CZ296981B6 - Zpusob pro identifikaci mikroorganizmu, zpusob identifikování genu, mikroorganizmus, vakcína a zpusob její prípravy, zpusob získání mutantního mikroorganizmu, zpusob prípravy farmaceutického prostredku, zpusob identifikace slouceniny a zpusob príprav - Google Patents

Zpusob pro identifikaci mikroorganizmu, zpusob identifikování genu, mikroorganizmus, vakcína a zpusob její prípravy, zpusob získání mutantního mikroorganizmu, zpusob prípravy farmaceutického prostredku, zpusob identifikace slouceniny a zpusob príprav Download PDF

Info

Publication number
CZ296981B6
CZ296981B6 CZ0175597A CZ175597A CZ296981B6 CZ 296981 B6 CZ296981 B6 CZ 296981B6 CZ 0175597 A CZ0175597 A CZ 0175597A CZ 175597 A CZ175597 A CZ 175597A CZ 296981 B6 CZ296981 B6 CZ 296981B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
microorganism
gene
spp
dna
mutant
Prior art date
Application number
CZ0175597A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ175597A3 (en
Inventor
William Holden@David
Elizabeth Shea@Jacqueline
Hensel@Michael
Original Assignee
Imperial College Innovations Limited
Microscience Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9424921.6A external-priority patent/GB9424921D0/en
Priority claimed from GBGB9501881.8A external-priority patent/GB9501881D0/en
Priority claimed from GBGB9509239.1A external-priority patent/GB9509239D0/en
Application filed by Imperial College Innovations Limited, Microscience Limited filed Critical Imperial College Innovations Limited
Publication of CZ175597A3 publication Critical patent/CZ175597A3/cs
Publication of CZ296981B6 publication Critical patent/CZ296981B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/255—Salmonella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Zpusob identifikace mikroorganizmu a zpusobu identifikace genu podílejících se na adaptaci mikroorganizmu na specifické prostredí, a zejména identifikace genu odpovedných za virulenci patogenního mikroorganizmu. Mikroorganizmus získaný za pouzití techto zpusobu, vakcína obsahující tento mikroorganizmus a zpusob její prípravy, gen získaný za pouzití zpusobu podle vynálezu, zpusob získání mutantního mikroorganizmu, zpusob prípravy farmaceutického prostredku na bázi uvedeného mutantního mikroorganizmu. Dále je popsán zpusob identifikace slouceniny, která snizuje schopnost mikroorganizmu se adaptovat na specifické prostredí a zpusob prípravy léciva k zabránení nebo zmírnení infekce zpusobené mikroorganizmem.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu identifikace mikroorganizmů a způsob identifikace genů podílejících se na adaptaci mikroorganizmu na specifické prostředí, a zejména identifikace genů odpovědných za virulenci patogenního mikroorganizmu. Dále vynález zahrnuje mikroorganizmus získaný za použití těchto způsobů, vakcínu obsahující tento mikroorganizmus a způsob její přípravy, gen získaný za použití způsobu podle vynálezu, způsob získání mutantního mikroorganizmu, způsob přípravy farmaceutického prostředku na bázi uvedeného mutantního mikroorganizmu. Dále zahrnuje vynález způsob identifikace sloučeniny, která snižuje schopnost mikroorganizmu se adaptovat na specifické prostředí a způsob přípravy léčiva k zabránění nebo zmírnění infekce způsob mikroorganizmem.
Dosavadní stav techniky
Rezistence (odolnost) k antibiotikům u bakteriálních a jiných patogenů se stává stále důležitější. Je proto významné najít no terapeutické přístupy pro narušení patogenních organizmů.
Patogenní mikroorganizmy se musí vyhnout obranným mechanismům hostitele a musí být schopny růst v prostředí chudém na živiny, aby mohla proběhnout infekce. Aby bylo toto možné, je potřeba mnoha genů virulence.
Geny virulence byly zjištěny pomocí klasické genetiky, přičemž bylo využito mnoha postupů mutageneze transposonů pro identifikaci bakteriálních genů virulence. Například, mutanty ztráta železem regulovaných proteinů (Holland a kol., 1992), nebo v testu pro studium penetrace epiteliálních buněk (Finay a kol., 1988) a přežití v buňkách makrofágů (Fields a kol., 1989; Miller a kol., 1989a; Groisman a kol., 1989). Transposonové mutanty byly také testovány na změněnou virulenci v živých zvířecích modelech infekce (Miller a kol., 1989b). Tento přístup měl výhodu v tom, ze mohly být identifikovány geny, které jsou významné v různých stádiích infekce, ale byl významně omezen potřebou individuálního testování široké škály mutantů na změny virulence. Miller a kol. (1989b) použili skupiny 8 až 10 myší a infikovali perorálně 95 separátních skupin různými mutanty a tak použili okolo 760 až 950 myší. Jelikož je vyžadován extrémně velký počet zvířat, rozsáhlé vyšetření bakteriálního genomu na geny virulence nebylo proveditelné.
Nově byl popsán genetický postup IVET (technika exprese in vivo), který pozitivně selektuje ty geny ze Salmonella, které jsou specificky indukovány v průběhu infekce (Mahan a kol., 1993). Technika umožňuje identifikovat ty geny, které jsou exprimovány v jednotlivých stádiích infekčního procesu. Nicméně neumožňuje identifikovat geny virulence, které jsou regulovány posttranskripčně a co je důležitější, neposkytuje informaci o tom, zda gen či geny, které byly identifikovány, jsou aktuálně vyžadovány k procesu infekce nebo k němu přispívají.
V publikaci Lee a Falkow (1994), Methods Enzymol. 236, 531-545, je popsán způsob pro identifikaci faktorů ovlivňujících invazi Salmonella do savčích buněk in vitro spočívající v izolování hyperinvazivních mutantů.
V publikaci Walsh a Čepko (1992), Science 255, 434-440, je popsán způsob pro sledování prostorového umístění progenitorových buněk cerebrálního kortexu v průběhu vývoje cerebrálního
-1 CZ 296981 B6 kortexu krys. Walsh a Cepkův způsob užívá tag (sekvenční značka), který obsahuje jedinečnou sekvenci nukleových kyselin a lacZ gen, ale není zde ukázáno, že by tento způsob mohl být použit pro identifikaci mutantů nebo genů.
V mezinárodní publikované patentové přihlášce WO 94/26933 a v publikaci Smith a kol. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 6479-6483, se popisuje metoda zaměřená na identifikaci funkčních úseků známého genu, nebo alespoň DNA molekuly, pro kterou je dostupná nějaká informace o sekvenci.
V publikaci Groisman a kol. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 1033-1037, se uvádí molekulární, funkční a evoluční analýza sekvencí specifických pro Salmonella.
V publikaci Hensel a kol. (1995) Science 269, 400-403, se popisuje současná identifikace bakteriálních genů virulence metodou negativní selekce. Tento článek byl zveřejněn v červenci 1995.
V publikaci Slauch a kol. (1994), Methods in Enzymology 235, 481-492, se popisuje technika in vivo exprese pro selekci bakteriálních genů specificky indukovaných ve tkáních hostitele.
V publikaci Pascopella a kol. (1994) Inf. Immun. 62, 1313-1319, se popisuje využití in vivo komplementace u Mycobacterium tuberculosis pro identifikaci genomových fragmentů asociovaných s virulencí.
Patent Spojených států amerických US 5 397 697 popisuje identifikaci na rostlinu reagujících genů u baktérií.
Některé geny virulence jsou již známé pro patogenní mikroorganizmy jako je Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Shigella flexneri a Listeria monocytogenes, ale ve všech případech byl identifikován pouze malý počet z celkového množství.
Choroba, kterou způsobuje Salmonella typhimurium u myší, poskytuje dobrý experimentální model tyfové horečky (Carter a Collins, 1974). Dosud bylo identifikováno přibližně čtyřicet dva genů ovlivňujících virulenci Salmonella (Groisman a Ochman, 1994). Tyto geny reprezentují přibližně jednu třetinu celkového počtu předpokládaných genů virulence (Groisman a Saier, 1990).
Podstata vynálezu
Předmětný vynález je zaměřen na metodu identifikace genů podílejících se na adaptaci mikroorganizmu na specifické prostředí, zejména vysoce účinná identifikace dalších genů virulence v patogenním mikroorganizmu. Cílem přitom bylo též snížení počtu experimentálních zvířat použitých pro identifikaci genů virulence. Kromě toho je vynález rovněž zaměřen na poskytnutí vakcín a způsobů pro screening (vyšetřování) léčiv, která redukují virulenci.
Vynález se týká způsobu pro identifikaci mikroorganizmů majících sníženou adaptaci na specifické prostředí, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kroky:
(1) vytvoření souboru mikroorganizmů, kde každý z nich je nezávisle mutován inserční inaktivací genu nukleovou kyselinou obsahující jedinečnou markerovou sekvenci tak, že každý mutant obsahuje jinou markerovou sekvenci, nebo klonů uvedených mikroorganizmů;
-2 CZ 296981 B6 (2) vytvoření jednotlivě uskladněných vzorků každého mutantu produkovaného v kroku (1) a vytvoření jednotlivě uskladněné nukleové kyseliny obsahující jedinečnou markerovou sekvenci z každého jednotlivého mutantu;
(3) vnesení souboru mutantů vytvořených v kroku (1) do tohoto specifického prostředí a umožnění růstu v tomto prostředí těm mikroorganizmům, které jsou ho schopny;
(4) získávání mikroorganizmů ze specifického prostředí nebo jeho vybrané části a izolaci nukleové kyseliny z takto získaných mikroorganizmů;
(5) porovnání libovolné markerové sekvence v nukleové kyselině izolované v kroku (4) s jedinečnou markerovou sekvencí každého jednotlivého mutantu uskladněného v kroku (2); a (6) selekci jednotlivých mutantů, které neobsahují žádnou z markerových sekvencí izolovaných v kroku (4);
kde toto prostředí není lidské tělo.
Vynález se rovněž týká způsobu pro identifikaci mikroorganizmů majících sníženou adaptaci na specifické prostředí, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kroky:
(1) vytvoření souboru mikroorganizmů, kde každý z nich je nezávisle mutován inserční inaktivací genu nukleovou kyselinou obsahující jedinečnou markerovou sekvenci tak, že každý mutant obsahuje jinou markerovou sekvenci, nebo klonů uvedených mikroorganizmů;
(2) vytvoření jednotlivě uskladněných vzorků každého mutantu produkovaného v kroku (1) a vytvoření jednotlivě uskladněné nukleové kyseliny obsahující jedinečnou markerovou sekvenci z každého jednotlivého mutantu;
(3) vnesení souboru mutantů vytvořených v kroku (1) do tohoto specifického prostředí a umožnění růstu v tomto prostředí těm mikroorganizmům, které jsou ho schopny;
(4) získávání mikroorganizmů ze specifického prostředí nebo jeho vybrané části a izolaci nukleové kyseliny z takto získaných mikroorganizmů;
(5) porovnání libovolné markerové sekvence v nukleové kyselině izolované v kroku (4) s jedinečnou markerovou sekvencí každého jednotlivého mutantu uskladněného v kroku (2); a (6) selekci jednotlivých mutantů, které neobsahují žádnou z markerových sekvencí izolovaných v kroku (4);
kde, jestliže toto specifické prostředí je diferencovaný mnohobuněčný organizmus, potom tento organizmus, je ne-lidské zvíře nebo rostlina.
Ve výhodném provedení je soubor mikroorganizmů, definovaný v kroku (1), připraven ze souboru mikroorganizmů, kde každý z nich obsahuje nukleovou kyselinu obsahující jedinečnou markerovou sekvenci, změnou jejich podmínek z prvních podmínek na druhé podmínky, přičemž (a) v prvních podmínkách je uvedená nukleová kyselina obsahující jedinečný markér udržována episomálně a (b) v druhých podmínkách uvedená nukleová kyselina obsahující jedinečnou markerovou sekvenci inserčně inaktivuje gen.
Rovněž je výhodné libovolné z výše uvedených provedení způsobu podle vynálezu, které dále obsahuje kroky:
(1A) odstranění auxotrofů ze souboru mutantů připravených v kroku (1); nebo
-3 CZ 296981 B6 (6A) určení toho, zda mutant selektovaný v kroku (6) je auxotrof; nebo jak krok (1 A), tak (6A).
Vynález rovněž zahrnuje způsob identifikování genu, který umožňuje mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje libovolný výše uvedený postup následovaný krokem:
(7) izolování inserčně inaktivovaného genu z jednotlivého mutantu izolovaného v kroku (6).
Výhodně je tento postup následován krokem zahrnujícím:
(8) izolování odpovídajícího divokého typu genu z divokého typu mikroorganizmu za použití inserčně inaktivovaného genu izolovaného v kroku (7) jako sondy.
Výhodně je specifickým prostředím diferencovaný mnohobuněčný organizmus, zejména rostlina nebo zvíře s výjimkou člověka. Zvířetem je zejména myš, krysa, králík, pes nebo opice, nejvýhodněji myš.
V kroku (4) jsou mikroorganizmy výhodně získány z uvedeného prostředí v místě vzdáleném od místa vnesení v kroku (3). V kroku (3) jsou mikroorganizmy výhodně vneseny perorálně nebo intraperitoneálně. V kroku (4) jsou mikroorganizmy výhodně získány ze sleziny. Mikroorganizmem je výhodně bakterie nebo houba, zejména může být mikroorganizmem bakterie patogenní pro rostliny, nebo houba patogenní pro rostliny, nebo bakterie patogenní pro zvířata, nebo houba patogenní pro zvířata.
Bakterie je výhodně vybrána ze souboru zahrnujícího Bordetella pertussisl, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Escherichia coli, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Listeria spp., Neisseria gonorrhoeael, Neisseria meningitidis, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Vibrio spp. a Yersinia pestis, a houba je výhodně vybrána ze skupiny zahrnující Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans a Histoplazma capsulatum.
Výhodně je v uvedeném postupu v kroku (1) gen inserčně inaktivován za použití transposonu nebo transposonu podobného elementu nebo jiné DNA sekvence nesoucí jedinečnou markerovou sekvenci. Rovněž je výhodně v kroku (1) každá z různých markerových sekvencí obklopena na obou stranách sekvencemi společnými pro všechny uvedené nukleové kyseliny. V kroku (2) je výhodně nukleová kyselina obsahující jedinečný markér izolována za použití technik DNA amplifikace a oligonukleotidových primerů, které hybridizují se společnými sekvencemi. V kroku (4) je výhodně nukleová kyselina obsahující soubor uvedených markerových sekvencí izolována za použití technik DNA amplifikace a oligonukleotidových primerů, které hybridizují se společnými sekvencemi.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží mikroorganizmus získaný za použití libovolného výše popsaného postupu.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití tohoto mikroorganizmu ve vakcíně.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vakcína obsahující mikroorganizmus podle předmětného vynálezu a farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku.
-4 CZ 296981 B6
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy vakcíny, který zahrnuje vytvoření mutantního mikroorganizmu podle a jeho formulaci do imunogenního přípravku. Imunogenní přípravek obsahuje výhodně adjuvans.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží gen získaný za použití způsobu podle vjnálezu.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob získání mutantního mikroorganizmu zahrnující kroky:
(a) identifikace genu, který umožňuje mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí za použití metody podle vynálezu, a (b) specifické zavedení mutace do odpovídajícího divokého typu genu mikroorganizmu za vzniku uvedeného mutantního mikroorganizmu.
Výhodně je uvedená mutace genu delece nebo mutace posunem čtecího rámce nebo libovolná jiná mutace, která je neschopná reverze. Odpovídající divoký typ genu hybridizuje za přísných podmínek na izolovaný inserčně-inaktivovaný gen nebo jeho část, jak je uvedeno ve výše popsaném kroku (7). Výhodně je uvedeným mikroorganizmem patogenní mikroorganizmus a genem, který umožňuje mikroorganizmu se adaptovat na specifické prostředí, je gen virulence, zejména mikroorganizmus patogenní pro zvířata nebo patogenní pro rostliny.
Konkrétně je mikroorganizmem výhodně libovolný mikroorganizmus vybraný ze skupiny zahrnující Bordetella spp., zejména B. pertussis, Campylobacter spp., zejména C.jejuni, Clostridium spp., zejména C. botulinum, Enterococcuis spp., zejména E.faecalis, Escherichia spp., zejména E. coli, Haemophilus spp., zejména H. ducrey a H. influenzae, Helicobacter spp., zejména H. pylori, Klebsiella spp., zejména K. pneumoniae, Legionella spp., zejména L. pneumophila, Listeria spp., zejména L. monocytogenes, Mycobacterium spp,, zejména M. smegmatis a M. tuberculosis, Neisseria spp., zejména N. gonorrhoeae a N. meningitidis, Pseudomonas spp., zejména Ps. aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., zejména S. aureus, Streptococcus spp., zejména 5. pyogenes a pneumoniae, Vibrio spp., Yersinia spp., zejména Y. pestis, Aspergillus spp., zejména A. fumigatus, Cryptococcus neoformans, Histoplazma capsulatum a Toxoplazma.
Dále je výhodně mikroorganizmem libovolný mikroorganizmus vybraný ze skupiny zahrnující Agrobacterium tumefaciens, Erwinia amylovara, Pseudomonas solanacearum, Rhizobium leguminosarum, Xanťhomonas campestris p.v. citri, Magnaporthe grisea, Fusarium spp., Erisypphe spp., Colletotrichum gloeosporiodes, Gaeumannomyces graminis, Glomus spp., Laccaria spp., Leptosphaeria maculans, Phoma tracheiphila, Phytophthora spp., Pyrenophora teres, Verticillium alboatrum a V. dahliae, a Mycosphaerella musicola a M. fijiensis.
Ve výhodném provedení jsou souborem mikroorganizmů v kroku (a) (1) mikroorganizmy Salmonella a mutantní mikroorganizmus získaný ve stupni (b) je mutant Salmonella.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy mutantního mikroorganizmu, který může účinkovat jako vakcína pro jiný patogen, zahrnující stupně vytvoření mutantního mikroorganizmu podle vynálezu, který exprimuje antigenní epitop z jiného patogenu.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy farmaceutického prostředku na bázi mutantního mikroorganizmu, zahrnující kombinaci tohoto mutantního mikroorganizmu podle vynálezu s jednou nebo více farmaceuticky přijatelnými nosičovými látkami.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob identifikace sloučeniny, která snižuje schopnost mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí, zahrnující kroky:
-5 CZ 296981 B6 (a) identifikování genu, který umožňuje mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí způsobem získání mutantního mikroorganizmu, nebo vytvoření genu identifikovaného jako SEQ ID č. 8 až 36 nebo genu v libovolné sekvenci ze Salmonella sekvencí zobrazených na obr. 5 nebo genu obsaženého v SEQ ID č. 37 nebo 38 nebo jeho varianty s přinejmenším 85% identitou sekvence, a (b) selektování sloučeniny, která interferuje s funkcí genu nebo s odpovídajícím divokým typem genu mikroorganizmu, nebo sloučenina, která interferuje s polypeptidem kódovaným tímto genem.
Při tomto postupu odpovídající divoký typ genu výhodně hybridizuje za přísných podmínek na izolovaný inserčně inaktivovaný gen nebo jeho část, jak je uvedeno v kroku (7) ve způsobu identifikace genu.
Do rozsahu předmětného vynálezu náleží rovněž způsob přípravy farmaceutického prostředku na bázi sloučeniny, která snižuje schopnost mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí, zahrnující (a) identifikaci sloučeniny za použití metody podle vynálezu, kde uvedený mikroorganizmus je patogenní pro zvířata, a (b) kombinaci s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy léčiva k zabránění nebo zmírnění infekce mikroorganizmem, zahrnující identifikaci sloučeniny za použití metody podle vynálezu kde uvedený mikroorganizmus je patogenní pro zvířata, a přípravu uvedeného léčiva.
Postup podle vynálezu tedy používá negativní selekce pro identifikaci mikroorganizmů s redukovanou proliferativní kapacitou ve specifickém prostředí.
Mikroorganizmus může žít ve velkém počtu různých prostředí a je známo, že jednotlivé specifické geny a jejich produkty umožňují adaptaci mikroorganizmu na specifické prostředí. Například, aby patogenní mikroorganizmus, jako je patogenní bakterie nebo patogenní houba, přežil ve svém hostiteli, je vyžadován produkt jednoho nebo více genů virulence. Takže ve výhodném provedení gen mikroorganizmu, který umožňuje adaptaci mikroorganizmu na specifické prostředí, je gen virulence.
Obvykle je specifickým prostředím diferencovaný mnohobuněčný organizmus jako je rostlina nebo zvíře. O mnoha baktériích a houbách je známo, že mohou infikovat rostliny a že jsou schopny přežít uvnitř rostliny a způsobit chorobu díky přítomnosti a expresi genů virulence. Ke vhodným mikroorganizmům, pro které je specifickým prostředím rostlina, patří Agrobacterium tumefaciens, vytvářející tumory (hálky) zejména na vinné révě; Erwinia amylovara; Pseudomonas solanacearum, která způsobují vadnutí (tzv. padání) u velkého množství rostlin; Rhizobium leguminosarum, které způsobuje choroby u fazolí; Xanťhomonas ampestris p.v. citri, která způsobuje sněť u citrusového ovoce; a dále sem patří houba Magnaporte grisea, která způsobuje chorobu rýže; Fusarium spp., která způsobuje množství chorob rostlin; Erisyphe spp., Colletotrichum gloeosporiodes; Gaeumannomyces graminis, která způsobuje choroby kořenů a květů u zeleniny a trav; Glomus spp., Laccaria spp:, Leptosphaeria maculans; Phoma tracheiphila; Phytophora spp:, Pyrenophora teres; Verticillium alboatrum a V. dahliae', a Mycosphaerella musicola a M. fijiensis. Jak je detailněji popsáno dále, pokud je mikroorganizmem houba, je vyžadována haploidní fáze jejího životního cyklu.
Obdobně, o mnoha mikroorganizmech včetně baktérií, hub, protozoí a trypanosom je známo, že infikují zvířata, zejména savce včetně lidí. Přežití mikroorganizmu uvnitř zvířete a schopnost mikroorganizmu způsobit chorobu je způsobena z velké části přítomností a expresí genů virulence. Vhodné bakterie zahrnují Bordetella spp., zejména B. pertussis, Campylobacter spp., zejména C. jejuni, Clostridium spp., zejména C. botulinum, Enterococcus spp., zejména E.
-6CZ 296981 B6 faecalis, Escherichia spp., zejména E. coli, Haemophilus spp., zejména H. ducrey a H. influenzae, Helicobacter spp. zejména H. pylori, Klebsiella spp., zejména K. pneumoniaea, Legionella spp, zejména L. pneumophila, Listeria spp., zejména L. monocytogenes, Mycobacterium spp., zejména M. smegmatis a M. tuberculosis, Neisseria spp., zejména N. gonorrhoeeae a N. meningitidis, Pseudomonas spp., zejména Ps. Aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., zejména S. aureus, Streptococcus spp., zejména S. pyogenes a S. pneumoniaea, Vibrio spp., a Yersinia spp., zejména Y. pestis. Všechny tyto bakterie způsobují choroby u lidí a existují také zvířecí modely těchto chorob. Takže pokud jsou tyto bakterie použity podle vynálezu, je specifickým prostředím zvíře, které mohou infikovat a u kterého mohou způsobit chorobu. Například, pokud je Salmonella typhimurium použita k infikování myši, rozvíjí se u myši choroba, která slouží jako model pro tyfovou horečku u lidí. Staphylococcus aureus způsobuje bakteriémii a tvorbu renálních abscesů u myší (Albus a kol. (1991) Infect. Immun. 59, 10081014) a endokarditidu u králíků (Perlman a Freedman (1971) YaleJ. Biol. Med. 44, 206-213). Je žádoucí, aby houba nebo vyšší eukaryotní parazit byl haploidní po relevantní část svého života (jako je růst ve specifickém prostředí). Výhodně je dostupný DNA zprostředkovaný integrovaný transformační systém a pokud je mikroorganizmus lidský patogen, je obyčejně dostupný zvířecí model lidské choroby. Vhodné houby patogenní pro člověka zahrnují určité druhy Aspergillus spp. (například A. fumigatus), Cryptococcus neoformans a Histoplazma capsulatum. Samozřejmě, že výše uvedené houby mají haploidní fázi, a že jsou pro ně dostupné DNA zprostředkované integrační transformační systémy. Toxoplazma může být také použita, jelikož je to parazit, který má haploidní fázi v průběhu infekce. Bakterie mají haploidní genom.
Často jsou dostupné zvířecí modely lidských chorob, ve kterých je zvířetem myš, krysa, králík, pes nebo opice. Je výhodné, aby zvířetem byla myš. Geny virulence detekované způsobem podle vynálezu za použití zvířecího modelu jsou s velkou pravděpodobností ty geny, které určují virulenci mikroorganizmu u lidí.
Zvláště výhodnými mikroorganizmy pro použití podle vynálezu jsou Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa a Aspergillus fumigatus.
V dalším popisu bude předmětný vynález popsán detailněji, včetně výhodných provedení.
Nukleová kyselina obsahující jedinečnou markerovou sekvenci je vytvořena následovně. Komplexní soubor (pool) dvouřetězcových tag DNA sekvencí (DNA sekvenčních značek, dle tohoto popisu jen zkráceně tag sekvencí nebo tagů) je generován za použití oligonukleotidové syntézy a polymerázové řetězové reakce (PCR). Každý tag má jedinečnou sekvenci velikosti okolo asi 20 až 80 bp, výhodně okolo 40 bp, která je obklopena raménky okolo 15 až 30 bp, výhodně okolo 20 bp, která jsou společná (shodná) pro všechny tágy. Počet bp v jedinečné sekvenci je dostačující pro generování velkého množství (například >1010) jedinečných sekvencí náhodnou oligonukleotidovou syntézou, ale není tak velký, aby umožnil tvorbu sekundárních struktur, které mohou interferovat s PCR. Obdobně, délka ramének by měla být dostatečná pro účinný priming (nasedání oček) oligonukleotidů v PCR.
