciclovir.
[796] Em qualquer modalidade fornecida no presente documento que inclui uma partícula retroviral recombinante incompetente de replicação em um método que inclui um MRB-CAR e um agente farmacológico, a partícula retroviral recombinante incompetente de replicação pode incluir em sua superfície um domínio de reconhecimento de um anticorpo monoclonal aprovado biológico. Por exemplo, o domínio de reconhecimento pode incluir um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo que reconhece EGFR, ou um epítopo do mesmo.
[797] Em qualquer modalidade fornecida no presente documento que inclui uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação em um método que inclui uma MRB-CAR e um agente farmacológico, o um ou mais elementos de pseudotipagem podem incluir um polipeptídeo F do Vírus do Sarampo, um polipeptídeo H do Vírus do Sarampo e/ou um fragmento dos mesmos que retém a capacidade de se ligar às células T em repouso e/ou células NK em repouso. Em algumas modalidades, o um ou mais elementos de pseudotipagem podem incluir um polipeptídeo de VSV-G. Em algumas modalidades, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação pode incluir em sua superfície um polipeptídeo de fusão de IL-7, ou um fragmento ativo do mesmo, e DAF incluindo uma sequência de ligação de âncora de GPI.
[798] Em qualquer modalidade fornecida no presente documento que inclui uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação em um método que inclui uma MRB-CAR e um agente farmacológico, o genoma da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação pode codificar uma ou mais moléculas inibidoras de RNA, por exemplo, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou seis ou mais moléculas inibidoras de RNA. Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA podem ser direcionadas contra diferentes alvos de RNA. Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA podem ser localizadas dentro do íntron. Em algumas modalidades, as moléculas
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323/540 inibidoras de RNA são capazes de formar uma haste 5 ’ e uma haste 3 ’ que formam um dúplex de RNA de 18 a 25 nucleotídeos. Em algumas modalidades, pelo menos uma das moléculas inibidoras de RNA pode incluir a orientação de 5’ a 3’: uma sequência de flanqueamento de microRNA 5’, uma haste 5’, um laço, uma haste 3’ e uma sequência de flanqueamento de microRNA 3’, em que a haste 5’ ou a haste 3’ é capaz de se ligar a um alvo de RNA. Nas modalidades adicionais, a haste 5 ’ pode ter 18 a 25 nucleotídeos de comprimento, em que a dita haste 3 ’ tem 18 a 25 nucleotídeos de comprimento, em que o dito laço tem 3 a 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a sequência de flanqueamento de microRNA 5 ’ e a sequência de flanqueamento de microRNA 3 ’ pode ser derivada de um miRNA de ocorrência natural, como mIR-155.
[799] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um agente farmacológico modulador de pH para uso em um método para controlar a ligação de a célula T e/ou célula NK a uma célula alvo de mamífero em um indivíduo in vivo, incluindo administrar o agente farmacológico modulador de pH ao indivíduo através de um regime de dosagem eficaz que aumenta o pH de um microambiente em um indivíduo, em que o indivíduo inclui a célula T e/ou a célula NK, em que a célula T e/ou célula NK expressa um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) que se liga a seu antígeno cognato diferencialmente a pH 6,7 em comparação com pH 7,4 em que a célula T e/ou célula NK expressa o MRB-CAR, em que o microambiente inclui a célula alvo de mamífero, em que a célula alvo de mamífero expressa o antígeno cognato em sua superfície, e em que a célula T e/ou célula NK se liga à célula alvo de mamífero diferencialmente antes versus depois de o pH do microambiente ser aumenta pela administração do agente farmacológico modulador de pH controlando assim a ligação da célula T e/ou célula NK à célula alvo de mamífero em um indivíduo in vivo.
[800] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um agente farmacológico para uso em um método para modular a ligação de um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) que expressa célula T ou célula NK a uma célula que expressa um antígeno cognato do MRB-CAR em um indivíduo, para tratar crescimento de tumor, em que o método inclui:
a. introduzir uma célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar a MRB-CAR no indivíduo, em que a MRB-CAR se liga à célula que expressa o antígeno cognato no
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4570/5200
324/540 indivíduo, em que após a introdução, a célula T e/ou a célula NK que inclui o ácido nucleico que codifica a MRB-CAR expressa a MRB-CAR e se liga à célula que expressa o antígeno cognato no indivíduo; e
b. administrar o agente farmacológico ao indivíduo em quantidade suficiente para aumentar o pH sanguíneo e/ou um pH tecidual e/ou um pH do microambiente para modular a ligação da célula T que expressa MRB-CAR e/ou célula NK que expressa o antígeno cognato no sangue, no tecido ou no microambiente com o aumento do pH.
[801] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um agente farmacológico para uso em um método para aliviar a toxicidade de tumor fora do alvo em um indivíduo, em que o método inclui:
a. introduzir um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) em uma célula T ou célula NK do indivíduo, para produzir uma célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar a MRB-CAR;
b. introduzir a célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar a MRB-CAR no indivíduo, em que após a introdução, a célula T e/ou a célula NK que inclui o ácido nucleico que codifica a MRB-CAR expressa a MRB-CAR e se liga à célula que expressa o antígeno cognato no indivíduo; e
c. administrar o agente farmacológico ao sujeito em quantidade suficiente para aumentar o pH do sangue e/ou um pH de tecido e/ou um pH de microambiente para modular a ligação da MRB-CAR ao seu antígeno cognato no sangue, o tecido e/ou o microambiente com o pH aumentado, aliviando, assim, na toxicidade de alvo fora do tumor no sujeito.
[802] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um agente farmacológico para uso em um método para controlar a ligação de uma célula T e/ou célula NK que expressa um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) a uma célula alvo de mamífero, para tratar crescimento de tumor, em que o método inclui:
a. colocar a célula alvo de mamífero em contato com a célula T e/ou célula NK que expressa a MRB-CAR em um microambiente, em que a célula alvo de mamífero expressa um antígeno cognato, e a célula T e/ou célula NK expressa MRB-CAR que se liga ao antígeno cognato diferencialmene a pH 6,7 em comparação com pH 7,4; e
b. aumentar o pH do microambiente através da introdução do agente farmacológico no
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4571/5200
325/540 microambiente em quantidade suficiente, controlando desse modo a ligação da célula T e/ou da célula NK que expressa o MRB-CAR na célula alvo de mamífero.
[803] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um agente farmacológico para uso em um método para controlar a ligação de uma célula T e/ou célula NK que expressa um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRBCAR) a uma célula-alvo de mamífero em um sujeito in vivo, para tratar o crescimento tumoral, em que o agente farmacológico é um agente farmacológico de modulação de pH, e em que o método inclui administrar o agente farmacológico de modulação de pH ao sujeito através de um regime de dosagem eficaz que aumenta o pH de um microambiente dentro do sujeito, em que o sujeito inclui a célula T e/ou célula NK que expressa uma MRB-CAR, em que a MRB-CAR se liga ao seu antígeno cognato de modo diferencial a pH 6,7 como comparado com o pH 7,4, em que o microambiente inclui a célula-alvo de mamífero, em que a célula-alvo de mamífero expressa Lantígeno cognato em sua superfície, e em que a célula T e/ou célula NK se liga à célula-alvo de mamífero de modo diferencial antes versus após o pH do microambiente ser aumentado.
[804] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um agente farmacológico de modulação de pH para uso em um método para controlar a ligação de uma célula T e/ou célula NK que expressa um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) a uma célula-alvo de mamífero em um sujeito in vivo, para tratar o crescimento tumoral, em que o método inclui administrar o agente farmacológico de modulação de pH ao sujeito através de um regime de dosagem eficaz que aumenta o pH de um microambiente dentro do sujeito, em que o sujeito inclui a célula T e/ou célula NK que expressa a MRB-CAR, em que a MRB-CAR se liga ao seu antígeno cognato de modo diferencial em pH 6,7 em comparação com o pH 7,4, em que o microambiente inclui a célula-alvo de mamífero, em que a célula-alvo de mamífero expressa o antígeno cognato em sua superfície, e em que a célula T e/ou célula NK se liga à célula-alvo de mamífero de modo diferencial antes versus após o pH do microambiente ser aumentado através da administração do agente farmacológico de modulação de pH.
[805] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um uso de um agente farmacológico modulador de pH para uso na fabricação de um medicamente para controlar uma ligação de uma célula T e/ou célula NK que expressa um receptor de antígeno quimérico biológico
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326/540 restrito ao microambiente (MRB-CAR) a uma célula alvo de mamífero em um indivíduo in vivo, em que o agente farmacológico modulador de pH deve ser administrado ao indivíduo através de um regime de dosagem eficaz que aumenta o pH de um microambiente em um indivíduo, em que o indivíduo inclui a célula T e/ou célula NK que expressa o MRB-CAR, em que o MRB-CAR se liga a seu antígeno cognato diferencialmente a pH 6,7 em comparação com pH 7,4, em que o microambiente inclui a célula alvo de mamífero, em que a célula alvo de mamífero expresses o antígeno congnato em sua superfície, e em que a célula T se liga à célula alvo de mamífero diferencialmente antes versus após o pH do microambiente é aumentado pela administração do agente farmacológico modulador de pH.
[806] Em qualquer um dos aspectos no presente documento que inclui um agente farmacológico modulador de pH ou um agente farmacológico para uso em um método e um MRB-CAR ou inclui o uso de um agente farmacológico modulador de pH e um MRB-CAR, o MRB-CAR pode ter ligação reduzida a seu antígeno cognato a um pH diferente daquele pH. Em modalidades ilustrativas em que os valores de pH ilustrativos para ligação diferencial de um MRB-CAR não são já fornecidos no aspecto mais amplo e alternativamente para outras modalidades em vez dos valores para tais aspectos, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB -CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5 do que em um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0. Em outras modalidades, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 do que a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5. Em algumas modalidades ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,5 a 6,7 em comparação com pH 7,4 a 7,6. Em outras modalidades ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,7 em comparação com um pH de 7,4. Em outras modalidades, o MRB-CAR exibe ligação aumentada no pH de um tumor em comparação com o pH do sangue. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode incluir uma região de direcionamento específica do antígeno, um stalk e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, o MRB-CAR também pode incluir um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar a um antígeno associado ao tumor.
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4573/5200
327/540 [807] Em qualquer um dos aspectos no presente documento que incluem um agente farmacológico modulador de pH ou um agente farmacológico para uso em um método e um MRB-CAR ou incluem o uso de um agente farmacológico modulador de pH e um MRBCAR, o pH do microambiente pode ser aumentando de um pH abaixo de 7,0 para um pH acima de 7,0. Por exemplo, o pH pode ser aumentado a partir de um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 para um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 ou 7,4. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar ao antígeno cognato no aumento do pH, mas não no pH do microambiente antes da introdução do agente farmacológico. Em certas modalidades, o pH pode ser aumentado de abaixo de 7,0 para um pH de 7,1 a 8,0 ou para um pH de 7,1 a 7,8 ou para um pH de 7,2 a 7,8 ou um pH de 7,2 a 7,6 ou um pH de 7,3 a 7,6 ou a um pH de 7,4 a 7,8 ou a um pH de 7,4 a 7,6. Tal aumento no pH pode ocorrer por menos de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas ou por mais de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas, dependendo do tipo e dose de agente farmacológico administrado. Em certas modalidades, o agente farmacológico administrado é tal modo que o pH permanece acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5; ou entre 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 no limite inferior do intervalo e 7,4, 7,5, 7,6, 7,7 ou 7,8 no limite superior do intervalo, no tecido alvo, tal como um tumor e, por exemplo, em pelo menos uma superfície de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), em pelo menos uma porção de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), e em modalidades ilustrativas ao longo de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor).
[808] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um agente farmacológico de modulação de pH ou um agente farmacológico para uso em um método e um MRB-CAR ou inclui o uso de um agente farmacológico de modulação de pH e um MRB-CAR, o microambiente pode ser um microambiente in vivo, como um tumor, um tecido, um tecido não tumor, um tecido normal ou um tecido que foi submetido a um deslocamento temporário em pH. Por exemplo, os tecidos que tipicamente sofrem alterações transitórias do pH incluem um tecido muscular em condições anaeróbicas ou tecido muscular submetido a exercício ou um tecido inflamado ou um tecido a experimentar inflamação. Em algumas modalidades que incluem uma célula alvo de mamífero, a célula alvo de mamífero pode ser uma célula tumoral ou uma célula não tumoral ou normal.
[809] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um agente farmacológico de modulação de pH ou um agente farmacológico para uso em
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4574/5200
328/540 um método e um MRB-CAR ou inclui o uso de um agente farmacológico de modulação de pH e um MRB-CAR, o agente farmacológico pode ser bicarbonate de sódio, aminometano trishidroxilmetila, uma solução hipertônica equimolar de bicarbonate de sódio e carbonato de sódio ou inibidores de bomba de próton como esomeprazol, esomeprazol e naproxeno, lansoprazol, omeprazol e rabeprazol.
[810] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um agente farmacológico de modulação de pH ou um agente farmacológico para uso em um método e uma MRB-CAR ou inclui o uso de um agente farmacológico de modulação de pH e uma MRB-CAR, o agente farmacológico pode ser usado em um método para o tratamento de câncer, tumores, crescimento tumoral ou um transtorno proliferativo de célula.
[811] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um kit que contém um recipiente que contém uma partícula retroviral recombinante incompetente de replicação, e instruções para uso do mesmo para tratar crescimento de tumor, em que as instruções instruem um método para controlar a ligação de uma célula T e/ou célula NK a uma célula alvo de mamífero, em um método incluindo:
a. transduzir a célula T e/ou célula NK com a partícula retroviral recombinante incompetente de replicação que inclui em seu genoma um receptor de antígeno quimérico biológico restrito ao microambiente (MRB-CAR) que se liga ao antígeno cognato diferencialmente a pH 6,7 em comparação com pH 7,4 para produzir uma célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar o MRB-CAR;
b. introduzir a célula T e/ou célula NK com capacidade de expressar a MRB-CAR no indivíduo, em que após a introdução, a célula T e/ou a célula NK que inclui o ácido nucleico que codifica a MRB-CAR expressa a MRB-CAR e se liga à célula que expressa o antígeno cognato no indivíduo;
c. colocar a célula alvo de mamífero em contato com a célula T que expressa MRB -CAR e/ou célula NK em um microambiente, em que a célula alvo de mamífero expressa um antígeno cognato do MRB-CAR, e a célula T e/ou célula NK expressa o MRB-CAR; e
d. aumentar o pH do microambiente através da introdução de um agente farmacológico modulador de pH no microambiente em quantidade suficiente, afetando desse modo a ligação da célula de mamífero alvo com a célula T e ou célula NK.
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Em algumas modalidades, o kit pode incluir adicionalmente um agente farmacológico modulador de pH.
[812] Em algumas modalidades do kit, o MRB -CAR pode ter uma ligação mais baixo com seu antígeno cognato em um pH do que em um pH diferente. Em modalidades ilustrativas em que os valores de pH ilustrativos para ligação diferencial de um MRB-CAR não são já fornecidos no aspecto mais amplo e alternativamente para outras modalidades em vez dos valores para tais aspectos, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB-CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5 do que em um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0. Em outras modalidades, o MRB-CAR pode ter uma ligação reduzida a um pH mais elevado do que a um pH mais baixo. Por exemplo, o MRB-CAR pode ter ligação reduzida ao seu antígeno cognato a um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 do que a um pH acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5. Em algumas modalidades ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,5 a 6,7 em comparação com pH 7,4 a 7,6. Em outras modalidades ilustrativas, o MRB-CAR exibe ligação aumentada a um pH de 6,7 em comparação com um pH de 7,4. Em outras modalidades, o MRB-CAR exibe ligação aumentada no pH de um tumor em comparação com o pH do sangue. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode incluir uma região de direcionamento específica do antígeno, um stalk e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, o MRB-CAR também pode incluir um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar a um antígeno associado ao tumor.
[813] Em algumas modalidades do kit, o pH do microambiente pode ser aumentado de um pH abaixo de 7,0 para um pH acima de 7,0. Por exemplo, o pH pode ser aumentado a partir de um pH abaixo de 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0 para um pH acima de 7,0, 7,1,7,2,7,3 ou 7,4. Em algumas modalidades, o MRB-CAR pode se ligar ao antígeno cognato no aumento do pH, mas não no pH do microambiente antes da introdução do agente farmacológico. Em certas modalidades, o pH pode ser aumentado de abaixo de 7,0 para um pH de 7,1 a 8,0 ou para um pH de 7,1 a 7,8 ou para um pH de 7,2 a 7,8 ou um pH de 7,2 a 7,6 ou um pH de 7,3 a 7,6 ou a um pH de 7,4 a 7,8 ou a um pH de 7,4 a 7,6. Tal aumento no pH pode ocorrer por menos de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas ou por mais de 1, 2, 4, 6, 8, 12 ou 24 horas, dependendo
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4576/5200
330/540 do tipo e dose de agente farmacológico administrado. Em certas modalidades, o agente farmacológico administrado é tal modo que o pH permanece acima de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5; ou entre 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 no limite inferior do intervalo e 7,4, 7,5, 7,6, 7,7 ou 7,8 no limite superior do intervalo, no tecido alvo, tal como um tumor e, por exemplo, em pelo menos uma superfície de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), em pelo menos uma porção de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor), e em modalidades ilustrativas ao longo de um microambiente de tecido alvo (por exemplo, tumor). Em algumas modalidades, o microambiente pode ser um microambiente in vivo, como um tumor, um tecido, um tecido não tumoral, um tecido normal, ou um tecido que sofreu um desvio transitório do pH. Por exemplo, os tecidos que tipicamente sofrem alterações transitórias do pH incluem um tecido muscular em condições anaeróbicas ou tecido muscular submetido a exercício ou um tecido inflamado ou um tecido a experimentar inflamação. Em algumas modalidades que incluem uma célula alvo de mamífero, a célula alvo de mamífero pode ser uma célula tumoral ou uma célula não tumoral ou normal.
[814] Em algumas modalidades de kit, o agente farmacológico pode ser bicarbonate de sódio, tris-hidroxilmetilaminometano, uma solução hipertônica equimolar de bicarbonate de sódio e carbonato de sódio, ou inibidores da bomba de prótons como esomeprazol, esomeprazol e naproxeno, lansoprazol, omeprazol e rabeprazol.
[815] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo nas células T e/ou células NK, em que:
a. uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e
b. uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[816] E fornecida em outro aspecto no presente documento uma linhagem
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331/540 celular de empacotamento de mamífero compreendendo um genoma de RNA empacotável para uma partícula retroviral incompetente em replicação, em que o genoma de RNA empacotável compreende:
a. uma repetição terminal longa 5' ou fragmento ativo da mesma;
b. uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral;
c. um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos de um ou mais ácidos nucleicos codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular; e
d. uma repetição terminal longa 3' ou fragmento ativo da mesma.
[817] Em algumas modalidades do aspecto de linhagem celular de empacotamento de mamífero, o polinucleotídeo de (c) pode estar em orientação reversa à sequência de ácidos nucleicos que codifica o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral (b), a repetição terminal longa 5' (a) e/ou a repetição terminal longa 3' (d).
[818] Em algumas modalidades do aspecto de linhagem celular de empacotamento de mamífero, a expressão do genoma de RNA empacotável é acionada por um promotor ativo induzível na linhagem celular de empacotamento de mamífero.
[819] Em algumas modalidades do aspecto de linhagem celular de empacotamento de mamífero, o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral pode compreender um trato de polipurina central (cPPT)/sequência de terminação central, uma Psi de HIV ou uma combinação dos mesmos.
[820] E fornecido em outro aspecto no presente documento um vetor retroviral compreendendo um genoma de RNA empacotável para uma partícula retroviral incompetente em replicação, em que o genoma de RNA empacotável compreende:
a. uma repetição terminal longa 5' ou fragmento ativo da mesma;
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4578/5200
332/540
b. uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral;
c. um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos de um ou mais ácidos nucleicos codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular; e
d. uma repetição terminal longa 3' ou fragmento ativo da mesma.
[821] Em algumas modalidades do aspecto de vetor retroviral, o polinucleotídeo de (c) pode estar em orientação reversa à sequência de ácidos nucleicos que codifica o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral (b), a repetição terminal longa 5' (a) e/ou a repetição terminal longa 3' (d).
[822] Em algumas modalidades do aspecto de vetor retroviral, a expressão do genoma de RNA empacotável é acionada por um promotor ativo induzível na linhagem celular de empacotamento de mamífero.
[823] Em algumas modalidades do aspecto de vetor retroviral, o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral pode compreender um trato de polipurina central (cPPT)/sequência de terminação central, uma Psi de HIV ou uma combinação dos mesmos. O vetor retroviral pode incluir opcionalmente um gene de resistência ao antibiótico e/ou um marcador detectável.
[824] E fornecido no presente documento, em outro aspecto, um método para modificar geneticamente ou transduzir um linfócito (por exemplo, uma célula T ou uma célula NK) ou uma população do mesmo, de um sujeito, compreendendo colocar o linfócito (por exemplo, a célula T ou célula NK) ou uma população do mesmo, do sujeito ex vivo, com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em linfócitos (por exemplo, células T e/ou células NK), em que
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4579/5200
333/540 uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um ou mais (por exemplo, dois ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o dito contato facilita modificação genética e/ou transdução do linfócito (por exemplo, célula T ou célula NK) ou pelo menos alguns dos linfócitos (por exemplo, células T e/ou células NK) pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, um linfócito geneticamente modificado e/ou transduzido (por exemplo célula T e/ou célula NK).
[825] Em algumas modalidades do método fornecido imediatamente acima, o linfócito geneticamente modificado e/ou transduzido (por exemplo, célula T e/ou célula NK), ou população do mesmo, é introduzido no sujeito. Em algumas modalidades, o linfócito geneticamente modificado e/ou transduzido (por exemplo, célula T e/ou célula NK) ou população do mesmo, é submetido a 4 ou menos divisões de célula ex vivo antes de ser introduzido ou reintroduzido no sujeito. Em algumas modalidades, o linfócito (ou linfócitos) consiste em células T em repouso e/ou células NK em repouso que estão em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação por entre 1 hora e 12 horas. Em algumas modalidades, não mais de 8 horas passam entre o momento em que o sangue é coletado do sujeito e o momento em que as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são reintroduzidas no sujeito. Em algumas modalidades, todas as etapas após o sangue ser coletado e antes que o sangue seja reintroduzido são realizadas em um sistema fechado em que uma pessoa monitora o sistema fechado ao longo do processamento.
[826] E fornecida, no presente documento, em outro aspecto, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada compreendendo:
a. uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA; e
b. um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que a dita uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras
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334/540 de RNA e a CAR são codificadas por sequências de ácido nucleico que são modificações genéticas da célula T e/ou célula NK.
[827] Em algumas modalidades do aspecto de célula T e/ou célula NK geneticamente modificada, a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada também compreende pelo menos um elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora, em que o dito elemento linfoproliferativo é codificado por um ácido nucleico que é uma modificação genética da célula T e/ou célula NK. Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA, a CAR e/ou o pelo menos um elemento linfoproliferativo são expressos em uma matéria policistrônica. Em modalidades ilustrativas, as moléculas inibidoras de RNA são expressas a partir de uma transcrição policistrônica única.
[828] E fornecida, no presente documento, em outro aspecto, uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação para uso em um método para modificar geneticamente um linfócito de um sujeito, para tratar o crescimento tumoral, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o método compreende o contato com uma célula T e/ou célula NK do sujeito ex vivo, e o dito contato facilita a transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada.
[829] No método para modificar geneticamente um linfócito de um sujeito aspecto fornecido imediatamente acima, em algumas modalidades, um agente farmacológico é usado no método, que inclui adicionalmente introduzir a célula T e/ou uma célula NK geneticamente modificada no sujeito.
[830] E fornecida, no presente documento, em outro aspecto, uma partícula de
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335/540 retrovirus recombinante incompetente em replicação para uso em um método para modificar geneticamente uma célula T e/ou célula NK de um sujeito, para tratar o crescimento tumoral, em que o método compreende:
a. colocai' a célula T e/ou célula NK do sujeito ex vivo, em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionada contra um ou mais alvos de RNA e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o dito contato facilita transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada; e
b. introduzir a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada no sujeito, modificando geneticamente, assim, a célula T e/ou célula NK do sujeito.
[831] No aspecto fornecido imediatamente acima, em algumas modalidades, uma população de células T e/ou células NK são colocadas em contato na etapa de contato, e introduzidas no sujeito na etapa de introdução.
[832] E fornecido, no presento documento, em outro aspecto, o uso de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação na fabricação de um kit para modificar geneticamente uma célula T e/ou célula NK de um sujeito, em que o uso do kit compreende:
1. colocar a célula T e/ou célula NK do sujeito ex vivo, em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico
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336/540 codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionada contra um ou mais alvos e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o dito contato facilita transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada; e
2. introduzir a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada no sujeito, modificando geneticamente, assim, a célula T e/ou célula NK do sujeito.
[833] E fornecido, no presento documento, em outro aspecto, o uso de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação na fabricação de um medicamento para modificar geneticamente uma célula T e/ou célula NK de um sujeito, em que o uso do medicamento compreende:
A) colocar a célula T e/ou célula NK do sujeito ex vivo, em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionada contra um ou mais alvos e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em que o dito contato facilita transdução de pelo menos algumas das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada; e
B) introduzir a célula T e/ou célula NK geneticamente modificada no sujeito, modificando geneticamente, assim, a célula T e/ou célula NK do sujeito.
[834] E fornecido, no presento documento, em outro aspecto, um recipiente
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337/540 comercial que contém a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação e instruções para o uso da mesma para tratar o crescimento tumoral em um sujeito, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo nas células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionada contra um ou mais alvos de RNA e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[835] Em algumas modalidades, nos aspectos do recipiente comercial, as instruções instruem um usuário a colocar em contato uma célula T e/ou célula NK do sujeito ex vivo, para facilitar a transdução de pelo menos uma célula T e/ou célula NK em repouso do sujeito pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, uma célula T e/ou célula NK geneticamente modificada.
[836] Em qualquer um dos aspectos do fornecidos no presente documento que incluem um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, o polinucleotídeo pode incluir adicionalmente uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos um elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser uma citocina ou receptor de citocina polipeptídeo ou um fragmento do mesmo compreendendo um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, o elemento linfoproliferativo é constitutivamente ativo. Em certas modalidades, o elemento linfoproliferativo pode ser um receptor de IL-7 ou um
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338/540 fragmento do mesmo. Em modalidades ilustrativas, o elemento linfoproliferativo pode ser um receptor de IL-7 constitutivamente ativo ou um fragmento constitutivamente ativo do mesmo.
[837] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos de RNA, uma molécula de RNA inibidora pode, em algumas, modalidades, incluir uma fita 5 ’ e uma fita 3’ que são parcial ou totalmente complementares uma à outra, em que a dita fita 5' e a dita fita 3' são capazes de formar um dúplex de RNA de 18 a 25 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a fita 5' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento e a fita 3' pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita 5' e a fita 3' pode ter comprimentos iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, a dúplex de RNA pode incluir uma ou mais incompatibilidades. Em modalidades alternadas, o dúplex de RNA não tem incompatibilidades.
[838] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos de RNA, pode ser uma molécula de RNA inibidora pode ser a miRNA. Em algumas modalidades, a molécula inibidora pode ser um precursor de um miRNA como, por exemplo, um Pri-miRNA ou um Pre-miRNA ou um precursor de um shRNA. Em algumas modalidades, a molécula inibidora pode ser um miRNA ou shRNA artificialmente derivado. Em outras modalidades, a molécula de RNA inibidora pode ser um dsRNA (transcrito ou artificialmente introduzido) que é processado em um siRNA ou o siRNA em si. Em algumas modalidades, a molécula de RNA inibidora pode ser um miRNA ou shRNA que tem uma sequência que não é encontrada na natureza, ou tem pelo menos um segmento funcional que não é encontrada natureza ou tem uma combinação de segmentos funcionais que não são encontrados na natureza. Em modalidades ilustrativas, pelo menos uma ou todas as moléculas inibidoras de RNA são miR-155.
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339/540 [839] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos de RNA, em algumas modalidades, pode compreender de orientação 5’ a 3’: um braço 5’, uma haste 5’, um laço, uma haste 3’ que é parcial ou totalmente complementar à dita haste 5' e um braço 3 ’. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas inibidoras de RNA tem essa disposição. Em outras modalidades, todas as duas ou mais moléculas de RNA inibidoras têm essas disposições. Em algumas modalidades, a haste 5' pode ter 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a haste 3' pode ter 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o laço pode ter 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,2 5, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o braço 5’, o braço 3’, ou ambos, são derivados de um miRNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o braço 5’, braço 3’, ou ambos, são derivados de um miRNA de ocorrência natural que é selecionado a partir do grupo que consiste em: miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122 e miR-21. Em modalidades ilustrativas, o braço 5’, braço 3’, ou ambos, são derivados de miR-155. Em algumas modalidades, o braço 5’, braço 3’ ou ambos são derivados de miR-155 de Mus musculus ou miR-155 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, o braço 5' tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:256 ou é uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, uma sequência que é igual ao comprimento como SEQ ID NO:256, ou 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 50% desde que SEQ ID NO: 256 ou é 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:256. Em algumas modalidades, o braço 3' tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:260 ou é uma variante funcional da mesma, como, por exemplo, igual ao comprimento como SEQ ID
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NO:260, ou 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 50% desde que SEQ ID NO: 260 ou é uma sequência que tem 100 nucleotídeos ou menos, 95 nucleotídeos ou menos, 90 nucleotídeos ou menos, 85 nucleotídeos ou menos, 80 nucleotídeos ou menos, 75 nucleotídeos ou menos, 70 nucleotídeos ou menos, 65 nucleotídeos ou menos, 60 nucleotídeos ou menos, 55 nucleotídeos ou menos, 50 nucleotídeos ou menos, 45 nucleotídeos ou menos, 40 nucleotídeos ou menos, 35 nucleotídeos ou menos, 30 nucleotídeos ou menos ou 25 nucleotídeos ou menos; e é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a SEQ ID NO:260. Em algumas modalidades, o braço 3' compreende os nucleotídeos 221 a 283 do Mus musculus BIC.
[840] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA, em algumas modalidades, podem ser posicionadas na primeira sequência de ácidos nucleicos em série. Em algumas modalidades, as moléculas inibidoras de RNA podem ser adjuntas uma à outra direta ou indiretamente por sequência (ou sequências) de aglutinante não funcional. Em algumas modalidades, as sequências de aglutinante podem ser entre 5 e 120 nucleotídeos de comprimento ou entre 10 e 40 nucleotídeos de comprimento.
[841] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica duas a quatro moléculas inibidoras de RNA. Em modalidades ilustrativas, entre 2 e 10, 2 e 8, 2 e 6, 2 e 5, 2 e 4, 3 e 5 ou 3 e 6 moléculas inibidoras de RNA são incluídos na primeira sequência de ácidos nucleicos. Em uma modalidade ilustrativa, quatro moléculas inibidoras de RNA são incluídas na primeira sequência de ácidos nucleicos.
[842] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de
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341/540 modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra uma ou mais alvos de RNA, a uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA podem ser em um íntron. Em algumas modalidades, o íntron está em um promotor. Nas modalidades ilustrativas, o íntron é íntron A EF-lalfa. Em algumas modalidades, o íntron é adjacente a e a jusante de um promotor que, nas modalidades ilustrativas, é inativo em uma célula de empacotamento usada para produzir a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
[843] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica duas ou mais moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA, em algumas modalidades, podem ser direcionadas contra alvos diferentes. Em uma modalidade alternada, as duas ou mais moléculas inibidoras de RNA são direcionados contra o mesmo alvo. Em algumas modalidades, os alvos de RNA são mRNAs transcritos de genes que são expressados por células T como, mas sem limitações, PD-1 (prevenir inativação); CTLA4 (prevenir inativação); TCRa (segurança - prevenir autoimunidade); TCRb (segurança - prevenir autoimunidade); CD3Z (segurança - prevenir autoimunidade); SOCS1 (prevenir inativação); SMAD2 (prevenir inativação); um alvo de miR-155 (promover ativação); IFN gama (reduzir CRS); cCBL (prolongar sinalização); TRAIL2 (prevenir morte); PP2A (prolongar sinalização); ABCG1 (aumentar teor de microdomínio de colesterol através da limitação da liberação de colesterol). Em algumas modalidades, os alvos de RNA são mRNAs transcritos a partir de genes que codificam componentes do complexo de receptor de célula T (TCR). Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre duas ou mais das moléculas inibidoras de RNA pode diminuir a expressão de receptores de célula T, em modalidades ilustrativas, um ou mais receptor (ou receptores) de célula T endógeno de uma célula T. Em certas modalidades, o alvo de RNA pode ser mRNA transcrito do gene de TCRa ou Τ€’Ρβ endógeno da célula T cujo genoma compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica o um ou mais
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342/540 miRNAs. Em modalidades ilustrativas, o alvo de RNA é mRNA transcrito do gene de TCRa.
[844] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que incluem um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, em algumas modalidades, o CAR é um CAR biológico restrito ao microambiente (MRB). Em outras modalidades, o ASTR do CAR se liga a um antígeno associado ao tumor. Em outras modalidades, o ASTR do CAR é um ASTR biológico restrito ao microambiente (MRB).
[845] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que incluem um polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas inibidoras de RNA direcionadas contra um ou mais alvos de RNA, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular e, em alguns casos, uma terceira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam pelo menos um elemento linfoproliferativo que não é uma molécula de RNA inibidora, em algumas modalidades, qualquer uma ou todas dentre a primeira sequência de ácidos nucleicos, a segunda sequência de ácidos nucleicos e a terceira sequência de ácidos nucleicos é operacionalmente ligada a um riboswitch. Em algumas modalidades, o riboswitch é capaz de se ligar a um análogo de nucleosídeo. Em algumas modalidades, o análogo de nucleosídeo é um fármaco antiviral.
[846] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em algumas
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343/540 modalidades, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um elemento de pseudotipagem em sua superfície que é capaz de se ligar a uma célula T e/ou célula NK e facilitar a fusão de membrana da partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação ao mesmo. Em algumas modalidades, o elemento de pseudotipagem pode ser um polipeptídeo F do Vírus do Sarampo, um polipeptídeo H do Vírus do Sarampo, um polipeptídeo de VSV-G ou um fragmento de qualquer um dos mesmos que retém a capacidade para se ligar às células T em repouso e/ou células NK em repouso. Em modalidades ilustrativas, o elemento de pseudotipagem é VSV-G.
[847] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em algumas modalidades, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um elemento de ativação em sua superfície que compreende um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3; e/ou um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga e/ou um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 é um scFV antiCD3 ou scFvFc anti-CD3. Em modalidades ilustrativas, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 é scFvFc anti-CD3. Em modalidades ilustrativas, o polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28 é CD80 ou um domínio extracelular do mesmo, ligado a uma sequência de ligação de âncora de GPI de CD16B.
[848] Em qualquer um dos aspectos fornecidos no presente documento que inclui uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em algumas modalidades, a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende em sua superfície um ácido nucleico que codifica um domínio reconhecido por um agente biológico aprovado para anticorpo monoclonal.
[849] Os polipeptídeos quiméricos nos aspectos fornecidos doravante que incluem um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, por exemplo, células B, células T e/ou células NK, podem ser chamados, no presente documento, de elementos linfoproliferativos quiméricos (CLEs). As modalidades fornecidas doravante que incluem as
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344/540 sequências de ácido nucleico que codificam um CLE e um CAR são chamadas no presente documento de modalidades de polinucleotídeo de CAR de CLE.
[850] Em modalidades e submodalidades de qualquer um dos aspectos e modalidades fornecidas no presente documento que incluem um elemento linfoproliferativo, incluindo aquelas nos parágrafos acima nesta seção, o elemento linfoproliferativo pode ser qualquer um dos elementos linfoproliferativos quiméricos fornecidos no presente documento, incluindo doravante nesta seção. Em outras modalidades e submodalidades de qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento que incluem uma CAR, o elemento linfoproliferativo em certas modalidades ilustrativas é qualquer um dos elementos linfoproliferativos quiméricos codificados por ácidos nucleicos em polinucleotídeo de CAR de CLE (e polipeptídeo associado) modalidades fornecidas no presente documento, por exemplo, como apontado doravante nesta seção.
[851] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio extracelular e transmembranar de um receptor de citocina ou um receptor de hormônio, em que pelo menos um dentre o domínio extracelular e o domínio transmembranar compreende
a. uma mutação que é encontrada em um mutante constitutivamente ativo do receptor de citocina e em que a sequência extracelular não se liga a um ligante do receptor de citocina, ou
b. um domínio extracelular e um domínio transmembranar de LMP1; e
b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de um gene que tem um primeiro domínio intracelular de um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 7 a 10, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de células B, células T e/ou células NK.
[852] Em uma modalidade do aspecto no parágrafo imediatamente acima, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um segundo domínio intracelular,
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345/540 em que o segundo domínio intracelular pode ser a montante (isto é, 5’) do primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é a jusante do primeiro domínio intracelular. Em uma submodalidade desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular compreende a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado. Consequentemente, visando o esclarecimento, em uma modalidade exemplificativa não limitante, o polipeptídeo selecionado é M008-S212-S075. Em tal modalidade, o primeiro domínio intracelular do polipeptídeo quimérico compreende ou é variante 1 de transcrição de TNFRSF8 (NM_001243_4) (S212) e i segundo polipeptídeo compreende ou é FCGR2C (NM_201563_5) (S075).
[853] Em uma modalidade desse aspecto, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado. Em uma modalidade desse aspecto, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado. Consequentemente, visando o esclarecimento, em uma modalidade exemplificativa não limitante, o polipeptídeo selecionado é M008-S212-S075. Em tal modalidade, o domínio extracelular e transmembranar do polipeptídeo quimérico compreende ou é Myc LMP1 (NC_007605_l) (M008), o primeiro domínio intracelular do polipeptídeo quimérico compreende ou é a variante 1 de transcrição de TNFRSF8 (NM_001243_4) (S212) e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo quimérico compreende ou é FCGR2C (NM_201563_5) (S075). Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, exceto pelo fato de que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação, ou não compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto pelo fato de que o domínio extracelular e transmembranar compreende um domínio de reconhecimento ou de eliminação do polipeptídeo selecionado, ou outra etiqueta de liberação. Em outra modalidade do aspecto fornecido no parágrafo acima, o
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346/540 primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular combinação compreende um primeiro domínio intracelular do polipeptídeo selecionado com qualquer domínio intracelular de qualquer gene identificado nos segundos domínios intracelulares de qualquer polipeptídeo candidato nas tabelas 7 a 10.
[854] Em outra modalidade deste aspecto, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em uma submodalidade desse aspecto, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular são a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10. Em outra submodalidade desta modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação, e em que o domínio de reconhecimento ou eliminação é um domínio de reconhecimento ou eliminação do domínio extracelular do polipeptídeo selecionado, ou outro domínio de reconhecimento ou eliminação, e em que o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10.
[855] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio extracelular e transmembranar de um receptor de citocina ou um hormônio, em que pelo menos um dentre o domínio extracelular e o domínio transmembranar compreende
c. uma mutação que é encontrada em um mutante constitutivamente ativo do receptor de
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347/540 citocina e em que a sequência extracelular não se liga a um ligante do receptor de citocina, ou
d. um domínio extracelular e um domínio transmembranar de LMP1; e
b) um primeiro domínio intracelular selecionado a partir de um domínio intracelular de CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, TNFRSF9, IL31RA ou MyD88, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas, de células B, células T e/ou células NK.
[856] Em uma modalidade do aspecto no parágrafo imediatamente acima, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um segundo domínio intracelular, em que o segundo domínio intracelular pode ser a montante (isto é, 5’) do primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é a jusante do primeiro domínio intracelular. Em uma submodalidade desta modalidade, o segundo domínio intracelular é de um gene de um segundo domínio intracelular em um polipeptídeo selecionado identificado em qualquer tabela do Exemplo 17 como produzindo um enriquecimento no dia 35 versus o dia 7 acima 0, 1 ou 2, em que o primeiro domínio intracelular é do gene do primeiro domínio intracelular do polipeptídeo selecionado. Em uma submodalidade adicional dessa submodalidade ou modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular são o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular de um polipeptídeo quimérico selecionado identificado em qualquer tabela do Exemplo 17 como rendendo um enriquecimento no dia 35 versus no dia 7 acima 0, 1 ou 2. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um primeiro gene de um primeiro domínio intracelular selecionado de um polipeptídeo selecionado nas tabelas 7 a 10 e o segundo domínio intracelular é de um segundo gene de um segundo domínio intracelular selecionado do polipeptídeo selecionado. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um polipeptídeo selecionado nas tabelas 7 a 10 e o segundo domínio intracelular é do polipeptídeo selecionado nas tabelas 7 a 10.
[857] Em outra submodalidade das modalidades imediatamente acima em que a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um segundo domínio
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348/540 intracelular, o segundo domínio intracelular é selecionado a partir de um segundo domínio intracelular identificado em qualquer uma das tabelas do Exemplo 17 como produzindo um enriquecimento no dia 35 versus no dia 7 acima 0, 1 ou 2, para o primeiro domínio intracelular correspondente. Nas submodalidades dessas modalidades, o primeiro domínio intracelular é selecionado a partir de um domínio intracelular de CD27, CD40 ou CD79B. Em outras submodalidades desta modalidade, o primeiro domínio intracelular é selecionado a partir de um domínio intracelular de CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, TNFRSF9, IL31RA ou MyD88 identificado em qualquer uma das tabelas do Exemplo 17 como produzindo um enriquecimento no dia 35 versus no dia 7 acima 0, 1 ou 2. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um primeiro gene de um polipeptídeo quimérico selecionado nas tabelas 7 a 10 e o segundo domínio intracelular é de um segundo gene do polipeptídeo quimérico selecionado nas tabelas 7 a 10. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades neste parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um primeiro gene de um polipeptídeo quimérico selecionado nas tabelas 7 a 10 e o segundo domínio intracelular é de um domínio intracelular de CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS, IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9 e TNFRSF18. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 7 a 10 e o segundo domínio intracelular é do polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 7 a 10. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende uma etiqueta de liberação, ou não compreende uma etiqueta de liberação e em que o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto que o domínio extracelular e transmembranar compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação do polipeptídeo selecionado, ou outro domínio de reconhecimento ou eliminação, e em que o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10.
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349/540 [858] Em outra modalidade deste aspecto, o primeiro domínio intracelular é selecionado de um domínio intracelular de CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8 ou TNFRSF9, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em uma submodalidade desse aspecto, o primeiro domínio intracelular é de um gene do primeiro domínio intracelular do polipeptídeo selecionado e o segundo domínio intracelular é de um gene do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10. Em uma submodalidade desse aspecto, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular são a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10. Em outra submodalidade desta modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação, e em que o domínio de reconhecimento ou eliminação é um domínio de reconhecimento ou eliminação do domínio extracelular do polipeptídeo selecionado, ou outro domínio de reconhecimento ou eliminação, e em que o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 7 a 10.
[859] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi, (a) um domínio extracelular e transmembranar de um receptor de citocina ou um hormônio, em que pelo menos um dentre o domínio extracelular e o domínio transmembranar compreende
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i. uma mutação que é encontrada em um mutante constitutivamente ativo do receptor de citocina e em que a sequência extracelular não se liga a um ligante do receptor de citocina, ou ii. um domínio extracelular e um domínio transmembranar de LMP1; e (b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS, IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9 e TNFRSF18, em que o dito polipeptídeo quimérico promove proliferação celular de PBMCs e em modalidades ilustrativas de células B, células T e/ou células NK.
[860] No Exemplo 17, os domínios intracelulares mencionados na imediatamente aspecto acima foram identificados como notórios segundos domínios intracelulares. Entretanto, será entendido que em algumas modalidades, domínios intracelulares identificados como segundos domínios intracelulares notáveis são primeiros domínios intracelulares do polipeptídeos quiméricos dessas modalidades.
[861] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio extracelular e transmembranar de um receptor de citocina ou um hormônio, em que pelo menos um dentre o domínio extracelular e o domínio transmembranar compreende
a. uma mutação que é encontrada em um mutante constitutivamente ativo do receptor de citocina e em que a sequência extracelular não se liga a um ligante do receptor de citocina, ou
b. um domínio extracelular e um domínio transmembranar de LMP1; e
b) um primeiro domínio intracelular selecionado a partir de um domínio intracelular de CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, TNFRSF9, IL31RA ou MyD88.
em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e, em
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351/540 modalidades ilustrativas de células B, células T e/ou células NK, e em que o domínio extracelular e transmembranar é selecionado a partir do domínio extracelular e do domínio transmembranar de IL7RA Ins PPCL, LMP1, CRLF2 F232C, CSF2RB V449E, CSF3R T640N, EPOR L251C I252C, GHR E260C I270C, IL27RA F523C e MPL S505N.
[862] Em certas modalidades de qualquer um dos aspectos acima direcionados a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo quimérico em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e em modalidades ilustrativas de células B, células T e/ou células NK, o domínio extracelular e domínio transmembranar são selecionados de CSF3R T640N e MPL S505N. Em modalidades ilustrativas, o domínio extracelular e o domínio transmembranar são de CSF3R T640N e em certas submodalidades, o polinucleotídeo isolado não compreende um CAR. Em certas submodalidades, o domínio extracelular e o domínio transmembranar são CSF3R T640N fornecidos na Tabela 6 exceto que o domínio de reconhecimento e eliminação é opcional. Em certas modalidades, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular são de qualquer um dos polipeptídeos fornecidos no Exemplo 17, e as tabelas no mesmo, que incluem um domínio intracelular e extracelular mencionado e um primeiro domínio intracelular mencionado. Em outras submodalidades, o domínio extracelular e transmembranar são de MPL S505N e, em certas modalidades, o domínio extracelular e o domínio transmembranar de MPL S505N fornecido na Tabela 6 exceto que o domínio de reconhecimento e eliminação é opcional.
[863] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar tipo I; e
b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de um gene que tem um primeiro domínio intracelular de um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 11 a 16, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de células B, células T e/ou células NK.
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352/540 [864] em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas de células B, células T e/ou células NK. Como mostrado no Exemplo anexo 18, tais polipeptídeos quiméricos são capazes de promover a proliferação celular de PBMCs na ausência de exposição ex vivo das PBMCs para IL-2 durante a cultura, por exemplo, na ausência de adição de IL-2 ao meio de cultura de PBMCs (por exemplo, células B, células T ou células NK) que expressam um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo quimérico.
[865] Em uma modalidade do aspecto no parágrafo imediatamente acima e qualquer modalidade deste aspecto no presente documento abaixo dessa seção, o primeiro domínio intracelular é um domínio intracelular de um gene que tem um primeiro domínio intracelular nas tabelas 11 a 16, e em outras modalidades ilustrativas, um dos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados nas tabelas 11 a 16, e nas modalidades adicionalmente ilustrativas, um dos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados em duas, três, quatro, ou cinco de seis tabelas de, ou todas as tabelas 11 a 16. Em uma modalidade, o primeiro domínio intracelular é um domínio intracelular identificado na Tabela 17. A Tabela 17 identifica construtos que promovem a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o dia 21 ou o dia 35, em que um segundo domínio intracelular não estava presente no construto. Em algumas submodalidades desta modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende uma combinação de domínio transmembranar e domínio intracelular, com ou sem um domínio extracelular compreendendo um motivo de dimerização, de Tabela 17.
[866] Em uma modalidade do aspecto no parágrafo imediatamente acima e qualquer modalidade desse aspecto no presente documento abaixo nessa seção, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um domínio extracelular, e em modalidades ilustrativas, o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização. Em quaisquer aspectos ou modalidades em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o motivo de dimerização pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: um polipeptídeo contendo motivo de zíper de leucina, CD69, CD71, CD72, CD96, Cdl05, Cdl61, Cdl62, Cd249, CD271 e Cd324, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos que retêm a capacidade para dimerizar. Em qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento, em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o motivo de dimerização pode exigir um agente de dimerização e o motivo de
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353/540 dimerização e o agente de dimerização associado pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: FKBP e rapamicina ou análogos dos mesmos, GyrB e cumermicina ou análogos dos mesmos, DHFR e metotrexato ou análogos dos mesmos ou DmrB e AP20187 ou análogos dos mesmos, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos das proteínas de dimerização mencionadas que retêm a capacidade para dimerizar.
[867] Em modalidades ilustrativas de quaisquer aspectos ou modalidades no presente documento em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o domínio extracelular pode compreender um motivo de zíper de leucina. Em algumas modalidades, o motivo de zíper de leucina é de um polipeptídeo jun, por exemplo, c-jun. Em certas modalidades, o polipeptídeo c-jun é a região de polipeptídeo c-jun de ECD-11.
[868] Em uma modalidade deste aspecto, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um segundo domínio intracelular, em que o segundo domínio intracelular pode ser a montante (isto é, 5’) do primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é a jusante do primeiro domínio intracelular. Em uma submodalidade desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular compreende um primeiro domínio intracelular do polipeptídeo selecionado com qualquer domínio intracelular de qualquer gene identificado nos segundos domínios intracelulares de qualquer polipeptídeo candidato nas tabelas 11 a 16, e em modalidades ilustrativas nas tabelas 11 a 16, e em outras modalidades ilustrativas, um dos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados nas tabelas 11 a 16 e nas modalidades adicionalmente ilustrativas, um dentre os primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados em duas, três, quatro ou cinco das tabelas de, ou todas as tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular compreende a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado.
[869] Em uma modalidade desse aspecto, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado. Em uma modalidade desse aspecto, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, em que o domínio extracelular opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação.
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Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, exceto pelo fato de que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação, ou não compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto pelo fato de que o domínio extracelular e transmembranar compreende um domínio de reconhecimento ou de eliminação do polipeptídeo selecionado, ou outro domínio de reconhecimento ou eliminação.
[870] Em outra modalidade deste aspecto, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em uma submodalidade desse aspecto, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular são a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 11 a 16, e em outras modalidades ilustrativas um dos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados nas tabelas 11 a 16, e em modalidades adicionalmente ilustrativas, um dos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados em duas, três, quatro, ou cinco das tabelas de, ou todas as tabelas 11 a 16. Em outra submodalidade desta modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular, e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 11 a 16, ou em modalidades ilustrativas em um dos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados nas tabelas 11a 16 e, em modalidades adicionalmente ilustrativas, um dos primeiros 50, 25 ou 10 construtos listados em duas, três, quatro ou cinco das tabelas de, ou todas as tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento e eliminação, e em que o domínio de reconhecimento
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355/540 ou eliminação é um domínio de reconhecimento ou eliminação do domínio extracelular do polipeptídeo selecionado, ou outro domínio de reconhecimento ou eliminação, e em que o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 11 a 16.
[871] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar tipo I; e
b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R ou CSF2RA, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas de células B, células T e/ou células NK.
[872] Em uma modalidade do aspecto no parágrafo imediatamente acima e qualquer modalidade desse aspecto no presente documento abaixo nessa seção, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um domínio extracelular, e em modalidades ilustrativas, o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização. Em modalidades ilustrativas desse aspecto, o domínio extracelular compreende um zíper de leucina. Em algumas modalidades, o zíper de leucina é de um polipeptídeo jun, por exemplo, c-jun. Em certas modalidades, o polipeptídeo c-jun é a região de polipeptídeo c-jun de ECD-11.
[873] Em outra modalidade desse aspecto em que o primeiro domínio intracelular é selecionado de um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R ou CSF2RA, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um segundo domínio intracelular, em que o segundo domínio intracelular pode ser a montante (isto é, 5’) do primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é a jusante do primeiro domínio intracelular. Em uma submodalidade desta modalidade, o segundo domínio intracelular é de um gene de um segundo domínio intracelular em um polipeptídeo selecionado identificado em qualquer tabela do Exemplo 18 como produzindo um enriquecimento no dia 21 versus o dia 7 acima 0, 1 ou 2, em que o primeiro domínio intracelular é do gene do primeiro domínio intracelular do polipeptídeo
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356/540 selecionado. Em uma submodalidade adicional dessa submodalidade ou modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular são o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular de um polipeptídeo quimérico selecionado identificado em qualquer tabela do Exemplo 18 como rendendo um enriquecimento no dia 21 versus no dia 7 acima 0, 1 ou 2. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um primeiro gene de um primeiro domínio intracelular selecionado de um polipeptídeo selecionado nas tabelas 11 a 16 e o segundo domínio intracelular é de um segundo gene de um segundo domínio intracelular selecionado do polipeptídeo selecionado. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um polipeptídeo selecionado nas tabelas 11 a 16 e o segundo domínio intracelular é do polipeptídeo selecionado. Em outra modalidade deste aspecto ou qualquer modalidade no presente documento, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[874] Em uma modalidade do aspecto e uma submodalidade ou submodalidade adicional das modalidades e submodalidades no parágrafo imediatamente anterior que compreende um segundo domínio intracelular, o primeiro domínio intracelular é um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2 e MPL. Em outra modalidade, o primeiro domínio intracelular é um domínio intracelular de LEPR, IFNAR2 e MPL. Em outra modalidade, o primeiro domínio intracelular é diferente de MyD88. Em outra modalidade, o primeiro domínio intracelular é diferente de MyD88 e o segundo domínio intracelular é diferente de CD40. Em uma submodalidade dessas modalidades nesse parágrafo, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[875] Em uma modalidade desse aspecto da invenção, MPL é o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular é de um gene de um segundo domínio intracelular em um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade adicional desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do
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357/540 segundo domínio intracelular compreende um primeiro domínio intracelular e um segundo domínio intracelular de um polipeptídeo quimérico selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em algumas submodalidades dessas modalidades, a orientação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular é inversa de modo que o resíduo terminal carbóxi do segundo domínio seja ligado ao primeiro domínio ou a um espaçador entre o segundo domínio e o primeiro domínio.
[876] Em uma modalidade desse aspecto da invenção, LEPR é o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular é de um gene de um segundo domínio intracelular em um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade adicional desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular compreende um primeiro domínio intracelular e um segundo domínio intracelular de um polipeptídeo quimérico selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em algumas submodalidades dessas modalidades, a orientação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular é inversa de modo que o resíduo terminal carbóxi do segundo domínio seja ligado ao primeiro domínio ou a um espaçador entre o segundo domínio e o primeiro domínio.
[877] Em uma modalidade desse aspecto da invenção, IFNAR2 é o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular é de um gene de um segundo domínio intracelular em um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade adicional desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular compreende um primeiro domínio intracelular e um segundo domínio intracelular de um polipeptídeo quimérico selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em algumas submodalidades dessas modalidades, a orientação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular é inversa de modo que o resíduo terminal carbóxi do segundo domínio seja ligado ao primeiro domínio ou a um espaçador entre o segundo domínio e o primeiro domínio.
[ 87 8 ] Em uma modalidade desse aspecto da invenção, MyD88 é o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular é de um gene de um segundo domínio intracelular em um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade adicional desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do
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358/540 segundo domínio intracelular compreende um primeiro domínio intracelular e um segundo domínio intracelular de um polipeptídeo quimérico selecionado identificado nas tabelas 11 a 16. Em algumas submodalidades dessas modalidades, a orientação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular é inversa de modo que o resíduo terminal carbóxi do segundo domínio seja ligado ao primeiro domínio ou a um espaçador entre o segundo domínio e o primeiro domínio.
Em algumas modalidades dos aspectos de polinucleotídeo isolado acima em que o primeiro domínio intracelular é selecionado a partir do domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL, o domínio transmembranar é selecionado a partir de um domínio transmembranar de CD40, CD8B, CRLF2, CSF2RA, GCGR2C, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IL10RB, IL18R1, IL18RAP, IL3RA e PRLR. Em algumas modalidades ilustrativas, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar de CD40 ou ICOS. Em algumas submodalidades, o primeiro domínio intracelular é de LEPR, MYD88, IFNAR2 e MPL. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar de CD40 e o primeiro domínio intracelular é um domínio intracelular de MPL.
[879] Em algumas modalidades de aspectos de polinucleotídeo isolado acima, em que o primeiro domínio intracelular é selecionado a partir de um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL, o segundo domínio intracelular é de CD40, CD79B ou CD27. Em algumas submodalidades, o primeiro domínio intracelular é de LEPR, MYD88, IFNAR2 e MPL. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro domínio intracelular é MPL e o segundo domínio intracelular é CD40. Em todas as modalidades nesse parágrafo, a ordem do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular no polipeptídeo pode ser invertida.
[880] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar tipo I; e
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b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de um gene que tem um primeiro domínio intracelular de um polipeptídeo selecionado identificado nas tabelas 11 a 16, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de células B, células T e/ou células NK.
em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas de células B, células T e/ou células NK. Em algumas modalidades, as células NK são células NKT.
[881] Em uma modalidade do aspecto no parágrafo imediatamente acima e qualquer modalidade desse aspecto no presente documento abaixo nessa seção, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um domínio extracelular, e em modalidades ilustrativas, o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização. Em quaisquer aspectos ou modalidades em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o motivo de dimerização pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: um polipeptídeo contendo motivo de zíper de leucina, CD69, CD71, CD72, CD96, Cdl05, Cdl61, Cdl62, Cd249, CD271 e Cd324, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos que retêm a capacidade para dimerizar. Em qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento, em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o motivo de dimerização pode exigir um agente de dimerização e o motivo de dimerização e o agente de dimerização associado pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: FKBP e rapamicina ou análogos dos mesmos, GyrB e cumermicina ou análogos dos mesmos, DHFR e metotrexato ou análogos dos mesmos ou DmrB e AP20187 ou análogos dos mesmos, assim como mutantes e/ou fragmentos ativos das proteínas de dimerização mencionadas que retêm a capacidade para dimerizar.
[882] Em modalidades ilustrativas de quaisquer aspectos ou modalidades no presente documento em que o domínio extracelular de um CLE compreende um motivo de dimerização, o domínio extracelular pode compreender um motivo de zíper de leucina. Em algumas modalidades, o motivo de zíper de leucina é de um polipeptídeo jun, por exemplo, c-jun. Em certas modalidades, o polipeptídeo c-jun é a região de polipeptídeo c-jun de ECD-11.
[883] Em uma modalidade deste aspecto, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um segundo domínio intracelular, em que o segundo domínio
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360/540 intracelular pode ser a montante (isto é, 5’) do primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é a jusante do primeiro domínio intracelular. Em uma submodalidade desta modalidade, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular combinação compreende um primeiro domínio intracelular do polipeptídeo selecionado com qualquer domínio intracelular de qualquer gene identificado nos segundos domínios intracelulares de qualquer polipeptídeo candidato nas tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade desta modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular compreende a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado.
[884] Em uma modalidade desse aspecto, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado. Em uma modalidade desse aspecto, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, em que o domínio extracelular opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação.
[885] Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, exceto pelo fato de que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação, ou não compreende um domínio de reconhecimento ou eliminação. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto pelo fato de que o domínio extracelular e transmembranar compreende um domínio de reconhecimento ou de eliminação do polipeptídeo selecionado, ou outro domínio de reconhecimento ou eliminação.
