CN105906712A - 抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体及其制备方法，属于生物技术领域。该单链抗体的重链可变区基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区基因序列如SEQ ID NO.2所示；其还包括猪抗体恒定区Fc段基因序列，序列如SEQ ID NO.3所示；重链可变区基因序列与轻链可变区基因序列由连接肽linker序列连接，序列如SEQ ID NO.4所示。本发明中scFv‑Fc的长度为1128bp，翻译成多肽链的分子量约为40kDa左右，是天然免疫球蛋白的1/4，分子量的减小能提高其在组织间的穿透性；Elisa结果显示scFv‑Fc可以对PEDV进行识别。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体，同时还涉及该抗体的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以不同年龄段猪的剧烈腹泻、呕吐和脱水等为特征的一种急性、高度接触性肠道传染病。针对PEDV的研究目前主要集中在利用基因工程手段克隆其纤突蛋白(S)、主要嵌膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，表达产物再作为保护性抗原免疫动物产生免疫应答。如公开的经典流行毒株CV777株和弱毒株ZJ08株(CN103725651A)、SD10株(CN103820399A)。再如，郑逢梅等应用RT-PCR方法，从腹泻仔猪样本中扩增得到1段PEDV，即河南地区流行毒株N基因全长序列，通过对其氨基酸序列的抗原性分析建立了特异性、灵敏性和可重复性良好的间接ELISA方法，可用于临床上PEDV抗体水平的监测和PED流行病学调查；满坤等以玉米为生物反应器，将PEDV主要中和抗原表位COE基因导入玉米自交系中，获得了高效表达PEDV-COE的转基因玉米稳定株系，表达产物具有显著的免疫原性；杨蓉将扩增出的长度501bp的COE抗原表位克隆入pET32a表达载体中，经诱导表达获得了纯度较高的重组蛋白；董丽娜等将PEDV-COE抗原基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149连接后，电击转入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞中，经诱导后PEDV部分S蛋白成功表达，并具有反应原性。在预防和治疗PED方面，研究主要集中在灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和联苗，如CN103060325A公开的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸及肽核酸PNA，CN104383528A公开的猪流行性腹泻灭活疫苗及其制备方法，CN104353069A公开的可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，CN104248762A公开的猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用，等等。
然而，现有手段均需要依赖刺激猪的免疫系统产生有效的免疫应答，而新生仔猪的免疫系统尚未发育健全，不能针对PEDV产生有效的免疫反应，主动免疫并不能保护仔猪的PEDV感染，这使得被动免疫在该病的防治中成为关键。如CN104788561A公开的抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其制备方法，CN105412923A公开的用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂及其制备方法，CN105440132A公开的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用，CN103705918A公开的抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法，等等。
单链抗体(signal chain fragment，scFv)是一种基因工程产品，其原理是利用基因重组的方法，将特异性抗体的重链和轻链可变区连接起来，形成一条多肽链，具有结合特异性抗原乃至中和病毒的能力。另外，Fc段还可决定动物的种属特异性，如人源化单链抗体在狂犬病防控中的应用。将scFv与不同动物源Ig的Fc段结合，有助于二聚体的形成，不仅可以延长scFv-Fc在体内的半衰期，而且可以激活补体依赖细胞毒反应(CDC)，与Fc受体结合可以激活抗体依赖细胞毒反应(ADCC)以及通过与Fc新生受体结合控制IgG的分解代谢，通过ADCC和CDC效应，吞噬免疫复合物介导抗原递呈，释放细胞因子和促炎症因子。
目前，国内外嵌合抗体的研究热点主要集中在人源化的单链抗体构建，已有商品化的含人抗体恒定区Fc段的表达载体，如InvivoGen的pFUSE-hIgG1-Fc1，就是将人类免疫球蛋白IgG1的Fc段构建成表达载体，通过将单链抗体scFv克隆入载体相应位点，经表达产生scFv和Fc融合的重组抗体。关于人源化单链抗体已有诸多报道，而猪源化或其他种属的类似表达载体尚未有商品化产品，也鲜有类似的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体。