Je dobře známo, že sekvence na 5' konci oligonukleotidu se nemusí zcela shodovat s cílovou sekvenci, která má být amplifíkována.
Je obvyklé, že PCR primery (očka) neobsahují žádné komplementární struktury delší jak 2 báze, zejména na svých 3' koncích, jelikož tato vlastnost může navodit tvorbu artefíciálních produktů nazývaných dimerní primery. Pokud 3' konce dvou primerů hybridizují, pak vytvářejí komplex primed templát (templát s očkem), a extenze primerů pak vede k tvorbě krátkého duplexního produktu nazývaného dimerní primer.
-7 CZ 296981 B6
Vnitřní sekundární struktura nesmí být u primerů přítomna. Pro symetrickou PCR je často doporučován 40 až 60% obsah G+C pro oba primery, s žádným dlouhým úsekem jakékoliv jedné báze. Klasická kalkulace teploty tání použitá společně se studiemi hybridizace DNA sond (prób) obvykle předpokládala, že daný primer by měl nasednout (hybridizovat) při specifické teplotě nebo že zvýšení teploty na 72 °C povede k předčasné disociaci hybridu primer/templát. V praxi jsou hybridy více efektivní v PCR procesu než bylo obyčejně předpokládáno jednoduchým výpočtem Tm.
Optimální teploty nasednutí čili hybridizace primeru (annealing) mohou být určeny empiricky a mohou být vyšší, než bylo předpokládáno. Taq DNA polymeráza je aktivní v oblasti 37 až 55 °C, takže extenze (prodlužování syntézou DNA) primerů může proběhnout během kroku nasedání a hybrid bude stabilizován. Koncentrace primerů jsou v konvenčním (symetrickém) PCR stejné a obvykle jsou v rozmezí 0,1 až 1 μΜ.
Tag sekvence jsou ligovány do transposonu nebo do transposonu podobného elementu za vytváření nukleové kyseliny obsahující jedinečnou markerovou sekvenci. Obyčejně je transposon přenesen na vhodném sebevražedném (suicide) vektoru, který je udržován jako plazmid v pomocném (helper) organizmu, ale který se ztrácí po transferu do mikroorganizmu podle způsobu vynálezu. Například pomocným organizmem může být Escherichia coli, mikroorganizmem způsobu může být Salmonella a přenos je konjugativní přenos. Ačkoliv transposon může být ztracen po přenosu, v části buněk podléhá transpozici, díky které je integrován náhodně, spolu se svým jedinečným tágem, do genomu mikroorganizmu použitého v předmětném vynálezu. Nejvýhodnější je, když transposon nebo transposonu podobný element může být selektován. Například, v případě Salmonelly může být přítomen v transposonu gen rezistence na kanamycin a exkonjuganty jsou selektovány v médiu obsahujícím kanamycin. Je také možné komplementovat autotrofícký markér v buňkách příjemce s funkčním genem v nukleové kyselině obsahující jedinečný markér. Tento způsob je zejména vhodný, pokud jsou podle vynálezu použity houby.
Výhodně komplementující funkční gen nepochází ze stejného biologického druhu jako je mikroorganizmus příjemce, jinak by mohla proběhnout nenáhodná integrace.
Je také zejména vhodné, aby transposon nebo transposonu podobný element byl nesen na vektoru, který se vyskytuje episomálně (to znamená, že není částí chromozomu) v mikroorganizmu použitém podle vynálezu, za prvních podmínek, zatímco po změně na druhé podmínky nemůže být episom udržován, což umožňuje selekci buněk, ve kterých transposon nebo transposonu podobný element byl podroben transpozici, díky které byl náhodně integrován, spolu se svým jedinečným tágem, do genomu mikroorganizmu použitého v tomto postupu. Toto zejména vhodné provedení je výhodné proto, že pokud je vytvořen mikroorganizmus nesoucí episomální vektor, pak vždy, když je transpozice selektována nebo indukována změnou podmínek mikroorganizmu (nebo jeho klonu) z prvních podmínek na druhé podmínky, transposon se může integrovat v různých místech genomu mikroorganizmu. Tak, když již byl vytvořen originální vzorový soubor (master collection) mikroorganizmů, kde každý jeho člen obsahuje jedinečnou tag sekvenci na transposonu nebo transposonu podobném elementu neseném na episomálním vektoru (za prvních podmínek), pak může být použita opakovaně ke generování zásob náhodných inserčních mutantů, kde každý z nich obsahuje odlišnou tag sekvenci (to znamená jedinečnou v rámci souboru). Toto provedení je zejména užitečné, jelikož (a) redukuje počet a komplexnost manipulací, které jsou požadovány pro generování souboru (pool) nezávisle mutovaných mikroorganizmů v kroku (1), uvedeném výše; a (b) počet různých tag sekvencí, které jsou zapotřebí, je stejný jako počet mikroorganizmů v souboru mikroorganizmů v kroku (1) tohoto postupu. Bod (a) tak činí způsob snazším pro použití u organizmů, pro které je provedení transposonové mutageneze obtížnější (například Staphylococcus aureus) a bod (b) znamená, že mohou být vybrány tag sekvence se zvláště dobrými hybridizačními charakteristikami, což činí
-8 CZ 296981 B6 snazší kontrolu kvality. Jak je detailněji popsáno níže, velikost souboru je obyčejně okolo 100 nebo 200 nezávisle mutovaných mikroorganizmů, a proto je originální vzorový soubor mikroorganizmů obyčejně uskladněn na jedné nebo dvou 96 jamkových mikrotitračních destičkách.
Ve zvláště výhodném provedení jsou první podmínky dané první specifickou teplotou nebo rozsahem teplot jako je například 25 °C až 32 °C, výhodněji přibližně 30 °C, a druhé podmínky jsou dány druhou specifickou teplotou nebo rozsahem teplot, jako například 35 °C až 45 °C, výhodněji přibližně 42 °C. V dalších výhodných provedeních jsou první podmínky charakterizované přítomností antibiotika, jako je streptomycin, a druhé podmínky jsou charakterizovány absencí uvedeného antibiotika; nebo jsou první podmínky dány absencí antibiotika a druhé podmínky jsou dány přítomností uvedeného antibiotika.
Transposony vhodné pro integraci do genomu gram negativních baktérií zahrnují Tn5, TnlO a jejich deriváty. Transposony vhodné pro integraci do genomu gram pozitivních baktérií zahrnují Tn916 a jejich deriváty a analoga. Transposony zejména vhodné pro použití ve Staphylococcus aureus zahrnují Tn917 (Cheung a kol., (1992) Proč. Nati. Acad. Sci USA 89, 6462-6466) a Tn918 (Albus a kol., (1991) Infect. Immunol. 59, 1008-1014).
Je zvláště výhodné, když transposony mají vlastnosti Tn917 derivátů jak je uvedeno v publikaci Camilli a kol., (1990) J. Bacteriol. 172, 3738-3744, a když jsou neseny na teplotně senzitivním vektoru jako je pE194Ts (Villafane a kol., (1987) J. Bacteriol. 169, 4822-4829).
Je zřejmé, že ačkoliv jsou transposony vhodné pro inserční inaktivaci genu, může být použita jakákoliv jiná známá metoda, nebo metoda, která bude známá v budoucnosti. Další vhodnou metodou pro inserční inaktivaci genu, zejména u některých baktérií jako je Streptococcus, je použití inserční duplikační mutageneze jak je uvedeno v publikaci Morrison a kol., (1984), J. Bacteriol. 159, 870 s ohledem na S. pneumoniae. Obecná metoda může být také použita na jiné mikroorganizmy, zejména bakterie.
Pro houby jsou inserční mutace vytvořeny transformací za použití DNA fragmentů nebo plazmidů nesoucích tag sekvence a výhodně selektovatelné markéry kódující například rezistenci na hygromycin B nebo phleomycin (viz Smith a kol., (1994) Infect, immunol. 62, 5247-5254). Náhodná jediná integrace DNA fragmentu kódujícího resistenci na hygromycin B do genomu vláknité houby, za použití restrikčním enzymem zprostředkované integrace (REMI; Schiestl a Petes (1991); Lu a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 12694-12653) je známá.
Jednoduchá technika inserční mutageneze pro houbu je popsána v publikaci Schiest a Petes (1994), která zde představuje odkazový materiál, a zahrnuje například použití elementů Ty a ribosomální DNA v kvasinkách.
Náhodná integrace transposonů nebo jiné DNA sekvence umožňuje izolaci souboru nezávisle mutovaných mikroorganizmů, kde je inserčně inaktivován různý gen v každém mutantu a každý mutant obsahuje odlišnou sekvenci markéru. Knihovna pro takové inserční mutanty je uspořádána na mikrotitračních destičkách s jamkami tak, že každá jamka obsahuje odlišný mutantní mikroorganizmus. DNA obsahující jedinečnou markerovou sekvenci z každého jednotlivého mutantního mikroorganizmu (obyčejně je použita celková DNA z klonu) je uskladněna. Obyčejně je toto provedeno odebráním vzorku mikroorganizmu z mikrotitrační destičky, bodovým přenesením na membránu pro hybridizaci nukleových kyselin (jako je nitrocelulózová nebo nylonová membrána), lýzou mikroorganizmů v alkalickém prostředí a fixováním nukleové kyseliny na membráně. Tak je připravena kopie obsahu mikrotitračních destiček.
Soubory mikroorganizmů z mikrotitračních destiček jsou připraveny a DNA je extrahována. Tato DNA je použita jako cíl pro PCR za použití primerů, které hybridizují (nasedají) ke společným raménkům sousedícím s tag sekvencemi a amplifikovaná DNA je značena, například 32p. Pro
-9CZ 296981 B6 dukt PCR je použit jako sonda k vyšetření DNA uskladněné z každého jednotlivého mutantu pro poskytnutí referenčních vzorů hybridizace pro otisky (repliky) mikrotitračních destiček. Toto je zkouška, že každý jednotlivý mikroorganizmus skutečně obsahuje markerovou sekvenci a že markerová sekvence může být amplifikována a účinně značena.
Jsou tak vytvořeny soubory transposonových mutantů pro vnesení do specifického prostředí. Obyčejně jsou použity 96-jamkové mikrotitrační destičky a soubor obsahuje 96 transposonových mutantů. Nicméně, nej nižší hranice pro velikost souboru jsou dva mutanty; neexistuje teoretická horní hranice velikosti souboru, ale jak je zmíněno dále, horní hranice může být určena ve vztahu k prostředí, do kterého jsou mutanty vneseny.
Jakmile jsou mikroorganizmy vneseny do specifického prostředí, je těm organizmům, které jsou toho schopny, umožněn růst v tomto prostředí. Doba, po kterou jsou mikroorganizmy ponechány v prostředí, je určena charakterem mikroorganizmu a prostředí. Po vhodné době jsou mikroorganizmy odstraněny z prostředí. DNA je extrahována a pak použita jako templát pro PCR za použití primerů, které nasedají na raménka sousedící s tag sekvencemi. PCR produkt je značen, například 32P, a je použit jako sonda ke screeningu DNA uskladněné od každého jednotlivého mutantu na otisku mikrotitrační destičky. Takto je identifikována uskladněná DNA, která hybridizuje slabě nebo vůbec se sondou generovanou z DNA izolované z mikroorganizmů odebraných z prostředí. Tyto nehybridizující DNA odpovídají mutantům, jejichž adaptace na specifické prostředí byla oslabena insercí transposonu nebo jiné DNA sekvence.
Ve zvláště výhodném provedení podle vynálezu nemají raménka žádné nebo velmi slabé značení ve srovnání s tag sekvencemi. Například jsou PCR primery vhodně projektovány tak, aby neobsahovaly žádné nebo pouze jedno G residuum, 32p-značeným nukleotidem je dCTP a v tomto případě není žádné nebo jedno C residuum inkorporováno do každého raménka, ale do tágu je inkorporováno větší množství radioaktivně značených C residuí. Je výhodné, aby tag sekvence měla alespoň desetkrát více inkorporovaných značek než raménko; lépe dvacetkrát nebo více a nejlépe padesátkrát nebo více. Obyčejně mohou být raménka oddělena od tag sekvencí za použití vhodného restrikčního enzymu, jehož místo může být inkorporováno při projektování primeru.
Jak bylo uvedeno výše, zvláště výhodné provedení je takové, kde mikroorganizmem je patogenní mikroorganizmus a specifickým prostředím je zvíře. V tomto provedení je velikost souboru mutantů zavedených do zvířete určena (a) počtem buněk každého mutantu, o kterých se předpokládá, že přežijí ve zvířeti (za předpokladu, že gen virulence nebyl inaktivován) a (b) celkovým inokulem mikroorganizmu. Pokud je množství (a) příliš nízké, pak mohou vzniknout falešně pozitivní výsledky, a pokud je množství (b) příliš velké, pak může zvíře zemřít před tím, než dostatek mutantů dostal šanci růst žádoucím způsobem. Počet buněk v (a) může být určen pro každý použitý mikroorganizmus, aleje výhodně vyšší než 50, lépe vyšší než 100.
Množství různých mutantů, které mohou být zavedeny do jednoho zvířete je výhodně mezi 50 a 500, běžně okolo 100. Je výhodné, aby celkové inokulum nepřesahovalo 106 buněk (výhodně 105 buněk), ačkoliv velikost inokula může být vyšší nebo nižší v závislosti na mikroorganizmu a zvířeti.
V běžném provedení je použito pro jedno zvíře inokulum 105 buněk obsahující 1000 buněk od každého ze 100 různých mutantů. Výhodnost je zřejmá, neboť v tomto způsobu může být použito jedno zvíře pro vyšetření 100 mutantů ve srovnání s předchozími způsoby v oboru, které vyžadovaly alespoň 100 zvířat pro vyšetření 100 mutantů.
Nicméně, je výhodné inokulovat tři zvířata stejným souborem mutantů, takže alespoň dva mohou být zkoumány (jeden jako opakování pro kontrolu spolehlivosti metody), zatímco třetí je použit
-10CZ 296981 B6 jako záložní soubor. Přesto poskytuje tato metoda více než 30-násobné snížení počtu použitých zvířat.
Doba mezi zavedením souboru mutantů do zvířete a odběrem mikroorganizmů se může lišit podle mikroorganizmu a zvířete, které jsou použity. Například, pokud je zvířetem myš a mikroorganizmem Salmonella typhimurium, je doba mezi inokulací a odběrem okolo tří dnů.
Podle jedné z variant výše uvedeného postupu jsou mikroorganizmy odstraněny z prostředí v kroku (5) v místě vzdáleném od místa zavedení v kroku (4), takže jsou zkoumány geny virulence včetně těch, které se podílejí na šíření mikroorganizmu mezi dvěma místy.
Například, u rostlin může být mikroorganizmus zaveden v lézi na stonku nebo v jednom místě listu a mikroorganizmus může být odebrán z jiného místa listu, kde se projevil chorobný stav.
V případě zvířat může být mikroorganizmus zaveden perorálně, intraperitoneálně, intravenózně nebo intranasálně, přičemž je odebrán později z vnitřních orgánů jako je slezina. To může být užitečné pro srovnání genů virulence identifikovaných po perorálním podání a genů virulence identifikovaných po intraperitoneálním podání, protože některé geny mohou být požadovány pro rozvoj infekce jednou cestou, ale nikoliv druhou. Je výhodné, aby Salmonella byla podána intraperitoneálně.
Jiným výhodným prostředím, které může být použito pro identifikaci genů virulence, jsou zvířecí buňky v kultuře (zejména makrofágy a epiteliální buňky) a rostlinné buňky v kultuře. Ačkoliv použití buněk v kultuře je užitečné samo o sobě, je také doplňkem použití celých zvířat nebo rostlin, které mohou vytvářet prostředí.
Je také výhodné, aby prostředí bylo částí lidského těla. V daných interakcích hostitel-parazit je možný velký počet různých prostředí, včetně různých orgánů a tkání, a jejich částí, jako jsou Peyerovy pláty.
Počet jednotlivých mikroorganizmů (to znamená buněk) odebraných z prostředí by měl být alespoň dvakrát vyšší, lépe alespoň desetkrát, a nejlépe 100-krát vyšší, než počet různých mutantů zavedených do prostředí. Například, pokud je zvíře inokulováno 100 různými mutanty, mělo by být odebráno okolo 10 000 jednotlivých mikroorganizmů a jejich markerová DNA by měla být izolována.
Další výhodné provedení obsahuje kroky:
(1A) odstranění auxotrofů ze souboru mutantů produkovaných v kroku (1); nebo (6A) určení, zda mutant selektovaný v kroku (6) je auxotrof; nebo provedení zahrnující jak (1A), tak (6A).
Je žádoucí rozlišit auxotrofy (což jsou mutantní mikroorganizmy, které vyžadují růstové faktory, které nevyžaduje divoký typ nebo prototrofy) a mutantní mikroorganizmy, kde je inaktivován gen umožňující adaptaci mikroorganizmu na specifické prostředí. Obyčejně je toto provedeno mezi kroky (1) a (2) nebo po kroku (6) výše uvedeného postupu.
Výhodně nejsou auxotrofy odstraněny, když jsou identifikovány geny virulence.
Podle dalšího aspektu vynálezu se provádí postup identifikace genů, které umožňují adaptaci mikroorganizmu na specifické prostředí, specifikovaný výše tak, že po provedení výše popsaného postupu následuje další krok, kterým je:
-11 CZ 296981 B6 (7) izolace inserčně inaktivovaného genu nebo jeho části z jednotlivého mutantu selektovaného v kroku (6).
Způsob pro izolaci genu obsahujícího jedinečný markér je dobře známý v oboru molekulární biologie.
Další výhodné provedení tohoto postupu obsahuje další následující krok, kterým je:
(8) izolace odpovídajícího genu divokého typu z divokého typu mikroorganizmu za použití inserčně inaktivovaného genu izolovaného v kroku (7) nebo jeho části jakožto sondy.
Způsob screeningu pomocí sondy genů je dobře známý v oboru molekulární biologie.
Metody molekulární biologie vhodné pro použití při praktickém provedení předkládaného vynálezu jsou popsány v laboratorní příručce Sambrook a kol., (1989), která je zde uváděna jako odkazový materiál.
Pokud je mikroorganizmem patogenní mikroorganizmus pro zvíře a genem je gen virulence a transposon byl použit pro inserční inaktivaci genu, pak jsou obyčejně geny virulence klonovány štěpením genomové DNA z jednotlivých mutantů selektovaných v kroku (6) restrikčním enzymem, který štěpí vně transposonu, ligováním podle velikosti frakcionované DNA obsahující transposon do plazmidu a selektováním plazmidových rekombinantů na základě resistence k antibiotiku udělené transposonem a nikoliv plazmidem. Genomová DNA mikroorganizmu sousedící s transposonem je sekvencována za použití dvou primerů, které nasedají na terminální úseky transposonu, a dvou primerů, které nasedají těsně k polylinkerovým sekvencím plazmidu. Sekvence mohou být podrobeny vyhledávání v DNA databázi pro určení, zda byl transposon přerušen známým genem virulence. Tak je obyčejně sekvence získaná tímto způsobem srovnána se sekvencemi přítomnými v běžně dostupných databázích jako je EMBL a GenBank. Nakonec, pokud se sekvence zdá být přerušená novým genem virulence, je mutace přenesena do nového genetického pozadí (například Salmonella fágem P22 zprostředkovanou transdukcí) a je určena LD5o mutantního kmene pro potvrzení toho, že avirulentní fenotyp je způsoben transpozicí a ne díky sekundární mutaci.
Počet jednotlivých mutantů screenovaných pro detekci všech genů virulence v mikroorganizmu závisí na počtu genů v genomu mikroorganizmu. Například, je pravděpodobné, že by mělo být vyšetřeno 3000 až 5000 mutantů Salmonella typhimurium, aby se detekovala většina genů virulence, zatímco pro Aspergillus spp., který má větší genom než Salmonella, by mělo být vyšetřeno okolo 20 000 mutantů. Přibližně se o 4 % neesenciálních genů 5. typhimurium soudí, že jsou vyžadovány pro virulenci (Grossman a Saier, 1990) a pokud tomu tak je, obsahuje genom S. typphimurium přibližně 150 genů virulence. Nicméně, tento výše uvedený postup podle vynálezu poskytuje rychlejší, vhodnější a lépe proveditelný způsob identifikace genů virulence.
Dalším aspektem tohoto vynálezu je mikroorganizmus získaný výše uvedeným způsobem.
Takový mikroorganizmus je užitečný, jelikož má tu vlastnost, že není adaptován, aby přežil ve specifickém prostředí.
Ve výhodném provedení není patogenní mikroorganizmus adaptován na přežití v hostitelském organizmu (specifickém prostředí), a v případě mikroorganizmů, které jsou patogenní pro zvířata, zejména savce, ještě přesněji lidi, může být mutant získaný výše uvedeným způsobem použit jako vakcína. Mutant je avirulentní a je proto očekáváno, že bude vhodný pro podání pacientovi, ale přitom je očekáváno, že je antigenní a že vyvolá ochrannou imunitní odpověď.
-12 CZ 296981 B6
Podle dalšího výhodného provedení je patogenní mikroorganizmus, který není adaptován na přežití v organizmu hostitele, získaný výše popsaným způsobem podle vynálezu modifikován, výhodně vnesením vhodné DNA sekvence tak, aby exprimoval antigenní epitop jiného patogenu. Tento modifikovaný mikroorganizmus může účinkovat jako vakcína pro jiný patogen.
Dalším aspektem tohoto vynálezu je mikroorganizmus, který obsahuje mutaci v genu identifikovaném výše uvedeným způsobem podle vynálezu.
Takže, ačkoliv mikroorganizmus podle jednoho z výše uvedených aspektů vynálezu uváděn jako užitečný, je výhodné, aby do identifikovaného genu byla specificky zavedena mutace. Ve výhodném provedení, zejména má-li být mikroorganizmus použit ve vakcíně, je mutací v genu delece nebo posunová mutace (posun čtecího rámce) nebo jakákoliv jiná mutace, které nemůže revertovat. Takové genově specifické mutace mohou být provedeny standardními postupy jako je vnesení kopie mutovaného genu na autonomním replikonu (jako je plazmid nebo virový genom) do mikroorganizmu a spoléhání na homologní rekombinaci, kterou se vnese mutace do kopie genu v genomu mikroorganizmu.
Podle dalších aspektů vynálezu jsou poskytnuty vhodné mikroorganizmy pro použití ve vakcíně a vakcína obsahující vhodný mikroorganizmus a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
Vhodným mikroorganizmem je výše uvedený avirulentní mutant.
Výhodná je aktivní imunizace pacienta. V tomto přístupu je připraven jeden nebo více mutantních mikroorganizmů v imunogenním přípravku obsahujícím vhodná adjuvans a nosiče, který je určen k podání pacientovi všeobecně známými způsoby. Vhodná adjuvans zahrnují Freundovo úplné nebo neúplné adjuvans, muramyldipeptid, Iscoms podle EP 109 942, EP 180 564, a EP 231039, hydroxid hlinitý, saponin. DEAE-dextran, neutrální oleje (jako je Miglyol), rostlinné oleje (jako je arašídový olej), liposomy, pluronické polyoly nebo adjuvantní systém Ribi (viz, například GB-A-2 189141). Pluronic je registrovaná ochranná známka. Pacientem, který má být imunizován, je pacient vyžadující ochranu před chorobou způsobenou virulentní formou mikroorganizmu.
Výše uvedený avirulentní mikroorganizmus podle vynálezu nebo jeho formulace může být podán jakýmkoliv běžným způsobem včetně perorálního podání a parenterální (tj. subkutánní nebo intramuskulární) injekce. Léčba se může skládat z jedné dávky nebo z většího počtu dávek v průběhu doby.
I když je možné pro avirulentní mikroorganizmus podle vynálezu, aby byl podán samostatně, je výhodné, aby byl přítomen ve farmaceutické formulaci, spolu s jedním nebo více akceptovatelnými nosiči. Nosiče musí být akceptovatelné ve smyslu kompatibility s avirulentním mikroorganizmem podle vynálezu a neškodnosti pro hostitele. Typicky je nosičem voda nebo fyziologický roztok, které jsou sterilní a apyrogenní.
Výhodnost bude zřejmá z toho, že vakcína podle vynálezu, v závislosti na své mikroorganizmové komponentě, může být použita v oblasti lidské i veterinární medicíny.
V případě mnoha zvířat jsou známé nejrůznější choroby způsobené mikroorganizmy, zejména například u domácích zvířat. Vakcíny podle vynálezu, pokud obsahují vhodné avirulentní mikroorganizmy, zejména avirulentní bakterie, jsou užitečné jak v případě lidí, tak také například u ovcí, krav, prasat, koní, psů a koček, a u drůbeže jako jsou kuřata, krocani, kachny a husy.
Dalšími aspekty vynálezu jsou gen získaný podle vynálezu, a polypeptid jím kódovaný.
-13 CZ 296981 B6
Do genu nejsou zahrnuty pouze úseky DNA, které kódují polypeptid, ale také regulační úseky DNA jako jsou úseky DNA, které regulují transkripci, translaci a u některých mikroorganizmů sestřih RNA. Takto tedy tento gen zahrnuje promotor, terminátor transkripce, ribosomální vazebné sekvence a u některých organizmů introny a rozpoznávací místa pro sestřih.
