CN110716035B - 基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法 - Google Patents

基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于细粒棘球蚴和多房棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴高通量药物筛选方法，包括以下步骤：分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α‑微管蛋白同型基因和11个β‑微管蛋白同型基因到质粒载体，得到包含质粒载体的蛋白表达基因工程菌；重组微管蛋白的表达及纯化；完成其体外聚合作用，将重组微管蛋白与待测药物进行共孵育，以药物对重组微管蛋白体外聚合的影响来筛选抗棘球蚴新药。本发明通过评价药物对微管蛋白聚合的促进或抑制作用，可以高效、简便、经济地高通量筛选基于微管蛋白的抗棘球蚴药物。本发明为抗棘球蚴病药物的筛选提供了新思路，可用于寻找有效的新药物或先导化合物，以治疗棘球蚴病。

Description

基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选 方法
技术领域
本发明涉及一种药物筛选方法，具体涉及一种基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法，属于生物医药领域。
背景技术
棘球蚴病（Hydatid diseases），也称为包虫病（Echinococcosis），是由棘球绦虫（Echinococcus spp.）的中绦期幼虫（棘球蚴）寄生在人类、偶蹄类和啮齿类动物等中间宿主所引起的人兽共患病，其中细粒棘球蚴（E. granulosus, Eg）和多房棘球蚴（E.multilocularis, Em）是两种最为重要的致病病原[参考：齐颜凤, 伍卫平. 棘球蚴病流行病学研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2013, 31(2):143-148；买买提江•吾买尔, 阿迪力•司马义, 伊斯拉音•乌斯曼,等. 2012年新疆维吾尔自治区人群棘球蚴病流行病学调查[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2016, 34(3):249-254.]。棘球蚴病呈现全球性分布，仅中亚地区的受威胁人口达2.7亿，预估全球患者近300万，每年新增病例达20万人[参见：Atkinson JA , Gray DJ, Clements AC, et al. Environmentalchanges impacting Echinococcus, transmission: research to support predictivesurveillance and control[J]. Global Change Biology, 2013, 19(3):677-688.]。我国是棘球蚴病的高度流行区，受威胁人口和患者数量均位居全球首位。该病所带来的危害十分严重，每年全球棘球蚴病的治疗费用和畜牧业经济损失高达30亿美元[Budke CM,Deplazes P, Torgerson PR. Global Socioeconomic Impact of CysticEchinococcosis[J]. Emerging Infectious Diseases, 2006, 12(2):296-303.]。
针对棘球蚴病，首选的治疗方案是进行手术治疗，但是由于多脏器感染、临床症状多在晚期出现等原因，药物化疗结合手术治疗成为其长期、必然的治疗手段。而对于失去手术治疗机会和不能耐受手术的患者而言，药物治疗则成为其唯一的治疗手段。目前，世界卫生组织（WHO）推荐的治疗药物包括阿苯达唑和甲苯达唑，但二者仍然存在吸收差、服药周期长和治愈率低（仅30%）等不足。由此可见，现有临床用药难以满足患者的需求。此外，现有的棘球蚴病药物研究同时存在筛选效率低、研究成本高等问题。因此亟需寻找新的有效替代药物和药物靶点，以促进棘球蚴病药物的研发。
微管广泛存在于几乎所有真核细胞中，参与维持细胞形态、细胞内运输等，在生物体的生长发育过程中发挥着重要作用。其中α-和β-微管蛋白所形成的二聚体是构成微管的基本单位，是重要的药物靶点。据文献报道，阿苯达唑等苯并咪唑类药物主要通过结合β-微管蛋白以抑制微管的正常组装来起作用。以此为切入点，本发明采用分子生物学技术克隆表达棘球蚴微管蛋白，以建立基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法，为抗棘球蚴病药物的筛选提供了新思路，有望用于寻找有效的新药物或先导化合物，以治疗棘球蚴病。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法。
