JP2002524077A - 抗原キャリヤーとしての弱毒化サルモネラｓｐｉ２突然変異体 - Google Patents

抗原キャリヤーとしての弱毒化サルモネラｓｐｉ２突然変異体

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ワクチン、特に少なくとも１つのＳＰＩ２遺伝子座が不活性化され、該不活性化が該細胞の野生型と比較してビルレンスの減衰／減少を生じる、ＳＰＩ２遺伝子座を有する弱毒化グラム陰性細胞、および宿主へ抗原提示をする該弱毒化グラム陰性細胞であるキャリヤーに関し、該細胞は、前記抗原をコードする核酸配列を有する少なくとも１つの異種核酸分子を含み、該細胞は、前記核酸分子を発現させることが可能であるか、または前記核酸分子の標的細胞中での発現を引き起こすことが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 １９９６年、世界的に主に先進国の１７００万人以上のヒトが、種々の感染に
より死亡した。世界的な移動と結びついた抗体物質抵抗性は、汎流行感染の大発
生の高い危険性をもたらした。この可能性は非常に深刻に受け止めなくてはなら
ない、それというのも、ある病原性細菌にとって、利用可能な治療法の代替が、
１つの選択に減少してしまったからである。興味深いことに、病原性細菌は、多
くの慢性病で関連のあるファクターであることも発見されてきた。例えば胃ガン
は、世界的に２番目に多い共通のガンであり、かつ慢性的なヘリコバクターピロ
リ（Helicobacter pylori）感染と直接的に関連している。クラミジア肺炎菌（c
hlamydia pneimoniae）は、動脈硬化プラーク中で検出され、最近では、この細
菌がアルツハイマー病に冒されているヒトの脳の疾患部分から見つかった。多く
の自己免疫疾患、例えばリュウマチ様動脈炎は、細菌がもとになっていると考え
られている。ボレリア ブルドルフェリ（Borrelia burgdoferi）は、多くの他
の細菌に加えて、多くのヒトに影響を与える疾患を引き起こす有名な生物の例で
ある。最後に、ナノバクテリアは、クリスタリン沈着物を有する患者の慢性病の
腎臓中で同定された。その他の深刻な慢性病は、ウイルス病原菌によって引き起
こされ、最も臨床的に関連のあるものは、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス（肝臓ガ
ン）およびヒト乳頭腫ウイルス（子宮頸ガン）である。
【０００２】 細菌性病原菌の臨床的重要性の増大は、慢性病を処理するための手段としての
治療または予防のパラダイムに関する盛んな討論を引き起こした。一貫して、あ
る慢性病は、抗生物質の治療により首尾よく治療された。しかし、上記のように
、全ての微生物は、十分な抗生物質耐性を有する子孫を迅速に生じることが遺伝
学的に可能であり、このように普通の治療を効率的に妨げてしまう。最終的に、
薬剤にとって代わる優れたワクチンおよびコストの点を考慮して疾患予防が治療
よりもコストに集中しない、ワクチン注射の選択になお関心がある。従って、治
療的ワクチン注射のアプローチは、特にガンおよび慢性細菌疾患またはウイルス
性疾患の治療において関連する。
【０００３】 最も頻繁に実施されているアプローチは、不活性化病原体（死菌ワクチン）の
経口的デリバリーを使用するかまたは精製したエレメント（サブユニットワクチ
ン）の定義された混合物の非経口的注射を使用する。殆どの死菌ワクチンは効能
があるが、しかし、不活性化の手順が不完全でありかつワクチンが感染され得る
というリスクが問題として残されている。さらに、死菌ワクチンは、大抵は天然
に存在する全ての遺伝的変異体を補わない。サブユニットワクチンは、従来の死
菌ワクチンの殆どの欠点を取り除く。しかし、サブユニットワクチンは、技術的
に高度な抗原およびアジュバント調整物を必要とし、これはそのようなワクチン
を比較的高価なものにする。さらに、サブユニットワクチンは、選択的に非経口
的経路によって接種されるが、これは幅広い免疫応答を誘導するための最適な経
路ではない。特に、多くの病原体に対する保護の第一線である免疫系の粘膜系（
mucosal branch）は、非経口的免疫化により著しく軽視されている。
【０００４】 その他のワクチンの世代は、弱毒化生ワクチンによって代表され、これは、非
病原変異体に突然変異させた病原細菌またはウイルスをベースとしている。この
変異体を宿主により完全に消化される前に、インビボで限定された時間で繁殖さ
せる。その宿主組織中の限定有病率は、宿主免疫系を適切に引き起こすために十
分であり、保護免疫応答を樹立することができる。安全性の見地から、弱毒化細
菌性生ワクチンは、弱毒化ウイルス性生ワクチンよりも有利である。弱毒化細菌
性生ワクチンがワクチンを脅かす場合は、弱毒化細菌は一般に抗生物質による処
理により制御することができる。反対に、宿主細胞の複製装置を使用するウイル
ス性生ワクチンは殆ど制御することができない。細菌性生ワクチンは、通常経口
的に投与されかつ粘膜免疫系の優れた刺激物質としてはたらく。さらに、細菌性
生ワクチンは組織系統的に活性な免疫系、すなわち、液性および細胞系の良好な
刺激物質でもある。これらの優れた免疫刺激特性により、細菌性生ワクチン菌株
、例えばサルモネラは、異種病原体からの抗原を発現するための理想的なキャリ
ヤーである。このような二価（または多価）ワクチンは、２つの病原体に対する
保護を媒介する：キャリヤーに相同の病原体と同様にその保護抗原がキャリヤー
によって発現される病原体。異種抗原を発現する二価の細菌性ワクチンは一般に
使用されないにもかかわらず、一般に研究されている可能性のあるキャリヤーは
、カルメット・ゲランウシ型結核菌[Bacille Calmette Guerin(BCG)]、サルモネ
ラ種、コレラ菌（Vibrio cholerae）および大腸菌（Escherichia coli.）を含む
。
【０００５】 弱毒化工程において、突然変異は、有利には宿主中で病原体の生存を支持する
遺伝子を標的にしている。はじめに、化学的突然変異方式は、チフス菌の菌株Ｔ
Ｙ２に適用され、結果としてこれは、死菌同族体と対照的に、保護免疫性を媒介
することができる完全に弱毒化された病原体であると考えられている。しかし、
その後の大規模な臨床上の試験は、そのような菌株が腸チフスの予防には十分な
効能がないことを明らかにした。このような菌株は、種々の遺伝子中で突然変異
し、過剰に弱毒化する結果となり、反対に菌株の免疫抗原性のポテンシャルに作
用するようである。新規のチフスワクチン菌株は、遺伝学的に定義された突然変
異の導入によって発展した。これらの突然変異の殆どは、ネズミチフス菌におい
て樹立された。ネズミチフス菌を用いた感染は、マウス中で腸チフス様の症状を
引き起こし、かつマウスサルモネラ症は、ヒトチフスによく容認されているモデ
ルである。このようなワクチン菌株は、芳香族アミノ酸（例えば、aroA、aroCお
よびaroD）またはプリン（例えば、purA および purE）中の生合成において欠損
を引き起こすタンパク質中、アデニル酸シクラーゼ遺伝子（cya）またはcAMPレ
セプタータンパク質（crp）中で突然変異を有するか、または幾つかのビルレン
スファクター（phoPおよびphoQ）の調節に作用する突然変異を有する。しかし、
多くの弱毒化突然変異体が製造され、かつビルレンスにおけるその役割に関して
マウスモデルにおいて特性を決定された にもかかわらず、比較的少数のものしかヒトにおいてワクチンキャリヤーとして
評定されていない。その理由は、使用された突然変異体は、ビルレントがなお強
力すぎて宿主中で重大な副作用を引き起こすか、または免疫系への不適当な提示
をするために十分に免疫抗原性ではないからであり、これは宿主中で活性化のた
めにワクチン菌株の存続の限界レベルを必要とする。
【０００６】 最近の研究では、ビルレンスの弱毒化を引き起こす個々のサルモネラ遺伝子の
不活性化が、ワクチンキャリヤー菌株に対する免疫応答の特質に直接影響するこ
とが明らかになった。この発見から、それぞれが特異なプロフィールおよび免疫
応答を誘導するための個々の能力を有する、種々の異なる弱毒化サルモネラワク
チン菌株を製造する事が可能であるのではないかという結論を導くことができた
。このレパートリーを用いて、特異的な免疫学的要求によりワクチン菌株を製造
することが可能であろう。論理的結果として、弱毒化サルモネラワクチン菌株を
予防または治療的目的のための発展させるべきである。しかし、このようなサル
モネラワクチン菌株の代表的なレパートリーを得て、かつさらに効能のあるワク
チンに発展させる手段を決定すべきである。
【０００７】 サルモネラワクチン菌株を異種抗原のためのキャリヤーとして使用する場合に
は、付加的なパラメーターを考慮すべきである。従来は、異種抗原はサルモネラ
サイトゾル中で発現していた。マウスチフスモデルでは、異種抗原がサルモネラ
サイトゾル中で高いレベルで発現する場合には、封入体が頻繁に形成され、これ
は、種痘した宿主中で組換え生ワクチン菌株の免疫抗原性に否定的に影響する。
封入体の形成は、細菌に致命的であり、さらに生命力を低下させかつ弱毒化を増
大させ、従って免疫抗原性が低下するという結論が出された。実に、この二次的
弱毒化の原則を回避する特異的な発現系、例えば２相調節発現系は、宿主免疫系
への異種抗原の提示の有効性を改善することができる。
【０００８】 生きた弱毒化サルモネラによる抗原の分泌は、保護的Ｔ−細胞反応を誘発し（
Hess et al., 1996; Hess et al., 1997b）および抗原−特異的抗体の高められ
たレベルを誘発する（Gentschev et al., 1998）両方の点おいて同じ抗原の細胞
内発現よりも優れていることが証明された。しかし、HlyAに方向付けられた分泌
系の有効性は、通常低く（全体の合成抗原の３０％以下）（Hess et al., 1997a
; Hess et al., 1996）、かつこの系が、異種抗原を輸送するためのチフス菌中
で問題となっているようである（Orr et al., 1999）。
【０００９】 類似した免疫抗原性プロフィールが、２つのIII型分泌系によって誘導されて
おり、これは、サルモネラ病原性領域（Salmonella Pathogenicity Islands）１
および２によってコード化されている。これらの複雑な分泌装置は、当然“エフ
ェクタータンパク質”を感染した宿主細胞のサイトゾル中へ送達し、宿主細胞内
での病原体の生存を支持する。遺伝子工学を用いて、“エフェクタータンパク質
”は、異種抗原からのエピトープのためのキャリヤーベヒクルに転用することが
できる。このようなキメラ“エフェクタータンパク質”は、そのビルレント特性
を失うが、しかし分泌特性を保持している。従って、キメラ“エフェクタータン
パク質”は、宿主細胞のルーメン中に送達され、ここで適当に処理され、引き続
き宿主免疫系の細胞毒系を刺激する。
【００１０】 サルモネラにより分泌される最も豊富なタンパク質は、フラゲリン[例えば（H
ueck et al., 1995）参照]である。ネズミチフス菌中で、フラゲリンは、２つの
対立遺伝子変異体、ＦｌｉＣまたはＦｌｊＢを生じるのに対して、ネズミチフス
菌キャリヤーは、単にＦｌｉＣ遺伝子だけを生じる。フラゲリンは、鞭毛−特異
的輸送（FEX）経路を介して分泌され（Macnab, 1996; Minamino and Macnab, 19
99）、これはIII型分泌経路と相同である(Hueck, 1998)。最近では、FEX経路は
、エルシニア・エンテロコルチカ菌中の非鞭毛タンパク質の分泌に働くことが示
された（Young et al., 1999）。III型分泌のように、ＦｌｉＣのアミノ末端基
は、分泌を支配する。従って、ＦｌｉＣの１８３アミノ末端のアミノ酸が欠如し
た形式（全長は４９５アミノ酸）は、本質的に大量に分泌される（Kuwajima et
al., 1989）。III型分泌に類似して、ＦｌｉＣ中の効果的な分泌シグナルは、１
０〜２０アミノ酸と同じくらいに短い。ＦｌｉＣまたはＦｌｊＢ分泌シグナルは
、異種種痘中で抗原としてはたらく大量の異種タンパク質を分泌するために潜在
的に使用することができる。分泌された抗原の量は、鞭毛生合成遺伝子の発現に
影響する調節突然変異体中でさらに増加させることさえでき（Macnab, 1996; Sc
hmitt et al., 1996）、または組換えプロモーターを使用することによりフラゲ
リン遺伝子の発現を駆動しているようである。
【００１１】 FEX経路を介する分泌は、早期かつ有効的な抗原処理のためのサルモネラ含有
食胞中への大量の抗原の送達および宿主免疫系への抗原提示を可能にすることが
できる。特に、宿主免疫系のMHCクラスII依存系（MHC ckassII dependent branc
h）は、FEX経路媒介抗原送達によって著しく支持されている。
【００１２】 その他の公知のグラム陰性細菌の輸送装置および表面提示系は、サルモネラの
ような細菌性ワクチンキャリヤーにも適用することができる。一般的に、良好な
免疫応答は、抗原がサルモネラ表面上に存在する場合に達成される。しかし、こ
のような抗原提示系の免疫学的因果関係については殆ど知られていないように、
さらに実験的研究が必要である。
【００１３】 付加的な免疫調節効果は、環境的に調節されたサルモネラプロモーターが異種
抗原の発現に使用される場合に達成することができる。例えば、インビボで調節
されたストレス応答ｈｔｒＡ遺伝子プロモーターの制御下のサルモネラキャリヤ
ー菌株中の異種遺伝子の発現は、ｎｉｒＢ遺伝子の嫌気的誘導性プロモーターの
制御下で得られる場合よりも強い免疫応答が生じた。
【００１４】 第１の見地により、本発明は、少なくとも５０ヌクレオチドを有し、ａ）図２
１Ａ、Ｂのうち１つの核酸配列、ｂ）図２１Ａ、Ｂのうち１つの核酸配列の対立
遺伝子、またはｃ）ストリンジェントな条件下で、図２１Ａ、Ｂのうち１つの核
酸配列とハイブリダイズする核酸配列、の核酸配列を有する単離された核酸分子
に関する。
【００１５】 本発明の意味におけるストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件とは
、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mamual, Cold Spring H
arbor Laboratory Press (1989), 1.101〜1. 104に記載されているように定義さ
れている。これによれば、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション
とは、１×SSC緩衝液および０．１％SDSを用いて５５℃で、有利には６２℃で、
特に有利には６８℃で１時間洗浄した後に、特に０．２×SSC緩衝液および０．
１％SDSを用いて５５℃で、有利には６２℃で、特に有利には６８℃で１時間洗
浄した後に、陽性のハイブリダイゼーションシグナルが、なお観察されることを
意味する。
【００１６】 特に、本発明は、遺伝子ssaD、ssaE、sseA、sseB、sscA、sseC、sseD、sseE、
sscB、sseF、sseG、ssaG、ssaH、ssaE、ssaJ、ssrAおよびssrBの完全なコード領
域またはその部分を有する核酸分子に関する。本発明は、前記遺伝子の少なくと
も１つのコード領域が機能的に欠失している核酸にも関する。
【００１７】 １態様では、挿入カセットを有する核酸分子は、トランスポゾンまたはファー
ジが媒介するメカニズムによって異種核酸分子の挿入を容易にする。
【００１８】 さらに、前記核酸分子は、少なくとも１つの異種核酸分子を有することができ
る。この場合には、異種核酸分子は、本発明の核酸分子の５’または３’で融合
しているか、挿入されているかまたは欠失−挿入されている。用語“欠失−挿入
”とは、異種核酸分子の挿入が、本発明の核酸分子の部分の同時の欠失と関連し
ているものと理解されている。有利には、核酸分子は挿入されているかまたは欠
失−挿入されており、かつ有利な１態様では、本発明による核酸分子は、異種核
酸分子に５’および３’で隣接しており、その際にそれぞれの前記の配列は、少
なくとも５０ヌクレオチド、有利には２００〜２５０ヌクレオチドの長さを有す
る。
【００１９】 有利には、異種核酸分子はポリペプチドまたはペプチドをコードし、より有利
には、細菌性またはウイルス性抗原またはその同族体をコードするか、または腫
瘍抗原をコードする。
【００２０】 核酸分子が、少なくとも１つの遺伝子発現カセットを有し、異種核酸分子の効
率的な発現を可能にするのが有利である。このような遺伝子発現カセットは、一
般的に、異種核酸分子の発現を改善するプロモーターおよび／またはエンハンサ
ーのようなエレメントを有する。一般的に、このような遺伝子発現カセットは、
転写を終了するためのエレメントを有する。しかし、転写ターミネーターの存在
は、異種核酸分子が他の遺伝子と一緒にシストロン性ｍＲＮＡ中にトランスクラ
イブされる場合に好ましくない。
【００２１】 核酸分子、１つ以上の選択マーカーカセットおよび１つ以上のトランスアクチ
ベーターカセットおよび任意にインベルターゼカセットは、１相系または２相系
において異種核酸分子の発現を可能にする。さらに、ポリペプチドまたはペプチ
ド−ターゲッティングドメインをコードする配列が存在していてもよく、このよ
うに異種核酸分子の発現生成物を予定された細胞コンパートメント、例えば、サ
イトゾル、周辺細胞質または外膜へターゲッティングすること、または前記発現
生成物の分泌を可能にし、または免疫刺激ドメインをコードする配列が存在して
いてもよい。
【００２２】 他の見地により、本発明は、上記の核酸分子を有する組換えベクターに関する
。本発明のその他の見地は、異種配列または組換えベクターの挿入により改質さ
れた上記のような本発明の核酸分子を有する細胞に関する。前記細胞は、グラム
陰性細胞のような原核細胞、例えば、サルモネラ細胞であってもよく、または哺
乳動物細胞のような真核細胞、例えばヒト細胞および特にマクロファージであっ
てもよい。
【００２３】 なお他の見地により、本発明は、少なくとも２０個のアミノ酸を有し、ａ）図
２３Ａ〜Ｑのうち１つの配列、またはｂ）図２３Ａ〜Ｑのうち１つの配列と６０
％、有利には６５％、特に有利には７０％相同である配列のペプチド配列を含む
ペプチドまたはポリペプチドに関する。特に、本発明は、ａ）図２３Ａ〜Ｑのう
ち１つ、またはｂ）図２３Ａ〜Ｑのうち１つの配列と６０％、有利には６５％、
特に有利には７０％相同である配列を含むペプチドに関する。
【００２４】 パーセント（％）相同性は、以下：
【００２５】
【化１】
【００２６】 ［式中、Ｈは、％相同性を表し、Ｌは、塩基配列の長さを表し、かつｎは、該塩
基配列に対する配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の違いの数を表す］ の方程式により決定される。
【００２７】 本発明のその他の見地は、前記のペプチドまたはポリペプチドから成るエピト
ープに対する抗体に関する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであ
ってもよい。
【００２８】 このような抗体を製造する方法は、当業者に公知である。
【００２９】 本発明のもう１つの見地は、請求項１７および１８のいずれか１項に記載のポ
リペプチドが挿入されているかまたは欠失−挿入されているかまたは少なくとも
１つの異種ポリペプチドとＣ−もしくはＮＨ２−末端で融合して成る融合タンパ
ク質に関する。有利な異種ポリペプチドは、抗原であり、より有利には細菌性ま
たはウイルス性抗原または腫瘍抗原である。
【００３０】 本発明は、種々の弱毒化のレベルを有する生サルモネラワクチン菌株の様々な
可能性を発展させるための指図をさらに提供し、これは引き続き異種病原体から
の抗原を発現する組換え生サルモネラワクチンキャリヤー菌株を発展させるため
の基盤として働き、従って多価ワクチンとして役立つ。このような組換え生サル
モネラワクチンキャリヤーは、サルモネラ中で異種抗原の発現を調節し、かつ宿
主免疫系に対する異種抗原の提示を決定する変異性遺伝子カセットを有するモジ
ュールを備えている。両方の系の組合せにより、弱毒化サルモネラ生ワクチン菌
株および変異性遺伝子カセットとは異なり、その変異性の免疫学的特性により予
防および治療的使用の両方のための幅広い適用スペクトルを有する種々の組換え
生ワクチンキャリヤー菌株を生成することができる。基本的な弱毒化の原則は、
サルモネラ病原性領域２（ＳＰＩ２）遺伝子座中の新規の突然変異から由来する
。単独またはｓｓｅもしくはＳＰＩ-２遺伝子中の突然変異と組み合わせて、ま
たはａｒｏＡ突然変異と組み合わせて、生ワクチンキャリヤー菌株を最適に弱毒
化するために使用できる付加的な突然変異は、最近報告されている（Heithoff e
t al., 1999; Valentine et al., 1998）。ＳＰＩ-２遺伝子座中の個々の突然変
異を相互に組合わせ、かつ他の公知の弱毒化遺伝子突然変異、例えばａｒｏＡ等
と組合わせることにより、幅広いレパートリーの弱毒化および免疫抗原性を達成
することができる。種々の発現カセットをこれらの基盤中に導入することができ
、異種抗原に対して方向付けられた免疫応答の調節をさらに可能にする。最後に
、免疫−刺激ポテンシャルの幅広いスペクトルをカバーする個々の組換体サルモ
ネラ生ワクチンキャリヤー菌株のライブラリーが形成され、これから特異的な病
原体または病気からヒトおよび／または動物を最適に保護するかまたは治療する
ための真性の生ワクチン菌株が製造される。
【００３１】 従って、もう１つの見地において、本発明は、ＳＰＩ２遺伝子座を有する弱毒
化グラム陰性細胞に関し、その際に前記ＳＰＩ２遺伝子座の少なくとも１つの遺
伝子が不活性化されており、この不活性化が前記細胞の野生型と比較してビルレ
ンスの減衰／減少を生じる。
【００３２】 III型分泌中に含有される種々のタンパク質をコード化するサルモネラ病原性
領域２中に存在する遺伝子および食細胞内で組織系統の分布および生存に必要と
される遺伝子は、病原性サルモネラｓｓｐの弱毒化に理想的な対象である。
【００３３】 いくつかのグラム陰性細菌性病原体は、特殊化したIII型分泌系を介して一定
のビルレンスタンパク質を分泌する。ビルレンス因子は、免疫系の特異的な作用
であるにもかかわらず、病原性細菌に宿主中の適所にコロニーを作らせることが
できる。III型分泌系は、特異的なエフェクタータンパク質を真核性の宿主細胞
中へ接触−依存した方法で輸送するために必要な多数のタンパク質を有し、従っ
て、このIII型分泌系は、接触−依存分泌系とも呼ばれる。いくつかの分泌系装
置のエレメントは、細菌種の間で進化的かつ機能的保護を示すにもかかわらず、
エフェクタータンパク質は、良好に保護されておらず、異なる機能を有する。エ
ルシニアエフェクターＹｐｋＡおよびＹｏｐＨは、トレオニン／セリンキナーゼ
を有し、かつそれぞれチロシンホスファターゼ活性を有する。これらの作用およ
びその他のＹｏｐｓは、宿主細胞により細菌性食作用を阻害し、このことが細胞
外の細菌増殖を可能にすると考えられている。ｍｘｉ／ｓｐａ III型分泌系に
よって分泌される赤痢菌ｌｐａタンパク質は、この細菌を上皮細胞中へ侵入する
ことを促進する。腸病原性大腸菌の小腸上皮細胞展退（ＬＥＥ）の遺伝子座によ
ってコード化されているＥｓｐＡ、ＥｓｐＢおよびＥｓｐＤは、細胞骨格の転移
および宿主細胞構造上の台座様構造の形成を引き起こすタンパク質の転座に必要
である。
【００３４】 本発明の目的のために、“ＳＰＩ２遺伝子座を有するグラム陰性細胞”は、食
細胞内で組織系統的分布および生存に必要な遺伝子を保持する遺伝子座を有する
細胞であり、従って、サルモネラからのＳＰＩ２遺伝子座の同族体であるかまた
は機能的同等物である。有利には、本発明の弱毒化グラム陰性細胞は、腸内細菌
細胞であり、より有利にはサルモネラ細胞、赤痢菌細胞またはビブリオ細胞であ
る。一般的に、幅広い宿主域を有する細胞が有利である。通常の宿主は、哺乳動
物、例えばヒト、およびトリ、例えばニワトリである。サルモネラ細胞はより有
利であり、特にサルモネラ抗原型チフス菌固有型１０４（DT104）が有利である
。
【００３５】 ネズミチフス菌は、ビルレンス決定基のための２つのIII型分泌系を含んでい
る点で珍しい。一方は、上皮細胞の細菌性逆位を制御し、かつ４０ｋｂ病原性領
域（SPI１）内の遺伝子によってコード化される。他方は、第２の４０ｋｂ病原
性領域（SPI2）内の遺伝子によってによってコード化され、かつその宿主内のこ
の病原体の組織系統の成長に必要である。病原性領域ＳＰＩ１上に位置する遺伝
子は、主に、免疫工程の初期段階、細菌による非病原性の宿主細胞の逆位の原因
である。殆どのＳＰＩ１遺伝子に関して、突然変異はインビトロで低減された侵