[886] Em outra modalidade deste aspecto, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em uma submodalidade desse aspecto, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4607/5200
361/540 são a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado, e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 11 a 16. Em outra submodalidade desta modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado e o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 11 a 16. Em uma submodalidade relacionada, o polipeptídeo quimérico compreende o domínio extracelular e transmembranar, o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular do polipeptídeo selecionado exceto que o domínio extracelular e transmembranar opcionalmente compreende um domínio de reconhecimento e eliminação, e em que o domínio de reconhecimento ou eliminação é um domínio de reconhecimento ou eliminação do domínio extracelular do polipeptídeo selecionado, ou outro domínio de reconhecimento ou eliminação, e em que o polipeptídeo selecionado é identificado nas tabelas 11 a 16.
[887] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, em que:
uma primeira sequência de ácidos nucleicos da uma ou mais sequências de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico que compreende, na orientação de amino para carbóxi,
a) um domínio transmembranar de uma proteína transmembranar tipo I; e
b) um primeiro domínio intracelular selecionado de um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL, em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas de células B, células T e/ou células NK.
[888] Em uma modalidade do aspecto no parágrafo imediatamente acima e qualquer modalidade desse aspecto no presente documento abaixo nessa seção, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um domínio extracelular, e em modalidades ilustrativas, o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização. Em modalidades ilustrativas desse aspecto, o domínio extracelular compreende um zíper de leucina. Em algumas modalidades, o zíper de leucina é de um polipeptídeo jun, por exemplo, c-jun. Em certas modalidades, o polipeptídeo c-jun é a região de polipeptídeo c-jun de ECD-11.
[889] Em outra modalidade desse aspecto em que o primeiro domínio
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362/540 intracelular é selecionado de um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica adicionalmente um segundo domínio intracelular, em que o segundo domínio intracelular pode ser a montante (isto é, 5’) do primeiro domínio intracelular ou, em modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é a jusante do primeiro domínio intracelular. Em uma submodalidade desta modalidade, o segundo domínio intracelular é de um gene de um segundo domínio intracelular em um polipeptídeo selecionado identificado em qualquer tabela do Exemplo 18 como produzindo um enriquecimento no dia 21 versus o dia 7 acima 0, 1 ou 2, em que o primeiro domínio intracelular é do gene do primeiro domínio intracelular do polipeptídeo selecionado. Em uma submodalidade adicional dessa submodalidade ou modalidade, a combinação do primeiro domínio intracelular e do segundo domínio intracelular são o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular de um polipeptídeo quimérico selecionado identificado em qualquer tabela do Exemplo 18 como rendendo um enriquecimento no dia 21 versus no dia 7 acima 0, 1 ou 2. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um primeiro gene de um primeiro domínio intracelular selecionado de um polipeptídeo selecionado nas tabelas 11 a 16 e o segundo domínio intracelular é de um segundo gene de um segundo domínio intracelular selecionado do polipeptídeo selecionado. Em outra submodalidade da modalidade ou submodalidades nesse parágrafo, o primeiro domínio intracelular é de um polipeptídeo selecionado nas tabelas 11 a 16 e o segundo domínio intracelular é do polipeptídeo selecionado. Em outra modalidade deste aspecto ou qualquer modalidade no presente documento, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
[890] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos ou modalidades de polinucleotídeo isolado no presente documento que incluem um polipeptídeo quimérico em que o dito polipeptídeo quimérico promove proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas, de células B, células T e/ou células NK, o primeiro e/ou segundo domínio intracelular, em modalidades ilustrativas, o primeiro domínio intracelular, é um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R ou CSF2RA. Em algumas
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363/540 modalidades, o primeiro domínio intracelular é de MPL. Em submodalidades exemplificativos, o polipeptídeo quimérico compreende um domínio extracelular compreendendo um motivo de dimerização fornecido no presente documento.
[891] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos ou modalidades de polinucleotídeo isolado no presente documento que inclui um polipeptídeo quimérico em que o dito polipeptídeo quimérico promove a proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas, de células B, células T e/ou células NK, o domínio transmembranar é de CD40, ICOS, FCGR2C, PRLR, IL3RA ou IL6ST. Em algumas modalidades ilustrativas, o domínio transmembranar de CD40 ou ICOS. Em submodalidades exemplificativos, o polipeptídeo quimérico compreende um domínio extracelular compreendendo um motivo de dimerização fornecido no presente documento.
[892] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos ou modalidades de polinucleotídeo isolado no presente documento que incluem um polipeptídeo quimérico em que o dito polipeptídeo quimérico promove proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas, de células B, células T e/ou células NK, o segundo e/ou segundo domínio intracelular, em modalidades ilustrativas, o primeiro domínio intracelular, é um domínio intracelular de CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G ou CD27. Em algumas modalidades ilustrativas, o segundo domínio intracelular é de CD40, CD79B ou CD27. Em submodalidades exemplificativos, o polipeptídeo quimérico compreende um domínio extracelular compreendendo um motivo de dimerização fornecido no presente documento.
[893] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos ou modalidades de polinucleotídeo isolado no presente documento que incluem um polipeptídeo quimérico em que o dito polipeptídeo quimérico promove proliferação celular de PBMCs e, em modalidades ilustrativas, de células B, células T e/ou células NK, o primeiro e/ou segundo domínio intracelular, é um domínio intracelular (um elemento P3 ou P4) de qualquer um dos polipeptídeos quiméricos nas tabelas 11 a 16. Em algumas modalidades o polipeptídeo quimérico compreende qualquer P2, P3 e P4 combinação de qualquer um dos polipeptídeos quiméricos nas tabelas 11 a 16.
[894] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos e modalidades em que o domínio transmembranar é uma proteína transmembranar tipo I, o domínio transmembranar pode ser um receptor de citocina tipo I, um receptor de hormônio, um receptor de célula T ou um
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364/540 receptor de família de TNF. Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos e modalidades em que o polipeptídeo quimérico compreende um domínio extracelular e em que o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização, o domínio transmembranar pode ser um receptor de citocina tipo I, um receptor de hormônio, um receptor de célula T ou um receptor de família de TNF. Em submodalidades ilustrativas de qualquer uma dessas modalidades neste parágrafo, o primeiro domínio intracelular é selecionado de um domínio intracelular de LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL.
[895] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos e modalidades direcionadas para polinucleotídeos compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo quimérico que compreende um domínio extracelular, o domínio extracelular pode compreender um 1, 2, 3 ou 4 aminoácido espaçador a 20 aminoácidos da terminação carbóxi do domínio extracelular e em modalidades ilustrativas, na terminação carbóxi do domínio extracelular de modo que o espaçador separa o domínio extracelular e o domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o 1, 2, 3 ou 4 aminoácido espaçador compreende um resíduo de alanina e, em alguns casos, apenas resíduos de alanina. Em submodalidades ilustrativas para modalidades que compreendem o dito espaçador, o domínio extracelular compreende um motivo de dimerização, por exemplo, um motivo de zíper de leucina.
[896] Será entendido que o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular para qualquer aspecto e modalidade fornecida no presente documento que compreende um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK, pode incluir mutantes e/ou fragmentos dos genes mencionados fornecidos que o polipeptídeo quimérico retém sua capacidade para promover a proliferação celular de PBMCs células B, células T e/ou células NK. Esses mutantes e/ou fragmentos tipicamente retêm a atividade de sinalização de modo que o polipeptídeo quimérico retém sua atividade de promoção de sobrevivência e proliferação. Será entendido que o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular podem ser invertidos para qualquer aspecto e modalidade fornecido no presente documento que compreende um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK. Assim, será entendido nessa modalidade que o primeiro domínio intracelular é o segundo domínio intracelular e vice-versa.
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365/540 [897] Em qualquer um dos aspectos e modalidades fornecido no presente documento que compreende polinucleotídeos que incluem uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo quimérico que promove proliferação celular de PBMCs, células B, células T, e/ou células NK, a sequência de ácidos nucleicos pode codificar adicionalmente um domínio de reconhecimento ou eliminação. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento ou eliminação é um domínio de reconhecimento de um agente biológico aprovado para anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento ou eliminação compreende um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo que reconhece EGFR, ou um epítopo do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento ou eliminação compreende um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo que reconhece MYC, ou um epítopo do mesmo.
[898] Em qualquer um dos aspectos e modalidades fornecidas no presente documento que compreende polinucleotídeos que inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo quimérico que promove proliferação celular de PBMCs, células B, células T, e/ou células NK, a primeira sequência de ácidos nucleicos e/ou a segunda sequência de ácidos nucleicos pode ser ligada de modo operacional a um primeiro promotor ativo em células B, células T e/ou células NK. Em algumas modalidades ilustrativas, o primeiro promotor é ativo na célula T e/ou células NK.
[899] Em uma modalidade de qualquer dos aspectos de polinucleotídeo isolado e modalidades fornecidos no presente documento que tem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo quimérico que promove proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK, um aglutinante pode estar presente entre o domínio transmembranar e o primeiro domínio intracelular e/ou entre o primeiro domínio intracelular e o segundo domínio intracelular, para modalidades de polinucleotídeo que compreendem um segundo domínio intracelular. Em algumas modalidades, um aglutinante de entre 1 e 4 alaninas está presente entre o domínio extracelular e o domínio transmembranar para modalidades compreendendo um domínio extracelular.
[900] Em uma modalidade de qualquer um dentre o polinucleotídeo isolado ou os aspectos e modalidades de vetor fornecidos no presente documento que compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo quimérico que promove a
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366/540 proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos podem ser separadas por uma sequência de salto ribossômica. Em algumas modalidades, a sequência de salto ribossômica é F2A, E2A, P2A ou T2A.
[901] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos de polinucleotídeo isolado e modalidades fornecidas no presente documento que codificam um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK, o dito polinucleotídeo compreende adicionalmente um ou mais de uma sequência tipo Kozak, um elemento de WPRE e um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla, em que um ou mais dos códons de interrupção do códon de interrupção dupla ou o códon de interrupção tripla definem uma terminação de uma leitura da pelo menos uma da uma ou mais unidades transcricionais. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma sequência tipo Kozak selecionada a partir de CCACCAUG(G), CCGCCAT/UG(G), GCCGCCGCCAT/UG(G) ou GCCGCCGCCAT/UG. Em certas modalidades, tanto os nucleotídeos -3 e +4 em relação a um códon inicial da primeira sequência de ácidos nucleicos compreendem um G. Em outra modalidade, que pode ser combinada com a modalidade precedente que compreende uma sequência tipo Kozak e/ou a seguinte modalidade que compreende códon de interrupção tripla, o polinucleotídeo inclui um elemento de WPRE. Em algumas modalidades, o elemento de WPRE é localizado 3 ’ de um códon de interrupção da uma ou mais unidades transcricionais e 5’ a um 3’ LTR do polinucleotídeo. Em outra modalidade, que pode ser combinada com uma ou ambas as modalidades anteriores (isto é, uma modalidade em que o polinucleotídeo compreende uma sequência tipo Kozak e/ou uma modalidade em que o polinucleotídeo compreendeu um WPRE), a uma ou mais unidades transcricionais terminam com um ou mais códons de interrupção de um códon de interrupção dupla ou um códon de interrupção tripla.
[902] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um vetor de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo isolado de qualquer um dos aspectos de polinucleotídeo isolado e
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367/540 modalidades fornecidas no presente documento que codificam um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK,
a. u origem de replicação;
b. um gene de resistência ao antibiótico; e/ou
c. uma ou mais sequências virais e/ou retrovirais selecionadas de uma repetição terminal longa retroviral (LTR) ou fragmento ativo da mesma, um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral e/ou um elemento trato de polipurina central retroviral/sequência de terminação central (CTS).
[903] Em certas modalidades desse aspecto, o vetor é um plasmídeo. Em outras modalidades, o vetor e um vetor viral incompetente em replicação, por exemplo, um vetor ou partícula retroviral incompetente em replicação. Nessas modalidades, o vetor ou partícula retroviral incompetente em replicação, pode compreender uma 5 ’ LTR retroviral, ou fragmento ativo da mesma, um elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral, e uma 3 ’ LTR retroviral ou fragmento ativo da mesma, em que a 5’ LTR retroviral e a 3’ LTR retroviral flanqueiam o polinucleotídeo isolado. Em algumas modalidades, o dito polinucleotídeo isolado está em orientação reversa à sequência de ácidos nucleicos que codificam o elemento de empacotamento de RNA de atuação cis retroviral, a repetição terminal longa 5' e/ou a repetição terminal longa 3’.
[904] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreendendo um genoma retroviral compreendendo qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento que compreendem um polinucleotídeo isolado que compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo quimérico que promove proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK, e compreendendo adicionalmente um cepsídeo e um envelope. A partícula retroviral pode compreender adicionalmente qualquer um dos elementos retrovirais apontados nesta revelação. Em uma modalidade, o genoma de retrovirus compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, a
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368/540 primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos podem ser separadas por uma sequência de salto ribossômica. Em algumas modalidades, a sequência de salto ribossômica é F2A, E2A, P2A ou T2A. Nessas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos são tipicamente na mesma unidade transcricional.
[905] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma célula de mamífero, em que a dita célula de mamífero, por exemplo, célula humana, é uma célula B, célula T ou célula NK compreendendo um polinucleotídeo isolado, que opcionalmente pode ser integrado no genoma da célula, de acordo com qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento que compreendem um polinucleotídeo isolado que compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado na célula de mamífero compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos podem ser separadas por uma sequência de salto ribossômica. Em algumas modalidades, a sequência de salto ribossômica é F2A, E2A, P2A ou T2A. Nessas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos são tipicamente na mesma unidade transcricional. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T ou célula NK e, em certas modalidades ilustrativas, a célula é uma célula humana T.
[906] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma célula de empacotamento compreendendo um polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento que compreende um polinucleotídeo isolado, que opcionalmente pode ser integrado no genoma da célula, que compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo quimérico que promove proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado na célula compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4615/5200
369/540 específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos podem ser separadas por uma sequência de salto ribossômica. Em algumas modalidades, a sequência de salto ribossômica é F2A, E2A, P2A ou T2A. Nessas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos são tipicamente na mesma unidade transcricional. Em algumas modalidades, a célula é a célula fornecida no presente documento para a geração de partículas retrovirais.
[907] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método para promover a proliferação celular de uma PB MC, por exemplo, uma célula B, célula T, e/ou célula NK, compreendendo transduzir e/ou modificar geneticamente a célula com um vetor que codifica um elemento linfoproliferativo, e em modalidades ilustrativas, um polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das modalidades fornecidas no presente documento, em que o polipeptídeo quimérico promove a proliferação de PB MC. O método pode incluir cultivar a célula por pelo menos 7, 14, 21, 28, 35, 42 ou 60 dias. Tipicamente, essa cultura é realizada na ausência de IL-2, por exemplo, após a transdução com meios que podem incluir IL-2 em algumas modalidades.
[908] Em um aspecto, é fornecido, no presente documento, um método para transfectar, transduzir e/ou modificar geneticamente uma célula B, célula T e/ou célula NK, que, em algumas modalidades não limitantes, pode ser uma célula alogeneica, uma célula autóloga ou diferente de uma célula alogeneica, compreendendo colocar a célula em contato com um polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento que compreendem um polinucleotídeo isolado que compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo quimérico que promove a proliferação celular de PBMCs, células B, células T e/ou células NK (aspectos e modalidades de CLE). Em algumas modalidades deste aspecto de método, a célula é uma célula T e o polinucleotídeo isolado compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular. Em outras palavras, o método para transfectar, transduzir e/ou modificar geneticamente uma célula B, célula T e/ou célula NK pode incluir colocar a célula em contato
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370/540 com polinucleotídeos isolados de acordo com qualquer uma das modalidades de CLE ou CAR de CLE no presente documento. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos podem ser separadas por uma sequência de salto ribossômica. Em algumas modalidades, a sequência de salto ribossômica é F2A, E2A, P2A ou T2A. Nessas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos são tipicamente na mesma unidade transcricional. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T ou célula NK e, em certas modalidades ilustrativas, a célula é uma célula humana T. O contato é realizado sob condições eficazes para transfectar, transduzir e/ou modificar geneticamente a célula. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado no momento do contato está dentro de um vetor de acordo com qualquer um dentre o aspecto e modalidades de vetor fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado está em uma partícula retroviral não replicativa no momento do contato.
[909] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos no presente documento, as células NK são células NKT.
[910] Os exemplos não limitantes a seguir são fornecidos apenas a título de ilustração das modalidades exemplificativas e não limitam de modo algum o escopo e espírito da presente revelação. Ademais, deve ser entendido que quaisquer invenções reveladas ou reivindicadas no presente documento abrangem todas as variações, combinações e permutações de qualquer um ou mais recursos descritos no presente documento. Qualquer um ou mais recursos podem ser explicitamente excluídos das reivindicações mesmo se a exclusão específica não for apresentada explicitamente no presente documento. Deve também ser entendido que a revelação de um reagente para uso em um método destina-se a ser sinônimo com (e fornecer suporte para) esse método que envolve o uso desse reagente, de acordo os métodos específicos revelados no presente documento ou outros métodos conhecidos na técnica a não ser que uma pessoa de habilidade comum na técnica entendesse de outro modo. Adicionalmente, quando o relatório descritivo e/ou reivindicações revelam um método, qualquer um ou mais dos reagentes revelados no presente documento podem ser usados no método, a não ser que uma pessoa de habilidade comum na técnica entendesse de outro modo.
Exemplos
Exemplo 1. Geração de riboswitches que respondem especificamente a fármacos
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371/540 antivirais de análogo de nucleosídeo.
[911] Esse exemplo fornece um método para triar bibliotecas com base em riboswitches estruturais naturais que se ligam à guanosina e desoxiguanosina. Esses riboswitches foram usados como arcabouços para desenvolver bibliotecas induzidas para a seleção de aptâmeros que se ligam especificamente a um ligante análogo de nucleosídeo. Anteriormente, a calorimetria de titulação isotérmica foi usada para mostrar que esses riboswitches naturais se ligam a seus ligantes nativos. Testes adicionais mostraram que uma comutação de desoxiguanosina também interagiu fracamente com os análogos de nucleosídeo aciclovir e penciclovir, levando ao reprojeto dessa sequência em uma nova biblioteca. As regiões de fita simples do riboswitch que foram alvejadas para sequências de variante de mutação que respondem especificamente um aciclovir ou penciclovir foram selecionadas.
Materiais [912] Os componentes de seleção guanina, guanosina, desoxiguanosina, aciclovir e penciclovir foram pedidos a partir da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Aciclovir foi o alvo inicial ao mesmo tempo que penciclovir foi um analito de interesse especial usado nos últimos ciclos e guanina, guanosina e desoxiguanosina foram usadas como contra-alvos. Oxido de grafeno (GrO), a ser usado como o meio de partição, foi adquirido junto à Angstron Materials (Dayton, OH). HEPES (pH 7,3) e MgC12 foram adquiridos junto à Amersco LLC. (Solon, OH). KC1 foi adquirido junto à Teknova (Hollister, CA). O tampão de seleção foi preparado a 5X (IX como HEPES 50 mM, KC1100 mM, MgC12 20 mM, pH 7,3). Alvos, contra-alvos e oligos foram reconstituídos em água isento de nuclease para análise preliminar e triagem de aptâmero. As alíquotas foram preparadas para todos alvos e armazenados a -20 °C para maximizar a vida útil.
Geração da biblioteca de aptâmero [913] O modelo de biblioteca de aptâmero inicial foi sintetizado por IB A GmbH (Gottingen, Alemanha) como o complemento reverso das sequências na Figura 14. Na Figura 14, os nucleotídeos em caixas são de fita simples nas sequências conhecidas, com mutações introduzidas durante a síntese para permitir uma melhor ligação a análogos dos alvos originais. Para nucleotídeos dentro das caixas contornadas com linhas contínuas, mutações de substituição foram permitidas; para nucleotídeos dentro das caixas contornadas com linhas tracejadas, mutações de substituição assim como inserções ou deleções foram permitidas. Os
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372/540 iniciadores foram sintetizados por IDT (Coralville, IA) como DNA de fita simples. O iniciador T7 (SEQ ID NO:240) foi combinado com sequências de modelo de biblioteca para extensão de iniciador com DNA polimerase Titanium Taq (Clontech; Mountain View, CA). O material estendido por iniciador foi transcrito com o uso do Kit T7 High Yield Transcription (Epicentre; Madison, WI) e, então, purificado em eletroforese de gel de poliacrilamida desnaturante 10% (PAGE) com ureia 8 M antes do uso na seleção. Durante a seleção, a biblioteca foi transcrita de modo reverso com o uso de Transcriptase Reversa SuperScript IV (Invitrogen; Carlsbad, CA) com o uso do iniciador reverso (SEQ ID NO:241) e amplificada com o uso de DNA polimerase Titanium Taq (Clontech; Mountain View, CA). O aptâmero com SEQ ID NO:248 tinha uma variação de laço J2-3 de -3 a -1 e uma diversidade de ~2,25xlO10. O aptâmero com SEQ ID NO:250 tinha uma variação de laço J2-3 de 0 (nativo) a +5 e uma diversidade de ~9,38xl014. Os dois oligonucleotideos (SEQ ID NOs:249 e 250) foram misturados a uma razão de 1:4.160 para produzir diversidade equimolar no agrupamento de biblioteca combinado, com uma diversidade total de ~9,38xl013.
Triagem de biblioteca [914] A triagem de biblioteca foi conduzida com o uso de uma abordagem de Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial com óxido de grafeno (GOSELEX) (Figura 15) (Park et al., 2012), aproveitando a interação π-π que confere ao óxido de grafeno uma alta afinidade para ácidos nucleicos de fita simples (Zeng et al., 2015). Esse objetivo foi selecionar sequências que não interagiram com o tampão de seleção IX ou com os contraalvos (guanina, guanosina e desoxiguanosina), mas não se ligaram ao alvo positivo aciclovir.
[915] Para cada ciclo, uma determinada quantidade de biblioteca foi primeiro reenovelada em tampão de seleção IX (desnaturação de 5 minutos a 90 °C, 5 minutos a 4 °C, então, temperatura ambiente). Os contra-alvos foram, então, adicionados a bibliotecas enoveladas e incubados por 30 minutos a 37 °C. As exceções a isso foram os ciclos 1 e 2, em que os contraalvos foram apenas brevemente (< 1 minuto) incluídos para ajudar a carregar a biblioteca no GrO. Após permitir que a biblioteca interaja com os contra-alvos e componentes de tampão, a biblioteca não ligada foi carregada em GrO (massa igual a 100 vezes a massa da biblioteca no início do ciclo) ao longo do curso de uma incubação de 10 minutos a 37 °C. A solução foi, então, centrifugada a 7.000 x g para sedimentar o GrO. O sobrenadante, que continha sequências ligadas
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373/540 aos contra-alvos e/ou ao tampão, foi removido. O sedimento foi, então, lavado duas vezes com 200 μΐ de tampão de seleção IX, centrifugando a 7.000 x g e removendo o sobrenadante após cada lavagem. Uma solução contendo alvo positivo foi, então, adicionada e deixada eluir a biblioteca do GrO sob as condições indicadas na Tabela 1 por até 60 minutos a 37 °C, permitindo essencialmente o alvo para competir com óxido de grafeno para ligação de biblioteca. As sequências que se ligam mais fortemente ao alvo dessorveriam do óxido de grafeno e permaneceríam ligadas ao alvo no final da incubação. Uma etapa de centrifugação final separou o material liberado, localizado no sobrenadante, da biblioteca não responsiva que permaneceu ligada ao óxido de grafeno.
[916] Após a seleção positiva, o RNA recuperado purificado com o uso de PAGE desnaturante 10% com Ureia 8 M foi, então, quantificado com o uso de uma leitura de espectrofotômetro (Tabela 1), transcrito de modo reverso com SuperScript IV e amplificado com o uso de PCR com DNA polimerase Titanium Taq. Os produtos de amplificação foram transcritos em RNA para o próximo ciclo de seleção.
[917] Três níveis de estringência foram implantados ao longo do curso de seleção (Tabela 1). Os primeiros dois ciclos de seleção não incluíram triagem contra contra-alvos para maximizar a biblioteca carregando em GrO. Adicionalmente, um grande excesso de aciclovir foi usado em incubações positivas para maximizar a recuperação de biblioteca, assim, a designação de baixa estringência. Incubações de contra-alvo foram introduzidas após a recuperação de biblioteca ter sido alcançada, como condições de estringência intermediária. A razão entre aciclovir e biblioteca foi também reduzida durante esses três ciclos para aumentar a competição de biblioteca para ligação ao alvo. Uma vez que mais do que 10% de recuperação foi alcançada, os ciclos finais de seleção de alta estringência foram implantados. A razão de contraalvos/biblioteca permaneceu alta, e a razão de alvo positivo/biblioteca foi colocada a 1:1 ao mesmo tempo que o tempo de incubação positiva foi reduzido para selecionar sequências de ligação mais rápidas. Uma vez que a recuperação de biblioteca mostrou permanecer acima de 10% após mais do que dois ciclos das condições de estringência alta, avaliações paralelas foram conduzidas.
Geração (Estringência)
Biblioteca: Alvos X(30 Biblioteca:(+) Alvo (+) Tempo de Incubação Recuperação (%)
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min de incubação) (min)
G0/R1 (baixa) 1:1.000* 1:1.000 60 0,43
G1/R2 (baixa) 1:1.000* 1:1.000 60 2,00
G2/R3 (média) 1:1.000 1:500 60 3,60
G3/R4 (média) 1:1.000 1:100 60 8,73
G4/R5 (média) 1:1.000 1:10 60 10,20
G5/R6(alta) 1:1.000 1:1 60 12,00
G6/R7(alta) 1:1.000 1:1 60 8,60
G7/R8(alta) 1:1.000 1:1 60 9,72
G8/R9 (alta) 1:1.000 1:1 30 20,08
G9/R10 (alta) 1:1.000 1:1 30 10,62
G10(-)’ (paralela 1) - - 30 3,74
G10(X)* (paralela 1) 1:40 - 30 3,60
G10(+)’ (paralela 1) - 1:4 30 14,14
G10(P)’ (paralela 1) - 1:4 30 5,46
Gll(-)t (paralela 2) - - 30 4,60
Gll(X): (paralela 2) 1:40 - 30 5,26
Gll(+)’ (paralela 2) - 1:2 30 9,34
Gll(P)t (paralela 2) - 1:4 30 6,32
Tabela 1. Condições de seleção e avaliação. Condições usadas para cada ciclo de seleção ou incubação, com recuperação como a razão entre a amostra recuperada e a biblioteca de entrada para cada ciclo. O enriquecimento de biblioteca foi monitorado ao longo do curso de seleção.
*Contra-alvos usados para carregamento, incubação não estendida, f Incubação précarregamento conduzida com contra-alvos agrupados. J Incubação pré-carregamento conduzida com o alvo positivo aciclovir. Isso foi feito para minimizar a recuperação de espécies com reatividade cruzada. As abreviações a seguir são usadas nessa tabela: Alvos x são contraalvos: alvo (+) é aciclovir ou penciclovir; (+) tempo de incubação (min) é o tempo que a
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375/540 solução de biblioteca: alvo (+) foi incubada no gro. G0 é geração 0 e assim por diante; rl é ciclo 1 e assim por diante. Para a avaliação paralela (paralela 1 e paralela 2), as incubações foram realizadas com: (-) Tampão de seleção Ix apenas, (x) contra-alvos em tampão de seleção Ix, (+) aciclovir em tampão de seleção Ix e (p) penciclovir em tampão de seleção Ix.
[918] Para as duas avaliações paralelas, a biblioteca a ser avaliada foi dividida em quatro quantidades iguais para preparação e reenovelamento conforme acima (Figura 16). Para cada condição, 50 pmol de biblioteca foram combinados com tampão de seleção IX, reenvelados (90 °C por 5 minutos, 4 °C por 5 minutos) e, então, incubados com 200 μΐ de contraalvos combinados 10 μΜ em tampão de seleção IX por 30 minutos a 37 °C. Essas amostras foram, então, carregadas em uma quantidade de óxido de grafeno igual a 100 vezes a massa da biblioteca na amostra e incubadas por 10 minutos a 37 °C e, então, lavadas duas vezes com 200 μΐ de tampão de seleção IX como antes. As amostras de óxido de grafeno carregadas forma, então, incubada em paralelo com 200 μΐ da condição de avaliação apropriada (tampão de seleção IX apenas, contra-alvos agrupados 10 μΜ, penciclovir 1 μΜ, aciclovir 1 μΜ para a primeira avaliação paralela ou aciclovir 0,5 μΜ para a segunda avaliação paralela; na Tabela 1, essas condições são mostradas como: (-); (X); (P); (+); e (+), respectivamente) em tampão de seleção IX por 30 minutos a 37 °C. Uma etapa de centrifugação final separou a biblioteca responsiva dessorvida da biblioteca ligada a óxido de grafeno não responsiva. As bibliotecas responsivas foram quantificadas com o uso de leitura espectrofotométrica (Tabela 1), verificadas com o uso de PAGE desnaturante 10% com ureia 8 M e preparadas para uma segunda avaliação paralela. Essa avaliação de acompanhamento continuou a usar contra-alvos para a incubação pré-carregamento da amostra positiva, mas utilizou o alvo positivo aciclovir para cada outra pré-incubação das amostras. Isso foi feito para minimizar a representação de sequências com reatividade cruzada em uma determinada amostra (isto é, responsiva a contra-alvos na amostra positiva, responsiva a aciclovir nas amostras negativa, de contra-alvos ou de penciclovir). O material recuperado da segunda avaliação paralela foi quantificado com o uso de leitura espectrofotométrica (Tabela 1), verificada com o uso de PAGE desnaturante 10% com ureia 8 M e preparada para sequenciamento por transcrição reversa e PCR para gerar DNA de fita simples.
Sequenciamento [919] A biblioteca inicial foi submetida a mais de 10 ciclos de seleção com base
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376/540 em GrO e avaliação paralela (Tabela 1). O processo GO-SELEX é projetado para enriquecer as sequências ao longo de múltiplos ciclos de seleção que se ligam aos determinados alvos de interesse e remover as sequências que se ligam aos componentes de tampão ou compostos não alvo. Como um resultado, espera-se que as populações a serem sequenciadas contenham múltiplas cópias de candidatos de aptâmero potenciais.
[920] O sistema Illumina MiSeq (San Diego, CA) foi implantado para sequenciar as bibliotecas de aptâmero após a avaliação paralela com o uso de uma técnica de leitura de uma extremidade. A análise de dados subsequentes e sequenciamento profundo reduz o grande número de ciclos de triagem que SELEX tradicional exige, o que pode introduzir erro e desvio devido ao processo de triagem (Schütze et al., 2011). Cinco amostras foram sequenciadas: a biblioteca de geração final que respondeu a aciclovir, a biblioteca de geração final que respondeu aos contra-alvos, a biblioteca de geração final que respondeu ao tampão de seleção IX (condição negativa), a biblioteca de penúltima geração que respondeu a aciclovir e a biblioteca de geração final que respondeu ao alvo adicional de interesse, penciclovir. A partir desses conjuntos de dados, famílias de sequência foram construídas a 95% de homologia (similaridade de sequência considerando mutações, deleções e inserção) para a identificação de candidato de aptâmero. Houve 1.711.535 sequências brutas (124.600 sequências exclusivas) a partir da biblioteca que respondeu a aciclovir e 2.074.832 sequências brutas (110.149 sequências exclusivas) a partir da biblioteca que respondeu a penciclovir.
Seleção de candidato de aptâmero [921] A construção de família de sequência focou primariamente na similaridade entre sequências. Isso significa que a frequência de uma sequência na população de alvo positivo foi levada em consideração, mas uma ênfase maior foi colocada no grau de variação entre sequências similares, com 95% de homologia sendo a exigência mínima (100% de correspondência ao longo da sequência inteira não é necessário para se unir a uma família, até 2 bases podem ser incompatíveis, inseridas ou deletadas). Seria, portanto, esperado famílias com o maior número de membros que têm uma classificação alta como candidatos de aptâmero. Após as famílias serem construídas, pode ser dada consideração à presença relativa de uma família em uma determinada população - famílias que ocorrem frequentemente nas populações de alvo negativo e contra-alvo são consideradas candidatos mais fracos, na medida em que as mesmas
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377/540 demonstram um grau na interação não específica na ligação aos componentes de tampão ou contra-alvo. Adicionalmente, as famílias que demonstram uma alta taxa de enriquecimento (isto é, razão grande entre a população positiva final e penúltima população positiva) aprimoram sua candidatura, na medida em que a taxa de enriquecimento foi vinculada à afinidade de ligação de 5 um candidato em relação ao resto da população (Levay et al., 2015; Wang et al., 2014). Sob essas condições, diversas famílias candidatas parecerem ser fortes candidatos para ligação de aciclovir (Tabela 2) e penciclovir.
Número de Sequência de Família Candidata SEQ ID NO: Sequência Compri mento % de Identidade
Consenso Tipo Selvagem
582-1 108 ACAGCTTAGCGTAATGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 100 80,77
582-2 109 ACAGCTTAGGATAATGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-3 110 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTCACAGACT 49 95,92 80,77
582-4 111 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTGACAGACT 49 95,92 80,77
582-5 112 ACAGCATAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 95,92 82,69
582-6 113 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATGTACAGACT 49 95,92 80,77
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582-7 114 ACAGCTAGCGTAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 48 97,96 80,77
582-8 115 ACAGCTTAGCATTATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-9 116 ACAGTTAGCATAATGGCTA CTGACGCCGTCCAAACCT ATTTACAGACT 48 95,92 82,69
582-10 117 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-11 118 ACAGCTTAGCTTAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 97,96 80,77
582-12 119 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC CATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-13 120 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC AATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-14 121 ACAGCTTAGCATAATGGAT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-15 122 ACAGCTTAGCATTGTGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 93,88 78,85
582-16 123 ACAGGTTAGCATAATGGC TACCGACGCCGTCCAAAC 49 93,88 82,69
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CTATTTACAGACT
582-17 124 ACAGCTTAGCGTAATGGC TACTGACGCCGCCCAAAC CTATTTACAGACT 49 97,96 82,69
582-18 125 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAAAC TATTTCCAGACT 49 93,88 80,77
582-19 126 ACAGCCTAGCATAAGGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 93,88 82,69
582-20 127 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGAGGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-21 128 ACAGCTTACCTTAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 95,92 78,85
582-22 129 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACCGACGCTGTCCAAACC TATTTACAGACT 49 93,88 78,85
582-23 130 ACAGCTTAGCGTAATGGC TACTGGCGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 97,96 78,85
582-24 131 ACAGCTTAGCATACTGGC TACTGACGCCGCCCAAAC CTATTTACAGACT 49 93,88 82,69
582-25 132 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCTAACC TATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-26 133 ACAGGTTAGCATAATGCCT 49 93,88 82,69
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380/540
ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACAGACT
582-27 134 ACAGCTTAGCATAATTGCT ACTGACGCCGTTCAAACC TATTTACAGACT 49 93,88 82,69
582-28 135 ACAGCTTAGCATAAAGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 95,92 80,77
582-29 136 ACAGCTTAGCGTAATGGC TACTGACGCCGTCTAAAC CTATTTCCAGACT 49 95,92 80,77
582-30 137 ACAGGTTAGCATAATGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTAGAGACT 49 93,88 86,54
582-31 138 ACAGGGTAGCGTAATGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 95,92 84,62
582-32 139 ACAGCGTAGCATAATGGC TACTGACGCCGTTCAAAC CTATTTACAGACT 49 93,88 86,54
582-33 140 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACT CATTTACAGACT 49 93,88 78,85
582-34 141 ACAGCGTAGCATAGTGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 93,88 82,69
582-35 142 ACAGCTTAGTGTAATGGC TACTGACGCTGTCCAAAC CTATTTACAGACT 49 95,92 76,92
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4627/5200
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582-36 143 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGGCGTTCAAACC TATTTACAGACT 49 93,88 82,69
582-37 144 ACAGGTTAGCATAATGGC TACTGACGCCGTCCAAAC CTATTTATAGACT 49 93,88 84,62
582-38 145 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTGTCGACT 48 91,84 80,77
582-39 146 ACAGCTTAGCATAATGGCT ACTGACGCCGTCCAAACC TATTTACGACT 48 95,92 80,77
582 Sequência de Consenso 222 ACAGNNTASBDTWVDKS MTACYGRSGSBGYYYWA AMYHATKBHBNGACT Em que o N na posição 5 pode ser C, G ou nenhum nucleotídeo, o N na posição 6 pode ser A, C, G, T ou nenhum nucleotídeo, e o N na posição 45 pode ser A ou nenhum nucleotídeo. 49 - -
769-1 147 ACAGGTCAGCATAATGTG CTAGTGCGCCTTCAAACC TATTTAGAGACT 48 100 82,69
769-2 148 ACAGGTCAGCATAATGTG CTAGTGCGCCCTCAAACC TATTTAGAGACT 48 97,92 80,77
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4628/5200
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769-3 149 ACAGGTTAGCATAATGTG CTATTGCGCCTTCAAACCT ATTTAGAGACT 48 95,83 84,62
769-4 150 ACAGGTCAGCATAATGTG CTAGTGCGCATTCAAACC TATTTAGAGACT 48 97,92 80,77
769-5 151 ACAGGTTAGCATAATGTG CTAGTGCGCCTTCAAACC TATTTTGAGACT 48 95,83 84,62
769-6 152 ACAGGTTATCATAATGTGC TAGTGCGCCTTCAAACCT ATTTAGAGACT 48 95,83 82,69
769-7 153 ACAGGTTAGCATGATGTG CTAGTGCGCCTTCAAACC TATTTAGAGACT 48 95,83 82,69
769-8 154 ACAGGTTAGCATAATGGG CTAGTGCGCCTTCAAACC TATTTAGAGACT 48 95,83 86,54
769-9 155 ACAGGTCAGCAAAATGTG CAAGTGCGCCTTCAAACC TATTTAGAGACT 48 95,83 78,85
769-10 156 ACAGGTCAGCATAATGTG CTAGTGCGCCTTCAAACC TATCTGGAGACT 48 95,83 82,69
769-11 157 ACAGCTTAGCATAATGTGC TAGTGCGCCTTCAAACCT ATTTAGAGACT 48 95,83 82,69
769-12 158 ACAGGTCAGCATAATGTG CTAGTGCGCCTTCAAACC 48 97,92 80,77
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4629/5200
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TATTTACAGACT
769-13 159 ACAGGTCAGCATAATGTG CTAGTGCGCCTTCAAACA TATTTAGAGACT 48 97,92 80,77
769-14 160 ACAGGGTAGCATAATGTG CTAGTGCGCCTTCAAACC TATTTAGAGACT 48 95,83 86,54
769-15 161 ACAGGTTAGCATAATGTG CTAGTGCGCCCTCAAACC TATTTAGAGACT 48 95,83 82,69
769-16 162 ACAGGTTAGCATAATGTG CCAGTGCGCCTTCAAACC TATTTAGAGACT 48 95,83 82,69
769-17 163 ACAGGTCAGCATAATGGG CTAGTGCGCCTTCAAACC TATTTAGAGACT 48 97,92 84,62
769 Sequência de Consenso 223 ACAGSKYAKCAWRATGKG CHAKTGCGCMYTCAAAC MTATYTDSAGACT 48 - -
795-1 164 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 100 83,02
795-2 165 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTACAGACT 49 97,96 81,13
795-3 166 ACAGCGAAGCATAATGGC TTCTGACGCCCTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 97,96 81,13
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4630/5200
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795-4 167 ACAGCCAAGCATACTGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 95,92 79,25
795-5 168 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCGCAAACC CTATTTGCAGACT 49 97,96 81,13
795-6 169 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGGCCTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 97,96 80,77
795-7 170 ACAGCGAGGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 97,96 81,13
795-8 171 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCTTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 97,96 84,91
795-9 172 ACAGCGAAGCATAATGGC TACAGACGCCCTCAAAAC CTATTTGCAGACT 49 95,92 80,77
795-10 173 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTGAGACT 48 97,96 83,02
795-11 174 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTGTCGACT 48 93,88 76,92
795-12 175 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 97,96 81,13
795-13 176 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC 49 95,92 83,02
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4631/5200
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CTATTTGGCGACT
795-14 177 ACAGCGAAGCATAATGTC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTGCAGACT 49 97,96 81,13
795-15 178 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCGTCAAACC CTATTTGTAGACT 49 95,92 83,02
795-16 179 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC TTATTTGCAGACT 49 97,96 83,02
795-17 180 ACAGGTAGCATAATGGCT ACTGACGCCCTCAAACCC TATTTGCAGACT 48 95,92 84,91
795-18 181 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTCTAGACT 49 95,92 81,13
795-19 182 ACAGCGAAGCATAATGGC TACTGACGCCCTCAAACC CTATTTGTAGACT 49 97,96 83,02
795 Sequência de Consenso 224 ACAGNSWRGCATAMTGK CTWCWGACGSCBKCAAA MCYTANTTVNMGACT Em que o N na posição 5 pode ser C ou nenhum nucleotídeo, o N na posição 40 pode ser T ou nenhum nucleotídeo e o N na posição 44 pode ser C, G, T ou nenhum nucleotide 49 - -
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4632/5200
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935-1 183 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTGTAGACT 48 100 86,79
935-2 184 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTGAGACT 47 97,92 86,79
935-3 185 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTTACGCCTTCACCT ATTTGTAGACT 48 97,92 84,62
935-4 186 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTCTAGACT 48 97,92 84,91
935-5 187 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTGGAGACT 48 97,92 88,68
935-6 188 ACAGGGTAGCATAGTGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTGTAGACT 48 97,92 84,91
935-7 189 ACAGGGTAGCATGATGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTGTAGACT 48 97,92 84,91
935-8 190 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTAGTAGACT 48 97,92 84,91
935-9 191 ACAGGGTAGCATAATGGG CTATTTGACGCCTTCACCT ATTTGTAGACT 48 97,92 84,91
935-10 192 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGCCGCCTTCACCT 48 97,92 86,54
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4633/5200
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ATTTGTAGACT
935-11 193 ACAGTGTAGCATAATTGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTGTAGACT 48 95,83 83,02
935-12 194 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGACGCTTTCACCT TTTTGTAGACT 48 95,83 83,02
935-13 195 ACAGGGTAGCATAAGGGG CTACTTGACGCCITCACCT ATTTGTAGACT 48 97,92 84,91
935-14 196 ACAGGGTAGCATAATGGA CTACTTGACGCCTCCACC TATTTGTAGACT 48 95,83 81,13
935-15 197 ACAGGGTAGCATAATGGG CTACTTGTCGCCTTCACCT ATTTGTAGACT 48 97,92 84,62
935 Sequência de Consenso 225 ACAGKGTCGCATRRKKGR CTAYTTKHCGCYTYCACC TWTTWSNAGACT Em que o N na posição 43 pode ser G, T ou nenhum nucleotídeo. 48 - -
946-1 198 ACAGGGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCCGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 100 84,62
946-2 199 ACAGGGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCAGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 97,96 82,69
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4634/5200
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946-3 200 ACATGTAGCATAATGGGCT ACTGACGCCGTCAAACCT ATTTGCAGACT 48 91,84 86,54
946-4 201 ACAGCGTAGCATAGTGGG CTGCAGACGCCGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 97,96 82,69
946-5 202 ACAGTGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCCTTCAAAC CTATTTGGAGACT 49 93,88 88,46
946-6 203 ACAGTGTAGCATAATGGG CTGCTGACGCCGTCAAAC CTATTTGAAGACT 49 93,88 86,54
946-7 204 ACAGCGTAGCATAATGGG CTACAGGCGCCGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 95,92 84,62
946-8 205 ACAGCGTAGCATAATGGG CTACTGGCGCCGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 93,88 86,54
946-9 206 ACAGCGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCCGTCAAAC CTATTTGAGACT 48 97,96 84,62
946-10 207 ACAGGTAGCATAATGGGC TGCAGACGCCGTCAAACC TATTTGCAGACT 48 97,96 84,62
946-11 208 ACAGGTAGCATAATGGGC TGCTGACGCCGTCAAACC TATTTACAGACT 48 93,88 84,62
946-12 209 ACAGCGTAGCATATTGGG CTGCAGACGCCGTCAAAC 49 97,96 82,69
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CTATTTGCAGACT
946-13 210 ACAGCGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCCTTCAAAC CTATTTGGAGACT 49 95,92 88,46
946-14 211 ACAGTGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCCGTCAAAC CTATTTGAGACT 48 95,92 84,62
946-15 212 ACAGCGTAGCATAATGGG CTGCTGACGCCGTCAAAC CTATTTGGAGACT 49 95,92 88,46
946-16 213 ACAGCGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCCGTCAAAC CTATTTACAGACT 49 97,96 82,69
946-17 214 ACAGCGTAGCATAATGGG CTGCTGACGCCGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 97,96 86,54
946-18 215 ACAGGGTAGCATAATGGG CTGCAGACGCCGTCAAAC CTATTTGGAGACT 49 95,92 88,46
946-19 216 ACAGCGTAGCATAATGGG CTACAGACGCCGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 97,96 86,54
946-20 217 ACAGCGTCGCATAATGGG CTGCAGACGCCGTCAAAT CTATTTGCAGACT 49 95,92 80,77
946-21 218 ACAGCGTAGCATAATGGG CTTCAGACGCCGTCAAAC CTATTTGCAGACT 49 97,96 84,62
946-22 219 ACATGTAGCATAATGGGCT 48 93,88 84,62
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GCAGACGCCGTCAAACCT ATTTGGAGACT
946 Sequência de Consenso 226 ACANNGTMGCATADTGGG CTDCWGRCGCMKTCAAA YCTATTTRNAGACT Em que o N na posição 4 pode ser G ou nenhum nucleotídeo, o N na posição 5 pode ser C, G, T ou nenhum nucleotídeo e o N na posição 44 pode ser A, C, G ou nenhum nucleotídeo. 49 - -
961-1 220 ACACCGTAGCATAATGGG CTACTGCCGCCGTCGACC TTTTGGAGACT 47 100% 82,69
996-1 221 ACAGGGTAGCATAATGGC TTAGGACGCCTTCAAACC TATCAAGACT 46 100% 76,92
Tabela 2. Candidatos para se ligarem a aciclovir e penciclovir. Sequências de dna que correspondem às regiões de não haste dos riboswitches de rna de ligação a aciclovir. Sete famílias foram identificadas na triagem: 582, 769, 795, 935, 946, 961 e 996 com entre 1 e 39 sequências em cada família. A identidade percentual para cada sequência na família foi comparada à sequência mais predominante dentro de cada família (582-1, 769-1, 7951, 935-1, 946-1, 961-1 e 996-1). A identidade percentual para cada sequência na família foi também comparada à sequência do tipo selvagem.
[922] O alvo positivo aciclovir produziu sete candidatos fortes (SEQ ID
NOs:87 a 93; sequências de RNA incluindo regiões de haste) que correspondem a 582-1 (SEQ ID NO:1Q8), 769-1 (SEQ ID NO:147), 795-1 (SEQ ID NO:164), 935-1 (SEQ ID NO:183), 946
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4637/5200
391/540 (SEQ ID NO: 198), 961-1 (SEQ ID NO:220) e 996-1 (SEQ ID NO:221), cada um designado FIA (Figura 17). Essas sequências foram as sequências mais prevalentes em cada família (as sequências de DNA de todos os membros de cada família foram: 582 (SEQ ID NOs:108 a 146); 769 (SEQ ID NOs:147 a 163); 795 (SEQ ID NOs:164 a 182); 935 (SEQ ID NOs:183 a 197); 946 (SEQ ID NOs:198 a 219); 961 (SEQ ID NO:220); e 996 (SEQ ID NO:221)). As sequências consenso mostram todas as substituições ou lacunas possíveis em cada posição de nucleotídeo para cada família (SEQ ID NOs:222 a 226). Como o objetivo foi identificar os aptâmeros de uma biblioteca com base no RNA que é conhecido por se ligar à desoxiguanosina, fortes candidatos precisaram ter uma presença mínima na população de contra-alvos. Os candidatos Fl A-795, F1A935 e F1A-946 satisfizeram esse critério muito bem, na medida em que os mesmos não foram detectados na população de contra-alvos. F1A-996 e F1A-961 são considerados os próximos melhores candidatos nesse aspecto, embora os mesmos apareçam a um grau menor na população de contra-alvos. Adicionalmente, os candidatos devem aparecer minimamente na população negativa, na medida em que aquelas sequências dessorveram de GrO sem a influência de aciclovir e poderíam representar falsos positivos. F1A-935 e F1A-946 tiveram desempenho ideal sob esse critério também, na medida em que os mesmos não são encontrados na população negativa. O candidato F1A-769 foi minimamente detectado na população negativa, com os candidatos F1A961, F1A-795 e F1A-996 tendo menor desempenho. A taxa de enriquecimento foi a condição final a ser considerada, com F1A-935, F1A-946 e F1A-769 tendo desempenho adequado. O candidato F1A-582 foi incluído devido ao fato de que o mesmo exibiu a maior taxa de enriquecimento, embora não tenha tido bom desempenho sob os outros critérios. Os candidatos restantes não tiveram bom desempenho em relação a esses quatro, mas exibiram características aceitáveis.
[923] O alvo adicional penciclovir produziu sete candidatos fortes (SEQ ID NOs:94 a 100), cada um designado F1P (Figura 18). Como antes, o objetivo foi identificar os aptâmeros de uma biblioteca com base no RNA que é conhecido por se ligar à desoxiguanosina, divergindo das bibliotecas enriquecidas para se ligarem a aciclovir (aciclovir) após o Ciclo 10. Os candidatos fortes precisaram ter presença mínima nas populações de contra-alvos e aciclovir para minimizar a reatividade cruzada. O candidato F1P-923 satisfez o primeiro critério, o candidato F1P-710 satisfez o segundo critério, e o candidato F1P-584 satisfez ambos os critérios a um grau.
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O candidato F1P-584 também demonstrou favorabilidade moderada para penciclovir em relação à condição negativa, assim como enriquecimento moderado em relação à resposta da geração anterior a aciclovir. Os candidatos restantes demonstraram ou favorecimento mínimo de penciclovir em relação a aciclovir ou favorecimento mínimo de penciclovir em relação aos contraalvos (F1P-837 e F1P-932; F1P-991 e F1P-718; respectivamente). Esses quatro candidatos demonstraram alguma favorabilidade para penciclovir em relação à condição negativa que minimiza a chance de um falso positivo, embora esse critério não seja tão significativo se um candidato não demonstrar seletividade para penciclovir em vez de seus análogos. A taxa de enriquecimento foi a condição final a ser considerada, com F1P-923, F1P-932 e F1P-584 tendo desempenho adequado.
[924] A avaliação por PAGE quantitativa dos aptâmeros selecionados foi realizada. Os aptâmeros individualmente sintetizados e transcritos foram submetidos à seleção em óxido de grafeno (GrO) sob Mg++ fisiológico (0,5 mM) e eluição com aciclovir (+) ou contraalvos (x). As frações de aptâmero especificamente diluídas para cada amostra foram submetidas à PAGE para análise.
[925] 100 pmol de cada candidato de aptâmero (por teste/faixa) foram ressuspensos em tampão de seleção modificado IX (HEPES 50 mM, KC1 100 mM, MgC12 0,5 mM, pH 7,3) e reenovelados (90 °C por 5 min, então, 4 °C por 5 min), então, incubados a 37 °C por 30 minutos com 200 pmol (cada) de contra-alvos agrupados ou alvo. A concentração de biblioteca final foi 0,5 μΜ, a concentração de alvo/contra-alvos foi 1 μΜ (o volume de incubação foi 200 μΐ).
[926] Após a incubação de alvo/contra-alvo, 250 pg de GrO (Angstron Materials (Dayton, OH) foram adicionados para adsorver o candidato não ligado (incubação de 10 minutos a 37 °C).
[927] As amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 7.000 x g. O sobrenadante foi recuperado, desnaturado com o uso de Formamida 2X com EDTA 40 mM e passado em PAGE desnaturante 10% com ureia 8 M (fornecedor: American Bioanalytical; número do catálogo AB13021-01000. AB13022-01000). Tampão corrente foi IX TBE (fornecedor: Amresco/VWR; no de catálogo 0658-20L, diluído com o uso de água DI). A escada de DNA foi escada de DNA 20/100 (IDT). Géis manchados com Gel Star (Lonza, 50535) e
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393/540 imageados em um transiluminador de luz azul.
[928] Os candidatos F1A-769, F1A-795, F1A-946 e F1A-996 parecem exibir resposta positiva seletiva nessa avaliação por PAGE quantitativa (boa eluição do aptâmero de GrO com alvo de aciclovir e eluição relativamente mais baixa ou mínima com contra-alvos).
Conclusão [929] Os candidatos fortes para aciclovir foram identificados após doze ciclos de triagem iterativa e avaliação paralela; candidatos razoáveis para penciclovir foram identificados após dois ciclos de triagem e avaliação paralela.
Exemplo 2. Isolamento de scFv's condicionais [930] As desvantagens de sítio de splicing potenciais são removidas, e os scFv’s específicos para antígeno de tumor são sintetizados por síntese de oligo sobreposta e clonados no construto de CAR contendo o elemento responsive de aciclovir e o promotor CD3ζ de primata. Como um protótipo inicial, anti-ECD de EPCAM ou ERBB2scFv com um peptídeo de sinalização CD8-alfa, haste e domínio transmembranar é utilizado. Produtos de CAR restritos ao microambiente de tumor sólidos são gerados ou com o uso dos métodos, conforme descrito na Patente no US 8.709.755 e na Publicação PCT WO/2016/033331A1, ou por seleção direta de bibliotecas de fago humanas sob condições permissivas ou não permissivas. Brevemente, uma biblioteca VH x VL humana junto à Creative Biolabs (Shirley, NY) é selecionada nas seguintes condições permissivas de tumor: 100 pg/ml de hialuronano, fração de 100 kDa (Lifecore Biomedical, Chaska, MN), 20 mg/ml de HSA recombinante (Cyagen, Santa Clara, CA), 200 ng/ml de VEGF humano recombinante em tampão de bicarbonate de sódio 25 mM, adenosina 2 μΜ, lactato de sódio 10 mM pH 6,7, após a liberação com microesferas magnéticas de estreptavidina (ThermoFisher, Carlsbad, CA) ligadas à IgG humana biotinilada. A ligação a ECD de receptor de alvo biotinilado de microesferas conjugadas com EPCAM e ERBB2 a 37 °C é realizada sob condições permissivas seguido de lavagens em série em condições permissivas. Os fagos são liberados com condições fisiológicas (1 pg/ml de hialuronano, 20 mg/ml de HSA, bicarbonate 25 mM, lactato de sódio 1 mM pH 7,2) seguido de eluição de variantes limitadas com eluição de ácido e neutralização rápida com Tris 1 M. Os fagos são expandidos e DNA genômico é dividido para análise profunda de sequências de cadeias VH x VL com o uso de sequenciamento de leitura longa (PacBio, Menlo Park, CA). A seleção pode ser repetida para enriquecimento. As
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394/540 sequências de VH x VL que mostram amplificação preferencial das leituras durante o processo de cultura de fago em relação ao enriquecimento ao alvo são excluídas para análise adicional. Os fagos com ligação seletiva ao alvo que são enriquecidos sob condições permissivas de tumor, mas liberados sob condições fisiológicas são escolhidos para caracterização adicional pela clonagem no sistema de expressão de construto de CAR, geração de lentivírus e transdução em células T para testar o extermínio de célula-alvo que expressa antígeno de tumor mediado por CAR em um ambiente seletivo de tumor em comparação às condições fisiológicas.
Exemplos 3. Geração de MRB-CARs com o uso de scfv's restritos ao microambiente.
[931] As ASTRs restritas ao microambiente foram obtidas, as quais foram produzidas submetendo-se sequências de Vh e Vl com baixa seletividade para o microambiente de pH baixo por evolução como descrito no pedido WO/2016/033331A1. Os receptores de antígeno quimérico (CARs) para ligar um dos dois antígenos de tumor cognato, Alvo 1 ou Alvo 2, com atividade aumentada no pH reduzido de um microambiente de tumor comparado com o microambiente de MRB-CARs de tecido normal foram produzidos incorporando-se as cadeias pesadas e as cadeias leves do anticorpos de cadeia única restritos ao microambiente em vetores de expressão lentivirais juntamente com outros domínios de CAR para gerar uma série de MRB CARs candidatos. Esses MRB-CARs incluíram várias combinações de módulos. Os MRB-CARs incluíram, da terminação amino à carbóxi, nas posições 1 a 9, um peptídeo de sinal de CD8 (sp) (Pl) (SEQ ID NO:74); uma ASTR anti-Alvo 1 restrita ao microambiente ou ASTR anti-Alvo 2 (P2-P4); um haste e domínio de transmembrana (TM) de CD8 (SEQ ID NO:75) (P5) e um domínio coestimulante de CD137 (P6) (SEQ ID NO: 1) nos casos de T2A e T2B ou uma haste e domínio de transmembrana (TM) de CD28 (SEQ ID NO:76) (P5) e um domínio coestimulante de ICA (SEQ ID NO:3) (P6) no caso de TIA; um domínio de ativação de CD3Z (SEQ ID NO: 13) (P7); uma 2A-1 sequência de salto ribossômica (SEQ ID NO:77) (P8); e uma eTAG exemplificativa (SEQ ID NO:78) (P9).
[932] As células T pan (AllCells, Alameda, CA) foram transduzidas com as partículas lentivirais recombinantes para expressar a série de MRB-CARs candidatos e a porcentagem de células transduzidas foi calculada determinando-se a porcentagem de células expressando a eTag com o uso de FACS. As células T pan foram transduzidas de modo bemsucedido com as partículas lentivirais recombinantes codificando os MRB -CARs candidatos.
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395/540 [933] A atividade citotóxica dos MRB-CARs candidatos contra células-alvo expressando Alvo 1 ou Alvo 2 (CHO-Alvo 1 e CHO-Alvo 2, respectivamente) foi analisada a um pH de 7,4 (tecido normal) ou um pH de 6,7 (pH reduzido de um microambiente de tumor) por Sistema xCELLigence (ACEA). Brevemente, as células-alvo que expressam o Alvo 1 ou Alvo 2 foram semeadas a uma E-placa de 96 poços a 20.000 células/poço com meio normal ou condicional de tumor um dia antes do experimento. As células efetoras foram repousadas por dois dias em meio de célula humana T contendo 100 lU/ml de IL-2 e adicionadas em poços experimentais contendo células-alvo em razão de célula efetora/célula-alvo (E/T) de 3:1, 1:1 e 0,3:1.
