CN103160515A

CN103160515A - 一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法

Info

Publication number: CN103160515A
Application number: CN2011104203340A
Authority: CN
Inventors: 孙远明; 董洁娴; 王弘; 雷红涛; 李振峰; 徐振林; 杨金易; 沈玉栋
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-12-15
Also published as: CN103160515B

Abstract

本发明公开了一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法。本发明的制备方法，步骤为：以杂交瘤细胞总mRNA为模板反转录得cDNA，选用简并性低的通用引物扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；将扩增出的重、轻链可变区基因序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源瘤细胞的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；将该基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，与相应抗原靶标分子进行分子对接分析；分析结果正确的候选重链和轻链通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定。本发明的制备方法适合所有源于单克隆杂交瘤细胞的单链抗体制备，过程简易、快速，产品质量高。

Description

一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学及分子生物学领域，具体涉及一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法。

背景技术

20世纪80年代初，随着分子生物学的发展，人们开始利用基因工程技术生产重组抗体，开辟了抗体在广泛领域里应用的新纪元，其中单链抗体 (Single- chain antibody, scFv) 的研究令人瞩目。单链抗体是由一条连接肽（linker）将抗体重链可变区V_H和轻链可变区V_L连在一起所形成的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键可形成具有抗原结合功能的Fv段。由于其制备周期短、可添加各种标签以便纯化、易于基因工程操作等优点，已成为抗体工程研究领域中的热点。

目前，针对单链抗体的制备主要通过构建天然库或免疫抗体库，借助噬菌体展示或核糖体展示等技术进行生物淘筛，获得对靶标有亲和力的抗体克隆。但抗体库和表面展示技术是一个复杂的系统，其展示效率难于确定，增加淘筛过程中的盲目性，使得源于杂交瘤细胞的单链抗体制备过程更加复杂低效。另外，在杂交瘤细胞中，常存在源于融合伴侣瘤细胞的假抗体基因或者错误重排的无义基因，如何排除错误基因的干扰，获取正确抗体基因是单链抗体制备过程中的首要关键。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中筛选抗体基因过程存在盲目性、杂交瘤细胞中的假抗体基因或无义基因难以排除等缺陷，提供一种基于杂交瘤细胞的简易、快速的单链抗体制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种基于杂交瘤细胞的单链抗体（简称scFv）的制备方法，主要流程为：抗体重、轻链可变区基因的克隆，抗体基因序列分析，抗体蛋白三维结构同源模建，抗体与抗原分子对接，融合碱性磷酸酶的可溶性表达以及抗体活性鉴定。

具体步骤如下：

（1）以杂交瘤细胞总mRNA为模板，Oligo dT为引物，反转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，在通用引物中筛选适当引物组，扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；所述杂交瘤为能够分泌抗目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞；所述适当引物组是指能够扩增出单链抗体的重链和轻链基因的上下游引物。

（2）步骤（1）得到的序列选择大小在300~500bp范围内，条带清晰单一的轻链和重链可变区基因进行测序，序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；所述融合伴侣瘤是指与产生抗体的B细胞融合的骨髓瘤细胞，（B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤）。

（3）将候选重链和轻链可变区基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，将该三维模拟结构与相应目标抗原分子进行分子对接分析，选出分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因；所述分析结果正确的标准是重、轻链存在二硫键，而且空间上比较接近，轻、重链能形成完整的疏水口袋，重链3个CDR区和轻链3个CDR去紧密围绕疏水口袋，分子相互作用的拟合度数值在10以上。

（4）将分子对接分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定，最终得到目的单链抗体。

上述步骤（1）中所述通用引物见表1（参见Krebber, A., et al., Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of immunological methods, 1997. 201(1): p. 35-55.现代免疫学实验技术，沈关心，湖北科学技术出版社，1998年第1版：p.54）。

表1 扩增单链抗体的重链和轻链可变区基因的通用引物

	单链抗体的轻链可变区通用引物		单链抗体的重链可变区通用引物
				编号	序列	编号	序列
LB1	GAYATCCAGCTGACTCAGCC (SEQ ID NO:51)	HB1	GAKGTRMAGCTTCAGGAGTC (SEQ ID NO:52)
				LB2	GAYATTGTTCTCWCCCAGTC (SEQ ID NO:53)	HB2	GAGGTBCAGCTBCAGCAGTC (SEQ ID NO:54)
LB3	GAYATTGTGMTMACTCAGTC (SEQ ID NO:55)	HB3	CAGGTGCAGCTGAAGSASTC (SEQ ID NO:56)
				LB4	GAYATTGTGYTRACACAGTC (SEQ ID NO:57)	HB4	GAGGTCCARCTGCAACARTC (SEQ ID NO:58)
LB5	GAYATTGTRATGACMCAGTC (SEQ ID NO:59)	HB5	CAGGTYCAGCTBCAGCARTC (SEQ ID NO:60)
				LB6	GAYATTMAGATRAMCCAGTC (SEQ ID NO:61)	HB6	CAGGTYCARCTGCAGCAGTC (SEQ ID NO:62)
LB7	GAYATTCAGATGAYDCAGTC (SEQ ID NO:63)	HB7	CAGGTCCACGTGAAGCAGTC (SEQ ID NO:64)
				LB8	GAYATYCAGATGACACAGAC (SEQ ID NO:65)	HB8	GAGGTGAASSTGGTGGAATC (SEQ ID NO:66)
LB9	GAYATTGTTCTCAWCCAGTC (SEQ ID NO:67)	HB9	GAVGTGAWGYTGGTGGAGTC (SEQ ID NO:68)
				LB10	GAYATTGWGCTSACCCAATC (SEQ ID NO:69)	HB10	GAGGTGCAGSKGGTGGAGTC (SEQ ID NO:70)
LB11	GAYATTSTRATGACCCARTC (SEQ ID NO:71)	HB11	GAKGTGCAMCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO:72)
				LB12	GAYRTTKTGATGACCCARAC (SEQ ID NO:73)	HB12	GAGGTGAAGCTGATGGARTC (SEQ ID NO:74)
LB13	GAYATTGTGATGACBCAGKC (SEQ ID NO:75)	HB13	GAGGTGCARCTTGTTGAGTC (SEQ ID NO:76)
				LB14	GAYATTGTGATAACYCAGGA (SEQ ID NO:77)	HB14	GARGTRAAGCTTCTCGAGTC (SEQ ID NO:78)
LB15	GAYATTGTGATGACCCAGWT (SEQ ID NO:79)	HB15	GAAGTGAARSTTGAGGAGTC (SEQ ID NO:80)
				LB16	GAYATTGTGATGACACAACC (SEQ ID NO:81)	HB16	CAGGTTACTCTRAAAGWGTSTG (SEQ ID NO:82)
LB17	GAYATTTTGCTGACTCAGTC (SEQ ID NO:83)	HB17	CAGGTCCAACTVCAGCARCC (SEQ ID NO:84)
				LB18	RACATTGTRATGACMCARTCTCC (SEQ ID NO:85)	HB18	GATGTGAACTTGGAAGTGTC (SEQ ID NO:86)
LB19	GGAGACATTGTGATGACCCAGTC (SEQ ID NO:87)	HB19	GAGGTGAAGGTCATCGAGTC (SEQ ID NO:88)
				LF1	ACGTTTGATTTCCAGCTTGG (SEQ ID NO:89)	HF1	CGAGGAAACGGTGACCGTGGT (SEQ ID NO:90)
LF2	ACGTTTTATTTCCAGCTTGG (SEQ ID NO:91)	HF2	CGAGGAGACTGTGAGAGTGGT (SEQ ID NO:92)
				LF3	ACGTTTTATTTCCAACTTTG (SEQ ID NO:93)	HF3	CGCAGAGACAGTGACCAGAGT (SEQ ID NO:94)
LF4	ACGTTTCAGCTCCAGCTTGG(SEQ ID NO:95)	HF4	CGAGGAGACGGTGACTGAGGT (SEQ ID NO:96)
				LF5	TTTKATTTCCAGCTTGGTSCCYC (SEQ ID NO:97)	HF5	YGAGGAGACGGTGACCRKGGTSC (SEQ ID NO:98)
LF6	AGCGCGCTTCAGTTCCAGTTTGG (SEQ ID NO:99)	HF6	TGMRGARACAGTGACCRKRGTCC (SEQ ID NO:100)

