KR20050052665A - 유전자의 동정 - Google Patents

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Abstract

특정 환경에 대한 감소된 적응력을 가지는 미생물을 동정(identification)하는 방법으로서, (1) 각각의 미생물이 독특한 표지(marker) 서열을 포함하는 핵산을 가진 유전자의 삽입 불활성화(insertional inactivation)에 의해 독립적으로 돌연변이되어 각각의 돌연변이가 상이한 표지 서열을 가지게 되는 복수의 미생물, 또는 상기한 미생물의 클론(clones)을 제공하는 단계; (2) 단계(1)에 의해 생산된 각 돌연변이의 저장 표본을 각각 제공하고, 각개의 돌연변이로부터의 독특한 표지 서열을 포함하는 저장 핵산을 각각 제공하는 단계; (3) 단계(1)에 의해 생산된 복수의 돌연변이들을 상기한 특정 환경에 도입하여 상기한 특정 환경에서 성장할 수 있는 그 미생물들이 상기한 환경에서 성장하도록 하는 단계; (4) 상기한 환경으로부터 미생물 또는 그들의 선택된 일부를 회수하고 그 회수된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계; (5) 단계(4)에서 분리된 핵산에 있는 모든 표지 서열과 단계(2)에서와 같이 저장된 각개의 돌연변이의 독특한 표지 서열을 비교하는 단계;그리고 (6) 단계(4)에서 분리된 어떠한 표지 서열도 가지고 있지 않는 개개의 돌연변이를 선별하는 단계:를 포함하는 방법이다.

Description

유전자의 동정 {IDENTIFICATION OF GENES}
본 발명은 미생물의 환경에 대한 적응에 관여하는 유전자들의 동정(identification)을 위한 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 병원성 미생물의 발병력(virulence)에 관여하는 유전자들의 동정에 관한 것이다.
세균성 그리고 기타 병원체에서 항생제에 대한 내성은 점차 중요해지고 있다. 따라서 병원 미생물을 공격하는 새로운 치료 방법을 찾아내는 것이 중요하다.
병원성 미생물은 숙주의 방어 기작을 침범하여야만 하고 감염을 확립시키기 위해서는 빈영양의 환경에서 성장할 수 있어야만 한다. 그렇게 하기 위해서는 미생물의 많은 "발병력" 유전자들이 요구된다.
발병력 유전자들은 고전 유전학을 이용하여 탐지된 바 있고 다양한 접근법들이 세균성 발병력 유전자들의 동정을 위한 트랜스포존 돌연변이(transposon mutagenesis)를 이용하는데 사용되어졌다. 예를 들면, 돌연변이들은 철에 의해 조절되는 단백질들의 유실(홀란드 등, 1992)과 같은 한정된 생리적 결점에 대해, 또는 표피 세포들의 투과(핀레이 등, 1988)와 매크로파아지(macrophage)내에서의 생존(필드 등,1989; 밀러 등, 1989a; 그로이즈만 등, 1989)을 연구하는 분석에서 스크린(screen)되어 왔다. 트랜스포존 돌연변이들은 또한 감염된 생존 동물 모델에서의 변화된 발병력에 대해서도 시험된 바 있다. 이러한 접근법은 감염의 상이한 단계 동안 중요한 유전자들을 동정할 수 있다는 장점을 가지만 광범위한 각각의 돌연변이가 별병력의 변화에 대해 시험되어야만 하는 요구에 의해 심각하게 제한된다. 밀러 등(1989b)은 8 내지 10마리 쥐 그룹을 이용하여 95개의 별개 그룹을, 즉 760 내지 950 마리의 쥐를 사용하여 다른 돌연변이로써 경구 감염시켰다. 지나치게 많은 동물이 필요하기 때문에 발병력 유전자에 대한 세균 게놈(genome)의 이해할 만한 스크리닝이 용이하지 않았다.
최근에 감염 동안 특이하게 유도되는 살모넬라(Salmonella) 유전자들을 양성적으로 선별하는 유전학적 시스템(생체내 발현 기술(in vivo expression technology, [IVET])이 기술된 바 있다. 그 기술은 감염 과정에 있어서 특정 단계에서 발현되는 유전자들을 동정한다. 그러나 전사 후 조절을 받는 발병력 유전자들을 동정할 수 없으며, 더욱 중요하게는 동정된 유전자가 실질적으로 감염 과정에 필요하거나 기여하는지 여부에 대한 정보를 제공할 수 없다.
리와 팔코우 (1994) Methods Enzymol. 236, 531-545는 과잉 침투성(hyperinvasive) 돌연변이를 분리함으로써 시험관 내에서(in vitro) 살모넬라를 포유 세포로 침투시키는데 영향을 미치는 인자들을 확인하는 방법을 기술하고 있다.
발쉬와 쳅코 (1992) 사이언스 255, 434-440는 쥐에서 뇌 피질의 발생 중 뇌 피질 원조(progenitor) 세포의 공간적 위치를 추적하는 방법을 기술하고 있다. 발쉬와 쳅코 방법은 독특한 핵산 서열과 lacZ 유전자를 가지는 태그(tag)를 사용하지만 유용한 돌연변이나 유전자가 그들의 방법에 의해 탐지될 수 있다는 어떠한 지적도 없다.
WO 94/26933과 스미스 등 (1995) Proc. Natl. Sci. USA 92, 6479-6483은 알려진 유전자, 또는 적어도 일부 서열 정보가 이용 가능한 DNA 분자의 기능적 부분의 동정을 목표로 하는 방법들을 기술하고 있다.
그로이즈만 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1033-1037은 살모넬라에 특이한 서열의 분자적이고 기능적이며 진화적인 분석을 기술하고 있다.
일부 발병력 유전자들이 에스쉐리치아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 클로스트리디움 보툴리넘(Clostridium botulinum), 예시니아 페스티스(Yersinia pestis), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)와 같은 병원성 미생물에 대해 알려져 있으나 모든 경우 전체 중 비교적 소수만이 동정되어 있다.
본 발명의 목적은 미생물의 환경에 대한 적응에 관여하는 유전자들을 동정하는 것이며, 특히 병원성 미생물에서 더 많은 발병력 유전자를 더욱 효율적으로 동정하는 것이다. 더 나아간 목적은 발병력 유전자를 동정하는데 사용되는 실험 동물들의 수를 줄이는 것이다. 본 발명의 더욱 더 나아간 목적은 백신(vaccine)과 발병력을 감소시키는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면은 특정 환경에 대한 감소된 적응을 가지는 미생물을 동정하는 방법으로서,
(1) 각각의 미생물이 독특한 표지 서열을 포함하는 핵산을 가진 유전자의 삽입 불활성화(insertional inactivation)에 의해 독립적으로 돌연변이되어 각 돌연변이가 상이한 표지 서열을 가지는 복수의 미생물, 또는 상기한 미생물의 클론을 제공하는 단계;
(2) 단계(1)에 의해 생산된 각 돌연변이의 저장된 표본을 각각 제공하고 각개의 돌연변이로부터의 독특한 표지 서열을 포함하는 저장된 핵산을 각각 제공하는 는 단계;
(3) 단계(1)에 의해 생산된 복수의 미생물을 상기한 특정 환경에 도입하여 상기한 특정 환경에서 성장할 수 있는 그들 미생물이 상기한 환경에서 성장하도록 하는 단계;
(4) 상기한 환경으로부터 미생물 또는 그들의 선택된 부분을 회수하고 회수된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계;
(5) 단계(4)에서 분리된 핵산에 있는 모든 표지 서열과 단계(2)에서와 같이 저장된 각개의 돌연변이의 독특한 표지 서열을 비교하는 단계;그리고
(6) 단계(4)에서 분리된 어떠한 표지 서열도 가지고 있지 않는 개개의 돌연변이를 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
따라서 본 방법은 그 환경에서 증식하는 능력이 감소된 미생물을 동정하기 위해 음성적인 선별법을 사용한다.
미생물은 많은 상이한 환경에서 생존할 수 있으며 특정 유전자들과 그들의 산물이 미생물로 하여금 특정 환경에 적응하도록 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 병원성 세균 또는 병원성 곰팡이와 같은 병원성 미생물이 그들의 숙주 내에서 생존하기 위해서는 하나 이상의 발병력 유전자의 산물이 필요하다. 따라서 본 발명의 더 바람직한 태양에서는 미생물이 특정 환경에 적응하도록 하는 유전자가 발병력 유전자인 것이다.
편리하게는 상기한 특정 환경은 식물 또는 동물과 같은 분화된 다세포 개체이다. 많은 세균과 곰팡이들은 식물을 감염하는 것으로 알려져 있고 그들은 식물 내에서 생존할 수 있으며 발병력 유전자의 존재와 그로부터의 발현 때문에 질병을 일으킨다. 그 특정 환경이 식물인 때 적합한 미생물은 세균으로 특히 포도에서 종양을 형성하는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens); 어비니아 아밀로바라(Erwinia amylovara); 광범위한 식물에서 시듦병을 일으키는 슈도모나스 솔라나세아럼(Pseudomonas solanacearum); 콩에서 질병을 일으키는 리조비움 레구미노사럼(Rhizobium leguminosarum); 감귤류의 열매에서 암종병을 일으키는 잔소모나스 캄페스트리스 p.v. 사이트리(Xanthomonas campestris p.v. citri)를 포함하고; 곰팡이로 벼 배 질병을 일으키는 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea); 광범위한 식물 질병을 야기하는 푸자리움 spp.(Fusarium spp.); 에리사이페 spp.(Erisyphe spp.); 콜레토트리첨 글로에오스포리오데스(Colletotrichum gloeosporiodes); 땅콩과 잔디에서 뿌리와 수관 병을 일으키는 가에우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis); 글로무스 spp.(Glomus spp.);, 락카리아 spp.(Laccaria spp.); 렙토스페리아 매큘란스(Leptosphaeria maculans); 포마 트라쉐이필라(Phoma tracheiphila): 파이토프쏘라 spp.(Phytophthora spp.); 피레노포라 테레스(Pyrenophora teres); 버티실리움 앨보아트럼(Verticillium alboatrum)과 V. 달리아에(V. dahliae); 마이코스페렐라 무시콜라(Mycosphaerella musicola)와 M. 피지엔시스(M. fijiensis)를 포함한다. 아래에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 미생물이 곰팡이일 때 그 생활사 중 반수체 기가 필요하다.
유사하게 세균, 곰팡이, 원생동물, 트리파노조마를 포함하는 많은 미생물들은 동물들, 특히 사람을 포함하는 포유류를 감염하는 것으로 알려져 있다. 그 미생물의 동물 내 생존과 그 미생물의 질병을 야기하는 능력은 발병력 유전자의 존재와 그로부터의 발현에 많은 부분 기인한다. 적합한 세균은 보데텔라 spp.(Bordetella spp.) 특히 B. 페르투시스(B. pertussis), 캠필로박터 spp.(Campylobacter spp.) 특히 C. 제주니(C. jejuni), 클로스트리디움 spp.(Clostridium spp.) 특히 C. 보툴리넘(C. botulinum), 엔테로코커스 spp.(Enterococcus spp.) 특히 E. 페칼리스( E. faecalis), 에스쉐리치아 spp.(Escherichia spp.) 특히 E. 콜라이(E. coli), 헤모필러스 spp.(Haemophilus spp.) 특히 H. 두크레이(H. ducreyi)와 H. 인푸루엔자에(H. influenzae), 헬리코박터 spp.(Helicobacter spp.) 특히 H. 피로리(H. pylori), 크렙시엘라 spp.(Klebsiella spp.) 특히 K. 뉴모니아(K. pneumoniae), 레지오넬라 spp.(Legionella spp.) 특히 L. 뉴모필라(L. pneumophila), 리스테리아 spp.(Listeria spp.), 특히 L. 모노사이토제네스(L.monocytogenes), 마이코박테리움 spp.(Mycobacterium spp.) 특히 M. 스메그마티스(M. smegmatis)와 M. 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 나이세리아 spp.(Neisseria spp.), 특히 N. 고노로레아에( N. gonorrhoeae)와 N. 메닌지티디스(N. meningitidis), 슈도모나스 spp.(Pseudomonas spp.) 특히 Ps. 아에루지노사(Ps. aeruginosa), 살모넬라 spp.(Salmonella spp.), 시겔라 spp.(Shigella spp.), 스타피로코커스 spp.(Staphylococcus spp.) 특히 S. 아우레우스(S.aureus), 스트렙토코커스 spp.(Streptococcus spp.) 특히 S. 피오제네스(S. pyogenes)와 뉴모니아에(pneumoniae), 비브리오 spp.(Vibrio spp.) 그리고 예시니아 spp.(Yersinia spp.) 특히 Y. 페스티스(Y. pestis)를 포함한다. 모든 이들 세균은 사람에서 질병을 일으키고 또한 그 질병에 대한 동물 모델이 있다. 예를 들면 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)이 쥐를 감염시키는데 사용되었을 때 그 쥐는 사람에서 장티푸스에 대한 모델로 제공되는 병을 나타낸다. 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 쥐에서 균혈증과 신장 농양 형성을(앨부스 등 (1991) Infect. Immun. 59, 1008-1014) 그리고 토끼에서 심내막염을(펄만 & 프리드만(1971) Yale J. Biol. Med. 44, 206-213) 일으킨다.
곰팡이 또는 고등 진핵 기생체는 그것의 생활의 관련 부분(그 환경에서의 성장과 같은)에 대해 반수체일 것이 요구된다. 바람직하게는 DNA-매개 삽입 형질 전환 시스템이 사용 가능하고 그 미생물이 인체 병원체일 때 편리하게는 사람 질병의 동물 모델이 이용 가능하다. 사람에 대해 병원성인 적합한 곰팡이는 특정 아스퍼질러스 spp.(Aspergillus spp.)(예로써 A. 푸미가투스(A. fumigatus), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)와 히스토플라스마 캡슐레텀(Histoplasma capsulatum)을 포함한다. 명확히 위에서 언급한 곰팡이들은 반수체 기를 가지며 그들을 위해 DNA-매개 삽입 형질 전환 시스템이 사용 가능하다. 감염 중 반수체 기를 가지는 기생체인 톡소플라즈마(toxoplasma) 또한 사용될 수 있다. 세균은 반수체의 게놈을 가진다.
사람 질병의 동물 모델은 그 동물이 흰쥐, 쥐, 토끼, 개 또는 원숭이일 경우 자주 사용 가능하다. 만약 그 동물이 흰쥐라면 바람직하다. 사람 질병의 동물 모델을 이용하는 본 발명의 방법에 의해 탐지되는 발병력 유전자들은 명확히 그 미생물의 사람에서의 발병력을 결정하는 유전자일 것이다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위해 특히 바람직한 미생물들은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 그리고 아스퍼질러스 푸미가티스(Aspergillus fumigatis)이다.
본 발명의 바람직한 태양을 지금부터 기재한다.
독특한 표지 서열을 포함하는 핵산은 다음과 같이 만들어진다.
이중 가닥 DNA 서열 "태그(tags)"의 복합 풀(pool)은 올리고누클레오티드 합성과 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 만들어진다. 각 DNA "태그"는 약 20 과 80bp 사이, 바림직하게는 약 15 내지 30bp의 아암(arm)에 의해 연결된 약 40bp, 바람직하게는 모든 "태그"에 공통된 약 20bp의 독특한 서열을 가진다. 독특한 서열에 있는 bp의 수는 무작위 올리고누클레오티드(oligonucleotide) 합성에 의해 대량의 독특한 서열이 생성되게 하는데 충분하여야 하나 PCR을 방해할 수 있는 2차 구조의 형성이 일어나게할 만큼 많은 수이어서는 안된다. 유사하게 아암의 길이는 PCR에서 올리고누클레오티드의 프라이밍(priming)을 가능하게 하는데 충분하여야 한다.
올리고누클레오티드의 5'말단 서열은 증폭될 표적 서열과 결합 가능할 필요가 없다는 것은 잘 알려져 있다.
보통 PCR 프라이머(primer)들은 특히 3' 말단에서 서로 두개의 염기보다 긴 어떠한 상보적인 구조를 가져서는 안되는데 이 특징이 "프라이머 이중체(dimer)"라고 불리는 인위적인 산물의 형성을 촉진할 수 있기 때문이다. 두 프라이머의 3' 말단이 결합할 때 그들은 "프라임된 주형(primed template)" 복합체를 형성하고, 프라이머 확장(primer extension)은 "프라이머 이중체"라는 짧은 이중체 산물을 만들게 된다.
내부 2차 구조는 프라이머에서 피해야만 한다. 대칭적 PCR을 위하여 양 프라이머가 어떠한 한 염기의 긴 신장(伸長)을 가지지 않으면서 40∼60%의 G+C 함량을 가지도록 보통 추천된다. DNA 프로브 결합 연구와 결합하여 사용되는 고전적인 녹는점 계산은 주어진 프라이머가 특정 온도에서 어닐(anneal)되어야 하고 72℃ 확장 온도는 프라이머/주형 하이브리드(hybrids)를 성급하게 분리시킬 것을 자주 예상케 한다. 실제로 하이브리드는 단순 Tm 계산에 의해 일반적으로 예상되는 것 보다 PCR 과정에서 더 유효하다.
최적 어닐링 온도는 실험적으로 결정되며 예상되는 것 보다 더 높을 수 있다. Taq DNA 중합 효소는 37∼55℃ 부근에서 활성을 가지며 따라서 프라이머 확장은 어닐링 단계 중 일어나고 하이브리드는 안정화될 것이다. 프라이머의 농도는 일반적인(대칭적인) PCR에서와 동일한 것으로 전형적으로는 0.1- 에서 1-μM 범위 내이다.
"태그"는 트랜스포존 또는 트랜스포존 유사 요소에 리게이션(ligation)되어 독특한 표지 서열을 포함하는 핵산을 형성하게 된다. 편리하게는 상기한 트랜스포존은 "조력자(helper)" 개체에서는 플라스미드로서 유지되지만 본 발명의 방법의 미생물로 전이된 후에는 소실되는 자살 벡터(suicide vector)상에 운반되어진다. 예를 들면, 상기한 "조력자" 개체는 에스쉐리치아 콜라이(Escherichia coli) 종이 될 수 있고, 본 방법의 미생물은 살모넬라일 수 있으며 상기한 전이는 접합에 의한 전이(congugational transfer)이다. 상기한 트랜스포존이 전이 후 소실되더라도 세포의 비율에 따라 그것은 본 방법에 사용되는 미생물의 게놈으로 그것의 독특한 태그와 함께 무작위적으로 삽입되는 것을 통하여 치환 현상을 수행한다. 트랜스포존 또는 트랜스포존 유사 요소가 선별될 수 있으면 가장 바람직하다. 예를 들면, 살모넬라의 경우 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자가 트랜스포존에 존재하고 경접합개체(經接合個體)(excongugants)는 카나마이신 함유 배지 상에서 선별된다. 상기 독특한 유전자를 포함하는 핵산에 있는 기능적인 유전자로써 수용체 세포에서 영양 요구 표지를 보상(complement)하는 것 또한 가능하다. 이 방법은 곰팡이가 본 방법에 사용될 때 특히 편리하다.
바람직하게는 보상 곰팡이 유전자는 수용체 미생물과 동일한 종으로부터 유래되지 않아야 하며 그렇지 않은 경우, 무작위적이지 않은 삽입 현상이 일어날 수 있다.
만약 상기 트랜스포존 또는 트랜스포존 유사 요소가 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 사용되는 미생물에서 첫 번째 주어진 조건에서 염색체 외에서(episomally) 유지되는 것으로서, 두 번째 주어진 조건으로 그 조건을 변화시킬 때 그 에피좀(episome)이 유지될 수 없어서 상기 트랜스포존이나 트랜스포존 유사 요소가 그것의 독특한 태그와 함께 무작위적으로 본 방법에 사용된 미생물의 게놈으로 삽입되는 것을 통하는 치환 현상을 수행한 세포의 선별을 허용하는 벡터 상에 운반된다면 또한 특히 바람직하다. 이 특히 편리한 태양은 일단 염색체 외 벡터를 운반하는 미생물이 만들어지면 치환 현상이 일어나는 각 시간이 선택되어 첫 번째 주어진 조건에서 두 번째 주어진 조건으로 상기 미생물의 조건을 변화시킴으로써 유도되어 상기 트랜스포존이 미생물 게놈의 상이한 위치에 삽입할 수 있는 장점을 가진다. 따라서, 일단 각각이 염색체 외 벡터상에 운반된 트랜스포존 또는 트랜스포존 유사 요소 내에 독특한 태그 서열을 가지는 미생물의 주(主) 콜렉션(collection)이 만들어지면, 각각이 상이한 태그 서열을 가지는(즉 풀내에서 독특한) 무작위 삽입 돌연변이의 풀을 생성하는 데 반복적으로 사용되어질 수 있다. 이 태양은 (a) 본 방법의 단계(1)에서 독립적으로 돌연변이된 미생물들의 복수개(풀)를 생성하는데 요구되는 조작의 수와 복잡성(complexity)을 감소시키고; (b) 상이한 태그의 수는 본 방법의 단계(1)의 복수의 미생물에서 그 미생물의 수와 동일한 수만큼만 필요하게 되므로 특히 유용하다. (a)점은 본 방법을 트랜스포존 돌연변이가 수행되기 곤란한 개체(예, 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus))에서 사용하는 것을 더욱 용이하게 하며 (b)점은 특히 우수한 하이브리디제이션(hybridisation) 특성을 가지는 태그 서열이 선별됨으로써 질 조절이 더욱 쉬워지도록 하는 것을 의미한다. 아래에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 풀의 크기는 편리하게는 약 100 또는 200개의 독립적으로 돌연변이된 미생물들이고 따라서 미생물의 주 콜렉션은 편리하게 1 또는 2개의 96-웰(well) 마이크로타이터(microtitre) 접시(dish)에서 저장된다.
특히 바람직한 태양에서 첫 번째 주어진 조건은 첫 번째 특정 온도 또는 25℃ 내지 32℃와 같은 온도 범위, 가장 바람직하게는 약 30℃이며, 두 번째 주어진 조건은 두 번째 특정 온도 또는 35℃ 내지 45℃와 같은 온도 범위, 가장 바람직하게는 42℃이다. 더욱 바람직한 태양에서는 첫 번째 주어진 조건은 스트렙토마이신(streptomycin)과 같은 항생제의 존재이고 두 번째 주어진 조건은 상기한 항생제의 부재이고, 또는 첫 번째 주어진 조건은 항생제의 부재이고 두 번째 주어진 조건은 상기한 항생제의 존재이다.
그램(Gram) 음성 균의 게놈(genome)에 삽입되는데 적합한 트랜스포존은 Tn5, Tn10과 그들의 유도체를 포함한다. 그램 양성 균의 게놈에 삽입되는데 적합한 트랜스포존은 Tn916과 그 유도체 또는 유사체를 포함한다. 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 사용되기에 특히 적합한 트랜스포존은 Tn917(정 등(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6462-6466)과 Tn918(앨부스 등(1991) Infect. Immun. 59, 1008-1014)을 포함한다.
상기한 트랜스포존들이 카밀리 등 (1990) J. Bacteriol. 172, 3738-3744에 의해 기술된 Tn917 유도체의 성질을 가지고 pE194Ts(빌라페인 등 (1987) J. Bacteriol. 169, 4822-4829)와 같은 온도 감수성 벡터에 의해 운반된다면 특히 바람직하다. 비록 트랜스포존들이 유전자를 삽입 불활성화시키는데 편리하더라도 모든 다른 알려진 방법 또는 장래에 개발되는 방법이 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히 스트렙토코커스(Streptococcus)와 같은 특정 세균에서 유전자를 삽입 불활성화시키는 더욱 편리한 방법은 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)에 관하여 모리슨 등 (1984) Infect. Immunol. 62, 5247-5254에 기재된 것과 같은 삽입-중복(insertion-duplication) 돌연변이를 사용하는 것이다. 일반적인 방법은 또한 다른 미생물, 특히 세균에 적용될 수 있다.
곰팡이에 대하여, 삽입 불화성화는 "태그"를, 그리고 바람직하게는 예를 들어 하이그로마이신(hygromycin) B 또는 프레오마이신(phleomycin)에 대한 내성을 지정하는 선별 가능한 표지들을 운반하는 DNA 조각 또는 플라스미드를 사용하는 형질 전환에 의해 만들어진다(스미스 등 (1994) Infect. Immunol. 62, 5247-5254). 제한 효소 매개 삽입(restriction enzyme mediated integration)(REMI; 쉬에스틀 & 페테스(1991); 루 등 (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91, 12649-12653)을 사용하는, 필라멘트 상 곰팡이의 게놈으로의 하이그로마이신 B 내성을 지정하는 DNA 조각의 무작위적, 단일 삽입이 알려져 있다.
곰팡이에 대한 단순한 삽입 돌연변이 기술이 여기에 참조로 채택된 쉬에스틀과 페테스 (1994)에 기재되어 있고 예를 들면 효모에서 Ty 요소와 리보솜(ribosomal) DNA의 사용을 포함한다.
상기한 트랜스포존 또는 다른 DNA 서열의 무작위 삽입은 복수의 독립적으로 돌연변이된 미생물의 분리를 가능케 하는 것으로 상이한 유전자는 각 돌연변이에서 삽입으로 불활성화되고 각 돌연변이는 상이한 표지 서열을 가진다.
