CN105602981B - 一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备方法及应用 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备方法及应用，包括以下步骤：1)扩增S1D基因、M基因；2)表达载体的构建；3)枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800感受态的制备及转化；4)蛋白的诱导表达；5)重组质粒稳定性试验；6)重组菌保存实验；7)疫苗的制备。实验结果表明，本发明所制备的重组菌能够引起机体产生有效的黏膜免疫反应，可作为安全有效的活菌疫苗防治猪流行性腹泻疾病。

Description

一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备 方法及应用
技术领域
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备方法及应用，属于预防兽医学防治领域。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种冬季多发的高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其对哺乳仔猪的危害最为严重，病死率平均为50％，给养猪业带来严重危害。
消化道是主要的传播途径，研究表明，给3日龄未吃初乳的仔猪口服接种PEDV后，22-36h后表现症状，透射电镜和免疫荧光证实，病毒在整段小肠和结肠绒毛的上皮细胞中复制，导致细胞变性、绒毛缩短、变形，绒毛长度和隐窝深度之比由正常的7:1减少到3:1，对养分吸收下降。PEDV在小肠上皮细胞内增殖还会导致分泌细胞的乳酸酶被破坏，二糖分解吸收下降，肠管渗透压升高，发酵异常，从而发生腹泻导致脱水，造成掉膘、降低饲料利用率，浪费药物和人力等所造成的经济损失是非常严重的。该病是世界性的疾病之一，亚洲、欧洲以及美洲等国家的许多猪阳性率都较高。
S基因编码的S纤突糖蛋白是PEDV的一个表面结构蛋白，含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞，并且拥有介导产生病毒中和抗体的抗原表位，是基因工程疫苗的首选基因。其中，PEDV S蛋白的S1区包含了病毒主要的中和表位和受体结合域。对S1蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选，选择具有较好免疫原性的S1D(636aa-789aa)线性表位作为目的基因扩增。
M蛋白是PEDV的膜糖蛋白，由226个氨基酸组成、分子质量为27KD～32KD，在病毒粒子的组装与出芽过程中具有重要作用。M蛋白由暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端区、病毒囊膜中大的C末端区和中间的α螺旋区三个结构域组成。M蛋白能介导机体产生α干扰素，在补体存在的条件下，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体能中和病毒的感染性，所以M蛋白可以作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原。
枯草芽孢杆菌是被公认的安全的微生物，与大肠杆菌表达系统相比，具有细胞壁不含内毒素、可直接将外源蛋白分泌至细胞外、没有明显的密码子偏好性等优点；与酵母表达系统相比较，枯草芽孢杆菌表达系统具有发酵周期短、没有明显的密码子偏好性、对培养基的要求低等优点。而且该菌不会进入体液循环，不产生菌血症，不垂直传播，因此对动物子代以及怀孕母猪是无毒副作用的。本产品针对特异性蛋白M做表达，不具有完整病毒感染细胞的能力，不会产生毒力返强的现象，相对更安全。
目前，PED发生率居高不下，发病的原因愈加复杂，且对PED并无特效治疗药物，一般对症治疗效果不佳，所以最好接种疫苗防止暴发。然而，市面上用于预防PEDV的商品化的疫苗主要为灭活苗和弱毒苗。灭活苗虽然安全稳定，但需要大剂量接种或应用浓缩抗原；免疫期短，常需强化接种；产生完全免疫力需要2周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用且灭活苗只能通过注射免疫，仔猪无法获得sIgA，保护效果不佳。而弱毒苗由于存在着成本高、易返祖、有潜在感染危险等缺陷，很难在实践中推广应用。传统疫苗在防治PED中暴露出越来越多的问题，已无法提供完全保护，研制一种新型可靠的疫苗迫在眉睫。
