CN114058634A

CN114058634A - 一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗

Info

Publication number: CN114058634A
Application number: CN202111057107.6A
Authority: CN
Inventors: 金梅林; 邓明勇; 康超; 黄运福; 姚蓉; 徐巧霞; 孙小美; 高浩天
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-09-09
Also published as: CN114058634B

Abstract

本发明的鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗包括有抗原蛋白和疫苗佐剂。其中，抗原蛋白由SEQ ID NO:1的核酸分子编码的鸡滑液囊支原体EF‑TU蛋白；与由SEQ ID NO:4的核酸分子编码的鸡滑液囊支原体dnaK蛋白；与由SEQ ID NO:6的核酸分子的鸡滑液囊支原体EF‑G蛋白；以及由SEQ ID NO:9的核酸分子编码的鸡滑液囊支原体Nuc2蛋白4种蛋白组合而成。该疫苗使用大肠杆菌BL21(DE3)表达的EF‑TU、dnaK、EF‑G和Nuc2蛋白，表达水平高、免疫原性强，对鸡没有致病性，并且本发明的疫苗能产生较高水平的抗体，抗体激发快，持续时间长，能够有效预防鸡滑液囊支原体的流行。相比传统的灭活疫苗，本发明的基因工程亚单位疫苗安全性高、培养条件简单、能大规模培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

Description

一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗

技术领域

本发明旨在利用一种基因工程亚单位疫苗有效防控鸡滑液囊支原体感染。

背景技术

鸡滑液囊支原体病(Mycoplasma Synoviae，MS)又称鸡传染性滑膜炎，是由鸡滑液囊支原体引起鸡和火鸡的一种传染病。其主要特征为关节肿大、滑液囊及肌腱发炎和实质器官的肿大。12周龄以上的鸡很少发病，患病最多的是9～12周龄的鸡，发病率5％～10％，死亡率一般在10％以内，严重者可高达75％左右。鸡滑液囊支原体可致母鸡产蛋量下降20％～30％，对养鸡行业带来巨大的经济损失。

鸡滑液囊支原体呈多形态的球形体，革兰氏染色呈阴性，对外界环境的抵抗力不强，多种消毒剂可以将其杀死，对酸敏感。目前，防治鸡滑液囊支原体主要采用抗生素疗法和疫苗接种两种方法。鸡滑液囊支原体对某些抗生素敏感，但极易产生抗药性，无法从根源上消除感染。并且，现有的疫苗都是传统的灭活疫苗，免疫保护力较弱且成本高。

目前，国内用于预防和控制鸡滑液囊支原体的疫苗主要是传统的灭活疫苗，其本身存在免疫保护力弱的问题。此外，支原体培养比较困难、成本高、工艺复杂，因此亟需一种安全高效的疫苗预防滑液囊支原体的传播。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗，用于鸡滑液囊支原体的免疫预防。

本发明的技术方案是第一方面提供一种重组表达载体，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含鸡滑液囊支原体EF-TU蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO:1所示的序列，所述重组表达载体为在T7 terminator序列和lac operator序列之间插入目的基因片段的pET-32a-EF-TU载体。

第二方面，提供一种重组表达载体，其含有目的基因片段，目的基因片段包含鸡滑液囊支原体dnaK蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经过定点突变得到的如SEQID NO:4所示的序列，所述定点突变包括将示于SEQ ID NO:3的序列的第609位和第630位的碱基A均突变为G，所述重组表达载体为在T7 terminator序列和lac operator序列之间插入目的基因片段的pET-28a-dnaK载体。

第三方面，提供一种重组表达载体，其含有目的基因片段，目的基因片段包含鸡滑液囊支原体EF-G蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经密码子优化得到如SEQ IDNO:3所示的序列，所述重组表达载体为在T7terminator序列和lac operator序列之间插入目的基因片段的pET-28a-EF-G载体。

第四方面，提供一种重组表达载体，其含有目的基因片段，所述的目的基因片段的序列为如SEQ ID NO:9所示的序列，所述序列为将SEQ ID NO:8序列的第669位的核苷酸A突变为G，并截去SEQ ID NO:8的序列的第1～105位的核苷酸所得，被截去的核苷酸用于编码Nuc2蛋白原始信号肽的第1～35位氨基酸，所述重组表达载体为在T7 terminator序列和lac operator序列之间插入目的基因片段的pET-28a-Nuc2载体。

第五方面，提供一种包含上述的重组表达载体表达的免疫原性组合物，其包括：由pET-32a-EF-TU载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:2所示的EF-TU蛋白，和由pET-28a-dnaK载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:5所示的dnaK蛋白，和由pET-28a-EF-G载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:7所示的EF-G蛋白，和由pET-28a-Nuc2载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:10所示的Nuc2蛋白，及药学上可接受的载体。

第六方面，提供上述的重组表达载体表达的抗原蛋白。

第七方面，提供鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗，其包含上述的免疫原性组合物，任选包含佐剂。

优选地，所述佐剂为水包油包水型佐剂。

优选地，所述佐剂为Summit P168佐剂，所述的基因工程亚单位疫苗为蛋白液和佐剂乳化后的混合液，蛋白液中EF-TU和dnaK和蛋白EF-G和Nuc2的质量比为1：1：1：1，蛋白液与佐剂的体积比为3：2。

第八方面，提供上述的免疫原性组合物，或上述的基因工程亚单位疫苗在制备用于治疗或预防鸡滑液囊支原体感染的药物中的应用。

第九方面，提供上述的抗原蛋白，在受试动物中诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的药剂的应用。

本发明采用EF-TU、dnaK、EF-G和Nuc2蛋白组合作为疫苗，与单一蛋白作为疫苗相比，极大地提高了疫苗的保护效力，能有效解决单一抗原蛋白带来的免疫保护力不足的问题。Ef-Tu和EF-G均为抗原延伸因子，能够在MS合成高度保守的蛋白时发挥作用；dnaK和Nuc2分别为MS核心伴侣蛋白和核酸内切酶；四种蛋白在MS中均具有免疫原性。

本发明的基因工程亚单位疫苗，其制备方法如下：

1)按照培养瓶体积的50％～75％加入大肠杆菌发酵培养基，pH为7.2～7.4、种子接种量为5％、培养温度为37℃、震荡速度为200r/min，培养4～6h至OD600为0.8，降温至20℃加入终浓度为0.5mmol的IPTG诱导8～12h，收集菌体，种子为所述的重组表达载体转化至BL21感受态细胞后培养出的菌液，重组表达载体为：pET-32a-EF-TU、pET-28a-dnaK、pET-28a-EF-G、pET-28a-Nuc2。

2)将收集的菌体称重，使用PBS按质量体积比为1:10重悬菌体，充分打散，使用800～1000bar压力破碎，分离上清。

3)将分离上清液使用镍柱纯化后，测定蛋白浓度。

4)配苗：将得到蛋白液混合配置，使每毫升体积含EF-TU蛋白、dnaK蛋白、EF-G蛋白、Nuc2蛋白各167μg，加适当的佐剂使佐剂相体积与蛋白相体积比为2:3，使疫苗中蛋白终浓度为100μg/mL，使用乳化仪10000r/min乳化10min完成制备。

