CN102863524A - 诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白（其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）。此外，本发明还公开了上述重组抗原蛋白的制备方法，包括采用RT-PCR扩增EgENO基因，将其克隆到表达载体PET28a(+)中构建重组质粒PET28a-EgENO，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达重组蛋白，用SDS-PAGE及Western blotting对纯化后重组抗原进行鉴定。此外，本发明还公开了上述重组抗原蛋白的诊断用途。实验证明，本发明的重组抗原蛋白对细粒棘球蚴病的诊断具有敏感性和特异性高等优点，在细粒棘球蚴病诊断方面具有广泛的应用前景。

Description

诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白；此外，本发明还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。

背景技术

细粒棘球蚴病又称囊型包虫病（cystic echinococcosis,CE）是一种由细粒棘球绦虫的幼虫引起的严重危害人体健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病，且已成为世界范围的一个重要的公共卫生、经济问题。我国是囊型包虫病发病最高的国家之一，其中以西部的新疆、青海、甘肃、宁夏、西川北部等地最为严重，流行区面积占全国总面积的44%以上，严重影响西部农牧民身体健康，是西部农牧区因病致贫、因病返贫的重要原因之一。目前CE确诊主要是通过物理影像，如X线、B超、断层扫描及核磁共振等方法，但由于细粒棘球蚴病患者早期无明显临床症状，这些方法也仅适用确诊中、晚期病患阶段，所以早期诊断对该病治疗和预后起着重要的作用。对临床早期可疑病患或对高风险人群进行大规模筛查采用免疫学检测显得尤为必要。目前广泛用于细粒棘球蚴病诊断抗原主要是囊液抗原及其组分抗原B和抗原5等，但受到不易标准化，特异性、敏感性不理想以及与其他带绦虫抗原存在交叉反应等问题的限制。寻找具有更高敏感性和特异性的抗原组分，提高对CE的诊断效率，是当前细粒棘球蚴病免疫诊断研究任务中的重要内容之一，而研制特异性快速诊断试剂盒也是目前免疫诊断的发展趋势。随着分子生物学技术的发展，用基因工程技术制备重组抗原有助于解决上述问题。

根据不完全统计，我国受细粒棘球蚴病威胁的人口在5000万人以上，但目前对于细粒棘球蚴病(囊型包虫病)的治疗效果尚不理想，所以早期诊断对于人囊型包虫病（CE）的及时治疗至关重要，而具有特异的免疫学诊断对CE的确诊有其重要作用。Enolase是利用免疫蛋白质组学技术用CE病人血清从原头节虫体蛋白中筛选出的一个抗原性蛋白分子，分子量约为50kDa，其编码基因为EgENO（细粒棘球绦虫烯醇酶），生物信息学分析显示EgENO含有多个B细胞抗原表位，并且蛋白质组分析显示Enolase也存在于原头节排泄分泌物中，提示该分子具有潜在诊断抗原价值。

寻找具有更高敏感性和特异性的CE诊断抗原，提高对囊型包虫病的检测效率，是当前细粒棘球蚴病免疫诊断研究课题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的用途。

为了解决上述技术问题，本发明从我国青海省细粒棘球蚴分离原头节cDNA扩增了ENO基因，克隆表达EgENO重组蛋白，通过ELISA方法评价分析重组抗原的诊断价值。

在本发明的一方面，提供一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。编码上述重组抗原蛋白的基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明提供一种重组质粒载体，其由上述编码重组抗原蛋白的基因与表达载体PET28a(+)连接构建。

所述的连接可以采用本领域常规或已知的方法进行，例如：所述的连接可以是将两侧带有限制性内切酶识别位点的细粒棘球蚴抗原蛋白基因与经相同酶切处理的表达载体PET28a(+)连接，构建重组表达质粒。所述的内切酶可以是本领域通常使用的内切酶，例如EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ。所述细粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR产物可以通过抽取细粒棘球蚴总RNA，反转录成cDNA作为扩增模板，通过PCR法进行扩增而得。

本发明提供一种转化体，其由上述重组质粒载体转化大肠杆菌BL21（DE3）而得。所述的转化可以按照本领域的常规或已知的方法进行。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物，其序列为：