注：LB表示轻链可变区下游引物，LF表示轻链可变区上游引物；HB表示重链可变区下游引物，HF表示重链可变区上游引物。

在通用引物中筛选适当引物的方法：以轻链可变区基因扩增引物筛选为例，上、下游引物分为两组，命名为组1，组2，将组2的所有引物等比例混合，混合物分别和组1的每一条引物混合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定组1的阳性引物（即能够扩增出基因）；组1中阳性引物每一条再分别与组2中的每一条引物组合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定组2中的阳性引物。重链可变区基因扩增引物筛选方法也一样，最终确定出扩增重链可变区和轻链可变区的引物组。

步骤（3）所述三维结构同源模建是在RosettaAntibody: F_V Homology Modeling Server平台进行的，可以获得scFv的三维模拟结构。将scFv的三维模拟结构与相应的靶标分子进行对接分析，其分析结果可以从侧面反映所构建的三维模型是否正确，同时也可以证明构建三维模型的基因序列是有功能的抗体基因序列。

步骤（4）所述表达为酶融合可溶性表达，即将单链抗体基因插入到融合碱性磷酸酶蛋白基因的可溶性表达载体，进行表达。表达载体优选pDAP2。

以上制备方法可以用于任何基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备，例如抗莱克多巴胺(Ractopamine,RAC，化学名称：1-(4-羟基苯基)-2[1-甲基-3-(4-羟基苯基)-丙氨基]-乙醇盐

酸盐）、呋喃它酮代谢物(Furazolidone Metabolite,AMOZ，化学名称：5-甲基玛琳-3-氨基-2-唑烷基酮)、有机磷(Organophosphorus,OPs，具体参见表2)、克伦特罗(Clenbuterol,CBL，化学名称：7-[2-甲基丙烷-2-亚氨基-甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐)单链抗体等。

表2 有机磷农药化学名称对照表

有机磷农药	化学名称
		蝇毒磷	O，O-二乙基-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7)硫逐磷酸酯
对硫磷	O，O -二乙基-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯
		除线磷	硫代磷酸-O,O-二乙基-O-2,4-二氯苯基酯
辛硫磷	O，O-二乙基-O-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯
		乙基谷硫磷	O,O-二乙基S-[(4-氧代-1,2,3-苯并三氮杂苯-3(4H)-基)甲基]二硫代磷酸酯
喹硫磷	O,O-二乙基-O-(喹恶磷)硫代磷酸酯
		三唑磷	O,O-二乙基-O-(1-苯基-l,2,4-三唑-3-基)硫代磷酸酯
伏杀硫磷	O,O-二乙基-S-(6-氯-2-氧代苯并恶啉-3-基甲基)二硫代磷酸酯
		甲拌磷	O,O-二乙基-S-(乙硫基甲基)二硫化磷酸酯
乙拌磷	O,O-二乙基-S-2-(乙硫基)乙基二硫代磷酸酯
		毒死蜱	O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯
乙基溴硫磷	O-(4-溴-2,5-二氯苯基)-O,O-二乙基硫代磷酸酯
		治螟磷	O,O,O',O'-四乙基二硫代焦磷酸酯
氯唑磷	O-5-氯-1-异丙基-1H-1，2，4-三唑-3-基-O,O-二乙基硫代磷酸酯
		二嗪磷	O，O-二乙基-O-（2-异丙基-6-甲基-4-嘧啶基）硫逐磷酸酯
乙基嘧啶磷	O-2-二乙氨基-6-甲基嘧啶-4-基-O,O-二乙基硫逐磷酸酯
		特丁硫磷	O，O-二乙基-S-特丁硫甲基二硫代硫酸酯
乙硫磷	O,O,O',O'-四乙基-S,S'-亚甲基双(二硫代磷酸酯)

上述制备方法在制备抗RAC单链抗体时是以分泌RAC单克隆抗体的杂交瘤细胞AC2为杂交瘤，重叠延伸PCR法中，以步骤（3）中筛选出的重链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 1~2为上下游引物，经过PCR得到重链Linker片段；以步骤（3）中筛选出的轻链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 3~4为上下游引物，经过PCR得到轻链Linker片段。步骤（4）所述拼接成单链抗体基因，扩增该基因的引物为SEQ ID NO:1、4。所述表达为将拼接成的单链抗体基因插入含碱性磷酸酶基因的可溶性表达载体。

上述制备方法在制备抗AMOZ单链抗体时，是以分泌AMOZ单克隆抗体的杂交瘤细胞2BE总mRNA为模板反转录得cDNA；重叠延伸PCR法是以步骤（3）中筛选出的重链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 5~6为上下游引物，经过PCR得到重链Linker片段；以步骤（3）中筛选出的轻链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 7~8为上下游引物，经过PCR得到轻链Linker片段。扩增单链抗体基因的引物为SEQ ID NO:5、8。

上述制备方法在制备抗OPs单链抗体时是以分泌OPs单克隆抗体的杂交瘤细胞12C2总mRNA为模板反转录得cDNA；重叠延伸PCR法中，以步骤（3）中筛选出的重链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 9~10为上下游引物，经过PCR得到重链Linker片段；以步骤（3）中筛选出的轻链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 11~12为上下游引物，经过PCR得到轻链Linker片段。步骤（4）所述拼接成单链抗体基因，扩增该基因的引物为SEQ ID NO:9、12。

上述制备方法在制备抗CBL单链抗体时是以分泌CBL单克隆抗体的杂交瘤细胞5D1总mRNA为模板反转录得cDNA；所述重叠延伸PCR法中，以步骤（3）中筛选出的重链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 13~14为上下游引物，经过PCR得到重链Linker片段；以步骤（3）中筛选出的轻链可变区基因为模板，以序列SEQ ID NO: 15~16为上下游引物，经过PCR得到轻链Linker片段。步骤（4）所述拼接成单链抗体基因，扩增该基因的引物为SEQ ID NO:13、16。

本发明利用简并度低的通用引物对单克隆杂交瘤细胞进行全套抗体可变区基因提取，测序后经抗体基因数据库分析，排除源于融合伴侣瘤细胞的抗体基因及错误重组基因，选择正确的目标重轻链基因，使用软件推导其氨基酸序列，在网络平台上进行抗体可变区的三维结构同源模建，并利用分子对接软件进行抗原与抗体分子相互作用分析，预测所选抗体基因的功能性与抗体三维模拟结构的合理性，最大程度上确保抗体基因的正确性，提高后续工作的有效性。

抗体基因序列的生物信息学分析作为一种预测手段，对于重组抗体功能预判有指导作用，但结果依然存在不确定因素，因此，抗体基因序列的有效性还需要通过体外表达、活性鉴定实验来验证。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的单链抗体简易制备方法避免了复杂的构建抗体库及噬菌体或核糖体展示筛选的过程，对于偶联了载体蛋白的小分子抗原而言，更是避免了载体蛋白在淘筛过程中的干扰难题，更加高效准确获得目标单链抗体。

2、本发明采用抗体基因数据库进行序列分析，结合分子模拟技术筛选合理的抗体基因，先找到成功概率较高的抗体基因，优先进行下一步体外活性鉴定，有效快捷而且大大降低下一步的工作量。

3、本发明采用碱性磷酸酶融合的可溶性表达方法，与常用包涵体表达相比，免去了繁琐的变性复性过程，直接收集培养基上清或周质腔裂解液上清纯化后，即可通过一步法显色鉴定，步骤简易，耗时短，耗费低，获得的抗体活性与母本相当甚至更好，简化实验步骤的同时还保证了重组抗体的活性，是一种优秀的活性筛选工具。

4、本发明的制备方法适合所有源于单克隆杂交瘤细胞的单链抗体制备，过程简易、快速，具有重要现实意义。

附图说明

图1. RAC- scFv与RAC药物的分子对接模式图。

图2. RAC-scFv-AP融合蛋白的SDS-PAGE检测结果，其中M为marker，1为含未重组pDAP2表达载体对照BL21菌株周质腔提取物，2为含重组pDAP2-RACscFv表达载体BL21菌株周质腔提取物。

图3. RAC-scFv-AP融合蛋白的western-blot检测结果，其中1为含未重组pDAP2表达载体对照BL21菌株周质腔提取物，2为含重组pDAP2-RACscFv表达载体BL21菌株周质腔提取物。

