KR101966346B1

KR101966346B1 - 시가 독소 Stx2e를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 부종병을 예방하기 위한 백신 조성물

Info

Publication number: KR101966346B1
Application number: KR1020170006280A
Authority: KR
Inventors: 김원일; 허진; 박정희; 서병주; 김소영
Original assignee: 전북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2019-04-05
Also published as: KR20180083687A

Abstract

일 양상에 따른 Stx2e A 및 B 서브유닛의 단백질 복합체를 제조하는 방법에 의하면 우수한 시가 독소 산생 미생물, 예를 들면 E.coli 150229 균주를 이용하여 높은 효율로 부종병 면역을 유도할 수 있는 단백질 복합체를 제조할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 단백질 복합체는 효율적으로 돼지의 부종병 면역을 유도할 수 있는 백신 조성물에 이용될 수 있다.

Description

시가 독소 Stx2e를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 부종병을 예방하기 위한 백신 조성물{Method for preparing shiga toxin Stx2e and vaccine composition for preventing porcrine edema disease comprising thereof}

시가 독소 Stx2e의 서브유닛 A 및 서브유닛 B의 복합체 및 이를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

돼지 부종병（Porcine edema disease)은 시가독소 산생형 대장균（shiga toxin-producing Eschcrichia (E.) coil: STEC)에 의해 발생되는 질병으로 주로 4-8주령 이유자돈에 많이 발생한다. 주요 증상으로 대장균이 분비하는 시가 독소에 의한 부종과 출혈성 병변이 관찰된다. 부종병의 감염에 의한 치사율은 5O-9O％로 매우 높고，재발이나 발육 불량 등의 생산성 저하를 초래하기 때문에 한번 발병하면 양돈농가의 경제적 손실이 매우 클 수밖에 없다．또한, 부종병은 돼지뿐만 아니라 다양한 동물에서 나타나며, 사람에게는 용혈성 요독증과 출혈성 대장염을 유발하기도 한다．돼지의 이유 후 설사병 및 부종병은 계속 증가하고 있고, 이를 예방하기 위한 백신 개발이 활발하지만 아직 상용화되어 판매되고 있는 제품은 극히 드물다．또한, 항생제의 사용은 항생제 내성균이 출현할 수 있어 부종병의 완전한 해법이 될 수 없다.

이유 후 자돈에서의 부종병은 Fl8ab+ 및 Stx2e+E. coli 에 의해 주로 발병되는 것으로 보고되고 있다．현재 상업적으로 이용되는 돼지 부종병 예방 백신은 부종병 유발 균주를 포르말린 등으로 불활화하거나, 독소의 일종인 Stx2e가 함유된 것이 대다수이다. 그러나，백신 생산을 위한 독소의 대량 생산을 위한 발현 시스템이 확립되어 있지 않아, Stx2e 항원만 포함되어 있는 백신 생산에 어려움이 있다.

일 양상은 Stx2e A 및 B 서브유닛의 복합체 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 양상은 Stx2e A 및 B 서브유닛의 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

일 양상은 시가독소 단백질 Stx2e의 A 및 B 서브유닛의 복합체 또는 이를 포함하는 부종병을 예방하기 위한 백신 조성물을 제공한다.

상기 Stx2e A 및 B 서브유닛은 서로 같은 균주로부터 유래하거나, 또는 서로 다른 균주로부터 유래한 서브유닛의 복합체일 수 있다. 상기 균주는 부종병을 유발하는 시가 독소 산생 대장균(shiga toxin-producing Escherichia coli: STEC), 또는 시가 독소 유전자를 발현하도록 유전자 조작된 미생물 균주를 포함한다.

용어 "유래"는 특정 펩티드가 그 균주로부터 분리 정제된 것뿐만 아니라, 그 균주의 유전자를 이용하여 생산한 재조합 단백질 등을 포함하는 넓은 의미로 이용된다.

용어 "시가 독소 산생 대장균(shiga toxin-producing Escherichia coli: STEC)"은 베로 세포 독성 생산 대장균(verocytotoxinproducing E. coli)으로도 불리며, 부종병을 일으키는 주요 병원성 대장균을 의미한다. 이들 대장균은 크게 Stx1 및 Stx2로 구분되는 항원형(serotype)의 시가 독소를 생산할 수 있으며, 그 중 Stx2는 a-g의 7개 아형이 존재한다.

