CN113583113A - 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法 - Google Patents
一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113583113A CN113583113A CN202011635459.0A CN202011635459A CN113583113A CN 113583113 A CN113583113 A CN 113583113A CN 202011635459 A CN202011635459 A CN 202011635459A CN 113583113 A CN113583113 A CN 113583113A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chain antibody
- variable region
- antibody
- pedv
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 13
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims description 6
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 claims description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 14
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 abstract description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 abstract description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单链抗体及其制备方法。使用小鼠来源的抗PEDV单克隆杂交瘤细胞，扩增IgG抗体的重链可变区和重链可变区序列，经linker相连，克隆进原核表达载体pET‑32a，单链抗体的氨基酸序列如所示SEQ ID No.2所示。经IPTG诱导表达、亲和层析纯化得到的单链抗体分子量约为29kDa，ELISA显示单链抗体可特异性识别PEDV，假病毒中和试验显示单链抗体可在细胞水平上中和PEDV假病毒感染PK15细胞的能力。抗PEDV单链抗体有望中和PEDV在仔猪体内的感染活性，阻断病毒在仔猪群中的传染。
Description
技术领域
本发明属于抗体工程的技术领域，具体涉及一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒科冠状病毒属。不同年龄段和品种的猪感染PEDV可引起急性传染性疾病，主要临床症状为水样腹泻、呕吐和脱水，2周龄以内的仔猪感染PEDV极容易引起脱水死亡，死亡率高达100％。1952年，Doyle等确定了病原体PEDV，随后在世界各地陆陆续续发现了该病毒，现已成为世界性的猪急性传染病。近年来，PEDV在我国有进一步流行的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行，给生猪养殖业带来极大损失，一定程度上推高了猪肉价格，影响到了民众的生活成本。PEDV在猪呼吸道、十二指肠、回肠和空肠中均可检测到，可经粪便和鼻腔分泌物排出并传染，猪感染PEDV后免疫力显著下降，对其它细菌性感染的抵抗力显著减弱。目前该病毒感染的主要预防手段是接种疫苗，包括灭活疫苗和减毒活疫苗。妊娠母猪经口、鼻、肌肉和乳腺内接种疫苗可产生乳汁免疫，我国哈尔滨兽医研究所研制的PEDV和猪流行性腹泻的二联细胞培养灭活疫苗具有一定免疫效果，但仍不能百分比保护仔猪不被PEDV感染致病或致死。
现有预防手段主要是针对母猪进行疫苗接种，而无法直接刺激仔猪的免疫系统，由于仔猪的免疫系统未发育完全，不能产生针对PEDV的主动免疫，因此直接给仔猪提供抗体等被动免疫措施尤为重要。例如专利公开的抗PEDV的单链抗体及其制备方法，采集抗PEDV 血清抗体阳性的仔猪白细胞，获得抗体重链可变区和轻链可变区序列。但是通过猪源抗体获得序列存在下列缺陷：仔猪感染PEDV后死亡率接近100％，很少有存活仔猪产生抗体；从仔猪血液中分离白细胞获得抗体序列，无法鉴定对PEDV具有高亲和力和特异性的抗体。
单链抗体是利用基因工程的办法将抗体的重链可变区和轻链可变区通过一个多肽linker相连，能够特异性结合病毒并中和病毒感染性，单链抗体的分子量较小、穿透能力强于完整抗体，且来源于单克隆抗体的单链抗体具有高亲和力和特异性的特点，在仔猪体内能够中和病毒，适用于给仔猪提供即刻被动免疫，保护仔猪不被病毒感染致病。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠来源的抗PEDV单链抗体，单链抗体可特异性识别PEDV，从而有望中和PEDV的感染活性，阻断PEDV 在仔猪群中的传染，同时还提供了一种利用大肠埃希菌原核表达可溶性抗PEDV单链抗体的制备方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，所述单链抗体具有如SEQ IDNo.1所示的核酸序列以及如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述单链抗体具有如SEQ IDNo.3所示抗体重链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No.4所示抗体轻链可变区的氨基酸序列，以及位于重链可变区和轻链可变区之间的linker氨基酸序列。