图4. RAC-scFv-AP一步法直接竞争ELISA标准曲线图，横坐标为RAC浓度，纵坐标为亲和率。

图5. AMOZ-scFv与NPAMOZ药物的分子对接模式图。

图6. AMOZ-scFv-AP一步法直接竞争ELISA标准曲线图，横坐标为NPAMOZ浓度，纵坐标为亲和率。

图7. OPs-scFv与OPs药物的分子对接模式图。

图8. OPs-scFv-AP一步法直接竞争ELISA标准曲线图，横坐标为OPs浓度，纵坐标为亲和率。

图9. CBL-scFv与CBL药物的分子对接模式图。

图10. CBL-scFv-AP(D)一步法直接竞争ELISA标准曲线图，横坐标为CBL浓度，纵坐标为亲和率。

具体实施方式

以下结合抗莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)以及呋喃它酮代谢物(Furazolidone Metabolite,AMOZ)、有机磷(Organophosphorus,OPs)、克伦特罗(Clenbuterol,CBL)单链抗体制备的实施例进一步阐释本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1 抗RAC的单链抗体制备

1. 抗RAC的抗体可变区基因的克隆

RAC单克隆杂交瘤细胞AC2（本实验室保存）复苏后，在RPMI 1640完全培养基扩大培养至1×10⁷，用Trizol（TAKARA公司）提取总RNA，按厂家说明书进行。

使用反转录试剂盒（Promega公司）将总RNA反转录成cDNA第1链，按厂家说明书进行。

使用通用型引物克隆抗体重、轻链可变区基因，通用型引物见表1，以轻链可变区基因克隆为例，先将LF的6条引物等比例混合，混合后的LF引物分别与LB1~19的19条引物组合，组成19个引物组，以cDNA第1链为模板，用这19个引物组分别扩增轻链可变区，反应程序是94 ℃ 2 min预变性，进行以下循环：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共25个循环，最后72 ℃延伸10 min。筛选出能够扩增出序列的引物组，确定其LB引物的编号，作为阳性LB引物。再用每一条阳性LB引物分别与6条LF引物组合，确定阳性LF引物。以一条阳性LB引物为例，与LF组成6个引物组，以cDNA第1链为模板，用这6个引物组进行PCR反应，有扩增产物的引物组合，其中的LB6-LF2、LB11-LF1、LB12-LF1和LB14-LF2引物即为所需的引物。

以cDNA第1链为模板，用筛选出的阳性上下游引物，进行PCR扩增反应，反应程序是94 ℃ 2 min预变性，进行以下循环：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共25个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增出轻链可变区的基因。

同样的原理，用HB和HF引物确定出重链可变区的引物组合，具体组合是：HB11-LF4，HB13-LF4。.扩增出重链可变区基因。

选择大小在300~500bp范围内，条带清晰单一的轻链和重链PCR产物进行连接pEasy-T3载体（北京全式金公司产品），按厂家说明书进行蓝白斑筛选，挑取白斑，扩培菌液后提取质粒，用EcoR I酶切鉴定，选择正确插入的重组质粒送至公司测序。

2. 抗莱克多巴胺单链抗体重链（RAC-V_H）和轻链（RAC-V_L）基因序列分析

由步骤1中筛选的引物组合进行PCR扩增后，重链RAC-V_H有2个引物组合的扩增产物大小在350bp左右，条带清晰单一，命名为RAC-V_H1、RAC-V_H2，轻链RAC-V_L有4个组合的大小在320bp左右，条带清晰单一，命名为RAC-V_L1、RAC-V_L2、RAC-V_L3、RAC-V_L4。其测序结果通过DNAman软件调整后，获取完整的正向序列。以FASTA格式输入IMGT进行鼠源抗体可变区基因序列分析。网址如下：http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg。

RAC-V_H1、RAC-V_H2及RAC-V_L1、RAC-V_L2、RAC-V_L3、RAC-V_L4的基因序列及其在IMGT中的分析结果如下：

（1）RAC-V_H1：该重链序列V-D-J重排正确，并且归属到IGHV3的鼠源胚系抗体序列中，同源性在90%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:17所示。

RAC-V_H2经过IMGT数据库分析，结果显示与RAC-V_H1为同一基因。

（2）RAC-V_L1：该轻链序列V-J重排正确，并且归属到IGKV1鼠源胚系抗体序列中，同源性在95%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:18所示。

（3）RAC-V_L2：该轻链RAC-V_L2的抗体轻链基因是假性基因，经过分析，该错误抗体基因来自于融合伴侣瘤细胞SP2/0，具体表现为CDR3读框移动，而且存在“GTATCC”BciVI酶切位点，该酶切位点是瘤细胞SP2/0抗体基因的特异酶切位点，序列如SEQ ID NO:19所示。

组合RAC-V_L3、RAC-V_L4的分析结果和RAC-V_L2相同，均克隆了来源于瘤细胞SP2/0的假基因。

经过以上分析，选择RAC-V_H1作为单链抗体的重链，RAC-V_L1为单链抗体的轻链。进入下一步分析。

3. RAC-scFv候选基因蛋白三维模型构建与分子对接分析

利用RosettaAntibody: F_V Homology Modeling Server在线同源模拟工具，在其网页中输入RAC-scFv候选基因RAC-V_H1和RAC-V_L1翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21，提交后生成RAC-scFv三维结构模型。在线同源模拟获取的抗体三维结构模型显示：轻、重链存在二硫键，而且空间上比较接近；轻重链能形成完整的疏水口袋；重链三个CDR和轻链三个CDR区紧密围绕疏水口袋。使用GOLD程序遗传算法将RAC-scFv三维模型的六个CDR区域和RAC分子进行柔性对接，充分搜索构象空间，找到相互作用的最优模式。采用GOLDSCORE打分函数得到分子相互作用的拟合度数值, 数值大小来判断分子对接的好坏，越大则相互作用越强，形成的包合物能量越低，越稳定，结果如说明书附图1所示，GOLDSCORE打分函数得到的拟合度数值为47.42。

4. RAC-scFv候选基因融合酶蛋白的可溶性表达和活性检测

（1）PCR扩增RAC-V_H1-Linker片段是以RAC-V_H1为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO:1、2所示。

反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物序列如SEQ ID NO:22。

（2）PCR扩增RAC-V_L1-Linker片段。以RAC-V_L1为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO: 3、4所示。

反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物序列如SEQ ID NO:23。

（3）PCR扩增RAC-scFv。将扩增得到的RAC-V_H1-Linker片段和RAC-V_L1-Linker片段等比例混合，通过重叠延伸PCR法拼接scFv。反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共10个循环，最后72℃延伸10 min。所得到的PCR产物即为拼接产物，以拼接产物为模板，SEQ ID NO:1、4所示的序列为上下游引物，再进行PCR扩增，反应程序是94℃ 2 min预变性，进行以下循环：94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共25个循环，最后72℃ 延伸10 min。扩增产物即为RAC-scFv，序列如SEQ ID NO:24。

（4）表达载体的构建。RAC-scFv片段和pDAP2表达载体用Sfi I和Not I进行双酶切，纯化回收后，使用T4连接酶进行连接反应，次日，将连接反应产物转化BL21感受态细胞。

（5）重组子（上述连接反应产物）经酶切鉴定正确后，菌液按1:1000接入10 mL 2×YT-氨苄培养基中，同时以未重组pDAP2表达载体的BL21转化子为空白对照，37℃培养过夜。次日，将过夜菌按1:50接入50 mL 2×YT-氨苄培养基中，37℃培养至OD₆₀₀=1.0左右，加入IPTG，28℃振荡培养8~20小时。培养产物离心，采用冻融法提取周质腔蛋白，并进行SDS-PAGE及western-blotting检测。检测结果见说明书附图2和图3。

（6）RAC-scFv-AP融合蛋白的活性鉴定

用包被液（0.1 mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6）稀释RAC-Ovalbumin至5 μg/mL，包被ELISA 96孔板，每孔加入100 μL，37℃过夜。次日，用PBST(PBS含0.5%Tween)洗板两次，加入PBST-5%BSA封闭，37℃孵育3小时，甩去封闭液，37℃烘干酶标板，备用。