상기 시가 독소 단백질은 일반적으로 1개의 A 서브유닛 및 5개의 B 서브유닛이 결합한 형태를 가진다. A 서브유닛은 세포 안으로 들어가 리보좀을 공격하여 단백질 합성을 저해하며, B 서브유닛은 세포 수용체인 글로보테트라오실세라마이드(globotetraosylceramide)와의 결합 및 세포독성의 특이성, 세포 외 정착성 및 항체형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 시가 독소 단백질, 그의 서브유닛은 전장 펩티드뿐만 아니라 그의 활성 단편이 대안적으로 이용될 수 있다. 또한 상기 시가 독소 단백질, 그의 서브유닛 또는 그의 활성 단편은 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 즉, 상기 시가 독소 단백질, 그의 서브유닛 또는 그의 활성 단편은 전달 시스템에 탑재되어 있는 것일 수 잇으며, 예를 들면, 시가 독소 단백질, 그의 서브유닛 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포 중 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 전달 시스템의 예로는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀을 포함할 수 있다. 상기 활성 단편은 그 전장 펩티드의 다른 단백질과의 결합 부위 또는 항원 결정부위를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "유전자 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전자 재조합 (genetic recombination)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 균주는 시가 독소 Stx, Stx1, Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, 또는 Stx2g 또는 그의 서브 유닛, 또는 그들의 활성 단편 등 부종병을 유발하는 단백질의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것, 예를 들면 외인성 시가 독소 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 외인성 유전자는, 상기 균주에서 그 모세포에 비하여 언급된 단백질의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자가 도입되는 세포는 대장균, 효모, 또는 동물 세포 등의 이종 세포를 포함하며, 상업적으로 구매 가능한 것일 수 있다.

상기 시가 독소 단백질 또는 그 유전자는 STEC 세포로부터 유래하거나, 당업계의 통상적인 방법에 따라 합성된 것일 수 있다. 일반적인 합성 방법은 "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Peptide Synthesis(Peptide Gosei)", Maruzen, 1975; "Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis(Peptide Gosei no Kiso to Jikken)", Maruzen, 1985; 및 "The sequel of Development of Pharmaceuticals(Zoku Iyakuhin no Kaihatsu)", Vol. 14, Peptide Synthesis(Peptide Gosei), Hirokawa Shoten, 1991과 같은 문헌, 및 국제공개 번호 WO 99/67288와 같은 국제공개특허에 기재되어 있다. 또한 단백질 또는 펩티드는 알려진 유전 공학 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 시가 독소 단백질 또는 그의 단편을 암호화하고 있는 DNA가 삽입된 벡터는 형질전환된 세포(transformed cells)를 생산하기 위해 적합한 숙주 세포에 도입(introduced into)하고, 이렇게 형질전환된 세포들에서 생산되는 펩타이드들을 수집함으로써 얻어질 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드는 처음에 펩타이드를 얻기 위해 그 다음에 적절한 프로테아제(protease)를 이용해 잘리는 융합 단백질(fusion protein)로서 만들어질 수 있다. 이들 융합 단백질은 이후 이들의 발현을 확인하거나, 분리 정제가 용이하도록 추가적인 아미노산 서열들이 더 포함된 것일 수 있다. 또한 이들은 그 자체로서 약학적 조성물 또는 백신 조성물에 사용될 수도 있다.

융합 단백질을 제조하기 위한 방법에서, 시가 독소 단백질 또는 그의 활성 단편을 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드는 다른 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 프레임(frame)에 연결(ligate)될 수 있으며, 이것은 숙주(host)에서의 발현(expression)을 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 기술들은 이런 목적을 위해 이용될 수 있다. 시가 독소 단백질과 융합된 펩타이드들의 확인 및 분리 정제를 위해, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개 내지 10개의 히스티딘(His)으로 이루어진 His 잔기들, 인플루엔자 혈구응집소(influenza hemagglutinin: HA), 인간 c-myc 단편, VSV-GP 단편, p18HIV 단편, T7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태크, 알파-튜블린(alpha-tubulin) 단편, B-태그, 및 Protein C 단편과 같이 알려진 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 융합 단백질을 만들기 위해 시가 독소 단백질 또는 그의 활성 단편을 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST), influenza hemagglutinin(HA), immunoglobulin constant regions, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 또는 말토즈-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP) 등을 연결하는 것이 가능하다.