病毒性毒性腹泻的免疫机制中，黏膜免疫具有非常重要的作用。传统的非肠道输入的灭活疫苗不产生sIgA抗体，细胞介导免疫反应弱而且维持时间短。口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，并且避免了常规注射所引起的应激及疫苗吸收问题。
黏膜免疫途径主要的障碍是酶对抗原的降解、黏膜表面抗原的清除机制和抗原提呈细胞对抗原的低效提呈，所以亚单位口服疫苗如果能够一次性递呈较多抗原刺激机体，则产生较强免疫反应的可能性就较大。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种安全无毒并能刺激机体产生黏膜免疫反应的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法及应用。
本发明采用如下技术方案，包括以下步骤：
(1)扩增S1D基因、M基因
设计特异性引物分别扩增S1D基因、M基因分别连接pMD19-T载体，转化至DH5α感受态细胞中，挑阳性单克隆，菌液PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定以及测序鉴定正确。其中所使用的特异性扩增S1D和M基因的两对引物分别为:
M F:(CGGGATCC)ATGTCTAACGGTTCTATTCCCG，
R:(TCCCCCGGG)TTAGACTAAATGAAGCACTTTCTCAC；
S1D F:(CGGGATCC)ATGACTCTGGATGTGTGTACCAAG，
R:(TCCCCCGGG)(TTA)AATACTCATACTAAAGTTGGTGGGA。
(2)表达载体构建
将鉴定正确的S1D基因、M基因片段和pHT01表达载体、pHT43表达载体分别用QuikCut BamH Ⅰ和QuikCut Sma Ⅰ双酶切，经胶回收纯化后进行16℃过夜连接转化至DH5α感受态中，挑阳性单克隆，菌液PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定以及测序鉴定正确。其中pHT01载体能在胞内分泌目的蛋白，pHT43载体能在胞外分泌目的蛋白，胞内和胞外蛋白的双重作用能够确保一次灌服产生较强的免疫刺激。
(3)枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800感受态的制备及转化
用接种环挑取一满环枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800的菌液，划线，从单菌落中挑菌接于5ml GM Ⅰ溶液，在30℃100rpm振荡培养过夜；次日取2ml转接到18ml GM Ⅰ中，37℃200rpm培养3.5小时。再取10ml转接到90ml GM Ⅱ中，37℃100rpm培养90分钟，离心收集菌体；用10ml原培养液上清液悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞，可以直接用于转化；也可以加30％的灭菌甘油至终浓度10％，混匀后分装到离心管中，随即放-70℃保存。转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在500ul菌液中加入适量质粒DNA(1ug/ml)；于37℃80rpm缓慢振荡培养60min后取100ul培养液涂氯霉素抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。
(4)蛋白的诱导表达
挑取重组菌单菌落接入LB培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，37℃225rpm摇菌过夜，次日按照1％接种量转接于新鲜LB培养基中，37℃225rpm摇菌培养至OD600达到0.8时，加入IPTG诱导剂至终浓度为1mM，30℃225rpm继续培养12h后离心收集菌体，然后用配制的高浓度的SDS裂解液裂解细胞，进行SDS-PAGE蛋白检测实验：结果显示所表达的目的蛋白大约为27KD；SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用1％的BSA封闭，以兔抗PEDV多克隆抗体血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG的二抗与之反应，最后用DAB显色；Western blot鉴定重组蛋白具有与抗PED的多抗发生反应的能力，证明重组菌表达的外源蛋白具有良好的反应原性。
(5)重组质粒稳定性试验
a、无抗生素选择压力下重组质粒稳定性试验
将重组菌株于新鲜LB培养基中培养12h，取少量菌液稀释106倍，涂布含氯霉素的抗性平板，37℃温箱48h后数单菌落数。连续传100代(每12h为10代)，计算质粒丢失率。
