CN117427153A

CN117427153A - 一种截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白制备的疫苗及应用

Info

Publication number: CN117427153A
Application number: CN202310881020.3A
Authority: CN
Inventors: 赵战勤; 詹鹏飞; 薛云; 马艳杰; 关丽君; 杨金钱
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2023-07-18
Filing date: 2023-07-18
Publication date: 2024-01-23

Abstract

本发明提供了一种截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白制备的疫苗及应用，属于兽用生物制品技术领域。本发明涉及一种截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白制备的疫苗，试验表明本发明中所使用的截短SpaA蛋白（SpaA2）具有表达量高，稳定性好的优点，和佐剂混合后制备猪丹毒亚单位疫苗工艺简单，安全性良好，可以有效地抵抗猪丹毒丝菌的感染，为工业化生产猪丹毒亚单位疫苗奠定基础。

Description

一种截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白制备的疫苗及应用

技术领域

本发明涉及一种截短的猪丹毒丝菌SpaA重组蛋白制备的猪丹毒亚单位疫苗及应用，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

猪丹毒是猪的一种急性、热性传染病，临床表现为急性败血型、亚急性疹块型和慢性心内膜炎型，该病在世界范围内广泛存在和流行。在20世纪50–80年代，猪丹毒曾是危害我国养猪业的三大传染病(猪瘟、猪丹毒、猪肺疫)之一。20世纪90年代至21世纪初很少有猪丹毒病例的报道，曾一度被认为在我国已经消失，但2010年以来，猪丹毒又在我国多个省份发生。因此，该病是一种典型的“老病新发”性细菌传染病。

猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)是丹毒丝菌科丹毒丝菌属的一种革兰氏阳性的纤细小杆菌。根据菌体胞壁抗原的差异，通过琼扩试验可将猪丹毒丝菌分为28个血清型(1a、1b、2–26及N型)。不同血清型菌株之间毒力差异较大，其中1a和1b型的毒力较强。在20世纪50–80年代，我国流行的血清型主要为1a型及少量2型，但2010年以来的分离株均为1a型。

目前已经发现的猪丹毒丝菌的毒力因子及其潜在的毒力因子有表面保护性抗原(Spa)、3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)、胆碱结合蛋白B(CbpB)、神经氨酸酶、透明质酸酶、荚膜等。Spa是猪丹毒丝菌的重要保护性抗原，通过序列分析将猪丹毒丝菌表面保护性抗原蛋白(sueface protective antigen，Spa)可分为三种类型，分别是SpaA、SpaB和SpaC。

表面保护性抗原A(SpaA)基因大小为1881bp，编码626个氨基酸，蛋白分子量约为64ku–66ku，包含N端的免疫保护区域和C端的细胞结合区域，其N端前1–29个氨基酸为其信号肽区域(图1)。SpaA主要存在于1a、1b、2、5、8、9、12、15、16、17和N型等11个丹毒丝菌血清型中。多项研究表明单个SpaA蛋白就能保护免疫动物抵抗猪丹毒丝菌的致死性攻击，因此该蛋白被视为研发猪丹毒亚单位疫苗最有潜力的候选蛋白。但是，猪丹毒丝菌天然SpaA蛋白的表达量低，纯化难度大，稳定性差等问题限制了SpaA蛋白疫苗的进一步研究与开发。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种截短的猪丹毒丝菌SpaA重组蛋白(SpaA2)制备的猪丹毒亚单位疫苗。

同时，本发明还提供SpaA2蛋白在制备猪丹毒亚单位疫苗中的应用。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：

基因工程菌BL21/pET28a-SpaA2，分类命名为：Escherichia coli BL21/pET28a-SpaA2,保藏编号：CCTCC NO：M2023649，保藏日期：2023年04月27日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

猪丹毒亚单位疫苗，其抗原为SpaA2蛋白。所述SpaA2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，编码该蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明中基因工程菌BL21/pET28a-SpaA2(CCTCC NO：M2023649)接种于固体培养基(如LB)中纯化培养后，再接种于液体培养基(如LB)中增殖培养，培养液经(IPTG)诱导表达后，纯化蛋白后与佐剂乳化制成亚单位疫苗，该亚单位疫苗具有预防猪丹毒丝菌侵袭的效果。

本发明中一种截短的猪丹毒丝菌SpaA重组蛋白(SpaA2)制备的亚单位疫苗，具有抗原表达量高，抗原稳定性强(不容易降解)，对猪安全性良好，对猪保护效力强的特点，适用于大量生产和市场应用。