申请人通过对细粒棘球蚴和多房棘球蚴的微管蛋白进行原核表达，并完成其体外聚合作用，探索将其建立成抗棘球蚴病高通量药物筛选方法的应用前景。当药物作用于所述聚合反应时，将促进或抑制微管蛋白的聚合，因此通过对比聚合速率的差异可达到快速筛选药物的目的。本发明构建的基于微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法，不局限于筛选现有的苯并咪唑类药物，还可用于筛选其他抗棘球蚴新药或先导化合物。
上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法的建立，包括以下步骤：
（1）基因工程菌的构建和验证：以pET-28a（+）和pET-30a（+）等原核表达质粒为载体，在强启动子T7的下游分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因（Eg/EmTUA1~Eg/EmTUA14）和11个β-微管蛋白同型基因（Eg/EmTUB1~Eg/EmTUB11），使重组表达的棘球蚴α-和β-微管蛋白的N端带上6个连续的组氨酸标签（6×His），得到的蛋白表达基因工程菌的质粒载体分别为pET28a/pET30a-Eg/EmTUA1 ~ pET28a/pET30a-Eg/EmTUA14和pET28a/pET30a-Eg/EmTUB1 ~ pET28a/pET30a-Eg/EmTUB11。
（2）重组微管蛋白的表达及纯化：将所述的蛋白表达基因工程菌的质粒载体通过热激法转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，得到重组BL21（DE3）细胞在LB培养基进行培养并用IPTG诱导表达，获得主要以包涵体形式存在的重组微管蛋白。利用镍离子（Ni2+）金属螯合亲和层析柱上复性方法大量获得纯化的重组微管蛋白。
（3）高通量药物筛选方法的构建：棘球蚴重组α-微管蛋白同型和β-微管蛋白同型可在0.25mg/mL~4mg/mL的浓度范围发生聚合，其聚合过程可用酶标仪检测其动力学特征。将能产生最佳聚合效果的相应浓度的重组微管蛋白与待测药物进行共孵育，并利用酶标仪进行检测，观察重组微管蛋白聚合效率发生的变化，以检测待测药物对重组微管蛋白体外聚合的影响，以此筛选基于棘球蚴微管蛋白的抗棘球蚴药物。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述在强启动子T7的下游分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~ Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~ Eg/EmTUB11具体为：在强启动子T7下游的多克隆位点处分别插入细粒棘球蚴和多房棘球蚴14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~Eg/EmTUB11，构建得到相应的重组载体，并对其进行测序验证。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述得到重组BL21（DE3）细胞后对其进行培养并诱导表达具体为：得到重组BL21（DE3）细胞在含50μ0胞在对卡那霉素的LB培养基，37℃进行培养并用0.1~1mM IPTG诱导表达。最优的技术方案如下：将重组BL21（DE3）细胞涂在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养板上，于37℃倒置培养过夜，然后挑取单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基内进行振摇培养至吸光度A450值达到0.5-0.7时，加入诱导剂0.1~1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达，待37℃振摇培养至吸光度A450值达到0.5-0.7后收集菌体，超声破碎大量获得以包涵体形式存在的重组微管蛋白。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述纯化具体包括如下步骤：
a. 对重组微管蛋白进行大量表达，收集菌体沉淀：利用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀，然后用缓冲液A充分悬浮菌体，并进行冰浴超声破碎，离心收集沉淀；所述缓冲液A由20 mMTris-HCl，300 mM NaCl，10mM 咪唑组成，其pH值为7.4；
