CN114703214A

CN114703214A - 一种抗丢失时空可控表达的新型质粒及其应用

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Publication number: CN114703214A
Application number: CN202210206992.8A
Authority: CN
Inventors: 华子春; 李霖; 李晨阳; 吴乐阳
Original assignee: Nanjing Nuobakang Biotechnology Co ltd; Nanjing Jiruikang Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Nanjing Nuobakang Biotechnology Co ltd; Nanjing Jiruikang Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2022-03-03
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2022-07-05

Abstract

本发明公开了一种抗丢失时空可控表达的新型质粒及其应用，并应用于构建细菌载体新冠疫苗。本发明的一种抗丢失时空可控表达的新型质粒，所述的细菌分泌信号为革兰氏阴性菌III型分泌信号，所述的革兰氏阴性菌III型分泌信号为沙门氏菌毒力岛2SPI‑2效应蛋白SseJ。具体地，通过将防丢失元件表达序列及启动子元件整合至质粒，保证细菌在宿主体内复杂环境条件下传代过程中稳定拷贝质粒，从而实现持久的异源蛋白表达，并应用至构建新型细菌载体新冠疫苗。

Description

一种抗丢失时空可控表达的新型质粒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗丢失时空可控表达的新型质粒及其应用。

背景技术

为了有效地防治新型冠状病毒的传播，急需开发安全、高效、廉价的 SARS-CoV-2疫苗。在早期针对SARS-CoV疫苗的开发过程中，研究人员发现针对病毒刺突蛋白(S蛋白)的抗体能高效中和病毒并预防感染(Yang ZY等人， 2005，Proc Natl Acad Sci U S A102:797-801)，因此针对SARS-CoV-2的S蛋白，尤其是该蛋白中的RBD区域，是当下抗病毒药物及疫苗开发的首要靶点(Walls AC等人，2020,Cell 181:281-292.e6)。现阶段开发的新型冠状病毒疫苗，涉及减毒活疫苗、重组病毒载体疫苗、灭活病毒疫苗、蛋白亚基疫苗、病毒样颗粒 (VLP)疫苗以及核酸疫苗等多种类型(Jeyanathan M等人，2020，Nat RevImmunol 20:615-632)。灭活疫苗存在着生产过程高风险；重组病毒疫苗和核酸疫苗存在费用高、接种不便等问题；而传统的重组蛋白疫苗因则需要额外佐剂的添加(Guy B等人，2007，Nat Rev Microbiol 5:505-517)。基于减毒菌株的口服疫苗因接种简单，价格低廉等优势，已应用于多种感染性疾病的疫苗开发。减毒沙门氏菌是一种天然的粘膜免疫佐剂，能够作为口服疫苗载体、进行抗原表达和投递。通过基因工程改造的重组疫苗株，经口服后通过肠道中M细胞进入机体内部(Jensen VB等人，1998，Infect Immun 66:3758-3366)，进入体内环境的菌株可被抗原呈递细胞(APC)所快速吞噬处理，此时若借助菌体的分泌系统便可有效地将抗原蛋白分泌至APC细胞内部，进一步被有效分解成多肽段并通过组织相容性复合体MHC-I或MHC-II途径展示给辅助T细胞(T-help cell)，以激发机体产生针对抗原分子的细胞、体液以及粘膜免疫应答(Mei Y等人，2017，Cancer Immunol Res5:503-514)。

但是开发一种用于预防新冠病毒的、高效且应用性强的口服减毒沙门氏菌疫苗，仍面临以下技术难题：a)如何维持重组细菌的表型稳定性，利用减毒细菌作为外源抗原的表达工具，急需建立一种合适的表达策略，以优化抗原表达量与质粒兼容性，否则会出现菌株毒性过高，工程质粒丢失严重而丧失免疫效果等问题；b)如何实现抗原蛋白经菌体分泌至细胞中的有效性？多数细菌在进入抗原递呈细胞后，会被一种膜包裹的囊泡结构(SCV)所包裹，这种结构很大程度地限制了抗原分子的有效递呈(Zhang XL等人，2008，Cell Mol Immunol 5:91-97)。若不能实现真正的有效呈递，将大大降低疫苗的预防效果；c)如何实现病毒抗原表位筛选与区域选择的最优性？由于新冠病毒S蛋白分子量大且结构复杂(Hsieh CL等人，2020，Science 369:1501-1505)，需要针对其多个结构域不同表位进行筛选，以避免过于复杂的蛋白结构无法被有效分泌，并通过尽可能多地呈递有效抗原决定簇来诱导产生更佳的免疫应答。