入性を生じる。しかし、侵入を欠失している突然変異体が必ずしも無毒性ではな
い；マウスでの研究は、ＳＰＩ１遺伝子中のこれらの突然変異が経口経路による
送達でのビルレンスを著しく低下させるのに対して、前記突然変異は次の感染の
腹腔内経路のビルレンスには影響を与えていないことを証明している。まとめる
と、これらの結果は、病原性領域ＳＰＩ１以内の遺伝子中の突然変異は、組織系
統的感染を取り除かず、従って安全な弱毒化サルモネラキャリヤー菌株の開発に
は非常に有用ではないことを示している。反対に、ＳＰＩ２突然変異体のビルレ
ンスの研究は、マウスの経口および腹腔内接種の両方の後に、野生型菌株と比較
して少なくとも５倍のオーダーの規模で弱毒化されていたことを示した。
【００３６】 ＳＰＩ２分泌系のエレメントをコード化している多くの遺伝子は、ＳＰＩ２の
２５ｋｂセグメント中に位置している。ＳＰＩ２は、III型分泌装置(ssa)、およ
び2つのエレメント調節系(ssr)の遺伝子と同様に分泌エフェクター(sse)および
その特異的シャペロン(ssc)のセットの対象遺伝子を含んでいる。他の細菌性病
原体中に存在する遺伝子の類似性に基づいて、ｓｓａＫ／Ｕオペロンおよびｓｓ
ａＪ内の最初の１３遺伝子は、分泌系装置のエレメントをコード化する。ｓｓａ
Ｃ（orf 11 in Shea et al., 1996; spiA in Ochman et al., 1996）およびssrA
（orf 12 in Shea et al., 1996; spiR in Ochman et al., 1996）を含めた付加
的な遺伝子の数（それぞれ、分泌系装置タンパク質および２つのエレメント調節
タンパク質をコード化する）は、ｓｓａＪからの約８ｋｂの領域中で見出される
。
【００３７】 有利には、本発明の弱毒化グラム−陰性細胞は、エフェクター（sse）遺伝子
、分泌装置（ssa）遺伝子、シャペロン（ssc）遺伝子および調節（ssr）遺伝子
から選択される少なくとも１つの遺伝子を不活性化した。より有利には、少なく
とも１つの不活性化遺伝子がｓｓｅ、ｓｓｃおよび／またはｓｓｒ遺伝子であり
、特に有利にはｓｓｅおよび／またはｓｓｃ遺伝子である。
【００３８】 ｓｓｅ遺伝子が不活性化により影響されている限り、不活性化遺伝子は、有利
にはｓｓｅＣ、ｓｓｅＤ、ｓｓｅＥまたはその組合せである。ｓｓｒ遺伝子が不
活性化により影響されている限り、有利には少なくとも１つのｓｓｒＢが不活性
化される。ｓｓｃ遺伝子が不活性化により影響されている限り、有利には少なく
とも１つのｓｓｃＢが不活性化される。
【００３９】 ＳＰＩ２遺伝子座の遺伝子の不活性化は（またはサルモネラ以外の細胞中でそ
れと機能的同等物）、欠失を含んでいてもよい突然変異により影響される。少な
くとも６個のヌクレオチドが欠失しているのが有利であり、かつより有利には、
前記遺伝子のコード配列が部分的に欠失し、特に完全に欠失しているのが有利で
ある。突然変異は、異種核酸分子の不活性化すべき前記遺伝子中への挿入または
欠失および挿入の組合せを含んでいてもよい。
【００４０】 病原性サルモネラｓｓｐは規定のＳＰＩ２遺伝子座突然変異の導入を通して達
成される漸進的な弱毒化によってもたらされる種々のサルモネラ生ワクチンプロ
トタイプのパネルの構築の基礎に役立つ。それぞれの得られる個々のサルモネラ
生ワクチンプロトタイプを更に（１）異種の病原からの遺伝子的に工作された遺
伝子および（２）宿主の免疫系に効果的な抗原提示を達成する適当な発現系を有
する交換可能なＤＮＡモジュールの導入によって多価の組み換えワクチンに形質
転換させる。それに対して、これらの特徴は種痘された宿主を引き続いての侵入
するサルモネラおよび／または他の病原から保護（予防接種）するか、または永
続的な病原、例えばヘリコバクター・ピロリを排除（治療的種痘）する特異的な
免疫応答を引き出す。
【００４１】 病原性サルモネラｓｓｐはＳＰＩ２遺伝子座の部分、例えばエフェクタータン
パク質をコードするｓｓｅ遺伝子、例えばｓｓｅＣ、ｓｓｅＤまたはｓｓｅＥ、
またはシャペロンをコードするｓｓｃ遺伝子、例えばｓｓｃＢ、またはレギュレ
ーターをコードするｓｓｒ遺伝子、例えばｓｓｒＢである個々のビルレンス遺伝
子における突然変異によって漸進的に弱毒化される。これらの遺伝子それぞれの
個々の突然変異は独特な個々の弱毒化の程度をもたらし、またこれは粘膜、体液
および細胞レベルで特徴的な免疫応答をもたらす。個々の弱毒化の程度はＳＰＩ
２遺伝子座内の少なくとも２つの遺伝子の突然変異の組合せ、またはビルレンス
を抑制することが知られている別のサルモネラ遺伝子、例えばａｒｏ遺伝子、例
えばａｒｏＡにおける突然変異との組合せによって適度に増大しうる。より程度
の大きい弱毒化は幾つかのビルレンス因子を含む転写ユニット、例えばｓｓｅＣ
、ｓｓｅＤ、ｓｓｅＥおよびｓｓｃＢ遺伝子をコードするポリシストロン性遺伝
子クラスターの一部であるビルレンス遺伝子の突然変異によって達成されるので
、突然変異は極性作用を発揮し、以下の遺伝子の発現を中断させる。弱毒化の程
度は極性突然変異ならびにその個々の特徴によって影響されるビルレンス遺伝子
の数に直接依存することがある。最終的に最も大程度な弱毒化は調節遺伝子、例
えばｓｓｒＢが突然変異される場合に達成される。またサルモネラｓｓｐのそれ
ぞれの弱毒化様式によって、株に存在する弱毒化突然変異の種類および／または
組合せに特徴的な粘膜、体液および細胞レベルでの免疫応答を誘発するサルモネ
ラ生ワクチン株の発生がもたらされる。生成された種々の弱毒化されたサルモネ
ラ生ワクチン株のパネルは、発現された異種抗原に関連する疾患の予防および撲
滅のいずれかのための最も効果的な免疫応答を引き起こすキャリヤーを選択でき
る潜在的なキャリヤー株のプールを表す。
【００４２】 指示されたサルモネラビルレンス遺伝子の弱毒化を惹起する突然変異は、有利
には選択されたビルレンス遺伝子を完全に欠失させるか、または不活性のビルレ
ンス因子をコードする欠損遺伝子をもたらす定義された欠失として組み換え遺伝
子ＤＮＡ技術によって導入される。両者の場合には、突然変異は単一遺伝子に関
連し、かつ隣接遺伝子の発現に影響しない（非極性突然変異）。指示されたビル
レンス遺伝子の１つにおける挿入突然変異は、選択された遺伝子がポリシストロ
ン性のビルレンス遺伝子クラスターの一部であり、かつ以下の全てのビルレンス
遺伝子が弱毒化プロセスに含まれる（極性突然変異）場合に有利である。非極性
の挿入突然変異は、一般に単独で転写されるか、またはポリシストロン性のクラ
スターの末端に局在する遺伝子、例えばｓｓｒＢに限定される。しかしながら、
他の弱毒化突然変異誘発は同時に化学的エネルギーまたは他の形の物理的突然変
異または交配の結果としてまたは他の形の遺伝子交換によってもたらされる。
【００４３】 このように本発明による弱毒化されたグラム陰性細胞の調製をもたらす突然変
異は極性または非極性突然変異であってよい。更に、弱毒化の程度はＳＰＩ２座
の外部の付加的な遺伝子、例えば別の毒性遺伝子もしくは代謝物またはその前駆
体の生合成に関連する遺伝子、例えばａｒｏ遺伝子、特にａｒｏＡまたは他の適
当な遺伝子、例えばスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を不活性化させる
ことによって変化させてもよい。
【００４４】 本発明による弱毒化された細胞は、更に前記の細胞の検出および／または挿入
された異種の核酸分子の発現を容易にするエレメントを有してよい。弱毒化され
た細胞の検出を容易にするエレメントの例は、選択マーカーカセット、特に細胞
に抗生物質耐性を付与することが可能な選択マーカーカセットである。１つの実
施態様においては、選択マーカーカセットはホニュウ類の治療に使用されない抗
生物質に対する抗生物質耐性を付与する。異種の核酸分子の発現を容易にするエ
レメントの例は１つ以上のプロモーター、エンハンサー、場合により転写終結因
子またはこれらの組合せを有してよい遺伝子発現カセット、トランスアクチベー
ターカセット、異種の核酸の１相または２相の発現のためのインベルターゼカセ
ットである。異種の核酸分子の挿入を容易にするエレメントの例は挿入カセット
である。
【００４５】 別の態様において本発明は宿主に抗原を提示させるためのキャリヤーを提供し
、該キャリヤーは請求項２２から４９までのいずれか１項記載の弱毒化されたグ
ラム陰性細胞であり、その際、該細胞は前記の抗原をコードする核酸配列を有す
る少なくとも１つの異種核酸分子を有し、該細胞は前記核酸分子を発現可能であ
り、または標的細胞中で前記の核酸分子をの発現をもたらすことができる。
【００４６】 有利には前記の核酸分子は細菌またはウイルス抗原または腫瘍抗原をコードす
る核酸配列を有する。細菌抗原の例は、ヘリコバクター・ピロリ、クラミジア・
プノイモニア（Chlamydia pneumoniae）、ボレリア・ブルクドルフェリ（Borrel
ia burgdorferi）およびナノバクテリアからの抗原である。ウイルス抗原の例は
肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、ヒトパピロー
マウイルスおよびヘルペスウイルスからの抗原である。異種の核酸分子は少なく
とも１つのポリペプチドまたはペプチドターゲティングドメインおよび／または
免疫刺激ドメインをコードする核酸配列を有してよい。このように前記の異種核
酸分子の発現産物は予定されたコンパートメント、例えばペリプラズマ、外膜等
に特異的に照準を合わせることができる。異種の核酸分子は融合タンパク質をコ
ードしてよい。
【００４７】 １つの実施態様によれば、異種の核酸分子はＳＰＩ２座、有利にはｓｓｅ遺伝
子、より有利にはｓｓｅＣ、ｓｓｅＤおよび／またはｓｓｅＥ、特にｓｓｅＣに
挿入される。
【００４８】 挿入は極性挿入または非極性挿入であってよい。一般に非極性挿入の導入が有
利である。それというのもこれはポリシストロン性遺伝子クラスターの残存遺伝
子の発現を可能にし、これは種々の程度の弱毒化を有するキャリヤーの作成のた
めに使用できるからである。
【００４９】 弱毒化されたサルモネラ生ワクチンは異種病原、例えばヘリコバクター等から
の特異抗原のためのキャリヤーとして使用され、こうして多価ワクチンとして作
用する。異種抗原は弱毒化されたサルモネラ株のゲノム中に遺伝子工学によって
挿入された遺伝子発現カセット（ＧＥＣ）によって提供される。有利には遺伝子
発現カセットの挿入は指示されたビルレンス遺伝子の１つに照準が合わされ、こ
れによって前記の段落に記載したような挿入突然変異が生ずる。別の適用形にお
いては、異種遺伝子の遺伝子発現カセット中での発現はトランスアクチベーター
カセット（ＴＣ）または２相の種々の発現様式をおこなうインベルターゼカセッ
トによってコードされるトランス作用因子によって調節される。有利にはトラン
スアクチベーターカセットの挿入は第二の選択されたビルレンス遺伝子に照準が
合わされ、次いでこれは失活される。選択的に遺伝子発現カセットまたはトラン
スアクチベーターカセットまたはインベルターゼカセットをサルモネラゲノム中
にトランスポゾン媒介性の挿入によって導入でき、これは弱毒化作用を有さない
。
【００５０】 遺伝子工学の原理はサルモネラビルレンス遺伝子における欠失または挿入の突
然変異を発生させるために必要である。一般に、選択マーカーカセット（ＳＭＣ
）を単独でか、または遺伝子発現カセットまたはトランスアクチベーターカセッ
トまたはインベルターゼカセットと組合わせて有する変異ビルレンス遺伝子カセ
ットを有する自殺プラスミドは形質導入によって摂受体であるサルモネラ株に導
入される。本来のビルレンス遺伝子は相同組み換えを介して変異ビルレンス遺伝
子カセットで置換され、かつサルモネラ摂受株中で複製できない自殺プラスミド
は迅速に減少する。好結果に組み換えられたサルモネラは選択マーカーカセット
内の遺伝子産物によって付与された特性（例えば限定されないが抗生物質耐性）
に基づいて選択することができる。変異ビルレンス遺伝子カセットは摂受体のサ
ルモネラ株の本来のビルレンス遺伝子が局在するゲノムに相同なＤＮＡ配列を有
する。本来のビルレンス遺伝子を完全に欠失させるべき場合、本来のビルレンス
遺伝子の境界をなすゲノムＤＮＡ配列（フランキング領域と呼称する）だけが変
異ビルレンス遺伝子カセット中に含まれる。変異ビルレンス遺伝子カセットの一
般的な構成は各末端において少なくとも５０ヌクレオチド、理想的には２００〜
２５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含み、これは本来のビルレンス遺伝子が局在
するゲノムセグメントと相同である。これらのＤＮＡ配列は選択マーカーカセッ
トおよび他のカセット、例えば遺伝子発現カセット（ＧＥＣ）またはトランスア
クチベーターカセット（ＴＣ）またはインベルターゼカセットに隣接している。
前記のようにこれらのカセットを使用して、本来の遺伝子発現を破壊する挿入突
然変異がもたらされる。
【００５１】 選択マーカーカセット（ＳＭＣ）は原則的に、摂受体のサルモネラ株を不活性
にできるが、事実上サルモネラ症の治療に使用できない抗生物質に対する、遺伝
子媒介性の耐性からなる。選択的に別の選択マーカーを使用できる。選択マーカ
ーカセットは標的ビルレンス遺伝子に枠内で挿入され、従ってマーカー遺伝子の
発現はビルレンス遺伝子プロモーターのコントロール下にある。選択的に該カセ
ットをポリシストロン性転写ユニット内に挿入し、その場合にマーカー遺伝子は
該ユニットのためのプロモーターのコントロール下にある。別の適用においては
選択マーカー遺伝子はそれ自体のプロモーターのコントロール下にあり；この場
合には転写終結因子は前記遺伝子の下流に含まれる。選択マーカーは変異ビルレ
ンス遺伝子カセットを摂受体のサルモネラ株のゲノムに好結果での挿入を指示す
る必要がある。更に、抗生物質耐性マーカーは種々の弱毒化されたサルモネラ株
の前臨床的な免疫学的評価を容易にする必要がある。別の適用形においては、選
択マーカーは同方向繰り返しと隣接しており、これは選択圧の不在下にゲノムか
らの選択マーカーカセットの組み換え的除去をもたらし、同方向繰り返しの短い
配列が残留する。選択的に、選択マーカーカセットは完全に組み換えＤＮＡ技術
によって除去できる。第一に、選択マーカーカセットは自殺プラスミド上の変異
した本来のビルレンス遺伝子から適当な制限エンドヌクレアーゼによって除去さ
れ、サルモネラゲノムに相同的なフランキング領域配列が残留する。次いで自殺
プラスミドを弱毒化された摂受体のサルモネラ株に、ＳＭＣを除去した変異ビル
レンス遺伝子カセットをＳＭＣを有する変異ビルレンス遺伝子カセットに組み換
えによって置換させて形質導入によって移行する。選択マーカーの除去後に、弱
毒化したサルモネラ株はヒトには適用できない。転写終結因子配列は一般に極性
突然変異が達成される場合にカセット中に含まれる。
【００５２】 遺伝子発現カセット（ＧＥＣ）は遺伝子の発現を可能にし、容易にし、または
改善するエレメントを有する。機能的な形式においては遺伝子発現カセットは付
加的に異種源からの完全な遺伝子またはその断片から誘導される１つ以上の遺伝
子発現ユニットを有し、最小サイズのエピトープに関する。多数の遺伝子発現ユ
ニットは、有利にはコンカテマー構造として組織化されている。遺伝子または遺
伝子断片は更に、得られたタンパク質または融合タンパク質がサイトゾル、ペリ
プラズム、表面で発現し、提示し、または分泌されるように遺伝子的に工作され
る。更に遺伝子または遺伝子断片を免疫学的に反応性のタンパク質部、例えばサ
イトカインまたは弱毒化された細菌性毒素をコードするＤＮＡ配列と融合するこ
とができる。遺伝子または遺伝子断片は１相様式で遺伝子発現カセット内のプロ
モーターからコントロールされるか、または２相様式でか、または間接的にトラ
ンスアクチベーターカセット（ＴＣ）によってコントロールされる。１相様式に
おいてはプロモーターは有利には環境シグナルによって活性化された、すなわち
誘導されるサルモネラプロモーターであるが、種々の強度の構成的プロモーター
を使用することもできる。２相様式においては、遺伝子カセットの発現はインベ
ルターゼカセットから導かれるインベルターゼによってコントロールされる。イ
ンベルターゼは遺伝子カセットを有するＤＮＡセグメントの逆位を触媒する。Ｄ
ＮＡセグメントは各末端で逆方向反復配列と隣接し、該配列はインベルターゼに
特異的な基質であり、最終的には遺伝子発現カセットプロモーターに関する２方
向の遺伝子カセットをもたらす。ＯＮ方向においては遺伝子カセットは正確に位
置し、遺伝子カセットの転写を可能にする。ＯＦＦにおいては、遺伝子カセット
の配列は不正確であり、転写は生じない。インベルターゼカセットは環境シグナ
ルによって誘導または抑制される構成的プロモーターまたはサルモネラプロモー
ターによってコントロールされるインベルターゼの遺伝子を有する。遺伝子発現
カセット内にコードされる異種抗原はプロモーター、例えば組織特異的プロモー
ターのコントロール下に発現されてよく、これらは構成的または誘導的であって
もよい。発現は標的細胞中で活性化でき、これによってシグナルは標的細胞から
サルモネラ細胞の内部に伝達され、該シグナルが発現を誘導する。標的細胞は、
例えばマクロファージであってよい。発現産物は、例えば融合タンパク質の形で
ターゲティングドメインまたは免疫刺激ドメインを有してよい。異種タンパク質
それ自体は融合タンパク質であってもよい。異種抗原は場合により、効率的な免
疫応答を達成するためにサイトゾルタンパク質、ペリプラズムタンパク質、表面
提示タンパク質または分泌タンパク質または融合タンパク質として発現されてよ
い。抗原をコードする配列はサルモネラ細胞のペリプラズムまたは外膜にか、ま
たは細胞外環境にタンパク質を方向付けるアクセサリー配列と融合していてもよ
い。異種ポリペプチドが分泌される場合、分泌はタイプＩＩＩ分泌系を使用して
生じうる。ＳＰＩ２タイプＩＩＩ分泌系による分泌が適当である。サルモネラの
サイトゾルコンパートメントに予定されるタンパク質はアクセサリー配列を必要
とせず、この場合には天然産生性のアクセサリー配列を、例えば抗原をコードす
る遺伝子から分離せねばならない。
【００５３】 サルモネラのペリプラズムコンパートメントのための補助的な配列はアミノ末
端に局在する、天然に一般の分泌経路、例えばＣｔｘＡ等を介して転位した異種
タンパク質のシグナルペプチドから推測されるＤＮＡ配列を有する。
【００５４】 サルモネラの外膜のコンパートメントのためのアクセサリー配列は有利には、
タイプＩＶの分泌（自己輸送）タンパク質、例えばＡＩＤＡまたはＩｇＡプロテ
アーゼの機能的に関連の部分から推測されるＤＮＡ配列を有する。適当な融合タ
ンパク質はアミノ末端に局在するシグナルペプチドおよび、カルボキシ末端には
β−バレル形状の膜間ドメインを有し、該ドメインに外来パッセンジャータンパ
ク質は細菌表面にパッセンジャータンパク質を固定するスペーサーを介してカッ
プリングする。
【００５５】 細胞外環境に分泌するためのアクセサリー配列はタイプＩＩＩ分泌系によって
天然に分泌されるタンパク質から推測されるＤＮＡ配列を有する。一般的に機能
的な融合タンパク質においては、異種抗原がタイプＩＩＩ経路によって天然に分
泌されるタンパク質の中央でか、またはそれぞれのタンパク質のカルボキシ末端
で融合する。
【００５６】 トランスアクチベーターカセット（ＴＣ）は種々の遺伝子発現カセットによっ
てコードされる異種抗原の発現を一般に改善するアクチベーターを提供する。か
かるアクチベーターは直接（ＲＮＡポリメラーゼ）または間接的に（転写アクチ
ベーター）高度に特異的な動向で転写レベルに作用する。有利にはかかるアクチ
ベーターの発現はインビボで環境シグナルによって誘導されるサルモネラプロモ
ーターによってコントロールされる。別の適用形においてはトランスアクチベー
ターカセット内のアクチベーターの合成は２相様式で調節される。インベルター
ゼカセットによって発現されるインベルターゼは転写プロモーターに関してアク
チベーターをコードするＤＮＡ断片を２方向で配置している。ＯＮ方向では、ア
クチベーター遺伝子は正確な転写動向にある。ＯＦＦモードにおいてはアクチベ
ーターは不正確に配向し、発現は生じない。
【００５７】 単純な系において、トランスアクチベーターカセットの遺伝子産物は遺伝子発
現カセット中に存在するプロモーターにおいて直接的にその作用を発揮し、直接
的に異種遺伝子の発現を活性化するか、または脱抑制する。複雑な系においては
、異種遺伝子発現カセットにおけるプロモーターの活性化は２種以上の相互作用
因子に依存し、（トランスアクチベーターカセット中にコードされる）その少な
くとも１つは外部シグナルによって調節されていてよい。更に複雑なものはカス
ケード系に見受けられ、そこでは外部シグナルはトランスアクチベーターカセッ
トにおいて直接その作用を発揮せず、むしろ多段階プロセスを経るか、またはト
ランスアクチベーターカセットの遺伝子産物は異種遺伝子発現カセットにおいて
直接その作用を発揮せず、むしろ多段階プロセスを経る。
【００５８】 更に別の態様によれば、本発明はＳＰＩ２遺伝子座を含む弱毒化されたグラム
陰性細胞であり、これは少なくとも１つのＳＰＩ２ポリペプチドの欠損を特徴と
し、その際、その欠損は前記の細胞の野生型と比較してビルレンスの弱毒化／低
減をもたらす。有利には前記の欠損したＳＰＩ２ポリペプチドは１つ以上のエフ
ェクターポリペプチド、分泌装置ポリペプチド、シャペロンポリペプチドまたは
調節ポリペプチドである。更に前記の弱毒化された細胞は同時に少なくとも１種
の異種ポリペプチドまたは免疫原特性を有するポリペプチドの存在を特徴とする
キャリヤーであってよい。
【００５９】 本発明の更なる態様は、作用物質として本発明により弱毒化されたグラム陰性
細胞またはキャリヤーである免疫学的保護された生ワクチンを含有する医薬品組
成物である。医薬品組成物は添加剤、例えば製薬学的に認容性の希釈剤、キャリ
ヤーおよび／またはアジュバントを含有している。これらの添加剤は当業者に公
知である。通常は、該組成物は粘膜表面を介するか、非経口経路を介して患者に
適用される。
【００６０】 本発明の更なる態様は生ワクチンの製造方法を含み、これはＳＰＩ２座を含む
生きているグラム陰性細胞を提供し、かつＳＰＩ２座の少なくとも１つの遺伝子
を失活させて、本発明の弱毒化されたグラム陰性細胞を得て、場合により抗原を
コードする少なくとも１つの異種核酸分子を挿入して、本発明によるキャリヤー
を得ることを特徴としている。更なる態様は本発明による弱毒化された細胞また
はキャリヤーを製薬学的に効果的な量で製薬学的に認容性の希釈剤、キャリヤー
および／またはアジュバントと一緒に配合することからなる生ワクチン組成物の
製造方法に関する。本発明の更なる態様は本発明による弱毒化された細胞または
キャリヤーの検出のための方法に関し、これは前記の細胞を含有する試料を提供
し、野生型細胞に存在しない特異的な特性を検出することからなる。弱毒化され
た細胞またはキャリヤーの、野生型には存在しない特異的な特性を検出するため
の方法は当業者に公知である。例えば弱毒化された細胞の前記の特異的な特性が
ＳＰＩ２座の１つ以上の部分の欠失を有する場合、前記の細胞の存在は該欠失に
隣接した配列に相補的な特異的プライマーのペアを提供し、ＰＣＲのような増幅
法を使用して特定の長さの断片を増幅させることによって検出できる。本発明に
よるキャリヤーの存在の検出のための方法は挿入された断片または挿入境界に及
ぶ断片のＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーション法または異種発現産物または選択
マーカーの検出を含む。
【００６１】 本発明の更なる態様は、それぞれ本発明による弱毒化されたグラム陰性細胞ま
たはキャリヤーのライブラリーを確立させるための方法である。該方法は、弱毒
化された組み換えワクチン株の製造からなり、該株はそれぞれＳＰＩ２座に種々
の突然変異を有し、これにより種々の弱毒化の程度をもたらす。前記の株の病原
性またはビルレンス素質は公知の方法、例えばＬＤ５０の測定を使用して測定で
き、かつ該株は種々の病原性、すなわち種々の弱毒化の程度に応じて評価される
。有利には該方法は他の関心のあるパラメータ、例えば宿主にもたらされる免疫
原性または免疫刺激応答の測定からなる。免疫刺激素質を測定するための方法は
当業者に公知であり、かつその幾つかは例６に記載されている。有利には本発明
による弱毒化された細胞またはキャリヤーの免疫刺激素質は体液レベル、細胞レ
ベルおよび／または粘膜レベルで測定される。こうして事前に決定された弱毒化
の程度および事前に決定された免疫刺激特性を有する弱毒化された細胞またはキ
ャリヤーのライブラリーを確立することができる。このようにそれぞれの適用の
ために所望の特性を有する株を特別に選択することができる。例えば通常は免疫
抑制剤を受容している患者への適用のためには強く弱毒化された株を選択するこ
