CN107190014B - Pedv m基因和s1基因串联重组质粒的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法，选择PEDV流行毒株的基因组为模版，分别针对S1基因和M基因的主要抗原位点，设计特异性引物，以PET32a为表达载体，设计特异的酶切位点，构建S1基因和M基因的串联重组质粒。该串联重组质粒可以体外同时重组表达S1蛋白和M蛋白的主要抗原位点，该发明可为PEDV基因工程疫苗的研发提供重要的基础。

Description

PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法。
背景技术
猪流行性腹泻是由流行性腹泻病毒（PEDV）感染所引起的肠道传染性疾病，以食欲下降、呕吐、腹泻和脱水为主要的临床症状。近年来，由于毒株发生变异，该病对哺乳仔猪造成了极大的危害，其感染率可达100%，这无论是给我国的养猪业还是养殖户都带来了很大的影响。目前对该疾病并无相当有效的药物进行治疗。
PEDV属于冠状病毒属，含有5个开放阅读框（ORF），编码4种主要的结构蛋白。S蛋白是病毒粒子表面的纤突蛋白，主要参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，并能诱导宿主产生中和抗体。但根据近年来的研究发现，S蛋白在受到宿主免疫选择的压力下易发生变异，导致宿主范围和毒力发生改变。有相关文献表明，2010年在我国已免疫的猪群中爆发的该病是由变异的PEDV毒株引发，且变异主要集中在S蛋白。因此，PEDV- S基因的变异可能是导致PED疫苗免疫效果不佳的原因。
PEDV另一主要结构蛋白M蛋白是冠状病毒外膜最主要的成分, 它的一级结构域对于装配是非常重要的。M蛋白为跨膜蛋白，较为保守，能间接诱导宿主а–干扰素的表达，并能够刺激机体产生相应的抗体，在补体存在条件下可中和病毒。因此，M蛋白可作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原。
基因工程疫苗的开发将是防控该病的一个重要的方向。因此，本发明选择PEDV最新流行毒株的基因组为模版，分别针对S1基因和M基因的主要抗原位点，设计特异性引物，以PET32a为表达载体，设计特异的酶切位点，构建S1基因和M基因的串联重组质粒。该串联重组质粒可以体外同时重组表达S1蛋白和M蛋白的主要抗原位点，该发明可为PEDV基因工程疫苗的研发提供重要的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
参照NCBI中已发表的PEDV M基因序列( KX253991.1 )和S基因序列（KU363118.1 ），采用Primer 7.0 软件设计特异性引物如下（带有下划线的为酶切位点），由上海生物工程有限公司合成。
M-F：CGGGATCC ATGTCTAACGGTTCTATTCC （BamH I）
M-R：GCGTCGAC TTAGACTAAATGAAGCACT（Sal I）
该引物扩增片段大小697bp；
S-F：5´-GCAAGCTTATGAGCCAACTCAAGTGTT-3´（HindIII）
S-R：5´-ATGCGGCCGCAACACCTGCCAAAAAGC-3´（NotId）
该引物扩增片段大小为639bp。
PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法，具体包括如下步骤：
（1）提取病毒RNA；
（2）M基因和S1基因的PCR扩增：病毒RNA反转录为cDNA，经PCR扩增目的基因；PCR扩增的目的基因产物进行琼脂糖凝胶电泳后，将含目的基因片段的胶切割，胶回收试剂盒纯化目的基因；
（3）重组M蛋白表达质粒的构建与鉴定：将M基因PCR产物和pET-32a质粒分别经BamH I和Sal I双酶切后，T4连接酶4℃过夜连接，接着转化到DH-5а感受态细胞，涂于加有氨苄的LB培养基，第二天挑取培养板中的菌落进行PCR鉴定，并提取质粒进行酶切鉴定，M蛋白重组表达质粒命名为pET-32a-M；
（4）分别用HindIII和NotId酶对S1基因的胶回收产物和M蛋白重组表达质粒pET-32a-M进行双酶切反应；将双酶切胶回收产物的目的基因片段和M蛋白重组表达质粒，过夜连接；将过夜连接后的串联重组质粒，转化到DH5α感受态细胞，37℃ 200r/m震荡孵育过夜；利用所述的2对引物进行PCR鉴定。
本发明的优点在于：
1.把PEDV 的两个和中和抗体形成有关的基因串联进同一个表达载体，该重组质粒诱导表达时可同时进行两个蛋白的表达。该结果为PDEV基因工程疫苗的研发提供重要的基础。
2.减少体外获得PEDV M蛋白和S1蛋白的时间和降低生产成本。
附图说明
图1 M基因和S1基因的PCR扩增结果；A: M基因的PCR扩增结果; B: S1基因的PCR扩增结果。
图2 M蛋白重组表达质粒的PCR和酶切鉴定结果；A: M蛋白重组表达质粒PCR鉴定结果；M: 2000bp DNA分子质量标准，1M蛋白基因上、下游引物的扩增产物，2: M蛋白基因上游+T7下游引物的扩增产物，3:M蛋白基因下游+T7上游引物的扩增产物，4: M蛋白基因上+下游引物的扩增产物；B：PCR酶切鉴定结果，M：DNA分子质量标准，1：双酶切，2：BamH I单酶切，3：SalI 单酶切，4：空质粒。