将RAC盐酸盐以PBST稀释液配制成浓度梯度为0、0.512、1.28、3.2、8、20、50 ng/mL的RAC标准品工作液，在酶标板孔中加入标品工作液与融合酶抗体，37℃反应1小时，洗板6次，加入碱性磷酸酶底物缓冲液（10%二乙醇胺，0.5 mM MgCl₂，pH值9.8；底物：1 mg/mL pNPP.）100 μL，37℃反应20 min，以Wallac Victor³1420多标记分析仪测量其405 nm吸光值。基于碱性磷酸酶的一步法ELISA（IC₅₀）为2.0 ng/mL，最低检测限为0.25 ng/mL、检测范围（IC₂₀-IC₈₀）在0.4-7.97 ng/mL之间，结果如说明书附图4所示。

实施例2 抗呋喃它酮代谢物（Furazolidone Metabolite,AMOZ）的单链抗体制备

1. 抗AMOZ的抗体可变区基因的克隆

AMOZ单克隆杂交瘤细胞2BE（本实验室保存）复苏后，在RPMI 1640完全培养基扩大培养至1×10⁷，用Trizol（TAKARA公司）提取总RNA，按厂家说明书进行。

使用通用型简并性引物克隆AMOZ抗体的重、轻链可变区基因，通用型简并性引物见表1，引物组筛选方法及抗体基因的克隆方法与实施例1相同。

筛选出的引物组合为：HB1-HF3，HB9-HF3，HB15-HF3，HB16-HF6，HB17-HF6，LB18-LF5，LB10-LF6，LB19-LF6。

2. 抗AMOZ单链抗体重链（AMOZ-V_H）和轻链（AMOZ-V_L）基因序列分析

经过引物配对组合后，重链AMOZ-V_H有5个组合的扩增产物大小在350bp左右，条带清晰单一，命名为AMOZ-V_H1、AMOZ-V_H2、AMOZ-V_H3、AMOZ-V_H4、AMOZ-V_H5，轻链AMOZ-V_L有3个组合的大小在320bp左右，条带清晰单一，命名为AMOZ-V_L1、AMOZ-V_L2、AMOZ-V_L3。其测序结果通过DNAman软件调整后，获取完整的正向序列。以FASTA格式输入IMGT进行鼠源抗体可变区基因序列分析。网址如下：http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg。

AMOZ-V_H1、AMOZ-V_H2、AMOZ-V_H3、AMOZ-V_H4、AMOZ-V_H5及AMOZ-V_L1、AMOZ-V_L2、AMOZ-V_L3的基因序列及其在IMGT中的分析结果如下：

（1）AMOZ-V_H1：该重链序列V-D-J重排正确，并且归属到IGHV6的鼠源胚系抗体序列中，同源性在95%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:25。

AMOZ-V_H3经过IMGT数据库分析，结果显示与AMOZ-V_H1为同一基因。

（2）AMOZ-V_H2：该重链AMOZ-V_H2的抗体重链基因是假性基因，经过分析，该错误抗体基因来自于融合伴侣瘤细胞SP2/0，具体表现为CDR3读框移动，且存在终止密码子。序列如SEQ ID NO:26

（3）AMOZ-V_H4、AMOZ-V_H5经过IMGT数据库分析，结果显示与AMOZ-V_H2为同一基因。

（4）AMOZ-V_L2：该轻链序列V-J重排正确，并且归属到IGKV6鼠源胚系抗体序列中，同源性在95%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:27。

（5）AMOZ-V_L1：该轻链AMOZ-V_L1的抗体轻链基因是假性基因，经过分析，该错误抗体基因来自于融合伴侣瘤细胞SP2/0，具体表现为CDR3读框移动，而且存在“GTATCC”BciVI酶切位点，该酶切位点是瘤细胞SP2/0抗体基因的特异酶切位点，序列如SEQ ID NO:28。

AMOZ-V_L3的分析结果和AMOZ-V_L1相同，均克隆了来源于瘤细胞SP2/0的假基因。

经过以上分析，选择AMOZ-V_H1作为单链抗体的重链，AMOZ-V_L2为单链抗体的轻链，进入下一步分析。

3. AMOZ-scFv候选基因蛋白三维模型构建与分子对接分析

利用RosettaAntibody: F_V Homology Modeling Server在线同源模拟工具，在其网页中输入AMOZ-scFv候选基因AMOZ-V_H1和AMOZ-V_L2翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，提交后生成AMOZ-scFv三维结构模型。在线同源模拟获取的抗体三维结构模型显示：轻、重链存在二硫键，而且空间上比较接近；轻重链能形成完整的疏水口袋；重链三个CDR和轻链三个CDR区紧密围绕疏水口袋。使用GOLD程序遗传算法将AMOZ-scFv三维模型的六个CDR区域和NPAMOZ（AMOZ 的邻位2-硝基苯甲醛衍生物）分子进行柔性对接，充分搜索构象空间，找到相互作用的最优模式。采用GOLDSCORE打分函数得到分子相互作用的拟合度数值，数值大小来判断分子对接的好坏，越大则相互作用越强，形成的包合物能量越低，越稳定，结果如说明书附图5所示，GOLDSCORE打分函数得到的拟合度数值为57.97。

4. AMOZ-scFv候选基因融合酶蛋白的可溶性表达和活性检测

（1）PCR扩增AMOZ-V_H1-Linker片段以AMOZ-V_H1为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO:5、6所示。

反应程序是94℃ 2 min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物序列如SEQ ID NO:31。

（2）PCR扩增AMOZ-V_L1-Linker片段。以AMOZ-V_L1为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO: 7、8所示。

反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物序列如SEQ ID NO:32。

（3）PCR扩增AMOZ-scFv。将扩增得到的AMOZ-V_H1-Linker片段和AMOZ-V_L-Linker片段等比例混合，通过重叠延伸PCR法拼接scFv。反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共10个循环，最后72℃延伸10 min。所得到的PCR产物即为拼接产物，以拼接产物为模板，SEQ ID NO:5、8所示的序列为上下游引物，再进行PCR扩增，反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃ 延伸10 min。扩增产物即为AMOZ-scFv，序列如SEQ ID NO:33。

（4）表达载体的构建。AMOZ-scFv片段和pDAP2表达载体用Sfi I和Not I进行双酶切，纯化回收后，使用T4连接酶进行连接反应，次日，将连接反应产物转化BL21感受态细胞。

（5）重组子（上述连接反应产物）经酶切鉴定正确后，菌液按1:1000接入10 mL 2×YT-氨苄培养基中，同时以未重组pDAP2表达载体的BL21转化子为空白对照，37℃培养过夜。次日，将过夜菌按1:50接入50 mL 2×YT-氨苄培养基中，37℃培养至OD₆₀₀=1.0左右，加入IPTG，28℃振荡培养8~20小时。培养产物离心，采用冻融法提取周质腔蛋白，并进行SDS-PAGE及western-blotting检测。

（6）AMOZ-scFv-AP融合蛋白的活性鉴定

用包被液（0.1 mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6）稀释AMOZ- Ovalbumin至5 μg/mL，包被ELISA 96孔板，每孔加入100 μL，37℃过夜。次日，用PBST(PBS含0.5%Tween)洗板两次，加入PBST-5%BSA封闭，37℃孵育3小时，甩去封闭液，37℃烘干酶标板，备用。

将NPAMOZ以PBS稀释液配制成浓度梯度为0、0.012、0.037、0.11、0.33、1、3 μg/mL的AMOZ标准品工作液，在酶标板孔中加入标品工作液与融合酶抗体，37℃反应1小时，洗板6次，加入碱性磷酸酶底物缓冲液（10%二乙醇胺，0.5 mM MgCl₂，pH值9.8；底物：1 mg/mL p-NPP.）100 μL，37℃反应20 min，以Wallac Victor³1420多标记分析仪测量其405 nm吸光值。基于碱性磷酸酶的一步法ELISA（IC₅₀）为38.75 ng/mL，最低检测限为4.72 ng/mL、检测范围（IC₂₀-IC₈₀）在8.85-841.27 ng/mL之间，结果如说明书附图6所示。

实施例3 抗OPs的单链抗体制备

1. 抗OPs的抗体可变区基因的克隆

OPs单克隆杂交瘤细胞12C2（本实验室保存）复苏后，在RPMI 1640完全培养基扩大培养至1×10⁷，用Trizol（TAKARA公司）提取总RNA，按厂家说明书进行。