[934] As leituras de impedância foram realizadas a cada 5 minutos por aproximadamente 40 horas após a adição das células efetoras e a impedância foi relatada como o índice de Células (IC). A porcentagem de citólise específica foi calculada como se segue ((células T efetoras transduzidas com vírus Cl + Alvo) - (células Alvo CI + T efetoras transduzidas com CARs dirigidas para Alvo 1 ou Alvo 2)/(células T efetoras transduzidas por vírus Cl + Alvo) x 100
Resultados [935] Muitos dos MRB-CARs candidatos tiveram atividade citotóxica mais alta nas células-alvo a um pH de 6,7 do que a um pH de 7,4. Os MRB-CARs exemplificativos que foram mais eficazes na lise de células-alvo em um pH de 6,7 do que em um pH de 7,4 incluíram MRB-CAR TIA, MRB-CAR T2A e MRB-CAR T2B. A ASTR de MRB-CAR TIA compreendeu, de 5’ a 3’, Alvo 1 MRB VH (SEQ ID NO:281) e Alvo 1 MRB VL (SEQ ID NO:282) separado por Ligante 1 (SEQ ID NO:283). A ASTR de MRB-CAR T2A compreendeu, de 5’ a 3’, Alvo 2 MRB VH (SEQ ID NO:289) e Alvo 2 MRB VL (SEQ ID NO:290) separado por Ligante 2 (SEQ ID NO:291). A ASTR de MRB-CAR T2B foi igual a MRB-CAR T2A, exceto pelo fato de que as posições de VH e VL foram trocadas.
Exemplos 4. Construção de riboswitches induzíveis por ligante.
[936] O aptâmero de riboswitch de desoxiguanosina e os aptâmeros de riboswitch de guanina (Pikovskaya, 2014; Kim, 2007) ou outros aptâmeros de riboswitch de purina são sintetizados como oligonucleotídeos. Em um exemplo, o riboswitch de desoxiguanosina IA de Mesoplasma florum (sublinhado e em negrito na Figura 6, Figura 7) é
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396/540 selecionado para a evolução para gerar um riboswitch responsivo a aciclovir. Em outro exemplo, o riboswitch de xpt de guanina de Bacillus subtilis (sublinhado e em negrito na Figura 10, Figura 11) é selecionado para a evolução para gerar um riboswitch responsivo a aciclovir. Para cada um desses dois exemplos, uma biblioteca de RNA aleatória é gerada com nucleotídeos alternados em posições de sequência alvejadas nos segmentos P2, P3, Jl-2 e J2-3 (Figuras 7 e 11). Cada segmento permite 3 ácidos nucleicos alternados em cada posição de sequência alvejada ou, alternativamente, deleção e inserção de base de 4 nucleotídeos no sítio +1 em cada posição de sequência alvejada para mutagênese por saturação conforme indicado nas Figuras 8A a 8B e 9 (M. florum IA) e Figuras 12A a 12B e 13 (B. subtilis xpt). A extensão de iniciador e a preparação de reagente são seguidas de transcrição de RNA. A biblioteca de RNA resultante é negativamente selecionada em óxido de grafeno na presença de guanina, guanosina e desoxiguanosina seguido da seleção positiva com aciclovir ou penciclovir. Durante os processos de seleção positiva e negativa, os níveis de magnésio fisiológicos de célula humana (0,5 mM a 1,2 mM) são usados, e a temperatura é mantida a 37 °C. Os aptâmeros recuperados são transcritos de modo reverso e amplificados por PCR seguido de transcrição e triagem subsequente por pelo menos 8 ciclos de seleção sucessivos. Em uma abordagem paralela, os aptâmeros são triados com uma triagem negativa adicional a 40 °C. Os agrupamentos positivos resultantes são examinados por sequenciamento e análise NextGen. Os aptâmeros individuais são sintetizados e examinados quanto à afinidade por calorimetria isotérmica a 35 a 40 °C em níveis de magnésio fisiológicos de célula humana. Após a seleção de aptâmeros específico para aciclovir e penciclovir positivos, os aptâmeros são integrados à ribozima cabeça de martelo e ribozimas pistola. Os aptâmeros seletivos de aciclovir positivos são combinados com ribozimas pistola para identificar as ribozimas reguladas por aciclovir. (Harris KA RNA. novembro de 2015;21(l 1): 1852-8. doi: 10.1261/rna). As variantes são submetidas à purificação por PAGE com base em deslocamento de gel na presença de aciclovir e ausência de penciclovir. Adicionalmente, o riboswitch seletivo de acicloguanosina é colocado imediatamente 3' em um laço a um aceitante de splicing a montante do construto de CAR/IL-7. Na ausência de aciclovir, a posição de sítio de splicing é ligada no complexo de riboswitch, mas na presença de aciclovir se torna acessível, gerando um transcrito de CAR funcional.
Exemplo 5. Construção de domínios de propagação in vivo.
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397/540 [937] Uma série de mutantes de transmembrana de receptor de IL7 (IL7R) constitutivamente ativos de leucemias linfoblásticas de célula T (243 InsPPCL (SEQ ID NO:82); 246 InsKCH (SEQ ID NO: 101); 241 InsFSCGP (SEQ ID NO: 102); 244 InsCHL (SEQ ID NO: 103); e 244 InsPPVCSVT (SEQ ID NO: 104); todos de Shochat et al 2011, J. Exp. Med. Volume 208 no 5 901-908) é sintetizada sobrepondo-se a síntese de oligonucleotídeo (DNA2.0, Newark, Califórnia). Os mutantes de transmembrana de IL7R constitutivamente ativos sintetizados são inseridos em uma cadeia principal de vetor lentiviral de expressão constitutiva atrás de uma sequência de salto de ribossoma 2A seguido de um cassete de expressão €Ό3ζ antiCD19, que inclui uma haste de CD8A (SEQ ID NO:79) e um peptídeo de iniciação (SEQ ID NO:74). As células de empacotamento HEK293 são transfectadas com os vetores lentivirais de mutante de transmembrana de IL7R e construtos de empacotamento lentiviral, e os sobrenadantes cultivados e virais são coletados com o uso dos métodos conhecidos na técnica. As células T estimuladas com CD3/CD28 são transduzidas com os sobrenadantes virais e cultivadas nos meios AIM V deficiente de IL2, CTS OpTmizer Cell T Expansion SFM ou X-VIVO 15 por 4 semanas, suplementados semanalmente com PBMCs congeladas do mesmo doador. As variantes de IL7R que expressam células T transduzidas expandidas são clonadas por classificação FACS e as sequências dos construtos de IL7R são identificadas pelo sequenciamento de produtos de RTPCR. A variante 243 InsPPCL (PPCL) (SEQ ID NO:82) é selecionada para a evolução adicional para gerar um CAR condicionalmente ativo.
Exemplos 6. Triagem de componentes acessórios para ativação e propagação de car-t.
[938] Uma série de domínios de codificação de proteína (ABCG1, SOCS1, SMAD2, TGFBR2, cCBL e PD1) e sequências de miRNA é construída para incorporação em um íntron sintético na fita reversa de um cassete de CAR acionado por promotor de CD3. Cada construto contendo o cassete de CAR acionado por promotor de CD3 e um domínio de codificação de proteína ou sequência de miRNA inclui códigos de barras exclusivos para sequenciamento profundo e é montado com o uso de montagem Gibson seguido de transformação e expansão de biblioteca em E. coli. Estoque virais são produzidos e usados para transduzir células T estimuladas por CD3/CD28 nos meios AIM V, CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM ou X-VIVO 15 sem IL2 e deixados proliferar por 4 semanas em cultura com amostragem em série de DNA para amplificação e sequenciamento profundo para identificação de código. A biblioteca é também
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398/540 submetida ao sequenciamento de comprimento completo PACBio para determinar a diversidade de biblioteca e para decodificar os componentes de código de barras. As sequências de miRNA e domínios de codificação de proteína são testados para ativação sinérgica de domínios €Ό3ζ de CAR.
Exemplos 7. Modificação genética de um sistema de transdução e empacotamento retroviral para ter como alvo células t em repouso para integração de célula t seletiva e expressão de pbmcs.
[939] Embora a produção de vetores lentivirais de alto título por transfecção temporária seja possível, esse método carrega o risco de gerar retrovirus competentes m replicação (RCRs) e não é escalonável para aplicações clínicas. No presente documento, uma linhagem de células de empacotamento retroviral estável é gerada pela introdução simultânea de múltiplos construtos que codificam promotores induzíveis e seus reguladores em células adaptadas à suspensão HEK293 (HEK293S) para produzir estavelmente os componentes virais, genes de CAR e seus componentes reguladores. Dois sistemas induzíveis distintos podem ser usados para controlar temporariamente a expressão de genes. Um sistema baseia-se na dimerização induzida por rapamicina ou rapalog de dois fatores de transcrição. Um fator de transcrição consiste em três cópias da proteína FKPB fundida a um domínio de ligação a DNA ZFHD1 e o outro fator de transcrição consiste em uma proteína FRB fundida a um domínio de ativação p65. A rapamicina ou um rapalog dimeriza os fatores de transcrição para formar ZFHDl/p65 AD e pode ativar a transcrição de gene em sítios de ligação 12xZFHDl.
[940] Uma série de vetores conforme mostrado nas Figuras 3A a 3E é gerada com sequências de transposon de flanqueamento para integração ao genoma de HEK293S. Uma vez integradas no genoma de uma célula, essas sequências funcionam como componentes reguladores e sítios lox e/ou FRT para integração subsequente com o uso de Cre e/ou flp recombinases, no presente documento denominadas blocos de depósito. Os 5 construtos iniciais contêm sequências de polinucleotídeos que codificam resistência à puromicina, GFP, RFP e uma etiqueta MYC extracelular que é direcionada à membrana celular através de um PLss N-terminal (peptídeo de sinalização de prolactina bovino) e ancorada à membrana celular através de um domínio de ancoragem de transmembrana C-terminal de receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR). Os 5 construtos iniciais podem também incluir CMV mínimo
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399/540 constitutivo e promotores de IL-2 mínimos, um promotor à base de ZFHD1 regulado por rapamicina, um promotor de elemento responsivo à tetraciclina (TRE) ou um promotor de TRE bidirecional (BiTRE). O construto na Figura 3A contém uma sequência de polinucleotídeos que codifica o domínio FRB fundido ao domínio ativador NFkB p65 (p65 AD) e domínio de ligação de DNA de ZFHD1 fundido a três repetições FKBP que é constitutivamente expresso. O construto na Figura O construto na Figura 3A também inclui REV de HIV 1 e SrcFlagVpx de domínio HSV VP65 sob o promotor de ZFHDl/p65 AD induzível por rapamicina. O construto na Figura 3B inclui um polinucleotídeo que codifica uma sequência de rtTA sob o controle do promotor de ZFHDl/p65 AD. O construto na Figura 3C inclui um polinucleotídeo que codifica um gene de resistência à puromicina flanqueado por sítios loxP e a etiqueta MYC extracelular flanqueada por sítios lox2272. Ambos esses marcadores selecionáveis estão sob o controle de um promotor BiTRE, que é flanqueado por sítios FRT. O construto na Figura 3D inclui um polinucleotídeo que codifica GFP flanqueada por sítios loxP que está sob o controle de um promotor TRE. O construto na Figura 3D também inclui um único sítio FRT entre o promotor TRE e o sítio 5' loxP de GFP. O construto na Figura 3E inclui um polinucleotídeo que codifica RFP flanqueada por sítios loxP que está sob o controle do promotor ZFHDl/p65 AD. O construto na Figura 3E também inclui um único sítio FRT entre o promotor ZFHDl/p65 ADe o sítio 5' loxP de RFP. Os construtos nas Figuras 3C a 3E funcionam como blocos de depósito para outras sequências de polinucleotídeos para inserção no genoma da linhagem de células de empacotamento. As sequências de polinucleotídeos a serem inseridas podem ser flanqueadas por sítios lox e inseridas no genoma com o uso de Cre recombinase e dos sítios loxP. Isso resulta na inserção e remoção simultânea das regiões genômicas que codificam a resistência à puromicina, a etiqueta MYC extracelular, GFP e RFP. Alternativamente, as sequências de polinucleotídeos podem ser flanqueadas por sítios FRT e inseridas no genoma com o uso de flp recombinase e dos sítios FRT seguido da remoção das sequências de polinucleotídeos que codificam a resistência à puromicina, a etiqueta MYC extracelular, GFP e RFP com o uso de Cre recombinase.
[941] Para gerar a linhagem de células de empacotamento com blocos de depósito integrados no genoma, células HEK293S são cotransfectadas com concentrações equimolares dos 5 plasmídeos (Figuras 3A a 3E) mais 5 pg de mRNA de piggybac transposase transcrito in vitro ou 5 pg de um plasmídeo com um promotor para expressar piggybac transposase
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400/540 na presença de PEI a uma razão de 2:1 ou 3:1 entre PEI e DNA (em p/p) ou 2 a 5 pg da proteína piggybac transposase com o uso de uma mistura de peptídeo catiônico. As células transfectadas são selecionadas com puromicina na presença de 100 nm de rapamicina e 1 ug/ml de doxiciclina por 2 a 5 dias seguido da classificação de célula ativada por fluorescência para coletar células que expressam GFP e RFP. As células classificadas são cultivadas 5 dias na ausência de puromicina, rapamicina e doxiciclina, e as células que expressam GFP e RFP são removidas, também, células positivas para myc são removidas com microesferas de myc. Os clones individuais de células negativamente classificadas são, então, triados para indução de GFP e RFP por rapamicina e doxiciclina e célula única clonada. O DNA de clones é coletado e sequenciado para análise de integração. Os clones positivos para expressão induzível forte de GFP e RFP na presença de rapamicina e doxiciclina com expressão de fundo limitada na ausência de rapamicina e doxiciclina são expandidos e depositados.
[ 942 ] As células HEK293S com os construtos das Figuras 3A a 3E integrados ao genoma são, então, transfectadas com um construto contendo um polinucleotídeo tricistrônico que codifica uma sequência de sinalização de DAF/scFVFc anti-CD3 (UCHTl)/sítio de ligação de âncora de GPI de CD14 (SEQ ID NO:287), uma sequência de sinalização de DAF/domínio extracelular de CD80 com capacidade para se ligar a CD28/sítio de ligação de âncora de GPI de CD16B (SEQ ID NO:286) e uma sequência de sinalização de DAF/IL-7/DAF (SEQ ID NO:286) e sequências de transposons que flanqueia a região de polinucleotídeo para integração ao genoma de HEK293S (Figura 4A). Após transfecção, as células são expandidas por 2 dias na ausência de rapamicina e doxiciclina, e colônias que são constitutivamente vermelhas são selecionados. As colônias positivas são, então, transitoriamente transfectadas com um construto para expressar Cre recombinase para remover o DNA genômico restante, e a região de codificação de RFP. Outro construto (Figura 4B) contendo um polinucleotídeo com um promotor BiTRE e uma região de polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos gag e pol em uma direção e uma região de polinucleotídeo que codifica as proteínas F e H do vírus do sarampo na outra direção é transfectado ao mesmo tempo. A Cre recombinase integra o construto ao genoma para gerar a sequência integrada mostrada na Figura 4B. As colônias resultantes são avaliadas para expressão de proteína na presença de doxiciclina e rapamicina e analisadas por sequenciamento profundo para integração genômica. O sítio de GFP responsivo a TRE restante é retido para a inserção de
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401/540 genoma lentiviral.
Exemplo 8. Geração de vetor de lentivírus e empacotamento retroviral.
[943] A linhagem de células estáveis de empacotamento retroviral geradas no Exemplo 7 é transfectada com um construto (Figura 4C) para expressar Flp recombinase e um construto contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CAR e o elemento linfoproliferativo IL7Ra-insPPCL sob o controle de um promotor CD3Z que não é ativo em células HEK293S, em que o CAR e IL7Ra-insPPCL são separados por uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma sequência de salto de ribossoma T2A e o IL7Ra-insPPCL tem uma ribozima controlada por riboswitch de aciclovir. O construto contendo CAR inclui adicionalmente cPPT/CTS e sequências de RRE e uma sequência de polinucleotídeos que codifica HIV-1 Psi. A sequência de polinucleotídeos inteira no construto contendo CAR a ser integrado ao genoma é flanqueada por sítios FRT. A integração bem-sucedida do construto contendo CAR causa a expressão constitutiva de GFP que é consequentemente removida por transfecção temporária com um construto para expressar Cre recombinase. A linhagem HEK293S é cultivada em meio isento de soro. Após o crescimento até a densidade de célula de pico em um reator de tanque agitado, as células são diluídas a uma densidade de célula de pico de 70% e tratadas com rapamicina 100 nM por 2 dias para induzir a expressão de genes precoces REV, Vpx e aCD3 scFv CD16B GPI, aCD28 scFv CD16B GPI e IL-7 SD GPI DAF seguido da adição de 1 ug/ ml doxiciclina no meio para induzir a expressão de elementos estruturais como Gag Pol, MV(Ed)FA30, MV(Ed)-HA18 e genoma lentiviral incluindo o alvo terapêutico. Os níveis de produção de vírus são examinados por qPCR da sequência de empacotamento e p24 ELISA. O vírus é coletado por filtrações profunda das células e concentração/diafiltração com o uso de um cartucho TFF seguido de congelamento rápido para colocação em frasco.
Exemplos 9. Isolamento, transdução e expansão de célula mononuclear de sangue periférico (pbmc).
[944] O exemplo a seguir ilustra o uso de um sistema fechado para processamento ex vivo de PBMCs antes da expansão in vivo. Como um exemplo, 30 a 200 ml de sangue humano é drenado de um sujeito com Solução de Citrato Ácido Dextrose (ACD) como um anticoagulante em uma bolsa de coleta de sangue. Alternativamente, o sangue é drenado para tubos Vacutainer, uma seringa ou um equivalente e é transferido para uma bolsa IV ou de coleta
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402/540 de sangue vazia. O sangue total é processado com o uso de um kit Neat Cell (no de catálogo CS900.2, Omniamed) em um sistema de processamento de célula Sepax 2 (BioSafe) de acordo com as instruções do fabricante. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) são coletadas ou em uma bolsa de cultura ou, alternativamente, uma seringa. Uma alíquota é retirada assepticamente para contagem de células para determinar o número de células viáveis. As PBMCs são transferidas para um dispositivo de Sistema de Cultura Celular Permeável a Gás GRexlOOMCS (Wilson Wolf) a uma concentração final de 0,1 a 1,0 x 106 células viáveis/ml nos meios X-VIVO 15 (no de catálogo 08-879H, Lonza) ou CTS OpTmizer Cell Expansion SFM (no de catálogo A1048501, Thermo Fisher Scientific) com 10 a 300 IU/ml de IL-2 (no de catálogo 202-IL-010, R&D Systems) em até 200 ml de volume final. Adicionalmente à IL-2, CTS Immune Cell SR (no de catálogo A2596101, Thermo Fisher Scientific) pode ser adicionado ao meio. O dispositivo de Sistema de Cultura Celular Permeável a Gás G-Rex fechado pode ser pré-revestido com Retronectina (no de catálogo CH-296, Takara) ou um equivalente derivado de fibronectina similar, de acordo com as instruções do fabricante.
[945] As PBMCs isoladas do sangue periférico são carregadas em um filtro de PBMC PALL, lavadas uma vez através do filtro com 10 ml de meios AIM V (Thermo Fisher Scientific) ou X-VIVO 15 seguido de perfusão com 10 a 60 ml de estoque de lentivírus (conforme preparado no Exemplo 8) a 37 °C a 5 ml/h. As PBMCs são, então, lavadas novamente com os meios AIM V, CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM ou X-VIVO 15 contendo DNase humana recombinante (Pulmozyme, Genentech) seguido de uma lavagem com DNase-free Lactated Ringers (no de catálogo L7500, Braun). As PBMCs são, então, perfundidas de modo reverso através do filtro para uma seringa. As células (os níveis-al vo de células são 5xl05alxl06 células/kg) são, então, reinfundidas no sujeito através de infusão intravenosa.
[946] Dependendo do riboswitch contido dentro do genoma retroviral, o sujeito recebe o respectivo fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo ou pró-fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo (aciclovir, valaciclovir, penciclovir ou fanciclovir). Os sujeitos podem receber qualquer dose terapeuticamente eficaz, tal como 500 mg do fármaco ou pró-fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo oralmente três vezes/dia. O tratamento com o fármaco ou prófármaco antiviral de análogo de nucleosídeo começa, de preferência, antes da reinfusão, tal como 2 horas antes, e pode também começar no momento da reinfusão ou em algum momento após a
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403/540 reinfusão. O tratamento pode continuar por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 120 dias ou 5, 6, 9, 12, 24, 36 ou 48 meses ou mais. O tratamento pode incluir a administração do fármaco ou pró-fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo uma vez, duas vezes, três ou quatro vezes por dia. Após a reinfusão e o tratamento serem iniciados, o número de células infectadas é determinado através de contagens sanguíneas nos dias 2, 5, 7, 11, 13, 18, 28 e 56 pós-reinfusão com o uso de qPCR para quantificar a quantidade de genoma viral. Um sujeito que experimenta febre ou síndrome de liberação de citocina pode ter a dose ou frequência do fármaco ou prófármaco antiviral de análogo de nucleosídeo reduzida ou interrompida. Se as células T infectadas falharem em amplificar 10.000 a 100.000 vezes até o dia 18, a dose ou frequência do fármaco ou pró-fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo pode ser aumentada. A resposta clínica do sujeito pode ser medida através de imaginologia FDG PET e varredura CT em série. A dosagem oral do fármaco ou pró-fármaco antiviral de análogo de nucleosídeo pode ser reduzida ou interrompida após remissão prolongada ou no caso de propagação excessiva de células T além de 30% das contagens de células T periféricas totais.
Exemplos 10. Intervenção terapêutica para elevar o ph vascular ou de tecido.
[947] Para reduzir a ligação de um domínio de ligação a antígeno a seu antígeno cognato, NaHCO3 é administrado como um bolus IV ou por infusão IV. A dosagem padrão é 1 mg/kg de peso corporal como a dose inicial seguida por 0,5 mg/kg a cada 10 minutos. Um bolus de 50 mililitros de NaHCO3 elevará o pH sérico aproximadamente 0,1 de uma unidade de pH. Se o pH for 7,0, o mesmo exige quatro ampolas de 50 mEq de HCO3 para corrigir o pH a 7,40
Exemplos 11. Teste de atividade de elementos de sobre vi vência/linfoproliferati vos de receptor de il-7 em pbmcs.
[948] Para testar as variantes de IL-7Ra quanto à sua capacidade para mediar a sobrevivência independente de citocina de células T, trinta mililitros de sangue humano foram drenados com citrato ácido dextrose (ACD) como um anticoagulante em tubos Vacutainer. O sangue total foi processado com o uso de centrifugação por gradiente de densidade com FicollPacque™ (General Electric) seguindo as instruções do fabricante para obter células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). As alíquotas das PBMCs foram assepticamente transferidas para cavidades de uma placa de cultura de tecido de 12 cavidades, juntamente com o meio X-Vivo™ 15 (Lonza) a uma concentração final de 0,5 milhão de células viáveis/ml em um
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404/540 volume final de 1 ml. A interleucina-2 (IL-2) humana recombinante (Novoprotein) foi também adicionada a uma concentração de 100 lU/ml em algumas amostras. Ab anti-CD3 de ativação (OKT3, Novoprotein) foi adicionado a uma concentração de 50 ng/ml para ativar a PBMC para transdução viral. As placas foram incubadas de um dia para o outro em uma incubadora de cultura de tecido umidificada padrão a 37 graus C e 5% de Dióxido de Carbono. Após a incubação de um dia para o outro, preparações de partícula de len ti vírus contendo os construtos de teste desejados (Figura 19A) foram adicionadas a cavidades individuais a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. A placa foi incubada de um dia para o outro em uma incubadora de cultura de tecido umidificada padrão a 37 graus C e 5% de Dióxido de Carbono. Após a incubação de um dia para outro, o conteúdo de cada uma das cavidades da placa de 12 cavidades foi coletado e centrifugado para obter um pélete. As amostras foram lavadas uma vez com D-PBS + Albumina Sérica Humana 2% (HSA), ressuspensas em meio X-Vivol5™ e transferidas para cavidades de dispositivos de cultura celular permeável a gás de 6 cavidades G-Rex® (Wilson Wolf). Mais meio X-Vivo™ 15 foi adicionado para levar o volume final de cada cavidade a 30 ml. As amostras de controle correspondentes para cada um dos construtos foram transferidas para cavidades de dispositivos de cultura celular permeável a gás de 6 cavidades G-Rex® (Wilson Wolf) e mais meio foi adicionado para levar o volume final a 30 ml com 100 lU/ml de IL-2 para algumas amostras de controle. O dispositivo G-Rex® foi incubado em uma incubadora de cultura de tecido umidificada padrão a 37 graus C e 5% de Dióxido de Carbono por 7 dias. IL-2 fresca foi adicionada às amostras de controle contendo IL-2 durante a cultura a cada 2 a 3 dias. As amostras de teste correlacionadas sem IL-2 não foram suplementadas. As amostras foram removidas para rastrear os números de células e a viabilidade durante a expansão (Countess, Thermo Fisher) no dia 7.
[949] A Figura 19A fornece um desenho esquemático dos construtos de IL7Ra que foram testados. Esses construtos foram inseridos em um genoma lentiviral recombinante. As partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação foram usadas para transduzir PBMCs. A Figura 19A mostra um desenho esquemático de IL7Ra do tipo selvagem (SEQ ID NO:229), que consiste em uma sequência de sinalização (SS), um domínio extracelular (ECD), uma transmembrana (TM) e um domínio intracelular (ICD). 1” indica o sítio de um domínio de fibronectina tipo III; “2” indica o sítio de um motivo WSXWS; “3” indica um sítio Box 1, “4”
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405/540 indica o sítio de um sítio de fosforilação de proteína quinase C (PKC), e “5” indica um sítio Box 2.
[950] A variante “A” é o IL-7Ra com um InsPPCL na posição 243 (Shochat et al 2011, J. Exp. Med. Volume 208 no 5 901 a 908), mas sem a mutação S185C, expresso em um transcrito com um polipeptídeo de GFP, um aglutinante GSG e uma sequência de salto de ribossoma P2A fundida a sua terminação N. A variante “B” é o IL-7Ra InsPPCL com um polipeptídeo de GFP, um aglutinante GSG e uma sequência de salto de ribossoma P2A fundida a sua terminação N assim como uma Etiqueta Myc entre a sequência de sinalização e o domínio extracelular. A variante “C” é similar à variante “B” exceto pelo fato de que seu domínio intracelular é truncado na posição 292. A variante “D” é similar à variante “A” exceto pelo fato de que seu domínio intracelular é truncado na posição 292. A variante “E” é a variante de IL-7Ra InsPPCL truncada em sua terminação N de modo que a sequência de sinalização e a maior parte do domínio extracelular (resíduos 1 a 228) não estejam presentes; a variante “E” também tem um polipeptídeo de GFP, um aglutinante GSG, uma sequência de salto de ribossoma P2A e um eTag fundido à terminação N, nessa ordem a partir da terminação amino. A numeração dos resíduos de aminoácidos baseia-se em IL7Ra (NCBI GI No. 002176.2). As células T contendo cada uma das variantes foram testadas quanto à viabilidade na presença ou ausência de IL-2 com o uso de exclusão por Azul de Tripano.
[951] Conforme mostrado na Figura 19B, as PBMCs exigem IL-2 para sobrevivência in vitro. Como ilustrado na Figura 19B, as PBMCs não transfectadas têm cerca de 80% de viabilidade na presença de IL-2 e 0% de viabilidade na ausência de IL-2 aos 7 dias após a transdução. As PBMCs que têm as versões de comprimento total de IL-7Ra InsPPCL (variantes de IL-7Ra A e B na Figura 19A) tiveram mais de 20% de viabilidade na ausência de IL-2 7 dias após a transdução, indicando que a expressão do receptor de InsPPCL de IL-7Ra constitutivamente ativo tem atividade de sobrevivência nessas células. Ademais, células T que expressam as variantes de InsPPCL de IL-7Ra com um domínio intracelular truncado (ICD) (variantes de IL-7Ra C e D na Figura 19A) tiveram viabilidade aumentada aos 7 dias após a transdução comparada com o receptor de IL-7 de tipo selvagem. Por fim, o receptor N-terminal de IL-7 mutante (variante E de IL-7Ra na Figura 19A) como mostrado na Figura 19B obteve atividade de sobrevivência nessas células. Consequentemente, esse exemplo ilustra que o receptor
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406/540 de IL-7 tem atividade de sobrevivência quando expresso em PBMCs.
Exemplo 12. Eficácia de transdução de células T humanas não estimuladas e recémisoladas por partículas retrovirais pseudotipadas com vsv-g e expressando scfvfc anti-cd3 EM SUAS superfícies.
[952] As partículas lentivirais recombinantes foram produzidas por transfecção temporária de células 293T (Lenti-X™ 293T, Clontech) com plasmídeos de empacotamento lentivirais separados que codificam gag/pol e rev, e um plasmídeo de pseudotipagem que codifica VSV-G. Um vetor de expressão lentiviral da terceira geração (contendo uma deleção na 3’LTR, levando à autoinativação) codificando GFP, um receptor de antígeno quimérico anti-CD19, e uma eTAG chamada, no presente documento, de Fl-0-03 (Figura 20) foi cotransfectada com os plasmídeos de empacotamento. As células foram adaptadas a cultura de suspensão por crescimento em série em Meio de Expressão de 293 Freestyle™ (ThermoFisher Scientific). As células em suspensão foram semeadas em 1 χ 106 células/ml (30 ml) em um frasco Erlenmeyer de 125 ml, e imediatamente transfectadas com o uso de polietilenimina (PEI) (Polysciences) dissolvida em ácido fraco.
[953] O DNA plasmídico foi diluído em 1,5 ml de meio Gibco™ Opti-MEM™ para 30 ml de células. Para obter partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G, o DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) usado foi uma mistura de 4 plasmídeos com as seguintes razões molares: 2x plasmídeo genômico (Fl-0-03), Ix plasmídeo contendo Rev, Ix plasmídeo contendo VSV-G e Ix plasmídeo contendo gag/pol. Para obter partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G e expressando um antiCD3-scFvFc-GPI em suas superfícies, o DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) usado foi uma mistura de 5 plasmídeos com as seguintes razões molares: 2x plasmídeo genômico (Fl-0-03), Ix plasmídeo contendo Rev, Ix plasmídeo contendo VSV-G, Ix plasmídeo contendo anti-CD3-scFvFc-GPI e Ix plasmídeo contendo gag/pol. Para obter partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G e expressando um anti-CD3-scFvFc-GPI e CD80-GPI em suas superfícies, o DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) usado foi uma mistura de 6 plasmídeos com as seguintes razões molares: 2x plasmídeo genômico (Fl-0-03), Ix plasmídeo contendo Rev, Ix plasmídeo contendo VSV-G, Ix plasmídeo contendo anti-CD3scFvFc, Ix plasmídeo contendo CD80, e Ix plasmídeo contendo gag/pol. Separadamente, o PEI foi diluído em 1,5 ml de Gibco™ Opti-MEM™ para 2 pg/ml (volume de cultura, razão de 2:1
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407/540 para DNA). Após uma incubação a temperatura ambiente de 5 minutos, misturaram-se bem as duas soluções e incubaram-se à temperatura ambiente durante mais 20 minutos. O volume final (3 ml) foi adicionado às células. As células foram então incubadas a 37 °C durante 72 horas com rotação a 125 rpm e com 8% de CO2. Os plasmídeos contendo antiCD3-scFvFc-GPI incluíram scFvs derivadas de OKT3 ou UCHT1, e uma sequência de ligação de âncora de GPI. O vetor de UCHTlscFvFc-GPI codifica um peptídeo (SEQ ID NO:278) que inclui o peptídeo de sinal KAPPA de Ig humana (aminoácidos 1 a 22 de NCBIGI n° CAA45494.1) fundido com o UCHT1 scFv (aminoácidos 21 a 264 de NCBI GI n° CAH69219.1), fundidos à IgGl humana Fc (aminoácidos 1 a 231 de NCBI GI No. AEV43323.1) como é uma substituição de A para T na posição 115, fundida à sequência de ligação de âncora de GPI de DAF humana (aminoácidos 345 a 381 de NCBI GI No. NP_000565). O vetor OKT3scFvFc-GPI codifica um peptídeo (SEQ ID NO:279) que inclui um peptídeo de sinal KAPPA de Ig humana (aminoácidos 1 a 22 de NCBI GI No. CAA45494.1) fundido a OKT3 scFv (SEQ ID NO:285) fundido à IgGl humana Fc (aminoácidos 1 a 231 de NCBI GI No. AEV43323.1) fundida à sequência de ligação de âncora de GPI de DAF humana (aminoácidos 345 a 381 de NCBI GI No. NP_000565). O CD80-GPI vetor codifica um peptídeo (SEQ ID NO:280) que inclui o peptídeo de sinal de CD80 humano e domínio extracelular (aminoácidos 1 a 242 de NCBI GI No. NP_005182) fundido à sequência de ligação de âncora de GPI de CD16b humana (aminoácidos 196 a 233 de NCBI GI No. NP_000561).
[954] Após 72 horas, os sobrenadantes foram coletados e clarificados por centrifugação a 1.200g por 10 minutos. Os sobrenadantes clarificados foram decantados para um novo tubo. As partículas lentivirais foram precipitadas por centrifugação de um dia para o outro a 3.300g, a 4 °C. O sobrenadante foi descartado, e os péletes de partícula lentiviral foram ressuspensos em 1:100 de volume inicial de meio 15 X-Vivo™ (Lonza). As partículas lentivirais foram tituladas por diluição serial e análise de expressão de GFP, em células 293T e Jurkat, 72 horas pós-transdução, por citometria de fluxo.
[955] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram primeiro isoladas no sangue fresco em tubos de ACD (dextrose de citrato de ácido), para doadores 12F e 12M, ou de um revestimento volumoso para o Doador 13F, coletado e distribuído pelo Banco de Sangue de San Diego, CA. A separação de densidade de gradiente à base de SepMate™ 50
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408/540 (Stemcell™) de PBMCs em Ficoll-Paque PLUS® (GE Healthcare Life Sciences) foi realizada conforme as instruções do fabricante. 30 ml de sangue ou revestimento volumoso diluído em PBS-2% de HIFCS (soro de novelo fetal inativado por calor) foram dispostos em camadas por cada tubo de SepMate™. Após a centrifugação à temperatura ambiente, a 1.200g, por 20 min, as camadas de PBMC foram coletadas, agrupadas e lavadas três vezes com 45 ml de PBS-2% de HIFCS e centrifugação a 400 g por 10 min à temperatura ambiente. Os péletes, então, incubados à temperatura ambiente por 10 min em 10 ml de tampão de lise de RBC (Alfa Aesar) e lavados duas vezes adicionais com 45 ml de PBS-2% de HIFCS, e centrifugação de 400 g por 10 min à temperatura ambiente. Uma lavagem final foi realizada na transdução e meio de cultura: XVivo™ 15 para o Doador 13F, ou RPMI-1640+10% de HIFCS para Doadores 12F e 12M. Nenhuma etapa adicional foi realizada para remover monócitos. Após o isolamento, PBMCs frescas e não estimuladas foram ressuspensas a uma concentração final de 1 x 106/ml em seu respectivo meio, e foram transduzidas, em duplicatas ou triplicatas, com as partículas lentivirais reveladas anteriormente. As transduções foram conduzidas por 14 h, a 37 °C, 5% de COz, em meio de X-Vivo™ 15 para o Doador 13F, ou em RPMI-1640+10% de HIFCS para os Doadores 12F e 12M. As transduções foram geralmente conduzidas a MOI 1 in em um formato de placa de 12 poços, 1 ml/poço. Para o experimento cinético, 0,5 x 106 PBMCs/ml foram transduzidas em 7 ml final, em MOI 1, em um frasco de agitação de 125 ml incubado a 37 °C por 2 a 20 h horas com rotação a 125 rpm e com 8% de CO2. Após a incubação com as partículas retrovirais pelo tempo selecionado, as células foram lavadas três vezes com meio X-Vivo™ 15 para Doador 13F, ou PBS+2% de HIFCS para Doadores 12F e 12M e, por fim, incubadas a uma densidade celular de Ix 106/ml em meio de X-Vivo™ 15 para o Doador 13F, ou RPMI-1640+10% de HIFCS para Doadores 12F e 12M, em 37°C, 5% de CO2. A partir do dia 3 após a transdução, e a cada 2 a 3 dias a partir de então, o volume do meio foi dobrado e suplementado com IL-2 a uma concentração final de 100 U/ml. As amostras foram coletadas em vários dias pós-transdução (Dia 3 a 17) para avaliar, através de níveis de expressão de GFP, as eficácias de transdução de cada tipo de lentivírus que foi gerado.
[956] Em vários dias pós-transdução, para as partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G, com ou sem anticorpo de OKT3 (Biolegend) a 1 pg/ml; partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G e que expressam scFvFc anti-CD3-GPI em sua superfície;
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409/540 ou partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G e que expressam scFvFc anti-CD3-GPI e CD80-GPI em sua superfície; 100 pL de células foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo para expressão de GFP na população de célula CD3+.
[ 957 ] As Figuras 21A e Figura 21B mostram um histograma da porcentagem (%) de células de CD3+GFP+ na população de CD3+ total e um histograma da contagem de célula absoluta por poço da população de CD3+GFP+, respectivamente, em 3, 6, 9, 13 e 17 dias após a transdução de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas do Doador 12M, por 14 h com as partículas lentivirais indicadas. Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas. As Figuras 21A e 21B mostram que as partículas lentivirais de pseudotipagem com VSV-G e que expressam antiCD3-scFvFc na superfície das partículas lentivirais transduzem de modo eficaz as PBMCs recém-isoladas e não estimuladas. Os scFvs Anti-CD3 derivados de OKT3 ou UCHT1, quando na forma de um scFvFc-GPI, foram eficazes.
[958] As Figuras 22A e Figura 22B mostram um histograma da porcentagem (%) de células de CD3+GFP+ na população de CD3+ total e um histograma da contagem de célula absoluta por poço da população de CD3+GFP+, respectivamente, em 3 e 6 dias após a transdução de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas do Doador 13F, por 14 h com as partículas lentivirais indicadas. Observa-se que “A” são resultados com o uso de partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G (experimentos triplicados); “B” são resultados com o uso de partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G com OKT3 Ab (1 ug/ml) adicionadas ao meio de transdução (experimentos duplicados); “C” são resultados com o uso de partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G expressando UCHT1 scFvFc ancorado em GPI em sua superfície (experimentos triplicados); e “D” são resultados com o uso de partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G expressando UCHT1 scFvFc ancorado em GPI e CD80 ancorado em GPI em sua superfície (experimentos duplicados). Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas ou triplicatas, como indicado na Figura 22A. As Figuras 22A e 22B mostram que as partículas lentivirais de pseudotipagem com VSV-G e que expressam antiCD3-scFvFc-GPI e CD80-GPI em suas superfícies também transduzem de modo eficaz PBMCs recém-isoladas e não estimuladas quando a transdução é realizada por 14 horas.
[959] As Figuras 23A e 23B mostram um histograma de porcentagem (%) de células de CD3+GFP+ na população de CD3+ total e um histograma da contagem de célula
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410/540 absoluta por poço da população de CD3+GFP+, respectivamente, em 3, 6 e 9 dias após a transdução de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas do Doador 12M pelo tempo indicado de exposição (2 a 20 h) (isto é, contato de células com partículas lentivirais em mistura de reação de transdução), com as partículas lentivirais indicadas. A transdução foi realizada em uma placa ou um frasco de agitador como indicado. Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas para partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G (“[VSV-G]”); os outros experimentos não tiveram réplicas. As Figuras 23A e 23B mostram que as PMBCs não estimuladas e recém-isoladas podem ser efetivamente transduzidas em até 2 horas com partículas de lentivírus pseudotipadas com VSV-G e que expressam scFvFc anti-CD3 e CD80 em suas superfícies.
[960] E notável que os experimentos subsequentes foram realizados com o uso de partículas lentivirais produzidas com o uso de apenas Rev, VSV-G, gag/pol e Fl-0-03 (e não um vetor que codifica um antiCD3 ou CD80) para transduzir PBMCs recém-isoladas em repouso na presença de anticorpos anti-CD3 solúveis (100 ng/ml) por 2,5 horas. A transdução foi alcançada com o uso de 3 diferentes clones de anticorpo anti-CD3 solúveis. As eficácias de transdução como medido por células de CD3+GFP+ no Dia 6 foram 4,31%, 3,27% e 0,52% para clones de anticorpo CD3 HIT3A, OKT3 e UCHT1, respectivamente. As eficácias de transdução dos antecedentes, na ausência de anticorpos solúveis foi de 0,06%.
Exemplos 13. Funcionalidade de mirnas inseridos no íntron de promotor ef-lalfa.
[961] Quatro Fragmentos de Gene de gBlocks® separados foram projetados, cada um contendo um framework de miR-155, incluindo uma sequência de flanqueamento de miR-155 5' ou “braço 5'” (SEQ ID NO:256) e uma sequência de flanqueamento de miR-155 3' ou “braço 3'” (SEQ ID NO:260). Para cada gBlock®, um fragmento de miRNA exclusivo que alveja a transcrição de mRNA CD3zeta foi usado para substituir o precursor de haste-laço de miR155. Cada gBlock® continha uma sequência de sobreposição de 40 bp projetada para facilitar a montagem de todos os quatro gBlocks® como uma cadeia única no íntron de promotor EF-lalfa. Os gBlocks® foram montados com o uso de um kit comercial para realizar montagem de Gibson® ultra (NEBuilder, New England Biolabs, Inc.).
[ 9 62 ] O promotor EF-lalfa sintético e o íntron A contendo os miRNAs (em SEQ ID NO:255) foram parte de um cassete de expressão transgene acionando a expressão de GFP e eTag contida em uma cadeia principal de vetor de lentivírus (a cadeia principal de vetor de
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411/540 lentivirus com a GFP e eTag exemplificativa reconhecidas por cetuximab é chamado no presente documento de Fl-0-02; Figuras 24A e 24B). A posições de nucleotídeo de cada gBlock® e seus respectivos componentes em SEQ ID NO:255 são denotados na Tabela 3 como as posições de cada “Recurso” na Figura 24B. A montagem adequada de quatro miRNA na cadeia principal de vetor de lentivírus foi confirmada por sequenciamento compreensivo do promotor EF-lalfa modificado e região de íntron.
Tabela 3. Posições de nucleotídeo de recursos em seq id no:255
Recurso Posições de Nucleotídeo em SEQ ID NO:255 SEQ ID NO: Recurso na FIG 24B
gBlock® 1 927 a 1.138
Sobreposição de EFlalfa 927 a 966 1
braço 5’ de miR155 967 a 994 SEQ ID NO:256 CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATG CTG 2
haste 5 ’ de miRNA 1 995 a 1.015 SEQ ID NO:257 ACATGGTACAGTTCAATGGTG 3
laço de miR 1.016 a 1.034 SEQ ID NO:258 GTTTTGGCCACTGACTGAC 4
haste 3 ’ de miRNA 1 1.035 a 1.053 SEQ ID NO:259 CACCATTGCTGTACCATGT 5
braço 3’ de miR155 1054-1098 SEQ ID NO:260 CAGGACACAAGGCCTGTTACTAGC ACTCACATGGAACAAATGGCC 6
gBlock® 2 1.099 a 1.310
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412/540
40 bp de 50% de GC Aglutinante 1 1.099 a 1.138 7
braço 5’ de miR155 1.139a 1.166 SEQ ID NO:256 2
haste 5 ’ de miRNA2 1.167 a 1.187 SEQ ID NO:261 TCAGTCTGTTCATCTTCTGGC 8
laço de miR 1.188 a 1.206 SEQ ID NO:258 4
haste 3 ’ de miRNA2 1.207 a 1.225 SEQ ID NO:262 GCCAGAAGGAACAGACTGA 9
braço 3’ de miR155 1.226 a 1.270 SEQ ID NO:260 6
gBlock® 3 1.271 a 1.482
40 bp de 50% de GC Aglutinante 2 1.271 a 1.310 7
braço 5’ de miR155 1.311 a 1.338 SEQ ID NO:256 2
haste 5 ’ de miRNA3 1.339 a 1.359 SEQ ID NO:263 AAGCGTGAAGTGAATCAACGG 10
laço de miR 1.360 a 1.378 SEQ ID NO:258 4
haste 3 ’ de miRNA3 1.379 a 1.397 SEQ ID NO:264 CCGTTGATACTTCACGCTT 11
braço 3’ de miR155 1.398 a 1.442 SEQ ID NO:260 6
gBlock® 4 1.443 a 1.654
40 bp de 50% de 1.443 a 7
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413/540
GC Aglutinante 4 1.482
braço 5’ de miR155 1.483 a 1.510 SEQ ID NO:256 2
haste 5 ’ de miRNA4 1.511 a 1.531 SEQ ID NO:265 GCAGTATCCTAGTACATTGAC 12
laço de miR 1.532 a 1.550 SEQ ID NO:258 4
haste 3 ’ de miRNA4 1.551 a 1.569 SEQ ID NO:266 GTCAATGTTAGGATACTGC 13
braço 3’ de miR155 1.570 a 1.614 SEQ ID NO:260 6
sobreposição de EF-lalfa 1.615 a 1.654
[963] As partículas lentivirais incompetentes em replicação contendo um ácido nucleico que codifica os quatro miRNAs direcionados contra CD3zeta em seu genoma foram produzidas por cotransfecção temporária de quatro plasmídeos em células de HEK293 em suspensão: um plasmídeo contendo o ácido nucleico que codifica F1 -0-02 modificado para incluir os quatro miRNAs alvejando a transcrição de mRNA CD3zeta, um plasmídeo que codifica VSVG, um plasmídeo que codifica REV, e um plasmídeo que codifica GAG-POL. O sobrenadante de partícula lentiviral foi coletado após 48 horas e precipitado-por PEG por 24 horas. Os sobrenadantes foram centrifugados, e as partículas de lentivírus peletizadas foram ressuspensas em meio de crescimento de PB MC completo sem IL-2. As titulações de partícula lentiviral foram calculadas por transdução de 48 horas de células de Jurkat.
[964] Para a transdução, as PBMCs foram condensadas no Dia 0 e incubadas por 24 horas com 100 U/ml de hrIL-2. No Dia 1, as PBMCs foram ativadas por meio de microesferas. Conjugadas de CD3/CD28 No Dia 2, as PBMCs ativadas foram transduzidas com as partículas lentivirais contendo um genoma com uma sequência de ácidos nucleicos que codificam os miRNAs em um MOI de 10. As células foram expandidas até o Dia 11, com hrIL-2
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414/540 fresco adicionado a cada dois dias. Nos dias 7, 9 e 11, 1 milhão de células foram coletadas para análise de FACS.
[965] As células foram manchadas para expressão de superfície de Epsilon CD3, usando anticorpo OKT-3 conjugado de PE (Biolegend). Os níveis de expressão foram determinados pela intensidade de fluorescência média (MF) de PE na população positiva de GFP (células transduzidas). Os níveis de expressão de células transduzidas foram comparados entre partículas retrovirais derivadas de F1-0-02 e partículas retrovirais derivadas de F1-0-02, em que a sequência de ácidos nucleicos que codificam os miRNAs CD3z posicionados em série foram inseridas no promotor EF-lalfa e íntron A.
[966] Os resultados são mostrados na Figura 25. Esses dados mostram que miRNAs seriais que alvejam CD3zeta codificado por uma sequência de ácidos nucleicos dentro do íntron de promotor EF-lalfa A, são eficazes em realizar knocking down da expressão do complexo de CD3.
Exemplo 14. Independência posicionai de mas inibidores seriais inseridos NO íntron de promotor ef-lalfa.
Clonagem [967] Quatro construtos de vetor lentiviral que expressa miRNA foram projetados para testar o processamento de precursores de miRNA individuais em uma estrutura compreendendo 4 precursores de miRNA em série. A Tabela 4 mostra os nomes dos construtos individuais e a posição do miR-TCRa em cada construto.
Tabela 4. Construtos que contêm mirnas policistrônicos
Construto Posição 1 Posição 2 Posição 3 Posição 4
TCRa-Pl miR-TCRa miR-155 miR-PD-1 miR-CTLA-4
TCRa-P2 miR-155 miR-TCRa miR-PD-1 miR-CTLA-4
TCRa-P3 miR-155 miR-PD-1 miR-TCRa miR-CTLA-4
TCRa-P4 miR-155 miR-CTLA-4 miR-PD-1 miR-TCRa
[968] Cada miRNA continha o framework de miR-155 usado no Exemplo 13, isto é, um braço 5' de miR-155 (SEQ ID NO:256), um braço 3' de miR-155 (SEQ ID NO:260),
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415/540 um laço (SEQ ID NO:258) e uma ordem específica de sequências de haste como mostrado na Tabela 5. O método de montagem tipo lis foi usado para alcançar a montagem dos quatro fragmentos de miRNA em suas posições adequadas dentro do intron EF-lalfa do construto de vetor de lentivírus (Fl-0-02; fornecido no Exemplo 13 e mostrado na Figura 24A).
TCRa-Pl (SEQ ID NO:278) TCRa-P2 (SEQ ID NO:279) TCRa-P3 (SEQ ID NO:280) TCRa-P4 (SEQ ID NO:281)
braço 5' SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256
haste 5’ de miRNA 1 SEQ ID NO:267 SEQ ID NO:270 SEQ ID NO:270 SEQ ID NO:270
laço de miR SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258
haste 3’ de miRNA 1 SEQ ID NO:268 SEQ ID NO:271 SEQ ID NO:271 SEQ ID NO:271
braço 3' SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260
Ligante 1 SEQ ID NO:269 SEQ ID NO:269 SEQ ID NO:269 SEQ ID NO:269
braço 5' SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256
haste 5 ’ de miRNA2 SEQ ID NO:270 SEQ ID NO:267 SEQ ID NO:273 SEQ ID NO:276
laço de miR SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258
haste 3 ’ de miRNA2 SEQ ID NO:271 SEQ ID NO:268 SEQ ID NO:274 SEQ ID NO:277
braço 3' SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260
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416/540
Ligante 2 SEQ ID NO:272 SEQ ID NO :272 SEQ ID NO:272 SEQ ID NO:272
braço 5' SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256
haste 5 ’ de miRNA3 SEQ ID NO:273 SEQ ID NO:273 SEQ ID NO:267 SEQ ID NO:273
laço de miR SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258
haste 3 ’ de miRNA3 SEQ ID NO:274 SEQ ID NO :274 SEQ ID NO:268 SEQ ID NO:274
braço 3' SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260
Ligante 3 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:275
braço 5' SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:256
haste 5 ’ de miRNA4 SEQ ID NO:276 SEQ ID NO:276 SEQ ID NO:276 SEQ ID NO:267
laço de miR SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:258
haste 3 ’ de miRNA4 SEQ ID NO:277 SEQ ID NO:277 SEQ ID NO:277 SEQ ID NO:268
braço 3' SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260 SEQ ID NO:260
em que:
SEQ ID NO:267 = TCRalpha haste de miRNA 1; ATATGTACTTGGCTGGACAGC
SEQ ID NO:268 = TCRalpha haste de miRNA 2; GCTGTCCACAAGTACATAT
SEQ ID NO:269 = Ligantel;
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417/540
CACATTGGTGCCGGATGAAGCTCTTATGTTGCCGGTCAT
SEQ ID NO:270 = mir-155 Stem 1; CTGTTAATGCTAATCGTGATA
SEQ ID NO:271 = mir-155 Stem 2; TATCACGATTATTAACAG
SEQ ID NO:272 = Ligante2;
GTTGCCGGAGTCTTGGCAGCGAGAGATCACTATCAACTAA
SEQ ID NO:273 = PD-1 haste de miRNA 1; TACCAGTTTAGCACGAAGCTC
SEQ ID NO:274 = PD-1 haste de miRNA 2; GAGCTTCGCTAAACTGGTA
SEQ ID NO:275 = Ligante3;
GTGTTAATTGTCCATGTAGCGAGGCATCCTTATGGCGTGG
SEQ ID NO:276 = CTLA-4 haste de miRNA 1; TGCCGCTGAAATCCAAGGCAA
SEQ ID NO:277 = CTLA-4 haste de miRNA 2; TTGCCTTGTTTCAGCGGCA
Tabela 5: Sequências em construtos de mirna
Produção de partícula lentiviral [969] Os quatro construtos e o controle Fl-0-02, que não inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um miRNA, foram usados para produzir partículas lentivirais em culturas de suspensão de 30 ml de células 293T. As partículas lentivirais foram coletadas e concentradas por precipitação de PEG. As titulações de partícula lentiviral funcionais foram obtidas através da transdução de células de Jurkat em múltiplas diluições (1:1.000, 1:10.000, 1:100.000), incubando as partículas lentivirais e as células por 2 dias a 37 °C, lavando as células 2X com tampão de FACS, e analisando GFP por citometria de fluxo. Outros detalhes a respeito da produção de partícula lentiviral são fornecidos no Exemplo 13 no presente documento.
Transdução [970] Para a transdução, as PBMCs foram condensadas e recuperadas de um dia para o outro em meio completo contendo 1.00 U/ml de hrIL-2. 1 x 105 PBMCs foram ativadas por meio da exposição ex vivo às microesferas conjugadas de CD3/CD28 por 24 horas. As células foram transduzidas em poços duplicados, com cada um dos quatro construtos de miRNA ou com partícula retroviral de controle Fl-0-02 em MOI 10. As células foram supridas com 100 U/ml de hrIL-2 a cada 3 dias e expandidas até o dia 10.
Facs [971] As células foram coletadas para análise de FACS, que confirmou que as
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418/540 células eram transduzidas com os vetores lentivirais incompetentes em replicação. Os resultados mostraram que quantidades aproximadamente equivalentes de miRNA contendo vírus foram entregues a cada poço no experimento.
Células-para-ct mirna rt-qpcr e análise [972] Um ensaio de RT-qPCR foi projetado para detectar a expressão e o processamento dos precursores de miRNA em miRs maduros processados. A análise foi realizada, primeiro, normalizando-se todos os valores de miR-TCRa ct para o controle interno de RNU48 para produzir valores de ACt. Em seguida, os valores de ACt de cada amostra transduzida foram subtraídos do ACt do controle não transduzido para produzir AACt. Esse valor é representativo da quantidade de miRNA de miR-TCRa processado em cada amostra transduzida em relação ao controle não transduzido.
[973] Conforme mostrado na Figura 26, o ensaio de RT-qPCR detectou de modo bem-sucedido o miR-TCRa processado em amostras transduzidas com miR-TCRa contendo partículas lentivirais incompetentes em replicação. Ademais, os resultados claramente indicam que não há nenhuma diferença notável no processamento de miRNA TCRa em nenhuma das quatro posições testadas.
Exemplo 15. Atividade citotóxica de células T que expressam CAR biológico restrito ao microambiente pode ser controlada pela mudança de pH.
[974] O exemplo seguinte ilustra como a atividade citotóxica de células T transduzidas (também referidas como células efetoras) expressando MRB-CARs pode ser modulada por alterações no pH do microambiente. Nesse exemplo, ácidos nucleicos que codificam um MRB-CAR com capacidade de se ligar ao antígeno cognato Alvo 1 (anti-Alvo 1) foram usados para gerar partículas lentivirais recombinantes incompetentes para replicação. As células T Pan foram transduzidas com as partículas lentivirais e a atividade citotóxica das células efetoras foi comparada com o uso de Análise de Células em Tempo Real (RTCA) antes e depois da alteração do pH do meio.
Produção de partículas lentivirais recombinantes incompetentes em replicação [975] Um ácido nucleico que codificou TIB, um MRB-CAR anti-Al vo 1 da série de MRB-CARs candidatos no Exemplo 3, foi testado. As partículas lentivirais recombinantes incompetentes em replicação foram produzidas por transfecção temporária de
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Lenti-X células 293T (Clontech, Mountain View, CA) com vetores de expressão lentivirais e ácidos nucleicos que incluem segmentos que codificam o MRB-CAR ou um controle, Cl, que contém um GMCFsp e uma eTAG (SEQ ID NO:284), mas não inclui um MRB-CAR anti-Alvo 1. As células foram adaptadas a cultura de suspensão por crescimento em série em Meio de Expressão de 293 Freestyle (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). As células em suspensão foram transfectadas usando PEI (Polysciences, Warminster, PA) dissolvido em ácido fraco. As células (30 ml) foram cultivadas a 1 x 106 células/ml em um frasco Erlenmeyer de 125 ml.
[976] O plasmidio total foi diluído em 1,5 ml de meio Optimem para 30 ml de células. O DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) foi uma mistura de 4 plasmideos com as seguintes razões molares: 2x plasmídeo genômico que inclui elementos de empacotamento lentivirais, LTRs e o ácido nucleico que codifica TIB, Ix plasmídeo que codifica Rev, Ix plasmídeo que codifica VSVg e Ix plasmídeo que codifica Gagpol. Separadamente, o PEI foi diluído em 1,5 ml de Optimem para 2 pg/ml (volume de cultura, razão de 2:1 para DNA). Após uma incubação a temperatura ambiente de 5 minutos, misturaram-se bem as duas soluções e incubaram-se à temperatura ambiente durante 20 minutos. O volume final (3 ml) foi adicionado às células. As células foram então incubadas a 37 °C durante 72 horas com rotação a 120 rpm e com 5 a 8% de CO2.
[977] Após 72 horas, o sobrenadante foi coletado por centrifugação a 1.000 g durante 10 minutos. O sobrenadante foi decantado para um tubo novo e foi adicionado G do volume sobrenadante em solução de PEG (PEG-IT, System Biosciences). As partículas lentivirais recombinantes incompetentes em replicação foram precipitadas por incubação de um dia para o outro a 4 °C seguido de centrifugação a 1.500 g por 20 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o vírus foi ressuspenso em 1:100 volume de meio de X-VIVO 15. Os vírus foram titulados por expressão de eTAG em células de Jurkat.
Transdução/expansão de célula T [978] As células T pan foram obtidas junto à AllCells. As partículas lentivirais recombinantes incompetentes em replicação de MRB-CAR Anti-Al vo 1 foram produzidas como discutido acima. Duas dias antes da transdução lentiviral, as células foram condensadas e cultivadas em meio de X-VIVO 15 (Lonza, Basel, Suíça) com 5% de soro de AB humano (Valley Biomedical Inc., Winchester, VA) e 10 mM de N-actil L-Cisteína (Sigma-Aldrich, St. Louis,
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MO). O IL-2 humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi adicionado a uma concentração final de 100 lU/ml. Vinte e quatro horas antes da transdução viral, semearam-se células T humanas primárias em uma placa de 12 poços a 0,5 x 106 células/poço e ativaram-se com o uso do Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific) a uma razão de célula:microesfera de 1:3. No dia de transdução, a solução de partícula lentiviral foi adicionada aos poços em um MOI de 5. As células T pan transduzidas foram mantidas a ~106/ml em meio de X-VIVO 15 por 3 dias, então, transferidas para uma placa G-Rex de 6 poços com 30 ml/poço de meio de X-VIVO 15 com 100 lU/ml de IL-2. As células foram cultivadas durante pelo menos 10 dias antes das experiências serem conduzidas e a IL-2 foi adicionada em dias alternados.