附图说明

图1为SpaA的抗原结构及其分段克隆表达示意图。

图2为重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。注：M，蛋白质Marker；A1U，SpaA1未经IPTG诱导的表达结果；A1I，SpaA1经IPTG诱导的表达结果；A1S，SpaA1经IPTG诱导超声破碎后上清；A1L，SpaA1经IPTG诱导超声破碎后菌体裂解物；SpaA2–SpaA7，按相同的方法标注；箭头指向目的蛋白表达的位置。

图3为重组蛋白在不同温度保存不同时间后的SDS-PAGE电泳图。注：0日，3张图来源于同一图片，重复放置是为了便于对比观察。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。本领域技术人员在权利要求的范围内做所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

本发明所述试剂如未特别说明，均购自商业渠道或为本领域的常规配制试剂。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1 7个SpaA抗原片段的克隆、表达及纯化

1.SpaA1–SpaA7抗原基因片段表达载体的构建

参考GenBank中登录的猪丹毒丝菌spaA抗原基因序列设计引物(见表1和图1)。以猪丹毒丝菌1a型HG-1株(保藏编号：CCTCC NO：M 2019684)的基因组为模板，PCR扩增spaA1基因片段(见图1)，利用DNA凝胶回收试剂盒回收spaA1的PCR产物，将回收的spaA1与pUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞构建重组质粒pUCm-SpaA1，将该重组质粒用BamHI/XhoI双酶切，克隆入经同样酶切处理的pET28a质粒中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞构建重组表达质粒pET28a-SpaA1，经测序鉴定正确后保存。按相同方法构建其他SpaA抗原基因片段SpaA2–SpaA7(见图1)的重组表达质粒pET28a-SpaA2–pET28a-SpaA7。

表1spaA抗原基因7个片段的PCR引物

2.SpaA1–SpaA7重组蛋白的诱导表达及纯化

将重组质粒pET28a-SpaA1转化大肠杆菌BL21感受态细胞(重组菌命名为BL21/pET28a-SpaA1)，挑取单菌落于含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养至对数生长期时(OD_600nm＝0.6–1.0)，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)37℃诱导培养4h，将菌液离心收集菌体，用原菌液1/40体积的PBS重悬菌体，在冰浴条件下进行超声裂解菌体，离心分离上清及沉淀，采用His6标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白，利用12％的SDS-PAGE分析其表达特性。按相同方法，将其他重组质粒pET28a-SpaA2–pET28a-SpaA7转化大肠杆菌BL21感受态细胞、诱导表达和纯化蛋白。

SDS-PAGE检测结果(见图2)显示，7个重组菌株经IPTG诱导表达后分别在约24ku、38ku、50ku、24ku、35ku、23ku、70ku处有明显的表达条带，将表达的重组蛋白分别命名为SpaA1–SpaA7。经Bio-Rad Quantity One Program软件分析，7个重组蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的19.42％、25.38％、23.96％、20.09％、17.44％、20.74％、19.22％。经His6标签蛋白纯化试剂盒纯化获得较纯的重组蛋白SpaA1–SpaA7。

实施例2SpaA1–SpaA7重组蛋白疫苗的制备

按照ISA201佐剂说明书，分别制备7个重组蛋白SpaA1–SpaA7的ISA201佐剂的亚单位疫苗。以重组蛋白SpaA1为例，制备方法如下。使用0.22μm孔径的滤膜将纯化的重组蛋白SpaA1过滤除菌，使用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定SpaA1蛋白的浓度，将SpaA1蛋白溶液的浓度调整至500μg/mL。使用高速匀浆机(10000r/min)将ISA201佐剂进行搅拌60s后，在继续搅拌状态下缓慢加入等体积SpaA1蛋白溶液(500μg/mL)，继续搅拌4–6min成为白色粘稠乳液，使疫苗中SpaA1蛋白终浓度为250μg/mL。按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。最后，定量分装，加盖密封，2～8℃保存。按相同的方法，制备其他6个重组蛋白SpaA2–SpaA7的ISA201佐剂亚单位疫苗。