本发明的疫苗使用大肠杆菌BL21(DE3)表达的EF-TU、dnaK、EF-G和Nuc2蛋白，表达水平高、免疫原性强，对鸡没有致病性，并且本发明的疫苗能产生较高水平的抗体，抗体激发快，持续时间长，能够有效预防鸡滑液囊支原体的流行。相比传统的灭活疫苗，本发明的基因工程亚单位疫苗安全性高、培养条件简单、能大规模培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

图1为EF-TU基因PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为EF-TU基因；M为分子量标记；

图2为EF-TU基因转化的菌落样品PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阳性对照；2～5为EF-TU基因转化的菌落样品PCR扩增产物；M为分子量标记；

图3为dnaK基因PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为dnaK基因；M为分子量标记；

图4为dnaK基因转化的菌落样品PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阳性对照；2～5为dnaK基因转化的菌落样品PCR扩增产物；M为分子量标记；

图5为EF-G基因PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为EF-G基因；M为分子量标记；

图6为EF-G基因转化的菌落样品PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阳性对照；2～5为EF-G基因转化的菌落样品PCR扩增产物；M为分子量标记；

图7为Nuc2基因PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为Nuc2基因；M为分子量标记；

图8为Nuc2基因转化的菌落样品PCR扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阳性对照；2～5为Nuc2基因转化的菌落样品PCR扩增产物；M为分子量标记；

图9为构建的重组原核表达载体pET-32a-EF-TU图谱；

图10为构建的重组原核表达载体pET-32a-dnaK图谱；

图11为构建的重组原核表达载体pET-32a-EF-G图谱；

图12为构建的重组原核表达载体pET-32a-Nuc2图谱；

图13为大肠杆菌表达的重组EF-TU蛋白、dnaK蛋白、EF-G蛋白、Nuc2蛋白进行SDS-PAGE垂直电泳的结果，其中Marker为分子量标记；

图14为纯化的EF-TU、dnaK、EF-G、Nuc2蛋白蛋白进行SDS-PAGE垂直电泳的结果，其中Marker为分子量标记；

图15为纯化后的EF-TU、dnaK、EF-G和Nuc2蛋白进行SDS电泳得到的Western blot结果，其中Marker为分子量标记；

图16为EF-TU、dnaK、EF-G、Nuc2四种蛋白诱导的抗体平均水平(S/P值)；

图17为使用本发明疫苗后，攻毒后阴性对照组与疫苗组鸡爪垫、跗关节和肾病变的对比结果。

具体实施方式

本发明所用培养基及其配制方法如下：

1.1大肠杆菌复苏培养基取蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，加适量去离子水定容至1L，混合溶解后121℃高压灭菌20分钟，冷却后室温保存备用。固体培养基灭菌前需加琼脂粉，其终浓度为15g/L。

1.2大肠杆菌诱导培养基取蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、丙三醇10mL，加适量去离子水定容至1L，混合溶解后121℃高压灭菌20分钟，冷却后室温保存备用。

下面结合具体实施案例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

实施例1表达载体pET-32a-EF-TU的构建与鉴定

1.EF-TU基因扩增与回收参照滑液囊支原体WVU 1853株(GenBankNo.CP011096.1)的EF-TU基因序列，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，由北京擎科生物科技有限公司合成了SEQ ID NO:1所示的基因序列EF-TU-opt。以合成的EF-TU-opt基因作为模板，EF-TU-F、EF-TU-R作为上下游引物进行PCR扩增(EF-TU-F、EF-TU-R序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示)。扩增体系及反应条件如表1所示。

表1EF-TU-opt基因扩增体系

将PCR产物使用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳验证扩增片段的大小，如图1所示，在1230bp位置出现目的条带，证明目的基因扩增成功，使用凝胶回收纯化试剂盒(OMEGA)进行回收纯化。

2.pET-32a载体的酶切与回收pET-32a质粒载体购买自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)。将pET-32a质粒使用BamHI和HindIII限制酶酶切2小时。将酶切产物进行凝胶电泳，用凝胶回收纯化试剂盒(OMEGA)进行回收纯化。

3.pET-32a-EF-TU载体构建将回收纯化的EF-TU-opt基因片段与pET-32a载体片段使用

II一步克隆试剂盒(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行连接反应，反应体系见表2，使用PCR仪37℃连接30分钟。

表2 EF-TU基因与pET-32a片段连接体系

4.转化将连接产物置于冰上预冷后，加入到100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入500μL无抗性LB液体培养基，37℃培养1小时。取100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12～18小时。

5.菌落PCR与测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养4小时。以菌液作为模板，T7和T7ter(序列分别如SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20所示)作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证条带大小，出现1943bp的条带的样品为阳性样品(图2)。将鉴定阳性的菌液使用质粒小量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒后送北京擎科生物科技有限公司进行测序，选择测序正确的质粒及对应的菌液保存。构建正确的pET-32a-EF-TU载体其示意图如图9。

实施例2表达载体pET-28a-dnaK的构建与鉴定

1.dnaK基因扩增与回收由于滑液囊支原体中编码色氨酸的TGA密码子在大肠杆菌中为终止密码子，参照滑液囊支原体WVU 1853株(GenBank No.CP011096.1)SEQ ID NO:3示出的dnaK基因序列，将基因第609位和第630位的碱基A均修正为G，然后在北京擎科生物科技有限公司合成如SEQ ID NO:4示的修改后的基因序列dnaK-opt。以合成的dnaK-opt基因作为模板，dnaK-F、dnaK-R作为上下游引物进行PCR扩增(dnaK-F、dnaK-R核苷酸序列如SEQID NO:13、SEQ ID NO:14所示)。扩增体系及反应条件如表3所示。

表3 dnaK-opt基因扩增体系及反应条件

将PCR产物使用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳验证扩增片段的大小，如图3所示，在1833bp位置出现目的条带，证明目的基因扩增成功，使用凝胶回收纯化试剂盒(OMEGA)进行回收纯化。

2.pET-28a载体的酶切与回收pET-28a质粒载体购买自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)。将pET-28a质粒使用EcoRI和XhoI限制酶酶切2小时。将酶切产物进行凝胶电泳，用凝胶回收纯化试剂盒(OMEGA)进行回收纯化。

3.pET-28a-dnaK载体的构建将回收纯化的dnaK-opt基因片段与pET-28a质粒片段使用

II一步克隆试剂盒(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行连接反应，反应体系见表4，使用PCR仪37℃连接30分钟。

表4 dnaK-opt基因与pET-28a片段连接体系

4.转化将连接产物置于冰上预冷后，加入到100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入500μL无抗性LB液体培养基，37℃培养1小时。取100μL菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12～18小时。

5.菌落PCR与测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养4小时。以菌液作为模板，T7和T7ter(序列分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示)作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证条带大小，出现2152bp的条带的样品为阳性样品(图4)。将鉴定阳性的菌液使用质粒小量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒后送北京擎科生物科技有限公司进行测序，选择测序正确的质粒及对应的菌液保存。构建正确的pET-28a-dnaK载体其示意图如图10。

