CN110218250A - 一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，是利用草鱼补体成分5引物通过PCR扩增技术合成草鱼补体成分5基因序列，再克隆到pET‑28a‑SUMO表达载体后导入到大肠杆菌（E.coli Rosetta）中表达，纯化，得到pET‑28a‑SUMO‑补体成分5蛋白抗原，将该抗原多次免疫实验级日本大耳白兔，采血，收集抗血清，用pET‑28a‑SUMO‑补体成分5蛋白作抗原亲合纯化，得到浓缩的补体成分5多克隆抗体。通过本方法能得到满足后续实验需求的浓缩草鱼补体成分5多克隆抗体，为后续检测草鱼补体成分5的表达提供重要实验材料。

Description

一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法。

背景技术

补体成分5是第五个参与补体系统激活的效应分子，对炎症反应和细胞凋亡起到重要调控作用。补体成分5在诱导哺乳动物白细胞介素和肿瘤坏死因子的表达、增强机体免疫应答方面的功能得到了大量实验验证。

草鱼作为我国大量养殖的淡水鱼类，是我国居民重要的水产蛋白质来源。但是草鱼病害却一直威胁草鱼的健康养殖，成为限制草鱼大规模养殖的关键瓶颈之一，也是影响草鱼品质的重要因素。对草鱼免疫机制的研究将有助于指导预防草鱼疾病以及开发免疫力和抗逆性强的新品种。然而，作为重要的炎症反应和免疫应答调节因子的补体成分5在草鱼免疫应答过程中的作用及表达规律尚未得到充分地研究。

多克隆抗体被广泛应用于分子生物学实验和临床医学实验研究，成为分子生物学和临床医学研究的重要工具。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，利用本方法从草鱼补体成分5基因序列开始构建，能够得到符合后续检测要求的草鱼补体成分5多克隆抗体，为后续能有效检测草鱼在不同调节下补体成分5的表达调控规律提供了重要实验材料。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，该方法步骤如下：

(1)利用SEQ ID NO.1所示的pET-28a-SUMO-C5-F和SEQ ID NO.2所示的pET-28a-SUMO-C5-R引物对，构建如SEQ ID NO.3所示的草鱼补体成分5基因片段的重组表达载体，将该重组表达载体导入表达大肠杆菌中表达，纯化后获得草鱼补体成分5抗原；

(2)利用该草鱼补体成分5抗原免疫实验级日本大耳白兔，采血，收集抗血清，将抗血清纯化得到浓缩后的草鱼补体成分5多克隆抗体。

上述构建重组表达载体时的原核表达载体为pET-28a-SUMO；上述表达大肠杆菌为E.coli Rosetta。

上述提及的利用该草鱼补体成分5抗原免疫实验级日本大耳白兔的过程如下：第一次免疫采用的免疫剂量为0.6mg，使用完全弗氏佐剂；12天后进行第二次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫26天后进行第三次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫40天后进行第四次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3mg，使用不完全弗氏佐剂。

免疫日本大耳白兔的采血时间为第一次免疫后52天；将抗血清纯化是用草鱼补体成分5抗原作抗原亲和纯化。

本发明的有益效果在于：能够得到满足后续实验需求的浓缩草鱼补体成分5多克隆抗体，为后续检测草鱼补体成分5的表达提供重要实验材料。

附图说明

图1是本发明草鱼补体成分5目的基因PCR扩增产物电泳图。

图2是本发明草鱼补体成分5大肠杆菌表达后破菌纯化PAGE凝胶电泳图；

图中，1：0.4mg/mL BSA；2：Marker；3：上清2蛋白2倍稀释(2M尿素溶解包涵体)；4：上清2蛋白5倍稀释(2M尿素溶解包涵体)；

表明：PCR扩增得到的草鱼补体成分5基因序列在构建的大肠杆菌表达体系中充分表达，表达得到的蛋白质产物大小符合预期。

图3是本发明抗原WB和内源WB检测结果；

图中，上图为抗原WB，下图为内源WB。

图4是使用本发明得到的草鱼补体成分5抗体对患有肠出血病的草鱼肝脏和脾脏进行Western Blot杂交结果图；

图中：A为肝脏样品，B为脾脏样品，C为大鼠皮质样品。

具体实施方式

以下实施是对本发明的进一步说明和解释，而不是对本发明的限制。

实施例1 草鱼补体成分5基因片段的合成

以NCBI网站GenBank数据库中草鱼补体C5基因序列(检索号AUW36852.1)，采用Primer Premier 5软件设计目的基因序列扩增引物，而后按照载体同源臂序列、酶切位点和目的基因序列扩增引物的顺序构成最终用于扩增草鱼补体成分5基因的引物序列(引物由武汉爱博泰克生物科技有限公司合成)，其中酶切位点为NdeI-NotI和Kan+，引物序列如下：

pET-28a-SUMO-C5-F：5′-GAACAGATTGGTGGATCCGAAAAAGTATACTTAATC-3′，SEQ IDNO.1；

pET-28a-SUMO-C5-R：5′-TGCGGCCGCAAGCTTAGCAGAAGAAATCGCCTGAAGGAAG-3′，SEQID NO.2。

采用默克GenElute动物基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取草鱼DNA，以草鱼DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增(PCR反应体系为每50μl反应混合液包含终浓度为1×Buffer、10nmol引物、10μmol dNTP、2.5U Taq酶、50ng草鱼基因组DNA和35.5μl无菌水；PCR反应条件为95℃预变性5分钟，后接35个循环的常规PCR(94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸30秒)，最后72℃延伸10分钟)，预期大小为267bp。将扩增产物经凝胶回收后进行测序，与预期大小一致，结合参见图1，表明扩增产物即为草鱼补体成分5基因片段(如SEQID NO.3所示)。