使用通用型简并性引物克隆OPs抗体的重、轻链可变区基因，通用型简并性引物见表1，引物组筛选方法及抗体基因的克隆方法与实施例1相同。

筛选出的引物组合为： HB1-HF4，HB8-HF4，HB9-HF4，HB12-HF4，HB15-HF4，HB18-HF4，LB1-LF1，LB5-LF2，LB11-LF1，LB17-LF1，LB17-LF2。

2. 抗OPs单链抗体重链（OPs-V_H）和轻链（OPs-V_L）基因序列分析

经过引物配对组合后，重链OPs-V_H有6个组合的扩增产物大小在350bp左右，条带清晰单一，命名为OPs-V_H1、OPs-V_H2、OPs-V_H3、OPs-V_H4、OPs-V_H5、OPs-V_H6，轻链OPs-V_L有5个组合的大小在320bp左右，条带清晰单一，命名为OPs-V_L1、OPs-V_L2、OPs-V_L3、OPs-V_L4、OPs-V_L5。其测序结果通过DNAman软件调整后，获取完整的正向序列。以FASTA格式输入IMGT进行鼠源抗体可变区基因序列分析。网址如下：http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg。

OPs-V_H1、OPs-V_H2、OPs-V_H3、OPs-V_H4、OPs-V_H5、OPs-V_H6及OPs-V_L1、OPs-V_L2、OPs-V_L3、OPs-V_L4、OPs-V_L5的基因序列及其在IMGT中的分析结果如下：

（1）OPs-V_H3：该重链序列V-D-J重排正确，并且归属到IGHV6的鼠源胚系抗体序列中，同源性在95%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:34。

OPs-V_H5经过IMGT数据库分析，结果显示与OPs-V_H3为同一基因。

（2）OPs-V_H1：该重链OPs-V_H1的抗体重链基因是假性基因，经过分析，该错误抗体基因来自于融合伴侣瘤细胞SP2/0，具体表现为CDR1、2读框缺失，没有产生重排的抗体基因，并且存在终止密码子，失去抗体的识别及表达功能。序列如SEQ ID NO:35。

（3）OPs-V_H2、OPs-V_H4、OPs-V_H6经过IMGT数据库分析，结果显示与OPs-V_H1为同一基因。

（4）OPs-V_L2：该轻链序列V-J重排正确，并且归属到IGKV12鼠源胚系抗体序列中，同源性在95%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:36。

（5）OPs-V_L5经过IMGT数据库分析，结果显示与OPs-V_H2为同一基因。

（6）OPs-V_L1：该抗体轻链基因是假性基因，经过分析，该错误抗体基因来自于融合伴侣瘤细胞SP2/0，具体表现为CDR3读框移动，而且存在“GTATCC”BciVI酶切位点（黄色标记），该酶切位点是瘤细胞SP2/0抗体基因的特异酶切位点，序列如SEQ ID NO:37。

（7）OPs-V_L3、OPs-V_L4的分析结果和OPs-V_L1相同，均克隆了来源于融合伴侣瘤细胞SP2/0的假基因。

经过以上分析，选择OPs-V_H3作为单链抗体的重链，OPs-V_L2为单链抗体的轻链。进入下一步分析。

3. OPs-scFv候选基因蛋白三维模型构建与分子对接分析

利用RosettaAntibody: F_V Homology Modeling Server在线同源模拟工具，在其网页中输入OPs-scFv候选基因OPs-V_H3和OPs-V_L2翻译后的氨基酸序列SEQ ID NO:38 和SEQ ID NO:39，提交后生成OPs-scFv三维结构模型。在线同源模拟获取的抗体三维结构模型显示：轻、重链存在二硫键，而且空间上比较接近；轻重链能形成完整的疏水口袋；重链三个CDR和轻链三个CDR区紧密围绕疏水口袋。使用GOLD程序遗传算法将OPs-scFv三维模型的六个CDR区域和蝇毒磷、对硫磷、辛硫磷分子进行柔性对接，充分搜索构象空间，找到相互作用的最优模式。采用GOLDSCORE打分函数得到分子相互作用的拟合度数值，数值大小来判断分子对接的好坏，越大则相互作用越强，形成的包合物能量越低，越稳定，结果如说明书附图7C(a)-(c)所示，GOLDSCORE打分函数得到的拟合度数值依次为42.91、31.96、33.32。

4. OPs-scFv候选基因融合酶蛋白的可溶性表达和活性检测

（1）PCR扩增OPs-V_H3-Linker片段：以OPs-V_H3为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO:9、10所示。

反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物序列如SEQ ID NO:40。

（2）PCR扩增OPs-V_L2-Linker片段。以OPs-V_L2为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO: 11、12所示。扩增OPs-V_L2-Linker片段，反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物序列如SEQ ID NO:41。

（3）PCR扩增OPs-scFv。将扩增得到的OPs-V_H3-Linker片段和OPs-V_L2-Linker片段等比例混合，通过重叠延伸PCR法拼接scFv。反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共10个循环，最后72℃延伸10min。所得到的PCR产物即为拼接产物，以拼接产物为模板，SEQ ID NO:9、12所示的序列为上下游引物，再进行PCR扩增，反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物即为OPs-scFv，序列如SEQ ID NO:42。

（4）表达载体的构建。OPs-scFv片段和pDAP2表达载体用Sfi I和Not I进行双酶切，纯化回收后，使用T4连接酶进行连接反应，次日，将连接反应产物转化BL21感受态细胞。

（6）OPs-scFv-AP融合蛋白的活性鉴定

用包被液（0.1 mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6）稀释半抗原H1- Ovalbumin至1 μg/mL，包被ELISA 96孔板，每孔加入100 μL，37℃过夜。次日，用PBST(PBS含0.5%Tween)洗板两次，加入PBST-5%BSA封闭，37℃孵育3小时，甩去封闭液，37℃烘干酶标板，备用。

将各种有机磷农药标准品以PBS稀释液配制成不同浓度梯度的OPs标准品工作液，在酶标板孔中加入标品工作液与融合酶抗体，37℃反应1小时，洗板6次，加入碱性磷酸酶底物缓冲液（10%二乙醇胺，0.5 mM MgCl₂，pH值9.8；底物：1 mg/mL p-NPP.）100 μL，37℃反应20min，以Wallac Victor³1420多标记分析仪测量其405 nm吸光值。基于碱性磷酸酶的一步法ELISA方法对蝇毒磷、对硫磷、辛硫磷的抑制标准曲线如图8所示，检测其他有机磷农药的灵敏度及特异性如表3所示。

表3抗OPs-scFv-AP对有机磷农药的特异性及灵敏度

药物	IC₅₀（μg/mL）	CR（%）^b	LOD^c
				半抗原H1	0.7315	100.0	0.0109
蝇毒磷	0.0058	15761.9	3.89×10^-5
				对硫磷	0.0267	2749.1	2.58×10^-5
除线磷	0.546	145.5	7.0×10^-5
				辛硫磷	0.206	364.9	1.0×10^-4
乙基谷硫磷	0.335	259.8	8.3×10^-4
				喹硫磷	0.339	221.8	1.9×10^-4
三唑磷	0.409	193.0	2.3×10^-4
				伏杀硫磷	0.660	140.4	1.5×10^-7
甲拌磷	1.479	44.4	5.0×10^-3
				乙拌磷	1.409	49.1	9.7×10^-4
毒死蜱	1.664	53.1	7.4×10^-3
				乙基溴硫磷	2.959	33.6	3.16×10^-3
治螟磷	0.757	107.3	1.66×10^-3
				氯唑磷	1.609	49.1	0.0214
二嗪磷	12.699	6.0	0.0459
				乙基嘧啶磷	>100	<0.8	–
特丁硫磷	57.52	1.3	0.083
				乙硫磷	>100	<1.0	–

实施例4 抗CBL的单链抗体制备

1. 抗CBL的抗体可变区基因的克隆

CBL单克隆杂交瘤细胞5D1（本实验室保存）复苏后，在RPMI 1640完全培养基扩大培养至1×10⁷，用Trizol（TAKARA公司）提取总RNA，按厂家说明书进行。