因此，要开发一个高效的基于减毒沙门氏菌分泌表达系统的(SARS-CoV-2)新冠病毒疫苗，必须构建一个安全、高效且稳定的沙门氏菌分泌表达载体，以实现抗原分子在沙门氏菌中的表达并可有效分泌至抗原呈递细胞内，以高效诱导机体免疫应答，这是本发明要解决的问题。

发明内容

本发明的主要目的是构建一种高效的减毒沙门氏菌表达分泌载体，并筛选出能够诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合，建立表达稳定、保护性效率高的、以减毒沙门氏菌为运输载体的新型冠状病毒口服疫苗。

为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种抗丢失时空可控表达的新型质粒，所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒包括细菌分泌信号及SseJ信号肽序列、SopE 启动子、以及防丢失质粒元件AT；细菌分泌信号为革兰氏阴性菌III型分泌信号，所述的革兰氏阴性菌III型分泌信号为沙门氏菌毒力岛2SPI-2效应蛋白SseJ信号肽，所述的SseJ信号肽的序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的防丢失质粒元件AT的序列SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列，所述的SopE启动子的序列SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

进一步地，利用革兰氏阴性菌III型分泌表达系统在减毒菌株中实现表达蛋白的分泌，所述的减毒菌株为减毒沙门氏菌VNP20009或htrA基因缺陷型减毒沙门氏菌VNP20009(Ah-1) 或其他类型减毒沙门氏菌；革兰氏阴性菌III型分泌表达系统包括III型分泌信号肽序列及其启动子；使用sseJ启动子和sifB启动子调控III型分泌信号的表达，所述的sseJ启动子的序列SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述的SifB启动子的序列SEQID No.5所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的减毒菌株为减毒沙门氏菌VNP20009或htrA基因缺陷型减毒沙门氏菌 VNP20009(Ah-1)或其他类型减毒沙门氏菌，包括但不限于前述已经申请发明专利的各菌株 (ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，202010182038.0；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021,11(10):3165-3177；phoP/phoQ，等)。

本发明抗丢失时空可控表达的新型质粒在制备减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈系统的制备方法，包括如下步骤：利用胞内诱导型启动子调控细菌分泌信号分泌表达；采用一步法同源重组克隆技术，将启动子元件及防丢失元件重组至质粒；在分析巨噬细胞等抗原递呈细胞的胞内微环境的基础上，利用生物信息的方法与分子克隆技术筛选并克隆细菌启动子和分泌信号；利用胞内诱导型启动子调控细菌分泌信号分泌表达的抗原，添加质粒防丢失元件提高菌内质粒稳定性，制得高效稳定的胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈系统。

进一步地，基于本发明所述的一种抗丢失时空可控表达的新型质粒，构建高效、稳定的胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈质粒，所述的胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达是抗原递呈细胞的胞内环境诱导的沙门氏菌III型分泌抗原表达系统，包括III型分泌系统启动子及信号肽序列。

进一步地，利用革兰氏阴性菌III型分泌系统分泌新型冠状病毒抗原分子，将III型分泌信号与抗原分子融合来实现对新型冠状病毒抗原的分泌。所述的III型分泌信号为沙门氏菌毒力岛2(SPI-2)效应蛋白SseJ，并使用sseJ启动子和sifB启动子对其表达进行调控。

本发明含有所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒的新型冠状病毒口服疫苗，筛选能诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合，所述的抗原分子为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)RBD结构域全部氨基酸序列。

本发明所述的减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈系统在制备新型冠状病毒口服疫苗中的应用。

有益效果：本发明提供了一种适用于该体系的质粒防丢失元件，从而实现表达抗原的持续稳定存在与抗原被机体抗原呈递细胞有效捕捉识别并呈递。本发明提供了一种全新的、高效的、安全的、低廉的、方便的、可用于人和动物的新型冠状病毒疫苗分泌表达载体及其应用。

与现有的以及正在研发中的新型冠状病毒疫苗相比，本发明的特色和创新之处在于：

(1)发明了一种利用沙门氏菌III型分泌系统信号指导新型冠状病毒疫苗抗原表达载体，实现了新型冠状病毒抗原的分泌表达，并在小鼠模型中诱导机体产生了高效价的抗体。

(2)发明了一种新型口服菌制新型冠状病毒疫苗，该疫苗使用新型的减毒沙门氏菌作为载体，该新型的减毒沙门氏菌因其微弱的病原性，自身便可作为一种高效的佐剂，省去了额外的佐剂添加。