따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 시가 독소 단백질, 그의 서브유닛 또는 그의 활성 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공될 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coliJM109, E. coliBL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 복합체는 개체의 STEC에 대한 면역 반응을 유도하고, 부종병 예방을 위한 백신 조성물로 이용될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 백신 조성물은 피하 주사, 복강 주사, 근육 주사, 비강내 투여, 흡입투여, 또는 경구 투여용일 수 있으며, 이러한 투여방법에 따른 제형에 따라 폐렴 예방용 백신 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 상기 담체는 희석제, 완충제, 보존제 등을 포함하는 의미로서 사용된다. 상기 담체에는 당업계에 알려진 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분이 포함될 수 있다. 상기 개체는 인간, 소, 돼지, 염소 및 양을 포함하는 포유동물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

다른 양상은 제1 균주로부터 유래한 Stx2e A 서브유닛을 발현시키는 단계; 상기 Stx2e A 서브유닛을 추출하는 단계; 상기 추출된 Stx2e A 서브유닛을 Stx2e B 서브유닛을 발현하는 제2 균주와 함께 배양하는 단계; 및 상기 배양으로부터 형성된 상기 Stx2e A 서브유닛과 상기 Stx2e B 서브유닛의 복합체를 추출하는 단계를 포함하는 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 제1 균주는 STEC로부터 유래한 Stx2e A 서브유닛을 포함하도록 유전자 재조합된 미생물을 포함한다. 상기 Stx2e A 서브유닛은 전술한 바와 같은 융합 단백질일 수 있다.

상기 제2 균주는 E.coli 150229 균주 또는 그의 Stx2e B 서브유닛 유전자를 발현하는 미생물을 포함한다.

상기 E.coli 150229 균주는 수탁번호 KCTC 13178BP의 미생물 및 이와 동일하거나, 이로부터 유래한 균주(strain)로 분리되는 미생물을 포함한다. 여기서 "유래한 균주"는 특정 균주가 150229 균주의 생식으로 발생하였거나, 또는 150229 균주의 유전자 정보를 이용하여 당업계에서 통상적인 기술을 사용하여 유전공학적으로 발생시킨 균주로서, 150229와 동일 또는 유사한 미생물학적 특성을 갖는 균주를 포함하는 의미로 사용된다.

상기 복합체를 추출하는 단계는 9-11 mM Tris, pH 6.5-7.5 조건에서 추출하는 것일 수 있다. 또한 상기 복합체를 추출하는 단계는 200-600 mM, 또는 450-550 mM 이미다졸로 추출하는 단계일 수 있다.

본 발명자들은 국내 야외 분리 부종병 유발 대장균 중 시가독소 산생이 매우 우수한 대장균을 확보하였으며，유전자 재조합을 이용하여 시가독소 산생을 더욱 증가시킬 수 있음을 증명하였다．따라서，본 발명의 일 양상에 따른 재조합 부종병 대장균을 이용하여 생산한 Stx2e A 서브유닛과 시가독소 산생이 매우 우수한 대장균을 함께 배양하여 생산한 Stx2e의 서브유닛간의 이종 조립체(heterogous assembly)는 돼지의 부종병 예방을 위한 백신 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 설명에서 이미 언급된 용어 또는 요소에 대해서는 따로 언급하는 것이 없는한 이미 상술한 바와 같다.

일 양상에 따른 Stx2e A 및 B 서브유닛의 단백질 복합체를 제조하는 방법에 의하면 우수한 시가 독소 산생 미생물을 이용하여 높은 효율로 부종병 면역을 유도할 수 있는 단백질 복합체를 제조할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 단백질 복합체는 효율적으로 돼지의 부종병 면역을 유도할 수 있는 백신 조성물에 이용될 수 있다.