とが有利である。
【００６２】 同様にして、本発明は規定の病原性および場合により免疫原性を有する弱毒化
されたキャリヤーのライブラリーの確立を可能にする。キャリヤーのライブラリ
ーの確立は更に前記のキャリヤー株の宿主に対する抗原の存在の測定からなり、
これによって種々のキャリヤー株のパネルが得られ、これは病原性、キャリヤー
抗原の免疫刺激素質および異種抗原の免疫刺激素質に関する規定の特性を有する
。
【００６３】 本発明の他の態様は本発明による弱毒化された細胞またはキャリヤーを、細菌
またはウイルスによって実質的に引き起こされる急性または慢性の疾患の予防的
または治療的処理のための薬剤の製造のために使用することである。例えばサル
モネラ感染の予防または治療に関しては、弱毒化されたサルモネラ細胞を適用し
て羅患した患者の免疫応答を引き起こす。同様に、本発明によるキャリヤーは腫
瘍の予防的または治療的処理のための薬剤の製造のために使用してよい。
【００６４】 確立された組み換えサルモネラワクチン株のそれぞれの個々の免疫保護的な素
質は誘発株として病原性サルモネラ・タイフィムリウムを使用してマウスモデル
において測定される。
【００６５】 − 組み換えサルモネラワクチン株のビルレンス素質の測定：（１）競合指数ま
たはＬＤ５０；（２）厳密には肝臓または脾臓を省いた血液における全身性羅患
率。
【００６６】 − サイトゾルで発現した異種試験抗原によるキャリヤー株の免疫刺激素質の測
定：（１）単一の経口の免疫化および引き続いての短期および長期の免疫応答の
評価：（ａ）体液性免疫応答プロフィールの分析、（ｂ）粘膜性免疫応答プロフ
ィールの分析、（ｃ）細胞性免疫応答プロフィールの分析；（２）多重の経口免
疫化および引き続いての短期および長期の免疫応答の評価：（ａ）体液性免疫応
答プロフィールの分析、（ｂ）粘膜性免疫応答プロフィールの分析、（ｃ）細胞
性免疫応答プロフィールの分析。
【００６７】 − 異種ＤＮＡの輸送のためのキャリヤー株の免疫刺激素質の測定（ＤＮＡ種痘
）。
【００６８】 有利にはサルモネラ受容株は広範な宿主幅を有し、動物およびヒトの両者にお
いて重大な病原性を示す。理想的にはこれはマウスに対する強力な病原であるサ
ルモネラ株、例えばＳ．タイフィムリウムである。組み換えサルモネラワクチン
株を好結果で開発した後に、該株は動物およびヒトの両者での使用のために直接
的に適用可能である。係る理想的なサルモネラ受容株はそれぞれの宿主のために
適合しておらず、他の宿主特異的なサルモネラ、例えばヒトに関してはＳ．タイ
フィムリウムを選択せねばならない。
【００６９】 本発明の他の態様は、図２１ＡまたはＢまたは図２２Ａ〜Ｑまでの１つに示さ
れているような、場合により前記に記載のように改変されている核酸分子の使用
または弱毒化された細胞、生ワクチンまたは宿主に対する抗原の提示のためのキ
ャリヤーの製造のための前記に記載のようなベクターの使用および弱毒化された
細胞、生ワクチンまたは有利には宿主に対する抗原の提示のためのキャリヤーの
製造のためのサルモネラＳＰＩ２座の使用に関する。この点において、用語“サ
ルモネラＳＰＩ２座”とはコードしているか、またはコードしていない任意の核
酸配列ならびにコードしている配列の発現産物を示す。
【００７０】 本発明の更なる態様は宿主に対する抗原の提示のためのキャリヤーの製造のた
めのグラム陰性細胞のビルレンス遺伝子座の使用である。
【００７１】 本発明の別の態様は、動物、例えばホニュウ類、例えばヒトを主に感染生物に
よって引き起こされる慢性の疾患に対する治療的または予防的な種痘の方法に関
し、これは本発明のワクチンの製造および適用を含む。
【００７２】 本発明の別の態様は、ａ）図２４Ａ、Ｂの１つの核酸配列、ｂ）図２４Ａ、Ｂ
の１つの核酸配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸配列の
少なくとも１００ヌクレオチドの核酸を有する単離された核酸分子である。
【００７３】 特に、前記の態様は、前記の核酸分子に機能的に結合しているペプチドまたは
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を誘導可能な前記核酸分子に関する。
【００７４】 インビボで誘導可能なプロモーターＰｉｖｉはオペレーターおよび転写プロモ
ーターのための配列を有するＤＮＡ断片を有する。係るインビボで誘導可能なプ
ロモーターは適当なリポーター遺伝子アプローチを適用することによって同定で
きる。係るインビボで誘導可能なプロモーターの２つはＳＰＩ２内で同定され、
これらはそれぞれｓｓａＢＣＤＥオペロンの発現を開始させ（プロモーターＡ２
）、かつｓｓｅＡＢｓｓｃＡｓｓｅＣＤＥｓｓｃＢｓｓｅＦＧオペロンの発現を
開始させる（プロモーターＢ）。これらのプロモーターはｓｓｒＡおよびｓｓｒ
Ｂ遺伝子産物を有する調節系によって誘導される。この調節系は付加的なＳＰＩ
２座の遺伝子の活性化を担うＳＰＩ２座の部分である。該調節系はマクロファー
ジにおいては環境シグナルによってセンサータンパク質ＳｓｒＡを介して活性化
される。最終的にＳｓｒＢタンパク質はＲＮＡポリメラーゼにより転写を開始さ
せる規定のＤＮＡ配列に結合する。
【００７５】 適用形においては、オペレーター／プロモーター配列を有するＤＮＡ断片をイ
ンベルターゼ遺伝子またはアクチベーター遺伝子または遺伝子発現カセットの前
に挿入し、これによってインビボで誘導可能な発現が少なくともｓｓｒＡおよび
ｓｓｒＢ遺伝子または完全なＳＰＩ２座を有する細菌において達成される。
【００７６】 こうして他の態様においては本発明は、前記の異種核酸のためのキャリヤー細
胞を含む、標的細胞における異種核酸のインビボで誘導可能な発現のための発現
系に関し、その際、前記のキャリヤー細胞は、前記のような（ａ）図２３Ｐに示
されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｓｓｒＡ）またはその機能的ホモロ
グ、（ｂ）図２３Ｑに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｓｓｒＢ）
またはその機能的ホモログ、ならびに（ｃ）図２４Ａ、Ｂの１つの核酸分子また
はその機能的ホモログを有する。
【００７７】 標的細胞は任意の適当な細胞であるが、有利にはこれはマクロファージである
。有利にはキャリヤー細胞はサルモネラ細胞である。標的細胞はまた前記のよう
な１種以上のエレメントを選択マーカーカセット、遺伝子発現カセット、遺伝子
発現カセット、トランスアクチベーターカセット、インベルターゼカセットおよ
び／または挿入カセットを有していてもよい。更にこれは、特に異種核酸を有し
ていてよく、異種核酸は遺伝子発現カセット中に挿入されていてよく、こうして
ＧＥＣ機能を示す。
【００７８】 本発明の更なる態様は図２４Ａ、Ｂの１つに示される核酸配列の少なくとも１
００ヌクレオチドを有するか、またはこれらとハイブリダイズし、かつプロモー
ター活性を有する核酸分子を異種核酸分子のインビボで誘導可能な発現のために
使用することに関する。
【００７９】 本発明の更なる態様はインビボで誘導可能なプロモーターの検出のための前記
の核酸分子の使用である。
【００８０】 実験方法 前記に示されたサルモネラ病原性アイライド２（ＳＰＩ２）の働きのＩＩＩ型
分泌系中で使用された菌株、材料および方法は次の通りである： マウス ６〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）を、施設内ガイドラインにしたが
って標準条件下で飼育した。この研究は、実験研究での動物使用に関する倫理委
員会によって承認された。
【００８１】 細菌株、ファージおよびプラスミド 本発明で使用された細菌株、ファージおよびプラスミドは第１表に記載されて
いる。別記しない限りは、細菌は３７℃で、適したアンピシリン（５０μｇ／ｍ
ｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはクロラムフェニコール（５０μｇ
／ｍｌ）が供給されているルーリア ベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）ブロ
スまたはアガー中で増加された。真核細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、
ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｌ、５×１０−５Ｍ
２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ Ｌ−グルタミン（GIBCO BRL; Prisl
ey, Scotland）が供給されているＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。β−ｇａｌ
の構成的な発現を達成するために、プラスミドｐＡＨ９７（Holtel et al., 199
2）を他で記載されているように（O' Callaghan and Charbit, 1990）ファージ
保有菌株中にエレクトロポレーションした。
【００８２】 第１表 本発明で使用されたファージ、プラスミドおよび細菌株
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】 例１：異なるサルモネラ菌株の範囲内での病原性領域ＳＰＩ−２の分布 種々のサルモネラ分離株およびＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２中のＳＰＩ−２領域転
写解読枠の存在を第２表に示したようにサザンハイブリダイゼーションによって
分析した。
【００８９】 第２表：発現遺伝子プローブから導かれた種々のサルモネラｓｓｐ．中のＳＰＩ
−２遺伝子の保有率
【００９０】
【表６】
【００９１】 ハイブリダイゼーションバンドの有無は、それぞれ＋または−によって示される
。
【００９２】 ハイブリダイゼーション 種々のサルモネラ菌株およびＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２のゲノムＤＮＡを以前に
示されているように調製した（Hensel et al., 1997a）。サザンハイブリダイゼ
ーション分析のために、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶで切断し、
０．６％アガロースゲル上で分画し、かつＨｙｂｏｎｄＮ＋メンブレン（Amersh
am, Braunschweig）にトランスファーした。ＳＰＩ−２領域に対応する種々のプ
ローブをλ１のサブクローニングされたインサートの制限断片として得た。ＯＲ
Ｆ２４２およびＯＲＦ３１９に対応するプローブをそれぞれのプライマー対
【００９３】
【外１】
【００９４】 を用いて、ＰＣＲによって製造した。ＰＣＲは製品使用説明書（Perkin-Elmer,
Weiterstadt）にしたがって実施した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動
し、かつ期待される大きさの断片を回収し精製した。ハイブリダイゼーションプ
ローブを、ＤＩＧラベリングシステム（Boehringer, Mannheim）を用いて製品に
記載されているように標識した。
【００９５】 例２：ｓｓｅ遺伝子の特徴付けおよびｓｓｅＣ：：ａｐｈＴ、ｓｓｅＤ：：ａｐ
ｈＴおよびｓｓｅＥΔネズミチフス菌突然変異株 ＭｖＰ１０３、ＭｖＰ１０１
およびＭｖＰ１０２の構造 ｓｓｅ遺伝子およびｓｓｃ遺伝子の起源 ＳＰ１２を遺伝的にかつ機能的に特徴付けるために、病原性領域の中央領域（
図１Ａ）をクローン化し、かつシークエンシングした。ｓｓａＣおよびｓｓａＪ
の間の領域を包囲するＤＮＡ断片は、図１Ｃ中に示されているようにプラスミド
ｐ５−２およびｐ５−４中にサブクローニングした。ｓｓａＣおよびｓｓａＫ間
の８ｋｂ領域中で遺伝子の配置および呼称は、図１Ｂに示されている。この配列
は、近い将来においてアクセス番号ＡＪ２２４８９２で、ＥＭＢＬデータベース
から入手可能であろう。シークエンシングされた領域はｓｐｉＢとして示された
ＩＩＩ型分泌器官の推定サブユニットをコードする遺伝子の転写解読枠（ＯＲＦ
）を拡大した。ＩＩＩ型分泌系サブユニットに関する一般的学名（Bogdanove et
al.,）および他のＳＰＩ２遺伝子に関する学名（Hensel et al., 1997b）を統
一するために、この遺伝子はｓｓａＤと呼称された。ｓｓａＤの推定されるアミ
ノ酸配列は、Ｙ．エンテロコリティカ（Y. enterocolitica）のＹｓｃＤと２４
％の同一性を有する。これは、タンパク質９．３ｋＤａに対するコード容量を有
するＯＲＦによって続けられ、この場合、これは、Ｙ．エンテロコルティカのＹ
ｓｃＥと３４％の同一性を有する。したがって、この遺伝子はｓｓａＥと名付け
られる。２６３ｂｐの配列は、ｓｓａＥおよび９つ遺伝子群、分泌されたエフェ
クタータンパク質または他の病原菌からのシャペロンと配列類似性を有するコー
ドタンパク質の幾つかを分離する。前記遺伝子は、短い遺伝子間領域によって分
離されるか、あるいは重複解読枠（overlapping reading frame）を有し、かつ
その幾つかは共転写（co-transcribed）され、かつ翻訳的に結合されると考えら
れる。したがって、前記コーディングシャペロンと類似の遺伝子はｓｓｃＡおよ
びｓｓｃＢと名付けされ、かつ他はｓｓｅＡ−Ｅと名付けされた。ｓｓｃＡから
導かれたアミノ酸配列は、ＹｏｐＢおよびＹｏｐＤ（Wattiau et al., 1994）に
対する分泌特異的シャペロンとして作用する、Ｙ．プセイドツベルクロシス（Y.
pseudotuberculosis）のＩｃｒＨの生成物である、ＳｙｃＤに対して、１５８
アミノ酸残基上で２６％の同一性／４９％の類似性を示す。ｓｓｃＢから導かれ
たアミノ酸配列は、シゲラ フレクスネリ（Shigella flexneri）のｌｐｐｌに
対して９８アミノ酸残基上で、２３％の同一性／３６％の類似性を示す。ｌｐｐ
ｌは、Ｓ．フレクスネリ 逆タンパク質（ｌｐａｓ）（Baundry et al., 1988）
のためのシャペロンである。分泌シャペロンＳｙｃＤ、ＩｐｐＩおよびＳｉｃＡ
（Kaniga et al., 1995）に関する場合と同様に、ＳｓｃＢは酸性ｐｌ（第３表
）を有し、その一方でＳｓｃＡは通常８．８の高いｐｌを有する。ＳｓｅＢは、
１９２アミノ酸残基タンパク質の全長上でＥＰＥＣのＥｓｐＡに対して、２５％
の同一性／４７％の類似性である。ＳｓｅＤは１６６アミノ酸残基上でＥＰＥＣ
のＥｓｐＢに対して２７％の同一性／５１％の類似性である。ＳｓｅＣは、標的
ホスト細胞中への他のエフェクターの転座中に含まれるエフェクタータンパク質
のクラスに対して配列類似性を有する。これらは、Ｙ．エンテロコリティカのＹ
ｏｐＢ、ＥＰＥＣのＥｓｐＤおよびシュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aerugunosa）のＰｅｐＢを含む。ＳｓｅＣは、ＥＰＥＣのＥｓｐＤおよびＹ
．エンテロコリティカのＹｏｐＢの双方に対しておおよそ２４％の同一性／４８
％の類似性である（図２ａ）。ＥｓｐＤおよびＹｏｐＢは、標的細胞膜中への挿
入が示されている２個の疎水性ドメインを有する（Pallen et al., 1997）。Ｓ
ｓｅＣは、膜−緊張性（membran-spanning）ドメインを表していてもよい３個の
疎水性ドメインを有する。前記に示されたエフェクタータンパク質の他の特徴は
第１表に示されている。ＴＭ予測プログラム（TMpredict program）（Hofmann a
nd Stoffel, 1993）を使用して、膜内外ヘリシス（transmembrene helices）は
、極めて親水性のＳｓｅＡとは別として、すべてのエフェクタータンパク質に関
して予測される。他の病原菌中のホモログに対するＳｓｅＣの配置は、図２ｂに
示されている。保存的アミノ酸は、主に、中心部、タンパク質のより疎水性部分
である中心部に集中しているが、しかしながら、ＹｏｐＢとは異なり、毒素のＲ
ＴＸファミリーに対する顕著な類似性はみられない。ＳｓｅＤ中の保存残基は、
主にタンパク質のＮ−末端半分に存在する。ｓｓｅＡＢＣＤＥＦの導かれたアミ
ノ酸配列と、ＰＲＯＳＩＴＥデータベース中の載せられているものとの比較によ
って、任意の特徴的なタンパク質モチーフの存在は示されなかった。ｓｓｅ遺伝
子の予測されるアミノ酸配列を、パーレンら（Pallen et al.）(1997) によって
記載されているように、プログラムＣＯＩＬおよびＭＵＬＴＩＣＯＩＬを使用し
て探究することが挙げらた。ＳｓｅＡおよびＳｓｅＤはそれぞれ１個の３量体コ
イル（trimeric coil）を有することが予測され、かつＳｓｅＣは２個の３量体
コイルを有することが予測される（第３表）。それというのも、ＥｓｐＢおよび
ＥｓｐＤは１個および２個の３量体コイルを有することがそれぞれ予測され（Pa
llen et al., 1997）、これは、前記タンパク質が機能的関連性があるというさ
らなる証拠を提供する。
【００９６】 第３表 予測されたタンパク質の特徴
【００９７】
【表７】
【００９８】 ＳＰＩ２遺伝子の発現 組み換えＳＰＩ２タンパク質に対する抗体の生成 ＳＰＩ２遺伝子ｓｓｅＢ、ｓｓｃＡおよびｓｓａＰの発現を試験するために、
組み換えＳＰＩ２タンパク質、ＳｓｅＢ、ＳｓｃＡおよびＳｓａＰに対して生じ
るポリクローナル抗体を有する全細菌細胞のウエスタン ブロット分析が実施さ
れた。
【００９９】 タンパク質ゲル電気泳動およびウエスタン ブロッティングは、他で記載され
たように実施された（Laemmli, 1970 and Sambrook et al., 1989）。組み換え
ＳＰＩ２タンパク質発現のためのプラスミドを、プラスミドｐＱＥ３０、ｐＱＥ
３２（Qiagen, Hilden）中で、 Ｎ−末端 ６Ｈｉｓ ｔａｇに対するインフレ
ーム（in-frame）融合を生じさせるために、別個のＳＰＩ２遺伝子のクローニン
グによって構築した。組み換えＳＰＩ２遺伝子は、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｍ１５［ｐＲ
ＥＰ］（Qiagen）中で発現され、かつ製造業者（Qiagen）の薦めにしたがって、
金属キレートクロマトグラフィーによって精製した。免疫化（immunisation）の
ために、組み換えＳＰＩ２タンパク質約１ｍｇを、一次免疫化および追加免疫化
のためのそれぞれ完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバ
ントを用いて乳化させた。ウサギを、標準プロトコールにしたがって、皮下に免
疫化した（Harlow and Lane, 1988）。ＳＰＩ２タンパク質を、全細胞からのタ
ンパク質の電気泳動による分離の後に、組み換えＳＰＩ２タンパク質に対して生
じた抗血清を用いて検出し、かつ‘セミ−ドライ（Semi-Dry）’ブロッティング
装置（Bio-Rad）を用いて、製品マニュアルにしたがって、ニトロセルロースメ
ンブレン（Schleicher and Schuell）上にトランスファーした。結合した抗体を
、２次抗体アルカリホスファターゼ複合体を用いて、標準プロトコール（Harlow
and Lane）に従って視覚化した。
【０１００】 レポーター遺伝子融合体の生成 ＳＰＩ２中の種々の遺伝子に対するレポーター遺伝子、発光性ルシフェラーゼ
（luc）の融合は、自殺ベクターｐＬＢＯ２およびｐＧＰＬ０１（Gunn and Mill
er, 1996）を用いて得られ、この場合、これはＤｒ．ガンおよびＤｒ．ミラー（
Drs. Gunn and Miller）（Seattle）によって好意的に提供されたものであった
。
【０１０１】 ｓｓａＢに対する融合を生じさせるために、ｐ２−２のＥｃｏＲＶ断片８３１
ｂｐを、ＥｃｏＲＶ切断されたｐＳＫ＋中にサブクローニングした。ｓｓｅＡに
対する転写的融合のために、ｐ５−４のＳｍａｌ／ＨｉｎｃＩＩ断片１０６０ｂ
ｐをｐＳＫ＋にサブクローニングした。得られた構築体のインサートは、Ｅｃｏ
ＲＩ／ＫｐｎＩ断片として回収され、かつＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ切断されたレポ
ーターベクターｐＧＰＬＯ１およびｐＬＢＯ２でライゲーションした。ｓｓａＪ
に対する転写融合体を生成するために、ｐ５−２のＳｍａＩ／ＫｐｎＩ断片３ｋ
ｂを直接的にｐＧＰＬＯ１およびｐＬＢＯ２中にサブクローニングした。
【０１０２】 ｌｕｃに対してＳＰＩ２遺伝子の転写融合体を有する構築体は、その後に、Ｅ
．Ｃｏｌｉ Ｓ１７−１ λｐｉｒを収容するぞれぞれの構築体と、１ナリジク
ス酸００μｇ×ｍｌ−１に耐性のネズミチフス菌自然突然変異体をかけあわせる
ことによって、ネズミチフス菌の染色体中に組み込み、かつカルベンシンリンお
よびナリジクス酸耐性の接合完了体を選択する。ＳＰＩ２（ｐＧＬＰ０１を用い
る構築体に関して）またはｚｃｈ領域（ｐＬＢ０２を用いる構築体に関して）中
の標的組み込みをサザン分析によって確認した。融合体をその後に、標準プロト
コールにしたがうＰ２２形質導入（Maloy et al., 1996）によって、ネズミチフ
ス菌ＮＣＴＣ１２０３２のマウス継代菌株中に移動させた。
【０１０３】 レポーター遺伝子の分析 レポーター遺伝子融合体のβ−ガラクトシダーゼ活性は、標準プロトコール（
Miller, 1992）にしたがって測定された。
【０１０４】 ＳＰＩ２遺伝子（菌株ＭｖＰ１２７、ｓｓｅＡ：：ｌｕｃ、菌株ＭｖＰ１３１
、ｓｓａＢ：：ｌｕｃ、菌株ＭｖＰ２６６、ｓｓａＨ：：ｌｕｃ）に対する発光
性ルシフェラーゼ融合体を収容する細菌株は、種々のＭｇ２＋濃度を有する培地
中で増殖させてもよい。培養物のアリコートのルシフェラーゼ活性を、プロメガ
（Promega）（Heidelberg）ルシフェラーゼ アッセイキットまたは適切な特注
の試薬を用いて測定した。
【０１０５】 要するに、細菌を５分間に亘って、２００００×ｇで、４℃での遠心分離によ
ってペレット化され、かつ溶解バッファー（100 mM KHPO４, pH7.8, 2mMEDTA, 1
% Triton X-100, 親ウシ血清アルブミン 5mg×ml - １、１ｍＭ ＤＴＴ、 リ
ソチーム 5mg×ml−１）中で再懸濁した。溶解物を室温で１５分に亘って、繰り
返し攪拌しながら恒温保持し、かつ凍結／融解サイクルを行った。溶解物のアリ
コート（２５μｌ）をマイクロタイタープレート（MICROFLUOR, Dynatech）に移
し、かつ５０μｌのルシフェラーゼ試薬（20mM Tricine-HCl, pH7.8, 1.07mM (M
gCO３)４ Mg(OH)２, 100μM EDTA, 33.3m M DTT, 270μM Li３-補酵素 A 470μM
D(-) -ルシフェリン, 530μM Mg-ATP）を添加した後すぐに、光子放出のために
、トリラックス マイクロベータ ルミノメーター（TriLux MicroBeta luminom
eter）（Wallac, Turku）を用いてアッセイした。すべてのアッセイは３重に行
い、かつ独立した条件下で繰り返した。
【０１０６】 成長培地の低いＭｇ２＋濃度によって誘導されるＳＰＩ２遺伝子、例えばｓｓａ
ＢおよびｓｓａＨの発現 ネズミチフス菌野生型菌株およびｓｓａＢに対するｌｕｃレポーター遺伝子融
合体を収容している菌株（菌株MvP131）およびｓｓａＨに対するｌｕｃレポータ
ー遺伝子融合体を収容している菌株（菌株MvP266）を、多量のＭｇ２＋（10mM M
gCl２）を含有する最少培地中で、中対数相（mid-log phase）（600nmでＯＤ約
０．５）まで増殖させた。Ｇ．バクテリア培地として引用される培地を、遠心分
離によって回収し、８μＭ Ｍｇ２＋を含有する最少培地中で３回に亘って洗浄
した。Ｆ．バクテリア培地として引用されるこの培地は、培地Ｆまたは培地Ｇ中
で再懸濁され、かつ成長は３７℃で続けられた。菌株ＭｖＰ１３１およびＭｖＰ
２６６の培養物のアリコートは、示された幾つかの異なる時点で採取され、かつ
ルシフェラーゼ活性のアッセイに使用された。野生型菌株のアリコートは、同時
点において採取された。全細菌細胞からのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って分離され、かつニトロセルロースメンブレンにトランスファーされた。これ
らのブロットは、マグネシウム濃度を変更した後に、タンパク質合成を検出する
ために、ＳｓａＰおよびＳｓｃＡ組み換えタンパク質に対して生じた抗体と一緒
に恒温保持した。細菌を、多量のＭｇ２＋を含有する成長培地から制限された量
のＭｇ２＋を含有する培地に移した後に、ＳＰＩ２遺伝子の発現は高く導入され
