CN113583113A - 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单链抗体及其制备方法。使用小鼠来源的抗PEDV单克隆杂交瘤细胞，扩增IgG抗体的重链可变区和重链可变区序列，经linker相连，克隆进原核表达载体pET‑32a，单链抗体的氨基酸序列如所示SEQ ID No.2所示。经IPTG诱导表达、亲和层析纯化得到的单链抗体分子量约为29kDa，ELISA显示单链抗体可特异性识别PEDV，假病毒中和试验显示单链抗体可在细胞水平上中和PEDV假病毒感染PK15细胞的能力。抗PEDV单链抗体有望中和PEDV在仔猪体内的感染活性，阻断病毒在仔猪群中的传染。

Description

一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法
技术领域
本发明属于抗体工程的技术领域，具体涉及一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒科冠状病毒属。不同年龄段和品种的猪感染PEDV可引起急性传染性疾病，主要临床症状为水样腹泻、呕吐和脱水，2周龄以内的仔猪感染PEDV极容易引起脱水死亡，死亡率高达100％。1952年，Doyle等确定了病原体PEDV，随后在世界各地陆陆续续发现了该病毒，现已成为世界性的猪急性传染病。近年来，PEDV在我国有进一步流行的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行，给生猪养殖业带来极大损失，一定程度上推高了猪肉价格，影响到了民众的生活成本。PEDV在猪呼吸道、十二指肠、回肠和空肠中均可检测到，可经粪便和鼻腔分泌物排出并传染，猪感染PEDV后免疫力显著下降，对其它细菌性感染的抵抗力显著减弱。目前该病毒感染的主要预防手段是接种疫苗，包括灭活疫苗和减毒活疫苗。妊娠母猪经口、鼻、肌肉和乳腺内接种疫苗可产生乳汁免疫，我国哈尔滨兽医研究所研制的PEDV和猪流行性腹泻的二联细胞培养灭活疫苗具有一定免疫效果，但仍不能百分比保护仔猪不被PEDV感染致病或致死。
现有预防手段主要是针对母猪进行疫苗接种，而无法直接刺激仔猪的免疫系统，由于仔猪的免疫系统未发育完全，不能产生针对PEDV的主动免疫，因此直接给仔猪提供抗体等被动免疫措施尤为重要。例如专利公开的抗PEDV的单链抗体及其制备方法，采集抗PEDV 血清抗体阳性的仔猪白细胞，获得抗体重链可变区和轻链可变区序列。但是通过猪源抗体获得序列存在下列缺陷：仔猪感染PEDV后死亡率接近100％，很少有存活仔猪产生抗体；从仔猪血液中分离白细胞获得抗体序列，无法鉴定对PEDV具有高亲和力和特异性的抗体。
单链抗体是利用基因工程的办法将抗体的重链可变区和轻链可变区通过一个多肽linker相连，能够特异性结合病毒并中和病毒感染性，单链抗体的分子量较小、穿透能力强于完整抗体，且来源于单克隆抗体的单链抗体具有高亲和力和特异性的特点，在仔猪体内能够中和病毒，适用于给仔猪提供即刻被动免疫，保护仔猪不被病毒感染致病。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠来源的抗PEDV单链抗体，单链抗体可特异性识别PEDV，从而有望中和PEDV的感染活性，阻断PEDV 在仔猪群中的传染，同时还提供了一种利用大肠埃希菌原核表达可溶性抗PEDV单链抗体的制备方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，所述单链抗体具有如SEQ IDNo.1所示的核酸序列以及如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述单链抗体具有如SEQ IDNo.3所示抗体重链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No.4所示抗体轻链可变区的氨基酸序列，以及位于重链可变区和轻链可变区之间的linker氨基酸序列。
SEQ ID No.1核酸序列展示如下
GGTACCGACGACGACGACAAGCAGGTGCAGCTGCAGCAG CAGGGCGCGGAACTGGTGCGCCCGGGCAGCAGCGTGAAACTG AGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTGCCGCATTTACCAGCTGGCTCAT GCATTGGGTGAAACAGCGCCCGACTCAGGGCCTGGAATGGCTG GGCAACCACGAACCGAGCGATACTGACAGCCATTATAACCAGA AATTTAAAGATAAAGTGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAG CACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCAGACCAGCGAAGATACC GCGGTGTATTATTGCGGCCGCCGCACCAACTATGAATTCGCGCA TATATGGTATTTTGATGTGTGGGGCGCGGGCACCACCGTGACCG TGAGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTG GCGGTGGTTCTGATATTGTGATGACCCAGAGCAGCTACAGCCTG GCGGTGAGCCTGAATCAGCGCGCGACCGGCAGCTGCCGCGCGAGCCATAAAGTGGAAACCGTGCTCTCACACAGCCCCATGCAGC GCTATCAGCAGAAATTACGATCACAGCCGCCGAAACTGCTGCA CTATCACCGCACTCCTATCGATAACGTGGAAAGCGGCGTGCCGG CGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATAACAGCCTGAA CATTCATCCGGTGGATGAAGATACCGCGATGTATTATTGCCAGAA AAAGCACTTAAGCCGTGAATATCAGTTTGGCGGCGGCACCAGC CTGGAAATTAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