实施例2 重组蛋白pET-28a-SUMO-补体成分5抗原的获得

将扩增得到的符合预期的草鱼补体成分5基因片段采用试剂盒(Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)进行纯化，按照pET-28a-SUMO表达载体(购自华越洋生物(北京)科技有限公司)说明书将纯化后的草鱼补体成分5基因片段连接到pET-28a-SUMO表达载体上，经测序确定连接正确后，导入大肠杆菌感受态细胞菌株E.coli Rosetta中，培养至OD₆₀₀为0.5-0.6。然后加入0.8mM IPTG，37℃诱导4小时以实现破菌，采用SDS-PAGE凝胶电泳对目的蛋白进行纯化，得到蛋白浓度和纯度达到免疫要求的草鱼补体成分5抗原即pET-28a-SUMO-补体成分5蛋白(pET-28a-SUMO-complement component 5蛋白)，大小为27kD(图2)。

实施例3 多克隆抗体的获得

挑选健康的6周大小的实验级日本大耳白兔(由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供)，稳定一周后首次从耳静脉采血10ml作为阴性对照，然后用得到的抗原多次免疫两只实验级日本大耳白兔，免疫部位为背部4个部位，每个部位注射250μl，第一次免疫采用的免疫剂量为0.6mg，使用完全弗氏佐剂；12天后进行第二次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫26天后进行第三次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫40天后进行第四次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3mg，使用不完全弗氏佐剂。第一次免疫后第52天，将免疫动物处死，取血，得到抗血清，将抗血清用浓度为3mg/ml的pET-28a-SUMO-补体成分5蛋白进行抗原亲和纯化，从两只实验级日本大耳白兔抗血清中分别得到浓度为2.24mg/ml和2.74mg/ml的浓缩草鱼补体成分5抗体，结合参见图3。

实施例4 抗体的检测验证

为了验证得到的抗体是否能够用于后续Western Blot实验，我们利用得到的草鱼补体成分5抗体检测草鱼补体成分5在患有肠出血病的草鱼肝脏和脾脏中的表达情况。首先从一尾患有肠出血病的草鱼样本采集肝脏和脾脏，分别剪取0.025g组织，用冰预冷PBS清洗组织后加入200μl RIPA裂解液于匀浆器中反复研磨组织直至看不到组织块；置于冰上10分钟，然后4℃、12000rpm离心15分钟，将离心后的上清分装转移至0.5ml离心管中用于后续实验。根据每个样品总蛋白量，按照上样量20μg点样至分离胶浓度为12％的PAGE胶中120V电泳至溴酚蓝到胶底部止。然后将草鱼补体成分5蛋白(28kD)进行转膜后用丽春红染膜检测蛋白转膜效率，而后用1×TBST缓冲液将丽春红洗净。用1×TBST缓冲液配制5％脱脂奶粉，将膜侵入室温放置90分钟。用1×TBST缓冲液将得到的浓缩草鱼补体成分5抗体按照750：1的比例稀释，将膜与抗体一起孵育，4℃过夜。孵育结束后，用1×TBST缓冲液洗涤3次，每次洗涤15分钟。然后用1×TBST缓冲液按照6000：1稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，将稀释后的二抗与膜共同孵育90分钟，然后用1×TBST缓冲液洗涤3次，每次洗涤15分钟。最后使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3分钟，用吸水纸吸尽液体后用保鲜膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光3分钟，显影冲洗。结果如图4所示，表明患有肠出血病的草鱼肝脏和脾脏中存在补体成分5的表达，而且表达量存在明显差异。也验证了通过本发明专利描述的方法能够得到用于草鱼补体成分5表达检测的浓缩草鱼补体成分5抗体。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法

<130> 006

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 1

gaacagattg gtggatccga aaaagtatac ttaatc 36

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 2

tgcggccgca agcttagcag aagaaatcgc ctgaaggaag 40

<210> 3

<211> 267

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 3

gaaaaagtat acttaatcac tgcacctaaa accctgcgtc tcgatgcttc agaaaatgtt 60

gtggtgcagt tgttcggtta tgaccaggaa actacagtag atcttcacct gaagaacaca 120

ctggcaccag attataaaga atatgcatct cagtccctga agctcaacgg cgcgaataac 180

tatcaagctt cggctacttt acggatcatg cctgtagatt tcacaaaaga ggacaaatat 240

gtcttccttc aggcgatttc ttctgct 267

Claims (6)

1.一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法步骤如下：

（1）利用SEQ ID NO.1所示的pET-28a-SUMO-C5-F和SEQ ID NO.2所示的pET-28a-SUMO-C5-R引物对，构建如SEQ ID NO.3所示的草鱼补体成分5基因片段的重组表达载体，将该重组表达载体导入表达大肠杆菌中表达，纯化后获得草鱼补体成分5抗原；

（2）利用该草鱼补体成分5抗原免疫实验级日本大耳白兔，采血，收集抗血清，将抗血清纯化得到浓缩后的草鱼补体成分5多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述构建重组表达载体时的原核表达载体为pET-28a-SUMO。

3.如权利要求1所述的一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述表达大肠杆菌为E. coli Rosetta。

4.如权利要求1所述的一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述利用该草鱼补体成分5抗原免疫实验级日本大耳白兔的过程如下：第一次免疫采用的免疫剂量为0.6 mg，使用完全弗氏佐剂；12天后进行第二次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3 mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫26天后进行第三次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3 mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫40天后进行第四次免疫，使用草鱼补体成分5抗原的剂量为0.3 mg，使用不完全弗氏佐剂。

5.如权利要求1所述的一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述采血时间为第一次免疫后52天。

6.如权利要求1所述的一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述将抗血清纯化是用草鱼补体成分5抗原作抗原亲和纯化。