た。この導入は、ＳＰＩ２の異なる位置で融合されたレポーター遺伝子ｌｕｃを
用いて試験されてもよい。さらに、ＳＰＩ２導入後に合成されたタンパク質は、
ウエスタンブロットによって検出された。しかしながら、多量のＭｇ２＋の存在
下であっても、低いレベルのＳＰＩ２遺伝子発現がみられた。
【０１０７】 ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ制御によって調節されたＳＰＩ２遺伝子、例えばｓｓｅＡお
よびｓｓａＢの発現 ｓｓｅＢまたはｓｓｃＡの発現は、種々の冨化培地（rich media）または血清
を含むかまたは含まない細胞培養培地中での増殖の間にはみられない。しかしな
がら、少量のＳｓａＰが、ＬＢまたは他の冨化培地、例えば脳心臓インフージョ
ン（ＢＨＩ）中で成長させた後に検出された。３０μＭに満たないＭｇ２＋を含
有する最少培地中での成長は、ＳＰＩ２遺伝子発現を誘導する。このようなＭｇ ２＋ 濃度の効果は、ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ−制御された遺伝子に関して観察される
のみであった。この観察は、バルディビアおよびファルコフ（Valdivia and Fal
kow）（１９９７）による従来の報告とは対照的であり、この場合、この報告は
、ＳＰＩ２遺伝子発現がＰｈｏＰ／ＰｈｏＱとは独立していることを仮定するも
のであった。しかしながら、ＰｈｏＰｃ（構成的）菌株バックグランド（ＣＳＯ
２２、Miller et al., 1989）において、ＳＰ１２遺伝子の発現は構成的ではな
いが、しかしながら依然として培地のＭｇ２＋濃度に依存している。これは、Ｓ
ＰＩ２遺伝子発現がＰｈｏＰ／ＰｈｏＱによって制御されることを示すが、しか
しながら、さらなる調節因子、例えばＳｓｒＡ／Ｂは必要ではない。
【０１０８】 ＤＮＡクローニングおよびサブクローニング ＤＮＡ調製および遺伝子操作は、標準プロトコールに従って実施された（Sambro
ok et al., 1989）。細菌細胞のプラスミドＤＮＡ形質転換はエレクトロポレー
ションによって実施された（O'Callaghan and Charbit 1990）。ＳＰＩ２断片を
収容するクローンは、以前に示されているλ１０５９中のネズミチフス菌の染色
体ＤＮＡライブラリーから同定された（Shea et al., 1996）。ｓｓｅおよびｓ
ｓｃ遺伝子は、図１および第１表で示されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中の
５．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（ｐ５−２）および５．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断
片（ｐ５−４）上で、クローンλ５からサブクローニングされた。
【０１０９】 ＤＮＡシークエンシングはプライマーワーキングストラダジー（primer-walki
ng strategy）を用いて実施した。ジデオキシ法（Sanger et al., 1977）を、手
動シークエンシングのためのファルマシアＴ７シークエンシングシステム（Phar
macia T7 sequencing system）およびＡＢＩ３７７シークエンシング装置で自動
分析のための色素終始暗号化学（dye terminator chemistry）を用いて実施した
。ＤＮＡ配列からのコンティグの組立ては、アシェンブリイリグ（AssemblyLign
）およびマックベクターソフトウエア（Mac Vector software）（Oxford Molecu
lar, Oxford）によって実施した。他の配列分析のために、ＧＣＧパッケージン
グ（GCG package） バージョン８（Devereux et al., 1984）のプログラムを、
ＨＧＭＰネットワーク上で使用した。
【０１１０】 非極性突然変異体の構築 ｓｓｅＣ（MvP103）、ｓｓｅＤ（MvP101）およびｓｓｅＥ（MvP102）中の非極
性突然変異体の構築は、以下に記載されている。すべての染色体の修飾はＰＣＲ
およびサザンハイブリダイゼーション分析（Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98
: 503~517）によって確認された。
【０１１１】 突然変異体ＭｖＰ１０３、ｓｓｅＣ．Ａ２．６ｋｂ断片を、ｐ５−２のＢａｍ
ＨＩおよびＣｌａＩ切断の後に回収し、かつＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ切断ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋中にサブクローニングした。結果として生じるｐ５−
Ｐ５０と名付けられた構築体は、ＨｉｎｄＩＩＩによって切断され、ＤＮＡポリ
メラーゼのクレノー断片を用いて平滑末端にし、かつａｐｈＴカセットにライゲ
ーションした。転写ターミネーターが除去された（Galan et al., 1992）アミノ
グリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｈＴ）を含有するｐＳ
Ｂ３１５のＨｉｎｃＩＩ断片９００ｂｐは、同様の向きでプラスミドｐ５−５０
の平滑末端化されたＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションされた。Ｅ．Ｃｏｌｉ
ＸＬ−１Ｂｌｕｅの形質転換およびマナマイシンおよびカルベニシリン（それぞ
れ５０μｇ／ｍｌ）耐性株の選択の後に、一つのクローンが選択され、かつ収容
するプラスミドを単離された。このプラスミドはｐ５−５１と名付けられ、かつ
その同定を制限酵素分析によって確認した。これはＳａｌＩ／ＸｂａＩでさらに
切断し、かつ３．５ｋｂのインサートをＳａｌＩ／ＸｂａＩ切断ｐＧＰ７０４に
ライゲートした。このプラスミドを、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＣＣ１１８λｐｉｒにエレ
クトロポレーションし、かつ形質転換体をカナマイシンおよびカルベニシリン（
それぞれ５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した。その後に、一つのクローンを
選択し、ｐ５−５３と呼称されたｐＧＰ７０４中に前記ＤＮＡ断片を含有するプ
ラスミドを単離し、かつ制限酵素分析によって確認した。プラスミドｐ５−５３
をＥ．Ｃｏｌｉ Ｓ１７−１ λｐｉｒ中にエレクトロポレーションし、かつネ
ズミチフス菌 ＮＣＴＣ１２０２３（ナリジクス酸耐性、１００μｇ／ｍｌ）中
に以前に示されているように接合によってトランスファーした（de Lorenzo and
Timmis, 1994）。ｓｓｅＣ遺伝子が、ａｐｈＴカセットの挿入によって分断さ
れたクローン遺伝子によって置換されている接合完了体は、カナマイシンおよび
ナリジクス酸（１００μｇ／ｍｌ）耐性によって選択された。結果として生じる
接合完了体は、ラクトース陰性表現型に関して、かつカルベニシリンに対するそ
れらの感受性に関して最終的に試験した。選択されたクローンはさらにサザンブ
ロト分析によって試験した。選択されたクローンはさらにサザンブロット分析に
よって試験された。クローニング工程中に獲得された可能な突然変異体を排除す
るために、突然変異されたｓｓｅＣ対立遺伝子を、Ｐ２２形質導入（Ｍａｌｏｙ
ら、１９９６年で記載された）によって、新鮮なサルモネラバックグランドにト
ランスファーされた。結果として生じるサルモネラ菌株ＭｖＰ１０３を、ＰＣＲ
を用いて、ｓｓｅＣ遺伝子の範囲内で耐性カセットの存在に関して試験した。増
幅は、プライマー
【０１１２】
【外２】
【０１１３】 を用いてＰＣＲによって実施した。得られる断片はネズミチフス菌野生型に関し
ては１．６ｋｂおよびＭｖＰ１０３菌株に関しては２．５ｋｂを有していた。
【０１１４】 ｓｓｅＣ中の非極性突然変異体の相補性に関して、相当する遺伝子を染色体Ｄ
ＮＡから、ＰＣＲによって、推定される開始コドンの５’領域および遺伝子の３
’末端に相当するプライマー群を用いて増幅した。これらのプライマーは、増幅
された遺伝子の末端領域で、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入した。ＢａｍＨＩで
の切断の後に、遺伝子をＢａｍＨＩ切断されたｐＡＣＹＣ１８４（Chang and Co
hen, 1978）にライゲートし、かつＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α中にトランスファー
した。インサートの向きはＰＣＲによって決定され、かつさらに、ＤＮＡシーク
エンシングをインサートの向きおよび正確なＤＮＡ配列を確認するために実施し
た。ｐＡＣＹＣ１８４のＴｅｔｒ遺伝子として、同様の転写配位中でインサート
を含有するプラスミドは、相補性の試験のために選択され、かつ相当する非極性
突然変異体を収容するネズミチフス菌菌株にエレクトロポレーションした。
【０１１５】 突然変異体ＭｖＰ１０１、ｓｓｅＤ、３．０ｋｂフラグメントを、ｐ５−２の
ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ切断の後に回収され、かつＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ切断
されたｐＵＣ１８中にサブクローニングした。得られるｐ５−３０と名付けられ
た構築体はＥｃｏＲＶによって切断され、かつアルカリホスファターゼで処理さ
れた。ａｐｈＴカセットを前記に示されたようにして単離し、かつ特異的なＥｃ
ｏＲＶ部位に同様の向きで、線状化されたプラスミドｐ５−３０にライゲートし
た。Ｅ．Ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅの形質転換およびカナマイシンおよびカル
ベニシリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌ）に対する選択の後に、１個のクローンを
選択し、かつ収容するプラスミドを単離した。このプラスミドをｐ５−３１と名
付け、かつその個性を制限酵素分析よって確認した。さらに、ｐ５−３１をＳｐ
ｈＩおよびＥｃｏＲＩによって切断し、４．０ｋｂの断片を単離し、かつＳｐｈ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ切断されたｐＧＰ７０４にライゲートした。このプラスミドをＥ
．Ｃｏｌｉ ＣＣ１１８λｐｉｒにエレクトロポレーションし、かつ形質転換体
をカナマイシンおよびカルベニシリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌ）に対して選択
した。その後に、１個のクローンを選択し、ｐ５−３３と名付けられた、ｐＧＰ
７０４ので相当するＤＮＡ断片を有するそのプラスミドを単離し、かつ制限酵素
分析によって確認した。プラスミドｐ５−３３をＥ．Ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐ
ｉｒ中にエレクトロポレーションし、かつ以前に示されているように（de Loren
zo and timmis, 1994）接合によってネズミチフス菌 ＮＣＴＣ１２０２３（ナ
リジクス酸耐性）中にトランスファーした。ｓｓｅＤ遺伝子がａｐｈＴカセット
の挿入によって分断されたクローン化された遺伝子によって置換されている接合
完了体は、カナマイシンおよびナリジクス酸（１００μｇ／ｍｌ）耐性によって
選択した。生じる接合完了体を、最終的にラクロース陰性表現型およびそのカル
ベニシリンに対する感受性を試験した。選択されたクローンをさらにサザンブロ
ット分析によって試験した。クローニング工程中で集積されうる可能な突然変異
体を取り除くために、突然変異されたｓｓｅＤ対立遺伝子を、Ｐ２２形質導入（
Maloyら、１９９６年によって記載された）によって新鮮なサルモネラバックグ
ランドにトランスファーした。得られるサルモネラ菌株ＭｖＰ１０１をｓｓｅＤ
遺伝子の範囲内で、ＰＣＲを用いて耐性カセットの存在に関して試験した。増幅
は、プライマー
【０１１６】
【外３】
【０１１７】 を用いることによって実施した。ネズミチフス菌野生型に関して０．８ｋｂの大
きさを有する、得られた断片を使用し、かつ菌株ＭｎＰ１０１のカセット中では
１．７ｋｂであった。
【０１１８】 ｓｓｅＥおよびｓｓｃＢ部分が欠失した、突然変異体ＭｖＰ１０２。４．５ｋ
ｂの断片をｐ５−２のＳｓｒＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断の後に回収し、かつＳ
ｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＫＳ＋中にサブクローニングした。得られたｐ５
−４０と名付けされた構築体はＳｍａＩによって切断し、アルカリフォスファタ
ーゼで処理し、かつａｐｈＴカセットと、前記に示されたようなｓｓｅＥ／ｓｓ
ｅＢ欠失プラスミド中で作製された特異的なＳｍａＩ部位中に、同様の向きでラ
イゲートした。Ｅ．Ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅの形質転換およびカナマイシン
およびカルバニシリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌ）に対する選択の後に、１個の
クローンを選択し、かつ収容されるプラスミドを単離した。このプラスミドをｐ
５−４１と名付け、かつ制限酵素分析を介してその同一性を確認した。これをさ
らにＫｐｎＩおよびＳｓｔＩで切断し、かつインサートをＫｐｎＩ／ＳｓｔＩで
切断されたｐＮＱ７０５にライゲートした。このプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ Ｃ
Ｃ１１８λｐｉｒ中にエレクトロポレーションし、かつカナマイシンおよびクロ
ラムフェニコール（それぞれ５０μｇ／ｍｌ）に対して選択された細菌に形質転
換した。その後に、１個のクローンを選択し、ｐ５−４３と名付けられたｐＮＱ
７０５中の相当するＤＮＡ断片を含有するそのプラスミドを単離し、かつ制限酵
素分析によって確認した。得られたプラスミドを前記に示されたようにサルモネ
ラ染色体上に突然変異された遺伝子をトランスファーするために使用した。得ら
れたクローンはをさらにサザンブロット分析によって試験した。クローン化工程
中に獲得されうる可能な突然変異体を取り除くために、突然変異されたｓｓｅＥ
／ｓｓｃＢ対立遺伝子を、Ｐ２２形質導入によって新鮮なサルモネラバックグラ
ンドにトランスファーした。得られたサルモネラ菌株ＭｖＰ１０２をＰＣＲを用
いて、ｓｓｅＥ／ｓｓｅＢ遺伝子の範囲内での耐性カセットの存在を試験した。
増幅は、プライマー
【０１１９】
【外４】
【０１２０】 を用いて実施した。得られた断片はネズミチフス菌野生型に関しては１．６ｋｂ
および菌株ＭｖＰ１０２に関しては１．９ｋｂの大きさを有した。
【０１２１】 ｓｓｅC、ｓｓｅＤおよびｓｓｃＢ中のイン−フレーム欠失を含む突然変異株の
構築： ｓｓｅＥ中の非極性は、マウスモデル中で、著しいビルレンスの弱毒化を生じ
ないことの観察に基づいて、ｓｓｅＥ遺伝子のための欠失突然変異体の調製は、
ファージ保有菌株の生成のために重要である。
【０１２２】 ｓｓｅＣ中のイン−フェレーム欠失の構築、突然変異体ＭｖＰ３３７ ｓｓｅＣのコドン２６４および４２２間の１５８ｂｐの欠失を生成した。プラ
スミドｐ５−２をＣｌａＩによって切断し、かつより長い断片を含有するベクタ
ータンパク質を回収し、セルフライゲートし、ｐ５−６０を生成した。プラスミ
ドｐ５−６０をＨｉｎｄＩＩＩでの切断によって線状化し、この場合、これはｓ
ｓｅＣ遺伝子の範囲内で一度に切断される。プライマー
【０１２３】
【外５】
【０１２４】 をＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入するように設計した。ＰＣＲを、テンプレートＤＮ
Ａとして線状化されたｐ５−６０を用いて実施した。ＴａｑＰｌｕｓポリメラー
ゼ（Stratagene）を製品の使用説明書に従って使用した。１００μｍ容量の反応
物を１０μｌの１０×ＴａｑＰｌｕｓを用いて作製した。精密バッファー（prec
ision buffer）は、塩化マグネシウム、１００ｍＭ ｄＮＴＰｓ ０．８μｌ、
ＤＮＡテンプレート ２５０ｎｇ（線状化ｐ５−８）、それぞれのプライマー
２５０ｎｇおよびＴａｑＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕを含有している。Ｐ
ＣＲを：９５℃ １分間、６０℃ １分間、７２℃ ６分間の３５サイクルで実
施した。その後に７２℃で１０分間の最終工程が付け加えられた。ＰＣＲ反応物
１０μｌを分析した。期待される大きさの生成物を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩによ
って切断し、セルフライゲートし、かつライゲーション混合物をＥ．Ｃｏｌｉ
ＤＨ５αをカルベニシリン耐性に形質転換するために使用した。プラスミドを形
質転換体から単離し、かつインサートの完全性および欠失を制限酵素切断および
ＤＮＡシークエンシングによって分析した。確認された構築体のインサートをＸ
ｂａＩおよびＫｐｎＩで切断した後に単離し、かつＸｂａＩ／ＫｐｎＩ切断され
たベクターｐＫＡＳ３２にライゲートした。得られた構築体をＥ．Ｃｏｌｉ Ｓ
１７−１λｐｉｒをカルベニシリン耐性に形質転換するために使用し、かつプラ
スミドのネズミチフス菌（NalＲ, StrepＲ）への接合的トランスファーを、標準
プロトコール（de Lorenzo and Timmis, 1994）に従って実施した。相同組み換
えによって自殺プラスミドに組み込まれた接合完了体をナリジクス酸耐性および
カルベニシリン耐性によって選択し、かつストレプトマイシンに対する感受性に
関してスクリーニングした。このようなクローンをＬＢ中でＯＤ６００で約０．
５までに増殖させ、かつアリコートをストレプトマイシン２５０μｇ／ｍｌ含有
するＬＢ上にプレートし、組み込まれたプラストを失い、かつ対立遺伝子交換を
うけたコロニーを選択した。ストレプトマイシン耐性であるが、カルベニシリン
感受性のクローンを他の分析に使用した。ｓｓｅＣ座の範囲内で欠失を有する突
然変異体のスクリーニングを、ＰＣＲによって、プライマー
【０１２５】
【外６】
【０１２６】 を用いて実施した。野生型ｓｓｅＣ対立遺伝子を含有するクローンからのＤＮＡ
の増幅は、１５２０ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、内部欠失体を有するｓｓｅＣ対立
遺伝子を保持するクローンからのＤＮＡの使用は、１０５０ｂｐのＰＣＲ産物を
生じた。ｓｓｅＣ欠失体を保持するクローンの完全性を、ｓｓｅＣ座のサザン分
析によってさらに確認した。最終的に、内部的なイン−フレーム欠失体を保持す
るｓｓｅＣ座を、Ｐ２２形質導入（Maloyら、１９９６年）によって、ネズミチ
フス菌の新鮮な菌株バックグランドに移し、かつ生じた菌株をＭｖＰ３３７と呼
称された。
【０１２７】 ｓｓｅＤ中のイン−フレーム欠失体の構築、突然変異株ＭｖＰ３３８ ｓｓｅＤのコドン２６および１４２間の１１６ｂｐの欠失を生じた。プラスミ
ドｐ５−２をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩによって切断し、かつ２．１ｋｂの断片
を単離し、かつＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ切断されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＳＫ＋中にサブクローニングした。得られた構築体をｐ５−８と呼称した
。ｐ５−８をＥｃｏＲＶでの切断によって線状化し、この場合、これはｓｓｅＤ
遺伝子の範囲内で２回に亘って切断された。プライマー
【０１２８】
【外７】
【０１２９】 をＥｃｏＲＩ部位に導入するように設計した。ＰＣＲをテンプレートＤＮＡとし
て線状化されたｐ５−８を用いて実施した。ＴａｑＰｌｕｓポリメラーゼ（Stra
tagene）を製品の使用説明書にしたがって使用した。１００μｌ容量の反応物を
、塩化マグネシウム、１００ｍＭ ｄＮＴＰｓｐ ０．８μｌ、ＤＮＡテンプレ
ート ２５０ｎｇ（線状化されたｐ５−８）、それぞれのプライマー ２５０ｎ
ｇおよびＴａｑＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕを含有する１０×ＴａｑＰｌ
ｕｓ精密バッファー １０μｌを用いて製造した。ＰＣＲを９５℃ １分間、６
０℃ １分間、７２℃ ５分間の３５サイクルで実施した。その後に７２℃で１
０分間の最終工程を付け加えた。ＰＣＲ反応物 １０μｌを分析した。期待され
る大きさの生成物を回収し、ＥｃｏＲＩによって切断し、セルフライゲートし、
かつライゲーション混合物をＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５αをカルベニシリン耐性に形
質転換するために使用した。プラスミドを形質転換体から単離し、かつインサー
トの完全性および欠失を制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングによって
分析した。確認された構築体のインサートをＸｂａＩおよびＫｐｎＩでの切断の
後に単離し、かつＸｂａＩ／ＫｐｎＩ切断ベクターｐＫＡＳ３２をライゲートし
た。得られた構築体を、Ｅ.Ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐｉｒをカルベニシリン耐
性に形質転換するために使用し、かつプラスミドのネズミチフス菌（NalＲ, Str
epＲ）に対する接合的トランスファーを、標準プロトコール（de Lorenzo and T
immis., 1994）に従って実施した。相同組み換えによって自殺プラスミドに組み
込まれた接合完了体をナリジクス酸耐性およびカルベニシリン耐性によって選択
し、かつストレプトマイシンに対する感受性をシークエンシングした。このよう
なクローンをＬＢ中で、ＯＤ６００で約０．５になるまで増殖させ、かつアリコ
ートをストレプトマイシン２５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ上にプレートし、コ
ロニーを選択し、この場合、このコロニーは組み込まれたプラスミドを失い、か
つ対立遺伝子交換がなされている。ストレプトマイシン耐性であるが、カルベニ
シリン感受性のクローンを他の分析に使用した。ｓｓｅＤ座の範囲内で欠失を有
する突然変異体のシークエンシングをＰＣＲによって、プライマー
【０１３０】
【外８】
【０１３１】 を用いて実施した。野生型ｓｓｅＤ対立遺伝子を含有するクローンからのＤＮＡ
の増幅は、５６０ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、内部欠失体を有するｓｓｅＤ対立遺
伝子を保持するクローンからのＤＮＡの使用は、２２０ｂｐのＰＣＲ産物を生じ
た。ｓｓｅＤ欠失体を保持するクローンの完全性を、さらにｓｓｅＤ座のサザン
分析によって確認した。最終的に、イン−フレーム欠失体を有するｓｓｅＤ座を
、Ｐ２２形質導入（Maloy et al., 1996）によってネズミチフス菌の新鮮な菌株
バックグランドに移し、かつ得られた菌株をＭｖＰ３３８と名付けた。
【０１３２】 ｓｓｃＢ中のイン−フレーム欠失体の構築、突然変異株ＭｖＰ３３９ ｓｓｃＢのコドン３２および１６０間の１２８ｂｐの欠失が生じた。プラスミ
ドｐ５−２のＢｇ／ＩＩ断片３ｋｂを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫｓ＋のＢａｍ
ＨＩ部位にライゲートし、プラスミドｐ５−７０を製造した。プラスミドｐ５−
７０をＮｃｏＩでの切断によって線状化し、この場合、これはｓｓｃＢ遺伝子の
範囲内で一度に切断された。プライマー
【０１３３】
【外９】
【０１３４】 をＢａｍＨＩ部位に導入するように設計した。ＰＣＲをテンプレートＤＮＡとし
て線状化されたｐ５−７０を用いて実施した。ＴａｑＰｌｕｓポリメラーゼ（St
ratagene）を製品の使用説明書にしたがって使用した。１００μｌ容量の反応物
を、塩化マグネシウム、１００ｍＭ ｄＮＴＰｓ ０．８μｌ、ＤＮＡテンプレ
ート２５０ｎｇ（線状化されたｐ５−７０）、それぞれのプライマー２５０ｎｇ
およびＴａｑＰｌｕｓポリメラーゼ ５Ｕを含有する、１０×ＴａｑＰｌｕｓ精
密バッファー １０μｌを用いて作製した。ＰＣＲを、９５℃ １分間、６０℃
１分間、７２℃ ６分間の３５サイクルで実施した。その後に７２℃で１０分