同时，本发明还提供一种抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体的制备方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体，其重链可变区基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区基因序列如SEQ ID NO.2所示。
所述抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体还包括猪抗体恒定区Fc段基因序列，其序列如SEQ ID NO.3所示。
具体的，重链可变区基因序列与轻链可变区基因序列由连接肽linker序列连接，其序列如SEQ ID NO.4所示。
抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)构建BL21/pET28a-scFv-Fc
利用限制性内切酶SacI和SalI分别对载体pET28a和合成序列scFv-Fc(如SEQ ID NO.6所示，该序列带有SacI、SalI酶切位点)进行双酶切，电泳后胶回收目的片段，连接后转化BL21(DE3)，经鉴定得到BL21/pET28a-scFv-Fc；
2)制备猪源化单链抗体scFv-Fc
取BL21/pET28a-scFv-Fc扩大培养，诱导表达目的蛋白，即得。
步骤1)中双酶切可采用分步法双酶切，第一步酶切的反应体系为：10units/μL SacI 1μL，10×L Buffer 2μL，合成序列scFv-Fc或载体pET28a 1μg，dH2O补足20μL，37℃温育2h；回收酶切产物后进行第二步酶切，酶切反应体系为：10units/μL SalI 1μL，10×H Buffer 2μL，酶切产物1μg，dH2O补足20μL，37℃温育2h。
步骤2)中诱导采用IPTG，其终浓度为0.6mM，诱导温度37℃，时间8小时。
本发明的有益效果：
目前，猪流行性腹泻病毒的防治仍缺乏合适有效的防疫方法，在自然状态下，PEDV通过消化道感染小肠粘膜，这也就说明分泌型的免疫球蛋白对于预防该病毒的感染具有重要作用。为保护仔猪免受PEDV的感染，利用母乳提供被动免疫是一种有效的手段，然而为获得有效的母乳，如何接种抗原刺激母猪产生较高效价的抗体就成为了关键点。但不幸的是，在国内这种方法并不都能有效防止病毒感染。结合当下猪流行性腹泻病的流行趋势，单链抗体能表现出较高的病毒结合活性，使得新型抗体药物的研制成为新的研究方向。针对PEDV单链抗体的研究在国内鲜有报道，究其原因有三个方面，其一，该病毒在流行过程中常常出现变异，其二，该病毒的分离较为困难，其三，该病毒的抗体基因尚未公布，这也就造成在研究该病毒相应抗体的过程中出现较大的困难和盲点。
本发明利用多对引物，筛选出抗PEDV抗体的可变区基因，利用基因工程手段在体外将VH和VL进行重组，包含通用连接肽[(Gly)4Ser]3，构建成VH-[(Gly)4Ser]3-VL；与此同时，从猪脾脏中扩增出猪抗体恒定区Fc，与scFv构建成为嵌合抗体，长度为1128bp，翻译成多肽链的分子量约为40kDa左右，是天然免疫球蛋白的1/4，分子量的减小可以提高其在组织间的穿透性。根据Elisa结果初步判断原核表达的猪源化嵌合单链抗体scFv-Fc可以对PEDV进行识别，这就为发挥Fc段的功能奠定了基础。
附图说明
图1为pET28a和scFv-Fc双酶切电泳图；
图2为不同IPTG浓度诱导表达SDS-PAGE结果；
图3为不同诱导时间SDS-PAGE结果；
图4为不同诱导温度SDS-PAGE结果；
图5为镍柱洗脱曲线；
图6为目的蛋白透析流程图；
图7为Elisa鉴定单链抗体scFv-Fc与PEDV的结合活性；
图8为pET28a-scFv-Fc载体的构建流程示意图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体，其基因序列结构为VH-Linker-VL-Fc，序列如SEQ ID NO.5所示，其中重链可变区基因序列VH如SEQ ID NO.1所示，连接肽linker序列如SEQ ID NO.4所示，轻链可变区基因序列VL如SEQ ID NO.2所示，猪抗体恒定区Fc段基因序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2
抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)构建BL21/pET28a-scFv-Fc
包含有重链可变区基因序列VH(如SEQ ID NO.1所示)、连接肽linker序列(如SEQID NO.4所示)、轻链可变区基因序列VL(如SEQ ID NO.2所示)、猪抗体恒定区Fc段基因序列(如SEQ ID NO.3所示)以及5’端酶切位点SacI和3’端酶切位点SalI的scFv-Fc序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列如SEQ ID NO.6所示。