图3 串联重组质粒PCR和酶切鉴定结果；A: 串联重组质粒PCR鉴定结果M：DL2000DNA Marker 1:S1基因的上游+下游，2：S1基因的上游+T7的下游，3：S1基因的下游+T7的上游，4：T7的上游+T7的下游；B: 串联重组质粒酶切鉴定结果，M：DNA分子质量标准，1：串联质粒，2：M质粒，3：S1基因的单酶切，4：M基因的双酶切，5：S1基因双酶切，6：M（上）+S1（下）双酶切。
具体实施方式
实施例1
１ 材料与方法
1.1 病毒及表达载体
表达载体：pET-32a(+)（购自Promega北京生物技术有限公司）；克隆和表达宿主菌：DH5α和E.coli BL 21 (DE3) 感受态细胞（购自Promega北京生物技术有限公司）。
1.2 主要试剂和仪器
主要仪器：DL777 型PCR仪(北京东林生物技术公司)、TG16-W微量高速离心机（维尔康湘鹰离心机有限公司）、ZHWY-103D恒温培养振荡器（智城分析仪器制造有限公司）、DYY16D 电泳仪(北京六一生物技术有限公司)、Bio-Rad凝胶成像分析系统（美国Bio-rad公司）。
主要试剂：2000bpDNALadder（天根生化科技有限公司）、病毒RNA提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）、反转录试剂盒（普洛麦格北京生物技术有限公司)、琼脂糖凝胶DNA快速回收试剂盒（购自北京康为世纪生物技术公司）、EcoR I QuickCut 和Not IQuickCut限制酶、高纯度质粒小提中量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（购自博士德生物技术有限公司）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、PageRuler Prestained ProteinLadder（10～120 ku）、SuperSignal West Pico化学发光底物（购自赛默飞世尔科技公司）。
1.3 病毒RNA的提取
将PEDV阳性病料用碾磨器充分磨碎，反复冻融3次后12000r/min离心5分钟，取上清，根据病毒RNA提取试剂盒说明书提取RNA，于-80℃保存。
引物设计与合成
参照NCBI中已发表的PEDV M基因序列( KX253991.1 )和S1基因序列（KU363118.1 ），采用Primer 7.0 软件设计特异性引物如下（带有下划线的为酶切位点），由上海生物工程有限公司合成。
M-F：CGGGATCC ATGTCTAACGGTTCTATTCC （BamH I）；
M-R：GCGTCGAC TTAGACTAAATGAAGCACT （Sal I）；
该引物扩增片段大小697bp；
S-F：5´-GCAAGCTTATGAGCCAACTCAAGTGTT-3´（HindIII）；
S-R：5´-ATGCGGCCGCAACACCTGCCAAAAAGC-3´（NotId）；
该引物扩增片段大小为639bp。
基因和S1基因的PCR扩增
病毒RNA反转录为cDNA，经PCR扩增目的基因。PCR扩增的目的基因产物进行琼脂糖凝胶电泳后，将含目的基因片段的胶切割，胶回收试剂盒纯化目的基因。
重组M蛋白表达质粒的构建与鉴定
将M基因PCR产物和pET-32a质粒分别经BamH I和Sal I双酶切后，T4连接酶4℃过夜连接，接着转化到DH-5а感受态细胞，涂于加有氨苄的LB培养基，第二天挑取培养板中的菌落进行PCR鉴定，并提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒送至生工生物有限公司进行测序。M蛋白重组表达质粒命名为pET-32a-M。
串联表达M+S1重组质粒的构建与鉴定
1.7.1目的基因和载体pet-32a-M的双酶切
分别用HindIII和NotId酶对S1基因的胶回收产物和M蛋白重组表达质粒pET-32a-M进行双酶切反应，81℃ 灭活30min。琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化目的条带。
1.7.2串联重组质粒的连接
将双酶切胶回收产物的目的基因片段和M蛋白重组表达质粒，按照载体：目的基因=1:7进行4℃过夜连接。
1.7.3转化
将过夜连接后的串联重组质粒，转化到DH5α感受态细胞，37℃ 200r/m震荡孵育过夜。
串联重组质粒pET-32a-S1-M PCR鉴定
挑取至少3个大小不同的白色的单克隆菌落，分别用2对引物进行PCR鉴定，分别为目的基因（F、R）、T7（F、R）、目的基因（F）+T7（R）、目的基因（R）+T7（F），琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1.7.5串联重组质粒pET-32a-S1-M的酶切鉴定
将PCR鉴定正确的阳性单克隆菌扩大培养，用质粒中量提取试剂盒提取串联重组质粒，分别进行单、双酶切的鉴定。
1.7.6串联重组质粒pET-32a-S1-M的测序鉴定
提取pET-32a-S1-M串联重组质粒10ul质粒送至上海生物工程技术公司测序,测序结果进行比对分析。
结果与分析
2.1 PEDV-M基因的PCR扩增结果
琼脂糖凝胶电泳结果表明， M基因引物可以特异地扩增到一条大小约为697bp的特异性条带（如图1A），S基因可以特异地扩增到一条大小约为639bp的特异性条带（如图1B），与预期的片段大小相符。
蛋白重组表达质粒的鉴定结果