(3)发明了一种成本低廉的口服菌制新型冠状病毒疫苗，该疫苗使用新型的减毒沙门氏菌作为载体，由于减毒菌株可自行增殖的特性，生产成本低并且极大缩减了疫苗制备时间，简化了操作流程，使得最终获得产品具备更强的价格优势。

(4)发明了一种安全可控的口服疫苗系统，该疫苗使用新型的减毒沙门氏菌作为载体，若出现显著的不良反应，可通过服用抗生素的方法实现有效且快速的消退。

附图说明

图1为本发明的体外传代验证防丢失质粒表达稳定性图；左：携带未整合防丢失元件质粒细菌体外传代实验表达红色荧光蛋白RFP效率图；右：携带整合防丢失元件质粒细菌体外传代实验表达RFP效率图。

图2为本发明的不同的新冠病毒S蛋白RBD的表达体系构建示意图；1.Ah-JP-RBD质粒，使用J23100启动子，pelB信号肽，表达RBD蛋白；2.Ah-NS-RBD质粒，使用NirB启动子，sseJ信号肽，表达RBD蛋白；3.Ah-SS-RBD质粒，使用sseA启动子，sseJ信号肽，表达RBD蛋白；4.Ah-JJ-RBD质粒，使用sseJ启动子，sseJ信号肽，表达RBD蛋白；5. Ah-BJ-RBD质粒，使用sifB启动子，sseJ信号肽，表达RBD蛋白。

图3为本发明的Western Blot检测不同表达体系在重组减毒沙门氏菌中表达与分泌RBD 蛋白的情况；3A.Ah-JP-RBD重组减毒沙门氏菌的RBD蛋白表达与分泌。1.菌体中RBD蛋白表达检测，2.培养上清中，RBD蛋白的分泌表达检测。Ah-JP-RBD重组减毒沙门氏菌可有效表达并分泌RBD蛋白；3B.Ah-NS-RBD，Ah-SS-RBD，Ah-JJ-RBD，Ah-BJ-RBD 4种重组减毒沙门氏菌表达与分泌RBD蛋白的情况。a.细菌培养在LB液体培养基中；b.细菌与巨噬细胞RAW264.7共培养；1.Ah-NS-RBD重组减毒沙门氏菌；2.Ah-SS-RBD重组减毒沙门氏菌；3.Ah-JJ-RBD重组减毒沙门氏菌；4.Ah-BJ-RBD重组减毒沙门氏菌。Ah-NS-RBD与 Ah-SS-RBD两种重组减毒沙门氏菌无法在胞内诱导表达RBD蛋白，而Ah-JJ-RBD与 Ah-BJ-RBD两种重组减毒沙门氏菌可在胞内有效诱导表达并分泌RBD蛋白。

图4为本发明的免疫荧光检测胞内诱导表达型工程菌表达与分泌RBD蛋白的情况图；1. 重组减毒沙门氏菌装载不含RBD-HA序列，其余原件相同的质粒；2.Ah-JJ-RBD重组减毒沙门氏菌；2.Ah-BJ-RBD重组减毒沙门氏菌。DAPI染色细胞核，Ah-1由沙门氏菌荧光抗体染色(箭头处)，RBD-HA由相应荧光抗体染色(箭头处)。

图5为本发明的重组菌免疫小鼠实验示意图。

图6为本发明的Ah-JP-RBD，Ah-JJ-RBD，Ah-BJ-RBD 3种重组减毒沙门氏菌诱导抗体产生评估图；1.空白对照组Ah-NC重组减毒沙门氏菌；2.Ah-JP-RBD重组减毒沙门氏菌；3.Ah-JJ-RBD重组减毒沙门氏菌；4.Ah-BJ-RBD重组减毒沙门氏菌。3种重组减毒沙门氏菌均有效诱导机体产生相应抗体，其中Ah-BJ-RBD重组减毒沙门氏菌的抗体诱导产生效果要显著优于其他3种重组菌，表明这一体系更加高效。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例用于说明本发明，但是不用来限制本发明的范围。以新型冠状病毒SARS-COV-2S蛋白的RBD蛋白区域作为投递抗原为实施例。实施例中所用减毒沙门氏菌为htrA缺陷型VNP20009减毒菌株(记做Ah-1)。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1