使用通用型简并性引物克隆CBL抗体的重、轻链可变区基因，通用型简并性引物见表1，引物组筛选方法及抗体基因的克隆方法与实施例1相同。

筛选出的引物组合为： HB8-HF5，HB10-HF4，HB10-HF5，HB12-HF5，LB4-LF1，LB6-LF1，LB7-LF2，LB8-LF2，LB8-LF3，LB13-LF2，LB16-LF1。

2. 抗CBL单链抗体重链（CBL-V_H）和轻链（CBL-V_L）基因序列分析

经过引物配对组合后，重链CBL-V_H有4个组合的扩增产物大小在350bp左右，条带清晰单一，命名为CBL-V_H1、CBL-V_H2、CBL-V_H3、CBL-V_H4，轻链CBL-V_L有7个组合的大小在320bp左右，条带清晰单一，命名为CBL-V_L1、CBL-V_L2、CBL-V_L3、CBL-V_L4、CBL-V_L5、CBL-V_L6、CBL-V_L7。其测序结果通过DNAman软件调整后，获取完整的正向序列。以FASTA格式输入IMGT进行鼠源抗体可变区基因序列分析。网址如下：http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg。

CBL-V_H1、CBL-V_H2、CBL-V_H3、CBL-V_H4及CBL-V_L1、CBL-V_L2、CBL-V_L3、CBL-V_L4、CBL-V_L5、CBL-V_L6、CBL-V_L7的基因序列及其在IMGT中的分析结果如下：

（1）CBL-V_H1：该重链序列V-D-J重排正确，并且归属到IGHV5的鼠源胚系抗体序列中，同源性在80%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:43。

CBL-V_H2、CBL-V_H3、CBL-V_H4经过IMGT数据库分析，结果显示与CBL-V_H1为同一基因。

（2）CBL-V_L3：该轻链序列V-J重排正确，并且归属到IGKV4鼠源胚系抗体序列中，同源性在94%以上。按照IMGT数据库成功划分4个FR区和3个CDR区，没有出现终止子，序列如SEQ ID NO:44。

（3）CBL-V_L5、CBL-V_L6经过IMGT数据库分析，结果显示与CBL-V_H3为同一基因。

（4）CBL-V_L1：该抗体轻链基因是假性基因，经过分析，该错误抗体基因来自于融合伴侣瘤细胞SP2/0，具体表现为CDR3读框移动，而且存在“GTATCC”BciVI酶切位点，该酶切位点是瘤细胞SP2/0抗体基因的特异酶切位点，序列如SEQ ID NO:45。

（5）组合CBL-V_L2、CBL-V_L4、CBL-V_L7的分析结果和CBL-V_L1相同，均克隆了来源于瘤细胞SP2/0的假基因。

经过以上分析，选择CBL-V_H1作为单链抗体的重链，CBL-V_L3为单链抗体的轻链。进入下一步分析。

3. CBL-scFv候选基因蛋白三维模型构建与分子对接分析

利用RosettaAntibody: F_V Homology Modeling Server在线同源模拟工具，在其网页中输入CBL-scFv候选基因CBL-V_H1和CBL-V_L3翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，提交后生成CBL-scFv三维结构模型。在线同源模拟获取的抗体三维结构模型显示：轻、重链存在二硫键，而且空间上比较接近；轻重链能形成完整的疏水口袋；重链三个CDR和轻链三个CDR区紧密围绕疏水口袋。使用GOLD程序遗传算法将CBL-scFv三维模型的六个CDR区域和CBL分子进行柔性对接，充分搜索构象空间，找到相互作用的最优模式。采用GOLDSCORE打分函数得到分子相互作用的拟合度数值, 数值大小来判断分子对接的好坏，越大则相互作用越强，形成的包合物能量越低，越稳定，结果如说明书附图9所示，GOLDSCORE打分函数得到的拟合度数值为32.36。

4. CBL-scFv候选基因融合酶蛋白的可溶性表达和活性检测

（1）PCR扩增CBL-V_H1-Linker片段以CBL-V_H1为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO:9、10所示。

反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物序列如SEQ ID NO:48。

（2）PCR扩增CBL-V_L3-Linker片段。以CBL-V_L3为模板，上下游引物序列如SEQ ID NO: 11、12所示。扩增CBL-V_L2-Linker片段，反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物序列如SEQ ID NO:49。

（3）PCR扩增CBL-scFv。将扩增得到的CBL-V_H1-Linker片段和CBL-V_L3-Linker片段等比例混合，通过重叠延伸PCR法拼接scFv。反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共10个循环，最后72℃延伸10min。所得到的PCR产物即为拼接产物，以拼接产物为模板，SEQ ID NO:9、12所示的序列为上下游引物，再进行PCR扩增，反应程序是94℃ 2min预变性，进行以下循环：94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃ 延伸10min。扩增产物即为CBL-scFv，序列如SEQ ID NO:50。

（4）表达载体的构建。CBL-scFv片段和pDAP2表达载体用Sfi I和Not I进行双酶切，纯化回收后，使用T4连接酶进行连接反应，次日，将连接反应产物转化BL21感受态细胞。

（6）CBL-scFv-AP融合蛋白的活性鉴定

用包被液（0.1 mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6）稀释CBL-Ovalbumin至1μg/mL，包被ELISA 96孔板，每孔加入100 μL，37℃过夜。次日，用PBST(PBS含0.5%Tween)洗板两次，加入PBST-5%BSA封闭，37℃孵育3小时，甩去封闭液，37℃烘干酶标板，备用。

将CBL盐酸盐以PBST稀释液配制成浓度梯度为0、0.1、1、10、100、1000 ng/mL的CBL标准品工作液，在酶标板孔中加入标品工作液与融合酶抗体，37℃反应1小时，洗板6次，加入碱性磷酸酶底物缓冲液（10%二乙醇胺，0.5 mM MgCl₂，pH9.8；底物：1 mg/mL p-NPP.）100 μL，37℃反应20 min，以Wallac Victor³1420多标记分析仪测量其405 nm吸光值。基于碱性磷酸酶的一步法ELISA（IC₅₀）为4.74 ng/mL，最低检测限为0.81 ng/mL、检测范围（IC₂₀-IC₈₀）在1.13-69.68 ng/mL之间结果如说明书附图10所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法

<130>

<160> 100

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttagtgcgg cccagccggc catggatgtg caactggtg 39

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccagagcca cctccgcctg aaccgcctcc acccgaggag acggtgac 48

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacattttga tgacccag 48

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggcatcgc ggccgcacgt ttgatttcca gcttggt 37

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttagtgcgg cccagccggc catggaagtg aaagttgag 39

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccagagcca cctccgcctg aaccgcctcc acccgcagag acagtgacc 49

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg aacattgtaa tgacacag 48

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtggcatcgc ggccgctttt attccagctt g 31

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttagtgcgg cccagccggc catggcccag gtcaaactgc a 41

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gccagagcca cctccgcctg aaccgcctcc acccgaggag acggtgactg agg 53

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gatattctga tgacccagtc 50

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtggcatcgc ggccgcacgt ttgatttcca gctt 34

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttagtgcgg cccagccggc catggcccag gtcaaactgc agg 43

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccagagcca cctccgcctg aaccgcctcc acctgaggag acggtgaccg 50

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacatcgagc tcactcagtc tc 52

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtggcatcgc ggccgcccgt tttatttcca gcct 34

<210> 17

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatgtgcaac tggtggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacatattct acagtggtag cactagctac 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat atttctgtgc aagattagcc 300

tactactatg attacgacgg ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcctcg 369

<210> 18

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gacattttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtgatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tatttgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ccaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgt 339

<210> 19

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gt 332

<210> 20

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ala Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 22

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gttagtgcgg cccagccggc catggatgtg caactggtgg agtcgggacc tggcctggtg 60

aaaccttctc agtctctgtc cctcacctgc actgtcactg gctactcaat caccagtgat 120

tatgcctgga actggatccg gcagtttcca ggaaacaaac tggagtggat gggctacata 180

ttctacagtg gtagcactag ctacaaccca tctctcaaaa gtcgaatctc tatcactcga 240

gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag ttgaattctg tgactactga ggacacagcc 300

acatatttct gtgcaagatt agcctactac tatgattacg acggctatgc tatggactac 360

tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcgggtggag gcggttcagg aggcggtggc 420

tctggc 426

<210> 23

<211> 385

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacattttga tgacccagac tccactctcc 60

ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gaacattgta 120

catagtgatg gaaacaccta tttagaatgg tatttgcaga aaccaggcca gtctccaaag 180

ctcctgatct ccaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt 240

ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt 300

tattactgct ttcaaggttc acatgttccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa 360

atcaaacgtg cggccgcgat gccac 385

<210> 24

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gttagtgcgg cccagccggc catggatgtg caactggtgg agtcgggacc tggcctggtg 60

aaaccttctc agtctctgtc cctcacctgc actgtcactg gctactcaat caccagtgat 120

tatgcctgga actggatccg gcagtttcca ggaaacaaac tggagtggat gggctacata 180

ttctacagtg gtagcactag ctacaaccca tctctcaaaa gtcgaatctc tatcactcga 240

gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag ttgaattctg tgactactga ggacacagcc 300

acatatttct gtgcaagatt agcctactac tatgattacg acggctatgc tatggactac 360

tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcgggtgggg cggttcaggc ggaggtggct 420

ctggcggtgg cggatcggac attttgatga cccagactcc actctccctg cctgtcagtc 480

ttggagatca agcctccatc tcttgcagat ctagtcagaa cattgtacat agtgatggaa 540

acacctattt agaatggtat ttgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctcca 600

aagtttccaa ccgattttct ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag 660

atttcacact caagatcagc agagtggagg ctgaggatct gggaatttat tactgctttc 720

aaggttcaca tgttccgtgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtgcgg 780

ccgcgatgcc ac 792

<210> 25

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gaagtgaaag ttgaggagtc tggaggaggc ttggttcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcttgtgctg cctctggatt cactttcagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgag attagaagca gagctgataa tcatgcaaca 180

tactatgctg agtctgtgaa agggagattc accatctcaa gagatgattc caaaagtggt 240

ctctacctgc aaatgaacaa cttaagaact gaagacactg gcatttatta ctgtactctc 300

tataggcctg gttactgggg cctagggact ctggtcactg tctctgcg 348

<210> 26

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

caggttactc traaagagtg tggcagtcag gaccgggcct agtgcagccc tcacagagcc 60

tgtccatcac ctgcacagtc tctggtttct cattaactag gaatggtgta cgctgggttc 120

gccagtctcc aggatagggt ctggggtggc tgggactgat ttggagtggt ggaaataaag 180

actctaacgc agctctcata tccggtcgga gcatcagcaa ggacatttcc aagagccaag 240

ttttctttaa agtgaacagt ctgcaaactc atgacacagc catttatttc tgtgtctcga 300

tcctatggct acgggatttg cttactgggg ccaagggact ccggtcac 348

<210> 27

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aacattgtaa tgacacagtc tccaaaattc atgtccacat caataggaga cagggtcacc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggg actagtgtag cctggcatca acagagacca 120

ggacaatctc ctaaagtact gattcattcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagaaa tgtccagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcaacaa tataaaaact atccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 28

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggagacattg tgatgaccca gtctcctgct tccttagctg tatctctggg gcagagggcc 60

accatctcat acagggccag caaaagtgtc agtacatctg gctatagtta tatgcactgg 120

aaccaacaga aaccaggaca gccacccaga ctcctcatct atcttgtatc caacctagaa 180

tctggggtcc ctgccaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac cctcaacatc 240

catcctgtgg aggaggagga tgctgcaacc tattactgtc agcacattag ggagcttaca 300

cgttcggagg ggggaccaaa ctggaactga agcgcgct 338

<210> 29

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Arg Ala Asp Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Gly

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Leu Tyr Arg Pro Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp His Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

His Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Lys Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gttagtgcgg cccagccggc catggaagtg aaagttgagg agtctggagg aggcttggtt 60

caacctggag gatccatgaa actctcttgt gctgcctctg gattcacttt cagtgacgcc 120

tggatggact gggtccgcca gtctccagag aaggggcttg agtgggttgc tgagattaga 180

agcagagctg ataatcatgc aacatactat gctgagtctg tgaaagggag attcaccatc 240

tcaagagatg attccaaaag tggtctctac ctgcaaatga acaacttaag aactgaagac 300

actggcattt attactgtac tctctatagg cctggttact ggggcctagg gactctggtc 360

actgtctctg cgggtggagg cggttcagga ggcggtggct ctggc 405

<210> 32

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg aacattgtaa tgacacagtc tccaaaattc 60

atgtccacat caataggaga cagggtcacc gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggg 120

actagtgtag cctggcatca acagagacca ggacaatctc ctaaagtact gattcattcg 180

gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat 240

ttcactctca ccatcagaaa tgtccagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcaacaa 300

tataaaaact atccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa agcggccgcg 360

atgccac 367

<210> 33

<211> 754

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gttagtgcgg cccagccggc catggaagtg aaagttgagg agtctggagg aggcttggtt 60

caacctggag gatccatgaa actctcttgt gctgcctctg gattcacttt cagtgacgcc 120

tggatggact gggtccgcca gtctccagag aaggggcttg agtgggttgc tgagattaga 180

agcagagctg ataatcatgc aacatactat gctgagtctg tgaaagggag attcaccatc 240

tcaagagatg attccaaaag tggtctctac ctgcaaatga acaacttaag aactgaagac 300

actggcattt attactgtac tctctatagg cctggttact ggggcctagg gactctggtc 360

actgtctctg cgggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgaac 420

attgtaatga cacagtctcc aaaattcatg tccacatcaa taggagacag ggtcaccgtc 480

acctgcaagg ccagtcagaa tgtggggact agtgtagcct ggcatcaaca gagaccagga 540

caatctccta aagtactgat tcattcggca tcctaccggt acagtggagt ccctgatcgc 600

ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagaaatgt ccagtctgaa 660

gacttggcag agtatttctg tcaacaatat aaaaactatc cgtacacgtt cggagggggg 720

accaagctgg aaataaaagc ggccgcgatg ccac 754

<210> 34

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gaagtgaaag ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcctgtgttg cctctggaat cactttcagt cactactgga tgaattgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga gatttagtaa tcatgtaaca 180

caatatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatgtcaa gagacgattc caaaagtagt 240

gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtaccagc 300

atctactatg ataacctgta ctacgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcctcg 369

<210> 35

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cgaggagacg gtgactgagg ttcaccatgt caagagacga ttccaaaagt agtgtctacc 60

tgcaaatgaa caacttaaga gctgaagaca ctggcactta ttactgtacc agcatctact 120

atgataacct gtactacgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct 180

cgacctcagt caccgtctcc tcgaccactc tcacagtctc ctcga 225

<210> 36

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gatattctga tgacccagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga aaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcaactcct ggtctattat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcggcct 240

gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggacta ctcctcggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgt 324

<210> 37

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gatattttgc tgactcagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gt 332

<210> 38

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Arg Phe Ser Asn His Val Thr Gln Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Ile Tyr Tyr Asp Asn Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 39

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Tyr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Arg Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 40

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gttagtgcgg cccagccggc catggaagtg aaagttgagg agtctggagg aggcttggtg 60

caacctggag gatccatgaa actctcctgt gttgcctctg gaatcacttt cagtcactac 120

tggatgaatt gggtccgcca gtctccagag aaggggcttg agtgggttgc tgaaattaga 180

ttgagattta gtaatcatgt aacacaatat gcggagtctg tgaaagggag gttcaccatg 240

tcaagagacg attccaaaag tagtgtctac ctgcaaatga acaacttaag agctgaagac 300

actggcattt attactgtac cagcatctac tatgataacc tgtactacgc tatggactac 360

tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcgggtggag gcggttcagg aggcggtggc 420

tctggc 426

<210> 41

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gatattctga tgacccagtc tccagcctcc 60

ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc atcacatgtc gagcaagtga aaatattcac 120

aattatttag catggtatca gcagaaacag ggaaaatctc ctcaactcct ggtctattat 180

gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa 240

tattctctca agatcaacag cctgcggcct gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat 300

ttttggacta ctcctcggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa acgtgcggcc 360

gcgatgccac 370

<210> 42

<211> 778

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gttagtgcgg cccagccggc catggaagtg aaagttgagg agtctggagg aggcttggtg 60

caacctggag gatccatgaa actctcctgt gttgcctctg gaatcacttt cagtcactac 120

tggatgaatt gggtccgcca gtctccagag aaggggcttg agtgggttgc tgaaattaga 180

ttgagattta gtaatcatgt aacacaatat gcggagtctg tgaaagggag gttcaccatg 240

tcaagagacg attccaaaag tagtgtctac ctgcaaatga acaacttaag agctgaagac 300

actggcattt attactgtac cagcatctac tatgataacc tgtactacgc tatggactac 360

tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcgggtggag gcggttcagg cggaggtggc 420

tctggcggtg gcggatcgga tattctgatg acccagtctc cagcctccct atctgcatct 480

gtgggagaaa ctgtcaccat cacatgtcga gcaagtgaaa atattcacaa ttatttagca 540

tggtatcagc agaaacaggg aaaatctcct caactcctgg tctattatgc aaaaacctta 600

gcagatggtg tgccatcaag gttcagtggc agtggatcag gaacacaata ttctctcaag 660

atcaacagcc tgcggcctga agattttggg acttattact gtcaacattt ttggactact 720

cctcggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gtgcggccgc gatgccac 778