实施例3表达载体pET-28a-EF-G的构建与鉴定

1.EF-G基因扩增与回收参照滑液囊支原体WVU 1853株(GenBank No.CP011096.1)的EF-G基因序列，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，优化密码子后，由北京擎科生物科技有限公司人工合成SEQ ID NO:6所示的基因序列EF-G-opt。并重组到pUC57载体上，得到pUC57-EF-G-opt质粒载体。以pUC57-EF-G-opt质粒作为模板EF-G-F、EF-G-R作为上下游引物进行PCR扩增(EF-G-F、EF-G-R序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示)。扩增体系如表5所示：

表5 EF-G-opt基因扩增体系：

将PCR产物使用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳验证扩增片段的大小，如图5所示，在2133bp位置出现目的条带，证明目的基因扩增成功，使用凝胶回收纯化试剂盒(OMEGA)进行回收纯化。

3.pET-28a-EF-G-opt载体的构建将回收纯化的EF-G-opt基因片段与pET-28a质粒片段使用

II一步克隆试剂盒(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行连接反应，反应体系见表6，使用PCR仪37℃连接30分钟。

表6 EF-G-opt基因与pET-28a片段连接体系

4.转化将连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入500μL无抗性LB液体培养基，37℃培养1小时。取100μL菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12～18小时。

5.菌落PCR与测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时。以菌液作为模板，T7和T7ter(序列分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示)作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证条带大小，出现2452bp的条带的样品为阳性样品(图6)。将鉴定阳性的菌液使用质粒小量提取试剂盒提取质粒后送测序公司进行测序，选择测序正确的质粒及对应的菌液保存。构建正确的pET-28a-EF-G-opt载体其示意图如图11。

实施例4表达载体pET-28a-Nuc2的构建与鉴定

1.Nuc2基因扩增与回收参照滑液囊支原体WVU 1853株(GenBank No.CP011096.1)的Nuc2基因序列，如SEQ ID NO：8所示，将基因核苷酸序列中第699位的碱基A修正为G，并去除SEQ ID NO:8的序列的第1～105位的核苷酸，被去除的核苷酸用于编码Nuc2蛋白原始信号肽的第1～35位氨基酸，然后由北京擎科生物科技有限公司人工合成如SEQ ID NO:9所示的基因序列Nuc2-opt。以合成的Nuc2-opt基因作为模板，Nuc2-F、Nuc2-R作为上下游引物进行PCR扩增(Nuc2-F、Nuc2-R序列如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示)。扩增体系及反应条件如表7所示。

表7 Nuc2-opt基因扩增体系

将PCR产物使用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳验证扩增片段的大小，如图7所示，在657bp位置出现目的条带，证明目的基因扩增成功，使用凝胶回收纯化试剂盒(OMEGA)进行回收纯化。

3.pET-28a-Nuc2-opt载体的构建将回收纯化的Nuc2-opt基因片段与pET-28a质粒片段使用

II一步克隆试剂盒(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行连接反应，反应体系见表8，使用PCR仪37℃连接30分钟。

表8 Nuc2-opt基因与pET-28a片段连接体系

5.菌落PCR与测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养4小时。以菌液作为模板，T7和T7ter(序列分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示)作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证条带大小，出现976bp的条带的样品为阳性样品(图8)。将鉴定阳性的菌液使用质粒小量提取试剂盒提取质粒后送测序公司进行测序，选择测序正确的质粒及对应的菌液保存。构建正确的pET-28a-Nuc2-opt载体其示意图如图12。

实施例5抗原蛋白EF-TU、dnaK、EF-G-和Nuc2的表达与纯化

1.载体转化表达菌将构建正确的pET-32a-EF-TU-opt、pET-28a-dnaK-opt、pET-28a-EF-G-opt、pET-28a-Nuc2-opt质粒各取1uL分别加入到100uL的BL21感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入500μL无抗性LB液体培养基，37℃培养1小时。取100μL菌液涂布于含有相应抗性的LB固体培养基上，37℃培养12～18小时。

2.目的蛋白表达情况验证分别挑取单菌落于10mL的LB液体培养基中，37℃培养4小时，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG于20℃诱导8～12小时，菌液10倍浓缩后超声破碎10分钟，12000rpm离心10分钟分离破碎上清。将分离的破碎上清进行SDS-PAGE电泳，蛋白均可在上清表达(如图13中的I和II)，将正确表达的菌株保种。

3.蛋白的大量表达平板划线复苏4种表达菌株，挑取单菌落于10mL的LB液体培养基中，37℃培养至对数生长期。将新鲜菌液转接至100mL的LB液体培养基中，37℃培养6小时。按接种量为1:100转接至大摇瓶，每种菌株各接10L，37℃培养至OD600为0.8，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG于20℃诱导8～12小时，使用离心机8000rpm离心5分钟收集菌体。

4.蛋白的纯化分别将收集的菌体使用1升PBS缓冲液重悬均匀后，使用压力破碎仪以800～1000bar高压破碎3遍，离心，分离破碎上清液。上清液使用镍柱纯化，收集纯化后的蛋白液，SD-PAGE电泳分析目的蛋白纯度，如图14所示。将纯化后蛋白液使用0.22μm滤膜无菌过滤后置于4℃保存。

实施例6蛋白含量的测定将实施例3中得到的4种蛋白液使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其含量，如表9所示。

实施例7western blot鉴定

分别将实施例7中纯化后的EF-TU、dnaK、EF-G和Nuc2蛋白进行SDS电泳，将电泳后的产物转印到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上；用5％脱脂乳封闭2小时；鸡源抗MS阳性血清孵育2小时，漂洗；HRP标记的羊抗鸡二抗(Abbkine)孵育2小时，漂洗；然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图15所示，4种蛋白均有目的条带，说明目的蛋白经大肠杆菌表达、镍柱纯化后与鸡滑液囊支原体中对应蛋白的结构具有一致性。

EF-TU蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，dnaK蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，EF-G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，Nuc2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。

实施例8疫苗的制备

取实施例5中过滤除菌后的4种蛋白进行混合，并使用灭菌水进行稀释，使每个抗原蛋白浓度达到167μg/mL，然后将混合好的蛋白液与佐剂Summit P168佐剂按照3:2均匀混合配制成疫苗。具体的，每600mL混合蛋白液加入Summit-P168佐剂400mL，然后用乳化仪10000rpm乳化10min，将蛋白相与佐剂相形成均一乳剂。佐剂Summit P168购自漯河桑米特生物科技有限公司，为禽流感疫苗专用水包油包水佐剂，主要成份:药物级白油、界面活性剂、免疫促进剂；具体的，每600mL混合蛋白液加入佐剂Summit P168400mL，然后用乳化仪10000rpm乳化10min，将蛋白相与佐剂相形成均一乳剂。

实施例9间接ELISA法检测抗体

免疫、采血取6日龄SPF鸡20只，当天采血，分离血清；次日，将实施例8中制备好的鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗以每只0.5ml颈部皮下注射10只；免疫后14日所有鸡只采血，分离血清，并进行二次相同剂量的免疫；二次免疫后14日，所有鸡只采血，分离血清。

准备ELISA板取实施例5中纯化后的EF-TU、dnaK、EF-G和Nuc2蛋白，分别使用包被液分别适当稀释至1μg/ml，每孔100μl分别加入ELISA板，4℃过夜包被，洗板三次，拍干；加入5％脱脂乳37℃封闭2小时，洗板三次，拍干，将ELISA板置于4℃备用。