利用限制性内切酶SacI和SalI分别对载体pET28a和合成序列scFv-Fc进行分步法双酶切，分步法双酶切体系为：1μL SacI(10units/μL)，2μL 10×L Buffer，1μg合成序列scFv-Fc或载体pET28a，dH2O补足20μL，37℃温育2h；随后用DNA纯化试剂盒回收，进行下一步酶切，体系为：1μL SalI(10units/μL)，2μL 10×H Buffer，1μg上步酶切产物，dH2O补足20μL，37℃温育2h，1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段(电泳图见图1，图中M1为DL5000Marker，M2为DL2000Marker，1为pET28a双酶切，2为scFv-Fc合成序列双酶切)，将目的基因scFv-Fc定向克隆至pET28a，连接体系为：2μL pET28a酶切产物(5358bp)，1μL合成序列scFv-Fc酶切产物(约1130bp)，1μL T4DNA Ligase(350units/μL)，1μL 10×T4DNA Ligase Buffer，dH2O补足10μL；连接产物转化BL21(DE3)，挑取单克隆并进行菌液PCR和酶切鉴定，保存阳性单克隆，命名为BL21/pET28a-scFv-Fc。
2)目的蛋白诱导表达
将BL21/pET28a-scFv-Fc按照1％接种量接种至卡纳青霉素抗性LB培养基中，37℃、220rpm摇床培养过夜；次日，将过夜培养物按照3％接种量接种至卡纳青霉素抗性LB培养基中，37℃、220rpm摇床培养3.5小时(3～4小时均可)，待OD600达到0.7时(0.6～0.8均可)，加入IPTG使其终浓度为0.6mM，37℃、220rpm摇床培养诱导表达8小时，8000rpm离心10min收集菌体。不同IPTG浓度诱导表达SDS-PAGE结果见图2，图中M为低分子量蛋白Marker，1为BL21/pET28a诱导，2为BL21/pET28a-scFv-Fc未诱导，3～9为BL21/pET28a-scFv-Fc分别在0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mMIPTG浓度下诱导。不同诱导时间SDS-PAGE结果见图3，图中M为低分子量蛋白marker，1为BL21/pET28a诱导，2为BL21/pET28a-scFv-Fc未诱导，3～9为pET28a-scFv-Fc诱导2h、4h、5h、6h、7h、8h、9h。不同诱导温度SDS-PAGE结果见图4，图中M为低分子量蛋白marker，1为BL21/pET28a诱导，2～4为BL21/pET28a-scFv-Fc在25℃、30℃、37℃分别诱导。
3)目的蛋白的检测及纯化
用PBS对上步中收集的菌体进行两次洗涤，随后加入超声缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，150mM NaCl，0.5％(w/v)Triton-X 100，pH 8.0)，冰上超声破碎，4℃、12000rpm离心30min，分别取未诱导全菌、诱导后全菌、破碎后上清和破碎后沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明该蛋白以包涵体形式表达。
取破碎后收集的沉淀，加入包涵体洗涤液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，150mM NaCl，2M Urea，1％(w/v)Triton-X 100，pH 8.0)洗涤两次，随后向其中加入包涵体溶解液(50mMTris-HCl，1mM EDTA，150mM NaCl，8M Urea，1％(w/v)Triton-X 100，pH 8.0)，室温放置1小时，4℃、12000rpm离心30min收集上清，过镍柱进行亲和层析纯化，随后向柱中加入平衡buffer(100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，8M Urea，pH 8.0)，直至A280接近0，向柱中加入一个柱体积的洗涤buffer(100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，10mM咪唑，8M Urea，pH 8.0)，洗涤未结合蛋白质，随后向其中加入30ml洗脱buffer(100mMNaH2PO4，10mM Tris-HCl，250mM咪唑，8M Urea，pH 8.0)，收集洗脱液，每管1ml；利用BCA法测定30管洗脱液的蛋白浓度，制作洗脱曲线(见图5)，根据洗脱曲线确定第2、3、4管为有效洗脱液。
4)目的蛋白的透析及超滤
目的蛋白透析流程见图6；收集透析袋中蛋白溶液，将蛋白溶液加入超滤管柱子，将超滤管放入离心机，4℃、15000g离心，离心时间根据柱子上余留蛋白溶液体积来确定；离心约5min后柱子上余留蛋白体积达到预期体积，此时终止超滤操作，将每个超滤管中的蛋白溶液移入新的1.5ml离心管，此即为最后纯化复性scFv-Fc蛋白，经过BCA法测定蛋白浓度，达0.72mg/ml。
试验例
Elisa鉴定单链抗体scFv-Fc与PEDV的结合活性：
1)包被抗原：用包被缓冲液将抗原(PEDV和PRV)1:100稀释，加入酶标板(100μl/孔)，同时设置不包被抗原的对照孔，将酶标板放置在37℃湿盒中孵育1h，随后放入4℃过夜；第二天取出，甩干包被液，用浸泡洗涤法洗涤酶标孔，加满PBST后立即甩干，随后加入300μl/孔的PBST，脱色摇床上浸泡2min，甩干，重复3遍；
2)封闭：每孔加入300μl封闭液，放入37℃湿盒中孵育2h，浸泡洗涤法洗涤酶标孔；
3)加待检样品：用封闭液对待检重组scFv蛋白作倍比稀释，稀释后的猪阳性血清为阳性对照，同时设置阴性对照孔(未免疫猪血清)和空白孔，每孔加入100μl，37℃湿盒中孵育1h，浸泡洗涤法洗涤酶标孔；