도 1은 시가 독소에 의한 베로 세포의 세포 독성을 확인하기 위해 시간에 따라 세포 변성 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 재조합 Stx2e A 서브유닛을 발현하는 발현 벡터의 유전자 구조를 나타낸다.
도 3은 이미다졸을 이용하여 재조합 Stx2e A-6-His/B를 분리 정제하는 방법을 나타내는 개요도이다.
도 4는 과발현된 Stx2e A 단백질을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. E. coli 150229의 선별

1. 재료 및 방법

2014년부터 2015년 12월까지 전북대학교 동물질병 진단센터로부터 돼지 부종병으로 진단된 시료를 확보하였다. 구체적으로, 돼지 분변 및 장기(폐, 비장 및 장) 1 g을 포스페이트 버퍼 살린(phosphate buffer saline: PBS) 9 mL에 희석하여 MacConkey 배지(MBcell, Seoul, Korea)에 37℃ 조건으로 24시간 배양하였다. MacConkey 배지에서 핑크색을 나타내는 세균 집락(colony)을 혈액 배지(MBcell, Seoul, Korea)에 37℃ 조건으로 24시간 배양하여 베타 용혈(β-hemolysis)을 나타내는 단일 세균 집락을 확보하였으며, 증균 배양 및 시가 독소 생성을 확인하게 위해 LB (Affymetrix USB, CA, USA) 액체 배지에서 37℃ 조건으로 48시간 배양하여 본 연구에 사용하였다. 아래 표 1과 같이 돼지 부종병 43사례로부터 베타 용혈을 나타내는 대장균주들을 분리하였다.

<표 1> 돼지 부종병 43 사례

2. 부종병 유발 대장균 검출을 위한 PCR

상기 야외 분리 대장균에 대한 병원성 및 독소 유전자를 검증 확인하였다. 문헌 등(Zhang W, Zhao M, Ruescg L, Omot A, Francis D. 2007. Prevalence of virulence factors of Escherichia coli strains isolated from pigs with post-weaning diarrhea. Vet Microbiol 123: 145-152.)에 기재된 방법에 따라, 병원성 및 독소 유전자를 검출하기 위해 아래 표 2와 같은 프라이머들을 사용하였다.

<표 2> 프라이머 서열

야외 분리 대장균 배양액을 100℃에서 10분간 반응(boiling methods)시키고, 10,000 g로 5분간 원심분리하여 상층액을 사용하였다. PCR 혼합물의 조건은 3 μL 주형(template) DNA와 1 μL의 각 프라이머(10 pM), 17 μL DW를 PCR premixture (AccuPowerⓡ Multiplex PCR PreMix, Bionneer, Daejeon, Korea)에 첨가하여 최종 부피가 20 μL가 되도록 하여 사용하였다. PCR 수행은 SimpliAmp Thermal Cycler (Life technologies, Carlsbad, California, USA)를 사용하였으며, 반응 조건은 전-인큐배이션(pre-incubation)을 95℃에서 15분간 진행한 후 변성(denaturation)은 95oC에서 30초, 어닐링(annealing)은 63℃에서 90초, 연장(extension)은 72℃에서 90초로 25회 반복하고, 72℃에서 10분간 반응하였다. PCR 수행 후 PCR 산물 10 μL를 3% 아가로스 겔에 Red Safe^TM (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 첨가하여 전기영동을 실시하였다. Zhang 등(2007)의 방법에 따라, DNA 밴드 사이즈를 확인하여 병원성 및 독소 유전자를 확인하였다.

그 결과 아래 표 3과 같이, 대장균 43주 중 42주에서 부종병 관련 유전자인 Stx2e 또는 F18 유전자 중 하나를 가지고 있음이 확인되었으며, 그 중 14주는 Stx2e와 F18 두 유전자 모두를 가지고 있었고, 시가 독소 생성과 관련된 Stx2e 유전자를 갖는 30주도 확인하였다. 그 외 다양한 병원성 유전자도 함께 확인되었다.