抗原蛋白RBD递送质粒的构建

结构分析表明，RBD蛋白在S蛋白与ACE2(血管紧张素酶2)结合的过程中起到关键性作用(图1)。组成型表达分泌体系Ah-JP-RBD质粒中，使用强组成型启动子J23100，pelB信号肽。诱导型表达III型分泌系统Ah-NS-RBD，Ah-SS-RBD，Ah-JJ-RBD，Ah-BJ-RBD质粒中，分别使用乏氧启动子NirB，III型分泌系统相关启动子SseA，SseJ，SifB，4种质粒均使用III型分泌系统相关信号肽SseJ。上述5种质粒的N端与抗原分子RBD序列借助Linker 进行偶联来实现其分泌，为方便后续检测，将RBD偶联HA标签(图2)。

NirB，sseA，sseJ与sifB启动子，sseJ，PelB信号肽，SARS-COV-2S蛋白区域中的RBD等均利用PCR方法获得。所述的SseJ信号肽的序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的防丢失质粒元件AT的序列SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述的SopE启动子的序列SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。所述的sseJ启动子的序列SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述的SifB启动子的序列SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

相关引物序列为：PNirB P1：所述的PNirB上游引物的序列SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。PNirB P2：所述的PNirB下游引物的序列SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。PsseAP1：所述的PsseA上游引物的序列SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。PsseAP2：所述的PsseA下游引物的序列SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

PsifB P1:5’-caaaatcccttataagaattctgccctaccgctaaacatc-3’；所述的PsifB上游引物的序列SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

PsifB P2：5’-tgtccaacactcaatggcatccacaagtgattatatgata-3’；所述的PsifB下游引物的序列SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。

sseJ P1:5’-tatcatataatcacttgtggatgccattgagtgttggaca-3’；所述的sseJ上游引物的序列SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

sseJ P2：5’-gccttcagtggaataatgatgagctataaaactttctaac-3’；所述的sseJ下游引物的序列SEQ ID No.13所示的核苷酸序列。

PsseJ-sseJ P1:5’-caaaatcccttataagaatttcacataaaacactagcact-3’；所述的PsseJ-sseJ上游引物的序列SEQ ID No.14所示的核苷酸序列。

PsseJ-sseJ P2：5’-GCCttcagtggaataatgatgagctataaaactttctaac-3’；所述的PsseJ-sseJ下游引物的序列SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。

以50ng沙门氏菌基因组DNA作为模板。RBD P1: 5’-agcggaggtggaggcagcccgaacatcaccaacctg-3’；所述的RBD上游引物的序列SEQ ID No.16所示的核苷酸序列。

RBD P2：5’-tctggaacatcgtatgggtacggcgcgtgcagcagttc-3’；所述的RBD下游引物的序列SEQ ID No.17所示的核苷酸序列。

以商业质粒MC_0101082作为模板；Vec P1:5’-tacccatacgatgttccagattacg-3’；所述的Vec 上游引物的序列SEQ ID No.18所示的核苷酸序列。

Vec P2:5’-gctgcctccacctccgctgc-3’；所述的Vec下游引物的序列SEQ ID No.19所示的核苷酸序列。

以本实验室带有AT元件的质粒pQE30作为模板。信号肽与目的蛋白间的Linker序列使用热退火自连法获取。通过PCR获得各个片段后，将相应片段利用同源重组法进行组装，最终获得III型分泌系统的各个蛋白表达分泌载体，包括Ah-JP-RBD，Ah-NS-RBD，Ah-SS-RBD， Ah-JJ-RBD，Ah-BJ-RBD。

实施例2

重组减毒沙门氏菌的电穿孔转化:

沙门氏菌电转感受态的制备:接种新鲜减毒沙门氏菌到200mL LB培养基中，37℃摇床培养至OD值在0.4-0.6之间,离心5000rpm，5min收集菌体,用无菌双蒸水清洗一次后，5000rpm，离心5min，并用灭菌的10％甘油洗涤菌体3-5次，离心5000rpm，5min，用500μL10％，甘油重悬，分装50μL/管，用于电转。采用电穿孔方法将重组疫苗DNA载体转化到减毒沙门氏菌内：在无菌条件下，将0.5-5μg构建好的重组载体加入在电转感受态中，混匀后，转移到2mm的电转杯中，用于电击，电转条件为1.8-2KV，25μF,400-500Ω，电转后涂卡纳平板筛选，长出的菌落即为构建的重组菌，挑选单克隆菌株进行测序验证。