Obvykle informace o sekvenci inaktivovaného genu pochází z kroku 7 výše uvedeného postupu. Výhodně jsou sekvence sousedící s konci transposonu použity jako hybridizační místa pro sekvencovací primer. Odvozená sekvence nebo samotný DNA restrikční fragment sousední k inaktivovánému genu je použit k vytvoření hybridizační sondy, se kterou se identifikuje a izoluje odpovídající divoký typ genu z divokého typu organizmu.
Je výhodné, jestliže se hybridizace se sondou provádí za přísných (stringentních) podmínek, čímž se zajistí to, že je získán skutečně správný gen, a nejen příbuzný gen. Přísnými podmínkami se míní to, že gen hybridizuje se sondou, pokud je gen imobilizován na membráně a sonda (která je v tomto případě větší než 200 nukleotidů) je v roztoku a imobilizovaný gen/hybridizovaná sonda jsou promývány v 0,1 x SSC při teplotě 65 °C po dobu 10 minut. SSC je 0,15 M NaCl/0,015 M citrát sodný.
Výhodné sekvence sond pro klonování genů virulence Salmonella jsou ukázány na Obrázcích 5 a 6 a jsou popsány v příkladu 2.
Ve zvláště výhodném provedení obsahují geny virulence Salmonella sekvence ilustrované na Obrázku 5 a 6 a popsané v příkladu 2.
Dále výhodnými geny jsou ty, které jsou obsaženy v sekvencích, nebo jejichž část je obsažena v sekvencích ilustrovaných na Obrázcích 11 a 12 a které byly identifikovány způsobem podle jednoho z aspektů vynálezu. Sekvence uvedené na Obrázcích 11 a 12 jsou částí genového shluku, klastru (cluster) ze Salmonella typhimurium, který byl nazván shluk genů virulence 2 (VGC2). Pozice insercí transposonu jsou ukázány uvnitř sekvence, a tyto inserce transposonu inaktivují virulentní determinanty organizmu. Jak je detailněji popsáno níže, a zejména v příkladu 4, kde je postup podle jednoho z aspektů vynálezu použit pro identifikaci genů virulence Salmonela typhimurium, je mnoho insercí nukleových kyselin (a proto identifikovaných genů) seskupeno v relativně malé části genomu. Tento úsek. VGC2, obsahuje jiné geny virulence, které, jak je popsáno níže, představují část vynálezu.
Gen izolovaný způsobem podle vynálezu může být exprimován ve vhodné hostitelské buňce. Tento gen (DNA) může být tedy použit v souladu se známými technikami, které jsou vhodně upraveny podle informací uvedených v tomto popisu, pro konstrukci expresního vektoru, který je potom použit k transformaci vhodných hostitelských buněk pro expresi a produkci polypeptidu podle vynálezu. Mezi tyto techniky patří metody, které jsou popsány v patentech Spojených států amerických US 4 440 859 uděleném 3.5.1984 (autoři Rutter a kol.), 4 530 901 uděleném 23.6.1985 (autor Weisman), 4 582 800 udělený 15.5.1986 (autor Crowl), 4 677 063 uděleném 30.7.1987 (autoři Mark a kol.), 4 678 751 uděleném 7.6.1987 (autor Goeddel), 4 704 362 uděleném 3.11.1987 (autoři Itakura a kol.), 4 710 463 uděleném 1.12.1987 (autor Murray), 4 757 006 uděleném 12.6.1988 (autoři Toole jr, a kol.), 4 766 075 uděleném 23.8.1988 (autoři Goeddel a kol.), a 4 810 684 uděleném 7.3.1989 (autor Stalker), které jsou zde všechny uvedeny jako odkazové materiály.
DNA kódující polypeptid vytvářející sloučeninu podle vynálezu může být připojena na širokou škálu jiných DNA sekvencí pro zavedení do vhodného hostitele. Doprovodná DNA bude záviset na charakteru hostitele, způsobu zavedení DNA do hostitele a na tom, jestli je žádoucí episomální výskyt nebo integrace.
- 14 CZ 296981 B6
Obecně je DNA insertována do expresního vektoru jako je plazmid, ve správné orientaci a ve správném čtecím rámci pro expresi. Pokud je to nutné, může být DNA připojena na vhodné transkripční a translační regulační kontrolní nukleotidové sekvence rozpoznávané požadovaným hostitelem, ačkoliv takové kontrolní sekvence jsou obecně dostupné v expresním vektoru. Vektor je potom zaveden do hostitele standardními technikami. Obecně, ne všichni hostitelé budou transformovány vektorem. Proto bude nezbytné selektovat transformované hostitelské Buňky.. Jedna ze selekčních technik zahrnuje inkorporaci určitých nezbytných kontrolních elementů, které kódují selektovatelný znak v transformovaných buňkách, jako je rezistence k antibiotiku, do DNA sekvence expresního vektoru. Alternativně může být gen pro takový selektovatelný znak na jiném vektoru, který je použit ke kotransformaci (současné transformaci) požadované hostitelské buňky.
Hostitelské buňky, které byly transformovány rekombinantní DNA podle vynálezu jsou potom kultivovány po dostatečnou dobu a za vhodných podmínek, které jsou odborníkům pracujícím v daném oboru dostatečně dobře známy na základě informací uvedených v tomto popisu tak, aby byla umožněna exprese polypeptidu, který potom může být izolován
Je známo mnoho expresních systémů, včetně baktérií (jako například E. coli a Bacillus subtilis), kvasinek (například Saccharomyces cerevisiae), vláknitých hub (například Aspergillus), rostlinných buněk, zvířecích buněk a hmyzích buněk.
Vektory obsahují prokaryontní replikon, jako je ColEl ori, pro propagaci v prokaryontech, dokonce i v případech kdy je vektor použit pro expresi v jiných, neprokaryontních buněčných typech. Vektor může také obsahovat vhodný promotor jako je prokaryontní promotor schopný řízení exprese (transkripce a translace) genů v bakteriálním hostiteli, jako je E. coli, který je jím transformován.
Promotor je expresní kontrolní element tvořený DNA sekvencí, která dovoluje vazbu RNA polymerázy a transkripci. Promotorové sekvence kompatibilní s příklady bakteriálních hostitelů jsou typicky poskytnuty v plazmidových vektorech obsahujících běžná restrikční místa pro inserci DNA segmentu podle předkládaného vynálezu.
Typickými prokaryotními vektorovými plazmidy jsou pUC18, pUC19, pBR322 a pBR329, dostupné od Biorad Laboratories, (Richmond. CA, USA) a pTrc99A a pKK223-3, k dispozici od Pharmacia. Piscataway. NJ, USA.
Typickým vektorovým plazmidem savčích buněk je pSVL, k dispozici od Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Tento vektor používá SV40 pozdní promotor pro řízení exprese klonovaných genů, přičemž nejvyšší hladina exprese je nacházena u T-antigen produkujících buněk, jako jsou COS-1 Buňky..
Příkladem indukovatelného savčího expresního vektoru je pMSG, rovněž k dispozici od Pharmacia. Tento vektor používá pro řízení exprese klonovaného genu glukokortikoidy indukovatelný promotor dlouhé terminální repetice z myšího viru nádoru mléčné žlázy.
Použitelné kvasinkové vektory jsou pRS403-406 a pRS413-416, které jsou obecně k dispozici u Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Plazmidy pRS403, pRS404, pRS405 a pRS406 jsou kvasinkové integrující plazmidy (YIps) a integrují do kvasinky selektovatelné markéry HIS3 TRPÍ, LEU2 a URA3. Plazmidy pRS413-416 jsou kvasinkové centromerové plazmidy (YCps).
Bylo vyvinuto množství metod pro operativní vložení DNA do vektorů pomocí komplementárních kohezivních konců. Například, komplementární homopolymerová část může být přidána k DNA segmentu, který má být vložen do vektorové DNA. Vektor a DNA segmenty jsou potom
- 15 CZ 296981 B6 spojeny vodíkovou vazbou mezi komplementárními homopolymerovými konci za vzniku rekombinantních DNA molekul.
Syntetické linkery obsahující jedno nebo více restrikčních míst poskytují alternativní metodu pro vložení DNA segmentu do vektorů. DNA segment, generovaný štěpením restrikční endonukleázou jak bylo popsáno dříve, je ošetřen bakteriofág T4 DNA polymerázou nebo E.coli DNA polymerázou 1, enzymy, které odstraňují přesahující 3'-jednořetězcové konce svou 3' -5' exonukleázovou aktivitou a vyplňují zbylé 3' -konce svou polymerázovou aktivitou.
Kombinace těchto aktivit proto generuje tupě zakončené DNA segmenty. Tupě zakončené segmenty jsou inkubovány s velkým molárním přebytkem linker molekul za přítomnosti enzymu, který je schopen katalyzovat ligaci tupě zakončených DNA molekul, jako je DNA ligáza z bakteriofága T4. Takže produkty reakce jsou DNA segmenty nesoucí polymerní linker sekvence na svých koncích. Tyto DNA segmenty jsou potom štěpeny vhodným restrikčním enzymem a ligo vány do expresního vektoru, který byl štěpen enzymem, který produkuje konce kompatibilní s konci DNA segmentu.
Syntetické linkery obsahující množství míst pro restrikční endonukleázy jsou komerčně získatelné z mnoha zdrojů včetně Intemational Biotechnologies, lne., New Haven, CN, USA.
Vhodným způsobem pro modifikaci DNA kódující polypeptid podle vynálezu je použití polymerázové řetězové reakce popsané v publikaci Saiki a kol., (1988), Science: 239, 487-491.
N tomto způsobu je DNA, která má být enzymaticky amplifikována, obklopena dvěma specifickými oligonukleotidovými primery, které se pak samy stanou součástí amplifikované DNA. Uvedené specifické primery mohou obsahovat rozpoznávací místa pro restrikční endonukleázy, které mohou být použity pro klonování do expresního vektoru za použití metod běžně známých v tomto oboru.
Dalším aspektem předmětného vynálezu jsou varianty genů. Je výhodné, aby varianty měly alespoň 70% identitu sekvence, lépe alespoň 85% identitu sekvence, a nejlépe alespoň 95% identitu sekvence s geny izolovanými výše popsaným způsobem podle vynálezu. Samozřejmě může být tolerováno nahrazení, delece a inserce. Stupen podobnosti mezi jednou sekvencí nukleových kyselin a jinou sekvencí nukleových kyselin může být určen za pomoci GAP programu University of Wisconsin Computer Group.
Obdobně představují aspekty předmětného vynálezu varianty proteinů kódovaných geny.
Variantami se míní inserce, delece a substituce, jak konzervativní, tak nekonzervativní, kde takové změny nemění podstatně normální funkce proteinu.
Konzervativní substitucí jsou míněny kombinace jako je Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; a Phe, Tyr.
Takové varianty mohou být vytvořeny za použití dobře známých metod proteinového inženýrství a místně řízené mutageneze.
Dalším aspektem vynálezu je způsob identifikace sloučenin, které redukují schopnost mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí, kde tento způsob obsahuje kroky selekce sloučenin, které interferují s funkcí (1) genu získaného způsobem podle jednoho z aspektů předmětného vynálezu nebo (2) polypeptidu kódovaného takovým genem.
Párové vyšetření sloučenin, které ovlivňují divoký typ buněk, ale nikoliv buněk s nadprodukcí genu izolovaného způsobem podle vynálezu tvoří část tohoto aspektu vynálezu.
-16CZ 296981 B6
Například, v jednom provedení podle vynálezu je jedna buňka buňkou divokého typu a druhou je Salmonella, která byla upravena tak, aby nadměrně exprimovala gen izolovaný způsobem podle vynálezu. Schopnost přežití a/nebo růstu každé buňky ve specifickém prostředí je určena za přítomnosti testované sloučeniny pro určení toho, zda sloučenina redukuje schopnost přežití nebo růstu divokého typu buněk a nikoliv buněk ve zvýšené míře exprimujících uvedený gen.
Je výhodné, aby genem byl gen virulence.
Například, podle jednoho z provedení předmětného vynálezu je mikroorganizmus (jako je S. typhimurium) upraven tak, aby ve zvýšené míře exprimoval gen virulence identifikovaný způsobem podle jednoho z aspektů předmětného vynálezu. Pro infikování buňky v kultuře je použit každý (a) ve zvýšené míře exprimující mikroorganizmus a (b) ekvivalentní mikroorganizmus (který ve zvýšené míře neexprimuje gen virulence). To, zda určitá testovaná sloučenina selektivně inhibuje funkci genu virulence je určeno zhodnocením množství testované sloučeniny, které je požadováno pro zabránění infekce hostitelské buňky (a) ve zvýšené míře exprimující mikroorganizmu a (b) ekvivalentního mikroorganizmu (alespoň pro některé produkty genu virulence je předpokládáno, že je bude testovaná sloučenina inaktivovat, a samy budou inaktivovány vazbou produktu genu virulence). Jestliže je potřeba pro zabránění infekci (a) než (b) více sloučenin, pak se dá předpokládat, že sloučenina je selektivní. Je výhodné, když je mikroorganizmus (jako je Salmonella) extracelulámě destruován mírnými antibiotiky jako je gentamicin (který nepenetruje do buněk hostitele) a aby účinek testované sloučeniny na zabránění infekci buněk mikroorganizmem byl způsoben lýzou uvedených buněk a určením, jak mnoho mikroorganizmů je přítomno (například nanesením na agarové plotny).
Párová vyšetření a jiná vyšetření na sloučeniny j sou obecně popsána v publikaci Kirsch and Di Domenico (1993) v The Discovery of Nátural Products with Therapeutic Potential (Ed., V. P. Gallo), kapitola 6, str. 177-221, Buttenvorths. V. K. (zde uvedenájako odkazový materiál).
Párová vyšetření mohou být navržena různými způsoby, ve kterých je relativní senzitivita sloučeniny porovnávána za použití dvou geneticky příbuzných kmenů. Pokud se kmeny liší v jednom lokusu, pak sloučenina pro tento cíl specifická může být identifikována porovnáváním senzitivity každého kmenu s inhibitorem. Například, inhibitor specifický pro cíl může být více aktivní vůči super senzitivnímu testovanému kmeni v porovnání s jiným isogenním sesterským kmenem. Ve formátu testu difúze v agaru je toto určeno měřením velikosti zóny inhibice okolo disku nebo jamky nesoucí sloučeninu. Díky difúzi je dán kontinuální koncentrační gradient sloučeniny, a senzitivita kmenu na inhibitor je úměrná vzdálenosti od disku nebo jamky ke kraj i zóny. U běžných antimikrobiálních látek, nebo antimikrobiálních látek s jiným způsobem účinku než je požadováno, je obyčejně pozorována stejná aktivita vůči obou kmenům.
Další typ molekulárního genetického vyšetření vyžaduje páry kmenů, kde je klonovaný genový produkt ve zvýšené míře exprimoexprimován (přeexprimován) v jednom kmenu ve srovnání s kontrolním kmenem. Odůvodněním tohoto typu testuje to, že kmen obsahující zvýšené množství cílového proteinu by měl být více rezistentní na inhibitory specifické pro klonovaný genový produkt, než isogenní kmen, který obsahuje normální množství cílového proteinu. V testu difúze na agaru v agaru je očekáváno, že velikost zóny okolo specifické sloučeniny bude menši u kmenu zvýšeně exprimujícího cílový protein než u jiného izogenního kmenu.
Další nebo alternativní selekce sloučeniny je dosažena v následujících krocích:
1. Mutantní mikroorganizmus získaný za použití způsobu podle jednoho z aspektů vynálezu je použit jako kontrola (má daný fenotyp, například, avirulentní).
2. Testovaná sloučenina je smíšena s divokým typem mikroorganizmu.
- 17 CZ 296981 B6
3. Divoký typ mikroorganizmu je zaveden do specifického prostředí (s testovanou sloučeninou nebo bez testované sloučeniny).
4. Pokud je divoký typ mikroorganizmu neschopen adaptace na specifické prostředí (po ošetření sloučeninou, nebo za přítomnosti sloučeniny), je sloučenina jednou z těch, které redukují schopnost mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí nebo v nem přežít.
Pokud je specifickým prostředím zvířecí tělo a mikroorganizmem je patogenní mikroorganizmus, pak může být sloučenina identifikovaná tímto způsobem použita v léčivu pro zabránění nebo zmírnění infekce mikroorganizmem.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je sloučeninu identifikovatelná způsobem podle vynálezu.
Výhodnost spočívá v tom, že použití sloučeniny podle jednoho z aspektů předmětného vynálezu souvisí se způsobem, kterým mohou být identifikovány, a zejména souvisí s patogenním mikroorganizmem pro hostitele. Například, pokud je sloučenina identifikovatelná způsobem používajícím gen virulence, nebo polypeptid jím kódovaný, z bakterie, která infikuje savce, pak může být sloučenina užitečná v léčbě infekce savců touto baktérií.
Obdobně, pokud je sloučenina identifikovatelná způsobem používajícím gen virulence, nebo polypeptid jím kódovaný, z houby, která infikuje rostliny, pak může být sloučenina užitečná v léčbě infekce rostlin touto houbou.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je molekula, která selektivně interaguje s genem podle předmětného vynálezu nebo jeho produktem, kterým je nukleová kyselina, nebo inhibuje jejich funkci.
Produktem genu, kterým je nukleová kyselina se míní jakákoliv RNA, zejména mRNA, transkribovaná z genu.
Výhodně je uvedenou molekulou, která selektivně interaguje s genem podle vynálezu nebo jeho produktem, kterým je nukleová kyselina, nebo inhibuje jejich funkci, antisenze nukleová kyselina nebo derivát nukleové kyseliny.
Nejvýhodněji je uvedenou molekulou antisenze oligonukleotid.
Antisenze oligonukleotidy jsou jednořetězcové nukleové kyseliny, které se mohou specificky vázat na komplementární sekvence nukleové kyseliny. Vazbou na vhodnou cílovou sekvenci je vytvořen RNA-RNA, DNA-DNA nebo RNA-DNA duplex (dvoušroubovice). Tyto nukleové kyseliny jsou často nazývány antisenze, protože jsou komplementární k senze nebo-li kódujícímu řetězci genu. Nově bylo shledáno možným vytváření trojitého helixu (troj šroubovice), kde je oligonukleotid vázán na DNA duplex. Bylo shledáno, že oligonukleotid může rozpoznávat sekvence v hlavní drážce (groove) DNA dvoušroubovice. Takto se může vytvářet trojšroubovice. Toto naznačuje, že je možné syntetizovat sekvenčně specifické molekuly, které se specificky vážou na dvoj řetězcovou DNA prostřednictvím rozpoznání vodíkových vazebných míst hlavní drážky.
Samozřejmě, sekvence antisenze nukleové kyseliny nebo oligonukleotidu může být snadno určena odkazem na sekvenci nukleotidů požadovaného genu. Například mohou být projektovány ty antisenze nukleové kyseliny nebo oligonukleotidy, které jsou komplementární k části sekvence ilustrované na Obrázcích 11 nebo 12, zejména k sekvenci, která tvoří část genu virulence.
-18CZ 296981 B6
Oligonukleotidy podléhají degradaci nebo inaktivaci buněčnými endogenními nukleázami. Pro řešení tohoto problému je možné použít modifikované oligonukleotidy, například mající alterované internukleotidové vazby, ve kterých byly přirozené fosfodiesterové vazby nahrazeny jinou vazbou. Například v publikaci Agrawal a kol., (1988), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 je popsána zvýšená inhibice HIV ve tkáňové kultuře za použití oligonukleotidu fosforoamidátu a fosforothioátu. V publikaci Sarin a kol., (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451 je popsána zvýšená inhibice HIV za použití oligonukleotidu methylfosfonátů. V publikaci Agrawal a kol., (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794 je popsána inhibice HIV-1 replikace jak v časně infikovaných, tak chronicky infikovaných buněčných kulturách, za použití pro nukleotidovou sekvenci specifického oligonukleotidu fosforothioátu. V publikaci Leither a kol., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 je popsána inhibice replikace viru chřipky ve tkáňové kultuře oligonukleotidem fosforothioátem. U oligonukleotidu majících artefíciální vazby bylo ukázáno, že jsou rezistentní na degradaci in vivo. Například, v publikaci Shaw a kol., (1991), Nucleic Acids Res. 19, 747-750, je uvedeno, že jinak nemodifikované oligonukleotidy se stávají více rezistentními na nukleázy in vivo, když jsou blokovány na 3' konci jistou čepičkovou strukturou a že oligonukleotid fosforothioát bez čepičky není degradován in vivo.
Detailní popis H-fosfonátového přístupu pro syntetizování oligonukleosidfosforothioátu je poskytnut v publikaci Agrawal a Tang (1990), Tetrahedron Letters 31, 7541-7544, jejichž poznatky jsou zde zahrnuty formou odkazu. Syntézy oligonukleosidmethylfosfonátů, fosforodithioátů, fosforoamidátů, fosfátových esterů, můstkových fosforodithioátfosforoamidátů jsou v tomto oboru z dosavadního stavu techniky známy. Viz, například publikace Agrawal a Goodchild (1987), Tetrahedron Letters 28, 3539; Nielsen a kol., (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager a kol., (1988), Biochemistry 27, 7237; Uznanaski a kol., (1987), Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth (1988), Helv. Chim. Acta., 71, 1517; Crosstick a Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal a kol., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405, které jsou zde uvedeny jako odkazové materiály. Rovněž jsou pro syntézu nebo produkci možné i jiné metody. Ve výhodném provedení je oligonukleotidem deoxyribonukleová kyselina (DNA), ačkoliv mohou být rovněž syntetizovány a použity sekvence ribonukleové kyseliny.
Oligonukleotidy využitelné ve vynálezu jsou výhodně navrhovány tak, aby byly rezistentní na degradaci endogenními nukleolytickými enzymy. In vivo degradace oligonukleotidů vytváří degradační produkty redukované délky. Takový zkrácený produkt se s větší pravděpodobností váže v nespecifické hybridizaci a je méně pravděpodobné, že bude účinný, vzhledem k jeho protějšku plné délky. Takže je žádoucí použít oligonukleotidy, které jsou rezistentní na degradaci v těle a které jsou schopny dosáhnout cílové buňky. Předkládané oligonukleotidy mohou být učiněny rezistentnějšími na degradaci in vivo tím, že se jedna nebo více přirozených fosfodiesterových vazeb nahradí artefíciální vazbou mezi nukleotidy, například nahrazením fosforu sírou ve vazbě. Jako příklad vazeb, které mohou být použity, je možno uvést vazby skupin jako jsou fosforothioáty, methylfosfonáty, sulfony, sulfáty, ketylové vazby, fosforodithioáty, různé fosforoamidáty, fosfátestery, můstkové fosforodithioáty a můstkové fosforoamidáty. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní, přičemž nejsou nikterak limitující, protože jsou v tomto oboru běžně známé i jiné internukleotidové vazby. Viz například publikace Cohen, (1990), Trends in Biotechnology. Syntéza oligonukleotidů majících jednu nebo více těchto vazeb nahrazujících fosfodiesterové internukleotidové vazby je tomto oboru běžně známá, včetně syntetických způsobů pro produkci oligonukleotidů majících smíšené internukleotidové vazby.
Oligonukleotidy mohou být učiněny rezistentními na extenzi endogenními enzymy tím, že jsou opatřeny čepičkou (capping) nebo inkorporací podobných skupin na 5' nebo 3' terminální nukleotidy. Reagens pro capping je běžně komerčně dostupné jako Amino-Link Π™ od Applied BioSystems lne., Foster City. CA. Metody cappingu jsou popsány například v publikaci Shaw a kol., (1991), Nucleic Acids Res. 19, 747-750, a v publikaci Agrawal a kol., (1991), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88 (17), 7595-7599, které zde slouží jako odkazové materiály.
- 19CZ 296981 B6
Dalším způsobem pro výrobu oligonukleotidů rezistentních na účinek nukleáz je jejich samostabilizace jak je popsáno v publikaci Tang a kol., (1993), Nucleic Acids Res. 21, 2729-2735, která je zde uvedena jako odkazový materiál. Samostabilizované (self-stabilised) oligonukleotidy mají vlásenkovité smyčkové struktury na svých 3' koncích, a vykazují zvýšenou rezistenci na degradaci fosfodiesterázou hadího jedu. DNA polymerázou 1 a fetálním hovězím sérem. Samostabilizující úsek v tomto oligonukleotidu neinterferuje v hybridizaci s komplementárními nukleovými kyselinami, přičemž farmakokinetické a studie stability u myší prokázaly zvýšenou in vivo perzistenci samostabilizovaných oligonukleotidů s ohledem na jejich lineární protějšky.
Podle vynálezu je inherentní vazebná specificita antisenze oligonukleotidů charakteristického párování bází zvýšena omezením dostupnosti antisenze sloučeniny k jejímu zamýšlenému lokusu in vivo, což umožní použití nižších dávek a minimalizaci systémových účinků. Takto jsou oligonukleotidy aplikovány lokálně pro dosažení požadovaného účinku. Koncentrace oligonukleotidů v požadovaném lokusu je mnohem vyšší, než když jsou oligonukleotidy podány systémově, přičemž terapeutický účinek může být dosažen za použití signifikantně nižšího celkového množství. Lokální vysoké koncentrace oligonukleotidů zvyšují penetraci do cílových buněk a účinně blokují translaci cílových sekvencí nukleových kyselin.