그러한 삽입 돌연변이의 라이브러리(library)는 웰(well) 마이크로타이터 접시에 배열되어 각 웰이 상이한 돌연변이 미생물을 가지도록 한다. 각개의 돌연변이 미생물로부터 독특한 표지 서열을 포함하는 DNA(편리하게는 클론으로부터의 총 DNA가 사용된다)는 저장된다. 편리하게는, 이것은 마이크로타이터 접시로부터 미생물 표본을 제거하고, 그것을 핵산 하이브리디제이션 막(nucleic acid hybridisation membrane) 상에 점으로 찍어 주고, 그 미생물을 알칼리에서 분해시키고 그 핵산을 막에 고정시킴으로써 행해진다. 따라서 웰 마이크로타이터 접시 함유물의 복사본이 만들어진다.
웰 마이크로타이터 접시로부터 미생물 풀이 만들어지고 DNA가 추출된다. 이 DNA는 "태그"를 연결하는 공통된 "아암"에 어닐하는 프라이머를 사용하는 PCR을 위한 표적으로서 사용되고 증폭된 DNA는 예를 들어 32P로 표지된다. PCR의 산물은 웰 마이크로타이터 접시의 복사본에 대한 참조 하이브리디제이션 양상(reference hybridisation pattern)을 제공하기 위해 각개의 돌연변이로부터 저장된 DNA를 프로브하는데 사용된다. 이것은 각개의 미생물이 사실상 표지 서열을 가지고 그 표지 서열이 효율적으로 증폭되고 표지될 수 있는가에 대한 검사이다.
트랜스포존 돌연변이 풀은 상기 특정한 환경으로 도입된다. 편리하게는 96-웰 마이크로타이터 접시가 사용되고 상기 풀은 96개 트랜스포존 돌연변이를 가진다. 그러나 상기 풀에 대한 하한(下限)은 2개의 돌연변이이다: 풀 크기에 대한 이론적인 상한(上限)은 없지만 아래에서 논의되는 바와 같이 상한은 그 돌연변이들이 도입되는 환경과 관련하여 결정되어질 것이다.
일단 상기 미생물들이 상기한 특정 환경에 도입되면 그 환경에서 성장 가능한 미생물들이 그 환경에서 성장되도록 한다. 미생물들이 환경에 머무는 시간의 길이는 그 미생물과 그 환경의 성질에 의해 결정된다. 적당한 길이의 시간이 지난 후 상기 미생물들은 환경으로부터 회수되고, DNA는 추출되어 DNA는 "태그"를 연결하는 "아암"에 어닐하는 프라이머를 이용하는 PCR을 위한 주형으로써 사용된다. 그 PCR 산물은 예를 들어 32P로 표지되고(labelled), 웰 마이크로타이터 접시로부터 복제된 각개의 돌연변이로부터 저장된 DNA를 프로브하는데 사용된다. 환경으로부터 회수된 미생물로부터 분리된 DNA로부터 생성된 프로브와 약하게 하이브리다이즈되거나 전혀 하이브리다이즈되지 않는 저장 DNA는 동정된다. 이들 하이브리다이즈되지 않는 DNA들은 그들의 특정 환경에 대한 적응력이 트랜스포존 또는 다른 DNA 서열의 삽입으로 약화된 돌연변이에 해당한다.
특히 바람직한 태양에서는 상기한 "아암"은 "태그"에 비해 표지를 가지지 않거나 극히 적게 가진다. 예를 들어, PCR 프라이머들은 G 성분을 가지지 않거나 하나의 G 성분만을 가지도록 적당히 설계되고, 32P 표지된 핵산은 dCTP이고, 이 경우, 방사성 표지되지 않은 또는 하나의 방사성 표지를 가지는 C 성분이 "아암"에 도입되지만 더 많은 양의 방사성으로 표지된 C 성분들이 "태그"에 도입된다. 만약 "태그"가 "아암" 보다 적어도 10배 이상;바람직하게는 20배 이상, 많은 표지를 가지는 것이 바람직하다. 편리하게는 그 "아암"은 프라이머 설계에서 도입될 수 있는 위치에 대한 적합한 제한 효소를 사용하여 "태그"로부터 제거되어질 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 태양은 미생물이 병원성 미생물이고 그 특정 환경이 동물일 때이다. 이 태양에서는 동물에 도입되는 돌연변이 풀의 크기는 (a) 그 동물에서 생존할 가능성이 있는 각 돌연변이의 수(발병력 유전자가 불활성화되지 않았다고 가정한 상태에서)와 (b) 그 미생물의 총 접종량에 의해 결정된다. (a)에 있는 수가 너무 작으면 잘못된 양성 결과가 나타날 수 있고 (b)에 있는 수가 너무 많으면 그 동물이 충분한 돌연변이가 원하는 방식으로 성장할 기회를 가지기 전에 사망할 수 있다. (a)에 있는 세포의 수는 사용되는 각 미생물에 따라 결정되지만 바람직하게는 50 이상 ,더욱 바람직하게는 100 이상이다.
하나의 동물에 도입될 수 있는 상이한 돌연변이의 수는 바람직하게는 50과 500사이, 편리하게 약 100이다. 비록 접종의 크기는 그 미생물과 그 동물에 따라 이 양의 상하로 변화될 수 있더라도 총 접종량이 106 세포(바람직하게는 105 세포)를 초과하지 않는 것이 바람직하다.
특히 편리한 방법에서는 각 100개의 상이한 돌연변이를 가진 1000개 세포를 가지는 105 접종이 하나의 동물에 대해 사용된다. 이 방법에서는 100개 돌연변이를 스크린하는데 적어도 100개 동물이 필요한 종래 기술의 방법에 비하여 하나의 동물이 100개의 돌연변이를 스크린하는데 사용될 수 있다.
그러나 세 번째는 백업(back-up)으로 유지되면서 적어도 두 개가 조사될 수 있도록(본 방법의 신뢰성을 검사하기 위한 복제본으로써 하나) 동일한 돌연변이 풀로 3마리 동물을 접종하는 것이 편리하다. 그렇더라도 본 방법은 사용되는 동물 수에 있어서 30 배 이상 절약되도록 한다.
돌연변이 풀이 동물에 도입되고 미생물이 회수되는 시간은 사용되는 미생물과 동물에 따라 변화된다. 예를 들어, 그 동물이 흰 쥐이고 그 미생물이 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)일 때 접종과 회수 사이의 시간은 약 3일이다.
본 발명의 한 태양에서는 미생물들은 단계(4)에서 도입된 위치로부터 떨어진 위치에서 단계(5)에서 환경으로부터 회수되어, 조사되는 발병력 유전자는 그 두 위치 사이의 미생물의 확산에 관여한 것들을 포함하도록 한다.
예를 들어, 식물에서 그 미생물은 줄기에 있는 상처 또는 잎의 한 위치에 도입될 수 있고 그 미생물은 발병 상태가 나타난 잎의 또다른 위치로부터 회수된다.
동물의 경우 그 미생물은 경구로, 복강내로, 정맥내로, 또는 비(卑)내로 도입되고 이후에 지라와 같은 내부 기관으로부터 회수된다. 한 경로에 의한 감염의 확립에 필요한 일부 유전자들이 다른 경로에 의할 때에는 필요치 않기 때문에 경구 투여에 의해 동정된 발병력 유전자와 복강내 투여에 의해 동정된 것들을 비교하는 것은 유용하다.
발병력 유전자를 동정하는 데 사용될 수 있는 다른 바람직한 환경은 배양 중인 동물 세포(특히 매크로파아지와 표피 세포)와 배양 중인 식물 세포이다. 배양 중인 세포를 사용하는 것이 그 자체로 유용하더라도 또한 환경으로서 전체 동물이나 식물의 사용을 보충할 수 있다. 그 환경이 동물 신체의 일부인 것 또한 바람직하다. 주어진 숙주-기생체 상호 작용 내에서 다른 기관과 조직들, 그리고 파이어집선(Peyer's patch)과 같은 그들의 일부를 포함하여 많은 다른 환경이 가능하다.
그 환경으로부터 회수되는 개개 미생물들(즉 세포들)의 수는 그 환경으로 도입되는 상이한 돌연변이의 수의 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 10배, 더 바람직하게는 100배이어야 한다. 예를 들어, 미생물이 100개의 상이한 돌연변이로 접종될 때 10,000개의 개개 미생물이 회수되어야 하고 그들의 표지 DNA가 분리되어야 한다.
더욱 바람직한 태양은 (1A) 단계(1)에서 생산된 복수의 돌연변이로부터 영양요구주를 제거하는 단계; 또는
(6A) 단계(6)에서 선별된 돌연변이가 영양요구주인지 여부를 결정하는 단계; 또는 단계 (1A)와 (6A):
를 포함한다.
영양 요구주(야생주나 비영양 요구주에 의해 요구되지 않는 성장 인자를 필요로 하는 돌연변이 미생물)와 미생물이 특정 환경에 적응하도록 하는 유전자가 불활성화된 돌연변이 미생물을 구별하는 것이 바람직하다. 편리하게는, 이것은 단계(1)과 (2) 사이 또는 단계(6) 이후에 행해진다.
바람직하게는 영양 요구주는 발병력 유전자가 동정될 때 제거되지 않는다.
본 발명의 두 번째 측면은 미생물이 특정 환경에 적응하도록 하는 유전자를 동정하는 방법으로서 본 발명의 첫 번째 측면의 방법 다음에 (7) 단계(6)에서 선별된 개개의 돌연변이로부터 삽입 불활성화된 유전자를 분리하는:
부가적인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
독특한 표지를 가지는 유전자를 분리하는 방법은 분자 생물학의 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
더욱 바람직한 태양은 (8) 야생형 미생물로부터 단계(7)에서 분리된 삽입 불활성화된 유전자를 프로브(probe)로 사용하여 상응하는 야생형 유전자를 분리하는:
더욱 부가적인 단계를 포함한다.
유전자를 프로브하는 방법은 분자 생물학의 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명의 실행에 적합한 분자 생물학적 방법은 여기서 참조로 채택한 샘브룩 등 (1989)에 개시되어 있다.
미생물이 동물에 대해 병원성이고 유전자가 발병력 유전자이며 트랜스포존이 그 유전자를 삽입 불활성화시키는데 사용되었을 때 발병력 유전자는 단계(6)에서 선별된 개개 돌연변이로부터 트랜스포존 바깥을 자르는 제한효소로 게놈 DNA를 분해하고, 트랜스포존을 가진 크기별로 분리된 DNA를 플라스미드에 리게이트(ligate)시키고, 플라스미드가 아닌 트랜스포존에 의한 항생제 내성을 기초로 하여 플라스미드 재조합체를 선별하는 것에 의하여 복제되는 것이 편리하다. 트랜스포존에 인접한 미생물 게놈 DNA는 트랜스포존의 말단 부분에 어닐하는 2개의 프라이머, 두 프라이머는 플라스미드의 다중링커(polylinker) 서열에 근접하게 어닐하는, 를 이용하여 서열 분석된다. 만약 그 트랜스포존이 알려진 발병력 유전자를 방해했다면 그 서열들을 결정하기 위한 DNA 테이타베이스 조사를 받을 수있다. 따라서 편리하게는 이 방법에 의해 얻은 서열은 EMBL과 GenBank와 같은 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스에 존재하는 서열들과 비교된다. 최종적으로 만약 방해받은 서열이 새로운 발병력 유전자인 것으로 보이면 그 돌연변이는 새로운 유전적 배경으로 전이되고(예로써 살모넬라의 경우 파아지 P22-매개 형질 도입에 의해) 비발병성(avirulent) 표현형이 치환 현상에 기인하고 2차 돌연변이에 기인한 것이 아니라는 것을 확실케하기 위하여 그 돌연변이종의 LD50이 결정된다.
미생물에 있는 모든 발병력 유전자를 탐지하기 위하여 스크린되는 개개 돌연변이의 수는 미생물의 게놈에 있는 유전자의 수에 의존한다. 예로써, 3000∼5000개의 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 돌연변이가 대다수 발병력 유전자를 탐지하기 위하여 스크린될 필요가 있는 반면 살모넬라보다 더 큰 게놈을 가지는 아스퍼질러스 spp.(Aspergillus spp.)에 대해서는 20,000개의 돌연변이가 스크린된다. 약 4%의 비필수적인 S. 타이피뮤리움(typhimurium) 유전자가 발병을 위하여 필요한 것으로 생각되며(그로이즈만 & 세이어, 1990) 만약 그렇다면 S. 타이피뮤리움(typhimurium) 게놈은 약 150개의 발병력 유전자를 가진다. 그러나 본 발명의 방법은 발병력 유전자를 동정하는 더 신속하고 더 편리하고 더 실용적인 경로를 제공한다. 그러한 미생물은 그들이 특정 환경에서 생존하도록 적응되지 않는 성질을 가지기 때문에 유용하다.
바람직한 태양에서 병원성 미생물은 숙주 개체(환경)에서 생존하도록 적응되지 않고, 동물, 특히 포유류에 병원성인 미생물의 경우, 본 발명의 방법에 의해 얻은 돌연변이는 백신에 사용될 수 있다. 돌연변이가 비발병성이고 따라서 환자에게 투여하기에 적합하지만, 항원성을 가지고 보호적인 면역 반응을 유발할 것으로 기대된다.
더욱 바람직한 태양에서 본 발명의 방법에 의해 얻은 숙주 개체에서 생존하도록 적응되지 않은 병원성 미생물은 바람직하게는 적합한 DNA 서열의 도입에 의해 다른 병원체로부터의 항원의 항원결정기(epitope)를 발현하도록 변형된다. 이 변형된 미생물은 다른 병원체에 대한 백신으로써 작용한다.
본 발명의 네 번째 측면은 본 발명의 두 번째 측면의 방법을 사용하여 동정된 유전자에 돌연변이를 포함하는 미생물을 제공한다.
따라서 비록 본 발명의 세 번째 측면의 미생물이 유용할지라도 만약 돌연변이가 동정된 유전자에 특이적으로 도입되면 바람직하다. 바람직한 태양에서 특히 미생물이 백신으로 사용될 때 유전자 내 돌연변이는 실질적으로 회복 불가능한 결실 또는 프레임이동(frameshift) 돌연변이 또는 기타 돌연변이이다. 그러한 유전자-특이성 돌연변이는 자치적 복제단위(autonomous replicon)(플라스미드나 바이러스 게놈)상에 돌연변이 유전자의 사본을 도입하는 것과 같은 표준적 과정을 이용하고 미생물의 게놈에 있는 유전자의 사본으로 돌연변이를 도입하는 유사적 재조합(homologous recombination)에 의존하여 만들어질 수 있다.
본 발명의 다섯 번째와 여섯 번째 측면은 백신으로 사용되기에 적합한 미생물과 적합한 미생물과 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 백신을 제공한다.
상기한 적합한 미생물은 위에서 언급한 비발병성 돌연변이이다.
환자의 활성 면역(active immunisation)이 바람직하다. 이 접근법에서는 하나 이상의 돌연변이 미생물이 적합한 매질(adjuvant)과 담체를 가지는 면역학적 조제로 준비되고 환자에게 알려진 방법으로 투여된다. 적합한 매질은 Freund의 완전 또는 불완전 매질 , 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), EP 109,942, EP 180,564와 EP 231,039의 "Iscoms", 수산화 알루미늄, 사포닌(saponin), DEAE-텍스트란(dextran), 중성 기름(마이글리올(miglyol)과 같은), 식물성 기름(낙화생유(arachis oil)와 같은), 리포좀(liposomes), 플루로닉 폴리올(Pluronic polyol) 또는 리비(Ribi) 매질 시스템(예로써 GB-A-2 189,141)을 포함한다. "Pluronic"은 등록 상표이다. 면역될 환자는 발병성 미생물에 의해 야기되는 질병으로부터 보호되는 것이 요구되는 환자이다.
상기한 본 발명의 비발병 미생물은 또는 그 조제는 경구와 비경구(피하 또는 근육내) 주사를 포함하는 모든 일반적인 방법에 의해 투여될 수 있다. 그 치료는 1회의 처방 또는 일정 기간에 걸친 복수의 처방으로 구성될 수 있다.
본 발명의 비발병 미생물이 단독으로 투여될 수 있지만 하나 이상의 수용 가능한 담체와 함께 약학적 조제로 존재하는 것이 바람직하다. 그 담체(들)는 본 발명의 비발병 미생물과 양립할 수 있고 그의 수혜자에게 치명적이지 않아야 한다는 의미에서 "수용 가능"하여야 한다. 전형적으로 담체들은 살균되고 발열 물질이 없는 물 또는 식염수가 될 것이다.
본 발명의 백신은 그것의 미생물 성분에 따라 인체 의약과 수의학용 의약 분야에서 유용하다.
미생물에 의해 야기되는 질병들은 가축들과 같은 많은 동물에서 알려져 있다. 본 발명의 백신은 적당한 비발병 미생물, 특히 비발병 세균을 가질 때 사람 뿐만 아니라 예를 들어 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이와 닭, 칠면조, 거위, 오리 등과 같은 가금류에서도 유용하다.
본 발명의 일곱 번째와 여덟 번째 측면은 본 발명의 두 번째 측면의 방법에 의해 얻어진 유전자와 그에 의해 지정된 폴리펩티드(polypeptide)를 제공한다.
우리는 "유전자"에 폴리펩티드를 지정하는 유전자 뿐 아니라 전사, 번역, 일부 미생물에서는 RNA의 스프라이싱(splicing)을 조절하는 DNA의 부분과 같은 DNA의 조절 부위를 포함한다. 따라서 상기 유전자는 프로모터(promoters), 전사 터미네이터(terminators), 리보솜-결합 서열(ribosome binding sequences)과 일부 개체에서는 인트론(introns)과 스프라이스(splice) 인지 위치를 포함한다.
전형적으로, 단계 7에서 얻어진 불할성화된 유전자의 서열 정보는 밝혀진다. 편리하게는 트랜스포존 말단에 근접한 서열들은 시퀀싱 프라이머(sequencing primer)의 하이브리디제이션 위치(hybridisation site)로써 사용된다. 밝혀진 서열 또는 불활성화된 유전자 자체에 인접한 DNA 제한 조각은 야생형 개체로부터 상응하는 야생형 유전자를 분리하고 동정하는 하이브리디제이션 프로브를 만드는데 사용된다.
하이브리디제이션 프로빙이 유사한 것이 아닌 상기한 유전자가 얻어지는 것을 확실하게 하는 엄격한(stringent) 조건 하에서 행해지는 것이 바람직하다. "엄격한"이란 그 유전자가 막상에 고정화되고 그 프로브(이 경우 >200 누클레오티드 길이)가 용액 내에 있고 그 고정화된 유전자/하이브리다이즈된 프로브가 65℃에서 10분 동안 0.1×SSC에서 세척된다. SSC는 0.15M NaCl/0.015M Na 구연산(citrate)이다.
살모넬라 발병력 유전자를 클로닝하기 위한 바람직한 프로브 서열은 도 5와 6에 나타나 있고 실시예 2에 기술되어 있다.
더욱 바람직하게는 그 유전자들은, 또는 적어도 그 일부가 도 11과 12에 나타낸 서열 내에 포함된 것들이며 본 발명의 두 번째 측면의 방법에 의해 동정된 것들이다. 도 11과 12에 나타낸 서열들은 발병력 유전자 크러스터 2(virulence genes cluster 2)(VGC2)라고 명명되는 살모넬라 타이피뮤리움으로부터의 유전자 크러스터의 일부이다. 트랜스포존 삽입의 위치는 서열 내에 지적되어 있고 그 트랜스포존 삽입은 그 개체의 발병력 결정기를 불화성화시킨다. 아래에서 더 논의되는 바와 같이, 그리고 특히 실시예 4에서, 본 발명의 두 번째 측면의 방법은 살모넬라 타이피뮤리움에 있는 발병력 유전자를 동정하는데 사용되고, 많은 핵산 삽입들(그리고 따라서 동정된 유전자들)이 게놈의 비교적 작은 부분에 크러스터되어 있다. 이 부분, VGC2는 아래에 기재되는 바와 같이 본 발명의 일부를 이루는 다른 발병력 유전자를 가진다.
본 발명의 방법에 의해 분리된 유전자는 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 따라서 그 유전자(DNA)는 여기에 포함된 가르침의 관점에서 적합하게 수정되는 알려진 기술들에 따라, 본 발명의 폴리펩티드의 발현과 생산을 위해 적합한 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용되는 발현 벡터를 제작하는데 사용될 수 있다. 그러한 기술들은 US 특허 Nos, 루터 등에게 1984년 4월 3일 등록된 4,440,859, 바이즈만 등에게 1985년 7월 23일 등록된 4,530,901, 크롤에게 1986년 4월 15일 등록된 4,582,800, 마크 등에게 1987년 6월 30일 등록된 4,677,063, 괴델 등에게 1987년 7월 7일 등록된 4,678,751, 이타쿠라 등에게 1987년 11월 3일 등록된 4,704,362, 무라이에게 1987년 12월 1일 등록된 4,710,463, 툴레,쥬니어 등에게 1988년 7월 12일 등록된 4,757,006, 괴델 등에게 1988년 8월 23일 등록된 4,766,075와 스타커에게 1989년 3월 7일에 등록된 4,810,648에 개시된 것들을 포함하며, 모두 여기에 참조로 채택되어 있다.
본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 지정하는 DNA는 적합한 숙주 내로의 도입을 위한 광범위하게 다양한 다른 DNA 서열들에 연결될 수 있다. 동료 DNA는 숙주의 성질, DNA가 숙주 내로 도입되는 방법, 염색체 외 유지 또는 삽입을 원하느냐에 의존한다.
일반적으로, DNA는 플라스미드와 같은 발현 벡터로 적당한 방향과 발현을 위한 올바른 리딩 프레임(reading frame)으로 삽입된다. 만약 필요하다면 DNA는 비록 그러한 제어들이 발현 벡터에서 일반적으로 사용 가능하다 하더라도 원하는 숙주에 의해 인지되는 적합한 전사와 번역을 조절하는 제어 누클레오티드에 연결될 수 있다. 그 벡터는 그때 표준적 기술들을 통하여 숙주로 삽입된다. 일반적으로 모든 숙주가 벡터에 의해 형질 전환되지는 않는다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포들을 선별하는 것이 필요하다. 한가지 선별 기술은 항생제 내성과 같은 형질 전환된 세포에서 선별 가능한 특성을 지정하는 DNA 서열을 모든 필요한 조절 요소들과 함께 발현 벡터로 도입하는 것을 포함한다. 또 다른 방법으로는 그러한 선별 가능한 특성을 위한 유전자가 또 다른 벡터 상에 있을 수 있고 원하는 숙주 세포를 동시-형질전환(co-transform)하는데 사용된다.
본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질 전환된 숙주 세포들은 폴리펩티드 발현을 허용하는데 여기에 개시된 가르침의 관점에서 본 기술 분야에서 숙련된 사람들에게 알려진 충분한 시간과 적당한 조건에서 배양된 후 회수된다.
많은 발현 시스템들이 세균(예로 E.콜라이(coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모들(예로 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)), 필라멘트상 곰팡이(예로 아스퍼질러스(Aspergillus), 식물 세포, 동물 세포와 곤충 세포를 포함하여 알려져 있다.
벡터들은 벡터가 다른 비진핵 세포 유형에서의 발현을 위해 사용되더라도 원핵 세포에서의 증식을 위한 ColE1과 같은 원핵 복제 단위(replicon)를 포함한다. 상기 벡터들은 또한 그 유전자들이 그로써 형질 전환된 E. 콜라이와 같은 세균 숙주 세포에서 발현될 수 있게 유도할 수 있는 원핵 프로모터와 같은 적합한 프로모터를 포함한다.
프로모터는 RNA 중합 효소의 결합이 일어나게 하여 전사가 일어나도록 하는 DNA 서열에 의해 형성되는 발현 조절 요소이다. 예가 되는 세균 숙주들과 양립 가능한 프로모터 서열들은 본 발명의 DNA 조각의 삽입을 위한 편리한 제한 위치를 가지는 플라스미드 벡터에 전형적으로 제공되어진다.
전형적인 원핵 벡터 플라스미드들은 pUC18, pUC19, pBR322와 바이오래드(Biorad)실험실(리치몬드,CA, USA)로부터 입수 가능한 pBR329와 파마시아(Pharmacia), 피스카타웨이(Piscataway), NJ, USA로부터 입수 가능한 pTrc99A와 pKK223-3이다.
전형적인 포유 세포 벡터 플라스미드는 파마시아, 피스카타웨이, NJ, USA로부터 입수 가능한 pSVL이다. 이 벡터는 클론된 유전자들의 발현, COS-1 세포들과 같은 T-항원 생산 세포에서 발현되는 가장 높은 수준의 발현을 유도하는 SV40 후기 프로모터를 사용한다.
유용한 효모 플라스미드 벡터들은 pRS403-406과 pRS413-416이고 일반적으로 스트라타진 클로닝 시스템(Stratagene Cloning Systems), La Jolla, CA92037, USA으로부터 입수 가능하다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405와 pRS406은 효모 삽입 플라스미드(YIps)이고 효모 선별 표지 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3을 도입한다. 플라스미드 pRS4130416은 효모 중심절(centromere) 플라스미드(YCps)이다.