b. 上述沉淀用缓冲液B悬浮溶解，离心收集上清；所述缓冲液B由20 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，10mM 咪唑，8M 尿素组成，其pH值为7.4；
c. 利用镍离子纯化柱进行蛋白纯化：首先利用缓冲液B对纯化柱进行柱平衡，然后将包涵体溶液上样后再用缓冲液B洗涤纯化柱；接着以低速用8M-0M尿素缓冲液对纯化柱进行线性梯度洗涤，使包涵体蛋白完成柱上复性，最后利用洗脱缓冲液C洗脱目标蛋白；所述缓冲液C由20 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，500mM 咪唑组成，其pH值为7.4。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，在重组微管蛋白的表达及纯化之间增加如下步骤：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）方法和免疫蛋白印迹(Western blot)法对表达的重组微管蛋白进行验证。优选的，所述验证步骤具体为：取1ml菌液作为未诱导组，剩余菌液加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达，摇培结束后，取1mL菌液做为诱导组；对未诱导组和诱导组的样品进行SDS-PAGE和Westernblot，检测观察目标蛋白表达情况。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）具体分为如下步骤：
a. 将适量100mM GTP加入至常规微管蛋白缓冲液General Tubulin Buffer制成GTP终浓度为1mM的G-PEM缓冲液，所述常规微管蛋白缓冲液由80mM PIPES，2mM MgCl2，0.5mM EGTA组成，其pH值为6.9；利用G-PEM缓冲液将重组微管蛋白制备成0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL六个梯度的微管蛋白混合液后置于处理好的96孔板内，立即将其放到酶标仪上进行动力学检测，检测条件为：37℃每分钟检测一次350nm处的吸光值，以观察并获得重组微管蛋白体外聚合的最佳浓度；
b. 分别将最佳聚合浓度的重组微管蛋白与待测药物加入处理好的96孔板内，以等量的溶剂作为对照组，立即用酶标仪进行动力学检测，观察重组微管蛋白聚合效率发生的变化，以检测待测药物对重组微管蛋白体外聚合的影响。
本发明主要术语的英文和中文对照：
（1） Eg（Echinococcus. granulosus，细粒棘球蚴）
（2） Em（Echinococcus. multilocularis，多房棘球蚴）
（3） GTP（Guanine trinucleotide phosphate，鸟嘌呤三核苷酸磷酸）
（4） PIPES（Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，哌嗪-1, 4-二乙磺酸）
（5） EGTA（Ethylene glycol tetraacetate，乙二醇四乙酸酯）
（6） EgTUA9（Echinococcus granulosus Tubulin-alpha9，细粒棘球蚴α9-微管蛋白）
（7） EgTUB4（E.granulosus Tubulin-beta4，细粒棘球蚴β4-微管蛋白）
（8） rEgTUA9（Recombinant E.granulosus Tubulin-alpha9，重组细粒棘球蚴α9-微管蛋白）
（9） rEgTUB4（Recombinant E.granulosus Tubulin-beta4，重组细粒棘球蚴β4-微管蛋白）
（10） rEmTUA9（Recombinant E. multilocularis Tubulin-alpha9，重组多房棘球蚴α9-微管蛋白）
（11） rEgTUB2（Recombinant E. multilocularis Tubulin-beta2，重组多房棘球蚴β2-微管蛋白）
（12） DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜）
（13） Colc（Colchicine，秋水仙素）
（14） OFZ（Oxfendazole，奥芬达唑）
（15） MBZ（Mebendazole，甲苯达唑）
（16） FLBZ（Flubendazole，氟苯达唑）
（17） ABZSN（Albendazole sulfone，阿苯达唑砜）