实施例3

抗原性蛋白有效分泌检测

将获得的重组减毒沙门氏菌于卡那霉素抗性液体LB培养基中培养至OD₆₀₀ 0.8-1.0，收集菌体并用PBS调节OD₆₀₀值至1.0左右。放置4度备用。使用100ng/mL LPS诱导巨噬细胞系RAW264.7，以获得M1型巨噬细胞，诱导时长为24小时(下述记作RAW264.7(M1))。将获得的RAW264.7(M1)与上述获得的Ah-NS-RBD，Ah-SS-RBD，Ah-JJ-RBD，Ah-BJ-RBD 共计4种重组减毒沙门氏菌以1：10共培养90分钟，吸弃上清并用PBS清洗2-3次，于添加有100ng/mL庆大霉素的细胞培养液(10％血清，不加双抗)中培养6小时。收集细胞并通过热裂解法收集细胞总蛋白，即100μL PBS重悬细胞，加入25μL 5X LoadingBuffer后，100 度裂解10-15分钟。9,000rpm离心5分钟收集LB中4种重组菌后，使用相同方法收集菌体中的总蛋白。

对于Ah-JP-RBD重组减毒沙门氏菌，将接种的菌体扩大培养于50mL卡那霉素抗性液体LB中培养至OD₆₀₀约1.0左右。使用TCA(三氯乙酸)-丙酮沉淀法收集上清中总蛋白，简单来说，转移上清至50ml离心管中，使用超速离心机15,000g，4度，离心10min。取上清转移至新的50ml离心管中，加入10％TCA，涡旋以充分混合，冰上静置30min。再7,000 g，4度，离心20min，以300μl PBS重悬沉淀，并转至1.5ml无菌EP管中。加入1.2ml预冷的丙酮(提前放置-20)，17,000g，4度，离心20min。去上清，再次加入300μl PBS，重复上述操作。去上清，加入40μl PBS重悬，即获得菌体分泌于上清中的总蛋白。将离心收集的菌体加入Loadingbuffer后，于100度下煮沸10分钟，获得菌体总蛋白。收集到的总蛋白使用蛋白免疫印迹(WB)法检测有无目的蛋白的产生与分泌。使用兔单克隆HA标签抗体作为一抗，使用偶联HRP的山羊抗兔IgG抗体作为二抗。

检测结果表明，Ah-JP-RBD重组减毒沙门氏菌能够有效的表达并分泌产生RBD蛋白(图 3A)。而对Ah-NS-RBD，Ah-SS-RBD，Ah-JJ-RBD，Ah-BJ-RBD 4种重组减毒沙门氏菌，在菌体存在于液体LB中时，4种菌都未出现RBD蛋白的表达与分泌；而当菌体处于巨噬细胞内部时，受到细胞内环境的诱导刺激，Ah-JJ-RBD与Ah-BJ-RBD重组减毒沙门氏菌均有效表达了带有信号肽的RBD蛋白(较大条带)，并且该蛋白被有效分泌入细胞内部后，被剪切掉信号肽(较小条带)。但Ah-NS-RBD与Ah-SS-RBD两种工程菌中未能有效实现RBD蛋白的表达与分泌，故在后续的实验中舍弃这两种工程菌(图3B)。

借助免疫荧光分析细胞内Ah-JJ-RBD，Ah-BJ-RBD重组菌对抗原性蛋白的表达与分泌情况，在按以上所述的方法获得吞噬了Ah-BJ-NC，Ah-JJ-RBD或Ah-BJ-RBD重组菌的RAW264.7(M1)细胞爬片后，PBS清洗3次，使用4％多聚甲醛室温固定30分钟，并用PBS 清洗3次。借助PBS配置的0.5％TritonX-100室温打孔30分钟。PBS清洗3次，使用3％BSA 室温封闭30分钟后，PBS清洗3次，使用兔单克隆HA标签抗体作为一抗4度过夜孵育爬片。 PBST清洗3次后，使用猴抗兔荧光二抗与沙门氏菌荧光抗体室温避光孵育1小时。PBST清洗3次后，添加核染料DAPI并使用荧光显微镜观察拍摄。荧光拍摄结果表明，存在于巨噬细胞内部的Ah-JJ-RBD或Ah-BJ-RBD重组减毒沙门氏菌可有效表达并分泌RBD-HA蛋白，而携带空载质粒的重组减毒沙门氏菌未检测到HA相关荧光信号(图4)。