다양한 방법들이 상보적인 점착성(cohesive) 말단을 통해 DNA를 벡터에 연결시기 위해 개발되어 왔다. 예를 들면, 상보적 호모폴리머(homopolymer) 구역이 벡터 DNA에 삽입되기 위하여 DNA 조각에 첨가될 수 있다. 상기한 벡터와 DNA 조각은 상보적인 호모폴리머 꼬리간의 수소 결합에 의해 결합되어 재조합 DNA분자들을 형성한다. 하나 이상의 제한 위치를 가지는 합성 링커(linker)는 DNA 조각을 벡터에 연결시키는 또 다른 방법을 제공한다. 이미 기슬한 바와 같은 엔도누클레아제(endonuclease) 제한 분해에 의해 발생된 DNA 조각은 그들의 3'-5'-엑소누클레아제(exonuclease) 활성으로 돌출된 3'-단일 가닥 말단을 제거하고 그들의 중합 활성으로 움푹 들어간 3'-말단을 채우는 효소인 박테리오파아지(bacteriophage) T4 DNA 중합 효소 또는 E.콜라이 DNA 중합 효소Ⅰ으로 처리된다.
이들 활성의 결합은 뭉툭한 말단을 가지는(blunt-ended) DNA 조각들을 생성한다. 상기한 뭉툭한 말단을 가지는 조각들은 박테리오파아지 T4 DNA 리가아제(ligase)와 같은 뭉툭한 말단을 가지는 DNA 분자의 리게이션(ligation)을 촉매할 수 있는 효소의 존재 하에 과량의 링커 분자와 함께 배양된다. 따라서 그 반응의 산물은 그들 말단에 다중 링커 서열(polymeric linker sequences)을 가지는 DNA 조각들이 된다. 이들 DNA 조각들은 적당한 제한 효소로 절단되고 상기한 DNA 조각들과 양립할 수 있는 말단을 생산하는 효소로 절단된 발현 벡터에 리게이션된다.
다양한 제한 엔도누클레아제 위치를 가지는 합성 링커는 국제 바이오테크놀로지 Inc(International Biotechnologies Inc), 뉴해븐, CN, USA를 포함한 다양한 출처로부터 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명의 폴리펩티드를 지정하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 사이키등(1988) 사이언스 239, 487-491에 의해 개시된 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)을 이용하는 것이다.
이 방법에서 효소적으로 증폭된 DNA는 그들 자신이 증폭된 DNA로 도입되는 두 개의 특정 올리고누클레오티드 프라이머들에 의해 연결된다. 상기한 특정 프라이머들은 이 기술 분야에서 알려진 방법들을 사용하여 발현 벡터로 클로닝되는데 사용될 수 있는 제한 엔도누클레아제 인지 위치를 포함할 수 있다.
상기 유전자들의 변형체 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 그 변형체가 본 발명의 방법에 의해 분리된 유전자들과 바람직하게는 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 85%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 가진다. 물론 교체, 결실, 삽입들은 견뎌질 수도 있다. 하나의 핵산 서열과 또 다른 것간의 유사성의 정도는 위스콘신 대학 컴퓨터 그룹의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
유사하게 그 유전자들에 의해 지정된 단백질 변형체는 포함된다.
"변형체"에 우리는 그러한 변화들이 실질적으로 단백질의 정상적 기능을 변화시키지 않는 보존적 또는 비보존적인 삽입, 결실, 치환 등을 포함한다.
"보존적 치환"은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser,Thr; Lys, Arg;과 Phe, Tyr과 같은 조합을 의미한다.
그러한 변형체는 단백질 공학과 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)의 잘 알려진 방법을 사용하여 만들어질 수 있다.
본 발명의 아홉번째 측면은 특정한 환경에 적응하는 미생물의 능력을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법으로서, (1) 본 발명의 두 번째 측면의 방법에 의해 얻은 유전자 또는 (2) 그러한 유전자에 의해 지정된 폴리펩티드의 기능을 방해하는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 분리된 유전자를 과잉 생산하는 세포에는 영향을 미치치 않으면서 야생형에 영향을 미치는 화합물에 대한 한벌의 스크린은 본 발명의 이 측면의 일부를 형성한다.
예를 들어 한 태양에서 한 세포는 야생형 세포이고 두 번째 세포는 본 발명의 방법에 의해 분리된 유전자를 과잉 생산하도록 만들어진 살모넬라이다. 상기한 유전자를 과잉 생산하는 세포가 아닌 야생형의 생존성 또는 성장성을 감소시키는 화합물을 동정하기 위해 특정 환경에서 각 세포의 생존성 그리고/또는 성장성이 시험되는 화합물의 존재 하에 결정된다.
그 유전자가 발병력 유전자인 것이 바람직하다.
예를 들어, 한 태양에서 그 미생물이 본 발명의 첫번 째 측면의 방법에 의해 동정된 발병력 유전자를 과잉 발현하도록 만들어진다. (a) 그 "과잉 발현" 미생물과 (b) 동등한 미생물(그 발병력 유전자를 과잉 발현하지 않는)의 각각은 배양 중인 세포를 감염시키는데 사용된다. 특정 시험이 발병력 유전자의 기능을 선별적으로 저해하는지 여부는 (a) 그 과잉 발현 미생물과 (b) 동등한 미생물(적어도 일부 발병력 유전자 산물에 대해 시험 화합물이 그들을 불활성화시키고 그 자신이 발병력 유전자 산물에 결합함으로써 불활성화되는 것이 보이는)이 그 숙주 세포들의 감염을 방해하는 데 요구하는 시험 화합물의 양을 측정함으로써 결정된다. 만약 (b) 보다 (a)가 감염을 방해하는데 더 많은 화합물을 요구한다면 이것은 그 화합물이 선별적이라는 것을 암시한다. 상기 미생물들이(살모넬라와 같은) 젠타마이신(gentamycin)(숙주 세포를 통과하지 않는)과 같은 약한 항생제에 의해 세포 외에서 파괴되고 미생물에 의한 세포의 감염을 방해하는 그 시험 화합물의 효과가 상기한 세포를 라이시스(lysis)하여 얼마나 많은 미생물이 존재하는지 결정함(예를 들어 아가(agar)상에 플레이팅(plating)함에 의해)에 의한다면 바람직하다.
화합물에 대한 한벌의 스크린과 다른 스크린들이 커쉬와 디 도메니코 (1993), "치료적 가능성을 가진 천연 산물의 발견"(Ed V.P. Gallo), 6장, 페이지 177-221, 버터워스, V.K.(여기에 참조로 채택된)에 일반적으로 개시되어 있다.
한벌 스크린은 화합물에 대해 상대적인 민감성이 두 유전학적으로 관련된 종을 이용하여 비교되는 많은 관련된 형식으로 설계될 수 있다. 만약 그 종들이 한 위치에서만 다르다면 그 표적에 특이한 화합물은 그 저해제에 대한 각 종의 민감성을 비교함으로써 동정될 수 있다. 예를 들어, 표적에 특이한 저해제는 그렇지 않으면 동인자형 자매 균주(isogenic sister strain)와 비교하였을 때 과잉 민감성 시험 균주에 대해 더 활성적일 것이다. 아가 확산 형식에서 이것은 화합물을 가지는 디스크 또는 웰 주위의 저해 구역의 크기를 측정함으로써 결정된다. 확산 때문에 화합물의 연속적인 농도 구배가 이루어지고 균주의 저해제에 대한 민감성은 디스크 또는 웰로부터 구역의 가장자리까지의 거리에 비례한다. 일반적인 항생제, 또는 원하는 것 이외의 작용 양식을 가지는 항생제는 일반적으로 두 균주에 대해 유사한 활성을 가지는 것으로 관찰된다.
분자 유전적 스크린의 또다른 유형은 클론된 유전자 산물이 표준 균주와 비교될 때 한 균주에서 과잉 발현되는 한쌍의 균주를 포함한다. 이 유형의 에세이 이면의 논리는 증가된 양의 표적 단백질을 가지는 균주가 정상량의 표적 단백질을 가지는 동인자형 균주보다 저해제에 대해 더욱 큰 내성을 가진다는 것이다. 아가 확산 에세이에서 특이 화합물을 둘러싼 구역 크기는 그렇지 않으면 동인자형인 균주와 비교하여 표적 당백질을 과잉 발현하는 균주에서 더 작을 것으로 예상된다.
부가적으로 또는 대안으로 화합물의 선별은 하기하는 단계들로 성취된다.
1. 본 발명의 첫 번째 측면의 방법을 사용하여 얻어진 돌연변이 미생물이 표준으로 사용된다(그것은 주어진 표현형, 예를 들면, 비발병성을 가진다.).
2. 시험되는 화합물이 야생형 미생물과 혼합된다.
3. 상기한 야생형 미생물은 그 환경으로 도입된다(시험 화합물과 함께 또는 없이)
4. 만약 야생형 미생물이 그 환경에 적응할 수 없다면 (그 화합물에 의한 뒤이은 처리 또는 그 화합물의 존재 하에), 그 화합물은 그 특정 환경에서 적응하거나 생존하는 능력을 감소시키는 것이다.
그 환경이 동물체이고 그 미생물이 병원성 미생물인 경우 이 방법에 의해 동정된 화합물은 그 미생물로 인한 감염을 방지하거나 완화시키는 약제에 사용될 수 있다.
본 발명의 열번째 측면은 따라서 아홉번째 측면의 방법에 의해 동정 가능한 화합물을 제공한다.
열번째 측면의 화합물의 용도는 그것을 동정할 수 있는 방법과, 특히 병원성 미생물의 숙주와 관련하여, 관련된 것이 기대된다. 예로써 만약 그 화합물이 포유동물을 감염하는 세균으로부터의 발병력 유전자 또는 그에 의해 지정되는 폴리펩티드를 사용하는 방법에 의해 동정 가능하다면 그 화합물은 그 세균에 의한 포유동물의 감염을 치료하는데 유용할 수 있다.
유사하게, 만약 그 화합물이 식물을 감염하는 곰팡이로부터의 발병력 유전자, 또는 그에 의해 지정되는 폴리펩티드를 사용하는 방법에 의해 동정 가능하다면 그 화합물은 그 곰팡이에 의한 식물의 감염을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 열한번째 측면은 본 발명의 일곱 번 째 측면의 유전자 또는 그의 핵산 산물과 선별적으로 상호 작용하고 실질적으로 그의 기능을 저해하는 분자를 제공한다.
"그의 핵산 산물"이란 모든 RNA, 특히 유전자로부터 전사된 mRNA를 포함한다.
바람직하게는 상기한 유전자 또는 상기한 핵산 산물과 선별적으로 상호 작용하고 실질적으로 그의 기능을 저해하는 분자는 안티센스(antisense) 핵산 또는 핵산 유도체이다.
더욱 바람직하게는 상기한 분자는 안티센스 올리고누클레오티드이다.
안티센스 올리고누클레오티드는 단일 가닥 핵산으로써, 상보적인 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합한 표적 서열에 결합함으로써 RNA-RNA, DNA-RNA, 또는 RNA-DNA 이중체가 형성된다. 이들 핵산은 그들이 유전자의 센스 또는 코딩(coding) 가닥에 상보적이기 때문에 자주 "안티센스"라고 명명된다. 최근, 삼중 나선의 형성이 올리고누클레오티드가 DNA 이중체에 결합할 때 가능한 것이 증명되었다. 올리고누클레오티드는 DNA 이중 나선의 주 그루브(major groove)에 있는 서열들을 인지할 수 있음이 밝혀졌다. 삼중 나선이 그에 의해 형성되었다. 이것은 주 그루브 수소 결합 위치의 인지를 통해 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 서열-특이적 분자들을 합성하는 것이 가능하다는 것을 암시한다.
명백하게, 안티센스 핵산 또는 올리고누클레오티드의 서열은 의문이 가는 유전자의 누클레오티드 서열에 대한 참조로 손쉽게 결정되어질 수 있다. 예를 들면, 안티센스 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드는 도 11 또는 12에 나타낸 서열의 일부, 특히 발병력 유전자의 일부를 형성하는 서열들에 상보적인 것으로 설계될 수 있다.
올리고누클레오티드는 세포 내생 누클레아제(nuclease)에 의해 분해되거나 불활성화되기 쉽다. 이 문제점에 대응하기 위하여, 즉 변화된 누클레오티드간 결합을 가지는, 자연적으로 발생하는 포스포디에스테르 결합(phosphodiester linkage)이 다른 결합으로 교체된, 변형된 올리고누클레오티드를 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 아그라왈 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083은 올리고누클레오티드 포스포르아미데이트(phosphoramidates)와 포스포로티오에이트(phosphorothioates)를 이용하여 HIV-1의 조직 배양에서 증가된 저해를 나타내었다. 사린 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451은 올리고누클레오티드 메틸포스포네이트(methylphosphonates)를 이용하여 HIV-1의 증가된 저해를 입증하였다. 아그라왈 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 7790-7794은 누클레오티드 서열-특이적 올리고누클레오티드 포스포로티오네이트를 사용하여 초기 감염된 그리고 만성적으로 감염된 세포 배양물에서 HIV-1의 증가된 저해를 입증하였다. 레이더 등 (1990) Proc Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434는 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트에 의한 인플루엔자 바이러스의 조직 배양에서의 저해를 보고하였다. 인위적인 결합을 가지는 올리고누클레오티드는 생체 내에서 분해에 내성을 가지는 것으로 나타났다. 예를 들면, Nucleic Acids Res. 19, 747-750에 샤우 등 (1991)은 달리 변형되지 않은 올리고누클레오티드가 특정 캡핑(capping) 구조에 의해 3' 말단이 차단될 때 생체 내에서 누클레아제에 대해 더 내성을 가지고 캡핑되지 않은 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트는 생체내에서 분해되지 않는다는 것을 보고하였다.
올리고누클레오티드 포스포로티오에이트를 합성하는 H-포스포네이트 접근법의 상세한 기술은 아그라왈과 탕 (1990) 테트라헤드론 레터즈 31, 7541-7544에 제공되어 있다. 올리고누클레오시드 메틸포스포네이트(oligonucleoside methylphosphonates), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioates), 포스포르아미데이트(phosphoramidates), 포스페이트 에스테르(phosphate ester), 브릿지된 포스포르아미데이트(bridged phosphoramidates) 그리고 브릿지 포스포로티오에이트(bridged phosphorothioates)의 합성은 본 기술에서 알려져 있다. 예를 들면, 아그라왈과 굳차일드 (1987) 테트라헤드론 레터즈 28, 3539; 닐슨 등 (1988) 테트라헤드론 레터즈 29, 2911; 예거 등 1988) 바이오케미스트리 27, 7237; 우즈난스키 등 (1987) 테트라헤드론 레터즈 28, 3401; 반와스 (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517; 크로스틱과 바일 (1989) 테트라헤드론 레터즈 30, 4693; 아그라왈 등(1990) Proc Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405를 참조하고, 그 가르침들은 여기서 참조로 채택되어 있다. 합성 또는 생산의 다른 방법 또한 가능하다. 바람직한 태양에서는 비록 리보누크레익 에시드(RNA) 서열들 또한 합성되고 적용될 수 있지만 올리고누클레오티드는 데옥시리보누클레익 에시드(DNA)이다.
본 발명에서 유용한 올리고누클레오티드들은 바람직하게는 내생 누클레오리틱 효소에 의한 분해를 견디도록 설계된다. 올리고누클레오티드들의 생체 내 분해는 감소된 길이의 올리고누클레오티드 파괴 산물들을 생상한다. 그러한 파괴 산물은 비특이적 하이브리디제이션에 관여하기 더 쉽고 전체-길이의 상대에 비해 덜 효과적이기 쉽다. 따라서, 체내에서 분해에 내성을 가지고 표적 세포에 도달할 수 있는 올리고누클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다. 본 올리고누클레오티드는 원래의 포스포디에스테르 결합 대신에 하나 이상의 인위적인 누클레오티드 간 결합으로 치환함에 의해, 예를 들면, 결합에서 인을 황으로 치환함에 의하여, 생체 내에서 분해에 더욱 내성을 가지도록 할 수 있다. 사용될 수 있는 결합의 예는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 술폰(sulphone), 설페이트(sulfate), 케틸(ketyl), 포스포로디티오에이트, 다양한 포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르, 브릿지드 포스포로디티오에이트, 그리고 브릿지드 포스포르아미데이트를 포함한다. 그러한 예들은 다른 누클레오티드간 결합이 본 기술에서 알려져 있기 때문에 한정적이라기 보다는 기술적이다. 예를 들어, 코헨 (1990). 트렌드즈 인 바이오테크놀로지를 참조하라. 포스포디에스테르 결합 대신에 하나 이상의 이러한 결합으로 치환된 올리고누클레오티드의 합성은 혼합된 누클레오티드간 결합을 가지는 올리고누클레오티드를 생산하는 합성 경로를 포함하여, 본 기술에서 잘 알려져 있다.
올리고누클레오티드는 "캡핑"에 의하거나 5' 또는 3' 말단 누클레오티드에 유사한 그룹을 도입함으로써 내성 효소들에 대해 매우 큰 내성을 가지도록 할 수 있다. 캡핑을 위한 시약은 어플라이드 바이오시스템즈 Inc, 포스터 시, CA로부터의 Amino-link ⅡTM와 같이 상업적으로 입수 가능하다. 캡핑 방법은 예를 들면, 샤우 등 (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750과 아그라왈 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(17), 7595-7599에 기재되어 있고 그 가르침은 여기에 참조로 채택되어 있다.
누클레아제 공격에 내성을 가지는 올리고누클레오티드를 만드는 더 나아간 방법은 여기에 참조로 채택된 탕 등 (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735에 기재된 바와 같이 "자가-안정화(self-stabilized)"되는 것이다. 자가-안정화된 올리고누클레오티드는 그들의 3' 말단에 머리핀 루프 구조를 가지며 뱀 독 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase), DNA 중합 효소Ⅰ과 태아 소 혈청에 의한 분해에 대해 증가된 내성을 보인다. 올리고누클레오티드의 자가-안정화된 부분은 상보적인 핵산과의 하이브리디제이션을 방해하지 않으며 흰쥐에서의 약물 역학적 그리고 안정성 연구는 그들의 선형 상대와 비교하여 자가-안정화된 올리고누크렐오티드의 생채 내 내성의 증가를 나타냈다.
본 발명에 따라, 염기 결합의 특징이 있는 안티센스 올리고누클레오티드의 고유한 결합 특이성은 안티센스 화합물의 이용 가능성을 생체 내에서 그들의 의도하는 위치로 제한함에 의해 증가되며, 이는 더욱 낮은 용량이 사용되는 것을 허용하고 체계의 영향을 최소화하게 된다. 따라서 올리고누클레오티드는 원하는 효과를 얻기 위하여 국소적으로 적용된다. 원하는 위치에서의 올리고누클레오티드의 농도는 올리고누클레오티드가 전신으로 투여된 경우 보다 훨씬 높고 그 치료 효과는 훨씬 낮은 총 용량으로도 성취될 수 있다. 국부적인 높은 농도의 올리고누클레오티드는 표적 세포의 투과를 촉진하고 효과적으로 표적 핵산 서열의 번역을 차단한다.
상기 올리고누클레오티드들은 약물의 국소 투여에 적합한 모든 수단들에 의해 위치로 전달될 수 있다. 예를 들면, 올리고누클레오티드 용액이 직접 그 위치로 주사되거나 융합 펌프(fusion pump)를 사용하는 융합에 위해 전달될 수 있다. 올리고누클레오티드 역시 원하는 위치에 위치되었을 때 올리고누클레오티드가 주위 위치로 방출되도록 하는 이식 가능한 도구로 도입될 수 있다.
상기한 올리고누클레오티드들은 가장 바람직하게는 하이드로젤(hydrogel) 물질을 통하여 투여된다. 상기한 하이드로젤은 염증을 유발치 않고 생분해 가능하다. 천연 또는 합성 고분자로부터 제조된 것들을 포함하여, 많은 그러한 물질들이 현재 알려져 있다 바람직한 태양에서는 체온 미만에서는 액체이지만 체온이나 그 근처 온도에서는 형태를 가지는 반고체 하이드로젤을 형성하는 젤을 밝히고 있다. 바람직한 하이드로젤은 에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드(ethylene oxide - propylene oxide) 반복 단위의 폴리머이다. 상기 폴리머의 성질은 폴리머의 분자량과 폴리머 내 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리프로필렌 옥사이드의 상대적 비율에 의존한다. 바람직한 하이드로겔은 약 10 내지 80 중량%의 에틸렌옥사이드와 약 20 내지 90중량%의 프로필렌 옥사이드를 가진다 특히 바람직한 하이드로젤은 약 70% 폴리에틸렌 옥사이드와 30% 폴리프로필렌 옥사이드를 가진다. 사용 가능한 하이드로젤은 예를 들면 PluronicR이라는 상표로 BASF Corp., Parsippany, NJ로부터 사용 가능하다.
이 태양에서 하이드로젤은 액체 상태로 냉각되고 올리고누클레오티드는 하이드로젤 그램 당 1 mg 올리고누클레오티드 농도까지 액체에 혼합된다. 얻어진 혼합물은 예를 들면 외과 수술 중 스프레이(spraying) 또는 페인팅(painting)에 의해 또는 카테테르(catheter) 또는 직달경(endoscopy) 과정을 이용하여 치료될 표면 위에 적용된다. 폴리머가 따듯해지기 때문에 그것은 고형화하여 젤을 형성하고 올리고누클레오티드는 젤로부터 정확한 조성의 젤에 의해 한정된 시간에 걸쳐 젤로부터 주변 세포들로 확산된다.
올리고누클레오티드는 리포좀(liposomes), 마이크로캡슐(microcapsules), 이식 가능한 도구를 포함하여 상업적으로 이용 가능하거나 과학 문헌에 기재되어 있는 다른 이식체를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리락틱 에시드(polylactic acid)와 폴리글리콜릭 에시드(polyglycolic acid)와 그들의 공중합체와 같은 생분해성 물질들로 만들어진 이식체, 또는 에틸렌비닐 아세테이트(ethylenevinyl acetate)(EVAc), 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate), 에틸렌비닐 알콜(ethylenevinyl alcohol)과 그들의 유도체와 같은 비생분해성 물질들이 올리고누클레오티드를 국소적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 올리고누틀레오티드는 용융 또는 용매 증발 기술을 이용하여 중합 또는 고체화되거나 그 물질과 기계적으로 혼합될 때 그 물질 내로 도입될 수 있다. 한 태양에서는 올리고누클레오티드는 덱스트란 코팅된 실리카 비드(dextran coated silica beads), 스탠트(stents), 또는 카테테르와 같은 이식 가능 도구들의 코팅 상에 혼합되거나 적용된다.
올리고누클레오티드의 용량은 올리고누클레오티드의 크기와 투여되는 목적에 의존한다. 일반적으로, 그 범위는 치료되는 조직의 표면적에 기초하여 계산된다. 올리고누클레오티드의 유효 용량은 올리고누클레오티드의 길이와 화학적 성분에 어느 정도 의존하지만 조직 표면적 cm2 당 약 30 내지 3000μg 범위에 있다.
올리고누클레오티드는 치료와 예방 목적으로 전신으로 환자에게 투여될 수 있다. 올리고누클레오티드는 모든 효과적인 방법, 예를 들면, 비경구적으로(즉 정맥내로, 피하로, 근육내로) 또는 경구, 비내 또는 올리고누클레오티드가 환자의 혈류내에 접근하고 순환할 수 있는 다른 수단에 의해 투여될 수있다. 전신으로 투여된 올리고누클레오티드는 바람직하게는 국소적으로 투여된 올리고누클레오티드에 부가하여 주어지지만 또한 국소 투여가 없더라도 유용성을 가진다. 성인에 대한 투여 당 약 0.1 내지 약 10그램 범위의 용량이 이 목적을 위하여 효과적이다.
본 발명의 이 측면의 분자들은 상기한 유전자가 분리된 미생물 또는 상기한 미생물의 근친종에 의해 야기되는 모든 감염을 치료하거나 예방하는데 유용할 것으로 기대된다. 따라서, 상기한 분자는 항생제이다.
따라서, 본 발명의 열두번째 측면은 본 발명의 열한번째 측면의 분자의 의약 용도를 제공한다.
본 발명의 열세번째 측면은 미생물로 감염되거나 감염되기 쉬운 숙주를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 열한번째 측면에 따른 분자의 유효 용량을 투여하는 것으로 상기한 유전자는 상기한 미생물, 또는 상기한 미생물의 근친종에 존재하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
"유효 용량"이란 감염을 실질적으로 예방 또는 완화하는 양을 의미한다. "숙주"란 미생물에 의해 감염될 수 있는 모든 동물 또는 식물을 포함한다.
본 발명의 열한번째 측면의 분자의 약학적 조제는 본 발명의 일부를 형성할 것으로 기대된다. 그러한 약학적 조제는 하나 이상의 수용 가능한 담체와 함께 상기한 분자를 포함한다. 담체(들)은 본 발명의 상기한 분자와 양립 가능하고 그들의 수혜자에게 치명적이지 않다는 의미이다. 전형적으로, 담체는 멸균되고 발열물질이 없는 물 또는 식염수이다.
상기한 바와 같이, 또 아래 실시예 4에서 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 살모넬라 타이피뮤리움에서 특정 발병력 유전자들이 VGC2라고 명명한 염색체의 일부분에 크러스터되어 있는 것을 발견하였다. DNA-DNA 하이브리디제이션 실험은 VGC2의 적어도 일부에 동질적인 서열이 살모넬라의 많은 종과 균주에서 발견되지만 시험된 E.콜라이와 시겔라에는 존재하지 않는다(실시예4 참조). 이러한 서열들은 적어도 살모넬라에서는 거의 확실히 보존된 유전자에 해당하며, 적어도 일부는 발병력 유전자이다. 다른 살모넬라 종에 있는 동등한 유전자들과, 존재한다면, 다른 장내 세균 또는 다른 세균에 있는 동등한 유전자 또한 발병력 유전자이다.