（18） ABZSO（Albendazole Sulfoxide，阿苯达唑亚砜）
（19） TCBZ（Triclabendazole，三氯苯达唑）
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：棘球蚴微管可参与维持细胞形态、细胞内运输等生物学功能，在寄生虫生长发育过程中发挥重要作用。其中微管蛋白异二聚体是构成微管的基本单位，是重要的药物靶点。本发明运用分子生物学技术对棘球蚴的多个微管蛋白同型分别进行原核表达和纯化，并实现了体外聚合。通过评价药物对不同微管蛋白同型聚合的促进或抑制作用，不仅可以高效、简便、经济地高通量筛选基于微管蛋白的抗棘球蚴药物，还可以针对特定的微管蛋白同型进行药物筛选。本发明为抗棘球蚴病药物的筛选提供了新思路，可用于寻找有效的新药物或先导化合物，以治疗棘球蚴病。
附图说明
图1：本发明的技术路线图。
图2：本发明实施例2的重组质粒转化感受态BL21(DE3)后挑取单克隆的菌落PCR验证结果示意图，其中，图2A 代表EgTUA9；图2B代表EgTUB4。
图3：本发明实施例2的重组质粒的双酶切验证结果示意图，其中，图3A 代表pET30a-EgTUA9；图3B代表pET30a-EgTUB4。
图4：本发明实施例3的重组微管蛋白的表达情况结果示意图，其中，图4A 代表rEgTUA9；图4B代表rEgTUB4。
图5：本发明实施例3的重组微管蛋白的抗His标签验证结果示意图，其中，图5A 代表rEgTUA9；图5B代表rEgTUB4。
图6：本发明实施例4的重组微管蛋白的特异性验证结果示意图，其中，图6A 代表rEgTUA9；图6B代表rEgTUB4。
图7：本发明实施例5的不同浓度重组微管蛋白的聚合情况结果示意图。
图8：本发明实施例5的重组微管蛋白聚合产物的透射电子显微镜观察结果示意图。
图9：本发明实施例5的待测药物对重组微管蛋白聚合作用影响的结果示意图，其中图9A代表细粒棘球蚴重组微管蛋白rEgTUA9和rEgTUB4，图9B代表多房棘球蚴重组微管蛋白rEmTUA9和rEmTUB2。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：基因工程菌的pET30a-EgTUA9和pET30a-EgTUB4质粒载体的构建（见图1的步骤1、2、3）
（1）以疫区患病绵羊的细粒棘球蚴囊为材料，在无菌条件下，收集原头节。用0.1%的亚甲基蓝溶液对原头节进行染色，并利用倒置显微镜观察，取活性大于95%的原头节用于后续实验。
（2）采用RNA提取试剂盒提取原头节RNA，并利用cDNA逆转录试剂盒获得细粒棘球蚴的cDNA；以上述cDNA为模板，用EgTUA9的上游引物CGCGAGCTCATGCGTGAATGTATCAGTAT（划线部分为Sac I的酶切位点），下游引物AGCGGCCGCTTAGTACTCCTCGCCCTCTT（划线部分为NotI的酶切位点）扩增出EgTUA9片段（1356bp）。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃ 40sec，60℃ 30sec，72℃ 90sec，35个循环；72℃延伸7min。将所扩增的EgTUA9基因PCR产物进行TA克隆连接至T载体T-Vector pMD19（simple）上，筛选阳性克隆并测序，我们将这个质粒命名为EgTUA9-T-pMD19。
（3）以上述cDNA为模板，用EgTUB4的上游引物CGCGGATCCATGCGAGAGATAGTACACGTT（划线部分为BamH I的酶切位点），下游引物CCCAAGCTTTTATGCTTCTTCCTCT（划线部分为HindIII的酶切位点）扩增出EgTUB4片段 （1332bp）。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃40sec，57℃ 30sec，72℃ 90sec，35个循环；72℃延伸7min。将所扩增的EgTUB4基因PCR产物进行TA克隆连接至T载体T-Vector pMD19（simple）上，筛选阳性克隆并测序，我们将这个质粒命名为EgTUB4-T-pMD19。
（4）在上述EgTUA9-T-pMD19和EgTUB4-T-pMD19质粒基础上，申请人分别将EgTUA9和EgTUB4继续亚克隆至原核表达载体pET-30a（+）或pET-28a（+）上，我们将获得的重组质粒分别命名为pET30a/28a-EgTUA9和pET30a/28a-EgTUB4。细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因（Eg/EmTUA1~Eg/EmTUA14）和11个β-微管蛋白同型基因（TUB1~TUB11）共25个基因，除了以上2个基因，其余23个基因按照上述方法进行载体的构建，上述细粒棘球蚴和多房棘球蚴的基因信息参见表1。