SEQ ID No.1核酸序列展示如下
GGTACCGACGACGACGACAAGCAGGTGCAGCTGCAGCAG CAGGGCGCGGAACTGGTGCGCCCGGGCAGCAGCGTGAAACTG AGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTGCCGCATTTACCAGCTGGCTCAT GCATTGGGTGAAACAGCGCCCGACTCAGGGCCTGGAATGGCTG GGCAACCACGAACCGAGCGATACTGACAGCCATTATAACCAGA AATTTAAAGATAAAGTGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAG CACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCAGACCAGCGAAGATACC GCGGTGTATTATTGCGGCCGCCGCACCAACTATGAATTCGCGCA TATATGGTATTTTGATGTGTGGGGCGCGGGCACCACCGTGACCG TGAGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTG GCGGTGGTTCTGATATTGTGATGACCCAGAGCAGCTACAGCCTG GCGGTGAGCCTGAATCAGCGCGCGACCGGCAGCTGCCGCGCGAGCCATAAAGTGGAAACCGTGCTCTCACACAGCCCCATGCAGC GCTATCAGCAGAAATTACGATCACAGCCGCCGAAACTGCTGCA CTATCACCGCACTCCTATCGATAACGTGGAAAGCGGCGTGCCGG CGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATAACAGCCTGAA CATTCATCCGGTGGATGAAGATACCGCGATGTATTATTGCCAGAA AAAGCACTTAAGCCGTGAATATCAGTTTGGCGGCGGCACCAGC CTGGAAATTAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
SEQ ID No.2氨基酸序列展示如下：
QVQLQQQGAELVRPGSSVKLSCKASGFAAFTSWLMHWVKQ RPTQGLEWLGNHEPSDTDSHYNQKFKDKVTLTVDKSSSTAYMQL SSQTSEDTAVYYCGRRTNYEFAHIWYFDVWGAGTTVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSDIVMTQSSYSLAVSLNQRATGSCRASHKVETVLS HSPMQRYQQKLRSQPPKLLHYHRTPIDNVESGVPARFSGSGSGTD NSLNIHPVDEDTAMYYCQKKHLSREYQFGGGTSLEIKLEHHHHH H
SEQ ID No.3抗体重链可变区的氨基酸序列展示如下：
QVQLQQQGAELVRPGSSVKLSCKASGFAAFTSWLMHWVKQ RPTQGLEWLGNHEPSDTDSHYNQKFKDKVTLTVDKSSSTAYMQL SSQTSEDTAVYYCGRRTNYEFAHIWYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID No.4抗体轻链可变区的氨基酸序列展示如下：
DIVMTQSSYSLAVSLNQRATGSCRASHKVETVLSHSPMQRYQ QKLRSQPPKLLHYHRTPIDNVESGVPARFSGSGSGTDNSLNIHPVD EDTAMYYCQKKHLSREYQFGGGTSLEIK
所述单链抗体的核酸序列中包含限制性酶切位点Kpn I和Xho I， Kpn I酶切位点为GGTACC，Xho I酶切位点为CTCGAG。
优选的，所述单链抗体中的氨基酸序列C端为一个6×His纯化标签，序列为HHHHHH。
所述单链抗体中的包含载体和宿主菌，所述载体为原核表达载体，所述宿主菌为大肠埃希菌E.coli BL21 gold(DE3)。
一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒单链抗体的制备方法，具体制备步骤如下：
S01：采用RT-PCR法从抗猪流行性腹泻病毒的小鼠单克隆杂交瘤细胞中扩增编码抗体基因的重链可变区与轻链可变区序列；
S02：人工合成scFv序列，包括重链可变区核酸序列VH、连接肽序列linker、轻链可变区核酸序列VL以及5’端酶切位点Kpn I和3’端酶切位点Xho I，序列如SEQ ID No.1所示；
S03：利用Kpn I和Xho I双酶切scFv片段和pET-32a载体，将scFv片段克隆进pET-32a载体中，得到原核表达载体pET-32a-scFv。
S04：步骤(S03)的pET-32a-scFv载体转化感受态大肠埃希菌E. coliBL21 gold(DE3)中，构建原核表达宿主菌；
S05：用IPTG诱导步骤(S04)的原核表达宿主菌表达分泌型单链抗体，从上清中经Ni-NTA亲和层析分离纯化单链抗体；