VGC2 부분 내의 유전자가 발병력 유전자인지 여부는 쉽게 결정된다. 예를 들면, 본 발명의 두 번째 측면의 방법(살모넬라 타이피뮤리움에 적용되고 그 환경이 흰쥐와 같은 동물인 경우)에 의해 동정된 VGC2 내의 그 유전자들은 발병력 유전자이다. 발병력 유전자들은 또한 유전자 내에 돌연변이를 만들고(바람직하게는 비극성(non-polar) 돌연변이, 그 돌연변이 균주가 비발병성인지를 결정함으로써 동정된다. 선별된 유전자에 돌연변이를 만드는 방법들은 잘 알려져 있고 아래에 기재되어 있다.
본 발명의 열네번째 측면은 살모넬라 타이피뮤리움의 VGC2 DNA 또는 그 일부, 또는 상기한 DNA의 변형체 또는 그 일부의 변형체를 제공한다.
살모넬라 타이피뮤리움의 VGC2 DNA는 도 8에 도식적으로 표현되어 있고 살모넬라 타이피뮤리움 ATCC 14028(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 12301 파크론 드라이브, 록빌, 마릴랜드 20582, USA로부터 이용 가능한; 또한 가입 번호 NCTC 12021로 NTCC, 퍼블릭 헬스 래보러토리 서비스, 콜린데일, UK에 기탁된)으로부터 실시예 4에서 제공되는 정보를 이용하여 손쉽게 얻을 수 있다. 예를 들면, 도 11과 12에 나타낸 서열로부터 유래된 프로브들은 살모넬라 타이피뮤리움 게놈 라이브러리(genome library)로부터 λ클론을 동정하는데 사용될 수 있다. 표준적인 게놈 워킹(walking) 방법들은 모든 VGC2 DNA를 얻는데 사용될 수 있다. 도 8에 나타낸 제한 지도는 VGC2로부터 DNA조각을 동정하고 위치를 결정하는데 사용될 수 있다.
"살모넬라 타이피뮤리움의 VGC2 DNA의 일부"란 VGC2의 적어도 10 누클레오티드, 바람직하게는 적어도 20 누클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 50 누클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100 누클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 500 누클레오티드를 포함하는 모든 DNA 서열을 의미한다. VGC2 DNA의 특히 바람직한 부분은 도 11에 나타낸 서열, 또는 그 일부이다. 또 다른 특히 바람직한 VGC2 DNA의 부분은 도 12에 나타낸 서열, 또는 그 일부이다.
유리하게는, VGC2 DNA의 일부는 유전자, 또는 그 일부이다.
VGC2 부분의 유전자들은 본 기술에서 알려진 컴퓨터 프로그램을 이용하여 오픈 리딩 프레임의 통계적 분석에 의해 동정될 수 있다. 만약 오픈 리딩 프레임이 약 100 코돈(codon) 보다 크면 유전자이기 쉽다(비록 이보다 작은 유전자들도 알려져 있지만). 오픈 리딩 프레임이 유전자의 폴리펩티드 코딩 부위에 해당하는지 여부는 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 오픈 리딩 프레임에 해당하는 DNA의 일부는 상기한 DNA와 하이브리다이즈하는 mRNA가 발현되는지 여부를 결정하기 의하여 노던(RNA) 블랏(nothern blot)에서 프로브로써 사용될 수 있다.; 대신으로 또는 부가적으로 돌연변이가 오픈 리딩 프레임으로 도입될 수 있으며 돌연변이의 미생물 표현형에 대한 영향이 결정될 수 있다. 만약 표현형이 변화하면 그 오픈 리딩 프레임은 유전자에 해당한다. DNA 서열 내에서 유전자를 동정하는 방법들은 본 기술에서 알려져 있다.
"상기한 DNA의 변형체 또는 그 일부의 변형체"란 본 발명의 일곱 번째 측면에서의 "변형체"라는 용어에 의해 정의된 모든 변형체를 포함한다.
따라서, 살모넬라 타이피뮤리움의 VGC2 DNA의 변형체는 다른 장내 세균과 같은 다른 세균으로부터 뿐만 아니라, 살모넬라 타이피와 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)와 같은 다른 살모넬라 종으로부터의 동등한 유전자, 또는 그의 일부를 포함한다.
"동등한 유전자"란 기능적으로 동등하고 돌연변이가 유사한 표현형(비발병성과 같은)을 일으키는 유전자를 포함한다. 본 발명 전에는 VGC2 또는 그에 포함된 유전자들이 동정되지 않았고 발병력 결정에 관여하는 것이 명확하지는 않았던 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명의 더 나아간 측면들은 돌연변이 세균으로서, 만약 세균이 VGC2에 있는 유전자와 동일하거나 동등한 유전자를 정상적으로 가진다면, 상기한 유전자가 상기한 돌연변이 세균 내에서 돌연변이되거나 부재하는 세균; 돌연변이 세균을 만드는 방법으로서, 만약 세균이 VGC2에 있는 유전자와 동일하거나 동등한 유전자를 정상적으로 가진다면, 상기한 유전자가 상기한 돌연변이 세균 내에서 돌연변이되거나 부재하는 방법; 을 제공한다.
하기한 것은 VGC2 유전자를 불활성화시키는 바람직한 방법이다. 먼저 유전자를 하이브리디제이션 실험에 프로브로서의 VGC2 조각을 사용하여 살모넬라 λDNA 라이브러리 또는 다른 라이브러리로부터의 DNA 조각 상에 서브클론(subclone)하고, 그 유전자를 제한효소 위치에 관하여 맵(map)하고 에스쉐리치아 콜라이에서 DNA 서열 분석에 의해 유전자의 특성을 밝힌다. 제한 효소를 사용하여, 가능하다면 제한효소에 의해 클론된 유전자의 코딩 부위를 결실시킨 후 항생제에 대한 내성(예를 들면 카나마이신)을 지정하는 DNA 조각을 유전자의 코딩 부위로 도입한다. 항생제 내성 표지를 가지는 방법과 DNA가 흥미 있는 유전자의 불화성화가 바람직하게는 비극성(non-polar), 즉, 흥미 있는 유전자 아래 부분(downstream)의 유전자들의 발현에 영향을 미치지 않는, 이라는 것을 확실히 하는 데 사용된다. 유전자의 돌연변이는 E.콜라이로부터 살모넬라 타이피뮤리움으로 파아지 P22 형질 도입을 이용하여 전이되고, 돌연변이 유전자의 염색체로의 유사적(homologous) 재조합에 대해 서던 하이브리디제이션(Southern hybridization)에 의하여 검사된다.
이 접근법은 살모넬라에서 일반적으로 사용되고(S.타이피에서 사용될 수 있고) 더욱 상세한 것은 갈란 등 (1992) 174, 4338-4349를 포함한 많은 논문에서 발견될 수 있다.
더 나아간 측면들은 상기한 돌연변이 세균의 백신에서의 용도; 상기한 세균과 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물; 살모넬라 타이피뮤리움의 VGC2에 의해 지정된 폴리펩티드 또는 그 일부, 또는 그 일부의 변형체; 숙주에서 감염 또는 질병을 유발하는 능력을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법; VGC2에 있는 유전자와 선택적으로 상호 작용하고 실질적으로 그 기능을 저해하는 분자, 또는 그들의 핵산 산물; 그들의 의약적 용도와 약학적 조성물들을 제공한다.
VGC2 DNA는 그들의 위치에 의해 동정된 유전자(비록 본 발명의 첫 번째와 두 번째 측면의 방법에 의해 동정 가능할지라도)들 뿐만 아니라 본 발명의 첫 번째와 두 번째 측면의 방법에 동정된 유전자들을 가진다. 본 발명의 이들 더 나아간 측면들은 본 발명의 네번째, 다섯번째, 여섯번째, 일곱번째, 여덟번째, 아홉번째, 열번째, 열한번번째, 열두번번째, 열세번째 측면들과 밀접하게 관련되며, 따라서 그들 측면과 관련되어 주어진 정보와 그들 측면들과 관련하여 표현된 바람직한 것들은 이들 더 나아간 측면에도 적용된다.
유전자가 VGC2로부터 오거나 S.타이피와 같은 다른 살모넬라 종으로부터의 동등한 유전자라면 바람직하다. 돌연변이 세균이 S. 타이피뮤리움 돌연변이 또는 S. 타이피와 같은 다른 살모넬라 종의 돌연변이라면 바람직하다. VGC2에 있는 유전자의 적어도 일부가 S.타이피뮤리움과 같은 세균이 세포 내로 들어가는 능력을 부여하는 것으로 믿어진다.
본 발명은 지금부터 하기한 실시예들과 도면들을 참조로 하여 기술될 것이다.
실시예 1: 살모넬라 타이피뮤리움에서의 발병력 유전자의 동정재료와 방법
세균 균주와 플라스미드들
살모넬라 타이피뮤리움 균주 12023(어메리칸 타입 컬쳐 컬콜렉션(ATCC) 균주 14028과 동등한)를 내셔널 콜렉션 오브 타입 컬쳐즈(National Collection of Type Cultures)(NCTC), 퍼블릭 헬스 래보러토리 서비스, 콜린데일, 런던, UK로부터 얻었다. 이 균주의 자발적인 날리디식 에시드(nalidixic acid) 내성 돌연변이(12023 Nalr)가 우리 실험실에서 선별되었다. 균주 12023의 또다른 유도체, CL1509(aro::Tn10)은 프레드 헤프론으로부터의 선물이었다. 에스쉐리치아 콜라이 균주 CC118λpir (Δ[ara-leu], araD, ΔlacX74, galE, galK, phoA20, thi-1, rpsE, rpoB, argE(Am), recA1, λpir 파아지 라이소젠(lysogen))과 S17-1 λpir(Tpr,Smr, recA, thi, pro, hsdR-M+, RP4:2-Tc:Mu:KmTn7, λpir)은 케네스 티미스의 선물이었다. E.콜라이 DH5α가 S. 타이피뮤리움 DNA를 가지는 pUC18(Gibco-BRL)과 Bluescript(Stratagene) 플라스미드를 증식시키기 위하여 사용되었다. 플라스미드 pUT 미니-Tn5Km2(드 로렌조 등, 1990)은 케네스 티미스의 선물이었다.
반-무작위 서열 태그들의 제조와 리게이션
올리고누클레오티드 풀 RT1 (5'-CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT-[NK]20-AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG-3')(SEQ ID No 1) 과 프라이머들 P2(5'-TACCTACAACCTCAAGCT-3')(SEQ ID No 2), P3(5'-CATGGTACCCATTCTAAC-3')(SEQ ID No 3), P4(5'-TACCCATTCTAACCAAGC-3')(SEQ IN No 4)와 P5(5'-CTAGGTACCTACAACCTC-3')(SEQ ID NO 5)가 올리고누클레오티드 합성기(어플라이드 바이오시스템즈., 모델 380B)에서 합성되었다.
이중 가닥 DNA 태그들은 표적으로써 200pg RT1과 함께 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM Tris-Cl(pH 8.0)을 가지는 100μl 부피 PCR에서 RT1으로부터 준비되었다: 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 250μg; 프라이머 P3과 P5 100pM; Amplitaq(Perkin-Elmer Cetus) 2.5U. 열 순환 조건들은 30초 동안 95℃, 45초 동안 50℃, 10초 동안 72℃의 30 사이클이다. PCR 산물은 젤 정제되고(샘브룩 등, 1989), elutipD 컬럼을 통과하고 pUC18 또는 pUT미니-Tn5Km2에 리게이션되기 전에 KpnⅠ으로 분해하였다. 리게이션을 위하여 플라스드들은 KpnⅠ으로 분해되고 송아지 내장 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)(Gibco-BRL)로 디포스포릴레이트(dephosphorylate)되었다. 선형화된 플라스미드 분자들은 분해로부터 모든 잔여 비절단 플라스미드 DNA를 제거하기 위하여 리게이션 전에 젤-정제되었다(샘브록 등, 1989). 리게이션 반응은 약 50ng의 각 플라스미드와 효소를 제공하는 버퍼(buffer)에 1 유닛(unit) T4 DNA 리가아제(Gibco-BRL)와 함께 25μl 부피 이중 가닥 태그 DNA를 포함한다. 리게이션은 24℃ 2시간 동안 행해졌다. 플라스미드 DNA의 자가 리게이션(self-ligation) 또는 비절단 플라스미드 DNA로부터 발생하는 세균 콜로니의 부분을 결정하기 위하여 표준 반응이 이중 가닥 태그 DNA가 리게이션 반응으로부터 제거된 상태로 행해졌다. 이중 가닥 태그 DNA를 가지는 리게이션 반응으로부터 생기는 185 콜로니와 비교할 때, 이것은 E. 콜라이 CC118(샘브룩 등, 1989)의 형질 전환을 뒤따르게 하는 어떤 앰피실린(ampicillin) 내성 세균 콜로니도 생산치 않았다.
세균 형질 전환과 메이팅(matings)
pUT 미니-Tn5Km2와 이중 가닥 태그 DNA 간의 여러 리게이션의 산물은 E.콜라이 CC 118을 형질 전환하는데 사용되었다(샘브룩 등, 1989). 총 약 10,300개 형질전환체가 풀되었고 그 풀로부터 추출된 플라스미드 DNA가 E.콜라이 S-17 λpir을 형질 전환하는데 사용되었다(드 로렌조 & 티미스, 1994). 메이팅 실험을 위하여, 약 40,000개 앰피실린 내성 E.콜라이 S-17λpir 형질 전환체 풀과 S. 타이피뮤리움 12023 Nalr이 흡광도 (OD)580 1.0까지 분리하여 배양하였다. 각 배양물의 부분 표본(0.4ml)이 5ml 10mM MgSO4와 혼합되었고 밀리포어(milipore) 막을 통해 여과되었다(0.45μm 직경). 그 필터들은 M9 염을 가지는 아가의 표면 상에 위치되었고(드 로렌조 & 티미스, 1994) 37℃ 16시간 동안 배양되었다. 세균은 그 필터들을 액체 LB배지에서 37℃ 40분 동안 흔들어 주어 회수되었고 경접합개체는 현탁액(suspension)을 100μgml-1 날리디식 에시드(공여체 균주에 대해 선별하기 위하여)와 50μgml-1 카나마이신(수용체 균주를 선별하기 위하여)을 가지는 LB 배지상에 플레이팅함으로써 선별되었다. 각 경접합개체는 날리디식 에시드 내성(nalr), 카나마이신 내성(kanr) 콜로니들을 맥콘키 락토오스 지시(MacConkey Lactose indicator) 배지로, 그리고 앰피실린을 가지는 LB 배지로 전이함으로써 조사되었다(E.콜라이와 S. 타이피뮤리움을 구별하기 위하여). nalr, kanr 콜로니들의 약 90%가 앰피실린에 민감하였고, 이들이 확실한 트랜스포지션(transposition) 현상으로부터 기인함을 지적한다(드 로렌조 & 티미스, 1994). 개개의 앰피실린 민감성 경접합개체는 LB 배지를 가지는 96 웰 마이크로타이터 접시에 저장되었다. 80℃에서 오랜 기간 저장을 위하여 7% DMSO 또는 15% 글리세롤(glycerol)이 배지 내에 포함되었다.
돌연변이의 표현형 특성 파악
돌연변이들은 영양 요구주를 확인하기 위하여 마이크로타이터 접시로부터 M9 염과 0.4% 글루코스를 가지는(샘브룩 등, 1989) 고체 배지상으로 플레이트된 복제본이었다. 거친(rough) 콜로니 형태를 가지는 돌연변이들은 아가 접시 상의 콜로니들의 저배율 현미경으로 탐지되었다.
콜로니 블랏, DNA 추출, PCRs, DNA 라벨링과 하이브리디제이션
콜로니 블랏 하이브리디제이션을 위하여 48-웰 금속 복제기(Sigma)가 50μg ml-1 카나마이신을 가지는 LB 아가의 표면 위에 위치시켰던 경접합개체를 마이크로타이터 접시로부터 하이본드(Hybond) N 나일론 필터(아머샴, UK)로 전이하는데 사용되었다. 37℃ 밤샘 배양 후 세균 콜로니들을 지지하는 필터들은 제거되고 상온에서 10분간 건조되었다. 그 세균들은 0.4N NaOH로 라이시스되었고 그 필터는 필터 제조자의 지시에 따라 0.5N Tris-Cl pH 7.0으로 세척되었다. 세균 DNA는 Stratalinker(Stratagene)로부터 UV 빛에 대한 노출에 의해 필터에 고정되었다. 32P-표지된 프로브들에 대한 하이브리디제이션은 앞서 기재한 바와 같이 엄격한 조건에서 수행되었다(홀덴 등, 1989). DNA 추출을 위하여 S. 타이피뮤리움 트랜스포존 돌연변이 균주들은 마이크로타이터 접시에서 액체 LB 배지에서 성장되었고 고체 배지에서 성장 한 후 LB 배지에서 재현탁되었다. 총 DNA는 아우수벨 등 (1987)에 따라, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide) (CTAB) 방법에 의해 준비되었다. 간략하게, 150에서 1000μl 부피 세포가 원심분리에 의해 침전되었고 576μl TE에 재현탁되었다. 이것에 15μl의 20% SDS와 3μl의 20mgml-1 프로티나제(proteinase) K를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 166μl의 3M NaCl을 첨가하여 완전히 혼합한 후 80μl의 10%(w/v) CTAB와 0.7M NaCl를 첨가하였다. 완전히 혼합한 후 용액은 65℃에서 10분간 배양되었다. 페놀과 페놀-클로로포름으로 추출한 다음 DNA는 이소프로판올을 첨가하여 침전시켰고 70% 에탄올로 세척하여 약 1μgμl-1 농도로 TE에 재현탁되었다.
DNA 표본은 표지된 프로브를 생산하기 위하여 2회의 PCR을 받게 한다. 첫 번째 PCR은 20mM Tris-Cl pH 8.3; 50mM KCl; 2mM MgCl2; 0.01% Tween 80; 각각 200μM의 dATP,dCTP, dGTP, dTTP; 2.5 유닛 Amplitaq 중합 효소(Perkin-Elmer Cetus); 각각 770ng의 프라이머 P2와 P4; 5μg 표적 DNA를 가지는 100μl 반응에서 수행되었다. 95℃에서 4분의 최초 변성 후, 열 사이클링은 50℃에서 45 초, 72℃에서 10초, 95℃에서 30초의 20 사이클로 구성되었다. PCR 산물들은 클로로포름/이소아밀 알콜(chloroform/isoamyl alcohol)(24/1)로 추출되었고 에탄올로 침전되었다. DNA는 10μl TE에 재현탁되었고 PCR산물은 TAE 버퍼에서 1.6% Seaplaque(FMC Bioproducts) 젤을 통한 전기영동에 의해 정제되었다. 약 80bp의 조각들을 가지는 젤 슬라이스들을 잘라내어 두 번째 PCR 을 위해 사용하였다. 이 반응은 20μl 총 부피에서 행해졌고, 20mM Tris-Cl pH8.3; 50mM KCl; 2 mM MgCl2; 0.01% Tween 80; 각 50μM의 dATP, dTTP, dGTP; 10μl 32P-dCTP(3000Ci/mmol, Amersham); 각 150ng의 프라이머 P2와 P4; 약 10 ng 표적DNA(첫회의 PCR산물을 가지는 1-2μl의 1.6% Seaplaque 아가로스); 0.5유닛의 Amplitaq 중합 효소를 포함하였다. 그 반응은 20μl 미네랄 오일로 덮어 주고 열 사이클링은 상기한 바와 같이 행해졌다. 방사성 표지의 도입은 와트만 DE81지에 대한 흡광도에 의해 정량되었다(샘브룩 등, 1989).
감염 연구
태그된 트랜스포존을 가지는 개개의 살모넬라 경접합개체는 37℃에서 밤새 마이크로타이터 접시에서 2% 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.92% v/v 글리세롤, 0.5% Na2PO4, 1% KNO3(TYGPN 배지)(아우수벨 등, 1987)에서 성장되었다. 금속 복제기는 작은 부피의 밤샘 배양물을 신선한 마이크로타이터 접시들로 옮기는데 사용되었고 배양물은 OD580(타이터텍 멀티스캔 마이크로타이터 플레이트 리더(Titertek Multiscan microtitre plate reader)를 이용하여 측정되는)이 각 웰에서 약 0.2가 될 때까지 37℃에서 배양되었다. 각 웰로부터의 배양액은 풀되어 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 OD550이 결정되었다. 배양물은 멸균된 식염수에서 약 5×105 cfu ml-1까지 희석되었다. 더 맣은 희석들이 접종액에 있는 cfu를 확인하기 위하여 날리디식 에시드(100mgml-1)와 카나마이신(50mgml-1)을 가지는 TYGPN상에 플레이트되었다.
3마리의 BALB/c 암컷 흰쥐 그룹들이 약 1×105 cfuml-1을 가지는 0.2ml 세균 현탁액으로 복강 내에 주사되었다. 쥐들은 접종 3일 후 희생되었고 그들의 지라가 세균을 회수하기 위하여 제거되었다. 각 지라의 반이 마이크로퓨즈(microfuse) 튜브에서 1ml 멸균 식염수에서 균등 분쇄(homogenized)되었다. 세포 찌꺼기가 가라앉도록 하고 현탁액에 아직 세포들을 가진 1ml의 식염수가 신선한 튜브로 제거되었고 마이크로퓨즈에서 2분간 원심분리되었다. 상층액은 빨아내고 침전물은 1ml의 멸균 증류수에 재현탁되었다. 희석 시리즈가 멸균 증류수에서 만들어졌고 각 희석의 100ml이 날리디식 에시드(100μml-1)와 카나마이신(50μml-1)을 가지는 TYGPN 아가 상에 플레이트되었다. 세균은 1000에서 4000 콜로니를 가지는 접시로부터 회수되었고 총 10,000 콜로니 이상이 각 지라로부터 풀되었고 콜로니 블랏을 스크린하기 위한 프로브의 PCR 생성을 위한 DNA를 준비하는데 사용되었다.
발병력 유전자 클로닝과 DNA 시퀀싱
총 DNA는 S. 타이피뮤리움 경접합개체로부터 분리되었고 각각 SstⅠ, SalⅠ, PstⅠ, SphⅠ으로 분리하여 분해되었다. 분해물은 아가로스 젤을 통하여 분류되었고 하이본드(Hybond) N+ 막(Amersham)으로 옮겨 pUT 미니-Tn5Km2의 카나마이신 내성 유전자를 프로브로 사용하여 서던 하이브리디제이션 분석을 받았다. 그 프로브는 디그옥시제닌(digoxygenin)(베링거-만하임)으로 표지되었고 화학적 발광 탐지가 제조자의 지시에 따라 행해졌다. 하이브리디제이션과 세척 조건은 상기한 바와 같았다. 3-5kb 범위의 하이브리다이징 조각을 만들어 내는 제한 효소들은 예비의 아가로스 젤을 위해 DNA를 분해하는데 사용되었고, 하이브리디제이션 신호의 크기에 해당하는 DNA 조각들은 이로부터 잘라내져 정제되고 pUC18에 리게이디트되었다. 리게이션 반응은 E.콜라이 DH5a를 카나마이신 내성으로 형질 전환하는데 사용되었다. 카나마이신 내성 형질 전환체로부터의 플라스미드는 elutipD 컬럼을 통한 통과에 의해 정제되었고 제한 효소 분해에 의해 조사되었다. 플라스미드 삽입은 -40 프라이머와 역 서열분석(reverse sequencing) 프라이머(유나이티드 스테이츠 바이오케미컬 코포레이션)와 각각 TN5의 I와 O말단에 어닐하는 프라이머 P6(5'-CCTAGGCGGCCAGATCTGAT-3')(SEQ ID No 6)과 P7(5'-GCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3')(SEQ ID No 7)을 이용하여 디-데옥시(di-deoxy) 방법(생어 등, 1977)에 의해 부분적으로 시퀀싱되었다. 누클레오티드 서열들과 추론된 아미노산 서열들은 매킨토시 SE/30 컴퓨터에서 맥벡터 3.5 소프트웨어 팩키지 런을 이용하여 조합되었다. 서열들은 휴먼 게놈 맵핑 프로젝트 리소스 센터, 해로우, UK에서 UNIX/SUN 컴퓨터 시스템을 이용하여 EMBL과 Genbank DNA 데이타베이스와 비교되었다.