上游：5'-GTAGAATTCATGTCCATCTTAAAGATCC-3'（如SEQ ID NO:3所示）或其互补链；

下游：5'-ATACTCGAGTTACAAAGGATTGCGGAAG-3'（如SEQ ID NO:4所示）或其互补链。

在本发明的另一方面，提供一种上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1）EgENO基因扩增，EgENO基因扩增的具体序列如SEQ ID NO:2所示；

2）重组质粒构建和鉴定，采用的重组质粒载体为：PET28a(+)；

3）重组蛋白的诱导表达及纯化。

步骤1）具体为：设计SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，抽取细粒棘球蚴总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增。所述RT-PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

步骤2）具体为：将步骤1）所得的PCR产物与经EcoRI和XhoI双酶切后的表达载体PET28a(+)连接，转入大肠杆菌DH5α，并培养过夜；筛选阳性菌落提取质粒，双酶切鉴定并测序，将测序无误的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）。

步骤3）具体为：将重组菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达，分别收集诱导前及不同诱导时间菌液，进行SDS-PAGE电泳分析；离心收集菌体，用纯化缓冲液重悬，冰浴，后冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀进行可溶性分析；按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。

在本发明的另一方面，提供一种上述重组抗原蛋白在制备诊断细粒棘球蚴病药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种上述重组抗原蛋白在制备细粒棘球蚴病诊断试剂盒中的应用。

本发明从我国青海省细粒棘球蚴包囊中分离原头蚴，抽提总RNA，采用RT-PCR扩增EgENO基因，将其克隆到原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgENO，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达重组蛋白，用SDS-PAGE及Western blotting对纯化后重组抗原进行鉴定分析，对32例囊型包虫病、24例泡型包虫病、5例日本血吸虫病、5例弓形虫病、5例华支睾吸虫病、4例囊尾蚴病、2例肺并殖吸虫病和16名健康人共93份血清进行ELISA检测，评价重组抗原的免疫诊断效果。双酶切鉴定及测序结果均显示重组质粒PET28a-EgENO构建成功，SDS-PAGE及Western blotting分析显示重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达，重组蛋白相对分子质量约为50000，可被囊型包虫病患者混合血清识别；该重组抗原对CE血清的诊断敏感性为81.25%，特异性为100%（除泡型包虫病人血清）。实验证明，本发明的EgENO重组抗原对细粒棘球蚴病的诊断具有敏感性和特异性高等优点，具有较好的诊断价值，为研制相关诊断试剂盒奠定了基础，在细粒棘球蚴病诊断方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例中EgENO基因的RT-PCR扩增结果示意图，其中，M表示DNA标志物，1表示EgENO PCR扩增产物；

图2是本发明实施例中重组质粒酶切鉴定结果示意图，其中，M表示DNA标志物，1表示PET28a-EgENO质粒经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，2表示以PET28a-EgENO质粒为模板EgENO基因的扩增产物；

图3是本发明实施例中PET28a-EgENO重组蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图，其中，M表示蛋白分子量标准，1表示PET28a-EgENO/BL21未经IPTG诱导，2表示PET28a-EgENO/BL21经IPTG诱导4h，3表示纯化的PET28a-EgENO重组蛋白；

图4是本发明实施例中PET28a-EgENO重组蛋白的Western-blot分析结果示意图，其中，M表示蛋白分子量标准，1表示囊性包虫病人血清。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1细粒棘球蚴重组抗原蛋白的制备

1材料

1.1细粒棘球蚴

从青海省屠宰场收集绵羊肝脏棘球蚴囊，无菌条件下分离并收集青海（羊源）细粒棘球蚴原头节。

1.2待检血清样本

中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供囊型包虫病人（CE）血清32份、泡型包虫病人（AE）血清24份、日本血吸虫病人血清5份、弓形虫病人血清5份、华支睾吸虫病人血清5份、囊尾蚴病人血清4份、肺并殖吸虫病人血清2份和健康人血清16份。