抗体检测取免疫前、一次免疫14日及二次免疫14日血清稀释1000倍，并以MS阴性及阳性血清作为对照，按每孔100μl分别加入制备好的ELISA板，37℃孵育1小时，洗板三次，拍干；HRP标记的羊抗鸡二抗(Abbkine)稀释5000倍后，按每孔100μl分别加入ELISA板，37℃孵育30分钟，洗板三次，拍干；显色，使用酶标仪在OD630nm时读数。

阴阳性判定标准计算未免疫阴性鸡血清S/P值(样品OD630nm/阳性对照血清OD630nm)，根据公式

(

为阴性血清样品S/P均值，SD为标准差)，计算出EF-TU、dnaK、EF-G、Nuc2免疫抗体S/P阴阳性临界点分别为0.181、0.146、0.141、0.147。

抗体水平结果显示，所有免疫后的鸡只抗体均呈阳性。4个蛋白诱导的抗体平均水平(S/P值)如图16所示。结果显示随着免疫时间的延长，鸡体内抗体水平持续升高，免疫后EF-TU免疫组的鸡只抗体水平最高，其次是dnaK免疫组，再次是EF-G和Nuc2免疫组。

实施例10免疫实验

取实施例5中4种蛋白分别加水稀释至167μg/mL，蛋白液与佐剂Summit P168佐剂按照3:2均匀混合配制成4种单一蛋白疫苗。将实施例8中制备好的鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗与配制的4种单一蛋白苗以每只0.5mL颈部皮下注射7日龄SPF鸡10只，另设不免疫对照组10只。免疫后14日进行二次相同剂量的免疫。二次免疫后14日，各组试验鸡均用活菌量约107CCU/mL的菌液爪垫注射攻毒，每只0.2mL。观察14日内试验鸡发病情况。试验结果表明，以0.5mL本发明的疫苗进行两次免疫7日龄SPF鸡，二免14日试验鸡的保护率为10/10；以0.5mL EF-TU单一蛋白苗进行两次免疫7日龄SPF鸡，二免14日试验鸡的保护率为6/10；以0.5mL dnaK单一蛋白苗进行两次免疫7日龄SPF鸡，二免14日试验鸡的保护率为6/10；以0.5mL EF-G单一蛋白苗进行两次免疫7日龄SPF鸡，二免14日试验鸡的保护率为6/10；以0.5mL Nuc2单一蛋白苗进行两次免疫7日龄SPF鸡，二免14日试验鸡的保护率为6/10；对照鸡10/10发病，出现精神不振，食欲下降，生长停滞，关节肿胀、跛行，甚至变形(如表10所示)。结果表明，疫苗免疫效力合格。分别解剖实验组和对照组鸡发现：对照组鸡爪垫出现肿胀坏死症状，跗关节出现化脓性感染症状，肾脏出现肿大及坏死症状；实验组均正常(图17)。

表10疫苗保护率

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctaagc tagactttga taggtcaaaa gagcacgtga acgtgggtac gatcggtcac 60

gttgaccacg gtaaaacgac cctgactgcc gcgatcgcca ccgtgttgtc caaaaagggt 120

ttaagcgagg cgcgtgatta cgcaagcatt gataatgctc cggaagagaa agcgcgtggg 180

attacgatta acaccagtca tattgaatac cagaccgaga aacgtcacta tgcacatgtt 240

gactgtccgg gtcatgctga ttacgttaaa aacatgatca cgggtgccgc tcagatggat 300

ggtgcgatcc tggttgttgc tgcgactgac ggccctatgc cgcaaacccg tgaacacatc 360

ctcctctcga aacaggtagg agttccgcgt atggtcgtgt tcctgaataa gtgcgatatg 420

gtggacgatg aggaaatgat tggtttggtt gagatggaaa tccgcgacct gctgtctgaa 480

tacggctttg atggtgataa cgcgccaatc gttcgtggta gcgcattgaa ggcgctggaa 540

ggcgatgcag tttatgagga caagatcatg gaactgatga atgcggtgga cacctatatt 600

gagaacccgg ttaaagagct ggataaaccg ttcctgatgg cagtagagga cgtctttacc 660

attaccggac gtggcaccgt tgcgaccggc cgcgtcgagc gcggccgtct gaccttgaat 720

gaagaagttg agatcgtggg tttgaagccg accaagaaga ccgttgtgac cggcatcgag 780

atgtttcgta aaaacctgaa agaagcgctt gccggcgaca acgctggctt gttgctgcgt 840

ggcgttaatc gagacgacgt agaacgtggc caagttctgg ctaaaccggg ttccatcgtg 900

ccgcataccg aattcgaagc ggcgatctac gtgctgaaga aggaggaggg tggtcgccac 960

accccgtttt tcaaaaacta caaaccgcaa ttttatttcc gcaccacaga tgtgacgggc 1020

ggtgtcgagt tcgaggcggg tagagaaatg gtgatgccag gtgaaaacgt caacctgaag 1080

gtgaagctga ttagcccgat tgcggtcgag gaaggcacca agttcagcat ccgtgagggt 1140

ggccgcaccg tgggcgcagg ctctgttacg aaaattgtta agtaa 1185

<210> 2

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Lys Leu Asp Phe Asp Arg Ser Lys Glu His Val Asn Val Gly

1 5 10 15

Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile

20 25 30

Ala Thr Val Leu Ser Lys Lys Gly Leu Ser Glu Ala Arg Asp Tyr Ala

35 40 45

Ser Ile Asp Asn Ala Pro Glu Glu Lys Ala Arg Gly Ile Thr Ile Asn

50 55 60

Thr Ser His Ile Glu Tyr Gln Thr Glu Lys Arg His Tyr Ala His Val

65 70 75 80

Asp Cys Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile Thr Gly Ala

85 90 95

Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr Asp Gly Pro

100 105 110

Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ser Lys Gln Val Gly Val

115 120 125

Pro Arg Met Val Val Phe Leu Asn Lys Cys Asp Met Val Asp Asp Glu

130 135 140

Glu Met Ile Gly Leu Val Glu Met Glu Ile Arg Asp Leu Leu Ser Glu

145 150 155 160

Tyr Gly Phe Asp Gly Asp Asn Ala Pro Ile Val Arg Gly Ser Ala Leu

165 170 175

Lys Ala Leu Glu Gly Asp Ala Val Tyr Glu Asp Lys Ile Met Glu Leu

180 185 190

Met Asn Ala Val Asp Thr Tyr Ile Glu Asn Pro Val Lys Glu Leu Asp

195 200 205

Lys Pro Phe Leu Met Ala Val Glu Asp Val Phe Thr Ile Thr Gly Arg

210 215 220

Gly Thr Val Ala Thr Gly Arg Val Glu Arg Gly Arg Leu Thr Leu Asn

225 230 235 240

Glu Glu Val Glu Ile Val Gly Leu Lys Pro Thr Lys Lys Thr Val Val

245 250 255

Thr Gly Ile Glu Met Phe Arg Lys Asn Leu Lys Glu Ala Leu Ala Gly

260 265 270

Asp Asn Ala Gly Leu Leu Leu Arg Gly Val Asn Arg Asp Asp Val Glu

275 280 285

Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys Pro Gly Ser Ile Val Pro His Thr Glu