결과
태그 디자인
DNA 태그들의 구조는 도 1a에 나타나 있다. 각 태그는 불변 서열의 "아암"에 의해 연결된 가변 중앙 부분으로 구성된다. 중앙 부분 서열([NK]20)은 보통 사용되는 6bp-인지 제한 효소 위치가 발생하지 않도록 설계되었지만, 통계적으로 동일한 서열이 2×1011 분자들에 한 번씩만 일어나는 것을 확실히 하기 위하여 충분히 가변적이다(12개의 무작위 선별된 태그들은 아무것도 가변 부분에 50% 이상의 동일성을 공유하지 않았다). (N은 모든 염기(A, G, C 또는 T)를 의미하고 K는 G 또는 T를 의미한다.) 아암들은 초기 클로닝 단계를 용이하게 하기 위하여 말단에 가까운 KpnⅠ위치를 가지고, 가변 부분의 경계에 위치한 HindⅢ 위치들은 하이브리디제이션 분석 전에 아암으로부터 방사성 표지된 가변 부분들을 방출하는데 사용되었다. 아암들은 또한 프라이머 P2와 P4 각각 하나의 구아닌 성분만을 가지도록 설계되었다. 따라서 이들 프라이머를 이용하는 PCR 중 독특한 서열에 평균 10개와 비교하여 단지 하나의 시토신이 각각 새로 합성된 아암에 도입될 것이다. 방사성 표지된 dCTP가 PCR에서 포함될 때 각 아암과 비교하여 평균 10 배 이상의 많은 표지가 독특한 서열에 존재하게 될 것이다. 이것은 그들이 HindⅢ로 분해되어 독특한 서열로부터 방출된 후, 아암으로부터의 배경 하이브리디제이션 신호를 최소화하기위한 의도이다. 이중 가닥 태그들은 플라스미드 pUT 상에 운반되는 미니-Tn5 트랜스포존 Km2의 KpnⅠ 위치에 리게이트되었다(드 로렌조 & 티미스, 1994). 이 플라스미드의 복제는 pir유전자의 R6K-특정된 π산물에 의존한다. 그것은 다양한 세균 종으로의 전이를 허용하는 RP4 플라스미드의 oriT 서열을 가지고(밀러 & 메카라노스, 1988), 미니-Tn5 요소의 이동에 필요한 tnp 유전자를 가진다. 태그된 미니-Tn5 트랜스포존은 접합에 의하여 S. 타이피뮤리움으로 전이되었고 이동 현상으로부터 나온 288개의 경접합개체들은 마이크로타이터 접시의 웰에 저장되었다. 이들의 12개로부터 분리된 총 DNA는 EcoRⅤ로 분해되었고, 미니-Tn5 트랜스포존의 카나마이신 내성 유전자를 프로브로 사용하는 서던 하이브리디제이션 분석을 받았다. 각 경우에, 경접합개체는 세균 게놈의 다른 위치로의 트랜스포존의 단일 삽입의 결과로 발생하였다(도 2).
특이성과 민감성 연구
우리는 다음으로 반응에 대한 표적으로써 경접합체 DNA 풀을 포함하는 PCR에서 DNA 태그들의 증폭의 효율성과 균일성을 결정하였다. PCR에서 태그의 불균일한 증폭을 최소화하기 위하여 우리는 아가로스 젤의 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색에 의해 가시화될 수 있는 산물을 만들게 되는 100μl 반응에 사용될 수 있는 DNA 표적의 최대량과 PCR 사이클의 최소 회수를 결정하였다(각각, 5μG DNA와 20 사이클).
마이크로타이터 접시에서 정체 성장기에 도달한 S. 타이피뮤리움 경접합개체는 합쳐져서 DNA를 추출하는데 사용되었다. 이것은 프라이머 P2와 P4를 사용한 PCR을 받았다. 80bp의 PCR 산물은 젤 정제되었고 32P-표지된 CTP이외에는 동일한 프라이머들을 이용하는,두 번째 PCR을 위한 표적으로 사용되었다. 방사성 표지된 산물은 HindⅢ로 분해되었고 그들의 상응하는 마이크로타이터 접시들로부터 콜로니 블랏된 DNA를 프로브하는데 사용되었다. 이 방법으로 시험된 1510 돌연변이 중 358개가 콜로니 블랏의 밤샘 노출이 따르는 오토다이어그램(autodiagram)상에 명확한 신호를 나타내지 못하였다. 이것을 설명하기 위한 세가지 가능성이 있다. 첫째, 트랜스포존의 일부가 태그를 운반하지 못한 가능성이 있다. 그러나, 태그의 존재 또는 부재하에 트랜스포존에 관여하는 리게이션 반응으로부터 결과하는 형질 전환 빈도와 비교함으로써 태그되지 않은 트랜스포존은 전체중 약 0.5% 이상으로 계산될 수 있을 것 같지 않다(재료와 방법 참조). 더 그럴듯한 이유는 가변 서열이 일부 태그에서 절단되었고, 그리고/또는 그 서열들의 일부가 2차 구조를 형성하여, 양자 모두 증폭을 방해하였다는 것이다. 명확한 신호를 나타내지 못한 돌연변이들은 앞으로의 연구에 포함되지 않았다. 효율적으로 증폭 가능한 태그들의 특이성은 마이크로타이터 접시의 24 콜로니들로부터 프로브를 생성하고, 그것을 프로브를 생산하는데 사용된 24개를 포함한 48개 콜로니들의 콜로니 블랏을 프로브하는데 사용함으로써 증명되었다. 프로브를 생산하는데 사용되지 않은 24개 콜로니들로부터의 어떤 하이브리디제이션 신호의 결핍은 사용된 하이브리디제이션 조건이 표지된 태그간에 크로스-하이브리디제이션을 방지하기에 충분하게 엄격하였다는 것을 나타내고, 각 경접합개체는 마이크로타이터 접시 내에서 중복되지 않는다는 것을 암시한다.
동물 실험에서 접종액으로써 사용될 수 있는 최대 풀 크기를 결정하는데 더깊은 고려가 있다. 각 트랜스포존을 위한 표지된 태그의 양은 태그 풀의 복잡성에 반비례하므로, 하이브리디제이션 신호가 너무 약하여 오토다이어그램의 밤샘 노출 후에 탐지될 수 없는 이상의 풀 크기에 대한 제한이 있다. 더욱 중요하게는 풀의 복잡성이 증가할수록 감염된 동물의 지라에서 풀의 발병성 표본이 충분한 표지된 프로브를 생산하는데 충분한 수로 존재하는 것이 실패할 가능성이 있음에 틀림 없다. 우리는 우리가 사용한 살모넬라증의 쥐 모델에서 풀 크기의 상한을 결정하지 않았지만 그것은 96을 초과하는 것임에는 틀림 없다.
트랜스포존 돌연변이의 발병력 시험
총 1152개 독특하게 태그된 삽입 돌연변이들(두 마이크로타이터 접시로부터)이 각각 96-웰 마이크로타이터 접시를 대표하는 12 풀에서 BALB/c 흰쥐에 대해 시험되었다. 동물들은 마이크로타이터 접시의 96개 트랜스포존 돌연변이들 각각의 약 103 세포의 복강내 주사를 받았다(총 105 개체). 주사 3일 후 흰쥐는 희생되어 세균이 지라 균등 분쇄물을 실험실 배지상에 플레이트함으로써 회수되었다. 각 쥐로부터 회수된 약 10,000 콜로니들이 풀되었고 DNA가 추출되었다. 이 DNA 표본에 있는 태그들은 PCR에 의해 증폭되고 표지되었고, 콜로니 블랏이 프로브되어 접종액으로부터 증폭된 태그를 이용하여 얻은 하이브리디제이션 양상과 비교되였다(도 3). 표준으로써 S. 타이피뮤리움의 aroA 돌연변이가 태그되었고 접종액에 96개 돌연변이 중 하나로 사용되었다. 이 균주는 그 발병력이 심각하게 약화되기 때문에 지라에서 회수되지 않을 것으로 예상된다(Buchmeier et al, 1993). 41ro 돌연변이가 그 DNA가 접종액으로부터의 표지된 태그에 하이브리다이즈하지만 지라로부터 회수된 세균으로부터의 표지된 태그에는 하이브리다이즈되지 않음이 확인되었다. 실험은 반복되어 동일한 41개 돌연변이가 다시 확인되었다. 이들 중 2개는 예상대로 aroA 돌연변이(풀 당 하나)였다. 또다른 것은 영양요구 돌연변이였다(그것은 최소 배지에서 성장하지 못한다). 모든 돌연변이들은 정상적인 콜로니 형태를 가졌다.
실시예 2: 트랜스포존을 연결하는 서열들의 클로닝과 부분적 특성 파악
DNA는 실시예 1에 기술된 돌연변이 중 하나로부터 추출되었고(풀 1, F10), SstⅠ으로 분해되고, 카나마이신 내성을 기초로 하여 서브클론되었다. 트랜스포존 말단을 연결하는 450bp 서열은 프라이머 P7을 이용하여 결정되었다. 이 서열은 열-조절 프로테아제를 지정하는 E.콜라이 clp(lon) 유전자와 80% 동일성을 나타낸다(도 5). 우리가 아는 바로는 이 유전자는 이전에는 발병력 결정기로 의미되지 않았다. 열세번째의 다른 살모넬라 타이피뮤리움 발병력 유전자의 일부 서열이 도 6에 나타나 있다(서열 A2 에서 A9 또 B1 에서 B5). P2D6, S4C3, P3F4, P7G2와 P9B7의 추론된 아미노산 서열은 살모넬라에서 inv 훼밀리로 알려진, 동물과 식물의 세균성 병원체를 걸쳐 보존된 분비-관련 단백질 훼밀리와 유사성을 가진다. S.타이피뮤리움에서 inv 유전자들은 장 조직으로의 세균의 침투에 필요하다. inv 돌연변이의 발병력이 구강 경로에 의해 접종될 때 약화되지만, 복강내로 투여될 때에는 그렇지 않다. 복강 내 접종이 따르는 발병력에 요구되는 inv-관련 유전자의 발견은 지라와 다른 기관의 비-파고사이틱(non-phargocytic) 세포들의 침투에 요구되는 새로운 분비 기구를 암시한다. 이들 새로운 유전자의 산물은 확립된 감연을 치료하는데 inv 단백질 보다 더 좋은 약물 표적을 나타낼 것이다.
이 예에서 확인된 더 나아간 특성 파악은 실시예 4에 기재될 것이다.
실시예 3: LD 50 결정과 흰쥐 백신 접종 연구
본 발명의 방법에 의해 동정된 돌연변이들은 발병력을 약화시킨다.
이전에는 발병력에 관련하는 것이 아니었던 유전자들에 돌연변이 5개가 P22-매개 형질 도입에 의해 S. 타이피뮤리움 12028의 날리디식 에시드-민감성 모균주에 전이되었다. 형질 도입체는 제한 맵핑에 의해 조사되었고 그들의 50% 치사 용량(LD50)을 결정하기 위하여 BALB/c 흰쥐로 복강 내 경로로 주사되었다. 돌연변이 S4C3, P7G2, P3F4와 P9B7에 대한 LD50 값은 야생 균주 보다 모두 수 등급의 크기였다. 돌연변이 P1F10에 대해서는 LD50에 차이가 없었다: 그러나, 이 균주와 야생 균주을 동일한 비율로 이루어진 접종물로 주사된 흰 쥐의 지라로부터 회수된 P1F10세포들의 비율에는 통계적으로 심각한 감소가 있었다. 이것은 이 돌연변이가 LD50에 의해 탐지될 정도는 아니지만 발병력을 약화시킨다는 것을 의미한다.
돌연변이 P3F4와 P9B7은 또한 107 세포/흰쥐의 접종 수준으로 구강 경로로 투여되었다. 어떤 쥐도 아프지 않았고 이들 돌연변이의 구강 LD50 수준이 적어도 야생형 균주보다 수 배 크기로 높다는 것을 가리킨다.
흰 쥐 백신 접종 연구에서 20-25g의 5마리 암컷 BALB/c 흰쥐 그룹이 살모넬라 타이피뮤리움 돌연변이 균주 P3F4와 P9B7의 연속 10배 희석으로 경구(p.o.) 또는 복강내로(i.p.) 최초 접종되었다. 4주 후 흰쥐들은 야생형 모균주의 500 c.f.u로 접종되었다. 사망이 4주에 걸쳐 기록되었다.
돌연변이 균주로 접종된 흰쥐와 동일한 연령과 배취(batch)의 두 마리 흰쥐 그룹이 역시 양성 표준으로 야생형 균주의 500 c.f.u로 i.p.로 접종되었다. 면역되지 않은 양 쥐는 예상대로 4주 내에 사망하였다.
결과는 아래에 표로 나타낸다.
1) 돌연변이 균주 P3F4로의 p.o. 최초 접종
초기 접종 c.f.u 첫 번째 도전에 살아남은 쥐 수 야생형 도전에 살아남은 쥐 수
5×109 5 2(40%)
5×108 5 2(40%)
5×107 5 0(0%)
2) 돌연변이 균주P3F4로의 i.p. 최초 접종
초기 접종 c.f.u 첫 번째 도전에 살아남은 쥐 수 야생형 도전에 살아남은 쥐 수
5×106 3 3(100%)
5×104 5 4(80%)
5×103 6 5(83%)
5×102 5 4(80%)
3) 돌연변이 균주 P9B7로의 p.o. 최초 접종
초기 접종 c.f.u 첫 번째 도전에 살아남은 쥐 수 야생형 도전에 살아남은 쥐 수
5×109 5 0(0%)
4) 돌연변이 균주 P9B7로의 p.o. 최초 접종
초기 접종 c.f.u 첫 번째 도전에 살아남은 쥐 수 야생형 도전에 살아남은 쥐 수
5×106 4 2(50%)
이들 실험으로부터 나는 돌연변이 P3F4가 뒤이은 야생형 도전에 대해 어떤 보호를 받는 것으로 결론을 내린다. 이 보호는 i.p.로 면역된 쥐에서 더 큰 것으로 보인다.
실시예 4: 살모넬라 타이피뮤리움 에서 두번째 유형 Ⅲ 분비 시스템을 지정하 는 별병력 위치의 동정
이 예에서 사용되는 약어는 VGC1, 발병력 유전자 크러스터 1; VGC2, 발병력 유전자 크러스터 2이다.
기술되는 실험에 대한 배경
살모넬라 타이피뮤리움은 사람에서 위장염의 주요 요인이며 사람 티푸스성 열에 대한 모델로 제공되는 흰쥐에서 전신의 병을 만든다(1). S.타이피뮤리움으로 흰쥐를 경구 접종 시키면, 파이어 집선(Peyer's patch) 소포들의 M 세포 또는 엔테로사이트(enterocytes)에 의하여 세균은 내장 점막을 통해 소장의 루멘(lumen)을 통과한다(2). 세균은 매크로파아지와 뉴트로필(neutrophil)을 침범하고 세망망내피 조직으로 들어가 지라와 간을 포함하여 다른 기관으로 분산되어, 더 많은 증식이 놀랍고 치명적인 균혈증을 일으킨다(3). 숙주 세포들을 침범하고, 다양한 생리학적으로 긴장을 주는 세포내와 세포외 환경에서 생존하고 복제하기 위하여 그리고 면역 체계의 특이한 항생 활성을 뛰어넘기 위하여 S. 타이피뮤리움은 발병력 인자들의 정교한 레파토리를 사용한다(4).
S.타이피뮤리움과 다른 병원체들의 발병력 기작의 더욱 납득할 만한 이해를 얻기 위하여 편리하게 '신호-태그된 돌연변이'(STM)라고 불리는, 돌연변이 분석의 힘을 단일 동물 내 많은 다른 돌연변이들의 운명을 동시에 뒤쫓을 수 있는 능력과 결합시킨, 트랜스포존 돌연변이 체계가 실시예 1에 기술되었다(5와 실시예 1; 참조 5는 본 발명의 우선일 이후에 공개되었다). 이 접근법을 이용하여 우리는 스크린된 총 1152 돌연변이로부터 약화된 발병력을 가지는 43개 돌연변이를 확인하였다. 5개의 이들 돌연변이의 트랜스포존의 삽입 지점을 연결하는 DNA의 누클레오티드 서열은 다양한 세균 병원체의 유형 Ⅲ 분비 체계를 지정하는 유전자들과 관련되어 있음을 보여주었다(6, 7). S. 타이피뮤리움의 inv/spa유전자 크러스터(8, 9)의 산물은 표피세포로 진입을 매개하는 표면 부착물의 조립을 위해 요구되는 유형 Ⅲ 분비 체계를 형성하는 단백질들이다(10). 따라서 inv/spa 크러스터에 돌연변이를 가지는 균주의 발병력은 접종물이 복강내로 투여될 때가 아니라 경구로 투여되기만 한다면 약화된다(8). STM에 의해 동정된 5개 돌연변이와 대조적으로 뒤따른 복강내 접종은 비발병성이다(5).
이 예에서 우리는 이들 5개 돌연변이의 트랜스포존 삽입 지점과 STM에 의해 동정된 부가적인 11개 돌연변이들 모두 S. 타이피뮤리움 염색체의 동일한 구역에 맵된다. 이 구역의 더 깊은 분석은 그의 추론된 산물이 유형 Ⅲ 분비 체계의 다른 성분들과 서열 유사성을 가지는 부가적인 유전자들을 밝혀냈다. 우리가 발병력 유전자 크러스터 2(VGC2)로써 언급한 이 염색체 부분은 많은 다른 장내 세균에는 존재치 않으며, S. 타이피뮤리움 발병력을 위한 중요한 위치를 나타낸다.
재료와 방법
세균 균주, 형질 도입과 성장 배지. 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 세로타입(serotype) 5791(aberdeen), 423180(gallinarum), 7101(cubana)와 12416(typhimurium LT2)는 내셔널 콜렉션즈 오브 타입 컬쳐즈, 퍼블릭 헬스 래보러토리 서비스(National Collections of Type Cultures, Public Health Laboratory Service), UK로부터 얻었다.
살모넬라 타이피(Salmonella typhi) BRD 123 게놈 DNA는 G. 두간으로부터의 선물이었고, 장병원성 에스쉐리치아 콜라이(EPEC), 장출혈성 E. 콜라이(EHEC), 비브리오 콜레라 바이오타입 엘토르(Vibrio cholera biotype Eltor), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 세로타입 2 와 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 디파트먼트 오브 인펙셔스 디지즈(Department of Infectious Diseases)와 박테리올로지, 로얄 포스트그래듀에이트 메디칼 스쿨( Bacteriology, Royal Postgraduate Medical School), UK로부터 얻어진 임상적인 분리물이었다. 예시니아 페스티스(Yersinia pestis)로부터의 게놈 DNA는 표준 방법을 이용하여 분리될 수 있다. S.타이피뮤리움 NCTC 균주 12023의 신호-태그된 미니-Tn5 트랜스포존 돌연변이를 생성하기 위해 사용되는 세균 균주와 방법은 이미 기술되어 있다(5, 11). 플라스미드의 일상적인 증폭은 E.콜라이 DH5α에서였다. 세균은 적당한 항생제로 보충된 LB 브로쓰(12)에서 성장되었다. 개개 돌연변이 균주들의 발병력 수준이 측정되기 전에 돌연변이는 파아지 P22 매개 형질 도입에 의해 S. 타이피뮤리움 12023의 날리디식 에시드 민감성 모균주로 먼저 전이되었다. 형질 도입체는 접종물로 사용되기 전에 제한 분해와 서던 하이브리디제이션에 의해 분석되었다.
람다 라이브러리 스크리닝. VGC2를 포함하는 중복 삽입 DNA를 가지는 람다(λ) 클론은 S.타이피뮤리움 LT2 게놈 DNA의 Sau3A로부터의 삽입을 포함하는 λ1059 라이브러리(14)로부터 표준 방법(13)에 의해 얻어졌다. 그 라이브러리는 살모넬라 제네틱 스탁 센터(SGSC), 캘거리, 캐나타로부터 K. 샌더슨을 통하여 얻어졌다. Mu d -P22 라이소젠. 방사성 표지된 DNA 프로브들은 S.타이피뮤리움 게놈에서 알려진 위치에서 Mud-P22 프로파아지를 하버링한 S.타이피뮤리움 셋트의 라이세트로부터 준비된 DNA를 가지는 하이본드 N(Amersham) 필터에 하이브리다이즈되었다. 마이토마이신(mitomycin)-유도된 Mud-P22 라이세트의 준비는 기술된 바와 같다(12, 15). Mud-P22 프로파아지의 셋트는 벤슨과 골드만에 의해 최초로 조립되었고 SGSC로부터 얻어졌다.
전기영동과 서던 하이브리디제이션. 전기영동은 0.5×TBE에서 1% 또는 0.6% 아가로스 젤 런에서 수행되었다. 젤 분류된 DNA는 하이본드 N 또는 N+막(Amersham)으로 옮겨져 엄격한 하이브리디제이션과 세척 과정(10% 이하의 미스매치(mismatch)를 가지는 누클레오티드 서열간의 하이브리디제이션을 허용하는)은 홀덴 등(17)에 의해 기재된 바와 같았다. 엄격하지 않은 조건을 위하여(50% 미스매치를 가지는 서열간의 하이브리디제이션을 허용하는) 필터는 10% 포름아미드/0.25M Na2HPO4/7% SDS에서 42℃에서 밤새 하이브리다이즈되었고 가장 엄격한 단계는 42℃에서 20mM Na2HPO4/1% SDS였다. 프로브로 사용된 DNA 조각은 '라드프라임' 시스템(Gibco-BRL)을 이용하여 [32P]dCTP로 표지되거나 방사성으로 표지된 프로브를 위해 사용된 것과 동일한 용액에서 행해졌다는 것을 제외하고는 제조자의 지시에 따라 [디그옥시제닌-11]dUTP로 표지되고 디그옥시제닌 시스템을 사용하여 탐지되었다. 게놈 DNA는 이미 기술된 바와 같이 서던 하이브리디제이션을 위해 준비되었다.
분자적 클로닝과 누클레오티드 시퀀싱. 제한 엔도누클레아제와 T4 DNA 라가아제는 Gibco-BRL로부터 얻어졌다. 일반적인 분자생물학적 기술은 샘브룩 등(18)에 기재된 바와 같다. 누클레오티드 시퀀싱은 T7 시퀀싱 키트(Pharmacia)를 이용하여 디데옥시 체인 종결 방법(19)에 의해 행해졌다. 서열들은 맥벡터 3.5 소프트웨어 또는 어셈블리 LIGN 팩키지로 조립되었다. 누클레오티드와 유도된 아미노산 서열들이 유럽 분자 생물학 실험실(EMBL)과 휴먼 게놈 맵핑 프로젝트 리소스 센터, 힌스톤, UK에 있는 네트워크 서비스 상의 위스콘신 대학으로부터의 GCG 팩키지의 BLAST 와 FASTA 프로그램(버젼 8)을 이용한 스위스프롯(Swissprot) 데이타베이스에 있는 것들과 비교되었다.
발병력 시험. 5마리 암컷 BALB/c 흰쥐 그룹들이 생리 식염수에 현탁된 세균의 10-배 희석들로 경구(p.o.) 또는 복강내(i.p.)로 접종되었다. 접종물의 준비를 위하여 세균은 흔들어주면서(50rpm) LB브로쓰 에서 37℃ 밤샘 성장되었고 560nm에서의 흡광도(OD)가 0.4 내지 0.6에 도달할 때까지 다양한 시간동안 신선한 배지를 접종하는데 사용되었다. ml 당 5×108 콜로니 형성 단위(cfu) 이상의 세포 밀도를 위하여 배양물은 원심분리에 의해 농축되었고 식염수에 재현탁되었다. cfu/ml농도는 접종물의 희석 시리즈를 LB아가 플레이트 상에 플레이트함으로써 조사되었다. 흰쥐는 0.2ml 부피로 i.p.으로 접종되었고 동일한 부피의 접종물로 섭식에 의해 p.o.으로 접종되었다. LD50값은 리드와 뮨크의 방법(21)에 의해 28일 후에 계산되었다.
결과
트랜스포존 삽입의 위치 파악. 살모넬라 타이피뮤리움 미니 Tn5 트랜스포존 돌연변이들의 뱅크(bank)의 생성과 약화된 발병력을 가진 43개 돌연변이를 동정하는데 사용된 스크린은 이미 기술된 바 있다(5). 트랜스포존과 연결 DNA 부위들은 카나마이신 내성에 대한 선별 또는 역 PCR에 의해 경접합개체로부터 클론되었다. 트랜스포존을 연결하는 300-600bp DNA의 누클레오티드 서열들은 33개 돌연변이에 대해 얻어졌다. 이들 서열의 DNA와 단백질 데이타베이스에 있는 것과의 비교는 14개 돌연변이가 이미 알려진 발병력 유전자로의 트랜스포존 삽입으로부터 나오고, 7개는 장내 세균의 알려진 유전자와 유사하게 새로운 유전자로의 삽입으로부터 발생하며 12개는 DNA와 단백질 데이터베이스에 참가된 것들과 유사하지 않은 서열들로의 삽입으로부터 나온다는 것을 지적하였다(참조 5, 실시예 1과 이 실시예).
*세 라인의 증거는 새로운 서열들로의 19개 트랜스포존 삽입들 중 16개는 처음에 A, B, C로 지정된 게놈의 세 부분에 크러스터되어 있다. 첫째, 트랜스포존 삽입 지점을 연결하는 구역들로부터의 서열을 서로 그리고 데이터베이스에 있는 것들과 비교하는 것은 일부 서열들이 서로 중복되어 있고 동일한 유전자의 상이한 부분과 강한 유사성을 가진다는 것을 보여 주었다. 둘째, 몇몇 제한 효소로 분해되고 트랜스포존 삽입 지점을 연결하는 제한 조각으로 프로브된 게놈 DNA의 서던 분석이 일부 트랜스포존 삽입들이 동일한 제한 조각 상에 위치한다는 것을 가리켰다. 셋째, 동일한 DNA 프로브가 S. 타이피뮤리움 λ DNA 라이브러리로부터의 플라크(plaque)에 하이브리다이즈되었을 때, 이전의 두 단계가 연결되었을 것이라고 암시한 돌연변이로부터의 프로브가 동일한 λ DNA 클론에 하이브리다이즈되는 것이 밝혀졌다. 따라서 두 돌연변이(P9B7과 P12F5)는 크러스터 A에 , 5개 돌연변이(P2D6, P9B6, P11C3, P11D10과 P11H10)는 크러스터 B에, 9개의 돌연변이(P3F4, P4F8, P7A3, P7B8, P7G2, P8G12, P9G4, P10E11과 P11B9)는 크러스터 C에 할당되었다(도 8).