1.3主要试剂和工具酶

RNA抽提试剂盒RNeasy Mini Kit、质粒抽提试剂盒QIAprep Spin MiniprepKit、DNA纯化试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit购于德国Qiagen公司，反转录试剂盒ReverTraAce-α-购于日本Toyobo公司，PremixTaq聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶EcoRI、XhoI购于美国Promega公司，过氧化物酶标记驴抗人IgG（即驴抗人HRP-IgG）购于美国Ptglab公司，蛋白纯化试剂盒ProbondTM Purification System购于美国Invitrogen公司。

2方法

2.1EgENO基因扩增与克隆

2.1.1基因扩增

根据报道的EgENO基因序列（GI:262192839）设计引物，上游引物含EcoRⅠ酶切位点，下游引物含Xho Ⅰ酶切位点，引物由上海Invitrogen公司（上海生物技术有限公司）合成。引物序列如下：

上游P1：5'-GTAGAATTCATGTCCATCTTAAAGATCC-3'（如SEQ ID NO:3所示）；下划线部分为EcoR I酶切位点；

下游P2：5'-ATACTCGAGTTACAAAGGATTGCGGAAG-3'（如SEQ ID NO:4所示）；下划线部分为XhoI酶切位点。

利用RNA抽提试剂盒抽取原头蚴总RNA，取1μgRNA利用反转录试剂盒反转录成cDNA,并以其为模板进行PCR扩增。反应体系为：引物P1（如SEQ ID NO:3所示）和引物P2（如SEQ ID NO:4所示）各2μl，25μl 2×PremixTaq，20μl水，1μl cDNA模板。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

2.1.2重组质粒构建和鉴定

PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后用EcoRI和XhoI双酶切，与用EcoRI和XhoI双酶切的载体PET28a(+)16℃条件下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有卡那霉素（50μg/ml）的LB平板中培养过夜，提取质粒，双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的菌样送上海Invitrogen公司（上海生物技术有限公司）进行测序分析；将测序正确的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）。

2.2重组蛋白的诱导表达及纯化

将重组菌接种于含卡那霉素（50μg/ml）的LB液体培养基中37℃培养过夜。按1%的比例接种于LB液体培养基中，于37℃振荡培养至菌液吸光度A₆₀₀≈0.4～0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1.0mmol/L诱导表达4h，进行SDSPAGE电泳分析；大量诱导表达菌液经4℃，5000r/min离心15min收集菌体，用纯化缓冲液重悬，冰浴10分钟，后冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀进行可溶性分析。按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。

3结果

3.1EgENO基因扩增与克隆

3.1.1基因扩增

采用RT-PCR的方法，获取EgENO的cDNA片段并以其为模板，扩增出与预期长度一致的目的片段（见图1）。经测序及与GenBank中EgENO基因序列blast分析，确定扩增片段正确。

3.1.2 EgENO基因克隆

目的基因片段用EcoRI和XhoI双酶切，与EcoRI和XhoI双酶切后的PET28a(+)连接，构建重组质粒PET28a-EgENO，经双酶切及测序鉴定，酶切鉴定获得与预期大小一致片段，测序结果表明序列无变异，开放阅读框正确，重组表达质粒构建成功（见图2）。

3.2PET28a-EgEPC1重组蛋白的表达、纯化

将蛋白表达产物经SDS-PAGE分析，在诱导4h时，在50KDa处出现一最高量表达条带，与目的蛋白分子质量基本相符；经纯化后蛋白在50KDa位置得到一清晰条带，与目的蛋白相符（见图3）。

实施例2PET28a-EgENO重组蛋白的Western-blot鉴定

1.Western-blot鉴定方法

将纯化后的PET28a-EgENO重组蛋白（由实施例1制得）经10%SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜，polyvinylidene fluoride）上；将膜置于5%脱脂奶粉溶液封闭1h，与囊性包虫病病人血清混合（1：200稀释）反应，4℃过夜，TBST（TBST中含有Tris-Hcl，NaCl，tween20这三种物质，是做Western-blot中常用的一种缓冲溶液）洗3次，每次5min；加入驴抗人HRP-IgG（1：10000）室温轻摇1h，TBST洗3次，每次5min；加入新鲜配制的DAB（二氨基联苯胺）联合显色液，直到出现目的条带，去离子水终止反应。