Oligonukleotidy mohou být dopraveny k lokusu jakýmkoliv vhodným způsobem vhodným pro lokální podání léčiva. Například, roztok oligonukleotidů může být injikován přímo do místa nebo může být dopraven infusí za použití infúzní pumpy. Oligonukleotidy mohou také být inkorporovány do implantabilního prostředku, který, pokud je umístěn v požadovaném místě, umožňuje uvolňování oligonukleotidů do okolního lokusu.
Oligonukleotidy jsou nej výhodněji podávány za pomoci hydrogelního materiálu. Hydrogel je nezánětlivý a biodegradovatelný. Je známo mnoho takovýchto materiálů, včetně těch, které jsou vyrobeny ze syntetických a přirozených polymerů. Ve výhodném provedení způsob využívá hydrogel, který je tekutý při teplotě nižší než je teplota těla, ale při teplotě těla nebo okolo ní gelovatí a vytváří tvar udržující semisolidní hydrogel. Výhodným hydrogelem jsou polymery s opakujícími se jednotkami ethylenoxid-propylenoxid. Vlastnosti polymeru jsou závislé na molekulární hmotnosti polymeru a relativním procentuálním poměru polyethylenoxidu a polypropylenoxidu v polymeru. Výhodné hydrogely obsahují od asi 10 do asi 80 % (hmotnostních) ethylenoxidu a od asi 20 do asi 90 % (hmotnostních) propylenoxidu. Zvláště výhodný hydrogel obsahuje okolo 70 % polyethylenoxidu a 30 % polypropylenoxidu. Hydrogely, které je možno pro tyto účely použít, jsou k dispozici například od BASF Corp., Parsippany. NJ, pod obchodní značkou Pluronic®.
V tomto provedení je hydrogel ochlazen na kapalný stav a oligonukleotidy jsou vmíchány do kapaliny v koncentraci okolo 1 mg oligonukleotidu na 1 gram hydrogelu. Výsledná směs je potom aplikována na povrch, který má být léčen, například nastříkáním sprejem nebo natřením v průběhu chirurgického zákroku nebo za použití katétru nebo endoskopických postupů. Jakmile se polymer ohřeje, přechází do pevného stavu za vzniku gelu, přičemž oligonukleotidy difundují z gelu do okolních buněk v průběhu doby dané přesným složením gelu.
Oligonukleotidy mohou být podány prostřednictvím jiných implantátů, které jsou běžně komerčně dostupné nebo jsou popsány v odborné literatuře, jako jsou liposomy, mikrokapsule, a implantabilní zařízení. Například, implantátem může být biodegradovatelný materiál jako jsou polyanhydridy, polyorthoestery, polymléčná kyselina nebo polyglykolová kyselina a jejich kopolymery, kolagen, a polymery proteinů, nebo nebiodegradovatelné materiály jako je ethylenvinylacetát (EVAc), polyvinylacetát, ethylenvinylalkohol, a jejich deriváty, které mohou být použity pro lokální dopravení oligonukleotidů. Oligonukleotidy mohou být inkorporovány do materiálu v době kdy je polymerizován nebo kdy je v pevném stavu, za použití metody tavení nebo odpaření rozpouštědla nebo mohou být mechanicky smíchány s materiálem. Podle jednoho
-20CZ 296981 B6 z aplikovatelných provedení jsou oligonukleotidy smíchány na nebo aplikovány na potah implantovatelných prostředků jako jsou dextranem potažené silikonové korálky, stenty nebo katétry.
Dávka oligonukleotidů závisí na velikosti oligonukleotidů a na účelu, pro který jsou podány. Obecně je velikost dávky určena podle povrchu oblasti tkáně, která má být léčena. Účinná dávka oligonukleotidů někdy závisí na délce a chemickém složení oligonukleotidů, ale obecně je v rozmezí okolo 30 až 3000 pg na čtvereční centimetr povrchu tkáně.
Oligonukleotidy mohou být podávány pacientovi systémově jak za terapeutickým, tak za profylaktickým účelem. Oligonukleotidy mohou být podány jakoukoliv účinnou metodou, například, parenterálně (například intravenózně, subkutánně nebo intramuskulámě) nebo perorálně, nazálně, nebo jiným způsobem, který umožňuje přístup oligonukleotidů do krevního oběhu pacienta. Systémově podané oligonukleotidy j sou výhodně podávány spolu s lokálně podanými oligonukleotidy, ale mají také uplatnění bez lokálního podání. Pro tento účel bude obecně účinná dávka v rozsahu od asi 0,1 do asi 10 gramů najedno podání u dospělého člověka.
Cenné je to, že molekuly podle tohoto aspektu předmětného vynálezu jsou využitelné pro léčbu a zabránění infekcím způsobeným mikroorganizmy, ze kterých je uvedený gen izolován, nebo blízce příbuznými mikroorganizmy. Takže uvedená molekula je antibiotikum.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je molekula, specifikovaná výše, která je použitelná v medicíně.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je metoda léčby hostitele, který je infikován nebo je citlivý na infekci mikroorganizmem, přičemž při tento postup zahrnuje podání účinného množství molekuly, výše specifikované, kde uvedený gen je přítomen v uvedeném mikroorganizmu, nebo jemu blízce příbuzném mikroorganizmu.
Účinným množstvím se míní množství, které v podstatě brání nebo zmirňuje infekci. Hostitele je míněno jakékoliv zvíře nebo rostlina, která může být infikována mikroorganÍ2mem.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující molekulu podle vynálezu. Takové farmaceutické prostředky obsahuj í uvedenou molekulu spolu s jedním nebo více akceptovatelnými nosiči. Nosič (e) musí být akceptovatelné ve smyslu kompatibility s uvedenou molekulou podle vynálezu a musí být neškodné pro jejich příjemce. Obvykle bude nosičem voda nebo fyziologický roztok, který bude sterilní a apyrogenní.
Jak bylo zmíněno výše, a jak bude detailněji uvedeno v Příkladu 4 níže, bylo podle předmětného vynálezu zjištěno, že jisté geny virulence jsou u Salmonella typhimurium seskupeny v oblasti chromozomu, který je nazván VGC2. DNA-DNA hybridizační experimenty určily, že sekvence homologní k alespoň části VGC2 se nacházejí v mnoha druzích a kmenech Salmonella, ale že nejsou přítomny u kmenů E. coli a Shigella, které byly testovány (viz. Příklad 4). Tyto sekvence téměř jistě korespondují s konzervativními geny, alespoň u Salmonella, a alespoň některé z nich jsou geny virulence. Soudí se, že ekvivalentní geny u jiných druhů Salmonella a, pokud jsou přítomny, i u jiných střevních nebo jiných baktérií, jsou také geny virulence.
To, zda gen v VGC2 regionu je gen virulence, se snadno určí. Například ty geny v VGC2, které byly identifikovány výše specifikovaným způsobem podle vynálezu (pokud byl aplikován na Salmonella typhimurium a pokud prostředím bylo zvíře jako je myš), jsou geny virulence. Geny virulence jsou také identifikovány vytvořením mutace v genu (výhodně nepolární mutace) a určením, zda mutantní kmen je avirulentní. Způsoby vytváření mutací ve vybraném genu jsou v tomto oboru dobře známy a jsou popsány níže.
-21 CZ 296981 B6
Dalším aspektem předmětného vynálezu je VGC2 DNA Salmonella typhimurium nebo jeho část, nebo varianta uvedené DNA nebo varianta její části.
VGC2 DNA Salmonella typhimurium je schématicky znázorněna na Obrázku 8 a je snadno získatelná ze Salmonella typhimurium ATCC 14028 (k dispozici od Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive. Rockville. Maryland 20852, USA; též uložena v NCTC, Public Health Laboratory Service. Colindale. UK pod číslem NCTC 12021) za použití informací daných v Příkladu 4. Například, sondy odvozené od sekvencí ukázaných na Obrázku 11 a 12 mohou být použity pro identifikování lambda klonů z genomových knihoven Salmonella typhimurium. Pro získání celé VGC2 DNA mohou být použity standardní metody procházení genomu (genom walking). Restrikční mapa ukázaná na Obrázku 8 může být použita pro identifikaci a umístění DNA fragmentů z VGC2.
Částí VGC2 DNA Salmonella typhimurium se míní jakákoliv DNA sekvence, která obsahuje alespoň 10 nukleotidů, výhodně alespoň 20 nukleotidů, ještě výhodněji alespoň 50 nukleotidů, a ještě výhodněji alespoň 100 nukleotidů a nejvýhodněji alespoň 500 nukleotidů VGC2. Zvláště výhodnou částí VGC2 DNA je sekvence uvedená na Obrázku 11, nebo její část. Jinou zvláště výhodnou částí VGC2 DNA je sekvence uvedená na Obrázku 12, nebo její část.
Výhodně je částí VGC2 DNA gen, nebo jeho část.
Geny mohou být identifikovány uvnitř úseku VGC2 statistickou analýzou otevřených čtecích rámců za použití počítačových programů běžně známých v tomto oboru. Pokud je otevřený čtecí rámec větší než asi 100 kodonů, pak je pravděpodobné, že to je gen (ačkoliv menší geny jsou také známé). To, zda otevřený čtecí rámec koresponduje s polypeptid kódujícím regionem genu může být určeno experimentálně. Například, část DNA odpovídající otevřenému čtecímu rámci může být použita jako sonda v northem (RNA) blotingu pro určení toho, zda je exprimována mRNA, která hybridizuje k uvedené DNA; alternativně nebo kromě toho mohou být do otevřeného čtecího rámce zavedeny mutace a může být určen účinek mutace na fenotyp mikroorganizmu. Pokud je fenotyp změněn, pak otevřený čtecí rámec odpovídá genu. Způsoby pro identifikaci genů v DNA sekvenci jsou v tomto oboru známé.
Variantami uvedené DNA nebo variantami její části se míní jakákoliv varianta, která je definována termínem: varianta podle jednoho z aspektů předmětného vynálezu, viz výše.
Varianty VGC2 DNA Salmonella typhimurium tedy zahrnují ekvivalentní geny, nebo jejich části, z jiných druhů Salmonella, jako je Salmonella typhi a Salmonella enterica, stejně jako ekvivalentní geny, nebo jejich části, z jiných baktérií jako jsou jiné enterální bakterie.
Ekvivalentním genem se míní geny, které jsou funkčně ekvivalentní a ty, u kterých mutace vede k podobnému fenotypu (jako je avirulence). Cenné je to, že před předkládaným vynálezem nebyly VGC2 nebo geny zde obsažené identifikovány a jistě nebyly předpokládány v určení virulence.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je tedy mutantní bakterie, přičemž pokud tato bakterie normálně obsahuje gen, který je stejný nebo je ekvivalentní genu v VGC2, pak je gen mutován nebo nepřítomen v mutantní baktérii; a způsob přípravy mutantní bakterie, přičemž pokud bakterie normálně obsahuje gen, který je stejný neboje ekvivalentní genu v VGC2, pak je gen mutován nebo nepřítomen v mutantní baktérii. Dále je uvedena výhodná metoda pro inaktivaci VGC2 genu. Nejprve je gen subklonován na DNA fragmentu ze Salmonella λ DNA knihovny nebo jiné DNA knihovny za použití fragmentu VGC2 jako sondy v hybridizačním experimentu, a potom je vytvořena mapa genu s ohledem na místa pro restrikční enzymy a gen je charakterizován DNA sekvencováním v Escherichia coli. Za použití restrikčních enzymů je
-22 CZ 296981 B6 potom do kódujícího regionu genu zaveden segment DNA kódující rezistenci na antibiotika (například kanamycin), pokud možno po deleci části kódujícího regionu klonovaného genu restrikčními enzymy. Pro potvrzení toho, že inaktivace požadovaného genu je výhodně nepolární, to znamená, že neovlivňuje expresi genů downstream (po směru transkripce) od požadovaného genu jsou použitelné způsoby a DNA konstrukty obsahující markér rezistence na antibiotika. Mutovaná verze genu je potom transformována z E. coli do Salmonella typhimurium za použití transdukce fágem P22 a transdukce je ověřena Southern hybridizací pro homologní rekombinaci mutantního genu do chromozomu.
Tento přístup je obyčejně použit u Salmonella (a může být použit u A typhi), přičemž další detaily mohou být nalezeny v mnoha článcích, včetně publikaci Galan a kol., (1992), 174, 43384349.
Dalším aspektem vynálezu jsou mutantní bakterie ve vakcíně; farmaceutický prostředek obsahující uvedené bakterie a farmaceuticky akceptovatelné nosiče; polypeptid kódovaný VGC2 DNA Salmonella typhimurium nebo jeho část, nebo variantu jeho části; způsob identifikace sloučenin, které redukují schopnost bakterie infikovat nebo způsobovat chorobu u hostitele; sloučenina identifikovatelná uvedeným způsobem; molekula, která selektivně interaguje s genem ve VGC2 nebo jeho nukleovým produktem, přičemž inhibuje jeho funkci; a lékařské použití a farmaceutické kompozice.
VGC2 DNA obsahuje geny, které byly identifikovány způsobem podle vynálezu, stejně jako geny, které byly identifikovány podle jejich umístění (i když identifikovatelné způsobem podle vynálezu). Tyto další aspekty souvisí s dalšími aspekty předmětného vynálezu a tudíž i informace uvedené ve vztahu k těmto aspektům a výhodné aspekty vyjádřené ve vztahu k těmto aspektům jsou aplikovatelné na další aspekty.
Je výhodné, jestliže gen je z VGC2 neboje ekvivalentním genem z jiného druhu Salmonella jako je 5. typhi. Je výhodné, aby mutantní baktérií byla mutant Salmonella typhimurium nebo mutant z jiného druhu Salmonella jako je např. S. typhi.
Soudí se, že alespoň některé z genů ve VGC2 udělují schopnost baktérii, jako je Salmonella typhimurium, vstupovat do buněk.
Vynález bude nyní popsán s odkazem na následující příklady a obrázky.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 schématicky znázorňuje jeden zvláště výhodný způsob podle vynálezu.
Obrázek 2 ukazuje Southern hybridizační analýzu DNA z 12 exkonjugantů S. typhimurium po štěpení EcoRV. Filtr byl hybridizován se sondou genu resistence na kanamycin mini-Tn5 transposonu.
Obrázek 3 ukazuje hybridizační analýzu DNA otisku kolonie, colony blot, ze 48 exkonjugantů S. typhimurium z poloviny mikrotitračních destiček (A1-H6). Filtr byl hybridizován se sondou obsahující značené amplifikované tágy z DNA izolované ze souboru prvních 24 kolonií (A1-D6).
Obrázek 4 ukazuje colony blot hybridizační analýzu DNA ze 95 exkonjugantů S. typhimurium z mikrotitračních destiček (AI- H11), které byly ijikovány do myší. Filtry s otisky byly hybridizovány se značenými amplifíkovanými tágy ze souboru (inokulační vzorec), nebo se značenými amplifíkovanými tágy z DNA izolované z více než 10 000 sloučených kolonií, které byly odebrány ze sleziny infikovaných zvířat (slezinový vzorec). Kolonie 86, All a C8 dávaly slabé
-23 CZ 296981 B6 hybridizační signály na obou sadách filtrů. Hybridizační signály z kolonií A3, C5, G3 (aroA), a F10 jsou přítomny v inokulačním vzorci, ale nikoliv ve slezinovém vzorci.
Obrázek 5 ukazuje sekvenci Salmonella genu izolovanou za použití způsobu podle vynálezu a srovnání s Escherichia coli clp proteázovým genomem.
Obrázek 6 ukazuje částečné sekvence dalších Salmonella genů izolovaných za použití způsobu podle vynálezu (SEQ ID NO 8 až 36).
Obrázek 7 ukazuje mapování VGC2 na chromozomu Salmonella typhimurium. (A) DNA sondy ze tří regionů VGC2 byly použity v Southem hybridizačních analýzách lyzátů ze soboru kmenů Salmonella typhimurium uzavřených v Mud-P22 profágách. Jsou ukázány lyzáty, které hybridizovaly na 7,5 kb Pstl fragment (sonda A na Obrázku 8). Jiné dvě použité sondy hybridizovaly na stejné lyzáty. (B) body inserce a směry balení fágu jsou ukázány spolu s mapou pozic v minutách (vydání VIII, ref 22 v Příkladu 4). Označení fágů odpovídá následujícím kmenům: 18P, TT15242; 18Q, 15241; 19P, TT15244; 19Q, TT15243; 20P, TT15246 a 20Q, TT15245 (ref, v Příkladu 4). Umístění mapovaných genů je znázorněno horizontálními proužky, přičemž je ukázáno přibližné umístění jiných genů.
Obrázek 8 ukazuje fyzikální a genetickou mapu VGC2. (A) Pozice 16 transposonových insercí jsou ukázány nad linií. Rozsah VGC2 je ukázán silnější linií. Pozice a směr transkripce ORF popsané v textu příkladu 4 jsou ukázány šipkami pod linií, spolu se jmény podobných genů, s výjimkou ORF 12 a 13, jejichž produkty jsou podobné senzorickým a regulačním složkám, v příslušném pořadí, velkého počtu dvousložkových regulačních systémů. (B) Umístění překrývajících se klonů a EcoRI/Xbal restrikčních fragmentů z Mud-P22 profágu kmene TT15244 jsou ukázány plnými proužky. Ukázána je pouze část λ klonů, které byly mapovány, přičemž klony mohou přesahovat tyto hranice. (C) Jsou vyznačena umístění restrikčních míst: B, fiamHI; E, EcoRI; V, EcoBN; H, Hindlíí; P, Pstl; a X, Xbal. Umístění 7,5 kb Pstl fragmentu (sonda A) použitého jako sonda v Obrázku 7 a umístění 2,2 kb Pstl/Hindlíí fragmentu (sonda B) použitého jako sonda na Obrázku 10 je ukázáno pod restrikční mapou. Umístění sekvence 1 (popsané na Obrázku 11) a sekvence 2 (popsané na Obrázku 12) je ukázáno tenkou šipkou (značená sekvence 1 a sekvence 2).
Obrázek 9 popisuje mapování hranic VGC2. (A) Umístění mapovaných genů v minutách 37 až 38 na E. coli K12 chromozomu jsou seřazena s korespondujícími regiony S. typhimurium LT2 chromozomu (minuty 30 až 31). Expandovaná mapa VGC2 regionu je ukázána s 11 S. typhimurium (S t.) DNA fragmenty použitými jako sondy (tlusté proužky) a restrikčními místy použitými pro jejich generování: B, 5umHI; C, Clal; H, HindR; K, Kpril; P, Pstl; N, Mzl a S, &z/I. Sondy, které hybridizovaly na E. coli K12 (E.c.) genomovou DNA jsou ukázány jako +; ty, které selhaly při hybridizaci jsou ukázány jako -.
Obrázek 10 ukazuje, že VGC2 je sekvence konzervativní a specifická pro Salmonellae. Genomová DNA ze serovarů Salmonella a jiných patogenních baktérií byla štěpena Pstl (A), Hindlll nebo EcoRV (B) a podrobena Southern hybridizační analýze, za použití 2,2 kb Pstl/Hindlll fragmentu z λ klonu 7 jako sondy (sonda B Obrázek 2). Filtry byly hybridizovány a promyty za přísných (stringent) podmínek (A) nebo za mírných (non-stringent) podmínek (B).
Obrázek 11 ukazuje DNA sekvenci Sekvence 1 VGC2 od středu do levostranného konce (viz šipkou značenou Sekvenci 1 na Obrázku 2). DNA je translatována ve všech šesti čtecích rámcích a start a stop pozice předpokládaných genů, přičemž jsou indikovány pozice inzerce transposonů pro různé mutanty identifikované STM (SEQ ID NO:37).
-24 CZ 296981 B6
Jak je běžné, ukazuje hvězdička * stop kodon a tam, kde je to nutné je použit standardní degenerovaný nukleotidový kód.
Obrázek 12 ukazuje DNA sekvenci Sekvence 2 VGC2 (shluk C) (viz šipkou značenou Sekvenci 2 na Obrázku 2). DNA je translatována ve všech šesti čtecích rámcích, přičemž jsou indikovány start a stop pozice předpokládaných genů a pozice inserce transposonů pro různé mutanty identifikované STM (SEQ ID NO:38).
Jak je běžné, ukazuje hvězdička * stop kodon a tam, kde je to nutné je použit standardní degenerovaný nukleotidový kód.
Obrázky 7 až 12 se převážně týkají příkladu 4.
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude v dalším blíže vysvětlen s pomocí konkrétních příkladů, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.
Příklad 1
Identifikace genů virulence u Salmonella typhimurium.
Materiál a metody
Bakteriální kmeny a plazmidy
Salmonella typhimurium kmen 12023 (ekvivalentní k Američan Type Culture Collection (ATCC) kmenu 14028) byl získán z National Collection of Type Cultures (NCTC), Public Health Laboratory Service. Colindale. Londýn. UK. Spontánní mutanty tohoto kmenu resistentní na kyselinu nalidixovou (12023 Nalr) byly selektovány v laboratoři autorů. Jiný derivát kmenu 12023, CLI509 (nraA: :Tnl0) byl získán od Fred Heffřon. Escherichia coli kmeny CC118 kpir (fi(ara-leu), araD, AlacX74, galE, galK, phoA20, thi-1, rpsE, rpoB, argE (am), recAl, Apir fág lysogen), a S17-lZpzr(Tpr, Smr, recA, thi,pro, hsdR XE, RP4:2-Tc: Mu: KmTn7, Epir) byly získány od Kenneth Timmis. E. coli DH5a byla použita pro propagaci pUC18 (Gibco-BRL) a Bluescript (Stratagene) plazmidů obsahujících S. typhimurium DNA. Plazmid pUTmini-Tn5Km2 (deLorenzo a kol., 1990) byl získán od Kenneth Timmis.
Konstrukce semináhodných sekvenčních značek (tagů) a ligace
Soubor oligonukleotidů RTI (5'-CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT(NK)2O-AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG-3') (SEQ ID NO:1), a primery P2 (5-TACCTACAACCTCAAGCT3') (SEQ ID NO:2), P3 (5-CATGGTACCCATTCTAAC-3') (SEQ ID NO: 3), P4 (5'TACCCATTCTAACCAAGC-3') (SEQ ID NO:4) a P5 (5-CTAGGTACCTACAACCTC-31) (SEQ ID NO:5) byly syntetizovány na syntezátoru oligonukleotidů (Applied Biosystems, model 380B). Dvouřetězcové DNA tágy byly připraveny z RTI v 100 μΐ objemu PCR obsahujícím 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCI, a 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) s 200 pg RTI jako cílem; 250 μΜ od každého dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 100 pM primerů P3 a P5; a 2,5 U Amplitaq (Perkin Elmer Cetus). Podmínky tepelného cyklování byly 30 cyklů 95 °C po 30 s, 50 °C po 45 s, a 72 °C po 10 s. PCR produkt byl purifikován na gelu (Sambrook a kol., 1989), vyčištěn elutipD kolonou (od Schleicher a Schull) a štěpen KpnI před ligací do pUC18 nebo pUTmini-Tn5Km2. Pro ligaci byly plazmidy štěpeny KpnI a defosforylovány telecí střevní alkalickou fosfatázou (GibcoBRL).
-25 CZ 296981 B6
Linearizované molekuly plazmidů byly purifikovány na gelu (Sambrook a kol., 1989) před ligací, pro odstranění jakékoliv residuální nenaštěpené plazmidové DNA. Ligační reakce obsahovaly přibližně 50 ng každého plazmidů a dvouřetězcové DNA tágy ve 25 μΐ objemu s 1 jednotkou T4 DNA ligázy (Gibco-BRL) v pufru doplněném enzymem. Ligace byla prováděna po 2 hodiny při 24 °C. Pro určení části bakteriálních kolonií vzniklých z buď vlastní ligace plazmidové DNA, nebo z nesestřižené DNA byla provedena kontrolní reakce, ve které byl dvouřetězcový DNA tag vynechán v ligační reakci. Toto nevedlo k žádným rezistentním bakteriálním koloniím po transformaci E. coli CC118 (Sambrook a kol., 1989) ve srovnání se 185 koloniemi vzniklými z ligační reakce obsahující dvouřetězcové DNA tágy.
Transformace a konjugace baktérií
Produkty několika ligací mezi pUT mini-Tn5Km2 a dvouřetězcovou DNA tagů byly použity pro transformaci E. coli CC118 (Sambrook a kol., 1989). Celkem bylo shromážděno asi 10 300 transformantů a plazmidová DNA získaná z tohoto souboru byla použita pro transformaci E. coli S-17 Tpir (deLorenzo a Timmins, 1994). Pro konjugační experimenty byly soubory přibližně 40 000 ampicilin resistentních E. coli S-17 Xpir transformantů a S. typhimurium 12 023 Nalr kultivovány separátně do optické density (OD)58o 1,0. Alikvoty každé kultury (0,4 ml) byly smíšeny v 5 ml 10 mM MgSO4 a filtrovány Millipore membránou (0,45 μιη průměr). Filtry byly umístěny na povrch agaru obsahujícího M9 sole (deLorenzo a Timmins, 1994) a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin. Bakterie byly získány třepáním filtru v kapalném LB médiu po dobu 40 minut při teplotě 37 °C, přičemž exkonjuganty byly selektovány nanesením suspenze na LB médium obsahující 100 pg ml'1 kyseliny nalidixové (pro selekci proti donorovému kmenu) a 50 pg ml’1 kanamycinu (pro selekci na kmenu příjemce). Každý exkonjugant byl ověřen přenosem kolonií resistentních na kyselinu nalidixovou (naf), a resistentních na kanamycin (kan1) do MacConkey laktózového indikátorového média (pro odlišení mezi E. coli a S typhimurium), a LB modia obsahujícího ampicilin. Přibližně 90 % nalr, kanr kolonií bylo senzitivních na ampicilin, což ukazuje, že toto je v důsledku autentické transpozice (deLorenzo a Timmins, 1994). Jednotlivé ampicilin senzitivní exkonjuganty byly uskladněny ve 96 jamkových mikrotitračních destičkách obsahujících LB medium. Pro dlouhodobé skladování při teplotě -80 °C bylo do média přidáno buď 7 % DMSO, nebo 15 % glycerolu.