实施例4.免疫程序及方法

6-8周龄雌性C57BL/6小鼠按照每组4-5只进行分组,每只小鼠按照口服1×10⁹CFU细菌剂量接种空载细菌或Ah-JP-RBD，Ah-JJ-RBD与Ah-BJ-RBD3种重组减毒沙门氏菌，间隔一周一次，第三次后一周进行眼球取血，检测血清中特异性抗体浓度(图6)。空白对照组Ah-NC 重组减毒沙门氏菌组的血清中特异性抗体滴度为0.0628±0.0153；Ah-JP-RBD重组减毒沙门氏菌组的血清中特异性抗体滴度为0.2928±0.0288；Ah-JJ-RBD重组减毒沙门氏菌组的血清中特异性抗体滴度为0.4862±0.0754；Ah-BJ-RBD重组减毒沙门氏菌组的血清中特异性抗体滴度为0.8042±0.0909。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 南京吉芮康生物科技研究院有限公司，南京诺佰康生物科技有限公司

<120> 一种抗丢失时空可控表达的新型质粒及其应用

<130> 2022

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列( 扩增SseJ信号肽)

<400> 1

atgccattga gtgttggaca gggttatttc acatcatcta tcagttctga aaaatttaat 60

gcgataaaag aaagcgcacg ccttccggaa ttaagtttat gggagaaaat caaagcatat 120

ttctttacca cccaccatgc agaggcgctc gaatgtatct ttaatcttta ccaccatcag 180

gaactgaatc taacaccggt acaggttcgc ggagcctaca tcaaacttcg agccttagcg 240

tctcagggat gtaaagaaca gtttattata gaatcacagg aacacgccga taagttgatt 300

attaaagatg ataatggtga aaatattttg tctattgagg ttgaatgtca tccggaagct 360

tttggtcttg caaaagaaat caataaatca catcccaagc ccaaaaatat ttctttgggt 420

gatattacca gactggtatt ttttggcgac agcttgtctg actccttagg gcgtatgttt 480

gaaaaaacac atcatatctt accctcctat ggtcaatact ttggcggaag gtttactaat 540

ggatttacct ggactgagtt tttatcatct ccacacttct taggtaaaga gatgcttaat 600

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atagctcatc attattccac tgaa 1224

<210> 2

<211> 1997

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增防质粒丢失元件AT)

<400> 2

gcccggggga tccgatactc tctcctttca tcgaaataac cctatgaaaa atatggctgc 60

aatcatcttg aatagtagac tcacaagggc taatacaaag cgccaaaaga ccaaacaaaa 120

taccagtatt gccaaaaata ctacgaagtt taaatgcaca gctgcagcat ggcgcataag 180

tatttcgcca acaaatagga ctgacaatag aggaatgatt ttattcatat ggatctcctt 240

ctttctctta ggttatcggg tgttgcccgc ttatttcgca ccacctaagc ggcgggggcg 300

gttggagcga ttggtgcgaa ataagaacca ttcccttagt tactaggttt tttgtcctta 360

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gatatggcat tcgtttacgg tcaagttcag gatccataag cgactaatgc caattgcaat 480

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aagcagtagc ttattcaaat ttccgccaaa atttacgtag ttatatgaaa caagttaatg 840