S06：纯化抗体经肠激酶切割，去掉促进可溶性表达的硫氧还蛋白(Trx)标签，得到不含Trx的单链抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过RT-PCR从抗PEDV的小鼠单克隆杂交瘤细胞中扩增抗体的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)，人工合成经 linker连接的VH和VL，并克隆进原核表达载体pET-32a。25℃下IPTG 诱导宿主菌E.coli BL21 gold(DE3)表达可溶性scFv。经超声破碎后，用Ni-NTA亲和层析从细菌上清中分离scFv。ELISA证明scFv可特异性识别PEDV；本发明通过利用抗PEDV的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区序列构建了单链抗体，特异性和亲和力优于抗体库筛选出的单链抗体，单链抗体有望中和PEDV的感染活性，阻断PEDV 在仔猪群中的传染。
以下将结合附图与具体的实施例对本发明进行详细的解释说明。
附图说明
图1为PCR扩增的重链可变区和轻链可变区核酸电泳图；
图2为pET-32a-scFv载体的双酶切(KpnI与XhoI)鉴定示意图；
图3为IPTG诱导E.coli表达scFv的SDS-PAGE电泳鉴定图；
图4为肠激酶切割后并经分离纯化的scFv电泳图；
图5为肠激酶切割和分子排阻凝胶层析纯化的scFv单洗脱峰示意图；
图6为ELISA证明抗PEDV scFv特异性结合PEDV示意图；
图7为抗PEDV scFv中和PEDV假病毒感染PK15细胞示意图；
图8为抗PEDV scFv中和PEDV假病毒感染PK15细胞数量增量变化示意图；
具体实施方式
实施例中采用的各种试剂、耗材和试验材料均购自商业公司，各试验方法均为试剂盒说明书所述方法。试验各步骤的中间产物和终产物均经过重复试验证明可重复。按照本发明陈述的试验方法，可以获得本发明各步骤所涉及的中间产物和终产物。实施例中的定量检测试验均为三次重复试验取平均值。
以下所有实施例将参照附图1-8所示，限制性内切酶Kpn I和Xho I、DNA纯化试剂盒、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒为Takara公司的产品。DNAmarker DL2000为Invitrogen公司的产品。PEDV毒株、pET-32a载体、E.coliBL21 gold(DE3)和小鼠抗PEDV杂交瘤细胞为安徽九川生物科技有限公司实验室保存。
实施例1是鼠源性抗PEDV单链抗体的制备。
(2)培养单克隆杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(Takara公司) 提取总RNA。以提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Takara 公司)反转录为cDNA。根据GenBank公布的鼠源性单克隆抗体的重 链可变区序列和轻链可变区序列设计引物，扩增鼠源性抗PEDV单克 隆抗体的重链可变区和轻链可变区。引物由深圳华大基因公司合成。
(2)培养单克隆杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(Takara公司) 提取总RNA。以提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Takara 公司)反转录为cDNA。根据GenBank公布的鼠源性单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列设计引物(表1)，扩增鼠源性抗 PEDV单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。引物由深圳华大基因公司合成。
(3)抗体重链可变区和轻链可变区的扩增
以cDNA为模板，扩增重链可变区的引物为VHF GAGGTGAAGCTTCTCGAGTC，VHRTGAGGAGACGGTGACCGTGG；扩增轻链可变区的引物为VLF CTGCTGCTCTGGGTTCC，VLRGAAGATGGATACAGTTGGTGC。 PCR反应体系为：PCRmix 2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，Forward引物0.5μl，Reverse引物0.5μl，cDNA 1μl，PCR缓冲液2μl和13μl H2O。扩增程序为：95℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。DNA纯化试剂盒回收PCR 扩增产物。经PCR扩增得到如SEQ ID No.5所示重链可变区核酸序列以及如SEQ IDNo.6所示轻链可变区核酸序列。
(4)上海生工生物工程股份有限公司合成scFv序列，由重链可变区核酸序列VH、连接肽序列linker、轻链可变区核酸序列VL以及 5’端酶切位点Kpn I和3’端酶切位点Xho I，完整序列如SEQ ID No.1 所示。限制性内切酶Kpn I和Xho I同时对pET-32a载体和合成的scFv 序列双酶切，酶切体系为：1μl Kpn I，1μl Xho I，2μl 10×缓冲液， 10μl scFv和6μlH2O；1μl Kpn I，1μl Xho I，2μl 10×缓冲液，2μl pET-32a和14μl H2O。37℃水浴酶切2h。使用DNA纯化试剂盒回收 scFv片段和载体的酶切产物。scFv片段与pET-32a相连，连接体系为：5μl scFv片段，1μl载体酶切产物，1μl T4连接酶，1μl连接缓冲液，2μl H2O。16℃水浴连接1h。连接产物转化感受态E.coliBL21 gold(DE3)。挑取单菌落，通过PCR和测序鉴定确定pET-32a载体中正确插入scFv的克隆，命名为pET-32a-scFv。
(5)单链抗体的诱导表达