挑选以白色单克隆菌，分别用目的基因上、下游引物，目的基因上游引物和T7下游引物，目的基因下游引物和T7上游引物，T7上、下游引物(T7-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；T7-R：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’）对阳性克隆菌落进行PCR鉴定，结果显示分别在697、805、1272和1380bp处得到相应的目的条带（图2A）。PCR鉴定后，提取重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果（如图2B）显示连入目的片段的重组质粒相对于空质粒的位置较高，且双酶切后多出一条大小约为697bp大小的片段，与预期片段大小一致，表明PEDV M蛋白已成功克隆至pET-32a载体，进一步通过测序结果验证质粒的成功构建无移码的错误。
2.3串联重组表达质粒的鉴定
挑选以白色单克隆菌，分别为目的基因（F、R）、T7（F、R）、目的基因（F）+T7（R）、目的基因（R）+T7（F）进行PCR鉴定，结果显示分别在639bp、844bp、1943bp和2086bp处得到相应的目的条带（如图3A）。 PCR鉴定后，提取重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果（如图3B）显示连入目的片段的串联重组质粒相对于只连入M基因的重组质粒位置较高，单酶切后显示的条带位置和预期的一样，分别用BamH I和Sal I、Hind III和NotＩ对串联重组的质粒进行双酶切，在697bp和639bp的位置上得到目的片段，同时ＢamＨＩ＋ＮotＩ进行酶切，在1330bp的位置上出现了特异条带，和预期的片段大小一样。因此，鉴定结果表明PEDV Ｓ1蛋白已成功插入至pET-32a-Ｍ重组质粒上。测序结果进一步证明，串联重组质粒（pET-32a-Ｓ1 -M）成功构建。
以载体T7通用引物进行PCR并测序，结果表明，M基因和1S基因的序列均在重组质粒pET-32a-S1-M 上，表明串联质粒pET-32a-S1-M构建成功。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgggatccat gtctaacggt tctattcc 28
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgtcgactt agactaaatg aagcact 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaagcttat gagccaactc aagtgtt 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgcggccgc aacacctgcc aaaaagc 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taatacgact cactataggg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (1)

1.PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法，其特征在于：选择PEDV流行毒株的M基因序列 KX253991.1和S基因序列KU363118.1为模版，分别针对S1基因和M基因的主要抗原位点，设计特异性引物，以PET32a为表达载体，设计特异的酶切位点，构建S1基因和M基因的串联重组质粒；
所述引物如下：
M-F：CGGGATCCATGTCTAACGGTTCTATTCC ；
M-R：GCGTCGAC TTAGACTAAATGAAGCACT ；
该引物扩增片段大小697bp；
S1-F：5´-GCAAGCTTATGAGCCAACTCAAGTGTT-3´；
S1-R：5´-ATGCGGCCGCAACACCTGCCAAAAAGC-3´；
该引物扩增片段大小为639bp；
具体包括如下步骤：
（1）提取病毒RNA；
（2）M基因和S1基因的PCR扩增：病毒RNA反转录为cDNA，经PCR扩增目的基因；PCR扩增的目的基因产物进行琼脂糖凝胶电泳后，将含目的基因片段的胶切割，胶回收试剂盒纯化目的基因；
（3）重组M蛋白表达质粒的构建与鉴定：将M基因PCR产物和pET-32a质粒分别经BamH I和Sal I双酶切后，T4连接酶4℃过夜连接，接着转化到DH-5а感受态细胞，涂于加有氨苄的LB培养基，第二天挑取培养板中的菌落进行PCR鉴定，并提取质粒进行酶切鉴定，M蛋白重组表达质粒命名为pET-32a-M；所述PCR鉴定引物为M-F/M-R与T7-F/T7-R；
（4）分别用HindIII和NotId酶对S1基因的胶回收产物和M蛋白重组表达质粒pET-32a-M进行双酶切反应；将双酶切胶回收产物的目的基因片段和M蛋白重组表达质粒，过夜连接；将过夜连接后的串联重组质粒，转化到DH5α感受态细胞，37℃ 200r/m震荡孵育过夜；利用2对引物进行PCR鉴定,利用BamH I和Sal ，IHindIII和NotId酶进行酶切鉴定；所述2对引物为S1-F/S1-R与T7-F/T7-R；所述T7-F/T7-R引物如下：T7-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；T7-R：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。
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