間の最終工程を付け加えた。ＰＣＲ反応物 １０μｌを分析した。期待された大
きさの生成物を回収し、ＢａｍＨＩによって切断し、セルフライゲートし、かつ
ライゲーション混合物、Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５αをカルベニシリン耐性に形質転換
するために使用した。プラスミドを形質転換体から単離し、かつインサートの完
全性および欠失を制限酵素分析およびＤＮＡシークエンシングによって分析した
。確認された構築体のインサートを、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで切断した後に単
離し、かつＸｂａＩ／ＫｐｎＩ切断されたベクターｐＫＡＳ３２２にライゲート
した。得られた構築体を、Ｅ．ＣｏｌｉＳ１７−１ λｐｉｒをカルベニシリン
耐性に形質転換するために使用し、かつＳ．チリフィルム（NalＲ, StrepＲ）に
対する接合トランスファーを、標準プロトコール（de Lorenzo and Timmis, 199
4）にしたがって実施した。相同組み換えによって自殺プラスミドに組み込まれ
た接合完了体を、ナリジクス酸耐性およびカルベニシリン耐性によって選択し、
かつストレプトマイシンに対する感受性に関してスクリーニングした。このよう
なクローンをＬＢ中で、ＯＤ６００で約０．５になるまで増殖させ、かつアリコ
ートを、ストレプトマイシン２５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ上にプレートし、
コロニーを選択し、この場合、このコロニーは、組み込まれたプラスミドを失い
、かつ対立遺伝子交換がなされている。ストレプトマイシン耐性であるがカルベ
ニシリン感受性のクローンを他の分析に使用した。ｓｓｅＣ座の範囲内での欠失
を有する突然変異体のスクリーニングを、ＰＣＲによって、プライマー
【０１３５】
【外１０】
【０１３６】 を用いて実施した。野生型ｓｓｃＢ対立遺伝子を含有するクローンからのＤＮＡ
の増幅は、４８０ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、内部欠失を有するｓｓｃＢ対立遺伝
子を保持するクローンからのＤＮＡの使用は、１００ｂｐのＰＣＲ産物を生じた
。ｓｓｅＣ欠失体を保持するクローンの完全性は、ｓｓｃＢ座のサザン分析によ
ってさらに確認された。最終的に、内部フレーム内欠失を含有するｓｓｃＢ座を
、Ｐ２２形質導入（maloy et al., 1996）によって、ネズミチフス菌の新鮮な菌
株バックグランドに移し、かつ得られた菌株をＭｖＰ３３９と名付けた。
【０１３７】 ｓｓｅＣ遺伝子中での欠失突然変異体の構築 他の試みにおいて、染色体ｓｓｅＣ遺伝子の完全長配列を、遺伝子の欠失させ
たコピーを用いて、対立遺伝子置換によって欠失させた。欠失を自殺プラスミド
（pCVD442 (Donnenberg et al., 1991)）中で構築した。最初に、ｓｓｅＣ遺伝
子に隣接する２個のＤＮＡ断片（断片Aは、それぞれ人為的ＳａｌｌおよびＸｂ
ａＩ部位をその５’末端および３’末端でそれぞれ有するものであり、かつ断片
Ｂは人為的ＸｂａＩおよびＳａｃＩ部位をその５’末端および３’末端でそれぞ
れ有するものである）をＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲのために使用された
オリゴヌクレオチドは、
【０１３８】
【外１１】
【０１３９】 得られたＰＣＲフラグメントをＸｂａＩ部位を介して一緒に融合した。得られ
たフラグメントをＳａｌＩおよびＳａｃｌで切断し、かつＳａｌＩおよびＳａｃ
Ｉで切断されたｐＣＶＤ４４２中にクローニングした。得られたプラスミドを接
合によってネズミチフス菌 ＮＣＴＣ１２０２３中に導入し、かつプラスミドの
ｓｓｅＣ座への染色体組み換え体を、プラスミドがコードされたアンピシリン耐
性マーカーによって選択した。第２工程において、プラスミドが失われたクロー
ンをアンピシリン耐性の損失に対してスクリーニングした。得られたクローンを
ＰＣＲによって、ｓｓｅＣ遺伝子の染色体欠失に関する試験をし、かつ完全長ｓ
ｓｅＣ転写解読枠を含有する１４５５ｂｐの断片の欠失が確認された。このΔｓ
ｓｅＣ突然変異株を、ＩＩＩ−５７ΔｓｓｅＣと名付けた。
【０１４０】 ｓｓｅＣ−ａｒｏＡ二重突然変異体の構築 生ワクチンのための基本型として役立ってもよい二重突然変異体を構築するた
めに、ＭｖＰ１０３からのｓｓｅＣ：ａｐｈＴ（ｋｍｒ）マーカーを、ａｒｏＡ
遺伝子の安定した欠失を含有する菌株であるネズミチフス菌ＳＬ７２０７（ｈｉ
ｓＧ４６ＤＥＬ４０７［ａｒｏＡ５４４：Ｔｎ１０］，ＴｃＲ）にＰ２２ファー
ジ形質転換によってトランスファーした。
【０１４１】 例３：組織培養中での侵入および細胞間増殖 突然変異株のマクロファージ内複製 内部マクロファージ（inside macrophage）およびマクロファージ様細胞系を
複製させる能力が欠失している幾つかの菌株を試験し、これによってマクロファ
ージ生存および複製は、生体内でサルノモネラ病原菌の重要な側面を表すと考え
られている（fields et al., 1986）。多くのＳＰＩ１２突然変異株がＲＡＷマ
クロファージの範囲内での生存または複製に関する欠失体をもたないことが従来
的に報告されている（Hensel et al., 1997b）。しかしながら、後の試験では、
幾つかのＳＰ１２突然変異体が、通気された固定相細菌培養が通常マウス血清で
オプソニン化される場合に、複製欠失体を有することが示されている（また付属
文献：Cirillo et al., 1998参照）。ＲＡＷマクロファージ中の異なる菌株に関
して、１６時間に亘ってのｃｆｕの増加は図３に示されている。複製欠失体は、
ｓｓａＶ（分泌器官のコーディング成分）、ｓｓｅＢおよびｓｓｅＣ中で突然変
異を有する菌株および多くはないがｓｓｅＥ中で突然変異を有する菌株に関して
見出された。この欠失の部分的な相補性は、ｓｓｅＢおよびｓｓｅＣ、ＨＨ１０
３およびＭｖＰ１０３［ｐｓｓｅＣ］それぞれの機能的コピーを有するプラスミ
ドを保持する菌株で達成された。Ｊ７７４．１マクロファージ細胞系（図４Ａ）
内部およびＣ３Ｈ/ＨｅＮマウスからの過ヨウ素酸塩−誘発型腹膜マクロファー
ジ（図４Ｂ）中でのＳＰＩ２突然変異株の複製能力が試験されている。ＳＰＩ２
遺伝子中でトランスポゾンまたは非極性突然変異体を含有するネズミチフス菌の
類似の複製欠失体が見出され、貪食細胞の型にかかわらず試験されるが、しかし
ながら、腹膜誘発細胞は、他の細胞系と比較して優れた抗細菌性活性を有する。
【０１４２】 マクロファージ生存分析 ＲＥＷ２６４．７細胞（ＥＣＡＣＣ ９１０６２７０２）、マウスマクロファ
ージ様細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２ｍＭグルタミンを含有
するダルベッコズ モディファイト イーグルズ培地 (Dulbecco's modified Ea
gle's medium)（DMEM）中で３７℃で５％ＣＯ２下で増殖した。ネズミチフス菌
菌株を固定相でのＬＢ中で増殖させ、かつＯＤ６００で０．１に希釈し、かつ１
０％正常マウス血清を含有するＤＭＥＭ中で２０分間に亘ってオプソニンを作用
させた。その後に細菌をマクロファージが播かれた２４ウェル組織培養プレート
中で、約１：１０の感染の多様性で遠心分離し、かつ３０分に亘ってインキュベ
ートした。感染に引き続いて、マクロファージをＰＢＳで２度に亘って洗浄し、
細胞外細菌を取り除き、かつグルタミン（１２μｇ／ｌ）を含有する培地中で９
０分間（２時間の後感染）または１６時間に亘ってインキュベートした。感染さ
せたマクロファージをＰＢＳで２回洗浄し、かつ１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１０
で１０分間に亘って溶解させ、かつ適切なアリコートおよび希釈物をＬＢアガー
上にプレートし、ｃｆｕを数えた。
【０１４３】 Ｊ７７４．１細胞（Ralph et al., 1975）またはＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス腹腔滲
出細胞（Charles River Laboratories, Wilmington, MA．から）中のオプソニン
化されたネズミチフス菌菌株の生存は、本質的にデグロートら（DeGroote et al
.）（１９９７）によって記載されたように測定されるが、しかしながらインタ
ーフェロン−ｙの添加はない。要するに、腹膜細胞は、５ｍＭ 過ヨウ素酸ナト
リウム（Sigma, St. Louis, MO）の腹腔内注射の４日後に、熱不活化された１０
％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＰＢＳ中に回収された腹膜細胞は、９６ウ
ェル平底マイクロタイタープレート（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）
中にプレートし、かつ２時間に亘って付着させた。付着しない細胞を、熱不活化
された１０％ウシ胎児血清を含有する予加熱された培地でフラッシした。従来の
研究において、本発明の方法の後に残存する９５％を上廻る細胞がマクロファー
ジであることが証明された。通気した一晩培養からのネズミチフス菌を正常マウ
ス血清でオプソニン化し、かつエフェクター細胞と標的細胞の比１：１０で付着
細胞上で遠心分離した。細胞を１５分間に亘って内部移入させ（internalize）
、かつゲンタマイシン６μｇ／ｍｌを有する培地で洗浄し、細胞外細菌を死滅さ
せた。０ｈおよび２０ｈで、細胞を０．５％デオキシクロレート（deoxycholate
）を含有するＰＢＳ（Sigma, St. Louis, MO）で、連続稀釈でプレートしながら
溶解し、コロニー形成単位を数えた。
【０１４４】 例４：ネズミチフス菌 マウスモデルサルモネラ菌の安全性の評価 非極性突然変異を有する菌株のビバレンス試験 ＤＮＡ配列分析は、ｓｓｅ遺伝子が分泌系のエフェクタータンパク質をコード
するであろうことを示唆したが、しかしながらｓｓＡ中のトランスポゾン挿入か
らの可能な極性作用とは別に、前記遺伝子中の変異を有する菌株を、ネズミチフ
ス菌ビバレンス遺伝子に関する原ＳＴＭスクリーン中で、ｍＴｎ５突然変異（He
nsel et al., 1995）を用いて回収し、かつビバレンスにおけるこれらの役割は
明らかにされていない。この問題を解消するために、ｓｓｅＣ、ｓｓｅＤおよび
ｓｓｅＥｓｓｃＢ（図１）中の非極性突然変異を有する菌株が構築されており、
かつビバレンス試験をおこなった。第４表は、突然変異体ｓｓｅＣおよびｓｓｅ
Ｄを含有する菌株で接種されたすべてのマウスが、野生型菌株のＬＤ５０よりも
３オーダーも多い、１×１０４ｃｆｕの投与量で耐えることを示し、この場合、
これは、接種がｉ．ｐ．経路（i.p. route）（Buchmeier et al., 1993; Shea e
t al, 1996）によって投与される場合には、１０ｃｆｕを下廻る。また、相当す
る野生型対立遺伝子を含有するプラスミドを含む同様の菌株を、１×１０４ｃｆ
ｕの投与量でマウスに接種した。前記感染において、マウスが生存することはな
く、この場合、これは、それぞれの突然変異がそれぞれの遺伝子の機能的コピー
の存在によって補われてもよいことを示し、かつ前記遺伝子それぞれのものが、
サルモネラビルレンスにおいて重要な役割をになう。ｓｓｅＥｓｓｃＢ中で非極
性の突然変異を有する菌株は、それぞれの菌株のおおよそ１×１０４細胞がｉ．
ｐ経路（第４表）によってマウス中へ接種された場合には、致命的な感染を引き
起こし、かつ混合された感染（５マウス／試験）において野生型菌株を用いて競
合的アッセイによってより詳細に分析され、これらがビルレンスを弱めるかどう
かを測定した。突然変異体と野生型細菌との導入比によって導かれた、突然変異
体と野生型細菌との生産比として定義された競合的指標は、ｓｓｅＥｓｓｃＢ突
然変異体が抗生物質耐性マーカーを有する完全なビルレント菌株とあまり異なら
ないことを示し、この場合、これは、この遺伝子が、マウスの故意的なサルモネ
ラ感染中で重要な役割をしないことを含む。
【０１４５】 第４表 マウスのネズミチフス菌の毒性
【０１４６】
【表８】
【０１４７】ａ マウスはそれぞれの菌株１×１０４細胞で腹腔内に接種した。
【０１４８】ｂ 野生型菌株ＮＣＴＣ１２０２３およびビルレントｍＴｎ５突然変異体との競
合結果は、ＳＴＭスクリーン中で同定された。
【０１４９】 例５：ｓｓｅＣ：：ａｐｈＴ、およびΔｓｓｅＤ：：ａｐｈＴ突然変異体ネズミ
チフス菌菌株ＭｖＰ１０３およびＭｖＰ１０１でのワクチン注射 生菌ワクチンとしての非極性突然変異を有する菌株 生菌ワクチンとしてのＭｖＰ１０１およびＭｖＰ１０３突然変異体の適否を確
認するために、これらの弱毒化レベルを、マウスへの経口接種の後にＬＤ５０を
測定することによって評価した。１０マウスの群に、ＭｖＰ１０１、ＭｖＰ１０
３または野生型親菌株ＮＣＴＣＮＣＴＣ１２０２３の連続的な希釈物を提供し、
かつ死んだマウスを感染後１０日間の範囲で記録した。得られた結果を、双方の
突然変異体が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに経口的に供給した場合（ＬＤ５０ １０９ 以上）には、親菌株の場合（ＬＤ５０＝６．９×１０５ＣＦＵ）と比較して高く
弱毒化されることを証明した。
【０１５０】 腹腔内接種の後に、ＢＡＬＢ／ｃ中のネズミチフス菌ＮＣＴＣ１２０２３野生
型のＬＤ５０は６細菌であり、かつＢＡＬＢ／Ｃ中のＭｖＰ１０３のＬＤ５０は
、腹腔内接種の後に２．７７×１０６である。突然変異はｐｓｓｅＣによって補
われるが、しかしながら完全な突然変異菌株に関するＬＤ５０測定は実施されな
かった。ＢＡＬＢ／ｃ中のＭｖＰ１０１のＬＤ５０は腹腔内接種の後に３．５４
×１０６である。プラスミドｐ５−ｋ１によって部分的に補われたものは可能で
ある。ＭｖＰ１０１［ｐ５−Ｋ１］に関する腹腔内ＬＤ５０ ８．４５×１０２ を測定した（ｐ５−Ｋ１の記載：ｓｓｅＣ’ｓｓｅＤｓｓｅＥｓｓｃＢｓｓｅＦ
’を含有するｐ５−２の３．２ｋｂ ＰｓｔＩ断片を、低コピー数クローニング
ベクターｐＷＳＫ２９中にサブクローニングした）。
【０１５１】 ＬＤ５０の測定 ネズミチフス菌ＮＣＴＣＮＣＴＣ１２０２３（野生型）または突然変異体ＭｖＰ
１０３およびＭｖＰ１０１のそれぞれ１０５〜１０９ＣＦＵの範囲の投与量は、
１０マウスの群に経口的に接種され、かつ生存率を１０日間に亘って記録した。
【０１５２】 腹腔内感染後のネズミチフス菌野生型および突然変異体ＭｖＰ１０１およびＭ
ｖＰ１０３のＬＤ５０を、６〜８週齢の５個体の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、
１０１〜１０７ＣＦＵの範囲の投与量で接種することによって測定した。生存率
を３週間に亘って記録した。誘発（challenge）菌株のＬＤ５０投与量をリード
およびメンシュ（Reed and Muench, 1938）の方法によって算定した。
【０１５３】 免疫化プロトコール ワクチン注射のために、細菌を一晩に亘って、中程度の対数期を達成するまで
増殖させた。その後に、遠心分離（３０００×ｇ）によって回収し、かつ５％重
炭酸ナトリウム中に再懸濁した。マウスを４回に亘って１５日間隔で、おおよそ
３０μｌの容量の細菌懸濁液（１０９ＣＦＵ／マウス）を穏やかに供給すること
によって免疫化した。対照群マウスを担体、欠損プラスミド（lacking plasmid
）でワクチン注射した。
【０１５４】 細胞毒性アッセイ 脾臓細胞を最終免疫後１４日目のマウスから得て、かつ２×１０６エフェクタ
ー細胞を生体外で５日間に亘って、ｒＩＬ２ ２０Ｕ／ｍｌおよびβＧＰ１ペプ
チド ２０μＭ（β−ｇａｌ ｐ８７６〜８８４、ＴＰＨＰＡＲＩＧＡＬ）によ
って供給された完全培地中で再刺激し、この場合、これは免疫優性Ｈ−２ｄ制限
β−ｇａｌエピトープを含有する。再刺激の後に、アッセイを［３Ｈ］−チミジ
ン組み込み法を用いてアッセイを実施した。要するに、１ｍｌに対する２×１０ ６ のＰ８１５細胞を［３Ｈ］−チミジンで、４時間に亘って完全媒体または２０
μＭ βＧＰ１ペプチドが供給された完全培地中で標識化し、かつ標識細胞とし
て使用した。洗浄の後に、２×１０５標識化された標的を２００μｌの完全培地
中で、３７℃で４時間に亘ってエフェクター細胞の連続的希釈物によって接種し
た。細胞を回収され、かつ特異的な溶解を次のようにして測定した：［（エフェ
クター不在下で保持されたｃ．ｐ．ｍ）−（エフェクターの存在下で実験的に保
持されたｃ．ｐ．ｍ）／エフェクターの不在下で保持されたｃ．ｐ．ｍ］×１０
０。
【０１５５】 例６：誘導された免疫応答の評価 経口的ワクチン投与後の粘膜性免疫応答の誘導 生サルモネラキャリアーを用いて、粘膜性病原菌に対する保護を達成するため
に、効果的な粘膜性応答の誘導が高く望まれる。
【０１５６】 したがって、ｐＡＨ９７を含有するＭｖＰ１０１、ＭｖＰ１０３またはＳＬ７
２０７で免疫化されたマウスからの腸洗浄液中で、β−ｇａｌ特異的抗体の存在
を、免疫後５２日目において試験した。図５に示されているように、３キャリア
すべてによる免疫化は、β−ｇａｌ特異的ｌｇＡの著量の生成を刺激し、かつわ
ずかではあるが、腸ルーメン中で抗原特異的ｌｇＧの漏出に有利である。統計的
に著しい相違点は、異なる組み換えクローンに対する粘膜性免疫応答の間に見出
されなかった。
【０１５７】 β−ｇａｌを発現するｓｓｅＣおよびｓｓｅＤ突然変異体での経口的免疫化の後
に誘発された細胞性免疫応答 免疫化されたマウス中に生じた、抗原特異的Ｔ細胞応答の効果を評価するため
に、脾臓細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞中で濃縮し、かつ生体外で４日間に亘ってβ−ｇ
ａｌで再刺激した。図６に示されているように、３キャリアーを用いてのワクチ
ン投与の後に抗原特異的ＣＤ４＋冨化脾臓細胞が生成されるけれども、特異的な
細胞性免疫応答の誘導において、ＭｖＰ１０３およびＭｖＰ１０１はＳＬ７２０
７（Ｐ ０．０５）よりも著しくより効果的であった。これとは対照的に、一つ
のキャリアーのみで免疫化されたマウスから単離された細胞は、β−ｇａｌの存
在中で増殖しなかった。
【０１５８】 免疫化によって誘導されたＴｈ−型免疫応答を試験するために、ＩＦＮ−ν、
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を再刺激された細胞
の上清中で測定した。結果は、主要なＴｈ１応答パターンがすべてのキャリアー
で免疫化されたマウス中に誘発されることを証明した。ＩＦＮ−νは、プラスミ
ド不含のキャリアーで免疫化されたマウスから単離された脾臓細胞からの上清中
で観察された前記ものと比較して、著しく増加したレベルのサイトカインのみで
あった（図７）。興味深いことに、ＩｇＧアイソタイプパターンと同様に、Ｍｖ
Ｐ１０３［ｐＡＨ９７］で免疫化されたマウスの細胞からの上清中のＩＦＮ−ν
レベルは、ＭｖＰ１０１［ｐＡＨ９７］またはＳＬ７２０７［ｐＡＨ９７］（図
７）で免疫化された動物からのものよりも著しく高かった（Ｐ ０．０５）。
【０１５９】 モデル抗原β−ｇａｌを発現する弱毒化されたネズミチフス菌ワクチンキャリア
ーで経口的に免疫化されたマウス中で生成された抗原特異的抗体応答 マウスの群をＭｖＰ１０１［ｐＡＨ９７］およびＭｖＰ１０３［ｐＡＨ９７］
組み換え菌株で免疫化した。基本型の効果を評価するために、もう一つの群をよ
く確立されたキャリアー菌株ＳＬ７２０７［ｐＡＨ９７］でワクチン投与した。
全身性体液性応答を誘導するための異なるキャリアーの能力を、ワクチン投与さ
れたマウスの血清中で、β−ｇａｌ特異的抗原のタイターを測定することによっ
て決定した。図８に示されているように、β−ｇａｌ特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ
抗原の著しいタイターを、ワクチン投与された動物で３０日目に検出した。３０
日目でプラトーに達したＩｇＭタイターに対して、ＩｇＧのタイターは、試験が
結論付けされた場合において、免疫後５２日目までに急速に増加した。すべての
試験されたキャリアーが優れた性質を示すけれども、ＭｖＰ１０３突然変異体は
抗β−ｇａｌ抗体（Ｐ ０．０５）の誘発において、最も効果的である。β−ｇ
ａｌ特異的ＩｇＡの著しいレベルは任意の３個の組み換えクローンで免疫化され
たマウス中では検出はされなかった（データは示されていない）。
【０１６０】 抗β−ｇａｌＩｇＧのサブクラス分布を測定するために、血清試料をＩｇＧ１
、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３の特異的レベルに関して分析した。図
９に示されている結果は、すべての免疫化されたマウスの血清中で存在する主要
なβ−ｇａｌ−特異的ＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ２であることを証明しており
、この場合、これは主要なＴｈ１応答を示している。興味深いことに、ＩｇＧ１
（Ｐ０．０５）の低い濃度は、ＭｖＰ１０３で免疫化されたマウス中で、ＭｖＰ
１０１およびＳＬ７２０２で免疫化されたマウスより見出され、この場合、これ
は残りの２個のキャリアーで免疫化された動物中での類似の応答パターンを示し
ている。
【０１６１】 試料の採取 血清試料を異なる時点で採取し、かつβ−ｇａｌ特異的抗体の存在のために試
験した。免疫化５２日目において、腸灌注液を、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
牛血清アルブミンおよび大豆トリプシン阻害剤０．１ｍｇ／ｍｌを供給された２
ｍｌのＰＢＳ（Sigma）で小腸をフラッシングすることによって得た。その後に
、灌注液を遠心分離（１０分間 ６００×ｇ）し、砕片を除去し、上清を除去し
、かつフェニルメチルスルホン酸フッ化物（１０ｍＭ）およびＮａＮ３を供給し
、−２０℃で保存した。
【０１６２】 抗体アッセイ 抗体のタイターを固相酵素免疫検定法（ELISA）によって測定した。要するに
、９６ウェルＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘＳｏｒｐＴＭアッセイプレート（
Nunc, Roskilde, Denmark）をコーティングバッファー（０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４、ｐＨ９．０）中の５０μｌ／ウェル β−ｇａｌ（５μｇ／ｍｌ）で被覆
した。４℃で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳ中の
１０％ＦＣＳで、３７℃で１時間に亘って遮断した。ＦＣＳ−ＰＢＳ中の血清の
連続的な２倍希釈物を添加し（１００μｌ／ウェル）、かつプレートを３７℃で
２時間に亘ってインキュベーションした。ＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０（Tw
een 20）での４回に亘る洗浄の後に、第２抗体：ビオチン化ν−鎖特異的ヤギ抗
マウスＩｇＧ、μ−鎖特異的ヤギ抗マウスＩｇＭ、α−鎖特異的ヤギ抗マウスＩ
ｇＡ抗体（Sigma, St. Louis, MO）を添加するか、または、ＩｇＧサブクラスを
測定するために、ビオチン−接合ラット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ
２ｂおよびＩｇＧ３（Pharmingen）を添加し、かつプレートをさらに３７℃で２
時間に亘ってインキュベーションした。４回に亘っての洗浄の後に、１００μｌ
のペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジン（Pharmingen, St. Diego, CA）を
それぞれのウェルに添加し、かつプレートを室温で１時間に亘ってインキュベー
ションした。４回に亘っての洗浄の後に、反応を、０．０１％Ｈ２Ｏ２を含有す
る０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ ４．３５）中でのＡＢＴＳ［２，２
’−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を用い
て展開した。エンドポイントタイターを、３０分のインキュベーション後に、ネ
ガティブコントロール群の値を上廻る０．１単位の４０５ｎｍでの光学濃度を生
じる最終的な希釈の逆ｌｏｇ２として表された。
【０１６３】 腸灌注液中に存在する全ｌｇの濃度を測定するために、相当する試料の連続的
希釈物を、捕獲抗体（capture antibodies）（１００μｇ／ウェル Ｓｉｇｍａ
）としてのヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡで被覆されているマイクロ
タイタープレート中でインキュベートし、かつ精製されたマウスＩｇＧ、ＩｇＭ
およびＩｇＡ（Sigma）の連続的希釈物を、標準曲線をえがくように使用した。
抗原特異的Ｉｇの希釈を前記のように実施した。
【０１６４】 β−ｇａｌを発現するキャリアー菌株で経口的に免疫化されたマウスでの、抗原
特異的ＣＴＬ応答の誘導 ＭＨＣクラスＩ制限された応答の誘導は、多くの細胞外病原菌および腫瘍に対
する保護のために特に重要である。抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬは生体外および生
体内の双方で、異種抗原を発現する組み換えサルモネラｓｐｐ．で免疫化された
後に生じてもよい。したがって、試験されたキャリアーがβ−ｇａｌ特異的ＣＴ
Ｌ応答を誘導できるかどうかを測定することが重要であると考えた。脾臓細胞を
ＭｖＰ１０１［ｐＡＨ９７］、ＭｖＰ１０３［ｐＡＨ９７］またはＳＬ７２０７
［ｐＡＨ９７］でワクチン投与されたマウスから、免疫後５２日目で採取され、
かつ生体外でβＧＰ１−パルス同系脾臓細胞（βGP1-pulsed syngenic spleen c
ell）で５日間に亘って再刺激した。図１０に示されているように、３個の構築
体それぞれで免疫化されたマウスからの脾臓細胞は、負荷されていないコントロ
ール群と比較してβＧＰ−１負荷標的細胞（βGP-1-loaded target cell）の顕
著な溶解を導いた。より効果的な応答はファージ保有菌株ＭｖＰ１０３を用いて
見出された。溶解はＣＤ８＋Ｔ細胞によって介在され、それというのも、細胞毒
性活性は、ＣＤ８＋Ｔエフェタター細胞が除去された場合に、完全に排除される
からである（データは示されていない）。
【０１６５】 サイトカイン測定 培養上清を増殖細胞から２日目および４日目で採取し、かつ−７０℃で保存し
た。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−νの
測定を特異的ＥＬＩＳＡによって実施した。要するに、９６ウェルマイクロタイ
ター プレートを４℃で一晩に亘って、精製されたラット抗マウスＩＬ−２ｍＡ
ｂ（クローン ＪＥＳＧ−１Ａ１２）、抗ＩＬ−４ｍＡｂ（クローン１１Ｂ１１
）、抗ＩＬ−５ｍＡｂ（クローンＴＲＦＫ５）、抗ＩＬ−６ｍＡｂ（クローンＭ
Ｐ５−２０Ｆ３）、抗ＩＬ−１０ｍＡｂ（クローンＪＥＳ５−２Ａ５）および抗
ＩＦＮν ｍＡｂ（クローンＲ４−６Ａ２）（Pharmingen）で被覆した。３回に
亘っての洗浄の後に、プレートを遮断し、かつ２倍の上清を添加した。標準曲線
をそれぞれのサイトカインに関して、組み換えマウスＩＬ−２（rIL-2）、ｒＩ
Ｌ−４、ｒＩＬ−５、ｒＩＬ−６、ｒＩＦＮ−ν、およびｒＩＬ−１０（Pharmi
ngen）を用いてつくった。さらにプレートを４℃で一晩に亘ってインキュベート
した。洗浄の後に、ビオチン化されたラット抗マウスＩＬ−２（クローン ＪＥ
Ｓ６−５Ｈ４）、ＩＬ−４（クローンＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＩＬ−５（クロー
ンＴＲＦＫ４）、ＩＬ−６（クローンＭＰ５ｐ−３２Ｃ１１）、ＩＬ−１０（ク
ローンＳＸＣ−１）およびＩＮＦ−ν（クローンＸＭＧ１．２）モノクローナル
抗体 １００μｌ／ウェルを添加し、かつＲＴで４５分に亘ってインキュベート
した。６回に亘っての洗浄の後に、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合
体を添加し、かつＲＴで３０分間に亘ってインキュベートした。最終的にはプレ
ートをＡＢＴＳを用いて顕出した。
【０１６６】 ＣＤ８＋脾臓細胞の除去 ＣＤ８＋細胞サブセットをＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気性Ｌｙ−２マイクロビースを用
いて、製品使用説明書（Miltenyi Biotec）に従って除去した。除去された細胞
標本は１％ＣＤ８＋細胞を含有していた。
【０１６７】 ＦＡＣＳｃａｎ分析 約５×１０５細胞を、望ましい抗体または抗体の組み合わせ物を含有する染色
バッファー（２％ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）中
で、４℃で３０分に亘ってインキュベートした。洗浄の後に、細胞をＦＡＣｃａ
ｎ上で分析した（Becton Dickinson）。使用されたモノクローナル抗体は、ＦＩ
ＴＣ接合抗ＣＤ４および抗ＣＤ８であった（クローンＨ１２９．１９および５３
−６．７；Pharmingen）。
【０１６８】 例７：細胞増殖 細胞増殖アッセイ 脾臓細胞懸濁液をＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気性Ｌｙ−２および間接的ヤギ抗マウス
ＩｇＧマイクロロビーズ用いて、製品使用説明書（Mitenyi Biotec GnbH, Germa
ny）に従ってＣＤ４＋Ｔ細胞に関して濃縮した。細胞調製物は６５％を上廻るＣ
Ｄ４＋細胞を含んでいた。細胞を２０Ｕ／ｍｌのマウスｒＩＬ−２（Pharmigen
）を供給された完全媒体中で２×１０６細胞／ｍｌに調整し、平底９６ウェルマ
イクロタイタープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中に１００μｌ／ウェル
で入れ、かつ溶解性β−ｇａｌの異なる濃度の存在下で４日間に亘ってインキュ
ベートした。最終的な１８時間の培養後に、［３Ｈ］−チミジン １μＣｉ（Am
ersham International, Amersham, U.K.）をウェル毎に添加した。細胞をペーパ
ーフィルター上で、細胞ハーベスターを用いて回収し、かつ増殖させた細胞のＤ
ＮＡ中に組み込ませた［３Ｈ］−チミジンを、β−シンチレーション検出器中で
測定した。
【０１６９】 例８：ｓｓｒ遺伝子および構築物の特徴付けおよびｓｓｒ突然変異体ネズミチフ
ス菌菌株ＭｖＰ２８４、ＭｖＰ３２０およびＭｖＰ３３３の構築および特徴付け
。
【０１７０】 他の細菌性タンパク質を含有するＳＰＩ２の２成分調節遺伝子ｓｓｒＡおよびｓ
ｓｒＢの相同性。
【０１７１】 ＳＰＩ２遺伝子ｓｓｒＡは、以前記載されているように細菌性２成分調節系の
センサー成分に類似するタンパク質をコードする（Ochman et al., 1996）。Ｓ
ＰＩ２ビルレンス遺伝子（Hensei et al., 1997b; Valdivia and Falkow, 1997
）の学名と同様に、この遺伝子はｓｓｒＡと呼称される。ｓｓｒＡの下流、２４
．３ｋＤａタンパク質に対するコーディング容量を有するＯＲＦが同定された。
この遺伝子は例えばバチルス スブチリス（Bacillus subtilis）のＤｅｇＵ、
Ｅ．ＣｏｌｉのＵｖｒＹおよびボルデテラ ペルツシス（Bordetella pertussis
）のＢｖｇＡの翻訳活性物質をコードする遺伝子ファミリーとかなりの類似性を
共有する。したがって、タンパク質はｓｓｒ系の制御成分として作用すると考え
られ、かつ遺伝子はｓｓｒＢと呼称される。
【０１７２】 ＳＰＩ１およびＳＰＩ２の逆調節 ＳＰＩ１およびＳＰＩ２のタイプＩＩＩ分泌系の発現は、環境条件によって厳
しく制御される。ＳＰＩ１を、高い浸透圧モル濃度（osmolarity）および制限さ
れたＯ２（酸素）濃度の冨化培地中で増殖させた後に、遅れたｌｏｇ／速い固相
の間に導入される一方で、ＳＰＩ２遺伝子の発現誘導は観察されなかった。これ
とは対照的に、制限されたＭｇ２＋量（８μＭ）を有する最少培地中で増殖させ
た後に、ｓｓａＢ：：ｌｕｃ融合体は、ｓｉｐＣ：：ｌａｃＺ融合が発現されな
い一方で、高く発現した。ｓｓａＢ：：ｌｕｃ融合体の発現は、ＳｓｒＡ／Ｂ融
合体に依存するが、それというのも、ｓｓｒＢ−陰性バックグランド菌株Ｐ８Ｇ
１２（Hensel et al., 1998）中で発現がみられないからである。ｓｉｐＣ：：
ｌａｃＺ融合体の発現は、ＨｉｌＡ、ＳＰＩ１の翻訳制御物質に依存している。
さらに、ｓｓｒＢ中の突然変異がｓｉｐＣ：：ｌａｃＺ融合体の発現に作用する
ことが見出された。これはＳＰＩ２がＳＰＩ１遺伝子発現上の調節的作用を有す
ることを示している。
【０１７３】 ＳＰＩ２（菌株ＭｖＰ１３１）中でｓｓａＢに対するｌｕｃ融合体およびＳＰ
Ｉ１（菌株ＭｖＰ２３９）中でｓｉｐＣに対するｌａｃＺ融合体を保持する細菌
株を、以前に示されたＳＰＩ遺伝子発現を誘発するための条件下で増殖させた。
細菌を一晩に亘って、８μＭ Ｍｇ２＋を有する最少培地中でかまたは１％Ｎａ
Ｃｌを含有するＬＢブロス（ＬＢ１％ＮａＣｌ）中で一晩に亘って増殖させた。
菌株ＭｖＰ１３１のＬｕｃ活性および菌株ＭｖＰ２３９のβ−ガラクトシダーゼ
活性を測定した。コントロール群として、双方のレポーター融合体をＰ８Ｇ１２
のｓｓｒＢ陰性菌株バックグランド中でアッセイした。
【０１７４】 ＳＰＩ遺伝子に対するｌａｃＺレポーター遺伝子融合体の発現レベルを、ミラ
ー（Miller）によって１９９２年に示されたようにアッセイした。
【０１７５】 ｓｓｅＡレポーター遺伝子融合体の構築および分析 ｐ５−４のＳｍａＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片の１．１ｂを、ｐＧＰＬ01、ｌｕｃ融
合体を製造するための自殺ベクター（Gunn and Miller, 1996）中にサブクロー
ニングした。結果として得られた、１．０ｋｂ上流にあり、かつ１１２ｂｐのｓ
ｓｅＡがｌｕＣに対して翻訳的に融合された構築体を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−
１λｐｉｒの形質転換ために使用し、かつネズミチフス菌に対する接合トランス
ファーは、以前に記載されている（Gunn and Miller, 1996）ようにして実施し
た。相同組み換えによってレポーター遺伝子融合体が染色体に組み込まれた菌株
を、ＰＣＲおよびサザンハイブリダイゼーション分析によって確認した。その後
に、融合体をＰ２２形質導入によって、ＳＰＩ１またはＳＰＩ２遺伝子（Maloy
et al., 1996）中のｍＴｎ５挿入での野生型および種々の突然変異菌株バックグ
ランド中に移した。コントロール群として、ｐＬＢＯ２の染色体組み込み、ｌｕ
ｃ遺伝子に対するプロモーター融合体を有さない自殺ベクター（Gunn and Mille
r, 1996）を保持している菌株を構築した。遺伝子発現の分析のために、菌株を
最少培地中で空気混和しながら増殖させた。細菌培養物のアリコートを溶解し、
かつルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイキットを用いて製品プロトコ
ールに従って測定した（Boehringer Mannheim）。光子検出をマイクロプレート
インチレーション／イウムネセンスカウンター（iuminesecence counter）（Wal
lac, Tueku）上で実施した。すべてのアッセイを３重に実施し、かつ独立した配
置で複製した。
【０１７６】 ＳｓｒＡＢに依存するｓｓｅＡの発現。
【０１７７】 ｓｓｅ遺伝子がＳＰＩ２分泌系の一部分であるかどうかを証明するために、相
同組み換えによって異なるＳＰＩ２突然変異株中に組み込まれたｓｓｅＡ：：ｌ
ｕｃレポーター遺伝子融合体の発現が試験された（図１１）。最少培地で増殖さ
れる間の野生型バックグランドにおけるｓｓｅＡの翻訳活性は、ＳＰＩ２ ２成
分系の不活性化によって急激に減少した。センサー成分および翻訳活性物質をそ
れぞれコードするｓｓｒＡ（突然変異株 Ｐ３Ｆ４）およびｓｓｒＢ（突然変異
株 Ｐ８Ｇ１２）のトランスポゾン挿入は、２５０〜３００倍の減少したｓｓｅ
Ａ発現を生じた。ｈｉｌＡ、ＳＰＩ１の翻訳活性物質（Bajaj et al., 1996）の
不活性化は、ｓｓｅＡ遺伝子発現の効果を有さなかった。ＳＰＩ２タイプＩＩＩ
分泌器官（ssaJ::mtn5 および ssaT::mTn5; 突然変異株Ｐ１１Ｄ１０およびＰ９
Ｂ７； Shea et al., 1996）成分をコードする２個の遺伝子中のトランスポゾ
ン挿入は、ｓｓｅＡ発現の著しい効果を有さない。前記データは、ＳｓｒＡ／Ｂ
がｓｓｅＡの発現に関して要求されるが、ｈｉｌＡに関しては要求されないこと
を示している。
【０１７８】 ＳｓｒＡ／Ｂに依存するマクロファージ内のＳＰＩ２の発現 真核細胞の範囲内のネズミチフス菌の存在は、ｓｓａＢおよびｓｓａＨに対す
る融合の分析によって示されたようにＳＰＩ２遺伝子の発現を誘導した。この発
現は、ＳＰＩ２によってコードされた２成分調節系ＳｓｒＡ／Ｂに依存する。
【０１７９】 マウス マクロファージ系細胞系Ｊ７４４を、この試験に使用した。マクロフ
ァージをＭｖＰ１３１（ｓｓａＢに対するｌｕｃ融合体）、ＭｖＰ２６６（ｓｓ
ａＨのｌｕｃ融合体）およびＭｖＰ２４４（ｓｓｒＢ陰性バックグランド中のｓ
ｓａＢに対するｌｕｃ融合体）を含有するマクロファージに対して１０個の細菌
の感染の多様性で感染させた。細胞外細菌をゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）
の添加によって死滅させた。種々の時点において、マクロファージをトライトン
Ｘ−１００の添加によって溶解させ、かつ細胞外細菌をＬＢアガープレート上で
の連続的希釈物をプレートすることによって数えた。細菌の他のアリコートを回
収し、かつルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は細菌に対して
かなり明るい発光を示した。
【０１８０】 ＳＰＩ１ＳｉｐＣの分泌されたエフェクタータンパク質上のｓｓｒＢ中での突
然変異の効果 ネズミチフス菌ＳＰＩ２突然変異株ＭｖＰ３２０（図１２、ａの非極性突然変
異）によって成長培地に分泌されたタンパク質の分析は、分泌されたＳＰＩ１エ
フェクタータンパク質（Hensel et al., 1997b）が存在しないかまたははげしく
減少することを示した。これらのＳＰＩ２突然変異体は、培養された上皮細胞ま
たは培養されたマクロファージ（Hensel et al., 1997a）に侵入するこれらの能
力を減少させた。この現象を試験するために、より詳しくは、組み換えＳｉｐＣ
（ｒＳｉｐＣ）を発現させ、かつウサギ中のｒＳｉｐＣに対する抗体を生じた。
ウエスタンブロットにおいて、ｒＳｉｐＣに対する抗血清はネズミチフス菌野生
型菌株ＮＣＴＣ１２０２３の培養上清の沈殿物からのタンパク質４２ｋＤａと反
応させた。ＥＥ６３８、ＳｉｐＣ中の菌株欠失体（Hueck et al., 1995）の培養
物からの上清との反応は見出されなかった。さらに、ウエスタン ブロットにお
いて、ＳｉｐＣはＳＰＩ２突然変異体ＭｖＰ３２０の培養上清中で検出されなか
った。しかしながら、ＳｉｐＣを他のＳＰＩ２突然変異体、例えばＰ２Ｄ６（ｓ
ｓａＶ：：ｍＴｎ５）、Ｐ９Ｂ６（ｓｓａＶ：：ｍＴｎ５）およびＮＰｓｓａＶ
（ｓｓａＶ：：ａｐｈＴ）（Deiwick et al., 1998）の培養上清中で検出した。
種々の菌株の培養上清中のＳｉｐＣの抗血清による検出を、ＳｉｐＣの存在下ま
たは不在下で、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出した。さらに、ＳＰＩ２突
然変異株の培養上清中のＳｉｐＣの不在が、タイプＩＩＩ分泌系を介してＳｉｐ
Ｃの欠失的分泌によるものであるか、あるいは前記菌株中のＳｉｐＣ合成を減少
させるかどうかを分析した。ｒＳｉｐＣに対する抗血清をＳＰＩ１遺伝子発現（
特に、固相、高い浸透圧モル濃度、低い酸素濃度）（Bajai et al., 1996）のた
めの誘導条件下で増殖された培養物のペレット中で、ＳｉｐＣを検出するために
使用された。野生型およびＳＰＩ１およびＳＰＩ２遺伝子中で種々の突然変異体
を有する菌株の分析は、ｓｓｒＢ中で非極性突然変異を有する突然変異体の高く
減少されたＳｉｐＣ量を示した。しかしながら、ＳｉｐＣは野生型培養物および
ＳＰＩ２突然変異株Ｐ２Ｄ６、Ｐ９Ｂ６およびＮＰｓｓａＶのペレット中で観察
されたものと比較可能なレベルで検出された。ＳｉｐＣ合成の効果は、ＳＰＩ２
突然変異体中の減少された成長速度または減少されたタンパク質レベルによるも
のではなく、それというのも、双方のパラメーターは野生型およびＳＰＩ２突然
変異体に関して比較可能であるためであった。
【０１８１】 ＳＰＩ１遺伝子発現上でのＳＰＩ２遺伝子ｓｓｒＢ中の突然変異の効果 ＳＰＩ１遺伝子発現上でＳＰＩ２突然変異体の効果をアッセイするために、以
前に特徴付けられている種々のＳＰＩ１遺伝子に対するｌａｃＺの融合体（Baja
i et al., 1995; Bajaj et al., 1996）を、ＳＰＩ２突然変異体ＭｖＰ３２０お
よび種々のＳＰＩ１突然変異体に導入し、一連のレポーター融合菌株を製造した
。ＳＰＩ１発現を誘導する条件下で培養物増殖中でのレポーターβ−ガラクトシ
ダーゼの発現（上記参照）をアッセイした。ｈｉｌＡ中のＴｎ挿入（P4H2）はｐ
ｒｇＫならびにｓｉｐＣの発現を減少させる一方で、ｓｐａＲＳ（P6E11）中の
挿入はｓｉｐＣの発現を作用するのみであった。２成分調節系の一つの成分をコ
ードするＳＰＩ２遺伝子ｓｓｒＢ中の突然変異体を含有する幾つかの突然変異株
はｐｒｇＫおよびｓｉｐＣ（図１１）に対するレッポーター融合体の減少された
発現を示した。双方の遺伝子の発現上の効果は類似している。ｓｓａＶ（Ｐ２Ｄ
６、Ｐ９Ｂ６）中のＴｎ挿入を有する他の突然変異株ならびにｓｓａＶ中の非極
性挿入を保持する突然変異体ＮＰｓｓａＶは、野生型遺伝的バックグランド中の
相当するレポーター融合体と比較可能なｐｒｇＫおよびｓｉｐＣの発現レベルを
有した。ｐｒｇＨおよびｉｎｖＦに対するｌａｃＺ融合体の分析は、ｐｒｇＫお
よびｓｉｐＣに関して示された発現上の類似の効果を示した。
【０１８２】 ＳＰＩ２遺伝子ｓｓｒＢ中の突然変異がＳＰＩ１調節ｈｉｌＡの発現を作用する
。
【０１８３】 ｓｉｐＣおよびｐｒｇＫに対するレポーター融合体の分析は、ＳＰＩ１の２つ
の異なるオペロン中の遺伝子発現がＳＰＩ２突然変異によって作用されてもよい
ことを示し、この場合、これは他のＳＰＩ１遺伝子を作用するこれらの突然変異
がｓｉｐＣおよびｐｒｇＫの調節中に含まれることを示唆している。ＳＰＩ１遺
伝子の発現が翻訳活性物質ＨｉｌＡ（Bajai et al., 1995; Bajai et al., 1996
）の管理下にあることは従来的に明らかにされている。ｈｉｌＡの発現はしたが
ってｓｓｒＢのＳＰＩ２突然変異の存在中で分析された。ＳＰＩ２突然変異株Ｍ
ｖＰ３２０は、ｈｉｌＡ発現のレベルを大きく減少させた。再度、極めて低いレ
ベルのｈｉｌＡ発現がｐｒｇＫおよびｓｉｐＣ発現の減少されたレベルの突然変
異体中で観察された。ｓｉｐＣ発現上のＳＰＩ２突然変異の効果が減少されたｈ
ｉｌＡ発現から得られるかどうかを分析するために、次にｐＶＶ１３５（Bajaj
et al., 1995）またはｐＶＶ２１４（内在性プロモーターからのｈｉｌＡ発現）
（Bajaj et al., 1995）を含有する種々の突然変異株中で相補性試験を実施した
。従来の研究（Bajaj et al., 1995）において、菌株Ｐ４Ｈ２のｈｉｌＡ突然変
異体はｐＶＶ２１４によって補われた。しかしながら、ｓｉｐＣ発現は、ｐＶＶ
１３５またはｐＶＶ２１４を含有する突然変異株中に復活しない。
【０１８４】 ネズミチフス菌菌株ＭｖＰ２８４ｓｓｒＡおよびｓｓｒＢ突然変異体の構築体 突然変異体ＭｖＰ２８４、ｓｓｒＡ。ｓｓｒＡ遺伝子（図１２）をファージク
ローンλ２由来のプラスミドｐ２−２中に５．７ｋｂでサブクローニングした。
ｐＵＣ１８中のＢａｍＨ１フラグメントは第１表に示された。１．６ｋｂのフラ
グメントはｐ２−２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｖｏＲＶ切断の後に回収され、か
つＨｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩ切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋中
にサクブローニングした。結果として生じるｐ２−２０と呼称される構築体はＨ
ｉｎｃＩＩで切断され、かつアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した。
ａｐｈＴカセットは前記に示したように単離され、かつ線状化されたプラスミド
にｐ２−２０に同じ向きで特有のＨｉｎｃＩＩ部位にライゲートした。Ｅ．Ｃｐ
ｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅの形質変換およびカナマイシンおよびカルバニシリン（
それぞれ５０μｇ／ｍｌ）に対する選択の後に、一つのクローンを選択し、かつ
保持するプラスミドを単離した。このプラスミドはｐ２−２１と呼称され、かつ
その同定は制限酵素分析によって証明された。ｐ２−２１はさらにＫｐｎ−１お
よびＸｂａ−１で切断され、２．５ｋｂのフラグメントを単離し、かつＫｐｎＩ
／ＸｂａＩ切断ｐＫＡＳ３２にライゲートした。このプラスミドはＥ．Ｃｏｌｉ
ＣＣ１１８λｐｉｒ中にエレクトロポレーションし、かつ形質転換体がカナマ
イシンおよびカルベニシリン（５０μｇ／ｌ）に対して選択された。その後に、
一つのクローンを選択し、ｐＫＡＳ３２中の前記ＤＮＡフラグメントを有するプ
ラスミドをｐ２−２２と呼称され、単離し、かつ制限酵素分析によって確認され
た。プラスミドｐ２−２２をＥ．ＣｏｌｉＳ１７−１λｐｉｒ中にエレクトロポ
レーションし、かつネズミチフス菌ＮＣＴＣ１２０２３（ストレプトマイシン耐
性）中に、以前に記載されているような（de Lorenzo and Timmis, 1994）接合
によってトランスファーした。ｓｓｒＡ遺伝子がａｐｈＴカセットの挿入によっ
て中断されたクローン化遺伝子によって置換されている接合完了体は、Ｍ９＋グ
ルコース最少培地アガープレート（Maloy et al., 1996）上のその増殖およびカ
ナマイシンおよびカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）に対するその耐性によっ
て選択された。結果として生じる接合完了体は、最終的にはラクトース陰性表現
型を有し、かつカナマイシンおよびストレプトマイシン感受性であると示された
。さらに選択されたクローンをサザンブロット分析によって試験した。クローニ
ング工程中で改善されるべき可能な突然変異の排除のために、突然変異されたｓ
ｓｒＡ対立遺伝子を新鮮なサルモネラバックグランド中に、Ｐ２２導入によって
トランスファーした（Maloy et al., 1996によって記載されている）。生じるサ
ルモネラ菌株ＭｖＰ２８４はｓｓｒＡ遺伝子の範囲内で耐性カセットの存在を、
プライマー
【０１８５】
【外１２】
【０１８６】 の使用によって試験した。野生型ｓｓｒＡ対立遺伝子を含有するクローンからの
ＤＮＡ増幅は、２８００ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、ｓｓｒＡ対立遺伝子を含有す
るクローンからのＤＮＡの使用は、３７５０ｂｐのＰＣＲ産物中で得られたａｐ
ｈＴカセットによって中断された。結果として生じるサルモネラ菌株ＭｖＰ３２
０はｓｓｒＢの範囲内で耐性カセットの存在を、接合完了体の全ＤＮＡのサザン
ハイブリダイゼーション分析を使用することによって試験された。
【０１８７】 突然変異体ＭｖＰ３２０、ｓｓｒＢ。ｓｓｒＢ遺伝子（図１２）はファージク
ローンλ１由来のプラスミドｐ１−６中に、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ中のＰｓｔＩ／Ｂ
ａｍＨＩ断片４．８ｋｂで、第１表に示されたようにサブクローニングした。１
．７ｋｂ断片をｐ１−６のＢａｍＨ１およびＨｉｎｃＩＩ切断の後に回収し、か
つＢａｍＨＩ／ＨｉｎｃＩＩ切断ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋中にサブク
ローニングした。結果として生じた、ｐ１−２０と呼称された構築体をＥｃｏＲ
Ｖで切断し、かつアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。ａｐｈＴカセット
を前記のようにして単離し、かつ線状化されたプラスミドｐ１−２０に、同じ向
きで特有のＥｃｏＲＶ部位にライゲートした。Ｅ．ＣｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅの
形質転換およびカナマイシンおよびカルベニシリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌ）