E.coli BL21菌株接种200ml氨苄青霉素LB培养基中，37℃、 220rpm振荡培养至OD600约等于0.6，加入IPTG至终浓度1mM，继续30℃、220rpm振荡培养过夜(约8小时)。8000rpm离心收集菌体，PBS清洗两次。加入超声破碎缓冲液：50mM Tris-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl、0.5％Triton-X 100、pH 8.0，冰浴中超声破碎。破碎后离心12000rpm、4℃、30min。丢弃裂解产物，保留上清。
(6)单链抗体的纯化
使用Ni-NTAHisband(Merck)纯化上清中的scFv。上清经0.45 μm滤膜过滤，加入Ni2+柱，流穿液重复加入Ni2+柱一次，加入结合缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0)，加入一个柱体积的漂洗缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM 咪唑，pH8.0)，清洗非特异性结合蛋白质至A280接近零，再加入 20ml洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、200mM咪唑， pH 8.0)洗脱单链抗体，收集洗脱液，每管1ml。
(7)使用AKTA蛋白纯化系统(GE Healthcare)和分子排阻凝胶层析纯化上述洗脱液中的scFv。收集洗脱液，在Tris-HCl pH 8.0 缓冲液中透析，超滤浓缩至蛋白质浓度约为0.5mg/ml。
(8)肠激酶切割
0.5mg蛋白(0.5mg/ml)与1U重组肠激酶(Solarbio)在25℃水浴中共孵育过夜，酶切去除Trx标签；酶切产物按照上述步骤(6) 和步骤(7)纯化切割的scFv，并透析浓缩，得到纯化的scFv，分子量约为29kDa。
实施例2是小鼠来源的抗PEDV单链抗体的鉴定。
(1)ELISA鉴定单链抗体结合PEDV的特异性；
用PEDV和对照TGEV病毒原液(100μl/孔)包被96孔板，设置缓冲液包被的空白对照孔，4℃湿盒包被过夜。第二天弃去包被液，每孔加200μl脱脂牛奶封闭液，37℃下封闭2h。弃去封闭液，PBST 洗两遍，加入倍比稀释的抗PEDV scFv(32、16、8、4、2、1μg/ml)， 37℃湿盒孵育1h。弃去scFv，0.5％PBST洗两遍，加100μl HRP标记的小鼠抗His tag IgG二抗(1:2000)，37℃湿盒孵育1h。弃去二抗， PBST洗两遍，加入TMB显色底物，每孔100μl，37℃避光孵育15min，加1M H2SO4终止显色反应。用酶标仪(BioTek)读取波长450nm 的吸光度。
假病毒中和试验鉴定单链抗体对PEDV的中和活性；
利用慢病毒系统pLP构建PEDV S蛋白的假病毒， pLP-PEDV-GFP表达GFP荧光蛋白，用于定性检测假病毒感染靶细胞PK15细胞(猪肾细胞系)的活性；pLP-PEDV-luciferase表达荧光素酶报告基因，用于定量检测假病毒感染PK15细胞的活性。
猪PK15细胞(104/孔)接种于96孔板，5％CO2，37℃培养过夜，第二天形成细胞单层；100μl假病毒pLP-PEDV-GFP/luciferase (103感染单位/孔)与梯度稀释的抗PEDV scFv(1、0.1、0.01、0.001 μg/ml)在37℃共孵育1h，然后加入PK15细胞中，100μl/孔，37℃感染24h后弃去，更换DMEM+10％FCS培养基继续培养48h；使用PEDV免疫的小鼠血清作为中和试验的阳性对照(1:1000稀释)，阴性对照孔不加抗血清或scFv；在荧光显微镜下观察PK15细胞表达的GFP，定性评价scFv中和假病毒感染PK15细胞的活性；96孔板中加入荧光素酶底物，室温下反应10min，利用化学发光仪检测PK15 细胞表达的荧光素酶，定量评价scFv中和假病毒感染PK15细胞的活性。
上述结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID No.1所示的核酸序列以及如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述单链抗体具有如SEQ ID No.3所示抗体重链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No.4所示抗体轻链可变区的氨基酸序列，以及位于重链可变区和轻链可变区之间的linker氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的的一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体中的核酸序列中包含限制性酶切位点Kpn I和Xho I，Kpn I酶切位点为GGTACC，Xho I酶切位点为CTCGAG。
3.根据权利要求1所述的的一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列C端为一个6×His纯化标签，序列为HHHHHH。
4.根据权利要求1所述的的一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体中的载体和宿主菌，所述载体为原核表达载体，所述宿主菌为大肠埃希菌E.coliBL21 gold(DE3)。
5.一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒单链抗体的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：
S01：采用RT-PCR法从抗猪流行性腹泻病毒的单克隆杂交瘤细胞中扩增编码抗体基因的重链可变区与轻链可变区；
S02：人工合成scFv序列，包括重链可变区核酸序列VH、连接肽序列linker、轻链可变区核酸序列VL以及5’端酶切位点Kpn I和3’端酶切位点Xho I，序列如SEQ ID No.1所示；