SEQ ID No.2氨基酸序列展示如下：
QVQLQQQGAELVRPGSSVKLSCKASGFAAFTSWLMHWVKQ RPTQGLEWLGNHEPSDTDSHYNQKFKDKVTLTVDKSSSTAYMQL SSQTSEDTAVYYCGRRTNYEFAHIWYFDVWGAGTTVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSDIVMTQSSYSLAVSLNQRATGSCRASHKVETVLS HSPMQRYQQKLRSQPPKLLHYHRTPIDNVESGVPARFSGSGSGTD NSLNIHPVDEDTAMYYCQKKHLSREYQFGGGTSLEIKLEHHHHH H
SEQ ID No.3抗体重链可变区的氨基酸序列展示如下：
QVQLQQQGAELVRPGSSVKLSCKASGFAAFTSWLMHWVKQ RPTQGLEWLGNHEPSDTDSHYNQKFKDKVTLTVDKSSSTAYMQL SSQTSEDTAVYYCGRRTNYEFAHIWYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID No.4抗体轻链可变区的氨基酸序列展示如下：
DIVMTQSSYSLAVSLNQRATGSCRASHKVETVLSHSPMQRYQ QKLRSQPPKLLHYHRTPIDNVESGVPARFSGSGSGTDNSLNIHPVD EDTAMYYCQKKHLSREYQFGGGTSLEIK
所述单链抗体的核酸序列中包含限制性酶切位点Kpn I和Xho I， Kpn I酶切位点为GGTACC，Xho I酶切位点为CTCGAG。
优选的，所述单链抗体中的氨基酸序列C端为一个6×His纯化标签，序列为HHHHHH。
所述单链抗体中的包含载体和宿主菌，所述载体为原核表达载体，所述宿主菌为大肠埃希菌E.coli BL21 gold(DE3)。
一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒单链抗体的制备方法，具体制备步骤如下：
S01：采用RT-PCR法从抗猪流行性腹泻病毒的小鼠单克隆杂交瘤细胞中扩增编码抗体基因的重链可变区与轻链可变区序列；
S02：人工合成scFv序列，包括重链可变区核酸序列VH、连接肽序列linker、轻链可变区核酸序列VL以及5’端酶切位点Kpn I和3’端酶切位点Xho I，序列如SEQ ID No.1所示；
S03：利用Kpn I和Xho I双酶切scFv片段和pET-32a载体，将scFv片段克隆进pET-32a载体中，得到原核表达载体pET-32a-scFv。
S04：步骤(S03)的pET-32a-scFv载体转化感受态大肠埃希菌E. coliBL21 gold(DE3)中，构建原核表达宿主菌；
S05：用IPTG诱导步骤(S04)的原核表达宿主菌表达分泌型单链抗体，从上清中经Ni-NTA亲和层析分离纯化单链抗体；
S06：纯化抗体经肠激酶切割，去掉促进可溶性表达的硫氧还蛋白(Trx)标签，得到不含Trx的单链抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过RT-PCR从抗PEDV的小鼠单克隆杂交瘤细胞中扩增抗体的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)，人工合成经 linker连接的VH和VL，并克隆进原核表达载体pET-32a。25℃下IPTG 诱导宿主菌E.coli BL21 gold(DE3)表达可溶性scFv。经超声破碎后，用Ni-NTA亲和层析从细菌上清中分离scFv。ELISA证明scFv可特异性识别PEDV；本发明通过利用抗PEDV的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区序列构建了单链抗体，特异性和亲和力优于抗体库筛选出的单链抗体，单链抗体有望中和PEDV的感染活性，阻断PEDV 在仔猪群中的传染。
以下将结合附图与具体的实施例对本发明进行详细的解释说明。
附图说明
图1为PCR扩增的重链可变区和轻链可变区核酸电泳图；
图2为pET-32a-scFv载体的双酶切(KpnI与XhoI)鉴定示意图；
图3为IPTG诱导E.coli表达scFv的SDS-PAGE电泳鉴定图；
图4为肠激酶切割后并经分离纯化的scFv电泳图；
图5为肠激酶切割和分子排阻凝胶层析纯化的scFv单洗脱峰示意图；
图6为ELISA证明抗PEDV scFv特异性结合PEDV示意图；
图7为抗PEDV scFv中和PEDV假病毒感染PK15细胞示意图；
图8为抗PEDV scFv中和PEDV假病毒感染PK15细胞数量增量变化示意图；
