CN110066770B - 分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用 - Google Patents

分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可以特异性结合莱克多巴胺的高亲和力单克隆抗体及其可变区氨基酸序列。本发明还提供了一株可以产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系(RAC S‑6‑10)。本发明所述抗体具有特异性识别并结合莱克多巴胺抗原的能力，可用于莱克多巴胺的检测。

Description

分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及 应用
技术领域
本发明涉及一株特异性结合莱克多巴胺的高亲和力单克隆抗体及其可变区氨基酸序列，以及分泌该抗体的细胞株和应用。
背景技术
莱克多巴胺(Ractopamine)是一种人工合成的β肾上腺受体激动剂，可用于治疗充血性心力衰竭症、肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积，并对胎儿和新生儿生长有益。莱克多巴胺正被作为一种新型瘦肉精被一些养猪场使用。对此药物在养殖业的适用范围和安全性世界各国的规定不尽相同。莱克多巴胺于1999年被美国食品药品管理局批准，但在欧盟、俄罗斯和中国被禁止用于生猪养殖。事实上，莱克多巴胺作为养猪添加剂，已遭到将近200个国家禁止。中国自2002年开始限制使用受体激动剂，2009年专门针对莱克多巴胺出台了禁令。
目前，国家及行业标准规定的莱克多巴胺权威检测方法为液相色谱-质谱技术。此方法灵敏度高、特异性强，可靠性好；但是依赖大型仪器，操作繁琐费时，成本较高，不能广泛推广使用。另外，基于抗原-抗体特异性结合的免疫学分析技术也可以被用于莱克多巴胺的检测，该方法灵敏度、特异性较好，不依赖于大型仪器，操作方便、时间短、成本低，是一种易于现场即时使用的检测技术。目前市场上有基于免疫层析等方法的多种莱克多巴胺检测试剂或试纸卡片在售。
基于免疫反应的检测方法核心是特异性识别莱克多巴胺的单克隆抗体，该抗体的结合灵敏度和特异性决定了检测试剂盒的质量，因此好的抗莱克多巴胺单克隆抗体的研制是该类检测试剂盒开发的关键前提。
发明内容
本发明提供了一株可以分泌特异性识别并高亲和力结合莱克多巴胺的单克隆抗体的细胞株。命名为杂交瘤细胞株RAC-S-6-10。该细胞株于2018年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2018165。
本发明还提供了上述细胞株分泌的可以特异性识别并高亲和力结合莱克多巴胺的单克隆抗体。
所述的单克隆抗体的可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ IDNO.2所示的轻链：
SEQ ID NO.1：
EVQLQQSGPGILQPSQTLTLTCSFYGFSLRTYGIGLGWVRQTSGKGLEWLAHIWWNDYKSYNTALKSRLTISKETSNNQVFLKISSVDTEDAATYYCTRIARIDYYSYGFAMDSWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.2：
DIVLTQSPLSLPVSLGDQVSISCRPSQSIVHSNGNTYLEWFLQKPGQSPKLLIYKASSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHIPWTFGGGTKLEIK
本发明还提供了上述细胞株或抗体在制备莱克多巴胺检测试剂盒中的应用，进行莱克多巴胺含量测定。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：首次获得高效结合莱克多巴胺抗原的单克隆抗体可变区基因序列，为后续抗体试剂应用于检测试剂盒时采用规模化表达生产提供了序列基础。
附图说明
图1抗莱克多巴胺ELISA效价检测。
图2可变区cDNA的5’race PCR结果，箭头表示目的片段。M：分子量标记；1：轻链可变区；2：重链可变区。
具体实施方式
以下为该抗体具体制备过程。如无特殊说明，本发明所述实验过程所用试剂、材料均为常规商品化试剂和材料，所用方法为标准实验方法(具体细节参照《抗体技术实验指南》(E.哈洛著科学出版社2005)和《抗体制备与使用实验指南》G.C.霍华德著科学出版社2010)，所提及学术专用名词及其英文缩写如无特殊说明均按照全国科学技术名词审定委员会编《免疫学名词》(科学出版社2008)的规定使用。
莱克多巴胺半抗原(莱克多巴胺BSA偶联物，简称RAC-BSA)购买自深圳安提生物。
小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0购自中科院细胞库。
实施例1动物免疫
实验动物采用Balb/c品系雌性6周龄小鼠。免疫流程：用RAC-BSA与Freund’s完全佐剂混合，乳化后，皮下多点注射进行免疫。RAC-BSA的剂量为0.1mg/次/只。首次免疫用完全Freund’s佐剂，再次免疫用不完全Freund’s佐剂。每次免疫的间隔时间为3周，共3次免疫。第三次免疫后，进行细胞融合前对小鼠进行回忆刺激，0.1mg抗原溶解于0.5ml PBS缓冲液中，腹腔注射。回忆刺激后3天，进行细胞融合和杂交瘤构建。
实施例2杂交瘤细胞株构建
细胞融合前一天制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml，小鼠脾细胞为1×106/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105/ml，均为100μl/孔。
(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液(RPMI1640)洗涤2次。