Fenotypická charakterizace mutantů
Mutanty byly přeneseny otiskem z mikrotitračních destiček na pevné modium obsahující M9 sole a 0,4% glukózu (Sambrook a kol., 1989) pro identifikaci auxotrofů. Mutanty s přibližnou morfologií kolonií byly detekovány mikroskopováním kolonií při malém zvětšení na agarových plotnách.
Bloty (otisky) kolonií. DNA extrakce. PCR, DNA značení a hybridizace.
Pro bloty kolonií pro hybridizaci byl použit 48 jamkový kovový replikátor (Sigma) pro přenos exkonjugantů z mikrotitračních destiček na filtry Hybond N (Amersham. UK), které byly potom umístěny na povrchu LB agaru obsahujícího 50 pg ml'1 kanamycinu. Po inkubaci přes noc při teplotě 37 °C byly filtry nesoucí bakteriální kolonie odstraněny a sušeny při teplotě místnosti po 10 minut. Bakterie byly lyžovány 0,4 N NaoH a filtry byly promyty 0,5 Tris-Cl pH 7,0 podle instrukcí výrobce filtru. Bakteriální DNA byla fixována na filtry vystavením UV světlu pomocí zařízení Stratalinker (Stratagene). Hybridizace se 32p-značenými sondami byla provedena za přísných podmínek jak bylo dříve popsáno (Holden a kol., 1989). Pro DNA extrakci byly S. typhimurium transposonové mutantní kmeny kultivovány v kapalném LB médiu na mikrotitračních destičkách nebo resuspendovány v LB médiu po kultivaci na pevném médiu. Celková DNA byla připravena za pomoci hexadecyltrimethylammoniumbromidové (CTAB) metody podle Ausubel a kol., (1987). Stručně, buňky ze 150 až 1000 μΐ objemu byly precipitovány centrifugací
-26CZ 296981 B6 a resuspendovány v 576 μΐ TE. K těmto bylo přidáno 15 μΐ 20% SDS a 3 pl 20 mg ml'1 proteinázy K. Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny bylo přidáno 166 μΐ 3M NaCl a promíseno, načež následoval přídavek 80 μΐ 10% (hmotnost/objem) CTAB a 0,7 M NaCl. Po promíchání byl roztok inkubován při teplotě 65 °C po dobu 10 minut. Po extrakci fenol-chloroformem byla DNA precipitována přidáním isopropanolu, promyta 70% ethanolem a resuspendována v TE v koncentraci přibližně 1 pg pl*1.
DNA vzorky byly podrobeny dvěma zpracováním PCR pro generování značených sond. První zpracování PCR bylo provedeno v 100 pl reakčním prostředí obsahujícím 20 mM Tris-Cl pH 8,3; 50 mM KC1; 2 mM MgCl2; 0,01% Tween 80; 200 pM každého dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 2,5 jednotek Amplitaq polymerázy (Perkin-Elmer Cetus); 770 ng každého primeru P2 a P4; a 5 pg cílové DNA. Po počáteční denaturaci po dobu 4 minut při teplotě 95 °C tepelné cyklování sestávalo z 20 cyklů 45 s při 50 °C, 10 s při 72 °C, a 30 s při 95 °C. PCR produkty byly extrahovány chloroform/isoamyl alkoholem (24/1) a precipitovány ethanolem. DNA byla resuspendována v 10 pl TE a PCR produkty byly purifíkovány elektroforézou na 1,6% Seaplaque (FMC Bioproducts) gelu v TAE pufru. Proužky gelu obsahující fragmenty okolo 80 bp byly vyříznuty a použity pro druhou PCR. Tato reakce byla provedena ve 20 pl celkového objemu a obsahovala 20 mM Tris-Cl pH 8,3; 50 mM KCI; 2 mM MgCl2; 0,01% Tween 80; 50 pM každého dATP, dGTP, a dTTP; 10 pl 32p-dCTP (3000 Ci/mmol. Amersham; 150 ng každého primeru P2 a P4; a přibližně 10 ng cílové DNA (1-2 pl 1,6% Seaplaque agarózy obsahující produkt prvního kola PCR); 0,5 jednotek Amplitaq polymerázy. Toto reakční prostředí bylo překryto 20 pl minerálního oleje, přičemž tepelné cyklování bylo provedeno jak bylo popsáno výše. Inkorporace radioaktivní značky byla kvantifikována absorbancí na filtrační papír WhatmanDE81 (Sambrook a kol., 1989).
Studie infekce
Jednotlivé exkonjuganty Salmonella obsahující cílové transposony byly kultivovány v 2% tryptonu, 1% kvasinkovém extraktu, 0,92% objem/objem glycerolu, 0,5% Na2PO4i 1% KN03 (TYGPN médium) (Ausubel a kol., 1987) na mikrotitračních destičkách přes noc při teplotě 37 °C. Kovový replikátor byl použit pro přenos malého objemu kultury kultivované přes noc na novou mikrotitrační destičku a kultura byla inkubována při teplotě 37 °C dokud ODsso (měřené za použití Titertek Multiscan čtečky mikrotitračních destiček) nebylo asi 0,2 v každé jamce. Kultury z jednotlivých jamek byly potom shromážděny a OD580 byla určena za použití spektrofotometru. Kultura byla naředěna sterilním fyziologickým roztokem na přibližně 5x105 cfu ml·1. Další ředění bylo umístěno na TYGPN obsahující kyselinu nalidixovou (100 mg ml*1) a kanamycin (50 mg ml'1) pro potvrzení cfu přítomných v inokulu.
Skupiny tří samic BALB/c myší (20 až 25g) byly injikovány intraperitoneálně 0,2 ml bakteriální suspenze obsahující přibližně lxl05 cfu ml*1. Myši byly utraceny tři dny po inokulaci a jejich sleziny byly vyjmuty pro získání baktérií. Polovina každé sleziny byla homogenizována v 1 ml sterilního fyziologického roztoku v mikroodstředivkové zkumavce. Bylo umožněno usazení buněčné drti a 1 ml fyziologického roztoku ještě obsahujícího buňky v suspenzi byl přesunut do nové zkumavky a centrifugován po dvě minuty v mikroodstředivce. Supematant byl odstraněn odsátím a pelety byly resuspendovány v 1 ml sterilní destilované vody. Dále bylo provedeno naředění destilovanou vodou za vzniku naředěné série, přičemž 100 ml každého naředěného podílu bylo umístěno na TZGPN agar obsahující kyselinu nalidixovou (100 pg ml'1) a kanamycin (50 pg ml*1). Bakterie byly odebrány z destiček obsahujících asi 1000 až 4000 kolonií, a celkové množství více než 10 000 kolonií odebraných z každé sleziny bylo shromážděno a použito pro přípravu DNA pro PCR generování sond pro vyšetření blotů (otisků) kolonií.
-27 CZ 296981 B6
Klonování genu virulence a DNA sekvencování
Celková DNA byla izolována z exkonjugantů S. typhimurium a štěpena separátně Sstl. Sáli. Pstl a Sphl. Produkty štěpení byly frakcionovány na agarózových gelech, přeneseny na membránu Hybond N4 (Amersham) a podrobeny Southern hybridizačním analýzám za použití genu rezistence na kanamycin pUT mini-Tn5Km2 jako sondy. Sonda byla značena digoxygeninem (Boehringer-Mannheim) a detekce chemiluminiscence byla provedena podle instrukcí výrobce. Hybridizační a promývací podmínky byly stejné, jako je popsáno výše. Restrikční enzymy, které dávaly vzniknout hybridizačním fragmentům v rozsahu 3 až 5 kb byly použity pro štěpení DNA pro preparativní agarózový gel, a DNA fragmenty odpovídající velikosti hybridizačních signálů byly vyříznuty z gelu, purifíkovány a ligovány do pUC18. Ligační reakce byly použity pro transformaci E. coli DH5a na kanamycinovou resistenci. Plazmidy z kanamycin resistentních transformantů byly purifíkovány na koloně elutipD a ověřeny štěpením restrikčním enzymem. Plazmidové inserty byly částečně sekvencovány di-deoxy metodou (Sanger a kol., 1977) za použití 40 primeru a reverzního sekvencovacího primeru (United States Biochemical Corporation) a primerů P6 (5'-CCTAGGCGGCCAGATCTGAT-3') (SEQ ID NO:6) a P7 (5'-GCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3') (SEQ ID NO: 7), které tepelně hybridizují na I a O konec Tn5, v příslušném pořadí. Nukleotidové sekvence a odvozené aminokyselinové sekvence byly sestaveny za použití Macvector 3.5 softwaru na počítači Macinthosh SE/30. Sekvence byly srovnány s DNA databázemi EMBL a Genbank za použití UNIX/SUN systému v Human Genome Mapping Project Resource Centre. Harrow. UK.
Výsledky
Příprava sekvenčních značek (tagů)
Struktura DNA tagů je ukázána na obrázku la. Každý tag se skládá z variabilního centrálního úseku obklopeného raménky invariantní sekvence. Sekvence centrálního úseku ((NK) 20) byla navržena tak, aby bylo zabráněno výskytu 6 bp-rozpoznávacích míst obecně používaných restrikčních enzymů, aleje dostatečně variabilní pro zajištění toho, aby se statisticky stejná sekvence mohla vyskytnout pouze jedenkrát mezi 2 x 1011 molekulami (DNA sekvencování 12 náhodně vybraných smyček ukázalo, že žádné nemají více než 50% identitu ve variabilním úseku). (N znamená jakoukoliv bázi (A, G, C nebo T) a K znamená G nebo T.) Raménka obsahující Kpn\ místa blízko koncům usnadňují počáteční krok klonování, a HindWi místa na hranicích s variabilním úsekem byly použity pro uvolnění radioaktivně značených variabilních úseků z ramének před hybridizační analýzou. Raménka byla také navržena tak, aby primery P2 a P4 obsahovaly pouze jedno guaninové residuum. Proto během PCR za použití těchto primerů bude pouze jeden cytosin inkorporován do nově syntetizovaného raménka, ve srovnání s průměrně deseti v jedinečné sekvenci. Pokud je radioaktivně značený dCTP obsažen v PCR, pak bude v průměru desetkrát více značky přítomno v jedinečné sekvenci ve srovnání s každým raménkem. Toto je z důvodů minimalizace hybridizačních signálů z ramének, poté, co j sou uvolněny z unikátní sekvence štěpením HindíTÍ. Dvouřetězcové tágy byly ligovány do Kprií míst mini-Tn5 transposonu Km2, neseného na plazmidu pUT (de Lorenzo and Timmins, 1994). Replikace tohoto plazmidu je závislá na R6K-specifíckém π produktu pir genu. Nese orzT sekvenci RP4 plazmidu, dovolující přenos na škálu bakteriálních druhů (Miller a Mekalanos, 1988), a tnp+ gen potřebný pro transpozici mini-Tn5 elementu. Tágem opatřené mini-Tn5 transposony byly přeneseny do S. typhimurium konjugací, a 228 exkonjugantů vzniklých z transpozice bylo uskladněno v jamkách mikrotitrační destičky. Celková DNA izolovaná z 12 z nich byla štěpena EcóPN, a podrobena Southern hybridizační analýze za použití genu rezistence na kanamycin mini-Tn5 transposonu jako sondy. V každém případě exkonjuganty vznikly v důsledku jedné integrace transposonu do jiného místa bakteriálního genomu (Obrázek 2).
-28 CZ 296981 B6
Studie specificity a senzitivity
Dále byla sledována účinnost a uniformita amplifikace DNA tagů v PCR obsahující soubory DNA z exkonjugantů jako cíle pro reakci. Ve snaze o minimalizaci nestejné amplifikace tagů v PCR se určovalo maximální množství cílové DNA, která může být použita v 100 μΐ reakci, a minimální počet PCR cyklů, které vedou k produktům, které mohou být vizualizovány barvením agarózového gelu ethidium bromidem (5 pg DNA a 20 cyklů, v příslušném pořadí).
S. typhimurium exkonjuganty, které dosáhly stacionární růstové fáze na mikrotitračních destičkách byly kombinovány a použity pro extrakci DNA. Ta byla podrobena PCR za použití primerů P2 a P4. PCR produkty o 80 bp byly purifikovány na gelu a použity jako cíl pro druhou PCR, za použití stejných primerů, ale s 32p-značeným CTP. Toto vedlo k více než 60% inkorporaci radioaktivně značeného dCTP do PCR produktů. Radioaktivně značené produkty byly štěpeny HindíS. a použity pro sondování otisků (blotů) DNA kolonií z jejich odpovídajících mikrotitračních destiček. Z 1510 mutantů testovaných tímto způsobem selhalo 358 v poskytnutí jasného signálu na autoradiogramu po expozici blotu kolonií přes noc. Pro toto existují tři potenciální vysvětlení. První je, že je možné, že část transposonů nenese tágy. Nicméně, srovnáním frekvencí transformací vzešlých z ligačních reakcí obsahujících transposon v přítomnosti nebo nepřítomnosti tagů se zdá nepravděpodobné, že transposony neopatřené tágy mohou dosáhnout více než přibližně 0,5 % celkového počtu (viz. Materiál a metody). Pravděpodobnější příčinou je, že variabilní sekvence byla zkrácena v některém tágu a/nebo že některé sekvence vytvářely sekundární strukturu, kde obě tyto události mohou zabránit amplifíkaci. Mutanty, které selhaly v dávání jasného signálu nebyly zahrnuty do dalších studií. Specifícita účinnosti amplifikovatelných tagů byla demonstrována generováním sondy ze 24 kolonií mikrotitrační destičky a jejich použitím pro screennig blotů kolonií 48 kolonií, které obsahovaly 24 kolonií použitých pro generování sondy. Nepřítomnost jakéhokoliv hybridizačního signálu z 24 kolonií nepoužitých pro generování sondy (Obrázek 3) ukázal, že použité podmínky hybridizace byly dostatečně přísné pro zabránění zkřížené hybridizace mezi značenými tágy, a napovídá, že žádný exkonjugant není znovu opakován v mikrotitrační destičce.
Dále bylo předmětem studie určení maximální velikosti souboru, který může být použit jako inokulum v experimentu na zvířeti. Protože množství značeného tágu pro každý transposon je v inverzním vztahu ke komplexitě souboru tagů, existuje limit velikosti souboru tagů, nad kterým je hybridizační signál příliš slabý pro detekování při expozici autoradiogramu přes noc. Důležitější je, že jak se komplexita souboru zvyšuje, tak se musí vyskytovat pravděpodobnost selhání virulentních reprezentantů souboru ve slezině infikovaných zvířat pro produkci dostatku značené sondy. Nebyla stanovena horní hranice velikosti souboru v myším modelu salmonelózy, který byl použit, ale s jistotou přesahuje 96.
Testy virulence transposonových mutantů
Celkem 1152 inserčních mutantů opatřených jedinečnými tágy (ze dvou mikrotitračních destiček) bylo testováno na virulenci v BALB/c myších v dvanácti souborech, kdy každý reprezentoval jednu mikrotitrační destičku. Zvířata obdržela intraperitoneální injekci přibližně 103 buněk každého z 96 transposonových mutantů mikrotitrační plotny (celkem 105 organizmů). Tři dny po injekci byly myši utraceny a byly získány bakterie po nanesení homogenátů sleziny na laboratorní médium. Přibližně 10 000 kolonií získaných z každé myši bylo shromážděno, načež byla extrahována DNA. Tágy přítomné v těchto DNA vzorcích byly amplifikovány a značeny PCR, a bloty kolonií byly screenovány a srovnány s hybridizačními vzorky získanými za použití tagů amplifíkovaných z inokula (obrázek 3). Jako kontrola, aroA mutant S. typhimurium byl opatřen tágem a využit jako jeden z 96 mutantů v inokulu. U tohoto kmenu nebylo očekáváno, že bude získán ze sleziny, neboť jeho virulence je vážně zeslabena (Buchmeier a kol., 1993). Bylo identifikováno 41 mutantů, jejichž DNA hybridizovala na značené tágy z inokula, ale nikoliv na zna
-29 CZ 296981 B6 čené tágy z baktérií získaných ze sleziny. Pokus byl opakován a znovu bylo identifikováno stejných 41 mutantů. Dva z nich byly aroA mutanty (jeden z každého souboru), jak bylo očekáváno. Jiný byl auxotrofický mutant (selhal v růstu na minimálním médiu). Všechny mutanty měly normální morfologii kolonií.
Příklad 2
Klonování a částečná charakterizace sekvencí obklopujících transposon
DNA byla extrahována z jednoho z mutantů popsaných v Příkladu 1 (soubor 1, F10), byla štěpena &/I a subklonována na základě rezistence na kanamycin. Sekvence o 450 bp sousedící s jedním koncem transposonu byla určena za použití primeru P7. Tato sekvence vykazovala 80% identitu s clp (Ion) genem E. coli, který kóduje teplem-regulovanou proteázu (Obrázek 5). Do našeho výzkumu nebyl tento gen předpokládán jako determinanta virulence.
Částečné sekvence třinácti dalších genů virulence Salmonella typhimurium jsou ukázány na obrázku 6 (sekvence A2 až A9 a 81 až B5). Odvozené aminokyselinové sekvence P2D6, S4C3, P3F4, P7G2 a P9B7 mají podobnost s rodinou sekrečně asociovaných proteinů, které byly konzervovány u bakteriálních patogenů zvířat a rostlin, a které jsou známé u Salmonell jako rodina inv. U 5. typhimurium jsou inv geny vyžadovány pro invazi baktérií do střevní tkáně. Virulence inv genů je oslabena, pokud jsou inokulovány peorální cestou, ale nikoliv, pokud jsou podány intraperitoneálně. Objev znv-příbuzných genů, které jsou vyžadovány pro virulenci po intraperitoneální inokulaci naznačuje nový sekreční aparát, který může být vyžadován pro invazi nefagocytujících buněk sleziny a jiných orgánů. Produkty těchto nových genů mohou být lepším cílem pro léčiva, než inv proteiny v léčbě rozvinutých infekcí.
Další charakterizace genů identifikovaných v tomto příkladu je popsána v příkladu 4.
Příklad 3
Určení LD50 a studie vakcinace myší
Mutace identifikované způsobem podle vynálezu oslabují virulenci.
Pět mutací genů, o kterých se dříve nepředpokládalo, že se účastní virulence, bylo transferováno P22-zprostředkovanou transdukcí do rodičovského kmenu S. typhimurium 12028 senzitivního na kyselinu nalidixovou. Transduktanty byly ověřeny restrikčním mapováním a potom byly injikovány intraperitoneálně do skupin BALB/c myší pro určení jejich 50% letální dávky (LD50). LD50 hodnoty pro mutanty S4C3, P7G2, P3F4 a P9B7 byly ve všech směrech vyšší než pro kmeny divokého typu. Žádný rozdíl v LD50 nebyl detekován pro mutant P1F10; nicméně zde bylo statisticky významné snížení v části P1F10 buněk odebraných ze slezin myší injikovaných inokulem skládajícím se ze stejných částí tohoto kmenu a kmenu divokého typu. Toto naznačuje, že tato mutace oslabuje virulenci, ale na stupen, který není detekovatelný pomocí LD50.
Mutanty P3F4 a P9B7 byly také podány perorální cestou za velikosti inokula 107 buněk/myš. Žádná z myší neonemocněla, což ukazuje, že perorální hladiny LD5 0 jsou vyšší než pro divoký typ kmenu.
Ve studiích vakcinace myší byly skupiny pěti samic BALB/c myší o hmotnosti 20 až 25 gramů počátečně inokulovány perorálně (p.o.) nebo intraperitoneálně (i.p.) sérií desetinásobného ředění mutantních kmenů Salmonella typhimurium P3F4 a P9B7. Po čtyřech týdnech byly myši inokulovány 500 c.f.u. parenterálního kmenu divokého typu. Úhyny pak byly zaznamenávány během čtyř týdnů.
-30CZ 296981 B6
Skupina dvou myší stejného věku a vrhu jako myši inokulované mutantním kmenem byla také inokulována i.p. 500 c.f.u. kmenu divokého typu jako pozitivní kontrola. Obě neimunizované myši uhynuly během čtyřech týdnů, jak bylo očekáváno.
Výsledky jsou uvedeny v tabulkách níže:
1) p.o. počáteční inokulace mutantním kmenem P3F4
Počáteční inokulum v c.f.u. počet myších přežívajících první imunizaci počet myší přežívajících imunizaci divokým typem
5 x 109 —— 5 2 (40 %)
5 x 10® 5 2 (40 %)
5 X 107 5 0 (0 %)
2) i.p. počáteční inokulace mutantním kmenem P3F4
Počáteční inokulum v c.f.u. počet myších přežívajících první imunizaci počet myší přežívajících imunizaci divokým typem
5 x 10* ” ~ 3 3 (100 %)
5 x 10s 5 4 (80 %)
5 x 104 6 5 (83 %)
5 x 103 5 4 (80 %)
3) p.o. počáteční inokulace mutantním kmenem P9B7
Počáteční inokulum v c.f.u. počet myších přežíváj ících první imunizaci počet myší přežívajících imunizaci divokým typem
5 x 109 5 0 (0 %)
4) i.p. počáteční inokulace mutantním kmenem p9B7
Počáteční inokulum v c.f.u. počet myších přežívajících první imunizaci počet myší přežívajících imun i z ac i divokým typem
5 x 106 4 2 (50 %)
-31 CZ 296981 B6
Z těchto pokusů lze usuzovat, že u mutantu P3F4 se zdá, že dává nějakou ochranu před následujícím vystavením divokému typu. Tato ochrana se zdá být vyšší pro myši imunizované i.p.
Příklad 4
Ildentifikace lokusu virulence kódujícího druhý typ III sekrečního systému u Salmonella typhimurium
Zkratky použité v tomto příkladu jsou VGC1, shluk (cluster) genu virulence 1; VGC2, shluk genu virulence 2.
Oblast pokusu
Salmonella typhimurium je základní příčinné agens gastroenteritidy u lidí a způsobuje systémové onemocnění u myší, které slouží jako model pro tyfovou horečku u lidí (1). Po perorální inokulaci myší S. typhimurium prochází bakterie skrz lumen tenkého střeva do střevní mukózy prostřednictvím enterocytů nebo M buněk folikulů Peyerových plátů (2). Bakterie potom vstupuje do makrofágů a neutrofílů, vstupuje do retikuloendoteliálního systému a diseminuje se do jiných orgánů, včetně sleziny a jater, kde další reprodukce vede k přemnožení a fatální bakteriémii (3). Pro invazi do hostitele, pro přežití v různých fyziologicky stresujících intracelulámích a extracelulárních prostředích a za okolních antibakteriálních aktivit imunitního systému využívá S. typhimurium složitý repertoár faktorů virulence (4).
Pro pochopení mechanismů virulence S. typhimurium a jiných patogenů byl využit systém mutageneze transposonů popsaný v příkladu 1, který je běžně nazýván signatuře tagged mutagenezis (STM), který kombinuje sílu mutační analýzy se schopností sledovat simultánně osud velkého množství různých mutantů v jednotlivém zvířeti (5 a příklad 1; odkaz 5 byl publikován po datu priority tohoto vynálezu). Za použití tohoto přístupu jsme identifikovali 43 mutantů s oslabenou virulencí z celkového počtu 1152 mutantů, které byly vyšetřovány. Nukleotidová sekvence DNA obklopující inserční body transposonů u 5 z těchto mutantů ukázaly, že jsou příbuzné ke genům kódujícím typ III sekrečních systémů různých bakteriálních patogenů (6, 7). Produkty inv/spa genových shluků S. typhimurium (8, 9) jsou proteiny, které vytvářejí typ III sekrečního systému vyžadovaného pro sestavení povrchových přívěsků zprostředkujících vstup do epiteliálních buněk (10). Proto je virulence kmenů nesoucích mutace v inv/spa seskupení atenuována pouze tehdy, pokud je inokulum podáno perorálně, a nikoliv je-li podáno intraperitoneálně (8). Oproti tomu 5 mutantů identifikovaných STM je avirulentních po intraperitoneální inokulaci (5).
V tomto příkladu je ukázáno, že inserční body transposonů těchto 5 mutantů a dalších 11 mutantů identifikovaných STM všechny mapují stejný region S. typhimurium chromozomu. Další analýzy tohoto úseku odhalily další geny, jejichž produkty mají podobnost sekvence s jinými složkami typu III sekrečních systémů. Tento chromozomální úsek, který označujeme jako shluk genu virulence 2 (VGC2) není přítomen v mnoha jiných střevních baktérií a reprezentuje důležitý lokus pro virulenci S. typhimurium.
Materiál a metody
Bakteriální kmeny, transdukce a kultivační média.