试验结果表明，在无抗生素选择压力的情况下，重组质粒丢失较多，100代时丢失约50％。这与枯草芽孢杆菌排斥外源质粒的特性相符，也与质粒丢失率与质粒大小成正相关相符。考虑到工业上从初级种子液到最终发酵液之间传代不超过50代，因此该重组菌在无抗生素选择压力的情况下是可以满足工业需要的。
b、有抗生素选择压力下重组质粒稳定性试验
将重组菌株于含氯霉素(25ug/ml)新鲜LB培养基中培养12h，取少量菌液稀释106倍，涂布含氯霉素的抗性平板，37℃温箱48h后数单菌落数。连续传100代(每12h为10代)，计算质粒丢失率。
试验结果表明，在有抗生素选择压力的情况下，重组质粒丢失不多，能够比较稳定的遗传下去。
(6)重组菌保存实验
按照1：50的接种量从重组菌培养液中取菌液接种于含氯霉素的100ml LB培养基中；37℃225rpm培养至OD600＝1.0，与100ml含3％蔗糖和10％脱脂牛奶混合液混合均匀，分装为2ml/管，冻干；冻干后分别经过7天、14天、21天、30天、60天、90天进行菌体复苏并计数，结果显示活菌数均在108CFU/ml；
(7)疫苗的制备
取冻干好的菌粉，加入1ml的生理盐水，混合均匀，直接口服。
本发明猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法的有益效果是：可以口服，口服免疫的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能，满足这一要求的必须是活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。以细菌病毒为活载体系统可达到这一目的，枯草芽孢杆菌已作为多种病原的活载体系统进行外源蛋白的递呈并取得良好效果。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，可经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。
附图说明
图1：酶切鉴定结果图，泳道1：酶切鉴定pHT43-M，泳道2：酶切鉴定pHT01-M；
图2：酶切鉴定结果图，泳道1，2：酶切鉴定pHT01-M，泳道3：酶切鉴定pHT43-S1D；
图3：酶切鉴定结果图，泳道1：酶切鉴定pHT01-S1D；
具体实施方式
实施例1：制备猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗
1、扩增S1D基因、M基因
以CV777株为模板设计特异性引物对分别扩增S1D基因、M基因分别连接pMD19-T载体，转化至DH5α感受态中，挑阳性单克隆，菌液PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定以及测序鉴定正确；其中所使用的特异性扩增S1D和M基因的两对引物分别为:
M F:(CGGGATCC)ATGTCTAACGGTTCTATTCCCG，
R:(TCCCCCGGG)TTAGACTAAATGAAGCACTTTCTCAC；
S1D F:(CGGGATCC)ATGACTCTGGATGTGTGTACCAAG，
R:(TCCCCCGGG)(TTA)AATACTCATACTAAAGTTGGTGGGA。
2、表达载体构建
将鉴定正确的S1D基因、M基因片段和pHT01表达载体、pHT43表达载体分别用QuikCut BamH Ⅰ和QuikCut Sma Ⅰ双酶切下，经胶回收纯化后进行16℃过夜连接转化至DH5α感受态中，挑阳性单克隆，菌液PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定以及测序鉴定正确；其中pHT01载体能在胞内分泌目的蛋白，pHT43载体能在胞外分泌目的蛋白，胞内和胞外蛋白的双重作用能够确保一次灌服产生较强的免疫刺激。
3、枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800感受态的制备及转化
用接种环挑取一满环枯草800的菌液，划线，从单菌落中挑菌接于5ml GM Ⅰ溶液，在30℃100rpm振荡培养过夜；次日取2ml转接到18ml GM Ⅰ中，37℃200rpm培养3.5小时。再取10ml转接到90ml GM Ⅱ中，37℃100rpm培养90分钟，离心收集菌体；用10ml原培养液上清液悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞，可以直接用于转化；也可以加30％的灭菌甘油至终浓度10％，混匀后分装到离心管中，随即放-70℃保存。转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在500ul菌液中加入适量质粒DNA(1ug/ml)；于37℃缓慢振荡(80rpm)培养60min后取100ul培养液涂氯霉素抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子；