Ensaio de citotoxicidade de desvio de pH [979] A atividade citotóxica de células T transduzidas antes e depois da alteração de pH por adição de NaHCO3 ou NaOH foi medida com o uso do sistema xCELLigence. Resumidamente, um dia antes do experimento, as células alvo (células de CHO estavelmente transfectadas com um construto para expressar Alvo 1 na superfície celular (células CHO-Alvo 1)), foram semeadas em uma placa E de 96 poços (ACEA; San Diego, CA, EUA) a 10.000 células/poço com meio X-VIVO 15 contendo HEPES 40 mM e PIPES 40 mM, pH 6,7. Células efetoras criopreservadas previamente transduzidas com partículas lentivirais contendo o ácido nucleico que codifica TIB ou Cl (T1BVP e C1VP, respectivamente) produzidas como discutido acima, foram descongeladas e cultivadas durante dois dias em X-VIVO 15 meios contendo 100 Ul/ml de IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). No dia do experimento, as células transduzidas com T1BVP ou C1VP foram lavadas e ressuspensas em meio X-VIVO 15 contendo HEPES 40 mM e PIPES 40 mM, pH 6,7 e depois adicionadas aos poços experimentais na razão de célula efetora/célula alvo (E/T) de 1:1.
[980] As leituras de impedância medidas no Sistema xCELLigence (ACEA) foram tomadas a cada 5 minutos e relatadas como o índice de Células (Cl) para quantificar a confluência celular como medida de proliferação celular/lise celular. Aproximadamente 3 horas após a adição das células efetoras, 8 pl de NaHCO3 a 7,5% ou 14 pl de NaOH 0,5 M foram adicionados aos poços com meio X-VIVO 15 contendo 40 mM HEPES e 40 mM PIPES, pH 6,7 para aumentar o pH de 6,7 para 7.4. As leituras de impedância foram continuadas por aproximadamente 20 horas após a adição das células efetoras. A porcentagem de citólise
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421/540 específica foi calculada como se segue ((Cl alvo + células T efetoras transduzidas com C1VP) (Cl alvo + células T efetoras transduzidas T1BVP)) / (Cl alvo + Células T efetoras transduzidas comClVP)x 100.
Comutador de Hcl em ensaio de extermínio de rtca [981] A atividade citotóxica de células T transduzidas antes e após a alteração do pH por adição de HC1 foi medida com o uso do sistema xCELLigence. Resumidamente, um dia antes do experimento, as células de CHO-Alvo 1 foram semeadas em uma placa E de 96 poços a 10.000 células/poço com meio X-VIVO 15 contendo HEPES 40 mM e PIPES 40 mM, pH 7,4. Células efetoras criopreservadas previamente transduzidas com C1VP ou T1BVP, foram descongeladas e cultivadas por dois dias em meio X-VIVO 15 contendo 100 Ul/ml de IL-2. No dia do experimento, as células transduzidas com T1BVP ou C1VP foram lavadas e ressuspensas em meio X-VIVO 15 contendo HEPES 40 mM e PIPES 40 mM, pH 7,4 e depois adicionadas a poços experimentais na razão de célula efetora/célula alvo (E/T) de 1:1.
[982] Leituras de impedância foram tomadas a cada 5 minutos e relatadas como o índice de Células (IC). Aproximadamente 3 horas após a adição das células efetoras, 8 pl de HC1 1 M foram adicionados aos poços com meio X-VIVO 15 contendo HEPES 40 mM e PIPES 40 mM, pH 7,4 para mudar o pH de 7,4 para 6,7. As leituras de impedância foram continuadas por aproximadamente 20 horas após a adição das células efetoras. A porcentagem de citólise específica foi calculada como se segue ((Cl alvo + células T efetoras transduzidas com C1VP) (Cl alvo + células T efetoras transduzidas T1BVP))/(CI alvo C1VP) x 100.
Resultados [983] A atividade citotóxica de um MRB-CAR com capacidade de se ligar ao antígeno cognato Alvo 1 com atividade aumentada em pH reduzido foi comparada em pH 6,7 e pH 7,4. As células T que foram transduzidas com partículas lentivirais que codificam um MRBCAR anti-Al vo 1, foram usadas para matar células CHO que expressam Alvo 1, e então o pH foi aumentado para determinar se a atividade citotóxica podería ser inibida por um desvio de pH. Conforme mostrado nas Figuras 27A e 27B, a adição de NaHCO3 ou NaOH ao microambiente de células CAR-T ativas para aumentar o pH do meio inibiu a atividade citotóxica das células T expressando o MRB-CAR. Esses resultados mostram que as células T que expressam MRB-CAR ativas podem matar as células que expressam o alvo e depois essa atividade de morte pode ser
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422/540 inibida aumentando o pH do microambiente.
[984] A capacidade da atividade citotóxica de células T que expressam o MRBCAR a ser ativado por uma alteração de pH foi também determinada. Conforme mostrado na Figura 27C, a atividade citotóxica de células T que expressam MRB-CAR anti-Alvo 1 em células CHO-Alvo 1 foi baixa a um pH de 7,4 e foi aumentada pela adição de HC1 para reduzir o pH do microambiente. Cumulativamente, esses resultados demonstram que a atividade citotóxica de células T expressando MRB-CARs pode ser modulada por uma mudança no pH dentro do microambiente, tanto pela redução da atividade citotóxica após um aumento no pH e aumento da atividade citotóxica após uma diminuição no pH. Nesse exemplo não limitative, o pH foi aumentado de pH 6,7 e diminuiu de 7,4.
Exemplo 16. Administração de bicarbonate pode aumentar o pH do microambiente tumoral em camundongos.
[985] O exemplo seguinte demonstra que o pH de um microambiente tumoral in vivo pode ser modulado pela administração de um agente farmacológico. Nesse exemplo, o agente farmacológico é bicarbonate de sódio e o microambiente tumoral é um tumor de xenoenxerto de CHO em camundongos. O exemplo inclui dois métodos de medição do pH de um microambiente tumoral, tanto in vivo como ex vivo.
[986] O microambiente extracelular da maioria dos tumores sólidos é ácido, com um pH tipicamente entre 6,5 e 6,9. Pelo contrário, o pH normal do tecido é básico, com um pH tipicamente entre 7,2 e 7,5. No entanto, medir diretamente o pH in vivo de um microambiente tumoral pode ser difícil. Felizmente, a atividade relativa da protease da catepsina é maior em pH mais baixo e menor em pH mais alto. Portanto, a medição da atividade da catepsina intratumoral pode servir como uma medida substituta do pH do microambiente tumoral. Para medir as atividades in vivo das catepsinas B, L, S, K, V e D, foi usada a sonda ProSense 750 FAST (PerkinElmer) de quase infravermelho. Para confirmar ainda a modulação do pH no microambiente do tumor por administração de bicarbonate de sódio, os tumores removidos foram tratados com vermelho de fenol e a cor foi anotada. O vermelho de fenol é um indicador de pH que sofre uma transição de cor dependente do pH. O sal de sódio do vermelho de fenol é amplamente usado em meios de cultura de células para identificar valores de pH. Uma solução de vermelho de fenol tem uma cor amarela a um pH de 6,4 ou abaixo, uma cor laranja em torno
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423/540 de pH 7,0, uma cor vermelha em torno de pH 7,4 e uma cor púrpura acima de pH 7,8.
[987] Os camundongos foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Os xenoenxertos tumorais de ovário de hamster chinês (sc) subcutâneos (sc) foram estabelecidos no flanco posterior de camundongos fêmeas camundongos B-NSG (NOD-PrkdcscidI12rgtml/Bcgen (Beijing Biocytogen Co. Ltd.). Resumidamente, células CHO cultivadas (ATCC, Manassas, VA) foram lavadas em DPBS (ThermoFisher), contadas, ressuspensas em DPBS frio e misturadas com um volume apropriado de Matrigel ECM (Corning; concentração final 5 mg/ml) a uma concentração de 1,5 x 106 células/200 μΐ no gelo.
[988] Os animais foram preparados para injeção com o uso de anestesia aprovada padrão com depilação (Nair) antes da injeção. 200 μΐ da suspensão de células em ECM foi injetado sc nos flancos traseiros dos camundongos. Uma vez que os tumores eram palpáveis, os tumores foram medidos usando calibres 2 vezes/semana. O volume do tumor foi calculado usando a seguinte equação: (diâmetro mais longo * diâmetro mais curto2)/2. Quando o volume médio do tumor atingiu 200 mm3, os camundongos foram aleatoriamente designados para os respectivos grupos de tratamento.
[989] Dois dias antes da administração de bicarbonate, a água potável para os camundongos B-NSG foi alterada de água purificada autoclavada com pH ácido a regular. No dia seguinte, a sonda FAST ProSense 750 foi administrada a 6 camundongos portadores de tumor de xenoenxerto CHO através de 100 μΐ de injeção na veia da cauda (4 nmol de sonda ProSense 750 FAST/100 μΐ de PBS). Um grupo separado de camundongos com tumor de xenoenxerto de CHO foi deixado sem tratamento. No dia seguinte, administrou-se bicarbonate de sódio e realizou-se imagiologia dos camundongos tratados com a sonda ProSense 750 FAST com o uso de um Calibre IVIS Lumina XR. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados usando O2 2 1/min de isoflurano em gás carreador de O2 a 2 1/min e, em seguida, colocados com cones de nariz fornecendo isoflurano a 1,5% para camundongos anestesiados durante a imagem. As aquisições de imagens consistiram em uma exposição ex vivo de 5 segundos para sondas de infravermelho próximo (745/810 nm de comprimento de onda de excitação/emissão). As imagens de fluorescência foram sobrepostas em imagens de luz normais dos camundongos. Imagens do tempo 0 (pré-tratamento) foram capturadas antes da administração de PBS (controle) ou bicarbonate de
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424/540 sódio. Os camundongos foram então administrados com 1 ml/PBS de camundongo (controle, ThermoFisher) ou 1 ml/bicarbonato de sódio 1 M de camundongo (Shanghai Experiment Reagent Co., LTD) por injeção intraperitoneal (ip). Os camundongos foram então imageados 30 min após a administração de PBS ou bicarbonate. As imagens de fluorescência coletadas foram ajustadas para ter os mesmos valores mínimos, máximos e limiares. As contagens de fótons foram definidas nesse estudo como unidades de fluorescência relativa (RFU). O RFU foi calculado normalizando as contagens de fótons do ponto de tempo de 30 minutos para o ponto de tempo de pré-tratamento (tempo 0; 100%) em cada camundongo. Devido à variabilidade entre os valores de fluorescência em cada camundongo no tempo 0 do valor de pré-tratamento, os valores da intensidade de fluorescência observada em diferentes pontos temporais foram normalizados apenas para o camundongo individual e não para um valor médio de pré-tratamento.
[990] Em um braço separado do experimento, os 6 camundongos que não receberam a sonda de catepsina NIR foram eutanasiados por deslocação cervical à 1,5 hora após a administração ip de PBS ou bicarbonate de sódio. O tumor de xenoenxerto de CHO foi excisado de cada camundongo. Os tumores xenoenxertados foram divididos em duas metades com um bisturi e colocados em uma placa de petri. As metades do tecido tumoral foram então cortadas/fatiadas repetidamente usando o bisturi. Adicionou-se, gota a gota, água ou solução de vermelho de fenol a 0,05% (50 mg de vermelho de fenol/1 00 ml de água) a cada metade do tumor, respectivamente. A cor foi anotada e foram tiradas imagens dos xenoenxertos de tumor tratados e da solução de vermelho de fenol remanescente na placa de petri assim que as amostras de xenoenxerto de tumor foram removidas.
Resultados [991] A Figura 29 mostra os resultados de RFU (média com SEM) da atividade de catepsina intratumoral de imageamento em camundongos com tumor de xenoenxerto de CHO antes e depois da administração de PBS (controle; n = 3) ou bicarbonate (n = 3). Esses resultados sugerem que a administração de bicarbonate de sódio pode aumentar o pH do microambiente do tumor in vivo, como evidenciado pela diminuição da atividade de catepsina observada após a administração de bicarbonate de sódio ip.
[992] Observou-se uma alteração da cor do indicador vermelho de fenol de amarelo/laranja para vermelho utilizando o tecido de tumor excisado de camundongos tratados
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425/540 com bicarbonate de sódio (η = 3) em relação aos camundongos tratados com PBS (n = 3). Esses resultados sugerem que a administração de bicarbonate de sódio aumentou o pH do microambiente do tumor in vivo após a administração ip como evidenciado pela mudança de cor do indicador vermelho de fenol de amarelo/laranja para vermelho.
Exemplos 17. Identificação de elementos linfoproliferativos de polipeptídeo candidato quimérico.
[993] Neste exemplo, duas bibliotecas de polipeptídeo quimérico (Biblioteca 1 e Biblioteca 2) de elementos linfoproliferativos quiméricos candidatos (putativo) foram montados em vetores virais de agrupamentos de sequências de bloco extracelular-transmembranar, sequências de bloco intracelulares e uma biblioteca de código de barras de acordo com o polipeptídeo quimérico que codifica construtos fornecidos nas Figuras 30 e 31. A proliferação de PBMCs transduzidas de biblioteca foi seguida ao longo do tempo: o DNA genômico foi extraído de PBMCs em intervalos de uma semana e a região de código de barras amplificada para que o sequenciamento de DNA estime o número de células nessas culturas misturadas de PBMCs contendo cada um dos elementos linfoproliferativos quiméricos candidatos do teste. Assim, a triagem testou a capacidade dos elementos linfoproliferativos quiméricos candidatos para promover a proliferação celular de PB MC na ausência de IL-2 ou qualquer oura citocina exógena.
[994] Duas bibliotecas foram produzidas e analisadas nesse estudo: os construtos da Biblioteca 1 (que foram usados nas triagens identificadas como Bibliotecas IA, LIA e 1.1B) foram flanqueados com um CAR na extremidade 5' do polipeptídeo candidato quimérico, enquanto os construtos de Biblioteca 2 (que foram usados nas triagens identificadas como Bibliotecas 2B e 2.1B) não incluem um CAR (Figuras 30 e 31). A Figura 30 fornece um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificative não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CAR e um elemento linfoproliferativo quimérico (CLE) candidato da Biblioteca 1 acionada por um promotor EF-1 alfa e uma sequência tipo Kozak (GCCGCCACC (SEQ ID NO:519)), em uma cadeia principal de vetor lentiviral. O CAR foi etiquetado com FLAG e continha uma ASTR direcionada a CD19, uma haste e porção de transmembrana de CD8, e um domínio de ativação intracelular de CD3z. Cada elemento linfoproliferativo candidato da Biblioteca 1 inclui 3 módulos; um módulo extracelular/transmembranar (PI-2) e 2 módulos intracelulares (P3 e P4). O módulo PI-2 também
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426/540 codificou um domínio de reconhecimento e/ou eliminação (TAG). Uma sequência de interrupção tripla (TAATAGTGA (SEQ ID NO:520)) separou P4 de um código de barras de DNA (P5). Um WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTT CTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCC GGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCT TTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO:521)) esteve presente entre o último códon de interrupção (a partir de 4 bp após o único nucleotídeo do último códon de interrupção) e a 3 ’ LTR (que começou com 83 nucleotídeos após o último nucleotídeo do WPRE).
[995] O CAR e PI-2 da Biblioteca 1 foi separado por uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma sequência de salto ribossômica T2A.
[996] A Figura 31 fornece um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificative não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CLE candidato da Biblioteca 2 acionada por um promotor EF-1 alfa e uma sequência tipo Kozak (GCCGCCACC (SEQ ID NO:519)), em uma cadeia principal de vetor lentiviral. Cada elemento linfoproliferativo candidato da Biblioteca 2 inclui 3 módulos; um módulo extracelular/transmembranar (PI-2) e 2 módulos intracelulares (P3 e P4). O módulo PI-2 também codificou um domínio de reconhecimento e/ou eliminação (TAG). Uma sequência de interrupção tripla (TAATAGTGA (SEQ ID NO:520)) separou P4 de um código de barras de DNA (P5). Um WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTT CTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCC GGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCT TTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO:521)) esteve presente entre o último códon de interrupção (a partir de 4 bp após o único nucleotídeo do último códon de interrupção) e a 3 ’ LTR (que começou com 83 nucleotídeos após o último nucleotídeo do WPRE).
[997] O polipeptídeo quimérico candidato montado parte de ambas as bibliotecas seguiu exatamente o mesmo projeto com 3 posições (1 módulo extracelular/transmembranar (PI-2) e 2 módulos intracelulares (P3 e P4), um dos quais pode ser um sinal de terminação precoce). Os ligantes de GGS codificados por sequências de ácido
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427/540 nucleico entre cada um dos domínios foram incluídos como um produto de montagem de construto. Os ácidos nucleicos que codificam versões variantes ou completas de um Myc ou um domínio de reconhecimento e/ou eliminação, eTAG (chamado, na Tabela 6, de “eTAG” ou “Etiqueta Myc”) foram inseridos 5 ’ no domínio extracelular de cada receptor de citocina truncado (ou selecionar construtos de LMP1) como parte dos módulos de PI-2, de modo que os polipeptídeos quiméricos candidatos codificados incluem um domínio de reconhecimento e/ou eliminação em quadro com o domínio extracelular. Uma sequência de sinal foi inserida na terminação 5 ’ das sequências de codificação de CAR na Biblioteca 1 e na terminação 5 ’ do domínio de reconhecimento e/ou eliminação que codifica sequências da Biblioteca 2. Uma sequência tipo Kozak (GCCGCCACC (SEQ ID NO:519)), que também é uma sequência tipo Kozak intensificada, foi inserido a 10 nucleotídeos antes do códon inicial de ATG, que estava na terminação 5 ’ da sequência de sinal que codifica as sequências na Biblioteca 1 e na terminação 5 ’ o domínio de reconhecimento e/ou eliminação que codifica as sequências (ou construtos seletos de LMP1) na biblioteca 2. Um 4o módulo contendo um código de barras aleatório gerado por montagem de PCR aleatória de -10.000 x -10.000 subcódigos de barras (-100 um milhão de combinações). As sequências de codificação dos CARs para construtos de Biblioteca 1 codificados a sequência de sinal, a FLAG etiqueta, uma scFv de ASTR anti-CD19, uma haste de CD8a, um domínio transmembranar de CD8a e um domínio de ativação intracelular CD3zeta. A expressão de um CAR (Biblioteca 1 apenas) e CLEs (Biblioteca 1 e Biblioteca 2) foi acionada por um promotor EF1 alfa. Nos construtos da Biblioteca 1, um sítio de T2A foi posicionado entre o CAR e as sequências que codificam o polipeptídeo quimérico. Nas bibliotecas 1 e 2, um códon de interrupção tripla esteve presente na extremidade 3’ de P4.
Síntese de vetores virais [998] As partes individuais para a montagem de biblioteca foram projetadas e sintetizadas como blocos de DNA com sobressalências de enzima Tipo lis compatível (AarI) e conectores que codificam uma sequência de Glicina-Glicina-Serina nas extremidades 5’ e 3’ de cada parte. Essas partes, então, foram individualmente clonadas em vetores de plasmídeo universais. A montagem para cada parte foi realizada como um tubo de montagem, em que 0,04 pmol da parte, 0,04 pmol mistura de código de barras e 0.04 pmol de cadeia principal de vetor de plasmídeo foram adicionados a uma reação de 10 ul seguido de 1 enzima de AarI de unidade de
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428/540 enzima, T4 DNA ligase a 10 unidades, e IX tampão de ligase (50 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCF, 1 mM de ATP, 10 mM de DTT) por atividade de ligase ideal. Os ciclos de digestão e ligação foram realizados com o uso de um termociclador como a seguir: 55 ciclos de 37 °C por 2 min e 16 °C por 5 min; a 5 min de incubação a 50 °C para digestão final; uma incubação de 10 min em 80 °C para inativação de AarI; e uma retenção final a 4 °C. Então, os vetores montados foram purificados por precipitação de etanol convencional. Os vetores purificados resultantes foram eletroporados (Electro Micropulser, Bio-rad) em células eletrocompetentes ToplO (Thermo Fisher Scientific) e diretamente recuperadas em culturas líquidas contendo antibiótico de Kanamicina para a seleção e expansão. As culturas foram incubadas a 37 °C por 10 a 12 horas e, então, coletadas e os plasmídeos purificados com o uso do Kit ZymoPURE-EndoZero™ Plasmid Gigaprep.
Produção de partícula lentiviral [999] Partículas lentivirais recombinantes foram produzidas por transfecção temporária de células 293T (Lenti-X™ 293T, Clontech) com plasmídeos de empacotamento lentivirais separados que codificam gag/pol e rev, e um plasmídeo de pseudotipagem que codifica VSV-G. Os vetores virais sintetizados que codificam polipeptídeos quiméricos candidatos com ou sem um receptor de antígeno quimérico coexpressado foram cotransfectados com os plasmídeos de empacotamento. As células foram adaptadas a cultura de suspensão por crescimento em série em Meio de Expressão de 293 Freestyle™ (ThermoFisher Scientific). As células em suspensão foram semeadas em 1 x 106 células/ml (30 ml) em um frasco Erlenmeyer de 125 ml, e imediatamente transfectadas com o uso de polietilenimina (PEI) (Polysciences) dissolvida em ácido fraco.
[10 0 0] O DNA plasmídico foi diluído em 10 ml de meio Gibco™ Opti-MEM™ para 30 ml de células. Para obter partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G, o DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) usado foi uma mistura de 4 plasmídeos com as seguintes razões molares: 2x vetores virais combinados, Ix plasmídeo contendo Rev, Ix plasmídeo contendo VSVG, e Ix plasmídeo contendo gag/pol. Separadamente, o PEI foi diluído em 10 ml de Gibco™ Opti-MEM™ para 2 pg/ml (volume de cultura, razão de 2:1 para DNA). Após uma incubação a temperatura ambiente de 5 minutos, misturaram-se bem as duas soluções e incubaram-se à temperatura ambiente durante mais 20 minutos. O volume final (20 ml) foi adicionado às células.
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As células foram então incubadas a 37 °C durante 48 horas com rotação a 125 rpm e com 8% de CO2.
[10 01] Após 48 horas, os sobrenadantes foram coletados e clarificados por centrifugação a l.OOOg por 10 minutos. O sobrenadante não viral foi, então, filtrado através de filtros de PVDF, 0,45 pm, de Millex-HV de baixa ligação de proteína (Millipore, n° de catálogo: SLHVR25LS). Os sobrenadantes clarificados foram decantados para um novo tubo, 1 volume de Lenti-X PEG (Takara ,4x) foi misturado com 3 volumes de sobrenadante clarificado, e incubados a 4 °C de um dia para o outro. As partículas lentivirais foram, então, precipitadas por 90 min de centrifugação a 1.500g e 4 °C. O sobrenadante foi descartado, e os péletes de partícula lentiviral foram ressuspensos em 1:100 de volume inicial de meio de crescimento de PBMC completo sem IL-2. As partículas lentivirais foram tituladas com o uso de um kit de ensaio Elisa p24 de Takara (n° 632200).
Transdução e cultura de pbmcs [10 02] O sangue humano integral de um doador saudável (101 ml) foi coletado em uma bolsa de sangue de 200ml contendo anticoagulante de CDP (Nanger; S-200). O sangue foi processado com o uso de centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll-Pacque™ (General Electric) com o uso de um dispositivo Sepax 2 S-100 (Biosafe; 14000) seguindo as instruções do fabricante e kit CS900.2 (BioSafe; 1008), para obter células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Rendimento de PBMC viável foi de 7,3 x 107 células. 1,5 x 107 PBMC foram adicionadas, cada uma, aos dois dispositivos de cultura de célula de G-Rex 100 M (Wilson Wolf, 81100S) a uma concentração final de 0,5 x 106 células viáveis/ml em um volume final de 30 ml de SFM de Expansão de Célula T completa OpTmizer™ CTS™ (OpTmizer™ CTS™ Meio Basal de Expansão de Célula T de 1 1 (Thermo Fisher, A10221) suplementado com 26 ml OpTmizer™ CTS™ Suplemento de Expansão de Célula T (Thermo Fisher, A10484-02), SR de Célula Imune de 25 ml CTS™ (Thermo Fisher, A2596101) e 10 ml de CTS™ GlutaMAX™-! Supplement (Thermo Fisher, A1286001) de acordo com as instruções do fabricante). A interleucina-2 humana recombinante (IL-2) (Novoprotein) também foi adicionada a uma concentração de 100IU/ml juntamente com Ab anti-CD3 de ativação (OKT3, Novoprotein) a uma concentração de 50 ng/ml, para ativar as PBMCs para transdução viral. Os dispositivos GRex foram incubados de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado
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430/540 padronizado a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação de um dia para o outro, as preparações de partícula de lentivírus contendo os construtos de codificação de polipeptídeo de teste desejados (Biblioteca 1 ou Biblioteca 2) foram adicionados aos dispositivos G-Rex individuais em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. Os dispositivos G-Rex (Biblioteca 1 e Biblioteca 2) foram incubados de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação de um dia para o outro, SFM de Expansão de Célula T Completa adicional OpTmizer™ CTS™ foi adicionada para trazer o volume final de cada dispositivo G-Rex para 500 ml. Nenhuma IL-2 adicional ou outra citocina exógena foi adicionada nessa ou nas próximas etapas de cultura. O dispositivo G-Rex® foi incubado em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2 por 7 dias de isolamento de PBMC. No dia 7, as células dos dois dispositivos G-Rex transduzidas com a Biblioteca 1 ou Biblioteca 2 foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. 1,25 x 10 7 de células da Biblioteca 1 e 2,54 107 células da Biblioteca 2 foram colocadas em um novo dispositivo G-Rex 100M contendo 500 ml SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. Uma ampola de PBMCs correspondentes ao doador congeladas no Dia 0 condensadas (1,46 x 107 PBMC) foi adicionada aos dispositivos G-Rex contendo células transduzidas com a Biblioteca 1 para fornecer ativação de célula B CD19+ da ASTR CD19. Nessas triagens, as células alimentadas com PBMCs foram designadas com A após o número da biblioteca, por exemplo, triagens realizadas com células transduzidas com Biblioteca 1 e alimentadas com PBMCs são chamadas de Biblioteca IA no presente documento. A Biblioteca 2 não recebeu PBCMs do Dia 0. Nessas triagens, as células não alimentadas com PBMCs foram designadas com B após o número da biblioteca, por exemplo, triagens realizadas com células transduzidas com Biblioteca 2 e não alimentadas com PBMCs são chamadas de Biblioteca 2B no presente documento. Os dispositivos G-Rex foram incubados de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. No dia 14, as células dos dois dispositivos G-Rex (Biblioteca 1A ou Biblioteca 2B) foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. Essas foram, cada uma, colocadas em poços individuais de placas G-rex de 6 poços (Wilson-Wolf; 80240M) contendo 30 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. Uma ampola de PBMCs correspondentes ao doador
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431/540 congeladas no Dia 0 condensadas foi adicionada ao poço contendo as células da Biblioteca IA para fornecer a ativação de célula B CD 19+ da ASTR CD 19. Os dispositivos G-Rex foram incubados de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. No dia 21, as células foram coletadas a partir dos poços das placas G-rex de 6 poços, e o processo realizado no dia 14 foi repetido. As amostras (1 x 105 a ~4-5 x 106 células) foram coletadas em vários dias pós-transdução (Dias 7, 21, 28 e/ou 35) e o DNA genômico foi purificado com o uso de DNA Genômico Mamífero GenElute™ Miniprep após o protocolo de kits. Em alguns casos, as amostras foram purificadas com o uso de centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll-Pacque™ (General Electric) para remover as células mortas antes da extração de DNA genômico. O DNA genômico purificado foi sequenciado com o uso de um Illumina HiSeq, gerando leituras de 150 bp de extremidade emparelhada. Geralmente, um subconjunto de 10 milhões de leituras foi extraído de cada arquivo de fastq de índice e processado para análise com o uso de barcode_reader, um R script personalizado modificado para extrair código de barras sequências com base na presença de uma região constante. O DNA genômico purificado também foi sequenciado em um sistema de sequenciamento PacBio para obter comprimentos de leitura maiores para associar códigos de barras com construtos. Essas triagens foram repetidas e as Bibliotecas foram designadas 1.1 A, ElBe2.1B, em que A e B indicaram se as células foram alimentadas com as PBMCs como discutido acima.
Análise de dados:
[10 03] Uma vez que os dados de HiSeq foram obtidos para todos os pontos no tempo, as tabelas de contagem de código de barras foram mescladas com base no código de barras ID. As contagens foram normalizadas como contagem por milhão com o da fórmula: 1 x 106 * contagem bruta / soma (contagens brutas para todo os códigos de barras na amostra), que são chamados de valores prevalentes. Os códigos de barras com uma prevalência média de 0,33 cpm por ponto no tempo ou menos foram descartados. As associações de código de barras-construto de comprimento total obtidas por sequenciamento de SMRT (Pacific Biosciences) em pontos no tempo seletos foram usadas para identificar montagens de interesse. Os construtos incompletos que não têm 3 partes ou construtos ambíguos que têm mais de uma chamada de construto foram removidos. Os valores de enriquecimento para cada montagem foram calculados como (contagem normalizada no ponto no tempo final + 1) / (contagem normalizada no ponto no tempo inicial +
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1). Os genes de polipeptídeo quimérico candidato foram identificados como construtos com um enriquecimento acima de um limiar valor específico para cada biblioteca.
Resultados [10 04] Os candidatos de polipeptídeo quimérico foram projetados para ter 3 domínios de teste, que incluíam um domínio extracelular e transmembranar (PI-2), um primeiro domínio intracelular (P3) e um segundo domínio intracelular (P4) (Figuras 30 e 31). Ademais, os construtos incluem um código de barras de DNA para auxiliar na análise e identificação do construto com o uso de sequenciamento da próxima geração. Adicionalmente, a maioria dos construtos como mostrado na Tabela 6 inclui sequências de ácido nucleico que codificam um domínio de reconhecimento e/ou eliminação em quadro com o domínio extracelular e transmembranar. Entretanto, os domínios de reconhecimento e/ou eliminação daqueles construtos que codificam um fragmento extracelular ou transmembranar de LMP1 foram intracelulares para aqueles construtos que continham tal domínio de reconhecimento e/ou eliminação. Os construtos de Biblioteca 1 codificaram um CAR a montante do candidato de polipeptídeo quimérico. Um total de 226.840 combinações conceitualizadas possíveis foram projetadas com base em 20 domínios extracelulares-transmembranares diferentes, 106 domínios de P3 possíveis e 107 domínios de P4 possíveis, um dos quais foi um códon de interrupção. Nem todos os construtos conceitualizados foram detectados após a montagem de vetor viral, a produção de partícula lentiviral, transdução de PMBC e 7 dias de cultura. Para a Biblioteca IA, 57.815 construtos estiveram presentes após a transdução de PBMCs e 7 dias de cultura. Para a Biblioteca 2B, 69.578 construtos estiveram presentes após a transdução de PBMCs e 7 dias de cultura. As informações detalhadas sobre os candidatos analisados, assim como resultados detalhados, são fornecidos nas tabelas 7 a 11. As informações detalhadas a respeito das várias partes de candidato são fornecidas na Tabela 6. Os cabeçalhos para as tabelas 7 a 11 são como a seguir: BlockSequence é o código de Pl a P2, P3 e os domínios de P4 da Tabela 6 usado em cada construto; Norm_D7 são as contagens normalizadas no dia 7; Enrich_DXX é o enriquecimento no dia XX versus dia 7, em que ο XX é o dia indicado na tabela, por exemplo, Enrich _D21 é o enriquecimento no dia 21 versus no dia 7 e Enrich_D35 é o enriquecimento no dia 35 versus o dia 7. Os dados para um construto são mostrados nas colunas imediatamente à direita para o construto. Os dados para dois construtos são mostrados em cada fileira. Por exemplo, o primeiro candidato identificado na
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Tabela 7 é M008-S212-S075. Para esse candidato, o domínio extracelular e transmembranar (Pl2) é M008, o primeiro domínio intracelular (P3) é S212 e o segundo domínio intracelular (P4) é S075. As informações detalhadas a respeito da identidade desses módulos, por exemplo, M008, são encontradas na Tabela 6. A Tabela 6 revela que M008 é LMP1 e que o construto inclui uma etiqueta Myc. As sequências de aminoácido dos domínios candidatos são fornecidas na Tabela 6. For esclarecimento, o identificador GenBank na Tabela 6 fornece uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio de polipeptídeo. Em alguns casos, a sequência de ácidos nucleicos foi modificada para auxiliar com a clonagem, ou para otimização de códon, porém, codifica o mesmo polipeptídeo que a sequência de GenBank. Em alguns casos, como será evidente pela sequência de aminoácidos fornecida na Tabela 6, uma porção do polipeptídeo codificado pela sequência de GenBank foi usada.
[10 05] Os domínios extracelulares e transmembranares candidatos foram selecionados a partir de receptores mutantes conhecidos como receptores de citocina ou hormônio que foram relatados como sendo constitutivamente ativos quando expressados pelo menos em alguns de célula. As Regiões de ligação de ligante não foram incluídas nos domínios candidatos extracelulares e transmembranares. As mutações em tais mutantes de receptor ocorrem na região de transmembrana ou na região de justamembrana. Os domínios candidatos extracelulares e transmembranares exemplificativos incluem IL7RA Ins PPCL, LMP1, CRLF2 F232C, CSF2RB V449E, CSF3R T640N, EPOR L251C I252C, GHR E260C I270C, IL27RA F523C e MPL S505N. Os domínios candidatos extracelulares e transmembranares incluem a proteína viral tipo selvagem LMP1, que é uma proteína transmembranar multiabrangente que é conhecida por ativar a sinalização celular independente do ligante quando alvejada às balsas lipídicas ou quando fundida a CD40 (Kaykas et al. EMBO J. 20: 2641 (2001)).
[10 0 6] As identidades de polipeptídeos potenciais escolhidas para ocupar o primeiro e o segundo domínios intracelulares dos polipeptídeos quiméricos candidatos foram idênticas. Esses domínios candidatos intracelulares foram domínios de sinalização intracelulares de genes que são conhecidos em pelo menos alguns tipos de célula para promover a proliferação, a sobrevivência (antiapopótica) e/ou fornecer um sinal coestimulante que aprimora um estado de diferenciação, potencial proliferativo ou resistência à morte celular. Alguns dos domínios intracelulares de polipeptídeos quiméricos candidatos são conhecidos por ativar sinalização de
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JAK1/JAK2 e STAT5. Os domínios intracelulares de alguns dos genes listados na Tabela 6 foram incluídos na biblioteca. Os domínios intracelulares exemplificativos desses genes são fornecidos nas localizações P3 e P4 das tabelas 7 a 11. As informações detalhadas a respeito desses domínios de P3 e P4 são fornecidos na Tabela 6.
[1007] Para a Biblioteca IA, que inclui construtos que codificam os polipeptídeos quiméricos e um CAR, 172 candidatos superiores de polipeptídeos quiméricos foram identificados (consultar a Tabela 7, em que o enriquecimento foi calculado como Log2(contagem normalizada no último dia indicado na tabela + 1) - log2(contagem normalizada no dia 7+1)) que promoveu a proliferação de PB MC à maior magnitude (e provavelmente a sobrevivência também) entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela quando cultivado na ausência de IL-2. E notável que este e todos os experimentos de triagem dos Exemplos 17 e 18 são experimentos competitivos. Assim, um resultado negativo não significa que um construto não promova a proliferação de células T na ausência de fatores de crescimento como IL-2. Isso significa apenas que em relação a outros construtos testados, o mesmo foi superado em relação à proliferação.
[ 1008 ] Para a Biblioteca IA, alguns dos construtos de polipeptídeo quimérico promoveram a proliferação celular entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela para todo domínio mutante extracelular e transmembranar testado na posição PI-2. Ademais, quanto todos os resultados de todos os construtos derivados da mesma posição PI-2 mutante foram combinados, todos os domínios extracelulares e transmembranares testados produziram enriquecimento celular maior do que 1 (isto é, promoveram proliferação celular) entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela. Os Exemplos de domínios extracelular e/ou transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos que promoveram a proliferação celular são fornecidos na Tabela 7. Os Exemplos de domínios extracelular e/ou transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 1.1 A, que promoveram a proliferação celular são fornecidos na Tabela 9. Os Exemplos de domínios extracelular e/ou transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 1.1B, que inclui células transduzidas com a Biblioteca 1 que foram PBMCs não alimentadas, que promoveram a proliferação celular são fornecidos na Tabela 10.
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435/540 [1009] Para a Biblioteca IA, os domínios intracelulares de CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8 e TNFRSF9, ou mutantes dos mesmos que conhecidos por terem atividade de sinalização se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados na posição do primeiro domínio intracelular (P3) de polipeptídeos quiméricos candidatos, promove proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados foram considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com primeiros domínios intracelulares (P3) derivados de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento de contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que pelo menos 3 vezes mais contagens para tal domínio estivessem presentes no último dia indicado na tabela do que no dia 7 para a Biblioteca IA, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a mais alta magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 7 Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 1.1 A, que promoveram a mais alta magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 9. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 1.1B, que inclui células transduzidas com a Biblioteca 1 que foram PBMCs não alimentadas, que promoveram a proliferação celular são fornecidos na Tabela 10.
[1010] Para a Biblioteca IA, os domínios intracelulares de CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS, IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9 e TNFRSF18 ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por terem atividade de sinalização se tais mutantes estiverem presentes nas tabelas, quando encontrados na posição de segundo domínio intracelular (P4) de polipeptídeos quiméricos candidatos promoveu a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados foram considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com segundos domínios intracelulares (P4) derivados de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento de contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que pelo menos 2,9 vezes mais contagens para tal domínio estivessem presentes no dia
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436/540 do que no dia 7 para a Biblioteca IA, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a mais alta magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 7 Os Exemplos de segundos domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 1.1 A, que promoveram uma proliferação celular são fornecidos na Tabela 9. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 1.1B, que inclui células transduzidas com a Biblioteca 1 que foram PBMCs não alimentadas, que promoveram a proliferação celular são fornecidos na Tabela 10.
[ 1011 ] Mais especificamente, para a Biblioteca IA, dos 5.996 construtos com MPL S505N (MPL proto-oncogene, trombopoietina receptor com serina 505 mutada para asparagina) como o módulo de P1-P2, 165 estavam positivos, o que foi definido como os construtos que têm um enriquecimento acima de dois para a Biblioteca IA. Dos 436 construtos com CD3D (molécula de CD3d) como o módulo de P3, 24 foram positivos. Dos 528 construtos com CD3E (molécula de CD3e) como o módulo de P3, 17 foram positivos. Dos 261 construtos com CD8A (molécula de CD8a) como o módulo de P3, 14 foram positivos. Dos 1.022 construtos com CD40 (molécula de CD40) como o módulo de P3, 50 foram positivos. Dos 568 construtos com IL3RA (subunidade alfa de receptor de interleucina 3) como o módulo de P3, 26 foram positivos. Dos 556 construtos com CD79B (molécula de CD79b) como o módulo de P3, 27 foram positivos. Dos 131 construtos com IFNAR1 (subunidade 1 de receptor de interferon alfa e beta ) com o módulo de P3, 7 foram positivos. Dos 519 construtos com IL13RA2 (subunidade alfa 2 de receptor de interleucina 13) como o módulo de P3, 33 foram positivos. Dos 571 construtos com IL2RA (subunidade alfa de receptor de interleucina 2) como o módulo de P3, 28 foram positivos. Dos 618 construtos com CD27 (molécula de CD27) como o módulo de P3, 30 foram positivos. Dos 573 construtos com TNFRSF8 (o membro 8 de superfamília de receptor de TNF) como o módulo de P3, 15 foram positivos. Dos 573 construtos com TNFRSF9 (o membro 9 de superfamília de receptor de TNF) como o módulo de P3, 25 foram positivos. Dos 360 construtos com IL13RA2 (subunidade alfa 2 de receptor de interleucina 13) como o módulo de P4, 25 foram positivos. Dos 490 construtos com IL2RA (subunidade alfa de receptor de interleucina 2) como
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437/540 o módulo de P4, 28 foram positivos. Dos 489 construtos com IL15RA (subunidade alfa de receptor de interleucina 15) como o módulo de P4, 22 foram positivos. Dos 590 construtos com CD8A (molécula de CD8a) como o módulo de P4, 25 foram positivos. Dos 619 construtos com IL13RA1 (subunidade alfa 1 de receptor de interleucina 13) como o módulo de P4, 25 foram positivos. Dos 637 construtos com CD3G (molécula de CD3g) como o módulo de P4, 30 foram positivos. Dos 618 construtos com CD3D (molécula de CD3d) como o módulo de P4, 37 foram positivos. Dos 673 construtos com CD27 (molécula de CD27) como o módulo de P4, 29 foram positivos. Dos 654 construtos com CD79B (molécula de CD79b) como o módulo de P4, 33 foram positivos. Dos 728 construtos com TNFRSF9 (o membro 9 de superfamília de receptor de TNF) como o módulo de P4, 30 foram positivos. Dos 1.169 construtos com CD40 (molécula de CD40) como o módulo de P4, 53 foram positivos. Dos 1.324 construtos com TNFRSF18 (o membro 18 de superfamília de receptor de TNF) como o módulo de P4, 54 foram positivos. Dos 1.739 construtos com CD8B como o módulo de P4, 73 foram positivos. Dos 286 construtos com CRLF2 como o módulo de P4, 8 foram positivos. Dos 725 construtos com FCGR2C como o módulo de P4, 29 foram positivos. Dos 602 construtos com ICOS como o módulo de P4, 24 foram positivos.
[ 1012 ] Para as Bibliotecas IA e 1.1A, os construtos M001-S116-S044, M024S192-S045, M001-S047-S102, M048-S195-S043, M012-S216-S211 e M030-S170-S194 tinham enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2.
[1013] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 1A quanto da Biblioteca 1.1A são fornecidas na Tabela 19, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de IL6R, MYD88, CD27, MYD88, TNFRSF18 ou IL31RA, quando presente no primeiro domínio intracelular (P3), e construtos com domínios intracelulares de CD8B, IL1RL1, CD8A, TNFRSF4, ou MYD88, quando presentes no segundo domínio
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438/540 intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas IA e 1.1 A (Tabela 19). Os construtos com domínios dos receptores de citocina IL6R, CD27, TNFRSF18 ou IL31RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com os domínios dos receptores de citocina IL1RL1 ou TNFRSF4, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas IA e 1.1 A (Tabela 19).
[1014] Na Biblioteca 2B, que inclui construtos que codificam os polipeptídeos quiméricos e não codificam um CAR, 167 candidatos quiméricos foram identificados (consultar a Tabela 8, em que o enriquecimento foi calculado como Log2(contagem normalizada no último dia indicado na tabela + 1) - log2(contagem normalizada no dia 7+1)) que promoveu a proliferação de PB MC entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela quando cultivado na ausência de IL-2. E notório que, em geral, o enriquecimento foi menos do que o encontrado para os construtos de Biblioteca 1 A, que incluem um CAR.
[1015] Para Biblioteca 2B, CSF3R T640N na posição Pl-2, a proliferação celular promovida entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela é melhor do que outros domínios extracelulares e transmembranares (Pl-2) testados, quando todos os resultados de todos os construtos derivados de um domínio extracelular e transmembranar foram combinados, rendendo um fator de enriquecimento maior do que 2,5. Os Exemplos de domínios extracelular e/ou transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de a proliferação celular são fornecidos na Tabela 8. Os Exemplos de domínios extracelular e/ou transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 2.1B, que promoveram a mais alta magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 11.
[1016] Para a Biblioteca 2B, os domínios intracelulares de CD8A, CD40, IFNAR1, IL31RA e MyD88 ou mutantes dos mesmos que conhecidos por terem atividade de sinalização se tais mutantes estiverem presentes nas tabelas, quando encontrados na posição do primeiro domínio intracelular (P3) de polipeptídeos quiméricos candidatos, promove proliferação celular de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com primeiros domínios intracelulares (P3) derivados de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento de
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439/540 contagens de sequência de construtos em populações de célula de PB MC cultivadas misturadas, de modo que pelo menos 2 vezes mais contagens para tal domínio estivessem presentes no dia 28 do que no dia 7 para a Biblioteca 2B, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 8 Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 2.1B, que promoveram a mais alta magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 11.
[1017] Para a Biblioteca 2B, os domínios intracelulares de CD27, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por terem atividade de sinalização se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados na posição de segundo domínio intracelular (P4) de candidatos de polipeptídeo quimérico, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com segundos domínios intracelulares (P4) derivados de tal gene, promovem proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela. Essa conclusão é baseada no enriquecimento de contagens de sequência de construtos em populações de célula de PB MC cultivadas misturadas, de modo que 11 vezes mais contagens para tal domínio estivessem presentes no dia 28 do que no dia 7 para a Biblioteca 2B, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 8 Os Exemplos de segundos domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 2.1B, que promoveram a maior magnitude de proliferação celular são fornecidos na Tabela 11.
[ 1018 ] Mais especificamente, para a Biblioteca 2B, dos 6.909 construtos com CSF3R T640N (receptor de fator 3 de estimulação de colônia com treonina 640 mutaram para asparagina) como o módulo P1/P2 para Biblioteca 2B, 59 foram positivos, o que foi definido como construtos tendo um enriquecimento acima de dois para a Biblioteca 2B. Dos 184 construtos com IFNAR1 (subunidade 1 de receptor de interferon alfa e beta) com o módulo de P3 para a Biblioteca 2B, 3 foram positivos. Dos 1.258 construtos com CD40 (molécula de CD40) como o
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440/540 módulo de P3 para a Biblioteca 2B, 17 foram positivos. Dos 851 construtos com CD27 (molécula de CD27) como o módulo de P4 para a Biblioteca 2B, 11 foram positivos. Dos 418 construtos com CD8A como o módulo de P3 para a Biblioteca 2B, 10 foram positivos. Dos 1.385 construtos com IL31RA como o módulo de P3 para a Biblioteca 2B, 12 foram positivos. Dos 5.757 construtos com MyD88 como o módulo de P3 para a Biblioteca 2B, 56 foram positivos.
[1019] Para as Bibliotecas 2B e 2.1B, os construtos M007-S049-S051, M007S050-S039, M012-S050-S043, M012-S161-S213, M030-S142-S049, M001-S145-S130, M018S085-S039, M018-S075-S053, M012-S135-S074 e M007-S214-S077 tiveram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2.
[102 0] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 2B quanto da Biblioteca 2.1B são fornecidas na Tabela 20, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de CD28, CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA ou TNFRSF14, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD40, CD3G, CD8A, TNFRSF9, CD28, IL10RB, CD79B, FCER1G ou GHR, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20). Os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA ou TNFRSF14, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina TNFRSF9, IL10RB, FCER1G, GHR ou CD40, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20). Os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de FCGR2C, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de CD3G,
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CD79B ou FCER1G, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 2B e 2.1B (Tabela 20).
Exemplos 18. Identificação de elementos linfoproliferativos de polipeptídeo candidato quimérico.
[1021] Neste exemplo, duas bibliotecas de polipeptídeo quimérico (Biblioteca 3 e Biblioteca 4) de elementos linfoproliferativos quiméricos candidatos (putativo) foram montados em vetores virais de agrupamentos de sequências de bloco extracelular-transmembranar, sequências de bloco intracelulares e uma biblioteca de código de barras de acordo com o polipeptídeo quimérico que codifica o construto fornecido nas Figuras 32 e 33. A proliferação de PBMCs transduzidas de biblioteca foi seguida ao longo do tempo: o DNA genômico foi extraído de PBMCs em intervalos de uma semana e a região de código de barras amplificada para que o sequenciamento de DNA estime o número de células nessas culturas misturadas de PBMCs contendo cada um dos polipeptídeos quiméricos candidatos do teste. Assim, a triagem testou a capacidade dos polipeptídeos quiméricos candidatos para promover a proliferação celular de PB MC na ausência de IL-2 adicionada exogenamente ou qualquer oura citocina exógena.
[1022] Duas bibliotecas foram produzidas e analisadas nesse estudo: A Biblioteca 3 (que foi usada nas triagens identificada como Bibliotecas 3A, 3B, 3.1A e 3.1B) foram flanqueados com um CAR na extremidade 5' do polipeptídeo quimérico, enquanto a Biblioteca 4 (que foram usados nas triagens identificadas como Bibliotecas 4B e 4.1B) não incluem um CAR. A Figura 32 fornece um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificative não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um CAR e um CLE candidato da Biblioteca 3 acionada por um promotor EF-1 alfa e uma sequência tipo Kozak (GCCGCCACC (SEQ ID NO:519)), em uma cadeia principal de vetor lentiviral. O CAR foi etiquetado com FLAG e continha uma ASTR direcionada a CD19, uma haste e porção de transmembrana de CD8, e um domínio de ativação intracelular de CD3z. Cada elemento linfoproliferativo candidato da Biblioteca 3 inclui 4 módulos; um módulo extracelular (Pl), um módulo transmembranar (P2) e 2 módulos intracelulares (P3 e P4). O módulo Pl também codificou um domínio de reconhecimento e/ou eliminação Myc. Uma sequência de interrupção tripla (TAATAGTGA (SEQ ID NO:520)) separou P4 de um código de barras de DNA (P5). Um WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTT
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CTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCC GGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCT TTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO: 521)) esteve presente entre o último códon de interrupção (a partir de 4 bp após o único nucleotídeo do último códon de interrupção) e a 3 ’ LTR (que começou com 83 nucleotídeos após o último nucleotídeo do WPRE).
[1023] O CAR e Pl da Biblioteca 3 foi separado por uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma sequência de salto ribossômica T2A.
[1024] A Figura 33 fornece um esquema de um cassete de expressão transgene exemplificativo não limitante contendo uma sequência de polinucleotídeos, um CLE candidato da Biblioteca 4 acionada por um promotor EF-1 alfa e uma sequência tipo Kozak (GCCGCCACC (SEQ ID NO:519)), em uma cadeia principal de vetor lentiviral. Cada elemento linfoproliferativo candidato da Biblioteca 4 inclui 4 módulos; um módulo extracelular (Pl), um módulo transmembranar (P2) e 2 módulos intracelulares (P3 e P4). O módulo Pl também codificou um domínio de reconhecimento e/ou eliminação Myc. Uma sequência de interrupção tripla (TAATAGTGA (SEQ ID NO:520)) separou P4 de um código de barras de DNA (P5). Um WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTT CTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCC GGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCT TTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO:521)) esteve presente entre o último códon de interrupção (a partir de 4 bp após o único nucleotídeo do último códon de interrupção) e a 3 ’ LTR (que começou com 83 nucleotídeos após o último nucleotídeo do WPRE).
[102 5] As partes de polipeptídeo quimérico montado parte de ambas as bibliotecas seguiu exatamente o mesmo projeto com 4 posições (1 módulo extracelular (Pl), um módulo transmembranar (P2) e 2 partes intracelulares (P3 e P4), um dos quais pode ser um sinal de terminação precoce) (Figuras 32 e 33). Os ácidos nucleicos que codificam versões variantes ou completas de uma etiqueta Myc ou um domínio de reconhecimento e/ou eliminação, eTAG (chamado, na Tabela 6, de “eTAG” ou “Etiqueta Myc”) foram inseridos na terminação 5’ das sequências de codificação de CAR em Biblioteca 3 e na terminação 5’ do domínio c-Jun em Pl na Biblioteca 4. Uma sequência de sinal foi inserida na terminação 5’ das sequências de codificação de CAR na Biblioteca 3 e na terminação 5’ do domínio de reconhecimento e/ou
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443/540 eliminação que codifica sequências da Biblioteca 4. O projeto e construção gerais da biblioteca, incluindo o código de barras, foi como revelado no Exemplo 17 no presente documento, exceto pelos domínios Pl e P2, como apontado em maiores detalhes posteriormente neste Exemplo. Ademais, o domínio de liberação foi em alguns construtos, como indicado na Tabela 6, e quando presente foi uma variante de eTag ou uma etiqueta Myc.
Síntese de vetores virais e produção lentiviral [102 6] Os vetores foram sintetizados e as partículas lentivirais foram produzidas para cada biblioteca como revelado no Exemplo 17.
Transdução e cultura de pbmcs [102 7] Para a Biblioteca 3A, o sangue humano integral de um doador saudável (89,lml) foi coletado em uma bolsa de sangue de 200ml contendo anticoagulante de CDP (Nanger; S-200). O sangue foi processado com o uso de centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll-Pacque™ (General Electric) com o uso de um dispositivo Sepax 2 S-100 (Biosafe; 14000) seguindo as instruções do fabricante e kit CS900.2 (BioSafe; 1008), para obter células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Rendimento de PBMC viável foi de 8,4 x 107 células. Dez ampolas de células em 5 x 106 PBMC por ampola foram congeladas para uso posterior na alimentação de células B CD 19+ para CD 19-CAR contendo amostras de Biblioteca 3 A. 3 x 107 PBMC foram adicionadas, cada uma, a um dispositivo de cultura de célula de G-Rex 100 M (Wilson Wolf, 81100S) a uma concentração final de 0,5 x 106 células viáveis/ml em um volume final de 60ml de SFM de Expansão de Célula T completa OpTmizer™ CTS™ (OpTmizer™ CTS™ Meio Basal de Expansão de Célula T de 1 1 (Thermo Fisher, A10221) suplementado com 26 ml OpTmizer™ CTS™ Suplemento de Expansão de Célula T (Thermo Fisher, A10484-02), SR de Célula Imune de 25 ml CTS™ (Thermo Fisher, A2596101) e 10 ml de CTS™ GlutaMAX™-! Supplement (Thermo Fisher, A1286001) de acordo com as instruções do fabricante). A interleucina-2 humana recombinante (IL-2) (Novoprotein) também foi adicionada a uma concentração de 100IU/ml juntamente com Ab anti-CD3 de ativação (OKT3, Novoprotein) adicionada a uma concentração de 50 ng/ml, para ativar as PBMCs para transdução viral. O dispositivo G-Rex foi incubado de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação de um dia para o outro, as preparações de partícula de lentivírus contendo os construtos de codificação de polipeptídeo
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444/540 de teste desejados (Biblioteca 3) foram adicionados ao dispositivo G-Rex em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. O dispositivo G-Rex foi incubado de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação de um dia para o outro, SFM de Expansão de Célula T Completa adicional OpTmizerTM CTS™ foi adicionada para trazer o volume final para 500 ml. Nenhuma IL-2 adicional ou outra citocina exógena foi adicionada nessa ou nas próximas etapas de cultura. O dispositivo G-Rex® foi incubado em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2 por 7 dias de isolamento de PBMC. No dia 7, as células do dispositivo G-Rex transduzidas com a Biblioteca 3 foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. 5 x 107 das células de Biblioteca 3 foram colocadas em um novo dispositivo G-Rex 100M contendo 500 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2 e identificadas como Biblioteca 3A. 1,1 x 108 das células de Biblioteca 3 foram colocadas em um novo dispositivo G-Rex 100M contendo 500 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2 e identificadas como Biblioteca 3B. Nessas triagens, as células alimentadas com PBMCs foram designadas com A após o número da biblioteca, por exemplo, triagens realizadas com células transduzidas com Biblioteca 3 e alimentadas com PBMCs são chamadas de Biblioteca 3A no presente documento. Quatro ampolas de PBMC correspondentes ao doador congeladas no Dia 0 condensadas (2 x 107 PBMC) foram adicionadas aos dispositivos G-Rex contendo células transduzidas com biblioteca 3A para fornecer a ativação de célula B CD19+ da ASTR CD19. A Biblioteca 3B não recebeu PBCM do Dia 0. Nessas triagens, as células não alimentadas com PBMCs foram designadas com um B após o número da biblioteca. Por exemplo, triagens realizadas com células transduzidas com Biblioteca 3 e não alimentadas com PBMCs são chamadas de Biblioteca 3B no presente documento. Os dispositivos G-Rex foram incubados em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. No dia 14, as células dos dois dispositivos G-Rex (biblioteca 3A ou biblioteca 3B) foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. Essas foram, cada uma, colocadas em poços individuais de placas G-Rex de 6 poços (Wilson-Wolf; 80240M) contendo 30 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. Uma ampola de PBMC correspondentes ao doador congeladas no Dia 0 condensadas (5 x 106 PBMC) foi adicionada à
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445/540 biblioteca 3 A G-Rex para fornecer a ativação de célula B CD 19+ da ASTR CD 19. Os dispositivos G-Rex foram incubados em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. Esse processo foi repetido no Dia 21, Dia 28, Dia 35 e Dia 42 exceto que duas ampolas de PB MC do Dia 0 congeladas foram adicionadas à Biblioteca 3 A no dia 21, e uma ampola nos Dias 28, 35 e 42. A Biblioteca 3B não foi cultivada além do dia 21. Essas triagens foram repetidas, exceto que a etiqueta Myc na parte PI foi substituída por uma eTag como mostrado nas Tabelas 6, 14, e 15 e designadas como Bibliotecas 3.1 A e 3.1B, em que o A e B indicam se as células foram alimentadas com PBMCs como discutido acima.
[102 8] As células da Biblioteca 3 A foram preparadas para análise por citometria de fluxo no Dia 49. As células foram coletadas por centrifugação (400g, 5 minutos) e dispostos sobre Ficoll (Ficoll-Paque Premium (GE, n° de cat. 17-5442-02) de acordo com as direções do fabricante. 1,7 x 106 células foram ressuspensas em 450 μΐ de Tampão de Mancha de FACs (554656, BD). As células ressuspensas foram aliquotadas em 9 tubos de eppendorf, cada um contendo 50 μΐ ou 1,8 x 105 células. 2,5 μΐ de Bloco de Fc humano (564220, BD) foi adicionado em cada tubo e incubado à temperatura ambiente por 10 minutos. A seguinte receita de anticorpo foi adicionada a 50 μΐ de amostras para manchar para CD3, CD4, CD8, CD56, CD19, FLAG Tag (CAR+): 2,5 μΐ de anticorpo anti-CD3-BV421 (clone de OKT3,317344, Biolegend), 2,5 μΐ de anticorpo anti-CD8-BV510 (clone de RPA-T8 (301048, Biolegend), 2,5 μΐ de anticorpo antiCD4-PE-Cy7 (clone de OKT4 (317412, Biolegend), 2,5 μΐ de anti-CD56-BV785(362550, Biolegend) e 0,5 μΐ de PE anti-FLAG Tag (anti-DYKDDDDK, Clone L5, 637310, Biolegend) para amostras manchadas com 5 cores. 2,5 μΐ de anticorpo de BB515 CD19 (clone HIB19, 564456, BD) e 0,5 ul de anticorpo PE anti-FLAG Tag foram adicionados para amostras de manchamento com 2 cores. As amostras com mancha única para CD3, CD4, CD8, CD56 ou FLAG Tag também foram preparados com o uso dos anticorpos e volumes acima. 2,5 μΐ BV421 IgG (camundongo IgG2a,400259, Biolegend), 2,5 μΐ PE/CY5 IgG (camundongo IgG2b,400317, Biolegend), 2,5 μΐ BV510 IgG (camundongo IgGl,400171, Biolegend), 2,5 μΐ BV785 IgG (camundongo IgGl, 400169, Biolegend) e 10 μΐ PE IgG (camundongo IgGl, 555749, BD) foram adicionados por amostras manchadas com controle de IgG. Nenhum anticorpo foi adicionado para um controle não manchado. As amostras foram incubadas 30 minutos em gelo. As amostras foram centrifugados (400 g, 5 minutos) e o sobrenadante foi removido. As amostras foram lavadas com
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0,5 ml de Tampão de Manchamento de FACS duas vezes. Os péletes de célula manchados foram ressuspensos em 125 μΐ Tampão de Manchamento de FACS e, então, fixados adicionando-se 125 ul de tampão Fixativo de BD (554655 BD). As amostras foram incubadas com tampão de fixação por 15 minutos a 4°C. As amostras foram lavadas duas vezes com 500 μΐ de Tampão de Manchamento de FACS e ressuspensas com 0,4 ml de Tampão de Manchamento de FACS. A análise de FACs de amostras foi realizada em um citômetro de fluxo de Novocyte (ACEA Biosciences) e analisada com o uso de uma porta de linfócito com base em difusão direta e lateral.