2.重组蛋白的Western-blot鉴定分析结果

分析结果显示，PET28a-EgENO纯化重组蛋白可被囊性包虫病人血清特异性识别，在50KDa处出现特异性的条带（见图4）。

实施例3细粒棘球蚴重组抗原蛋白的诊断效果实验

1.重组抗原的ELISA血清学评价

将多份囊性包虫病人血清和健康人血清分别等量混合配制成阳性和阴性血清对照。血清按1：100稀释，通过方阵滴定确定重组抗原（由实施例1制得）工作浓度10μg/ml，驴抗人HRP-IgG工作浓度为1：10000。DAB显色，测A₄₅₀。以16例健康人血清的吸光度均值2倍SD作为阳性判断值。

2.数据统计分析

使用Excel电子表格处理软件对实验数据进行整理和统计分析。

3.重组抗原的血清学检测结果的分析评价

用重组抗原EgENO分别对CE、AE和其他寄生虫病感染及健康人血清进行ELISA的IgG检测，其敏感性为81.25%，特异性为100%（除泡型包虫病人血清）。由表1可见，除泡型包虫病患者血清外，重组抗原与CE患者血清有较好的特异性反应，与日本血吸虫病人血清、弓形虫病人血清、华支睾吸虫病人血清、囊尾蚴病人血清及肺并殖吸虫病人血清未发生交叉反应。

表1EgENO重组抗原ELISA检测不同血清结果

4.讨论

本发明从Eg原头节cDNA中扩增ENO基因,成功克隆获得EgENO,与原核表达载体PET28a（+）构建重组质粒，并通过大肠杆菌系统高效表达了EgENO重组蛋白,纯化后的重组蛋白经Western-blot鉴定表明有较好的反应原性。

分子克隆技术为发展早期诊断及疗效评估的抗原检测方法提供了方便，然而分子诊断技术的快速发展受到经费等多方面的限制，特别是技术复杂性的制约，使其一些偏远地区或大范围研究不易推广，基于ELISA免疫诊断方法具有较高的实用性，且已广泛应用于包虫病辅助诊断和群体流行病学调查监测，所以本发明用该重组抗原对93份血清进行ELISA检测，结果表明EgENO重组抗原对囊型包虫病患者血清的敏感性为81.25%，除泡型包虫病患者血清外，其诊断特异性为100%；与日本血吸虫病人血清、弓形虫病人血清、华支睾吸虫病人血清、囊尾蚴病人血清及肺并殖吸虫病人血清未发生交叉反应。研究分析表明该重组抗原能够较好的检测囊型包虫病，是一种具有较好诊断潜能的抗原，在囊型包虫病单流行区有较好应用前景，但鉴于该重组抗原与泡型包虫病患者血清有一定的反应也显示出该抗原可能不适用于鉴别泡型包虫病和囊型包虫病，如要更有效的区分两型包虫病则需采用与泡型包虫病特异性抗原联合应用的诊断方法。

Claims (9)

1.一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物，其特征在于，其序列为：

上游：5'-GTAGAATTCATGTCCATCTTAAAGATCC-3'（如SEQ ID NO:3所示）或其互补链；

下游：5'-ATACTCGAGTTACAAAGGATTGCGGAAG-3'（如SEQ ID NO:4所示）或其互补链。

3.一种如权利要求1所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）EgENO基因扩增，EgENO基因扩增的具体序列如SEQ ID NO:2所示；

2）重组质粒构建和鉴定，采用的重组质粒载体为：PET28a(+)；

3）重组蛋白的诱导表达及纯化。

4.如权利要求3所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1）具体为：设计SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，抽取细粒棘球蚴总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增。

5.如权利要求4所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

6.如权利要求3所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2）具体为：将步骤1）所得的PCR产物与表达载体PET28a(+)连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选菌落、培养并提取质粒，双酶切鉴定并测序，将测序无误的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）。

7.如权利要求3所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3）具体为：将重组菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达，分别收集诱导前及不同诱导时间菌液，进行SDS-PAGE电泳分析；离心收集菌体，用纯化缓冲液重悬，冰浴，后冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀进行可溶性分析；按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。

8.一种如权利要求1所述的重组抗原蛋白在制备诊断细粒棘球蚴病药物中的应用。

9.一种如权利要求1所述的重组抗原蛋白在制备细粒棘球蚴病诊断试剂盒中的应用。

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