aggatgctga aacacttatt gtaacaagta aagatgtaga agatacagtt gttgtattat 900

caaaaagaga ttatgattct atgcaagaaa cgttgagaac actttctaat aattacgtca 960

tggaaaaaat tcgtcgagga gatgaacaat tctccaaagg tgcatttaaa acacatgact 1020

taatcgaggt tgaatctgat gattaaggct tggtctgatg atgcttggga tgattatctt 1080

tattggcatg agcaaggaaa caaaagcaat ataaaaaaga ttaacaagtt aataaaagat 1140

atcgatcgtt ccccctttgc tggattagga aaacctgagc cattaaagca tgatttatct 1200

ggaaaatggt ccagaagaat tacagatgaa catagactga tatatagagt tgaaaatgaa 1260

acgatattta tttattctgc aaaagatcac tattaaccaa tcggaagtaa ggaaagggtc 1320

agaaacttaa aagtttttga tccttatttt atttacccta gtcatttaaa aagctaatat 1380

agcttagtgt tgattgttat taatgaatgt gtttgttacg cgtattacgg atataaggtt 1440

agtaaaatca tttctaaagt tgaggaaaag taaatataaa tggcttaaat ttcaacaatt 1500

tgaagttgaa tagatatgtt ataatactat tgtagtgtgg gatgttagtt actaaaggat 1560

gacgcttata tatatgactg aatagaataa gcaataggtt taataatcta ttttaaattt 1620

tttgtactag ttttagtcaa ttagcaaaaa caacaaaaat aaacttctca tagaatttag 1680

ctaaaaatta atgatttatt tacatattaa atttggatac agttaagtaa tttttatata 1740

ttggaggaga agtaatggaa tataaattta acttgaattt gaaagaagta tcgagctcgg 1800

aagcttggca gcggccgctg gcgggtgtgt cgagtggatg gtaggatcga caaagatctg 1860

gctacactcg atcagcagtt agataataaa atcgctatcc atcgaagatg gatgtgtgtt 1920

ggttttttgt gtgtgtaacg caacgattga tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg 1980

tcttgagggg ttttttg 1997

<210> 3

<211> 766

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增SopE 启动子)

<400> 3

tccagatcga ttagaaatgc gttgaaattt gcatcctttc tgacgcgctc gaaaaagtgg 60

ttaagcataa gctgtaattc catttgttaa cctattgtaa gttataatgt tatatgttgt 120

gttagagtat tgttgcttaa aagcagccat acagatatgt tacctaaaag caataataat 180

cacctggtat catatagttt acgttatgat tggaatagtg ttgcaattgt tactgattat 240

ttctcgtagc gcgttttttt gaccactaat agatgcgtca atccatttca tttgtagttt 300

ttctgaacgt catgaaaagt cataatatat aaaaatcagt taattaattg atgtttagat 360

aaggattaca gtgacggaga ggtttggcgt ggcgacttta taggttttga aaaagcggct 420

aactcgctgg caggataatt ggtagccagc ctgcgaatgg gggcaaaatc gtaacaacat 480

cagcataaat aataatattc atgaatgttt tatgtgacgc agtagttgaa ttgaagtgat 540

gttttacctg ttcaggattg tcccgataaa aatgttcctc gataaaagtc gatcaccttg 600

cgccgaaaaa aaacaggcta agtgacagaa gaacaaaatc catcaggaaa ataaaattta 660

taaatatcaa tgagtaaaaa tggttgtgga gaaggtggct attttttgaa agcaagaaat 720

ataaacaaag tgtagctatg catagttatc taaaaggaga actacc 766

<210> 4

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列( 扩增SseJ启动子)

<400> 4

tcacataaaa cactagcact ttagcaataa tagtcggatg ataagtttgt ctgtttttcc 60

tgagtatcaa gccagctcat actcacgcca gcacactaaa atcaggagtg gcttcttttt 120

tagatctttg ccttagccag gcgcacactc aataatgata gcagtcagat aatatgtacc 180

aggcattaac ctcacgttgt tgatgatata tttacttcgt tgaaaaacaa taaacattgt 240

atgtatttta ttggcgacga aaaactgtta aagaagcgta attccatata caccatttac 300

ctgattactt ttcttgctaa tatttgctaa ttaattattt gctaaagcgt gtttaataaa 360

gtaaggagga cact 374

<210> 5

<211> 388

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增SifB启动子)

<400> 5

ctgccctacc gctaaacatc tcattgttgt tagcctaata atacttttag tttaacttct 60

tataagacaa tttctacacg gttgagcaac tatttacttt ctctaaaaat aatatagtgc 120

gtaattaatc attactcata gtacatgatg atgtgagaat taagaaaacc gttttacttt 180

cattcgtttt atctgacata tttcatggcc aggaggcgtg ggcatgacta aagctacggg 240

tcgatttgaa caattgaaca ataatgttga cggttcagga caaagcaaaa atcaggtgtt 300

tcaccgatag gcaaaccgat gggcaacatg ggataatatt tcgaatacca cctattccag 360

taatgaagta tcatataatc acttgtgg 388

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PNirB上游引物)

<400> 6

gcaaaatccc ttataagaat tgagggttac cggcccgatc 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PNirB下游引物)

<400> 7

cctctttctc tagtatctag accgcctacc ttaacgattc 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PSseA上游引物)