[1029] Para a Biblioteca 4B, o sangue humano integral de um doador saudável (70ml) foi coletado em uma bolsa de sangue de 200ml contendo anticoagulante de CDP (Nanger; S-200). O sangue foi processado com o uso de centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll-Pacque™ (General Electric) com o uso de um dispositivo Sepax 2 S-100 (Biosafe; 14000) seguindo as instruções do fabricante e kit CS900.2 (BioSafe; 1008), para obter células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Rendimento de PBMC viável foi de 4,9 x 107 células. 4,9 x 107 PBMC foram adicionadas, cada uma, a um dispositivo de cultura de célula de G-Rex 100 M (Wilson Wolf, 81100S) a uma concentração final de 0,5 x 106 células viáveis/ml em um volume final de 98ml de SFM de Expansão de Célula T completa OpTmizer™ CTS™. A interleucina-2 humana recombinante (IL-2) (Novoprotein) também foi adicionada a uma concentração de 100 lU/ml juntamente com Ab anti-CD3 de ativação (OKT3, Novoprotein) adicionada a uma concentração de 50 ng/ml, para ativar as PBMC para transdução viral. O dispositivo G-Rex foi incubado de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação de um dia para o outro, as preparações de partícula de lentivírus contendo os construtos de codificação de polipeptídeo de teste desejados (Biblioteca 4) foram adicionados ao dispositivo G-Rex em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. O dispositivo G-Rex foi incubado de um dia para o outro em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação de um dia para o outro, SFM de Expansão de Célula T Completa adicional OpTmizerTM CTS™ foi adicionada para trazer o volume final para 500 ml. Nenhuma IL-2 adicional foi adicionada nessa ou nas próximas etapas de cultura. O dispositivo G-Rex® foi incubado em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2 por 7 dias de isolamento de PBMC. No dia 7, as células do dispositivo G-Rex transduzidas com a biblioteca 4 foram coletadas
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447/540 por centrifugação e ressuspensas em SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. 1,63 x 108 das células de Biblioteca 4 foram colocadas em um novo dispositivo G-Rex 100M contendo 500 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2 e identificadas como Biblioteca 4. A Biblioteca 4 não recebeu PBCM do Dia 0. Assim, nessas triagens, as bibliotecas foram designadas com um B após o número da biblioteca, por exemplo, triagens realizadas com células transduzidas com Biblioteca 4 não foram alimentadas com PBMCs e são chamadas de Biblioteca 4B no presente documento. O dispositivo G-Rex foi incubado em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. No dia 14, as células do dispositivo G-Rex (Biblioteca 4) foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. Essas células foram, cada uma, colocadas em um poço individual de placas G-rex de 6 poços (WilsonWolf; 80240M) contendo 30 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ sem IL-2. O dispositivo G-Rex foi incubado em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2. As amostras de Biblioteca 4 não foram cultivadas além do Dia 21. Essas triagens foram repetidas, exceto que a etiqueta Myc na parte PI foi substituída por uma eTag como mostrado nas Tabelas 6 e 16, e designada como Biblioteca 4.1B, em que o B indica que as células não foram alimentadas com PBMCs como discutido acima.
[103 0] As amostras (7 x 104 a ~4-8 x 106 células) foram coletadas em vários dias pós-transdução (Dias 7 e 21) e o DNA genômico foi purificado com o uso de DNA Genômico Mamífero GenElute™ Miniprep após o protocolo de kits. Em alguns casos, as amostras foram purificadas com o uso de centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll-Pacque™ (General Electric) para remover as células mortas antes da extração de DNA genômico. O DNA genômico purificado foi sequenciado com o uso de um Illumina HiSeq, gerando leituras de 150 bp de extremidade emparelhada. Geralmente, um subconjunto de 10 milhões de leituras foi extraído de cada arquivo de fastq de índice e processado para análise com o uso de barcode_reader, um R script personalizado modificado para extrair código de barras sequências com base na presença de uma região constante. O DNA genômico purificado também foi sequenciado em um sistema de sequenciamento PacBio para associar códigos de barras com construtos.
Análise de dados [1031] A análise de dados foi realizada como revelado no Exemplo 17, exceto
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448/540 que os pontos no tempo diferem.
Resultados [1032] Neste experimento, os candidatos de polipeptídeo quimérico foram projetados para ter 4 domínios de teste, que incluem um domínio extracelular (Pl), um domínio transmembranar (P2), um primeiro domínio intracelular (P3) e um segundo domínio intracelular (P4) (Figuras 32 e 33). Como explicado no Exemplo 17, os construtos incluem um código de barras de DNA para auxiliar na análise e identificação do construto com o uso de sequenciamento da próxima geração. Adicionalmente, todos os construtos incluem sequências de ácido nucleico que codificam um domínio de reconhecimento e/ou eliminação em quadro com o domínio extracelular. Os construtos na Biblioteca 3, mas não na Biblioteca 4, codificaram um CAR a montante do candidato de polipeptídeo quimérico, que foi idêntico, quanto à estrutura, a um CAR usado na Biblioteca 1 (Exemplo 17).
[1033] O domínio extracelular usado para a Biblioteca 3 e a Biblioteca 4 foi uma variante de c-Jun que inclui o motivo de zíper de leucina (NM_002228_3) conhecido por ser um motivo de dimerização (consultar, por exemplo, Chinenov e Kerppola, Oncogene. 30 de abril de 2001;20(19):2438-52). Um espaçador de entre 0 e 4 resíduos de alanina foi incluído nos polipeptídeos quiméricos candidatos entre o domínio extracelular de c-Jun e o domínio transmembranar. Sem se ater à teoria, acredita-se que o espaçador de alanina pode afetar a sinalização dos domínios intracelulares conectados à região extracelular de zíper de leucina por meio do domínio transmembranar através da alteração da orientação do dos domínios de transmembrana e/ou domínios intracelulares conectados.
[1034] Os domínios transmembranares candidatos foram selecionados de domínios transmembranares de abrangência única conhecidos de receptores tipo selvagem e Tipo I mutante como citocina, hormônio, receptores de ativação ou coestimulantes que foram relatados como sendo constitutivamente ativos quando expressados pelo menos em alguns tipos de célula. As mutações em tais mutantes de receptor selecionados para a Biblioteca 3 e Biblioteca 4 ocorrem na região de transmembrana. Os domínios transmembranares exemplificativos para as Bibliotecas 3A, 3B, 3.1 A, 3.1B, 4B e 4.1B podem ser identificados nas Tabelas 12 a 17. Os cabeçalhos para as Tabelas 12 a 17 são da seguinte forma: BlockSequence é o código de Pl, P2, P3 e os domínios de P4 da Tabela 6 usado em cada construto; Norm_D7 são as contagens normalizadas no dia 7;
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Enrich_DXX é o enriquecimento no dia XX versus dia 7, em que ο XX é o dia indicado na tabela, por exemplo, Enrich _D21 é o enriquecimento no dia 21 versus no dia 7 e Enrich_D35 é o enriquecimento no dia 35 versus o dia 7. Os dados para um construto são mostrados nas colunas imediatamente à direita para o construto. Os dados para dois construtos são mostrados em cada fileira. Por exemplo, o primeiro construto que é identificado na Tabela 12 é E013-T047-S158S080, que aponta P1-P2-P3-P4. Em tal construto, o domínio transmembranar (P2) é T047, que é o domínio transmembranar de IL7RA Ins PPCL (interleucina 7 receptor) como fornecido na Tabela 6, juntamente com a sequência de aminoácidos desse domínio que foi incluído nesse construto. Os mesmos primeiros domínios intracelulares (P3) e segundos domínios intracelulares (P4) incluídos no Exemplo 17 foram incluídos nas bibliotecas nesse exemplo exceto pelo fato de que uma das partes P3 foi um espaçador (consultar abaixo).
[1035] Um total de 5 combinações conceitualizadas possíveis foram projetadas com base em um domínio de zíper de leucina Jun extracelular com um espaçador de alanina 0-4 separando o mesmo de 82 domínios transmembranares diferentes, 81 domínios de P3 possíveis, um dos quais foi um espaçador de 23 aminoácidos e 21 domínios de P4 possíveis, um dos quais foi um códon de interrupção. Nem todos os construtos conceitualizados foram detectados após a montagem de vetor viral, a produção de partícula lentiviral, transdução de PMBC e 7 dias de cultura. Para as Bibliotecas 3A e 3B, 68.951 construtos estiveram presentes após a transdução de PBMCs e 7 dias de cultura. Para a Biblioteca 4B, 50.652 construtos estiveram presentes após a transdução de PBMCs e 7 dias de cultura. As informações detalhadas a respeito dos candidatos analisados podem ser determinadas a partir das Tabelas 6el2al7. O sistema de codificação para construtos é igual ao explicado para o Exemplo 17, como apontado no parágrafo anterior.
[1036] Para as Bibliotecas 3A, 3B, 3.1A, 3.1B, 4B e 4,1B, construtos foram identificados que promovem proliferação celular de PB MC entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela. Certos polipeptídeos em módulos específicos do CLEs foram entre as compatibilidades de topo através das bibliotecas 3A, 3B e 4. Esses CLEs promoveram a proliferação à maior magnitude. Por exemplo, os construtos exemplificativos contendo CD40 ou ICOS na posição P2; MPL, MyD88, LEPR ou IFNAR2 na posição P3; e/ou CD40, CD79B ou CD27 na posição P4 foram entre os 5 polipeptídeos quiméricos mais frequentes em pelo menos 2 das 3 Bibliotecas 3A, 3B e 4B (consultar as Tabelas 12, 13 e 16). Surpreendentemente, MPL foi o polipeptídeo
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450/540 quimérico mais frequente em P3 por uma grande margem para todas as 3 bibliotecas. Observa-se que as compatibilidades de topo de P3 (MPL, MyD88, LEPR e IFNAR2) não foram incluídas na posição P4 para esses construtos.
[1037] Nas Bibliotecas 3A e 3B, que incluem construtos que codificam os polipeptídeos quiméricos e um CAR e PBMCs transduzidas que foram suplementadas com (Biblioteca 3A) ou sem (Biblioteca 3B) PBMCs frescas não transduzidas, 126 e 127 candidatos superiores foram identificados, respectivamente (consultar as Tabelas 12 e 13) que promoveram a proliferação de PBMC entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela quando cultivados na ausência de IL-2. As listas de candidatos superiores das Tabelas 12 e 13 foram geradas combinando os 100 candidatos mais prevalentes no dia 21 com base em análise de dados interina inicial, e os 100 construtos candidatos mais enriquecidos entre o dia 21 e o dia 7 com base na análise de dados interina inicial. Os dados interinos iniciais foram gerados decodificando-se parte da biblioteca codificada de modo que 66 dos 100 principais construtos, e 538 dos 1.000 principais construtos foram decodificados para a biblioteca 3A; e 77 dos 100 principais construtos, e 464 dos 1.000 principais construtos foram decodificados para a biblioteca 3B.
[103 8] Para a Biblioteca 3A, os domínios transmembranares (P2) de CD40, CD8B, CRLF2, CSF2RA, FCGR2C, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IL10RB, IL18R1, IL18RAP, IL3RA, LEPR e PRLR, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, a proliferação promovida de PBMCs entre o dia 7 e o dia 21, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um domínio transmembranar derivado de tal gene (dados não mostrados). Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada dia 21 mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Para a Biblioteca 3B, os domínios transmembranares de CD40, ICOS, CSF2RA, IL18R1, IL3RA e TNFRSF14, foram os de melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de domínios transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a proliferação celular para as Bibliotecas
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3A, e 3B nos dias 35 e 21, respectivamente, são fornecidos nas tabelas 12 e 13. Os Exemplos de domínios transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos nas triagens repetidas chamadas de Bibliotecas 3.1 A e 3.1B, que promoveram a proliferação celular são fornecidos nas Tabelas 14 e 15.
[103 9] Para a Biblioteca 3A, os primeiros domínios intracelulares (P3) de IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R e MPL, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados no primeiro domínio intracelular (P3) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o dia 21, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um primeiro domínio intracelular derivado de tal gene (dados não mostrados). Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PB MC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada dia 21 mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Para a Biblioteca 3B, os primeiros domínios intracelulares de IL21R, MPL e IL2RB, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nas tabelas, foram os de melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de proliferação celular para as Bibliotecas 3A, e 3B para os dias 35 e 21, respectivamente, são fornecidos nas tabelas 12 e 13. Os Exemplos primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos nas triagens repetidas chamadas de Bibliotecas 3.1 A e 3.1B, que promoveram a proliferação celular são fornecidos nas Tabelas 14 e 15.
[104 0] Para a Biblioteca 3A, segundos domínios intracelulares (P4) de CD27, CD3G, CD40 e CD79B, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula de tais mutantes estiverem presentes nas tabelas, quando encontrado no segundo domínio intracelular (P4) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação celular de PBMCs entre o dia 7 e
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452/540 dia 21, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um segundo domínio intracelular derivado de tal gene (dados não mostrados). Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada dia 21 mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Para a Biblioteca 3B, os segundos domínios intracelulares de CD40, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nas tabelas, foram os de melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de proliferação celular para as Bibliotecas 3A, e 3B para os dias 35 e 21, respectivamente, são fornecidos nas tabelas 12 e 13. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos nas triagens repetida chamada de Bibliotecas 3.1 A e 3.1B, que promoveram a maior magnitude de proliferação celular são fornecidos nas Tabelas 14 e 15.
[1041] Em relação aos genes específicos, dos 798 construtos com CD8B (molécula de CD8b) como a parte P2, 111 foram positivos, que foram definidos como construtos que têm um enriquecimento acima de dois (log2) para Bibliotecas 3 A ou 3B no dia 21. Dos 1.032 construtos com CD40 (molécula de CD40) como a parte de P2, 159 foram positivos. Dos 1.339 construtos com CRLF2 (receptor de citocina tipo fator 2) como a parte P2, 175 foram positivos. Dos 593 construtos com CSF2RA (subunidade de receptor alfa de fator 2 de estímulo de colônia) como a parte P2, 108 foram positivos. Nos 714 construtos com FCGR2C (fragmento Fc de receptor de IgG IIc (gene/pseudogene)) como a parte P2, 88 foram positivos. Dos 788 construtos com ICOS (coestimulador de célula T induzível) como a parte P2, 108 foram positivos. Dos 882 construtos com IFNAR1 (subunidade 1 de receptor de interferon alfa e beta) com a parte de P2, 106 foram positivos. Dos 806 construtos com IFNGR1 (receptor de interferon gama) com a parte de P2, 104 foram positivos. Dos 938 construtos com IL3RA (subunidade alfa de receptor de interleucina 3) como a parte de P2, 132 foram positivos. Dos 746 construtos com IL10RB (subunidade beta de receptor de interleucina 10) como a parte de P2, 99 foram positivos. Dos 814
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453/540 construtos com IL18R1 (receptor 1 de interleucina 18) como a parte de P2, 131 foram positivos. Dos 552 construtos com IL18RAP (proteína de acessório de receptor de interleucina 18) como a parte de P2, 83 foram positivos. Dos 1.390 construtos com LEPR (receptor de leptina) como a parte P2, 184 foram positivas. Dos 795 construtos com PRLR (receptor de prolactina) como a parte P2, 123 foram positivas.
[1042] Dos 1.259 construtos com IL1RAP (proteína acessório receptor de interleucina 1) como a parte P3, 158 foram positivos, o que foi definido como construtos que têm um enriquecimento acima de dois para Bibliotecas 3A ou 3B no dia 21. Dos 200 construtos com IL17RD (receptor D de interleucina 17) como a parte de P3, 31 foram positivos. Dos 11 construtos com IL17RE (receptor E de interleucina 17) como a parte de P3, 3 foram positivos. Dos 538 construtos com IL23R (receptor de interleucina 23) como a parte de P3, 86 foram positivos. Dos 1.531 construtos com MPL (MPL proto-oncogene, receptor de trombopoietina) como a parte P3,
509 foram positivos.
[104 3] Dos 3.124 construtos com CD3G (molécula de CD3g) como a parte P4,
458 foram positivos, o que foi definido como construtos que têm um enriquecimento acima de dois para Bibliotecas 3A ou 3B no dia 21. Dos 3.293 construtos com CD27 (molécula de CD27) como a parte de P4, 443 foram positivos. Dos 5.163 construtos com CD40 (molécula de CD40) como a parte de P4, 724 foram positivos. Dos 4.486 construtos com CD79B (molécula de CD79b) como a parte de P4, 663 foram positivos. E notável para qualquer construto que, visto que esse é um ensaio competitivo, “negativo” significa que um construto foi superado em relação à promoção da proliferação, porém, não que um construto não seja capaz de promover a proliferação.
[1044] Para as Bibliotecas 3A e 3.1A, os construtos E008/E013-T041-S186S050, E006/E011-T077-S186-S211, E007/E012-T021-S186-S051, E009/E014-T041-S186S053, E007/E012-T073-S186-S053, E006/E011-T017-S186-S051, E006/E011-T031-S186S211, E006/E011-T011-S186-S050, E006/E011-T011-S186-S047, E007/E012-T001-S186S050, E006/E011-T041-S186-S051, E008/E013-T028-S186-S076, E009/E014-T029-S199S053, E009/E014-T062-S186-S216, E007/E012-T006-S058-S051, E009/E014-T076-S186-S211 e E007/E012-T001-S186-S047 apresentaram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens, em que as partes de PI separadas por uma barra aqui incluíram diferentes
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454/540 etiquetas para as Bibliotecas 3A e 3A.1 como mostrado nas tabelas 6, 12 e 14. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2.
[104 5] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 3A quanto da Biblioteca 3.1A são fornecidas na Tabela 21, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de MPL, OSMR, ou CSF2RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD40, TNFRSF4, CD79B, CD27, FCGR2A ou TNFRSF18, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1 A (Tabela 21). Os construtos com domínios dos receptores de citocina MPL, OSMR ou CSF2RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, TNFRSF4, CD27, FCGR2A ou TNFRSF18, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1 A (Tabela 21). Os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de MPL ou OSMR, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3A e 3.1 A (Tabela 21).
[1046] Para as Bibliotecas 3B e 3.1B, os construtos E007/E012-T017-S186-
5051, E007/E012-T073-S186-S053, E008/E013-T028-S186-S047, E006/E011-T011-S186S047, E007/E012-T082-S176-S214, E006/E011-T046-S186-S052, E008/E013-T029-S186-
5052, E009/E014-T011-S186-S053, E008/E013-T032-S186-S039, E007/E012-T034-S186S051, E007/E012-T041-S192-S213, E006/E011-T014-S069-S213, E006/E011-T022-S186-
5053, E006/E011-T023-S115-S075, E006/E011-T029-S106-S213, E006/E011-T032-S155S080, E006/E011-T041-S186-S216, E006/E011-T057-S135-S080, E006/E011-T072-S191X002, E006/E011-T077-S186-S216, E006/E011-T080-S141-S080, E007/E012-T001-X001S214, E007/E012-T007-S059-S211, E007/E012-T016-S186-S052, E007/E012-T031-S186
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455/540
S053, E007/E012-T044-S102-S052, E007/E012-T044-S142-X002, E007/E012-T055-S069S053, E007/E012-T063-S176-S216, E007/E012-T065-S157-S075, EOO8/EO13-TOO8-SO85X002, E008/E013-T011-S085-S048, E008/E013-T021-S109-X002, E008/E013-T021-S168S211, E008/E013-T032-S064-S214, E008/E013-T037-S170-S215, E008/E013-T038-S176S048, E008/E013-T039-S137-S216, E008/E013-T041-S141-S053, E008/E013-T045-S177-
5048, E008/E013-T048-S109-S074, E008/E013-T073-S199-S075, E009/E014-T001-S157-
5074, E009/E014-T005-S196-S049, E009/E014-T011-S130-X002, E009/E014-T013-S155X002, E009/E014-T017-S186-S076, E009/E014-T021-S142-S080, E009/E014-T023-S082S076, E009/E014-T038-S196-S037, E009/E014-T055-S186-S052, E009/E014-T060-S175-
S053, E009/E014-T070-S085-S212, E008/E013-T026-S054-S213, E009/E014-T007-S120S053, E007/E012-T045-S186-S211, E008/E013-T073-S186-X002, E008/E013-T074-S186X002, E007/E012-T055-S186-S053, E008/E013-T036-S186-S053, E007/E012-T017-S058S053, E008/E013-T030-S189-S080, E006/E011-T029-S081-S047, E009/E014-T044-S194S050, E006/E011-T028-S121-X002, E008/E013-T028-S186-S053, E009/E014-T078-S142S213, E009/E014-T041-S186-S051, E008/E013-T006-S186-S050, E006/E011-T028-S186-
5075, E006/E011-T040-S120-S038, E007/E012-T044-S115-S211, E009/E014-T039-S176-
5075, E007/E012-T028-S186-S050, E008/E013-T031-S202-S050, E007/E012-T072-S192S053, E006/E011-T065-X001-S051, E007/E012-T030-S062-X002, E007/E012-T073-S186X002, E009/E014-T056-S186-S053, E008/E013-T046-S137-X002, E006/E011-T016-S136-
5076, E007/E012-T032-S142-S037, E007/E012-T065-S120-S215, E009/E014-T077-S186-
S047, E009/E014-T001-S126-S051, E006/E011-T030-S121-S039, E008/E013-T006-S176S213, E009/E014-T032-S130-S215, E008/E013-T041-S186-S039, E009/E014-T021-S186S047, E008/E013-T026-S137-S214, E007/E012-T029-S116-S075, E008/E013-T026-S106-
5049, e E007/E012-T032-S168-S075 tiveram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens, em que as partes de PI separadas por uma barra aqui incluíram diferentes etiquetas para as Bibliotecas 3B e 3.1B como mostrado nas tabelas 6, 13 e 15. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log22((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2.
[104 7] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios
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456/540 intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 3B quanto da Biblioteca 3.1B são fornecidas na Tabela 22, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de MPL, LEPR, MYD88, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA, IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R ou IL15RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD40, CD79B, CD27, TNFRSF14, CD79A, CD3G, TNFRSF9, FCGR2C, ICOS, TNFRSF18, TNFRSF4, CD28, FCER1G, FCGR2A, CD3D, TNFRSF8 ou CD3E, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22). OS construtos com domínios dos receptores de citocina MPL, LEPR, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA, IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R ou IL15RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina CD40, CD27, TNFRSF14, TNFRSF9, FCGR2C, TNFRSF18, TNFRSF4, FCER1G, FCGR2A ou TNFRSF8, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22). Os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de CD79B, CD79A, CD3G, FCGR2C, FCER1G, FCGR2A, CD3D ou CD3E, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 3B e 3.1B (Tabela 22).
[104 8] A análise de FACs revelou que o Dia 49, as células expandidas da Biblioteca 3A foram principalmente CD3+, CD8+, CD56+ e FLAG-Tag+. A tabela imediatamente abaixo mostra a porcentagem de linfócitos que mancharam positivo para o marcador indicado e as combinações de marcador. Esses dados mostram que os condutores identificados a partir dessa triagem de biblioteca principalmente expandiram o componente de célula T CD3+.
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% de Linfócitos
CD3+ 98,11%
CD3+CD4+ 8,96%
CD3+CD8+ 87,00%
CD3-CD56+ 0,22%
CD3+CD56+ 79,13%
CD3+FLAG+ 79,93%
CD3+CD4+FLAG+ 0,77%
CD3+CD8+FLAG+ 79,66%
CD3-CD56+FLAG+ 3,33%
CD3+CD56+FLAG+ 78,14%
CD19+FLAG+ 0,03%
[1049] Para a Biblioteca 4B, que inclui construtos que codificam os polipeptídeos quiméricos, mas não o CAR, e PBMCs transduzidas que não foram suplementadas com PBMCs frescas não transduzidas, 154 candidatos superiores foram identificados (consultar a Tabela 16) que promoveram a maior magnitude de proliferação de PBMC entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela quando cultivados na ausência de IL-2.
[1050] Para a Biblioteca 4B, os domínios transmembranares (P2) de CD40, CD8B, CSF2RA, IL18R1 e IL3RA, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização constitutiva em certos tipos de célula se tais mutantes são presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados na posição de domínio transmembranar (P2) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, proliferação celular promovida de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um domínio transmembranar derivado de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada no último dia indicado na tabela mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 4B, quando os resultados para todos os construtos para
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458/540 um gene são combinados. Os Exemplos de domínios transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes na Biblioteca 4B em construtos que promoveram a proliferação celular são fornecidos na Tabela 16. Os Exemplos de domínios transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 4.1B, que promoveram uma proliferação celular são fornecidos na Tabela 17.
[1051] Para a Biblioteca 4B, os primeiros domínios intracelulares (P3) de CRLF2, CSF2RA, IFNGR2, IL4R, MPL e OSMR ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados no primeiro domínio intracelular (P3) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram proliferação celular de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um primeiro domínio intracelular derivado de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PB MC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada no último dia indicado na tabela mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de acima de 0 para a Biblioteca 4B, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na Biblioteca 4B, que promoveram uma proliferação celular são fornecidos na Tabela 16. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 4.1B, que promoveram uma proliferação celular são fornecidos na Tabela 17.
[ 1052 ] Para a Biblioteca 4, segundos domínios intracelulares (P4) de CD27, CD40, e CD79B ou mutantes dos mesmos que são conhecidos para promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados no segundo domínio intracelular (P4) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveu proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada
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459/540 para todos os construtos com um segundo domínio intracelular derivado de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento de contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que mais contagens para tais domínios estivessem presentes no último dia do que no dia 7 para a Biblioteca 4B, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na Biblioteca 4B, que promoveram uma proliferação celular são fornecidos na Tabela 16. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos na triagem repetida chamada de Biblioteca 4.1B, que promoveram uma proliferação celular são fornecidos na Tabela 17.
[1053] Para as Bibliotecas 4B e 4.1B, os construtos E007/E012-T078-S154-S047,
E008/E013-T062-S186-X002, E007/E012-T077-S054-S053, E009/E014-TO11 -S141-S037, E006/E011 -TO 11 -S121-X002, E007/E012-T008-S064-S051, E008/E013-T003-S104-S216, E006/E011-T021-S054-X002, E008/E013-T027-S121-S211, E008/E013-T069-S083-X002, E007/E012-T047-S05 8-S211, E006/E011-T062-S069-X002, E008/E013-T039-S141-S050, E007/E012-TO19-S120-X002, E007/E012-T047-S05 8-S051,
E008/E013-T055-S186-S050, E007/E012-T034-S135 -S211, E008/E013 -T041 -S186-S037, E007/E012-T007-S085 -S215, E006/E011-T041 -S186-S047, E006/E011 -TO 19-S 186-S053, E006/E011-T003-S135 -X002, E009/E014-T032-S195 -X002, E008/E013-T026-S116-S038, E008/E013-T046-S142-S080, E007/E012 -T047-S098 -X002, E006/E011-T052-S130-S052, E008/E013-T045-S186-S053,
E007/E012-T069-S109-X002,
E009/E014-T057-S186-S050, E009/E014-T071-X001-S216, E006/E011-T038-S106-S039, E006/E011-T041 -S186-S050, E008/E013-T045-S186-S051, E008/E013-T071-S064-S080, E009/E014-T020-S199-S213, E009/E014-T050-S171-X002, E009/E014-T072-S195-X002, E006/E011-T065-S186-S076, E009/E014-T069-S099-S048, E008/E013-T041 -S186-X002, E006/E011-T003-S170-S039, )09/E014-T019-S130-S075, e
E006/E011-T047-S054-S053 tiveram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as triagens, em que as partes de PI separadas por uma barra aqui incluíram diferentes etiquetas para as Bibliotecas 4B e 4.1B como mostrado nas tabelas 6, 16 e 17. Para os propósitos das triagens repetidas, os construtos com enriquecimentos particularmente notáveis foram aqueles que tiveram um valor de contagem de log2((dados de contagem normalizados no último dia + l)/(dados de
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460/540 contagem normalizados no dia 7+1)) acima de 2.
[1054] As informações adicionais a respeito do primeiro e do segundo domínios intracelulares em construtos com enriquecimentos particularmente notáveis em triagens tanto da Biblioteca 4B quanto da Biblioteca 4.1B são fornecidas na Tabela 23, incluindo o gene (ou genes) do qual o primeiro e segundo domínios intracelulares são derivados, independentemente de o primeiro e/ou segundo domínios intracelulares serem receptores de citocina, e de o primeiro e/ou o segundo domínios intracelulares terem pelo menos um motivo de ITAM. Os construtos com domínios intracelulares de IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, MYD88, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB ou IL3RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios intracelulares de CD27, CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF18, CD3D, CD3G, CD27, ICOS, TNFRSF9, CD3E, FCGR2A, CD28, CD79A ou FCGR2C, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23). Os construtos com domínios dos receptores de citocina IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB ou IL3RA, quando presentes no primeiro domínio intracelular (P3), e os construtos com domínios dos receptores de citocina CD27, CD40, TNFRSF4, TNFRSF18, TNFRSF9, FCGR2A ou FCGR2C, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23). Os construtos com domínios contendo motivos de ITAM de CD79B, CD3D, CD3G, CD3E, FCGR2A, CD79A ou FCGR2C, quando presentes no segundo domínio intracelular (P4), mostraram enriquecimentos particularmente notáveis em ambas as Bibliotecas 4B e 4.1B (Tabela 23).
[1055] Para a Biblioteca 4B, dos 572 construtos com CD8B (molécula de CD8b) como a parte P2, 21 foram positivos, que foram definidos como construtos que têm um enriquecimento acima de dois para a Biblioteca 4B. Dos 897 construtos com CD40 (molécula de CD40) como a parte de P2, 50 foram positivos. Dos 551 construtos com CSF2RA (subunidade de receptor alfa de fator 2 de estímulo de colônia) como a parte P2, 25 foram positivos. Dos 732 construtos com IL3RA (subunidade alfa de receptor de interleucina 3) como a parte de P2, 47 foram positivos. Dos 738 construtos com IL18R1 (receptor 1 de interleucina 18) como a parte de P2, 44 foram
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461/540 positivos. Dos 1.683 construtos com MPL (MPL proto-oncogene, receptor de trombopoietina) como a parte P3, 305 foram positivos.
[105 6] Na análise interina inicial para a Biblioteca 3A no dia 21, 66 das 100 principais compatibilidades e 538 das 1.000 principais compatibilidades foram decodificadas. A decodificação adicional forneceu a decodificação profunda e a identidade de 99 das 100 principais compatibilidades e 992 das 1.000 principais compatibilidades da Biblioteca 3A e os dados foram coletados para o dia 35 e a análise foi atualizada no dia 21. Na análise inicial para a Biblioteca 3B no dia 21, 77 da 100 principais compatibilidades e 464 das 1.000 principais compatibilidades foram decodificadas na análise interina inicial. A decodificação adicional forneceu a decodificação profunda e a identidade de 100 das 100 principais compatibilidades e 708 das 1.000 principais compatibilidades da Biblioteca 3B. Os construtos superiores para as Bibliotecas 3A e 3B como os dados do dia 35, dados para a Biblioteca 3A e o dia 21, dados para a Biblioteca 3B são mostrados nas Tabelas 12 e 13, respectivamente.
[1057] Nas Bibliotecas 3A e 3B, que incluem construtos que codificam os polipeptídeos quiméricos e um CAR e PBMCs transduzidas que foram suplementadas com (Biblioteca 3A) ou sem (Biblioteca 3B) as PBMCs frescas não transduzidas, após a decodificação profunda, 124 candidatos superiores foram identificados para a Biblioteca 3A no dia 35, e 131 candidatos superiores foram identificados para a biblioteca 3B no dia 21 (consultar as Tabelas 12 e 13, respectivamente) que promoveram a maior magnitude de proliferação de PB MC entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela quando cultivados na ausência de IL-2 (isto é, IL-2 não foi adicionado ao meio de cultura durante a cultura após a transdução inicial). As listas de candidatos superiores de Tabelas 12 (Biblioteca 3A, dia 35) e 13 (Biblioteca 3B, dia 21) foram geradas combinando-se os 100 principais candidatos mais prevalentes no dia 21 (Biblioteca 3B) ou dia 21 ou 35 (Biblioteca 3A) e o 100 construtos candidatos principais mais enriquecidos entre o dia 21 e dia 7 (Biblioteca 3B) ou entre o dia 21 e dia 7 ou dia 35 e o dia 7 (Biblioteca 3A) após a decodificação profunda.
[1058] Das tabelas de compatibilidades de topo com o uso de resultados com a decodificação profunda, certos polipeptídeos em módulos específicos dos CLEs foram entre as compatibilidades de topo através de pelo menos uma das Bibliotecas 3A e 3B e para pelo menos um dos pontos no tempo do dia 21 e do dia 35 (Biblioteca 3A) ou no dia 21 (Biblioteca 3B). Por
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462/540 exemplo, os construtos exemplificativos contendo CD40 (especificamente, por exemplo, o domínio transmembranar com o código T011), ICOS (especificamente, por exemplo, o domínio transmembranar com o código T028), FCGR2C (especificamente por exemplo domínio transmembranar com o código T024), PRLR (especificamente, por exemplo, o domínio transmembranar com o código T077), IL3RA (especificamente, por exemplo, o domínio transmembranar com o código T041), IL6ST (especificamente, por exemplo, o domínio transmembranar com o código T045) na posição P2, IL18R1 (especificamente, por exemplo, o domínio transmembranar com o código T062) na posição P2;
MPL (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S186), IL18R1 (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S154), IL13RA2 (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S142), IL10RB (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código SI30), LEPR (especificamente por exemplo domínios intracelulares com o código S176), IFNAR2 (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S083), IL23R (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S165), MyD88 (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código SI94) e CSF2RA (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S058), na posição P3; e/ou CD40 (especificamente, por exemplo, um domínio intracelular com o código S050 ou S051), CD79B (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S053), TNFRSF4 especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S211), TNFRSF9 (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S213), TNFRSF14 (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S214), FCGRA2 (especificamente, por exemplo, os domínios intracelulares com o código S076), CD3G (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S039) ou CD27 (especificamente, por exemplo, o domínio intracelular com o código S047) na posição P4 foram entre os principais 5 polipeptídeos quiméricos mais frequentes (consultar Tabelas 12 e 13). Surpreendentemente, MPL foi o polipeptídeo quimérico mais frequente em P3 por uma grande margem para ambas as Bibliotecas 3A e 3B. Observa-se que as partes de compatibilidades principais de P3 não foram incluídos na posição P4 para esses construtos na Biblioteca 3A ou 3B.
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463/540 [1059] As observações adicionais a seguir sã notáveis: P2_CD40, P2_ICOS, P3_MPL, P4_CD40 e P4_CD79B surgiram como partes mais frequentes nas compatibilidades principais em cada uma das Tabelas 12 e 13. P4_CD27 surgiu como uma parte mais frequente nas Tabelas e 13. CSF2RB surgiu 4 vezes nos 123 mais enriquecidos e mais rep em P2, porém, o mutante V449E mutante não ocorre nessas compatibilidades principais (Tabela 12). Consequentemente, em algumas modalidades no presente documento, um polipeptídeo quimérico compreende um domínio transmembranar identificado em qualquer um dos construtos mostrados nas tabelas 12 e diferentes de um mutante de domínio transmembranar V449E de CSF2RB. Oito variantes de MyD88 ocorreram na posição P3 pelo menos uma vez nos 123 principais da Biblioteca 3A (Tabela 12). Ambas as variantes de CD40 testadas na biblioteca ocorreram pelo menos uma vez na posição P4 na lista de 123 principais para a Biblioteca 3A (Tabela 12). A combinação de MPL em P3 e CD40 em P4 mostrou até 26 construtos na lista dos 123 construtos principais da Biblioteca 3A (Tabela 12).
[10 60] Para a análise de gene por gene, para a Biblioteca 3A, os domínios transmembranares (P2) de CD4, CD8B, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2C, GHR, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IFNGR2, IL1R1, IL1RAP, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6ST, IL7RA, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL22RA1, IL31RA, LEPR, PRLR e TNFRSF8, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, promoverem a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um domínio transmembranar derivado de tal gene (Tabela 12). Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada no último dia indicado na tabela mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Para a Biblioteca 3B (Tabela 13), os primeiros domínios intracelulares de CD40, ICOS e IL18R1, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos
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464/540 fornecidos nas tabelas, obtiveram o melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de domínios transmebranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de proliferação celular para as Bibliotecas 3A e 3B são fornecidos nas tabelas 12 e 13. Os Exemplos de domínios transmembranares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos nas triagens repetidas chamadas de Bibliotecas 3.1 A e 3.1B, que promoveram a proliferação celular são fornecidos nas Tabelas 14 e 15.
[10 61] Para a Biblioteca 3A, os primeiros domínios intracelulares (P3) de CSF2RA, IFNAR1, IL1RAP, IL4R, IL6ST, IL11RA, IL12RB2, IL17RA, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL21R, IL23R, MPL e MyD88, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados no primeiro domínio intracelular (P3) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação celular de PBMCs entre o dia 7 e o último indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um primeiro domínio intracelular derivado de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PB MC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada no último dia indicado na tabela mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Para a Biblioteca 3B, os primeiros domínios intracelulares de CSF2RB, IL4R e MPL, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, obtiveram o melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de proliferação celular para as Bibliotecas 3A e 3B são fornecidos nas tabelas 12 e 13. Os Exemplos primeiros domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos nas triagens repetidas chamadas de Bibliotecas 3.1 A e 3.1B, que promoveram a proliferação celular são fornecidos nas Tabelas 14 e 15.
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465/540 [10 62] Para a Biblioteca 3A, os segundos domínios intracelulares (P4) de CD3D, CD3G, CD27, CD40, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGRA2, ICOS, TNFRSF4 e TNFRSF8, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nos construtos fornecidos nas tabelas, quando encontrados no segundo domínio intracelular (P4) de elementos de polipeptídeos quiméricos candidatos no presente documento, promoveram a proliferação de PBMCs entre o dia 7 e o dia 21 ou entre o dia 7 e o último dia indicado na tabela, quando os dados são considerados de uma maneira combinada para todos os construtos com um segundo domínio intracelular derivado de tal gene. Essa conclusão é baseada no enriquecimento das contagens de sequência de construtos em populações de célula de PBMC cultivadas misturadas, de modo que o enriquecimento, calculado como o logaritmo na base 2 da razão entre a contagem normalizada no último dia indicado na tabela mais um e a contagem normalizada no dia 7 mais um, foi de pelo menos 2 para a Biblioteca 3A, quando os resultados para todos os construtos para um gene são combinados. Para a Biblioteca 3B, os segundos domínios intracelulares de CD40, ou mutantes dos mesmos que são conhecidos por promover a atividade de sinalização em certos tipos de célula se tais mutantes estiverem presentes nas tabelas, embora não alcance um enriquecimento de 2 vezes log2, foram os de melhor desempenho quando analisados dessa forma. Os Exemplos de segundos domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos que estavam presentes em construtos que promoveram a maior magnitude de proliferação celular para as Bibliotecas 3A e 3B são fornecidos nas tabelas 12 e 13. Os Exemplos segundos domínios intracelulares ou porções e/ou mutantes dos mesmos, que estavam presentes em construtos nas triagens repetidas chamadas de Bibliotecas 3.1A e 3.1B, que promoveram a proliferação celular são fornecidos nas Tabelas 14 e 15.
Exemplos 19. Desnaturação térmica de fla-795 na ausência e presença de aciclovir por CALORIMETRIA DE VARREDURA DIFERENCIAL (dsc).
[10 63] Neste exemplo, a ligação de um fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo a um domínio de aptâmero de um riboswitch (SEQ ID NO: 87) foi demonstrada comparando-se a desnaturação térmica do domínio de aptâmero na ausência versus presença do fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo aciclovir.
Preparação de aptâmero [1064] O iniciador de T7 (SEQ ID NO:246), assim como o modelo (complemento
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466/540 inverso) da sequência de candidato identificado foi sintetizado por IDT (Coralville, IA) como DNA de fita única. Os candidatos foram estendidos por iniciador combinando-se os componentes com 1 μΜ de modelo, 2 μΜ de iniciador de T7, 200 μΜ de dNTPs, DNA Polimerase de IX Titânio Taq e tampão de IX Titanium Taq (Clontech Laboratories; Mountain View, CA), então, aquecimento por 3 minutos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C e 2 minutos a 68 °C (sem ciclagem). 42 pmoles de DNA de fira dupla foram usados para doze reações de 20 μΐ com o Kit de Transcrição de Alto Rendimento Ampliscribe T7 (Lucigen; Middleton, WI) de acordo com as direções-padrão do kit (IX tampão de reação, 7,5 mM de cada NTP, 10 mM de DTT, IX RiboGuard inibidor de RNase, IX Ampliscribe T7 solução de enzima). As reações foram incubadas a 42 °C de um dia para o outro, então, interrompidas adicionando-se 1 μΐ de DNase I e incubando por 15 minutos a 37 °C. Os produtos de transcrição foram purificados em 10% de PAGE de desnaturação com 8 M de ureia. Pelo menos 10 nmole de cada candidato foi liofilizado, e ressuspenso em IX Tampão de Ligação (50 mM de HEPES, 100 mM de KC1, 0,5 mM de MgCL, pH 7,3) no dia de avaliação de ligação.
[1065] Brevemente, DSC foi usado para analisar F1A-795 (7,2 μΜ) na ausência de aciclovir ou F1A-795 (2,77 μΜ) na presença de aciclovir (29,4 μΜ). Todas as análises foram conduzidas em IX Tampão de Ligação e toda a água usada foi tratada com DEPC. Todos os analitos foram ressuspensos primeiros em água tratada com DEPC, então, diluídos para sua concentração listada final em IX Tampão de Ligação. Antes do carregamento do DSC (GE Healthcare MicroCai VP-DSC), as amostras foram degaseificadas a 25 °C por 10 minutos. A amostra sem aciclovir foi submetida à varredura a partir de 10 °C a 115 °C a uma taxa de 1 °C por minuto. A amostra com aciclovir foi submetida à varredura a partir de 10 °C a 105 °C a uma taxa de 1 °C por minuto.
Resultados [10 6 6] A desnaturação térmica de Fl A-795 na ausência de aciclovir como medido por DSC tem uma transição centralizada em cerca de 60 °C (Figura 28). Essa transição sugere que o domínio de aptâmero seja estruturado na ausência de aciclovir. Na presença de aciclovir, F1A795 tem uma transição centralizada a cerca de 75 °C (Figura 28). Esse efeito estabilizante indica que o fármaco antiviral análogo ao nucleosídeo aciclovir se liga ao domínio de aptâmero F1A795. Assim, esse experimento confirmou que F1A-795 é ligado ao aciclovir.
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467/540 [10 67] Exemplo 20. Eficácia de transdução de células T humanas recém-isoladas e não estimuladas por partículas retrovirais contendo um elemento de pseudotipagem de vsv-g. e uma elemento de ativação ligado à membrana e opcionalmente contendo proteína vpu.
[10 68] As partículas lentivirais recombinantes foram produzidas por transfecção temporária de células 293T (Lenti-X™ 293T, Clontech) com plasmídeos de empacotamento lentivirais separados que codificam gag/pol e rev, e um plasmídeo de pseudotipagem que codifica VSV-G. Um vetor de expressão lentiviral da terceira geração codificando GFP, um receptor de antígeno quimérico anti-CD19, e uma eTAG chamada, no presente documento, de Fl-0-03 (Figura 20) foi cotransfectada com os plasmídeos de empacotamento. As células foram adaptadas a cultura de suspensão por crescimento em série em Meio de Expressão de 293 Freestyle™ (ThermoFisher Scientific). As células em suspensão foram semeadas em 1 x 106 células/ml (30 ml) em um frasco Erlenmeyer de 125 ml, e imediatamente transfectadas com o uso de polietilenimina (PEI) (Polysciences) dissolvida em ácido fraco.
[10 69] O DNA plasmídico foi diluído em 1,5 ml de meio Gibco™ Opti-MEM™ para 30 ml de células. Para obter partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G, o DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) usado foi uma mistura de 4 plasmídeos com as seguintes razões molares: 2x plasmídeo genômico (Fl-0-03), Ix plasmídeo contendo Rev, Ix plasmídeo contendo VSV-G e Ix plasmídeo contendo gag/pol. Para obter partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G e exibindo um anti-CD3-scFvFc-GPI em suas superfícies, o DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) usado foi uma mistura de 5 plasmídeos com as seguintes razões molares: 2x plasmídeo genômico (Fl-0-03), Ix plasmídeo contendo Rev, Ix plasmídeo contendo VSV-G, Ix plasmídeo contendo anti-CD3-scFvFc-GPI e Ix plasmídeo contendo gag/pol. Para obter partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G exibindo um anti-CD3-scFvFc-GPI e, contendo a proteína auxiliar Vpu, o DNA total (1 pg/ml de volume de cultura) usado foi uma mistura de 6 plasmídeos com as seguintes razões molares: 2x plasmídeo genômico (Fl-0-03), Ix plasmídeo contendo Rev, Ix plasmídeo contendo VSV-G, Ix plasmídeo contendo anti-CD3-scFvFc-GPI, Ix plasmídeo contendo Vpu-CH, e Ix plasmídeo contendo gag/pol. Separadamente, o PEI foi diluído em 1,5 ml de Gibco™ Opti-MEM™ para 2 pg/ml (volume de cultura, razão de 2:1 para DNA). Após uma incubação a temperatura ambiente de 5 minutos, misturaram-se bem as duas soluções e incubaram-se à temperatura ambiente durante mais 20 minutos. O volume final (3 ml) foi
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468/540 adicionado às células. As células foram então incubadas a 37 °C durante 72 horas com rotação a 125 rpm e com 8% de CO2. O plasmídeo contendo antiCD3-scFvFc-GPI inclui um scFv derivado de UCHT1, e uma sequência de ligação de âncora de GPI derivada de DAF (CD55). O vetor de UCHTlscFvFc-GPI codifica um peptídeo (SEQ ID NO:278) que inclui o peptídeo de sinal KAPPA de Ig humana (aminoácidos 1 a 22 de NCBIGI n° CAA45494.1) fundido com o UCHT1 scFv (aminoácidos 21 a 264 de NCBI GI n° CAH69219.1), fundidos à IgGl humana Fc (aminoácidos 1 a 231 de NCBI GI No. AEV43323.1) fundida à sequência de ligação de âncora de GPI de DAF humana (aminoácidos 345 a 381 de NCBI GI No. NP_000565). O plasmídeo contendo Vpu-CH codifica um peptídeo (MFDFIARVDYRVGVVALVVALIIAIIVWSIVYIEYRKLLKQRKIDWLIKRIRERAEDSGN ESDGEIEELSTMVDMEHLRLLDDL*) que inclui a sequência Vpu do isolado de HIV-1 M CH167-CC (aminoácidos 1 a 84, GenBank: AGF30946.1).
[107 0] Após 72 horas, os sobrenadantes foram coletados e clarificados por centrifugação a 1.200g por 10 minutos. Os sobrenadantes clarificados foram decantados para um novo tubo. As partículas lentivirais foram precipitadas por centrifugação de um dia para o outro a 3.300g, a 4 °C. O sobrenadante foi descartado, e os péletes de partícula lentiviral foram ressuspensos em 1:100 de volume inicial de meio 15 X-Vivo™ (Lonza). As partículas lentivirais foram tituladas por diluição serial e análise de expressão de GFP, em células 293T e Jurkat, 72 horas póstransdução, por citometria de fluxo.
[1071] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de um revestimento volumoso, coletado e distribuído pelo Banco de Sangue de San Diego, CA. A separação de densidade de gradiente àbase de SepMate™ 50 (Stemcell™) de PBMCs em FicolL Paque PLUS® (GE Healthcare Life Sciences) foi realizada conforme as instruções do fabricante. 30 ml de revestimento volumoso diluído em meio de X-Vivo™ 15 foram dispostos em camadas por cada tubo SepMate™. Após a centrifugação à temperatura ambiente, a 1.200g, por 20 min, as camadas de PBMC foram coletadas, agrupadas e lavadas três vezes com 45 ml de meio de XVivo™ 15 e centrifugação a 400 g por 10 min à temperatura ambiente. Os péletes, então, incubados à temperatura ambiente por 10 min em 10 ml de tampão de lise de RBC (Alfa Aesar) e lavados duas vezes adicionais com 45 ml de meio de X-Vivo™ 15, e centrifugação de 400 g por 10 min à temperatura ambiente. Nenhuma etapa adicional foi realizada para remover
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469/540 monócitos. Após o isolamento, PBMCs frescas e não estimuladas foram ressuspensas a uma concentração final de 1 x 106/ml em meio X-Vivo™ 15 meio, e foram transduzidas, em duplicatas, com as partículas lentivirais reveladas anteriormente. As transduções foram conduzidas por 3 dias, a 37 °C, 5% de CO2, em meio de X-Vivo™ 15. As transduções foram conduzidas a MOI 10 para [VSV-g]pp e MOI 1 para [VSV-G + UCHTl]pp e [VSV-G + UCHT1 + Vpu-CH]pp, em um formato de placa de 12 poços, 1 ml/poço, em duplicatas. Após 3 dias de transdução, as amostras foram coletadas e analisadas por FACS para a contagem de célula absoluta e níveis de expressão de GFP na população de CD3+.
[1072] A Figura 34A e Figura 34B mostram histogramas da porcentagem (%) de células de CD3+GFP+ na população de CD3+ total (Figura 34A) e um histograma da contagem de célula absoluta por poço da População de CD3+ viva (FIG 34B), respectivamente, 3 dias após a transdução de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas com as partículas lentivirais indicadas. Cada barra representa o +/- SD médio de duplicatas. A Figura 34A mostra que adicionar uma porção química de antiCD3-scFvFc-GPI (UCHT1) às partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G resulta em eficácias de transdução superiores de PBMCs recém-isoladas e não estimuladas em comparação com [VSV-G]pp sozinho. A Figura 34A também mostra que a adição de Vpu-CH pode aprimorar adicionalmente a eficácia de transdução do vetor duplamente pseudotipado [VSV-G + UCHTl]pp. Figura 34B mostra que a porção química de UCHT1 intensifica o estímulo de célula por contagem de célula absoluta por ul como comparado com apenas VSV-G. A adição de Vpu e UCHT1 intensifica, de modo similar, o estímulo celular por contagem de célula absoluta em comparação com apenas VSV-G.
Exemplo 21. Caracterização de elementos linfoproliferativos individuais.
[107 3] Neste exemplo, os elementos linfoproliferativos quiméricos (CLEs) seletos identificados nas triagens de biblioteca descritas no Exemplo 17 e Exemplo 18 foram avaliados individualmente. Para analisar adicionalmente os CLEs identificados nas triagens de Biblioteca 2B, as PBMCs ativadas foram transduzidas de um dia para o outro com partículas lentivirais que codificam um CLE sozinho e cultivado na ausência de citocinas exógenas. Para analisar adicionalmente os CLEs identificados nas triagens de Biblioteca 3A, PBMCs ativadas foram transduzidas de um dia para o outro com partículas lentivirais que codificam um CLE flanqueado com um CAR anti-CD19 na extremidade 5’ e cultivados na presença de células B CD 19+
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470/540 correspondentes ao doador adicionadas à cultura a cada 7 dias, porém, na ausência de citocinas exógenas. As células foram cultivadas por até 35 dias para avaliar a capacidade dos CLEs para promover proliferação de PBMC. Esse exemplo fornece adicionalmente métodos através dos quais caracterizar qualquer elemento linfoproliferativo putativo individual e confirma adicionalmente as identidades de vários CLEs altamente ativos.
[107 4] As partículas lentivirais recombinantes foram produzidas em células 293T (LentiX™ 293T, Clontech) que foram adaptadas à cultura em suspensão em meio de expressão Freestyle™ 293 (Thermo Fisher Scientific), meio definido quimicamente livre de soro. As células foram transfectadas temporariamente com o uso de PEI com um plasmídeo genômico e 3 plasmídeos de empacotamento lentivirais separados que codificam gag/pol, rev e um plasmídeo de pseudotipagem que codifica VSV-G como explicado no Exemplo 20. Os CLEs selecionados identificados nas triagens de biblioteca descritos nos Exemplos 17 e 18 foram regenerados individualmente de suas partes (Pl-2, P3 e P4 ou Pl, P2, P3 e P4) e inseridos nos mesmos cassetes de expressão de transgene como aquele da biblioteca da qual os mesmos são primeiro identificados. As partes de módulo de cada um dos CLEs selecionados são mostradas nas Figuras 35 e 36 e os nomes de gene e sequências de aminoácidos são mostradas na Tabela 6. As Figuras 31 e 32 mostram os cassetes para as Bibliotecas 2 e 3, respectivamente. As células transduzidas com partículas lentivirais contendo construtos identificados através de triagens de biblioteca são chamadas de “DL” seguido pelo número da biblioteca. Por exemplo, as células transduzidas com partículas lentivirais contendo construtos da Biblioteca 2 são chamadas de DL2. Assim, os CLEs com o prefixo “DL2” e “DL3” foram construídos no cassete mostrado nas Figuras 31 e 32, respectivamente. De modo similar, “DC 1-5” e “DC 1-6” compreendem CLEs inseridos no cassete de expressão transgene usado para a Biblioteca 1 como mostrado na Figura 30. O elemento linfoproliferativo quimérico de DC 1-5 codificado a partir da terminação amino à carbóxi, IL-7 humano (SEQ ID NO:511), um aglutinante flexível (SEQ ID NO:53) e resíduos 21-458 do IL7Ra humano (SEQ ID NO:229) que é o IL-7Ra de comprimento total sem seu peptídeo de sinal. O CLE de DC1-6 codificado a partir da terminação amino à carbóxi, IL-7 (SEQ ID NO:511), um aglutinante flexível (SEQ ID NO:53), as porções extracelulares e transmembranares do IL-7Ra (CD127) (SEQ ID NO:513) e o domínio intracelular do IL-2Rb (CD122) (SEQ ID NO:514). As proteínas quiméricas IL-7 - IL-7Ra e IL-7 - IL-7Ra - IL-2Rb foram descritas anteriormente
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471/540 (Hunter et al. Molecular Immunology 56(2013):1-11). Os IL-7s “DC2-5” e “DC2-6” compreendem CLEs inseridos no cassete de expressão transgene usado para a Biblioteca 2 como mostrado na Figura 31. Os CLEs em DC2-5 e DC2-6 foram os mesmos CLEs que DC 1-5 e DC Ιό, respectivamente. As PBMCs não transduzidas (NT), PMBCs transduzidas com um vetor que codifica uma eTag, mas não um CLE (Fl-0-01), e as PMBCs transduzidas com um vetor que codificam um CAR anti-CD19 e uma eTag, mas não um CLE (Fl-3-23) foram incluídas como controles negativos.
[1075] Os construtos da Biblioteca 2B usados neste Exemplo foram: DL2-1 (M024S190-S047), DL2-2 (M025-S050-S197), DL2-3 (M036-S170-S047), DL2-4 (M012-S045-S048), DL2-5 (M049-S194-S064), DL2-6 (M025-S190-S050) e DL2-7 (M025-S190-S051).
[1076] Os construtos da Biblioteca 3A usados neste Exemplo foram: DL3A-1 (E013T047-S158-S080), DL3A-2 (E011-T024-S194-S039), DL3A-3 (E014-T040-S135-S076), DL3A4 (E013-T041-S186-S051), DL3A-5 (E013-T064-S058-S212), DL3A-6 (E013-T028-S186S051), DL3A-7 (E014-T015-S186-S051), DL3A-8 (E011-T016-S186-S050), DL3A-9 (E011T073-S186-S050) e DL3A-10 (E013-T011-S186-S211).
[107 7] No Dia 0, as PBMCs foram enriquecidas a partir de camadas leucoplaquetas (San Diego Blood Bank) por centrifugação em gradiente de densidade com Ficoll-Paque PREMIUM® (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com as instruções do fabricante seguidas de lise de glóbulos vermelhos. 1,5 x 106 PBMCs viáveis foram semeadas nos poços das Placas de 6 Poços (Wilson Wolf, 80240M) em 3 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ suplementadas com 100 I U/ml (IL-2) e 50 ng/ml de anticorpo anti-CD3 (317326, Biolegend) para ativar as PBMCs para a transdução viral. Após a incubação de um dia para o outro a 37 °C e 5% de CO2, as partículas lentivirais que codificam os construtos descritos acima foram adicionadas diretamente às PBMCs ativadas em um MOI de 5 e incubadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO2. No dia seguinte, o volume de meio em cada poço foi trazido a 30 ml com SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ e as placas foram retornadas ao incubador. Nenhuma IL-2, IL-7 ou outra citocina exógena foi adicionada nessa ou nas etapas de cultura subsequentes. As células de cada poço foram coletadas no Dia 7 para determinar os números de célula, porcentagem de viabilidade e porcentagem de células transduzidas, que foi definido como a porcentagem de células de FLAG-Tag+ ou E-Tag+ por análise de FACS. As
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472/540 células foram, então, centrifugadas, ressuspensas em SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™, e 0,5 x 106 células para cada amostra foram ressemeadas no poço de uma Placa de 6 Poços G-Rex em 30 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™. As PBMCs correspondentes ao doador do Dia 0 criopreservadas anteriormente contendo 0,5 x 106 células B CD19+ (como determinado por FACS no Dia 0) foram adicionadas a culturas de “DL3A-” para fornecer ativação de célula B CD 19+ da ASTR CD 19. Esse processo foi repetido nos dias 14, 20 e 28 antes que as células fossem coletadas no Dia 35.
Resultados [107 8] As PBMCs transduzidas com partículas lentivirais que codificam os CLEs foram cultivadas na ausência de citocinas exógenas por 35 dias. A proliferação é representada como expansão multiplicada que foi calculada dividindo-se o número total de células pelo número de células semeadas para tal ponto no tempo. As PBMCs transduzidas com cada CLE selecionado individual mostradas na Figura 35 proliferaram mais do que os controles negativos, que incluíam PBMCs não transduzidas e PMBCs transduzidas com um vetor que codifica a eTag, mas não um CLE (Figura 35). Ademais, os seguintes CLEs exibiram uma expansão multiplicada maior do que 23 nos dias 14, 21, 28 e 35, enquanto a expansão multiplicada dos controles negativos foi próxima a 0 para esses pontos no tempo: DL2-7, DC2-6, DL2-6, DL2-2, DL2-1 e DC2-5. As PBMCs transduzidas com construtos que codificam um CAR anti-CD 19 e vários CLEs (mostrado na Figura 36) e cultivadas na presença de PBMCs frescas correspondentes ao doador adicionadas a cada 7 dias, porém, na ausência de citocinas exógenas, proliferaram mais do que os controles negativos, que incluíam PBMCs não transduzidas e PMBCs transduzidas com um vetor que codifica um CAR anti-CD19 e uma eTag, mas não um CLE. Todos os CLEs mostrados na Figura 36 exibiram uma expansão multiplicada maior do que 23 no dia 35, ao passo que a expansão multiplicada dos controles negativos foi próxima a 0 no dia 35. A proliferação de PBMCs transduzidas com partículas lentivirais contendo polinucleotídeos codificando DL3A-1 (E013T047-S158-S080), DL3A-2 (E011-T024-S194-S039), DL3A-3 (E014-T040-S135-S076) e DL3A-5 (E013-T064-S058-S212) foi comparável à dos controles negativos e não são mostradas na Figura 36.