表1棘球蚴的微管蛋白基因信息
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2：基因工程菌重组质粒的转化及蛋白的诱导表达（见图1的步骤4）
（1）以pET30a-EgTUA9和pET30a-EgTUB4为例，描述基因工程菌重组质粒的转化及蛋白的诱导表达，其余棘球蚴微管蛋白的表达方法均与其一致：加入感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，冰上孵育30min，然后42℃热激90s，立即置于冰上孵育3min，再分别加入适量无抗性的LB液体培养基混匀，37℃振摇培养45min，然后涂于含50μg/mL卡那霉素LB固体板，37℃倒置培养过夜。
（2）挑取单克隆利用5mL含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基于37℃振摇培养过夜；分别对单克隆进行菌落PCR验证，结果如图2所示，出现了符合预期目标片段大小的条带；并抽提质粒进行双酶切验证，结果如图3所示，出现了符合预期目标片段大小的条带。
（3）取阳性克隆菌液转接至50mL含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中继续培养至A450值达到0.5-0.7时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃继续振荡培养4-6h诱导蛋白表达。
实施例3：重组微管蛋白表达验证（见图1的步骤5）
（1）蛋白诱导表达前取1mL菌液做为未诱导组，摇培结束后，取1mL菌液做为诱导组，未诱导组和诱导组的菌液离心收集菌体沉淀，加入上样缓冲液并混合均匀，备用。对剩余菌液进行离心收集菌体沉淀，并重悬于缓冲液A（20mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM 咪唑，pH7.4）中，并在冰上进行冰浴超声破碎，12000rpm离心20min，收集上清液，沉淀溶解于缓冲液B（20mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM 咪唑，8M尿素，pH7.4）中，分别从取适量上清液和沉淀溶液并加入等体积的上样缓冲液，分别标记为上清组和沉淀组；4组样品煮沸并离心，分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE），观察目标蛋白的表达情况，结果如图4所示，目标蛋白主要以包涵体形式进行表达。
（2）对上述包涵体溶液进行SDS-PAGE，并转至聚偏二氟乙烯膜（PDVF膜）上，然后用封闭液对膜进行室温封闭1h，回收封闭液并用TBST液（1×TBS，0.05%Tween 20）洗涤3次（5min/次）；分别以His标签抗体（小鼠）为一抗进行室温振摇孵育约1 h或4 ℃ 过夜；回收一抗，用TBST将PVDF膜洗涤5次（5min/次），再以辣根过氧化物酶（HRP）抗体（马抗鼠）为二抗室温振摇孵育约2 h；倒去二抗，用TBST将PVDF膜洗涤6次（5 min/次），进行ECL显示观察，结果如图5所示，重组微管蛋白rEgTUB4和rEgTUA9均成功获得表达。
实施例4：重组蛋白的纯化及验证（见图1的步骤6）
（1）对rEgTUB4和rEgTUA9进行大量表达，收集菌体沉淀。利用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀，然后用缓冲液A（20 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，10mM 咪唑，pH7.4）充分悬浮菌体，并进行冰浴超声破碎，12000rpm离心20min收集沉淀。
（2）上述沉淀用缓冲液B（20 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，10mM 咪唑，8M 尿素，pH7.4）悬浮溶解，12000rpm离心20min收集上清。
（3）利用GE公司的镍离子（Ni2+）纯化柱进行蛋白纯化。首先利用缓冲液B对纯化柱进行柱平衡，然后将包涵体溶液上样后再用缓冲液B洗涤纯化柱；接着以低速用8M- 0M尿素缓冲液对纯化柱进行线性梯度洗涤，使包涵体蛋白完成柱上复性，最后利用洗脱缓冲液C（20 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，500mM 咪唑，pH7.4）洗脱目标蛋白。