対する選択の後に、一つのクローンを選択し、含有しているプラスミドを単離し
た。このプラスミドはｐ１−２１と呼称され、かつその同定は制限酵素分析によ
って確認された。さらにｐ１−２１はＫｐｎＩおよびＸｂａＩで切断され、２．
５ｋｂのフラグメントを単離し、かつＫｐｎＩ／ＸｂａＩ切断されたｐＫＡＳ３
２にライゲートした。このプラスミドはＥ．ＣｏｌｉＣＣ１１８λｐｉｒにエレ
クトロポレートし、かつカナマイシンおよびカルベニシリン（それぞれ５０μｇ
／ｍｌ）に対して選択された形質転換された細菌を用いた。その後に、一つのク
ローンが選択し、ｐ１−２２と呼称されたｐＫＡＳ３２中の前記ＤＮＡフラグメ
ントを含有するそのプラスミドを単離し、かつ制限酵素分析によって確認した。
プラスミドｐ１−２２をＥ．ＣｏｌｉＳ１７−１ λｐｉｒ中にエレクトロポレ
ーションし、かつネズミチフス菌ＮＣＴＣ１２０２３（de Lorenzo and Timms,
1994 ）中に、以前に記載されたように接合することによってトランスファーし
た。ａｐｈＴカッセトの挿入によるクローン遺伝子によってｓｓｒＢ遺伝子が置
換されている接合完了体を、Ｍ９＋グルコース最少培地アガープレート（mayoy
et al., 1996）上のその増加およびカナマイシンおよびカルベニシリン（１００
μｇ／ｍｌ）に対する耐性によって選択した。結果として生じる接合完了体はラ
クトース陰性の表現型を有し、かつカナマイシンおよびストレプトマイシンに感
受性であることを最終的に示した。さらに、選択されたクローンをサザンブロッ
ト分析によって試験した。クローニング工程中に獲得されるべき可能な突然変異
を排除するために、突然変異されたｓｓｒＢ対立遺伝子をＰ２２導入によって新
鮮なサルモネラバックグランドにトランスファーした（Maloy et al., 1996によ
って記載された）。ｓｓｒＢ座の範囲内でａｐｈＴカセットの挿入を含む突然変
異体のスクリーニングは、プライマー
【０１８８】
【外１３】
【０１８９】 を用いてＰＣＲによって実施した。野生型ｓｓｒＢ対立遺伝子を含有するクロー
ンからのＤＮＡの増幅は、６６０ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、ｓｓｒＢ対立遺伝子
を含有するクローンからのＤＮＡの使用は、１６００ｂｐのＰＣＲ産物を生じる
ａｐｈＴカセットの挿入によって分断された。結果として生じるサルモネラ菌株
ＭｖＰ３２０はｓｓｒＢ遺伝子の範囲内で、接合完了体の全ＤＮＡをサザンハイ
ブリダイゼーション分析を用いて、耐性カセットの存在を試験した。
【０１９０】 ｓｓｒＡ中のイン−フレーム欠失を有する突然変異株ＭｖＰ３４０の構築。
【０１９１】 ｓｓｒＢのコドン４４および４５１の間の４０７コドンの欠失が生じた。プラス
ミドｐ２−２をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩによって切断し、３．７ｋｂのフラグ
メントが回収し、かつｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中にサブクローニングされ
、かつｐ２−５０を生じた。プラスミドｐ２−５０をＰｓｔ１での切断によって
線状化し、この場合、これはｓｓｒＡ遺伝子のサブクローニングされたフラグメ
ントの範囲で一度に切断する。プライマー
【０１９２】
【外１４】
【０１９３】 をＰｓｔＩ部位に導入するように設計した。ＰＣＲはテンプレートＤＮＡとして
線状化されたｐ２−５０を用いて実施した。ＴａｑＰｕｌｓポリメラーゼ（Stra
tagene）は製品使用説明書にしたがって使用した。１００μｌの容量の反応は塩
化マグネシウム、１００ｍＭｄＮＴＰ ０．８μｌ、ＤＮＡテンプレート ２５
０ｎｇ（線状化されたｐ２−５０）、それぞれのプライマー ２５０ｎｇおよび
５ＵのＴａｑＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼを含有する１０×ＴａｑＰｌｕｓ精密
バッファー １０μｌを用いて開始した。ＰＣＲは９５℃で１分間、６０℃で１
分間、７２℃で６分間を３５サイクルで実施した。その後に、最終段階７２℃で
１０分間を加えた。ＰＣＲ反応物 １０μｌを分析した。期待された大きさの生
成物が回収され、ＰｓｔＩで切断され、セルフライゲートされ、かつライゲーシ
ョン混合物はＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５αにカルバニシリン耐性を形質転換するため
に使用された。プラスミドを形質転換体から単離し、かつインサートの完全性お
よび欠失は制限酵素分析およびＤＮＡシークエンシングによって分析された。確
認された構築体のインサートをＸｂａＩおよびＫｐｎＩでの切断の後に単離し、
かつＸｂａＩ／ＫｐｎＩ切断されたベクターｐＫＡＳ３２にライゲートした。結
果として生じる構築体をＥ．ＣｏｌｉＳ１７−１λｐｉｒにカルベニシリン耐性
を形質転換するために使用し、かつプラスミドのネズミチフス菌（NalR, StrepR
）への接合トランスファーは標準化プロトコール（de lorenzo and Timmis, 199
4）によって実施された。相同組み換えによって自殺プラスミドに組み込まれる
接合完了体をナリジクス酸およびカルベリシリン耐性によって選択し、かつスト
レプトマイシン感受性に関してスクリーニングした。このようなクローンをＬＢ
中で増殖させ、ＯＤ６００を約０．５にし、かつアリコートを２５０μｇ／ｍｌ
のストレプトマイシン含有ＬＢ上でプレートし、組み込まれたプラスミドを失い
、かつ対立遺伝子交換されたコロニーを選択した。カルバニシン耐性であるがス
トレプトマイシン耐性のコロニーはさらなる分析のために使用された。ｓｓｒＡ
座の範囲内の欠失を有する突然変異体のスクリーニングは、プライマー
【０１９４】
【外１５】
【０１９５】 を用いて、ＰＣＲによって実施された。野生型ｓｓｒＡ対立遺伝子を含有するコ
ロニーからのＤＮＡの増幅は２８００ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、内部欠失でのｓ
ｓｒＡ対立遺伝子を含有するコロニーからのＤＮＡの使用は、１５８０ｂｐのＰ
ＣＲ産物を生じた。ｓｓｒＡ欠失を有するコロニーの完全性を、さらにｓｓｒＡ
座のサザン分析によって確認した。最終的に、内部インーフレーム欠失を含有す
るｓｓｒＡ座をネズミチフス菌の新鮮な菌株バックグランドにＰ２２形質導入（
Maloy et al., 1996）によって移し、かつ結果として生じる菌株はＭｖＰ３４０
と呼称された。
【０１９６】 サザン ハイブリダイゼーション サルモネラの染色体ＤＮＡは以前に記載（Hensel et al., 1997）されている
ように調製された。サザンハイブリダイゼーション分析のために、染色体ＤＮＡ
はＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶで切断され、０．６％アガロースゲル上で分画さ
れ、かつＨｙｂｏｎｄＮ＋メンブレン（Amersham, Braunschweig）にトランスフ
ァーされた。ｓｓｒＡおよびｓｓｒＢ領域に相当する種々のプローブはλ１およ
びλ２のサブクローニングされたインサートの制限された断片として得られた。
【０１９７】 例９：ネズミチフス菌株ＭｖＰ３２０の安全性の評価 ネズミチフス菌野生型と突然変異株ＭｖＰ３２０との競合分析のために、細菌は
ＬＢ中で６００ｎｍで０．４〜０．６の最適密度に増殖された。培養物は希釈さ
れ、かつ２つの培養物のアリコートは混合され、双方の菌株を等量含有する摂取
材料を形成した。双方の菌株の割合は、それぞれの菌株に関して抗生物質選択性
を有するＬＢプレート上に希釈物をプレートすることによって測定された。ウニ
ット（ｃｆｕ）を形成する約１０４コロニーの摂取材料は、腹腔内注射によって
、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River breeders, Wiga）に感染
させるために使用された。感染後幾つかの時点において、マウスは頸部脱臼によ
って殺戮し、かつ肝臓および脾臓の細菌性荷重（load）は、‘ＷＡＳＰ’（Mein
trup, Laehden）らせん型器具を用いて組織ホモジネートをプレートすることに
よって測定した。プレーティングは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンまたは１００
μｌ／ｍｌのナリジクス酸を含有するＬＢプレートを用いて実施され、それぞれ
突然変異株または野生型を選択した。
【０１９８】 ａｐｈＴ遺伝子カセットをｓｓｒＢ中に含有する菌株ＭｖＰ３２０はネズミチフ
ス菌野生型菌株よりも少なくとも１０００倍低い数で回収された。これらのデー
タはｓｓｒＢがマウスモデルのサルモネラ中でネズミチフス菌の全身性の感染に
著しく寄与することを示した。
【０１９９】 すべての試験の統計的分析 ２つの試料間の統計学的意義はステューデンツ試験（Student's test）によっ
て測定された。得られた結果の意義は、Ｗｉｎｄｏｗｓ２．０ソフトウェア（St
atistical Graphic Corp.）に関する、スタットグラフィック プラス（statgra
phic plus）を用いて測定された。
【０２００】 例１０：生体内での誘導性ＰｓｓａＥプロモーターの特徴付け（Promoter B, 図
２４Ｂ） ｓｓａＥの上流に位置するプロモーター（PＳＳＡＥ、プロモーターＢと呼称さ
れる）はｓｓｒＡＢ座によって調節されることが示された。誘導された配列（図
２１Ａ）中に８００〜１２０のヌクレオチド（８００〜１２０５）を含有するＤ
ＮＡフラグメントは、プロモーターに対して融合されたレポーター遺伝子（ｇｆ
ｐ）の発現上のｓｓｒＢ依存型調節を参照するために示された。ＤＮＡフラグメ
ントはｇｆｐ遺伝子の前部で低コピー数のプラスミド上でクローン化された、他
のレポーター遺伝子構築体に関して以前に示されているように、Ｐｓｓａ（８０
０〜１２０５）からの誘導発現は、マグネシウム最少培地（）中で観察され、か
つｓｓｒＢの染色体性野生型対立遺伝子の存在に依存していた。ヌクレオチド９
２３〜１２０５（９２３〜１２０５）を誘導された配列中に含有する短いＤＮＡ
フラグメントは、ｇｆｐ発現上の調節を参照しなかった。しかしながら、発現は
ＰｓｓａＥフラグメント（８００〜１２０５）と比較して減少され、かつマグネ
シウム最少培地中に誘導されないばかりか、ｓｓｒＢに依存しない。したがって
、ＰｓｓａＥ（８００〜１２０５）フラグメントはポロモーター活性物質および
調節配列を含有し、おそらくはＳｓｒＢ結合部位を含有している。
【０２０１】 配列表 配列番号：１ ゲノム領域 核酸 図21A 配列番号：２ ゲノム領域 核酸 図21B 配列番号：３ sseA 核酸 図22A 配列番号：４ sseA 翻訳生成物 図23A 配列番号：５ sseB 核酸 図22B 配列番号：６ sseB 翻訳生成物 図23B 配列番号：７ sseC 核酸 図22C 配列番号：８ sseC 翻訳生成物 図23C 配列番号：９ sseD 核酸 図22D 配列番号：１０ sseD 翻訳生成物 配列番号：１１ sseD タンパク質 図23D 配列番号：１２ sseE 核酸 図22E 配列番号：１３ sseE 翻訳生成物 図23E 配列番号：１４ sseF 核酸 図22F 配列番号：１５ sseF 翻訳生成物 図23F 配列番号：１６ sseG 核酸 図22G 配列番号：１７ sseG 翻訳生成物 図23G 配列番号：１８ sscA 核酸 図22H 配列番号：１９ sscA 翻訳生成物 図23H 配列番号：２０ sscB 核酸 図22I 配列番号：２１ sscB 翻訳生成物 図23I 配列番号：２２ ssaD 核酸 図22J 配列番号：２３ ssaD 翻訳生成物 図23J 配列番号：２４ ssaE 核酸 図22K 配列番号：２５ ssaE 翻訳生成物 図23K 配列番号：２６ ssaG 核酸 図22L 配列番号：２７ ssaG 翻訳生成物 図23L 配列番号：２８ ssaH 核酸 図22M 配列番号：２９ ssaH 翻訳生成物 図23M 配列番号：３０ ssaI 核酸 図22N 配列番号：３１ ssaI 翻訳生成物 図23N 配列番号：３２ ssaJ 核酸 図22O 配列番号：３３ ssaJ 翻訳生成物 図23O 配列番号：３４ ssrA 核酸 図22P 配列番号：３５ ssrA 翻訳生成物 図23P 配列番号：３６ ssrB 核酸 図22Q 配列番号：３７ ssrB 翻訳生成物 図23Q 配列番号：３８ プロモーターA2 核酸 図24A 配列番号：３９ プロモーターB 核酸 図24B 配列番号：４０ EspA タンパク質 図2A 配列番号：４１ EspD タンパク質 図2B 配列番号：４２ YopB タンパク質 図2B 配列番号：４３ PepB タンパク質 図2B 配列番号：４４ D89 核酸 ３３ページ 配列番号：４５ D90 核酸 ３３ページ 配列番号：４６ D91 核酸 ３３ページ 配列番号：４７ D92 核酸 ３３ページ 配列番号：４８ E25 核酸 ４１ページ 配列番号：４９ E28 核酸 ４１ページ 配列番号：５０ E6 核酸 ４２ページ 配列番号：５１ E4 核酸 ４３ページ 配列番号：５２ sseC-del1 核酸 ４４ページ 配列番号：５３ sseE-del1 核酸 ４４ページ 配列番号：５４ sseC-For 核酸 ４５ページ 配列番号：５５ sseC-Rev 核酸 ４５ページ 配列番号：５６ sseD-del1 核酸 ４５ページ 配列番号：５７ sseD-del2 核酸 ４５ページ 配列番号：５８ sseD-For 核酸 ４６ページ 配列番号：５９ sseD-Rev 核酸 ４６ページ 配列番号：６０ sscB-del1 核酸 ４７ページ 配列番号：６１ sscB-del2 核酸 ４７ページ 配列番号：６２ sscB-For 核酸 ４７ページ 配列番号：６３ sscB-Rev 核酸 ４７／４８ページ 配列番号：６４ ssrA-For 核酸 ６６ページ 配列番号：６５ ssrA-Rev 核酸 ６６ページ 配列番号：６６ ssrB-For 核酸 ６７ページ 配列番号：６７ ssrB-Rev 核酸 ６７ページ 配列番号：６８ ssrA-del1 核酸 ６7ページ 配列番号：６９ ssrB-del2 核酸 ６８ページ
【０２０２】
【外１６】
【０２０３】
【外１７】
【０２０４】
【外１８】
【０２０５】
【外１９】
【０２０６】
【外２０】
【０２０７】
【外２１】
【０２０８】
【外２２】
【０２０９】
【外２３】
【０２１０】
【外２４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、サルモネラ病原性領域２の地図を示す図であり、（Ａ）は、菌株MvP1
01、MvP102、およびMvP103(B)中の突然変異の位置を示す。ゲノム領域の部分的
な制限地図を示し、かつこの実験に関連するプラスミドインサートの位置が（Ｃ
）に示されている。B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; P, PstI; V, EcoRV; S, Sma
l; EMBL データベース受入番号は、（Ａ）中の配列に示されている。
【図２ａ】 図２ａは、想定されるSseBアミノ酸配列とEPEC（Elliot et al., 1998）のEsp
Aの整合を示す図である。MacVector 6.0 プログラムの ClustalWアルゴリズムを
整合を構成するために使用した。類似したアミノ酸基を囲み、同一の基を囲みか
つ陰影をつけた。
【図２ｂ】 図２ｂは、想定されるSseCアミノ酸配列とEPECのEspD（Elliot et al., 1998
）、エルシニア・エンテロコリチカのYopB (Hakansson et al., 1993)、および
シュードモナス・エルジノーサのPepB (Hauser et al., 1998)の整合を示す図で
ある。MacVector 6.0 プログラムの ClustalWアルゴリズムを整合を構成するた
めに使用した。少なくとも３個のアミノ酸基が類似している場所を囲み、少なく
とも３個のアミノ酸基が同一の場所を囲みかつ陰影をつけた。
【図３】 図３は、RAW 264.7マクロファージ中のネズミチフス菌ＳＰＩ２突然変異体の
細胞内累積物を示す図である。オプソニン処理および感染に続いて、マクロファ
ージを溶解しかつ感染後２ｈおよび１６ｈに細胞内細菌（ゲンタマイシン保護）
を計数するために培養した。折りたたみの増加を示す数値は、感染後２ｈと１６
ｈの間の細胞内細菌の割合として計算された。感染を、それぞれの菌株に対して
３回実施し、かつ平均からの標準誤差を示した。
【図４】 図４は、(A)J774.1細胞および(B)C3H/HeN マウスからの過ヨウ素酸塩で顕在化
した腹腔マクロファージ中のＳＰＩ２突然変異体ネズミチフス菌の細胞内生存お
よび複製を示す図である。オプソニン処理および内在化した後に、食細胞を溶解
しかつ生存可能な細胞内細菌を計数するために０ｈで培養した。表示された数値
は、２０ｈで生存可能な細胞内接種物±平均標準誤差の割合を示す。試料を３つ
作成し、かつそれぞれの実験を少なくとも２回行った。
【図５】 図５は、免疫化の５２日後にMvP101[pAH97]、MvP103[pAH97]、SL7207[pAH97]
またはMvP101を用いて経口的に免疫化したマウスの腸管洗浄中のβ−gal-特異的
抗体を示す図である。結果を腸管洗浄中に存在する相応する全Ｉｇサブクラスの
パーセンテージとして表示し、SEMは、垂直線によって示されている。抗原特異
的IgMの有意水準は、どの群でも検出できなかった。MvP103およびSL7207（表示
なし）で得られた結果は、MvP101の結果と類似していた。
【図６】 図６は、MvP101[pAH97]、MvP103[pAH97]、SL7207[pAH97]またはMvP101を用い
て経口的に免疫化したマウスからのＣＤ４＋富化脾臓細胞のβ−gal-特異的増殖
性反応を示す図である。細胞を種々の濃度の可溶性β−galを用いて４日間のイ
ンキュベートの間に細胞をインビトロで再刺激した。数値は、３つの平均ｃｐｍ
として表示されている；SEMは、全ての場合に１０％よりも低かった。抗原を刺
激しなかったウェルから得られたバックグラウンド値は、差し引いてある。MvP1
03およびSL7207（表示なし）で得られた結果は、MvP101の結果と類似していた。
【図７】 図７は、培養の２日および４日目に、MvP101[pAH97]、MvP103[pAH97]、SL7207
[pAH97]またはプラスミドなしのMvP101を用いて経口的に免疫化したマウスの培
養されたＣＤ４＋富化脾臓細胞からの上澄液中に存在するIFN-γを示す図である
。脾臓細胞を免疫化の５２日後にマウスから単離し、かつＣＤ４＋富化個体群を
インビトロで４日間、可溶性のβ−gal（２０μg/ml）の存在で再刺激した。IFN
-γ生産量は、ELISAによって測定され、結果は、３つの測定値の平均を示してい
る。SEMは、垂直線によって示され、類似した結果は、どのプラスミドなしのキ
ャリアー（表示なし）を使用しても得られた。IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、および
IL-10を試験した場合に（表示なし）、対照群との著しい違いは観察されなかっ
た。
【図８】 図８は、MvP101[pAH97]（三角）、MvP103[pAH97]（丸）、SL7207[pAH97]（四
角）またはプラスミドなしのMvP101（菱形）を用いて経口的に免疫化した後のマ
ウス（ｎ＝５）中の、β−gal−特異的血清IgG（黒塗りの記号）およびIgM（白
塗りの記号）抗体反応の動態を示す図である。結果は、相乗平均エンドポイント
タイター（GMT）の逆数ｌｏｇ２で表示されている。SEMは、全ての場合に１０％
よりも低かった。類似した結果は、どのプラスミドなしのキャリアー（表示なし
）を用いても得られ、免疫化は、矢印により示されている。
【図９】 図９は、免疫化の５２日後に、MvP101[pAH97]、MvP103[pAH97]、SL7207[pAH97
]またはプラスミドなしのMvP101を用いて経口的に免疫化したマウス（ｎ＝５）
の血清中に存在するβ−gal−特異的IgG抗体のサブクラスのプロフィールを示す
図である。結果は、ng/mlで表示され、SEMは、垂直線により示されている。類似
した結果は、どのプラスミドなしのキャリアー（表示なし）を用いても得られた
。
【図１０】 図１０は、MvP101[pAH97]、MvP103[pAH97]、SL7207[pAH97]またはプラスミド
なしのMvP101を用いて経口的にワクチン注射したマウス中でインビボでリンパ球
により初回抗原刺激を受けさせたMHCクラスI−制限βGP1エピトープーの認識を
示す図である。免疫化したマウスからの脾臓細胞を２０μM βGP1の存在下で５
日間インビトロで再刺激した。培養の終わりに、P815（白塗りの記号）およびβ
GP1−負荷P815（黒塗りの記号）をターゲットとして用いて、リンパ球を[３Ｈ]
−チミジン−放出アッセイにおいて試験した。結果は、三重反復ウェル（３つの
独立試験うち１つが示されている）の平均値であり、次のように表示されている
：[（エフェクター不在下に残留したｃｐｍ）−（エフェクター存在下に実験的
に残留したｃｐｍ）／エフェクター不在下に残留したｃｐｍ]×１００；SEMは、
５％よりも低い数値であった。類似した結果は、どのプラスミドなしのキャリア
ー（表示なし）を用いても得られた。
【図１１】 図１１は、野生型中のsseA：：luc融合およびネズミチフス菌のmTn5突然変異
体菌株の発現を示す図である。
【図１２】 図１２は、菌株MvP284およびMvP320（Ｂ）中の突然変異の位置を示すサルモネ
ラ病原体領域２（Ａ）の地図を示す図である。ゲノム領域の部分的な制限地図を
示し、この実験に関連のあるプラスミドのインサートの位置が（Ｃ）に示されて
いる。B, BamHI; C, Clal; H, HindIII; P, PstI; V; S, Smal; EcoRV; II, HincII 。
【図１３】 図１３は、ＳＰＩ２ビルレンス遺伝子の転写構成のモデルを示す図である。こ
のモデルは、ＳＰＩ２遺伝子の転写方向（プロモーター活性の特性決定）の観察
に基づいている。
【図１４】 図１４は、異なる減衰の度合いを有する突然変異がどのように生じ得るかとい
う原理を示す図である。Aに示されているように、sseのような１つのエフェクタ
ー遺伝子の不活性化は、低い度合いの減衰を生じる。Bに示されているように、
ＳＰＩ２遺伝子座の外に位置する遺伝子、例えばaroAの付加的な不活性化は、中
程度の減衰を生じる。極性効果を用いる挿入突然変異により、多シストロン性ク
ラスター中の全ての遺伝子が作用し、その結果Ｃに示されているような高い度合
いの減衰が生じる。Ｄに示されているように、調節遺伝子、例えばssrBの不活性
化は、最大の減衰を生じる。
【図１５】 図１５は、ビルレンス遺伝子中への挿入突然変異の例による挿入突然変異の原
理を示す図である。種々のカセット、例えばSMC、GEC、TCおよび／またはインベ
ルターゼカセットは、クローン化ビルレンス遺伝子中に挿入することができ、こ
のようにビルレンス遺伝子カセットを用いる相同的組換えにより細胞中へ導入す
ることができる不活性化ビルレンス遺伝子を生じる。
【図１６】 図１６は、選択マーカーカセットを説明する図である。
【図１７】 図１７は、遺伝子発現カセットおよび二相系におけるその誘導を示す図である
。遺伝子発現カセットは、プロモーター、任意に１つ以上の発現単位を有する遺
伝子カセットおよび任意に発現単位のための１つ以上の転写ターミネーターおよ
び／または遺伝子発現カセットの５’に転写される配列を有する。
【図１８】 図１８は、異種抗原を種々をコンパートメント、すなわち、発現生成物のター
ゲッティングを支配するアクセサリー配列中へ送出すための遺伝子発現単位の構
造的要求条件を示す図である。
【図１９】 図１９は、１相系および２相系中のトランスアクチベーターカセットを示す図
である。
【図２０】 図２０は、一相系および二相系中の種々のアクセサリー配列および／またはカ
セットの組合せによって実現する種々の遺伝子発現の様式を示す図である。
【図２１Ａ】 図２１Ａは、遺伝子ssaE〜ssalの完全な配列およびssaDおよびssaJの部分的な
配列を有するサルモネラからのＳＰＩ２遺伝子座の領域のゲノム配列を示す図で
ある（図１２を参照）。
【図２１Ｂ】 図２１Ｂは、ssrAおよびsseBのコード配列を有するサルモネラからのＳＰＩ２
遺伝子座の領域のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２２】 図２２Ａ〜Ｑは、表示されたそれぞれの遺伝子のヌクレオチド配列を示す図で
ある。
【図２３】 図２３Ａ〜Ｑは、表示されたそれぞれのポリペプチドのアミノ酸配列を示す図
である。