S03：利用Kpn I和Xho I双酶切scFv片段和pET-32a载体，将scFv片段克隆进pET-32a载体中，得到原核表达载体pET-32a-ScFv。
S04：步骤(S03)的pET-32a-ScFv载体转化感受态大肠埃希菌E.coliBL21 gold(DE3)中，构建原核表达宿主菌；
S05：用IPTG诱导步骤(S04)的原核表达宿主菌表达分泌型单链抗体，从上清中经Ni-NTA亲和层析分离纯化得到单链抗体；
S06：纯化抗体经肠激酶切割，去掉促进可溶性表达的硫氧还蛋白(Trx)标签，得到不含rx的单链抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011635459.0A CN113583113B (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011635459.0A CN113583113B (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113583113A true CN113583113A (zh) | 2021-11-02 |
| CN113583113B CN113583113B (zh) | 2023-02-03 |
Family
ID=78237984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011635459.0A Active CN113583113B (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113583113B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116217714A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-06-06 | 华中农业大学 | 一种全猪源pedv单克隆抗体及其抗原表位 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105440132A (zh) * | 2014-08-07 | 2016-03-30 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| CN105906712A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-08-31 | 河南农业大学 | 抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体及其制备方法 |
| CN106243219A (zh) * | 2016-08-04 | 2016-12-21 | 上海交通大学 | 一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及其制备方法 |
| CN106632670A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-05-10 | 上海交通大学 | 一种猪源性抗猪传染性胃肠炎病毒的单链抗体及其制备方法 |
-
2020
- 2020-12-31 CN CN202011635459.0A patent/CN113583113B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105440132A (zh) * | 2014-08-07 | 2016-03-30 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| CN105906712A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-08-31 | 河南农业大学 | 抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体及其制备方法 |
| CN110128533A (zh) * | 2016-06-28 | 2019-08-16 | 河南农业大学 | 抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体及其制备方法 |
| CN106243219A (zh) * | 2016-08-04 | 2016-12-21 | 上海交通大学 | 一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及其制备方法 |
| CN106632670A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-05-10 | 上海交通大学 | 一种猪源性抗猪传染性胃肠炎病毒的单链抗体及其制备方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116217714A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-06-06 | 华中农业大学 | 一种全猪源pedv单克隆抗体及其抗原表位 |
| CN116217714B (zh) * | 2022-10-14 | 2024-03-15 | 华中农业大学 | 一种全猪源pedv单克隆抗体及其抗原表位 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113583113B (zh) | 2023-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108680744B (zh) | 一种检测新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用 | |