290 295 300

Phe Glu Ala Ala Ile Tyr Val Leu Lys Lys Glu Glu Gly Gly Arg His

305 310 315 320

Thr Pro Phe Phe Lys Asn Tyr Lys Pro Gln Phe Tyr Phe Arg Thr Thr

325 330 335

Asp Val Thr Gly Gly Val Glu Phe Glu Ala Gly Arg Glu Met Val Met

340 345 350

Pro Gly Glu Asn Val Asn Leu Lys Val Lys Leu Ile Ser Pro Ile Ala

355 360 365

Val Glu Glu Gly Thr Lys Phe Ser Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr Val

370 375 380

Gly Ala Gly Ser Val Thr Lys Ile Val Lys

385 390

<210> 3

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcaaaag aaatagtatt aggaattgac ttaggaacaa caaactcagt tgtttctatc 60

gtagaaggta aaaacccaac cgttttagaa aacccaaacg gaaaaagaac aactccttca 120

gttgtggctt ttaaaaacgg agaaataatt gtaggagatg ctgcaaagcg tcaagttgaa 180

accaacccag atacaattat ttctattaaa agattaatgg gaaccaataa aaccgttaaa 240

gctaataata aagaatataa accagaagaa atttcagcaa tgattctttc atatatgaaa 300

gactatgctg aaaaaaaact aggacaaaaa gtatctaaag cagttattac tgtaccagca 360

tattttgata acgctgaaag agaagcaacc aaaaatgccg gtagaattgc aggactagaa 420

gttttaagaa taataaacga gcctaccgca gcagcgcttg catttggact agataaaaat 480

aaagcaatga aagtgctagt ttacgattta ggaggaggaa cttttgacgt ttctgttcta 540

gatttagaag atggaacttt cgaagtgctt tcaacttctg gagataatca ccttggtgga 600

gatgattgag ataacgaaat agttaaatga ttaactaaag aaataaatac aaaatacagc 660

tacgatgtat ctaaagataa atacgcttta gctcgtttaa aagaaaacgc tgaaaaagct 720

aaaattgatc tatcaaatca atcagttgtg caaattaata ttccattttt agcaatgtca 780

gctaatgggc caatcaacgt tgagctttct ctaaaaagaa gtgaatttga agcaatgact 840

tcacatttat tagatagaac cagaaaacct atcgaagacg ctcttaaaga agcaaaacta 900

agtgctaatg acattcacga agtgctttta gtaggtggat ctactagaat gccagcggtg 960

caagatatgg ttaaaagaac tttaggaaaa gaacctaacc gttcaattaa ccctgacgaa 1020

gttgtatcta taggagctgc tatccaagga ggagtgctag ccggacatat cgacgatata 1080

ttactgctag atgtaactcc gcttacttta ggaattgaaa ctcttggagg agtagctact 1140

cctttaattc caagaaacac aaccattcct gcaactaaat ctcaagtgtt ttctaccgca 1200

gccgacaacc aaaccgaagt tacaattagc gtaattcaag gtgaaagaca aatggcaagc 1260

gataataaaa tgctaggaag atttaatcta acaggaatag aagccgctcc tagaggagtt 1320

cctcaaattg aagttacatt ttcaattgac gttaatggta ttactaaagt ttcagcgaaa 1380

gacatgaaaa ctcaaaaaga gcaaaccatt actatagaaa attcttcaaa actttcagaa 1440

gaagaaattc aaaaattcat caaagacgca gaagccaata aagaagctga tgctaaaaga 1500

aaagaagaag ctgaaaccat cgttagagca gagtcattaa ttgaccaagt caaaaaagcg 1560

cttgaagctc aaggcgataa agctgacgct aaaaccaaag aagaatcaga aaagctaatc 1620

aaagaattgc aaaatttaat cgataaaaaa gatattccta ctttaaaagc taagttagaa 1680

gaagtagaaa atatgatgaa aaactttgca aacttcgctc aacaagcaaa tgctactaaa 1740

gatcaaagct ctaaagacca agaagaagta gctacagttg tagaagaata a 1791

<210> 4

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcaaaag aaatagtatt aggaattgac ttaggaacaa caaactcagt tgtttctatc 60

gtagaaggta aaaacccaac cgttttagaa aacccaaacg gaaaaagaac aactccttca 120

gttgtggctt ttaaaaacgg agaaataatt gtaggagatg ctgcaaagcg tcaagttgaa 180

accaacccag atacaattat ttctattaaa agattaatgg gaaccaataa aaccgttaaa 240

gctaataata aagaatataa accagaagaa atttcagcaa tgattctttc atatatgaaa 300

gactatgctg aaaaaaaact aggacaaaaa gtatctaaag cagttattac tgtaccagca 360

tattttgata acgctgaaag agaagcaacc aaaaatgccg gtagaattgc aggactagaa 420

gttttaagaa taataaacga gcctaccgca gcagcgcttg catttggact agataaaaat 480

aaagcaatga aagtgctagt ttacgattta ggaggaggaa cttttgacgt ttctgttcta 540

gatttagaag atggaacttt cgaagtgctt tcaacttctg gagataatca ccttggtgga 600

gatgattggg ataacgaaat agttaaatgg ttaactaaag aaataaatac aaaatacagc 660

tacgatgtat ctaaagataa atacgcttta gctcgtttaa aagaaaacgc tgaaaaagct 720

aaaattgatc tatcaaatca atcagttgtg caaattaata ttccattttt agcaatgtca 780

gctaatgggc caatcaacgt tgagctttct ctaaaaagaa gtgaatttga agcaatgact 840

tcacatttat tagatagaac cagaaaacct atcgaagacg ctcttaaaga agcaaaacta 900

agtgctaatg acattcacga agtgctttta gtaggtggat ctactagaat gccagcggtg 960

caagatatgg ttaaaagaac tttaggaaaa gaacctaacc gttcaattaa ccctgacgaa 1020

gttgtatcta taggagctgc tatccaagga ggagtgctag ccggacatat cgacgatata 1080

ttactgctag atgtaactcc gcttacttta ggaattgaaa ctcttggagg agtagctact 1140

cctttaattc caagaaacac aaccattcct gcaactaaat ctcaagtgtt ttctaccgca 1200

gccgacaacc aaaccgaagt tacaattagc gtaattcaag gtgaaagaca aatggcaagc 1260

gataataaaa tgctaggaag atttaatcta acaggaatag aagccgctcc tagaggagtt 1320

cctcaaattg aagttacatt ttcaattgac gttaatggta ttactaaagt ttcagcgaaa 1380

gacatgaaaa ctcaaaaaga gcaaaccatt actatagaaa attcttcaaa actttcagaa 1440

gaagaaattc aaaaattcat caaagacgca gaagccaata aagaagctga tgctaaaaga 1500

aaagaagaag ctgaaaccat cgttagagca gagtcattaa ttgaccaagt caaaaaagcg 1560

cttgaagctc aaggcgataa agctgacgct aaaaccaaag aagaatcaga aaagctaatc 1620

aaagaattgc aaaatttaat cgataaaaaa gatattccta ctttaaaagc taagttagaa 1680

gaagtagaaa atatgatgaa aaactttgca aacttcgctc aacaagcaaa tgctactaaa 1740

gatcaaagct ctaaagacca agaagaagta gctacagttg tagaagaata a 1791

<210> 5

<211> 596

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Lys Glu Ile Val Leu Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser

1 5 10 15

Val Val Ser Ile Val Glu Gly Lys Asn Pro Thr Val Leu Glu Asn Pro

20 25 30

Asn Gly Lys Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Lys Asn Gly Glu

35 40 45

Ile Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Val Glu Thr Asn Pro Asp

50 55 60

Thr Ile Ile Ser Ile Lys Arg Leu Met Gly Thr Asn Lys Thr Val Lys

65 70 75 80

Ala Asn Asn Lys Glu Tyr Lys Pro Glu Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu

85 90 95

Ser Tyr Met Lys Asp Tyr Ala Glu Lys Lys Leu Gly Gln Lys Val Ser

100 105 110

Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asp Asn Ala Glu Arg Glu

115 120 125

Ala Thr Lys Asn Ala Gly Arg Ile Ala Gly Leu Glu Val Leu Arg Ile

130 135 140

Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Phe Gly Leu Asp Lys Asn

145 150 155 160

Lys Ala Met Lys Val Leu Val Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp

165 170 175

Val Ser Val Leu Asp Leu Glu Asp Gly Thr Phe Glu Val Leu Ser Thr

180 185 190

Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Asn Glu Ile Val

195 200 205

Lys Trp Leu Thr Lys Glu Ile Asn Thr Lys Tyr Ser Tyr Asp Val Ser

210 215 220

Lys Asp Lys Tyr Ala Leu Ala Arg Leu Lys Glu Asn Ala Glu Lys Ala

225 230 235 240

Lys Ile Asp Leu Ser Asn Gln Ser Val Val Gln Ile Asn Ile Pro Phe

245 250 255

Leu Ala Met Ser Ala Asn Gly Pro Ile Asn Val Glu Leu Ser Leu Lys

260 265 270

Arg Ser Glu Phe Glu Ala Met Thr Ser His Leu Leu Asp Arg Thr Arg

275 280 285

Lys Pro Ile Glu Asp Ala Leu Lys Glu Ala Lys Leu Ser Ala Asn Asp

290 295 300

Ile His Glu Val Leu Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro Ala Val

305 310 315 320

Gln Asp Met Val Lys Arg Thr Leu Gly Lys Glu Pro Asn Arg Ser Ile

325 330 335

Asn Pro Asp Glu Val Val Ser Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val

340 345 350

Leu Ala Gly His Ile Asp Asp Ile Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu

355 360 365

Thr Leu Gly Ile Glu Thr Leu Gly Gly Val Ala Thr Pro Leu Ile Pro

370 375 380

Arg Asn Thr Thr Ile Pro Ala Thr Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala

385 390 395 400

Ala Asp Asn Gln Thr Glu Val Thr Ile Ser Val Ile Gln Gly Glu Arg

405 410 415

Gln Met Ala Ser Asp Asn Lys Met Leu Gly Arg Phe Asn Leu Thr Gly

420 425 430

Ile Glu Ala Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Ser

435 440 445

Ile Asp Val Asn Gly Ile Thr Lys Val Ser Ala Lys Asp Met Lys Thr

450 455 460

Gln Lys Glu Gln Thr Ile Thr Ile Glu Asn Ser Ser Lys Leu Ser Glu

465 470 475 480

Glu Glu Ile Gln Lys Phe Ile Lys Asp Ala Glu Ala Asn Lys Glu Ala

485 490 495

Asp Ala Lys Arg Lys Glu Glu Ala Glu Thr Ile Val Arg Ala Glu Ser

500 505 510

Leu Ile Asp Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ala Gln Gly Asp Lys Ala

515 520 525

Asp Ala Lys Thr Lys Glu Glu Ser Glu Lys Leu Ile Lys Glu Leu Gln

530 535 540

Asn Leu Ile Asp Lys Lys Asp Ile Pro Thr Leu Lys Ala Lys Leu Glu

545 550 555 560

Glu Val Glu Asn Met Met Lys Asn Phe Ala Asn Phe Ala Gln Gln Ala

565 570 575

Asn Ala Thr Lys Asp Gln Ser Ser Lys Asp Gln Glu Glu Val Ala Thr

580 585 590

Val Val Glu Glu

595

<210> 6

<211> 2091

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggcacgtg attatgatct gaaagattat cgtaacatcg gtattatggc gcatattgat 60