<표 3> 대장균으로부터 확인된 병원성 유전자

3. 세포 변성 효과 검증

야외 분리 대장균의 시가 독소 생성을 검증하기 위해 문헌(Schmitt CK, McKee ML, O'Brien AD. 1991. Two copies of Shiga-like toxin II-related genes common in enterohemorrhagic Escherichia coli strains are responsible for the antigenic heterogeneity of the O157:H- strain E32511. Infect Immun 59: 1065-1073.) 등에 기재된 방법에 따라 베로 세포(vero cell, ATCC CRL-1587)를 이용하여 세포 변성 효과를 검증하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. 야외 분리 대장균을 LB 액체 배지로 37℃ 조건으로 48시간 배양하였으며, 배양된 대장균은 4,500 g로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 0.22 mm 여과 필터(500 mL Corning Filter System, NY, USA)로 여과하여 상층액에 남아 있을 세균은 모두 제거하였다. 베로 세포는 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Welgene, Korea)에 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, Gibco, NY, USA), 1% L-glutamine 200 mM(100X) (Gibco, NY, USA) 및 1% Antibiotic-Antimycotic (100X) (Gibco, NY, USA)를 사용하여 5% CO₂ 조건으로 37℃에서 배양하였다. 야외 분리 대장균 중 부종병 유발 대장균에서 생성되는 시가 독소에 대한 세포 독성 평가는 96 웰 조직 배양 플레이트(Falcon, USA)에 부종병 유발 대장균 배양 상층액을 세포배양 배지로 십진 희석으로 10^6까지 희석하고, 베로 세포가 배양된 96 웰 조직 배양 플레이트에 분주하여 72시간 동안 세포변성효과를 확인하였다.

그 결과, 아래 표 4와 같이 야외 분리 대장균 중 Stx2e 유전자를 포함하는 29주에서 세포 변성 효과를 확인할 수 있었으며, 대부분의 야외 분리 대장균에서 생성되는 시가 독소는 희석배수 10¹에서 10³까지 세포변성효과를 나타내었다. 야외 분리 대장균 중 150229주는 희석배수 10⁴까지 세포변성효과가 나타나 가장 높은 시가 독소 생성을 확인하였다.

<표 4> 희석 농도에 따른 각 균주의 세포 독성 확인

^a) 세포 변성 효과

^b) 세포 변성 효과 없음

4. 야외 분리 대장균 150229주의 특성 확인

(1) 배양 시간에 따른 세포 독성 확인

세포변성효과가 매우 우수하였던 야외 분리 대장균 150229에 대한 특성 조사를 실시하였다. 먼저 배양 시간에 따른 세균수 및 세포독성 검증을 상기 실시예에서와 동일한 방법으로 실시하였다. 도 1과 같이 배양 후 24시간부터 최대 세균수를 확인하였으며, 시가 독소에 의한 베로 세포의 세포 독성은 배양 후 48시간부터 10⁴까지 나타남을 확인하였다.

(2) 항생제 내성 검사

아목시실린(amoxicillin)/클라불란산(clavulanic acid)(2/1-64/32 μg/ml), 세파로신(cephalothin)(2-64 μg/ml), 세폭시틴(cefoxitin)(1-32 μg/ml), 트리메토프림(trimethoprim)/설파메톡사졸(sulfamethoxazole)(0.12/2.38-4/76 μg/ml), 클로람페니콜(chloramphenicol)(2-64 μg/ml), 플로르페니콜(florfenicol)(2-64 μg/ml), 스트렙토마이신(streptomycin)(2-128 μg/ml), 세프티오퍼(ceftiofur)(0.5-8 μg/ml), 겐타마이신(gentamicin)(1-64 μg/ml), 네오마이신(neomycin)(2-32 μg/ml), 테트라사이클린(tetracycline)(2-128 μg/ml), 콜리스틴(colistin)(2-32 μg/ml), 날리딕스산(nalidixic acid)(2-128 μg/ml), 암피실린(ampicillin)(2-64 μg/ml), 및 시프로플록사신(ciprofloxacin)(0.12-16 μg/ml) 14종 항생제에 대한 내성 검사를 실시하였다.

대장균 150229를 LB 액체배지에서 48시간 배양한 후, Sensititre® V3011 Nephelometer (TREK Diagnostic Systems, OH, USA)를 사용하여 대장균 150229를 약 1x10⁸ CFU/ml (0.5 McFarland 탁도 표준)로 희석하였다. 희석한 대장균 150229 용액 10ul를 11ml의 cation-adjusted Mueller-Hinton broth (TREK Diagnostic Systems)에 넣어 부유시킨 후 50 ul씩 microdilution plate (TREK Diagnostic Systems)의 웰에 분주하고 37℃에서 18시간 배양하였다.