4、蛋白的诱导表达
挑取重组菌单菌落接入LB培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，37℃225rpm摇菌过夜，次日按照1％接种量转接于新鲜LB培养基中，37℃225rpm摇菌培养至OD600达到0.8时，加入IPTG诱导剂至终浓度为1mM，30℃225rpm继续培养12h后离心收集菌体，然后用配制的高浓度的SDS裂解液裂解细胞，进行SDS-PAGE蛋白检测实验：结果显示所表达的目的蛋白大约为27KD；SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用1％的BSA封闭，以兔抗PEDV多克隆血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG的二抗与之反应，最后用DAB显色；Western鉴定重组蛋白具有与抗PED的多抗发生反应的能力，证明重组菌表达的外源蛋白具有良好的反应原性。
5、重组质粒稳定性试验
无抗生素选择压力下重组质粒稳定性试验
将重组菌株于新鲜LB培养基中培养12h，取少量菌液稀释106倍，涂布含氯霉素的抗性平板，37℃温箱48h后数单菌落数。连续传100代(每12h为10代)，计算质粒丢失率。
试验结果表明，在无抗生素选择压力的情况下，重组质粒丢失较多，100代时丢失约50％。这与枯草芽孢杆菌排斥外源质粒的特性相符，也与质粒丢失率与质粒大小成正相关相符。考虑到工业上从初级种子液到最终发酵液之间传代不超过50代，因此该重组菌在无抗生素选择压力的情况下是可以满足工业需要的。
有抗生素选择压力下重组质粒稳定性试验
将重组菌株于含氯霉素(25ug/ml)新鲜LB培养基中培养12h，取少量菌液稀释106倍，涂布含氯霉素的抗性平板，37℃温箱48h后数单菌落数。连续传100代(每12h为10代)，计算质粒丢失率。
试验结果表明，在有抗生素选择压力的情况下，重组质粒丢失不多，能够比较稳定的遗传下去。
6、重组菌保存实验
按照1：50的接种量从重组菌培养液中取菌液接种于含氯霉素的100ml LB培养基中；37℃225rpm培养至OD600＝1.0，与100ml含3％蔗糖和10％脱脂牛奶混合液混合均匀，分装为2ml/管，冻干；冻干后分别经过7天、14天、21天、30天、60天、90天进行菌体复苏并计数，结果显示活菌数均在108CFU/ml(见表1)。
表1：重组菌保存实验
Figure BDA0000944119180000061
Figure BDA0000944119180000071
7、疫苗的制备
取冻干好的菌粉，加入1ml的生理盐水，混合均匀，直接口服。
实施例2：组合口服疫苗对非靶动物的免疫效力试验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物 30只4周龄的的清洁级Balb/c小鼠，购自青岛某公司。
1.1.2试验药品 实验室制备的3批重组疫苗产品，稀释后检测活菌数为3.0×109/ml。
1.2试验方法
1.2.1免疫接种试验
30只4周龄的的清洁级Balb/c小鼠，分为3组，每组10只，即重组菌组，空菌对照组，生理盐水对照组，重组菌组每只小鼠口服组合重组菌0.4ml，约3.0×109/ml，空菌对照组口服空菌0.4ml，约3.0×109/ml。对照组口服0.4ml灭菌生理盐水。
免疫程序：免疫3次，每隔一周加强免疫一次，每次连续免疫3d，每天1次。
1.2.2样品采集与处理
分别于第一次免疫后18d、32d、38d、46d、60d收集免疫小鼠新鲜粪便样品。-70℃冻存备用。
粪便样品处理：每0.1g粪便加入1ml粪便提取液，置于振荡器上，振荡30min充分混匀，4℃浸润过夜。10000r/min离心10min，收集上清作为检测样品。
1.2.3免疫小鼠粪便sIgA测定
采用间接ELISA检测试剂盒进行检测。
2结果
由表2显示的实验数据可以分析出，组合口服疫苗在连续3次免疫小鼠后产生了明显的特异性sIgA抗体。抗体水平明显高于空菌对照和生理盐水对照(P﹤0.05)，组合口服疫苗免疫32d检测时sIgA抗体水平达到最大值，之后下降。并且空菌对照和生理盐水对照组之间抗体水平并无明显差异。
表2：实验小鼠粪便sIgA抗体水平检测
Figure BDA0000944119180000072
Figure BDA0000944119180000081
实施例3：组合口服疫苗对靶动物的安全性试验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物 仔猪由山东某猪场提供。