이들 세 크러스터로부터의 DNA 프로브의 Mud-P22 프로파아지에 록(lock)된 S. 타이피뮤리움 균주 하버링(harboring) 셋트(15, 16)로부터의 라이세트에 대한 하이브리디제이션은 세 위치 모두 30분에서 31분 구역에 위치하고 있으며, 이 세 위치가 밀접하게 연결되어 있고 하나의 큰 발병력 위치를 구성한다는 것을 가리킨다. 크러스터 A, B, C에 걸친 모든 λ클론이 중복 DNA 삽입을 가지는지를 결정하기 위하여 각 클론의 말단 부분으로부터의 DNA 조각들이 다른λ클론의 서던 하이브리디제이션 분석에서 프로브로써 사용되었다. 하이브리다이즈하는 DNA 조각들은 몇몇 λ클론들이 중복하고 크러스터 A, B, C가 하나의 연속된 구역을 이룬다는 것을 보여 주었다(도 8). 이 구역의 말단으로부터의 DNA 조각들은 인접한 구역을 나타내는 삽입들을 가지는 더 많은 클론들을 동정하기 위하여 λ라이브러리를 프로브하는데 사용되었다. 어떠한 λ 클론도 그 위치의 극우측 말단을 포함하지 않는 것으로 확인되었고 따라서 이 부분은 Mud-P22 프로파아지 균주 TT15244(16)의 라이세트로부터 6.5kb EcoRⅠ/XbaⅠ조각을 클로닝함으로써 얻어졌다.
제한 맵핑과 서던 하이브리디제이션 분석이 이 위치의 물리적 맵을 만드는데 사용되었다(도 8). 이 위치를 63분에 잘 특성이 밝혀진 inv/spa 유전자 크러스터(판 Ⅷ, 참조 22)(8, 9, 23, 24, 25, 26)로부터 구별하기 위하여 우리는 후자를 발병력 유전자 크러스터 1(VGC1)으로 언급하고 새로운 발병력 위치를 VGC2라고 정의하였다("서열 1"과 "서열 2"). 그 누클레오티드 서열은 도 11과 12에 나타나 있다.
S.타이피뮤리움 염색체 상의 VGC2의 경계의 맵핑. VGC2 왼쪽에 있는 λ클론 7의 누클레오티드 시퀀싱은 그 추론된 아미노산 서열이 E.콜라이의 ydhE+ 유전자의 조각의 유도된 산물과 90% 이상 동일한 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혔고 VGC2의 오른쪽에 있는 6.5kb EcoRⅠ/XbaⅠ의 시퀀싱은 그의 예상되는 아미노산 서열이 pykF유전자에 의해 지정되는 E.콜라이의 피루브산 키나아제Ⅰ과 90% 이상 동일한 ORF의 존재를 밝혔다(27). E.콜라이 염색체 상에 ydhE와 pykF가 37분에서 38분에서 서로 가깝게 위치하고 있다. VGC2 길이를 따라 분포된 11개의 비중복 DNA조각들은 E.콜라이와 S. 타이피뮤리움 게놈 DNA의 엄격하지 않은 서던 하이브리디제이션 분석에서 프로브로써 사용되었다. 하이브리다이즈하는 DNA 조각들은 VGC2를 포함하는 약 40kb구역이 E. 콜라이 게놈에 없고 1kb 내에 VGC2의 경계들이 위치한다는 것을 보여 주었다(도 9). VGC2의 오른쪽 말단(도 8)에 가까운 XbaⅠ위치의 염색체의 30분 구역에 있는 알려진 XbaⅠ위치 맵과의 자리 비교는 30.7분의 맵 위치가 VGC2에 대해 추론되는 것이 가능하게 한다.
VGC2의 구조. VGC2 부분의 누클레오티드 시퀀싱은 19 OFFs의 존재를 밝혀 내었다(도 8). VGC2내 26kb 누클레오티드 서열의 G+C함량은 VGC1(9)의 47%와 전체 살모넬라 게놈(30)에 대해 추정되는 51-53%와 비교하여 44.6%이다.
ORFs 1-11의 완전한 추정 아미노산 서열은 식물과 동물의 다양한 세균 병원체에서 발병력 결정기의 수송을 위하여 요구되는 것으로 알려진 유형 Ⅲ 분비 체계(6, 7)의 단백질의 그것들과 유사하다(7). ORFs 1-8(도 8)의 예상되는 단백질들은 예시니아 슈도튜버큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis)(31)의 yscN-U 유전자의 산물과, 살모넬라 타이피뮤리움의 VGC1에 있는 inv/spa 크러스터의 invC/spaS(8, 9)와, 시겔라 프렉스네리(Shigella flexneri)의 spa/mxi 크러스터의 spa47/spa40(32, 33, 34, 35)과 구성과 서열에서 유사하다. 예를 들면 ORF3의 예상되는 아미노산 서열(도 8)은 Y. 슈도튜버큘로시스의 YscS(31)와 50% 동일하고, S. 프렉스네리의 Spa9(35)와 34% 동일하고, S. 타이피뮤리움의 VGC1의 SpaQ와 37% 동일하다. ORF9의 예상되는 단백질 산물은 Y. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica)의 LcrD923(36)와 43% 동일성을, S. 프렉스네리의 MxiA(32)와 39% 동일성을, VGC1의 InvA(23)와 40% 동일성을 가지면서 LcrD 훼밀리 단백질과 밀접하게 관련되어 있다. 도 8에 나타난 남은 ORFs에 대한 부분적 누클레오티드 서열은 ORF10의 예상되는 단백질은 세균 외막(outer membrane)에 위치한 리포프로틴(lipoprotein)인 Y. 엔테로콜리티카의 YscJ(37)와 가장 유사하며, ORF11 은 PulD 훼밀리 트랜스로케이즈(translocase)의 성원인 S. 타이피뮤리움 InvG(38)와 유사함을 가리킨다. ORF12와 ORF13은 2 성분 조절 시스템을 이루는 다양한 단백질로부터의, 각각 센서와 조절 단위와 상당한 유사성을 보인다(39). ORFs9와 10, ORFs 10과 11, ORF19와 VGC2 의 우측 말단 사이에 더 많은 유전자를 위한 풍부한 코딩 능력이 있다.
VGC2는 살모넬라 간에 보존되어 있고 살모넬라에 특이적이다. DNA와 단백질 데이터베이스 참여체와 서열 유사성이 없는 VGC2의 중앙에 위치한 2.2 kb PstⅠ/HindⅢ 조각은 살모넬라 세로바와 다른 병원성 세균의 게놈 DNA의 서던 하이브리디제이션 분석에서 프로브로 사용되었다(도 10A). 엄격하지 않은 조건에서 하이브리다이즈하는 DNA 조각들은 VGC2가 S. 아베르딘, S. 큐바나, S. 타이피에 존재하고, EPEC, EPEC, Y. 페스티스, S. 프렉스네리, V. 콜레라와 S. 아우레우스에 없는 것을 보여주었다. 따라서 VGC2는 살몬넬라에 간에 보존되어 있고 살모넬라에에 특이적인 것 같다. 위치 구성은 시험된 살모넬라 세로바 간에 보존되어 있는지를 결정하기 위하여 2개의 더 많은 제한 효소로 분해된 게놈 DNA로 엄격한 서던 하이브리디제이션이 수행되었다. 하이브리다이즈하는 DNA 조각은 S. 타이피뮤리움 LT2와 S. 갈리나럼, S. 큐바나와 S. 타이피(도 10B) 간에 제한 위치의 배열에 약간의 이질성이 있다. 더구나, S. 갈리나럼과 S. 타이피는 조사된 다른 살모넬라에 존재하는 것들에 부가적인 하이브리다이징 조각을 가져, VGC2 부분들이 이들 종에서 중복되었음을 암시한다.
VGC2는 흰쥐에서 발병력에 필요하다. 이전의 실험들은 트랜스포존 돌연변이 P3F4, P7G2, P9B7과 P11C3의 i.p. 접종에 대한 LD50은 적어도 야생형 균주 보다 100배 더 크다는 것을 보여 주었다(5). 감염 과정에서 VGC2의 중요성을 명확히 하기 위하여 돌연변이 P3F4와 P9B7에 대한 p.o.과 i.p. LD50이 결정되었다(표 1). 양 돌연변이는 모균주와 비교할 때 어떤 접종 경로에 의해서도 5 등급 크기의 발병력 감소를 보였다. 양 접종 경로에 의한 이 심각한 발병력 약화는 VGC2가 BALB/c 흰쥐에서 표피 세포 투과 후 감염 과정에서의 현상에 요구된다는 것을 증명한다.
S. 타이피뮤리움 균주의 LD50 값
LD50(cfu)
균주 i.p. p.o.
12023 야생형 4.2 6.2×104
P3F4 1.5×106 >5×109
P9B7 >1.5×106 >5×109
cfu. 콜로니 형성 단위
논의
염색체 상 30.7분에 위치한 약 40kb의 지금까지 알려지지 않은 발병력 위치가 약화된 발병력을 가지는 일군의 신호-태그된 트랜스포존 돌연변이의 삽입 지점을 맵핑함으로써 동정되었다(5). 이 위치는 우리가 VGC1으로 재명명할 것을 제안한 63분 위치에 inv/spa 발병력 유전자들(판Ⅷ, 참조 22)로부터 구별하기 위하여 발병력 유전자 크러스터 2(VGC2)라고 언급된다. VGC1과 VGC2 양자는 유형 Ⅲ 분비 체계의 성분들을 지정한다. 그러나, 이들 분비 체계들은 기능적으로 별개이다.
새로운 유전자로의 삽입으로부터 발생하는 19개 돌연변이(참조 5와 이 실시예)의 16개가 염색체의 동일한 구역에 맵하였다. 미니-Tn5 삽입이 VGC2에서 선호되어 일어나는 것이 가능하다. 대안으로, 약화된 발병력을 가지는 돌연변이를 동정하는데 사용된 음성 선별(5)이 매우 엄격하였기 때문에 이전에 알려지지 않았던 유전자들 중 VGC2의 것들에 있는 돌연변이만이 스크린에서 회수되기에 충분한 약화 정도를 낳은 것도 가능하다. VGC2를 동정하기 위한 S. 타이피뮤리움에 대한 이전의 탐구의 실패는 감염의 생존 동물 모델 보다 세포 배양 분석에 의존한 것으로부터 기인할 수 있다. 살모넬라에에 독특한 S.타이피뮤리움 LT2 염색체의 부분을 동정한 이전의 연구는 그런 하나의 구역(RF333)을 30.5-32분에 위치시켰다. 따라서, RF333은 비록 RF333이 발병력 결정에 관여한다는 것이 알려지지 않았을지라도, VGC2에 해당할 것이다.
살모넬라의 VGC1과 뿐만 아니라 예시니아와 시겔라의 발병력 플라스미드들에 의해 지정되는 유형 Ⅲ 분비 체계와의 비교는 VGC2가 분비 기구의 기초적인 구조 성분을 지정한다는 것을 가리킨다. 더욱이, VGC2에서 ORFs 1-8의 순서는 예시니아, 시겔라의 유사체와 S. 타이피뮤리움의 VGC1에서의 유전자 순서와 동일하다. VGC2의 분비 체계의 구성과 구조가 VGC2의 낮은 G+C 함량과 함께, 예시니아의 해당 유전자 만큼 VGC1에 밀접하게 관련되어 있는 것은 VGC1(40, 41, 42)처럼, VGC2가 수평적인 전파에 의해 S.타이피뮤리움에 의해 독립적으로 획득되었다는 것을 암시한다. ORFs 12와 13에 의해 지정된 단백질들은 세균의 2 성분 조절자(39)와 강한 유사성을 보이고 ORFs 1-11그리고/또는 이 체계의 분비된 단백질을 조절할 수 있었다.
VGC1에 있는 많은 유전자들은 S. 타이피뮤리움의 표피 세포로의 진입에 중요하다는 것을 보여주었다. 이 과정은 세균 접촉(2)을 요구하고 국소적인 막 물결 운동(ruffling)(43, 44)을 일으키는 세포 골격의 재배열을 낳는다. VGC1의 역할과 그것의 감염의 이 단계로의 제한은 VGC1 돌연변이로 p.o. 접종된 BALB/c 흰쥐에서 발병력이 약 50 배 약화되고 VGC1 돌연변이들이 i.p. 로 투여될 때(8) 발병력의 유실을 보이지 않는 사실에 의해 반영된다. 두 번째 관찰은 또한 어떤 VGC1 돌연변이들도 우리의 스크린(5)에서 얻어지지 않은 이유를 설명한다. 반대로, VGC2에 있는 돌연변이들은 p.o.과 i.p. 접종 모두에 따라 심각하게 약화된다. 이것은 VGC1과 달리 VGC2가 표피 세포 투과 후 흰쥐에서 발병력에 요구됨을 보여주지만, 이 발견은 감염의 초기 단계에서 VGC1의 역할을 배제하지는 않는다.
따라서, 요약하면 살모넬라 타이피뮤리움 상의 16개 신호-태그된 트랜스포존 돌연변이들의 삽입 지점의 맵핑은 30.7분에 40kb 발병력 유전자 크러스터의 동정에 이르게 하였다. 이 위치는 조사된 다른 살모넬라 종 간에 보존되어 있지만, 다른 다양한 병원성 세균과 에스쉐리치아 콜라이 K12에는 존재하지 않는다. 이 위치의 일부의 누클레오티드 시퀀싱은 그의 예상되는 단백질들이 유형 Ⅲ 분비 체계의 성분을 지정하는 11개의 오픈 리딩 프레임을 밝혔다. 이것과 inv/spa 침범 위치에 의해 지정되는 유형 Ⅲ 분비 체계를 구별하기 위하여 우리는 inv/spa 위치를 발병력 유전자 크러스터 1(VGC1)으로 언급하고 새로운 위치를 VGC2로 언급한다. VGC2는 살모넬라 게놈 보다 낮은 G+C 함량을 가지며 그 산물이 E. 콜라이 ydhE와 pykF 유전자들의 것과 90% 이상의 동일성을 공유한다. 따라서 VGC2는 아마 ydhE와 pykF 사이의 것에 해당하는 구역으로의 삽입에 의해 수평적으로 획득되었을 것이다. VGC2의 발병력 연구는 경구 또는 복강내 접종이 따르면 그들이 야생형 균주와 비교하여 적어도 5 등급 크기 정도 약화되는 것을 보였다.
이 실시예를 위한 참조들
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실시예 5: 스트렙토코커스 뉴모니아에에서의 발병력 유전자의 동정
(a) 돌연변이유발
편리한 트랜스포존 체계가 없는 상태에서 스트렙토코커스 뉴모니아에의 태그된 돌연변이를 만드는 가장 효율적인 방법은 삽입-중복 돌연변이(모리슨 등 (1984) J. Bacteriol. 159, 870)를 사용하는 것이다. 무작위 S. 뉴모니아에 DNA 조각 200-400bp가 젤 분류와 T4 DNA 중합 효소를 이용한 DNA 말단-수리가 따르는 제한효소로의 게놈 DNA의 분해 또는 초음파에 의한 물리적 전단(shearing)에 의해 생성될 것이다. 그 조각들은 다중링커 클로닝 위치의 하나에 DNA 서열 태그들의 도입에 의해 미리 변형된 플라스미드 pJDC9(E. 콜라이와 S. 뉴모니아에에서 에리트로마이신(erythromycin) 선별을 위한 erm유전자를 가지는 피어스 등(1993) Mol. Microbiol. 9, 1037)에 리게이트된다. 클론된 S. 뉴모니아에 DNA의 크기는 유사적 재조합을 보장하기에 충분하고, E. 콜라이에서 비대표적인 라이브러리를 생성할 가능성을 줄인다(S. 뉴모니아에의 발현이 E. 콜라이에 유독할 수 있다). 다른 선별 가능한 표지를 가지는 대체 벡터들이 사용가능하고 pJDC9대신 사용되어 질 수 있다. DNA 조각들을 가지는 태그된 플라스미드들은 뉴모코커스의 뉴모니아의 쥐 모델에서 세로타입과 발병력에 기초하여 선택된 적합한 S. 뉴모니아에에 도입된다. S. 뉴모니아에에서 유전적 형질 도입 능력의 조절은 능력 인자(competence factor), 시카고에 있는 일리노이 대학에 돈 모리슨의 그룹에 의해 최근 특성지어졌고 , 하바스타인, 쿠마라스와미와 모리슨 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11140-11144에 기술된 17 아미노산의 펩티드에 의해 지배된다. 형질 전환 실험에서 이 펩티드의 미미한 양의 도입은 S. 뉴모니아에의 일부 캡슐화된 임상적 분리물에서 매우 효율적인 형질 전환 빈도를 낳는다. 이것은 뉴모코커스의 분자 유전학에서 주요 장애를 극복하며 이 펩티드의 이용가능성은 S. 뉴모니아에 돌연변이 뱅크의 제조를 크게 용이하게 하였고 돌연변이될 균주를 선택함에 있어 유동성을 가능케 하였다. 일부 형질전환체는 플라스미드서열의 유사적 삽입을 확인하기 위하여 분석되고 안정성에 대해 조사된다. 삽입-중복에 의해 생성된 돌연변이와 연관된 매우 낮은 복귀가 중복된 구역이 짧을 것(200-400bp)이라는 사실에 의해 최소화된다; 그러나 만약 복귀 수준이 수용할수 없을 정도로 높다면 항생제 선별이 배양 중과 동물에서 성장되는 중에 유지된다.
(b) 동물 모델
S. 뉴모니아에 돌연변이 뱅크는 스위스 그리고/또는 C57B1/6 흰쥐로의 접종을 위한 풀로 구성된다. 예비 실험들이 풀의 최적 복잡성과 최적 접종 수준을 결정하기 위하여 수행된다. 하나의 매력적인 모델은 입에 의해 기관(氣管)으로 전달되는, 105 cfu 접종을 이용한다(베버 등 (1993) J. 안티마이크로비얼 케모써라피 32, 473). 스위스 흰쥐는 3-4일내에 급성 폐렴을 일으키고 C57B1/6 흰쥐는 8-10일내에 준급성 폐렴을 일으킨다. 감염의 이들 폐 모델은 사망 시 108 cfu/폐(베버 등 (1993) J. 안티마이크로비얼 케모써라피 32, 473)의 수율을 보인다. 필요하다면, 흰쥐들은 혈류 감염에 필요한 유전자들의 동정을 위하여 복강내로 주사된다(설리반 등 (1993) 안티마이크로비얼 에이전트 앤드 케모써라피 37 , 234).
(c) 발병력 유전자 동정
일단 감염 모델의 매개변수들이 최적화되면, 수천 균주들로 구성된 돌연변이 뱅크가 발병력 시험을 받는다. 약화된 발병력을 가지는 돌연변이들은 프로브로써 '인풋(input)'과 '회수된' 풀로부터 표지된 태그들을 이용하는, 하이브리디제이션 분석에 의해 동정된다. 만약 S. 뉴모니아에 DNA가 쉽게 콜로니 블랏될 수 없으면 염색채 DNA는 도트-블랏(dot-blot)기구를 이용하는 나일론 막으로 옮기기 전에 마이크로타이터 접시의 웰에서 화학적 또는 효소적으로 방출된다. 삽입된 플라스미드를 연결하는 DNA는 E. 콜라이에서 플라스미드 레스큐(plasmid rescue)에 의해 클론되고(모리슨 등 (1984) J. Bacteriol. 159, 870), 서열 분석된다. 게놈 DNA 라미브러리는 E. 콜라이 또는 그램-양성 숙주 균주에서 유지되는 적당한 벡터에서 제조되어, 완전히 서열 분석되고 자세한 기능 분석을 받게 되는 클론된 발병력 유전자를 분리하기 위하여 삽입된 플라스미드를 연결하는 제한 조각들로 프로브된다.
실시예 6: 엔테로코커스 페칼리스에서 발병력 유전자의 동정
(a) 돌연변이유발
E. 페칼리스의 돌연변이는 이 목적으로 개발된, pAT112 또는 유도체를 이용하여 수행된다. pAT112는 그램-양성과 그랜-음성 양자에서의 선별을 위한 유전자와 Tn1545의 att위치를 가진다. 따라서 그것은 이동을 위하여 숙주 균주에서 인테그라아제(integrase)의 존재를 요구하고 만약 숙주가 엑시져나아제(excisionase) 유전자를 가지지 않으면 안정한 단일의 사본이 얻어진다(트리유-쿠오트 등 (1991) 진 106 21). 삽입된 플라스미드를 연결하는 DNA의 회수는 게놈 DNA의 제한 분해, 분자내 리게이션과 E. 콜라이에서의 형질 전환에 의해 수행된다. pAT112와 그 유도체에서 제한 효소에 대한 단일의 의치의 존재는(트리유-쿠오트 등 (1991) 진 106, 21) 접합, 에렉트로포레이션(electrophoration) 또는 형질 전환에 의해 플라스미드 pAT145를 가지는(인테그라아제 기능을 제공하기 위하여) E. 페칼리스의 발병성 균주로 전이하기 전에 DNA 서열의 삽입을 허락한다(트리유-쿠오트 등 (1991) 진 106, 21;위스 등 (19860 J. Bacteriol. 165, 831).
(b) 동물 모델
많은 수의 삽입 돌연변이들이 수혜자, 제한효소 분해와 서던 하이브리디제이션으로부터 DNA를 분리함으로써 플라스미드의 무작위 삽입에 대해 분석된다. 개개 돌연변이들은 마이크로타이터 접시의 웰에서 저장되고, 풀된 접종들의 복잡성과 크기는 돌연변이 뱅크의 스크리닝 전에 최적화된다. E. 페칼리스(E. faecalis)에 의해 유발된 감염의 두 개의 다른 모델들이 사용된다. 첫째는 카테테르가 대동맥판을 가로질러 삽입되는 108 cfu까지의 E.페칼리스의 동물로의 꼬리 혈관 주사를 포함하는, 심내막염의 화립된 쥐 모델이다(휘트만 등 (1993) 안티마이크로비얼 에이젼트 앤드 케모써라피 37, 1069). 동물들은 접 종 후 다양한 시기에 희생되고, 대동맥판 상 세균 증식들은 잘라내어져, 균등 분쇄되고 세균 콜로니를 회수하기 위하여 배양 배지에 플레이트한다. 발병성 세균은 또한 접종 후 다양한 시기에 혈액으로부터 회수된다. 둘째 모델은 흰쥐에서 복막염으로서, 109 cfu까지의 E.페칼리스의 복강 내 주사가 뒤따른다(케노웨스 등 (1990) 안티마이크로비얼 에이젼트 앤드 케모써라피 34, 1800). S. 뉴모니아에 모델과 같이, 예비 실험들이 돌연변이 뱅크의 스크리닝 전에 최적 풀의 복잡성과 최적 접종 수준을 확립하기 위하여 행해진다.
(c) 발병력 유전자 동정
E. 콜라이의 복제 원점을 이용하는 pAT112의 삽입 위치를 연결하는 DNA의 분리는 벡터에서 일반적으로 사용되는 6 bp 인지 제한 효소들의 대부분에 대한 위치의 결핍에 의해 단순화된다. 따라서 관심 있는 균주로부터의 DNA는 이들 효소 중 하나로 분해되고, 자가-리게이트되고, E. 콜라이에 형질 전화되고, 플라스미드 상의 att 위치에 인접한 서열들에 기포한 프라이머를 이용하여 서열분석된다, E. 페칼리스의 게놈 DNA 라이브러리는 서열 분석될 발병력 유전자의 손상되지 않은 사본들을 동정하기 위하여 관심 있는 서열들로 프로브된다.
실시예 7: 슈도모나스 아에루지노사( Psedomonas aeruginosa )에서 발병력 유 전자의 동정
(a) 돌연변이 유발
트랜스포존 Tn5가 다른 사람들에 의해 슈도모나스 아에루지노사를 돌연변이시키는데 사용되었고, 살모넬라 타이피뮤리움 발병력 유전자의 동정을 위하여 사용되었던 미니-Tn5 유도체(실시예 1)가 몇몇 슈도모나스(드 로렌조와 티마리스 (1994) Methods Enzymol. 264, 386)를 포함하여, 그램-음성 세균 중에 넓은 용도를 가지는 것으로 보고되어 있으므로 P. 아에루지노사 돌연변이 뱅크가 자살 벡터의 하나 이상의 발병성(그리고 가능하게는 점액성)인 수혜자 균주들로의 접합 전이에 의해 우리의 현존하는 신호 태그된 미니 Tn5트랜스포존 풀을 사용하여 제작된다. 이 접근법은 상당한 시간 절약을 나타낸다. P. 아에루지노사를 위해 특별히 설계된 Tn5 의 다른 유도체들(렐라 등 (1985) 진 33, 293)이 대신 미니 Tn5 트랜스포존으로 사용될 수 있다.