Salmonella enterica serotypy 5791 (aberdeen), 423180 (gallinarum), 7101 (cubana), a 12416 (typhimurium LT2) byly získány z National Collection of Type Cultures. Public Health Laboratory Service. UK. Genomová DNA Salmonella typhi BRD 123 byla získána od G. Dougan, enteropatogenní Escherichia coli (EPEC), enterohemorhagická E. coli (EHEC), Vibrio cholerae bio
-32CZ 296981 B6 typ El Tor, shigella flexneri serotyp 2 a Staphylococcus aureus byly klinické izoláty získané od Department of Infectious Diseases and Bacteriology. Royal Postgraduate Medical School. UK. Genomová DNA z Yersinia pestis byla získána od J. Heesemann. Nicméně, genomová DNA mohla být izolována za použití standardních metod. Bakteriální kmeny a metody použité pro generování signaturetagged (podepsaných sekvenční značkou) mini-Tn5 transposonových mutantů S. typhimurium NCTC kmene 12023 byly popsány dříve (5, 11). Rutinní propagace plazmidů byla v E. coli DH5cc. Bakterie byly kultivovány v LB bujónu (12) doplněném vhodnými antibiotiky. Předtím, než byla hodnocena úroveň virulence byly mutace nejprve přeneseny fágem P22 zprostředkovanou transdukcí (12) do rodičovských kmenů S. typhimurium 12023 senzitivních na kyselinu nalidixovou. Transduktanty byly analyzovány restrikčním štěpením a Southern hybridizací před použitím jako inokulum.
Vyšetření Lambda knihovny
Lambda (λ) klony s překrývajícími se inserty DNA pokrývající VGC2 byly získány standardními metodami (13) z λ1059 knihovny (14) obsahující inserty z částečného Sau3A. štěpení S. typhimurium LT2 genomové DNA. Knihovna byla získána prostřednictvím K. Sandersona, ze Salmonella Genetics Stock Centre (SGSC), Calgary. Canada.
Mud-P22 Lysogeny
Radioaktivně značené DNA sondy byly hybridizovány na filtry Hybond N (Amersham) nesoucí DNA připravenou z lysátů souboru S. typhimurium kmenů nesoucích Mud-P22 profágy ve známé pozici genomu S. typhimurium. Příprava mitomycinem indukovaných Mud-Y22 lyzátů byla jak je popsáno (12, 15). Sada Mud-P22 profágů byla původně sestavena Bensonem a Goldmanem (16) a byla získána z SGSC.
Gelová elektroforéza a Southern hybridizace
Gelová elektroforéza byla provedena v 1% nebo 0,6% agarózových gelech v 0,5 x TBE. Na gelu frakcionovaná DNA byla přenesena na membránu Hybond N nebo N+ (Amersham) a přísná hybridizace a promývací postupy (dovolující hybridizací mezi nukleotidovými sekvencemi s 10% nebo menším chybným párováním) byly provedeny stejným způsobem, jako je uvedeno v publikaci Holden a kol., (17). Za mírných podmínek (umožňujících hybridizací mezi sekvencemi s 50% chybným párováním) byly filtry hybridizovány přes noc při teplotě 42 °C v 10% formamidu/0,25 M Na2HPO4/7% SDS a nejpřísnější krok byl s 20 mM Na2HPO4/l% SDS při teplotě 42 °C. DNA fragmenty použité jako sondy byly značeny (32p) dCTP) za použití Radprime systému (Gibco-BRL) nebo (digoxigeninem-11) dUTP a detegovány za použití Digoxigenin systému (Boehringer-Mannheim) podle instrukcí výrobce, kromě toho, že hybridizace byla provedena ve stejném roztoku, jaký byl použit pro radioaktivně značené sondy. Genomová DNA byla připravena pro Southern hybridizací jak bylo popsáno dříve (13).
Molekulární klonování a DNA sekvencováni
Restrikční endonukleázy a T4 DNA ligáza byly získány od Gibco-BRL. Obecné techniky molekulární biologie byly stejné, jak je popsáno v publikaci Sambrook a kol. (18). Sekvencováni nukleotidů bylo provedeno dideoxy-terminační metodou (19) za použití T7 sekvenačního kitu (Pharmacia). Sekvence byly sestaveny za použití softwaru MacVector 3.5 nebo AssemblyLIGN. Nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence byly srovnány se sekvencemi v databázích European Molecular Biology Laboratory (EMBL) a SwissProt za použití programů BLAST a FASTA z balíku GCG z University of Wisconsin (verse 8) (20) na internetové službě v Human Genome Mapping Project Resource Centre. Hinxton. UK.
-33 CZ 296981 B6
Testy virulence
Skupiny pěti samic BALB/c myší (20 až 25 gramů) byly inokulovány perorálně (p.o.) nebo intraperitoneálně (i.p.) 10 násobným ředěním baktérií ředěných ve fyziologickém roztoku. Pro přípravu inokula byly bakterie kultivovány přes noc při teplotě 37 °C v LB bujónu s třepáním (50 otáček za minutu) a potom použity pro inokulaci čerstvého média po různou dobu dokud nebyla dosažena optická hustota (OD) při 560 nm 0,4 až 0,6. Pro hustoty buněk 5 x 108 kolonie vytvářející jednotky (cfu) na ml a vyšší byly kultury koncentrovány centrifugací a resuspendováním ve fyziologickém roztoku. Koncentrace cfu/ml byla ověřena umístěním sérií ředění inokula na LB agarové plotny. Myši byly inokulovány i.p. 0,2 ml objemy a p.o. podáním stejného objemu inokula. LD50 hodnoty byly vypočítány po 28 dnech metodou podle Reed and Meunch (21).
Výsledky
Lokalizace transposonových insercí
Generování banky Salmonella typhimurium mini Tn5 transposonových mutantů a vyšetření použitá pro identifikaci 43 mutantů s oslabenou virulenci byla popsána dříve (5). Transposony a obklopující DNA regiony byly klonovány z exkonjugantů selekcí pro rezistenci na kanamycin nebo inversní PCR. Nukleotidové sekvence o 300 až 600 bp DNA obklopující transposony byly získány pro 33 mutantů. Srovnání těchto sekvencí se sekvencemi v DNA a proteinových databázích ukázalo, že 14 mutantů vzešlo z transposonových insercí do dříve známých genů virulence, 7 vzniklo z insercí do nových genů podobných známým genům enterobaktérií a 12 vzniklo z insercí do sekvencí bez podobnosti se sekvencemi, které již jsou v DNA a proteinových databázích (odkaz 5, příklad la tento příklad).
Tři linie důkazu naznačují, že 16 z 19 transposonových insercí do nových sekvencí bylo seskupeno do tří úseků genomu, na začátku označených A, B a C. Za prvé, srovnání nukleotidové sekvence z úseků obklopujících body inserce transposonů navzájem a se sekvencemi v databázích ukázalo, že některé sekvence se překrývají s jinými nebo mají silnou podobnost s jinými úseky stejného genu. Za druhé, Southern analýza genomové DNA štěpené několika restrikčními enzymy a sondované restrikčními fragmenty obklopujícími body inserce transposonů ukázala, že některé transposonové inserce byly umístěny na stejných restrikčních fragmentech. Za třetí, pokud stejná DNA sonda byla hybridizována na plaky z S. typhimurium λ DNA knihovny, pak sondy z mutantů, u kterých předchozí dva kroky naznačovaly, že mohou být ve vazbě, hybridizovaly na stejné λ DNA klony. Tak dva mutanty (P9B7 a P12F5) byly zařazeny do shluku A, pět mutantů (P2D6, P9B6, P11C3, P11D10 a P11H10) do shluku B a devět mutantů (P3F4, P4F8, P7A3, P7B8, P7G2, P8G12, P9G4, P10E11 a PÍ 1B9) do shluku C (obrázek 8).
Hybridizace DNA sond z těchto tří shluků na lysáty ze souboru S. typhimurium nesoucích MudP22 profágy (15, 16) ukázalo, že tři lokusy byly všechny umístěny v minutě 30 až 31 úseku (odkaz 22, vydání VII) (Obrázek 7), což ukazuje, že tyto tři lokusy byly těsně vázány nebo vytvářely velký lokus virulence. Pro určení toho, zda jakýkoliv z λ klonů pokrývá shluky A, B a C obsažené v překrývajících se DNA insertech byly DNA fragmenty z terminálních regionů každého klonu použity jako sondy v Southern hybridizační analýze jiných λ klonů. Hybridizace DNA fragmentů ukázala, že některé λ klony se překrývají a že shluky A, B a C obsahují jeden souvislý úsek (obrázek 8). DNA fragmenty z konců tohoto úseku byly použity pro sondování lambda knihovny pro identifikaci dalších klonů obsahujících inserty reprezentující sousedící regiony. Nebyly identifikovány žádné λ klony, které by pokrývaly úplně pravostranný konec lokusu, takže tento úsek byl získán klonováním 6,5 kb EcoPA/Xbal fragmentu z lyzátu Mud-Y22 profágového kmenu TT15244 (16).
-34 CZ 296981 B6
Restrikční mapování a Southern hybridizační analýza byly potom použity pro konstrukci fyzikální mapy tohoto lokusu (obrázek 8). Pro odlišní tohoto lokusu od dobře charakterizovaného shluku inv/spa genů v minutě 63 (vydání VIII, ref 22) (8, 9, 23, 24, 25, 26) bylo pro tento shluk užito označení shluk genu virulence 1 (VGC1) a nový lokus virulence byl nazván VGC2. Obrázek 2 ukazuje pozici dvou částí DNA, jejich DNA sekvence byla určena (Sekvence 1 a Sekvence 2). Nukleotidová sekvence je ukázána na Obrázku 11 a 12.
Mapování hranic VGC2 na chromozomu S. typhimurium
Sekvencování nukleotidů λ klonu 7 nalevo od VGC2 ukázalo přítomnost otevřeného čtecího rámce (ORF), jehož odvozená aminokyselinová sekvence je více než z 90% identická s odvozeným produktem segmentu ydhE+ genu E. coli a sekvencování 6,5 kb EcóRAlXbal klonovaného fragmentu napravo od VGC2 ukázalo přítomnost ORF, jehož předpokládaná aminokyselinová sekvence je z více než 90% identická s pyruvátkinázou IE. coli kódovanou pykY genem (27). Na chromozomu E. coli jsou pykF a ydhE umístěny těsně u sebe, v minutě 37 až 38 (28). Jedenáct nepřekrývajících se DNA fragmentů distribuovaných v průběhu VGC2 bylo použito jako sondy v mírné Southern hybridizační analýze genomové DNA z E. coli a S. typhimurium. Hybridizující DNA fragmenty ukázaly, že úsek o přibližně 40 kb obsahující VGC2 nebyl přítomen v genomu E. coli a lokalizovaly vazbu VGC2 do 1 kb (Obrázek 9). Srovnání polohy Xba\ místa těsně vedle pravostranného konce VGC2 (Obrázek 8) s mapou známých Aůal míst (29) v úseku chromozomu v minutě 30 (22) umožňuje odvození pozice pro VGC2 do polohy 30,7 minut.
Struktura VGC2
Sekvencování nukleotidů části Vgc2 odhalilo přítomnost 19 ORF (Obrázek 8). G + C obsah přibližně 26 kb nukleotidové sekvence uvnitř VGC2 je 44,6%, ve srovnání s 47% pro VGC1 (9) a 51 až 53% zjištěnými pro celý gsnova. Salmonella (30).
Kompletní odvozené aminokyselinové sekvence ORF 1 až 11 jsou podobné proteinům typu III sekrečních systémů (6, 7), o kterých je známo, že jsou vyžadovány pro produkci determinant virulence u různých bakteriálních patogenů rostlin a zvířat (7). Předpokládané proteiny ORF 1 až 8 (Obrázek 8) jsou podobné v organizaci a sekvenci produktům yscN-U genů Yersinia pseudotuberculosis (31), invC/spaS ze shluku inv/spa v VGC1 u Salmonella typhimurium (8, 9) a spa47/spa40 ze shluku spa/mxi Shigella flexneri (32, 33, 34, 35). Například předpokládaná aminokyselinová sekvence ORF 3 (Obrázek 8) je z 50 % identická s YscS Y. pseudotuberulosis (31), ze 34 % identická se Spa9 z S. flexneri (35) a ze 37 % identická se SpaQ VGC1 S. typhimurium (9). Předpokládaný proteinový produkt ORF9 je blízce příbuzný LcrD rodině proteinů se 43% identitou k LcrD Y. enterocolitica, (36), 39% identitou s MxiA S. flexneri (32) a 40% identitou s InvA VGC1 (23). Jednotlivé nukleotidové sekvence pro zbývající ORF ukázané na Obrázku 8 naznačují, že předpokládaný protein z ORF 10 je nejpodobnější ZscJ Y. enterocolitica (37) lipoproteinu umístěném na zevní membráně baktérií, s ORF 11 podobném S. typhimurium InvG, členu PuID rodiny translokázy (38). ORF 12 a ORF 13 vykazují signifikantní podobnost se senzorickou a regulační podjednotkou, v příslušném pořadí, z různých proteinů obsahujících dvousložkové regulační systémy (39). Je zde rozsáhlá kódující kapacita pro další geny mezi ORF9 a 10, ORF 10 a 11, a mezi ORF 19 a pravostranným koncem VGC2.
VGC2 je specificky pro Salmonellae a konzervován v Salmonellae.
2,2 kb PstVHindAl fragment, umístěný v centru VGC2 (sonda B, Obrázek 8) postrádající podobnost sekvence se známými DNA a proteiny z databází, byl použit jako sonda v Southern hybridizační analýze genomové DNA ze šero varů Salmonella a jiných patogenních baktérií (Obrázek IOA). DNA fragmenty hybridizující za mírných podmínek ukázaly, že VGC2 je přítomen v S. aberdeen, S. gallinarum, S. cuban,. S. typhi a není přítomen v EPEC, EHEC, Y. pestis, S. flex
-35 CZ 296981 B6 neri, V. cholerae a S. aureus. Takto VGC2 je konzervován v Salmonellae, přičemž je pravděpodobně specifický pro Salmonellae.
Pro určení toho, zda je organizace lokusu konzervována v testovaných serovarech Salmonella byla provedena přísná Southern hybridizace s genomovou DNA štěpenou dvěma dalšími restrikčními enzymy. Hybridizující DNA fragmenty ukázaly, že je zde určitá heterogenita v uspořádání restrikčních míst mezi S. typhimurium LT2 a 5. gallinarum, S. cubana a S. typhi (Obrázek 10B). Navíc. S. gallinarum a 5. typhi obsahovaly další hybridizační fragmenty kromě těch, které byly přítomny u jiných zkoumaných Salmonella, což naznačuje, že úseky VGC2 byly duplikovány u těchto druhů.
VGC2 je vyžadován pro virulenci u myší
Předešlé experimenty ukázaly, že hodnoty LD50 pro i.p. inokulaci transposonových mutantů P3F4, P7G2, P9B7 a PIIC3 byly alespoň 100-krát vyšší než u kmene divokého typu (5). Pro ujasnění významu VGC2 v procesu infekce byly určeny p.o. a i.p. LD50 hodnoty pro mutanty P3F4 a P9B7 (Tabulka 1). Oba mutanty ukázaly redukci virulence alespoň na pětinu při každém způsobu inokulace ve srovnání s rodičovskými kmeny. Toto významné oslabení virulence při obou způsobech inokulace ukázalo, že VGC2 je požadován pro proběhnutí infekčního procesu po penetraci epiteliálních buněk u BALB/c myší.
Tabulka 1
LDSO hodnoty pro kmeny S. typhimurium
LD5o (cfu)
Kmen i .p. p.o.
12023 divoký typ 4,2 6,2 x 104
P3F4 1,5 x 10s >5 X 109
P9B7 >1,5 x 106 >5 X 109
Diskuze
Byl identifikován doposud neznámý lokus virulence 5. typhimurium o přibližně 40 kb umístěný v minutě 30,7 na chromozomu za pomocí mapování bodů inserce skupiny signaturetagged (podepsaných) transposonových mutantů s oslabenou virulenci (5). Lokus je označen jako shluk genu virulence 2 (VGC2) pro odlišení od inv/spa genů virulence v 63. minutě (vydání VII, odkaz 22), které bylo navrženo přejmenovat na VGC1. VGC1 a VGC2 oba kódují složky typu III sekrečních systémů. Nicméně, tyto sekreční systémy jsou funkčně odlišné.
Z 19 mutantů vzniklých z insercí do nových genů (odkaz 5 a tento příklad) mapovalo 16 stejný region chromozomu. Je možné, ž se mini-Tn5 inserce vyskytují přednostně ve VGC2. Alternativně, protože negativní selekce použitá pro identifikaci mutantů s oslabenou virulenci byla velmi přísná (reflektováno vysokými hodnotami LD50 pro VGC2 mutanty) je možné, že mezi dříve neznámými geny vedou pouze mutace v těchto VGC2 k dostatečnému stupni oslabení získanému při vyšetření. Selhání dřívějších pokusů o nalezení determinant virulence S. typhimurium pro identifikaci VGC2 může pramenit ze spolehnutí se na testy na buněčných kulturách více než na zvířecí model infekce. Předchozí studie, které identifikovaly úseky S. typhimurium chromozomu jedinečné pro Salmonellae (40) umístily jeden takový úsek (RF333) na minuty 30,5
-36CZ 296981 B6 až 32. Proto. RF333 může korespondovat VGC2, ačkoliv nebylo známo, že RF333 je vyžadován v determinaci virulence.
Srovnání s typem III sekrečních systémů kódovaných plazmidy virulence Yersinia a Shigella, stejně jako VGC1 Salmonella ukazuje. VGC2 kóduje základní strukturní složky sekrečního aparátu. Navíc, pořadí ORF 1 až 8 v VGC2 je stejné jako pořadí genů v homolozích od Yersinia, Shigella a VGC1 S. typhimurium. Fakt, že organizace a struktura VGC2 sekrečního systému není více příbuzná k VGC1 než ke korespondujícím genům Yersinia, spolu s nízkým obsahem G + C VGC2 napovídá, že VGC2, jako VGC1 (40, 41, 42) byl nezávisle získán S. typhimurium prostřednictvím horizontální transmise. Proteiny kódované ORF 12 a 13 vykazují silnou podobnost s bakteriálními dvousložkovými regulátory (39) a mohou regulovat jak ORF 1 až 11 a/nebo secernované proteiny tohoto systému.
O mnoha genech VGC1 bylo prokázáno, že jsou důležité pro vstup 5. typhimurium do epiteliálních buněk. Tento proces vyžaduje bakteriální kontakt (2) a vede k přestavbě cytoskeletu vedoucímu k lokalizovanému poškození membrány (43, 44). Role VGC1 a jeho restrikce v tomto stavu infekce se odráží v asi 50 násobnému oslabení virulence u BALB/c myší inokulovaných p.o. VGC1 mutanty a ve faktu, že VGC1 mutanty nevykazují žádnou ztrátu virulence, pokud jsou podány i.p. (8). Druhé pozorování také vysvětluje, proč nebyly žádné VGC1 mutanty získány v našem screeningu (5). Oproti tomu, mutanty v VGC2 jsou silně oslabeny jak při p.o., tak při i.p. inokulaci. Toto ukazuje, že oproti VGC1 je VGC2 vyžadován pro virulenci u myší po penetraci do epitelií, ale toto zjištění nevylučuje roli VGC1 v tomto ranném stadiu infekce.
Shrnuto, mapování inserčních bodů 16 signature-tagged transposonových mutantů na chromozomu Salmonella typhimurium vedlo k identifikaci shluku genu virulence o 40 kb v minutě 30,7. Tento lokus je konzervován u všech vyšetřovaných druhů Salmonella, ale není přítomen u mnoha jiných patogenních baktérií nebo u Escherichia coli K12. Sekvencování nukleotidů části tohoto lokusu odhalilo 11 otevřených čtecích rámců, jejichž předpokládané proteiny tvoří složky typu III sekrečního systému. Pro odlišení mezi tímto a sekrečním systémem typu III kódovaným inv/spa invazním lokusem byl označen inv/spa lokus jako shluk genu virulence 1 (VGC1) a nový lokus jako VGC2. VGC2 měl nižší obsah G+C než genom Salmonella a byl obklopen geny, jejichž produkty mají více než 90% identitu s produkty gemnydhE apykFE. coli. Tak VGC2 byl pravděpodobně získán horizontálně insercí do úseku odpovídajícího úseku mezi geny ydhE a pykF E. coli. Studie virulence VGC2 mutantů ukázaly, že jsou alespoň pětkrát oslabeny ve srovnání s kmenem divokého typu po perorálním nebo intraperitoneálním podání.
Publikace citované v tomto příkladu
1. Carter, P.B. & Collins, F. M. (1974) J. Exp. Med. 139, 1189-1203.
2. Takeuchi, A. (1967) Am. J. Pathol. 50, 109-136,
3. Finlay, B.B.. (1994) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 192, 163-185.
4. Groisman, E.A. & Ochman. H. (1994) Trends Microbiol. 2, 289-293.
5. Hensel. M., Shea. J.E., Gleeson, C. Jones, M.D. Dalton, E. & Holden D.W. (1995) Science 269, 400-403.
6. Salmond, G.P.C. & Reeves, P.J. (1993) Trends Biochem. Sci. 18, 7-12.
7. Van Gijsegem, F. Genin, S & Boucher, C. (1993) Trends Microbiol, 1, 175-180.
8. Galan. J.E. & Curtiss, R. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6383-6387.
9. Groisman, E.A. & Ochman. H. (1993) EMBOJ. 12, 3779-3787.
10. Ginocchio. C.C.. Olmsted. S.B.. Wells, C.L. & Galan. J. E. (1994) Cell 76, 717-724.
.de Lorenzo. V. & Timmis. K.N. (1994) Methods Enzymol. 264, 386-405.
-37CZ 296981 B6
12. Davis, R.H., Botstein, D. & Roth, J.R. (1980) Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
13. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl,
K. (1987) Current Protocols in Molecular Biology Vol 4 John Wiley and Son, lne, New York.
14. Maurer, R., Osmond, B.C., Shekhtman, E., Wong, A. & Botstein, D. (1984) Genetics 108, 1-23.
15. Youderain, P., Sugiono, P., Brewer, K.L., Higgins, N.P. & Elliott, T. (1988) Genetics 118, 581-592.
ló.Benson, N.R. & Goldman, B.S. (1992) J. Bacteriol. 174, 1673-1681.
17.Holden, D.W., Kronstad, J.W. & Leong, S. (1989) EMBOJ. 8, 1927-1934.
18.Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratoř, Cold Spring Harbor, New York).
19.Sanger, F. Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. Ί4, 5463-5467.
20. Devereux, J., Hearberli, P. & Smithies, 0. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 387-399.
21. Reed. L.J. & Muench, H. (1938) Am. J. Hyg. 27, 493-497.
22.Sanderson, K.E., Hessel. A. & Rudd, K.E. (1995) Microbiol. Rev. 59, 241-303.
23. Galan. J.E.. Ginocchio. C. & Costeas. P. (1992) J. Bacteriol. 174, 4338-4349.
24. Ginocchio. C. Páce. J. & Galan. J.E. (1992) Proč. Nati Acad. Sci. U.S.A. 89, 5976-5980.
25. Eichelberg, K., Ginocchio, C.C. & Galan, J.E. (1994) J. Bacteriol. 176, 4501-4510.
26. Collazo, CM., Zierler, M.K. & Galan, J.E. (1995) Mol. Microbiol 15, 25-38.
27.0hara, O., Dorit, R.L. & Gilbert, W. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 6883-6887. 28.Bachman, B. (1990) Micro. Rev. 54, 130-197.
29-Liu, S.L., Hessel, A. & Sanderson, K.E. (1993) J. Bacteriol. 175, 4104-4120.
30. Fasman, G.D. (1976) CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Cleveland.
31. Bergman, T., Erickson, K., Galyov, E., Persson, C. & Wolf Watz, H. (1994) J. Bacteriol. 176, 2619-2626.
32. Andrews, G.P. & Maurelli, A.T. (1992) Infect, Immun. 60, 3287-3295.
33. Allaoui, A., Sansonetti, P.J. & Parsot, C. (1993) Mol. Microbiol. 7, 59-68.
34. Venkatesan, M., Buysse, J.M. & Oaks, E.V. (1992) J. Bacteriol. 174, 1990-2001. 35.Sasakawa, C., Komatsu, K., Tobě, T., Suzuki, T. & Yoshikawa, M. (1993) J. Bacteriol. 175,
2334-2346.
36. Plano, G.V., Barvě, S.S. & Straley, S.C. (1991) J. Bacteriol. 173, 7293-7303.
37. Michiels, T., Vanooteghem, J.C., Lambert de Rouvroit, C., China, B., Gustin, A., Boudry, P. & Comells. G.R. (1991) J. Bacteriol. 173,4994-5009.
38. Kaniga, K., Bossio. J.C. & Galan. J.E. (1994) Mol. Microbiol. 13, 555-568.
39. Ronson. C.W. Nixon. B.T. & Ausubel. F.M. (1987) Cell 49, 579-581.
40. Groisman, E.A., Sturmoski, M.A., Solomon, F.R., Lin, R. & Ochman, H. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. US.A. 90, 1033-1037.
41. Altmeyer, R.M., McNem, J.K., Bossio, J.C., Rosenshine, I., Finlay, B.B. & Galan, J.E. (1993) Mol. Microbiol. 7, 89-98.
42. Li, J., Ochman, H., Groisman, E.A., Boyd, E.F., Soloman, F., Nelson, K. & Selander, R.K. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 7252-7256.