具体实施方式
实施例中采用的各种试剂、耗材和试验材料均购自商业公司，各试验方法均为试剂盒说明书所述方法。试验各步骤的中间产物和终产物均经过重复试验证明可重复。按照本发明陈述的试验方法，可以获得本发明各步骤所涉及的中间产物和终产物。实施例中的定量检测试验均为三次重复试验取平均值。
以下所有实施例将参照附图1-8所示，限制性内切酶Kpn I和Xho I、DNA纯化试剂盒、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒为Takara公司的产品。DNAmarker DL2000为Invitrogen公司的产品。PEDV毒株、pET-32a载体、E.coliBL21 gold(DE3)和小鼠抗PEDV杂交瘤细胞为安徽九川生物科技有限公司实验室保存。
实施例1是鼠源性抗PEDV单链抗体的制备。
(2)培养单克隆杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(Takara公司) 提取总RNA。以提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Takara 公司)反转录为cDNA。根据GenBank公布的鼠源性单克隆抗体的重 链可变区序列和轻链可变区序列设计引物，扩增鼠源性抗PEDV单克 隆抗体的重链可变区和轻链可变区。引物由深圳华大基因公司合成。
(2)培养单克隆杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(Takara公司) 提取总RNA。以提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Takara 公司)反转录为cDNA。根据GenBank公布的鼠源性单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列设计引物(表1)，扩增鼠源性抗 PEDV单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。引物由深圳华大基因公司合成。
(3)抗体重链可变区和轻链可变区的扩增
以cDNA为模板，扩增重链可变区的引物为VHF GAGGTGAAGCTTCTCGAGTC，VHRTGAGGAGACGGTGACCGTGG；扩增轻链可变区的引物为VLF CTGCTGCTCTGGGTTCC，VLRGAAGATGGATACAGTTGGTGC。 PCR反应体系为：PCRmix 2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，Forward引物0.5μl，Reverse引物0.5μl，cDNA 1μl，PCR缓冲液2μl和13μl H2O。扩增程序为：95℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。DNA纯化试剂盒回收PCR 扩增产物。经PCR扩增得到如SEQ ID No.5所示重链可变区核酸序列以及如SEQ IDNo.6所示轻链可变区核酸序列。
(4)上海生工生物工程股份有限公司合成scFv序列，由重链可变区核酸序列VH、连接肽序列linker、轻链可变区核酸序列VL以及 5’端酶切位点Kpn I和3’端酶切位点Xho I，完整序列如SEQ ID No.1 所示。限制性内切酶Kpn I和Xho I同时对pET-32a载体和合成的scFv 序列双酶切，酶切体系为：1μl Kpn I，1μl Xho I，2μl 10×缓冲液， 10μl scFv和6μlH2O；1μl Kpn I，1μl Xho I，2μl 10×缓冲液，2μl pET-32a和14μl H2O。37℃水浴酶切2h。使用DNA纯化试剂盒回收 scFv片段和载体的酶切产物。scFv片段与pET-32a相连，连接体系为：5μl scFv片段，1μl载体酶切产物，1μl T4连接酶，1μl连接缓冲液，2μl H2O。16℃水浴连接1h。连接产物转化感受态E.coliBL21 gold(DE3)。挑取单菌落，通过PCR和测序鉴定确定pET-32a载体中正确插入scFv的克隆，命名为pET-32a-scFv。
(5)单链抗体的诱导表达
E.coli BL21菌株接种200ml氨苄青霉素LB培养基中，37℃、 220rpm振荡培养至OD600约等于0.6，加入IPTG至终浓度1mM，继续30℃、220rpm振荡培养过夜(约8小时)。8000rpm离心收集菌体，PBS清洗两次。加入超声破碎缓冲液：50mM Tris-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl、0.5％Triton-X 100、pH 8.0，冰浴中超声破碎。破碎后离心12000rpm、4℃、30min。丢弃裂解产物，保留上清。
(6)单链抗体的纯化
使用Ni-NTAHisband(Merck)纯化上清中的scFv。上清经0.45 μm滤膜过滤，加入Ni2+柱，流穿液重复加入Ni2+柱一次，加入结合缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0)，加入一个柱体积的漂洗缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM 咪唑，pH8.0)，清洗非特异性结合蛋白质至A280接近零，再加入 20ml洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、200mM咪唑， pH 8.0)洗脱单链抗体，收集洗脱液，每管1ml。