<210> 43

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gaggtgcagc tggtggagtc gtcaggggga ggcttagtga agcctagagg gtccctgaaa 60

ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc agcagctatg acatgtcttg ggttcgccag 120

actccggaga agaggctgga gtgggtcgca tcaattagaa gtggtggtta ttacaccctc 180

tatccggaca gtgtgaaggg gcgattcacc atctccagag acaatgtcaa gaacaccctg 240

tacctacaaa tgagcagtct gaggtctgag gacacggcca tgtattactg ttcacgagat 300

ggtaacgacg aatacttcga tgtctggggc gcaggcacca cggtcaccgt ctcctca 357

<210> 44

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gacatccaga tgacacagac tccagcaatc ctgtcagcat ctccagggga aaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccaattc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcacgc 120

acctccccca aactctggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaggtcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg aaactcttat tctctcacga tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgttgcca cttattactg ttttcagggg agtaagtacc cattcacgtt cggctcgggg 300

accaagctgg aaataaaacg t 321

<210> 45

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gacattgtga tgactcagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gt 332

<210> 46

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Arg

1 5 10 15

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ser Arg Asp Gly Asn Asp Glu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Arg Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Lys Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 48

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gttagtgcgg cccagccggc catggaggtg cagctggtgg agtcgtcagg gggaggctta 60

gtgaagccta gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagcagc 120

tatgacatgt cttgggttcg ccagactccg gagaagaggc tggagtgggt cgcatcaatt 180

agaagtggtg gttattacac cctctatccg gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc 240

agagacaatg tcaagaacac cctgtaccta caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg 300

gccatgtatt actgttcacg agatggtaac gacgaatact tcgatgtctg gggcgcaggc 360

accacggtca ccgtctcctc aggtggaggc ggttcaggag gcggtggctc tggc 414

<210> 49

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacatccaga tgacacagac tccagcaatc 60

ctgtcagcat ctccagggga aaaggtcacc atgacctgca gtgccaattc aagtgtaagt 120

tacatgcact ggtaccagca gaagtcacgc acctccccca aactctggat ttatgacaca 180

tccaaactgg cttctggagt cccaggtcgc ttcagtggca gtgggtctgg aaactcttat 240

tctctcacga tcagcagcat ggaggctgaa gatgttgcca cttattactg ttttcagggg 300

agtaagtacc cattcacgtt cggctcgggg accaagctgg aaataaaacg tgcggccgcg 360

atgccac 367

<210> 50

<211> 763

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gttagtgcgg cccagccggc catggaggtg cagctggtgg agtcgtcagg gggaggctta 60

gtgaagccta gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagcagc 120

tatgacatgt cttgggttcg ccagactccg gagaagaggc tggagtgggt cgcatcaatt 180

agaagtggtg gttattacac cctctatccg gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc 240

agagacaatg tcaagaacac cctgtaccta caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg 300

gccatgtatt actgttcacg agatggtaac gacgaatact tcgatgtctg gggcgcaggc 360

accacggtca ccgtctcctc aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420

ggatcggaca tccagatgac acagactcca gcaatcctgt cagcatctcc aggggaaaag 480

gtcaccatga cctgcagtgc caattcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 540

tcacgcacct cccccaaact ctggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccca 600

ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggaaac tcttattctc tcacgatcag cagcatggag 660

gctgaagatg ttgccactta ttactgtttt caggggagta agtacccatt cacgttcggc 720

tcggggacca agctggaaat aaaacgtgcg gccgcgatgc cac 763

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gayatccagc tgactcagcc 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gakgtrmagc ttcaggagtc 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

gayattgttc tcwcccagtc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gaggtbcagc tbcagcagtc 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gayattgtgm tmactcagtc 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

caggtgcagc tgaagsastc 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gayattgtgy tracacagtc 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gaggtccarc tgcaacartc 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gayattgtra tgacmcagtc 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

caggtycagc tbcagcartc 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

gayattmaga tramccagtc 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

caggtycarc tgcagcagtc 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

gayattcaga tgaydcagtc 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

caggtccacg tgaagcagtc 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

gayatycaga tgacacagac 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gaggtgaass tggtggaatc 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gayattgttc tcawccagtc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

gavgtgawgy tggtggagtc 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

gayattgwgc tsacccaatc 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

gaggtgcags kggtggagtc 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

gayattstra tgacccartc 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

gakgtgcamc tggtggagtc 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gayrttktga tgacccarac 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gaggtgaagc tgatggartc 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gayattgtga tgacbcagkc 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gaggtgcarc ttgttgagtc 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

gayattgtga taacycagga 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gargtraagc ttctcgagtc 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

gayattgtga tgacccagwt 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

gaagtgaars ttgaggagtc 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

gayattgtga tgacacaacc 20

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

caggttactc traaagwgts tg 22

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

gayattttgc tgactcagtc 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

caggtccaac tvcagcarcc 20

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

racattgtra tgacmcartc tcc 23

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

gatgtgaact tggaagtgtc 20

<210> 87

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

ggagacattg tgatgaccca gtc 23

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

gaggtgaagg tcatcgagtc 20

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

acgtttgatt tccagcttgg 20

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

cgaggaaacg gtgaccgtgg t 21

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

acgttttatt tccagcttgg 20

<210> 92

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

cgaggagact gtgagagtgg t 21

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

acgttttatt tccaactttg 20

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

cgcagagaca gtgaccagag t 21

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

acgtttcagc tccagcttgg 20

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

cgaggagacg gtgactgagg t 21

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

tttkatttcc agcttggtsc cyc 23

<210> 98

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

ygaggagacg gtgaccrkgg tsc 23

<210> 99

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

agcgcgcttc agttccagtt tgg 23

<210> 100

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

tgmrgaraca gtgaccrkrg tcc 23

Claims

1.一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）以杂交瘤细胞总mRNA为模板，Oligo dT为引物，反转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，在通用引物中筛选适当引物组，扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；所述杂交瘤为能够分泌抗目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤；

（2）步骤（1）得到的序列选择大小在300~500bp范围内，条带清晰单一的进行测序，序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；

（3）将候选重链和轻链可变区基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，将该三维模拟结构与相应目标抗原分子进行分子对接分析，选出分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因；

2.根据权利要求1所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤（1）所述在通用引物中筛选适当引物的方法为：先确定上游引物序列：将通用引物的上、下游引物分成两组，将下游引物组的所有引物等比例混合，混合物分别与上游引物组的每一条引物混合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定出该组的上游引物序列；将确定出具体序列的上游引物再分别与下游引物组中的每一条引物组合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定出该组的下游引物序列；依次类推，继续确定出其他引物组序列，完成筛选。

3.根据权利要求1所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤（3）所述三维结构同源模建是在RosettaAntibody: F_V Homology Modeling Server平台进行的。

4.根据权利要求1所述单链抗体的制备方法，其特征在于步骤（4）所述表达为酶融合可溶性表达，即将单链抗体基因插入到融合碱性磷酸酶蛋白基因的可溶性表达载体，进行表达。

5.权利要求1~4任意一项所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法在制备抗莱克多巴胺单链抗体、抗呋喃它酮代谢物单链抗体、抗有机磷单链抗体和/或抗克伦特罗单链抗体中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗莱克多巴胺单链抗体的杂交瘤细胞为AC2，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:1~2所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:3~4所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:1和4。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗呋喃它酮代谢物单链抗体的杂交瘤细胞为2BE，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:5~6所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:7~8所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:5和8。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗有机磷单链抗体的杂交瘤细胞为12C2，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:9~10所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:11~12所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:9和12。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗克伦特罗单链抗体的杂交瘤细胞为5D1，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:13~14所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:15~16所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:13和16。