1.1.2试验药品 实验室制备的3批重组疫苗产品，稀释后检测活菌数为3.0×109个/ml。
1.2试验方法
本试验共采用了三批实验室制品，由于试验条件和场地限制，以下所有试验都是在不同时间分别独立进行。试验用仔猪的生产母猪为猪流行性腹泻阴性猪，试验期间保证仔猪正常吃奶。
1.2.1单剂量安全性试验
7日龄仔猪80头，分为4组，每组20头。试验组3组(注射三批重组枯草芽孢杆菌疫苗制品)，生理盐水对照1组。试验组每头灌服重组枯草芽孢杆菌1ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，灌服一次后，连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻等不良症状出现，并对成活率、增重等生产性能进行统计。
1.2.2单剂量重复安全性试验
7日龄仔猪80头，分为4组，每组20头。试验组3组(注射三批重组枯草芽孢杆菌疫苗制品)，生理盐水对照1组。试验组每头灌服重组枯草芽孢杆菌1ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，每天1次，连用7天，自第一天用药后连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻等不良症状出现，并对成活率、增重等生产性能进行统计。
1.2.3超剂量安全性试验
7日龄仔猪80头，分为4组，每组20只。试验组3组(灌服三批重组枯草芽孢杆菌疫苗制品)，生理盐水对照1组。试验组每头灌服重组枯草芽孢杆菌2ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，灌服1次后，连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻等不良症状出现，并对成活率、增重等生产性能进行统计。
2结果
各试验组仔猪在灌服重组枯草芽孢杆菌后，连续14天观察仔猪的反应，未观察到腹泻、食欲不振等不良症状，所有试验仔猪均健康存活，体重增加且略高于对照组同日龄仔猪体重。试验结束后各试验组随机挑选3头剖杀，观察剖检变化，各组仔猪剖检的组织和器官与生理盐水对照组基本无差别。证明仔猪对该组合疫苗无不良反应，该疫苗可应用为安全的组合口服疫苗来防治猪流行性腹泻病。
实施例4：组合口服疫苗对靶动物的免疫试验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物 21日龄的商品用仔猪，购自山东省青岛市某猪场。
1.1.2试验药品 实验室制备的3批重组疫苗产品，稀释后检测活菌数为3.0×109个/ml。
1.2试验方法
分组及免疫接种：14头仔猪随机分为2组，每组7头。对仔猪进行采血，用ELISA检测方法检测母源抗体，排除母源抗体干扰。免疫组每头仔猪每次灌服组合口服疫苗1头份，约3亿活菌，对照组每次灌服等剂量的无菌生理盐水。免疫3次，每隔一周加强免疫一次，每次连续免疫3d，每天1次。分别于最后一次免疫后的7d、14d、21d、28d对每头猪进行采血，测血液中抗体含量。并每天对仔猪的精神状态、食欲、被毛状况、粪便、体温等指标进行观察及统计。
2结果
由表6的实验数据可以分析出，组合口服疫苗在连续3次免疫仔猪后产生的抗体IgG水平明显高于生理盐水对照(P﹤0.05)，在免疫21d检测时抗体IgG水平达到最大值，之后下降。
表6：猪免疫实验分组及免疫接种
Figure BDA0000944119180000091
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
Figure BDA0000944119180000101
Figure BDA0000944119180000111
Figure IDA0000944119260000011
Figure IDA0000944119260000021

Claims (6)

1.一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗，其特征在于：所述口服疫苗包括B.subtilisWB800/pHT01-M，B.subtilisWB800/pHT01-S1D，B.subtilisWB800/pHT43-M和B.subtilis WB800/pHT43-S1D的组合，其中，M基因的序列为SEQ ID NO.1，S1D基因的序列为SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)扩增S1D基因、M基因；
(2)表达载体构建；
(3)枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800感受态的制备及转化；