实施例3SpaA1–SpaA7重组蛋白疫苗的小鼠免疫保护效力比较试验

将270只小鼠，随机均分为9组，30只/组，第1–7组分别皮下注射制备的SpaA1–SpaA7重组蛋白，第8组接种ISA201佐剂0.2mL为ISA201佐剂对照组，第9组注射无菌PBS为空白对照组(见表2)；21日后采用相同的方法进行二免。二免后14日，从9组小鼠中各取10只，每只腹腔注射约11LD₅₀(半数致死剂量，50％lethal dose)的猪丹毒丝菌HG-1株(对昆明小鼠的LD₅₀为692CFU)菌液0.2mL(含活菌7.1×10³CFU)；从各组剩余20只中各取10只腹腔注射约1.1×10³LD₅₀的HG-1株菌液0.2mL(含活菌7.1×10⁵CFU)；最后将各组剩余10只小鼠各腹腔注射约1.1×10⁵LD₅₀的HG-1株菌液0.2mL(含活菌7.1×10⁷CFU)。观察并记录小鼠的发病和死亡情况21日，统计分析7个SpaA重组蛋白亚单位疫苗的小鼠免疫保护率。

结果(见表2)显示，PBS对照组小鼠攻毒后均出现精神沉郁、食欲减退或废绝、蜷缩等症状，在21日观察期内均全部死亡。当使用11LD₅₀的猪丹毒丝菌HG-1株攻毒后，SpaA1、SpaA2、SpaA3、SpaA4和SpaA7疫苗组小鼠的保护率均为100％(10/10)，SpaA5和SpaA6的保护率分别为7/10和5/10；当使用约1.1×10³LD₅₀的HG-1株攻毒后，SpaA1、SpaA2、SpaA3和SpaA4疫苗组仍能得到100％的保护率，SpaA5和SpaA7的疫苗能提供部分保护，SpaA6疫苗的保护率为0；当使用约1.1×10⁵LD₅₀的HG-1株攻毒后，SpaA1、SpaA2和SpaA3疫苗组仍能得到100％的保护率，SpaA4疫苗能提供部分保护(4/10)；SpaA5、SpaA6和SpaA7疫苗的保护率均为0。这表明，SpaA1、SpaA2和SpaA3蛋白制备的疫苗对免疫小鼠具有很强的保护效力，SpaA4疫苗也具有较强的保护效力。

表2SpaA1–SpaA7重组蛋白疫苗的小鼠免疫保护效力比较试验结果

实施例4SpaA1–SpaA4重组蛋白疫苗的仔猪免疫保护效力比较试验

鉴于重组蛋白SpaA1、SpaA2、SpaA3和SpaA4在小鼠免疫保护试验中均表现出了良好的免疫保护效力，因此进一步对4个重组蛋白进行仔猪免疫保护效力比较试验评价。将30头仔猪随机均分为6组，5头/组。第1–4组分别颈部肌肉接种实施例2中制备的SpaA1疫苗、SpaA2疫苗、SpaA3疫苗和SpaA4疫苗(2mL/头)，第5、6组分别颈部肌肉注射无菌ISA201佐剂和PBS(2mL/头)作为对照组(见表3)；21日后用相同的方法进行二免。二免后14日，每头仔猪皮下注射约10MLD(最小致死剂量，minimum lethal dose)的猪丹毒丝菌HG-1株菌液1mL(含活菌量为2.1×10⁶CFU)。观察、记录其发病和死亡情况21日，统计分析4个重组蛋白亚单位疫苗的仔猪免疫保护率。

结果(见表3)显示，攻毒后ISA201佐剂对照组和PBS对照组仔猪出现精神沉郁，食欲减退或废绝，跛行，皮肤出现“打火印”样疹块等临床发病症状，且在21日的观察期内全部死亡。SpaA2疫苗组和SpaA3疫苗组仔猪均没有出现明显的发病和死亡情况，保护率均为100％(5/5)；SpaA1疫苗组有2头出现了轻微的发病症状，发病周期为4–5日，保护率为60％(3/5)。SpaA4疫苗组均出现了明显的发病症状，且有2头死亡，保护率为0。这表明，在四种蛋白疫苗中，SpaA2疫苗和SpaA3疫苗均能提供免疫仔猪针对猪丹毒丝菌致死性攻击的完全保护效力，SpaA1疫苗也具有一定的保护效力，SpaA4疫苗的保护效力较弱。

表3SpaA1–SpaA4重组蛋白疫苗的仔猪免疫保护效力比较试验结果

实施例5SpaA1–SpaA4重组蛋白亚单位疫苗的仔猪安全性比较试验

将25头3～4周龄仔猪随机均分为5组(5头/组)，用制备的SpaA1、SpaA2、SpaA3和SpaA4疫苗分别对1～4组仔猪通过颈部肌肉途径进行超剂量接种(4.0mL/头)。同时设立1组5头仔猪接种无菌PBS(0.0l mol/L、pH值7.2)为空白对照。观察、记录其精神、食欲状态、呕吐、腹泻，以及死亡情况。21日观察期结束后每组剖杀2头，检查接种部位的炎症、组织病变以及疫苗残留情况。