Exemplo 22. Prova do conceito para vários métodos ilustrativos fornecidos no presente documento, incluindo expansão IN VIVO de linfócitos geneticamente modificados.
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473/540 [107 9] Este exemplo fornece métodos exemplificativos para transduzir PBMCs, incluindo células T, ex vivo e expandir tais PBMCs transduzidas, incluindo células T, in vivo. Tais métodos incluem um método de transdução de 4 horas ilustrativo com vetores lentivirais recombinantes ilustrativos que expressam certos elementos linfoproliferativos quiméricos ilustrativos. Ademais, tais métodos fornecem métodos exemplificativos adicionais para transduzir PBMCs que, em modalidades ilustrativas, são tipicamente células T com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em 4 horas em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação foram produzidos por células de empacotamento de transfecção com vetores que codificam vários componentes das partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em suspensão em meios quimicamente definidos livres de soro.
Materiais e métodos [10 8 0] As partículas lentivirais recombinantes foram produzidas em células 293T (LentiX™ 293T, Clontech) que foram adaptadas à cultura em suspensão em meio de expressão Freestyle™ 293 (Thermo Fisher Scientific), meio definido quimicamente livre de soro. As células foram transfectadas temporariamente com o uso de PEI com um 1 de 3 plasmídeos genômicos (detalhado abaixo) e 3 plasmídeos de empacotamento lentivirais separados que codificam gag/pol, rev e um plasmídeo de pseudotipagem que codifica VSV-G como explicado no Exemplo 20. Para produzir as partículas retrovirais que também exibem um elemento de ativação ligado à membrana, um quarto plasmídeo empacotamento que codifica um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD3 (UCHTlscFvFc-GPI) foi cotransfectado como descrito no Exemplo 20. Os plasmídeos genômicos foram vetores de expressão lentivirais da terceira geração contendo uma deleção na 3’LTR, levando à autoinativação em que os plasmídeos codificaram os seguintes:
(1) Anti-ROR2 MRB-CAR:T2A:eTag (Fl-1-27): Esse plasmídeo genômico é idêntico àquele mostrado na Figura 20, exceto pelo fato de que a sequência que codifica anti-CD19 CAR foi substituída por um MRB-ASTR que tem um scFv que reconhece ROR2 humano, uma haste de CD8 e sequência transmembranar (SEQ ID NO:75), CD137 (SEQ ID NO:1) e CD3z (SEQ ID NO: 13). As partículas lentivirais recombinantes que codificam esse construto são chamadas de Fl-1-27;
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474/540 (2) Flag-Anti-ROR2 MRB-CAR:T2A:CLE (Fl-1-228 e F1-1-228U): Esse plasmídeo genômico é idêntico àquele mostrado na Figura 20, exceto pelo fato de que a sequência que codifica anti-CD19 foi substituída por uma Flag-tag covalentemente ligada ao MRBCAR anti-ROR2 descrito em (1) acima, e o GMCSFR ss:eTag foi substituído por um CLE. O CLE foi uma proteína transmembranar tipo I compreendendo um módulo de dimerização extracelular (Pl), um módulo transmembranar (P2) e 2 módulos intracelulares (P3 e P4). Os genes nas posições P1-P2-P3-P4 foram MycTag 2A JunIL13RA-MPL-CD40. Os códigos para esses módulos são E013-T041-S186-S051 (consultar a Tabela 6). Esse CLE foi primeiro identificado nas bibliotecas 3A, 3B e 4B e foi o 6o CLE mais enriquecido entre os dias 7 e 35 na biblioteca 3A. As partículas lentivirais recombinantes que codificam esse construto são chamadas de Fl-1-228 e partículas lentivirais recombinantes que codificam esse construto e exibem UCHTlscFvFc-GPI são chamadas de F1-1-228U; ou (3) Flag-Anti-CD19 CAR:T2A:CLE (Fl-3-219 e F1-3-219U): Esse plasmídeo genômico é idêntico ao CAR CD 19 anti-humano mostrado na Figura 20, exceto pelo fato de que a Flag-tag foi inserida entre o CD8ss e o CAR, e a sequência que codifica o GMCSFRss:eTag foi substituída por um CLE. O CLE foi uma proteína transmembranar tipo I compreendendo um polipeptídeo de interleucina ligado covalentemente por meio de um aglutinante flexível aos domínios extracelulares e transmembranares de seu receptor de interleucina cognato e ligado covalentemente ao domínio intracelular de um receptor de citocina dissimilar. Em particular, da terminação amino à carbóxi, o plasmídeo codificou IL-7 (SEQ ID NO:511), um aglutinante flexível (SEQ ID NO:53), as porções extracelulares e transmembranares do IL-7Ra (CD127) (SEQ ID NO:513) e o domínio intracelular do IL-2Rb (CD122) (SEQ ID NO: 514). As partículas lentivirais recombinantes que codificam esse construto são chamadas de Fl-3-219 e partículas lentivirais recombinantes que codificam esse construto e exibem UCHTlscFvFc-GPI são chamadas de F1-3-219U.
Isolamento de Pbmc, transdução de um dia para o outro de pbmcs após estímulo ex vivo, seguido por expansão DE 15 dias ex vivo de linfócitos geneticamente modificados [10 81] No dia 0, PBMCs foram isoladas de sangue periférico-DAC de um voluntário
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475/540 saudável com consentimento informado por centrifugação em gradiente de densidade com FicollPacque™ (General Electric) com o uso de um kit CS-900.2 (BioSafe; 1008) em um dispositivo Sepax 2 S-100 (Biosafe; 14000 ) de acordo com as instruções do fabricante. 3,0 x 107 PBMCs viáveis foram semeadas em 1 1 de G-Rex (Wilson-Wolf) e o volume foi levado a 60ml com SFM de Expansão de Células T Complete OpTmizerTM CTSTM suplementado com 100 lU/ml IL-2 (Novoproteína, GMP-CD66), 10 ng/ml IL-7 (Novoprotein, GMP-CD47) e 50 ng/ml de anticorpo anti-CD3 (OKT3, Novoprotein) para ativar as PBMCs, que incluem células T e células NK, para transdução viral. Após a incubação de um dia para o outro a 37 °C e 5 % de CO2, as partículas lentivirais que codificam o MRB-CAR anti-ROR2, Fl-1-27, foram adicionados diretamente às PBMCs ativadas em um MOI de 5 (440 ul) e incubadas de um dia para o outro a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação de um dia para o outro, as células foram alimentadas trazendo o volume total de meios no G-Rex para 100 ml com SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ suplementada com NAC (Sigma) para aumentar a concentração final por 10 mM juntamente com 100 lU/ml de IL-2 humano recombinante e 10 ng/ml IL-7 humano recombinante. O dispositivo G-Rex foi incubado em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2 com adições de 100 lU/ml IL-2 humano recombinante e 10 ng/ml IL-7 humano recombinante solução a cada 48 horas. As células foram expandidas através do Dia 15 antes de ser coletado. Essas células transduzidas foram lavadas em meio congelante (70% de RPMI 1640, 20% de FBS inativada por calor, 10% de DMSO) e criopreservadas em 1 ml de alíquotas em 5,0 x 107 células/ml para uso posterior. Dois dias antes do uso no Grupo A dos experimentos neste exemplo abaixo, 8 ampolas (4,0 x 108) dessas PBMCs transduzidas de Fl-127 criopreservadas foram condensadas e repousadas por 2 dias em um G-Rexl00M contendo 377 ml SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ (Meio Basal de Expansão de Célula T de 1 1 de OpTmizer™ CTS™ (Thermo Fisher, A10221) suplementada com 26 ml de Suplemento de Expansão de Célula T OpTmizer™ CTS™ (Thermo Fisher, A10484-02), 25 ml de CTS™ Immune Cell SR (Thermo Fisher, A2596101) e 10 ml de Suplemento de CTS™ GlutaMAX™-! (Thermo Fisher, A1286001) de acordo com instruções do fabricante) suplementada com 100 lU/ml de IL-2 (Novoprotein), 10 ng/ml de IL-7 (Novoprotein), e NAC suficiente para aumentar a concentração final de 10 mM.
Isolamento de Pbmc e transdução vantajosamente rápida de linfócitos em repouso sem estímulo
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476/540 ex vivo anterior e sem célula expansão ex vivo [1082] O sangue humano integral DE 2 voluntários saudável com consentimento informado foi coletado em múltiplos tubos Vacutainer de 100 mm (Becton Dickenson; 364606) contendo 1,5 ml de anticoagulante de Solução A de Dextrose de Citrato Ácido (sangue periférico de ACD). Para cada voluntário, o sangue dos tubos Vacutainer foi agrupado (185,2 ml para o Grupo B, 182,5 ml para o Grupo C) e distribuído a 2 bolsas de coleta de sangue de 500 ml padrão. As seguintes etapas de enriquecimento de PBMCs através da transdução foram realizadas em um sistema fechado.
[10 8 3] O sangue nas 2 bolsas de sangue de cada voluntário foi processado sequencialmente com o uso de centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll-Paque™ (General Electric) com o uso de um kit CS-900.2 (BioSafe; 1008) em um dispositivo Sepax 2 S100 (Biosafe; 14000) com o uso de 2 ciclos de lavagem de acordo com as instruções do fabricante, para obter 45 ml de PBMCs isoladas de cada ciclo. A solução de lavagem usada no processo de Sepax 2 foi Solução salina normal (Chenixin Pharm) + 2% de albumina de soro humano (HSA) (Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical). A solução de ressuspensão celular final foi de 45 ml SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ (Meio Basal de Expansão de Célula T de 1 1 OpTmizer™ CTS™ (Thermo Fisher, A10221-03) suplementada com 26 ml de Suplemento de Expansão de Célula T OpTmizer™ CTS™ (Thermo Fisher, A10484-02), 25 ml de CTS™ Immune Cell SR (Thermo Fisher, A2596101) e 10 ml de Suplemento CTS™ GlutaMAX™-! (Thermo Fisher, A1286001)). Cada etapa de processamento na máquina Sepax 2 foi de aproximadamente 1 hora e 12 minutos. As PBMCs enriquecidas obtidas a partir dos 2 ciclos de processamento foram agrupadas separadamente para o Grupo B e o Grupo C e as células, contadas.
[1084] 5,5x107 de PBMCs viáveis recém-enriquecidas foram semeadas em cada uma das 4 coleta de bolsas de sangue padrão para o Grupo B e o volume foi trazido a55 ml com SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™ de modo que as células estivessem a uma densidade de 1,0 x 106 /ml. 1,12 x 108 de PBMCs viáveis recém-enriquecidas foram semeadas em cada uma das 2 coleta de bolsas de sangue padrão para o Grupo Ceo volume foi trazido a 110 ml com SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizerTM CTSTM de modo que as células
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477/540 estivessem a uma densidade de 1,0 x 106 /ml. Nenhum anti-CD3, anti-CD28, IL-2, IL-7 ou outra citocina exógena foi adicionada para ativar ou, de outro modo, estimular o linfócito ex vivo antes da transdução. As partículas lentivirais foram adicionadas diretamente às PBMCs não estimuladas em coleta de bolsas de sangue em um MOI de 1 como a seguir: 0,779 ml de Fl-1-228 foi 5 adicionado a uma bolsa e 3,11 ml de F1-1-228U foi adicionado à outra bolsa do Grupo B PBMCs;
0,362 ml de Fl-3-219 foi adicionado a uma bolsa e 3,52 ml de F1-3-219U foi adicionado à outra bolsa de PBMCs de Grupo C. As misturas de reação de transdução foram gentilmente massageadas para misturar o conteúdo, então, incubadas por quatro (4) horas na coleta de bolsas de sangue em um incubador de cultura de tecido umidificado padrão a 37 °C e 5% de CO2. As 10 PBMCs de cada bolsa foram, então, transferidas para um tubo cônico de 50 ml (removendo, assim, as células do sistema fechado nessa prova de experimento de conceito) e lavadas 3 vezes em DPBS + 2% de HSA antes de serem ressuspensas em 5 mis DPBS + 2% de HSA e contadas. A tabela abaixo mostra a duração de cada etapa no processo e o tempo total decorrido. Nenhum processamento adicional foi realizado nessas PBMCs antes de seu uso nos experimentos neste 15 exemplo.
Grupo B
Grupo C
Tempo Tempo Tempo Tempo
Decorrido Decorrido
Total Total
Retirada e coleta de 9:00- 10:00
sangue
Execução do Ia Sepax 10:08-11:16 2 h 16 min 10:30-11:45 1 h 45 min
Execução do 2a Sepax 11:21-12:30 3 h 30 min 11:48-13:04 3 h 4 min
Contagem celular 12:40-13:00 4 h 0 min 13:11-13:35 3 h 35 min
Distribuir em bolsas 13:55-14:03 5 h 3 min 13:37-13:44 3 h 44 min
Adição de meio 14:06-14:20 5 h 20 min 13:45-13:58 3 h 58 min
Adição de vírus 14:55-15:01 6 h 1 min 14:00-14:30 4 h 30 min
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478/540
Grupo B
Grupo C
Tempo Tempo Tempo Tempo
Decorrido Decorrido
Total Total
Transdução 15:10-19:10 10 h 10 min 14:30-18:30 8 h 30 min
Transfer & Pellet 19:10-19:36 10 h 36 min 18:30-19:04 8 h 4 min
1- lavagem 19:55-20:10 11 h 10 min 19:14-19:30 9 h 30 min
2- lavagem 20:21-20:36 11 h 36 min 19:35-19:51 9 h 51 min
3~ lavagem 20:47-21:02 12 h 2 min 19:56-20:02 9 h 2 min
Contagem celular 21:12-22:10 13 h 10 min 20:03-20:50 10 h 50 min
Transporte 21:58-23:10 14 h 10 min 21:50-21:25 11 h 25 min
Dosagem em 23:12-23:30 14 h 30 min 21:25-21:30 11 h 30 min
camundongo
Tabela 24. TEMPOS decorridos para etapas após A RETIRADA DE sangue agrupamento.
Eficácia de transdução e sobrevivência/proliferação independente de citocina in vitro de pbmcs 5 transduzidas pelos MÉTODOS acima [1085] 2,0 x 106 PBMCs que incluem células T e células NK foram semeadas em duplicata ou triplicata nos poços de uma placa de cultura de tecido de 6 poços para cada amostra. As placas foram centrifugadas e cada amostra foi ressuspensa em 2 ml de SFM de Expansão de Célula T Completa OpTmizer™ CTS™. As citocinas não foram adicionadas. As placas foram 10 incubadas em um incubador de cultura de tecido umidificado padronizado a 37 °C e 5% de CO2 por 6 dias. Metade (Iml) da suspensão celular de cada poço foi removida no dia 3 e as células restantes removidas no dia 6 para determinar os números de célula, a porcentagem de viabilidade e a porcentagem de células transduzidas, que foi definida como a porcentagem de células FLAGTag+ pela análise de FACS. As contagens de célula totais no dia 6 foram dobradas para considerar
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479/540 a remoção de metade das células no dia 3.
A proliferação/sobrevivência e o extermínio alvejado de tumores in vivo por PBMCS efetoras transduzidas pelos métodos acima [10 8 6] Um modelo de xenoenxerto com o uso de NSG, ou camundongos NOD Scid Gamma foi escolhido para sondar a capacidade de PBMCs humanas transduzidas com Fl-1-27, Fl-1-228, F1-1-228U, Fl-3-219 e F1-3-219U para sobreviver, proliferar e exterminar os tumores de expressão de antígeno cognato in vivo. O NSG é uma cepa de camundongos que não possuem células T maduras, células NK e células B e está entre as cepas de camundongos mais imunodeficientes descritas até o momento. A remoção desses componentes celulares do sistema imune é tipicamente realizada para possibilitar que as PBMCs humanas enxertem sem reações inatas, humorais ou imunoadaptativas do hospedeiro. Concentrações de citocinas homeostáticas normalmente presentes apenas após a quimioterapia de radiação ou linfodepletação em seres humanos são alcançadas devido à ausência da cadeia gama comum extracelular murina, que permite que células humanas transferidas de forma adoptiva recebam tais citocinas. Ao mesmo tempo, esses animais podem também ser usados para enxertar alvos de xenoenxerto tumoral para examinar a eficácia de CARs para matar tumores que expressam alvos. Embora a presença de antígenos do receptor de células T xeno-reativas no produto celular efetor resultem eventualmente em doença do enxerto versus hospedeiro, esses modelos permitem uma avaliação de curto prazo da farmacologia animal e tolerabilidade aguda.
[1087] As células de Raji (ATCC, Manassas, VA) que expressam CD19 humano endógeno e células CHO (ATCC, Manassas, VA) transfectadas para expressar de modo estável o ROR2 humano (CHO-ROR2) foram utilizados para fornecer antígeno para estimular as células efetoras de CAR e para gerar tumores-alvo uniformes para determinar a eficácia de células efetoras de CAR para exterminar tumores de expressão de antígeno cognato. As células Raji e transgênica de CHO cresceram rapidamente com malignidade disseminada após administração subcutânea em camundongos NSG em combinação com membrana basal artificial de Matrigel.
[10 8 8] Os camundongos foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Os xenoenxertos tumorais (sc) subcutâneos (sc) foram estabelecidos no flanco posterior de camundongos fêmeas NODPrkdcscidI12rgtml/Begen (B-NSG) (Beijing Biocytogen Co. Ltd.). Brevemente, as células Raji
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480/540 cultivadas e células CH0-R0R2 cultivadas foram separadamente lavadas em DPBS (Thermo Fisher), contadas, ressuspensas em DPBS frio e misturadas com um volume apropriado de Matrigel ECM (Corning; concentração final 5 mg/ml) a uma concentração de 0,5 x 106 células/200 μΐ no gelo. Os animais foram preparados para injeção com o uso de anestesia aprovada padrão com depilação (Nair) antes da injeção. 200 μΐ de suspensão celular em ECM foram injetados sc nos flancos traseiros de camundongos com 9 ou 10 semanas de idade para céluals Raji e CHO-ROR2, respectivamente.
[10 8 9] 5 dias após a inoculação tumoral, os camundongos portando tumores CHOROR2, que tinham em média 77 mm3 de volume, receberam a dose de modo intravenoso (IV) por injeção de veia caudal como a seguir: Os camundongos NSG no Grupo A receberam 1 x 107 PBMCs transduzidas com partículas lentivirais de Fl-1-27 em 200 plde DPBS (n=4), ou 200 μΐ de DPBS sozinho (n=2); camundongos NSG no Grupo B receberam 0,85 x 107 PBMCs transduzidas com partículas lentivirais Fl-1-228 em 200 μΐ de DPBS (n=2), 0,85 x 107 PBMCs transduzidas com partículas lentivirais F1-1-228U em 200 μΐ de DPBS (n=2) ou 200μ1 DPBS sozinho (n=2). De modo similar, 5 dias após a inoculação tumoral, os camundongos no Grupo C portanto tumores de Raji, com média de 76 mm3 de volume, foram dosados de modo intravenoso (IV) por injeção de veia caudal com 200 μΐ de DPBS sozinho (n=4) ou 1 x 107 PBMCs transduzidas com partículas lentivirais de Fl-3-219 em 200 de μΐ de DPBS (n=3) ou F1-3-219U partículas lentivirais em 200 μΐ de DPBS (n=3). Observa-se que o protocolo para a transdução vantajosamente rápida de linfócitos em repouso antes da ativação ex vivo e sem expansão celular ex vivo foi usado para transduzir as PBMCs com Fl-1-228, F1-1-228U, Fl-3-219 e F1-3-219U usadas para dosar esses camundongos. O tempo total decorrido da coleta de sangue humano total para dosagem IV dos camundongos com PBMCs transduzidas foi de 14,5 horas para Fl-1-228 e F1-1-228U e 11,5 horas para Fl-3-219 e F1-3-219U.
[10 90] Os tumores foram medidos usando calibre 2 vezes por semana e o volume do tumor foi calculado usando a seguinte equação: (diâmetro mais longo * diâmetro mais curto2)/2. Aproximdamente 100 μΐ de sangue foi coletado de cada camundongo nos dias 7, 14 e 21 para análise por FACS e qPCR. O sangue, o baço e o tumor também foram coletados quando os camundongos foram submetidos à eutanásia consistente com as diretrizes da necropsia de fardo de tumor.
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Citometria de fluxo [10 91] Para as células coletadas de cultura in vitro - as células foram giradas para baixo e ressuspensas em 0,5 ml de Tampão de Manchamento de FACS (554656, BD). 2,5 pl de Bloco de Fc humano (BD, 564220) foram adicionados a cada amostra e incubados à temperatura ambiente por 10 minutos. As células foram manchadas com 0,5 pl anti-FLAG Tag PE ((antiDYKDDDDK) 637310, Biolegend) e 0,5 pl mancha de célula Morta Verde Flexível Viva/Morta (L34970, Thermo Fisher) por 30 min em gelo. As células foram lavadas duas vezes em tampão de FACS, fixadas em uma mistura de 1:1 mistura do tampão de FACS e BD Cytofix (554655, BD), processadas com Novocyte (ACEA) e os dados resultantes foram analisados com software NovoExpress software (ACEA) com o uso de portas vivas com base na difusão direta e lateral e na mancha viva/morta. Os linfócitos transduzidos foram medidos como células FLAG Tag+.
[10 92] Para as células obtidas a partir do sangue - as hemácias no sangue recém-coletado foram lisadas com o uso de Tampão de Lisagem (555899, BD) e as células restantes, ressuspensas em 100 pl de Tampão de Manchamento de FACS. 2,5 pl de Bloco de Fc humano (BD, 564220) foram adicionados a cada amostra e incubados à temperatura ambiente por 10 minutos. As células foram manchadas com cetuximab biotinilado por 30 mins em gelo. As células manchadas foram lavadas com tampão de FACS e adicionalmente manchadas com 5 pl de CD45-PE-Cy7 antihumano e 0,5 pl CD45-FITC anticamundongo. 0,4 pl de SA-PE foi adicionado às amostras de camundongos dosados com células transduzidas com controles de Fl-1-27, Fl-1-228, F1-1-228U e PBS para esses grupos. 1 pl de anti-FLAG Tag PE ((anti-DYKDDDDK) 637310, Biolegend) foi adicionado às amostras de camundongos dosados com células transduzidas com controles de Fl-3-219 e F1-3-219U e PBS para esse grupo. As células foram incubadas por 30 min em gelo, lavadas duas vezes em tampão de FACS e ressuspensas em 100 pl de Tampão de Manchamento de FACS com 1 pl de 7-AAD (420404, Biolegend). As amostras recém-manchadas foram processadas com Novocyte (ACEA) e os dados resultantes foram analisados com software NovoExpress (ACEA) com o uso de portas vivas com base na difusão direta e lateral, uma porta viva com base em 7-AAD, CD45+ humano e examinada quanto à expressão de FLAG ou eTag. Opcr [10 93] Os DNA genômico (gDNA) isolado das amostras de sangue foi avaliado quanto à presença de linfócitos transduzidos por qPCR bioanalítico. O DNA genômico foi isolado de 50
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482/540 μΐ de amostras de sangue com o uso no kit QIAamp DNA blood Mini (Qiagen 51106) e o DNA foi adicionalmente limpo com o uso do kit QIAamp DNA Micro Kit (56304). Um ensaio de TaqMan (Thermo Fisher) foi realizado no DNA genômico isolado com o uso de um conjunto de iniciador e sonda específico para a 5’ LTR de lentivírus para detectar células transduzidas.
Resultados [10 94] As partículas lentivirais pseudotipadas com VSV-G e que codificam CAR e um elemento linfoproliferativo foram usadas neste experimento. As partículas lentivirais F1-1-228 e F1-1-228U codificaram um MRB-CAR a ROR2 e partículas lentivirais Fl-2-219 e F1-3-219U codificaram um CAR a CD19. As partículas lentivirais F1-1-228U e F1-3-219U também exibiram UCHTlscFvFc-GPI em sua superfície. As PBMCs foram isoladas de sangue humano por centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll-Paque™. As PBMCs frescas foram transduzidas com as partículas lentivirais em bolsas de sangue padrão sem ativação anterior das células ex vivo. Após uma transdução de 4 horas, as células foram lavadas e usadas nos experimentos abaixo. Um técnico versado irá entender que todo o processo de coleta de sangue à lavagem de células pode ser realizado de um sistema fechado. Como um controle, as PBMCs foram ativadas de um dia para o outro, transduzidas com partículas lentivirais que codificam um CAR sem um elemento linfoproliferativo ou UCHTlscFvFc-GPI e expandida ex vivo por 15 dias (Fl-1-27).
[10 95] As PBMCs transduzidas foram cultivadas in vitro na ausência de citocinas. A Figura 37 mostra eficácias de transdução no Dia 6. UCHTlscFvFc-GPI aumentou a eficácia de transdução tanto de Fl-1-228 quanto de Fl-3-219. As PBMCs em repouso, quando expostas por 4 horas a F1-1-228U ou F1-3-219U, tiveram eficácias de transdução de 34% e 73%, respectivamente. A Figura 38 mostra o número total de células viáveis nessas culturas entre os dias 3 e 6. As PBMCs em repouso transduzidas com F1-1-228U ou F1-3-219U sobreviveram e até mesmo proliferaram entre o dia 3 e o dia 6 na ausência de citocinas exógenas, enquanto com as PBMCs transduzidas com Fl-1-228 ou Fl-3-219 não ocorreu o mesmo. Esses resultados demonstram que as partículas retrovirais que exibem um elemento de ativação e codificação e um elemento linfoproliferativo pode transduzir PBMCs em repouso em 4 horas e que essas PMBCs transduzidas podem proliferar e sobreviver in vitro quando cultivadas por 6 dias na ausência de citocinas exógenas.
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483/540 [10 9 6] Os camundongos imunodeficientes que portam tumores de ROR2 ou CD 19 foram dosados de modo intravenoso com 1 x 107 PBMCs que expressam um CAR a ROR2 ou CD19, respectivamente. A capacidade das PBMCs transduzidas para sobreviver e se proliferar in vivo foi examinada ao longo do tempo. As Figuras 39A a 39C mostram as cópias lentivirais por pg de DNA genômico por qPCR como uma leitura para células transduzidas. A Figura 39A mostra que as cópias lentivirais por pg de DNA genômico para Fl-1-27, que não codifica para um elemento linfoproliferativo, diminuíram de uma média de 884 no dia 7 para abaixo do limite inferior de quantização (LLOQ) no dia 21. A Figura 39B mostra que as cópias lentivirais para F1-1-228U foram abaixo da LLOQ nos dias 7 e 14, porém, aumentaram acima do LLOQ no dia 21 e aumentaram para uma média de 1.939 no dia 25. A Figura 39C mostra que as cópias lentivirais para F1-3-219U aumentaram de menos de LLOQ no dia 7 para 20.430 no dia 14 quando os camundongos foram submetidos à eutanásia. As copies lentivirais nas amostras de controle, Fl1-228 e Fl-3-219, permaneceram abaixo do LLOQ. A Figura 40 mostra o número de células transduzidas por 200 ul de sangue no momento que os camundongos foram submetidos à eutanásia (os últimos pontos no tempo são mostrados na Figura 39) como determinado por análise de FACS para a eTag ou FLAG-Tag do construto de CAR. Números significativos de células CAR+ foram detectados por 200 ul de sangue de camundongos dosados com células transduzidas com F1-1-228U (5.857) e F1-3-219U (121.324). Os linfócitos transduzidos com F1-1-228U ou F1-3-219U exterminaram os tumores que expressam seu antígeno-alvo em vivo (Figuras 41A e B). Em ambos os casos, os linfócitos reduziram o volume de tumor de uma maneira retardada. Sem se ater à teoria, porém, esse atraso é consistente com uma necessidade de que as células injetadas se expandam, o que demorou como visto por qPCR. Os pontos no tempo posteriores não podem ser estudados neste experimento, visto que os camundongos que portavam ROR2 tumores alcançam as diretrizes de eutanásia para o fardo do tumor e os camundongos que portam tumores de Raji desenvolveram uma doença de enxerto versus hospedeiro causada pelo número significativo de linfócitos transduzidos e expandidos nos camundongos. Juntos, esses dados mostram que as partículas retrovirais exibindo um elemento de ativação e codificando um elemento linfoproliferativo podem transduzir PBMCs em repouso em 4 horas e que essas PMBCs transduzidas podem se proliferar e sobreviver in vivo. Ambos os elementos linfoproliferativos testados neste experimento, MycTag 2A Jun-IL13Ra-MPL-CD40 e IL-7- IL-7Ra - IL-2Rb,
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484/540 exibiram a capacidade para promover a sobrevivência e a proliferação in vivo. Ademais, esses linfócitos transduzidos dessa maneira expressando um MRB-CAR (F1-1-228U) ou um CAR tradicional (F1-3-219U) foram capazes de reconhecer e exterminar as células de tumor in vivo.
[10 97] As modalidades, exemplos e experimentos revelados não se destinam a limitar o escopo da revelação ou a representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços têm sido feitos para assegurar precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser levados em conta. Deve ser entendido que variações nos métodos como descrito podem ser realizadas sem alterar os aspectos fundamentais que os experimentos são destinados a ilustrar. [10 98] Os versados na técnica podem conceber muitas modificações e outras modalidades dentro do escopo e espírito da presente revelação. De fato, as variações nos materiais, métodos, desenhos, experimentos, exemplos e modalidades descritas podem ser realizadas por técnicos versados sem alterar os aspectos fundamentais da presente revelação. Qualquer uma das modalidades reveladas pode ser usada em combinação com qualquer outra modalidade revelada.
[10 99] Em alguns casos, alguns conceitos foram descritos com referência a modalidades específicas. Contudo, um versado na técnica aprecia que podem ser realizadas várias modificações e alterações sem afastar-se do escopo da invenção, conforme estabelecido nas reivindicações abaixo. Consequentemente, o relatório descritivo e as figuras devem ser consideradas em um sentido ilustrativo e não restritivo, e todas essas modificações destinam-se a ser incluídas no âmbito da invenção.
Tabela 6. Códigos, nomes, receptores de citosina, motivo de ITAM e sequência de aminoácidos para as partes pl-p2, pl, p2, p3 e p4.
Código Nome Sequência de Aminoácidos
M001 eTAG IL7RA Ins PPCL (receptor de interleucina 7) MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPEINNSSGEMDPILLPPCLTISILSFFSVALLVILACVL (SEQ ID NO:292)
M002 eTAG IL7RA Ins PPCL (receptor de interleucina 7) MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQPEINNSSGEMDPILLPPCLTISILSFFSVALLVILACVL (SEQ ID NO:293)
M007 Etiqueta Myc LMP1 NC_007605_l MEQKLISEEDLEHDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSLGLALLLLLLALLFWLYIVMSDWTGGAL LVLYSFALMLIIIILIIFIFRRDLLCPLGALCILLLMITLLLIALWNLHGQALFLGIVLFIFGCLL VLGIWIYLLEMLWRLGATIWQLLAFFLAFFLDLILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAI LIWM (SEQ ID NO:294)
M008 Myc LMP1 NC_007605_l MEQKLISEEDLSSSLGLALLLLLLALLFWLYIVMSDWTGGALLVLYSFALMLIIIILIIFIFRR DLLCPLGALCILLLMITLLLIALWNLHGQALFLGIVLFIFGCLLVLGIWIYLLEMLWRLGATI WQLLAFFLAFFLDLILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWM (SEQ ID NO:295)
M009 LMP1 NC_007605_l MEHDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSLGLALLLLLLALLFWLYIVMSDWTGGALLVLYSFALM LIIIILIIFIFRRDLLCPLGALCILLLMITLLLIALWNLHGQALFLGIVLFIFGCLLVLGIWIYLLE MLWRLGATIWQLLAFFLAFFLDLILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWM (SEQ ID NO:296)
M010 LMP1 NC_007605_l MSLGLALLLLLLALLFWLYIVMSDWTGGALLVLYSFALMLIIIILIIFIFRRDLLCPLGALCIL LLMITLLLIALWNLHGQALFLGIVLFIFGCLLVLGIWIYLLEMLWRLGATIWQLLAFFLAFF LDLILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWM (SEQ ID NO:297)
M012 variante de transcrição 1 de eTAG CRLF2 NM_022148_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGAETPTPPKPKLSKCILISSLAILLMVSLLLLSLW (SEQ ID NO:298)
M013 variante de transcrição 1 de eTAG CRLF2 NM_022148_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQAETPTPPKPKLSKCILISSLAILLMVSLLLLSLW (SEQ ID NO:299)
M018 eTAG CSF2RB NM 000395 2 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGTESVLPMWVLALIEIFLTIAVLLAL (SEQ ID NO:300)
M019 eTAG CSF2RB NM 000395 2 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQTESVLPMWVLALIEIFLTIAVLLAL (SEQ ID NO:301)
M024 variante de transcrição 1 de eTAG CSF3R NM_000760_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGTPEGSELHIILGLFGLLLLLNCLCGTAWLCC (SEQ ID NO:302)
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
M025 variante de transcrição 1 de eTAG CSF3R NM_000760_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQTPEGSELHIILGLFGLLLLLNCLCGTAWLCC (SEQ ID NO:303)
M030 variante de transcrição 1 de eTAG EPOR NM_000121_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRT DLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWK KLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDK CNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGV MGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGTPSDLDPCCLTLSLILVVI LVLLTVLALLS (SEQ ID NO:304)
M031 variante de transcrição 1 de eTAG EPOR NM_000121_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQTPSDLDPCCLTLSLILVVILVLLTVLALLS (SEQ ID NO:305)
M036 variante de transcrição 1 de eTAG GHR NM-000163-4 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGTLPQMSQFTCCEDFYFPWLLCIIFGIFGLTVMLFVFLFS (SEQ ID NO:306)
M037 variante de transcrição 1 de eTAG GHR NM-000163-4 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQTLPQMSQFTCCEDFYFPWLLCIIFGIFGLTVMLFVFLFS (SEQ ID NO:307)
M042 eTAG truncado após Fn F523C IL27RA NM_004843_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGHLPDNTLRWKVLPGILCLWGLFLLGCGLSLA (SEQ ID NO:308)
M043 eTAG truncado após Fn F523C IL27RA NM_004843_3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQHLPDNTLRWKVLPGILCLWGLFLLGCGLSLA (SEQ ID NO:309)
M048 eTAG truncado após Fn S505N MPL NM-005373-2 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGETATETAWISLVTALHLVLGLNAVLGLLLL (SEQ ID NO:310)
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487/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
M049 eTAG truncado após Fn S505N MPL NM_005373_2 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQETATETAWISLVTALHLVLGLNAVLGLLLL (SEQ ID NO:311)
E006 eTag 0A JUN NM 002228 3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKV (SEQ ID NO:312)
E007 eTag 1AJUN NM 002228 3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVA (SEQ ID NO:313)
E008 eTag 2A JUN NM 002228 3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVA A (SEQ ID NO:314)
E009 eTag 3A JUN NM 002228 3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVA AA (SEQ ID NO:315)
E010 eTag 4A JUN NM 002228 3 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVA FRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKA TGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLC HPNCTYGCTGPGLEGCPTNGLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVA AAA (SEQ ID NO:316)
E011 Etiqueta Myc 0A JUN NM 002228 3 MTILGTTFGMVFSLLQVVSGEQKLISEEDLLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQ VAQLKQKV (SEQ ID NO:317)
E012 Etiqueta Myc IA JUN NM 002228 3 MTILGTTFGMVFSLLQVVSGEQKLISEEDLLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQ VAQLKQKVA (SEQ ID NO:318)
E013 Etiqueta Myc 2A MTILGTTFGMVFSLLQVVSGEQKLISEEDLLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQ
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4734/5200
488/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
JUN NM 002228 3 VAQLKQKVAA (SEQ ID NO:319)
E014 Etiqueta Myc 3 A JUN NM 002228 3 MTILGTTFGMVFSLLQVVSGEQKLISEEDLLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQ VAQLKQKVAAA (SEQ ID NO:320)
E015 Etiqueta Myc 4A JUN NM 002228 3 MTILGTTFGMVFSLLQVVSGEQKLISEEDLLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQ VAQLKQKVAAAA (SEQ ID NO:321)
T001 variante de transcrição 1 de CD2 NM_001328609_l LIIGICGGGSLLMVFVALLVFYI (SEQ ID NO:322)
T002 variante de transcrição 1 de CD3D NM_000732_4 GIIVTDVIATLLLALGVFCFA (SEQ ID NO:323)
T003 CD3E NM 000733 3 VMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWS (SEQ ID NO:324)
T004 CD3G NM 000073 2 GFLFAEIVSIFVLAVGVYFIA (SEQ ID NO:325)
T005 variante de transcrição 1 de CD3Z CD247 NM_198053_2 LCYLLDGILFIYGVILTALFL (SEQ ID NO:326)
T006 variante de transcrição 1 e 2 de CD4 NM_000616_4 MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF (SEQ ID NO:327)
T007 variante de transcrição 1 de CD8A NM-001768-6 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:328)
T008 variante de transcrição 2 de CD8B NM_172213_3 LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (SEQ ID NO:329)
T009 CD27 NM-001242-4 ILVIFSGMFLVFTLAGALFLH (SEQ ID NO:330)
T010 variante de transcrição 1 de CD28 NM-006139-3 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:331)
T011 variante de transcrição 1 e 6 de CD40 NM-001250-5 ALVVIPIIFGILFAILLVLVFI (SEQ ID NO:332)
T012 variante de transcrição 1 de CD79A NM_001783_3 IITAEGIILLFCAVVPGTLLLF (SEQ ID NO:333)
T013 variante de transcrição 3 de CD79B NM-001039933-2 GIIMIQTLLIILFIIVPIFLLL (SEQ ID NO:334)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4735/5200
489/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
T014 variante de transcrição 1 de CRLF2 NM_022148_3 FILISSLAILLMVSLLLLSLW (SEQ ID NO:335)
T015 variante de transcrição 1 de CRLF2 NM_022148_3 CILISSLAILLMVSLLLLSLW (SEQ ID NO:336)
T016 variante de transcrição 7 e 8 de CSF2RA NM-001161529.1 NLGSVYIYVLLIVGTLVCGIVLGFLF (SEQ ID NO:337)
T017 CFS2RB NM 000395 2 MWVLALIVIFLTIAVLLAL (SEQ ID NO:338)
T018 CFS2RB NM 000395 2 MWVLALIEIFLTIAVLLAL (SEQ ID NO:339)
T019 variante de transcrição 1 de CSF3R NM_000760_3 IILGLFGLLLLLTCLCGTAWLCC (SEQ ID NO:340)
T020 variante de transcrição 1 de CSF3R NM_000760_3 IILGLFGLLLLLNCLCGTAWLCC (SEQ ID NO:341)
T021 variante de transcrição 1 de EPOR NM_000121_3 LILTLSLILVVILVLLTVLALLS (SEQ ID NO: 342)
T022 variante de transcrição 1 de EPOR NM_000121_3 CCLTLSLILVVILVLLTVLALLS (SEQ ID NO:343)
T023 FCER1G NM_004106_l LCYILDAILFLYGIVLTLLYC (SEQ ID NO:344)
T024 FCGR2C NM 201563 5 IIVAVVTGIAVAAIVAAVVALIY (SEQ ID NO:345)
T025 variante de transcrição 1 de FCGRA2 NM-001136219-1 IIVAVVIATAVAAIVAAVVALIY (SEQ ID NO:346)
T026 variante de transcrição 1 de GHR NM-000163-4 FPWLLIIIFGIFGLTVMLFVFLFS (SEQ ID NO:347)
T027 variante de transcrição 1 de GHR NM-000163-4 FPWLLCIIFGIFGLTVMLFVFLFS (SEQ ID NO:348)
T028 ICOS NM_012092.3 FWLPIGCAAFVVVCILGCILI (SEQ ID NO:349)
T029 IFNAR1 NM_000629_2 IWLIVGICIALFALPFVIYAA (SEQ ID NO:350)
T030 variante de IGGIITVFLIALVLTSTIVTL (SEQ ID NO:351)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4736/5200
490/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
transcrição 1 de IFNAR2 NM_207585_2
T031 IFNGR1 NM 000416 2 SLWIPVVAALLLFLVLSLVFI (SEQ ID NO:352)
T032 variante de transcrição 1 de IFNGR2 NM_001329128_l VILISVGTFSLLSVLAGACFF (SEQ ID NO:353)
T033 IFNLRl NM_170743_3 FLVLPSLLILLLVIAAGGVIW (SEQ ID NO:354)
T034 variante de transcrição 2 de IL1R1 NM_001288706_l HMIGICVTLTVIIVCSVFIYKIF (SEQ ID NO:355)
T035 variante de transcrição 1 de IL1RAP NM-002182-3 VLLVVILIVVYHVYWLEMVLF (SEQ ID NO:356)
T036 variante de transcrição 1 de IL1RL1 NM-016232.4 IYCIIAVCSVFLMLINVLVII (SEQ ID NO:357)
T037 IL1RL2 NM_003 854.2 AYLIGGLIALVAVAVSVVYIY (SEQ ID NO:358)
T038 variante de transcrição 1 de IL2RA NM_000417_2 VAVAGCVFLLISVLLLSGL (SEQ ID NO:359)
T039 variante de transcrição 1 de IL2RB NM_000878_4 IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI (SEQ ID NO:360)
T040 IL2RG NM 000206 2 VVISVGSMGLIISLLCVYFWL (SEQ ID NO:361)
T041 variante de transcrição 1 e 2 de IL3RA NM-002183-3 TSLLIALGTLLALVCVFVIC (SEQ ID NO:362)
T042 variante de transcrição 1 de IL4R NM_000418_3 LLLGVSVSCIVILAVCLLCYVSIT (SEQ ID NO:363)
T043 variante de transcrição 1 de IL5RA NM_000564_4 FVIVIMATICFILLILSLIC (SEQ ID NO:364)
T044 variante de transcrição 1 de IL6R NM_000565_3 TFLVAGGSLAFGTLLCIAIVL (SEQ ID NO:365)
T045 variante de transcrição 1 e 3 de IL6ST AIVVPVCLAFLLTTLLGVLFCF (SEQ ID NO:366)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4737/5200
491/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
NM 002184 3
T046 IL7RA NM_002185-3 ILLTISILSFFSVALLVILACVL (SEQ ID NO:367)
T047 IL7RA Ins PPCL (receptor de interleucina 7) ILLPPCLTISILSFFSVALLVILACVL (SEQ ID NO:368)
T048 variante de transcrição 1 de IL9R NM-002186-2 GNTLVAVSIFLLLTGPTYLLF (SEQ ID NO:369)
T049 variante de transcrição 1 de IL10RA NM_001558_3 VIIFFAFVLLLSGALAYCLAL (SEQ ID NO:370)
T050 IL10RB NM_000628_4 WMVAVILMASVFMVCLALLGCF (SEQ ID NO:371)
T051 IL11RA NM-001142784-2 SLGILSFLGLVAGALALGLWL (SEQ ID NO:372)
T052 variante de transcrição 1 e 4 de IL12RB1 NM_005535_2 WLIFFASLGSFLSILLVGVLGYLGL (SEQ ID NO:373)
T053 variante de transcrição 1 e 3 de IL12RB2 NM_001559_2 WMAFVAPSICIAIIMVGIFST (SEQ ID NO:374)
T054 IL13RA1 NM_001560_2 LYITMLLIVPVIVAGAIIVLLLYL (SEQ ID NO:375)
T055 IL13RA2 NM_000640_2 FWLPFGFILILVIFVTGLLL (SEQ ID NO:376)
T056 variante de transcrição 4 de IL15RA NM_001256765_l VAISTSTVLLCGLSAVSLLACYL (SEQ ID NO:377)
T057 IL17RA NM_014339_6 VYWFITGISILLVGSVILLIV (SEQ ID NO:378)
T058 IL17RB NM-018725-3 LLLLSLLVATWVLVAGIYLMW (SEQ ID NO:379)
T059 variante de transcrição 1 de IL17RC NM-153460-3 WALVWLACLLFAAALSLILLL (SEQ ID NO:380)
T060 variante de transcrição 2 de IL17RD NM-017563-4 AVAITVPLVVISAFATLFTVM (SEQ ID NO:381)
T061 variante de transcrição 1 de IL17RE NM_153480_l LGLLILALLALLTLLGVVLAL (SEQ ID NO:382)
T062 variante de transcrição 1 de IL18R1 GMIIAVLILVAVVCLVTVCVI (SEQ ID NO:383)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4738/5200
492/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
NM 003855 3
T063 IL18RAP NM_003 853_3 GVVLLYILLGTIGTLVAVLAA (SEQ ID NO:384)
T064 variante de transcrição 1 de IL20RA NM_014432_3 IIFWYVLPISITVFLFSVMGY (SEQ ID NO:385)
T065 IL20RB NM_144717_3 VLALFAFVGFMLILVVVPLFV (SEQ ID NO:386)
T066 variante de transcrição 2 de IL21R NM_181078_2 GWNPHLLLLLLLVIVFIPAFW (SEQ ID NO:387)
T067 IL22RA1 NM_021258_3 YSFSGAFLFSMGFLVAVLCYL (SEQ ID NO:388)
T068 IL23R NM_144701_2 LLLGMIVFAVMLSILSLIGIF (SEQ ID NO:389)
T069 IL27RA NM_004843_3 VLPGILFLWGLFLLGCGLSLA (SEQ ID NO:390)
T070 IL27RA NM_004843_3 VLPGILCLWGLFLLGCGLSLA (SEQ ID NO:391)
T071 variante de transcrição 1 de IL31RA NM_139017_5 IILITSLIGGGLLILIILTVAYGL (SEQ ID NO:392)
T072 variante de transcrição 1 de LEPR NM_002303_5 AGLYVIVPVIISSSILLLGTLLI (SEQ ID NO:393)
T073 LIFR NM-001127671-1 VGLIIAILIPVAVAVIVGVVTSILC (SEQ ID NO:394)
T074 MPL NM_005373_2 ISLVTALHLVLGLSAVLGLLLL (SEQ ID NO:395)
T075 MPL NM_005373_2 ISLVTALHLVLGLNAVLGLLLL (SEQ ID NO:396)
T076 variante de transcrição 4 de OSMR NM_001323505_l LIHILLPMVFCVLLIMVMCYL (SEQ ID NO:397)
T077 variante de transcrição 1 de PRLR NM_000949_6 TTVWISVAVLSAVICLIIVWAVAL (SEQ ID NO:398)
T078 TNFRSF4 NM_003327_3 VAAILGLGLVLGLLGPLAILL (SEQ ID NO:399)
T079 variante de transcrição 1 de TNFRSF8 NM_001243_4 PVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLC (SEQ ID NO:400)
T080 TNFRSF9 NM_001561_5 IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV (SEQ ID NO:401)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4739/5200
493/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
T081 variante de transcrição 1 de TNFRSF14 NM-003 820-3 WWFLSGSLVIVIVCSTVGLII (SEQ ID NO:402)
T082 variante de transcrição 1 de TNFRSF18 NM_004195-2 LGWLTVVLLAVAACVLLLTSA (SEQ ID NO:403)
S036 variante de transcrição 1 de CD2 NM_001328609_l TKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSH RPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN (SEQ ID NO:404)
S037 variante de transcrição 1 de CD3D NM_000732_4 GHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK (SEQ ID NO:405)
S038 CD3E NM_000733_3 KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ ID NO:406)
S039 CD3G NM 000073 2 GQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN (SEQ ID NO :407)
S042 variante de transcrição 1 e 2 de CD4 NM_000616_4 CVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKTCQCPHRFQKTCSPI (SEQ ID NO:408)
S043 variante de transcrição 1 de CD8A NM-001768-6 LYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV (SEQ ID NO :409)
S044 variante de transcrição 2 de CD8B NM_172213_3 RRRRARLRFMKQPQGEGISGTFVPQCLHGYYSNTTTSQKLLNPWILKT (SEQ ID NO:410)
S045 variante de transcrição 3 de CD8B NM_172101_3 RRRRARLRFMKQLRLHPLEKCSRMDY (SEQ ID NO:411)
S046 variante de transcrição 5 de CD8B NM-004931-4 RRRRARLRFMKQFYK (SEQ ID NO:412)
S047 CD27 NM-001242-4 QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO:413)
S048 variante de transcrição 1 de Delta Lek CD28 mutante NM-006139-3 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQAYAAARDFAAYRS (SEQ ID NO:414)
S049 variante de transcrição 1 de CD28 NM-006139-3 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:415)
S050 variante de transcrição 1 e 6 de CD40 KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQER Q (SEQ ID NO :416)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4740/5200
494/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
NM-001250-5
S051 variante de transcrição 5 de CD40 NM_001322421.1 SESSEKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISV QERQ (SEQ ID NO:417)
S052 variante de transcrição 1 de CD79A NM_001783_3 RKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLE KP (SEQ ID NO:418)
S053 variante de transcrição 3 de CD79B NM-001039933-2 LDKDDSKAGMEEDHTYEGLDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE (SEQ ID NO:419)
S054 variante de transcrição 1 de CRLF2 NM-022148-3 KLWRVKKFLIPSVPDPKSIFPGLFEIHQGNFQEWITDTQNVAHLHKMAGAEQESGPEEPLV VQLAKTEAESPRMLDPQTEEKEASGGSLQLPHQPLQGGDVVTIGGFTFVMNDRSYVAL (SEQ ID NO:420)
S057 CFS2RB NM_000395_2 RFCGIYGYRLRRKWEEKIPNPSKSHLFQNGSAELWPPGSMSAFTSGSPPHQGPWGSRFPEL EGVFPVGFGDSEVSPLTIEDPKHVCDPPSGPDTTPAASDLPTEQPPSPQPGPPAASHTPEKQA SSFDFNGPYLGPPHSRSLPDILGQPEPPQEGGSQKSPPPGSLEYLCLPAGGQVQLVPLAQAM GPGQAVEVERRPSQGAAGSPSLESGGGPAPPALGPRVGGQDQKDSPVAIPMSSGDTEDPG VASGYVSSADLVFTPNSGASSVSLVPSLGLPSDQTPSLCPGLASGPPGAPGPVKSGFEGYVE LPPIEGRSPRSPRNNPVPPEAKSPVLNPGERPADVSPTSPQPEGLLVLQQVGDYCFLPGLGP GPLSLRSKPSSPGPGPEIKNLDQAFQVKKPPGQAVPQVPVIQLFKALKQQDYLSLPPWEVN KPGEVC (SEQ ID NO:421)
S058 variante de transcrição 7 e 8 de CSF2RA NM-001161529-1 KRFLRIQRLFPPVPQIKDKLNDNHEVEDEIIWEEFTPEEGKGYREEVLTVKEIT (SEQ ID NO:422)
S059 variante de transcrição 9 de CSF2RA NM-001161531-1 KRFLRIQRLFPPVPQIKDKLNDNHEVEDEMGPQRHHRCGWNLYPTPGPSPGSGSSPRLGSE SSL (SEQ ID NO:423)
S062 variante de transcrição 1 de CSF3R NM_000760_3 SPNRKNPLWPSVPDPAHSSLGSWVPTIMEEDAFQLPGLGTPPITKLTVLEEDEKKPVPWES HNSSETCGLPTLVQTYVLQGDPRAVSTQPQSQSGTSDQVLYGQLLGSPTSPGPGHYLRCDS TQPLLAGLTPSPKSYENLWFQASPLGTLVTPAPSQEDDCVFGPLLNFPLLQGIRVHGMEAL GSF (SEQ ID NO:424)
S063 variante de transcrição 3 de CSF3R NM_156039_3 SPNRKNPLWPSVPDPAHSSLGSWVPTIMEELPGPRQGQWLGQTSEMSRALTPHPCVQDAF QLPGLGTPPITKLTVLEEDEKKPVPWESHNSSETCGLPTLVQTYVLQGDPRAVSTQPQSQS GTSDQVLYGQLLGSPTSPGPGHYLRCDSTQPLLAGLTPSPKSYENLWFQASPLGTLVTPAP SQEDDCVFGPLLNFPLLQGIRVHGMEALGSF (SEQ ID NO:425)
S064 variante de transcrição 4 de CSF3R NM_172313_2 SPNRKNPLWPSVPDPAHSSLGSWVPTIMEEDAFQLPGLGTPPITKLTVLEEDEKKPVPWES HNSSETCGLPTLVQTYVLQGDPRAVSTQPQSQSGTSDQAGPPRRSAYFKDQIMLHPAPPNG LLCLFPITSVL (SEQ ID NO:426)
S069 variante de transcrição 1 de EPOR NM_000121_3 HRRALKQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLYQNDGCLWWSPCTPFTEDPPASLEVL SERCWGTMQAVEPGTDDEGPLLEPVGSEHAQDTYLVLDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDI VAMDEGSEASSCSSALASKPSPEGASAASFEYTILDPSSQLLRPWTLCPELPPTPPHLKYLYL VVSDSGISTDYSSGDSQGAQGGLSDGPYSNPYENSLIPAAEPLPPSYVACS (SEQ ID NO:427)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4741/5200
495/540
Código Nome Sequência de Aminoácidos