43. Finlay, B.B. & Rauschkowski, S. (1991) J. Cell Sci. 99, 283-296.
44. Francis, C.L., Stambach, M.N. & Falkow, S. (1992) Mol. Microbiol. 6, 3077-3087.
-38 CZ 296981 B6
Příklad 5
Identifikace genů virulence u Streptococcus pneumoniae (a) Mutageneze
Za absence vhodných transposonových systémů je nejúčinnějším způsobem pro vytvoření sekvenční značkou (tágem) opatřených mutantů Streptococcus pneumoniae použití inserčně-duplikační mutageneze (Morrison a kol., (1984), J. Bacteriol. 159, 870). Náhodné A pneumoniae DNA fragmenty 200 až 400 bp jsou generovány štěpením genomové DNA restrikčním enzymem nebo fyzikálním rozrušením sonikací, po které následuje frakcionace na gelu a oprava konců DNA za použití T4 DNA polymerázy. Fragmenty jsou ligovány do plazmidu pJDC9 (Pearce a kol., (1993) Mol. Microbiol., 9, 1037, který nese gen erm pro erytromycinovou selekci v E. coli a S. pneumoniae), který byl dříve modifikován inkorporací DNA tag sekvencí do jednoho z polylinkerových klonovacích míst. Velikost klonované DNA S. pneumoniae je dostatečná pro zajištění homologní rekombinace, a redukuje pravděpodobnost generování nereprezentativní knihovny v E. coli (exprese S. pneumoniae proteinů může být toxická pro E. coli). Alternativně jsou dostupné vektory nesoucí různé selektovatelné markéry, přičemž mohou být použity na místě pJDC9. Tágy opatřené plazmidy nesoucí DNA fragmenty jsou zavedeny do vhodného kmene S. pneumoniae selektovaného na základě serotypu a virulence v myším modelu pneumokokové pneumonie. Regulace kompetence pro genetickou transformaci v S. pneumoniae je řízena faktorem kompetence, peptidem o 17 aminokyselinách, který byl nedávno charakterizován skupinou Don Morrisona na University of Illinois v Chicago a který je popsán v publikaci Havarstein, Coomaraswamy and Morrison (1995), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 11140-11144. Inkorporace minimálních množství tohoto peptidu v transformačních pokusech vedla k velmi účinné frekvenci transformace v některých enkapsulovaných klinických izolátech S. pneumoniae. Toto překonává hlavní překážku v molekulární genetice pneumokoka a dostupnost peptidu značně usnadňuje konstrukci banky S. pneumoniae mutantů a umožňuje flexibilitu ve výběru kmenů pro mutaci. Část transformantů je analyzována pro potvrzení homologní integrace plazmidových sekvencí, a ověřována na stabilitu. Velmi nízká hladina reverzí asociovaná s mutanty generovanými insercíduplikací je minimalizována skutečností, že duplikované regiony budou krátké (200 až 400 bp); nicméně, pokud je hladina reverzí neakceptovatelně vysoká, je udržována antibiotická selekce během růstu transformantů v kultuře a během růstu ve zvířeti.
(b) Zvířecí model
Banka mutantů S. pneumoniae byla organizována do souborů pro inokulaci do myší Swiss a/nebo C57B1/6. Předběžné experimenty byly zaměřeny na určení optimální komplexity souborů a optimální hladinu inokula. Jeden atraktivní model využívá inokula 105 cfu, které je dopraveno perorálně myším do trachey (Veber a kol., (1993), J. Antimicrobial Chemotherapy 32, 473). U Swiss myší se rozvíjí akutní pneumonie během 8 až 10 dnů. Tyto pulmonální modely infekce dávají 108 cfu/plíce (Veber a kol., (1993) J. Antimicrobial Chemotherapy 32, 473) v době uhynutí. Je-li to žádoucí, jsou myši také injikovány intraperitoneálně pro identifikaci genů vyžadovaných pro infikování krevního řečiště (Sullivan a kol., 1993, Antimicrobial Agens and Chemotherapy 372, 234).
(c) Identifikace genu virulence
Jakmile byly parametry infekčního modelu optimalizovány, byla banka mutantů skládající se z několika tisíc kmenů podrobena testům virulence. Mutanty s oslabenou virulenci byly identifikovány hybridizační analýzou za použití značených tagů z vstupních a získaných souborů jako sond. Pokud DNA S. pneumoniae nemohla být snadno přenesena jako kolonie (colony blotted), byla chromozomální DNA uvolněna chemicky nebo enzymaticky v jamkách mikrotitrační
-39 CZ 296981 B6 destičky před přenosem na nylonové membrány za použití přenosových dot-blot přístrojů. DNA obklopující integrovaný plazmid je klonována metodou vyproštění plazmidu (plazmid rescue) v E. coli (Morrison a kol., (1984), J. Bacteriol. 159, 870) a sekvencována. Genomové DNA knihovny jsou konstruovány ve vhodných vektorech udržovaných buď v E. coli, nebo v Gram pozitivním hostitelském kmeni, přičemž jsou screenovány restrikčními fragmenty obklopujícími integrovaný plazmid, aby byly izolovány klonované geny virulence, které jsou potom plně sekvencovány a podrobeny detailní funkční analýze.
Příklad 6
Identifikace genů virulence u Enterococcus faecalis (a) Mutageneze
Mutageneze E. faecalis byla provedena za použití plazmidu pATl 12 nebo jeho derivátu, vyvinutému pro tento účel, pAT112 nese geny pro selekci jak v Gram-negativních, tak Grampozitivních baktériích, a att místo Tnl545. Vyžaduje proto pro transpozici přítomnost integrázy v hostitelském kmenu, a stabilní, jednokopiová inserce je získána, pokud hostitel neobsahuje excionázový gen (Trieu-Cuot a kol., (1991) Gene 106, 21). Získání DNA obklopující integrovaný plazmid bylo provedeno restrikčním štěpením genomové DNA, intramolekukulámí ligací a transformací E. coli. Přítomnost jednotlivých míst pro restrikční enzymy v pAT112 a jeho derivátech (Trieu-Cuot a kol., (1991) Gene 106, 21) umožňuje inkorporaci DNA tag sekvencí před transferem do virulentního kmene E. faecalis nesoucího plazmid pAT145 (pro poskytnutí integrázové funkce) buď konjugací, elektroporací, nebo transformací (Trieu-Cuot a kol., (1991) Gene 106, 21; Wirth a kol., (1986), J. Bacteriol. 165, 831).
(b) Zvířecí model
Velké množství inserčních mutantů bylo analyzováno na náhodnou integraci plazmidu izolováním DNA od transcipientů, štěpením restrikčními enzymy a Southem hybridizací. Jednotlivé mutanty byly uskladněny v jamkách mikrotitračních destiček, přičemž komplexita a velikost souborů inokul byla optimalizována před vyšetřením banky mutantů. Byly využity dva různé modely infekce E. faecalis. První je dobře zavedený krysí model endokarditidy, vyžadující injikování více než 108 cfu E. faecalis do ocasní vény zvířete, které má katétr zavedený přes aortální chlopeň (Whitman a kol., (1993) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37, 1069). Zvířata byla utracena různou dobu po inokulaci, přičemž byly odebrány bakteriální vegetace na aortální chlopni, načež následovala homogenizace a umístění do kultivačního média pro získání bakteriálních kolonií. Virulentní bakterie byly také odebrány z krve různou dobu po inokulaci. Druhý model je peritonitida u myší, po intraperitoneální injekci více než 109 cfu E. faecalis (viz publikace Chenoweth a kol., (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34, 1800). Stejně jako pro S. pneumoniae model, byly pro stanovení optimální komplexity souborů a optimální hladiny inokula provedeny předběžné pokusy před screeningem banky mutantů.
(c) Identifikace genu virulence
Izolace DNA obklopující místo integrace pATl 12 za použití počátku replikace E. colifi. zjednodušena nepřítomností 6 bp rozpoznávacích míst pro většinu běžně používaných restrikčních enzymů ve vektoru. Proto DNA z požadovaných kmenů je štěpena jedním těchto enzymů, samoligována, transformována do E. coli a sekvencována za použití primerů založených na sekvencích sousedících att místům plazmidu. Genomová DNA knihovna E. faecalis je screenována požadovanými sekvencemi pro identifikování intaktních kopií genů virulence, které jsou potom sekvencovány.
-40 CZ 296981 B6
Příklad 7
Identifikace genů virulence u Pseudomonas aeruginosa (a) Mutageneze
Protože transposon Tn5 byl jinak použit pro mutování Pseudomonas aeruginosa, a o mini-Tn5 derivátu, který byl použit pro identifikaci genů virulence Salmonella typhimurium (Příklad 1) se uvádí, že má široké využití u Gram-negativních baktérií, včetně některých pseudomonad (DeLorenzo a Timaris (1994), Methods Enzymol. 264, 386), byla banka mutantů P. aeruginosa konstruována za použití našeho existujícího souboru signature-tagged miniTn5 transposonů konjugativním přenosem sebevražedného vektoru do jednoho nebo více virulentních (a pokud možno mukoidních) kmenů příjemce. Tento přístup reprezentuje značnou úsporu času. Jiné deriváty Tn5 projektované specificky pro P. aeruginosa mutagenezi (Rella a kol., (1985), Gene33, 293) mohou být alternativně použity s mini Tn5 transposonem.
(b) Zvířecí model a identifikace genu virulence
Banka P. aeruginosa inserčních mutantů byla vyšetřována na oslabenou virulenci v modelu chronické pulmonální infekce u krys. Suspenze buněk P. aeruginosa byla zavedena do bronchu po tracheotomii, a onemocnění se rozvinulo během 30 dní (Woods a kol., (1982) Infect. Immunol., 36, 1223). Bakterie byly získány umístěním homogenátů plic do laboratorního méidia a sekvence tagů z nich byly použity k sondování DNA blotů kolonií baktérií použitých jako inokulum. Je také možné podrobit banku mutantů testům virulence v modelu endogenní bakteriémie (Hirakata a kol., (1992) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36, 1198), a cystické fibrózy (Davidson a kol., (1995), Nátuře Genetics 9, 351) u myší. Klonování a sekvencování DNA obklopující transposony se provede stejným způsobem jako je popsáno v Příkladu 1. Genomové DNA knihovny pro izolaci a sekvencování intaktních kopií genů jsou konstruovány v laboratoři podle standardních metod.
Příklad 8
Identifikace genů virulence u Aspergillus fumigatus (a) Mutageneze
Funkčním ekvivalentem transposonové mutageneze u hub je restrikčním enzymem zprostředkovaná integrace (REMI) transformující DNA (Schiestl a Petes (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. 88, 7585). V tomto procesu jsou buňky hub transformovány DNA fragmenty nesoucími selektovatelný markér za přítomnosti restrikčního enzymu, a integrace jedné kopie se vyskytuje v různých místech genomu, definovaných jako cílová sekvence restrikčního enzymu. REMI již byla použita pro úspěšnou izolaci genů virulence Cochliobolus (Lu a kol., (1994), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 12694) a Ustilago (Bolker a kol., (1995), Mol. Gen. Genet. 248, 547), přičemž bylo ukázáno, že inkorporace aktivního restrikčního enzymu s plazmidem kódujícím rezistenci na hygromycin vede k jediné a zjevně náhodné integraci lineárního plazmidu do genomu A. fumigatus. Sekvence tagů jsou zavedeny do vhodných míst v jednom nebo dvou vektorech pro rezistenci na hygromycin, přičemž jsou použity pro transformaci klinických izolátůÁ./wmzga/MS.
-41 CZ 296981 B6 (b) Zvířecí model a identifikace genů virulence
Nízkodávkový model aspergilózy u neutropenických myší odpovídá průběhu plicní choroby u lidí (Smith a kol., (1994), Infect. Immunol. 62, 5247). Myši jsou inokulovány intranasálně více než 1 000 000 konidiosporami/myš, a virulentní mutanty hub jsou odebrány o 7 až 10 dní později za použití homogenizátů plic pro inokulaci kapalného média. Hyfy jsou shromážděny po několika hodinách, a z nich je DNA extrahována pro amplifikaci a značení tagů pro sondování DNA blotů kolonií ze souboru transformantů obsahujících inokulum. DNA z regionů obklopujících REMI body inserce je klonována štěpením DNA transformantů restrikčním enzymem, který vystřihuje REMI vektor, samoligací a transformací A. coli. Primery na bázi známé sekvence plazmidu jsou použity pro určení sousedních DNA sekvencí A. fumigatus. Pro ověření, že inserce vektoru byla příčinou avirulentního fenotypu je odebraný plazmid znovu štěpen stejným restrikčním enzymem, jako byl použit pro klonování, přičemž se provede zpětná transformace do divokého typu A. fumigatus rodičovského kmenu. Transformanty, které vznikly homologní rekombinací se potom podrobí testům virulence.
Publikace (ostatní kromě příkladu 4)
Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons.
Buchmeier, N.A., Lipps, C.J., So, M.Y. and Heffron, F. (1993) Recombination-defícient mutants of Salmonella typhimurium are avirulent and sensitive to the oxidative burst of macrophages. Mol. Microbiol. 7, 933-936.
Carter, P.B. and Collins, F.M. (1974) The routě of enteric infection in normál mice. J. Exp. Med. 139, 1189-1203.
de Lorenzo, V. and Timmis, K.N. (1994) Analysis and construction of stable phenotypes in Gram-negative bacteria with Tn5-and TnlO-derived minitransposons. Methods Enzymol. 264, 386-405.
de Lorenzo, V., Herrero, M., Jakubzik. U. and Timmis, K.N. (1990) Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenezis, promotér probing, and chromozomal insertion of cloned DNA in gram-negative eubacteria. J. Bacteriol. 172, 6568-6572.
Fields, P.I., Groisman, E.A. and Heffron, F. (1989) A Salmonella locus that controls resistance to microbicidal proteins from phagocytic cells. Science 243, 1059-1062.
Finlay, B.B., Stamnach. M.N. Francis, C.L. Stocker, B.A. Chatfield, S., Dougan. G. and Falkow, S. (1988) Identifícation and characterization of TnphoA mutants of Salmonella that are unable to pass through a polarized MDCK epithelial cell monolayer. Mol. Microbiol. 2, 757-766.
Groisman, E.A., Chiao, E., Lipps, C.J., Heffron, F. (1989) Salmonella typhimurium phoP virulence gene is a transcriptional regulátor. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 86, 7077-7081.
Groisman, E.A. and Ochman, H. (1994) How to become a pathogen. Trends Microbiol. 2, 289-293.
Groisman, E.A. and Saier, M.H., Jr. (1990) Salmonella virulence: new clues to intramacrophage survival. Trends Biochem. Sci. 15, 30-33.
Herrero, M., de Lorenzo, V. and Timmis, K.N. (1990) Transposon vectors containing nonantibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromozomal insertion of foreign genes in Gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 172, 6557-6567.
Holden D.W., Kronstad J.W., Leong S.A. (1989) Mutation in a heatregulated hsp70 gene of Ustilago maydis. EMBOJ. 8, 1927-1934.
Holland J., Towner K.J., Williams P. (1992) Tn916 insertion mutagenezis in Escherichia coli and Haemophilus influenzae type b following conjugative transfer. J. Gen. Microbiol. 138, 509-515.
-42 CZ 296981 B6
Mahan, M.J., Slauch, J.M., Mekalanos, J.J. (1993) Selection of bacterial virulence genes that are specifícally induced in host tissues. Science 259, 686-688.
Miller. S.I., Kukral. A.M. and Mekalanos. J.J. (1989a) A twocomponent regulátory systém (phoP phoQ) controls Salmonella typhimurium virulence. Proč. Nad. Acad. Sci. USA. 86, 5054-5058.
Miller, I., Masekll, D., Hormaeche, C., Johnson, K., Pickard, D. and Dougan, G. (1989b) Isolation of orally attenuated Salmonella typhimurium following Tnp/ioa mutagenezis. Infect. Immun. 57, 2758-2763.
Miller, V.L. and Mekalanos, J.J. (1988) A novel suicide vector and its use in construction of invertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol 170, 2575-2583.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. Ί4, 5463-5467.
Schiestl R.H., and Petes T.D. (1991) Integration of DNA fragments by illegitimate recombination in Saccharomvces cerevisiae. Proč. Nati. Acad. Sci USA. 88, 7585-7589.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (48)

  1. (1) vytvoření souboru mikroorganizmů, kde každý z nich je nezávisle mutován inserční inaktivací genu nukleovou kyselinou obsahující jedinečnou markerovou sekvenci tak, že každý mutant obsahuje jinou markerovou sekvenci, nebo klonů uvedených mikroorganizmů;
    1. Způsob pro identifikaci mikroorganizmů majících sníženou adaptaci na specifické prostředí, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
  2. (2) vytvoření jednotlivě uskladněných vzorků každého mutantu produkovaného v kroku (1) a vytvoření jednotlivě uskladněné nukleové kyseliny obsahující jedinečnou markerovou sekvenci z každého jednotlivého mutantu;
    2. Způsob pro identifikaci mikroorganizmů majících sníženou adaptaci na specifické prostředí, vyznačující se t í m , že zahrnuje kroky:
    (2) vytvoření jednotlivě uskladněných vzorků každého mutantu produkovaného v kroku (1) a vytvoření jednotlivě uskladněné nukleové kyseliny obsahující jedinečnou markerovou sekvenci z každého jednotlivého mutantu;
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že soubor mikroorganizmů, definovaný v kroku (1), je připraven ze souboru mikroorganizmů, kde každý z nich obsahuje nukleovou kyselinu obsahující jedinečnou markerovou sekvenci, změnou jejich podmínek z prvních podmínek na druhé podmínky, přičemž (a) v prvních podmínkách je uvedená nukleová kyselina obsahující jedinečný markér udržována episomálně a (b) v druhých podmínkách uvedená nukleová kyselina obsahující jedinečnou markerovou sekvenci inserčně inaktivuje gen.
    (3) vnesení souboru mutantů vytvořených v kroku (1) do tohoto specifického prostředí a umožnění růstu v tomto prostředí těm mikroorganizmům, které jsou ho schopny;
    (3) vnesení souboru mutantů vytvořených v kroku (1) do tohoto specifického prostředí a umožnění růstu v tomto prostředí těm mikroorganizmům, které jsou ho schopny, (4) získávání mikroorganizmů ze specifického prostředí nebo jeho vybrané části a izolaci nukleové kyseliny z takto získaných mikroorganizmů;
  4. 4. Způsob podle kterékoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje kroky:
    (1A) odstranění auxotrofů ze souboru mutantů připravených v kroku (1); nebo (6A) určení toho, zda mutant selektovaný v kroku (6) je auxotrof; nebo jak krok (1A), tak (6A).
    (4) získávání mikroorganizmů ze specifického prostředí nebo jeho vybrané části a izolaci nukleové kyseliny z takto získaných mikroorganizmů;
  5. 5 látkou.
    5. Způsob identifikování genu, který umožňuje mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí, vyznačující se tím, že zahrnuje způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 následovaný krokem:
    (5) porovnání libovolné markerové sekvence v nukleové kyselině izolované v kroku (4) s jedinečnou markerovou sekvencí každého jednotlivého mutantu uskladněného v kroku (2); a
    (5) porovnání libovolné markerové sekvence v nukleové kyselině izolované v kroku (4) s jedinečnou markerovou sekvencí každého jednotlivého mutantu uskladněného v kroku (2); a (6) selekci jednotlivých mutantů, které neobsahují žádnou z markerových sekvencí izolovaných v kroku (4);
    kde toto prostředí není lidské tělo.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok:
    (6) selekci jednotlivých mutantů, které neobsahují žádnou z markerových sekvencí izolovaných v kroku (4);
    kde, jestliže toto specifické prostředí je diferencovaný mnohobuněčný organizmus, potom tento organizmus, je ne-lidský živočich nebo rostlina.
  7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že specifickým prostředím je diferencovaný mnohobuněčný organizmus.
    -44CZ 296981 B6
    (7) izolování inserčně inaktivovaného genu z jednotlivého mutantu izolovaného v kroku (6).
  8. 8. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m , že mnohobuněčným organizmem je rostlina.
    (8) izolování odpovídajícího divokého typu genu z divokého typu mikroorganizmu za použití inserčně inaktivovaného genu izolovaného v kroku (7) jako sondy.)
  9. 9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že mnohobuněčným organizmem je zvíře s výjimkou člověka.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že zvířetem je myš, krysa, králík, pes nebo opice.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vy z n a č uj í c í se t í m, že zvířetem je myš.
  12. 12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11,vyznačující se tím, že v kroku (4) jsou mikroorganizmy získány z uvedeného prostředí v místě vzdáleném od místa vnesení v kroku (3).
  13. 13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11,vyznačující se tím, že v kroku (3) jsou mikroorganizmy vneseny perorálně nebo intraperitoneálně.
  14. 14. Způsob podle nároku 13, při závislosti na nárocích 9 nebo 10, vy z n a č uj í c í se tím, že v kroku (4) jsou mikroorganizmy získány ze sleziny.
  15. 15. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je bakterie.
  16. 16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je houba.
  17. 17. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je bakterie patogenní pro rostliny.
  18. 18. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je houba patogenní pro rostliny.
  19. 19. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 9 až 11, vy z n a č uj í c í se t í m , že mikroorganizmem je bakterie patogenní pro zvířata.
  20. 20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je houba patogenní pro zvířata.
  21. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že bakterie je vybrána ze souboru zahrnujícího Bordetella pertussis, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Escherichia col, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Listeria spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus aureus,. Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Vibrio spp. a Yersinia pestis.
  22. 22. Způsob podle nároku 20, vy z n a č u j í cí se t í m , že houba je vybrána ze skupiny zahrnující Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans a Histoplasma capsulatum.
  23. 23. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že v kroku (1) je gen inserčně inaktivován za použití transposonu nebo transposonu podobného elementu nebo jiné DNA sekvence nesoucí jedinečnou markerovou sekvenci.
  24. 24. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že v kroku (1) je každá z různých markerových sekvencí obklopena na obou stranách sekvencemi společnými pro všechny uvedené nukleové kyseliny.
  25. 25. Způsob podle nároku 24, v y z n a č u j í c í se tím , že v kroku (2) je nukleovákyselina obsahující jedinečný markér izolována za použití technik DNA amplifikace a oligonukleotidových primerů, které hybridizují se společnými sekvencemi.
  26. 26. Způsob podle nároku 24 nebo 25, vyznačující se tím, že v kroku (4) je nukleová kyselina obsahující soubor uvedených markerových sekvencí izolována za použití technik DNA amplifikace a oligonukleotidových primerů, které hybridizují se společnými sekvencemi.
  27. 27. Mikroorganizmus získaný za použití způsobu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.
  28. 28. Mikroorganizmus obsahující mutaci v genu identifikovaném za použití způsobu podle nároku 6.
  29. 29. Mikroorganizmus podle nároku 27, při závislosti na nároku 9, nebo podle nároku 28 pro použití ve vakcíně.
  30. 30. Vakcína obsahující mikroorganizmus podle nároku 27, při závislosti na nároku 9, nebo podle nároku 28, a farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku.
  31. 31. Gen získaný za použití způsobu podle nároku 5 nebo 6.
  32. 32. Způsob získání mutantního mikroorganizmu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) identifikace genu, který umožňuje mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí za použití kroků definovaných v nároku 5, a (b) specifické zavedení mutace do odpovídajícího divokého typu genu mikroorganizmu za vzniku uvedeného mutantního mikroorganizmu.
  33. 33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že mutace genu je delece nebo mutace posunem čtecího rámce nebo libovolná jiná mutace, která je neschopná reverze.
  34. 34. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že odpovídající divoký typ genu hybridizuje za přísných podmínek na izolovaný inserčně-inaktivovaný gen nebo jeho část, jak je uvedeno v kroku (7).
  35. 35. Způsob podle kterékoliv z nároků 32 až 34, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je patogenní mikroorganizmus a genem, který umožňuje mikroorganizmu se adaptovat na specifické prostředí, je gen virulence.
  36. 36. Způsob podle kterékoliv z nároků 32 až 35, vy z n a č uj í c í se t í m , že mikroorganizmem je mikroorganizmus patogenní pro zvířata.
  37. 37. Způsob podle kterékoliv z nároků 32 až 36, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je mikroorganizmus patogenní pro rostliny.
  38. 38. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je libovolný mikroorganizmus vybraný ze skupiny zahrnující Bordetella spp., zejména B. pertussis,
  39. 39. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že mikroorganizmem je libovolný mikroorganizmus vybraný ze skupiny zahrnující Agrobacterium tumefaciens, Erwinia amylovara, Pseudomonas solanacearum, Rhizobium leguminosarum, Xanthomonas campestris p.v. citri, Magnaporthe grisea, Fusarium spp., Erisyphe spp., Colletotrichum gloeosporiodes, Gaeumannomyces graminis, Glomus spp., Laccaria spp., Leptosphaeria maculans, Phoma tracheiphila, Phytophthora spp., Pyrenophora teres, Verticillium alboatrum a V. dahliae, a Mycosphaerella musicola a M. fljiensis.
  40. 40. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že soubor mikroorganizmů v kroku (a) (1) jsou mikroorganizmy Salmonella a mutantní mikroorganizmus získaný ve stupni (b) je mutant Salmonella.
  41. 41. Způsob přípravy mutantního mikroorganizmu, který může účinkovat jako vakcína pro jiný patogen, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně vytvoření mutantního mikroorganizmu podle nároku 36, který exprimuje antigenní epitop z jiného patogenu.
  42. 42. Způsob přípravy vakcíny, vyznačující se tím, že zahrnuje vytvoření mutantního mikroorganizmu podle nároku 36 nebo 41 a jeho formulaci do imunogenního přípravku.
  43. 43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že imunogenní přípravek obsahuje adjuvans.
    -43 CZ 296981 B6 (1) vytvoření souboru mikroorganizmů, kde každý z nich je nezávisle mutován inserční inaktivací genu nukleovou kyselinou obsahující jedinečnou markerovou sekvenci tak, že každý mutant obsahuje jinou markerovou sekvenci, nebo klonů uvedených mikroorganizmů;
  44. 44. Způsob přípravy farmaceutického prostředku na bázi mutantního mikroorganizmu, vyznačující se tím, že zahrnuje kombinaci tohoto mutantního mikroorganizmu podle nároku 36 nebo 41 s jednou nebo více farmaceuticky přijatelnými nosičovými látkami.