(7)使用AKTA蛋白纯化系统(GE Healthcare)和分子排阻凝胶层析纯化上述洗脱液中的scFv。收集洗脱液，在Tris-HCl pH 8.0 缓冲液中透析，超滤浓缩至蛋白质浓度约为0.5mg/ml。
(8)肠激酶切割
0.5mg蛋白(0.5mg/ml)与1U重组肠激酶(Solarbio)在25℃水浴中共孵育过夜，酶切去除Trx标签；酶切产物按照上述步骤(6) 和步骤(7)纯化切割的scFv，并透析浓缩，得到纯化的scFv，分子量约为29kDa。
实施例2是小鼠来源的抗PEDV单链抗体的鉴定。
(1)ELISA鉴定单链抗体结合PEDV的特异性；
用PEDV和对照TGEV病毒原液(100μl/孔)包被96孔板，设置缓冲液包被的空白对照孔，4℃湿盒包被过夜。第二天弃去包被液，每孔加200μl脱脂牛奶封闭液，37℃下封闭2h。弃去封闭液，PBST 洗两遍，加入倍比稀释的抗PEDV scFv(32、16、8、4、2、1μg/ml)， 37℃湿盒孵育1h。弃去scFv，0.5％PBST洗两遍，加100μl HRP标记的小鼠抗His tag IgG二抗(1:2000)，37℃湿盒孵育1h。弃去二抗， PBST洗两遍，加入TMB显色底物，每孔100μl，37℃避光孵育15min，加1M H2SO4终止显色反应。用酶标仪(BioTek)读取波长450nm 的吸光度。
假病毒中和试验鉴定单链抗体对PEDV的中和活性；
利用慢病毒系统pLP构建PEDV S蛋白的假病毒， pLP-PEDV-GFP表达GFP荧光蛋白，用于定性检测假病毒感染靶细胞PK15细胞(猪肾细胞系)的活性；pLP-PEDV-luciferase表达荧光素酶报告基因，用于定量检测假病毒感染PK15细胞的活性。
猪PK15细胞(104/孔)接种于96孔板，5％CO2，37℃培养过夜，第二天形成细胞单层；100μl假病毒pLP-PEDV-GFP/luciferase (103感染单位/孔)与梯度稀释的抗PEDV scFv(1、0.1、0.01、0.001 μg/ml)在37℃共孵育1h，然后加入PK15细胞中，100μl/孔，37℃感染24h后弃去，更换DMEM+10％FCS培养基继续培养48h；使用PEDV免疫的小鼠血清作为中和试验的阳性对照(1:1000稀释)，阴性对照孔不加抗血清或scFv；在荧光显微镜下观察PK15细胞表达的GFP，定性评价scFv中和假病毒感染PK15细胞的活性；96孔板中加入荧光素酶底物，室温下反应10min，利用化学发光仪检测PK15 细胞表达的荧光素酶，定量评价scFv中和假病毒感染PK15细胞的活性。
上述结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID No.1所示的核酸序列以及如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述单链抗体具有如SEQ ID No.3所示抗体重链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No.4所示抗体轻链可变区的氨基酸序列，以及位于重链可变区和轻链可变区之间的linker氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的的一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体中的核酸序列中包含限制性酶切位点Kpn I和Xho I，Kpn I酶切位点为GGTACC，Xho I酶切位点为CTCGAG。
3.根据权利要求1所述的的一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列C端为一个6×His纯化标签，序列为HHHHHH。
4.根据权利要求1所述的的一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体中的载体和宿主菌，所述载体为原核表达载体，所述宿主菌为大肠埃希菌E.coliBL21 gold(DE3)。
5.一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒单链抗体的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：
S01：采用RT-PCR法从抗猪流行性腹泻病毒的单克隆杂交瘤细胞中扩增编码抗体基因的重链可变区与轻链可变区；
S02：人工合成scFv序列，包括重链可变区核酸序列VH、连接肽序列linker、轻链可变区核酸序列VL以及5’端酶切位点Kpn I和3’端酶切位点Xho I，序列如SEQ ID No.1所示；
S03：利用Kpn I和Xho I双酶切scFv片段和pET-32a载体，将scFv片段克隆进pET-32a载体中，得到原核表达载体pET-32a-ScFv。
S04：步骤(S03)的pET-32a-ScFv载体转化感受态大肠埃希菌E.coliBL21 gold(DE3)中，构建原核表达宿主菌；
S05：用IPTG诱导步骤(S04)的原核表达宿主菌表达分泌型单链抗体，从上清中经Ni-NTA亲和层析分离纯化得到单链抗体；
S06：纯化抗体经肠激酶切割，去掉促进可溶性表达的硫氧还蛋白(Trx)标签，得到不含rx的单链抗体。
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