(b) 동물 모델과 발병력 유전자 동정
P. 아에루지노사 삽입 돌연변이들 뱅크는 쥐에서 만성 폐 감염 모델에서 약화된 발병력에 대해 스크린된다. P. 아에루지노사 세포들의 현탁액은 기관절개를 뒤따르게 하여 기관지로 도입되고, 질병은 30일 기간에 걸쳐 나타난다(우즈 등 (1982) Infect. Immun. 36, 1223). 세균들은 폐 균등 분쇄물을 플레이팅함에 의해 실험실 배지로 회수되고 이들로부터의 서열 태그들은 접종으로 사용된 세균들의 DNA 콜로니 블랏을 프로브하는데 사용된다. 그 돌연변이 뱅크를 흰쥐에서 내생성 균혈증(히라카타 등 (1992) 안티마이크로비얼 에이젼트 앤드 케모써라피 36 , 1198)과 낭포성 섬유증(데이비드슨 등 (1995) 내이쳐 제네틱스 9, 351)의 모델에서 발병력 시험을 받게 하는 것도 가능하다, 트랜스포존을 연결하는 DNA의 클로닝과 시퀀싱은 실시예 1에 기재된 바와 같이 행해진다. 유전자의 완전한 사본들의 분리와 시퀀싱을 위한 게놈 DNA 라이브러리는 표준 방법에 의해 실험실에서 제작된다.
실시예 8: 아스퍼질러스 푸미가투스( Aspergillus fumigatus )에서 발병력 유 전자들의 동정
(a) 돌연변이 유발
곰팡이에서 트랜스포존 돌연변이의 기능적인 동등체는 DNA를 형질 전환하는 제한 효소 매개 삽입(REMI)이다(쉬에스틀과 페테스 (1991) Proc Natl. Acad. Sci. 88, 7585). 이 과정에서, 곰팡이 세포들은 제한 효소 존재 하에 선별 가능 표지를 가지는 DNA 조각들로 형질 전환되고, 단일 사본 삽입이 제한 효소의 표적 위치에 의해 한정된 상이한 게놈 위치들에서 일어난다. REMI는 이미 코크리오볼러스(Cochliobolus(루 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12649))와 우스틸라고(Ustilago)(볼커 등 (1995) Mol. Gen. Genet. 248, 547)의 발병력 유전자를 분리하는데 성공적으로 사용되었고, 하이그로마이신 내성을 지정하는 플라스미드와 함께 활성 제한 효소의 도입은 A. 푸미가투스 게놈으로 선형 플라스미드의 단일의 또한 명백하게 무작위인 삽입을 낳는다는 것을 보였다. 서열 태그들은 하이그로마이신 내성을 위한 두 벡터 중 하나에 편리한 위치로 도입되고, A. 푸미가투스의 임상 분리물을 형질 전환하는데 사용된다.
(b) 동물 모델과 발병력 유전자 동정
호중구 감소증(neutropenic) 흰쥐에서 아스퍼질러스병(aspergillosis)의 낮은 용량 모델은 특히 사람에서 폐 질병 경로와 일치한다(스미스 등 (1994) Infect. Immun. 62, 5247). 흰쥐들은 1,000,000 분생포자/흰쥐 까지 비내로 접종되고, 발병성 곰팡이 돌연변이들이 액체 배지를 접종하기 위하여 폐 균등 분쇄물을 이용하여 7-10일 후 회수되었다. 균사는 수 시간 후 수집되고, 그로부터의 DNA가 접종을 이루는 형질 전환체 풀로부터 DNA의 콜로니 블랏을 프로브하기 위한 태그들의 증폭과 표지를 위해 추출된다. REMI삽입 지점들을 연결하는 구역으로부터의 DNA는 형질 전환체 DNA를 REMI 바깥을 자르는 제한효소로 분해하고, 자가 리게이션과 E. 콜라이에서 형질 전환에 의해 클론된다. 플라스미드의 알려진 서열에 기초한 프라이머들이 인접한 A. 푸미가투스 DNA 서열들을 결정하는데 사용된다. 벡터의 삽입이 비발병성 표현형의 원인임을 증명하기 위하여, 회수된 플라스미드는 클로닝에 사용된 것과 동일한 제한 효소로 재절단되고, 야생형 A. 푸미가투스 모균주로 역으로 형질 전환된다. 유사적 재조합에 의해 발생한 형질 전환체는 그때 발병력 시험을 받게 된다.
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본 발명에 따르면, 미생물의 환경에 대한 적응에 관여하는 유전자들을 동정하고, 특히 병원성 미생물에서 더 많은 발병력 유전자를 더욱 효율적으로 동정하는 것이 가능하였다.
도 1은 본 발명의 특히 바람직한 한가지 방법을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 EcoRⅤ로 분해한 후 12개 S. 타이피뮤리움 경접합개체들의 서던 하이브리디제이션 분석을 나타낸다.
도 3은 마이크로타이터 접시의 절반(A1-H6)으로부터 48개 S. 타이피뮤리움 경접합개체 DNA의 콜로니 블랏 하이브리디제이션(colony blot hybridisation) 분석을 나타낸다. RM 필터는 첫 번째 24개 콜로니들(A1-D6) 풀로부터 분리된 DNA로부터 표지된 증폭 태그들을 포함하는 프로브로 하이브리다이즈되었다.
도 4는 흰쥐로 주사되었던 마이크로타이터 접시의 95개 S. 타이피뮤리움 경접합개체의 DNA 콜로니 블랏 하이브리디제이션 분석을 나타낸다. 복제본 필터로부터의 표지된 풀 증폭 태그들 또는 동물의 지라로부터 회수된 10,000개의 풀 콜로니(지라 패턴)로부터 분리된 DNA로부터의 표지된 증폭 태그들과 하이브리다이즈되었다. 콜로니들 B6, A11과 C8은 양 세트의 필터 상에서 약한 하이브리디제이션 신호를 일으켰다. 콜로니 A3, C5, G3(aroA)와 F10으로부터의 하이브리디제이션 신호는 접종 패턴에는 존재하나 지라 패턴에는 존재하지 않는다.
도 5는 본 발명의 방법에 의해 분리된 살모넬라 유전자의 서열과 에스쉐리치아 콜라이 clp 프로테아제(protease) 게놈에 대한 비교를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 방법을 이용하여 분리된 더 많은 살모넬라 유전자의 부분적 서열을 나타낸다(SEQ ID Nos. 8 에서 36)
도 7은 S. 타이피뮤리움 염색체상의 VGC2의 맵핑(mapping)을 나타낸다. (A) VGC2의 세 부분으로부터의 DNA 프로브가 Mud-P22 프로파아지에 가둬진 한 세트의 S. 타이피뮤리움 균주 하버링(harbouring)으로부터의 라이세트(lysates)의 서던 하이브리디제이션 분석에 사용된다. 7.5 kb PstⅠ조각에 하이브리다이즈된 라이세트(도 8의 프로브 A)가 나타나 있다. 사용된 다른 두 프로브가 동일한 라이세트에 하이브리다이즈하였다. (B) 파아지의 삽입 지점과 팩키징(packaging) 방향이 분으로 지도 위치와 함께 나타나 있다(실시예 4에서 참조 22의 Ⅷ판). 그 파아지 지정은 다음 균주들에 해당한다: 18P, TT15242; 18Q, 15241; 19P, TT15244;19Q, TT15243; 20p, TT15246과 20Q, TT15245(실시예 4에 참조). 맵된 유전자의 위치들은 수평 막대에 의해 나타나 있고 다른 유전자들의 대략적인 위치가 지적되어 있다.
도 8은 VGC2의 물리적 그리고 유전적 지도를 나타낸다. (A) 16개 트랜스포존 삽입의 위치가 선 위에 나타나 있다. VGC2의 범위는 굵은 선에 의해 지적되어 있다. 실시예 4의 교재에서 기술된 ORF의 전사의 위치와 방향은 그 산물이 각각 다양한 2 성분 조절 체계(2 component regulatory systems)의 센서와 조절 성분과 유사한 ORFs 12와 13을 제외하고는 유사한 유전자의 이름과 함께 선 아래 화살표에 의해 나타나 있다. (B) 중복되는 클론과 Mud-P22 프로파아지 균주 TT15244로부터의 EcoRⅠ/XbaⅠ 제한 조각의 위치가 채워진 막대로써 나타나 있다. 맵된 λ클론의 단지 일부분만이 나타나 있으며 그 클론들은 이들 한계를 초과할 수 있다. (C) 제한 위치의 자리가 지적되어 있다:B, BamHⅠ; E, EcoRⅠ; V, EcoRⅤ; H, HindⅢ; P, PstⅠ과 X, XbaⅠ. 도 7에서 프로브로 사용된 7.5kb PstⅠ 조각(프로브 A)의 위치와 도 10에서 프로브로 사용된 2.2kb PstⅠ/HindⅢ 조각(프로브 B)의 위치가 제한 지도 아래 나타나 있다. 서열 1(도 11에 기술된)과 서열 2(도 12에 기술된)의 위치들이 가는 화살표에 의해 나타나 있다(표지된 서열 1과 서열 2).
도 9는 VGC2의 경계를 맵핑하는 것을 기술한다. (A) E.콜라이 K12 염색체 상에 37 에서 38 분에 맵된 유전자의 위치들이 S. 타이피뮤리움 LT2 염색체의 해당하는 부분(30에서 31분)과 배열되어 있다. VGC2 부분의 확장된 맵은 프로브로 사용된 11개 S. 타이피뮤리움(S. t.) DNA 조각(굵은 막대)와 그들을 생성시키는데 사용된 제한 위치와 함께 나타나 있다: B, BamHⅠ; C, ClaⅠ; H, HindⅡ; K, KpnⅠ; P, PstⅠ; N, NsiⅠ과 S, SalⅠ. E..콜라이 K12(E. c)에 하이브리다이즈된 프로브들은 +로 지적되어 있다; 하이브리다이즈되지 않는 것들은 -로 지적되어 있다.
도 10은 VGC2가 살모넬라에 사이에 보존되어 있고 살모넬라에에 특이적임을 보여 준다. 살모넬라 세로바(serovars)와 다른 병원성 세균으로부터의 게놈 DNA가 PstⅠ(A), HindⅢ 또는 EcoRⅤ(B)로 제한되고 λ클론 7로부터의 2.2kb PstⅠ/HindⅢ 조각을 프로브(도 2 프로브B)로 사용하는 서던 하이브리디제이션 분석을 받게 된다. 그 필터는 엄격한(stringent)(A) 또는 엄격하지 않은(non-stringent)(B) 조건에서 하이브리다이즈되고 세척된다.
도 11은 중심부터 왼쪽 말단으로 VGC2의 "서열 1"의 DNA 서열을 나타낸다(도 2에 화살표 표지된 서열 1 참조) DNA는 모두 6개의 리딩 프레임과 추정되는 유전자의 개시 그리고 중단 위치로 번역되고 STM에 의해 확인된 다양한 돌연변이에 대한 트랜스포존 삽입 위치가 지적되어 있다(SEQ ID No 37).
*일반적인 것과 같이 *은 중단 코돈을 지시하고 표준 누클레오티드 불확실성(ambiguity) 코드들이 필요한 경우 사용되었다.
도 12는 VGC2(크러스터 C)의 "서열 2"의 DNA 서열을 나타낸다(도 2에 화살표 표지된 서열 1 참조). DNA는 모두 6개의 리딩 프레임과 추정되는 유전자의 개시 그리고 중단 위치로 번역되고 STM에 의해 확인된 다양한 돌연변이에 대한 트랜스포존 삽입 위치가 지적되어 있다(SEQ ID No 38).
일반적인 것과 같이 *은 중단 코돈을 지시하고 표준 누클레오티드 불확실성(ambiguity) 코드들이 필요한 경우 사용되었다.
도 7과 12는 실시예 4와 가장 관련이 깊다.
<110> COLLEGE INNOVATION LIMITED MICROSCIENCE LIMITED <120> IDENTIFICATION OF GENES <130> IPP20030566 <150> GB 6424921.6 <151> 1994-12-09 <150> GB 9501181.8 <151> 1995-01-31 <150> GB 9509239.1 <151> 1995-05-05 <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE <400> 1 ctaggtacct acaacctcaa gcttnknknk nknknknknk nknknknknk nknknknknk 60 nknkaagctt ggttagaatg ggtaccatg 89 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 tacctacaac ctcaagct 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 catggtaccc attctaac 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 tacccattct aaccaagc 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 ctaggtacct acaacctc 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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aattctttta cctccataag ctgcgtggca tagcgataca gagtattaag cgggtgtgtt 60 acatcgtcat ccaacaacat acgcagcgag ccgccacgcc ggaaaaaccg catcgtgtca 120 tgtgcctgtt gtagggtcgg gtcttttttt catgagtacg tgttctgcgc tatcatactg 180 gaaatttccc cccacttact gataagccct gtcagttggg taaggacagc gttaagctcc 240 tgagacattt tttgagttgt tatctgcccc ccgactcata agatcgggta ttccgcggtg 300 g 301 <210> 35 <211> 297 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <400> 35 atatccctaa tgcttttcct taaaataaat accacggaag gatactggcc acctagccaa 60 atttagaaag caatgaacat ccggtttatt cctgaaaacg attactccgg cgcacgttgt 120 tctggcgtta cctgagccag caaacgatat aatggggtgg tgacccgcat accggtcatt 180 ggcatcccat ccacaccgga gggagtaaaa ctcattaggc cataggtaat atcattaaga 240 cgctctaata aatgagggtg gggggcccaa actaccactc cagtatgtat tgagtca 297 <210> 36 <211> 291 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <400> 36 cccatgggcg caatttgttg cgcagcgttt acccgaccat cgcgtttatg agctgtaatt 60 catggggggt aaaaacgggc gtgacgaccc caacggaaga taaggccggg cttaaacagg 120 agattattgc taatgcgcag 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gtaattttaa gcagatattc 10740 tctttacata gcgtagtaga attatgtaaa tccagcctaa aagttatcat gctatctctt 10800 atctttgcct ttttctttta ttattatgcc agtacttttc gggcgctacc gtactgtggg 10860 ttagcctgtg gcgtgcttgt ggtttcttct ttaataaaat ggttatgggt aggggtgatg 10920 gttttttata tcgtcgttgg catactggac tattcttttc aatattataa gattagaaaa 10980 gctatctaaa aatgagtaaa gatgacgtaa aacaggagca taaagatctg gagggcgacc 11040 ctcaaatgaa gacgcggcgt cggaaatgca gagtgaaata caaagtggga gtttagctca 11100 atctgttaaa caatctgttg cggtagtgcg taatccaacg catattgcgg tttgtcttgg 11160 ctatcatccc accgatatgc caataccacg cgtcctggaa aaaggcagtg atgctcaagc 11220 taactatatt gttaacatcg ctgaacgcaa ctgcatcccc gttgttgaaa atgttgagct 11280 ggcccgctca ttattttttg aagtggaacg cggagataaa attcctgaaa cgttatttga 11340 acccgttgca gccttgttac gtatggtgat gaagatagat tatgcgcatt ctaccgaaac 11400 accataaatg cttttggtat gcttcttcag gccactgcga aggttaagag ggtaatagcg 11460 tatagagcag tgcttgacga taaaggtgag agactgaaaa taatcgcttt tagcctggca 11520 caagcaccag atagcgtatt ataaaattaa acaagataat ggattggtgc gtctgaatgg 11580 actcgaacca ctcgaccccc accatgtcaa ggtggtgctc taaccaactg agctatgaac 11640 ggcaacgttg taggtgacaa cggggacgaa tattagcgtc acaaccgcaa tgaggcaaga 11700 gggaaatcgc aattttcttc ctgaaatcac ctgattgcgg tggaaatatg caacatgtcg 11760 agaaaatagc cgccatgcga cggctatcgt cgtattatcg gagcgcgctg caaaatgatg 11820 gcggacggct gacgttgtag atagcgcatc cgtagcatca ttaacaccgc cgccgaggtc 11880 aggccgatga tgaaccccat ccagaagcct gccggtccca tacgatccac caccaaatcc 11940 gttaacgcca ggatataacc gctgggtaaa cctaacaccc agtaggcggt aaaggtgata 12000 aaaaagatgg aacgcgtatc tttataaccg cgcagaatac cgctgccgat aacctgtata 12060 gagtcggaaa tctggtaaac cgcagcgagc agcattaatt gcggcaagcg ccacgacctc 12120 agggttgtca ttgtagagca aagcaatatg cttacgcaga gtaacggtaa aaatagcggt 12180 aaccacagcc atacaaatgc cgacgcctaa accggtacgc gctgcgtttg cgcatccagc 12240 gttgagccct ggcccagacc gataacccac tcgaatcgtt accgccgcag ccagcgacat 12300 cggcagtacg aacatcagcg agctaaagtt aagcgcaatc tgatgaccgg cgacatccac 12360 aatacctaat ggcgaaacca gcagcgcaac gaccgcaaat aacgtcactt caaagaacag 12420 ccagcgcaat cggcaacccc agttgaatca ggcgcttcat gacgacgcta tcgggtttgc 12480 caaagccttt ttcattacga atatcacgca ttgaacgcgc gtgtttaatg taagaaagca 12540 tggcgataaa catcacccaa tagaccgccg cagtcgcaac gccgcagccg ataccgccga 12600 gttccggcat accaaaatgg ccatagataa aaatatagtt caccggaata ttcaccagca 12660 ggcccaaaaa tcccatcacc atacccggtt tggttttggc cagaccttcg cactggtttc 12720 gcgctacctg aaagaaaagg tatcctgcgc cccacagcag cgcgcgaaga taacccacgg 12780 ctttatcggc cagcgccgga tcaatattat gcatagagcg gataatgtat ccggcattcc 12840 acaggacgat catcaccagc acggagacaa agcccgccag ccagaaccct tgtcgaacct 12900 gatgcgcgat acgctcacga cggccggagc cattgagttg cgcaatcaca ggcgtcaagg 12960 ccagcagtaa gccgtgacca aacaaaatgg cgggaagcag atagaggtgc cgatagcgac 13020 ggcagccatg tccgtagcgc tatagcctcc cgccatgacg gtatcgacga atccattgcg 13080 gtctatacca cttgcgcaag gatcaccggt atctgaacgc taataactga cgcgcttcac 13140 tggtatactt ctgcacgtat tcacctttta ttttgttgtt atatgaaaga ctaaaaagcc 13200 gccgaagtgg cagccaaaag aaatagcagg ggaaatttca gtctattgta gcggggtatt 13260 actatttctc cagtgaaaaa acagttgtta acggcgcatt gctggcaagc tgtttttcca 13320 cctgctattg tgctgaacag ttctgctttt atttatttca ggagttgaag atatgtttac 13380 ggggatcgta cagggtaccg cgaaactggt atcgata 13417 <210> 38 <211> 5746 <212> DNA <213> VGC II cluster C <400> 38 ggatcctttt tctttaatgc tgctaacgtt tcttgcaaaa tgcgttgatg agattcatcc 60 agtacaccac tgataacaaa agagcgncgc attggcnwam mwtkrnnmrn nscnnnacta 120 aaccgttctc tattatcgca gaaataatat catccccctg agactgatga gagtgactaa 180 tctgccagtg caataacccg ggaatatctg caagtaatgg ttgaaccttg cgccattgct 240 gatccatttg tatatcatca tgaattaaca cgctccccgg cccttcgctg gatacttcag 300 catnssggta acccattttt atcaaaacat cctgcacttc tcgtaccaat aagtcatcac 360 agattacacc atcccgatac atgacccccc atgattcgag agtcgctctc accttttgca 420 tctgttcgct tgacgagcaa taaccggaca actgcaggct gccatcttct ttccattgcg 480 cccgcacata atgaatattg cttttgtcta ataaaaactt aacccgcaaa ggtaagtcat 540 ttaccgtttc aggctgacca ctaatactta acaggacacc cattccaccg atgaaaatca 600 agaatacgcc agccaaccac cagtaccctg atctggaaac gggtatttga taatcagcaa 660 gttcacaatc ctgtttacca aacgcgatas scactcccgc aacctgcaaa accccactgg 720 atggtagcgg cttatttgga ttaaatctgc ggccattaac tctaactctg gctttcccgg 780 catcaacaaa taaactatct gcctgttctc tcagaataat tttttcattt atagccagcg 840 aatacaaata tcgcatccct tctcccccag tgacaggtta ccttcattca gccatacttc 900 ccggccttgt aaaacgtgac ctaaaaaacg tattttccag gaactctttg gattaaccat 960 gagatatgcc attatttact actgaggctt taatcaaaaa aagcctgatt acactatgta 1020 cttgagtcgt atcattgcga aacaaatgac ctacaacagg aatatcgccc aataaaggga 1080 ttttgttttg cgagtggatt tgtttacctt gtttaaaccc tcccagcaat nagactttgc 1140 ccggccaata atgtggcttg cgaancratt tcagaatttt gcacttcggg cagcgggtct 1200 gtntygcytt kgnstatcac tttgttgtcc atcctgaant attaagatta agcattattt 1260 tttgcgtgcc attgtcattt aacaagcgag gtgtaacgcg wnaacaaaga acccgtagtg 1320 atggattcaa gtttagccac tttttctccc tgcagtttgg tatagaaagt aatattttta 1380 tccagcacag cctggatatt atttaaagtc accacagatg gctgggaaag tacataagcc 1440 tgagagcttt tttccagggc attcagacgc accataaagt ttgaggtatc gctgattacc 1500 gttgannaac cactagcacc accgtcattc aaacctgtat tgaacgcaat tttcttgcca 1560 cccagcgaca ctgccgttcc ccagtcgatg cctaactggt taatatctcc agcattaaca 1620 tcgataattt tcaccgaaat ctctatcatc tgctggcgtt gatctaattc tgtgatgagt 1680 ttccgatacn nngccatatt ggnnncataa tcacgaacga tcactgcatt ctggcgtngg 1740 gtcggcagca aacatnggca atgcctgtgt agcgggtgaa ccattgttcn tcgatgacgt 1800 cgggacgctg gttttactca tctcacgcaa tacactaacg acccctggnn aaccacgacg 1860 gactgatcgc gatattggta ctgggtatcc atcgcagtgg catacttaag cgtgtatata 1920 cttacactca ccgcactgtc ttttcgtttg attaacgcat tatccagcac tgaagctaat 1980 tgactaatac gagtcaggca gctgggaaca ccgctcacct ccacagcttt ggtaccggta 2040 atttctttaa cctcgcatcc cggtgatgaa aggatattct ggctgcgtaa gtaatgaatg 2100 aaccgtccag tagataaaat attgaaagtg ataacctgat gttttaataa cgatgcagga 2160 tatacatata acatgctgcc atcaaaccag gtaagcaaat catattgtgc tgccaggtta 2220 ttcaaaatat cgaccggtgg tccaggcgga atttttccac taaatgtagc tgttatcaat 2280 gggctaatag taatagccgt atcatagttc tctgagagca gatgtnaaaa cctctgctaa 2340 tggcatttgt ctggcataaa gggtgaagtc attacctttc catgataact catcactctt 2400 tgctgtattg agtataaata gtaaaattaa gattaaacgt ttatttacta ccattttata 2460 ccccacccga ataaagttta tggtgattgc gtattacatt ttttnaaaat gcaagttaaa 2520 gccaggtgtt tttctatctc aatagcaata agctcagagc tactacttgt ggtataataa 2580 ccgtttaacc atcccccatc cgctgtgagc tgtatagcat aatcatggac gtccgggtgt 2640 gcgcaarcrg tagtgtcamm taggcaagac aaggcttagg taagctttcc aggtcattta 2700 agaacaaaga aatagaaaat gcttctgaga aaatttctyc ybhnnnnnnn nnnnnnnnnn 2760 nnnnnnnnca tcaatagtca ttatccagga tsskmtwwym nyykssscys wkatmyyswr 2820 wwttaatgga atgcctttta aaactgccag catgaatccc tcctcagaca taaatgggag 2880 tttctatcaa attcgctcac aaccacatcc gtaaaaagcc tgattcacat ttatttcgac 2940 tatactcttc ttgtacaata tcaggatgct gtctacatat accttgtcac aggcgattct 3000 atcattcgga ttttccgata aattnmmcaa ttacattttc agcattgaca taaaaactta 3060 caatttgnaa aattatttat taaataaact gttacgatgt ttttacatcg ccatcttatt 3120 aaaaagtaat tgtagtcatc gactnggtta tatatgaaga aatttatctt cctaatgata 3180 acaccatcga ttaatcwwct gatgaaacta tatgtactgc gatagtgatc aagtgccaaa 3240 gattttgcaa caggcaactg gagggaagca ttatgaattt sstcaatctc aagaatacss 3300 ysyrnnnnnn tctttagtaa tcaggctaac ttttttattt ttattaacaa caataattwt 3360 ttggctgcta tctgtgctta ccgcagctta tatatcaatg gttcrgaaac ggcagcatat 3420 aatagaggat ttatccgttc tatccgagat gaatattgta ctaagcaatc aacggtttga 3480 agaagctgaa cgtgacgcta aaaatttaat gtatcaatgc tcattagcga ctgagattca 3540 tcataacgat attttccctg aggtgagccg gcatctatct gtcggtcctt caaattgcac 3600 mgccgacgct naacggagag aagcaccgtc tctttctgca gtcctctgat atcgatgaaa 3660 atagctttcg tcgcgatagt tttattctta atcataaaaa tgagatttcg ttattatcta 3720 ctgataaccc ttcagattat tcaactctac agcctttaac gcgaaaaagc tttcctttat 3780 acccaaccca tgccgggttt tactggagtg aaccagaata cataaacggc aaaggatggc 3840 aacgcttccg ttgcggttgc cgatcaggca aggcgtattt tttgaggtga cggttaaact 3900 tcccgatctc attactaaga gccacctgcc attagatgat agtattcgag tatggctgga 3960 tcaaaacaac cacttattgc cgttttcata catcccggca aaaaatacgt acacagttag 4020 aaaatgtaac gctgcatgat ggatggcagc aaattcccgg atttctgata ttacgcacaa 4080 ccttgcatgg ccccggatgg agtctggtta cgctgtaccc atacggtaat ctacataatc 4140 gcatcttaaa aattatcctt caacaaatcc cctttacatt aacagcattg gtgttgatga 4200 cgtcggcttt ttgctggtta ctacatcgct cactggccaa accgttatgg cgttttgtcg 4260 atgtcattaa taaaaccgca actgcaccgc tgagcacacg tttaccagca caacgactgg 4320 atgaattaga tagtattgcc ggtgctttta accaactgct tgatactcta caagtccaat 4380 acgacaatct ggaaaacaaa gtcgcagacg cacccaggcg ctaaatgaag caaaaaaacg 4440 cgctgagcna gctaacaaac gtaaaagcat tcatcttacg gtaataagtc atgagttacg 4500 tactccgatg aatggcgtac tcggtgcaat tgaattatta caaaccaccc ctttaaacat 4560 agagcaacaa ggattagctg ataccgccag aaattgtaca ctgtctttgt tagctattat 4620 taataatctg ctggattttt cacgcatcga gtctggtcat ttcacattac atatggaaga 4680 aacagcgtta ctgccgttac tggaccaggc aatgcaaacc atccaggggc cagcgcnaaa 4740 gcaaaaaact gtcattacgt acttttgtcg gtcaacatgt ccctctctat tttcataccg 4800 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cathayannt tacaaaacca gtgacattgg ctaccttagc tcgctacatc agtattgccg 5700 cagaatacca acttttacga aatatagagc tacaggagca ggatcc 5746

Claims (63)

  1. 특정 환경에 대한 감소된 적응력을 가지는 미생물을 동정(identification)하는 방법으로 얻어진 미생물로서,
    상기 미생물은 보데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 보툴리넘(Clostridium botulinum), 에스쉐리치아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori), 크렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 spp.(Listeria spp.), 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 spp.(Pseudomonas spp.), 살모넬라 spp.(Salmonella spp.), 시겔라 spp.(Shigella spp.), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 비브리오 spp.(Vibrio spp.), 및 예시니아 페스티스(Yersinia pestis)로 이루어진 군으로부터 선택된 세균; 또는
    아스퍼질러스 spp.(Aspergillus spp.), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)와 히스토플라스마 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum)로 이루어진 군으로부터 선택된 곰팡이이고,
    상기 방법은
    (1) 각각의 미생물이 독특한 표지(marker) 서열을 포함하는 핵산을 가진 유전자의 삽입 불활성화(insertional inactivation)에 의해 독립적으로 돌연변이되어 각각의 돌연변이가 상이한 표지 서열을 가지게 되는 다수의 미생물, 또는 상기 미생물의 클론(clones)을 제공하는 단계;
    (2) 단계(1)에 의해 생산된 각 돌연변이의 저장(stored) 표본을 각각 제공하고, 각개의 돌연변이로부터의 독특한 표지 서열을 포함하는 저장 핵산을 각각 제공하는 단계;
    (3) 단계(1)에 의해 생산된 다수의 돌연변이들을 상기 특정 환경에 도입하여 특정 환경에서 성장할 수 있는 그 미생물들이 상기 환경에서 성장하도록 하는 단계;
    (4) 상기 환경으로부터 미생물 또는 그들의 선택된 일부를 회수하고 그 회수된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계;
    (5) 단계(4)에서 분리된 핵산에 있는 모든 표지 서열과 단계(2)에서와 같이 저장된 각개의 돌연변이의 독특한 표지 서열을 비교하는 단계; 및
    (6) 단계(4)에서 분리된 어떠한 표지 서열도 가지고 있지 않는 개개의 돌연변이를 선별하는 단계
    를 포함하는 미생물.