（4）验证重组蛋白的特异性。将上述纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE，并转PDVF膜上，然后用封闭液对膜进行室温封闭1h，回收封闭液并用TBST液（1×TBS，0.05%Tween 20）洗涤3次（5 min/次）；分别以β-微管蛋白和α-微管蛋白的单克隆抗体（含HRP）振摇孵育约4h，用TBST将PVDF膜洗涤6次（5 min/次），进行显色观察，结果如图6所示，纯化所获得的重组微管蛋白为我们所需要的目标蛋白rEgTUB4和rEgTUA9。
实施例5：高通量药物筛选方法的构建和验证（见图1的步骤7）
（1）于冰上将适量100mM GTP加入至General Tubulin Buffer（80mM PIPES，2mMMgCl2,0.5mM EGTA，pH6.9）制成GTP终浓度为1mM的G-PEM缓冲液；
（2）用G-PEM缓冲液将重组微管蛋白制备成0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL六个梯度的微管蛋白混合液后置于处理好的96孔半孔板内，并立即放到酶标仪上进行动力学检测，检测条件为：37℃每分钟检测一次350nm处的吸光值，以观察其聚合情况，结果如图7所示，重组微管蛋白最佳的体外聚合浓度为2mg/mL。
（3）进一步验证重组微管蛋白聚合所形成的结构。取重组微管蛋白聚合物, 置于37℃下保温30min；用2.5%的戊二醛溶液固定，反应2h；用PBS清洗3次（15min/次）；将产物滴加到铜网格上，待干燥后，用1%的乙酸双氧铀染色10min；用蒸馏水洗涤3次，干燥过夜；利用透射电子显微镜进行观察，结果如图8所示，rEgTUB4和rEgTUA9二者能在体外适宜缓冲液中聚合产生类微管结构。
（4）分别将最佳聚合浓度的重组微管蛋白与待测药物加入96孔板内，以等量的溶剂作为对照组，立即用酶标仪进行检测，观察重组微管蛋白聚合效率发生的变化，以检测待测药物对重组微管蛋白体外聚合的影响。结果如图9所示，待测药物对重组微管蛋白的聚合产生不同程度的抑制作用。

Claims (8)

1.一种基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）基因工程菌的构建和验证：以pET-28a+和pET-30a+原核表达质粒为载体，在强启动子T7的下游分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~ Eg/EmTUB11，使重组表达的棘球蚴α-和β-微管蛋白的N端带上6个连续的组氨酸标签6×His，得到的蛋白表达基因工程菌的质粒载体分别为pET28a/pET30a-Eg/EmTUA1 ~ pET28a/pET30a-Eg/EmTUA14和pET28a/pET30a-Eg/EmTUB1 ~ pET-28a/pET30a-Eg/EmTUB11；
（2）重组微管蛋白的表达及纯化：将所述的蛋白表达基因工程菌的质粒载体通过热激法转化至感受态大肠杆菌BL21-DE3中，得到重组BL21-DE3细胞在LB培养基进行培养并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导表达，获得主要以包涵体形式存在的重组微管蛋白；利用镍离子Ni2+金属螯合亲和层析柱上复性方法大量获得纯化的重组微管蛋白；
所述纯化具体包括如下步骤：
a. 对重组微管蛋白进行大量表达，收集菌体沉淀：
b. 悬浮溶解上述沉淀，离心收集上清；
c. 利用镍离子纯化柱进行蛋白纯化：首先对纯化柱进行柱平衡，然后将包涵体溶液上样后再洗涤纯化柱；接着以低速用8M-0M尿素缓冲液对纯化柱进行线性梯度洗涤，使包涵体蛋白完成柱上复性，最后洗脱目标蛋白；
（3）高通量药物筛选方法的构建：棘球蚴重组α-微管蛋白同型和β-微管蛋白同型在0.25mg/mL~4mg/mL的浓度范围发生聚合，其聚合过程用酶标仪检测其动力学特征；将能产生最佳聚合效果的相应浓度的重组微管蛋白与待测药物进行共孵育，并利用酶标仪进行检测，观察重组微管蛋白聚合效率的变化，以检测待测药物对重组微管蛋白体外聚合的影响，以此筛选以棘球蚴微管蛋白为靶点的治疗棘球蚴病药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述在强启动子T7的下游分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~ Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~ Eg/EmTUB11，具体为：在强启动子T7下游的多克隆位点处分别插入细粒棘球蚴和多房棘球蚴14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~Eg/EmTUB11，构建得到相应的重组载体，并对其进行测序验证。