S072 variante de transcrição 1 de EPOR NM_000121_3 HRRALKQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLYQNDGCLWWSPCTPFTEDPPASLEVL SERCWGTMQAVEPGTDDEGPLLEPVGSEHAQDTYLVLDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDI VAMDEGSEASSCSSALASKPSPEGASAASFEYTILDPSSQLLRPWTLCPELPPTPPHLKFLFL WSDSGISTDYSSGDSQGAQGGLSDGPYSNPYENSLIPAAEPLPPSYVACS (SEQ ID NO:428)
S074 FCER1G NM_004106_l RLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (SEQ ID NO:429)
S075 FCGR2C NM 201563 5 CRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQPEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDD KNIYLTLPPNDHVNSNN (SEQ ID NO:430)
S076 variante de transcrição 1 de FCGRA2 NM-001136219.1 CRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQLEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDD KNIYLTLPPNDHVNSNN (SEQ ID NO:431)
S077 variante de transcrição 1 de GHR NM-000163-4 KQQRIKMLILPPVPVPKIKGIDPDLLKEGKLEEVNTILAIHDSYKPEFHSDDSWVEFIELDIDE PDEKTEESDTDRLLSSDHEKSHSNLGVKDGDSGRTSCCEPDILETDFNANDIHEGTSEVAQP QRLKGEADLLCLDQKNQNNSPYHDACPATQQPSVIQAEKNKPQPLPTEGAESTHQAAHIQ LSNPSSLSNIDFYAQVSDITPAGSVVLSPGQKNKAGMSQCDMHPEMVSLCQENFLMDNAY FCEADAKKCIPVAPHIKVESHIQPSLNQEDIYITTESLTTAAGRPGTGEHVPGSEMPVPDYTS IHIVQSPQGLILNATALPLPDKEFLSSCGYVSTDQLNKIMP (SEQ ID NO:432)
S080 ICOS NM_012092.3 CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO:433)
S081 IFNAR1 NM_000629_2 KVFLRCINYVFFPSLKPSSSIDEYFSEQPLKNLLLSTSEEQIEKCFIIENISTIATVEETNQTDED HKKYSSQTSQDSGNYSNEDESESKTSEELQQDFV (SEQ ID NO:434)
S082 variante de transcrição 1 de IFNAR2 NM_207585_2 KWIGYICLRNSLPKVLNFHNFLAWPFPNLPPLEAMDMVEVIYINRKKKVWDYNYDDESDS DTEAAPRTSGGGYTMHGLTVRPLGQASATSTESQLIDPESEEEPDLPEVDVELPTMPKDSP QQLELLSGPCERRKSPLQDPFPEEDYSSTEGSGGRITFNVDLNSVFLRVLDDEDSDDLEAPL MLSSHLEEMVDPEDPDNVQSNHLLASGEGTQPTFPSPSSEGLWSEDAPSDQSDTSESDVDL GDGYIMR (SEQ ID NO:435)
S083 variante de transcrição 2 de IFNAR2 NM_000874_4 KWIGYICLRNSLPKVLRQGLAKGWNAVAIHRCSHNALQSETPELKQSSCLSFPSSWDYKR ASLCPSD (SEQ ID NO:436)
S084 IFNGRl NM 000416 2 CFYIKKINPLKEKSIILPKSLISVVRSATLETKPESKYVSLITSYQPFSLEKEWCEEPLSPATV PGMHTEDNPGKVEHTEELSSITEVVTTEENIPDWPGSHLTPIERESSSPLSSNQSEPGSIALN SYHSRNCSESDHSRNGFDTDSSCLESHSSLSDSEFPPNNKGEIKTEGQELITVIKAPTSFGYD KPHVLVDLLVDDSGKESLIGYRPTEDSKEFS (SEQ ID NO:437)
S085 variante de transcrição 1 de IFNGR2 NM-001329128-1 LVLKYRGLIKYWFHTPPSIPLQIEEYLKDPTQPILEALDKDSSPKDDVWDSVSIISFPEKEQE DVLQTL (SEQ ID NO:438)
S086 IFNLRl NM_170743_3 KTLMGNPWFQRAKMPRALDFSGHTHPVATFQPSRPESVNDLFLCPQKELTRGVRPTPRVR APATQQTRWKKDLAEDEEEEDEEDTEDGVSFQPYIEPPSFLGQEHQAPGHSEAGGVDSGR PRAPLVPSEGSSAWDSSDRSWASTVDSSWDRAGSSGYLAEKGPGQGPGGDGHQESLPPPE FSKDSGFLEELPEDNLSSWATWGTLPPEPNLVPGGPPVSLQTLTFCWESSPEEEEEARESEIE DSDAGSWGAESTQRTEDRGRTLGHYMAR (SEQ ID NO:439)
S087 variante de transcrição 2 de IFNLRl KTLMGNPWFQRAKMPRALELTRGVRPTPRVRAPATQQTRWKKDLAEDEEEEDEEDTEDG VSFQPYIEPPSFLGQEHQAPGHSEAGGVDSGRPRAPLVPSEGSSAWDSSDRSWASTVDSSW
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
NM_173064_2 DRAGSSGYLAEKGPGQGPGGDGHQESLPPPEFSKDSGFLEELPEDNLSSWATWGTLPPEPN LVPGGPPVSLQTLTFCWESSPEEEEEARESEIEDSDAGSWGAESTQRTEDRGRTLGHYMAR (SEQ ID NO:440)
S098 variante de transcrição 2 de IL1R1 NM_001288706_l KIDIVLWYRDSCYDFLPIKVLPEVLEKQCGYKLFIYGRDDYVGEDIVEVINENVKKSRRLIII LVRETSGFSWLGGSSEEQIAMYNALVQDGIKVVLLELEKIQDYEKMPESIKFIKQKHGAIR WSGDFTQGPQSAKTRFWKNVRYHMPVQRRSPSSKHQLLSPATKEKLQREAHVPLG (SEQ ID NO:441)
S099 variante de transcrição 3 de IL1R1 NM_001320978_l KIDIVLWYRDSCYDFLPIKASDGKTYDAYILYPKTVGEGSTSDCDIFVFKVLPEVLEKQCGY KLFIYGRDDYVGEDIVEVINENVKKSRRLIIILVRETSGFSWLGGSSEEQIAMYNALVQDGI KVVLLELEKIQDYEKMPESIKFIKQKHGAIRWSGDFTQGPQSAKTRFWKNVRYHMPVQRR SPSSKHQLLSPATKEKLQREAHVPLG (SEQ ID NO:442)
S100 variante de transcrição 1 de IL1RAP NM-002182-3 YRAHFGTDETILDGKEYDIYVSYARNAEEEEFVLLTLRGVLENEFGYKLCIFDRDSLPGGIV TDETLSFIQKSRRLLVVLSPNYVLQGTQALLELKAGLENMASRGNINVILVQYKAVKETKV KELKRAKTVLTVIKWKGEKSKYPQGRFWKQLQVAMPVKKSPRRSSSDEQGLSYSSLKNV (SEQ ID NO:443)
S101 variante de transcrição 6 de IL1RAP NM-001167931-1 YRAHFGTDETILDGKEYDIYVSYARNAEEEEFVLLTLRGVLENEFGYKLCIFDRDSLPGGN TVEAVFDFIQRSRRMIVVLSPDYVTEKSISMLEFKLGVMCQNSIATKLIVVEYRPLEHPHPGI LQLKESVSFVSWKGEKSKHSGSKFWKALRLALPLRSLSASSGWNESCSSQSDISLDHVQRR RSRLKEPPELQSSERAAGSPPAPGTMSKHRGKSSATCRCCVTYCEGENHLRNKSRAEIHNQ PQWETHLCKPVPQESETQWIQNGTRLEPPAPQISALALHHFTDLSNNNDFYIL (SEQ ID NO:444)
S102 variante de transcrição 1 de IL1RL1 NM-016232.4 LKMFWIEATLLWRDIAKPYKTRNDGKLYDAYVVYPRNYKSSTDGASRVEHFVHQILPDV LENKCGYTLCIYGRDMLPGEDVVTAVETNIRKSRRHIFILTPQITHNKEFAYEQEVALHCAL IQNDAKVILIEMEALSELDMLQAEALQDSLQHLMKVQGTIKWREDHIANKRSLNSKFWKH VRYQMPVPSKIPRKASSLTPLAAQKQ (SEQ ID NO:445)
S103 IL1RL2 NM_003 854.2 NIFKIDIVLWYRSAFHSTETIVDGKLYDAYVLYPKPHKESQRHAVDALVLNILPEVLERQC GYKLFIFGRDEFPGQAVANVIDENVKLCRRLIVIVVPESLGFGLLKNLSEEQIAVYSALIQD GMKVILIELEKIEDYTVMPESIQYIKQKHGAIRWHGDFTEQSQCMKTKFWKTVRYHMPPR RCRPFPPVQLLQHTPCYRTAGPELGSRRKKCTLTTG (SEQ ID NO :446)
S104 variante de transcrição 1 de IL2RA NM_000417_2 TWQRRQRKSRRTI (SEQ ID NO:447)
S105 variante de transcrição 1 de IL2RB NM_000878_4 NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEV LERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSE EDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAG EERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFP WSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV (SEQ ID NO:448)
S106 IL2RG NM 000206 2 ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGE GPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET (SEQ ID NO:449)
S109 variante de transcrição 1 e 2 de IL3RA NM-002183-3 RRYLVMQRLFPRIPHMKDPIGDSFQNDKLVVWEAGKAGLEECLVTEVQVVQKT (SEQ ID NO:450)
S110 variante de KIKKEWWDQIPNPARSRLVAIIIQDAQGSQWEKRSRGQEPAKCPHWKNCLTKLLPCFLEH
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
transcrição 1 de IL4R NM 000418 3 NMKRDEDPHKAAKEMPFQGSGKSAWCPVEISKTVLWPESISWRCVELFEAPVECEEEEE VEEEKGSFCASPESSRDDFQEGREGIVARLTESLFLDLLGEENGGFCQQDMGESCLLPPSGS TSAHMPWDEFPSAGPKEAPPWGKEQPLHLEPSPPASPTQSPDNLTCTETPLVIAGNPAYRSF SNSLSQSPCPRELGPDPLLARHLEEVEPEMPCVPQLSEPTTVPQPEPETWEQILRRNVLQHG AAAAPVSAPTSGYQEFVHAVEQGGTQASAVVGLGPPGEAGYKAFSSLLASSAVSPEKCGF GASSGEEGYKPFQDLIPGCPGDPAPVPVPLFTFGLDREPPRSPQSSHLPSSSPEHLGLEPGEK VEDMPKPPLPQEQATDPLVDSLGSGIVYSALTCHLCGHLKQCHGQEDGGQTPVMASPCCG CCCGDRSSPPTTPLRAPDPSPGGVPLEASLCPASLAPSGISEKSKSSSSFHPAPGNAQSSSQTP KIVNFVSVGPTYMRVS (SEQ ID NO:451)
S113 variante de transcrição 1 de IL4R NM_000418_3 KIKKEWWDQIPNPARSRLVAIIIQDAQGSQWEKRSRGQEPAKCPHWKNCLTKLLPCFLEH NMKRDEDPHKAAKEMPFQGSGKSAWCPVEISKTVLWPESISWRCVELFEAPVECEEEEE VEEEKGSFCASPESSRDDFQEGREGIVARLTESLFLDLLGEENGGFCQQDMGESCLLPPSGS TSAHMPWDEFPSAGPKEAPPWGKEQPLHLEPSPPASPTQSPDNLTCTETPLVIAGNPAYRSF SNSLSQSPCPRELGPDPLLARHLEEVEPEMPCVPQLSEPTTVPQPEPETWEQILRRNVLQHG AAAAPVSAPTSGYQEFVHAVEQGGTQASAVVGLGPPGEAGYKAFSSLLASSAVSPEKCGF GASSGEEGYKPFQDLIPGCPGDPAPVPVPLFTFGLDREPPRSPQSSHLPSSSPEHLGLEPGEK VEDMPKPPLPQEQATDPLVDSLGSGIVFSALTCHLCGHLKQCHGQEDGGQTPVMASPCCG CCCGDRSSPPTTPLRAPDPSPGGVPLEASLCPASLAPSGISEKSKSSSSFHPAPGNAQSSSQTP KIVNFVSVGPTYMRVS (SEQ ID NO:452)
S115 variante de transcrição 1 de IL5RA NM_000564_4 KICHLWIKLFPPIPAPKSNIKDLFVTTNYEKAGSSETEIEVICYIEKPGVETLEDSVF (SEQ ID NO:453)
S116 variante de transcrição 1 de IL6R NM_000565_3 RFKKTWKLRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRP DARDPRSPYDISNTDYFFPR (SEQ ID NO:454)
S117 variante de transcrição 1 e 3 de IL6ST NM-002184-3 NKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDGNFTDVSWEIEANDK KPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTVVHS GYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQHESSP DISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAADAFGPGTEGQVER FETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ (SEQ ID NO:455)
S120 Isoforma 1 de IL7RA NM-002185.4 WKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFL QDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRS LDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAY VTMSSFYQNQ (SEQ ID NO:456)
S121 Isoform 3 de IL7RA (deleção de terminação C) (receptor de interleucina 7) WKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKVSVFGA (SEQ ID NO:457)
S126 variante de transcrição 1 de IL9R NM-002186-2 KLSPRVKRIFYQNVPSPAMFFQPLYSVHNGNFQTWMGAHGAGVLLSQDCAGTPQGALEP CVQEATALLTCGPARPWKSVALEEEQEGPGTRLPGNLSSEDVLPAGCTEWRVQTLAYLPQ EDWAPTSLTRPAPPDSEGSRSSSSSSSSNNNNYCALGCYGGWHLSALPGNTQSSGPIPALAC GLSCDHQGLETQQGVAWVLAGHCQRPGLHEDLQGMLLPSVLSKARSWTF (SEQ ID NO:458)
S129 variante de transcrição 1 de QLYVRRRKKLPSVLLFKKPSPFIFISQRPSPETQDTIHPLDEEAFLKVSPELKNLDLHGSTDS
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
IL10RA NM 001558 3 GFGSTKPSLQTEEPQFLLPDPHPQADRTLGNREPPVLGDSCSSGSSNSTDSGICLQEPSLSPS TGPTWEQQVGSNSRGQDDSGIDLVQNSEGRAGDTQGGSALGHHSPPEPEVPGEEDPAAVA FQGYLRQTRCAEEKATKTGCLEEESPLTDGLGPKFGRCLVDEAGLHPPALAKGYLKQDPL EMTLASSGAPTGQWNQPTEEWSLLALSSCSDLGISDWSFAHDLAPLGCVAAPGGLLGSFN SDLVTLPLISSLQSSE (SEQ ID NO:459)
S130 IL10RB NM 000628 4 ALLWCVYKKTKYAFSPRNSLPQHLKEFLGHPHHNTLLFFSFPLSDENDVFDKLSVIAEDSE SGKQNPGDSCSLGTPPGQGPQS (SEQ ID NO:460)
S135 IL11RA NM001142784-2 RLRRGGKDGSPKPGFLASVIPVDRRPGAPNL (SEQ ID NO:461)
S136 variante de transcrição 1 e 4 de IL12RB1 NM_005535_2 NRAARHLCPPLPTPCASSAIEFPGGKETWQWINPVDFQEEASLQEALVVEMSWDKGERTE PLEKTELPEGAPELALDTELSLEDGDRCKAKM (SEQ ID NO :462)
S137 variante de transcrição 3 de IL12RB1 NM_001290023_l NRAARHLCPPLPTPCASSAIEFPGGKETWQWINPVDFQEEASLQEALVVEMSWDKGERTE PLEKTELPEGAPELALDTELSLEDGDRCDR (SEQ ID NO:463)
S138 variante de transcrição 1 e 3 de IL12RB2 NM_001559_2 HYFQQKVFVLLAALRPQWCSREIPDPANSTCAKKYPIAEEKTQLPLDRLLIDWPTPEDPEPL VISEVLHQVTPVFRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDL YKVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQHIS LSVFPSSSLHPLTFSCGDKLTLDQLKMRCDSLML (SEQ ID NO:464)
S141 IL13RA1 NM_001560_2 KRLKIIIFPPIPDPGKIFKEMFGDQNDDTLHWKKYDIYEKQTKEETDSVVLIENLKKASQ (SEQ ID NO:465)
S142 IL13RA2 NM_000640_2 RKPNTYPKMIPEFFCDT (SEQ ID NO:466)
S143 variante de transcrição 4 de IL15RA NM_001256765_l KSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL (SEQ ID NO:467)
S144 IL17RA NM_014339_6 CMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQF LLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGR GAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAP RYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVR CPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEE GGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGE ACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQ AQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKP ALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGWDTMGSESEGPSA (SEQ ID NO:468)
S145 IL17RB NM-018725-3 RHERIKKTSFSTTTLLPPIKVLVVYPSEICFHHTICYFTEFLQNHCRSEVILEKWQKKKIAEM GPVQWLATQKKAADKVVFLLSNDVNSVCDGTCGKSEGSPSENSQDLFPLAFNLFCSDLRS QIHLHKYVVVYFREIDTKDDYNALSVCPKYHLMKDATAFCAELLHVKQQVSAGKRSQAC HDGCCSL (SEQ ID NO:469)
S146 variante de transcrição 1 de IL17RC NM_153460_3 KKDHAKGWLRLLKQDVRSGAAARGRAALLLYSADDSGFERLVGALASALCQLPLRVAV DLWSRRELSAQGPVAWFHAQRRQTLQEGGVVVLLFSPGAVALCSEWLQDGVSGPGAHGP HDAFRASLSCVLPDFLQGRAPGSYVGACFDRLLHPDAVPALFRTVPVFTLPSQLPDFLGAL QQPRAPRSGRLQERAEQVSRALQPALDSYFHPPGTPAPGRGVGPGAGPGAGDGT (SEQ ID NO:470)
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4745/5200
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
S147 variante de transcrição 4 de IL17RC NM_001203263_l KKDHAKAAARGRAALLLYSADDSGFERLVGALASALCQLPLRVAVDLWSRRELSAQGPV AWFHAQRRQTLQEGGVVVLLFSPGAVALCSEWLQDGVSGPGAHGPHDAFRASLSCVLPD FLQGRAPGSYVGACFDRLLHPDAVPALFRTVPVFTLPSQLPDFLGALQQPRAPRSGRLQER AEQVSRALQPALDSYFHPPGTPAPGRGVGPGAGPGAGDGT (SEQ ID NO:471)
S148 variante de transcrição 2 de IL17RD NM_017563_4 CRKKQQENIYSHLDEESSESSTYTAALPRERLRPRPKVFLCYSSKDGQNHMNVVQCFAYFL QDFCGCEVALDLWEDFSLCREGQREWVIQKIHESQFIIVVCSKGMKYFVDKKNYKHKGG GRGSGKGELFLVAVSAIAEKLRQAKQSSSAALSKFIAVYFDYSCEGDVPGILDLSTKYRLM DNLPQLCSHLHSRDHGLQEPGQHTRQGSRRNYFRSKSGRSLYVAICNMHQFIDEEPDWFE KQFVPFHPPPLRYREPVLEKFDSGLVLNDVMCKPGPESDFCLKVEAAVLGATGPADSQHE SQHGGLDQDGEARPALDGSAALQPLLHTVKAGSPSDMPRDSGIYDSSVPSSELSLPLMEGL STDQTETSSLTESVSSSSGLGEEEPPALPSKLLSSGSCKADLGCRSYTDELHAVAPL (SEQ ID NO:472)
S149 variante de transcrição 1 de IL17RE NM_153480_l TCRRPQSGPGPARPVLLLHAADSEAQRRLVGALAELLRAALGGGRDVIVDLWEGRHVAR VGPLPWLWAARTRVAREQGTVLLLWSGADLRPVSGPDPRAAPLLALLHAAPRPLLLLAYF SRLCAKGDIPPPLRALPRYRLLRDLPRLLRALDARPFAEATSWGRLGARQRRQSRLELCSR LEREAARLADLG (SEQ ID NO:473)
S154 variante de transcrição 1 de IL18R1 NM-003 855_3 YRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGY KLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILI EFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEV LPVLSES (SEQ ID NO:474)
S155 IL18RAP NM-003 853_3 SALLYRHWIEIVLLYRTYQSKDQTLGDKKDFDAFVSYAKWSSFPSEATSSLSEEHLALSLFP DVLENKYGYSLCLLERDVAPGGVYAEDIVSIIKRSRRGIFILSPNYVNGPSIFELQAAVNLAL DDQTLKLILIKFCYFQEPESLPHLVKKALRVLPTVTWRGLKSVPPNSRFWAKMRYHMPVK NSQGFTWNQLRITSRIFQWKGLSRTETTGRSSQPKEW (SEQ ID NO:475)
S156 variante de transcrição 1 de IL20RA NM-014432-3 SIYRYIHVGKEKHPANLILIYGNEFDKRFFVPAEKIVINFITLNISDDSKISHQDMSLLGKSSD VSSLNDPQPSGNLRPPQEEEEVKHLGYASHLMEIFCDSEENTEGTSLTQQESLSRTIPPDKT VIEYEYDVRTTDICAGPEEQELSLQEEVSTQGTLLESQAALAVLGPQTLQYSYTPQLQDLD PLAQEHTDSEEGPEEEPSTTLVDWDPQTGRLCIPSLSSFDQDSEGCEPSEGDGLGEEGLLSR LYEEPAPDRPPGENETYLMQFMEEWGLYVQMEN (SEQ ID NO :476)
S157 IL20RB NM_144717_3 WKMGRLLQYSCCPVVVLPDTLKITNSPQKLISCRREEVDACATAVMSPEELLRAWIS (SEQ ID NO:477)
S158 variante de transcrição 2 de IL21R NM_181078_2 SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPST LEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLV SIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGS PGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFV GSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS (SEQ ID NO:478)
S161 IL22RA1 NM_021258_3 SYRYVTKPPAPPNSLNVQRVLTFQPLRFIQEHVLIPVFDLSGPSSLAQPVQYSQIRVSGPREP AGAPQRHSLSEITYLGQPDISILQPSNVPPPQILSPLSYAPNAAPEVGPPSYAPQVTPEAQFPF YAPQAISKVQPSSYAPQATPDSWPPSYGVCMEGSGKDSPTGTLSSPKHLRPKGQLQKEPPA GSCMLGGLSLQEVTSLAMEESQEAKSLHQPLGICTDRTSDPNVLHSGEEGTPQYLKGQLPL LSSVQIEGHPMSLPLQPPSRPCSPSDQGPSPWGLLESLVCPKDEAKSPAPETSDLEQPTELDS LFRGLALTVQWES (SEQ ID NO:479)
S165 IL23R NM-144701-2 NRSFRTGIKRRILLLIPKWLYEDIPNMKNSNVVKMLQENSELMNNNSSEQVLYVDPMITEI KEIFIPEHKPTDYKKENTGPLETRDYPQNSLFDNTTVVYIPDLNTGYKPQISNFLPEGSHLSN
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4746/5200
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
NNEITSLTLKPPVDSLDSGNNPRLQKHPNFAFSVSSVNSLSNTIFLGELSLILNQGECSSPDIQ NSVEEETTMLLENDSPSETIPEQTLLPDEFVSCLGIVNEELPSINTYFPQNILESHFNRISLLEK (SEQ ID NO:480)
S168 IL27RA NM_004843_3 TSGRCYHLRHKVLPRWVWEKVPDPANSSSGQPHMEQVPEAQPLGDLPILEVEEMEPPPVM ESSQPAQATAPLDSGYEKHFLPTPEELGLLGPPRPQVLA (SEQ ID NO:481)
S169 IL27RA NM_004843_3 TSWVWEKVPDPANSSSGQPHMEQVPEAQPLGDLPILEVEEMEPPPVMESSQPAQATAPLD SGYEKHFLPTPEELGLLGPPRPQVLA (SEQ ID NO:482)
S170 variante de transcrição 1 de IL31RA NM_139017_5 KKPNKLTHLCWPTVPNPAESSIATWHGDDFKDKLNLKESDDSVNTEDRILKPCSTPSDKLV IDKLVVNFGNVLQEIFTDEARTGQENNLGGEKNGYVTCPFRPDCPLGKSFEELPVSPEIPPR KSQYLRSRMPEGTRPEAKEQLLFSGQSLVPDHLCEEGAPNPYLKNSVTAREFLVSEKLPEH TKGEV (SEQ ID NO:483)
S171 variante de transcrição 4 de IL31RA NM-001242638_1 KKPNKLTHLCWPTVPNPAESSIATWHGDDFKDKLNLKESDDSVNTEDRILKPCSTPSDKLV IDKLVVNFGNVLQEIFTDEARTGQENNLGGEKNGTRILSSCPTSI (SEQ ID NO:484)
S174 variante de transcrição 1 de LEPR NM_002303_5 SHQRMKKLFWEDVPNPKNCSWAQGLNFQKPETFEHLFIKHTASVTCGPLLLEPETISEDISV DTSWKNKDEMMPTTVVSLLSTTDLEKGSVCISDQFNSVNFSEAEGTEVTYEDESQRQPFV KYATLISNSKPSETGEEQGLINSSVTKCFSSKNSPLKDSFSNSSWEIEAQAFFILSDQHPNIISP HLTFSEGLDELLKLEGNFPEENNDKKSIYYLGVTSIKKRESGVLLTDKSRVSCPFPAPCLFT DIRVLQDSCSHFVENNINLGTSSKKTFASYMPQFQTCSTQTHKIMENKMCDLTV (SEQ ID NO:485)
S175 variante de transcrição 2 de LEPR NM_001003680_3 SHQRMKKLFWEDVPNPKNCSWAQGLNFQKMLEGSMFVKSHHHSLISSTQGHKHCGRPQ GPLHRKTRDLCSLVYLLTLPPLLSYDPAKSPSVRNTQE (SEQ ID NO :486)
S176 variante de transcrição 3 de LEPR NM_001003679_3 SHQRMKKLFWEDVPNPKNCSWAQGLNFQKRTDIL (SEQ ID NO:487)
S177 variante de transcrição 5 de LEPR NM-001198688-1 SHQRMKKLFWEDVPNPKNCSWAQGLNFQKKMPGTKELLGGGWLT (SEQ ID NO:488)
S180 LIFR NM-001127671-1 YRKREWIKETFYPDIPNPENCKALQFQKSVCEGSSALKTLEMNPCTPNNVEVLETRSAFPKI EDTEIISPVAERPEDRSDAEPENHVVVSYCPPIIEEEIPNPAADEAGGTAQVIYIDVQSMYQP QAKPEEEQENDPVGGAGYKPQMHLPINSTVEDIAAEEDLDKTAGYRPQANVNTWNLVSP DSPRSIDSNSEIVSFGSPCSINSRQFLIPPKDEDSPKSNGGGWSFTNFFQNKPND (SEQ ID NO:489)
S183 LMP1 NC_007605_l YYHGQRHSDEHHHDDSLPHPQQATDDSGHESDSNSNEGRHHLLVSGAGDGPPLCSQNLG APGGGPDNGPQDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPHDPLPQDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGP HDPLPHSPSDSAGNDGGPPQLTEEVENKGGDQGPPLMTDGGGGHSHDSGHGGGDPHLPTL LLGSSGSGGDDDDPHGPVQLSYYD (SEQ ID NO:490)
S186 MPL NM_005373_2 RWQFPAHYRRLRHALWPSLPDLHRVLGQYLRDTAALSPPKATVSDTCEEVEPSLLEILPKS SERTPLPLCSSQAQMDYRRLQPSCLGTMPLSVCPPMAESGSCCTTHIANHSYLPLSYWQQP (SEQ ID NO:491)
S189 variante de transcrição 1 de MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4747/5200
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
MYD88 NM-001172567-1 EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQ QQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDIQFVQEMIRQL EQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRLARRPRGGCRRMVVVVSDDYLQSKECD FQTKFALSLSPGAHQKRLIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTRLAKALSLP (SEQ ID NO:492)
S190 variante de transcrição 2 de MYD88 NM_002468_4 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQ QQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDIQFVQEMIRQL EQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRCRRMVVVVSDDYLQSKECDFQTKFALS LSPGAHQKRLIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTRLAKALSLP (SEQ ID NO:493)
S191 variante de transcrição 3 de MYD88 NM-001172568-1 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIGHMPERFDAFI CYCPSDIQFVQEMIRQLEQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRCRRMVVVVSDD YLQSKECDFQTKFALSLSPGAHQKRLIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTR LAKALSLP (SEQ ID NO:494)
S192 variante de transcrição 4 de MYD88 NM-001172569-1 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQ QQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGAAGWWWLSLMITCRARNVTSRPNL HSASLQVPIRSD (SEQ ID NO:495)
S193 variante de transcrição 5 de MYD88 NM-001172566-1 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIGAAGWWWLSL MITCRARNVTSRPNLHSASLQVPIRSD (SEQ ID NO:496)
S194 variante de transcrição 1 de MYD88 NM-001172567-1 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQ QQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDI (SEQ ID NO:497)
S195 variante de transcrição 3 de MYD88 NM-001172568-1 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIGHMPERFDAFI CYCPSDI (SEQ ID NO:498)
S196 variante de transcrição 1 de MYD88 NM-001172567-1 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQ QQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDIQFVQEMIRQL EQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRLARRPRGGCRRMVVVVSDDYLQSKECD FQTKFALSLSPGAHQKRPIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTRLAKALSLP (SEQ ID NO:499)
S197 variante de transcrição 2 de MYD88 NM_002468_4 MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQ QQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDIQFVQEMIRQL EQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRCRRMVVVVSDDYLQSKECDFQTKFALS LSPGAHQKRPIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTRLAKALSLP (SEQ ID NO:500)
S198 variante de transcrição 3 de MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYL EIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIGHMPERFDAFI
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4748/5200
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Código Nome Sequência de Aminoácidos
MYD88 NM-001172568 1 CYCPSDIQFVQEMIRQLEQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRCRRMVVVVSDD YLQSKECDFQTKFALSLSPGAHQKRPIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTR LAKALSLP (SEQ ID NO:501)
S199 variante de transcrição 4 de OSMR NM_001323505_l KSQWIKETCYPDIPDPYKSSILSLIKFKENPHLIIMNVSDCIPDAIEVVSKPEGTKIQFLGTRKS LTETELTKPNYLYLLPTEKNHSGPGPCICFENLTYNQAASDSGSCGHVPVSPKAPSMLGLM TSPENVLKALEKNYMNSLGEIPAGETSLNYVSQLASPMFGDKDSLPTNPVEAPHCSEYKM QMAVSLRLALPPPTENSSLSSITLLDPGEHYC (SEQ ID NO:502)
S202 variante de transcrição 1 de PRLR NM_000949_6 KGYSMVTCIFPPVPGPKIKGFDAHLLEKGKSEELLSALGCQDFPPTSDYEDLLVEYLEVDDS EDQHLMSVHSKEHPSQGMKPTYLDPDTDSGRGSCDSPSLLSEKCEEPQANPSTFYDPEVIE KPENPETTHTWDPQCISMEGKIPYFHAGGSKCSTWPLPQPSQHNPRSSYHNITDVCELAVG PAGAPATLLNEAGKDALKSSQTIKSREEGKATQQREVESFHSETDQDTPWLLPQEKTPFGS AKPLDYVEIHKVNKDGALSLLPKQRENSGKPKKPGTPENNKEYAKVSGVMDNNILVLVPD PHAKNVACFEESAKEAPPSLEQNQAEKALANFTATSSKCRLQLGGLDYLDPACFTHSFH (SEQ ID NO:503)
S211 TNFRSF4 NM_003327_3 ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:504)
S212 variante de transcrição 1 de TNFRSF8 NM-001243_4 HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPL METCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTV KAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTA ASGK (SEQ ID NO:505)
S213 TNFRSF9 NM_001561_5 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:506)
S214 variante de transcrição 1 de TNFRSF14 NM-003 820-3 CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH (SEQ ID NO:507)
S215 variante de transcrição 1 de TNFRSF18 NM-004195-2 QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO:508)
S216 variante de transcrição de TNFRSF18 3_NM_148902_l QLGLHIWQLRKTQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO:509)
X001 Aglutinante GSGGSEGGGSEGGAATAGSGSGS (SEQ ID NO:510)
Tabela 7. Biblioteca la top construtos.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35
M008-S212-S075 1,42 10,58 M008-S039-S212 2,44 8,05
M025-S194-S045 22,50 7,23 M049-S195-S213 2,46 8,03
M018-S195-S104 2,75 9,75 M049-S045-S142 4,08 7,47
M030-S076-S104 2,60 9,49 M007-S109-S076 7,95 6,65
M049-S211-S076 7,09 8,24 M043-S087-S038 1,42 8,53
M013-S165-S194 2,96 9,15 M049-S081-S074 2,34 8,06
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BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35
M013-S038-S059 14,06 7,15 M008-S045-S126 1,62 8,41
M019-S059-S043 0,00 10,85 M008-S044-S039 10,46 6,28
M008-S047-S053 7,27 7,78 M037-S180-S157 0,00 9,79
M030-S104-S176 2,31 9,10 M007-S099-S059 17,07 5,61
M013-S121-S053 19,93 6,41 M024-S197-S037 3,32 7,68
M025-S103-S141 2,73 8,90 M036-S104-S154 13,42 5,94
M031-S074-S038 2,71 8,86 M042-S135-S120 0,00 9,78
M013-S084-S059 9,91 7,30 M037-S059-S045 3,19 7,70
M007-S137-S047 13,29 6,87 M024-S038-S213 0,00 9,72
M043-S169-S213 2,53 8,88 M009-S051-S216 0,00 9,64
M013-S190-S047 0,00 10,68 M049-S116-S043 0,00 9,64
M007-S116-S050 10,42 7,14 M025-S183-S189 0,00 9,61
M043-S106-S176 6,06 7,82 M019-S083-S050 0,00 9,59
M031-S190-S141 3,01 8,62 M007-S053-S189 0,00 9,58
M002-S143-S212 9,08 7,24 M049-S054-S216 0,00 9,52
M018-S157-S216 24,51 5,90 M049-S154-S143 0,00 9,47
M019-S136-S214 2,65 8,68 M002-S170-S043 0,00 9,46
M002-S135-S104 11,35 6,85 M025-S049-S168 0,00 9,38
M030-S100-S064 7,68 7,35 M049-S086-S045 0,00 9,38
M043-S109-S176 3,71 8,22 M036-S045-S043 0,00 9,35
M049-S083-S190 25,27 5,71 M043-S104-S213 0,00 9,32
M001-S064-S036 1,30 9,21 M031-S192-S047 0,00 9,32
M043-S106-S211 13,93 6,49 M043-S044-S136 0,00 9,30
M009-S038-S212 5,54 7,66 M048-S171-S075 0,00 9,30
M007-S216-S052 0,50 9,75 M008-S050-S104 0,00 9,29
M048-S109-S054 16,67 6,19 M007-S051-S109 0,00 9,28
M049-S121-S169 12,36 6,58 M002-S130-S037 0,00 9,18
M010-S194-S214 2,92 8,34 M002-S106-S141 0,00 9,16
M019-S169-S038 2,93 8,32 M018-S053-S051 0,00 9,09
M019-S142-S053 14,15 6,38 M018-S216-S104 0,00 9,00
M043-S109-S215 0,00 10,29 M008-S050-S048 0,00 9,00
M013-S214-S197 24,02 5,64 M007-S051-S085 0,00 8,98
M019-S104-S157 0,00 10,28 M031-S212-S042 0,00 8,97
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4750/5200
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BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35
M049-S142-S043 16,10 6,18 M012-S170-S135 0,00 8,94
M012-S213-S080 0,00 10,27 M024-S211-S141 0,00 8,91
M007-S213-S213 34,94 5,09 M008-S039-S158 0,00 8,89
M007-S115-S189 1,92 8,70 M012-S049-S072 0,00 8,86
M049-S135-S142 7,42 7,17 M007-S171-S175 0,00 8,85
M002-S052-S050 20,15 5,84 M024-S142-S053 0,00 8,80
M013-S101-S157 1,82 8,72 M042-S044-S075 0,00 8,77
M031-S142-S051 6,29 7,34 M036-S136-S104 0,00 8,77
M042-S083-S037 5,91 7,38 M001-S104-S142 0,00 8,76
M024-S194-S053 0,00 10,16 M036-S191-S135 0,00 8,75
M002-S169-S042 14,27 6,22 M043-S214-S043 0,00 8,73
M010-S192-S136 16,88 5,99 M037-S175-S077 0,00 8,70
M013-S121-S039 9,20 6,75 M013-S039-S169 0,00 8,66
M002-S199-S042 16,48 5,97 M007-S115-S046 0,00 8,65
M001-S051-S142 20,08 5,70 M001-S202-S085 0,00 8,63
M030-S052-S121 27,94 5,19 M049-S175-S202 0,00 8,58
M025-S120-S039 4,61 7,55 M030-S047-S142 0,00 8,56
M013-S050-S135 28,40 5,13 M019-S126-S116 0,00 8,55
M010-S157-S050 2,61 8,14 M019-S213-S058 0,00 8,55
M042-S109-S116 2,48 8,18 M002-S051-S037 0,00 8,52
M018-S116-S176 23,75 5,35 M019-S177-S116 0,01 8,51
M037-S142-S043 7,79 6,84 M030-S136-S104 1,03 8,49
M037-S175-S186 2,73 8,07 M002-S043-S109 0,00 8,49
M009-S059-S069 0,00 9,97 M025-S136-S198 0,00 8,48
M001-S175-S048 3,93 7,65 M037-S043-S216 0,00 8,48
M013-S051-S197 4,74 7,42 M018-S053-S169 0,00 8,47
M025-S213-S215 22,18 5,41 M049-S155-S104 0,00 8,46
M049-S080-S046 2,12 8,30 M007-S199-S135 0,00 8,46
M007-S121-S050 1,94 8,37 M018-S175-S058 0,00 8,45
M019-S135-S216 27,12 5,11 M048-S191-S142 0,00 8,45
M031-S116-S052 14,89 5,92 M007-S171-S051 0,00 8,44
M043-S183-S038 1,31 8,70 M037-S137-Z001 0,00 8,44
M025-S080-S102 18,66 5,60 M009-S183-S183 0,75 8,44
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4751/5200
505/540
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35
M007-S158-S084 13,62 6,03 M002-S143-S075 0,00 8,43
M009-S042-S047 15,99 5,81 M025-S036-S215 0,00 8,43
M008-S050-S062 14,05 5,98 M049-S183-S135 0,00 8,43
M043-S195-S048 30,26 4,93 M008-S080-S145 0,00 8,41
M037-S044-S058 13,82 6,00 M009-S052-S039 0,00 8,39
M030-S212-S045 14,24 5,95 M002-S212-S049 0,00 8,39
M031-S053-S143 5,48 7,18 M007-S137-S202 0,00 8,39
M019-S168-S216 5,39 7,19 M025-S037-S050 0,00 8,39
M013-S047-S046 6,89 6,89 M024-S189-S076 0,01 8,38
M007-S042-S215 5,27 7,22 M019-S083-S155 0,00 8,38
M049-S143-S053 2,99 7,85 M049-S214-S054 0,00 8,38
M037-S076-S115 0,00 9,85 M043-S126-S037 0,00 8,38
M043-S081-S098 10,07 6,38 M012-S054-S194 0,00 8,38
M025-S142-S048 3,67 7,62 M018-S038-S169 0,95 8,37
Tabela 8. Construtos principais da biblioteca 2b.
BlockSequence Norm D7 Enrich D28 BlockSequence Norm D7 Enrich D28
M024-S190-S047 30,96 10,78 M018-S199- 6,87 6,78
M025-S050-S197 2,95 13,25 M008-S074- 7,98 6,59
M036-S170-S047 0,00 13,79 M043-S053- 20,99 5,30
M012-S045-S048 1,35 12,24 M018-S115- 7,37 6,69
M049-S194-S064 10,08 9,04 M002-S069- 10,80 6,19
M019-S161-S215 10,44 8,59 M037-S046- 18,41 5,47
M025-S190-S050 25,07 7,20 M049-S138- 7,49 6,67
M013-S141-S045 2,58 9,78 M010-S103- 8,34 6,53
M036-S104-S062 10,56 8,06 M030-S198- 13,25 5,92
M001-S099-S080 7,86 8,42 M013-S215- 15,21 5,73
M018-S053-S130 4,30 8,84 M019-S130- 4,30 7,34
M037-S081-S142 4,67 8,67 M001-S190- 8,72 6,47
M030-S170-S168 8,60 7,83 M024-S176- 4,42 7,31
M001-S174-S044 8,59 7,81 M030-S064- 7,24 6,70
M002-S190-S183 9,34 7,63 M049-S064- 1,60 8,37
M049-S105-S084 12,28 7,22 M008-S176- 10,31 6,24
M019-S046-S197 2,45 9,08 M002-S051- 0,00 9,69
M036-S085-S044 8,23 7,61 M001-S063- 0,00 9,68
M030-S059-S106 1,47 9,50 M007-S050- 0,00 9,67
M048-S157-S154 10,32 7,30 M030-S141- 0,00 9,66
M025-S177-S194 13,51 6,88 M018-S197- 0,00 9,63
M019-S214-S138 17,44 6,51 M019-S098- 0,00 9,62
M037-S120-S085 8,35 7,47 M037-S141- 0,00 9,61
M037-S043-S074 12,77 6,90 M008-S202- 0,00 9,61
M009-S213-S037 0,00 10,68 M036-S144- 0,00 9,61
M049-S192-S212 3,93 8,37 M013-S143- 0,00 9,60
M049-S098-S177 13,39 6,82 M019-S039- 0,00 9,58
M043-S069-S177 0,74 9,86 M036-S126- 0,00 9,57
M025-S072-S047 38,55 5,34 M018-S190- 0,00 9,56
M030-S043-S194 9,21 7,29 M024-S072- 0,00 9,52
M037-S083-S109 2,82 8,70 M036-S175- 0,00 9,49
M025-S154-S216 0,00 10,63 M010-S130- 0,00 9,49
M049-S138-S047 27,13 5,71 M018-S130- 0,00 9,41
M002-S103-S158 8,72 7,23 M048-S051- 0,00 9,24
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M012-S050-S043 3,19 8,42 M042-S109- 0,73 8,87
M002-S036-S121 19,90 6,05 M036-S174- 0,73 8,85
M031-S083-S130 5,28 7,72 M009-S101- 0,86 8,83
M043-S186-S087 13,75 6,48 M049-S042- 0,00 8,75
M012-S216-S039 9,45 6,97 M013-S190- 0,00 8,74
M043-S214-S104 15,84 6,24 M036-S156- 0,86 8,72
M049-S076-S157 4,79 7,78 M025-S050- 0,00 8,71
M008-S186-S076 7,37 7,24 M037-S042- 0,86 8,67
M031-S038-S212 3,80 8,00 M002-S174- 0,98 8,65
M030-S130-S216 3,56 8,04 M009-S049- 0,98 8,59
M007-S049-S051 0,00 10,22 M010-S190- 0,00 8,58
M042-S082-S158 12,40 6,47 M018-S053- 1,23 8,57
M037-S194-S194 10,07 6,75 M024-S084- 1,23 8,56
M031-S135-S183 6,75 7,23 M007-S189- 0,86 8,55
M043-S156-S099 5,77 7,41 M030-S197- 1,10 8,53
M012-S186-S169 3,81 7,89 M018-S130- 0,00 8,51
M048-S038-S076 10,55 6,59 M042-S155- 1,47 8,43
M042-S059-S106 8,34 6,82 M010-S052- 1,10 8,42
M037-S074-S175 1,47 8,69 M042-S087- 1,35 8,42
M012-S121-S106 14,24 6,05 M018-S062- 0,00 8,39
M013-S075-S212 17,18 5,74 M010-S099- 1,47 8,30
M013-S193-S168 5,16 7,28 M030-S059- 1,35 8,26
M002-S142-S072 36,59 4,65 M019-S176- 1,35 8,22
M001-S199-S102 5,77 7,11 M037-S058- 1,84 8,21
M010-S062-S192 14,00 5,95 M002-S171- 1,84 8,21
M031-S075-S169 11,66 6,19 M002-S130- 1,84 8,20
M049-S216-S193 10,55 6,31 M036-S183- 1,72 8,19
M030-S130-S064 5,27 7,19 M048-S106- 1,59 8,18
M031-S158-S046 7,24 6,79 M036-S045- 2,09 8,08
M049-S193-S044 16,94 5,67 M049-S129- 1,72 8,08
M043-S102-S080 4,91 7,25 M008-S146- 1,96 8,03
M042-S191-S047 1,47 8,51 MO3O-SO51- 1,84 7,95
M008-S156-S161 19,26 5,47 M043-S051- 2,33 7,92
M007-S050-S110 5,52 7,10 M024-S190- 2,33 7,88
M031-S109-S192 5,27 7,15 M010-S177- 1,35 7,88
M024-S064-S168 14,48 5,83 M049-S050- 2,45 7,87
M018-S215-S213 20,62 5,35 M008-S143- 2,33 7,86
M025-S084-S039 8,47 6,54 M002-S039- 1,72 7,84
M042-S101-S171 5,89 6,99 M019-S138- 2,70 7,82
M013-S148-S085 14,36 5,83 M019-S116- 2,33 7,82
M031-S054-S138 10,18 6,29 M013-S076- 1,59 7,80
M030-S161-S213 6,99 6,77 M024-S042- 2,57 7,80
M042-S180-S042 10,43 6,26 M007-S202- 2,33 7,78
M024-S049-S189 1,23 8,61 M002-S043- 2,94 7,76
M025-S121-S052 5,27 7,12 M030-S215- 2,58 7,75
M012-S072-Z001 5,15 7,14 M001-S098- 1,84 7,74
M048-S104-S180 12,27 6,03 M013-S085- 2,70 7,73
M048-S045-S045 0,00 9,76 M043-S046- 2,82 7,73
M031-S189-S050 7,61 6,66 M009-S059- 2,70 7,70
M037-S109-S135 2,70 7,87
Tabela 9, Construtos principais da biblioteca 1.1a.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D42 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D42
M007-S120-S214 0,00 16,52 M030-S054-S169 0,97 10,42
M001-S117-S105 2,25 15,48 M012-S117-S142 4,31 10,40
M024-S062-S137 0,77 14,07 M042-S038-S053 1,54 10,24
M012-S117-S194 4,25 14,05 M001-S186-S084 3,02 10,17
M012-S117-S126 0,00 13,58 M024-S130-S171 0,00 10,05
M001-S117-S169 0,84 13,18 M042-S190-S042 3,41 9,93
M012-S062-S046 2,45 12,77 M036-S143-S194 0,39 9,92
M012-S117-S058 2,96 12,75 M030-S168-S137 7,34 9,81
M048-S054-S076 5,15 12,73 M012-S062-S136 1,29 9,77
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M036-S080-S195 3,09 12,44 M030-S084-S143 7,53 9,60
M042-S120-S199 3,09 12,29 M012-S054-S169 2,70 9,51
M030-S080-S197 0,00 12,21 M012-S062-S170 14,22 9,34
M001-S155-S048 1,29 11,96 M030-S062-S143 0,45 9,34
M012-S171-S074 1,09 11,86 M030-S154-S194 3,09 9,28
M030-S117-S049 5,21 11,74 M012-S064-S063 3,35 9,25
M030-S170-S080 6,18 11,63 M030-S170-S194 7,27 9,19
M030-S136-S101 4,38 11,59 M030-S170-S168 3,67 9,14
M024-S130-S063 8,30 11,51 M012-S106-S169 1,35 9,10
M024-S211-S154 4,83 11,45 M001-S117-S052 2,64 9,10
M012-S062-S138 0,90 11,06 M030-S198-S169 1,03 9,04
M030-S102-S191 1,42 10,86 M030-S214-S050 2,32 9,02
M036-S197-S076 0,00 10,82 M036-S199-S038 1,61 9,01
M030-S190-S047 0,00 10,75 M018-S044-S177 4,38 8,85
M012-S062-S169 11,00 10,59 M001-S190-S042 0,00 8,79
M012-S037-S157 0,90 10,52 M036-S175-S059 10,04 8,78
Tabela 10. Construtos principais da biblioteca 1.1b.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D28 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D28
M001-S126-S170 2,57 7,68 M042-S141-S120 0,84 6,17
M012-S106-S169 1,35 7,65 M042-S130-S177 0,84 6,17
M007-S194-S100 0,00 7,19 M036-S176-S116 0,58 6,16
M036-S101-S183 0,00 7,11 M007-S109-S212 0,64 6,14
M024-S135-S098 0,00 7,08 M010-S195-S100 0,84 6,10
M024-S038-S098 0,00 7,04 M012-S168-S175 0,00 6,07
M007-S109-S135 0,00 7,02 M018-S102-S117 0,00 6,01
M024-S191-S038 0,00 6,94 M018-S211-S083 0,00 6,00
M012-S064-S116 0,00 6,93 M018-S192-S058 0,00 6,00
M009-S100-S074 0,00 6,84 M042-S143-S168 0,00 5,95
M001-S120-S039 0,00 6,84 M012-S186-S120 0,00 5,95
M018-S154-S085 0,00 6,83 M030-S087-S052 0,00 5,95
M030-S104-S048 0,00 6,79 M008-S186-S085 0,00 5,94
M030-S168-S121 0,00 6,78 M042-S202-S050 0,00 5,93
M042-S120-S171 1,16 6,75 M001-S171-S214 0,00 5,91
M036-S176-S195 0,90 6,62 M001-S138-S037 0,00 5,91
M010-S171-S169 0,00 6,53 M012-S143-S176 0,00 5,91
M030-S175-S120 1,48 6,52 M042-S186-S050 0,00 5,91
M048-S051-S115 0,84 6,52 M012-S192-S076 3,09 5,91
M024-S047-S080 0,00 6,50 M048-S098-S074 0,00 5,90
M009-S199-S141 0,77 6,39 M042-S186-S215 0,00 5,90
M018-S136-S183 0,39 6,34 M048-S050-S211 0,00 5,90
M036-S062-S212 1,03 6,30 M010-S074-S169 1,35 5,88
M012-S211-S137 0,71 6,21 M008-S212-S099 3,22 5,88
M010-S064-S171 0,71 6,19 M001-S074-S197 0,00 5,88
Tabela 11. Construtos principais da biblioteca 2.1b.
BlockSequence Norm_D7 Enich_D28 BlockSequence Norm_D7 Enich_D28
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M042-S186-S044 0,78 8,65 M010-S177-S215 1,63 5,85
M048-S100-S045 0,98 8,51 M024-S193-S193 0,33 5,83
M001-S186-S170 2,21 8,24 M012-S049-S192 0,20 5,80
M024-S039-S052 6,24 7,53 M048-S130-S170 0,39 5,80
M001-S214-S058 0,26 7,27 M018-S175-S171 1,56 5,80
M042-S080-S074 2,02 7,04 M030-S051-S080 2,28 5,79
M030-S170-S115 2,60 6,96 M012-S121-S072 0,13 5,76
M009-S083-S138 1,04 6,44 M009-S183-S161 1,50 5,75
M042-S154-S075 2,73 6,44 M007-S077-S059 0,33 5,75
M030-S214-S143 4,49 6,33 M018-S058-S062 1,76 5,73
M012-S213-S211 1,63 6,23 M008-S170-S168 0,33 5,73
M036-S212-S214 0,78 6,17 M018-S050-S043 0,33 5,73
M030-S036-S106 2,86 6,05 M012-S215-S126 1,17 5,69
M001-S169-S083 1,30 6,04 M024-S083-S047 3,58 5,68
M007-S105-S064 0,13 5,95 M048-S052-S084 0,52 5,68
M009-S039-S183 1,56 5,95 M042-S052-S130 1,56 5,67
M009-S074-S050 1,63 5,94 M036-S064-S047 1,95 5,65
M012-S076-S051 1,43 5,94 M008-S148-S137 0,52 5,65
M010-S072-S186 1,30 5,92 M036-S198-S135 0,52 5,64
M008-S142-S075 0,13 5,91 M018-S043-S051 1,11 5,64
M001-S175-S168 0,33 5,87 M042-S105-S104 0,46 5,62
M036-S170-S175 0,13 5,87 M030-S074-S082 0,39 5,61
M018-S194-S116 1,43 5,87 M036-S083-S130 0,52 5,59
M042-S115-S121 0,33 5,85 M001-S137-S157 0,46 5,58
M018-S043-S086 0,00 5,85 M008-S083-S104 0,72 5,57
Tabela 12. Construtos principais da biblioteca 3a.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35
E013-T047-S158-S080 0,00 17,08 E014-T054-S186-S053 0,00 8,77
E011-T024-S194-S039 0,00 16,99 E012-T062-S186-S047 0,92 8,74
E014-T040-S135-S076 0,61 15,47 E012-T066-S197-S076 1,34 8,72
E013-T041-S186-S051 2,54 15,08 E012-T054-S102-S214 1,18 8,71
E013-T064-S058-S212 3,91 13,86 E013-T010-S106-S076 1,03 8,68
E013-T028-S186-S051 12,36 12,80 E011-T046-S186-S050 2,26 8,65
E014-T015-S186-S051 0,00 12,78 E014-T071-S100-S049 3,43 8,63
E011-T016-S186-S050 2,31 11,97 E014-T045-S186-S051 2,26 8,62
E011-T073-S186-S050 0,00 11,96 E013-T032-S145-X002 0,00 8,61
E013-T011-S186-S211 1,75 11,90 E013-T049-S149-S037 0,00 8,60
E012-T011-S186-S047 3,85 11,85 E012-T046-S186-S050 7,48 8,60
E012-T020-S117-S212 0,54 11,33 E013-T061-S121-S074 1,50 8,59
E012-T017-S186-S051 0,00 11,31 E014-T017-S198-S211 0,94 8,57
E012-T028-S186-S039 0,00 11,22 E014-T059-S059-S050 1,08 8,57
E014-T034-S069-S053 0,00 11,19 E012-T077-S196-S080 0,00 8,56
E012-T059-S175-S213 3,20 11,05 E014-T005-S137-S214 1,09 8,54
E014-T035-S154-S076 2,56 11,04 E013-T052-S148-S050 2,08 8,53
E013-T045-S169-S215 4,85 11,02 E011-T051-S083-S076 0,00 8,52
E014-T031-S186-S211 2,18 10,86 E014-T072-S085-S213 1,13 8,52
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E012-T063-S191-S052 0,00 10,75 E013-T006-S177-S075 1,63 8,51
E011-T064-S083-S048 2,15 10,67 E012-T050-S099-S214 0,00 8,51
E013-T055-S099-S215 0,00 10,65 E014-T056-S058-S216 1,10 8,50
E014-T029-S154-S047 0,00 10,64 EO13-TO45-S186-SO53 4,11 8,50
E013-T050-S186-S047 0,00 10,62 E014-T045-S186-S053 3,15 8,50
E013-T017-S106-S080 1,75 10,54 E013-T021-S186-S211 0,00 8,49
E012-T049-S197-S053 1,12 10,44 E013-T073-S054-S075 0,00 8,49
E011-T011-S186-S211 5,44 10,40 E014-T072-S101-X002 3,23 8,49
E014-T041-S186-S053 3,26 10,35 EO13-TO36-S1O2-SO53 0,00 8,48
E011-T007-S154-S216 0,00 10,33 E011-T047-S145-S052 0,00 8,46
E013-T041-S186-S050 11,95 10,28 E012-T006-S186-S039 0,00 8,45
E012-T072-S189-S212 0,92 10,18 E012-T031-S186-S050 0,95 8,41
E011-T077-S186-S211 5,16 10,13 E014-T060-S109-S076 2,22 8,41
E013-T045-S143-S038 0,00 10,11 E011-T005-S098-S074 1,12 8,39
E014-T041-S186-X002 3,72 10,09 E011-T017-S186-X002 1,05 8,38
E014-T057-S186-S050 3,07 10,09 E011-T043-S054-S049 1,04 8,37
E013-T068-S170-S050 1,45 9,91 E014-T080-S193-S050 1,01 8,35
E014-T055-S186-S053 0,00 9,90 E014-T007-S190-S053 2,44 8,33
E014-T028-S186-S051 2,10 9,86 EO13-TO23-S1O5-XOO2 1,09 8,29
E013-T032-S136-S050 0,00 9,83 E013-T057-S186-S051 6,29 8,16
E012-T064-S135-S080 1,11 9,80 E014-T031-S186-S053 11,27 6,86
E014-T050-S186-S050 1,53 9,80 E012-T062-S186-S211 3,99 8,15
E011-T001-S177-S074 6,99 9,74 E012-T006-S186-S047 3,85 8,07
E013-T040-S171-S038 2,08 9,73 E014-T028-S186-S053 3,49 8,13
E013-T034-S186-S050 0,00 9,72 E014-T041-S186-S211 5,72 7,54
E013-T055-S104-S052 0,00 9,50 E011-T047-S085-S211 3,66 8,06
E014-T051-S058-S211 3,87 9,48 E014-T038-S186-X002 6,13 7,42
E013-T012-S194-X002 0,79 9,42 E013-T028-S186-S076 8,76 6,60
E013-T019-S186-S050 3,33 9,42 E011-T045-S186-S051 2,25 8,16
E012-T071-S069-S075 0,00 9,42 E011-T022-S186-S050 1,93 8,29
E011-T026-S186-S051 1,06 9,34 E012-T004-S202-S211 1,91 8,26
E013-T050-S186-S050 0,00 9,29 E011-T022-S194-S074 2,04 8,17
E012-T024-S186-S051 0,90 9,27 E011-T011-S186-S047 2,19 8,10
E012-T073-S186-S053 0,00 9,12 E012-T031-S186-S052 3,62 7,55
E013-T071-S115-S213 1,04 9,09 EO13-TO3O-S138-S216 1,95 8,20
E014-T062-S186-S211 2,15 8,99 E013-T016-S186-S050 2,98 7,74
E011-T062-S186-S211 0,00 8,92 EO13-TO34-S186-SO53 3,51 7,54
E014-T011-S186-S039 0,46 8,86 E011-T012-S193-S052 4,66 7,19
E013-T069-S109-S074 0,00 8,84 E012-T047-S186-S047 3,51 7,43
E011-T058-S156-X002 0,92 8,83 EO11-TO55-S186-SO53 8,63 6,29
E014-T021-S171-S053 0,00 8,83 E013-T077-S186-S051 2,48 7,73
E014-T073-S161-S050 0,00 8,81 E014-T041-S186-S052 7,19 6,47
E011-T011-S186-S051 1,71 8,79 E013-T029-S186-S051 5,53 6,76
Tabela 13. Construtos principais da biblioteca 3b.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D21 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D21
E014-T011-S186-S039 0,46 9,67 E011-T007-S064-S075 0,00 6,58
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E013-T057-S115-S214 0,00 9,40 EO13-TO59-S136-SO5O 1,83 6,58
E013-T028-S186-S051 12,36 9,28 EO13-TO34-S186-SO53 3,51 6,56
E013-T019-S142-S212 0,00 9,04 E014-T022-S087-S075 0,00 6,55
E011-T020-S104-S080 0,99 8,92 E012-T055-S142-X002 0,03 6,55
E011-T011-S186-S039 0,00 8,75 E011-T067-S186-S051 1,79 6,53
EO13-TO31-S169-S214 0,00 8,74 E012-T073-S083-S037 4,04 6,48
E013-T062-S158-S051 1,30 8,51 E011-T028-S171-S038 1,19 6,47
E011-T041-S186-S047 2,62 8,43 E012-T016-S186-S039 0,00 6,45
E012-T024-S142-S211 1,17 8,31 E012-T047-S104-S053 1,60 6,44
E013-T017-S143-S216 0,00 8,26 E014-T016-S186-S039 2,60 6,37
E013-T058-S183-S051 1,00 8,19 E013-T042-S191-S074 1,11 6,37
E011-T030-S176-S050 0,60 8,16 E014-T017-S186-S053 0,96 6,33
E012-T062-S186-S037 3,05 8,10 E013-T048-S154-S038 0,10 6,33
E014-T041-S085-S037 0,91 8,02 EO13-TO45-S186-SO53 4,11 6,32
E011-T080-S115-S211 0,00 7,86 E013-T016-S186-S050 2,98 6,27
E013-T041-S186-S039 1,07 7,81 E013-T062-S186-S051 1,11 6,23
E014-T028-S186-S053 3,49 7,78 E011-T001-S177-S074 6,99 6,23
E014-T019-S057-S074 1,16 7,76 E012-T027-S116-S215 0,00 6,22
E012-T044-S130-S074 1,09 7,75 E011-T046-S186-S052 0,00 6,21
E013-T081-S085-S211 3,54 7,74 E013-T031-S186-S047 3,33 6,10
E014-T028-S186-S051 2,10 7,68 E014-T012-S121-S213 1,72 6,09
E012-T027-S083-S080 0,00 7,60 EO12-TO33-S13O-XOO2 0,00 6,09
E013-T052-S126-S213 0,00 7,58 E014-T055-S109-S211 0,67 6,06
E012-T039-S176-S213 4,06 7,53 E013-T014-S197-S214 0,00 6,02
E014-T072-S101-X002 3,23 7,45 E014-T041-S186-S047 0,00 6,02
E012-T011-S186-S047 3,85 7,43 E012-T021-S186-S051 1,47 6,01
E014-T041-S186-S053 3,26 7,41 E014-T073-S059-S048 0,93 5,99
E013-T002-S135-S038 0,00 7,40 E013-T050-S186-S047 0,00 5,98
E011-T015-S170-S047 4,71 7,39 E013-T022-S189-S215 1,69 5,97
E014-T072-S198-S076 2,28 7,35 E014-T042-S177-X002 6,13 5,95
E014-T028-S186-S039 1,44 7,31 E014-T076-S186-S050 8,73 5,95
E013-T027-S186-S051 3,03 7,30 E012-T011-S186-S216 0,60 5,93
E014-T011-S186-X002 4,22 7,29 E012-T034-S186-S053 3,99 5,92
E014-T015-S186-S051 0,00 7,25 E014-T031-S186-S053 11,27 5,70
E012-T010-S063-S039 3,22 7,23 E013-T020-S083-X002 7,87 5,69
E011-T011-S186-S053 8,27 7,23 E012-T072-S176-S211 6,58 5,74
E012-T067-S072-S075 0,00 7,21 E014-T062-S186-X002 11,85 4,83
E012-T043-S186-S051 1,16 7,21 EO13-TO11-S186-SO39 5,19 5,75
E012-T030-S059-X002 2,08 7,15 E013-T021-S069-S216 4,36 5,82
E011-T011-S186-S051 1,71 7,14 E012-T077-S186-S052 5,77 5,42
E012-T059-S175-S213 3,20 7,08 E012-T077-S195-S080 4,48 5,64
E011-T038-S116-S039 2,16 7,07 E012-T043-S186-S053 8,59 4,72
E012-T028-S186-S039 0,00 7,03 E012-T011-S186-S052 4,03 5,63
E012-T024-S186-S053 4,74 6,98 E012-T016-S186-S075 7,32 4,87
E012-T033-S157-S053 0,00 6,96 E012-T043-S186-X002 3,44 5,73
E013-T071-S072-S213 0,00 6,95 E014-T071-S121-X002 3,30 5,77
E012-T050-S099-S214 0,00 6,94 E014-T028-S186-X002 5,96 5,03
E011-T062-S186-S053 0,00 6,90 E014-T062-S186-S051 4,96 5,24
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E013-T044-S143-S050 1,31 6,85 E012-T021-S186-S053 17,53 3,59
E014-T008-S186-S053 1,59 6,82 E014-T062-S102-S215 5,11 5,13
E014-T065-S142-S050 2,28 6,79 E014-T011-S186-S053 10,09 4,26
E013-T055-S195-S076 0,00 6,78 E012-T062-S186-S076 3,01 5,70
E013-T028-S186-S047 0,52 6,77 E013-T028-S186-S076 8,76 4,42
E014-T077-S130-S038 0,00 6,74 E013-T062-S186-S075 2,89 5,73
E014-T016-S186-S051 1,17 6,73 E011-T030-S082-X002 8,98 4,37
E013-T039-S186-S214 1,55 6,72 E013-T019-S186-S050 3,33 5,51
E012-T012-S103-S213 0,00 6,69 E013-T011-S186-S037 3,85 5,33
E013-T032-S142-S074 1,03 6,67 E012-T002-S136-S080 6,27 4,74
E013-T057-S186-S051 6,29 6,66 E013-T062-S186-S047 2,87 5,61
E012-T078-S183-S212 0,00 6,65 E012-T034-S186-S051 6,25 4,70
E013-T046-S135-S037 0,00 6,64 E012-T046-S186-S050 7,48 4,37
E013-T008-S101-S080 1,08 6,62 E011-T067-S165-S038 6,40 4,56
E012-T044-S105-S214 1,16 6,61 E012-T031-S186-X002 4,42 4,95
E014-T001-S186-S053 0,00 6,59 E014-T019-S170-X002 3,05 5,35
E013-T028-S186-S050 0,00 6,58
Tabela 14. Construtos principais da biblioteca 3.1a.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35
E006-T074-S194-S211 0,00 15,37 E007-T065-S106-S053 1,23 11,32
E010-T073-S186-S211 3,27 14,82 EOO8-TOO1-S19O-SO53 0,00 11,30
E009-T049-S106-S037 0,00 13,34 E007-T032-S138-S052 0,00 11,24
E009-T073-S190-S215 2,10 13,00 E010-T044-S190-S080 2,28 11,20
E009-T009-S165-S052 0,80 12,98 E009-T044-S129-S053 1,23 11,18
E009-T066-S168-S053 2,10 12,85 E008-T073-S186-S080 0,00 11,17
E010-T024-S197-S214 0,00 12,59 E007-T020-S082-S211 0,00 11,16
E009-T072-S186-S039 0,00 12,42 E007-T006-S195-S052 0,00 11,11
E009-T038-S105-S050 0,00 12,38 E008-T027-S190-S050 1,61 11,08
E006-T057-S105-S039 0,00 12,38 E007-T056-S143-S050 0,68 10,99
E007-T017-S197-S047 1,79 12,25 E010-T042-S177-S049 1,85 10,96
E010-T045-S138-S074 0,00 12,20 E008-T034-S064-S039 0,00 10,95
E008-T024-S197-S039 0,00 12,16 E007-T040-S054-S052 1,85 10,83
E006-T077-S202-S053 0,00 12,09 E010-T019-S054-S051 1,48 10,80
E009-T032-S105-S048 1,85 12,05 E007-T058-S086-S052 1,48 10,78
E008-T056-S197-S050 0,00 12,02 E009-T019-S192-S214 0,86 10,69
E006-T008-S170-S075 1,36 12,01 E010-T066-S192-S037 1,91 10,67
E010-T017-S084-S052 0,00 11,96 E006-T048-S194-S074 0,00 10,57
E009-T032-S129-S047 0,00 11,69 E006-T078-S102-S075 1,05 10,55
E010-T053-S194-S211 1,30 11,69 E010-T017-S197-S053 1,17 10,55
E008-T010-S064-S037 0,00 11,68 E010-T041-S169-S074 0,00 10,50
E009-T060-S175-S053 0,00 11,50 E006-T038-S192-S053 1,79 10,47
E008-T073-S169-X002 0,00 11,39 E007-T032-S129-S212 0,49 10,46
E009-T071-S186-S211 4,08 11,38 E007-T035-S189-S051 4,08 10,45
E006-T077-S069-S050 4,94 11,35 E006-T006-S116-S214 0,00 10,44
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Tabela 15. Construtos principais da biblioteca 3.1b.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D35
E010-T044-S171-S050 0,00 15,69 E006-T034-S192-S049 0,99 9,11
E007-T061-S169-S211 0,00 15,11 E010-T040-S102-S051 0,00 9,11
E010-T072-S183-S212 3,89 14,56 E009-T041-S129-S049 0,93 9,03
E008-T013-S192-S037 5,19 14,19 E008-T003-S176-S215 0,00 8,92
E008-T058-S176-S212 6,11 13,64 E006-T055-S105-S214 0,00 8,87
E006-T045-S130-S039 3,64 13,62 E007-T039-S058-S211 0,00 8,79
E008-T006-S169-X002 5,93 13,43 E010-T020-S104-X002 1,54 8,67
E008-T041-S141-S053 6,54 13,29 E010-T030-S197-S047 0,00 8,65
E007-T024-S115-S074 8,40 12,97 E007-T038-S099-X002 0,00 8,62
E009-T021-S138-S037 7,16 12,91 E010-T024-S197-S214 0,00 8,59
E009-T044-S197-S051 7,78 11,62 E008-T041-S058-S216 0,00 8,59
E009-T019-S192-S214 0,86 11,28 EO1O-TO13-S13O-SO8O 1,11 8,56
E008-T065-S101-X002 1,42 10,48 E008-T079-S168-S038 0,00 8,48
E008-T082-S102-S048 0,00 10,15 E008-T021-S126-S053 0,00 8,39
E010-T072-S186-S211 2,59 10,14 E010-T045-S102-S213 1,17 8,38
E007-T006-S141-S050 0,00 10,08 E009-T076-S186-S211 0,68 8,36
E009-T073-S064-S037 0,00 9,96 E009-T005-S196-S049 1,54 8,33
E010-T072-S197-S051 0,00 9,80 E008-T020-S100-S053 0,00 8,25
E007-T054-S194-S214 0,00 9,72 E009-T075-S102-S039 9,88 8,23
E010-T044-S137-S052 0,00 9,51 E008-T006-S064-S051 0,00 8,20
E010-T078-S197-S051 0,31 9,40 E007-T046-S154-S075 0,00 8,18
E007-T003-S120-S075 0,00 9,24 E008-T071-S138-S047 0,00 8,17
E010-T030-S197-S037 0,00 9,22 E006-T008-S170-S075 1,36 8,15
E007-T017-S058-S211 0,74 9,20 E007-T073-S154-S048 0,00 8,13
E006-T068-S136-S048 0,00 9,15 EOO8-TOO1-S19O-SO53 0,00 8,13
Tabela 16. Construtos principais da biblioteca 4b.