(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
(6)在室温下融合：30秒内加入预热的1ml 45％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。作用90秒钟。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
(7)离心，800rpm，6分钟。
(8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
(11)在融合24小时后，加HAT选择培养液。用时1ml加入50ml 20％小牛血清完全培养液中。37℃、5％CO2培养3-7天。该细胞株于2018年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2018165。
实施例3杂交瘤细胞株的单克隆化(有限稀释法)
(1)制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml，小鼠脾细胞为1×106/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105/ml，均为100μl/孔。
(2)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×103/ml
(3)取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
(4)培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。
(5)第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
(6)采用有限稀释法连续克隆阳性杂交瘤细胞3次。构建稳定细胞株，并扩大培养、冻存。
实施例4抗体生产
(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1～9周内种植细胞。
(2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用不完全培养液洗涤一次，1 000r/min离心10min。
(3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用不完全培养液配成1.0×107细胞/ml的悬液。
(4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml(含1.0×107个细胞/ml)。
(5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1～3天取1次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
实施例5抗体纯化
(1)小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1×105转离心30min，去沉淀。
(2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。
(3)此溶液置冰中30min～60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。
(4)将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混浊)。
(5)装入透析袋于Tris－HCl缓冲液(20mMol/L NaCl)中透析除盐。
(6)离心去沉淀。
(7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量：1A280unit＝0.8mg蛋白质。
一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg～36mg。
(8)过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为1ml～2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L～150mMol/L NaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。
实施例6检测莱克多巴胺抗原识别(ELISA)
(1)抗原包被。取抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液配制成一定浓度的包被液，混匀。加入96孔ELISA检测板，100ul/孔。置于4℃冰箱内过夜。
(2)封闭。洗板。加封闭液(0.5％BSA溶于PBS)，200ul/孔。37℃温箱温育2小时。
(3)加一抗(待测样品)。洗板。将处理好的一抗溶液【细胞融合后杂交瘤细胞培养上清液(实施例2中第11步所描述上清液)，或免疫抗原的小鼠血清(完成实施例1免疫程序7天后采用尾静脉采血分离制备的小鼠血清)稀释液，或实施例5纯化后的抗体】加到孔内，100ul/孔。37℃温箱温育2小时。
(4)加二抗。洗板。稀释好的二抗(商品化羊抗鼠Ig-HRP，如：ab6789，abcam，1:2000稀释使用)加入孔内。100ul/孔。37℃温育1小时。
(5)显色。洗板。配好TMB底物，加入孔中，100ul/孔。显色5～10min。加2M硫酸100ul/孔终止反应。
(6)检测。用酶标仪检测溶液在450nm下的吸光度OD值。得到数据。
ELISA检测结果表明，三种抗体对莱克多巴胺抗原具有特异性识别活性，最低稀释度达到了1:128000以上。
实施例7抗体基因序列获得
(1)RNA抽提