| EP2670847A1 (en) | Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria | |
| CN107176977B (zh) | 牛支原体MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鉴别中的应用 | |
| CN109867727B (zh) | 一种flagellin-fiber2融合蛋白、其制备方法和应用 | |
| CN112125961B (zh) | 牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗及其鉴定方法 | |
| CN110128533B (zh) | 抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体及其制备方法 | |
| US11958883B2 (en) | Recombinant canine parvovirus 2a VP2 and 2b VP2 antigen protein, and use thereof | |
| CN113637056A (zh) | 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒 | |
| CN113583113B (zh) | 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法 | |
| CN106939042B (zh) | 一种猪α干扰素及其应用 | |
| CN108956985B (zh) | 一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用 | |
| CN113444743A (zh) | 含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法 | |
| JP7213507B2 (ja) | 組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質及びその用途 | |
| CN112812177B (zh) | 一种鼠源性抗猪传染性胃肠炎病毒的单链抗体及其制备方法 | |
| CN108982847B (zh) | 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法 | |
| US11957743B2 (en) | Streptococcus suis (S. suis) vaccine | |
| CN102746397A (zh) | 一种鸡源性抗鸡新城疫病毒p蛋白的单链抗体zl2、其制备方法及其用途 | |
| CN114213532B (zh) | 高亲和力的抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体的制备及其应用 | |
| CN115850501A (zh) | 非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用 | |
| CN108693357B (zh) | 一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用 | |
| CN113861277A (zh) | 一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用 | |
| KR20160076416A (ko) | 바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 바실러스 세레우스 검출용 매개체 | |
| CN107190014B (zh) | Pedv m基因和s1基因串联重组质粒的构建方法 | |
| CN117164705B (zh) | 一种靶向h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体 | |
| CN113564192B (zh) | 蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体、重组菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 4th Floor, Incubation Building, No. 35 Hengshan Road, Economic and Technological Development Zone, Wuhu City, Anhui Province, 241000 Patentee after: ANHUI JIUCHUAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 241000 No. 101 and 102, D Park, science and innovation center, Wuhu District, China (Anhui) pilot Free Trade Zone, Jiujiang District, Wuhu City, Anhui Province Patentee before: ANHUI JIUCHUAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region before: China |