  2. 하기 단계를 포함하는 방법으로 동정된 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 미생물로서,
    상기 미생물은 보데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 보툴리넘(Clostridium botulinum), 에스쉐리치아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori), 크렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 spp.(Listeria spp.), 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 spp.(Pseudomonas spp.), 살모넬라 spp.(Salmonella spp.), 시겔라 spp.(Shigella spp.), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 비브리오 spp.(Vibrio spp.), 및 예시니아 페스티스(Yersinia pestis)로 이루어진 군으로부터 선택된 세균; 또는
    아스퍼질러스 spp.(Aspergillus spp.), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)와 히스토플라스마 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum)로 이루어진 군으로부터 선택된 곰팡이이고,
    상기 방법은
    (1) 각각의 미생물이 독특한 표지(marker) 서열을 포함하는 핵산을 가진 유전자의 삽입 불활성화(insertional inactivation)에 의해 독립적으로 돌연변이되어 각각의 돌연변이가 상이한 표지 서열을 가지게 되는 다수의 미생물, 또는 상기 미생물의 클론(clones)을 제공하는 단계;
    (2) 단계(1)에 의해 생산된 각 돌연변이의 저장(stored) 표본을 각각 제공하고, 각개의 돌연변이로부터의 독특한 표지 서열을 포함하는 저장 핵산을 각각 제공하는 단계;
    (3) 단계(1)에 의해 생산된 다수의 돌연변이들을 상기 특정 환경에 도입하여 특정 환경에서 성장할 수 있는 그 미생물들이 상기 환경에서 성장하도록 하는 단계;
    (4) 상기 환경으로부터 미생물 또는 그들의 선택된 일부를 회수하고 그 회수된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계;
    (5) 단계(4)에서 분리된 핵산에 있는 모든 표지 서열과 단계(2)에서와 같이 저장된 각개의 돌연변이의 독특한 표지 서열을 비교하는 단계;
    (6) 단계(4)에서 분리된 어떠한 표지 서열도 가지고 있지 않는 개개의 돌연변이를 선별하는 단계;
    (7) 단계(6)에서 선별된 개개의 돌연변이로부터 삽입으로 불활성화된 유전자를 분리하는 단계; 및
    (8) 야생형 미생물로부터 단계(7)에서 분리된 삽입으로 불활성화된 유전자를 프로브(probe)로 사용하여 상응하는 야생형 유전자를 분리하는 단계
    를 포함하는 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 특정 환경이 동물인 백신에 사용하는 미생물.
  4. 제1항 또는 제2항에 따르는 미생물 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 동물에 대한 미생물의 적응력을 감소시키는 백신.
  5. 미생물을 특정 환경에 적응시키도록 하는 유전자를 동정하는 방법으로 얻어지는 유전자로서,
    상기 미생물은
    보데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 보툴리넘(Clostridium botulinum), 에스쉐리치아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori), 크렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 spp.(Listeria spp.), 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 spp.(Pseudomonas spp.), 살모넬라 spp.(Salmonella spp.), 시겔라 spp.(Shigella spp.), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 비브리오 spp.(Vibrio spp.), 및 예시니아 페스티스(Yersinia pestis)로 이루어진 군으로부터 선택된 세균; 또는
    아스퍼질러스 spp.(Aspergillus spp.), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)와 히스토플라스마 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum)로 이루어진 군으로부터 선택된 곰팡이이고,
    상기 방법은
    (1) 각각의 미생물이 독특한 표지(marker) 서열을 포함하는 핵산을 가진 유전자의 삽입 불활성화(insertional inactivation)에 의해 독립적으로 돌연변이되어 각각의 돌연변이가 상이한 표지 서열을 가지게 되는 다수의 미생물, 또는 상기 미생물의 클론(clones)을 제공하는 단계;
    (2) 단계(1)에 의해 생산된 각 돌연변이의 저장(stored) 표본을 각각 제공하고, 각개의 돌연변이로부터의 독특한 표지 서열을 포함하는 저장 핵산을 각각 제공하는 단계;
    (3) 단계(1)에 의해 생산된 다수의 돌연변이들을 상기 특정 환경에 도입하여 특정 환경에서 성장할 수 있는 그 미생물들이 상기 환경에서 성장하도록 하는 단계;
    (4) 상기 환경으로부터 미생물 또는 그들의 선택된 일부를 회수하고 그 회수된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계;
    (5) 단계(4)에서 분리된 핵산에 있는 모든 표지 서열과 단계(2)에서와 같이 저장된 각개의 돌연변이의 독특한 표지 서열을 비교하는 단계;
    (6) 단계(4)에서 분리된 어떠한 표지 서열도 가지고 있지 않는 개개의 돌연변이를 선별하는 단계; 및
    (7) 단계(6)에서 선별된 개개의 돌연변이로부터 삽입으로 불활성화된 유전자를 분리하는 단계; 및 선택적으로
    (8) 야생형 미생물로부터 단계(7)에서 분리된 삽입으로 불활성화된 유전자를 프로브(probe)로 사용하여 상응하는 야생형 유전자를 분리하는 단계
    를 포함하는 유전자.
  6. 살모넬라 게놈(genome)에서 분리되고, 엄격한(stringent) 조건하에서 도 5에 기재된 살모넬라 서열중 어느 하나에 혼성화되는 DNA.
  7. 살모넬라 게놈에서 분리되고, 엄격한(stringent) 조건하에서 SEQ ID No 8 내지 11, 14 내지 36 및 38로서 동정된 서열중 어느 하나에 혼성화되는 DNA.
  8. (1) SEQ ID No 8 내지 11, 14 내지 36중 어느 하나로서 동정된 서열을 포함하는 독성 유전자 또는 (2) SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 독성 유전자, 또는 50개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 (1) 또는 (2)의 일부, 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가진 (1) 또는 (2)의 변형체.
  9. 제8항에 있어서,
    SEQ ID No 30으로 동정된 서열 또는 그의 변형체를 포함하는 독성 유전자.
  10. 제5항, 제8항, 또는 제9항에 따르는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  11. SEQ ID No 8 내지 36으로 동정된 서열 또는 도 5에 도시된 살모넬라 서열 중 하나를 포함하는 유전자 또는 SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 유전자, 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가진 이의 변형체, 또는 이것으로 코딩되는 폴리펩티드의 기능을 저해하는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 특정 환경에 적응하는 미생물의 능력을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법.
  12. 제11항의 방법에 의해 동정 가능한 화합물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 특정 환경이 숙주 유기체인 화합물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 숙주 유기체가 식물인 화합물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 숙주 유기체가 동물인 화합물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 상기 숙주 유기체의 미생물 감염을 치료하기 위한 약제.
  17. SEQ ID No 8 내지 36으로 동정된 서열 또는 도 5에 도시된 살모넬라 서열 중 하나를 포함하는 유전자, 또는 SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 유전자, 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가진 이의 변형체, 또는 이의 핵산 산물과 선택적으로 상호 작용하여 그 기능을 실질적으로 저해하는 안티센스 핵산 또는 그 유도체 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드인 분자.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    의약으로서 사용되는 분자.
  20. 제13항 또는 제17항에 따른 유효량의 분자 또는 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 유전자가 상기 미생물 또는 그 미생물의 근친종(close relative)에 존재하는, 미생물에 감염되기 쉬운 또는 감염된 인간을 제외한 숙주를 치료하는 방법.
  21. 제13항 또는 제17항에 따른 분자 또는 화합물 및 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 미생물에 의한 감염의 치료 또는 예방용 제약학적 조성물.
  22. 정상적인 살모넬라 세균이 SEQ ID No 8 내지 12, 14 내지 36중 어느 하나로 동정된 서열을 포함하는 유전자 또는 SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 유전자 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가진 이의 변형체 또는 엄격한 조건하에서 도 5에 도시된 살모넬라 서열중 하나와 혼성화되는 살모넬라 게놈의 유전자를 포함하는 경우,
    상기 유전자가 존재하지 않거나 불활성화되어 있는 돌연변이 살모넬라 세균.
  23. 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) DNA 또는 그 일부, 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가진 상기 DNA의 변형체로서, 상기 VGC2 DNA는 ydhE 및 pykF 유전자 사이에 위치한 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 DNA로 정의되며, 그 일부는 50개 이상의 뉴클레오티드로 이루어짐을 특징으로 하는 VGC2 DNA.
  24. 살모넬라의 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) DNA 유전자의 프로모터로서, 상기 VGC2 DNA는 ydhE 및 pykF 유전자 사이에 위치한 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 DNA 또는 다른 살모넬라의 동등한 DNA로 정의됨을 특징으로 하는 프로모터.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 DNA의 변형체가 살모넬라 아버딘(Salmonella aberdeen), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 쿠바나(Salmonella cubana) 및 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) 중 어느 하나인 DNA.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 그 일부가 프로모터인 DNA.
  27. 정상적인 살모넬라 세균이 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) 유전자와 동일하거나, 또는 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) 유전자와 85% 이상의 서열 동일성을 가진 유전자를 정상적으로 포함하는 경우, 상기 유전자가 돌연변이되거나 존재하지 않는 돌연변이 살모넬라 세균으로서,
    독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) DNA는 ydhE 및 pykF 유전자 사이에 위치한 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 DNA로 정의됨을 특징으로 하는
    돌연변이 살모넬라 세균.
  28. 제27항에 있어서,
    독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) 유전자와 동일하거나, 또는 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) 유전자와 85% 이상의 서열 동일성을 가진 유전자가 코딩 영역의 일부의 결실에 의해 돌연변이되는 돌연변이 살모넬라 세균.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 세균이 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 아버딘(Salmonella aberdeen), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 쿠바나(Salmonella cubana) 및 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)중 어느 하나인 살모넬라 세균인 돌연변이 살모넬라 세균.
  30. 제27항에 따르는 세균의 유전자를 돌연변이시키는 단계; 및
    상기 돌연변이 세균을 분리시키는 단계
    를 포함하는 세균의 생산 방법.
  31. 제27항 또는 제28항에 따르는 돌연변이 살모넬라 세균을 포함하는 백신으로서,
    정상적인 살모넬라 세균이 SEQ ID No 8 내지 36에서 동정된 서열 또는 도 5에 도시된 살모넬라 서열 중 하나를 포함하는 유전자, 또는 SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 유전자, 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가진 이의 변형체를 정상적으로 포함하는 경우, 상기 돌연변이 살모넬라 세균이 유전자가 돌연변이 살모넬라 세균에서 존재하지 않거나 불활성화되는 돌연변이임을 특징으로 하는 백신.
  32. 제31항에 따르는 돌연변이 살모넬라 세균 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는, 그 세균에 의한 감염을 치료하거나 예방하기 위한 제약학적 조성물.
  33. 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) DNA 유전자 또는 50개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 그의 일부로 코딩되거나, 또는 상기 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) DNA에 85% 이상의 서열 동일성을 가진 상기 DNA의 변형체에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서,
    독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) DNA는 ydhE 및 pykF 유전자 사이에 위치한 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 DNA로 정의됨을 특징으로 하는
    폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 변형체가 살모넬라 아버딘(Salmonella aberdeen), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 쿠바나(Salmonella cubana) 및 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)중 어느 하나의 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드.
  35. 숙주에서 감염 또는 질병을 일으키는 세균의 능력을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    제23항에 따른 유전자 또는 제33항에 따른 폴리펩티드의 기능을 저해하는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제35항의 방법에 의해 동정되는 화합물.
  37. 제23항에 정의된 DNA 유전자 또는 그의 핵산 산물과 선택적으로 상호 작용하여 그 기능을 실질적으로 저해하는 안티센스 핵산 또는 핵산 유도체 분자.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    약제에 사용하는 화합물 또는 분자.
  39. 제22항, 제27항, 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    다른 병원체로부터 얻어진 항원성 에피토프를 코딩하는 DNA를 추가로 포함하는 돌연변이 세균.
  40. 돌연변이 미생물의 생산 방법으로, 상기 방법은
    (a) 다음의 단계로 미생물을 특정 환경에 적응하도록 하는 유전자를 동정하는 단계;
    (1) 각각의 미생물이 독특한 표지(marker) 서열을 포함하는 핵산을 가진 유전자의 삽입 불활성화(insertional inactivation)에 의해 독립적으로 돌연변이되어 각각의 돌연변이가 상이한 표지 서열을 가지게 되는 다수의 미생물, 또는 상기 미생물의 클론(clones)을 제공하는 단계;
    (2) 단계(1)에 의해 생산된 각 돌연변이의 저장(stored) 표본을 각각 제공하고, 각개의 돌연변이로부터의 독특한 표지 서열을 포함하는 저장 핵산을 각각 제공하는 단계;
    (3) 단계(1)에 의해 생산된 다수의 돌연변이들을 상기 특정 환경에 도입하여 특정 환경에서 성장할 수 있는 그 미생물들이 상기 환경에서 성장하도록 하는 단계;
    (4) 상기 환경으로부터 미생물 또는 그들의 선택된 일부를 회수하고 그 회수된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계;
    (5) 단계(4)에서 분리된 핵산에 있는 모든 표지 서열과 단계(2)에서와 같이 저장된 각개의 돌연변이의 독특한 표지 서열을 비교하는 단계;
    (6) 단계(4)에서 분리된 어떠한 표지 서열도 가지고 있지 않는 개개의 돌연변이를 선별하는 단계; 및
    (7) 단계(6)에서 선별된 개개의 돌연변이로부터 삽입으로 불활성화된 유전자를 분리하는 단계; 및
    (b) 돌연변이를 해당 미생물의 야생형 유전자에 특이적으로 도입하여 상기 돌연변이 미생물을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 유전자 내의 돌연변이가 결실 또는 변좌 돌연변이 또는 실질적으로 복귀가 불가능한 임의의 다른 돌연변이인 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 해당 야생형 유전자가 엄격한 조건하에서 단계 (7)에서 얻어진 삽입으로 불활성화된 유전자 또는 그의 일부와 혼성화되는 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물이 병원성 미생물이고, 그 미생물이 특정 환경에 적응하도록 하는 유전자가 독성 유전자인 방법.
  44. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물이 동물에 대해 병원성인 방법.
  45. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물이 식물에 대해 병원성인 방법.
  46. 제44항에 있어서,
    상기 미생물이 보데텔라 spp.(Bordetella spp.) 특히 B. 페르투시스(B. pertussis), 캠필로박터 spp.(Campylobacter spp.) 특히 C. 제주니(C. jejuni), 클로스트리디움 spp.(Clostridium spp.) 특히 C. 보툴리넘(C. botulinum), 엔테로코커스 spp.(Enterococcus spp.) 특히 E. 페칼리스( E. faecalis), 에스쉐리치아 spp.(Escherichia spp.) 특히 E. 콜라이(E. coli), 헤모필러스 spp.(Haemophilus spp.) 특히 H. 두크레이(H. ducreyi)와 H. 인푸루엔자에(H. influenzae), 헬리코박터 spp.(Helicobacter spp.) 특히 H. 피로리(H. pylori), 크렙시엘라 spp.(Klebsiella spp.) 특히 K. 뉴모니아(K. pneumoniae), 레지오넬라 spp.(Legionella spp.) 특히 L. 뉴모필라(L. pneumophila), 리스테리아 spp.(Listeria spp.), 특히 L. 모노사이토제네스(L.monocytogenes), 마이코박테리움 spp.(Mycobacterium spp.) 특히 M. 스메그마티스(M. smegmatis)와 M. 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 나이세리아 spp.(Neisseria spp.), 특히 N. 고노로레아에( N. gonorrhoeae)와 N. 메닌지티디스(N. meningitidis), 슈도모나스 spp.(Pseudomonas spp.) 특히 Ps. 아에루지노사(Ps. aeruginosa), 살모넬라 spp.(Salmonella spp.), 시겔라 spp.(Shigella spp.), 스타피로코커스 spp.(Staphylococcus spp.) 특히 S. 아우레우스(S.aureus), 스트렙토코커스 spp.(Streptococcus spp.) 특히 S. 피오제네스(S. pyogenes)와 뉴모니아에(pneumoniae), 비브리오 spp.(Vibrio spp.), 예시니아 spp.(Yersinia spp.) 특히 Y. 페스티스(Y. pestis), 아스퍼질러스 spp.(Aspergillus spp.) 특히 A. 푸미가투스(A. fumigatus), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐레텀(Histoplasma capsulatum) 및 톡소플라즈마(toxoplasma)중 어느 하나인 방법.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 미생물이 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens); 어비니아 아밀로바라(Erwinia amylovara); 슈도모나스 솔라나세아럼(Pseudomonas solanacearum); 리조비움 레구미노사럼(Rhizobium leguminosarum); 잔소모나스 캄페스트리스 p.v. 사이트리(Xanthomonas campestris p.v. citri); 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea); 푸자리움 spp.(Fusarium spp.); 에리사이페 spp.(Erisyphe spp.); 콜레토트리첨 글로에오스포리오데스(Colletotrichum gloeosporiodes); 가에우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis); 글로무스 spp.(Glomus spp.);, 락카리아 spp.(Laccaria spp.); 렙토스페리아 매큘란스(Leptosphaeria maculans); 포마 트라쉐이필라(Phoma tracheiphila): 파이토프쏘라 spp.(Phytophthora spp.); 피레노포라 테레스(Pyrenophora teres); 버티실리움 앨보아트럼(Verticillium alboatrum)과 V. 달리아에(V. dahliae); 및 마이코스페렐라 무시콜라(Mycosphaerella musicola)와 M. 피지엔시스(M. fijiensis) 중 어느 하나인 방법.
  48. 제40항에 있어서,
    상기 단계 (a)(1)에서 복수의 미생물이 살모넬라이고, 단계(b)에서 얻어진 돌연변이 미생물이 돌연변이 살모넬라인 방법.
  49. 다른 병원체에 대해 백신으로 작용할 수 있는 돌연변이 미생물의 제조방법으로,
    상기 방법은 상기 다른 병원체로부터 얻어진 항원성 에피토프를 발현하는 제44항에 따르는 돌연변이 미생물의 제조 단계를 포함하는 방법.
  50. 제44항에 따르는 돌연변이 미생물의 제조 단계; 및
    면역원성 제제 내로 제조하는 단계
    를 포함하는 백신의 제조 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 면역원성 제제가 아쥬번트를 포함하는 제조 방법.
  52. 돌연변이 미생물의 제약학적 제제의 제조방법으로,
    상기 제조방법은 제44항에 따르는 돌연변이 미생물과 하나 이상의 제약학적으로 수용가능한 담체를 결합시키는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  53. 특정 환경에 대한 미생물의 적응력을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법으로,
    (a) 제40항 (a)의 일부에 기재된 방법에 의해 특정 환경에 미생물을 적응시키는 유전자를 동정하는 단계; 또는 SEQ ID No 8 내지 36으로 동정된 유전자 또는 도 5에 도시된 살모넬라 서열 중 하나를 포함하는 유전자 또는 SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 유전자 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가진 이의 변형체를 제공하는 단계; 및
    (b) 유전자 또는 미생물의 해당 야생형 유전자의 기능을 저해하는 화합물 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 저해하는 화합물을 선별하는 단계
    를 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 해당 야생형 유전자를 엄격한 조건하에서 단계 (7)에서 얻어지는 분리된 삽입으로 불활성화된 유전자와 혼성화시키는 방법.
  55. 동물에 대해 병원성인 미생물의 특정 환경에 대한 적응력을 감소시키는 화합물을 포함하는 제약학적 조성물의 제조방법으로,
    (a) 제53항 또는 제54항에 따르는 방법을 이용하여 화합물을 동정하는 단계; 및
    (b) 제약학적으로 수용가능한 담체와 결합하는 단계
    를 포함하는 방법.
  56. 동물에 대해 병원성인 미생물에 의한 감염을 예방하고 완화시키는 약제의 제조방법으로,
    제53항 또는 제54항에 따르는 방법으로 화합물을 동정하는 단계; 및
    상기 약제를 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  57. 숙주에서 미생물 감염을 예방하는 약제로서,
    세균이 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) 유전자와 동일하거나 동등한 유전자를 정상적으로 포함하는 경우, 상기 유전자가 돌연변이되거나 존재하지 않는 돌연변이 세균; 또는
    세균이 SEQ ID No 8 내지 36으로 동정된 서열, 도 5에 도시된 살모넬라 서열을 포함하는 독성 유전자, 또는 SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 독성 유전자 또는 그의 균등물을 정상적으로 포함하는 경우, 상기 유전자가 돌연변이되거나 존재하지 않는 돌연변이 세균
    을 포함하는 약제.
  58. 병원체에 대해 숙주를 백신화하는 약제로서,
    세균이 독성 유전자 클러스터 2 (VGC2: virulence genes cluster 2) 유전자와 동일하거나 동등한 유전자를 정상적으로 포함하는 경우, 상기 유전자가 돌연변이되거나 존재하지 않는 돌연변이 세균; 또는
    세균이 SEQ ID No 8 내지 36으로 동정된 서열, 도 5에 도시된 살모넬라 서열중 하나를 포함하는 독성 유전자, 또는 SEQ ID No 37 또는 38에 함유된 독성 유전자 또는 그의 균등물을 정상적으로 포함하는 경우, 상기 유전자가 돌연변이되거나 존재하지 않는 돌연변이 세균을 포함하며,
    상기 돌연변이 세균이 상기 다른 병원체로 부터 얻어진 항원성 에피토프를 코딩하는 DNA를 추가로 포함하는
    약제.
  59. 제57항에 있어서,
    상기 유전자가 코딩 영역의 일부의 결실 또는 삽입 불활성화에 의해 돌연변이되는 약제.
  60. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    상기 세균이 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 아버딘(Salmonella aberdeen), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 쿠바나(Salmonella cubana) 및 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)중 어느 하나인 살모넬라 세균인 약제.
  61. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    상기 숙주가 인간 환자인 약제.
  62. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    상기 숙주가 비인간 동물인 약제.
  63. 제57항에 있어서,
    상기 미생물의 감염이 살모넬라 spp.(Salmonella spp.) 세균에 의한 것인 약제.
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