MIC 결과는 CLSI M100-S24의 기준에 따라 표기하였고, 그 결과는 아래 표 5와 같다. 150229 균주는 클로람페니콜, 플로르페니콜, 테트라사이이클린, 날리딕스산, 암피실린 및 시프로플록사신에 대해서는 저항성을 나타낸 반면, 아목실린/클라불란산(2:1), 세파로신, 세폭시틴, 트리페토프림/설파메톡사졸, 세프티오퍼, 겐타마이신, 네오마이신 및 콜리스틴에 대해서는 민감성을 나타냈다.

< 표 5> 항생제 내성 검사 결과

실시예 2. Stx2e A-6- His /B의 제조 및 세포 독성 확인

1. Stx2e A-6- His 재조합 단백질 발현 및 정제

유전자 재조합 단백질의 발현을 위해서 pET30a 단백질 발현 벡터를 사용하였다. 이 벡터는 발현하고자 하는 단백질의 N-말단에 pelB 신호 서열과 6개의 히스티딘 잔기를 발현하도록 제작하였으며, Stx2e A 서브유닛 유전자를 각각의 제한 효소로 절단한 후, 동일한 제한효소로 자른 pET30a 단백질 발현 벡터에 결찰(ligation)하였다. 도 2는 상기 발현 벡터의 유전자 구조를 나타낸다. 형질전환이 완료된 E. coli BL21을 카나마이신 25 ㎍/㎖를 포함하고 있는 LB 고체 선택배지에 도말하여 선별하였다. 선별된 세포를 LB (+kan) 브로스에 접종하여 37℃에서 배양하였다. OD600 0.3~0.8이 되었을 때, 100 mM IPTG(Isopropyl-β-D- Thiogalactoside, Duchefa, Netherlands)를 최종농도 0.1 mM ~ 1 mM 이 되도록 첨가한 후, 다시 3시간 이상 배양을 진행하였다. 배양이 완료된 세포는 수확 과정을 거친 후(10,000 rpm, 4 ℃, 5min, centrifugation), HisTrap FF 칼럼(GE Healthcare, PA, USA)으로 정제하였다. 10~500 mM 농도의 이미다졸을 이용하여 추출하였으며, SDS-PAGE를 통해 단백질 발현을 검증하였다.

2. 재조합 Stx2e A-6- His 및 150229 균주의 Stx2e B 서브유닛의 복합체 형성 및 이의 세포 독성 확인

상기 실시예 2.1의 재조합 발현벡터를 야외 분리 150229에 도입하여 카나마이신 25 ㎍/㎖를 포함하고 있는 LB 브로스에서 배양하였다. 재조합 단백질은 100 mM IPTG(Isopropyl-β-D- Thiogalactoside, Duchefa, Netherlands)를 최종농도 0.1 mM ~ 1 mM 이 되도록 첨가하여 발현을 유도하였고, 72시간 배양하였다. 배양 후 야외 분리 150229에서 발현된 재조합 Stx2e A-6-His 단백질과 야생형 Stx2e B 서브유닛과 복합체를 형성을 조사하였다. 재조합 Stx2e A-6-His/B 복합체는 HisTrap FF 칼럼(GE Healthcare, PA, USA)에 흡착시킨 후 이미다졸의 농도에 따라서 야외 분리 150229에서 발현된 야생형 시가 독소 단백질 복합체를 제거하였으며, 10 mM Tris, pH 7 조건 및 250~500 mM 이미다졸에서 재조합 Stx2e A-6-His/B를 확보하였다. 도 3은 전술한 바와 같이 이미다졸을 이용하여 재조합 Stx2e A-6-His/B를 분리 정제하는 방식을 나타낸다. 아래 표 6과 같이, 500 mM 이미다졸로 추출한 재조합 Stx2e A-6-His/B는 10⁵로 희석한 때에도 세포독성이 나타났다.