【図２４】 図２４Ａ、Ｂは、インビボで誘導性のプロモーターを有するヌクレオチド配列
を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月２９日（２０００．１１．２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/245 Ａ６１Ｋ 39/29 39/29 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/005 Ｃ０７Ｋ 14/005 14/195 14/195 14/255 14/255 14/47 14/47 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 7/00 7/00 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｕｌｍｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ 160ａ、Ｄ −86156 Ａｕｇｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａ ｎｙ (72)発明者 ハイコ アプフェル ドイツ連邦共和国 アウグスブルク リン グシュトラーセ 11アー (72)発明者 クリストフ ヒュック ドイツ連邦共和国 アウグスブルク ヘン ヒシュトラーセ １ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA03 CA07 DA05 EA04 GA25 HA01 4B065 AA01X AA01Y AA46Y AA55X AA93Y AA95Y AA98X AB01 AC14 BA01 CA24 CA45 4C084 AA13 NA14 ZB26 ZB33 ZB35 4C085 AA03 AA05 BA24 BA51 BA78 BA87 CC07 CC08 CC13 DD23 EE01 FF24 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA01 CA11 CA40 DA86 EA31 FA74

Claims (100)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも５０ヌクレオチド ａ）図２１Ａ、Ｂのうち１つの核酸配列 ｂ）図２１Ａ、Ｂのうち１つの核酸配列の対立遺伝子、または ｃ）ストリンジェントな条件下で、図２１Ａ、Ｂのうち１つの核酸配列とハイブ
    リダイズする核酸配列 を有する核酸配列を有する単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 該核酸配列が、以下の配列 ａ）図２２Ａ〜Ｑのうち１つの核酸配列 ｂ）遺伝子コードの縮重内で図２２Ａ〜Ｑのうち１つの核酸配列に相当する核酸
    配列、または ｃ）ストリンジェントな条件下で、図２２Ａ〜Ｑのうち１つの核酸配列とハイブ
    リダイズする核酸配列 の少なくとも５０ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 該核酸配列が、 ａ）図２２Ａ〜Ｑのうち１つの核酸配列 ｂ）遺伝子コードの縮重内で図２２Ａ〜Ｑのうち１つの核酸配列に相当する核酸
    配列、または ｃ）ストリンジェントな条件下で、図２２Ａ〜Ｑのうち１つの核酸配列とハイブ
    リダイズする核酸配列 を有する、請求項２に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 少なくとも１つのコード領域が機能的に欠失している、請求
    項１から３までのいずれか１項に記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 トランスポゾンまたはファージが媒介する挿入のための少な
    くとも１つの挿入カセットが挿入されている、請求項１から４までのいずれか１
    項に記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 ポリペプチドまたはペプチドをコードする少なくも１つの異
    種核酸分子が挿入されているかまたは欠失−挿入されている、請求項１から５ま
    でのいずれか１項に記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 該異種核酸分子をフランキングしている配列が、それぞれ少
    なくとも５０ヌクレオチド、有利には２００〜２５０ヌクレオチドの長さを有す
    る、請求項６に記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 該異種核酸分子が、細菌性またはウイルス性抗原またはその
    相同体をコードする核酸配列を有する、請求項６または７に記載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 該異種核酸分子が腫瘍抗原をコードする核酸配列を有する、
    請求項６または７に記載の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 該異種核酸分子が少なくとも１つの遺伝子発現カセットを
    有する、請求項７から９までのいずれか１項に記載の核酸分子。
  11. 【請求項１１】 該異種核酸分子が少なくとも１つのトランスアクチベータ
    ーカセット、選択マーカーカセット、インベルターゼカセットまたはその組合せ
    を有する、請求項７から１０までのいずれか１項に記載の核酸分子。
  12. 【請求項１２】 該異種核酸分子がポリペプチドまたはペプチドターゲッテ
    ィングおよび／または免疫刺激ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
    を有する、請求項７から１１までのいずれか１項に記載の核酸分子。
  13. 【請求項１３】 請求項１から１２までのいずれか１項に記載の核酸分子を
    有する組み換えベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項５から１２までのいずれか１項に記載の核酸分子ま
    たは請求項１３に記載の組み換えベクターを有する細胞。
  15. 【請求項１５】 該細胞がグラム陰性細胞である、請求項１４に記載の細胞
    。
  16. 【請求項１６】 該細胞がサルモネラ細胞である、請求項１４に記載の細胞
    。
  17. 【請求項１７】 以下の配列 ａ）図２３Ａ〜Ｑの配列、または ｂ）図２３Ａ〜Ｑの配列と６０％相同である配列 の少なくとも２０個のアミノ酸を有するペプチド配列を含むペプチドまたはポリ
    ペプチド。
  18. 【請求項１８】 配列 ａ）図２３Ａ〜Ｑ、または ｂ）図２３Ａ〜Ｑの配列と６０％相同である配列 を有するポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１７および１８のいずれか１項に記載のポリペプチ
    ドに対する抗体。
  20. 【請求項２０】 請求項１７および１８のいずれか１項に記載のポリペプチ
    ドが挿入されているかまたは欠失−挿入されているかまたはＣ−またはNH２−末
    端で少なくとも１つの異種ポリペプチドと一緒に融合して成る融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】 異種ポリペプチドが、細菌性、ウイルス性または腫瘍抗原
    から選択される、請求項２０に記載の融合タンパク質。
  22. 【請求項２２】 ＳＰＩ２遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子が不活性化さ
    れ、不活性化が該細胞の野生型と比較してビルレンスの減衰／減少を生じる、Ｓ
    ＰＩ２遺伝子座を有する弱毒化グラム陰性細胞。
  23. 【請求項２３】 少なくとも１つの不活性化遺伝子がエフェクター（sse）
    遺伝子、分泌装置（ssa）遺伝子、シャペロン（ssc）遺伝子および調節（ssr）
    遺伝子から選択される、請求項２２に記載の弱毒化グラム陰性細胞。
  24. 【請求項２４】 該細胞がエンテロバクテリカ細胞、特にサルモネラ細胞、
    赤痢菌細胞またはビブリオ細胞である、請求項２２および２３に記載の弱毒化グ
    ラム陰性細胞。
  25. 【請求項２５】 該細胞がサルモネラ細胞である、請求項２４に記載の弱毒
    化グラム陰性細胞。
  26. 【請求項２６】 該細胞が広い宿主域を有する、請求項２４または２５に記
    載の弱毒化グラム陰性細胞。
  27. 【請求項２７】 該細胞がサルモネラ抗原型チフス菌固有型１０４（DT104
    ）細胞である、請求項２６に記載の弱毒化グラム陰性細胞。
  28. 【請求項２８】 少なくとも１つの不活性化遺伝子がｓｓｅ、ｓｓｃおよび
    ｓｓｒから選択される、請求項２２から２７までのいずれか１項に記載の細胞。
  29. 【請求項２９】 少なくとも１つの不活性化遺伝子が、少なくとも１つのｓ
    ｓｅ遺伝子を有する、請求項２２から２８までのいずれか１項に記載の細胞。
  30. 【請求項３０】 少なくとも１つのｓｓｅ遺伝子がｓｓｅＣ、ｓｓｅＤおよ
    びｓｓｅＥから選択される、請求項２９に記載の細胞。
  31. 【請求項３１】 少なくとも１つの不活性化遺伝子が、少なくとも１つのｓ
    ｓｒ遺伝子を有する、請求項２２から３０までのいずれか１項に記載の細胞。
  32. 【請求項３２】 少なくとも１つの該ｓｓｒ遺伝子がｓｓｒＢである、請求
    項３１に記載の細胞。
  33. 【請求項３３】 少なくとも１つの不活性化遺伝子が、少なくとも１つのｓ
    ｓｃ遺伝子を有する、請求項２２から３２までのいずれか１項に記載の細胞。
  34. 【請求項３４】 少なくとも１つのｓｓｃ遺伝子がｓｓｃＢである、請求項
    ３３に記載の細胞。
  35. 【請求項３５】 少なくとも１つの遺伝子が欠失を含む突然変異によって不
    活性化されている、請求項２２から３４までのいずれか１項に記載の細胞。
  36. 【請求項３６】 欠失が少なくとも６ヌクレオチドから成る、請求項３５に
    記載の細胞。
  37. 【請求項３７】 突然変異が該遺伝子の完全なコード配列の欠失から成る、
    請求項３５および３６のいずれか１項に記載の細胞。
  38. 【請求項３８】 少なくとも１つの遺伝子が異種核酸分子の欠失から成る突
    然変異によって不活性化されている、請求項２２から３７までのいずれか１項に
    記載の細胞。
  39. 【請求項３９】 該突然変異が非極性突然変異である、請求項３５から３８
    までのいずれか１項に記載の細胞。
  40. 【請求項４０】 ＳＰＩ２遺伝子座の外に位置する少なくとも１つの付加的
    な遺伝子が不活性化され、不活性化が野生型と比較してさらにビルレンスの減衰
    ／減少を生じる、請求項２２から３９までのいずれか１項に記載の細胞。
  41. 【請求項４１】 付加的な該遺伝子がａｒｏ遺伝子を有する、請求項４０に
    記載の細胞。
  42. 【請求項４２】 該ａｒｏ遺伝子がａｒｏＡである、請求項４１に記載の細
    胞。
  43. 【請求項４３】 付加的な該遺伝子がスーパーオキシドジスムターゼである
    、請求項４０に記載の細胞。
  44. 【請求項４４】 少なくとも１つの選択マーカーカセットを有する、請求項
    ２２から４３までのいずれか１項に記載の細胞。
  45. 【請求項４５】 該選択マーカーカセットが、細胞へ抗生物質耐性を与える
    ことができる、請求項４４に記載の細胞。
  46. 【請求項４６】 少なくとも１つの遺伝子発現カセットを有する、請求項２
    ２から４５までのいずれか１項に記載の細胞。
  47. 【請求項４７】 少なくとも１つのトランスアクチベーターカセットを有す
    る、請求項２２から４６までのいずれか１項に記載の細胞。
  48. 【請求項４８】 少なくとも１つのインベルターゼカセットを有する、請求
    項２２から４７までのいずれか１項に記載の細胞。
  49. 【請求項４９】 少なくとも１つの挿入カセットを有する、請求項２２から
    ４８までのいずれか１項に記載の細胞。
  50. 【請求項５０】 宿主に抗原提示をするキャリヤーであって、該キャリアー
    が請求項２２から４９までのいずれか１項に記載の弱毒化グラム陰性細胞であり
    、該細胞が該抗体をコードする核酸配列を有する少なくとも１つの異種核酸分子
    を有し、かつ該細胞が該核酸分子の発現を可能とするか、または標的細胞中で該
    核酸分子の発現を引き起こすことを可能とすることを特徴とする、宿主に抗原提
    示をするキャリヤー。
  51. 【請求項５１】 該核酸分子が細菌性またはウイルス性抗原または腫瘍抗原
    をコードする核酸配列を有する、請求項５０に記載のキャリヤー。
  52. 【請求項５２】 該核酸配列が、ヘリコバクターピロリ、クラミジア肺炎菌
    、ボレリア・ブルクドルフェリ、ナノバクテリア、肝炎ウイルス、ヒト乳頭ウイ
    ルスまたはヘルペスウイルスからの抗原をコードする、請求項５１に記載のキャ
    リヤー。
  53. 【請求項５３】 該核酸分子がＳＰＩ２遺伝子座中に挿入されている、請求
    項５０から５２までのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  54. 【請求項５４】 該核酸分子がｓｓｅ遺伝子中に挿入されている、請求項５
    ３に記載のキャリヤー。
  55. 【請求項５５】 該ｓｓｅ遺伝子が、ｓｓｅＣ、ｓｓｅＤおよびｓｓｅＥか
    ら選択される、請求項５４に記載のキャリヤー。
  56. 【請求項５６】 挿入が非極性挿入である、請求項５０から５５までのいず
    れか１項に記載のキャリヤー。
  57. 【請求項５７】 該異種核酸分子の発現が組織特異性である、請求項５０か
    ら５６までのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  58. 【請求項５８】 該異種核酸の発現が誘導性である、請求項５０から５７ま
    でのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  59. 【請求項５９】 該異種核酸の発現が標的細胞中で活性化される、請求項５
    ０から５８までのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  60. 【請求項６０】 該標的細胞がマクロファージである、請求項５９に記載の
    キャリヤー。
  61. 【請求項６１】 該核酸分子が、少なくとも１つのポリペプチドまたはペプ
    チドターゲッティングおよび／または免疫刺激ドメインをコードする核酸配列を
    有する、請求項５０から６０までのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  62. 【請求項６２】 該核酸分子が融合タンパク質をコードする、請求項５０か
    ら６０までのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  63. 【請求項６３】 該核酸分子の発現生成物が、該キャリヤーのサイトゾル中
    に残存する、請求項５０から６２までのいずれか１項に記載の細胞。
  64. 【請求項６４】 該核酸分子の発現生成物が、該キャリヤーのペリプラズム
    間隙に方向付けされる、請求項５０から６２までのいずれか１項に記載のキャリ
    ヤー。
  65. 【請求項６５】 該核酸分子の発現生成物が該キャリヤーの外膜に方向付け
    される、請求項５０から６２までのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  66. 【請求項６６】 該核酸分子の発現生成物が分泌されている、請求項５０か
    ら６２までのいずれか１項に記載のキャリヤー。
  67. 【請求項６７】 該核酸分子の発現生成物がIII型分泌系によって分泌され
    ている、請求項６６に記載のキャリヤー。
  68. 【請求項６８】 該核酸分子の発現生成物がＳＰＩ２III型分泌系によって
    分泌されている、請求項６７に記載のキャリヤー。
  69. 【請求項６９】 少なくとも１つのＳＰＩ２ポリペプチドの欠損により特徴
    付けられている、ＳＰＩ２遺伝子座を有する弱毒化グラム陰性細胞において、該
    欠損が細胞の野生型と比較してビルレンスの減衰／減少を生じることを特徴とす
    る、ＳＰＩ２遺伝子座を有する弱毒化グラム陰性細胞。
  70. 【請求項７０】 失われたポリペプチドが、エフェクター（sse）ポリペプ
    チド、分泌装置（ssa）ポリペプチド、シャペロン（ssc）ポリペプチドおよび調
    節（ssr）ポリペプチドから選択される、請求項６９に記載の弱毒化グラム陰性
    細胞。
  71. 【請求項７１】 宿主へ抗原提示をするキャリヤーであって、該キャリヤー
    が請求項６９または７０に記載の弱毒化グラム陰性細胞であり、免疫原特性を有
    する少なくとも１つの異種ペプチドまたはポリペプチドの存在によってさらに特
    徴付けられている、宿主へ抗原提示をするキャリヤー。
  72. 【請求項７２】 作用物質として、請求項２２から４９、６９および７０の
    いずれか１項に記載の弱毒化細胞であるか、または請求項５０から６８および７
    １のいずれか１項に記載のキャリヤーである免疫学的に保護性の生ワクチンを含
    有する製薬的組成物。
  73. 【請求項７３】 製薬的に認容性の希釈剤、担体および／またはアジュバン
    トを有する請求項７２に記載の組成物。
  74. 【請求項７４】 粘膜表面にまたは非経口的経路を介して投与するのに適当
    である、請求項７２および７３のいずれか１項に記載の組成物。
  75. 【請求項７５】 生ワクチンの製法の製法において、ＳＰＩ２遺伝子座を有
    する生きているグラム陰性細胞を提供し、かつＳＰＩ２遺伝子座の少なくとも１
    つの遺伝子を不活性化して請求項２２から４９、６９および７０のいずれか１項
    に記載の弱毒化グラム陰性細胞を得ることを特徴とする、生ワクチンの製法。
  76. 【請求項７６】 抗原をコードする少なくとも１つの異種核酸分子を挿入し
    て請求項５０から６８および７１のいずれか１項に記載のキャリヤーを得ること
    をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 請求項２２から４９、６９および７０のいずれか１項に記
    載の弱毒化細胞または請求項５０から６８および７１のいずれか１項に記載のキ
    ャリヤーを製薬学的に有効な量で、製薬学的に認容性の希釈剤、担体および／ま
    たはアジュバントと一緒に配合することを特徴とする、生ワクチン組成物の製法
    。
  78. 【請求項７８】 該細胞を含有する試料を提供し、かつ野生型には存在しな
    い特異的な特性を検出することを特徴とする、請求項２２から４９、６９および
    ７０のいずれか１項に記載の弱毒化細胞または請求項５０から６８および７１の
    いずれか１項に記載のキャリヤーの検出法。
  79. 【請求項７９】 請求項２２から４９、６９および７０のいずれか１項に記
    載の少なくとも２つの弱毒化細胞を得て、該細胞の病因を決定し、かつ該細胞の
    病因の相間を決定することを特徴とする、弱毒化グラム陰性細胞のライブラリー
    を樹立する方法。
  80. 【請求項８０】 該細胞の免疫抗原性を決定し、かつ該細胞の免疫抗原性の
    相間を決定することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 免疫抗原性の決定は、液性、細胞性および／または粘膜の
    免疫抗原性の決定である、請求項８０に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 宿主へ抗原提示をする弱毒化キャリヤーのライブラリーを
    樹立する方法において、請求項５０から６８および７１のいずれか１項に記載の
    少なくとも２つのキャリヤーを得て、（ａ）該細胞の病因および該細胞の病因の
    相間を決定し、かつ（ｂ）該宿主中での該抗原提示の効果を決定し、かつ該細胞
    によって引き起こされた効果の相間を決定することを特徴とする、宿主へ抗原提
    示をする弱毒化キャリヤーのライブラリーを樹立する方法。
  83. 【請求項８３】 抗原提示の効果を液性、細胞性および／または粘膜のレベ
    ルで決定する、請求項８２に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 該細胞の免疫抗原性を決定し、かつ該細胞の免疫抗原性の
    相間を決定し、その際に場合により該決定が液性、細胞性および／または粘膜の
    免疫抗原性の決定であることをさらに含む、請求項８２または８３に記載の方法
    。
  85. 【請求項８５】 本質的に細菌またはウイルスによって引き起こされる急性
    または慢性疾患を予防的または治療的に処置するための薬剤を製造するための、
    請求項２２から４９、６９および７０のいずれか１項に記載の弱毒化細胞または
    請求項５０から６８および７１のいずれか１項に記載のキャリヤーの使用。
  86. 【請求項８６】 該疾患が本質的にサルモネラ細胞によって引き起こされる
    、請求項８５に記載の使用。
  87. 【請求項８７】 腫瘍を予防的または治療的に処置するための薬剤を製造す
    るための請求項５０から６８および７１のいずれか１項に記載のキャリヤーの使
    用。
  88. 【請求項８８】 弱毒化細胞、生ワクチンまたは宿主へ抗原提示をするキャ
    リヤーを製造するための請求項１から１２までのいずれか１項に記載の核酸分子
    または請求項１３に記載のベクターの使用。
  89. 【請求項８９】 弱毒化細胞、生ワクチンまたは宿主へ抗原提示をするキャ
    リヤーを製造するためのサルモネラＳＰＩ２遺伝子座の使用。
  90. 【請求項９０】 宿主へ抗原提示をするキャリヤーを製造するためのグラム
    陰性細胞のビルレンス遺伝子座の使用。
  91. 【請求項９１】 以下の配列 ａ）図２４Ａ、Ｂのうち１つの核酸配列、 ｂ）ストリンジェントな条件下で、図２４Ａ、Ｂのうち１つの核酸配列とハイブ
    リダイズする核酸配列 の少なくとも１００ヌクレオチドの核酸を有する単離された核酸分子。
  92. 【請求項９２】 該核酸分子が、該核酸分子と作動的に結合しているペプチ
    ドまたはポリペプチドをコードする核酸配列の発現を誘導することができる、請
    求項９１に記載の核酸分子。
  93. 【請求項９３】 異種核酸を標的細胞においてインビボで誘導的に発現する
    ための発現系において、該発現系が該異種核酸のためのキャリヤー細胞を有して
    いて、該キャリヤー細胞が（ａ）図２３Ｐ（ssrA）に示されるアミノ酸配列を有
    するポリペプチドまたはその機能的相同体、（ｂ）図２３Ｑ（ssrＢ）に示され
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的相同体、および（ｃ）請
    求項９２に記載の核酸分子を有することを特徴とする、異種核酸を標的細胞にお
    いてインビボで誘導的に発現するための発現系。
  94. 【請求項９４】 該標的細胞がマクロファージである、請求項９１に記載の
    発現系。
  95. 【請求項９５】 該キャリヤー細胞がサルモネラ細胞である、請求項９３お
    よび９４に記載の発現系。
  96. 【請求項９６】 該標的細胞が遺伝子発現カセットを有する、請求項９３か
    ら９５までのいずれか１項に記載の発現系。
  97. 【請求項９７】 該標的細胞が挿入カセットを有する、請求項９３から９６
    までのいずれか１項に記載の発現系。
  98. 【請求項９８】 該標的細胞がペプチドまたはポリペプチドをコードする異
    種核酸分子を有する、請求項９３から９７までのいずれか１項に記載の発現系。
  99. 【請求項９９】 異種核酸分子をインビボで誘導的に発現させるための請求
    項９２に記載の核酸分子の使用。
  100. 【請求項１００】 インビボで誘導性のプロモーターを検出するための請求
    項９２に記載の核酸分子の使用。
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