4)加酶标二抗：用封闭液对HRP anti-labeled 6×His进行稀释，稀释度为1:2000，每孔加入100μl，37℃避光孵育1h，浸泡洗涤法洗涤酶标孔；
5)显色：将TMB底物显色试剂盒中A和B按照1:100混合成工作液，每孔加底物显色工作液100μl，37℃避光孵育15-30min，直至显色至预期深浅；
6)终止反应：每孔加100μl终止液(1M H2SO4)，孔中溶液由蓝色变为黄色；
7)读数：终止反应后15分钟内，在酶标仪上450nm读取各孔溶液的吸光值；
8)结果判定：当阳性对照孔OD450值≥1.0、阴性对照孔OD450值<0.2且P/N>2.0时，试验成立(如图7所示)。
注：P/N＝(待检样品孔OD450值—空白孔OD450值)/(阴性对照孔OD450值—空白孔OD450值)。
初构建pET28a-scFv-Fc表达载体的技术简介：
本发明采用两套不同的方法获得基因序列的scFv，一方面通过抗PEDV的杂交瘤细胞中获得，即从抗PEDV杂交瘤细胞中提取总RNA，反转录获得cDNA，以此为模板，采用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因，通过连接肽将VH和VL基因连接起来得到单链抗体基因scFv；另一方面，先用原核系统表达PEDV的抗原中和表位S1蛋白，然后将该重组蛋白免疫小鼠，提取免疫小鼠脾脏的总RNA，反转录成cDNA，并以此为模板，利用PCR方法扩增抗体VH序列和VL序列。与此同时，提取猪脾细胞总RNA，反转录全套cDNA，以此为模板，利用特异性引物扩增抗体Fc序列。通过SOE-PCR方法拼接得到单链抗体scFv-Fc，该基因全长1128bp，包含366bp重链可变区，354bp轻链可变区，45bp连接序列(Gly4Ser)3，363bp猪抗体Fc段。合成带有SacI、SalI酶切位点的scFv-Fc序列(如SEQ IDNO.6所示)，利用限制性内切酶Sac I和Sal I分别对表达载体pET28a和合成序列scFv-Fc双酶切，电泳后胶回收目的片段，将目的基因scFv-Fc定向克隆至pET28a，得到pET28a-scFv-Fc。载体构建流程示意图见图8。
Claims (7)
1.抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体，其特征在于：其重链可变区基因序列如SEQID NO.1所示，轻链可变区基因序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：还包括猪抗体恒定区Fc段基因序列，其序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的单链抗体，其特征在于：重链可变区基因序列与轻链可变区基因序列由连接肽linker序列连接，其序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的单链抗体，其特征在于：其基因序列如SEQ ID NO.5所示。
5.抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)构建BL21/pET28a-scFv-Fc
利用限制性内切酶SacI和SalI分别对载体pET28a和合成序列scFv-Fc进行双酶切，电泳后胶回收目的片段，连接后转化BL21(DE3)，经鉴定得到BL21/pET28a-scFv-Fc；
合成序列scFv-Fc如SEQ ID NO.6所示；
2)制备猪源化单链抗体scFv-Fc
取BL21/pET28a-scFv-Fc扩大培养，诱导表达目的蛋白，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中双酶切为分步法双酶切，第一步酶切的反应体系为：10units/μL SacI 1μL，10×L Buffer 2μL，合成序列scFv-Fc或载体pET28a 1μg，dH2O补足20μL，37℃温育2h；回收酶切产物后进行第二步酶切，酶切反应体系为：10units/μL SalI 1μL，10×H Buffer 2μL，酶切产物1μg，dH2O补足20μL，37℃温育2h。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中诱导采用IPTG，其终浓度为0.6mM，诱导温度37℃，时间8小时。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106632670A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-05-10 | 上海交通大学 | 一种猪源性抗猪传染性胃肠炎病毒的单链抗体及其制备方法 |
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| CN108659124A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-10-16 | 青岛博隆基因工程有限公司 | 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及其应用 |
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