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述得到重组BL21-DE3细胞后对其进行培养并诱导表达，具体为：得到重组BL21-DE3细胞在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃进行培养并用0.1~1mM IPTG诱导表达。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述得到重组BL21-DE3细胞后对其进行培养并诱导表达，具体为：将重组BL21-DE3细胞涂在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养板上，于37℃倒置培养过夜，然后挑取单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基内进行振摇培养至吸光度A450值达到0.5-0.7时，加入诱导剂0.1~1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达，待37℃振摇培养至吸光度A450值达到0.5-0.7后收集菌体，超声破碎大量获得以包涵体形式存在的重组微管蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述纯化具体包括如下步骤：
a. 对重组微管蛋白进行大量表达，收集菌体沉淀：利用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀，然后用缓冲液A充分悬浮菌体，并进行冰浴超声破碎，离心收集沉淀；所述缓冲液A由20 mMTris-HCl，300 mM NaCl，10mM 咪唑组成，其pH值为7.4；
b. 上述沉淀用缓冲液B悬浮溶解，离心收集上清；所述缓冲液B由20 mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM 咪唑，8M 尿素组成，其pH值为7.4；
c. 利用镍离子纯化柱进行蛋白纯化：首先利用缓冲液B对纯化柱进行柱平衡，然后将包涵体溶液上样后再用缓冲液B洗涤纯化柱；接着以低速用8M-0M尿素缓冲液对纯化柱进行线性梯度洗涤，使包涵体蛋白完成柱上复性，最后利用洗脱缓冲液C洗脱目标蛋白；所述缓冲液C由20 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，500mM 咪唑组成，其pH值为7.4。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，在重组微管蛋白的表达及纯化之间增加如下步骤：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳SDS-PAGE方法和免疫蛋白印迹Western blot对表达的重组微管蛋白进行验证。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述验证步骤具体为：取1ml菌液作为未诱导组，剩余菌液加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达，摇培结束后，取1mL菌液做为诱导组；对未诱导组和诱导组的样品进行SDS-PAGE和Western blot，以检测观察目标蛋白表达情况。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）具体分为如下步骤：
a. 将适量100mM GTP加入至常规微管蛋白缓冲液General Tubulin Buffer制成GTP终浓度为1mM的G-PEM缓冲液，所述常规微管蛋白缓冲液由80mM PIPES，2mM MgCl2，0.5mMEGTA组成，其pH值为6.9；利用G-PEM缓冲液将重组微管蛋白制备成0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL六个梯度的微管蛋白混合液后置于处理好的96孔板内，立即将其放到酶标仪上进行动力学检测，检测条件为：37℃每分钟检测一次350nm处的吸光值，以观察并获得重组微管蛋白体外聚合的最佳浓度；
b. 分别将最佳聚合浓度的重组微管蛋白与待测药物加入处理好的96孔板内，以等量的溶剂作为对照组，立即用酶标仪进行动力学检测，观察重组微管蛋白聚合效率发生的变化，以检测待测药物对重组微管蛋白体外聚合的影响。
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