(4)蛋白的诱导表达；
(5)重组质粒稳定性试验；
(6)重组菌保存实验；
(7)疫苗的制备，取冻干好的菌粉，加入1ml的生理盐水，混合均匀，直接口服；
其中，所述步骤(1)扩增S1D基因、M基因的步骤为：设计特异性引物分别扩增S1D基因、M基因分别连接pMD19-T载体，转化至DH5α感受态细胞中，挑阳性单克隆，菌液PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定以及测序鉴定正确，其中所使用的特异性扩增S1D和M基因的两对引物分别为:
M F:(CGGGATCC)ATGTCTAACGGTTCTATTCCCG，
R:(TCCCCCGGG)TTAGACTAAATGAAGCACTTTCTCAC；
S1D F:(CGGGATCC)ATGACTCTGGATGTGTGTACCAAG，
R:(TCCCCCGGG)(TTA)AATACTCATACTAAAGTTGGTGGGA；
所述步骤(2)表达载体构建方法为：将鉴定正确的S1D基因、M基因片段和pHT01表达载体、pHT43表达载体分别用QuikCut BamHⅠ和QuikCut SmaⅠ双酶切下，经胶回收纯化后进行16℃过夜连接转化至DH5α感受态中，挑阳性单克隆，菌液PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定以及测序鉴定正确，其中pHT01载体能在胞内分泌目的蛋白，pHT43载体能在胞外分泌目的蛋白，胞内和胞外蛋白的双重作用能够确保一次灌服产生较强的免疫刺激。
3.根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800感受态的制备及转化步骤为：用接种环挑取一满环枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800的菌液，划线，从单菌落中挑菌接于5ml GMⅠ溶液，在30℃100rpm振荡培养过夜；次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃200rpm培养3.5小时。再取10ml转接到90ml GMⅡ中，37℃100rpm培养90分钟，离心收集菌体；用10ml原培养液上清液悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞；转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在500ul菌液中加入质粒DNA至1ug/ml；于37℃80rpm缓慢振荡培养60min后取100ul培养液涂氯霉素抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。
4.根据权利要求2或3所述的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于所述蛋白的诱导表达方式为：挑取重组菌单菌落接入LB培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，37℃225rpm摇菌过夜，次日按照1％接种量转接于新鲜LB培养基中，37℃225rpm摇菌培养至OD600达到0.8时，加入IPTG诱导剂至终浓度为1mM，30℃225rpm继续培养12h后离心收集菌体，然后用配制的高浓度的SDS裂解液裂解细胞，进行SDS-PAGE蛋白检测实验，并用Western鉴定重组蛋白免疫反应原性。
5.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于所述重组质粒稳定性试验为：
a、无抗生素选择压力下重组质粒稳定性试验
将重组菌株于新鲜LB培养基中培养12h，取少量菌液稀释106倍，涂布含氯霉素的抗性平板，37℃温箱48h后数单菌落数，连续传100代，计算质粒丢失率；
b、有抗生素选择压力下重组质粒稳定性试验
将重组菌株于含25ug/ml氯霉素新鲜LB培养基中培养12h，取少量菌液稀释106倍，涂布含氯霉素的抗性平板，37℃温箱48h后数单菌落数，连续传100代，计算质粒丢失率。
6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于所述重组菌保存实验为：按照1：50的接种量从重组菌培养液中取菌液接种于含氯霉素的100ml LB培养基中；37℃225rpm培养至OD600＝1.0，与100ml含3％蔗糖和10％脱脂牛奶混合液混合均匀，分装为2ml/管，冻干。
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