gcgggtaaaa ccaccaccac cgaacgcatt ctgtatcata ccggtaaaat tcataaaatc 120

ggtgaaacac atgatggtgt ttctcagatg gattggatgg aacaggaaaa agaacgtggc 180

attacaatca ccagcgcagc aaccacagca tattggaaaa ataaacgtat taacatcatc 240

gataccccgg gtcatgttga ttttaccgtt gaagttgaac gtagcctgcg tgttctggat 300

ggcgccgttg cagttctgga tgcacagagc ggtgtggaac cgcagaccga aaccgtgtgg 360

cgccaggcaa ccaattataa agttccgcgt attgtgtatg ttaataaaat ggataaagca 420

ggtgcggatt ttgaagcggc agtagcaagc gttaaaagcc gtctgggtgg caatgcggtt 480

gcaattcagt ggccgatcgg tagcgaaagc aattttaatg gcatcattga tctggttaca 540

atgaccgcga caacctataa tggtgaaagt gcagaagaag aatttccgat ggaaattccg 600

gcagatctgc tggatgtggc aaaagcaaaa cgtcaggaac tgctggaagc agccgcaaat 660

tttgatgaag aagttatgat gatggtgctg gaaggtgcag atgttgatat tgatactttt 720

aaaaacacca tccgtaaagc aacactgacc agcgaatttt ttccggtagt atgtggtacc 780

agctttaaaa ataaaggtgt taaaaagatg atcgatgcag ttgttgatta tctgccgtcc 840

ccgctggata ttccgccgat caaagcatat ctgaatgatc aggaaaccga tgttgtggca 900

acggatgatg gcgaatttgc agcactggca tttaaagtta tgaccgatcc ttttgttggt 960

tctctgacct tttttcgcgt ctatcgcggt gttctggaaa aaggtagtta tgtttataac 1020

agcaccaaag aacagaaaga acgtattggt cgtattctgc agatgcatgc aaataatcgt 1080

gttgaaattg atgaatgtcg tgcaggtgat attgcagcag cagtgggtct gaaatttacc 1140

accaccggtg atacactggt tggcgaaaaa tcacctaaag ttgttctgga aaaaatggtt 1200

tttccggaac cggttattag ccaggcactg gaaccggaaa gcaaagcagc aaatgaaaaa 1260

ctgagcctgg gtctgcagaa actgagcgca gaagatccga cctttcgtac ctataccgat 1320

gaagaaaccg gtcagaccat tattagcggt atgggtgaac tgcatctgga tattattgtt 1380

gatcgtctga aacgtgaatt tggtgttaaa gttaaagttg gtgcaccgca ggttagctat 1440

cgtgaaacca ttaccaaaag cgcagaagtt gaaggtaaac atattaaaca gagcggtggt 1500

aaaggtcagt atggtcatgt ttggctgaaa tttgaaccga atcatgatca gggttttgaa 1560

tttattgata aaattgttgg tggtaaaatt ccgaaagaat atattaaacc gattcagaaa 1620

ggtctggaag aaaaaatggc agttggtatt ctggcaggtt atccgatgat tgatgttaaa 1680

gcaaccctgt ttgatggtag ctatcatgat gttgatagca gcggtctggc atataaaatt 1740

gcagcaagca aagcactgac caaagcaaaa gatctgattg gtaccgttct gctggaaccg 1800

attatggatg ttagcgttgt tgttccgagc gatcacatgg gtgatgttat tggtgatctg 1860

agccgtcgtc gtggtctgat tagcgatcag gaacagcgta atgatggtgc agttattgtt 1920

cgtgcaaaag ttccgctgag cgaaatgttt ggttatagca ccgaactgcg tagcatgacc 1980

agcggtcgtg gtacctatca gatgcagttt gatcattatg aaaaatgtcc gaaaaatatt 2040

agcgatgaaa ttattaaaaa acgtaatatt caggataaag atgaagatta a 2091

<210> 7

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Arg Asp Tyr Asp Leu Lys Asp Tyr Arg Asn Ile Gly Ile Met

1 5 10 15

Ala His Ile Asp Ala Gly Lys Thr Thr Thr Thr Glu Arg Ile Leu Tyr

20 25 30

His Thr Gly Lys Ile His Lys Ile Gly Glu Thr His Asp Gly Val Ser

35 40 45

Gln Met Asp Trp Met Glu Gln Glu Lys Glu Arg Gly Ile Thr Ile Thr

50 55 60

Ser Ala Ala Thr Thr Ala Tyr Trp Lys Asn Lys Arg Ile Asn Ile Ile

65 70 75 80

Asp Thr Pro Gly His Val Asp Phe Thr Val Glu Val Glu Arg Ser Leu

85 90 95

Arg Val Leu Asp Gly Ala Val Ala Val Leu Asp Ala Gln Ser Gly Val

100 105 110

Glu Pro Gln Thr Glu Thr Val Trp Arg Gln Ala Thr Asn Tyr Lys Val

115 120 125

Pro Arg Ile Val Tyr Val Asn Lys Met Asp Lys Ala Gly Ala Asp Phe

130 135 140

Glu Ala Ala Val Ala Ser Val Lys Ser Arg Leu Gly Gly Asn Ala Val

145 150 155 160

Ala Ile Gln Trp Pro Ile Gly Ser Glu Ser Asn Phe Asn Gly Ile Ile

165 170 175

Asp Leu Val Thr Met Thr Ala Thr Thr Tyr Asn Gly Glu Ser Ala Glu

180 185 190

Glu Glu Phe Pro Met Glu Ile Pro Ala Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys

195 200 205

Ala Lys Arg Gln Glu Leu Leu Glu Ala Ala Ala Asn Phe Asp Glu Glu

210 215 220

Val Met Met Met Val Leu Glu Gly Ala Asp Val Asp Ile Asp Thr Phe

225 230 235 240

Lys Asn Thr Ile Arg Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Phe Phe Pro Val

245 250 255

Val Cys Gly Thr Ser Phe Lys Asn Lys Gly Val Lys Lys Met Ile Asp

260 265 270

Ala Val Val Asp Tyr Leu Pro Ser Pro Leu Asp Ile Pro Pro Ile Lys

275 280 285

Ala Tyr Leu Asn Asp Gln Glu Thr Asp Val Val Ala Thr Asp Asp Gly

290 295 300

Glu Phe Ala Ala Leu Ala Phe Lys Val Met Thr Asp Pro Phe Val Gly

305 310 315 320

Ser Leu Thr Phe Phe Arg Val Tyr Arg Gly Val Leu Glu Lys Gly Ser

325 330 335

Tyr Val Tyr Asn Ser Thr Lys Glu Gln Lys Glu Arg Ile Gly Arg Ile

340 345 350

Leu Gln Met His Ala Asn Asn Arg Val Glu Ile Asp Glu Cys Arg Ala

355 360 365

Gly Asp Ile Ala Ala Ala Val Gly Leu Lys Phe Thr Thr Thr Gly Asp

370 375 380

Thr Leu Val Gly Glu Lys Ser Pro Lys Val Val Leu Glu Lys Met Val

385 390 395 400

Phe Pro Glu Pro Val Ile Ser Gln Ala Leu Glu Pro Glu Ser Lys Ala

405 410 415

Ala Asn Glu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Gln Lys Leu Ser Ala Glu Asp

420 425 430

Pro Thr Phe Arg Thr Tyr Thr Asp Glu Glu Thr Gly Gln Thr Ile Ile

435 440 445

Ser Gly Met Gly Glu Leu His Leu Asp Ile Ile Val Asp Arg Leu Lys

450 455 460

Arg Glu Phe Gly Val Lys Val Lys Val Gly Ala Pro Gln Val Ser Tyr

465 470 475 480

Arg Glu Thr Ile Thr Lys Ser Ala Glu Val Glu Gly Lys His Ile Lys

485 490 495

Gln Ser Gly Gly Lys Gly Gln Tyr Gly His Val Trp Leu Lys Phe Glu

500 505 510

Pro Asn His Asp Gln Gly Phe Glu Phe Ile Asp Lys Ile Val Gly Gly

515 520 525

Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Ile Lys Pro Ile Gln Lys Gly Leu Glu Glu

530 535 540

Lys Met Ala Val Gly Ile Leu Ala Gly Tyr Pro Met Ile Asp Val Lys

545 550 555 560

Ala Thr Leu Phe Asp Gly Ser Tyr His Asp Val Asp Ser Ser Gly Leu

565 570 575

Ala Tyr Lys Ile Ala Ala Ser Lys Ala Leu Thr Lys Ala Lys Asp Leu

580 585 590

Ile Gly Thr Val Leu Leu Glu Pro Ile Met Asp Val Ser Val Val Val

595 600 605

Pro Ser Asp His Met Gly Asp Val Ile Gly Asp Leu Ser Arg Arg Arg

610 615 620

Gly Leu Ile Ser Asp Gln Glu Gln Arg Asn Asp Gly Ala Val Ile Val

625 630 635 640

Arg Ala Lys Val Pro Leu Ser Glu Met Phe Gly Tyr Ser Thr Glu Leu

645 650 655

Arg Ser Met Thr Ser Gly Arg Gly Thr Tyr Gln Met Gln Phe Asp His

660 665 670

Tyr Glu Lys Cys Pro Lys Asn Ile Ser Asp Glu Ile Ile Lys Lys Arg

675 680 685

Asn Ile Gln Asp Lys Asp Glu Asp

690 695

<210> 8

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggctatca agggaaaatt aagaatgaaa aagaaaaatt tttgaaaaaa gttaatttta 60