<400> 8

caaaatccct tataagaatt agaagagaac aacggcaagt 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PSseA下游序列)

<400> 9

tgtccaacac tcaatggcat acgatagata attaacgtgc 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PsifB 上游序列)

<400> 10

caaaatccct tataagaatt ctgccctacc gctaaacatc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PsifB 下游序列)

<400> 11

tgtccaacac tcaatggcat ccacaagtga ttatatgata 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(sseJ 上游序列)

<400> 12

tatcatataa tcacttgtgg atgccattga gtgttggaca 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(sseJ 下游序列)

<400> 13

gccttcagtg gaataatgat gagctataaa actttctaac 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PsseJ-sseJ 上游序列)

<400> 14

caaaatccct tataagaatt tcacataaaa cactagcact 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(PsseJ-sseJ 下游序列)

<400> 15

gccttcagtg gaataatgat gagctataaa actttctaac 40

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(RBD 上游序列)

<400> 16

agcggaggtg gaggcagccc gaacatcacc aacctg 36

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(RBD 下游序列)

<400> 17

tctggaacat cgtatgggta cggcgcgtgc agcagttc 38

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Vec 上游序列)

<400> 18

tacccatacg atgttccaga ttacg 25

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Vec 下游序列)

<400> 19

gctgcctcca cctccgctgc 20

Claims

1.一种抗丢失时空可控表达的新型质粒，其特征在于：所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒包括细菌分泌信号及SseJ信号肽序列、SopE启动子、以及防丢失质粒元件AT；细菌分泌信号为革兰氏阴性菌III型分泌信号，所述的革兰氏阴性菌III型分泌信号为沙门氏菌毒力岛2SPI-2效应蛋白SseJ信号肽，所述的SseJ信号肽的序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的防丢失质粒元件AT的序列SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述的SopE启动子的序列SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒，其特征在于：利用革兰氏阴性菌III型分泌表达系统在减毒菌株中实现表达蛋白的分泌，所述的减毒菌株为减毒沙门氏菌VNP20009或htrA基因缺陷型减毒沙门氏菌VNP20009(Ah-1)或其他类型减毒沙门氏菌；革兰氏阴性菌III型分泌表达系统包括III型分泌信号肽序列及其启动子；使用sseJ启动子和sifB启动子调控III型分泌信号的表达，所述的sseJ启动子的序列SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述的SifB启动子的序列SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒，其特征在于：所述的减毒菌株为减毒沙门氏菌VNP20009或htrA基因缺陷型减毒沙门氏菌VNP20009(Ah-1)或其他类型减毒沙门氏菌，包括但不限于前述已经申请发明专利的各菌株(ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，202010182038.0；ActaPharmaceutica Sinica B 2021,11(10):3165-3177；phoP/phoQ，等)。

4.权利要求1所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒在制备减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤：利用胞内诱导型启动子调控细菌分泌信号分泌表达；

采用一步法同源重组克隆技术，将启动子元件及防丢失元件重组至质粒；在分析巨噬细胞等抗原递呈细胞的胞内微环境的基础上，利用生物信息的方法与分子克隆技术筛选并克隆细菌启动子和分泌信号；利用胞内诱导型启动子调控细菌分泌信号分泌表达的抗原，添加质粒防丢失元件提高菌内质粒稳定性，制得高效稳定的胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈系统。

5.根据权利要求4所述的口服抗原递呈系统的制备方法，其特征在于：基于权利要求1所述的一种抗丢失时空可控表达的新型质粒，构建高效、稳定的胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈质粒，所述的胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达是抗原递呈细胞的胞内环境诱导的沙门氏菌III型分泌抗原表达系统，包括III型分泌系统启动子及信号肽序列。

6.根据权利要求4所述的口服抗原递呈系统的制备方法，其特征在于：利用革兰氏阴性菌III型分泌系统分泌新型冠状病毒抗原分子，将III型分泌信号与抗原分子融合来实现对新型冠状病毒抗原的分泌。所述的III型分泌信号为沙门氏菌毒力岛2(SPI-2)效应蛋白SseJ，并使用sseJ启动子和sifB启动子对其表达进行调控。

7.含有权利要求1所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒的新型冠状病毒口服疫苗，其特征在于：筛选能诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合，所述的抗原分子为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)RBD结构域全部氨基酸序列。

8.权利要求1至7任一项所述的抗丢失时空可控表达的新型质粒在制备新型冠状病毒口服疫苗中的应用。