BlockSequence Norm D7 Enrich D21 BlockSequence Norm D7 Enrich D21
E014-T046-S186- 0,000 11,939 E013-T062-S058- 6,678 7,463
E014-T041-S058-S211 0,000 10,739 E013-T008-S072- 2,701 7,451
E012-T067-S142- 0,000 10,684 EO12-TO3O-S13O- 0,954 7,443
EO13-TO53-S1O1- 0,000 10,439 E012-T065-S057- 0,000 7,436
E011-T041-S186-S053 0,000 10,295 E011-T015-S186- 0,000 7,430
E012-T013-S158- 0,000 10,040 E014-T028-S186- 0,000 7,417
E013-T029-S058- 4,437 9,654 E011-T071-S098- 4,692 7,401
E011-T044-S145-S049 0,000 9,625 E013-T079-X001- 0,000 7,392
E012-T008-S085-S211 4,537 9,592 E011-T040-S143- 0,000 7,372
E014-T065-S064- 1,253 9,559 E012-T006-S186- 0,000 7,362
E011-T047-S189-S051 0,000 9,513 E014-T082-S109- 0,000 7,351
E012-T078-S154- 0,000 9,471 E014-T004-X001- 0,000 7,344
E013-T024-S176- 2,385 9,354 E014-T053-S174- 0,000 7,338
E012-T022-S186- 0,000 9,344 EO12-TO23-S135- 0,000 7,320
E012-T016-S186- 1,875 9,244 EO11-TO38-XOO1- 0,000 7,307
E013-T030-S175- 2,252 9,223 E012-T011-S186- 0,000 7,287
E013-T077-S186- 0,000 9,217 E011-T057-S169- 0,000 7,284
E012-T048-S157- 0,000 9,153 E012-T015-S186- 0,000 7,275
E013-T016-S186- 2,036 9,085 E011-T049-S189- 0,000 7,263
E011-T041-S199-S038 2,779 9,018 E011-T031-S186- 5,596 7,257
E011-T041-S186-S052 0,000 8,856 E013-T029-S104- 0,000 7,234
E012-T022-S186- 0,000 8,856 E013-T041-S186- 0,000 7,226
E014-T016-S142- 0,000 8,830 E013-T073-S186- 0,000 7,214
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4759/5200
513/540
E011-T077-S186-S053 0,000 8,615 E011-T021-S157- 170,218 4,017
E013-T011-S186-S053 5,158 8,540 E014-T027-S176- 174,583 3,959
E012-T031-S085- 0,000 8,537 E011-T021-S083- 151,189 3,611
E013-T041-S143- 4,731 8,536 E012-T050-S145- 68,520 4,545
E013-T023-S105- 0,000 8,515 E011-T067-S146- 49,063 4,896
E012-T011-S186-S052 2,024 8,510 E011-T052-S143- 70,467 4,322
E012-T031-S085- 0,000 8,471 E014-T074-S138- 66,035 4,290
E014-T016-S186- 1,137 8,452 E013-T012-S058- 92,824 3,772
E013-T069-S115-S214 0,000 8,437 E012-T015-S069- 86,934 3,776
E011-T008-S177- 0,000 8,330 EO13-TO23-S157- 85,531 3,689
E014-T017-S141- 0,971 8,328 E012-T006-S136- 7,798 6,983
E014-T028-S186- 1,897 8,305 E012-T024-S062- 69,784 3,940
E013-T016-S186- 0,000 8,292 E012-T025-S085- 108,753 3,034
E014-T044-S099- 2,202 8,285 E011-T016-S186- 5,447 7,123
E014-T020-S168- 2,235 8,284 E011-T015-S186- 9,296 6,412
E012-T030-S115-S075 0,000 8,257 E012-T004-S195- 44,560 4,178
E014-T002-S169-S211 0,000 8,239 E011-T032-S102- 5,635 6,948
E013-T020-S194- 0,000 8,226 E011-T014-S117- 10,350 6,156
E011-T018-S117-S216 0,000 8,212 E014-T015-S186- 6,839 6,688
E013-T062-S186- 7,937 8,203 E013-T048-S177- 60,727 3,700
E014-T062-S186- 0,000 8,155 E012-T028-S186- 17,510 5,428
E012-T078-S129- 0,000 8,111 EO12-TO59-S135- 6,206 6,655
E011-T017-S077-S075 0,000 8,105 E012-T044-S081- 45,663 3,895
E011-T006-S186-S051 0,000 8,095 E014-T011-S186- 4,298 7,022
E013-T050-S186- 4,359 8,015 E011-T017-S058- 7,582 6,323
E011-T041-S054-S050 0,000 7,984 E013-T027-S175- 27,643 4,558
E011-T036-S138-S076 0,000 7,978 E014-T056-S136- 4,099 7,044
E014-T080-S197- 0,000 7,899 E014-T065-S196- 4,875 6,823
E014-T036-S106- 0,000 7,886 E013-T028-S186- 4,215 6,893
E014-T017-S058- 2,263 7,837 E011-T023-S058- 37,543 3,995
E012-T055-S186- 0,932 7,824 E011-T028-S186- 5,524 6,499
E011-T015-S186-S053 0,000 7,806 E014-T072-S069- 48,963 3,487
E014-T030-S058- 0,000 7,798 EO11-TO32-S13O- 25,169 4,402
E011-T017-S054-S037 1,764 7,786 E012-T052-S169- 4,099 6,662
E012-T028-S186- 1,198 7,779 E012-T076-S121- 38,253 3,711
E013-T062-S186- 0,000 7,749 E012-T062-S186- 10,250 5,469
E012-T011-S186-S037 0,000 7,707 E013-T011-S186- 9,972 5,499
E013-T035-S145- 0,000 7,704 E013-T029-S186- 4,215 6,526
E012-T066-S130- 0,000 7,701 E013-T011-S186- 4,398 6,474
E012-T017-S192- 0,000 7,624 EO11-TO75-S13O- 60,189 2,941
E012-T002-S084- 0,998 7,614 E014-T044-S193- 2,302 7,150
E013-T050-S138- 0,000 7,603 E013-T045-S186- 5,175 6,203
E013-T043-S186- 0,000 7,595 E011-T065-S143- 28,447 3,947
E011-T034-S064-S053 0,000 7,589 E013-T077-S099- 2,191 7,134
E012-T017-S186- 0,072 7,567 E014-T057-S186- 3,627 6,594
E011-T030-S186-S038 0,000 7,564 E013-T011-S186- 6,678 5,862
E012-T011-S170- 0,000 7,560 E011-T073-S069- 4,104 6,445
E012-T039-S177- 0,000 7,540 E012-T046-S186- 7,621 5,686
E014-T041-S186- 2,158 7,534 E014-T062-S186- 5,940 5,989
E014-T012-S183- 0,000 7,513 E014-T028-S186- 2,074 7,146
E013-T055-S186- 0,000 7,509 E014-T055-S186- 7,565 5,614
E012-T045-S170- 0,000 7,487 E014-T011-S186- 8,885 5,336
E012-T024-S186- 0,000 7,469 EO13-TO55-S186- 2,202 6,852
E013-T010-S183- 0,000 7,463 E011-T019-S072- 26,351 3,742
Tabela 17. Construtos principais da biblioteca 4.1b.
BlockSequence Norm_D7 Enrich_D42 BlockSequence Norm_D7 Enrich_D42
E009-T061-S170-S050 0,56 9,29 E008-T079-S142-S211 0,00 5,84
E008-T001-S190-S047 0,00 8,97 E008-T082-S126-S053 0,21 5,82
E008-T020-S083-S080 0,77 8,64 E010-T022-S143-S213 0,70 5,78
E009-T074-S085-X002 1,39 8,43 E009-T006-S194-S038 0,28 5,76
E010-T034-S058-S212 0,70 8,13 E006-T077-S199-S075 0,21 5,76
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514/540
E006-T010-S064-S051 0,42 7,90 E006-T002-S198-X002 0,70 5,74
E009-T055-S064-S053 1,05 7,73 E010-T002-S165-S052 0,70 5,72
E006-T039-S193-S075 0,70 7,38 E010-T079-S194-S053 0,14 5,68
E008-T071-S109-S212 1,12 7,37 E006-T019-S199-S076 0,07 5,68
E010-T019-S168-X002 1,81 7,31 E008-T053-S102-S037 0,35 5,65
E009-T072-S170-S211 0,77 6,56 E006-T069-S193-S038 0,07 5,65
E006-T049-S145-S052 0,28 6,52 E008-T072-S171-S212 0,91 5,63
E009-T010-S064-S051 2,02 6,49 E007-T062-S137-S214 0,28 5,60
E007-T010-S064-S047 1,26 6,41 E007-T060-S176-S047 0,21 5,60
E007-T056-S180-S213 1,32 6,33 E009-T034-S064-S051 1,19 5,58
E007-T008-S154-S074 0,28 6,31 E008-T078-S103-S211 0,07 5,57
E010-T027-S199-S075 0,07 6,31 E008-T010-S062-S051 0,56 5,56
E010-T017-S136-S050 0,14 6,26 E010-T057-S154-S213 0,28 5,55
E008-T043-S109-S047 0,35 6,20 EO1O-TO51-S138-SO75 0,28 5,54
E008-T038-S102-S051 0,14 6,13 E010-T031-S102-S039 0,07 5,48
E008-T017-S058-X002 0,70 6,13 E009-T071-S180-S074 0,14 5,48
E007-T065-S102-S049 1,32 6,06 E009-T027-S175-S213 0,00 5,46
E006-T030-S084-S074 1,53 6,03 E007-T052-S193-S214 1,46 5,45
E010-T036-S192-S050 0,70 5,88 E009-T030-S087-S039 0,56 5,45
E009-T017-S168-S216 0,49 5,87 E007-T006-S059-S047 0,35 5,44
Tabela 18. Interrupção de Lib3 p4.
BlockSequence N D7 N D21 3B E D21 3B N D21 3A E D21 3A N D35 3A E D35 3A
E014-T041- 3,72 146,55 4,97 4927,54 10,03 5163,05 10,09
E013-T012- 0,79 16,46 3,29 268,84 7,24 1221,60 9,42
E011-T058- 0,92 41,10 4,45 275,82 7,17 874,92 8,83
E013-T032- 0,00 0,00 0,00 613,68 9,26 390,18 8,61
E014-T072- 3,23 740,94 7,45 14542,93 11,75 1520,08 8,49
E011-T017- 1,05 0,00 -1,04 1960,69 9,90 680,44 8,38
E013-T023- 1,09 0,00 -1,07 151,63 6,19 655,49 8,29
E011-T039- 1,12 20,25 3,32 742,40 8,45 504,52 7,89
E013-T055- 0,00 16,40 4,12 1736,80 10,76 191,90 7,59
E014-T038- 6,13 0,00 -2,83 1147,62 7,33 1218,74 7,42
E014-T019- 3,05 164,40 5,35 950,31 7,87 665,15 7,36
E014-T014- 0,00 0,00 0,00 269,39 8,08 133,71 7,07
E013-T045- 2,82 0,00 -1,94 39,44 3,40 460,88 6,92
EO13-TO35- 0,00 34,31 5,14 216,60 7,77 105,91 6,74
E014-T067- 2,21 118,19 5,21 541,72 7,40 322,27 6,65
E012-T020- 3,03 26,98 2,80 5712,32 10,47 326,42 6,35
E014-T074- 1,17 0,00 -1,12 90,02 5,39 146,76 6,09
E013-T066- 0,00 9,85 3,44 9,12 3,34 52,14 5,73
E012-T030- 2,08 437,19 7,15 1336,66 8,76 142,82 5,54
E011-T057- 1,18 9,13 2,22 0,00 -1,12 99,52 5,53
E013-T075- 0,95 0,00 -0,96 551,34 8,14 86,06 5,48
E011-T063- 1,45 0,00 -1,29 218,81 6,49 106,86 5,46
E013-T057- 0,00 17,18 4,18 33,01 5,09 42,82 5,45
E012-T033- 0,00 67,18 6,09 142,99 7,17 41,19 5,40
E014-T067- 0,86 79,68 5,44 342,51 7,53 67,16 5,20
E014-T032- 0,45 10,58 2,99 166,33 6,85 48,53 5,09
E012-T017- 2,72 15,38 2,14 66,93 4,19 125,01 5,08
E014-T022- 0,00 19,29 4,34 132,58 7,06 29,71 4,94
E012-T003- 0,00 16,46 4,13 316,91 8,31 27,19 4,82
E011-T030- 8,98 204,84 4,37 1073,77 6,75 277,27 4,80
E012-T043- 2,15 0,00 -1,66 9,74 1,77 79,53 4,68
E014-T028- 5,96 226,89 5,03 2380,18 8,42 153,76 4,47
E012-T064- 2,07 6,61 1,31 263,63 6,43 58,60 4,28
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4761/5200
515/540
E013-T028- 0,00 0,00 0,00 147,22 7,21 17,67 4,22
E014-T014- 1,39 9,07 2,07 0,00 -1,26 42,21 4,17
E012-T064- 0,96 0,00 -0,97 36,87 4,27 33,92 4,15
E013-T071- 0,00 0,00 0,00 68,83 6,13 16,18 4,10
E013-T020- 7,87 458,11 5,69 1612,42 7,51 148,53 4,08
E013-T009- 1,08 8,65 2,22 0,00 -1,05 33,58 4,06
E012-T074- 0,73 8,35 2,44 89,35 5,71 26,65 4,00
E013-T007- 0,00 0,00 0,00 13,23 3,83 14,89 3,99
EO13-TO31- 2,94 10,58 1,55 45,56 3,56 60,02 3,95
E013-T016- 4,90 113,99 4,29 584,77 6,63 87,76 3,91
E011-T021- 0,00 9,55 3,40 97,43 6,62 14,00 3,91
E012-T001- 5,69 8,65 0,53 645,09 6,59 92,65 3,81
E013-T041- 15,80 41,16 1,33 286,42 4,10 234,04 3,81
E014-T011- 4,22 814,84 7,29 2615,15 8,97 71,51 3,80
E013-T007- 2,12 10,34 1,86 7,29 1,41 39,90 3,71
E012-T037- 1,28 0,00 -1,19 15,49 2,85 28,82 3,71
E014-T071- 3,30 233,32 5,77 469,83 6,77 55,13 3,71
E013-T057- 8,49 10,03 0,22 131,66 3,81 114,27 3,60
E014-T011- 2,73 0,00 -1,90 484,03 7,02 43,91 3,59
E014-T044- 1,73 9,97 2,00 149,91 5,79 31,00 3,55
E012-T055- 1,19 0,00 -1,13 154,51 6,15 24,54 3,54
E014-T068- 0,00 19,53 4,36 115,93 6,87 10,40 3,51
E012-T043- 3,44 234,64 5,73 434,80 6,62 49,42 3,50
E012-T060- 4,58 26,26 2,29 150,89 4,77 60,91 3,47
E014-T017- 2,26 12,50 2,05 193,70 5,90 33,92 3,42
E014-T047- 0,55 4,09 1,71 13,47 3,22 15,50 3,41
E014-T062- 11,85 364,97 4,83 1056,62 6,36 135,27 3,41
E014-T069- 1,86 0,00 -1,52 136,56 5,59 28,89 3,39
E012-T041- 3,43 10,52 1,38 105,39 4,58 43,84 3,34
E014-T046- 3,96 0,00 -2,31 471,60 6,57 46,29 3,25
E014-T079- 0,97 9,97 2,48 107,90 5,79 17,40 3,22
E014-T032- 2,26 6,13 1,13 164,98 5,67 29,03 3,20
E013-T021- 5,66 0,00 -2,74 130,01 4,30 60,16 3,20
E012-T031- 4,42 166,56 4,95 882,03 7,35 47,86 3,17
E014-T035- 0,00 0,00 0,00 51,75 5,72 7,34 3,06
E011-T043- 1,84 0,00 -1,50 0,00 -1,50 19,85 2,88
E011-T045- 0,19 5,17 2,37 12,43 3,50 7,27 2,80
EO13-TOO3- 3,48 101,07 4,51 391,99 6,46 29,71 2,78
E014-T006- 1,13 0,00 -1,09 0,00 -1,09 11,76 2,58
E013-T073- 0,00 7,51 3,09 7,78 3,13 4,96 2,58
E012-T057- 2,73 29,74 3,04 210,23 5,82 20,66 2,54
E014-T015- 2,19 0,00 -1,67 0,00 -1,67 17,33 2,52
E014-T010- 0,57 0,00 -0,65 36,25 4,57 7,89 2,50
E011-T012- 1,95 7,75 1,57 0,00 -1,56 15,43 2,48
E014-T078- 0,93 4,03 1,38 92,72 5,60 9,58 2,46
EO13-TO51- 5,29 11,30 0,97 89,23 3,84 33,04 2,44
E014-T072- 2,37 20,07 2,65 88,06 4,73 15,16 2,26
E013-T001- 0,93 0,00 -0,95 0,00 -0,95 7,48 2,13
E012-T019- 1,19 0,00 -1,13 89,35 5,37 8,56 2,13
E012-T015- 2,88 0,00 -1,96 0,00 -1,96 14,61 2,01
E011-T055- 3,65 41,34 3,19 27,99 2,64 17,54 2,00
E013-T021- 2,06 0,00 -1,61 410,18 7,07 10,20 1,87
E012-T056- 2,34 0,00 -1,74 78,02 4,56 10,94 1,84
E014-T016- 8,46 36,29 1,98 483,36 5,68 32,02 1,80
E012-T069- 2,12 0,00 -1,64 309,01 6,64 9,65 1,77
E013-T034- 4,33 0,00 -2,41 64,55 3,62 15,84 1,66
E012-T057- 5,58 25,90 2,03 18,25 1,55 17,06 1,46
E014-T057- 1,87 0,00 -1,52 30,07 3,43 6,12 1,31
E013-T010- 6,44 40,50 2,48 122,11 4,05 16,11 1,20
E012-T011- 10,02 87,67 3,01 424,02 5,27 22,09 1,07
E014-T050- 7,72 31,31 1,89 59,95 2,81 15,63 0,93
E013-T027- 5,15 42,12 2,81 167,98 4,78 9,31 0,75
E014-T028- 1,72 46,09 4,12 68,40 4,67 2,99 0,55
E011-T062- 0,00 0,00 0,00 45,26 5,53 0,07 0,09
E011-T001- 0,00 8,17 3,20 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T001- 0,00 0,00 0,00 6,74 2,95 0,00 0,00
E011-T001- 0,00 0,00 0,00 6,92 2,99 0,00 0,00
E011-T004- 0,00 9,37 3,37 0,00 0,00 0,00 0,00
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4762/5200
516/540
E011-T004- 0,00 0,00 0,00 5,33 2,66 0,00 0,00
E011-T004- 0,00 0,00 0,00 8,82 3,30 0,00 0,00
E011-T005- 0,00 8,41 3,23 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T005- 0,00 6,91 2,98 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T005- 0,00 3,55 2,18 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T006- 0,00 19,77 4,38 42,38 5,44 0,00 0,00
E011-T006- 0,00 9,61 3,41 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T008- 0,00 9,07 3,33 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T008- 0,00 0,00 0,00 5,45 2,69 0,00 0,00
E011-T008- 0,00 10,03 3,46 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T009- 0,00 8,89 3,31 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T009- 0,00 7,45 3,08 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T011- 0,00 9,55 3,40 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T011- 0,00 21,69 4,50 142,75 7,17 0,00 0,00
E011-T012- 0,00 8,59 3,26 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T012- 0,00 0,00 0,00 28,72 4,89 0,00 0,00
E011-T012- 0,00 9,55 3,40 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T014- 0,00 0,00 0,00 8,21 3,20 0,00 0,00
E011-T014- 0,00 10,46 3,52 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T016- 0,00 9,13 3,34 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T016- 0,00 5,89 2,78 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T018- 0,00 10,88 3,57 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T018- 0,00 8,29 3,22 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T019- 0,00 9,61 3,41 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T019- 0,00 9,79 3,43 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T019- 0,00 4,45 2,45 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T019- 0,00 9,43 3,38 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T020- 0,00 9,73 3,42 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T021- 0,00 4,27 2,40 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T022- 0,00 9,31 3,37 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T023- 0,00 5,11 2,61 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T023- 0,00 9,91 3,45 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T027- 0,00 4,81 2,54 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T027- 0,00 0,00 0,00 19,11 4,33 0,00 0,00
E011-T028- 0,00 3,06 2,02 143,48 7,17 0,00 0,00
E011-T029- 0,00 7,93 3,16 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T029- 0,00 10,09 3,47 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T030- 0,00 8,83 3,30 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T030- 0,00 9,01 3,32 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T031- 0,00 9,55 3,40 7,41 3,07 0,00 0,00
E011-T032- 0,00 8,71 3,28 0,00 0,00 0,00 0,00
EO11-TO33- 0,00 7,09 3,02 0,00 0,00 0,00 0,00
EO11-TO33- 0,00 6,97 2,99 0,00 0,00 0,00 0,00
EO11-TO33- 0,00 8,29 3,22 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T034- 0,00 8,77 3,29 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T034- 0,00 0,00 0,00 7,10 3,02 0,00 0,00
EO11-TO35- 0,00 9,49 3,39 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T037- 0,00 0,00 0,00 6,98 3,00 0,00 0,00
E011-T038- 0,00 9,01 3,32 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T038- 0,00 8,41 3,23 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T039- 0,00 8,83 3,30 0,00 0,00 0,00 0,00
E011-T039- 0,00 10,52 3,53 0,00 0,00 0,00 0,00
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4767/5200
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4771/5200
525/540
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4772/5200
526/540
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4774/5200
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4776/5200
530/540
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4777/5200
531/540
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4778/5200
532/540
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Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4779/5200
533/540
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E012-T016- 2,93677922 20,7300934 2,46460666 0 - 0
E014-T044- 2,95407984 0 - 76,9774807 4,30164363 0
E013-T056- 2,99733137 19,3480872 2,34778410 0 - 0
E014-T077- 3,00165652 0 - 36,8046666 3,23989508 0
E013-T046- 3,01463199 0 - 20,6987975 2,43427544 0
E013-T071- 3,01463199 20,5498317 2,42433695 0 - 0
E013-T019- 3,02328229 18,5669532 2,28197426 0 - 0
E014-T073- 3,03193260 18,0261682 2,23844161 0 - 0
E014-T057- 3,03625775 15,8029408 2,05762353 0 - 0
E014-T030- 3,04490806 16,9445981 2,14937079 0 - 0
E014-T045- 3,04923321 14,4810218 1,93478005 479,379251 6,89038129 0
E012-T075- 3,05788352 20,3094828 2,39269622 0 - 0
E012-T030- 3,07950929 20,1292211 2,37277205 0 - 0
E012-T002- 3,08815959 42,1211464 3,39887211 20,2701242 2,37930503 0
E014-T014- 3,10978536 16,7042492 2,10696070 0 - 0
E012-T078- 3,12708598 18,8073021 2,26283699 0 - 0
E014-T032- 3,12708598 19,1077383 2,28455541 0 - 0
E014-T002- 3,13141113 18,3266043 2,22588164 0 - 0
E012-T020- 3,14006144 21,1507040 2,41962847 0 - 0
E013-T020- 3,15303690 16,8845109 2,10647206 95,2267164 4,53419890 0
E014-T042- 3,16168720 0 - 21,6786222 2,44609255 0
E012-T006- 3,16601236 9,97447975 1,39741352 41,8875074 3,36381844 0
E014-T077- 3,19196328 18,9274766 2,24906105 54,4415118 3,72526861 0
E014-T049- 3,22223935 18,3266043 2,19450791 0 - 0
E013-T061- 3,22656451 0 - 21,8011003 2,43154607 0
E013-T038- 3,23521481 0 - 29,8234153 2,86351967 0
E013-T007- 3,23953997 0 - 35,5186466 3,10665366 0
E014-T030- 3,26116574 13,4595389 1,76270147 68,5877314 4,02951290 0
E014-T034- 3,26549089 0,18026168 - 315,074891 6,21141084 0
E011-T013- 3,27846635 19,4682616 2,25822293 0 - 0
E014-T034- 3,30009212 20,8502679 2,34521149 0 - 0
E012-T006- 3,30441727 17,1849470 2,07885487 0 - 0
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4780/5200
534/540
E013-T080- 3,30441727 13,9402367 1,79531316 16,2895862 2,00601349 0
E014-T035- 3,30441727 0 - 49,4811491 3,55185490 0
E012-T047- 3,32171788 20,3695701 2,30588108 7,04249028 0,89603738 0 -2,1116049
E012-T014- 3,34334365 19,1077383 2,21087280 0 - 0
E014-T023- 3,34766881 17,7257320 2,10670817 0 - 0
E014-T073- 3,34766881 22,2322741 2,41781643 0 - 0
E012-T074- 3,38227003 20,1893084 2,27358621 0 - 0
E013-T073- 3,38659519 27,0993395 2,67936274 5,20531890 0,50040378 0
E012-T052- 3,44282218 21,0305296 2,30995587 0 - 0
E014-T017- 3,53365041 24,2752398 2,47897973 0 - 0
E013-T062- 3,56825163 8,59247352 1,07026075 22,8421641 2,38380116 0
E011-T077- 3,63312894 27,7002118 2,63100264 126,274912 4,77981743 0
E012-T030- 3,64177924 21,2107912 2,25851097 0 - 0
E011-T022- 3,65475470 20,4296573 2,20283173 0 - 0
E013-T014- 3,66340501 19,2279127 2,11689182 0 - 0
E013-T056- 3,73260747 19,8287850 2,13787151 11,8803749 1,44446741 0
E013-T028- 3,77153385 21,9919252 2,26860226 173,735173 5,19457312 0
E011-T062- 3,77585900 68,9801370 3,87311334 333,262888 6,12907913 0
EO13-TO15- 3,77585900 7,03020560 0,74967668 56,5848784 3,59185786 0
E014-T060- 3,80613508 19,1678255 2,06910644 0 - 0
E014-T014- 3,84938661 0 - 58,3608107 3,61363661 0
E013-T010- 3,90128845 18,6270405 2,00160968 0 - 0
E014-T002- 3,90993876 4,80697819 0,24208258 63,4436516 3,71426130 0
E014-T057- 3,90993876 19,5884361 2,06805731 0 - 0
E014-T019- 3,92291422 25,0563738 2,40405181 10,9617892 1,28084869 0
E013-T029- 3,9531903 19,5884361 2,05540429 0 - 0
E014-T073- 3,96616576 35,5716386 2,88052094 0 - 0
E011-T077- 3,97481606 10,2148286 1,17269248 63,4436516 3,69532315 0
E011-T073- 3,98779152 21,0305296 2,14303110 6,61381696 0,61021872 0
E012-T011- 4,00509214 20,5498317 2,10620807 0 - 0
E011-T009- 4,03536821 9,49378193 1,05936553 66,3831258 3,74221816 0
EO13-TO51- 4,09592036 25,6572461 2,38711311 0 - 0
E014-T044- 4,19972404 0 - 22,8421641 2,19700822 0
E013-T065- 4,29920258 0 - 62,1576316 3,57510988 0
E012-T005- 4,66251547 0 - 29,7621763 2,44164258 0
E012-T057- 4,66684062 12,0174454 1,19982983 98,5948639 4,13545481 0
E013-T006- 4,80957069 26,2581183 2,23018251 0 - 0
E012-T032- 4,93500014 0 - 32,3342162 2,48968383 0
E014-T026- 5,13395720 28,3010841 2,25606403 0 - 0
E013-T007- 5,17288358 0 - 55,5438146 3,19535272 0
E013-T022- 5,19883450 49,9324859 3,03851724 300,438759 5,60372413 0
E013-T020- 5,30696334 28,3611713 2,21889207 0 - 0
E012-T028- 5,91680998 8,83282243 0,50749876 31,4156305 2,22851090 0
E014-T073- 6,03791428 9,55386916 0,58455215 36,9271447 2,43001091 0
E014-T042- 6,12874251 440,920074 5,95399404 52,4818623 2,90733018 0
E012-T061- 6,20659527 8,89290965 0,45707707 54,1353166 2,93558699 0
E012-T076- 6,41420264 24,2752398 1,76936133 102,146728 3,79826270 0
E014-T057- 6,42717810 30,7646604 2,09653651 6,24638268 - 0
E012-T046- 6,57855847 0 - 125,968717 4,06640582 0
E014-T068- 6,60018424 29,5629158 2,00767589 0 - 0
E012-T077- 6,81644191 9,97447975 0,48956861 262,593029 5,07565637 0
E014-T029- 7,01972413 15,5025046 1,04106049 105,576115 3,73218773 0
E014-T012- 7,59929470 0 - 36,4984713 2,12454154 0
E012-T021- 8,26104318 19,1077383 1,11850420 125,785000 3,77506555 0
E013-T021- 8,74546037 9,07317134 0,04771571 84,0812100 3,12603830 0
E013-T057- 9,57588985 28,1809096 1,46424580 135,583247 3,69092958 0
E014-T017- 15,0472090 87,0663925 2,45626916 261,858160 4,03389021 0
Tabela 19. Construtos com enriquecimentos particularmente notáveis nas bibliotecas la e 1.1a.
BlockSequence
P3 P4
Gene Receptor de Contém Gene Receptor de Contém
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535/540
citocina? motivo de ITAM? citocina? motivo de ITAM?
M001-S116-S044 IL6R S N CD8B N N
M024-S192-S045 MYD88 N N CD8B N N
M001-S047-S102 CD27 S N IL1RL1 S N
M048-S195-S043 MYD88 N N CD8A N N
M012-S216-S211 TNFRSF18 S N TNFRSF4 S N
M030-S170-S194 IL3 IRA S N MYD88 N N
Tabela 20. Construtos com enriquecimentos particularmente notáveis nas bibliotecas 2b e2.1b.
P3 P4
BlockSequence Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM? Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM?
M007-S049-S051 CD28 N N CD40 S N
M007-S050-S039 CD40 S N CD3G N S
M012-S050-S043 CD40 S N CD8A N N
M012-S161-S213 IL22RA1 S N TNFRSF9 S N
M030-S142-S049 IL13RA2 S N CD28 N N
M001-S145-S130 IL17RB S N IL10RB S N
M018-S085-S039 IFNGR2 S N CD3G N S
M018-S075-S053 FCGR2C S S CD79B N S
M012-S135-S074 IL11RA S N FCER1G S S
M007-S214-S077 TNFRSF14 S N GHR S N
Tabela 21. Construtos com enriquecimentos particularmente notáveis nas bibliotecas 3a e 3.1a.
P3 P4
BlockSequence Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM? Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM?
E008/E013-T041-SI86-S050 MPL S N CD40 S N
E006/E011-T077-S186-S211 MPL S N TNFRSF4 S N
E007/E012-T021-S186-S051 MPL s N CD40 s N
E009/E014-T041-S186-S053 MPL s N CD79B N S
E007/E012-T073-S186-S053 MPL s N CD79B N S
E006/E011 -TO17-S186-S051 MPL s N CD40 S N
E006/E011-T031-SI86-S211 MPL s N TNFRSF4 S N
E006/E011-TO 11-SI86-S050 MPL s N CD40 S N
E006/E011-TO 11-S186-S047 MPL s N CD27 S N
E007/E012-T001-S186-S050 MPL s N CD40 S N
E006/E011-T041-SI86-S051 MPL s N CD40 S N
E008/E013 -T028-S186-S076 MPL s N FCGR2A S S
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E009/E014-T029-S199-S053 OSMR S N CD79B N S
E009/E014-T062-S186-S216 MPL s N TNFRSF18 S N
E007/E012-T006-S058-S051 CSF2RA s N CD40 S N
E009/E014-T076-S186-S211 MPL s N TNFRSF4 S N
E007/E012-T001-S186-S047 MPL s N CD27 S N
Tabela 22. Construtos com enriquecimentos particularmente notáveis nas bibliotecas 3b e3.1b.
P3 P4
BlockSequence Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM? Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM?
E007/E012-T017-S186-S051 MPL S N CD40 S N
E007/E012-T073-S186-S053 MPL S N CD79B N S
E008/E013-T028-S186-S047 MPL s N CD27 S N
E006/E011-TO 11-S186-S047 MPL s N CD27 S N
E007/E012-T082-S176-S214 LEPR s N TNFRSF14 S N
E006/E011-T046-S186-S052 MPL s N CD79A N S
E008/E013-T029-S186-S052 MPL s N CD79A N S
E009/E014-T011-S186-S053 MPL s N CD79B N S
E008/E013-T032-S186-S039 MPL s N CD3G N S
E007/E012-T034-S186-S051 MPL s N CD40 S N
E007/E012-T041-S192-S213 MYD88 N N TNFRSF9 S N
E006/E011 -TO14-S069-S213 EPOR S N TNFRSF9 S N
E006/E011-T022-S186-S053 MPL S N CD79B N S
E006/E011-T023-S115-S075 IL5RA s N FCGR2C S S
E006/E011-T029-S106-S213 IL2RG s N TNFRSF9 S N
E006/E011-T032-S155-S080 IL18RAP s N ICOS N N
E006/E011-T041-SI86-S216 MPL s N TNFRSF18 S N
E006/E011-T057-S13 5-S080 IL11RA s N ICOS N N
E006/E011-T072-S191-X002 MYD88 N N N/A N N
E006/E011-T077-S186-S216 MPL S N TNFRSF18 S N
E006/E011-T080-S141-S080 IL13RA1 S N ICOS N N
E007/E012-TOO 1-X001-S214 N/A N N TNFRSF14 S N
E007/E012-T007-S059-S211 CSF2RA S N TNFRSF4 S N
E007/E012-T016-S186-S052 MPL S N CD79A N S
E007/E012-T031-S186-S053 MPL S N CD79B N S
E007/E012-T044-S102-S052 IL1RL1 S N CD79A N S
E007/E012-T044-S142-X002 IL13RA2 S N N/A N/A N/A
E007/E012-T055-S069-S053 EPOR S N CD79B N S
E007/E012-T063-S176-S216 LEPR S N TNFRSF18 S N
E007/E012-T065-S157-S075 IL20RB S N FCGR2C S S
E008/E013-T008-S085-X002 IFNGR2 s N N/A N/A N/A
E008/E013-TO 11-S085-S048 IFNGR2 s N CD28 N N
E008/E013-T021-S109-X002 IL3RA s N N/A N/A N/A
E008/E013-T021-S168-S211 IL27RA s N TNFRSF4 S N
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E008/E013-T032-S064-S214 CSF3R S N TNFRSF14 S N
E008/E013-T037-S170-S215 IL3 IRA s N TNFRSF18 S N
E008/E013-T038-S176-S048 LEPR s N CD28 N N
E008/E013-T039-S137-S216 IL12RB1 s N TNFRSF18 S N
E008/E013-T041-S141-S053 IL13RA1 s N CD79B N S
E008/E013-T045-S177-S048 LEPR s N CD28 N N
E008/E013-T048-S109-S074 IL3RA s N FCER1G S S
E008/E013-T073-SI99-S075 OSMR s N FCGR2C S S
E009/E014-T001-S157-S074 IL20RB s N FCER1G S S
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E009/E014-T011-S130-X002 IL10RB S N N/A N/A N/A
E009/E014-TO13 -S15 5 -X002 IL18RAP S N N/A N/A N/A
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E007/E012-T072-S192-S053 MYD88 N N CD79B N S
E006/E011-T065 -X001-S051 N/A N/A N/A CD40 S N
E007/E012-T030-S062-X002 CSF3R S N N/A N/A N/A
E007/E012-T073 -S186-X002 MPL S N N/A N/A N/A
E009/E014-T056-S186-S053 MPL S N CD79B N S
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E006/E011 -TO 16-S13 6-S076 IL12RB1 S N FCGR2A S S
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4784/5200
538/540
E007/E012-T032-S142-S037 IL13RA2 S N CD3D N S
E007/E012-T065-S120-S215 IL7R s N TNFRSF18 S N
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E008/E013-T041-SI86-S03 9 MPL s N CD3G N S
E009/E014-T021-S186-S047 MPL s N CD27 S N
E008/E013-T026-S137-S214 IL12RB1 s N TNFRSF14 S N
E007/E012-T029-S116-S075 IL6R s N FCGR2C S S
E008/E013-T026-S106-S049 IL2RG s N CD28 N N
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E007/E012-T043-SI86-S051 MPL s N CD40 S N
E008/E013-T066-S130-S075 IL 1 ORB s N FCGR2C S S
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E006/E011 -TO 10-S13 0-X002 IL 1 ORB s N N/A N/A N/A
E009/E014-T065-S083-S215 IFNAR2 s N TNFRSF18 S N
E007/E012-T041-S130-S075 IL 1 ORB s N FCGR2C S S
E007/E012-T044-S199-S053 OSMR s N CD79B N S
E007/E012-T075-S059-X002 CSF2RA s N N/A N/A N/A
E008/E013-T015-S170-S214 IL3 IRA s N TNFRSF14 S N
E006/E011-T03 0-X001-S076 N/A N/A N/A FCGR2A S S
E009/E014-T072-S186-X002 MPL s N N/A N/A N/A
E008/E013-T032-S176-S211 LEPR s N TNFRSF4 S N
E009/E014-T075-S136-S052 IL12RB1 s N CD79A N S
E007/E012-T041-S186-S052 MPL s N CD79A N S
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E007/E012-T044-S186-S051 MPL s N CD40 S N
E007/E012-T014-S058-X002 CSF2RA s N N/A N/A N/A
E008/E013-T001-SI86-S075 MPL s N FCGR2C S S
E009/E014-T029-S137-X002 IL12RB1 s N N/A N/A N/A
E006/E011-T004-S194-S038 MYD88 N N CD3E N S
E007/E012-T016-S186-X002 MPL s N N/A N/A N/A
E009/E014-T031-S186-S075 MPL s N FCGR2C S S
E009/E014-T069-S137-S039 IL12RB1 s N CD3G N S
E007/E012-T049-S143-S216 IL15RA s N TNFRSF18 S N
E007/E012-T028-S186-S053 MPL s N CD79B N S
E008/E013-T011-S186-S037 MPL s N CD3D N S
E009/E014-T031-S186-S039 MPL s N CD3G N S
E009/E014-T020-S186-S050 MPL s N CD40 S N
E008/E013-T016-S186-X002 MPL s N N/A N/A N/A
E009/E014-T046-S186-S053 MPL s N CD79B N S
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4785/5200
539/540
Tabela 23. Construtos com enriquecimentos particularmente notáveis nas bibliotecas 4b e 4.1b.
P3 P4
BlockSequence Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM? Gene Receptor de citocina? Contém motivo de ITAM?
E007/E012-T078-S154-S047 IL18R1 S N CD27 S N
E008/E013-T062-S186-X002 MPL S N N/A N/A N/A
E008/E013-T055-S186-S050 MPL s N CD40 S N
E009/E014-T057-S186-S050 MPL s N CD40 S N
E007/E012-T077-S054-S053 CRLF2 s N CD79B N S
E007/E012-T034-S135-S211 IL11RA s N TNFRSF4 S N
E009/E014-T071-X001-S216 N/A N/A N/A TNFRSF18 S N
E009/E014-T011-S141-S037 IL13RA1 S N CD3D N S
E008/E013-T041-S186-S037 MPL S N CD3D N S
E006/E011-T038-S106-S039 IL2RG S N CD3G N S
E006/E011 -TO 11 -S121-X002 IL7R S N N/A N/A N/A
E007/E012-T007-S085-S215 IFNGR2 S N TNFRSF18 S N
E006/E011-T041-SI86-S050 MPL S N CD40 S N
E007/E012-T008-S064-S051 CSF3R S N CD40 S N
E006/E011-T041-S186-S047 MPL S N CD27 S N
E008/E013 -T045-S186-S051 MPL S N CD40 S N
E008/E013-T003-S104-S216 IL2RA S N TNFRSF18 S N
E006/E011 -TO 19-S186-S053 MPL S N CD79B N S
E008/E013-T071-S064-S080 CSF3R S N ICOS N N
E006/E011-T021-S054-X002 CRLF2 S N N/A N/A N/A
E006/E011-T003 -S13 5 -X002 IL11RA s N N/A N/A N/A
E009/E014-T020-S199-S213 OSMR s N TNFRSF9 S N
E008/E013 -T027-S121-S211 IL7R s N TNFRSF4 S N
E009/E014-T032-S195-X002 MYD88 N N N/A N/A N/A
E009/E014-T050-S171-X002 IL3 IRA S N N/A N/A N/A
E008/E013-T069-S083-X002 IFNAR2 S N N/A N/A N/A
E008/E013-T026-S116-S038 IL6R S N CD3E N S
E009/E014-T072-S195-X002 MYD88 N N N/A N/A N/A
E007/E012-T047-S058-S211 CSF2RA S N TNFRSF4 S N
E008/E013-T046-S142-S080 IL13RA2 S N ICOS N N
E006/E011-T065-S186-S076 MPL S N FCGR2A S S
E006/E011-T062-S069-X002 EPOR S N N/A N/A N/A
E007/E012-T047-S098-X002 IL1R1 S N N/A N/A N/A
E009/E014-T069-S099-S048 IL1R1 S N CD28 N N
E008/E013-T039-S141-S050 IL13RA1 S N CD40 S N
E006/E011-T052-S130-S052 IL10RB S N CD79A N S
E008/E013 -T041 -S186-X002 MPL s N N/A N/A N/A
E007/E012-T019-S120-X002 IL7R s N N/A N/A N/A
E008/E013-T045-S186-S053 MPL s N CD79B N S
E006/E011-T003-S170-S039 IL3 IRA s N CD3G N S
E007/E012-T047-S058-S051 CSF2RA s N CD40 S N
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4786/5200
540/540
E007/E012-T069-S109-X002 IL3RA S N N/A N/A N/A
E009/E014-T019-S130-S075 IL 1 ORB s N FCGR2C S S
E006/E011-T047-S054-S053 CRLF2 s N CD79B N S
Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4787/5200

Claims (71)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uso de uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação na fabricação de um kit para modificar geneticamente uma célula T em repouso ou célula NK em repouso de um sujeito caracterizado pelo fato de que o uso do kit compreende:
    colocar a célula T ou célula NK ex vivo em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um elemento de pseudotipagem em uma superfície e um elemento de ligação de célula T ligado à membrana na superfície, em que o dito contato facilita a transdução da célula T ou célula NK pela partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, produzindo, assim, uma célula T ou célula NK geneticamente modificada, e em que o contato é realizado por entre 1 e 12 horas.
  2. 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado por entre 1 e 6 horas.
  3. 3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação de célula T ligado à membrana é scFvFc anti-CD3.
  4. 4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligado de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo de célula T, e em que as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são capazes de sobrevivência em cultura ex vivo pelo menos 7 dias na ausência de um alvo para um ASTR do CAR e na ausência de citocinas exógenas.
  5. 5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o elemento linfoproliferativo de célula T compreende um receptor de citocina quimérico.
  6. 6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 aglutinado ao receptor de IL-7 alfa ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para promover a proliferação de células T e/ou células NK, e em que o receptor de citocina quimérico é constitutivamente ativo.
  7. 7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o receptor de
    Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4238/5200
    2/10 citocina quimérico compreende IL-7 covalentemente ligado a um fragmento extracelular funcional do receptor de IL-7 capaz de se ligar a IL-7, um domínio transmembranar de receptor de IL-7 e um domínio de sinalização de receptor de IL-7.
  8. 8. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o CAR é um MRB-CAR.
  9. 9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação consiste em partículas lentivirais, e em que a célula geneticamente modificada é uma célula T geneticamente modificada.
  10. 10. Célula T ou célula NK geneticamente modificada caracterizada pelo fato de que é produzida através de transdução de células T em repouso e/ou células NK em repouso, de acordo com um método que compreende colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso ex vivo em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um elemento de ligação de célula T ligado à membrana em sua superfície, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas, e em que o contato é realizado por entre 1 e 12 horas.
  11. 11. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o contato é realizado por entre 1 e 6 horas.
  12. 12. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o elemento de ligação de célula T ligado à membrana é scFvFc anti-CD3.
  13. 13. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo de célula T, e em que as células T e/ou células NK
    Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4239/5200
    3/10 geneticamente modificadas são capazes de sobrevivência em cultura ex vivo por pelo menos 7 dias na ausência de um alvo para um ASTR do CAR e na ausência de citocinas exógenas.
  14. 14. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o CAR é um MRB-CAR.
  15. 15. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende adicionalmente um ou mais dentre uma sequência relacionada a Kozak, um elemento de WPRE e uma sequência de múltiplas interrupções.
  16. 16. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o elemento linfoproliferativo de célula T compreende um receptor de citocina quimérico.
  17. 17. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma da reivindicação 10 a 16, caracterizada pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação é uma partícula lentiviral, e em que a célula geneticamente modificada é uma célula T.
  18. 18. Método para transduzir um linfócito com uma partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação caracterizado pelo fato de que compreende:
    A. cultivar uma célula de empacotamento em suspensão em meios livres de soro, em que a célula de empacotamento compreende sequências de ácido nucleico que codificam um genoma de RNA empacotável da partícula retroviral incompetente em replicação, uma proteína REV, um polipeptídeo gag, um polipeptídeo pol e um elemento de pseudotipagem;
    B. coletar a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação dos meios livres de soro; e
    C. colocar o linfócito em contato com a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, em que o contato é realizado por menos que 12 horas, transduzindo, assim, o linfócito.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a célula de empacotamento compreende adicionalmente ácidos nucleicos que codificam um elemento de ativação.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o elemento
    Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4240/5200
    4/10 de ativação é um anticorpo anti-CD3.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD3 é um scFvFc anti-CD3.
  22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a célula de empacotamento é uma célula imortalizada que compreende ácidos nucleicos estavelmente integrados na mesma, que codifica o genoma de RNA empacotável.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo gag e o polipeptídeo pol são expressados a partir de um ou mais promotores induzíveis e em que o método compreende adicionalmente, durante a cultura, adicionar um transativador para induzir a expressão do polipeptídeo gag e do polipeptídeo pol a partir do um ou mais promotores induzíveis.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR).
  25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o CAR é um MRB-CAR.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um elemento linfoproliferativo.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado por entre 1 e 12 horas.
  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o linfócito é capaz de se expandir in vitro na ausência de qualquer citocina exógena.
  29. 29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 28, caracterizado pelo fato de que o linfócito é uma célula T em repouso e em que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação é uma partícula lentiviral.
    Petição 870190086255, de 02/09/2019, pág. 4241/5200
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  30. 30. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação caracterizada pelo fato de que compreende:
    A. um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um receptor de antígeno quimérico (CAR); e
    B. um elemento de pseudotipagem e um elemento de ativação de célula T em sua superfície, em que o elemento de ativação de célula T não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, e em que o elemento de ativação de célula T é um anticorpo de scFvFc anti-CD3.
  31. 31. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que as partículas retrovirais incompetentes em replicação compreendem adicionalmente um polipeptídeo ligado à membrana capaz de se ligar a CD28.
  32. 32. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de scFvFc anti-CD3 é fundido a uma sequência de ligação de âncora de GPI heteróloga.
  33. 33. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais unidades transcricionais codificam adicionalmente um elemento linfoproliferativo.
  34. 34. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o CAR e o elemento linfoproliferativo são expressados como polipeptídeos separados.
  35. 35. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o elemento linfoproliferativo é um elemento linfoproliferativo quimérico.
  36. 36. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o elemento linfoproliferativo quimérico é um receptor de citocina quimérico constitutivamente ativo, e em que a expressão do receptor de citocina quimérico constitutivamente ativo está sob o controle de um elemento de controle.
  37. 37. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a
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    6/10 reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o receptor de citocina quimérico compreende um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-7, um domínio de sinalização intracelular de um IL-12 receptor, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL15, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-21, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-23, um domínio de sinalização intracelular de um receptor de IL-27, um domínio de sinalização intracelular de um receptor chamariz de fator de crescimento de transformação β (ΤΘΡβ) ou CD28.
  38. 38. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o elemento linfoproliferativo quimérico compreende um receptor de citocina e o receptor de citocina compreende IL-7 aglutinado para o receptor de IL-7 ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para promover proliferação de células T e/ou células NK, e em que o receptor de citocina quimérico é constitutivamente ativo.
  39. 39. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 covalentemente ligado a um fragmento extracelular funcional do receptor de IL-7 capaz de ligação a IL-7, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização de receptor de IL-7.
  40. 40. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende adicionalmente um ou mais de uma sequência relacionada a Kozak, um elemento de WPRE e uma sequência de múltiplas interrupções.
  41. 41. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com as reivindicações 30 a 39, caracterizada pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação é uma partícula lentiviral e o promotor é ativo em células T.
  42. 42. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligadas de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo quimérico constitutivamente ativo, e em que o elemento linfoproliferativo quimérico não compreende uma citocina aglutinada ao seu receptor
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    7/10 cognato ou aglutinada a um fragmento de seu receptor cognato.
  43. 43. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o elemento linfoproliferativo quimérico compreende um receptor de citocina quimérico.
  44. 44. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a expressão do elemento linfoproliferativo quimérico constitutivamente ativo é sob o controle de um elemento de controle.
  45. 45. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende adicionalmente um elemento de pseudotipagem em sua superfície.
  46. 46. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende adicionalmente um elemento de ativação de célula T em sua superfície, em que o elemento de ativação de célula T não é codificado por um polinucleotídeo na partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação.
  47. 47. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o elemento de ativação de célula T é um anticorpo anti-CD3.
  48. 48. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o elemento de ativação de célula T é um scFvFc anti-CD3.
  49. 49. Partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação, de acordo com as reivindicações 42 a 47, caracterizada pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação é uma partícula lentiviral e em que o promotor é ativo em células T.
  50. 50. Célula T ou célula NK geneticamente modificada em que a célula T ou célula NK é caracterizada pelo fato de que expressa um primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado que compreende um elemento linfoproliferativo quimérico constitutivamente ativo que não compreende uma citocina aglutinada ao seu receptor cognato ou aglutinada a um fragmento de seu receptor cognato, e um segundo polipeptídeo de sinalização geneticamente
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    8/10 modificado que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) que inclui uma região de alvejamento específico para antígeno (ASTR), um domínio transmembranar e um domínio de ativação intracelular.
  51. 51. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a expressão do primeiro polipeptídeo de sinalização geneticamente modificado está sob o controle de um elemento de controle.
  52. 52. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula T.
  53. 53. Célula T ou célula NK geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que o CAR é um MRB-CAR.
  54. 54. Método para transduzir células T em repouso e/ou células NK em repouso caracterizado pelo fato de que compreende colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso ex vivo, em contato com partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um elemento de ligação de célula T ligado à membrana em sua superfície, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, células T e/ou células NK geneticamente modificadas, e em que o contato é realizado por entre 1 e 12 horas.
  55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado por entre 1 e 6 horas.
  56. 56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação de célula T ligado à membrana é scFvFc anti-CD3.
  57. 57. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligado de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo de célula T, e em que as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são capazes de sobrevivência em cultura ex vivo pelo
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    9/10 menos 7 dias na ausência do alvo para um ASTR do CAR e na ausência de citocinas exógenas.
  58. 58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o elemento linfoproliferativo de célula T compreende um receptor de citocina quimérico.
  59. 59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 aglutinado ao receptor de IL-7 alfa ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para promover a proliferação de células T e/ou células NK, e em que o receptor de citocina quimérico é constitutivamente ativo.
  60. 60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 covalentemente ligado a um fragmento extracelular funcional do receptor de IL-7 capaz de se ligar a IL-7, um domínio transmembranar de receptor de IL-7 e um domínio de sinalização de receptor de IL-7.
  61. 61. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o CAR é um MRB-CAR.
  62. 62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 61, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação consiste em partículas lentivirais, e em que a célula geneticamente modificada é uma célula T geneticamente modificada.
  63. 63. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que entre 10% e 50% das células T em repouso e/ou células NK em repouso são transduzidas.
  64. 64. Método para transduzir células T em repouso e/ou células NK em repouso caracterizado pelo fato de que colocar as células T em repouso e/ou células NK em repouso ex vivo em contato com as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação em uma mistura de reação de transdução, em que as partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação compreendem um elemento de pseudotipagem em sua superfície e um anticorpo de scFvFc anti-CD3 ligado à membrana em sua superfície, em que o dito contato facilita a transdução das células T e/ou células NK em repouso pelas partículas retrovirais recombinantes incompetentes em replicação, produzindo, assim, as células T e/ou células NK geneticamente modificadas.
  65. 65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a transdução é executada por entre 1 hora e 20 horas.
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    10/10
  66. 66. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação compreende um polinucleotídeo que compreende uma ou mais unidades transcricionais ligado de modo operacional a um promotor ativo em células T e/ou células NK, em que a uma ou mais unidades transcricionais codificam um primeiro polipeptídeo que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um segundo polipeptídeo que compreende um elemento linfoproliferativo de célula T, e em que as células T e/ou células NK geneticamente modificadas são capazes de sobrevivência em cultura ex vivo pelo menos 7 dias na ausência do alvo para um ASTR do CAR e na ausência de citocinas exógenas.
  67. 67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o elemento linfoproliferativo de célula T compreende um receptor de citocina quimérico.
  68. 68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 aglutinado ao receptor de IL-7 alfa ou um fragmento do mesmo que retém a capacidade para promover a proliferação de células T e/ou células NK, e em que o receptor de citocina quimérico é constitutivamente ativo.
  69. 69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o receptor de citocina quimérico compreende IL-7 covalentemente ligado a um fragmento extracelular funcional do receptor de IL-7 capaz de se ligar a IL-7, um domínio transmembranar de receptor de IL-7 e um domínio de sinalização de receptor de IL-7.
  70. 70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 69, caracterizado pelo fato de que a partícula de retrovirus recombinante incompetente em replicação consiste em partículas lentivirais, e em que a célula geneticamente modificada é uma célula T geneticamente modificada.
  71. 71. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que entre 10% e 50% das células T em repouso e/ou células NK em repouso são transduzidas.
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