结果显示，仔猪一次超剂量接种重组蛋白SpaA1、SpaA2、SpaA3和SpaA4制备的猪丹毒亚单位疫苗后，精神、食欲、行为等表现均正常，无呕吐、腹泻、死亡等不良反应。观察期结束后，解剖观察各组试验仔猪免疫部位，疫苗组仔猪的免疫部位均无明显的疫苗残留、局部炎症和组织病变等现象，与对照组相比无明显差异。上述试验结果表明，重组蛋白SpaA1、SpaA2、SpaA3和SpaA4制备的猪丹毒亚单位疫苗对靶动物仔猪进行接种均是安全的。

实施例6SpaA1–SpaA4重组蛋白的稳定性比较试验

将2.0mL纯化的重组蛋白SpaA1、SpaA2、SpaA3和SpaA4，均分为5管(0.4mL/管)，从4种重组蛋白中各取1管进行SDS-PAGE分析；剩余4管分别放置在-20℃、4℃和25℃条件下保存，于7日、35日和63日后分别从4种重组蛋白中取1管进行SDS-PAGE分析；同时，另取浓度为1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL牛血清白蛋白溶液进行SDS-PAGE分析，以Alpha-Imager^TM 2200对图像进行定量分析，以BSA分析值和蛋白浓度建立回归曲线，再以回归曲线计算SpaA1、SpaA2、SpaA3和SpaA4蛋白的浓度。

结果(见图3和表4)显示，在-20℃、4℃和25℃三种条件下进行保存，SpaA1蛋白的降解速度均是最快的。SpaA1蛋白的初始浓度为753μg/mL，在-20℃条件下保存7日、35日和63日后的蛋白浓度分别为63μg/mL、47μg/mL和11μg/mL，为初始蛋白浓度的8.4％、6.2％和1.5％；在25℃条件下保存7日的蛋白浓度为22μg/mL，为初始浓度的2.9％，保存35日后完全降解为0。

在-20℃、4℃和25℃三种条件下进行保存，SpaA2蛋白的降解速度均是最慢的。SpaA2蛋白的初始浓度为1012μg/mL，在三种温度条件下保存63日后的蛋白浓度分别为707μg/mL、714μg/mL和721μg/mL，为初始蛋白浓度的69.9％、70.6％和71.2％，表明保存温度对SpaA2蛋白的稳定性影响较小，该蛋白稳定性良好。

将SpaA2和SpaA3蛋白进行比较分析，发现在-20℃条件下保存63日后，SpaA2和SpaA3蛋白的浓度分别是其初始蛋白浓度的70.7％和37.1％，两者比值为1.9倍；在4℃条件下保存63日后，分别是其初始蛋白浓度的71.4％和17.5％，两者比值为4.1倍；在25℃条件下保存63日后，分别是其初始蛋白浓度的71.2％和7.4％，两者比值为9.6倍。这表明，在-20℃、4℃和25℃三种条件下进行保存，SpaA2蛋白的稳定性均明显强于SpaA3蛋白，且随着保存温度的升高，差异更明显。

表4SpaA1–SpaA4重组蛋白的稳定性比较试验结果

良好的安全性、有效性和稳定性是一种优秀疫苗的重要特征。本发明制备了7个重组表达的猪丹毒丝菌SpaA抗原蛋白片段SpaA1–SpaA7的疫苗，通过小鼠免疫保护效力比较试验筛选出免疫保护效力较强的SpaA1–SpaA4蛋白疫苗，然后通过靶动物仔猪的免疫试验评价了SpaA1–SpaA4蛋白疫苗的安全性和保护效力，同时对SpaA1–SpaA4蛋白的稳定性进行了比较试验，最终筛选出最佳的猪丹毒丝菌SpaA2蛋白疫苗，该疫苗具有良好的安全性、有效性以及抗原稳定性，具有较大的应用价值。

Claims

1. 一种截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白在制备疫苗的应用，其特征在于：所述截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白为SpaA2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码SpaA2蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

3. 一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗是使用一种截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白作为抗原制备的；所述截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白为SpaA2，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

4.根据权利要求3所述的亚单位疫苗在制备猪丹毒病防控药物中的应用。