  45. 45. Způsob identifikace sloučeniny, která snižuje schopnost mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) identifikování genu, který umožňuje mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí způsobem uvedeným v části (a) nároku 32, nebo vytvoření genu identifikovaného jako SEQ ID č. 8 až 36 nebo genu v libovolné sekvenci ze Salmonella sekvencí zobrazených na obr. 5 nebo genu obsaženého v SEQ ID č. 37 nebo 38 nebo jeho varianty s přinejmenším 85% identitou sekvence, a (b) selektování sloučeniny, která interferuje s funkcí genu nebo s odpovídajícím divokým typem genu mikroorganizmu, nebo sloučenina, která interferuje s polypeptidem kódovaným tímto genem.
    -45 CZ 296981 B6
  46. 46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že odpovídající divoký typ genu hybridizuje za přísných podmínek na izolovaný inserčně-inaktivovaný gen nebo jeho část, jak je uvedeno v kroku (7) v nároku 5.
    -46 CZ 296981 B6
    Campylobacter spp., zejména C. jejuni, Clostridium spp., zejména C. botulinum, Enterococcuis spp., zejména E. faecalis, Escherichia spp., zejména E. coli, Haemophilus spp., zejména H. ducrey a H. influenzae, Helicobacter spp., zejména H. pylori, Klebsiella spp., zejména K. pneumoniae, Legionella spp., zejména Z. pneumophila, Listeria spp., zejména Z. monocytogenes, Mycobacterium spp., zejména M. smegmatis a M. tuberculosis, Neisseria spp., zejména N. gonorrhoeae a N. meningitidis, Pseudomonas spp., zejména Ps. aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., zejména S. aureus, Streptococcus spp., zejména S. pyogenes a pneumoniae, Vibrio spp., Yersinia spp., zejména Y. pestis, Aspergillus spp., zejména A. fumigatus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum a Toxoplazma.
  47. 47. Způsob přípravy farmaceutického prostředku na bázi sloučeniny, která snižuje schopnost mikroorganizmu adaptovat se na specifické prostředí, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) identifikaci sloučeniny za použití metody podle nároku 45 nebo 46, kde uvedený mikroorganizmus je patogenní pro zvířata, a (b) kombinaci s farmaceuticky přijatelnou nosičovou
    -47 CZ 296981 B6
  48. 48. Způsob přípravy léčiva k zabránění nebo zmírnění infekce mikroorganizmem, vyznačující se tím, že zahrnuje identifikaci sloučeniny za použití metody podle nároku 45 nebo 46, kde uvedený mikroorganizmus je patogenní pro zvířata, a přípravu uvedeného léčiva.
CZ0175597A 1994-12-09 1995-12-11 Zpusob pro identifikaci mikroorganizmu, zpusob identifikování genu, mikroorganizmus, vakcína a zpusob její prípravy, zpusob získání mutantního mikroorganizmu, zpusob prípravy farmaceutického prostredku, zpusob identifikace slouceniny a zpusob príprav CZ296981B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9424921.6A GB9424921D0 (en) 1994-12-09 1994-12-09 Identification of genes
GBGB9501881.8A GB9501881D0 (en) 1995-01-31 1995-01-31 Identification of genes
GBGB9509239.1A GB9509239D0 (en) 1995-05-05 1995-05-05 Identification of genes
PCT/GB1995/002875 WO1996017951A2 (en) 1994-12-09 1995-12-11 Identification of genes responsible for in vivo survival of microorganisms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ175597A3 CZ175597A3 (en) 1997-10-15
CZ296981B6 true CZ296981B6 (cs) 2006-08-16

Family

ID=27267507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0175597A CZ296981B6 (cs) 1994-12-09 1995-12-11 Zpusob pro identifikaci mikroorganizmu, zpusob identifikování genu, mikroorganizmus, vakcína a zpusob její prípravy, zpusob získání mutantního mikroorganizmu, zpusob prípravy farmaceutického prostredku, zpusob identifikace slouceniny a zpusob príprav

Country Status (20)

Country Link
US (7) US5876931A (cs)
EP (3) EP0889120B1 (cs)
JP (3) JP3522285B2 (cs)
KR (4) KR20060099543A (cs)
CN (3) CN1912141B (cs)
AT (2) ATE171477T1 (cs)
AU (1) AU711524C (cs)
CA (2) CA2623339C (cs)
CZ (1) CZ296981B6 (cs)
DE (3) DE69505011T2 (cs)
DK (2) DK0889120T3 (cs)
ES (2) ES2126332T3 (cs)
FI (1) FI121601B (cs)
HU (1) HUT76975A (cs)
NO (2) NO320492B1 (cs)
NZ (3) NZ511170A (cs)
PT (1) PT889120E (cs)
RU (1) RU2370541C2 (cs)
SG (4) SG119177A1 (cs)
WO (1) WO1996017951A2 (cs)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ296981B6 (cs) * 1994-12-09 2006-08-16 Imperial College Innovations Limited Zpusob pro identifikaci mikroorganizmu, zpusob identifikování genu, mikroorganizmus, vakcína a zpusob její prípravy, zpusob získání mutantního mikroorganizmu, zpusob prípravy farmaceutického prostredku, zpusob identifikace slouceniny a zpusob príprav
AU743007B2 (en) * 1996-06-17 2002-01-17 Essential Therapeutics, Inc. Screening methods using microbial strain pools
US6455323B1 (en) 1997-07-03 2002-09-24 Pharmacia & Upjohn Company Anti-bacterial methods and materials
NO974299D0 (no) * 1997-09-18 1997-09-18 Forskningsparken I Aas As Metode for stabil merking av mikroorganismer
AU2144499A (en) * 1998-01-22 1999-08-09 Vrije Universiteit Brussel Live attenuated salmonella vaccine
EP0943681A1 (en) * 1998-01-22 1999-09-22 Vrije Universiteit Brussel Live attenuated salmonella vaccine
WO1999045136A1 (en) * 1998-03-05 1999-09-10 University Of British Columbia Methods for assaying type iii secretion inhibitors
AU758565B2 (en) * 1998-03-18 2003-03-27 Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The Selection subtraction approach to gene identification
AU4188199A (en) * 1998-05-15 1999-12-06 University Of California, Los Angeles Type iii (bordetella) secretion system
BR9914479A (pt) * 1998-09-04 2001-06-26 Creatogen Ag Mutantes sp12 de salmonella atenuada como carreadores antìgenos
AU6504399A (en) * 1998-09-30 2000-04-17 Boston Medical Center Corporation Identification of virulence determinant activators in prokaryotic pathogens government support
US6720139B1 (en) 1999-01-27 2004-04-13 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Genes identified as required for proliferation in Escherichia coli
US6299850B1 (en) 1999-03-16 2001-10-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Energy Carbon activation process for increased surface accessibility in electrochemical capacitors
US6790950B2 (en) 1999-04-09 2004-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Anti-bacterial vaccine compositions
EP2281833B1 (en) 1999-04-09 2014-07-02 Zoetis P&U LLC Attenuated Pasteurellaceae bacterium having a mutation in a virulence gene
GB9910812D0 (en) 1999-05-10 1999-07-07 Microscience Ltd Vaccine composition
WO2001002555A1 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 Institut Pasteur Method of making and identifying attenuated microorganisms, compositions utilizing the sequences responsible for attenuation, and preparations containing attenuated microorganisms
WO2001034810A2 (en) * 1999-11-09 2001-05-17 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Genes essential for microbial proliferation
WO2001057075A2 (en) * 2000-02-03 2001-08-09 Microscience Limited Virulence genes, proteins, and their use
US6783985B1 (en) 2000-02-18 2004-08-31 Elitra Pharmaceuticals Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
AU2001256957B2 (en) 2000-03-17 2005-08-25 Pharmacia & Upjohn Company Llc Salmonella vaccine materials and methods
GB0008748D0 (en) * 2000-04-11 2000-05-31 Univ Manchester Mutant bank
GB0011108D0 (en) * 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
US20020076722A1 (en) * 2000-09-13 2002-06-20 Neyfakh Alexander A. Antibiotic hypersusceptibility mutations in bacteria
US20020094536A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-18 Cell Therapeutics, Inc. Methods for making polynucleotide libraries, polynucleotide arrays, and cell libraries for high-throughput genomics analysis
US20030180953A1 (en) * 2000-12-29 2003-09-25 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
US20030119013A1 (en) * 2001-04-23 2003-06-26 Bo Jiang Identification of essential genes of Aspergillus fumigatus and methods of use
ATE345386T1 (de) * 2001-05-17 2006-12-15 Creatogen Ag Methode zum auffinden von abgeschwächten oder virulent-defekten mikroben
WO2002103513A1 (en) * 2001-06-15 2002-12-27 Chiron Corporation Essential and important genes of pseudomonas aeruginosa and the use thereof to design or identify antibacterial agents
WO2003089572A2 (en) * 2002-04-15 2003-10-30 Chiron Corporation Essential and important genes of pseudomonas aeroginosa and the use thereof to design or identify antibacterial agents
CA2451026C (en) 2001-06-22 2013-12-10 Health Protection Agency Mycobacterial antigens expressed under low oxygen tension
JP2005508613A (ja) 2001-07-04 2005-04-07 ヘルス プロテクション エージェンシー 潜伏中に発現されるマイコバクテリア抗原
WO2003008631A2 (en) * 2001-07-20 2003-01-30 Health Protection Agency Tagging of microorganisms
US7026123B1 (en) 2001-08-29 2006-04-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. UTR tag assay for gene function discovery
GB0125535D0 (en) 2001-10-24 2001-12-12 Microbiological Res Authority Mycobacterial genes down-regulated during latency
US20040029129A1 (en) * 2001-10-25 2004-02-12 Liangsu Wang Identification of essential genes in microorganisms
WO2003041734A1 (en) * 2001-11-12 2003-05-22 Pharmacia & Upjohn Company Salmonella vaccine
US20030170694A1 (en) * 2001-12-21 2003-09-11 Daniel Wall Stabilized nucleic acids in gene and drug discovery and methods of use
US7449178B2 (en) 2002-04-05 2008-11-11 Merial Limited Attenuated gram negative bacteria
ES2320419T3 (es) * 2002-04-05 2009-05-22 Merial Bacterias gram negativas atenuadas.
WO2004018624A2 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Chiron Corporation Random transposon insertion in staphylococcus aureus and use thereof to identify essential genes
FI116068B (fi) * 2003-09-15 2005-09-15 Fit Biotech Oyj Plc Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi
US20070224341A1 (en) * 2003-11-21 2007-09-27 Matthias Kuntz Method for the Modification of Chiral Liquid-Crystal Films with the Aid of Extractants
US20050266447A1 (en) * 2004-04-19 2005-12-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for identifying activators of gene transcription
WO2006085899A2 (en) 2004-05-21 2006-08-17 The Regents Of The University Of California Method for enhancing production of isoprenoid compounds
US8163980B2 (en) 2005-07-05 2012-04-24 The Regents Of The University Of California Polynucleotides encoding isoprenoid modifying enzymes and methods of use thereof
EP1752532A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-14 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Extracellular polyhydroxyalkanoates produced by genetically engineered microorganisms
MX284139B (es) 2006-05-26 2011-02-18 Amyris Biotechnologies Inc Produccion de isoprenoides.
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
EP3020799B1 (en) 2006-09-26 2020-08-26 The Regents of The University of California Production of isoprenoids and isoprenoid precursors
US20110027321A1 (en) * 2007-05-25 2011-02-03 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia Vaccine Comprising HtrA Polypeptides
WO2009158240A1 (en) 2008-06-16 2009-12-30 Emergent Product Development Uk Limited Salmonella vectored vaccines against chlamydia and methods of use
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US9051665B2 (en) * 2008-11-20 2015-06-09 Steven L. Zeichner Method for screening biomolecules
US10369772B2 (en) 2012-07-10 2019-08-06 Textron Innovations Inc. Method of making core-stiffened structure
WO2011123567A1 (en) 2010-03-31 2011-10-06 Codexis, Inc. Production of geranyl diphosphate
EP3078753B1 (en) 2010-05-10 2018-04-18 The Regents of The University of California Methods using endoribonuclease compositions
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US8829171B2 (en) 2011-02-10 2014-09-09 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
CN103443338B (zh) 2011-02-02 2017-09-22 华盛顿大学商业化中心 大规模平行邻接作图
US8481052B2 (en) * 2011-05-17 2013-07-09 Cj Cheiljedang Corporation Avirulent Salmonella gallinarum variants and pharmaceutical composition using the same
JP6406581B2 (ja) 2011-12-16 2018-10-17 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー オプシンポリペプチドおよびその使用法
RU2015105588A (ru) 2012-07-19 2016-09-10 Редвуд Байосайнс, Инк. Антитело, специфическое к cd22, и способы его применения
HUE048780T2 (hu) 2012-08-16 2020-09-28 Ipierian Inc Tauopátia kezelésére szolgáló módszerek
EP2912065A4 (en) 2012-10-25 2016-10-19 True North Therapeutics Inc ANTI COMPLEMENT C1S ANTIBODIES AND USES THEREOF
CA2889197A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
EP3881868B1 (en) 2013-02-15 2023-09-27 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptor and methods of use thereof
EP2970951B1 (en) 2013-03-13 2019-02-20 Illumina, Inc. Methods for nucleic acid sequencing
WO2014161988A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Université Du Luxembourg Biotechnological production of itaconic acid
SMT202000401T1 (it) 2013-06-10 2020-11-10 Ipierian Inc Metodi di trattamento di una taupatia
DK3083994T3 (da) 2013-12-20 2021-09-13 Illumina Inc Bevarelse af genomisk konnektivitetsinformation i fragmenterede genomiske DNA-prøver
SG11201610910QA (en) 2014-06-30 2017-01-27 Illumina Inc Methods and compositions using one-sided transposition
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US11873480B2 (en) 2014-10-17 2024-01-16 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
MX389703B (es) 2015-04-06 2025-03-20 Bioverativ Usa Inc Anticuerpos anti-c1s humanizados y metodos para usarlos.
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN117510633A (zh) 2015-09-02 2024-02-06 伊缪泰普有限公司 抗lag-3抗体
CU24649B1 (es) 2016-03-19 2023-02-13 Exuma Biotech Corp Retrovirus recombinantes incompetentes de replicación para la transducción de linfocitos y expansión regulada de los mismos
WO2020047527A2 (en) 2018-09-02 2020-03-05 F1 Bioventures, Llc Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
EA201892225A1 (ru) 2016-04-04 2019-09-30 БИОВЕРАТИВ ЮЭсЭй ИНК. АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ Bb КОМПЛЕМЕНТА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
AU2017292936C1 (en) 2016-07-08 2024-05-02 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
CA3030792A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-18 uBiome, Inc. Method and system for microbial pharmacogenomics
AR110677A1 (es) 2016-10-12 2019-04-24 Bioverativ Usa Inc Anticuerpos anti-c1s y métodos para usarlos
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
WO2018136570A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 F1 Oncology, Inc. Chimeric antigen receptors against axl or ror2 and methods of use thereof
EP3589733A1 (en) 2017-03-03 2020-01-08 F1 Oncology, Inc. Methods and compositions for transducing and expanding lymphocytes and regulating the activity thereof
JP7618192B2 (ja) 2017-03-28 2025-01-21 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 移植された組織を拒絶反応から保護するための方法
JP7198555B2 (ja) 2017-04-27 2023-01-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア カンナビノイドおよびカンナビノイド誘導体を産生するための微生物および方法
WO2018232372A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Protelica, Inc. Fibronectin binding domain chimeric antigen receptors and methods of use thereof
JP7369121B2 (ja) 2017-10-11 2023-10-25 バイオベラティブ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド 補体活性を誘発する方法
US11447769B2 (en) 2018-03-27 2022-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified immune cells having enhanced function and methods for screening for same
CA3100247A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 Regents Of The Univesity Of Minnesota Drug-resistant immune cells and methods of use thereof
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
WO2022187289A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for the delivery of retroviral particles
EP4433512A2 (en) 2021-11-19 2024-09-25 The Trustees of The University of Pennsylvania Engineered pan-leukocyte antigen cd45 to facilitate car t cell therapy
US20250099612A1 (en) 2022-03-01 2025-03-27 Exuma Biotech Corp. Viral particles with membrane-bound hyaluronidase

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992001056A1 (fr) * 1990-07-11 1992-01-23 Institut Pasteur Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires
WO1993004202A1 (en) * 1991-08-22 1993-03-04 Washington University Polynucleotide probes for salmonella
US5397697A (en) * 1989-01-10 1995-03-14 Ciba-Geigy Corporation Identification of plant-responsive genes of bacteria

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) * 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) * 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
DK171727B1 (da) * 1978-12-22 1997-04-14 Biogen Inc Rekombinante hepatitis B virus DNA-molekyler, værtsorganismer transformeret hermed, HBV-antigenspecifikke polypeptider, DNA-sekvenser kodende for HBV-antigenspecifikke polypeptider, metoder til påvisning af hepatitis B virus-antistoffer, metoder til fremstilling af nævnte DNA-molekyler, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte polypeptider og midler til påvisning af HBV-infektion
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4837151A (en) * 1980-05-19 1989-06-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen
US4550081A (en) * 1980-05-19 1985-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Non-reverting salmonella
US5210035A (en) * 1980-05-19 1993-05-11 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Non-reventing live vaccines
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) * 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4757006A (en) * 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) * 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US5643579A (en) * 1984-11-01 1997-07-01 American Home Products Corporation Oral vaccines
US4810648A (en) * 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
SU1751208A1 (ru) * 1989-08-10 1992-07-30 Институт Органического Синтеза Ан Латвсср Рекомбинантна плазмидна ДНК pFRBLV - F6, кодирующа белок оболочки бактериофага @ и белок @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструировани и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент белка оболочки бактериофага @ и белка @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота
SE9101433D0 (sv) 1991-05-13 1991-05-13 Marianne Hansson Recombinant dna sequence and its use
WO1993007266A1 (en) * 1991-10-07 1993-04-15 Idaho Research Foundation, Inc. Genetic construct for selection of homologous recombinants on a single selective medium
US5356797A (en) * 1991-11-15 1994-10-18 Board Of Regents, The University Of Texas Membrane expression of heterologous genes
AU3130893A (en) 1991-11-15 1993-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Membrane expression of heterologous genes
EP0668779A4 (en) 1992-11-06 1996-08-21 Univ Minnesota Vaccine to protect against pasteurellosis - infection by P.multocida.
WO1994026933A1 (en) * 1993-05-13 1994-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genetic footprinting: insertional mutagenesis and genetic selection
US5700638A (en) 1993-08-26 1997-12-23 Washington University Cell death regulator
DE4405652A1 (de) * 1994-02-22 1995-09-07 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von nichtoxidischer Keramik mit definierter Wärmeleitfähigkeit
WO1996011708A1 (en) 1994-10-18 1996-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Membrane expression of heterologous genes
CZ296981B6 (cs) * 1994-12-09 2006-08-16 Imperial College Innovations Limited Zpusob pro identifikaci mikroorganizmu, zpusob identifikování genu, mikroorganizmus, vakcína a zpusob její prípravy, zpusob získání mutantního mikroorganizmu, zpusob prípravy farmaceutického prostredku, zpusob identifikace slouceniny a zpusob príprav
US5700683A (en) * 1995-02-17 1997-12-23 Pathogenesis Corporation Virulence-attenuating genetic deletions deleted from mycobacterium BCG
JPH11514870A (ja) * 1995-10-16 1999-12-21 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 新規な唾液結合タンパク質
WO1997018225A1 (en) 1995-11-14 1997-05-22 The General Hospital Corporation Salmonella secreted proteins and uses thereof
AU4070097A (en) 1996-08-16 1998-03-06 Uab Research Foundation, The Mucosal immunogens for novel vaccines
GB9621091D0 (en) * 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
ATE284613T1 (de) 1997-02-14 2005-01-15 Merck & Co Inc Polynukleotid-impfstoff-formulierungen
US6455323B1 (en) 1997-07-03 2002-09-24 Pharmacia & Upjohn Company Anti-bacterial methods and materials
GB9804809D0 (en) 1998-03-06 1998-04-29 Wallis Timothy S Attenuated salmonella:materials and methods relating thereto
US6585975B1 (en) * 1998-04-30 2003-07-01 Acambis, Inc. Use of Salmonella vectors for vaccination against helicobacter infection
BR9914479A (pt) 1998-09-04 2001-06-26 Creatogen Ag Mutantes sp12 de salmonella atenuada como carreadores antìgenos
AU773003B2 (en) * 1998-11-09 2004-05-13 Microscience Limited Virulence genes and proteins, and their use
GB9910812D0 (en) * 1999-05-10 1999-07-07 Microscience Ltd Vaccine composition
EP1226254A2 (en) 1999-11-05 2002-07-31 L'Unité de Recherche en Biologie Moléculaire (URBM) des Facultés Universitaires Notre Dame de la Paix (FUNDP) Virulence genes, proteins, and their use
EP1240332B1 (en) * 1999-12-23 2008-01-23 Vmax Limited Streptococcus pyogenes virulence genes and proteins and their use
GB0011108D0 (en) 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
US6548368B1 (en) * 2000-08-23 2003-04-15 Applied Materials, Inc. Method of forming a MIS capacitor
GB0127657D0 (en) 2001-11-19 2002-01-09 Microscience Ltd Virulence genes and proteins and their use
US7449178B2 (en) * 2002-04-05 2008-11-11 Merial Limited Attenuated gram negative bacteria

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5397697A (en) * 1989-01-10 1995-03-14 Ciba-Geigy Corporation Identification of plant-responsive genes of bacteria
WO1992001056A1 (fr) * 1990-07-11 1992-01-23 Institut Pasteur Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires
WO1993004202A1 (en) * 1991-08-22 1993-03-04 Washington University Polynucleotide probes for salmonella

Also Published As

Publication number Publication date
AU711524C (en) 2004-03-18
US7842290B2 (en) 2010-11-30
ATE171477T1 (de) 1998-10-15
DE69505011T2 (de) 1999-05-06
KR20040023806A (ko) 2004-03-19
EP1285960A2 (en) 2003-02-26
KR100551104B1 (ko) 2006-02-09
JP3522285B2 (ja) 2004-04-26
US5876931A (en) 1999-03-02
JP4220195B2 (ja) 2009-02-04
EP0889120B1 (en) 2002-04-10
WO1996017951A2 (en) 1996-06-13
HK1009833A1 (en) 1999-06-11
NZ511170A (en) 2005-02-25
US6984490B1 (en) 2006-01-10
KR100445103B1 (ko) 2004-12-04
SG56084A1 (en) 2003-03-18
EP0889120A1 (en) 1999-01-07
KR20060099543A (ko) 2006-09-19
CN1912141B (zh) 2010-10-27
AU711524B2 (en) 1999-10-14
CN1912141A (zh) 2007-02-14
NO327361B1 (no) 2009-06-15
PT889120E (pt) 2002-09-30
US20060216309A1 (en) 2006-09-28
HUT76975A (hu) 1998-01-28
NO972468D0 (no) 1997-05-30
RU2370541C2 (ru) 2009-10-20
DE69526377T2 (de) 2002-11-07
FI121601B (fi) 2011-01-31
DK0796341T3 (da) 1999-06-14
US6342215B1 (en) 2002-01-29
EP0796341B1 (en) 1998-09-23
DE69526377D1 (de) 2002-05-16
SG173213A1 (en) 2011-08-29
JP2009005688A (ja) 2009-01-15
US6015669A (en) 2000-01-18
AU4121996A (en) 1996-06-26
JP2003144180A (ja) 2003-05-20
RU2003135645A (ru) 2005-05-27
CZ175597A3 (en) 1997-10-15
NZ296581A (en) 2000-02-28
CA2206515A1 (en) 1996-06-13
FI972424A0 (fi) 1997-06-06
EP1285960A3 (en) 2003-05-07
CA2623339A1 (en) 1996-06-13
ATE215986T1 (de) 2002-04-15
CA2206515C (en) 2009-11-17
ES2178101T3 (es) 2002-12-16
JPH10509872A (ja) 1998-09-29
DE69505011D1 (de) 1998-10-29
US20080175866A1 (en) 2008-07-24
CN1160469C (zh) 2004-08-04
CA2623339C (en) 2012-05-08
FI972424A7 (fi) 1997-08-06
ES2126332T3 (es) 1999-03-16
WO1996017951A3 (en) 1996-10-17
CN1510137A (zh) 2004-07-07
HK1100782A1 (en) 2007-09-28
EP0796341A2 (en) 1997-09-24
NO20042249L (no) 1997-08-08
NZ502020A (en) 2001-06-29
NO972468L (no) 1997-08-08
NO320492B1 (no) 2005-12-12
KR20050052665A (ko) 2005-06-03
US20110229515A1 (en) 2011-09-22
DE889120T1 (de) 2001-01-11
DK0889120T3 (da) 2002-07-22
SG119177A1 (en) 2006-02-28
SG165157A1 (en) 2010-10-28
CN1176662A (zh) 1998-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0796341B1 (en) Identification of genes which allow a microorganism to adapt to a particular environment
RU2241758C2 (ru) Способ определения микроорганизма с пониженной адаптацией к конкретной окружающей среде, днк (варианты), ген вирулентности, полипептид, способ определения соединения, антисмысловая нуклеиновая кислота, способ лечения хозяина и фармацевтическая композиция
AU758791B2 (en) Identification of genes
HK1100782B (en) Identification of genes
HK1009833B (en) Identification of genes
HK1063200A (en) Identification of genes

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20121211