tctattagta gtttatttgt aacagctact gttgtaactt catgttcatt tggctttagt 120

cagaaaaaag acgaaaaaca aaacgaacaa agctcgccag gaactagcat cggacaaact 180

caaaatcaag atcaaaaagt tgccgctagc aatcttccaa aagctaaagt aacaagatat 240

accgatggag atacagttga catcatctac gatactatcg aagttacagc taaaattaga 300

ttttatggaa ttgacactcc tgaaacttta aaaggatcaa atagaaatct aatagctaaa 360

tatgaaaacg tttatgctca aaaagcaaaa gactatgtaa aagatttaat cactaaaaac 420

aatcacgtag tttacgttaa aaaaataaca accgataaat ataatcgtac cgttgcaatt 480

ttatatttaa ccaatgacca aacttcaaaa agcgttaacg aattaattgt agaaaacggt 540

tacggtgctg ttagatatat ttcactaact aataaaacct ataaagtaaa agatgatttt 600

caaagagact tttactttag actacttaat ttacaagaag aagcaaaatc taaatcatta 660

aatatctgag aacatgattt aaaagatgtt tactataaat acccttttaa taatgattaa 720

<210> 9

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcatttggct ttagtcagaa aaaagacgaa aaacaaaacg aacaaagctc gccaggaact 60

agcatcggac aaactcaaaa tcaagatcaa aaagttgccg ctagcaatct tccaaaagct 120

aaagtaacaa gatataccga tggagataca gttgacatca tctacgatac tatcgaagtt 180

acagctaaaa ttagatttta tggaattgac actcctgaaa ctttaaaagg atcaaataga 240

aatctaatag ctaaatatga aaacgtttat gctcaaaaag caaaagacta tgtaaaagat 300

ttaatcacta aaaacaatca cgtagtttac gttaaaaaaa taacaaccga taaatataat 360

cgtaccgttg caattttata tttaaccaat gaccaaactt caaaaagcgt taacgaatta 420

attgtagaaa acggttacgg tgctgttaga tatatttcac taactaataa aacctataaa 480

gtaaaagatg attttcaaag agacttttac tttagactac ttaatttaca agaagaagca 540

aaatctaaat cattaaatat ctgggaacat gatttaaaag atgtttacta taaataccct 600

tttaataatg attaa 615

<210> 10

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Phe Gly Phe Ser Gln Lys Lys Asp Glu Lys Gln Asn Glu Gln Ser

1 5 10 15

Ser Pro Gly Thr Ser Ile Gly Gln Thr Gln Asn Gln Asp Gln Lys Val

20 25 30

Ala Ala Ser Asn Leu Pro Lys Ala Lys Val Thr Arg Tyr Thr Asp Gly

35 40 45

Asp Thr Val Asp Ile Ile Tyr Asp Thr Ile Glu Val Thr Ala Lys Ile

50 55 60

Arg Phe Tyr Gly Ile Asp Thr Pro Glu Thr Leu Lys Gly Ser Asn Arg

65 70 75 80

Asn Leu Ile Ala Lys Tyr Glu Asn Val Tyr Ala Gln Lys Ala Lys Asp

85 90 95

Tyr Val Lys Asp Leu Ile Thr Lys Asn Asn His Val Val Tyr Val Lys

100 105 110

Lys Ile Thr Thr Asp Lys Tyr Asn Arg Thr Val Ala Ile Leu Tyr Leu

115 120 125

Thr Asn Asp Gln Thr Ser Lys Ser Val Asn Glu Leu Ile Val Glu Asn

130 135 140

Gly Tyr Gly Ala Val Arg Tyr Ile Ser Leu Thr Asn Lys Thr Tyr Lys

145 150 155 160

Val Lys Asp Asp Phe Gln Arg Asp Phe Tyr Phe Arg Leu Leu Asn Leu

165 170 175

Gln Glu Glu Ala Lys Ser Lys Ser Leu Asn Ile Trp Glu His Asp Leu

180 185 190

Lys Asp Val Tyr Tyr Lys Tyr Pro Phe Asn Asn Asp

195 200

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaggccatgg ctgatatcgg atccatggct aagctagact ttga 44

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgctcgagt gcggccgcaa gcttcttaac aattttcgta acagag 46

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctggtgccgc gcggcagcca tatggcaaaa gaaatagtat 40

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtggtggtgg tggtggtgct cttattcttc tacaactgt 39

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctggtgccgc gcggcagcca tatggcacgt gattatgatc 40

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtggtggtgg tggtggtgct catcttcatc tttatcctga atat 44

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctggtgccgc gcggcagcca tatcattatt aaaagggtat t 41

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtggtggtgg tggtggtgct ctcatttggc tttagtcaga a 41

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taatacgact cactataggg 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctagttatt gctcagcgg 19

Claims

1.一种重组表达载体，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含鸡滑液囊支原体EF-TU蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO:1所示的序列，所述重组表达载体为在T7terminator序列和lacoperator序列之间插入目的基因片段的pET-32a-EF-TU载体。

2.一种重组表达载体，其含有目的基因片段，目的基因片段包含鸡滑液囊支原体dnaK蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经过定点突变得到的如SEQ ID NO:4所示的序列，所述定点突变包括将示于SEQ ID NO:3的序列的第609位和第630位的碱基A均突变为G，所述重组表达载体为在T7terminator序列和lacoperator序列之间插入目的基因片段的pET-28a-dnaK载体。

3.一种重组表达载体，其含有目的基因片段，目的基因片段包含鸡滑液囊支原体EF-G蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经密码子优化得到如SEQ ID NO:6所示的序列，所述重组表达载体为在T7terminator序列和lacoperator序列之间插入目的基因片段的pET-28a-EF-G载体。

4.一种重组表达载体，其含有目的基因片段，所述的目的基因片段的序列为如SEQ IDNO:9所示的序列，所述序列为将SEQ ID NO:8序列的第669位的核苷酸A突变为G，并截去SEQID NO:8的序列的第1～105位的核苷酸所得，被截去的核苷酸用于编码Nuc2蛋白原始信号肽的第1～35位氨基酸，所述重组表达载体为在T7terminator序列和lacoperator序列之间插入目的基因片段的pET-28a-Nuc2载体。

5.一种包含权利要求1～4所述的重组表达载体表达的免疫原性组合物，其包括：由pET-32a-EF-TU载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:2所示的EF-TU蛋白，和由pET-28a-dnaK载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:5所示的dnaK蛋白，和由pET-28a-EF-G载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:7所示的EF-G蛋白，和由pET-28a-Nuc2载体表达并纯化得到的如SEQ ID NO:10所示的Nuc2蛋白，及药学上可接受的载体。

6.如权利要求1～4任一项所述的重组表达载体表达的抗原蛋白。

7.鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗，其包含权利要求5所述的免疫原性组合物，任选包含佐剂。

8.根据权利要求7所述的基因工程亚单位疫苗，所述佐剂为水包油包水型佐剂。

9.根据权利要求8所述的基因工程亚单位疫苗，所述佐剂为SummitP168佐剂，所述的基因工程亚单位疫苗为蛋白液和佐剂乳化后的混合液，蛋白液中EF-TU和dnaK和蛋白EF-G和Nuc2的质量比为1：1：1：1，蛋白液与佐剂的体积比为3：2。

10.如权利要求5所述的免疫原性组合物，或权利要求7～9任一项所述的基因工程亚单位疫苗在制备用于治疗或预防鸡滑液囊支原体感染的药物中的应用。

11.如权利要求6所述的抗原蛋白，在受试动物中诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的药剂的应用。