胰酶消化至RAC S-6-10细胞悬浮，1000rpm，5min离心，PBS洗涤两次，血球计数板确定细胞至107；加入1ml TRI REAGENT(Sigma-Aldrich)裂解，用微量移液器吹打混匀，室温5min之后加入200ul氯仿(剧烈摇匀，室温5min,冰上5min)；高速离心12000g，15min，4℃之后，取水相(600ul)加入等体积异丙醇(室温5min，冰上5min)，加完异丙醇立即上下颠倒5－10次混匀；高速离心12000g，15min，4℃，倾倒除去上清，并用移液器吸干；1ml 75％乙醇清洗一次，吹打均匀，离心7500g，5min，4℃去上清；在空气室温下干燥20min，加入50ulddH2O(DEPC treated)；检测OD值，1％agarose电泳以确定RNA的质量和浓度。
(2)RT-PCR与5’race PCR
将反转录引物Random Primer和RNA按比例混匀后，70℃水浴10min，冰浴2-3min；然后加入反转录系统其他试剂(Thermo Scientific Fisher)，37℃水浴1.5h，95℃水浴5min，冰浴，-20℃冻存。反转录后用持家基因HPRT引物进行聚合酶链式反应(PCR)，检测RNA反转录所得到的cDNA质量。
Figure GDA0002088351040000061
5′race PCR利用TdT酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5′末端时自动加上3-5个(dG)残基；然后用含有部分接头序列的通用引物Poly C(UniversalPrimer)作为上游引物，用基因特异引物作为下游引物，以G-cDNA为模板进行PCR，扩增目的基因5′末端的cDNA片段。获得cDNA之后，取1ul的cDNA加入3ul的dGTP和2ul的TdT酶(Promega)，在37℃温浴15分钟后迅速放入70℃温浴10分钟，即获得了加G尾的cDNA。
在50ul的PCR反应体系中，加入1ul的G尾cDNA模版、1ul的PolyC和特异性引物(表1)，在0.5ul的Taq Platium(Qiagen)的作用下进行扩增延伸；
表1扩增抗体可变区基因引物序列
Figure GDA0002088351040000062
反应条件为：
Figure GDA0002088351040000063
(3)酶切、连接、转化DH5a
胶回收获得PCR产物，在该末端平滑DNA片段的3'末端加上A尾，然后与pGEM-TVector(Promega)进行连接，16℃连接3h以上用于转化，也可置于4℃连接过夜。
连接System(10ul)
Figure GDA0002088351040000071
连接后取出感受态菌DH5a室温放置至半融状态。加入5ul重组质粒，轻搅至混匀。冰浴30min，42℃热休克45－50s，置冰上2－3min。加入500ul Amp－LB液体培养基，37℃摇床培养20－30min。取菌液300ul涂平板，37℃倒置培养12－16h。在得到一系列菌落后，通过蓝白斑筛选系统挑取阳性克隆，并且用PCR和酶切系统再次验证是否为阳性菌。获得阳性菌之后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行质粒测序。测得的结果表明：所述的单克隆抗体的可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ ID NO.2所示的轻链：
SEQ ID NO.1：
EVQLQQSGPGILQPSQTLTLTCSFYGFSLRTYGIGLGWVRQTSGKGLEWLAHIWWNDYKSYNTALKSRLTISKETSNNQVFLKISSVDTEDAATYYCTRIARIDYYSYGFAMDSWGQGTSVTVSS；
SEQ ID NO.2：
DIVLTQSPLSLPVSLGDQVSISCRPSQSIVHSNGNTYLEWFLQKPGQSPKLLIYKASSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHIPWTFGGGTKLEIK。
序列表
<110> 中抗生物医药（杭州）有限公司
<120> 分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Tyr Gly Phe Ser Leu Arg Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Gly Leu Gly Trp Val Arg Gln Thr Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Tyr Lys Ser Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Glu Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Arg Ile Ala Arg Ile Asp Tyr Tyr Ser Tyr Gly Phe Ala Met
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Pro Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (4)

1.分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株于2018年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO：C2018165。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的莱克多巴胺单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的重链可变区和SEQ ID NO.2所示的轻链可变区。
4.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备莱克多巴胺检测试剂盒中的应用。
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