<표 6> 재조합 Stx2e A-6-His/B 복합체의 10배 희석 농도에 따른 세포 변성 효과

또한, 아래 표 7과 같이 2배수 희석시에는 150229는 2¹⁴의 세포 독성이 확인되었고, 500 mM 이미다졸로 추출한 재조합 Stx2e A-6-His/B는 2¹⁸으로 세포독성이 확인되어, 야생형 단백질보다 더 높은 세포 독성을 확인하였다.

<표 7> 재조합 Stx2e A-6-His/B 복합체의 2배 희석 농도에 따른 세포 변성 효과

실시예 3. 재조합 Stx2e A-6- His /B 단백질을 이용한 단일 혹은 다가 항체 생산

상기 실시예 2에서 500 mM 이미다졸로 추출한 재조합 Stx2e A-6-His/B를 PBS와 혼합하여 10주령 암컷 BALB/c 마우스 꼬리 정맥 (미정맥, intravenous injection, iv) 마리당 10~100 μL를 총 4마리에 주입하였다. 두 번째 면역화를 위한 상기 항원은 10일 후에 주입하였으며, 첫 번째와 동일한 방법으로 실시하였다. 최종 면역화 후 25일째 전혈을 실시하였으며, 혈청을 이용하여 항체 생산을 검증하였다. 정제된 재조합 Stx2e A-6-His/B를 SDS-PAGE상에서 전기영동 하였으며, 마우스에서 확보된 항체와 함께 웨스턴 블롯으로 특이성 검사를 실시하였다.

도 4a, 4b 및 4c의 각 레인은 각각 E. coli BL21 (1), 재조합 Stx2e A 단백질이 발현된 E. coli BL21 (2), 야외 분리 150229 균주 (3), 재조합 Stx2e A 단백질이 발현된 야외 분리 150229 균주를 나타낸다. 도 4a는 각 균주를 SDS-PAGE로 분리한 것을 나타내고, 도 4b 및 4c는 각 균주를 히스티딘 결합 항체와 상기의 마우스에서 확보한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 기법으로 확인한 것을 나타낸다. 레인 1을 제외하고, 모든 균주에서 Stx2e A 단백질을 확인하였다.

[수탁 정보]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13178BP

수탁일자 : 20161228

Claims

제1 균주로부터 유래한 Stx2e A 서브유닛 또는 및 제2 균주로부터 유래한 Stx2e B 서브유닛이 결합한 단백질 복합체로서, 상기 제2 균주는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli: E coli) 150229 KCTC13178BP 균주인 단백질 복합체.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 Stx2e A 서브유닛은 분리 정제를 위한 아미노산 서열과의 융합 단백질인 단백질 복합체.
청구항 3에 있어서, 상기 분리 정제를 위한 펩티드 서열은 FLAG, 6개 내지 10개의 히스티딘(His) 잔기, 인플루엔자 혈구응집소(influenza hemagglutinin: HA), 인간 c-myc 단편, VSV-GP 단편, p18HIV 단편, T7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태크, 알파-튜블린(alpha-tubulin) 단편, B-태그, 또는 Protein C 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 복합체.
삭제
삭제
청구항 1의 단백질 복합체를 포함하는 부종병 예방을 위한 백신 조성물.
제1 균주로부터 유래한 Stx2e A 서브유닛을 발현시키는 단계;
상기 Stx2e A 서브유닛을 추출하는 단계;
상기 추출된 Stx2e A 서브유닛을 Stx2e B 서브유닛을 발현하는 제2 균주와 함께 배양하는 단계로서, 상기 제2 균주는 E.coli 150229 KCTC13178BP 균주 또는 그의 Stx2e B 서브유닛 유전자를 발현하는 미생물인 단계; 및
상기 배양으로부터 형성된 상기 Stx2e A 서브유닛과 상기 Stx2e B 서브유닛의 복합체를 추출하는 단계를 포함하는 단백질 복합체를 제조하는 방법.
삭제
청구항 8에 있어서, 상기 Stx2e A 서브유닛은 6-His 아미노산 서열이 연결된 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 복합체를 추출하는 단계는 9-11 mM Tris, pH 6.5-7.5 조건에서 400-600 mM 이미다졸로 추출하는 단계인 방법.
시가 독소 Stx2e의 발현량이 증가된 E.coli 150229 KCTC13178BP 균주.
삭제